CN102202653B - 用于免疫疗法的纳米颗粒 - Google Patents

用于免疫疗法的纳米颗粒 Download PDF

Info

Publication number
CN102202653B
CN102202653B CN200980143261.6A CN200980143261A CN102202653B CN 102202653 B CN102202653 B CN 102202653B CN 200980143261 A CN200980143261 A CN 200980143261A CN 102202653 B CN102202653 B CN 102202653B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
particle
antigen
cell
polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980143261.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102202653A (zh
Inventor
杰弗里.A.哈贝尔
康林.P.奥尼尔
赛.T.雷迪
梅洛迪.A.斯沃茨
黛安娜.维卢托
安德烈.范德弗利斯
埃莉奥诺拉.西梅奥尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Original Assignee
Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL filed Critical Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Publication of CN102202653A publication Critical patent/CN102202653A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102202653B publication Critical patent/CN102202653B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001158—Proteinases
    • A61K39/001161—Caspases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine

Abstract

本发明描述了在缺少生物学分子时激活补体的纳米颗粒。该种纳米颗粒显示出在不使用生物学分子来寻靶时特异性靶向特定淋巴结中的抗原呈递细胞。这些颗粒是运送免疫治疗剂的有用媒介。本发明描述了纳米颗粒的表面化学和化学配制剂。

Description

用于免疫疗法的纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本申请涉及美国申请流水号11/707,627，该申请收入本文作为参考。
发明领域
在有些方面，技术领域涉及具有用于激活免疫系统的表面化学性质的纳米颗粒。
发明背景
如果能训练免疫系统以按所需方式(如形成对抗原的耐受或学习排斥它)来应答抗原，那么就可以实现许多医疗益处。已经尝试了各种方法来满足这一挑战，包括系统性药物治疗、抗原注射和抗体疗法。
发明概述
本文公开了一种将治疗性物质特异性靶向身体中内特定位置上的抗原呈递细胞(APC)的新方法及其它。APC通常是树突细胞和巨噬细胞，而在有些情况下则是B细胞。在本文中，术语APC只用于描述树突细胞和巨噬细胞，不描述B细胞。尽管APC遍布全身，但这种方法将药剂靶向特定位置上的APC。APC在淋巴结中的表现与在身体其它部分大相径庭，致使在此位置摄取药剂是有利的。而且，这种媒介(vehicle)持续数小时或数天使得能实现其效应，而且它还是可生物降解的。不仅特异性靶向淋巴结中的APC，而且治疗剂的运送媒介也可用来以特异性方式激活APC：即通过激活补体系统。激活补体系统要调用已知的应答途径，因而可以选择适宜的免疫治疗剂。此外，补体系统可受到运送媒介中的合成材料的激活，而不牵涉生物学药剂。所有这些特异性靶向特征的结果是得到一种媒介，其一般以APC得到激活而实现所需免疫疗法时的时间和位置将治疗剂运送至APC。媒介自身不需要生物学分子或多肽，因而易于接受任何药剂而没有免疫系统的抵触、交叉反应、或不想要的拮抗作用。
在有些实施方式中，这种方法包括具有合适物理特性且其大小能流过间质间隙(interstitial space)以渗入淋巴系统的颗粒。太大的颗粒不能有效迁移至淋巴系统。此类颗粒可以用可生物降解的合成聚合物和能激活补体的聚合物制成。此类颗粒可以通过将各种聚合物交联在一起并在颗粒上可用于激活补体的位置部署某些激活补体性官能基来制备。所有这些特征在下文中有详细描述。
在有些实施方式中，组合物是纳米颗粒组合物，其包含：合成的、可生物降解的颗粒的一个分离的集合，所述颗粒结合有免疫治疗剂且包含能激活补体的第一聚合物和第二共价交联的聚合物，其中所述集合具有约10nm到约100nm，或小于约70nm的平均直径，所述第一聚合物不含能激活补体的天然存在的生物分子，且所述第一聚合物牢固结合至所述第二聚合物。
有些实施方式涉及制备纳米颗粒的免疫治疗性组合物的方法，其包括第一聚合物与聚合过程中用作乳化剂的第二聚合物的乳液聚合物以制备平均直径介于约20nm和约100nm之间，或小于约70nm的可生物降解颗粒的集合，选择第二聚合物以包含能激活补体的羟基和/或氢硫基官能基，并使免疫治疗剂与颗粒结合。
有些实施方式涉及运送免疫治疗剂的方法，其包括将特异性靶向淋巴结中抗原呈递细胞的、可生物降解合成颗粒的集合导入患者，其中所述颗粒包含能激活补体的第一聚合物，所述集合的平均直径约10nm到约100nm，或小于约70nm，所述第一聚合物不含能激活补体的天然存在的生物分子，且所述颗粒包含第二共价交联的聚合物，其牢固结合至第一聚合物。
有些实施方式涉及纳米颗粒组合物，其包含合成颗粒的分离的集合，所述合成颗粒包含能激活补体的合成聚合物，其中所述集合具有例如大约10nm到大约100nm，或小于大约70nm的平均粒径。所述颗粒还可结合有抗原。有些实施方式中的合成聚合物不含能激活补体的氨基酸序列或糖(saccharides)序列，或者完全不含氨基酸和/或核酸和/或糖。所述合成聚合物可以包含例如疏水性部分，其吸附至形成纳米颗粒核心的可生物降解的第二聚合物的疏水性部分，由此使合成聚合物结合至核心。
有些实施方式涉及纳米颗粒组合物，其包含：合成颗粒的分离的集合，其中所述集合的平均直径约例如10nm到约100nm，或小于约70nm，其中所述颗粒包含免疫抑制剂或其它药剂，且其中所述颗粒还结合有抗原。在有些形式中，所述颗粒包含至少一种疏水性嵌段与至少一种亲水性嵌段的两性嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物在水溶液中自组装成颗粒。
一些实施方式涉及供导入哺乳动物中的医药组合物，其包含合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于约70nm的平均粒径，且包含抗原和具有能在哺乳动物中激活补体的官能基的合成聚合物，所述抗原和合成聚合物纳米颗粒的外部。所述官能基可包含例如亲核性基团，例如羟基和/或氢硫基。当应用于纳米颗粒系统时，可选择所述官能基能在哺乳动物中诱导Th-1应答。
所述纳米颗粒可以是微团。一些微团实施方案是用包含亲水性聚合物和疏水性聚合物的嵌段共聚物制备的。亲水性聚合物的一个例子是水溶性的亲水性聚合物，而且包含聚氧化乙烯。疏水性聚合物的一个例子是非水溶性的聚合物，而且包含聚(硫化丙烯)。可以用所述微团封装治疗剂。所述组合物一般可以不含所述合成聚合物以外的佐剂。
纳米颗粒可以与一种或多种抗原或危险信号联合，本文中详述了多种危险信号。一些此类联合牵涉共价、离子、和/或二硫键。所述危险信号可以是所述官能基或用于形成所述纳米颗粒的所述聚合物以外的生物活性分子；换言之，用于制备纳米颗粒的配制剂可以用另一种分子进一步修饰，所述另一种分子是在自然界中找到的或在自然界中找不到的危险信号。一些危险信号是疏水性的，而且与纳米颗粒的疏水性部分联合。一种联合方法是电荷-电荷相互作用，要联合至颗粒的模块具有一种电荷，而纳米颗粒在联合之前具有相反的电荷，例如纳米颗粒上有正电荷而要联合的模块上有负电荷。例如，肽可以用多种带正电荷或负电荷的模块来表达，例如天冬氨酸和/或谷氨酸(电荷状态通常指体内pH条件)。抗原的例子包括肿瘤抗原或传染病抗原，例如胱天蛋白酶-8、MAGE-1、酪氨酸酶、HER-2/neu、或MUC-1。危险信号的例子有炎性细胞因子或Toll样受体的配体。纳米颗粒可以不含特异性结合细胞的靶向配体。
在一些实施方案中，纳米颗粒是使用合成聚合物制备的，所述合成聚合物包含至少一种疏水性嵌段和至少一种亲水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物在水溶液中自组装成所述颗粒，其中官能基包含羟基和/或氢硫基。或者，纳米颗粒可包含核心和亲水性壳冠，其中所述核心由聚(硫化丙烯)构成，而所述亲水性壳冠由所述合成聚合物构成，所述合成聚合物包含聚乙二醇，且其中所述官能基包含亲核体。
一个实施方式是供导入患者中的免疫刺激性组合物，其包含合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于大约70nm的平均粒径，且包含抗原，所述组合物在患者中诱导针对所述抗原的免疫应答，不诱导TNF-α应答且不诱导IL-6应答。此类纳米颗粒可具有本文所述特征，例如所述纳米颗粒不含特异性结合细胞的靶向受体，和/或所述抗原是肿瘤或传染病的抗原。
纳米颗粒还可包含免疫抑制剂。当抗原接种在诱导耐受的DC激活完全缺失下进行时，此特征对于诱导耐受是有利的。如此一来，纳米颗粒不仅运送抗原，而且对受影响的树突细胞产生高度特异且因而高度有效的免疫抑制。
另一个实施方式涉及供导入哺乳动物中的医药组合物，其包含合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于约70nm的平均粒径，且在纳米颗粒外部包含编码抗原的核酸和具有能激活哺乳动物补体的官能基的合成聚合物。
一个实施方式是转染患者的淋巴结中树突细胞的组合物或方法，包括在淋巴结外部的位置上对患者施用包含编码抗原的核酸的合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于大约70nm的平均粒径，并具有适于所述颗粒运动至患者的淋巴结、以被树突细胞摄取、用所述核酸转染所述树突细胞的表面化学，所述表面化学包含与能激活补体的亲水性合成聚合物联合的多个亲核性基团。转染的效率可以是例如淋巴结中至少大约30％的树突细胞被核酸转染。多种纳米颗粒实施方案可用于此情况，例如其中所述纳米颗粒包含聚(硫化丙烯)的核心，所述合成亲水性聚合物包含聚乙二醇，而所述官能基包含羟基和/或氢硫基，或其中所述纳米颗粒包含核心和包含所述亲水性聚合物和所述亲核性基团的亲水性壳冠，其中所述核心由聚(硫化丙烯)构成，或其中所述纳米颗粒包含微团。
另一个实施方式是方法或供导入患者的组合物，其包含缀合至抗原的分支聚合物，其中所述分支聚合物包含至少四个是亲核性基团且能在导入患者后激活补体的末端，且其中所述组合物能刺激患者的免疫系统响应所述抗原。例如，所述分支聚合物可包含聚乙二醇，而所述亲核性基团可以是羟基或氢硫基。
一个实施方式是刺激患者淋巴结中树突细胞的组合物或方法，其中包括在淋巴结外部的位置对患者施用能激活补体的分支聚合物，其中所述聚合物缀合至抗原且包含至少四个是亲核性基团的末端，所述聚合物被运输至患者的淋巴结，供树突细胞摄取，以呈递所述抗原。
一个实施方式是刺激患者淋巴结中树突细胞的组合物或方法，其中包括在淋巴结外部位置对患者施用能激活补体且包含抗原的合成分支聚合物集合，其中所述聚合物还包含至少四个包含亲核性基团的末端，以供淋巴结中的细胞摄取并将所述抗原释放至所述树突细胞，表面化学包含与合成亲水性聚合物联合的多个亲核性基团。
一个实施方式是运送医药疫苗的组合物或方法，其中包括提供纳米颗粒的集合。例如，转染患者淋巴结中树突细胞的方法包括在轻度压力下对患者的外部粘膜表面施用包含抗原的合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于大约70nm的平均粒且具有适于所述颗粒运动至患者淋巴结以供树突细胞摄取、以用所述核酸转染所述树突细胞的表面化学，所述表面化学包含与能激活补体的合成亲水性聚合物联合的多个亲核性基团。所述粘膜表面的一个例子是鼻粘膜。
附图简述
图1的显微照片组图显示纳米颗粒摄入初始淋巴的情况的比较，这是在输注了直径(A)20nm，(B)45nm，和(C)100nm、且加载了荧光的PPS纳米颗粒90分钟后，小鼠尾部皮肤的毛细淋巴管网络的荧光显微淋巴管造影。拍摄这些图像时的曝光是一样。在对应于20nm颗粒的图像中，六边形的淋巴网络清晰可见。标尺＝100μm。
图2的显微照片组图显示了纳米颗粒在淋巴结的滞留，这是将20nm、45nm、和100nm的PPS纳米颗粒注射入小鼠尾部后来自引流淋巴结的切片。在注射后24小时、72小时、96小时、和120小时取出淋巴结。在所有时间点都明显可见20nm和45nm的纳米颗粒，但是在淋巴结中没有看到100nm颗粒。标尺＝200μm。
图3的显微照片组图显示纳米颗粒在淋巴结内的定位，这是注射20nmPPS纳米颗粒后96小时之时的一系列淋巴结切片。免疫细胞用抗(A)CD3e(T细胞)、(B)CD45R(B细胞)、和(C)CD68(巨噬细胞(Mac)和树突细胞(DC))的抗体识别，在图中标出。纳米颗粒显然不存在于T细胞和B细胞区，但明显与巨噬细胞和DC共定位。标尺＝100μm。(D)内皮标志物CD31表明纳米颗粒(绿色)在淋巴结窦结构背景下的分布。标尺＝100μm。
图4的显微照片组图显示了巨噬细胞和树突细胞(DC)对纳米颗粒的内在化，这是注射20nm PPS纳米颗粒后96小时之时的淋巴结切片共焦图像。(A)巨噬细胞和DC二者都表达CD68，其染色揭示了这些细胞对纳米颗粒的内在化。(B)Dec-205仅见于DC表面，其染色表明DC也内吞纳米颗粒。标尺＝20μm。
图5的柱形图显示了细胞摄取纳米颗粒(NP)的量。使用流式细胞术分析来测定内吞NP(FITC+)的淋巴结APC(MHCII+)和DC(CDl Ic+)级分。(A)在注射后24小时之时，淋巴结中超过38％的APC和超过50％的DC内吞20nm纳米颗粒。这两种细胞群对45nm纳米颗粒的摄取量减少，所有APC中只有约10％摄取100nm纳米颗粒。(B)在体外用纳米颗粒脉冲APC和DC 24小时后，几乎所有的APC和DC都内吞了所有3种大小的纳米颗粒。如此以来，由于所有3种纳米颗粒大小在体外是同等摄取的，因此体内注射后看到的差异最有可能是由于注射后纳米颗粒被摄入淋巴时的差异。这些结果还表明，纳米颗粒摄取发生在淋巴结中，而不是被外周部位的细胞摄入再移至淋巴结。
图6的(A)显微照片组图和(B)柱形图都显示了巨噬细胞和树突细胞(DC)的存在随时间的增多。如图所示，淋巴结在注射20nm PPS纳米颗粒(NP)后24小时之时和96小时之时切片，对巨噬细胞(Mac)和DC(CD68+细胞)以及细胞核染色。Mac和DC共定位随时间增多。标尺＝100μm。(B)用流式细胞术分析来测定带有纳米颗粒(NP+)的淋巴结(LN)细胞级分，其为注射20nm纳米颗粒后24小时之时和96小时之时的APC(MHCII+)和DC(CD11c+)。与24小时之时相比，96小时之时带有纳米颗粒的APC和DC细胞级分显著增多。另外，24小时之时，带有纳米颗粒的几乎所有APC看起来都是DC。
图7显示内吞纳米颗粒(NP)后DC的成熟标志物CD86和CD80的表达增多。(A)注射PBS或20nm颗粒后24小时之时DC(CD11c+)的CD86表达的典型直方图。在带有纳米颗粒的DC(CD11c+ FITC+)中观察到CD86表达明显移位。(B)内吞纳米颗粒化后阳性表达CD86和CD80的细胞级分明显增加。另外还显示，CD86和CD80表达在注射后96小时之时仍保持在较高水平。
图8的数据显示，PLURONIC F-127经过修饰使得末端OH基团转变成OCH3基团(A)。(B)经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒(OH-NP)与血清一起温育，比甲氧基封端的PLURONIC稳定的纳米颗粒(CH3-NP)，引起更强的补体激活效应，这通过测定血清+PBS中的C3a倍增来确定。
图9显示纳米颗粒表面化学特性控制了(dictate)DC的成熟反应。25nm、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒(OH-NP)使DC成熟的程度，比25nm、甲氧基封端的PLURONIC稳定的纳米颗粒(CH3-NP)和20nm羧基化聚苯乙烯(polystyrene)纳米珠(COOH-NS)大得多。
