CN101524548A - 一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该组合物是由包含CD基因的质粒、包含TRAIL基因的质粒与纳米颗粒结合制备而得。本发明的纳米载体组合物选择PEG－PEI和FA－PEG－PEI作为传输基因治疗药物的载体，不但充分利用了PEI可有效复合DNA，具有独特的“质子缓冲”功能，能够破坏酸性溶酶体并释放所负载的DNA，从而可获得理想的DNA传送效果和转染效率高等优势，而且FA的加入也使得载体具有了更高的靶向性。本发明采用CD基因和TRAIL基因联合作用于病变位置，与这两个基因分别单独治疗肿瘤相比，本发明的联合基因治疗其肿瘤治疗效果更加显著，因此本发明可用于制备抗肿瘤药物，如抗脑恶性胶质瘤药物等。

Description

一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及纳米材料在基因治疗中的应用，具体涉及一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

基因治疗是将外源性基因导入细胞内部，通过恢复或增添基因表达以纠正人体自身基因的结构或功能上的错乱，抑制外源性病原体遗传物质的复制，杀灭病变的细胞，阻止病变的发展，从而达到治疗的目的。基因治疗作为治疗肿瘤的一种新的辅助手段，逐渐受到人们的重视和关注。基因治疗中最关键的是将DNA导入细胞中，而后进入细胞核；单纯质粒DNA很难直接进入细胞，因此，基因治疗的成功实施除了需要安全、有效的目的基因外，高效、安全的基因传输载体也是关键因素。

纳米颗粒(nanoparticle，NP)是一种粒径在1～100nm之间的超微粒子，具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等。纳米颗粒基因转移载体是目前最为有效的非病毒载体，其转染效率较传统方法高上百倍。

目前用于肿瘤诊断和治疗的药物载体主要由金属纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒、生物降解性高分子纳米颗粒和生物性颗粒构成，其中生物降解性是药物载体或基因载体的重要特征之一，通过降解，载体与药物/基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载体被生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了药物在其他组织中释放。

将药物、DNA和RNA等基因治疗分子和可降解性高分子生物材料形成生物性高分子纳米颗粒，同时再耦联特异性的靶向分子，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。

肿瘤的发生、发展是一个极其复杂的过程，许多基因在不同环节和水平上参与这一过程。目前的基因治疗多为单基因，同时基因的表达和调控以及基因转录系统也不够完善。不同单基因系统治疗肿瘤的疗效不同，长期治疗后肿瘤细胞可产生耐药性，而且单基因系统载体转染瘤细胞效率不高，这些均表明单基因系统治疗肿瘤存在一定的局限性，因此人们必须从多方面着手肿瘤的治疗，而联合基因疗法则可能减少或避免这些不足。

联合基因是利用基因工程技术将两种或多种基因共同表达，目的是为两者或多者共同联合发挥抑制肿瘤作用。目前尚未见到有用生物降解性高分子纳米颗粒协同联合基因一起作用于肿瘤治疗的相关研究报道。

自杀基因，又称为前药敏感基因，是病毒和细菌等原核生物含有的一类基因，其编码的酶能将原来无毒的或微毒的药物前体转化具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞。

将自杀基因导入恶性肿瘤细胞是人类基因治疗的一种重要方法。目前研究较多的选择性的自杀基因为单纯疱疹病毒腺苷激酶/无环鸟苷系统(HSVtk/GCV)，是一种很常见的自杀基因治疗系统，但是这种杀伤基因治疗系统在临床实验中仍显示出局限性，而且基因转运效率较低。

近年来发现另外一种自杀基因大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(E-coli cytosinedeaminase，EC-CD)在肿瘤杀伤作用方面较HSV具有更大的优势，在一些临床前实验中CD/5-FC系统被认为比HSV-tk/GCV系统对肿瘤细胞具有更强的杀灭率。

