CN109354638A - 聚l-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用 - Google Patents

聚l-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用。聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的结构如式(Ⅰ)所示；本发明还提供了聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，该合成方法简单，原料成本较低，反应用到的试剂和合成的产物无毒无污染；各步反应的反应条件温和，易于操作，且反应副产物少，可广泛应用于科学研究及生产。

Description

聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于有机及高分子聚合物合成领域，尤其涉及聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用。
背景技术
1900年俄国化学家古列维奇首次从肉类中提取得到肌肽，1918年Barger等人首次确定肌肽的化学结构组成为β-丙氨酰-L-组氨酸，即由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽(β-alanyl-L-histidine)。肌肽被证明是一种内源性二肽，肌肉组织和脑组织中均含有高浓度的肌肽(20mM)。除了从肌肉组织中人工提取肌肽，有关肌肽的化学合成和生物合成也有很多报道。最早的化学合成肌肽的方法是Baumann等人为了证实从牛肉中提取出来的肌肽的化学结构的假想而报道的，组氨酸与β碘代丙酰氯反应后再氨解得到肌肽。Cherevin等人于2007年报道了由三氟乙酸化的β-丙氨酸和组氨酸反应合成肌肽的方法，避免了引起产物的外消旋。酶合成策略作为肌肽化学合成的替代方法可以克服化学合成法的不足，如缺乏反应特异性、有机溶剂使用和官能团的保护和活化等。由β-丙氨酸和L-组氨酸在肌肽合成酶的催化下合成肌肽是最常见的酶合成方法。Heck等人报道了利用细菌性β-氨肽酶催化水溶液酶反应系统合成肌肽。
肌肽分子结构含中有三个可电离的基团，羧基pKa＝2.75，β-丙氨酸中伯胺pKa＝9.3，咪唑环上的氨基pKa＝6.75。肌肽本身具有较强的缓冲能力，且肌肽水溶性极好，而难溶于常见的大多数有机溶剂。
大量的研究表明肌肽具有多种生物学特性，如修复肝损伤、保护中枢神经系统、和调节酶活性等。进一步的研究表明肌肽有助于保护生物膜免受脂质过氧化而带来的损伤和清除活性氧(ROS)的功能。有关肌肽的抗氧化性已有比较深入的研究，现在普遍认为肌肽的抗氧化性主要体现在三个方面：与金属离子螯合、具有超氧化物歧化酶类似活性、清除ROS和其它自由基的能力。肌肽因独特的生理活性在病理学、医学、营养学和运动学等领域已被大量研究，近年来，肌肽在化学和生物交叉领域的研究报道也越来越多，但基于L-肌肽的均聚物或共聚物合成研究还未见报道，使肌肽的生物应用范围受到严重限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用，该聚L-肌肽甲基丙烯酰胺聚合物具有低毒性，可用于细胞转染。
本发明所述一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，结构如式(Ⅰ)所示：
其中数均聚合度n＝17～19。
进一步，数均聚合度n＝17，数均分子量Mn.GPC＝7.6kDa，分子量分布PDI≈1.2，聚合物重复单元分子量Mm＝436。
本发明提供了一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物(PCar)的合成方法，是以L-肌肽为起始原料，采用常用的二碳酸二叔丁酯作为氨基保护剂合成双Boc肌肽，接着利用N-羟基琥珀酰亚胺活化双Boc肌肽分子结构中的羧基得到双Boc肌肽活性酯；与此同时，将甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺进行反应制得甲基丙烯活性酯，再与过量乙二胺反应得到氨乙基甲基丙烯酰胺，随后将双Boc肌肽活性酯与氨乙基甲基丙烯酰胺进行反应得到双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺，最终通过传统自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合，聚合反应产物经无水乙醚多次沉淀纯化后由酸脱除Boc即得到聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。具体包括：
(1)以二碳酸二叔丁酯作为氨基保护试剂保护L-肌肽分子结构中的咪唑氨基和伯胺，得双Boc肌肽；
(2)所述双Boc肌肽与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂条件下反应生成双Boc肌肽活性酯；
(3)甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成甲基丙烯活性酯，三乙胺作为碱吸收反应生成的HCl；
(4)所述甲基丙烯活性酯与乙二胺反应生成氨乙基甲基丙烯酰胺；
(5)所述双Boc肌肽活性酯和氨乙基甲基丙烯酰胺反应生成双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺；
(6)采用自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发所述双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合；
(7)采用酸脱除聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物分子结构中的Boc，得聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。
步骤(1)中，L-肌肽与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:2～1:4，优选为1:3；反应溶剂由1,4-二氧六环与水按体积比3～4:1组成；反应温度为4～25℃，反应时间为12～24h；反应在pH 8～9条件下进行，可用饱和NaHCO3溶液提供碱性环境。
步骤(2)中，脱水剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；双Boc肌肽、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2，优选为1:1.1:1.5；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为二氯甲烷等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。
步骤(3)中，甲基丙烯酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2，优选为1:1.1:1.1；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为二氯甲烷等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。
步骤(4)中，甲基丙烯活性酯与乙二胺的摩尔比为1:10～1:20，优选为1:15；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为四氢呋喃等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。
步骤(5)中，双Boc肌肽活性酯与氨乙基甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:1～1:1.2，优选为1:1；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为四氢呋喃等；反应温度为20～25℃，反应时间为6～12h。