图10显示纳米颗粒大小控制了DC的成熟反应。25nm、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒(OH-NP)诱导了DC的成熟，而100nm、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒不然。
图11显示了修饰纳米颗粒的化学方案及这种纳米颗粒在淋巴结中的显微照片，其中(A)PLURONIC用乙烯砜(vinylsulfone)官能化(PL-VS)。然后可以将乙烯砜附着在卵清蛋白(OVA)的游离半胱氨酸上。再然后将PL-VS-OVA与PLURONIC混合，按常规合成25nm纳米颗粒。(B)25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定的纳米颗粒将OVA运送至淋巴结。
图12显示在注射后24小时之时，25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性PPS纳米颗粒(OH-OVA-NP)以与OVA加LPS相似的水平诱导DC成熟。
图13显示了在过继性(adoptive)转移来自OT-II小鼠的T细胞后，25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒(OH-OVA-NP)以与OVA加LPS相同的水平引起CD4 T细胞增殖。
图14显示25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的激活补体性纳米颗粒(OH-OVA-NP)引起CD8T细胞记忆，这是通过IFN-γ斑点/淋巴结细胞测量的。*，P＜0.05。
图15显示第21天的OVA抗体滴度。25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒(OH-OVA-NP)以与OVA加LPS相似的水平引起OVA抗体滴度。25nm、偶联OVA的、以甲氧基为末端的PLURONIC稳定的PPS纳米颗粒和100nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒(OH-OVA-100)引起较低的抗体滴度。25nm、偶联OVA的、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的(OH-OVA-25)在C3-/-小鼠中引起较低的抗体滴度。
图16a-16c描绘了多幅图，显示了补体激活性纳米颗粒诱导细胞免疫及Th1偏爱性应答。小图a是一幅柱形图，展示了与纳米颗粒和对照一起温育24小时后骨髓衍生树突细胞(BMDC)的白介素12p40(IL-12p40)生成。通过ELISA对细胞培养基测量IL-12p40，倍数升高是血清的。小图b是一幅柱形图，展示了BMDC与纳米颗粒和对照一起温育24小时后的MHC I表达(通过流式细胞术测量)。小图c是一幅柱形图，显示了用于测定CD8T细胞记忆的再刺激测定法的结果。小鼠接受抗原和纳米颗粒配制剂的各种注射，并在注射后21天分离引流淋巴结。该图显示了暴露于MHC-I OVA抗原性肽后的生成干扰素-γ(IFN-g)的CD8 T细胞，而且展现了用OH-OVA-25-NP处理后的记忆，但是CH3O-OVA-25-NP不然。结果是来自每组中三只小鼠的均值，误差条对应于SEM。*，P＜.05。
图17a-17b显示了不包括促炎性细胞因子的补体激活性纳米颗粒的结果。小图a和b是柱形图，分别展示了与纳米颗粒和对照一起温育24小时后骨髓衍生树突细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF)和白介素-6(IL-6)生成。通过ELISA对细胞培养基测量细胞因子。N.D.(检测不到)。
图18a-18b显示了体外羟基化纳米颗粒IL-12p40分泌和体内抗OVA滴度的分子测量。小图a是一幅柱形图，显示了有TLR4的小鼠中暴露于血清的羟基化纳米颗粒的高IL-12p40分泌，与无TLR4的小鼠的低分泌比较。小图b是通过将羟基化纳米颗粒导入有TLR4(野生型)或无TLR4(TLR4-/-)的小鼠中诱导的针对卵清蛋白(OVA)的抗体的对数散点图。无TLR4的小鼠具有低得多的针对OVA的抗体水平，指示TLR4是羟基化纳米颗粒诱导抗体的机制的一种重要介导物。
图19显示了具有氢硫基表面的羟基和甲氧基纳米颗粒(分别为OH-SH-和CH3-SH-NP)比没有氢硫基的纳米颗粒显著更多地激活补体。纳米颗粒诱导的补体激活，如经由与纳米颗粒一起温育后人血清中的C3a存在测量的，展现出OH-SH-NP和CH3-SH-NP比没有氢硫基的纳米颗粒(OH-和CH3O-NP)高得多。结果相对于与PBS一起温育的血清对照标准化。数值是三次独立实验的均值；误差条对应于均值的标准误差，SEM。
图20a-20b显示了具有羟基和氢硫基表面的纳米颗粒(OH-SH-NP)激活树突细胞。小图a，流式细胞术直方图显示了暴露于纳米颗粒和对照后骨髓衍生树突细胞(BMDC)上的CD80，一种成熟标志物的表达。OH-SH-NP及血清(补体)诱导树突细胞成熟，而无氢硫基的羟基纳米颗粒(OH-NP)和血清则不然。小图b，柱形图展示了与纳米颗粒和对照一起温育24小时后BMDC的白介素12p40(IL-12p40)生成。通过ELISA对细胞培养基测量IL-12p40，倍数升高是血清的。OH-SH-NP及血清引起高水平的IL-12p40，而OH-NP及血清则不然。
图21是一幅流式细胞术直方图，显示了加载有咪喹莫特(imiquimod)的PEG-PPS纳米颗粒展现出骨髓衍生树突细胞(BMDC)的强成熟。成熟标志物CD86的流式细胞术直方图显示了加载有咪喹莫特的PEG-PPS微团使BMDC成熟，接近有力的激活剂LPS。
图22描绘了一种合成路径，用于生成PEG-PPS嵌段共聚物两亲物，自其可形成聚合物微团。显示了在PEG链的末端上获得-OH基团的一种路径。在没有末端加帽的情况中，获得末端-SH，而在有末端加帽的情况中，可封闭末端-SH基团。
图23描绘了一种合成路径，用于生成PEG-PPS嵌段共聚物两亲物，自其可形成聚合物微团。显示了获得在PEG链的末端上有-CH3基团，即在PEG链的末端上缺少-OH基团的聚合物的一种路径。正如图22中，末端-SH链可保留或封闭。
图24a描绘了一种合成途径，用于生成含胺的PEG-PPS嵌段共聚物两亲物，自其可形成聚合物微团，对该聚合物微团可偶联抗原。显示了PEG链的末端上有-CH3基团的聚合物的情况。
图24b描绘了一种用于生成例如在PEG链的末端上有-OH基团的聚合物的合成路径。
图24c描绘了一种合成路径，由此可活化图24a和24b中显示的聚合物的末端以形成末端胺，为偶联至抗原提供路径。
图25a描绘了一种路径，用于微团表面和纳米颗粒上聚合物链末端的吡啶基二硫化物活化，并因而提供一种容易的手段来偶联拥有游离半胱氨酸的或改造成拥有游离半胱氨酸残基的抗原。
图25b描绘了一种用于保护氢硫基的路径，作为中间缀合步骤。
图25c描绘了一种用于使游离氢硫基反应以将模块结合至纳米颗粒的缀合方案。注意，使用NSVYWFFVWL(SEQ ID NO：1)作为例子。
图26描绘了一种路径，用于抗原上的半胱氨酸残基或其它氢硫基残基的吡啶基二硫化物活化，导致注射和运输至淋巴结，继以被驻留淋巴结的DC摄取后SIINFEKL(SEQ ID NO：2)固定化以及MCHI中的适宜展示。
图27描绘了一种使N端α-胺衍生化从而能例如经吡啶基二硫化物或乙烯砜模块偶联至纳米颗粒表面的合成方案。“Flic”代表一种特征性蛋白质，而“NP”代表一种特征性纳米颗粒表面。
图28是一幅柱形图，显示了上文所述聚合物微团如何暴露或不暴露于血清，然后暴露于体外BMDC，此后通过流式细胞术测量CD86来测定DC激活。显示了与交联核心PPS纳米颗粒(携带表面HO-和HS-基团)(NPHS040)及与CpG寡核苷酸的激活的比较性结果。PEG-PPS聚合物微团实施显示出具有完全活性。
图29描绘了危险信号(这里以CpG DNA为例)如何也能缀合至纳米颗粒和微团表面。
图30描绘了分支的8臂PEG，其激活体内DC。流式细胞术直方图显示了皮内注射8臂PEG、25nm带氢硫基的多羟基化NP(OH-SH-NP)任一后24小时自小鼠淋巴结分离的CD11c+DC。8臂PEG诱导DC成熟标志物CD86、CD80、和CD40上调，与OH-SH-NP相似。还显示了来自接受阴性和阳性对照，分别为PBS和LPS注射的小鼠的直方图；证明了8臂的激活与LPS的激活也相当。
图31描绘了一种合成方案，由此形成支化PEG，其含有HO-端基，供补体激活之用，以及供经吡啶基二硫化物位点上的二硫化物交换偶联抗原的位点之用。
图32a显示了一种形成PEG-PPS-PEI的合成方案，PEG-PPS-PEI形成微团，微团还能与DNA形成复合物。
图32b显示了用质粒DNA复合物及自PEG-PPS混合PEG-PPS-PEI形成的混合微团进行的实验的结果，产生约30nm直径的含DNA的纳米颗粒，其高度转染驻留淋巴结的细胞；转染了T细胞、B细胞、和DC。
图33显示了掺入纳米颗粒中的免疫抑制性分子，其可用于阻止暴露于甚至很有力的DC激活信号如LPS后的DC激活。
图34A显示了封装钙黄绿素的PEG-ss-PPS囊泡的透射电子显微照片，作为肽或蛋白质抗原的一个模型。
图34b显示了图34A的钙黄绿素被有效摄取入细胞胞质中，随它在囊泡破裂后去淬灭而测量钙黄绿素荧光。
图35，与没有压力下的应用(B)相比，用轻度压力使用钝头套管将30nmPPS核心纳米颗粒导入至啮齿类动物的舌下组织，组织穿透很好(A)。
发明详述
发明介绍
具有合适特性的纳米颗粒可用于将治疗性物质特异性靶向抗原呈递细胞(APC)，包括淋巴结中的树突细胞(DC)。本文中展现了小鼠中应答皮内注射时纳米颗粒大小对淋巴摄取、淋巴结保持(retention)及由淋巴结APC和DC进行的内在化的影响(小鼠的淋巴毛细管大小与人类似-10-80μm-但它们在这两个物种内部的差别较大[20，42])。尽管可以使用多种大小的纳米颗粒，但是直径大约20nm的纳米颗粒最易于摄取，而且在淋巴结中保持的时间(可长达120小时)比先前关于其它颗粒所报道的长[31-34，36]。
某些纳米颗粒表面化学性质出人意料的展现出能激活补体和牵涉toll样受体TLR4的由Th1介导的免疫学应答(实施例18和20)。这些纳米颗粒引起出人意料有效且有力的免疫系统激活，而且可用于制备纳米颗粒疫苗。纳米颗粒能起佐剂的作用，其中将抗原导入纳米颗粒中或上，或与纳米颗粒一起在混合物中；下文详细讨论了别的选项。纳米颗粒也可以制备成具有出人意料低的毒性，其中纳米颗粒基本上不引起肿瘤坏死因子α(TNF-α)或白介素-6(IL-6)生成(实施例19)。
通过将羟基和氢硫基基团组合入纳米颗粒中实现了出人意料的协同(实施例21)。此组合甚至比仅有羟基的制备物更有效。因此纳米颗粒的某些实施方式包括氢硫基和羟基的组合。
在淋巴结内，显示出激活补体性纳米颗粒无需靶向配体就可受到驻留的(resident)APC(MHC II+细胞，包括DC和一些巨噬细胞)及其它非抗原呈递巨噬细胞(MHC II-)的有效内在化。驻留淋巴结的DC的较大级分(可多达50％)内在化20nm的激活补体性纳米颗粒，而且数目随时间而增多。发现了在激活补体性纳米颗粒受到内在化后发生DC成熟。
大小和表面化学同样重要：一些激活补体性纳米颗粒(例如100nm纳米颗粒)其大小致使不能以给定效率进入淋巴，这些颗粒作为佐剂不如具有相同化学性质的相对较小的纳米颗粒(例如25nm)有效，后者具有更高的进入效率。一些激活补体性纳米颗粒(例如有甲氧基表面基团的25nm纳米颗粒)，其大小易于进入淋巴，它们作为佐剂不如具有不能激活补体的表面化学性质的相同大小的纳米颗粒(例如有羟基表面基团的25nm纳米颗粒)有效。注射抗原偶联的有甲氧基表面基团的25nm纳米颗粒的C3-/-动物中免疫应答不良证明了补体激活在该机制中发挥关键作用。因此，较小的(例如20-45nm)羟基化纳米颗粒提供了将免疫治疗剂运送至淋巴结中DC和其它APC的策略。一般而言，纳米颗粒大小指颗粒的最大尺度，例如球体的直径或穿过非球体颗粒例如杆或椭球体可追踪的最长长度。
某些表面化学性质可用于激活APC，包括DC，然后诱导T细胞依赖性获得性免疫应答。有些材料表面，包括羟基化的表面[117]或通过PLURONIC稳定化获得的羟基化表面[118]可激活补体级联反应。可将材料表面偶联至某些羟基化分子和生物分子以激活补体。例如，技术人员可以应用本文所列技术来实现偶联。此外，植入物、医疗装置、或纳米颗粒以外的其它载体可以接受一层本文所述激活补体性聚合物，或者可将聚合物或羟基直接导入到此类材料上。在佐剂研发中，科学家所用的常规方法经由Toll样受体的外源激活剂，诸如脂多糖(LPS)来激活细胞，诸如DC[119-121]。但是已经发现了某些纳米颗粒表面化学性质可激活先天免疫的一个不同方面，即补体级联：本文中的详细实施例证明了羟基化和/或纳米颗粒可激活补体级联的内源成分，而且这可以继而激活APC(包括DC)和诱导T细胞依赖性体液免疫和细胞免疫。其它实施方式是用替代方案来呈递羟基的纳米颗粒或有氢硫基或氢硫基和羟基二者的纳米颗粒。在不采用补体机制的、以纳米颗粒作为佐剂的其它工作中，聚合物纳米颗粒大小决定了DC受到靶向和激活的程度：对于羧基化聚苯乙烯(polystyrene)纳米颗粒，中间(45nm)大小的纳米颗粒受到DC的摄取并激活DC，但是更小的纳米颗粒(20nm)不然[116]。然而，对于本文所述纳米颗粒，补体可以受到有力激活，而且这提供了激活DC和诱导T细胞依赖性体液和细胞方面的获得性免疫应答的有力信号。
已知补体激活增强获得性免疫应答，尤其是B细胞免疫。先前的工作证明了补体蛋白质C3b和C3d可用作分子佐剂来增强B细胞依赖性体液免疫。给小鼠免疫C3b或C3d与模型抗原的融合物，证实了获得性免疫B细胞应答与单独的游离抗原相比有显著增加[134，135]。C3b和C3d佐剂的作用机制可能是经由直接结合C3d受体(CD21/35)，后者结合有CD19，一种已知的B细胞激活作用放大器。然而，已经发现CD21/35并非总是这种B细胞应答所必需的[136]。关于C3b-和C3d-抗原融合物确定的是它们对于体液免疫的佐剂能力是经由与B细胞的直接相互作用[137]。这不同于T细胞依赖性体液免疫，后者发生于本文所述的抗原受到DC摄取，DC成熟，DC加工抗原并经MHC II呈递抗原至CD4T细胞，CD4T细胞呈递抗原至B细胞，以及最后B细胞生成抗体。虽然已经发现补体牵涉T细胞依赖性免疫，但是其机制尚无记载[138]。此外，先前没有提出补体激活可用作T细胞依赖性免疫的分子佐剂。
然而，本文中的系统描述了补体激活如何可用作T细胞依赖性免疫的分子佐剂。此外，有些实施方式包括能经由纳米颗粒表面化学而激活补体的纳米颗粒。具体而言，例如，结果显示了羟基化的和/或氢硫基化的纳米颗粒诱导DC成熟，并且首次证明了经由羟基化和/或氢硫基化表面的补体激活可用作危险信号来诱导DC成熟。本文还描述了经由羟基化和/或氢硫基化的纳米颗粒的补体激活用作佐剂来诱导DC介导的T细胞依赖性体液免疫和细胞免疫。
免疫系统靶向
抗原呈递细胞(APC)是高度有效的吞噬细胞，其利用MHC I类、II类和其它共刺激分子(即CD86和CD80)来刺激幼稚T细胞和诱导细胞介导的免疫。APC，其包括一些巨噬细胞和更有力的树突细胞(DC)，存在于外周组织中，在那里它们起哨兵的作用，将外来抗原内在化并加工，随后发生成熟并迁移至淋巴结，以呈递抗原至T细胞[1-3]。根据APC和DC在获得性免疫中发挥的至关重要的作用，实施了各种实验以将免疫调控剂，诸如DNA、蛋白质、和多肽靶向这些细胞[4-14]。术语多肽指两个或多个氨基酸连在一起，包括蛋白质。
基于聚合物的运送系统和基于脂质体的运送系统主要致力于将蛋白质和DNA运送至外周DC，在那里它们首先内在化药物媒介，然后在约1-2天内迁移至淋巴结以激活T细胞[9，12，13]。直到最近，仍然不清楚未成熟但能够摄取抗原的DC是否存在于淋巴结中。然而，最近的研究确立了淋巴结中驻留的DC的实质性级分在表型上是未成熟的且能够内在化那里的抗原和颗粒[15，16]。如此，如本文所述，驻留的淋巴结APC也可用作免疫治疗性药物或其它治疗剂的靶物。靶向淋巴结APC或DC以而不是外周位点中的那些的潜在好处在于过早的(premature)抗原呈递(即DC在迁移到淋巴结前就在其表面上表达抗原)常常可导致免疫细胞耐受[13，17，18]；因此，运送至淋巴结APC可潜在避免这个问题。另外，其它DC靶向研究使用偶联的靶向配体，诸如抗Dec-205和抗CD11c来提高DC特异性[4，5，8，9，12，19]。
然而，通常不被领会的是，可以有效的利用DC生来就是高度吞噬性且以高浓度存在于淋巴结中的事实。因而，已经开发了特异性靶向淋巴结中这些细胞的材料和方法，如本文所述，包括不使用靶向配体时的靶向。靶向配体指能特异性结合至细胞上特定化学基团(例如细胞表面受体或细胞表面蛋白质)的化学基团。如此，有些实施方案可以是基于大小和其它物理特性的靶向，而且是没有外源多肽、没有外源配体、没有外源核酸、没有抗体或其片段、或者没有关于受体、细胞表面分子、胞外基质分子、细胞表面抗原、细胞标志物分子、或多糖任一项的外源配体时的靶向。