CD基因是大肠杆菌中一段3.1kb基因，包含两个阅读框架：codA(编码胞嘧啶脱氨酶)和cod B(编码胞嘧啶脱氨酶通透酶)(M.Bentires-Alj，A.C.Hellin，C.Lechanteur，F.Princen，M.Lopez，G.Fillet，J.Gielen，M.P.Merville，V.Bours，Cytosine deaminase suicide gene therapy for peritoneal carcinomatosis，CancerGene Ther 7(2000)20-26.)。

CD基因治疗肿瘤的作用不仅仅是引起导入基因的肿瘤细胞“自杀”，还可通过“旁观者”效应杀伤未导入基因的临近分裂细胞，显著扩大其杀伤效应。

TRAIL，即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素-2配体。它是肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)超家族的成员，是新近发现的凋亡诱导配体。近年来研究发现TRAIL具有选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的特性，而对正常组织无损伤作用，因此在肿瘤的治疗中具有巨大潜力。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种靶向性的、可生物降解的、对病变组织表现高度特异性、转染效率高、自身毒性小、能够安全高效地进入靶细胞内，且可实现双基因联合治疗的纳米载体组合物。

本发明的另一个目的在于提供上述纳米载体组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种纳米载体组合物，该组合物是以纳米颗粒作为载体将CD基因和TRAIL基因均运送到人体内病变部位，然后通过CD基因和TRAIL基因一起联合作用从而取得比传统单基因治疗更好的治疗效果。

本发明的纳米载体组合物可以采取两种形式，一种是将分别包含CD基因和TRAIL基因的质粒与纳米颗粒结合制备而得，这种形式具体的制备过程如下：

(1)制备包含CD基因的质粒；

(2)制备包含TRAIL基因的质粒；

(3)将上述步骤(1)和步骤(2)制备的两种质粒一起与纳米颗粒结合，从而形成“CD基因-TRAIL基因-纳米颗粒”，然后进行转染，并实现双基因对病变位置的联合治疗。

本发明的纳米载体组合物还可以采用另外一种形式，就是由纳米颗粒和包含CD基因的质粒结合得到组分1，再由纳米颗粒和包含TRAIL基因的质粒结合得到组分2，组分1和组分2混合得到纳米载体组合物，其具体制备过程如下：

(1)制备包含CD基因的质粒；用纳米颗粒和该质粒结合得到组分1，即“CD基因-纳米颗粒”；

(2)制备包含TRAIL基因的质粒；用纳米颗粒和该质粒结合得到组分2，即“TRAIL基因-纳米颗粒”；

(3)将上述步骤(1)所得组分1和步骤(2)所得组分2分别进行转染，从而实现双基因对病变位置的联合治疗。

N/P是指作为载体的纳米颗粒中的氨基基团与DNA中的磷酸基团的摩尔比，本发明纳米载体组合物中，包含CD基因的质粒、包含TRAIL基因的质粒与作为载体的纳米颗粒，其三者的比例用N/P来表示：作为载体的纳米颗粒与包含CD基因的质粒的N/P比为(5∶1)～(30∶1)，优选为15∶1；作为载体的纳米颗粒与包含TRAIL基因的质粒的N/P比为(5∶1)～(30∶1)，优选为15∶1。

在本发明纳米载体组合物中作为载体的纳米颗粒，可选择任何一种本领域常用的作为输送药物进入靶细胞的纳米颗粒，优选PEG-PEI或FA-PEG-PEI，更加优选FA-PEG-PEI。

本发明人中的梁兵等人在已经公开的文章“新型靶向纳米材料介导基因治疗胶质瘤的体外研究”中，设计并通过化学方法合成了可降解性PEG-PEI和FA-PEG-PEI，并研究了这两种纳米颗粒负载质粒DNA的能力，比较所形成纳米材料/DNA复合物在体外对细胞的毒性大小及其转染效率，研究结果发现，这两种纳米颗粒的纳米材料/DNA复合物其细胞毒性比常用的PEI 5kd低，而且在N/P比＝15时，这两种纳米颗粒的转染效率都表现为最好，FA-PEG-PEI中FA的靶向效果也最好(B.Liang，M.L.He，Z.P.Xiao，Y.Li，C.Y.Chan，H.F.Kung，X.T.Shuai，Y.Peng.Synthesis and characterization of folate-PEG-grafted-hyperbranched-PEI for tumor-targeted gene delivery，Biochem BiophysRes Commun，367，(2008)：874-880)。

