CN115947671B - 一种含氨基甲酸酯键的脂质化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含氨基甲酸酯键的脂质化合物及其应用，属于生物医药领域，脂质化合物为如下结构的化合物：
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种含氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)的脂质化合物及其应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是通过将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷、异常基因引起的疾病，达到治疗目的的一种治疗方法。核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(genetic vaccine),是指将含编码免疫原蛋白或多肽的核酸序列(如DNA、mRNA等)导入宿主体内，通过宿主细胞表达免疫原蛋白或多肽，诱导宿主细胞产生对该免疫原的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。其中，确保外源基因的顺利导入是基因治疗过程和基因疫苗免疫极为重要的一环。在众多基因导入的方法中，开发合适的脂质纳米粒(即LNP，Lipid Nanoparticle)包裹核酸，使其靶向至目标细胞，并将特定基因的核酸递送至细胞内的方法逐渐为科学家所使用。
核酸药物与普通化学药物的一个明显区别是核酸带有数量庞大的磷酸根，因而呈负电，且分子量大。为了使其能够被脂质纳米粒更好地包裹，人们开发了可电离脂质等多种脂质化合物。
本发明中所述的含氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)的脂质化合物，可能存在随环境pH值改变电荷的性质。即指在酸性pH值下带正电荷，在生理pH值下呈中性。其理化性质及浓度等参数影响LNP在不同pH条件下的表面电荷。这种电荷状态可以影响其在血液中的免疫识别、血液清除和组织分布，以及其在细胞内的内涵体逃逸的能力，对于核酸的细胞内递送是至关重要的。
“脂质纳米粒(LNP)”是指使用脂质化合物(如可电离脂质化合物)等将需要递送的核酸等药物封装或缔合后形成的纳米结构，具有双层或多层膜结构。纳米粒中分布有可电离脂质化合物、其它脂质辅料及包裹在纳米粒中的核酸。LNP和其组合物可以用于各种目的，包括在体外和体内将封装的或缔合的(例如，复合的)诸如核酸等治疗剂递送至细胞，从而诱导目标蛋白质的表达或者抑制靶基因的表达。
LNP的开发克服了核酸类药物在临床应用中面临的诸多难题，比如：第一，核酸分子易被生物体内或自然界中存在的核酸酶降解；第二，核酸分子进入细胞、与目标细胞器相互作用、调节目标基因表达或目标蛋白表达的能力有限；第三，胞内递送效率低(如无法从内涵体逃逸)。
核酸递送的核心主要包括载体和mRNA，其中载体的核心是可电离脂质，一种能够克服以上难题的可电离脂质分子对于核酸的递送至关重要，尽管市售的可电离脂质化合物已经取得了较大的成功，但仍然存在多种问题，如由于递送效率低而不得不加大脂质化合物用量而导致的副作用大等缺点。为了提高核酸的递送效率，并增加LNP的安全性，本发明提供了一种含氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)的可电离脂质化合物解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)的可电离脂质化合物及其应用，通过本发明全新结构的可电离脂质化合物制备得到的mRNA-LNP的核酸转染效率高、生物相容性好、稳定性高。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种脂质化合物，其特征在于，所述的化合物具有如下结构：
其中，n1和n2各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
G1、G2各自独立地为C1-C10的亚烷基；
R1、R2、R3、R4各自独立地为H、C1-C20的直链或支链烷烃基，或C2-C20的直链或支链烯烃基；
G3为C1-C10的亚烷基；或G3为(CH2)a-O-(CH2)b，其中，a、b各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9，且a+b为2-10的整数；
L1为-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、或-O(C＝O)O-；
L2为-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-。
本发明的脂质化合物以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团。这样的结构使其在缓冲液中能够在两个分子尾部形成氢键，进一步使两分子呈现一个立体锥形结构，这样的结构可以促进LNP的膜融合能力，提高内涵体逃逸能力，提高转染效率；只要是基于这样结构的脂质分子做的改进均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。
前述的一种脂质化合物，作为一种实施例，-CH(R1)R2和-CH(R3)R4各自独立地选自下组： 中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，只要是采用以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。