为了靶向淋巴结中的APC(包括DC)，本文中证明了设计可以被容易的摄取入淋巴管并保留在引流淋巴结中的运送媒介是有用的。运送媒介指能运送治疗剂(例如抗原或免疫抑制剂)的药剂，例如颗粒或微团。淋巴系统的主要作用是摄取来自间质间隙的流体和颗粒，其是微循环的小但重要的成分[20-23]。
使用脂质体和聚合物颗粒来调查淋巴系统的其它体内淋巴靶向实验研究指出了，颗粒大小可以是从间质间隙摄取淋巴的一个因素[21，24-29]。大于170nm的脂质体一般显示出较差的淋巴摄取，而保留在注射部位，而在40-70nm范围中的颗粒显示出显著的进入淋巴管的摄取[25]。
一项使用羧基化聚苯乙烯颗粒的此类研究教授了只有在40-50nm窄范围中的颗粒实际上是有用的，因为这种大小是DC所识别的危险信号；因此，DC在真皮部位(dermal site)而非在淋巴结中受到激活[116]。这项聚苯乙烯珠研究显示了这种珠在淋巴结中的积累情况，中间大小的(40nm)多于更小的(20nm)和更大的(＞100nm)大小，而且教授了40-50nm是珠应当采用的大小。更具体的说，这项研究显示了发现很小的颗粒(20nm)和更大的颗粒(100nm)在对DC标志物阳性(根据DC抗原DEC205所示)的细胞中比40nm颗粒显著更少的积累[116]。作者教授了40nm聚苯乙烯珠引起真皮部位中DC激活和迁移至淋巴结；因此，40nm珠不能靶向淋巴结驻留的DC。
而且，该项聚苯乙烯珠研究教授了珠大小是DC的危险信号，因为DC进化成能识别病毒大小范围。因此，珠大小会控制成功的DC靶向，正确大小的珠受到外周中DC的识别，并引起DC的激活。这种教授与本文所述更小纳米颗粒(小于大约40nm或大约35nm或大约25nm)用于DC激活的成功使用形成尖锐对比。这种教授还与本文中显示表面化学性质是危险信号的结果(例如像纳米颗粒，其利用羟基和/或氢硫基化表面化学来激活补体作为危险信号)形成对比。此外，本文中的结果将颗粒大小与淋巴结靶向能力而非DC大小识别联系起来。例如，25nm的PLURONIC稳定化的激活补体性纳米颗粒在体内注射后激活DC和获得性T细胞免疫方面优于100nm的PLURONIC稳定化的激活补体性纳米颗粒。
使用羧基化聚苯乙烯珠作为实验模型系统，至少部分是因为它们便利的合成和乳液聚合特征产生了窄且受控制的大小分布[116]。聚苯乙烯珠用作治疗性或预防性系统有潜在的缺点。例如，无一生物学途径能从身体中降解和消除此类颗粒。相反，本文所述可生物降解系统会在应答体内环境时容易且有效的降解成可溶性聚合物，例如就像PPS纳米颗粒在内吞和加工后遭遇的氧化性条件下降解一样。虽然纳米颗粒的降解可能是有益的，但是这并非必然是用作佐剂的必要条件。
颗粒表面与间质之间的相互作用可能是在淋巴摄取中发挥作用的另一个因素[30]。通过给脂质体和颗粒包被亲水层诸如聚(乙二醇)(PEG)及其共聚物诸如PLURONICS(包括聚(乙二醇)-b1-聚(丙二醇)-b1-聚(乙二醇)的共聚物)实现的空间稳定化可以降低与间质蛋白质的非特异性相互作用，正如皮下注射后淋巴摄取得到改善所证明的[21，27，31-35]。所有这些事实均指向颗粒的物理特性在淋巴摄取方面的重要性。
然而，虽然较小的颗粒更易于摄取，但是它们也更易于离开淋巴结；因此，实现有效的淋巴摄取和淋巴结保持二者都是重要的。因而，某些纳米颗粒实施方案以解决摄取和保持二者为特色，正如根据本文所列实施例和实施方案显而易见的。就纳米颗粒的大小而言，例如，对淋巴系统的调查指出在注射后12小时以后，所注射的70nm脂质体中只有1-2％保留在淋巴结中[30]，而且较大脂质体(＞70nm)的淋巴结保持比较小脂质体更有效[24，29]。这显然是部分由于淋巴结巨噬细胞吞噬较大颗粒更有效的事实。虽然通常假设给脂质体包被空间保护剂如PEG应降低巨噬细胞的吞噬，但是已经显示了此类包被不显著影响淋巴结保持[36]。通常还假设淋巴结中所吞噬的颗粒主要是由巨噬细胞吞噬的[21，27，29，30，32，36，37]。使用羧基化聚苯乙烯纳米颗粒，发现了在体内DC对20nm纳米颗粒的摄取比40nm纳米颗粒少得多[116]。因此，在运送药物供巨噬细胞摄取之外，将药物运送至淋巴结供其它APC(包括DC)摄取是有利的。如下文所示，本发明颗粒的某些实施方案事实上是由APC和/或DC摄取的，甚至在至少小至20nm的较小大小的情况下也是。
先前的研究提出了在抗原摄取后，强有力的生物学“危险信号”诸如炎性细胞因子(即CD40配体)是DC成熟和随后诱导细胞介导的免疫所必需的[5，12，38]。然而超越(forego)此类信号可能是有利的。事实上，在有些实施方案中，是纳米颗粒自身用作成熟的刺激物，以避免使用常规生物学生物分子“危险信号”，例如有些多肽、抗体、核酸序列。这些结果在体内纳米颗粒内在化后观察到的DC成熟应答中是明显的。
纳米颗粒配制剂
如本文所记载的，纳米颗粒的大小与其在淋巴结中的摄取和保持有关。本文记载了纳米颗粒的淋巴摄取、淋巴结保持、及淋巴结和那里的细胞群内的定位。使用常规方法的一项挑战是获得有效的淋巴摄取和淋巴结保持二者，因为纳米颗粒的特性，诸如大小和表面特征，可具有抵触的效应。一般而言，较小的颗粒具有比较大的颗粒更好的淋巴摄取但更低的淋巴结保持。大小为大约5nm到大约100nm直径的纳米颗粒是优选的；技术人员将立即领会，本发明涵盖明确述及范围内的所有范围和数值，例如20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、或80nm。纳米颗粒可以制成平均直径大约5nm到大约100nm的颗粒的集合；技术人员将立即领会，本发明涵盖明确述及范围内的所有范围和数值，例如大约10nm到大约70nm。此类颗粒集合的大小分布可以是受控的，使得围绕颗粒集合平均直径的变异系数(标准偏差除以平均颗粒大小)可以是小于大约50nm、大约35nm、大约20nm、大约10nm、或大约5nm[39]；技术人员将立即领会，本发明涵盖明确述及范围内的所有范围和数值。
物理特性也与纳米颗粒被摄入淋巴结中并被保持后的有用性有关。这些包括机械特性，诸如刚性或韧性(rubberiness)。有些实施方案基于强韧的核心，例如聚(硫化丙烯)(PPS)核心，其具有覆盖层，例如亲水性覆盖层，就像在PEG中，像在最近为系统性(但非靶向或免疫)运送而开发和表征的PPS-PEG系统中一样[39，40]。强韧的核心与实质上刚硬的核心相反，后者像在聚苯乙烯或金属纳米颗粒系统中一样。术语强韧(rubbery)指在天然或合成橡胶以外的有弹性的某些材料，术语强韧是聚合物领域的技术人员所熟悉的。例如，可以使用交联PPS来形成疏水性强韧核心。PPS是在氧化性条件下降解成聚亚砜和最终降解成聚砜的一种聚合物[41]，如此从疏水性橡胶转变成亲水性、水溶性聚合物[39]。其它硫化聚合物可以适应后使用，术语硫化聚合物指单体单元的主链中有硫的聚合物。可以使用的其它强韧聚合物(rubbery polymer)有在水化条件下的玻璃转变温度低于大约37℃的聚酯。与亲水性覆盖层一起使用疏水性核心可能是有利的，因为核心和覆盖层趋向于不混合，使得覆盖层趋向于空间伸展而远离核心。核心指在其上有一个层的颗粒。层指覆盖至少部分核心的材料。层可以是吸附的或共价结合的。颗粒或核心可以是实心的或空心的。强韧疏水性核心优于刚性疏水性核心，诸如晶体或玻璃体(像聚苯乙烯的情况)核心，因为具有强韧疏水性核心的颗粒可以携带更大载荷的疏水性药物。
另一个物理特性是表面亲水性。亲水性材料在未交联时在水中具有至少1克每升的溶解度。将颗粒用亲水性聚合物进行空间稳定化可以通过降低非特异性相互作用而改善来自间质的摄取；然而，颗粒的隐秘性(stealth nature)升高也可以降低淋巴结中吞噬细胞的内在化。但这就要求平衡这些竞争性特征，本申请记载了用于有效淋巴运送至淋巴结中DC和其它APC的纳米颗粒的产生。如此，有些实施方案包括亲水性成分，例如一层亲水性材料。合适的亲水性材料的例子有一种或多种聚氧化烯、聚氧化乙烯、聚糖、聚丙烯酸、和聚醚。可以调节一层中聚合物的分子量以在体内提供有用的空间位阻程度，例如大约1,000到大约100,000或甚至更大；技术人员将立即领会，本发明涵盖明确述及范围内的所有范围和数值，例如介于10,000和50,000之间。例子包括具有亲水性表面的颗粒，所述亲水性表面是衍生自PLURONIC的PEG，PLURONIC在乳液合成过程中用作稳定剂。
纳米颗粒可以掺入供进一步反应的官能基。供进一步反应的官能基包括亲电体或亲核体；这些官能基便于与其它分子起反应。亲核体的例子有伯胺基、氢硫基(thiol)和羟基。亲电体的例子有琥珀酰亚氨基酯基、醛基、异氰酸根和马来酰亚胺基。例如，使用PPS-PLURONIC纳米颗粒作为例子，然后如实施例1所述合成颗粒，只是2％的PLURONIC用OVA/OVA257-264/OVA323-339衍生化PLURONIC替换。使用总量1.5％的PLURONIC。反应时间缩短至2小时，并以与起始物-硫醇1∶1等摩尔比例添加碱来降低纳米颗粒合成过程中蛋白质或肽在碱性条件下暴露的机会。此方案只是用于PEG官能化的一个例示性方法；根据所偶联的蛋白质或肽，可以利用数种其它方法[111]。
纳米颗粒还可以掺入供补体激活的官能基或基序。一种优选的官能基是羟基，它对于激活补体特别有效，正如本文所记载的。其它亲核官能基可以与C3中的硫酯起反应。本文中证明了羟基化纳米颗粒表面在靶向淋巴结中的APC(包括DC)中特别有用。在本文所例示的PPS纳米颗粒的情况中，羟基化是通过用以羟基为末端的PLURONIC稳定化获得的。在将这些羟基转变成甲氧基以封闭羟基时，纳米颗粒不能很好的起到佐剂的功能。在C3-/-小鼠中测试羟基化纳米颗粒时，它们的佐剂效应大大降低。这些结果与本文实施例C3激活中所述的测量结果一起证明了用激活补体性纳米颗粒靶向APC(包括DC)是特别有用的。因而，在有些实施方案中，纳米颗粒仅依赖于OH来激活补体且排除以下一种或多种：pH 7.0-7.4的阳离子、胺基、伯胺基、仲胺基、pH 7.0-7.4的阴离子、氢硫基、pH 7.0-7.4的两性离子；或者，此类基团存在于纳米颗粒上，但是是不含一种或多种此类基团的纳米颗粒上的一层聚合物。或者，纳米颗粒和/或层没有能在pH 7.0到7.4有效形成离子的基团，除了OH。
官能基可以根据可及性的需要加载到颗粒上。一种位置是作为核心聚合物或作为核心上的层的聚合物或以其它方式与颗粒在一起的聚合物的侧基团或末端。例如，本文中所包括的例子描述了用PEG稳定纳米颗粒，其可以容易的官能化，以便供特异性细胞靶向或蛋白质和肽药物运送之用。
可生物降解聚合物可用于制备所有或有些聚合物和/或颗粒和/或层。可生物降解指聚合物通过自发水解、切割特定氨基酸序列的酶的化学攻击、或掺入对氧化敏感的官能基进行降解。由于官能基与溶液中的水起反应，进行自发水解的聚合物会在体外在保持在pH 7.0到7.4的水溶液中降解。术语“降解”在用于本文时指变成可溶性的，方法是，降低分子量(就像聚酯的情况)或将疏水性基团转变成亲水性基团(就像PPS的情况)。具有酯基的聚合物一般进行自发水解，例如聚丙交酯(polylactide)和聚乙交酯(polyglycolide)。已知许多肽序列受到特异性酶促攻击，例如被胶原酶或金属蛋白酶降解：仅仅被生物学自由基机制降解的序列不是特异性降解的。具有对氧化敏感的官能基的聚合物会被温和的氧化剂造成化学改变，其检验标准是在体外在暴露于10％过氧化氢20小时后溶解增强了。例如，PPS就是对氧化敏感的聚合物[39]。
虽然在某些实施方案中使用PPS颗粒作为例示系统来证明如何制备和使用纳米颗粒，但是可以使用其它备选材料。一般而言，颗粒系统每种成分的特性可以根据制备功能性颗粒的需要而自由混合和匹配。例如，可以使用较小的(例如小于大约100nm或小于大约70nm)且因此有效进入淋巴循环的其它颗粒。此类颗粒可以任选移植有PEG覆盖层，或者以其它方式掺入有亲水性聚合物，而且可以任选移植有抗原、危险信号、或二者。例如，PEG偶联的嵌段共聚物可以吸附至适宜大小的可降解聚合物纳米颗粒，而抗原可以进一步附着至这种经处理的聚合物的表面。又例如，含PEG的嵌段共聚物可以吸附至适宜大小的无机纳米颗粒，而抗原可以进一步附着至这种经处理的聚合物的表面。虽然可能希望纳米颗粒核心降解，但是这并非必然是必要条件。
微团系统(Micellar system)也可展示与上文所述相同的有用特征，包括自聚(乙二醇)与PPS的AB和ABA嵌段共聚物形成的微团[100-104]。若此类共聚物是用相对较大量的聚(乙二醇)，例如过量大约40％而形成的，则预计可以在某些条件下形成球形微团。这些微团可以是较小的，例如达到上文为淋巴进入所述的大小，而且可以任选移植有PEG覆盖层，或以其它方式掺入有PEG或其它聚合物以实现类似特性。此外，正如本文所教授的，它们可以在微团表面偶联有抗原、危险信号、或二者。嵌段共聚物可以以羟基为末端，用于补体激活，而且特别有益的是，亲水性嵌段以羟基为末端，使得该羟基会在微团纳米颗粒表面上更易于可及，供补体结合。这样羟基化的此类表面可以适应性的有效激活补体。一种特别有用的亲水性嵌段是以羟基为末端的PEG。在形成微团的聚合物体系结构之外，还可选择嵌段大小和嵌段大小比例以形成囊泡结构(vesicular structures)。微团配制剂还有许多其它可能的化学组成可使用[105-108]。
从生成大小分布很窄的很小结构的角度看，以及从比交联核心纳米颗粒更快地自身体清除的角度看，聚合物微团可能是有利的。此特征得到了作为微团制备的聚乙二醇-聚硫化丙烯(PEG-PPS)纳米颗粒能够展示表面羟基基团以及表面氢硫基基团的证明，例如见实施例23。图22中显示了合成封闭或不封闭末端-SH基团的羟基-PEG-PPS的一种路径，而图23中示明一种合成甲基-PEG-PPS的路径。
模块例如抗原、肽、抗体、抗体片段、核酸、核酸片段可附着至纳米颗粒或分支聚合物。下文描述了模块附着至微团纳米颗粒的例子，而且描绘于图24-27和29，还可见实施例23。图28汇总了详述的实验的结果，显示了制成微团的纳米颗粒与交联核心纳米颗粒相当；标有NPHS040的柱是羟基和氢硫基表面基团的PPS交联核心纳米颗粒。
在一些实施方式中，制备并干燥微团纳米颗粒，以保存微团结构，这些纳米颗粒称作“干燥微团”，注意，微团为一般指溶液中结构的术语。一种形成干燥的微团的方法是冷冻微团的集合，并将它们冻干以除去水。所得材料可保存于低于0℃的温度直至使用，或者可贮存于更高的温度。干燥的微团也可在干燥工艺，诸如真空蒸发或喷雾干燥之后干贮存。干燥的微团可以干施用，或者可以在施用之前再水合。或者，微团可在溶液中冷冻，并以冷冻状态施用，或者在使用之前融化，例如通过添加室温生理学可接受溶液。
有些聚合物系统自身是纳米微粒，而且包括在术语纳米颗粒内。例如，树状聚体(dendrimer)是一类聚合物，其可以是在10nm范围内的纳米微粒[141]。这些聚合物在其表面包含大量的官能基，例如其已经用于偶联至生物分子和其它基团[142，143]。类似的，抗原可以偶联至树状聚体表面。此外，树状聚体表面上的官能基可以为补体激活目的而优化，例如通过羟基化而优化。有些树状聚体-DNA复合物已经展示出激活补体[144，145]。如此，树状聚体代表了一种有兴趣的纳米微粒化学性质，其可以适于使用本文所述技术的淋巴靶向、用于抗原偶联、和用于补体激活，例如参见美国专利申请公开号2004/0086479、2006/0204443、及美国专利号6,455,071和6,998,115，它们收入本文以与明确公开的内容不抵触的程度作为参考。
树状分子是反复分叉的聚合物，其中原子排列在自中央核心辐射出去的许多臂和亚臂中。树状聚物特征在于它们的结构完美性(如基于对称性和多分散性二者的评估)，而且需要特别的化学工艺来合成。因而，技术人员能容易地区分树状聚物纳米颗粒与非树状聚物纳米颗粒。本文中的纳米颗粒的实施方案包括非树状聚物。一些非树状聚物是如下的纳米颗粒，它们是具有聚合度为至少5的分支的分支聚合物，其中术语分支指位于分支点之间的聚合物链部分。一些非树状聚物具有分子量为至少200的分支，例如聚合度为至少5的聚乙二醇。
树状聚体的形状高度依赖于其成分聚合物在给定环境中的可溶性，而且可以根据其周围的溶剂或溶质而显著变化，例如根据温度、pH、离子含量的变化而变化，或在被DC摄取后变化。相反，具有比树状聚体或其它仅仅分支聚合物系统相对更稳定的物理尺度(physical dimension)的纳米颗粒对于储存目的可以是有用的，或者可以与生物学活性有关，例如具有亲水冠的实心核心会始终如一的将冠呈递给其环境。因而，纳米颗粒的有些实施方案依赖于不是树状聚体的颗粒、或核心为实心和/或核心为交联水凝胶(cross-linkedhydrogel)的颗粒。基于PPS的纳米颗粒不是树状聚体，而且具有实心核心。
诸实施方式包括展示本文所述能够激活补体的模块的很小纳米结构。此类结构也可展示抗原或其它模块。某些实施方式是水溶性多功能聚合物，诸如分支聚合物，例如具有一个分支或多个分支的分支PEG，其具有为至少约5的聚合度。水溶性是指材料具有至少1克每升水的溶解度的术语。图30(见实施例24)显示了具有羟基末端基团的8臂(8个末端)分支的PEG(总MW约40,000)有效激活体内树突细胞。图31提供了用于制备分支PEG的一种详细方案。末端指聚合酶末端基团，8臂分支的PEG具有8个羟基末端。分支指自聚合物骨架或核心延伸出来的侧链。在对称的聚合物的情况中，核心指分支的中央部分。术语骨架在这些领域中是按惯例的，而且它的范围和边界将是技术人员立即领会的。
