KR100860416B1

KR100860416B1 - 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운유전자 전달체

Info

Publication number: KR100860416B1
Application number: KR1020060088277A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 조명행; 최윤재; 아롯 로이다스; 김유경
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2008-09-26
Also published as: KR20080024016A

Abstract

본 발명은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민으로 구성된 유전자 전달체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민으로 구성된 유전자전달체로써 낮은 세포독성, 생분해성 및 높은 유전자 전달효율로 유전자를 효율적으로 전달하는 뛰어난 효과가 있다.

유전자전달체, 생분해성, 폴리에스텔아민, 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌이민

Description

폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운 유전자 전달체{A novel biodegradable polyesteramine based on polycaprolactone diacrylate and polyethylenimine as a gene carrier}

도 1은 본 발명의 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민를 제조방법의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 생분해성 폴리에스텔아민을 특성화하기 위하여 H¹-NMR로 측정한 결과이다.

도 3은 본 발명의 생분해성 폴리에스텔아민의 in vitro 상에서의 시간에 따른 생분해도를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 다양한 전하비 (N/P)에 따른 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA 복합체를 나타내는 전기영동 사진으로써 (a)는 PCLDA/PEI-0.6, (b)는 PCLDA/PEI-1.2 및 (c)는 PCLDA/PEI-1.8이다.

도 5는 본 발명의 다양한 전하비에 따른 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA 복합체 및 폴리에틸렌이민 25K와 DNA 복합체의 입자크기를 나타내는 표이다.

도 6은 본 발명의 전하비 30에서 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA 복합체의 형태를 나타내는 원자력간 현미경 사진이다.

도 7은 본 발명의 다양한 전하비에 따른 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 및 폴리에틸렌이민 25K와 DNA와의 복합체의 표면전하를 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA 복합체에 (a)PBS 및 (b)DNase Ι을 처리하고 1% SDS를 처리하였을때 DNA의 해리정도와 DNase Ι에 대한 방어능력을 나타내는 전기영동 사진이다(1:marker, 2:plasmid DNA alone, 3:PCLDA/PEI-1.8, 4:PCLDA/PEI-1.2 및 5:PCLDA/PEI-0.6).

도 9는 본 발명의 다양한 농도와 세포에서 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 세포독성을 나타낸 그래프로써 (a)는 HeLa, (b)는 HepG2 및 (c)는 293T이다.

도 10은 본 발명의 세포 내에서 유전자 전달효율을 나타낸 그래프로써 (a)는 HeLa, (b)는 HepG2 및 (c)는 293T이다.

도 11은 본 발명의 293T 세포에서 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 GFP 발현을 보여주는 그래프이다.

도 12는 다양한 전하비와 세포에서 생분해성 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체를 마우스의 폐에 흡입하여 GFP 발현을 나타낸 사진이다. (a)는 PCLDA/PEI-1.2의 형광 현미경 사진, (b)는 PCLDA/PEI-1.2의 위상 차 사진, (c)는 PEI 25K의 형광 현미경 사진 및 (d)는 PEI 25K의 위상 차 사진이다.

본 발명은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트(polycaprolactone diacrylate;PCLDA)와 폴리에틸렌이민(polyethylenimine;PEI)을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 신규한 유전자 전달체에 관한 것이다.

유전자 치료는 인간 건강에 주요한 영향을 미치게 될 분자 의약의 새로운 형태를 구성한다. 그러나 유전자 전달을 위한 안전하고 효율적인 방법의 필요성은 유전자 치료에 있어서 여전히 핵심적인 장애물로 남아있다. 최근 재조합된 바이러스들이 가장 효율적인 유전자 전달 벡터로 사용하고 있으나 비바이러스성 벡터는 바이러스 벡터를 대체할 만한 많은 장점을 가지고 있다. 지난 10년 넘게 많은 연구들이 바이러스 벡터와 비슷한 수준의 높은 유전자 발현과 면역 반응을 회피할 수 있게 하는 점에 초점을 맞추어 왔다. 이런 연구들은 유전자 전달을 위한 비바이러스성 합성 벡터들의 세포내 전달 증가뿐만 아니라 더 나은 치료 효과를 위한 내재된 생물학적 활성의 증진에 그 잠재성이 있다.