前述的一种脂质化合物，作为一种实施例，-CH(R1)R2和-CH(R3)R4各自独立地选自下组： 中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，只要是采用以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。
前述的一种脂质化合物，作为一种实施例，-CH(R1)R2和-CH(R3)R4各自独立地选自下组：中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，只要是采用以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。
在最优选的实施方式中，前述的一种脂质化合物选自下组：
一种组合物，其特征在于，包含前述的一种脂质化合物、其立体异构体、其互变异构体或其在药学上可接受的盐的组合物。
前述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：载体、所载的药物、药用辅助剂，或其组合。
前述的组合物，其特征在于，载体包括：一种或多种脂质化合物、助脂质、结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物中的一种或几种的组合；需要说明的是：载体组合物的组分不受限制，可以是现有已知的物质组成的组合物也可以是未知的物质组成的组合物，只要是采用了本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。
前述的组合物，其特征在于，作为一种实施例，前述的脂质化合物与助脂质的摩尔比为0.5:1-15:1。
前述的组合物，其特征在于，作为一种实施例，前述的脂质化合物与结构脂质的摩尔比为0.5:1-5:1。
前述的组合物，其特征在于，作为一种实施例，前述的脂质化合物与聚合物缀合脂质的摩尔比为5:1-250:1。
前述的组合物，其特征在于，作为一种实施例，前述的脂质化合物与两亲性嵌段共聚物的摩尔比为1:1-200:1。
前述的组合物，其特征在于，载体为脂质纳米粒，脂质纳米粒的平均尺寸为30-200nm，脂质纳米粒的多分散指数≤0.3。
前述的组合物，其特征在于，所载的药物包括：核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中，或其组合；所载的药物的选择和组合配方不受限制，只要是采用了本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。
前述的组合物，其特征在于，药用辅助剂包括：稀释剂、稳定剂、防腐剂或冻干保护剂，或其组合；药用辅助剂的选择和组合配方不受限制，只要是采用了本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。
本发明的有益之处在于：
本发明的脂质化合物以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团，这样的结构使其在缓冲液中能够在两个分子尾部形成氢键，进一步使两分子呈现一个立体锥形结构，这样结构化合物组成的LNP可以促进LNP的膜融合能力，提高内涵体逃逸能力，提高转染效率，从而产生更强蛋白表达能力。
本发明的脂质化合物引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团，其具有良好的生物相容性。
本发明结构的脂质转染效率高，安全性好，生物相容性高，合成步骤简单，适合生物医药产业化。
附图说明
图1是本发明的E-1脂质化合物的氢谱图；
图2是本发明的E-1脂质化合物的粒径分布图；
图3是本发明实验二中化合物E-1～E-28、ALC0315组成LNP转染Luciferase mRNA后的荧光示意图；
图4是本发明脂质化合物制备得到的LNP和市场上的LNP的免疫效果对比实验结果示意图。
术语、英文缩写解释说明：
核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由多个核苷酸单体组成的生物大分子；核酸由核苷酸组成，核苷酸单体由五碳糖、磷酸基、含氮碱基、或任何修饰基团组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。
核酸分子包括单链DNA、双链DNA、短异构体、mRNA、tRNA、rRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小非编码RNA(miRNA和siRNA)、端粒酶RNA(Telomerase RNA Component)、小分子RNA(snRNA和scRNA)、环状RNA(circRNA)、合成miRNA(miRNA mimics、miRNA agomir、miRNA antagomir)、反义DNA、反义RNA、核酶(ribozyme)、不对称干扰RNA(aiRNA)、Dicer-substrate RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、gRNA、sgRNA、crRNA或tracrRNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉反义寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或生物定制寡核苷酸等。这里的举例也并非穷举，只要是由核苷酸单体聚合成的都可以应用于本发明。
在本发明的权利要求中，当描述“C1-C20的直链或支链烷烃基”时，指基团可以是具有1-20个碳原子(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子)的烷烃基，所述的烷烃基为饱和烷烃基，其可以为直链，或者具有支链结构，满足前述碳原子数的烷烃基均在该术语描述范围内。