因而，诸实施方式包括如下的水溶性聚合物，其具有介于10,000和1,000,000之间的分子量及4个至5,000个末端，该聚合物激活体内树突细胞，例如如使用实施例24和/或图30的方法测试的。技术人员将立即领会，本发明涵盖明确述及范围内的所有范围和数值，例如至少四个末端、或至少8个末端、或4-20个末端。聚合物的大小定成能穿透穿过间质组织，使其能够在引流淋巴系统内收集到，从而能够靶向驻留在那里的APC。因此，球状分支聚合物可能比相同分子量和相同末端数目的长分支聚合物优选，因为较长的聚合物可能更易于在组织的蛋白质和糖胺聚糖网络内变得牵连。无论如何，只要穿过间质组织的穿透是足够的，具有侧分支的长聚合物就是有用的。因此，多个实施方案包括自一个或多个中央分支点辐射出来的分支聚合物以及具有侧分支的长聚合物二者。分支聚合物可以是非树状聚合物。
按照图31，分支聚合物还可含有官能基供进一步反应，例如氨基或氢硫基。还有，可如上所述附着其它模块，例如抗原或危险信号。此外，可以用生物可降解基团来制备聚合物。本文所列各种实施方案描述了纳米颗粒的使用和改进；这些使用和改进也可应用于水溶性树状聚物或分支的材料，如本文所述。
纳米颗粒可制备成囊泡，例如水核心囊泡。水核心囊泡可以用例如两亲性共聚物来制备，而且可加工达到纳米颗粒结构和尺度。可以用还原敏感性连接来制备囊泡。可以联合抗原性或治疗性模块来制备囊泡。
使用纳米颗粒的免疫疗法
在应用中，此类纳米颗粒作为例如抗原和药物运送媒介靶向淋巴结中的APC(尤其是DC)是有用的。运送抗原和/或药物和/或危险信号至淋巴结中的DC的能力是免疫疗法的有用方法。用纳米颗粒有效靶向淋巴结DC和其它APC的能力提供了运送抗原性蛋白质和多肽和抗原编码核酸的方法。由于DC至关重要的牵涉通过将抗原呈递给T细胞而启动细胞介导的免疫，所以这种运送方法可用于数种疫苗和免疫疗法应用。而且，纳米颗粒作为诊断工具(例如成像)、研究工具(例如ALDRICH产品目录中所销售的或用于显微镜显现)、或体外药物运送或显现(例如APC和/或DC和/或巨噬细胞体外摄取药物或成像剂)是有用的。
抗原和/或药物和/或危险信号可以共价附着至颗粒，吸附至颗粒，加载入颗粒，或与颗粒集合混合，供同时导入患者。用于共价键合的基序在本文中其它地方有讨论，而且也可以应用于这种情况。吸附可以如下实现，将药剂与颗粒以预定的量和时间混合，然后通过物理方法将颗粒与混合物分开，例如通过离心或过滤。分离可以发生在施用之前或之后，体外或在身体中，例如通过注射混合物并容许扩散力(diffusion force)和对流力将各成分分开。加载在颗粒合成期间或之后进行。例如，可以将颗粒在存在药剂时聚合，这会通过吸附或通过相分离来包裹药剂，像基于微团的聚合。合成后的加载可以根据需要来实现，例如通过将颗粒暴露于第一溶剂中的药剂，所述第一溶剂使颗粒膨胀或使药剂易于扩散，然后将颗粒暴露于第二溶剂，其使颗粒收缩，或将它们还原成水溶液，其停止或减缓药剂的扩散，例如：加载有机溶剂中的疏水性药物，并在水溶液中保存颗粒。为了同时导入而进行的混合可以如下实现，例如将颗粒导入装有抗原和/或药物和/或危险信号的溶液的注射器并将它们共注入患者。
如本文所述，纳米颗粒(包括微团)或分支聚合物可包括用于激活的官能基，例如羟基和/或氢硫基。也可制备具有别的官能基供进一步衍生化(例如氨基、氢硫基、不配对的半胱氨酸残基)的材料。在一些实施方案中，制备具有用于免疫激活的和还有用于进一步衍生化的官能基二者的纳米颗粒或分支聚合物的集合。在其它实施方案中，制备具有用于免疫激活的官能基或用于衍生化的官能基任一的纳米颗粒或分支聚合物的集合，并且分开地或作为组合物地或分开但基本上同时地对患者施用该集合。可以如本文所述用模块衍生化具有可衍生基团的纳米颗粒或分支聚合物以制备衍生化材料的集合。任何集合可进一步与本文所述吸附的或可溶性的药剂组合使用或混合，或者加载本文所述药剂。方法包括用于纳米颗粒或分支聚合物刺激淋巴结处的APC或DC成熟。
可制备纳米颗粒(包括微团)或分支聚合物来激活获得性免疫系统的完全应答，例如见实施例18-21。多个方法包括以在淋巴结处的APC或DC中有效刺激Th1偏爱性应答和/或IL-12分泌和/或TLR4介导的免疫应答的量施用材料。多个方法包括刺激体外或体内免疫应答(完全的获得性免疫应答、补体激活、抗体生成、IL-12分泌、APC成熟、DC成熟、CD80诱导)，任选没有或基本上没有(意味着通过惯常用于这些分子的测定法在患者的血液样品中检测不到)TNF-α和/或IL-6生成。
使用纳米颗粒和免疫抑制性药物的免疫疗法
免疫抑制是免疫疗法一种至关重要的形式，其是临床移植(例如同种移植物)和自身免疫病(例如多发性硬化)的情况中大大需要的。免疫抑制性药物诸如皮质类固醇(例如环孢霉素(cyclosporine))和雷帕霉素(rapamycin)的使用导致了这些免疫病症治疗的大大进步[122]。一般认为T细胞是免疫抑制性药物的重要靶物，免疫抑制性药物通过抑制炎性细胞因子(主要是IL-2和TNF-γ)的基因来起作用，并因此降低T细胞增殖。开发的另一种免疫抑制方法是使用抗体来阻断T细胞受体CD28和CD40[123]。阻断这些受体导致定位于DC上的共刺激性分子激活不足，并因此引起有效消除T细胞增殖的耐受效应。然而，使用皮质类固醇或阻断性抗体的治疗是非常非特异性，而且可导致副作用，诸如降低免疫系统抗击其它感染的能力。因此，能诱导抗原特异性耐受的更特异性的免疫抑制策略会是免疫疗法的超常进步。
最近发现了DC可以是免疫抑制的靶物；在它们刺激T细胞免疫的能力之外，DC还能够调节T细胞耐受[124]。地塞米松(Dexamethasone，Dex)是一种合成的糖皮质素，在诸如预防同种移植物移植排斥的应用中用于免疫抑制。传统上认为糖皮质素只作用于T细胞。然而，最近的研究证明了Dex可作用于DC以下调共刺激性分子的表达和炎性细胞因子的分泌[125，126]。这实质性的暗示利用DC来诱导耐受的可能。在缺乏共刺激性分子时呈递抗原给T细胞的DC会诱导T细胞对所呈递抗原的无反应性或耐受。
免疫抑制性药物可以与纳米颗粒一起运送。在有些实施方案中，抗原可以凭借它们的大小和与间质流(interstitial flows)的相互作用而有效的靶向淋巴结DC，并进入淋巴。为了预防DC激活而将抗原与免疫抑制剂同时运送会导致耐受。在这样的情况中，不能激活补体的纳米颗粒可能是有益的。有些主要免疫抑制性药物是糖皮质素，其是疏水性的，而且可以加载入纳米颗粒的疏水性PPS核心。某些糖皮质素诸如地塞米松、他克莫司(tacrolimus)、和环孢菌素A已经证明它们能通过下调共刺激性分子(即CD80和CD86)的表达和炎性细胞因子(即IL-6和TNF-α)的分泌而抑制DC的成熟和同种刺激(allostimulatory)能力[125-131]。
免疫抑制性药物可以加载入本文所述纳米颗粒，并导入患者。纳米颗粒可以特异性靶向淋巴系统和淋巴结，而且可以特异性靶向而供APC和/或DC摄取。疏水性药物或其它药剂可以有利的使用具有疏水性成分或核心的纳米颗粒来运送。而且，抗原可以与药物联合运送。抗原可以与纳米颗粒结合，例如通过共注射、吸附、或共价键合而结合。
例如，一种策略是加载疏水性免疫抑制性药物(例如Dex)入用以甲氧基为末端的模块稳定化(如此成为非羟基化的且不能激活补体)的纳米颗粒的核心，并将抗原移植至表面。因此，通过将Dex或其它免疫抑制性药物与抗原一起运送至淋巴结中的DC，有可能下调共刺激性分子，但仍运送抗原并继而引起抗原特异性耐受。因此，纳米颗粒，例如用甲氧基封端的PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒，在联合抗原偶联和免疫抑制性药物加载时，可以在诸如自身免疫病和移植排斥的治疗应用中用于诱导耐受。
另外，免疫抑制剂可以与转染细胞的方案组合，以便例如制备耐受原性疫苗。纳米颗粒集合可用加载了免疫抑制剂并经衍生而携带DNA或RNA的颗粒来制备，或者运送免疫抑制剂的颗粒的不同集合可以与多个运送核酸的颗粒组合(为混合物或分开施用)。因此，免疫抑制剂可与用纳米颗粒(包括微团或非树状聚合物)所运送抗原的免疫疗法组合使用。
使用抗原的免疫疗法
内在化蛋白质抗原的APC可经由MHC I和II途径加工和呈递抗原性肽表位。一种免疫治疗性方法牵涉共价附着一种或多种抗原至纳米颗粒，或以其它方式结合它们。抗原指可被免疫系统识别的、糖基化或未糖基化的多肽，，而且长度一般为至少约三个氨基酸。抗原还可经核酸序列诸如DNA或RNA来编码。例如，如果DNA编码存在于病原体上的多肽抗原，则DNA编码抗原。在将DNA运送至APC的细胞核后，会发生抗原性多肽抗原的表达，并将其呈递在MHC I上。可以使用完整蛋白质，但是也可以使用抗原性片段，因而可以使用具有约3个到约20个残基的多肽；技术人员将立即领会其涵盖明确述及范围内的所有范围和数值，例如少于大约10个残基。由于可以使用无需多肽参与就能直接激活补体系统的纳米颗粒，所以可以使用不能激活补体系统的抗原。
抗原(或其它模块)也可以通过经包括被蛋白酶特异性切割的底物的接头将抗原附着至分支聚合物或纳米颗粒(包括微团)来运送，其中该底物牵涉抗原加工。例如，可将组织蛋白酶底物KQKLR(SEQ ID NO：3)掺入接头中，并受到组织蛋白酶S的切割。也可经二硫键将抗原附着至纳米颗粒或分支聚合物，经APC摄取后该二硫键被还原。例如，抗原性肽可包括可用来与聚合物上的自由硫化物形成二硫键的半胱氨酸残基或硫化物模块。图25a、25b和25c描绘了将肽或其它模块附着至纳米颗粒或分支聚合物的方法。实验显示了肽被释放入靶细胞中，而且是有生物活性的。图26显示了附着至纳米颗粒的肽SIINFEKL(SEQ ID NO：2)被固定化至颗粒，被运送至体内淋巴结，被驻留淋巴结的DC摄取，并在MHC1中展示(实施例23)。某些实施方式包括掺入有抗原或其它模块的纳米颗粒或分支聚合物，它们被APC、DC或驻留淋巴结的APC或DC摄取，并被以生物活性形式释放至细胞，或为了在MHC复合物中表达而被释放至细胞。用于模块的连接任选包括二硫桥键或受到蛋白酶(例如细胞内蛋白酶)切割的肽序列。
抗原可以用于针对许多不同疾病的免疫疗法。一种特定应用是肿瘤免疫疗法。有用的抗原展示在肿瘤细胞上而非健康细胞。已经鉴定了数种抗原是对某些类型的肿瘤特异性的，诸如胱天蛋白酶(Caspase)-8、MAGE-I、酪氨酸酶、HER-2/neu、和MUC-I[112]。请注意，纳米颗粒可用于运送此类抗原至淋巴结中的DC，作为激活T细胞来攻击肿瘤的手段。另一种应用是预防传染病。暴露于抗原可产生针对此类疾病的抵抗力，或者用作各种疾患的疫苗接种。
在DC激活信号存在下，有效转染淋巴结中的细胞的能力对于诱导免疫也是有用的，或者在DC激活信号缺失下，对于诱导抗原特异性耐受也是有用的。在CpG DNA缺失下，转染可导致抗原表达，及此外在危险信号和如此共刺激分子表达缺失下，导致延长的抗原表达。因而，实施方式包括不含CpG DNA的纳米颗粒的集合。此外，就像可以掺入APC激活性疏水性免疫调控剂那样，也可以掺入疏水性免疫抑制性分子，诸如地塞米松，如早就讨论过的那样。各方法包括转染细胞以在淋巴结内特异性地且直接地表达抗原，其中转染任选伴有免疫抑制性药物。可以使用本文所述既含有载体又含有药物的纳米颗粒或聚合物，或者可将具有其中之一和/或另一的纳米颗粒/聚合物混合在一起或者序贯使用，或者可以随时间施用其中之一或另一，例如一剂转染剂和重复多剂免疫抑制剂。
所谓的耐受原性疫苗配制剂迄今是相当粗糙的。将抗原运送至淋巴结的能力直接避免了耐受原性疫苗中的一个困境，即如何将抗原运送至淋巴结内的DC，但是不激活那些DC。通常，如果在外周中收集抗原，DC不迁移至淋巴结。除非它们被激活：如此造成困境。在某些实施方式中，将抗原络合或缀合至不激活DC的纳米颗粒，由此提供耐受原性、抗原特异性配制剂。此外，此类纳米颗粒，无论是通过反向乳液聚合或者是通过微团化形成的，都可加载免疫抑制性分子，例如地塞米松、西罗莫司、他克莫司、依维莫司、或环孢霉素A。这些药物还阻止任何DC激活，其可以是预先存在的或可以是由纳米颗粒摄取过程诱导的。图33(见实施例26)显示了可将骨髓衍生DC暴露于加载有地塞米松的纳米颗粒，然后可暴露于很强的DC激活信号，诸如LPS；掺入有免疫抑制剂的纳米颗粒能阻止DC激活，甚至对于如此强的信号。其它免疫调控性分子，例如半乳凝素-1或iC3b，也能缀合至纳米颗粒表面或结合至纳米颗粒上或结合至纳米颗粒内。某些实施方式提供靶向淋巴细胞的本文所述纳米颗粒或聚合物，它们将细胞暴露于抗原和/或免疫抑制剂。可以使用既具有抗原又具有药物的本文所述纳米颗粒或聚合物，或者具有其中之一和/或另一的纳米颗粒/聚合物可以混合在一起或序贯使用，或者可以随时间施用其中之一或另一，例如一剂转染剂和重复多剂免疫抑制剂。
此外，还可用本文所述纳米颗粒和/或聚合物来运送免疫调控性药物。特异性靶向淋巴系统中的细胞有利地避免了全身运送。
不激活DC的、携带抗原的纳米颗粒作为耐受原性疫苗配制剂在多种疾病中是有用的，诸如I型糖尿病，例如与抗原胰岛素原、胰岛素原衍生肽或谷氨酸脱羧酶等一起；或诸如多发性硬化，例如与抗原髓磷脂碱性蛋白一起；或诸如类风湿性关节炎，例如与抗原胶原II一起。
使用纳米颗粒和核酸的免疫疗法
有些纳米颗粒集合可以包括纳米颗粒和核酸，例如编码肽例如抗原的DNA或RNA。此外，这些还可以包括表达盒，其包括启动子或增强子作为载体的一部分，或以其它方式掺入本领域已知的基因运送基序，参见例如美国专利号7,160,695、7,157,089、7,122,354、7,052,694、7,026,162、6,869,935，它们收入本在与本文明确公开的内容不抵触的程度上文作为参考。此外，序列可以编码其它治疗性生物分子。核酸抗原诸如DNA可以附着至纳米颗粒，包括聚合物微团内的络合或聚合囊泡内的封装，或分支聚合物，正如本文关于抗原和其它药剂所述。而且，例如，DNA-聚合物偶联可以经由静电吸附、聚合物-生物素化来进行[139]。有许多其它化学偶联策略可用于附着聚合物至DNA，其可以适应性的用于此处[140]。通过使用本文所述纳米颗粒，可以靶向APC(包括淋巴结DC)来进行抗原基因表达以及激活，以确保适宜的T细胞刺激。
可使用基于与PEG-PPS-PEI混合的PEG-PPS的超小DNA复合物来运送核酸，例如作为DNA疫苗。靶向T细胞也是有用的。图32，见实施例25，显示了这些超小复合物用模型蛋白质(绿色荧光蛋白，GFP)有效转染体内细胞。直到现在，已经就它们的细胞靶而言非常非特异性地使用了DNA疫苗；本文中呈现了一种不同的办法，即转染驻留在淋巴结中的细胞。PEG-PPS和PEG-PPS-PEI平台提供了疫苗接种中的多面办法。例如，可将疏水性免疫调控剂，例如咪喹莫特掺入DNA复合物中。或者，可掺入CpG DNA，或是在质粒自身内或是分开地在复合物内。复合物可设计成激活补体，或者可偶联至其它危险信号诸如鞭毛蛋白。组合肽/蛋白质配制剂与DNA配制剂也是有用的，用以实现抗原的短期存在，继以基因表达所致延长的存在。
其他人已经探索了DNA疫苗，探索途径的范围从裸DNA或与阳离子聚合物和阳离子脂质的复合物及至病毒形式。对于DNA疫苗，用非病毒载体靶向淋巴结内的细胞以进行基因运送因阳离子脂质或阳离子聚合物的非病毒复合物的大小等其它因素变得非常复杂。对于例如质粒DNA，这些复合物的大小范围通常为100-250nm，而且在例外和特殊的配制剂中不小于60-100nm。然而，如本文中显示的，经间质流的颗粒运输对于很小的纳米颗粒(例如本文中20-25nm纳米颗粒显示的)是非常有效的。实施例25首次证明了能形成到达淋巴结并靶向那里预定细胞类型的超小质粒DNA复合物。这些复合物自PEG-PPS的和PEG-PPS-PEI的混合微团制备。PEG-PPS-PEI络合DNA，而且PEG-PPS与PEG-PPS-PEI之比控制了复合物的大小。如实施例25所示，这些超小质粒DNA复合物在注射(例如皮内或皮下)时能够到达淋巴结。观察了T细胞、B细胞和DC的转染。如此，本文中教授的复合物作为靶向多种细胞类型的DNA疫苗是有用的。或者，复合物对于运送成像剂或治疗剂一般是有用的。应用包括成像和诊断。
模块对纳米颗粒的偶联
可利用多种附着抗原或其它模块至亲核或亲电子官能基的方案。一般而言，此类方案可适于酌情附着药物或危险信号。
举例而言，提供了附着抗原至实心核心PPS纳米颗粒上的PLURONIC的实施例。抗原偶联至PPS纳米颗粒可以通过用蛋白质或肽官能化PLURONIC(PEG与PPG的嵌段共聚物)表面来实现。Pluronic F127(Sigma)、二乙烯基砜(Fluka)、氢化钠(Aldrich)、甲苯(VWR)、乙酸(Fluka)、二乙醚(Fisher)、二氯甲烷(Fisher)和硅藻土(Celite，Macherey Nagel)以收到的状态使用。反应在氩气(Messer)下进行。1H NMR在含氘的氯仿(Armar)中测量，而化学移位(δ)以相对于0.0ppm时内部标准物四甲基硅烷(Armar)信号的ppm给出。将15g(1.18mmol)Pluronic F-127在400ml甲苯中的溶液使用迪安-斯塔克疏水器(Dean-Stark trap)通过共沸蒸馏干燥4小时。将溶液在冰浴中冷却，并添加0.283g(11.8mmol)氢化钠。将反应混合物搅动15分钟，并迅速添加3.55ml(35.4mmol)二乙烯基砜(Sigma-Aldrich)。室温下避光搅动5天后，添加1.35ml(23.6mmol)乙酸将反应淬灭。在硅藻土上过滤并将滤出液减压浓缩至小体积后，将产物在1升冰冷的二乙醚中沉淀。将固体过滤出来，溶解于最小量的二氯甲烷，并在冰冷的二乙醚中沉淀，总共4次。将聚合物在真空下干燥，得到6.0g，并保存于氩气下、-20℃，以备OVA偶联。NMR显示了存在乙烯砜和官能化程度为88％。δ＝1.1(m，CH3，PPG)，3.4(m，CH，PPG)，3.5(m，CH2，PPG)，3.6(PEG)，6.1(d，CHcis＝CH-SO2)和6.4(d，CHtrans＝CH-SO2)，6.85(dd，CH2＝CHSO2-)。