本发明的纳米载体组合物是采用先分别制备含有CD基因和TRAIL基因的质粒，然后再结合纳米颗粒的，所述包含CD基因的质粒和包含TRAIL的质粒均采用真核表达载体，从而更加有利于后期转染效率的提高。

本发明的纳米载体组合物可用于制备抗肿瘤药物，如抗脑恶性胶质瘤药物、抗乳腺癌药物、抗胃癌药物、抗皮肤癌药物、抗大肠癌药物或抗肺癌药物等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.虽然CD基因和TRAIL基因各自都对肿瘤细胞具有抑制作用，但是由于肿瘤的产生多存在异源性，即涉及到多个基因(有时还涉及到未明基因)，单纯地阻断或下调某一种(有时甚至几种)癌基因的表达，往往仍然不能获得理想的效果，本发明的纳米载体组合物，采用将CD基因和TRAIL基因联合作用于病变位置，即可发挥CD基因能够将无细胞毒性的前体药物5-FC转化为5-FC来实现肿瘤细胞杀伤的作用，又可发挥TRAIL诱导多种细胞核肿瘤细胞发生凋亡的作用，弥补单一基因治疗的不足，使两种基因优势互补，发挥了1+1＞2的效果，其对肿瘤细胞的抑制效果远远大于单基因的分别作用，是胶质瘤基因治疗的趋势之一；

2.目前基因治疗在全世界范围内已有多种治疗方案进入临床，但疗效尚不能令人满意，一方面是因为缺乏一种高效、靶向的载体系统，另一方面是因为肿瘤是一种多基因、多步骤变化的复杂疾病，而目前常用的单一基因治疗显然是不够的。本发明的纳米载体组合物选择PEG-PEI和FA-PEG-PEI作为传输基因治疗药物的载体，不但充分利用了PEI可有效复合DNA，具有独特的“质子缓冲”功能，能够破坏酸性溶酶体并释放所负载的DNA，从而可获得理想的DNA传送效果和转染效率高等优势，而且FA的加入也使得载体具有了更高的靶向性。

附图说明

图1为重组质粒双酶切鉴定电泳图；

其中，1为Marker，2为真核表达载体pIRES2-EGFP/CD，3为真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL；

图2为重组质粒PCR鉴定电泳图；

其中，1为Marker，2为目的基因TRAIL，3为目的基因CD；

图3为CD及TRAIL蛋白表达的Western blot检测电泳图；

其中，1为转染空质粒对照组的C6细胞，2为转染单基因TRAIL对照组的C6细胞，3为转染单基因CD对照组的C6细胞，4为转染CD-TRAIL联合治疗组的C6细胞；

图4为不同试验组大鼠肿瘤的病理解剖学检查；

其中，1为PBS脑内处理对照组背面观，2为PBS脑内处理对照组肿瘤组织切面，3为pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组肿瘤组织切面，4为单基因CD脑内治疗组肿瘤组织切面，5为单基因TRAIL脑内治疗组肿瘤组织切面，6为CD-TRAIL联合治疗组肿瘤组织切面，箭头所指部位是肿瘤；

图5为不同处理组大鼠的肿瘤平均体积；

其中，1为PBS脑内处理对照组，2为pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组，3为单基因CD脑内治疗组，4为单基因TRAIL脑内治疗组，5为CD-TRAIL联合治疗组；