비바이러스성 벡터 가운데 최근 유전자 전달 고분자로 성공적이고 널리 사용되고 있는 폴리에틸렌이민은 pH 반응성의 완충능력으로 인한 높은 전자효율을 가져 in vitro와 in vivo 상에서 유전자를 다양한 세포에 효과적으로 전달하는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나 폴리에틸렌이민은 여러 세포주에서 심각한 수준의 세포 독 성이 나타난다고 보고되었고, 세포독성은 특히 폴리에틸렌이민의 분자량과 연관되어 있어 분자량이 큰 폴리에틸렌이민 25K의 경우는 높은 유전자 효율을 보이나 세포독성 또한 매우 높은 것으로 알려져 있다. 세포 독성에 관한 문제점을 해결하기 위하여 여러 생분해성 폴리에틸렌이민이 유전자 전달체로써 연구되어져 왔다. 최근 저분자 폴리에틸렌이민과 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)로 구성된 생분해성 폴리에스텔아민(poly(esteramine))를 합성되었고 폴리에틸렌 글라이콜 분자량이 증가할수록 유전자 전달 효율이 감소 된다고 보고하였다.

폴리카프로락톤(polycaprolactone)은 생체에 적합하고 반 결정성이 있는 지방성 폴리에스터이다. 소수성인 폴리카프로락톤은 poly(lactide), poly(glycolide), poly(lactide-co-glycolide) 같은 다른 폴리에스터 계열보다 늦은 분해 양상을 보이며 체내에서 순환되는 기간이 더 긴 것으로 보고되었다.

따라서 본 발명는 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 본 발명의 목적은 낮은 세포독성과 생분해성을 가지면서 유전자 전달효율이 높은 새로운 유전자 전달체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운 유전자 전달체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸레이민 를 1:1, 1:2, 1:4 비율로 폴리에스텔아민을 합성하고 각각의 DNA 복합체를 제조한 후 이들 복합체의 크기, 표면전자, 효소로부터의 보호와 방출, 세포 생존율 및 유전자전달 효율이 우수함을 확인함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 작용 및 구성을 상세히 설명한다.

본 발명 폴리에스텔아민 유전자전달체의 분자량은 결합시키는 폴리에틸렌이민의 분자량(Mw 100~10,100)에 따라 3,000~20,000으로 다양하다. 유전자전달 효율은 전달체의 분자량에 영향을 많이 받으며 분자량이 클수록 더 효율이 증가한다.

본 발명 폴리에스텔아민 유전자전달체는 상대적으로 큰 분자량을 지니고 있어 유전자전달 효율을 높이며 세포 내에서는 에스텔결합이 가수분해(hydrolysis)된다.

본 발명 폴리에스텔아민 유전자전달체의 주요한 작용은 생분해성에 있다.

본 발명은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민를 각각 무수성의 메틸알코올이 포함된 유리병에 넣어 1:1, 2:1, 4:1이 되도록 녹인 후 폴리에스텔아민을 합성하는 단계; 상기 제조된 폴리에스텔아민을 각각의 DNA 복합체를 제조하는 단계 및 상기 복합체를 이용하여 in vitro 및 in vivo 상에서의 유전자전달체의 효능을 비교하는 단계로 구성된다.

본 발명의 실험예는 실시예에서 합성된 폴리에스텔아민 중 PCLDA/PEI-0.6(4:1), PCLDA/PEI-1.2(2:1) 및 PCLDA/PEI-1.8(4:1)으로 합성된 폴리에스텔아민 을 대표로 사용하였다.

본 발명에서 원자력간 현미경(atomic force microscopy; AFM) 실험에 필요한 마이카(mica)는 서울대학교 농업과학공동기기센터(NICEM)에서 제공받았다.