然后肽或蛋白质抗原可以偶联至PLURONIC乙烯砜(VS)。用于调查DC抗原呈递的模型蛋白质是卵清蛋白(OVA)。OVA拥有抗原性肽OVA257-264和OVA323-339，其由DC分别经由MHC I和II途径加工。OVA257-264和OVA323-339用肽合成仪偶联至半胱氨酸残基。然后通过与其半胱氨酸硫醇反应将肽偶联至PLURONIC-VS。将18mg肽溶于6.43ml pH 8.5的0.1M磷酸钠缓冲液中，得到2mM溶液。添加60mg(1.68mM)PLURONIC-VS。将混合物搅动3小时，期间每15-30分钟采集等分试样供Ellman氏硫醇检测。将4mg Ellman氏试剂(5，5′-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸))在1ml pH 8.5的0.1M磷酸钠和1mM EDTA(以螯合二价金属离子，其可氧化巯基)中溶解。取15μl与1.5ml 0.1M磷酸钠混合，并取30μl反应混合物用120μl pH 7的磷酸钠淬灭。混合并于室温温育15分钟后，测量412nm的吸光度。硫醇的数量计算如下：c＝Abs/E*D，其中E(消光因子)＝14150M1而D是稀释因子。将PLURONIC经由6-8kDa MWCO的膜逆水透析，并将溶液冷冻干燥。产率约88％，通过1H-NMR证实了乙烯砜基团的完全转化。偶联OVA至PLURONIC-VS是通过类似的策略进行的，利用游离半胱氨酸硫醇和赖氨酸胺[109-111]。然后将PL-VS-OVA肽/蛋白质保存于-20℃，直到用于纳米颗粒合成。
抗原可以通过其它手段偶联至纳米颗粒，包括共价偶联至对天然存在的多肽抗原为外源的氨基酸、共价偶联至对天然存在的抗原为内源的氨基酸、物化吸附、和其它手段。
实施方案包括有一个或多个游离亲核基团可供进一步反应的纳米颗粒。亲核基团包括例如羟基、胺基，以及氢硫基。也可制备有羧基基团可供后续反应的纳米颗粒。图24a描述了用于制备具有胺可供与模块反应的纳米颗粒的一种合成路径。图24b描述了有羟基可供进一步反应的纳米颗粒。图24c显示了用于使羟基或胺与其它模块反应的一种方案。许多方案可用于与羟基、胺、和硫醇反应，例如Bioconjugate Techniques，第2版，Greg T.Hermanson著，Academic Press，Inc.出版，2008，1202页，该文章收入本文作为参考。例子包括使用N-羟基琥珀酰亚胺酯、醛、异氰酸盐/酯、三氟代乙烷磺酰氯(tresylchloride)，或者肼/酰肼的缀合。图25描绘了使用二硫键来实现模块附着至纳米颗粒的一种方案。图26显示了肽模块SIINFEKL(SEQ ID NO：2)被成功固定化至纳米颗粒并被运送至淋巴结，接着被驻留淋巴结的DC摄取。在这里，二硫键连接是特别有用的，原因在于它在细胞内化后还原释放游离肽，容许在MHC I或MHC II上呈递。如果肽或蛋白质抗原含有对牵涉抗原加工的蛋白酶敏感的位点，或是内源位点或是改造位点，此类方案可能是有帮助的，但是不是必须的。如果利用没有此类位点的肽，经可还原连接将肽附着至纳米颗粒可能是方便的，如上文和图26中所教授的。虽然可以涵盖经多种位点的缀合且可测定免疫学应答来找到缀合的最佳位点，经位于N端的或位于N端附近的半胱氨酸残基的缀合常常是方便的，因为与N端相比，抗原性肽与其关联受体之间适合的保真度更高，且如此差别更大。图27显示了用于使肽(该术语包括蛋白质)的N端α胺或其它模块与纳米颗粒(例如有吡啶基二硫化物或乙烯基砜模块)反应的一种方案；NP代表纳米颗粒，而“Flic”代表肽。
除在纳米颗粒或分支聚合物上共价嫁接模块(例如抗原、肽、核酸)之外，也可用物理化学手段。一种有力的方法是合成或表达肽或蛋白质抗原以掺入一段强阴离子氨基酸，诸如寡E或寡D区，或其它阴离子氨基酸，或阴离子氨基酸的组合，以能够形成静电复合物，像siRNA或适体复合物。例如，想要与纳米颗粒联合的肽可以用多个天冬氨酸或谷氨酸残基来制备，例如3-30个；技术人员将立即领会明确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如至少4个或介于5个和15个之间。另一种可使用的方法是将模块，例如抗原肽或蛋白质掺入水核心内皮内，例如用PEG-ss-PPS形成的。可以自两亲性共聚物形成聚合物囊泡，如Velluto等人的论文，Molecular Pharmaceutics2008，“PEG-b-PPS Diblock Copolymer Aggregates for Hydrophobic DrugSolubilization and Release：Cyclosporin A as an Example”中所教授的，该文收入本文作为参考。其中有对还原敏感的连接的聚合物囊泡中的封装在细胞内的靶向释放中是特别有力的，原因在于二硫化物在胞吞后被还原，如Cerritelliet al.，Biomacromolecules 2007：1966-1972中所教授的，该文收入本文作为参考。因而，可将对还原敏感的连接掺入微团或纳米颗粒中，例如通过形成如下的纳米颗粒，其在暴露于患者中的生理环境后它的二硫桥原位反应时降解。
图34展现了细胞摄取后的释放，即水溶性有效载荷被非常有效地运送至DC的胞质，如荧光报告物运送至骨髓衍生DC所证明的，见图34A和34b。由于抗原运送至胞质在通过MHC I途径的抗原呈递中是特别重要的，封装在聚合物型囊泡的水核心内的抗原是抗原运送的一种特别有力的手段，根本不需要化学缀合抗原。另外，可将其它药剂诸如危险信号缀合至聚合物囊泡的表面，或掺入聚合囊泡的水核心内，或封装在形成囊泡之壳的疏水性片层内；另外，聚合物囊泡表面可设计得能激活补体，如其它聚合物纳米颗粒，包括本文中的微团所教导的。
使用纳米颗粒和危险信号的免疫疗法
另一种免疫治疗方法牵涉危险信号的应用。本文中的结果显示了可制备羟基化和/或氢硫基化的纳米颗粒或分支聚合物来提供危险信号或刺激使DC成熟的功能，正如通过例如共刺激性分子CD86和CD80的表达升高所证明的。虽然纳米颗粒或分支聚合物不需要非补体危险信号或成熟信号，但是在有些情况中，添加这样的信号可以进一步帮助免疫学应答的发生。其它DC靶向研究提出了抗原摄取后，危险信号诸如炎性细胞因子(即CD40配体)和/或Toll样受体激活物(例如LPS和CpG DNA)是DC成熟和后续诱导细胞介导的免疫所必需的[113-115]。危险信号鉴定为导致基因NF-κB上调，继而导致APC成熟和炎性细胞因子释放的生物分子。在这样的情况中，危险信号细胞因子诸如CD40配体、GM-CSF或Toll样受体激活物可附着至纳米颗粒(例如在核心或表面层或亲水性聚合物层)，例如遵循先前关于蛋白质或肽偶联所述方案[109-111]。此外，还可合成表面上附着抗原和/或非补体危险信号的纳米颗粒。
实施方式包括与危险信号联合的纳米颗粒和/或分支聚合物。危险信号可以共价附着或吸附，例如如本文中别处描述的。纳米颗粒和/或分支聚合物可具有与危险信号组合的氢硫基和/或羟基，或者使它们的一些末端或表面基团或所有末端或表面基团用信号进行衍生。实施例22和图21描述了给纳米颗粒加载咪喹莫特的实验，咪喹莫特即当前用作药物的一种化学危险信号的实验是高度有效的，而且与LPS相当。图29(见实施例23)提供了为运送而共价偶联的危险信号的一个例子，其中纳米颗粒与例如CpG DNA反应。危险信号包括当前作为佐剂分子调查的化合物，诸如鞭毛蛋白、鞭毛蛋白片段、CpG寡核苷酸、咪喹莫特、单磷酰脂质A、和皂苷等。
抗体生成的免疫疗法
有些实施方案致力于给患者导入抗原以在患者中生成针对抗原的抗体。例如，可以以这种方法进行疫苗接种或抗肿瘤疗法。或者，此类方法可用于生成抗体，供用作科学试剂，例如在动物中使用。
如此，纳米颗粒与抗原的组合可以导入患者。预定时间(例如1-30天)后，从患者中采集样品，并测量针对抗原的抗体。可以定期采集另外的样品和进行另外的测量。如果抗体滴度太低，那么可以再次导入纳米颗粒和抗原，并进行另外的测量，根据需要重复该过程使抗体滴度达到期望水平。组合可以施用数次。
实验结果的讨论
本文中记载了运送可生物降解纳米颗粒至抗原呈递细胞(APC)，具体是树突细胞(DC)和另外的巨噬细胞以及B细胞，包括免疫疗法的应用。本文中的详细实施例描述了运送20nm、25nm、45nm、和100nm直径聚(乙二醇)稳定化的聚(硫化丙烯)(PPS)纳米颗粒至淋巴结中的DC。详细实施例中的纳米颗粒包含交联的强韧的PPS核心，其包围有聚(乙二醇)的亲水性冠。PPS结构域能够携带疏水性药物，而且在氧化性环境中降解成可溶性聚合物。肽或蛋白质抗原，包括糖肽(本文中定义为糖基化多肽)抗原，和编码抗原的核酸可附着至纳米颗粒表面。20nm颗粒最易于在间质注射后摄入淋巴，而20nm和45nm这两种颗粒都显示了在淋巴结中的显著保持，在注射后24小时、72小时、96小时和120小时展示了一致且强烈的存在。在不使用外源靶向配体时纳米颗粒受到可多达40-50％的淋巴结DC(和APC)的内在化，而且内在化位点在淋巴结内而非注射位点。与24小时之时相比，在96小时之时看到含纳米颗粒的DC(和其它APC)增多，显示了这些细胞浸润至淋巴结。发现纳米颗粒大小和表面化学二者都影响体内注射后的DC成熟。
实验发现所合成的基础PPS纳米颗粒，即用PLURONIC(聚乙二醇(PEG)与聚丙二醇的嵌段共聚物)稳定化的PPS纳米颗粒核心，能在体内注射纳米颗粒后激活DC，正如纳米颗粒非常小时成熟标志物CD86、CD80和CD40的表达升高所证明的那样；25nm纳米颗粒在体内注射后广泛激活DC，而100nm纳米颗粒则不然。在利用第二种纳米颗粒表面化学，即用甲氧基封端的PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒核心时，即使非常小的纳米颗粒也不能在体内注射后激活DC。证明了PLURONIC稳定化的纳米颗粒能有效激活补体，而用甲氧基封端的PLURONIC稳定化的纳米颗粒却不能有效激活补体。选定的配制剂携带表面硫醇，发现那里也诱导补体激活，而且本文中呈现的数据指示硫醇激活的补体在触发获得性免疫应答中可能是特别有力的。因此，纳米颗粒的补体激活作用诱导DC在暴露于这些纳米颗粒后激活。
实验发现纳米颗粒大小和表面化学都在体内注射后影响获得性免疫。将抗原偶联至PLURONIC稳定化的纳米颗粒表面，发现只在纳米颗粒非常小时强烈诱导抗体形成；25nm纳米颗粒诱导的抗体形成比100nm纳米颗粒强烈得多。当利用第二种纳米颗粒表面化学，即用甲氧基封端的PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒核心时，即使非常小的纳米颗粒也不能在体内注射后诱导强烈的抗体形成。此外，在给补体蛋白3已被敲除的小鼠(C3-/-小鼠)注射25nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒时，这些纳米颗粒没有强烈诱导抗体形成。因此，详细实施例显示了合适大小的纳米颗粒，例如20-45nm，具有免疫治疗性应用的潜力；例如，它们可用于特异性靶向并激活淋巴结中的DC。此外，当这些纳米颗粒拥有能激活补体的表面化学，诸如通过用PLURONIC稳定化而得到的表面化学时，它们具有起到抗原载体和诱导获得性免疫的佐剂功能的强烈潜力。大小较小(例如20-45nm)与补体激活的特殊组合对于在疫苗配制剂中作为佐剂是有价值的。
如此，实施例显示了纳米颗粒可用于靶向抗原和药物运送至淋巴结中的APC，具体是DC。这种方法的简单性在于通过控制大小，纳米颗粒可以被有效摄取入淋巴，以及保持在淋巴结中(如所示的，至少5天)，而不需要使用任何特异性外源靶向配体；它们被驻留淋巴结的DC和其它APC(例如巨噬细胞)有效内在化。大至大约45nm或高达大约100nm的纳米颗粒不能通过这种手段有效靶向入淋巴系统和淋巴结。另外，证明了多至大约40％到大约50％的驻留淋巴结的DC内在化纳米颗粒，进一步证明了这种运送媒介的有效性。同样证明了在暴露于这样的能有效靶向淋巴系统的大小范围的纳米颗粒后，在那些纳米颗粒激活补体时，DC的应答是变得更加成熟并诱导T细胞依赖性获得性免疫。这清楚证明了在抗原呈递佐剂配制剂中使用补体级联作为危险信号的效力。证明了较小大小(从而能够在施用后有效进入淋巴)与补体激活(从而能够刺激APC，包括DC成熟)的组合可诱导强烈的获得性免疫应答，包括T细胞依赖性的体液免疫应答(经抗体滴度)和细胞免疫应答(经T细胞记忆的测量、经T细胞增殖和ELISPOT测量)二者。较小大小与补体激活的这种特殊组合对于在免疫治疗性剂中是非常有价值的。本文中呈现的实验证明了TLR4受体可能在此应答中也发挥作用。获得性免疫应答经由补体的激活从安全性和副作用的角度看可能是非常有价值的，原因在于与经LPS或经CpG刺激的DC相比，来自经补体激活性纳米颗粒刺激的DC的有力的且危险的炎性细胞因子诸如IL-6和TNFα的生成很低。因而，实施方案包括供导入患者中的免疫刺激性组合物，其包含含有抗原的合成纳米颗粒的集合，其中所述组合物在患者中诱导针对抗原的免疫应答，不诱导TNF-α应答且不诱导IL-6应答。
实施例中呈现了其它纳米颗粒形式。呈现了自两亲性嵌段共聚物形成的微团，使用PEG和PPS的及PEG、PPS和PEI的嵌段共聚物作为实验例。微团非常方便，原因在于它们可形成为具有很小的大小和很窄的大小分布。它们的表面可设计成经表面羟基或表面氢硫基来激活补体。可将疏水性危险信号或免疫抑制剂掺入微团核心内。可将抗原化学缀合或络合至微团表面。实施例呈现了形成微团，缀合抗原，激活补体，激活DC，及诱导获得性免疫。实施例呈现了质粒DNA与聚合物纳米颗粒形成很小纳米颗粒及对淋巴系统中对注射部位引流的淋巴结内的DC、B细胞和T细胞的有效转染。如此，实施例显示了此类来自嵌段共聚物的形式用于肽/蛋白质抗原和用于DNA编码的抗原二者的能力。实施例教授了淋巴结内的细胞作为肽/蛋白质抗原和作为DNA编码的抗原二者的靶物的效用。
实施例中呈现了来自嵌段共聚两亲物的其它纳米颗粒形式。水核心囊泡，在文献中有时称作polymersomes或polymerosomes，是自嵌段共聚物形成的，使用PEG和PPS的嵌段共聚物作为实验例。囊泡非常方便，原因在于可以在它们的水核心内含有亲水性有效载荷。此亲水性有效载荷可包含亲水性危险信号，诸如CpG寡核苷酸，或抗原，诸如肽或蛋白质，或编码抗原表达的基因序列，其它免疫调控性蛋白质，或超过一种的上述。
实施例中呈现了来自分支聚合物的其它纳米颗粒形式。纳米颗粒可以如此之小以致于它们能自单一分支聚合物有效形成。分支为缀合抗原或缀合危险信号或与危险信号诸如补体自发装配或二者提供了多个位点。实施例呈现了合成此类官能化分支聚合物的办法。
实施例呈现了使用靶向淋巴结的纳米颗粒来诱导获得性免疫应答和诱导耐受二者。如本文中及实施例中详细描述的，可将抗原和危险信号缀合或络合至纳米颗粒(包括微团和囊泡)或分支聚合物或封装在其内，以诱导获得性免疫应答；或者可在危险信号缺失下，或甚至与免疫抑制性或免疫调控性分子一起将抗原缀合或络合至纳米颗粒(包括微团和囊泡)或分支聚合物或封装在其内以诱导耐受。类似地，可以与危险信号一起运送编码抗原的DNA以诱导获得性免疫，或者可以在危险信号缺失下或甚至与免疫抑制性或免疫调控性分子一起运送编码抗原的DNA以诱导耐受。
实施例聚焦于PPS作为聚合物纳米颗粒(包括微团和囊泡)的疏水性成分的实验数据。PPS在水存在下是稳定的，但是在身体的氧化性条件中及尤其在胞吞后在溶酶体的氧化性条件中是不稳定的。因此，聚合物自疏水性聚硫化丙烯氧化成亲水性亚砜和砜，在氧化后产生水溶性的且能经肾过滤被肾清除的聚合物。因此，PPS及其共聚物当在管形瓶中在水中配制时会是稳定的，但是在身体中注射之后是不稳定的。这提供了独特的成本和后勤优势，这对于应用可能是特别重要的。纳米颗粒可通过冻干或通过简单干燥来进一步干燥，并可再水合以再形成可注射纳米颗粒配制剂。在一些应用中，干的配制剂可直接使用，例如当放置在粘膜组织表面上时。
实施例还呈现了不同施用路径。当在组织间质内注射时，诸如皮内、皮下、或肌肉内，纳米颗粒的超小大小允许它们在间质流的对流影响下穿透穿过间质，自组织中的毛细血管流动至毛细淋巴管或清除入引流淋巴结中。如果颗粒足够小，那么它们不被俘获在组织中并如此有效转运入淋巴系统中。实施例还呈现了应用外源压力来获得穿透穿过组织屏障，例如对足够小的纳米颗粒应用轻度压力来穿透入口腔粘膜中。轻度压力是排除高压无针头注射系统的术语，其依赖高压来迫使药物进入患者中。轻度压力有力地避免了实际粘膜破坏。某些实施方案致力于使用小于大约760mm Hg的外源压力；技术人员将立即领会确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如小于大约40、100、或200mm Hg或大约10至120mm Hg。外部粘膜的例子有鼻、口、口服、阴道、和结肠，例如通过含服、子宫套(pessary)或栓剂手段来运送。