步骤(6)中，双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺与偶氮二异丁腈摩尔比为18:1～20:1；双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺在体系中的浓度为0.48～0.52mol/L ，优选为0.5mol/L；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺等；反应温度为73～77℃，优选为75℃，反应时间为20～24h。
步骤(7)中，酸为三氟乙酸。
本发明还提供了所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在作为外源DNA运输载体中的应用。本发明的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物具有良好的缓冲能力，能与DNA形成稳定的纳米复合物，毒性小，可作为DNA运输载体。
本发明还提供了所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在体外细胞转染中的应用。
其中，体外细胞转染时N/P＝5～30，优选为10～30，进一步优选为20～30。
有益效果：
本发明的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的毒性很低，可作为外源DNA的运输载体，用于细胞转染研究。
本发明的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物合成方法简单，原料成本较低，反应用到的试剂和合成的产物无毒无污染；各步反应的反应条件温和，易于操作，且反应副产物少，可广泛应用于科学研究及生产。
附图说明
图1为双Boc肌肽核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图2为双Boc肌肽核磁共振碳谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图3为双Boc肌肽高分辨质谱图；
图4为双Boc肌肽活性酯核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图5为双Boc肌肽活性酯核磁共振碳谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图6为双Boc肌肽活性酯高分辨质谱图；
图7为甲基丙烯活性酯核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图8为氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图9为双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图10为双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振碳谱图(溶剂为氘代氯仿)；
图11为双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺高分辨质谱图；
图12为聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱图(溶剂为氘代甲醇)；
图13为聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振碳谱图(溶剂为氘代甲醇)；
图14为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱图(溶剂为氘水)；
图15为本发明实施例1条件聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺凝胶渗透色谱测试结果，流动相为含0.5M LiBr的N,N-二甲基甲酰胺，柱温34.5℃，柱压6.80MPa，流速1mL/min；
图16为另一种聚合条件下聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺凝胶渗透色谱测试结果，流动相为含0.5M LiBr的N,N-二甲基甲酰胺，柱温34.5℃，柱压6.80MPa，流速1mL/min；
图17为聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测试结果；
图18为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺和L-肌肽酸碱滴定曲线；
图19为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物琼脂糖凝胶电泳图；
图20为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物的粒径及表面Zeta电势随不同N/P条件的变化结果；
图21为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺对HeLa细胞毒性测试结果；
图22为聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物基因转染实验结果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明实施方案进行更加详细的阐述，但是这些阐述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
其中，其中Boc2O表示二碳酸二叔丁酯，EDC表示1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，TEA表示三乙胺，EDA表示乙二胺，AIBN表示偶氮二异丁腈，TFA表示三氟乙酸，DCM表示二氯甲烷，THF表示四氢呋喃，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺；数均聚合度n＝18。
聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物(PCar-1)合成方法如下：
(1)称取L-肌肽(CAS 305-84-0)10mmol加入200mL单口烧瓶，往反应烧瓶中加入15mL饱和NaHCO3溶液，肌肽完全溶解，得肌肽溶液；将肌肽溶液置于冰水浴中，低速搅拌下缓慢加入25mL 1,4-二氧六环。称取二碳酸二叔丁酯30mmol至小烧杯中，加入20mL 1,4-二氧六环溶解，待二碳酸二叔丁酯完全溶解后将其转移至恒压滴液漏斗并缓慢滴加到肌肽溶液中，三十分钟滴加完毕。在整个加料过程中反应体系处于冰水浴，加料结束移走冰浴，反应体系在室温下(25℃)反应24h。反应结束，将反应溶液转移至分液漏斗，首先用石油醚萃取三次；取下层水相溶液，然后用饱和NaHSO4溶液缓慢调节水相溶液pH至弱酸性(pH值大约4～5)，再用乙酸乙酯萃取水相溶液三次，通过薄层色谱法检测水相溶液中反应产物的转移情况。取乙酸乙酯有机相，加入无水Na2SO4干燥除水，常压过滤，减压旋除乙酸乙酯，产物真空干燥12h，得白色固体双Boc肌肽，氮气保护下密封低温保存。
表征数据(图1、图2、图3)
1H NMR(400MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)1.43(s,9H,-C(CH3)3on the secondaryamine),1.60(s,9H,-C(CH3)3on the imidazole),2.44(m,2H,-COCH2CH2NH-),3.14(m,2H,-CimCH2CH-),3.42(m,2H,-COCH2CH2NH-),4.68(m,1H,-NHCHCO-),7.19(s,1H,-NCH＝C-on theimidazole),8.11(s,1H,-NCH＝N-on the imidazole).