본 발명의 가지형의 폴리에틸렌이민(Mn: 600, 1200, 1800), 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트(Mn: 530), 폴리에틸렌이민 25K, 무수성의 메틸알콜, 아크리로일 클로라이드, 염 형태의 소 흉선 DNA는 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

본 발명에서 플라스미드 DNA는 항체 반응을 일으키는 JM109(competent E. coli)에서 증식시켰고, DNA-Spin^TM (Intron-Bio, Korea) 키트로 분리하였으며 수득된 DNA 산물의 순도와 농도는 260과 280nm에서 UV 흡광도로 결정하였다.

이하 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 공중합체의 합성

폴리카프로락톤 다이아크릴레이트(Mn: 530, 4.0mg, 2mM)을 40ml 벤젠에 녹였다. 상기 용액에 트리에틸아민 0.63ml(4.5mM)과 아크릴로일 클로라이드 0.37ml (4.5mM)을 첨가 한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후 기공의 크기 0.8㎛인 필터를 이용하여 트리에틸아민 하이드로클로라이드를 제거하였 고, 과량의 n-헥산(hexane)에 여과한 반응물을 떨어뜨리는 방법을 통해서 PCLDA를 침전시켰고, 이를 2 내지 3일 동안 진공오븐에서 건조하였다.

폴리에스텔아민은 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 도 1에 나타낸 것과 같이 가지형의 폴리에틸렌이민(Mn: 600, 1,200 및 1,800)과 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트(Mn: 530)를 중합시켜 제조하였다.

가지형 폴리에틸렌이민(Mn: 600, 1,200 및 1,800)와 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트(Mn: 530)를 각각 무수성의 메틸알코올이 포함된 유리병에 넣어 폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트의 비가 1:1, 2:1, 4:1이 되도록 녹인 후, 폴리에틸렌이민 용액을 교반하면서 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트 용액을 천천히 첨가했다. 유리병들은 용매 저항성 뚜껑으로 잘 잠근 후 40℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 후 증류수에서 분획 분자량 6,000 내지 8,000의 멤브레인 필터를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 투석하였고, 이를 동결건조 하였다(도 1 참조).

본 발명에서는 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트가 상업적으로 이용 가능할 뿐만 아니라 반응이 간단한 장점이 있기 때문에 미카엘형 부가반응을 선택하여 폴리에스텔아민을 합성하였다.

그러나 본 발명의 공중합체를 합성할 수 있는 방법이라면 어느 것이라도 적용 가능하였다.

실험예1 . 폴리에스텔아민의 특성

본 발명 폴리에스텔아민의 조성은 도 2와 같이 ¹H 핵자기공명법(Avance^TM 500, Bruker, Germany)으로 측정하였다. 본 발명 폴리에스텔아민의 분자량은 다 각도 레이저 분산을 이용한 겔 침투 크로마토그래피(GPC-MALS) (Dawn Eos, Wyatt, USA) 로 690nm 레이저 파장에서 측정하였다.

본 발명 폴리에스텔아민의 분해도는 폴리에스텔아민의 분자량을 측정하여 추정하였다. 본 발명 폴리에스텔아민 0.1mg을 0.1M PBS(pH 7.4) 1ml에 녹인 후 37℃에서 100rpm으로 교반하고 본 발명 폴리에스텔아민 용액을 동결건조한 후 시료의 분자량을 690nm 레이저 파장에서 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography combined with multi-angle laser light scattering; GPC-MALS)로 측정하였다.

본 발명 폴리에스텔아민의 분해도는 도 3에 나타낸 것과 같이 생리학적인 환경에서 급격히 분해되었다. 본 발명 폴리에스텔아민의 분자량은 3일 후에 약 4,000정도로 일정하게 유지되었으며, 이들은 약 4 내지 5일 후에 최초 분자량의 절반으로 감소하였다. 본 발명 폴리에스텔아민의 특징을 표 1에 나타내었다.