当描述“C2-C20的直链或支链烯烃基”时，指基团可以是具有2-20个碳原子(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子)的烯烃基，所述的烷烃基为饱和烷烃基，其可以为直链，或者具有支链结构，满足前述碳原子数的烯烃基均在该术语描述范围内。在本发明的不同实施方式中，所述的烯烃基可以为单烯烃或多烯烃(如二烯烃)。
当描述“C1-C10的亚烷基”时，指基团可以是具有1-10个碳原子(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)的亚烷基，所述的亚烷基可以为直链或支链结构。
当描述“氨基甲酸酯键”时，指-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-。
当描述“含氨基甲酸酯键的脂质化合物”时，指脂质化合物的疏水基团上含有-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-。
药物可用的盐是指酸加成盐或碱加成盐。
其中酸加成盐的酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、酸式磷酸盐、乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸，柠檬酸、环酰胺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚酸、葡糖酸、葡聚糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5二甲酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、棕榈酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、季铵酸以及十一碳烯酸。
其中碱加成盐举例包括但不限于：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐，锌盐、铜盐、锰盐、以及铝盐；有机碱包括但不限于氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、脱醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、肼苯胺、胆碱、甜菜碱、苯那敏(benethamine)、苄星青霉素(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、以及聚胺树脂；优选地，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
助脂质包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(SM)、甾醇及其衍生物、神经酰胺、带电脂质中的一种或几种的组合；磷脂酰胆碱作为一种优选包括：DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC；磷脂酰乙醇胺作为一种优选为DOPE；甾醇作为一种优选为胆固醇；带电脂质作为一种实施例为DOTAP、DOTMA、18PA；这里并非穷举，只要是采用本发明结构的脂质化合物的组合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。这里并非穷举，助脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
带电脂质是指一类脂质化合物以带正电荷或带负电荷的形式存在；其所带电荷不依赖于生理学范围内的pH，例如pH 3～9，不受pH的影响。带电脂质可以是合成的或天然来源的。带电脂质的实例包括但不限于DOTAP、DOTMA、18PA。
mRNA，信使RNA，中文译名：信使核糖核酸，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。mRNA可以是单顺反子mRNA也可以是多顺反子mRNA。mRNA也可以包含一种或多种功能性核苷酸类似物，功能性核苷酸类似物举例包括：假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷或5-甲基胞嘧啶等。这里的举例也并非穷举，任何修饰的mRNA或其衍生物都可以应用于本发明。
小分子化合物可以是用于治疗或预防的试剂中的有效成分，例如：抗肿瘤药、抗感染药、局部麻醉药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗生素/抗菌剂、抗真菌药、抗寄生虫药、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼剂、麻醉剂、或成像剂等，这里并非穷举。
多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质；蛋白质可以是干扰素、蛋白质激素、细胞因子、趋化因子或者酶类等。
稀释剂是本领域技术人员可知的任意可以药用的水溶性辅料，包括：氨基酸、单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、其它寡聚糖、甘露醇、右旋糖苷、氯化钠、山梨醇、聚乙二醇、磷酸盐，或其衍生物等。
稳定剂可以是本领域技术人员可知的任意可以药用的辅料：吐温-80、十二烷基硫酸钠、油酸钠、甘露醇、甘露糖或海藻酸钠等。
防腐剂可以是本领域技术人员可知的任意可以药用的防腐剂，比如：硫柳汞等。
冻干保护剂可以是领域技术人员可知的任意可以药用的冻干保护剂，比如：葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖，海藻糖，麦芽糖等。