13C NMR(100MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)27.97,28.53,29.26,36.31,36.85,52.55,79.43,86.67,115.50,137.05,146.43,156.26,171.95,173.83,176.02.
HR-MS:calcd for:427.2193([M+H]+),found:427.2186([M+H]+).
(2)称取双Boc肌肽3mmol加入100mL单口烧瓶中，加入25mL二氯甲烷充分溶解，然后往反应烧瓶中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺3.3mmol和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4.5mmol，反应体系在冰水浴中反应1h后室温下反应过夜。反应结束，将反应溶液转移至分液漏斗，先用饱和NaCl溶液洗涤反应溶液两次，再用去离子水洗涤反应溶液一次。取下层二氯甲烷有机相，加入无水Na2SO4干燥除水，常压过滤，减压旋除二氯甲烷，产物真空干燥12h，收得淡黄色固体双Boc肌肽活性酯，氮气保护下密封低温保存。
表征数据(图4、图5、图6)
1H NMR(400MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)1.41(s,9H,-C(CH3)3on the secondaryamine),1.61(s,9H,-C(CH3)3on the imidazole),2.46(m,2H,-COCH2CH2NH-),2.81(s,4H,-COCH2CH2CO-),3.20(m,2H,-CimCH2CH-),3.43(m,2H,-COCH2CH2NH-),5.14(m,1H,-NHCHCO-),7.41(s,1H,-NCH＝C-on the imidazole),8.03(s,1H,-NCH＝N-on the imidazole).
13C NMR(100MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)25.68,28.00,28.56,29.12,36.36,36.85,51.07,79.20,86.00,116.24,136.97,146.80,156.23,167.06,168.60,171.90.
HR-MS:calcd for:546.2176([M+Na]+),found:546.2173([M+Na]+).
(3)称取N-羟基琥珀酰亚胺4.4mmol加入100mL单口烧瓶中，加入25mL二氯甲烷(CaH2回流干燥除水)溶解，再往反应溶液中加入三乙胺4.4mmol，将反应体系置于冰水浴中低速搅拌。移取甲基丙烯酰氯4mmol加入15mL二氯甲烷中溶解，然后转移至恒压滴液漏斗缓慢滴加到N-羟基琥珀酰亚胺溶液中，十五分钟滴加完毕。反应体系在冰水浴中反应1h后室温下反应过夜。反应结束，将反应溶液转移至分液漏斗，先用饱和NaHCO3溶液洗涤反应溶液两次，再用去离子水洗涤反应溶液一次。取下层二氯甲烷有机相，加入无水Na2SO4干燥除水，常压过滤，减压旋除二氯甲烷，产物真空干燥12h，收得白色固体甲基丙烯活性酯，氮气保护下密封低温保存。
表征数据(图7)
1H NMR(400MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)2.03(s,3H,CH2＝CCH3),2.83(s,4H,-COCH2CH2CO-),5.87(s,1H,CH2＝CCH3),6.39(s,1H,CH2＝CCH3).
(4)往100mL单口烧瓶中加入25mL四氢呋喃，然后移取乙二胺45mmol加入反应烧瓶中，将反应体系置于冰水浴中低速搅拌。称取甲基丙烯活性酯3mmol加入15mL四氢呋喃中溶解，然后转移至恒压滴液漏斗缓慢滴加至乙二胺溶液中，三十分钟滴加完毕。反应体系在冰水浴中反应1h后室温下反应过夜。反应结束，常压滤除反应溶液中的白色沉淀，取滤液，减压旋干，产物真空干燥12h，收得无色油状液体氨乙基甲基丙烯酰胺，氮气保护下密封低温保存。
表征数据(图8)
1H NMR(400MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)1.92(s,3H,CH2＝CCH3),2.82(m,2H,-NHCH2CH2NH2),3.31(m,2H,-NHCH2CH2NH2),5.28(s,1H,CH2＝CCH3),5.68(s,1H,CH2＝CCH3).
(5)称取双Boc肌肽活性酯2mmol加入100mL单口烧瓶，加入25mL四氢呋喃溶解；称取氨乙基甲基丙烯酰胺2mmol，加入15mL四氢呋喃充分溶解后转移至恒压滴液漏斗并缓慢滴加至双Boc肌肽活性酯溶液中，三十分钟滴加完毕。反应体系在室温下反应6h。反应结束，减压旋除反应溶剂四氢呋喃，然后加入二氯甲烷重新溶解反应产物，将反应产物溶液转移至分液漏斗，先用饱和NaCl溶液洗涤两次，再用去离子水洗涤一次；取下层二氯甲烷有机相，加入无水Na2SO4干燥除水，常压过滤，减压旋除二氯甲烷；硅胶柱层析对反应粗产物进行分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇(20:1，体积比)，双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺Rf≈0.45(展开剂为乙酸乙酯/甲醇＝20:1，体积比)，减压旋除反应溶剂，产物真空干燥12h，即得到双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺。
表征数据(图9、图10、图11)
1H NMR(400MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)1.42(s,9H,-C(CH3)3on the secondaryamine),1.60(s,9H,-C(CH3)3on the imidazole),1.94(s,3H,CH2＝CCH3),2.49(m,2H,-COCH2CH2NH-),2.97(m,2H,-CimCH2CH-),3.42(m,6H,-COCH2CH2NH-,-NHCH2CH2NH-),4.63(m,1H,-NHCHCO-),5.32(s,1H,CH2＝CCH3),5.72(s,1H,CH2＝CCH3),7.17(s,1H,-NCH＝C-onthe imidazole),7.97(s,1H,-NCH＝N-on the imidazole).