实施例
实施例1：纳米颗粒
如文献[39]所述通过反向乳液聚合(inverse emulsion polymerization)合成直径20nm、45nm、和100nm的PPS纳米颗粒；术语“乳液聚合(emulsionpolymerization)”在用于本文时包括反向乳液聚合，而术语“乳液”包括反向乳液(inverse emulsion)。简言之，乳液是如下生成的，在恒速搅动下添加PEG嵌段共聚物乳化剂PLURONIC F-127(Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland)和单体硫化丙烯(monomer propylene sulfide)至超纯milliQ水中。如文献[39]所述，合成受保护的起始物季戊四醇四硫酯(pentaerythritol tetrathioester)，并在另一个烧瓶中，通过在搅动条件下将其与0.20mL 0.5M甲酸钠溶液混合10分钟来脱保护。脱保护后，将起始物添加至单体乳液中，并在5分钟后添加60μl碱(base)二氮杂[5.4.0]二环十一碳-7-烯(diaza[5.4.0]bicycycloundec-7-ene，DBU)至反应体系中，并让其在惰性气氛下继续搅动24小时。然后将纳米颗粒暴露于空气，以生成二硫键交联。
通过用12-14kDa MWCO膜(Spectrum Laboratories，nmcho Dominguez，CA)在超纯milliQ水中反复透析2天，将纳米颗粒纯化，使其与剩余的单体、碱、或游离PLURONIC分开。用动态光散射仪(Malvern，Worcestershire，UnitedKingdom)测定纳米颗粒的大小分布。荧光标记是如下实现的，即以1mg/ml纳米颗粒溶液添加6-碘代乙酰胺-荧光素或Alexa Fluor 488马来酰亚胺(Molecular Probes，Eugene，OR)至纳米颗粒上剩余的反应性硫醇，然后在黑暗中搅动6小时。然后将纳米颗粒暴露于空气以进一步进行二硫键交联。用25kDa MW截留膜(Spectrum Laboratories)在5mM PBS中反复透析1天，消除游离的碘代乙酰胺-荧光素或Alexa Fluor马来酰亚胺。
实施例2：甲氧基封端PLURONIC的合成
Pluronic F127(Sigma)、甲基碘(Fluka)、氢氧化钾(Fluka)、五水合硫代硫酸钠(Riedel de Haen)、无水硫酸钠(Applichem)、氯化钠(Sigma)、二乙醚(Fisher)和二氯甲烷(Fisher)不经处理直接使用。经0.025％ BHT(Acros)稳定的四氢呋喃在分子筛上干燥后备用。反应在氩气(Messer)气氛下进行。为了透析，使用分子量截留值3400的的再生纤维素管(Spectrapor)。1H NMR在含氘的二甲亚砜(Armar)中测量，化学移位(δ)用ppm值表示，是相对于2.5ppm时的残余溶剂信号的值。
向10.0g(0.79mmol)PLURONIC F127在100ml THF中的溶液中添加2.99g(53.3mmol)磨细的氢氧化钾和988μl(15.9mmol)甲基碘，将混合物在黑暗中搅动19小时。滗去清澈的溶液，添加3.94g五水合硫代硫酸钠、100ml饱和氯化钠水溶液和100ml二氯甲烷。将混合物剧烈搅动，转移至分液漏斗。将各层分开，水相用二氯甲烷(2x100ml)提取。将有机级分合并，在硫酸钠上干燥，减压浓缩。将固体溶解于最小量的双蒸水，在4500ml水中透析1天。将清澈的水溶液用氯化钠饱和，用二氯甲烷(3x100ml)提取，并在硫酸钠上干燥。除去溶剂后，将残余物在索格利特提取器(soxhlet extractor)中用二乙醚提取6小时，减压干燥后产生9.25g白色固体。NMR显示，4.6ppm时不存在OH基团和3.2ppm时存在OCH3基团。δ＝1.1(d，CH3，PPG)，3.2(s，OCH3)，3.3(m，CH，PPG)，3.4(m，CH2，PPG)，3.5(m，PEG)。
实施例3：动物
除非另有说明，此研究使用6-9周龄、体重20-30g的BALB/c小鼠。所有方案由瓦特州(Canton Vaud)兽医当局依照瑞士法律批准。通过皮下注射盐酸氯胺酮10mg/kg和赛拉嗪1mg/kg实施麻醉。通过CO2窒息使小鼠安乐死。
实施例4：显微淋巴管造影
为了测定纳米颗粒经间质注射方式注入皮肤后的相对摄取特征，如先前文献所述[43-45]，通过尾尖恒压注射来实施荧光显微淋巴管造影。除掉小鼠尾毛，并将小鼠置于显微镜台(Axiovert 200M，Zeiss)上，该显微镜台带有加热垫，以维持37℃体温。把荧光PPS纳米颗粒(20nm、45nm、或100nm直径)在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的20mg/ml溶液吸入导管；将附着在导管上的30号针头在距尾尖约1mm处插入皮内，打开活塞，起动恒压40mmHg条件下的流动。纳米颗粒溶液的流速(通过管道上游远端的气泡监测)平均为0.1μl/min，进入约20mm3的组织内(根据由注射储库可见的体积估算)，或约5μl/g/min。没有观察到明显的膨胀。以恒定曝光时间沿尾长方向收集连续图像；对每种纳米颗粒大小重复3次实验。
使用小鼠尾部荧光显微淋巴管造影来评估20nm、45nm、和100nm直径PPS纳米颗粒的淋巴摄取。输注20nm颗粒后，六边形的淋巴毛细管网络在90分钟后清楚可见，且自注射位点起均匀填充(图1a)。相反，在注射45nm颗粒后只观察到非常模糊的淋巴网络(图1b)，用100nm颗粒只能看到非常少的网络(图1c)，指示摄取较差。高分子/蛋白质/颗粒渗漏入毛细血管的大小上限众所周知是约3.5nm[42]，因此我们最小的20nm颗粒对血管系统的渗漏实际为零。如此，这种方法定性证实了，与45nm和100nm颗粒相比，20nm颗粒最易于从间质间隙摄取到淋巴毛细管中。
实施例5：淋巴结中纳米颗粒分布的评估：小纳米颗粒(例如20-45nm)的淋巴结保持
为了评估淋巴结保持，将20μl 20mg/ml荧光PPS纳米颗粒(20nm、45nm、和100nm直径)经由30号针头以推注形式注射入小鼠尾尖或前足垫；对照为注射20μl PBS。在注射位点没有观察到炎症。在24小时、72小时、96小时或120小时的时间点上，通过CO2窒息处死小鼠。把排出尾部和腿部淋巴的骶淋巴结和腰淋巴结取出，把排出前足垫区淋巴的臂淋巴结和腋窝淋巴结取出，快速冷冻，冷冻切成10um切片，并用抗小鼠CD3e抗体(Pharmingen，San Diego，CA)、CD45R抗体(Caltag，Burlingame，CA)、CD68抗体(Serotec，Dusseldorf，Germany)、Dec-205抗体(Serotec)、和CD31抗体(Pharmingen)的抗体免疫染色以分别标记T细胞、B细胞、巨噬细胞/DC、DC、和内皮细胞。使用Alexa Flour594nm(Molecular Probes)抗体进行第二种检测。通过荧光(Axiovert 200M，Zeiss)和共聚焦激光扫描显微镜检术(LSM 510 Meta，Zeiss)对淋巴结切片成像。
为了研究淋巴系统，其他一些研究人员已经调查了纳米颗粒和脂质体的淋巴结保持时间，该时间通常集中于注射后6-52小时范围内的不同时间点[31～34、36]。本文中所报告的实施例描述了最长达120小时的纳米颗粒淋巴结保持，而且显示了20nm颗粒经皮内推注20μl后，在24小时、72小时、96小时、120小时的时间点上，以质量恒定水平(qualitatively consistent level)显著存在于淋巴结中(图2)。45nm纳米颗粒在所有时间点也存在于淋巴结中，只是量较低，而100nm纳米颗粒在任何时间点均未明显见于淋巴结中(图2)。如此，与图1的结果一起，这些数据显示了20～45nm是在淋巴摄取和淋巴结保持两方面表现都较好的PPS纳米颗粒大小范围，以20nm为最佳，而100nm颗粒对于在恒压注射后有效的自间质摄取入淋巴而言太大了。这与先前显示了＞70nm的脂质体大部分保留在注射位点的研究相一致[24、30]。
评估了淋巴结内关于PPS纳米颗粒在其中积累的各种免疫细胞的特异性定位。染色结果与已知的淋巴结体系结构一致，其中可容易看到T和B淋巴细胞的特异性区域[2]。T细胞趋向于在淋巴结的中心区域聚集，而B细胞则常常见于朝向外膜的生发中心。其它存在于淋巴结中的主要细胞类型有APC或MHC II+细胞，即DC和有些巨噬细胞，而且它们的定位常常更分散。图3显示了同一淋巴结在皮内注射20nm颗粒后的连续切片。纳米颗粒不存在于T细胞或B细胞区域(图3a，b)。然而，存在纳米颗粒与巨噬细胞和DC；即，CD68+细胞的显著共定位(图3c)。
一般都假设，运送至淋巴结的脂质体和纳米颗粒主要被那里的巨噬细胞吞噬[21、27、29、30、32、36、37]。然而，本领域没有认识到，能够摄取抗原的未成熟DC也存在于淋巴结中[15、16]。凭借PPS纳米颗粒运送，CD68(尽管它是跨膜蛋白质，但也在胞内表达[47-50])的免疫染色证实了巨噬细胞和DC使PPS纳米颗粒内在化(图4a)。为了进一步测定CD68+细胞是否是巨噬细胞、DC或二者兼为之，将淋巴结对高度特异性的DC受体Dec-205免疫染色[4、38、51～56]。Dec-205+细胞及其与纳米颗粒的共定位(图4b)证明了淋巴结内吞噬纳米颗粒的较大细胞级分事实上是DC。这对于将抗原运送至淋巴结以刺激APC(包括最有效力的APC类型-DC)将是有利的。
实施例6：淋巴结细胞分离和染色
遵循先前所述方案[46]分离淋巴结细胞。简言之，在如前所述，注射荧光纳米颗粒或PBS后，取出淋巴结，用26号针头整理，并在胶原酶D(Roche，Basel，Switzerland)中于37℃消化25分钟。然后，使组织通过70μm细胞滤网(BD，Basel，Switzerland)以回收细胞悬浮液。凭借淋巴结细胞悬浮液，将APC用抗MHC II-(I-A)-R-PE型(Chemicon，Temecula，CA)染色，将DC用抗CD11c-别藻蓝蛋白(Pharmingen)染色。通过抗CD86-R-PE和抗CD80-R-PE(Pharmingen)的染色来测量DC成熟。
实施例7：体外纳米颗粒内在化
淋巴结细胞分离后，将细胞以约500,000细胞/ml铺入RPMI(5％ FBS)。然后将细胞用20μl 20mg/ml荧光纳米颗粒脉冲并温育24小时。然后将细胞用HBSS清洗两次，并如前所述对APC和DC染色。
实施例8：流式细胞术和分析以及体外纳米颗粒内在化：APC(包括DC)的摄取
染色后，通过流式细胞术(CyAn ADP，Dako，Glostrup，Denmark)分析淋巴结细胞悬浮液。再用FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)进行分析。已将荧光纳米颗粒内在化的APC和DC经测定分别为MHCII+FITC+和CD11c+FITC+，FITC代表纳米颗粒的标记。通过计算表达CD86和CD80的细胞级分来评估纳米颗粒内在化后的DC成熟。
实施流式细胞术分析来对淋巴结中内内在化纳米颗粒的APC和DC级分定量。图5a显示了淋巴结中最多达约40％的APC(MHC II+)、特别是约50％的DC(CD11c+)在注射后24小时摄取了20nm纳米颗粒。因而，且总体上，本发明涉及所应用的纳米颗粒至少10％到大约95％被APC和/或DC摄取的；技术人员将立即领会明确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如至少约25％、至少约40％、或者介于约25％和约75％/50％之间。同样，APC和DC级分的很大部分吞噬45nm纳米颗粒，而在体内注射后观察到很少的100nm纳米颗粒摄取。APC，包括DC，可在达到淋巴结后已经吞噬颗粒，或者在注射位点上将颗粒内在化，然后移动至淋巴结。如果是后一种情况，那么在淋巴结中应该能看到100nm颗粒，因为更大的颗粒(1-10μm)完全可以像较小的颗粒那样被APC吞噬[13、57]。体外实验证实，纳米颗粒尺寸不影响APC或DC内在化；几乎所有APC和DC内在化过的纳米颗粒，不管尺寸如何(图5b)。因此，PPS纳米颗粒有可能被动的摄取入外周淋巴管并到达淋巴结，在那里它们被驻留的DC或APC吞噬。这些结果加强了最近的发现，即淋巴结中存在相当数目的、能将抗原内在化的未成熟DC[15，16]。事实上，淋巴结中的DC和其它APC提供了有价值的靶物，用于经由药物运送媒介起动细胞介导的免疫。
调查了不同时间纳米颗粒内在化的比较。发现与巨噬细胞和DC共定位的纳米颗粒在96小时之时比24小时之时内在化更明显(图6a)。使用流式细胞术分析来测定在96小时之时与24小时之时正在内在化纳米颗粒的巨噬细胞和DC类型是否有变化。在24小时时已将纳米颗粒内在化的所有细胞中，约15％是APC(MHCII+)，约13％是DC(CD11c+)，表明大多数APC是DC，而且剩余约85％含纳米颗粒的细胞是非抗原呈递性巨噬细胞(MHCII-)。在96小时时间点，带纳米颗粒、且为APC或DC的细胞级分分别为61±5％和33±3％(注意，这不反映含纳米颗粒的淋巴结APC和DC级分的增加，它们在图5a中显示为保持恒定水平)。含纳米颗粒的MHCII+和CD11c+细胞的增加可能是由于APC和DC浸润到淋巴结中，然后摄取仍在淋巴结组织中的游离纳米颗粒。还有可能是带纳米颗粒的MHCII+细胞的增加是由于24～96小时之间巨噬细胞的激活(即MHCII-巨噬细胞在纳米颗粒内在化后变成激活的，并因而为MHCII+)。
淋巴结中主要的DC级分是已成熟的，然而由于存在未成熟的DC，很有可能这些细胞在抗原摄取后变成成熟的。因此，测定了20nm PLURONIC稳定化的激活补体性(并因而羟基化)的PPS纳米颗粒是否有助于诱导DC成熟，使得在与PLURONIC稳定化的激活补体性PPS纳米颗粒联合使用时常规生物学外源“危险信号”不是必需的。注射20nm PLURONIC稳定化的激活补体性纳米颗粒后，DC成熟标志物CD86的表达与接受PBS注射的对照相比升高了(图7)。还测量了CD80的DC表达，并在纳米颗粒内在化后测定为大得多(图7b)。最后，发现了CD86和CD80在带纳米颗粒的DC中的表达水平在注射后96小时之时较之24小时之时没有变化。这表明20nm、PLURONIC稳定化的激活补体性纳米颗粒提供了延长的成熟刺激，这对于长时间维持T细胞激活和细胞介导的免疫可以是有用的。因此，这些结果显示了PLURONIC稳定化的激活补体性PPS纳米颗粒可起着双重作用，既起着DC特异性抗原运送的媒介作用，又起着使淋巴结中的DC成熟和激活的佐剂作用。
实施例9：人血清中的C3a检测
以100μl/孔给多个96孔板(Becton Dickinson)包被PBS中1∶4000稀释的C3a/C3a(desArg)小鼠抗人单克隆抗体(AntibodyShop，Grusbakken，Denmark)。将这些板放置于室温(RT)过夜。甩去未结合的抗体(即以突发性机械运动除去)，并将该板用200μl/孔DI水清洗3次。然后将各板用200μl/孔封闭缓冲液(PBS+Tween20 0.05％+牛血清清蛋白0.5％)室温封闭1.5小时。
将人血清与PBS、用PLURONIC稳定化的纳米颗粒(并因而羟基化的纳米颗粒)的悬浮液、和用以甲氧基封端的纳米颗粒(并因而未羟基化的纳米颗粒)的悬浮液以1∶1体积在Eppendorf管中37℃温育45分钟。对板完成封闭后，将它们用250μl/孔清洗缓冲液(PBS+Tween20 0.05％)清洗3次。然后将血清-纳米颗粒样品以50μl/孔一式三份添加至各孔中并于室温温育2小时。然后甩去样品，并将板用清洗缓冲液以250μl/孔清洗5次。然后以50μl/孔添加封闭缓冲液中1∶4000稀释的C3a/C3a(desArg)-生物素化检测用抗体(AntibodShop)，并于室温温育2小时。然后甩去C3a检测用抗体，并将板用清洗缓冲液以250μl/孔清洗5次。接着，将链霉亲和素-HRP抗体(R&D Systems)在封闭缓冲液中稀释至制造商推荐的浓度，并以50μl/孔添加至板，于室温温育2小时。然后甩去HRP抗体，并将板用清洗缓冲液以250μl/孔清洗5次。接着，以100μl/孔添加HRP底物试剂(R&D Systems)，室温下避光温育45分钟。通过添加50μl/孔2N H2SO4来终止反应。然后将板在Tecan读板仪上于450nm和540nm波长读数。将450nm读数减去540nm背景值，得到最终值。
将同PBS一起温育的血清中存在的C3a与用PLURONIC稳定化过的PPS纳米颗粒(并因而羟基化的纳米颗粒)和用甲氧基封端的PLURONIC稳定化过的PPS纳米颗粒(并因而未羟基化的纳米颗粒)温育后存在的C3a加以比较。如图8所示，同PBS一起温育的血清中存在的C3a，同甲氧基封端的PLURONIC稳定化过的PPS纳米颗粒一起温育，导致约7倍的增加，而同PLURONIC稳定化过的PPS纳米颗粒一起温育则导致约32倍的增加。测量人血清C3切割成可溶性C3a和结合型C3b的情况发现，羟基化的纳米颗粒如此比非羟基化的纳米颗粒激活更加多的补体系统。这证实了纳米颗粒的OH表面激活补体系统备选途径的效力远比甲氧基表面多。