DSPC：英文名称：Distearoyl Phosphatidylcholine，1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；中文名称：二硬脂酰基卵磷脂，CAS号:816-94-4。
DPPC：中文名称：二棕榈酸磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-DIPALMITOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE，CAS号:63-89-8。
DMPC：中文名称：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:18194-24-6。
DOPC：中文名称：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:4235-95-4。
POPC：中文名称：2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:26853-31-6。
DOPE：中文名称：1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺；英文名称：1,2-DIOLEOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOETHANOLAMINE，CAS号：4004-05-1。
DOTAP：中文名称：N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基-硫酸盐；英文名称：1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt)，CAS号：144189-73-1；化学结构式如下所示：
DOTMA：中文名称：N,N,N-三甲基-2,3-双(十八碳-9-烯-1-基氧基)丙-1-铵氯化物，CAS号:1325214-86-5，化学结构式如下所示：
18PA：CAS号：108392-02-5，化学结构式如下所示：
SM：中文名称：鞘磷脂(SM)；英文名称：sphingomyelin。
PEG：中文名称：聚乙二醇；英文名称：Polyethylene glycol。
两亲性嵌段共聚物指：PEG与下列一种或多种聚合物组分的嵌段共聚物，聚合物组分包括：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯、聚酸酐、聚(β-氨基酯)(PBAE)中的一种或多种。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
通过以下实施例1的制备方法制备含氨基甲酸酯键的脂质化合物。
实施例1：
化合物E101-I21的合成。将E101-S13(4.84g,20.0mmol)溶于DCM(20mL)，加入Et3N(3.9mL)，CDI(3.24g,20mmol),于50℃反应1.5h。然后加入E101-S12(3.52g,30.0mmol),于50℃反应2h。冷至室温，依次用5％柠檬酸(20mL×2)，饱和食盐水(10mL)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝100:1)纯化得产物6.88g，收率：89.1％。
化合物E101-I22的合成。将E101-I21(6.88g,17.84mmol)溶于DCM(54mL)，加入PPh3(7.02g,26.76mmol)，冰浴下，分批加入CBr4(8.87g,26.76mmol,1.5eq),于冰浴下反应25min。加入10mL甲醇淬灭反应，直接浓缩得粗品。粗品经柱层析(PE:EA＝10:1)纯化得产物7.52g，收率：94.0％。
化合物E101-I01的合成。将E101-S01(3.62g，20mmol),E101-S02(5.12g，20mmol)和DMAP(0.85g，7mmol)溶于DCM(60mL)，降温至0℃加入DCC(4.32g,21mmol)，升至室温搅拌过夜。反应液过滤，浓缩，经柱分离纯化(硅胶柱，洗脱液为PE：EA＝50：1)得产物8.0g，收率：89％。
化合物E101-I04的合成。将E101-I01(2.25g,5.0mmol),E101-S11(5.26g,50.0mmol)和EtOH(3.0mL)加入厚壁耐压瓶中，加热至90℃反应过夜。反应液浓缩，倒入一酸乙酯/水(1：1)乙酯中萃取，取有机相水洗一次，饱和食盐水洗两次。有机相浓缩得到产物2.26g,100％收率。
化合物E-18的合成。将E101-I04(300mg，0.676mmol)，E101-I22(364mg，0.811mmol)，DIEA(222uL，1.27mmol)，KI(34mg,0.2mmol),THF(1.0mL)和CH3CN(1.0mL)加入后壁耐压瓶中，加热至80℃反应过夜。反应液浓缩，溶解于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液/水(1：2)洗一次，饱和食盐水洗一次，取有机相干燥、浓缩，经柱分离纯化(硅胶柱，洗脱液为1.5-3％MeOH in DCM+0.5％NH3H2O)得产物343mg，收率63％。MS m/z(ESI)：811.7[M+H]+。
采用实施例1的方法，换用对应的起始原料同样也可以制备得到化合物E-1～E-17,E-18～E-21,E-25,E-27，在此不再一一赘述。
实施例2：
化合物合成路线：
化合物合成具体方法：