<표 1> 본 발명에서 합성된 폴리에스텔아민의 특징

구 분	반응물의 분자량		PEI:PCLDA (Mol/Mol)	공중합체의 조성	혼성중합체의 수득량(%)	분자량
구 분	PEI	PCLDA	PEI:PCLDA (Mol/Mol)	공중합체의 조성	혼성중합체의 수득량(%)	분자량
PCLDA/PEI-0.6	600	530	1:1	66.63	23.74	10,570
PCLDA/PEI-0.6	600	530	2:1	82.63	32.84	4,160
PCLDA/PEI-0.6	600	530	4:1	77.24	39.00	3,388
PCLDA/PEI-1.2	1200	530	1:1	30.56	31.80	14,270
PCLDA/PEI-1.2	1200	530	2:1	70.32	31.85	12,670
PCLDA/PEI-1.2	1200	530	4:1	80.51	42.52	5,938
PCLDA/PEI-1.8	1800	530	1:1	46.41	43.75	15,460
PCLDA/PEI-1.8	1800	530	2:1	22.48	42.63	15,050
PCLDA/PEI-1.8	1800	530	4:1	69.69	36.86	10,700

실시예2 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체 제조

본 발명 폴리에스텔아민에 대한 각각의 DNA와의 복합체를 제조하였다. 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체는 사용하기 직전에 준비하였다. 상기 복합체는 소 흉선 DNA(복합체의 크기와 표면전하 측정용), pEGFP-N2 용액 (GFP 발현 효율 측정용) 또는 pGL3-control 용액 (기타 모든 실험용)에 동일한 부피의 공중합체 용액을 더한 후 실온에 30분 동안 반응시켜 형성하였고 용매는 pH 7.4의 10mM NaCl(AFM 측정용) 또는 pH 7.4의 PBS를 사용하였다.

실험예2 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체의 형성 능력

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 형성능력이 있는지 전기영동 분석으로 확인하였다. 상기 복합체 형성은 3부터 30까지 다양한 전하비(N/P)에서 유도시켰다.

유전자전달체로서 필수조건 중의 하나는 DNA를 압축하는 능력이다. 합성한 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 형성을 확인하기 위하여 아가로스 겔 전기영동 분석으로 전하비(N/P) 3 내지 30에서 유도하여 DNA의 이동이 감소하는 것을 확인하였다. 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체는 도 4에서 보여지는 것과 같이 전하비(N/P) 약 5 내지 30까지 복합체가 잘 형성되어 DNA 단독 밴드가 나타나지 않음을 확인하였다.

실험예3 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체의 크기 측정

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 크기를 90° 산란각도에서 전기영동 광산란 광도계 (ELS 8000, Otsuka Electronics, Osaka Japan)를 이용하여 측정하였다.

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 크기를 도 5와 같이 나타내었다. 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 크기는 평균 200nm 이하였다. 본 발명 중 PCLDA/PEI-0.6과 DNA와의 복합체의 크기가 전하비(N/P) 10 내지 15에서 갑자기 증가하였는데 이는 복합체간의 소수성 상호 결합 때문이다. 가장 높은 유전자 전달 효율을 보여 준 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체의 경우 가장 작은 127-177nm의 크기를 보였다. 이는 고분자 구조 변형에 있어서의 불규칙이 DNA와 작게 균일한 복합체 형성을 유도했기 때문이다.

실험예4 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체의 원자력간 현미경 관찰

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 중 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체에 대하여 그의 모양과 크기를 원자력간 현미경으로 관찰하였다. 전하비(N/P) 30의 본 발명 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체 용액을 반대 전하를 띤 마이카 위에 떨어뜨리고 1분 동안 놓아둔 다음 마이카를 증류수로 세척한 후 실온에서 건조하였다. 이미지는 non-contact mode에서 얻었으며, silicon pyramidal tip을 가진 V-shaped cantilever를 이용하였다.