实施例10：表面化学对DC成熟的影响
如先前所述，将25nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒(并因而羟基化的纳米颗粒；如本文所述生成)、25nm的用甲氧基封端的PLURONIC稳定化过的纳米颗粒(并因而未羟基化的纳米颗粒)、20nm的羧基化聚苯乙烯纳米珠(COOH-NS)(Invitrogen)、PBS、和LPS(30μg)皮内注入小鼠。然后如先前所述收获淋巴结，分离细胞，并对CD11c、CD86、CD80、和CD40染色。实施流式细胞术以确定淋巴结DC的成熟谱(profile)。
如图9中所见，与经甲氧基封端的PLURONIC稳定化的(并因而未羟基化的)纳米颗粒及与羧基化的聚苯乙烯纳米珠相比，经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒的CD86、CD80、和CD40谱显著不同。来自经PLURONIC稳定化后的纳米颗粒所处理动物的DC显示了这些DC成熟标志物的更高表达，而且它们诱导成熟至与阳性对照LPS类似的水平。来自用甲氧基封端PLURONIC稳定化的纳米颗粒所处理动物的DC和来自用羧基化聚苯乙烯纳米珠所处理动物的DC产生与阴性对照PBS注射几乎相同的DC成熟应答。这些结果显示了活体内DC成熟应答尤由20-25nm纳米颗粒的表面化学支配。羟基化的表面诱导DC成熟，而甲氧基和羧基表面则不然。基于本文所示结果，这些表面的功能差异在于羟基化表面进行的补体激活。
实施例11：尺寸对DC成熟的影响
如先前所述，将25nm的经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒、100nm的经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒以及PBS皮内注入小鼠。然后如本文所述收获淋巴结，分离细胞，并对CD11c、CD86、CD80、和CD40染色。实施流式细胞术以测定淋巴结DC的成熟谱。
如图10中所见，25nm的经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒的CD86、CD80以及CD40谱与表面化学性质相同的100nm纳米颗粒显著不同。25nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒显示这些DC成熟标志物的更高表达。100nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒注射产生与阴性对照PBS注射几乎相同的DC成熟应答。这些结果显示了活体内DC成熟应答尤与纳米颗粒尺寸有关。本文中描述了25nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒有效进入淋巴毛细管并移动至淋巴结，其程度比100nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒大得多。同样，淋巴结中DC对25nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒在淋巴结中的保持和DC对其的内在化比100nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒大得多。本文中还显示了25nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒的DC成熟比100nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒大得多。超小的25nm的PLURONIC稳定化纳米颗粒诱导DC成熟的能力证明了淋巴结靶向和表面化学性质对激活DC是有用的。基于本文展示的纳米颗粒进入淋巴毛细管的结果，预计45nm的经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒可激活淋巴结内的DC。
实施例12：OVA偶联至纳米颗粒
抗原偶联至PPS纳米颗粒可用蛋白质或肽，包括糖肽，使Pluronic(PEG与PPG的嵌段共聚物)表面官能化来实现。本实施例中提出了含游离半胱氨酸残基的蛋白质抗原用于化学偶联的偶联方案。其它官能基可用于相关方案，诸如N-末端或赖氨酸残基上的胺。抗原也可以吸附至纳米颗粒表面。
本文中显示了卵清蛋白(OVA)的偶联方案。OVA是用于调查DC抗原呈递的模型蛋白质，其拥有抗原性多肽OVA257-264和OVA323-339，它们分别可以由DC经由MHC I和II途径加工。偶联方案以合成Pluronic二乙烯基砜作为起始，该Pluronic二乙烯基砜在Michael加成反应中经OVA上的游离氢硫基基团与OVA偶联。这两个步骤的合成详情见下文。
Pluronic F127(Sigma)、二乙烯基砜(Fluka)、氢化钠(Aldrich)、甲苯(VWR)、乙酸(Fluka)、二乙醚(Fisher)、二氯甲烷(Fisher)和硅藻土(Macherey Nagel)以收到的状态使用。反应在氩气(Messer)下进行。在含氘的氯仿(Armar)中测量1H NMR，而化学移位(δ)用ppm值表示，是相对于0.0ppm时的内部标准物四甲基硅烷(Armar)信号的值。
将15g(1.18mmol)Pluronic F-127在400ml甲苯中的溶液用迪安-斯塔克疏水器(Dean-Stark trap)通过共沸蒸馏(azeotropic distillation)4小时来干燥。将溶液在冰浴中冷却，并添加0.283g(11.8mmol)氢化钠。将反应混合物搅动15分钟，并迅速添加3.55ml(35.4mmol)二乙烯基砜(Sigma-Aldrich)。室温下避光搅动5天后，添加1.35ml(23.6mmol)乙酸将反应淬灭。在硅藻土上过滤并将滤出液减压浓缩至小体积后，使产物在1升冰冷的二乙醚中沉淀。滤出固体物，将之溶于最小量的二氯甲烷，并在冰冷的二乙醚中沉淀，总共4次。真空干燥聚合物，得到6.0g，并保存于氩气气氛下、-20℃，以备OVA偶联之用。NMR显示，存在乙烯砜，官能化程度为88％。δ＝1.1(m，CH3，PPG)，3.4(m，CH，PPG)，3.5(m，CH2，PPG)，3.6(PEG)，6.1(d，CHcis＝CH-SO2)和6.4(d，CHtrans＝CH-SO2)，6.85(dd，CH2＝CHSO2-)。
偶联前，用截留分子量为6-8kDa的再生纤维素透析管，将PLURONIC乙烯砜针对水透析数日。通过冻干回收物质，并测量NMR以证实此步骤对乙烯砜基团数目没有影响。OVA的偶联是通过添加300mg(0.023mmol)PLURONIC乙烯砜至50mg(0.0011mmol)OVA在0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝8.1)中的溶液进行的。4℃反应6小时后，将反应混合物冻干。添加二氯甲烷，并将混浊的混合物于室温以12000rpm离心5分钟。除去含有未反应PLURONIC乙烯砜的二氯甲烷，并将沉淀物减压干燥以除去残余的二氯甲烷。然后将PL-VS-OVA保存于-20℃，直到用于纳米颗粒合成。
如本文所述合成颗粒，区别在于用PL-VS-OVA代替2％ wt的Pluronic。对PPS使用了总量为1.5％的PLURONIC(重量/体积)。为减少纳米颗粒合成过程中蛋白质或肽接触碱性条件，将反应时间缩短至6小时，并将碱以1∶1摩尔比添加到引发剂-硫醇中。
另外，PL-VS-OVA还可通过使OVA上的剩余游离硫醇起反应而用罗丹明碘代乙酰胺进行荧光标记。纳米颗粒可以合成和标记上荧光素碘代乙酰胺来生成双重标记的OVA偶联纳米颗粒，其中OVA标记有罗丹明，而纳米颗粒标记有荧光素。
如本文所述将双重标记的OVA偶联的纳米颗粒皮内注入小鼠。在注射后24小时和48小时的时刻取出淋巴结，然后将它们冷冻并冷冻切片。然后通过荧光显微镜检术检查淋巴结切片。
对OVA偶联的PLURONIC稳定化的纳米颗粒实施动态光散射，证明了尺寸维持于约25nm。注射后24和48小时之时，淋巴结中存在双重标记的OVA偶联的PLURONIC稳定化的纳米颗粒，如图11所证明的。OVA存在于与纳米颗粒相同的位置。这些结果证明，用约43kDa MW的蛋白质抗原OVA官能化的纳米颗粒不显著影响纳米颗粒尺寸。生成OVA偶联的25nm纳米颗粒的能力容许蛋白质抗原经淋巴运送至淋巴结中的DC。这种抗原至驻留淋巴结的DC的运送提供了增强后续获得性免疫应答的可能性。OVA在本文中仅仅作为例示性的模型抗原呈现。任何数目的分子抗原都可进行类似的利用，包括肽、蛋白质、包括糖肽、和编码蛋白质抗原的核酸。
实施例13：偶联至PLURONIC稳定化纳米颗粒的OVA所诱导的DC成熟
如本文所述，将25nm、偶联OVA的、PLURONIC稳定化的纳米颗粒和与脂多糖(LPS)混合的OVA皮内注入小鼠。然后如本文所述收获淋巴结，分离细胞，并对CD11c、CD86、CD80、和CD40染色。实施流式细胞术以测定淋巴结DC的成熟谱。
如图12所示，25nm、偶联OVA的、PLURONIC稳定化的纳米颗粒的CD86、CD80和CD40谱与阳性对照OVA加LPS几乎相同。二者都显示了这些DC成熟标志物的高表达。这些结果显示了通过PLURONIC稳定化的25nm纳米颗粒运送的OVA和与分子危险信号LPS共注射的OVA的体内DC成熟应答几乎相同。这表明了使用偶联至羟基化的和激活补体性的小(例如20-45nm)纳米颗粒(例如通过PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒)形成的OVA作为抗原运送媒介和成熟刺激佐剂二者的可能性。
实施例14：T细胞增殖
使用已知为T细胞过继转移的一种方法来测量T细胞增殖。OT-II Tg(Jackson Immunoresearch)小鼠是转基因的，即它们在CD4 T细胞中具有上调水平的OVA T细胞受体。分离来自OT-II Tg小鼠的脾和淋巴结以制备细胞悬浮液。对于脾细胞悬浮液，将红细胞用1.667％ NH4Cl溶解。合并来自脾和淋巴结的细胞并计数：回收了总共400x106个细胞。
将细胞用羧基荧光素琥珀酰亚氨基酯(CFSE)标记，并以20x106/ml重悬于不含FBS的RPMI。CFSE储液是DMSO中的5mM。在PBS中制备1/10的第一稀释液，并向细胞添加必要体积以得到终浓度5μM。添加CFSE，温和混匀，并与细胞一起于37℃温育10分钟，让盖子敞开着，并每约2分钟温和混匀一次(将细胞分到两管中，以防凝块形成和细胞死亡)。温育后，添加含5％ FBS的RPMI以清洗细胞，用不含FBS的RPMI清洗一次，并用PBS清洗一次。对总共300x106个细胞标记CFSE后进行细胞计数。
将细胞以50x106/ml重悬于PBS，并将10x106个细胞(200μl/小鼠)注射到CD45.1同类系(congenic)受试小鼠的尾静脉内。保留一部分细胞，用于通过流式细胞术检查所注射T细胞的CFSE标记和CFSE+的比例。将细胞染色，用APC抗CD4染色。
在第2天，将20μl抗原(OVA 10ug+5ug LPS或25nm OVA偶联的PLURONIC稳定化的纳米颗粒10ug)注射入受试小鼠的前足垫。在第5天，将小鼠处死，并取出每只小鼠的臂淋巴结和腋窝淋巴结，合并以制备细胞悬浮液。将细胞对CD45.2 PE、碘化丙啶(死细胞)和CD4别藻蓝蛋白染色。实施流式细胞术以测量T细胞增殖。
图13(左图)显示了注射PBS后，所有CFSE标记的OT-II T细胞保持于最大荧光水平。然而，注射阳性对照OVA加LPS(中图)和注射偶联至25nm的经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的PPS纳米颗粒的OVA后，CD4 T细胞的荧光有显著降低。荧光的这种降低指示子代细胞群，其展示出比亲本群少的荧光。注射OVA加LPS或注射偶联至PLURONIC所稳定化的PPS纳米颗粒的OVA后有大约7个循环的增殖。
OT-II小鼠是转基因的，即它们拥有上调了T细胞OVA受体的CD4 T细胞。因此这些T细胞在它们遭遇OVA抗原时极其敏感。因此，CFSE标记的OT-II T细胞过继转移入WT小鼠是体内测量T细胞增殖的卓越模型。
本文中证明了淋巴结DC在运送偶联至25nm的经PLURONIC稳定化(并因此羟基化)的PPS纳米颗粒的OVA后成熟。这些结果现在显示了在纳米颗粒的这种内在化后，OVA抗原至少部分经由MHC-II途径加工，且其抗原肽由成熟DC呈递给CD4 T细胞。CD4 T细胞继而成激活态并增殖。激活的CD4 T细胞能够帮助获得性免疫应答(例如把抗原呈递给B细胞来诱导抗体生成)。我们的结果证明了偶联至25nm的、PLURONIC稳定化的(并因而羟基化的和激活补体性的)OVA能够以与阳性对照OVA加LPS非常类似的水平诱导T细胞增殖。这是重要的，因为它表明将会进一步发生T细胞介导的免疫应答。
实施例15：CD8T细胞记忆-细胞免疫的测量
如本文所述，将25nm、偶联OVA的PLURONIC稳定化纳米颗粒、PBS中的OVA、和OVA加LPS注入C57/BL6小鼠。然后在第7天给予小鼠加强注射。在第21天，如本文所述处死小鼠，取出淋巴结，并分离细胞。使用血球计对细胞悬浮液计数。
遵照制造商的方案准备针对IFN-γ的ELISPOT板(eBioscience)。将含10％小鼠血清的RPMI培养基按20μl/孔添加至每个孔。接着，向每个孔添加2个单位的IL-2和0.4μg CD28。接着，以2mM浓度添加20μl/孔OVA323-339MHC-I肽。然后以100μl/孔向各孔添加细胞。有些孔不接受OVA肽，作为无刺激对照，而其它孔接受PMA，作为阳性对照。将板置于37℃温箱中2天。2天后，遵照制造商的方案将ELISPOT板显色。使用Leica MZ1 6FA立体镜采集各孔的图像。然后用Matlab图像分析程序对各孔中的斑点计数。
如图14所示，免疫小鼠后，使用ELISPOT试验来测定再次暴露于抗原后能生成IFN-γ的CD8T细胞(通过板上的斑点测)的量。接受注射PBS中的OVA的小鼠显示出非常小数目的IFN-γ T细胞，而在注射偶联至25nm的PLURONIC稳定化的(并因而羟基化的和激活补体性的)纳米颗粒的OVA、阳性对照OVA加LPS的小鼠中有显著升高。与本文所示其它结果一致，偶联至非常小(例如20-45nm)的、补体激活性的纳米颗粒(例如经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的PPS纳米颗粒)的OVA能够诱导DC成熟和CD4 T细胞增殖。这些结果显示了偶联至PLURONIC稳定化的25nm纳米颗粒的OVA可充分生成CD8 T细胞记忆。CD8 T细胞响应由MHC-I途径加工和呈递的抗原。MHC-I途径一般与在DC细胞质中加工的抗原有关。这表明纳米颗粒可运送抗原用于MHC-I和-II加工和呈递二者。CD8 T细胞还已知为细胞毒性杀伤T细胞，因为它们直接攻击病原体和感染了病原体的细胞。因此，小尺寸(例如20-45nm)激活补体性(例如PLURONIC稳定化的)纳米颗粒生成CD8 T细胞记忆的能力显示出其用于疫苗的强烈潜力。
 实施例16：抗体(Ab)滴度-体液免疫的测量
如上所述将25nm、偶联OVA、经PLURONIC稳定化(并因此羟基化)的纳米颗粒；100nm、OVA偶联、经PLURONIC稳定化(并因此羟基化)的纳米颗粒；25nm、偶联OVA、甲氧基封端的PLURONIC稳定化的(并因而未羟基化的)纳米颗粒；PBS中的OVA；和OVA加LPS注射入C57/BL6小鼠。将25nm、偶联OVA、经PLURONIC稳定(并因此羟基化)的纳米颗粒和OVA加LPS注射入C3-/-小鼠。从注射前和注射后第21天采集自小鼠的血液分离血清，并保存于-20℃直到使用。不进行加强注射。
将96孔板(Becton Dickinson)用PBS中的OVA(2μg/ml)以100μl/孔包被。将板于室温(RT)放置过夜。甩去未结合的抗原，并将板用200μl/孔DI水清洗3次。然后将板于室温用200μl/孔封闭缓冲液封闭1.5小时。
将小鼠血清样品在封闭缓冲液中自1∶103连续稀释至1∶108。当板完成封闭时，将它们用150μl/孔清洗缓冲液清洗3次。然后将血清样品按50μl/孔添加至各孔并于室温放置2小时。添加注射前血清样品，一式三份。然后甩去样品，并将板用150μl/孔清洗缓冲液清洗5次。将小鼠抗IgG-HRP在封闭缓冲液中1∶3000稀释，并以50μl/孔添加，室温下放置2小时。然后甩去HRP抗体，并将板用150μl/孔清洗缓冲液清洗5次。接着，以100μl/孔添加HRP底物试剂(R&D Systems)，室温下避光放置45分钟。添加50μl/孔2N H2SO4来终止反应。然后在Tecan读板仪上于450nm和540nm波长对板测量吸光度。将450nm读数减去540nm背景值，得到最终值。如果注射后血清值大于截留值，则确定为阳性样品。截留值计算自注射前一式三份平均值加3倍标准偏差。具有阳性值的最高稀释度视为抗体(Ab)滴度值。