化合物E101-S08b的合成。将E101-S08(3.85g，15mmol)，N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(5.84g，22.8mmol)和DMAP(2.75g，22.5mmol)加入DMF(60mL)中，加热至75℃，搅拌过夜。反应液倒入300mL水中，乙酸乙酯萃取2次。有机相混合，饱和食盐水洗三次。取有机相干燥浓缩，经硅胶柱层析提(硅胶柱，洗脱液为PE：EA＝50：1)纯得到产物1.8g，收率42％。
化合物E101-I23的合成。将E101-S08b(1.8g，4.53mmol)，F101-S12(636mg，5.43mmol)和DMAP(554mg，4.53mmol)加入DMF(30mL)中，加热至60℃，搅拌过夜。反应液倒入300mL水中，乙酸乙酯萃取2次。有机相混合，饱和食盐水洗三次。取有机相干燥浓缩得到产物1.84g，100％收率，直接用于下一步反应。
化合物E101-I23b的合成。在0℃，向溶有E101-I23(1.84g，4.53mmol)，DMAP(61mg，0.5mmol)和TEA(2.5mL，18mmol)的DCM(60mL)溶液中缓慢加入Ms2O(1.57g，9mmol)的DCM溶液。在0℃下搅拌30分钟后，加水(100mL)淬灭。分离有机相，水洗一次，10％柠檬酸洗一次，饱和食盐水洗一次。有机相干燥浓缩得到粗产物2.05g，直接用于下一步反应。
化合物E101-I24的合成。E101-I23b(2.05g，4.29mmol)和LiBr(1.2g，13.6mmol)加入到THF(25mL)中，加热至45℃搅拌过夜。垫硅胶过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层(硅胶柱，洗脱液为PE：EA＝10：1)析提纯得产物1.84g，收率93％。
化合物E101-I34的合成。将E101-S09(310.0mg,5.07mmol,3eq)溶于DMF(3.4mL)，加入E101-I24(782.5mg,1.69mmol,1eq)，DIEA(655.9mg,5.07mmol,3eq),于50℃反应18h。冷至室温，加入乙酸乙酯(40mL),用半饱和食盐水(5mL×3)与饱和食盐水依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝20:1)纯化得364.3mg淡黄色油状物。收率：48.7％。
化合物E-26的合成。将E101-I34(364.3mg,822.85μmol,1eq)溶于DMF(1.0mL)，加入DIEA(319.1mg,2.47mmol,3eq)，E101-I09(431.2mg,1.23mmol,1.5eq)，于50℃反应16h。冷至室温，加入乙酸乙酯(40mL)，用半饱和食盐水(5mL×3)与饱和食盐水依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝100:1,50:1,20:1,13:1)纯化得335.7mg淡黄色油状物。收率：57.4％。MS m/z(ESI)：711.7[M+H]+。
实施例3：
化合物E101-I32的合成。将E101-S05(3.45g,20.0mmol,1eq)溶于DCM(20mL)，加入Et3N(3.9mL)，CDI(3.24g,20mmol,1eq),于50℃反应1.5h。然后加入E101-S10(2.67g,30.0mmol,1.5eq),于50℃反应16h。冷至室温，依次用5％柠檬酸(20mL×2)，饱和食盐水(10mL)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。于粗品中加入DCM(20mL),搅拌10min,抽滤，滤饼用少量DCM洗涤，滤饼浓缩后得产物3.77g。收率：65.6％。
化合物E101-I33的合成。将E101-I32(3.77g,13.12mmol,1eq)溶于DCM(39mL)，加入PPh3(5.16g,19.67mmol,1.5eq)，冰浴下，分批加入CBr4(6.52g,19.67mmol,1.5eq),于冰浴下反应20min。加入10mL甲醇淬灭反应，直接浓缩得粗品。粗品经柱层析(PE:EA＝10:1,)纯化得产物2.70g，收率：58.8％。
化合物E101-I38的合成。将三光气(1.01g,3.41mmol,0.35eq)，溶于DCM(50mL)，冰浴条件下滴加溶于50mL DCM的DMAP(4.17g,33.12mmol,3.5eq)，滴加完毕后，冰浴条件下继续搅拌10分钟，然后冰浴条件下滴加E101-S08(1.01g,3.41mmol,0.35eq)，逐渐恢复至室温，继续搅拌2小时，然后冰浴条件下滴加E101-S16，然后逐渐恢复至室温，继续搅拌2小时。反应液使用用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×2)与饱和食盐水(100mL×1)依次洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品使用硅胶过滤纯化，浓缩后得粗产物4g，直接进行下一步反应。
化合物E101-I39的合成。将E101-I33(1.0g,2.85mmol,1.0eq)，E101-S09(1.74g,28.54mmol,10.0eq)，溶于乙醇(5mL)，88℃加热封管反应12小时。冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯，使用用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×2)与饱和食盐水(100mL×1)依次洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品使用20mL PE打浆纯化，过滤得到产物0.31g，收率33％。