본 발명 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체의 모양을 원자력간 현미경으로 관 찰한 결과는 도 6에 나타내었다. 본 발명 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체는 구형으로 잘 압축된 모양을 보여주었으며, 원자력간 현미경으로 측정한 평균 본 발명 PCLDA/PEI-1.2와 DNA와의 복합체의 크기는 150 내지 200nm로, 전기영동 광산란 광도계로 측정한 결과와 유사하였다.

실험예5 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체의 표면전하

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 표면전하는 세포내로의 흡수와 밀접하게 관련되어 있다.

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체와 폴리에틸레이민 25K와 DNA와의 복합체의 표면전하(N/P)는 도 7에 나타내었다. 예상대로 전하비(N/P)가 5 내지 30으로 증가함에 따라 표면전하(N/P)가 점점 증가하는 경향을 보였으며, 8mV 내지 48mV로 나타났다. 전하비 30(N/P)으로 증가함에 따라 증가한 표면전하(N/P)는 세포 내로 유전자가 도입되기 적당한 표면전하(N/P)를 나타내었다.

실험예6 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체에서 DNA 보호와 방출

유전자전달체에서 DNA는 효소로부터 보호되어야 하며, 유전자가 발현되기 위하여 방출되어야 한다. 따라서 합성한 폴리에스텔아민가 DNase I으로부터 DNA 분해를 막을 수 있는지, DNA가 원래대로 방출되는지 알아보았다.

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체에서 DNA의 보호와 방출을 전기영 동으로 확인하였다. DNaseⅠ 2unit을 DNase/Mg2⁺ digestion buffer (50mM, Tris-Cl, pH 7.6 and 10mM MgCl2)에 혼합하여 이를 플라스미드 DNA 3㎕에 더한 후, 37℃에서 100rpm으로 30분 동안 교반하였다. DNase I의 불활성화를 위해 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체에 EDTA (250mM) 3㎕를 넣고 10분 동안 놓아둔 후, 0.1N NaOH (pH 7.2) 에 녹인 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 최종부피(20㎕)의 1%가 되도록 혼합하였다. 최종 시료는 실온에서 2시간 동안 놓아두었으며, 1.0% 아가로스 겔을 사용하여 50V에서 1시간 동안 전기영동으로 관찰하였다.

도 8에서와 같이, 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체는 전하비(N/P) 10에서도 DNaseI으로부터 DNA를 잘 보호하였으며, DNA는 상기 복합체로부터 분리될 수 있음을 확인하였다.

실험예7 . 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA 와의 복합체 세포 생존률 검사

(1) 세포주와 세포배양

사람의 신장세포 293T, 사람의 자궁경부암 세포 HeLa 및 사람의 간암세포HepG2를 10% FBS, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 페니실린 100U/ml가 포함된 DMEM에서 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다.

(2) 세포 생존률 검사

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체를 상기 3가지 세포에 대한 각각의 in vitro 상 세포독성을 MTS법에 의하여 검사하였다. 상기 3가지 세포들을 0.2ml의 배지에 초기농도가 1×10⁴ 내지 2×10⁴ cells/well 이 되게 하여 96-well plate에 넣은 후 18 내지 20시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 그 후 배지를 다양한 전하비의 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체가 포함되어 있는 혈청이 없는 배지로 갈아주었다. 24시간 동안 추가로 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양한 후에 셀 타이터 96 어큐어스 원 솔루션 시약 20㎕가 포함된 배지로 갈아주고 3시간 후에 세포의 대사활성을 측정하기 위하여 ELISA plate reader (GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률(%)은 다음의 식에 따라 계산하였다:

세포 생존률 (%) = (OD₅₄₀(실험군)/OD₅₄₀(대조군))×100.

도 9는 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 세포독성 결과를 보여주고 있다. 폴리에틸렌이민 25K의 세포생존률이 농도가 상승함에 따라 급격히 감소하는 반면 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 (전하비 30)는 모든 세포주에서 80%이상의 생존률을 보였다. 폴리에틸렌이민 25K에 비해 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 세포생존률 증가는 독성이 없는 기본요소(building block)의 형성과 본 발명 폴리에스텔아민의 에스터 구조로부터 나타난 생분해성 산물 때문일 것이다. 보통 낮은 표면전하와 낮은 세포독성은 상호 연관이 있다고 알려져 있기 때문에 본 발명 폴리에스텔아민은 폴리카프로락톤 단위의 소수성에 때문에 매우 생체에 적합할 것이며 세포생존률 증가에 영향을 미쳤을 것이다.