图6为不同试验组大鼠肿瘤的HE染色图片；

其中，1为正常组，2为pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组，3为单基因CD脑内治疗组，4为单基因TRAIL脑内治疗组，5为CD-TRAIL联合治疗组；

图7为不同试验组大鼠肿瘤的免疫组化照片；

其中，1为正常组，2为pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组，3为单基因CD脑内治疗组，4为单基因TRAIL脑内治疗组，5为CD-TRAIL联合治疗组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1纳米载体组合物的制备

本实施例所用到的pCMV/CD质粒和pcDNA3.1(+)/TRAIL质粒分别来自德国柏林Max-Delbrück分子医学中心和香港中文大学。

质粒pIRES2-EGFP是一种带绿色荧光蛋白的真核表达载体，市售。

1、真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定

a.真核表达载体pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定

将pCMV/CD质粒和pIRES2-EGFP质粒分别用Sac II/Xho I双酶切，酶切产物经凝胶电泳后切胶回收纯化，得到目的基因CD片段和线性化pIRES2-EGFP质粒片段，然后用T4连接酶将两个片段连接起来，连接产物经转化、质粒抽提后对重组质粒进行双酶切(Sac II/Xho I)鉴定、PCR鉴定(上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示)以及序列分析。

重组质粒的双酶切鉴定结果如图1所示，双酶切后凝胶电泳结果显示所构建的真核表达载体pIRES2-EGFP/CD经Sac II/Xho I双酶切后其回收片段分别为1.3kb(CD基因片段)和5.2kb。

重组质粒的PCR鉴定结果如图2所示，凝胶电泳图上可见扩增片段位于1000bp-1500bp之间，与目的片段一致。

对重组质粒进行序列分析，结果显示，目的基因已插入，并证实质粒的开放阅读框架正确。

由此说明本实施例的真核表达载体pIRES2-EGFP/CD构建成功。

b.真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL的构建和鉴定

将pcDNA3.1(+)-TRAIL质粒和pIRES2-EGFP质粒分别用BamH I/Xho I双酶切，酶切产物经凝胶电泳后切胶回收纯化，得到目的基因TRAIL片段和线性化pIRES2-EGFP质粒片段，然后用T4连接酶将两个片段连接起来，连接产物经转化、质粒抽提后对重组质粒进行双酶切(BamH I/Xho I)鉴定、PCR鉴定(上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示)以及序列分析。

重组质粒的双酶切鉴定结果如图1所示，双酶切后凝胶电泳结果显示所构建的真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL经BamH I/Xho I双酶切后其回收片段分别为1.0kb(TRAIL基因片段)和5.2kb。

重组质粒的PCR鉴定结果如图2所示，凝胶电泳图上可见扩增片段位于1000bp-1500bp之间，与目的片段一致。

对重组质粒进行序列分析，结果显示，目的基因已插入，并证实质粒的开放阅读框架正确。

由此说明本实施例的真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL构建成功。

本实施例的真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定实验中，所涉及到的双酶切、凝胶电泳、切胶纯化回收、转化、质粒抽提、PCR鉴定等实验均为本领域的常规操作，按照相关操作说明书或者试剂盒说明书进行即可。

2、纳米载体组合物的制备

在Eppendorf管中，将1μg上述真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL稀释在50μl不含FBS的DMEM中，振荡均匀，按照N/P＝15，把相应量的FA-PEG-PE加入到另外一管装有50μl不含FBS的DMEM的Eppendorf管中，然后把两溶液在室温下振荡5分钟得到均匀复合物，即FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)复合物。

参照上述同样的操作，制备得到FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/CD)复合物。

实施例2Western blot检测CD及TRAIL蛋白表达

本实施例分以下几个实验组进行平行对比实验：

1.pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组：即FA-PEG-PEI，转染空质粒pIRES2-EGFP；

2.单基因TRAIL对照组：即实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)复合物；

3.单基因CD对照组：即实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/CD)复合物；

4.CD-TRAIL联合治疗组：即本发明的纳米载体组合物，也就是实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)复合物和FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/CD)复合物的组合；