化合物E-24的合成。将E101-I39(0.30g,0.91mmol,1eq)，F101-I38(0.63g,1.36mmol,1.5eq),DIPEA (0.15g,1.18mmol,1.3eq)，KI(15mg,0.09mmol,0.1eq)溶于THF/MeCN(2.0mL+2.0mL)，于86℃封管反应12h。冷至室温，加入乙酸乙酯(100mL),用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×2)与饱和食盐水(100mL×1)依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品使用柱分离纯化(DCM:EtOH＝50:1)，得浅黄色油状产物0.24g，收率：37.1％。MSm/z(ESI)：713.7[M+H]+。采用实施例3的方法，换用对应的起始原料，用这样的制备方法可以得到：E-22，E-23。
实施例4：
化合物E-28的合成。将E101-I22(500mg，1.11mmol)，E101-S10(40.0mg，0.45mmol)，DIEA(173mg，1.34mmol)，KI(14mg,0.09mmol),THF(1.0mL)和CH3CN(1.0mL)加入后壁耐压瓶中，加热至80℃反应过夜。反应液浓缩，溶解于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液/水(1：2)洗一次，饱和食盐水洗一次，取有机相干燥、浓缩，经柱分离纯化(硅胶柱，洗脱液为1.5-3％MeOH in DCM)得产物260mg，淡黄色油状物，收率71％。MS m/z(ESI)：824.5[M+H]+。
化合物的氢谱数据如下和图1所示：
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作为一种应用，以上化合物可以用于制备医药用途的组合物，组合物包括：载体，所载的药物，药用辅助剂。
载体包括：一种或多种含氨基甲酸酯键的脂质化合物，助脂质，结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物。
作为一种实施例，载体为脂质纳米粒(LNP)，脂质纳米粒的平均尺寸为30-200nm，纳米粒制剂的多分散指数≤0.3。需要说明的是：只要是采用本发明结构的脂质化合物制备成的任何纳米粒都在本专利范围内，均受本发明的启示；比如：除了脂质纳米粒还可能是一种或多种含氨基甲酸酯键的脂质化合物与高分子形成的掺杂纳米粒，比如：PLGA-PEG，PLA-PEG，PCL、PBAE(Polyβ-amino acid)等这里不再穷举。
助脂质包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(SM)、甾醇及其衍生物、神经酰胺、带电脂质中的一种或几种的组合；磷脂酰胆碱作为一种优选包括：DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC；磷脂酰乙醇胺作为一种优选为DOPE；甾醇作为一种优选为胆固醇；带电脂质作为一种实施例为DOTAP、DOTMA、18PA；这里并非穷举，只要是采用本发明结构的脂质化合物的组合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。这里并非穷举，助脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
结构脂质包括：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚或皮质类固醇中的一种或几种。这里并非穷举，结构脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
聚合物缀合脂质为聚乙二醇化脂质；作为一种实施例，聚乙二醇化脂质包括：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油或PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。这里并非穷举，聚合物缀合脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
作为一种实施例，两亲性嵌段共聚物可以包括：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯、聚酸酐、聚(β-氨基酯)(PBAE)或聚乙二醇(PEG)修饰的两亲性嵌段共聚物中的一个或多个的组合。需要说明的是：这里的举例并非穷举只要是对本发明结构脂质的应用都在本发明的保护范围之内。
所载的药物包括：核酸分子，小分子化合物，多肽或蛋白质中的一种或多种。这里并非穷举，只要是采用本发明结构的脂质化合物，无论选用何种药物均可以应用于本发明，均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
药用辅助剂包括：稀释剂，稳定剂，防腐剂或冻干保护剂中的一种或多种。这里并非穷举，只要是采用本发明结构的脂质化合物，无论选用何种药用辅助剂复配，均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。
实验一：mRNA-LNP的制备
制备mRNA-LNP用于以下的实验方法制备。
将表1中的脂质化合物(Lipid)，DOPE(艾维拓(上海)医药科技有限公司)，胆固醇(艾维拓(上海)医药科技有限公司)，以及PEG-脂质以设计的处方配比(Lipid/DOPE/Cholesterol/lipid-PEG为35/25/38.5/1.5(摩尔比))溶于乙醇中，配制成脂质乙醇溶液(Lipid的浓度20mg/mL)。将表1中市售对比样品ALC0315对应的脂质化合物(辉瑞疫苗BNT162b2)通过其最优配比Lipid/DSPC/Cholesterol/lipid-PEG为46.3/9.4/42.7/1.6(摩尔比))溶于乙醇，制得的脂质乙醇溶液(Lipid的浓度20mg/mL)。