13C NMR(100MHz,CDCl3,298K):δ(ppm)18.72,27.93,28.48,29.86,36.74,36.89,39.74,53.24,79.38,86.00,114.99,120.23,136.87,138.78,139.61,146.79,156.29,169.22,171.92,172.11.
HR-MS:calcd for:559.2856([M+Na]+),found:559.2852([M+Na]+).
(6)称取双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺1mmol加入10mL单口烧瓶中，加入1.9mLN,N-二甲基甲酰胺(P2O5回流干燥除水)溶解；称取偶氮二异丁腈0.0556mmol，加入0.1mL N,N-二甲基甲酰胺(P2O5回流干燥除水)充分溶解后加入反应烧瓶中，控制单体双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺浓度为0.5mol/L。将反应体系置于冰水浴中低速搅拌，反应体系保持密封状态下往反应溶液中鼓入Ar气一个小时，然后将反应体系转移至75℃油浴中高速搅拌反应24h。反应结束，将反应体系置于液氮中急冷淬灭聚合反应，然后将聚合反应溶液逐滴滴加至20倍体积无水乙醚中沉淀，高速离心，取底部白色沉淀，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺重新溶解后再次逐滴滴加至20倍体积无水乙醚中沉淀，用无水乙醚重复沉淀三次，取最后一次离心沉淀真空干燥12h，得白色固体聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺。
表征数据(图12、图13)
1H NMR(600MHz,CD3OD,298K):δ(ppm)1.00(s,3H,-CH2CCH3),1.41(s,9H,-C(CH3)3on the secondary amine),1.77(s,2H,-CH2CCH3),2.43(s,2H,-COCH2CH2NH-),2.99(m,2H,-CimCH2CH-),3.28(m,6H,-COCH2CH2NH-,-NHCH2CH2NH-),4.59(s,1H,-NHCHCO-),6.88(s,1H,-NHCH＝C-on the imidazole),7.62(s,1H,-NHCH＝N-on the imidazole).
13C NMR(150MHz,CD3OD,298K):δ(ppm)19.87,28.90,31.64,36.94,37.36,38.10,41.06,55.13,80.15,115.64,132.72,136.43,158.28,164.86,173.99.
(7)称取0.5mmol聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺加入25mL单口烧瓶中，然后加入3mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，将反应体系置于冰水浴中低速搅拌；往反应烧瓶中缓慢加入3mL三氟乙酸，反应体系在冰水浴中搅拌反应三十分钟后室温下继续反应4h。反应结束，减压旋除过量的三氟乙酸，然后用饱和NaHCO3溶液调节溶液pH至中性，将反应产物溶液转移至透析袋(截留分子量MWCO＝3500Da)透析两天；第一天透析液为0.1mol/L HCl溶液，第二天透析液为去离子水。透析结束，冻干48h，得白色固体聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺。
表征数据(图14)
1H NMR(400MHz,D2O,298K):δ(ppm)0.93(s,3H,-CH2CCH3),1.72(s,2H,-CH2CCH3),2.75(m,2H,-COCH2CH2NH2),3.23(s,2H,-CimCH2CH-),3.30(s,6H,-COCH2CH2NH2,-NHCH2CH2NH-),4.71(s,1H,-NHCHCO-),7.36(s,1H,-NHCH＝C-on the imidazole),8.70(s,1H,-NHCH＝N-on the imidazole).