选择胶质瘤C6细胞，将细胞以1×10⁵细胞/孔接种在24孔板上培养至细胞丰度70％，在转染前4小时用不加FBS的DMEM培养基置换培养液，然后把其吸走后每孔中分别加入上述四个实验组(N/P＝15∶1)各4μg和1ml不含FBS的DMEM培养基，在37℃下培养4h，吸去转染液，加入DMEM完全培养基；72h后尽量吸尽培养孔中的培养液，弃去，加入1ml预冷的0.01mol/L PBS，平放轻轻摇动洗涤细胞，1min×3次，弃去洗液，置培养瓶于冰上；按1ml RIPA细胞裂解液加PMSF 10μl的比例，将二者摇匀混合，放置冰上；每孔细胞加100μl含PMSF的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解30min；裂解完成后，迅速用干净的刮棒刮于培养孔一侧，用移液器将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中，4℃下离心，12,000rpm，5min；取上清，-20℃保存，可用于检测蛋白含量和后续的Western blot实验，Western blot实验的操作采用本领域的常规做法，按照参考书或者试剂盒上的说明操作即可。

Western blot的结果如图3所示，pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组的C6细胞其CD蛋白基因和TRAIL蛋白基因均不表达，转染单基因TRAIL对照组的C6细胞只表达TRAIL蛋白基因，转染单基因CD对照组的C6细胞只表达CD蛋白基因，只有转染CD-TRAIL联合治疗组的C6细胞不但表达CD蛋白基因而且表达TRAIL蛋白基因。

凋亡的最终发生与一系列caspase蛋白酶级联激活密切相关，caspase-3检测结果也证实，TRAIL和CD基因转染组有明显的两个条带，表明细胞中caspase-3蛋白被激活，酶解为两部分，肿瘤细胞发生大量凋亡；而对照组第二条带很浅，表明机体对抗肿瘤细胞时也有少量的caspase-3蛋白被酶解，但是酶解量远低于TRAIL和CD基因转染组。

实施例3动物实验

一、脑内原位接种和重组质粒联合治疗

用1％戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠头部固定在脑立体定向仪上，剪去头顶毛发，消毒后铺洞巾。内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，分离暴露颅骨。在立体定位仪引导下，根据大鼠头部立体定向解剖图谱确定确定右尾状核靶点，于冠状缝后1mm，中线右旁开3mm，用牙科钻钻一小孔，勿损伤硬脑膜。

100μl微量注射器抽取大鼠星形胶质瘤C6细胞悬液10μl(1×10⁶C6细胞)，沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下5mm，注射速度为1μl/min，共注射10min，注射完毕后留针5min，缓慢拔针，接种的细胞量：1×10⁶/只。骨孔用骨蜡封闭，缝合切口后消毒皮肤，则完成脑内原位接种，整个接种过程在层流超净工作台进行，术后无需抗感染治疗。

脑内接种后第三天用原位治疗，大鼠重新固定于立体定向台上，沿原道注入治疗基因。

45只大鼠分五组，每组9只，分别接受如下五组治疗基因的注入：

(1)单基因CD脑内治疗组：即实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/CD)复合物；

(2)单基因TRAIL脑内治疗组：即实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)复合物；

(3)CD-TRAIL联合治疗组：即本发明的纳米载体组合物，也就是实施例1制备所得FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/TRAIL)复合物和FA-PEG-PEI/(pIRES2-EGFP/CD)复合物的组合；

(4)pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组；

(5)PBS脑内处理对照组。

治疗基因注入2天后，再向试验大鼠的腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC)500mg/kg，注射10天，对各组动物治疗后动物行为及荷瘤鼠治疗前后生存期进行观察。