步骤二：按照脂质纳米粒(LNP)与mRNA质量比为10:1到30:1准备mRNA，使用柠檬酸盐或醋酸钠缓冲液(pH＝3或5)将mRNA稀释至0.2mg/mL。
步骤三，将步骤一得到的脂质乙醇溶液与mRNA溶液以体积比为1:5到1:1的比例充分混匀。所获纳米粒通过超滤和透析的手段纯化，过滤除菌后，使用Malvern ZetasizerNano ZS表征mRNA-LNP(包载mRNA的脂质纳米粒)的粒径约和PDI，再使用Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher)测定mRNA的包封率。如表1和图2所示，本发明的脂质纳米粒都能形成稳定的纳米结构，尺寸分布较窄，尺寸随不同的脂质纳米粒的结构有所变化，在60-120nm范围内。
表1
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实验二：转染效率验证实验：
雄性ICR小鼠(6-8week，上海杰思捷实验动物有限公司)饲养在22±2℃以及相对湿度为45–75％的实验条件下，光照/黑暗周期为12h。使用编码荧光素酶的mRNA(luciferase mRNA)作为报道基因。荧光素酶催化荧光素产生生物荧光，通过检测单位时间内生物荧光强度，反映LNP的转染效率。以荧光素酶mRNA(购自ApexBio Technology)为例，准备实验一获得的mRNA-LNP样品E-1到E-28，市售对比样品ALC0315；将以上样品分别以150μg/kg mRNA的剂量，通过肌肉注射给药，每组样品两只小鼠，两条腿。取特定的时间点，于小鼠腹腔注射荧光素(20μg/mL)，5分钟后，将小鼠置于小动物活体成像仪测定荧光强度，最后的结果以平均荧光强度表示，小鼠腹腔注射给药后荧光强度实验结果如表2和图3所示。
表2
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结果分析：
ALC0315是市售对比样品(辉瑞BNT162b2)。本发明的含有E-1到E-28的LNP样品与ALC0315的实验结果对比可知：本发明结构的脂质化合物制备得到的脂质纳米粒样品的转染效率显著高于市售对比样品的转染效率，具有显著的进步，具有意想不到的效果。
实验三：生物相容性实验
使用CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒测定细胞活力。将处于指数增长期的Hep3B细胞(100μL，细胞密度为2×104个/ml)悬浮液加入96孔板中，于细胞培养箱中孵育24h，然后从每个孔中除去细胞培养液，并添加100μL含mRNA 20μg/mL的LNP的新制细胞培养液，和细胞共孵育4h。随后，除去细胞上清液，加入新鲜细胞培养液，继续孵育20h。然后，除去上清液，加入含CCK-8工作溶液(10μL/mL)的新鲜的细胞培养液100μL，孵育2h，空白孔的设置：加含CCK-8工作溶液的细胞培养液。使用多功能微孔板检测仪检测每孔于450nm处的吸光度(检测过程中孔板中不能出现气泡)，将未经LNP处理的细胞作为对照组，将其细胞活力设为100％。
细胞活力(％)＝[A1-A0]/[A2-A0]×100；
A1为加药组吸光度，A0为空白组吸光度，A2为对照组吸光度。实验结果如表3所示。
表3
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实验结果表明在限定的LNP浓度内，细胞活力均大于90％，未见明显细胞毒性。
实验四：脂质纳米粒低温保存稳定性实验
以样品E-5为例，将按照配方制作的脂质纳米粒置于4℃条件下低温保存，取不同时间点(0天、6天、10天、15天、30天、45天)，使用Malvern Zetasizer Nano ZS表征mRNA-LNP(包载mRNA的脂质纳米粒)的粒径(Size)约和PDI，mRNA的包封率均使用Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher)测定。测定结果见表4所示。
表4
由表4可知：本发明的脂质分子形成的LNP(脂质纳米粒)可在低温储存90天粒径和包封率仍然稳定，方便产品的运输和保存，适合工业生产。
实验五：免疫效果动物试验
材料准备：六周龄雌性Balb/c小鼠，体重15～20g，20只，饲养于温度22±2℃，相对湿度45-75％的实验环境中，光照/黑暗周期为12h。小鼠购入后先于动物房内适应一周后方可进行正式的动物试验。将20只小鼠随机分成4组，第一组后腿肌肉注射等体积PBS(阴性对照组)，第二组后腿肌肉注射市售对比样品ALC-0315(阳性对照组)、10μg的mRNA、PBS的混合物，第三组为后腿肌肉注射对比样品E-28(试验组1)、10μg的mRNA、PBS的混合物，第四组后腿肌肉注射样品E-1(试验组2)、10μg的mRNA、PBS的混合物；以上mRNA为基于自主设计的模板通过体外转录合成的可表达Spike全长的mRNA。
实验过程为：在第0和14天，按照以上四个分组将包载mRNA的LNP混合物肌肉注射到Balb/c小鼠体内。在第13和21天进行眼部取血，将血样放在37℃孵育1小时后，3500rpm离心15分钟，取上清进行分析。通过自制ELISA试剂盒检测一免和二免小鼠血清对Delta变异株S1蛋白特异性抗体滴度。