(8)聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺凝胶渗透色谱测试，聚合物样品用N,N-二甲基甲酰胺过夜溶解，样品浓度为1.5mg/mL，流动相为含0.5M LiBr的N,N-二甲基甲酰胺，柱温34.5℃，柱压6.80MPa，流速1mL/min。
表征数据如图15。
(9)聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测试；聚合物样品用甲醇过夜溶解，样品浓度为1mg/mL，辅助基质为2,5-二羟基苯甲酸。
表征数据如图17。
咪唑胺基脱Boc是否对双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合反应有破坏性的影响需要对聚合产物的分子量和结构做进一步的表征。为了考察咪唑胺基Boc脱除对自由基聚合反应的影响情况，通过高分辨质谱MALDI-TOF-MS对聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的分子量及其重复单元结构进行了更为准确的表征，结果如图17所示。图中每两个相邻分子离子峰的m/z差值介于437～439之间，而根据聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱结果推算的重复单元分子量为436，两者结果基本一致，由此可确定聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺重复单元结构为单Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺。
根据高分辨质谱MALDI-TOF-MS结果不仅可以求证聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的重复单元结构，聚合物的分子离子峰从侧面说明了双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合已成功进行，由此可推断咪唑胺基Boc脱除对双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合反应进程没有明显影响。
由双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺通过传统自由基聚合方法合成的聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺分子链不含特征基团，无法通过核磁共振氢谱计算聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的聚合度。MALDI-TOF-MS结果中显示的分子离子峰也不能反映聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的准确分子量。
另一方面，由单一的偶氮二异丁腈引发甲基丙烯基单体自由基聚合体系的组成成分和聚合机理并不复杂，由于引发剂浓度较低，故忽略链自由基向引发剂的转移反应，自由基向溶剂链转移对聚合度的影响也可以忽略，因此只用考虑自由基向单体链转移的情况；而在偶氮二异丁腈引发的本体聚合中，甲基丙烯基类单体自由基聚合向单体的链转移常数较小，对聚合度的影响不大，因此忽略自由基向单体链转移。基于上述分析，可以将双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合的聚合机理简化，并假设聚合产物的聚合度仅与单体/引发剂摩尔比、单体浓度和聚合温度有关；聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的理论分子量(Mn.th)可以由下列公式粗略计算：
Mn.th＝nm/ni×Mm+Mi/2
其中nm和ni分别表示自由基聚合单体和引发剂的摩尔量，nm/ni表示单体和引发剂摩尔比，此时nm/ni＝18；Mm和Mi分别表示重复单元和引发剂分子量。
选择单体/引发剂摩尔比为nm/ni＝18，并假设每个引发剂分子引发18个单体分子自由基聚合生成聚合物链。由于自由基聚合反应过程中存在副反应，导致聚合产物实际分子量和理论分子量存在一定的偏差，因此通过凝胶渗透色谱(GPC)对聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的实际分子量(Mn.GPC)和分子量分布情况(PDI)进行了表征；以含有0.5M LiBr的DMF为流动相，线性聚苯乙烯(PS)为标样，示差检测器记录聚合物在凝胶柱内的洗脱时间，柱温34.5℃，柱压6.80MPa，流动相流速1mL/min。GPC测试结果表明，在上述聚合条件(单体浓度0.5mol/L，单体/引发剂摩尔比nm/ni＝18，聚合温度75℃，聚合时间24h)，双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合产物表现为单一的峰，数均分子量Mn.GPC＝7.6kDa，且分子量分布较窄(PDI≈1.2)，如图15所示。根据GPC测试结果中聚合物的数均分子量(Mn.GPC)以及聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱和MALDI-TOF-MS确定的聚合物重复单元分子量(Mm＝436)，由上述公式计算聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合度(DPGPC)约为17。考虑到GPC测试标样PS和实际测试样品之间结构和性质的差异引起的偏差，DPGPC与前述假设基本一致，这也进一步印证了前述简化的聚合机理。
在探索优化双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合反应条件的过程中，设计了一系列实验来比较单体浓度(0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L)、单体/引发剂摩尔比nm/ni(9:1、18:1、27:1)、聚合时间(24h、48h)和聚合温度(63℃、75℃)等聚合反应条件对聚合产物分子量的影响情况，如下表1所示。对比分析多次自由基聚合反应主产物的分子量，从Test 3～Test 7和Test 9～Test 12两组实验数据中可以看出当固定聚合温度和单体/引发剂摩尔比nm/ni时，提高单体浓度和延长聚合时间对提高聚合产物分子量没有明显的帮助；当聚合时间也保持一致时，聚合物产率随单体浓度的增大而显著提高，表明单体的转化率也相应提高，这和聚合总速率与单体浓度正相关的自由基聚合规律是一致的；当单体浓度、聚合温度和单体/引发剂摩尔比nm/ni都一定时，适当延长聚合时间在一定程度上可以提高单体的转化率，继续延长聚合时间对提高聚合物产率并无明显帮助，特别是当单体浓度较高的情况下。
比较Test 8、Test 11和Test 12三个聚合反应实验数据可以发现，聚合温度对双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合反应的产物分子量有一定的调控作用，聚合物分子量随聚合温度降低而升高，这与自由基聚合的反应特点相吻合。在自由基聚合反应中，反应温度对自由基聚合速率和聚合度的影响方向恰好相反，升高温度使聚合速率增加，却使聚合度降低。这是由于虽然链转移速率常数和链增长速率常数均随反应温度升高而增加，链转移常数也随温度的升高而增大，但链转移速率常数受温度的影响更为显著；因此，降低反应温度有利于得到聚合度更高的聚合物，Test 9～Test 12系列实验充分说明了这一点。