실험예8 . 유전자 전달체의 in vitro 상에서의 루시퍼라아제 활성 측정

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체에 대한 루시퍼라아제 활성 측정을 하기와 같이 실시하였다. 배지 1ml에 HeLa, 293T 및 HepG2 세포 농도를 1×10⁵ 내지 2×10⁵cells/well가 되도록 24-well plate에 접종한 후 18 내지 20시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 배양 후 배지를 다양한 전하비의 본 발명 폴리에스텔아민과 pGL3-control 1㎍가 들어간 혈청이 없는 배지로 교환해 준 후 6시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 다시 혈청이 포함된 새 배지로 갈아준 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 루시퍼라아제 활성은 루시퍼라제 리포터 1000 분석계를 이용하여 측정하였다. Relative light unit (RLU)은 화학발광분석기 (Autolumat LB953, EG&G Derthold, Germany)를 이용하여 측정하였다. RLU는 세포 추출물의 단백질의 농도로 나누어 이용하였으며, 단백질 정량은 BCA 방법을 이용하였다.

본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체의 전하비(N/P)에 따른 유전자 전달효율을 조사하기 위하여 세포생존률 검사에 사용한 것과 동일한 상기 3가지의 세포들을 이용하여 in vitro 상에서 루시퍼라아제 활성을 측정하여 도 10에 나타내었다. 본 발명 폴리에스텔아민과 DNA와의 복합체 및 폴리에틸렌이민 25K와 DNA와의 복합체의 유전자 전달 효율은 세포, 전하비에 따라 다르게 나타났다. 폴리에틸렌이민 25K와 DNA와의 복합체가 전하비(N/P) 5에서는 모든 세포에서 본 발명 폴리에스 텔아민 보다 높은 유전자 전달 효율을 나타냈으나 매우 높은 세포 독성 때문에 전하비(N/P) 30에서는 유전자전달 효율이 감소하였다. 본 발명 폴리에스텔아민의 유전자 전달 효율은 분자량에 크게 영향을 받았으며 분자량이 제일 큰 본 발명 PCLDA/PEI-1.2, PCLDA/PEI-1.8 그리고 마지막으로 분자량이 가장 작은 PCLDA/PEI-0.6 순서로 유전자전달 효율이 높았다. 본 발명 PCLDA/PEI-1.2의 유전자 발현 정도는 폴리에틸렌이민 25K와 비교하여 293T 세포에서는 20 내지 25배, HeLa 세포에서는 15 내지 20배 증가하였다.

실험예9 . 유전자 전달체의 in vitro 상에서의 GFP 발현

유전자전달체를 이용하여 도입한 유전자의 발현을 GFP 유전자를 사용하여 알아보았다. 배지 1ml에 293T 세포의 농도가 1×10⁵ cells/well가 되도록 하여 24-well plate에 넣은 후 18 내지 20시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 배양 후 배지를 다시 다양한 전하비의 본 발명 폴리에스텔아민와 pEGFP-N2의 1㎍가 들어간 혈청이 없는 배지로 교환해 준 후 6시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 다시 혈청이 포함된 새 배지로 갈아준 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양한 후 GFP 발현을 측정하였다. 유전자 전달 효율은 FACS caliber system (Becton-Dickinson, San Joes, CA)를 이용하여 GFP 발현 세포의 퍼센트를 측정하였다.

293T 세포주에서 GFP 발현을 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. GFP 발현 역시 전하비(N/P) 30에서 본 발명 PCLDA/PEI-1.2의 경우가 폴리에틸렌이민 25K에 비해 높게 발현되었다. 도 11에 나타낸 GFP 발현정도는 고분자 자체의 자가 형광을 고려해 그 값을 빼 준 결과이다.