检测一免和二免小鼠血清对Delta变异株S1蛋白特异性抗体滴度的具体操作过程如下：将Spike S1重组蛋白加入96孔板，每孔加0.25μg，4℃放置过夜。第二天，弃去孔内液体，使用5％ BSA的PBST溶液(200ul)在37℃条件下封闭1h。之后弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。将小鼠血清用PBS稀释(稀释比列为1：20000)，或者标准品用PBS稀释为一系列浓度(母液为1ug/ul，对半稀释，共14个标曲)。将稀释后的样品和标准品100μL加入空中，37℃，孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。加入Goat anti-mouse IgG HRP(PBS 1:5000稀释)，每孔100ul，37℃，1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。将TMB底物A液和B液等比例混合，每孔100μL，置37℃避光放置数分钟(3-5mins)。在650nm测吸光度，最高吸光度值在1.5附近时，即可加100ul终止液。加入终止液后15min内检测450nm处的吸光度值。根据标准曲线公式计算各组IgG含量。
实验结果如图4所示，结果显示：阳性对照组和试验组三组均可产生针对S1蛋白特异性抗体，并且试验组的抗体滴度显著高于阳性对照组，试验组可高效递送mRNA进入细胞，表达抗原，进而激起体内免疫反应，产生相应抗体，发挥保护功能。
综上所述，本发明的新型脂质化合物结构具有突出性的实质性特点，且以上实验证明本发明的新型脂质化合物以含三级胺的基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水基团上分别一边引入-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-，一边引入氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)作为可降解功能团，这样结构的化合物组成的LNP可以使得LNP更容易破坏细胞内涵体膜，增强LNP内涵体逃逸的能力；且相比市场已在使用的LNP(辉瑞样品)有更好的转染效果；本发明的脂质化合物结构新颖，具有意想不到的技术效果，具有非显而易见性，具有创造性。
这里需要说明的是：本发明脂质化合物是一种药物原料、药物产品，不涉及任何疾病的治疗方法或诊断方法，属于可以授予专利权利的范围。本发明的应用范围不受限制，可以应用于疫苗领域，也可以应用在蛋白替代疗法，基因编辑，细胞治疗等领域，且这里的举例不是穷举，只要是采用本发明结构特征的脂质化合物均在本发明的保护范围内。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (14)
1.一种脂质化合物，其特征在于，所述的化合物具有如下结构：
其中，n1和n2各自独立地为0、1、2；
G1、G2各自独立地为具有4-8个碳原子的亚烷基；
R1、R2、R3、R4各自独立地为C1-C12的直链或支链烷烃基，或C2-C10的直链或支链烯烃基；
G3为具有2-5个碳原子的亚烷基；或G3为(CH2)a-O-(CH2)b，其中，a、b各自独立地为2；
L1为-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、或-O(C＝O)O-；
L2为-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-。
2.根据权利要求1所述的一种脂质化合物，其特征在于，所述的-CH(R1)R2和-CH(R3)R4各自独立地选自下组：
3.根据权利要求1所述的一种脂质化合物，其特征在于，所述的-CH(R1)R2和-CH(R3)R4各自独立地选自下组：
4.根据权利要求1所述的一种脂质化合物，其特征在于，所述的脂质化合物选自下组：
5.包含权利要求1-4任意一项所述的一种脂质化合物、其立体异构体、其互变异构体或其在药学上可接受的盐的组合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括：载体，或其与所载的药物、药用辅助剂的组合。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述载体包括：一种或多种如权利要求1-4任一种所述的脂质化合物、助脂质、结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物，或其组合。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脂质化合物与助脂质的摩尔比为0.5:1-15:1。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脂质化合物与结构脂质的摩尔比为0.5:1-5:1。
10.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脂质化合物与聚合物缀合脂质的摩尔比为5:1-250:1。
11.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脂质化合物与两亲性嵌段共聚物的摩尔比为1:1-200:1。
12.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述载体为脂质纳米粒，所述脂质纳米粒的平均尺寸为30-200nm，所述脂质纳米粒的多分散指数≤0.3。
13.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述所载的药物包括：核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质，或其组合。
14.根据权利要求6所述所述的组合物，其特征在于，所述药用辅助剂包括：稀释剂、稳定剂、防腐剂或冻干保护剂，或其组合。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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