另一方面，虽然降低聚合温度有利于合成分子量更高的聚合物，但在聚合温度63℃时合成的聚合产物的分子量分布较宽(PDI≈1.6)，GPC测试结果显示聚合产物并非单一的峰，聚合物分子量可控性较差，如图16所示。
基于多次的自由基聚合反应结果，最终确定的最佳聚合反应条件为单体浓度0.5mol/L，单体/引发剂摩尔比nm/ni＝18，聚合温度75℃，聚合时间24h；并选取数均分子量为7.6kDa的聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺作为后续实验的材料。
表1部分双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合探索反应列表
实施例2
聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺(PCar-1)生物应用研究内容主要有以下几点：
(1)聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺缓冲容量测定：
肌肽和聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺在生理条件pH(5.1～7.4)范围内的质子缓冲能力可以通过酸碱滴定法测定，实验方法简要概括如下：称取等摩尔量的肌肽和聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺各自溶解于10mL 0.9％NaCl溶液中，用1mol/L盐酸溶液调节上述溶液pH＝1.94，然后用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定，记录加入的NaOH溶液体积及对应的溶液pH值，然后作图。缓冲能力被定义为在pH为5.1～7.4范围内被质子化胺基基团的百分数，计算公式如下式：
Buffer Capacity(％)＝100(△VNaOH×0.1mol/L)/N mol
其中，△VNaOH是将溶液的pH值从5.1调节至7.4所消耗的0.1mol/L NaOH标准溶液的体积，N mol是指所需质子化的胺总量。
通过酸碱滴定法测定肌肽和聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺在pH为5.1～7.4范围内的质子缓冲能力，滴定结果如图18所示；从图中可以很直观的看出聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺和肌肽均具有较强的缓冲能力，通过进一步的计算得到肌肽在上述pH范围内的缓冲容量为97.2％，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的缓冲容量为71.7％。由酸碱滴定曲线还可发现，肌肽分子结构中的咪唑pKa约为6.5，而聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺侧链结构中咪唑的pKa约为4.8，这可能是由于肌肽分子结构中的羧基反应转化为酰胺键而对咪唑的pKa产生了影响。
(2)聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物凝胶电泳实验
带负电荷的质粒DNA在电场中会向正极移动，以含有溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶作为载体，DNA与所处位置凝胶中的EB结合后经紫外光激发可产生荧光，在凝胶成像系统中可以观察到DNA在电场中的运动情况。而当阳离子聚合物与质粒DNA通过静电相互作用形成稳定的纳米复合物之后，质粒DNA分子本身携带的负电荷被阳离子聚合物的正电荷中和，DNA在电场中向正极移动受到抑制。因此，根据阳离子聚合物/DNA纳米复合物的凝胶电泳结果可以初步判断阳离子聚合物对质粒DNA的包裹能力，并筛选出合适的阳离子聚合物/DNA复合物的复合比(N/P)。
琼脂糖凝胶制备方法：称取琼脂糖(0.4g,0.634mmol)加入250mL锥形瓶，然后往锥形瓶中加入50mL 1×TAE缓冲液，摇匀后微波炉加热90秒，待温度冷至50℃左右加入25μL1μg/μL EB溶液，将琼脂糖溶液倒入模板中室温冷却40分钟得到琼脂糖凝胶。将琼脂糖凝胶浸入1×TAE缓冲液中，从配制的一系列不同N/P的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物溶液中移取5μL与1μL6×Loading Buffer(15％focill)混匀后加入琼脂糖凝胶微孔，每个加样孔中质粒DNA的质量恒定。120V电压通电60分钟。电泳结束后取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪中，记录302nm紫外光激发下琼脂糖凝胶中EB/DNA复合物的荧光强度和分布。
聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物制备方法：首先根据N/P计算并配制一系列不同浓度的聚合物溶液，移取10μL聚合物溶液加入2mL低吸附离心管，然后往每份聚合物溶液中加入10μL质粒DNA水溶液(0.05μg/μL)与聚合物溶液等体积混合，静置15分钟。加样时从每份聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物溶液中移取5μL溶液与1μLLoading Buffer混匀后加入琼脂糖凝胶微孔中。120V电压下通电60分钟。
从聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物的凝胶电泳结果(图19)可以看出，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺对质粒DNA的负电荷有着较好的中和能力，当N/P＝2.5时质粒DNA负电荷即能被聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺完全中和。
(3)聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物DLS和Zeta电势实验
DLS测试样品制备方法：配制浓度为6.4μg/mL的质粒DNA水溶液，根据实验设计的不同N/P计算对应N/P条件下所需聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺质量并配制成1mL水溶液，将1mL聚合物水溶液与1mL 6.4μg/mL质粒DNA水溶液等体积混合后室温静置15～20分钟；质粒DNA最终浓度为3.2μg/mL。
表面Zeta电势测试样品制备方法：移取60μL KCl溶液(20mM)加入到240μL去离子水中，然后往其中加入300μL DLS测试样品，质粒DNA最终浓度为1.6μg/mL，KCl最终浓度为1mM。
纳米复合物的粒径和表面Zeta电势由英国Malvern Nano ZS90在298K条件下测定，所有样品重复测定3次。