二、实验观察指标

1、观察大鼠生活状态及生存周期

大鼠脑内原位接种后第3天时恢复正常觅食、饮水；

原位基因治疗后第2周，PBS脑内处理对照组和pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组出现颅内高压症状，表现为皮毛不整洁，毛色失去光泽，活动、觅食、饮水减少，体质量减轻，反应迟钝。接种2周后症状明显加重，出现眼周淤血，平均每天进食2g左右，体重下降5.5g，部分出现恶液质，四肢抽搐，昏迷，甚至死亡等。接种10天内有2例死亡，20天内PBS脑内处理对照组和pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组全部死亡。

单基因CD治疗组和单基因TRAIL治疗组大鼠在接种3周内较活泼，无死亡。第4周各有3只死亡，余6例均于第6周后处于濒死状态并死亡，最长生存时间分别为40和44天。

而CD-TRAIL联合治疗组大鼠术后2天恢复正常觅食、饮水，兴奋、体质量呈明显上升趋势，第32天死亡第1只，40天内死亡2只，第43-55天死亡5只，而有2只一直存活，未见上述症状。

大鼠接种后CD-TRAIL联合治疗组大鼠术后恢复快，行为更接近正常，而且30天内无一死亡，治疗效果明显好于其它四组。

2、病理解剖学检查

大鼠于濒死前即取全脑，待解剖出大鼠全脑标本，按大鼠脑表面的接种刺刺点做冠状切口，观察各组肿瘤生长情况，并按垂直和水平方向测量肿瘤大小，肿瘤体积＝a²×b×π/6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。

病理解剖学观察结果如图4所示：

图4(1)可看出解剖大鼠时未发现颅外肿瘤生长；

图4(2)和(3)中，PBS脑内处理对照组和pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组大鼠右尾状核区均有团块状肿瘤形成，肿瘤呈不规则形或椭圆形，无包膜，边界较清楚，并向周围脑组织浸润性生长，中线结构明显移位，占位效应明显，切开后的肿瘤为实质性，色白呈鱼肉状，瘤内出血坏死明显；

图4(4)和图4(5)中，单基因CD治疗组和单基因TRAIL治疗组死亡较早的大鼠肿瘤标本可见肿瘤呈圆形或椭圆形浸润生长，较周围正常组织颜色深，境界清楚，周边脑组织肿胀，中线结构向对侧移位，瘤内出血及坏死较对照组轻；

图4(6)中，CD-TRAIL联合治疗组生存期长的大鼠右侧尾状核区肿瘤较小，有明显软化灶，占位效应不明显。

不同处理组大鼠的肿瘤平均体积如图5所示：

图5(1)和(2)中，PBS脑内处理对照组和pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组大鼠的肿瘤大小相仿，平均体积分别为(172.28±8.24)mm³和(172.03±8.48)mm³；

图5(3)和(4)中，单基因CD脑内治疗组和单基因TRAIL脑内治疗组肿瘤平均体积分别为(90.37±4.14)mm³和(88.80±6.14)mm³；

图5(5)中，CD-TRAIL联合治疗组肿瘤平均体积为(53.13±3.72)mm³。

图5中各组的肿瘤体积再次证实了CD-TRAIL联合治疗组的治疗效果要明显好于对照组和单基因治疗组。

三、组织病理学检查

当肿瘤标本取出固定后，进行切片处理，每个标本取切片共12张，10张行免疫组化检测，两张做HE染色。HE染色的操作按照HE染色试剂盒说明书。

HE染色见大鼠肿瘤由包膜、C6胶质瘤和中心缺血坏死区组成，符合胶质瘤的形态特征，五个实验组的HE染色结果如图6所示：

图6(1)为正常大鼠脑组织HE染色。脑组织结构完整清晰，细胞核染色鲜艳，核无明显肿胀，核浆对比度好，无共染现象，未见扩张的毛细血管；

图6(2)中，pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组大鼠肿瘤细胞生长活跃且呈浸润性生长，脑组织与肿瘤交界处虽能见到肿瘤细胞浸润，但仍能见到一个较明显的界线，瘤细胞丰富密集，呈长梭形，多数瘤细胞分化较低，偶见瘤巨细胞，核大深染，病理性核分裂象多见，血管增生较丰富，在肿瘤中心部位可见大量坏死的肿瘤细胞，有典型的栅栏状坏死，周边围绕着胶质瘤细胞；