실험예10 . 유전자 전달체의 in vivo 상에서의 GFP 발현

본 발명 폴리에스텔아민의 유전자 전달 효율을 in vivo 상에서 마우스에 흡입함으로써 측정하였다. 13주 된 암컷 마우스(BALB/C mice)에 노출 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 통해 마우스 코에 흡입시켰다. 1mg pEGFP-N2 플라스미드 DNA를 합성한 본 발명 폴리에스텔아민 (PCLDA/PEI-1.2) 또는 폴리에틸렌이민 25K와 복합체를 형성시킨 뒤 마우스 코로 30분간 노출시켰다. 유전자를 마우스 코를 통해 도입시킨 2일 후 해부하여 폐를 분리하여 조직을 4% 포름알데하이드 용액에 저장하였다. 저장 된 조직을 5㎛ 두께가 되게 절단 하였고 절단 된 조직을 슬라이드에 고정시켜 형광 현미경으로 관찰하였다.

마우스에 흡입시킨 후 GFP 발현 효율을 도 12에 나타내었다. 본 발명 PCLDA/PEI-1.2는 in vivo 상에서 높은 유전자 전달 능력을 보여주고 있다. 폴리에틸렌이민 25K에 비해 본 발명 PCLDA/PEI-1.2의 경우 폐포 조직에서 더 높은 유전자 발현이 관찰되었다. 폐 조직 중에서도 폐포 세포가 복합체를 내재화시키는데 더 적당하기 때문에 본 발명 PCLDA/PEI-1.2의 경우가 유전자전달에 더욱 효율적으로 확인되었다.

본 발명 유전자전달체는 생분해성, DNA와의 복합체 형성능력 및 유전자전달을 위한 우수한 물리화학적 특징을 보여주었다. 본 발명 유전자전달체는 높은 전하비(N/P: 30)에서 신장세포, 자궁경부암세포 및 간암세포에 대해 세포 독성이 기존의 폴리에틸렌이민 25K에 비해 거의 없었으며, 폴리에틸렌이민 25K보다 월등히 높은 전달 효율을 보여주었다. 따라서 본 발명은 유전자전달 효율은 높으나 세포독성이 높아 실제 적용에 한계점을 갖고 있는 폴리에틸렌이민 25K를 대신할 수 있는 매우 뛰어난 유전자 전달체를 제공하였다. 본 발명 폴리에스텔아민 유전자전달체는 생분해성, 낮은 세포독성 및 높은 유전자전달 효율을 제공하는데 뛰어난 효과가 있으므로 생명공학을 위한 의학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트를 각각 무수성의 메틸알코올에 녹이는 단계;

상기 메틸알코올에 녹인 폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트를 혼합하는 단계;

용매저항성 뚜껑으로 잘 잠근 후 40℃에서 24시간 동안 반응하는 단계 및

상기 반응 후 분획 분자량 6,000 내지 8,000의 멤브레인을 이용하여 4℃에서 24시간동안 투석하는 단계로 결합됨을 특징으로 유전자전달체 제조방법.
상기 제1항에 의해 제조되어 하기 화학식의 주반복단위로 이루어진 공중합체인 것을 특징으로 하는 하기 화학식의 유전자전달체:

상기 식에서, m은 1 내지 1,000의 정수이며, n은 1 내지 10,000의 정수이다.
삭제
상기 제2항에 있어서, 분자량이 3,000 내지 20,000인 것을 특징으로 하는 유전자전달체.
상기 제1항에 있어서, 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민의 몰비가 1:1 내지 4인 것을 특징으로 하는 유전자전달체의 제조방법.
상기 제2항의 유전자전달체와 DNA와의 복합체로 구성됨을 특징으로 하는 유전자전달 복합체.
상기 제6항의 유전자전달 복합체를 동물세포 또는 동물조직에 유전자전달 목적으로 적용하는 것을 특징으로 하는 유전자전달 복합체.