大量的研究表明，阳离子聚合物/DNA复合物的流体力学体积和表面Zeta电势是影响细胞内吞的重要因素。一般情况下，复合物的粒径随N/P增大而减小，如图20所示，当N/P由10增大到30，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物的粒径显著减小，这表明DNA尚未被完全压缩，有进一步被压缩的空间；继续提高N/P，复合物的粒径随N/P的增大仅有略微减小，复合物粒径基本趋向于稳定，表明阳离子聚合物对DNA的压缩已达饱和，进一步增加阳离子聚合物浓度对缩小复合物粒径几乎没有帮助。
Zeta电势是评价复合物表面电位的参数，表面带正电荷的复合物与表面带负电荷的细胞膜产生静电相互作用能提高复合物与细胞膜之间的亲和力，并极大的促进细胞对复合物的非特异性内吞。如图20所示，复合物表面Zeta电势随着N/P的提高而逐渐增大，这表明更多的阳离子聚合物参与对DNA的压缩并形成更加紧密的复合物，复合物表面电荷密度增大；当N/P由50提高到100，复合物表面Zeta电势上升减缓，表明在较高的N/P条件下，当阳离子聚合物完全压缩DNA形成稳定的复合物之后，多余的阳离子聚合物不再参与络合作用，因此也不会对复合物表面电荷密度产生明显的影响。
综合分析，复合物的粒径和表面Zeta电势随N/P的变化趋势是一致的。
(4)聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺细胞活力实验(MTT)
Mosmann于1983年报道了MTT法检测细胞活力的研究，活细胞线粒体在能量代谢过程中琥珀酸脱氢酶将可溶性四唑盐MTT还原为不溶于水的蓝紫色产物甲瓒晶体，晶体生长的量与活细胞数量和细胞活性呈线性关系。当有外界刺激如化学物质干扰了细胞的正常代谢过程，引起细胞部分或大量死亡，将导致细胞群体活性降低，产生的有色代谢产物甲瓒减少。选择合适的裂解液如二甲亚砜(DMSO)溶解沉积在细胞中的甲瓒晶体，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值(OD)，便可检测出待测细胞的活性。MTT法具有快速准确的优点，已被广泛应用于生物医用材料细胞毒性分析研究。
细胞活力测试是评价并筛选阳离子聚合物基因载体时所依据的重要参数之一，理想的阳离子聚合物基因载体应当具有较高的转染效率和较低的细胞毒性。
聚合物的细胞毒性通过MTT法测定。当细胞在细胞培养瓶中融合度达到90％左右，消化收集细胞悬液，以每孔约1.5×104个/200μL的细胞密度接种到96孔板中，放在37℃、含有5％CO2的恒温细胞培养箱孵育12～24h。当细胞融合度在80％左右时，将培养基吸除，PBS洗细胞1～2遍去除死细胞，接着往每孔加入200μL新制备的含有特定浓度聚合物材料的完全培养基，在含有5％CO2的37℃恒温培养箱中继续孵育24h。达到预定孵育时间后吸除含有测试样品的培养基，每孔加入100μL含有0.15mg/mL MTT的完全培养基，培养箱内继续孵育4h。4h后吸除培养基，用1×PBS小心清洗细胞1～2次，再加入150μL DMSO，摇床上轻摇20分钟，使生成的甲瓒晶体完全溶解。酶标仪分别测定各孔在570nm、720nm波长下的吸收值，记录结果。其中，每孔所记录的720nm波长下的吸光度值为扣除背景用，即最终计算用的吸光度值为OD570减去OD720后的数值，每组平行3次，细胞存活率可以按照如下公式计算：
细胞存活率(％)＝(样品组平均吸光度/对照组平均吸光度)×100％
同时以25kDa bPEI作为对照。
HeLa细胞与聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺和25kDa bPEI两种聚合物作用24h后的细胞活力状态如图21，当聚合物浓度由0.1μg/mL逐渐升高到100μg/mL，不同聚合物对HeLa细胞活力的影响明显不同；当聚合物浓度达到50μg/mL时，经25kDa bPEI处理的细胞存活率仅为7％，而聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺处理的细胞存活率为70％；继续提高聚合物浓度至100μg/mL，经聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺处理的HeLa细胞存活率降低至40％，对HeLa细胞的毒性显著增大，但仍远小于同浓度下25kDa bPEI的细胞毒性。总体而言，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺和25kDa bPEI两种聚合物对HeLa细胞的毒性随聚合物浓度的上升而逐渐增大，但在高浓度下聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺对HeLa细胞的毒性远远低于25kDabPEI的毒性。
(5)聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA复合物体外转染实验
聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的体外基因转染实验在HeLa细胞中进行测试，选取25kDa bPEI作为对照组，转染36h后通过荧光倒置显微镜观察记录细胞转染情况。
将HeLa细胞于转染前24h以每孔约1.6×104个/200μL的细胞密度接种到96孔板中，放在37℃、含有5％CO2的恒温细胞培养箱孵育24h。当细胞融合70～80％时，将培养基吸除，PBS洗细胞1～2遍去除死细胞，接着往每孔加入100μL含有不同浓度聚合物材料/pGFP纳米复合物的不完全培养基，37℃、含有5％CO2的恒温培养箱中继续孵育4h。4h后往每孔补加100μL含有20％FBS的培养基并摇匀，然后继续放在37℃、含有5％CO2的培养箱中生长36h。达到预定时间后通过荧光倒置显微镜观察记录聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的细胞转染情况。
同时以25kDa bPEI作为对照。
在聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的细胞转染实验中主要考察了制备纳米复合物的N/P条件和转染所用质粒DNA的终浓度这两个变量对细胞转染结果的影响情况，结果如图22所示；其中，选取的制备纳米复合物的N/P比依次为5、8、30、50、100、150、200，质粒DNA终浓度分别为2μg/mL和5μg/mL，25kDa bPEI对照组转染所用质粒DNA终浓度为2μg/mL，这主要是因为当质粒DNA终浓度为5μg/mL时，25kDa bPEI在较高的N/P条件下已显示出较强的细胞毒性，转染效果较差。
从聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的细胞转染结果可以看出聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺具有一定的细胞转染能力，但与国际“金标”25kDa bPEI(支化聚乙烯亚胺)相比，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺的细胞转染效率偏低；一方面可能是由于聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺分子量较低所致，另一方面，通过聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺酸碱滴定结果可以发现聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺侧链肌肽中咪唑的pKa降低至4.8左右，这意味着在与质粒DNA络合时咪唑基本不贡献正电荷，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺整体结合质粒DNA能力较弱，从而导致转染效率偏低。