图6(3)和(4)中，单基因CD治疗组和单基因TRAIL治疗组肿瘤细胞结构松散，细胞之间出现大量空泡；

图6(5)中，CD-TRAIL联合治疗组空泡更多，甚至出现大的囊状空泡，肿瘤细胞基本消失，纤维结缔组织增生明显。

由图6可以看出，CD-TRAIL联合治疗组的治疗效果较好，肿瘤细胞基本消失，而其它四组则以肿瘤细胞多见，对照组更是常见坏死与出血区。

四、免疫组织化学检查

切片常规脱蜡至水；微波修复抗原：将切片浸入柠檬酸缓冲液，微波炉火力打至高档加热至沸腾后，再将火力降至低档，加热15分钟后，自然冷却至室温；PBS清洗5min×3次；切片入3％H₂O₂/甲醇溶液浸泡15min，消除内源性过氧化物酶；PBS清洗5min×3次；用体积分数10％正常山羊血清室温封闭20min，甩去多余液体，不洗；滴加CD或TRAIL一抗(1∶100)，4℃孵育过夜，PBS清洗2min×3次；滴加生物素化二抗(1∶100)，37℃孵育30min，PBS清洗2min×3次；滴加SABC，37℃孵育30min；PBS清洗5min×4次；新鲜配制DAB，滴加显色；流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片，光镜下观察。

免疫组织化学染色结果如图7所示：

图7(1)和(2)中，正常大鼠脑组织和pIRES2-EGFP空质粒脑内处理对照组由于没有CD-TRAIL两种蛋白的表达，因此细胞呈蓝色；

图7(3)和(4)中，单基因CD治疗组和单基因TRAIL治疗组肿瘤细胞胞浆内见棕色染色，证明分别有CD和TRAIL蛋白表达；

图7(5)中，CD-TRAIL双基因联合治疗组，肿瘤细胞胞浆内棕色染色深染，表明有CD和TRAIL蛋白表达。

一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tatcccaacg gtgaagcg                                        18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcgatgagac ggtcgtattt                                      20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agagtagcag ctcacataa                                       19

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atgattccca ggagttta                                        18

Claims (8)

1、一种纳米载体组合物，其特征在于该组合物是由分别包含CD基因和TRAIL基因的质粒与纳米颗粒结合制备而得，或该组合物是由纳米颗粒和包含CD基因的质粒结合得到组分1，再由纳米颗粒和包含TRAIL基因的质粒结合得到组分2，组分1和组分2混合得到纳米载体组合物。

2、根据权利要求1所述纳米载体组合物，其特征在于所述包含CD基因的质粒与纳米颗粒的N/P比为5∶1～30∶1，所述包含TRAIL基因的质粒与纳米颗粒的N/P比为5∶1～30∶1。

3、根据权利要求2所述纳米载体组合物，其特征在于所述包含CD基因的质粒与纳米颗粒的N/P比为15∶1，所述包含TRAIL基因的质粒与纳米颗粒的N/P比为15∶1。

4、根据权利要求1所述纳米载体组合物，其特征在于所述纳米颗粒为FA-PEG-PEI或PEG-PEI。

5、根据权利要求4所述纳米载体组合物，其特征在于所述纳米颗粒为FA-PEG-PEI。

6、根据权利要求1所述纳米载体组合物，其特征在于所述包含CD基因的质粒和包含TRAIL的质粒均为真核表达载体。

7、权利要求1所述纳米载体组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8、根据权利要求7所述应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为抗脑恶性胶质瘤药物、抗乳腺癌药物、抗胃癌药物、抗皮肤癌药物、抗大肠癌药物或抗肺癌药物。

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