比较纳米复合物不同N/P条件下的细胞转染实验结果可以看出，当N/P由5逐渐提高至100，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的转染效率有一定程度的升高；继续提高N/P至200，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的转染效率出现略微降低或者基本维持不变。在低N/P(如N/P＝5)时，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺压缩质粒DNA不完全，通过静电相互作用形成的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物较为松散，尺寸较大且表面电荷密度较低，不易于进入细胞。在较高的N/P(如N/P＝30)条件下，聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺完全压缩质粒DNA形成结构紧密、尺寸更小和表面电荷密度更高的纳米复合物，还有游离的阳离子聚合物等多种因素共同作用促使纳米复合物转染效率提高。随着N/P的进一步增大，纳米复合物的转染效率会有所提升，但游离的阳离子聚合物的数量也随之增多，细胞毒性增大，细胞过早凋亡而来不及表达转移基因，最终导致转染效率降低。
质粒DNA终浓度对聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物的转染效率的影响并不十分显著，在相同N/P条件下两种质粒DNA终浓度的转染效率相近。
综合分析不同N/P条件和两种转染所用质粒DNA的终浓度对细胞转染效率的影响情况，最终筛选出聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺/DNA纳米复合物比较合适的转染条件为质粒DNA浓度2μg/mL，N/P＝30。

Claims (10)

1.一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：
其中数均聚合度n＝17～19。
2.根据权利要求1所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，其特征在于，n＝17。
3.根据权利要求1或2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，包括：
(1)以二碳酸二叔丁酯作为氨基保护试剂保护L-肌肽分子结构中的咪唑氨基和伯胺，得双Boc肌肽；
(2)所述双Boc肌肽与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂条件下反应生成双Boc肌肽活性酯；
(3)甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成甲基丙烯活性酯，三乙胺作为碱吸收反应生成的HCl；
(4)所述甲基丙烯活性酯与乙二胺反应生成氨乙基甲基丙烯酰胺；
(5)所述双Boc肌肽活性酯和氨乙基甲基丙烯酰胺反应生成双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺；
(6)采用自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发所述双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合；
(7)采用酸脱除聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物分子结构中的Boc，得聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。
4.根据权利要求2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，L-肌肽与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:2～1:4；反应温度为4～25℃，反应时间为12～24h；反应在pH 8～9条件下进行；
步骤(2)中，脱水剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；双Boc肌肽、N-羟基琥珀酰亚胺和脱水剂的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2；反应在有机溶剂中进行；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。
5.根据权利要求2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，步骤(3)中，甲基丙烯酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2；反应在有机溶剂中进行；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h；
步骤(4)中，甲基丙烯活性酯与乙二胺的摩尔比为1:10～1:20；反应在有机溶剂中进行；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。
6.根据权利要求2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，步骤(5)中，双Boc肌肽活性酯与氨乙基甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:1～1:1.2；反应在有机溶剂中进行；反应温度为20～25℃，反应时间为6～12h。
7.根据权利要求2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，步骤(6)中，双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺与偶氮二异丁腈摩尔比为18:1～20:1；双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺在体系中的浓度为0.48～0.52mol/L ；反应在有机溶剂中进行；反应温度为73～77℃，反应时间为20～24h。
8.根据权利要求1或2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在作为外源DNA运输载体中的应用。
9.根据权利要求1或2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在体外细胞转染中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，体外细胞转染N/P＝5～30。
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