如图15所示，测定了注射各种处理剂的小鼠中log10 IgG OVA抗体滴度。注射阴性对照OVA加PBS的小鼠显示出没有阳性滴度。注射阳性对照OVA加LPS的小鼠显示出阳性滴度介于3-6之间，野生型和C3-/-小鼠均如此。注射偶联至25nm、PLURONIC稳定化PPS纳米颗粒的OVA，产生了滴度4，而注射偶联至100nm、PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒的OVA和偶联至25nm、甲氧基封端的PLURONIC所稳定化的PPS纳米颗粒的OVA产生了更低的滴度值。最后，用偶联至25nm的PLURONIC所稳定化PPS纳米颗粒的OVA处理的动物的抗体滴度在C3-/-小鼠中显著更低。
OVA IgG抗体滴度的存在是体液免疫的证据。该过程发生的一种路径是抗原由DC加工并呈递给CD4 T细胞，后者然后刺激B细胞来生成针对抗原的抗体。在没有危险信号时运送游离蛋白质抗原已知不能显著诱导体液免疫，而且我们的结果显示了这一点，即PBS中的OVA不产生阳性滴度。然而，阳性对照OVA加LPS在野生型和C3-/-小鼠中都显示出显著水平的滴度。我们在本文中已经显示了偶联至25nm的PLURONIC稳定化的(并因而羟基化的和激活补体性的)PPS纳米颗粒的OVA可诱导DC成熟、T细胞增殖和CD8 T细胞记忆。通过生成抗OVA IgG滴度，这些结果显示了偶联至25nm的PLURONIC稳定化的(并因而羟基化的和激活补体性的)纳米颗粒的OVA还可诱导体液免疫。偶联至100nm的PLURONIC稳定化的纳米颗粒的OVA不生成阳性滴度，证明了淋巴结靶向对于纳米颗粒诱导体液免疫是至关重要的。同样，偶联至25nm、甲氧基封端、PLURONIC稳定化的纳米颗粒的OVA(其激活补体至低得多的程度)显示出降低的抗体滴度值，表明控制表面化学性质对于生成由补体激活介导的这样强的免疫应答也是必需的。最后，显示了补体激活在诱导体液免疫中发挥重要作用，因为偶联至25nm、PLURONIC稳定化的PPS纳米颗粒的OVA在C3-/-小鼠中生成比野生型小鼠中低得多的滴度值。
这些结果证明了如本文所述制备的各个实施方式的纳米颗粒(其具有经由淋巴结靶向发挥作用的特定大小，和特定的表面化学性质，即能够补体激活(例如羟基化的，通过PLURONIC稳定化和其它手段得到的))，可用于与共注射的抗原一起产生强烈的T细胞依赖性体液免疫。本文中证明了在抗原偶联至纳米颗粒表面时就是这种情况；将抗原结合至纳米颗粒表面的吸附方法也将是有效的。抗原与此类纳米颗粒的共注射也应当是有效的，尽管可能程度较低。
实施例17：疏水性药物加载
加载疏水性药物，例如地塞米松可用适宜的溶剂蒸发方法来实现[132、133]。简言之，举例而言，将药物添加至溶剂二氯甲烷(1mg/ml)。然后将1ml药物-溶剂悬浮液添加至1ml 20mg/ml PPS纳米颗粒溶液。将乳液室温下避光不停搅动以蒸发掉溶剂。药物加载效率通过GPC来测量。
实施例18：可制备能诱导Th1偏爱性应答(指示细胞免疫的激活)的补体激活性纳米颗粒
以Th1偏爱性应答为特征的细胞免疫是多种应用的疫苗所需要的。通过测定DC激活的分子标志物，使用骨髓衍生DC(BMDC)激活的一种体外模型来收集Th1应答的证据。细胞因子表达样式指向纳米颗粒配制剂的作用机制。具体而言，在体外将BMDC暴露于纳米颗粒和对照配制剂，并测量IL-12p40，即DC激活T细胞的能力中的一种关键调节物。观察到与暴露于LPS所诱导的相比有力的IL-12p40分泌(图16小图a)。与携带羟基的纳米颗粒的表观作用机制一致，只在纳米颗粒暴露于血清(正如注射后会发生的)后观察到此效果，而且激活补体依赖于纳米颗粒表面上羟基基团的存在。如此强的IL-12p40应答显示了获得性免疫应答的完整应答，包括Th1应答。图16小图b显示了与仅有血清相比在血清存在下展示羟基基团的纳米颗粒使MHCI升高4倍。另外，图16小图c显示了带羟基的25nm、PPS核心的补体激活性纳米颗粒在小鼠中诱导CD8 T细胞记忆，表现为由纳米颗粒诱导的干扰素-γ生成，但对照组则不然。
实施例19：补体激活性纳米颗粒展示有力的安全性概况
这些结果出乎意料地证明了为DC提供激活信号的补体激活路径具有特别的毒物学优势：在体外用25nm的PPS核心的补体激活性纳米颗粒刺激的BMDC在血清暴露后被强烈激活(如通过CD86、CD80和CD40的表达而测量的)，但是不表达TNF-a或IL-6，即能导致来自危险信号暴露的毒性效应的细胞因子。作为用于比较的佐剂，选择了LPS(对于临床使用而言毒性太高)，而且选择了CpG DNA(为了临床使用正积极开发)。用BMDC获得的此数据没有展现出可测量的TNF-a或IL-6生成，与暴露于CpG DNA和LPS后观察到的形成对比(图17)。
实施例20：经由TLR-4活化来发挥功能的补体激活性纳米颗粒
据信Toll样受体TLR4能介导纳米颗粒结合的补体的有力应答。当为暴露于血清的25nm、PPS核心的补体激活性羟基化纳米颗粒测量到来自自TLR4-/-小鼠(不表达TLR4的小鼠)分离的BMDC的IL-12p40分泌时，IL-12p40水平与野生型小鼠(其表达TLR4)相比显著降低；作为对照，用CpG DNA(一种不同TLR的配体)刺激的BMDC没有展现出差异(图18小图a)。此外，当对羟基化纳米颗粒测量到抗卵清蛋白(OVA)滴度时，OVA结合的纳米颗粒在TLR4-/-动物中未能诱导应答，而对照佐剂CpG DNA确实诱导了正常应答(图18，小图b)。无TLR4的小鼠不产生针对OVA结合的纳米颗粒的抗体，但是有TLR4受体的小鼠确实响应OVA结合的纳米颗粒而产生抗OVA抗体。对照生物学和化学测量决定性地排除了纳米颗粒受到TLR活化剂污染的可能性。
实施例21：纳米颗粒结合的硫醇模块触发获得性免疫应答
有表面氢硫基的纳米颗粒对补体依赖性获得性免疫应答的激活具有令人惊讶的和出乎意料的效果。这些结果意味着新的纳米颗粒材料配制剂和用途。例如，携带表面氢硫基的，表面上还存在羟基或甲氧基之中任一基团的25nm、PPS核心的纳米颗粒有力地激活补体，如通过C3a生成所测量的，而氢硫基的缺失显著降低补体激活的水平(图19)。此现象对于具有羟基和氢硫基二者的纳米颗粒表面是最有力的。
另外，体外BMDC被携带羟基和氢硫基表面的25nm的PPS核心的纳米颗粒强烈激活(通过CD80表达和IL-12p40生成来测量)。然而，用没有氢硫基的纳米颗粒羟基表面没有观察到此效果(图20)。
实施例22：可以在纳米颗粒疫苗组合物中掺入分子危险信号
可将多种分子危险信号掺入纳米颗粒表面中或掺加在纳米颗粒表面上。虽然有可能将亲水性危险信号附着到纳米颗粒的表面上，但是也有可能将疏水性危险信号掺入纳米颗粒的疏水性核心内。疏水性危险信号的一个例子是药物咪喹莫特，及其同族药物中活化TLR-7的成员。将咪喹莫特加载至25nmPPS核心纳米颗粒的疏水性核心内，如早就描述的，并将这些暴露于体外BMDC。通过流式细胞术进行的对DC激活的表征提供了纳米颗粒疏水核心中所掺加的咪喹莫特对DC激活的有力证据(图21)。
实施例23：自组装的纳米颗粒作为一种技术平台
微团形成
纳米颗粒，包括聚合物微团，可用于实施补体激活的多种实施方式。图22显示了封端或不封端-SH基团的OH-PEG-PPS的合成路径的一个例子。图23显示了一个合成CH3-PEG-PPS的路径的例子。这些分子可用于形成微团。微团形成方法包括从有机溶剂分散到水性介质中，从薄膜悬浮至水性介质中，或聚合物直接水合。
微团形成方法的一个例子可见于Velluto et al.，Molecular Pharmaceutics2008，“PEG-b-PPS Diblock Copolymer Aggregates for Hydrophobic DrugSolubilization and Release：Cyclosporin A as an Example”，该文收入本文作为参考。某些实施方式包括以大于约30％的效率加载有药剂的微团；技术人员将立即领会，明确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如大于约50％、或约66％。加载方法包括例如共溶剂蒸发法或热水悬浮法。微团中可封装药剂，例如抗原、药物或核酸。封装方法包括那些效率大于约30％者；技术人员将立即领会，明确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如大于约50％、或约70％。
微团形成及抗原附着
也可容易地将抗原附着在PEG-PPS嵌段共聚物微团的表面上。一种这样做的路径是提供一些有胺官能度的链末端，然后对其偶联肽或蛋白质抗原。图24显示了此类聚合物的一种路径。
还已进行过偶联抗原的其它路径。如图25所示，一种已经使用的方案是用来合成肽或蛋白质抗原，以携带可附着在纳米颗粒表面吡啶基二硫基上的不配对半胱氨酸残基。已经使用的另一种办法是合成肽或蛋白质抗原，以包含抗原加工中所涉及的蛋白酶底物，诸如组织蛋白酶S底物；组织蛋白酶S既牵涉MHC I抗原加工又牵涉MHC II抗原加工。描述了序列KQKLR(SEQ IDNO：3)作为例子。这样，原位生成实际抗原性肽。
图25a中显示的方案以及图25b和25c中的备选安排已经用于将肽抗原缀合至纳米颗粒表面，而且已经展现出在细胞摄取和加工后细胞内释放它们的肽有效载荷。例如，图26显示了结果，其中将卵清蛋白的SIINFEKL(SEQ IDNO：2)MHC I肽缀合至25nm的、PPS核心的补体激活性羟基化纳米颗粒，而且在注射和收获后，通过用对SIINFEKL-MHC I复合物特异性的抗体进行流式细胞术，证明了驻留淋巴结的DC在MHC I复合物内正确地展示了肽。这证明了缀合方案是有效的，而且还证明了设计的释放机制，即还原二硫化物，较好地发挥功能。
已经开发了一些方案，藉助这些方案能在人们不希望表达携带不配对半胱氨酸变异抗原时，将氢硫基官能度(functionality)添加至可能没有此类官能度的抗原，例如蛋白质抗原。在许多情况下，可用例如图27介绍的方案将末端α-胺变成末端氢硫基。
采用DC激活的实验已证明，在PEG-PPS微团中也看到了对交联核心PPS纳米颗粒观察到的相同效果。自6-8周龄C57BL6/J健康小鼠提取骨髓衍生树突细胞(BMDC)，并予细胞培养，用重组GM-CSF来诱导分化成DC。如下制备PEG-PPS的微团。为了形成无氢硫基的微团，使用H3CO-EG46-PS17-phth、HO-EG68-PS20-phth、H3CO-EG46-PS11-SH和HO-EG68-PS25-SH在10mmol PBSpH 7.4中自THF形成微团(phth指酞酰亚胺)。将H3CO-EG46-PS17-phth和H3CO-EG46-PS11-SH的样品标准化至8.2mg/mL，而将HO-EG68-PS25-SH和HO-EG68-PS20-phth的样品标准化至16.6mg/mL。然后将这些添加至BMDC(100,000个细胞每孔)，H3CO聚合物为122μL，或HO聚合物为60.3μL，以添加1mg聚合物每孔。然后将细胞和微团在有或无小鼠血清下温育45分钟，清洗，然后在培养基中温育24小时。用抗CD11c-别藻蓝蛋白和抗CD86-PE(Pharmigen)抗体标记细胞，并如上所述使用FACS对结果定量。用PluronicF-127 PPS核心纳米颗粒(～1mmol SH)和未甲基化的CpG对照组进行比较。
本实施例中所用微团的平均直径为18nm，而且通过调整PEG和PPS分子量能容易地制备10nm-50nm范围内的微团。技术人员会认识到微团形状或自组装结构将取决于亲水性嵌段分子量(这里是PEG分子量)与疏水性嵌段分子量(那里是PPS分子量)之比，而微团的尺寸或自组装结构将取决于总分子量。因而，比本实施例中检验的微团大的球状微团可按同样的嵌段分子量比得自更高分子量嵌段共聚物，而较小的球状微团则可按同样的嵌段分子量比得自较低分子量嵌段共聚物。因而，比本实施例中检验的微团大的球状微团可按同样的嵌段分子量比得自更高分子量嵌段共聚物，而较小的球状微团则可按同样的嵌段分子量比得自较低分子量嵌段共聚物。人们注意到，凭借本实施例所示的PEG-PPS微团，观察到HO-基团的同样重要性以及HS-基团在补体激活中的作用，如图28所示。因此，获得携带抗原、能激活补体、靶向淋巴结的微团是非常有用的。
除抗原分子之外，也可使用上文所述化学方案将危险信号分子化学缀合至纳米颗粒表面。例如，如图29所示，可将CpG DNA偶联至纳米颗粒表面。
实施例24：分支的或多功能的可溶性聚合物是一种有用的平台
这些数据显示了有可能形成很小的纳米结构，该纳米结构能激活补体且在可溶性多功能聚合物，诸如分支聚合物，例如分支PEG中展示抗原。如下确立了羟基化的且能够激活补体的分支PEG在体内激活淋巴结中的DC的能力，即注射40kDa分子量的8臂PEG。自小鼠的淋巴结分离细胞，并通过流式细胞术对DC分析激活。如图30所示，HO-封端的分支PEG能够在体内有力地激活DC。有方案可用于生成分支PEG，其也为抗原偶联而活化，诸如图31中显示的。
实施例25：用于DNA疫苗和其它应用的纳米颗粒载体
已得到证明的是，由混合了PEG-PPS-PEI的PEG-PPS所形成的超小DNA复合物(参见WO2007/008300或US2005000686188，该专利文件按收入本文资作参考)尺寸很小(如图所示，直径为30nm)，能在间质注射后进入淋巴系统，并能有效转染淋巴结中的细胞。图32a示出一种合成PEG-PPS-PEI(也称PEG-PPS-ss-PEI，用来指示PPS域与PEI域之间二硫键的存在(此二硫键是任选的)的方案。此图举例说明了用聚合度为44的PEG进行的合成，但以同样的方式也可按其它聚合度进行合成。如本实施例所例示，微团尺寸可用PEG-PPS-PEI与PEG-PPS的混合物形成混合微团来有力地控制。当自PEG44-PPS40-PEI120(1mg)和PEG44-PPS20(10mg)形成混合微团时，含DNA的复合物的平均直径只有30nm，技术人员会认识到是很小的DNA复合物。因而，虽然自所示分子量的PEG-PPS-PEI形成相当大的微团，但与PEG-PPS混合能迫使微团尺寸小得多，甚至在与DNA络合后。如图32b所示，在两项分开的实验中，淋巴结中驻留的细胞5％以上被绿色荧光蛋白(GFP)转染，数目相当高。在这些转染的细胞中，流式细胞术分析显示了T细胞和B细胞被非常有效地转染，而且DC也被有效转染。DNA疫苗的概念，即提供以遗传序列编码的抗原，当然已经由其他人证明，然而，技术人员会公认，如本文所述，淋巴结中的转染细胞，不是外周中的细胞，而是一个非常不同的概念，其导致新的疗法、新的治疗办法，而且需要独特的装置。如此，本文所述具有能够通过间质流而靶向淋巴结并转染淋巴结中的免疫细胞诸如B细胞、DC和巨噬细胞以及T细胞的结构的超小纳米颗粒形式呈现了DNA疫苗的一种有力新办法。这通过以很小复合物的形式(小于约50nm，更优选约30nm)来提供DNA而实现。
实施例26：用于抗原特异性耐受原性疫苗的纳米颗粒载体
如本文所述，可用纳米颗粒和聚合物微团来将抗原运送至树突细胞，而且还免疫抑制剂运送至该细胞。图33示明，可将骨髓衍生DC暴露于加载地塞米松的25nm PPS核心纳米颗粒，然后可暴露于很强的DC激活信号如LPS；掺入纳米颗粒中的免疫抑制剂甚至在如此强的信号下阻止DC激活。
实施例27：抗原掺入的物理化学机制
除在纳米颗粒上共价嫁接抗原之外，还考虑到物理化学手段。一种有效的方法是合成或表达肽或蛋白质抗原来掺入一段强阴离子氨基酸，如寡E或寡D区，以能够形成静电复合物，如用于siRNA者或适体复合物。正如聚阴离子DNA与含PEG-PPS-PEI的微团的复合物能形成一样，也有可能将包含所设计的阴离子区的抗原掺入这些含聚阳离子的聚合物微团中。另一种物理化学方法是将抗原肽或蛋白质掺入水核心囊泡内，例如用PEG-ss-PPS形成的。此类囊泡的形成可参见Cerritelli等人的论文Biomacromolecules2007：1966-1972来实现。当想要抗原的胞质释放时，如MHC I呈递的情况，这种抗原运送方法是特别有用的。此类囊泡的尺寸可通过多种手段来控制，例如通过灌注穿过膜滤器，产生大小与它们灌注穿过的膜的孔相似的囊泡，参见Napoli等人的论文，Nature Materials，2004，3：183-189。细胞摄取后的释放能非常有效地将水溶性有效载荷运送至DC的胞质，如图34中用骨髓衍生的DC所示。因而，本发明的诸实施方式包括是水核心囊泡的纳米颗粒，例如尺寸范围为约10nm至约50nm或70nm的纳米颗粒；技术人员将立即领会，明确述及范围内的所有范围和数值都在本发明范围内，例如小于约50nm或18nm。
实施例28：纳米颗粒运送至粘膜表面
在上述各实施例中，所探索的主要施用路径是组织中的注射，诸如皮内或皮下注射，尽管预期肌肉内注射会是相似的。纳米颗粒的超小尺寸对于纳米颗粒进入引流淋巴系统是关键的。纳米颗粒的超小性质还可用于获得进入其它组织。在疫苗接种中，对粘膜感兴趣，原因在于想要生成粘膜免疫，而且可获得无针头施用。可以在口腔中、在注射后、在鼻腔中、在阴道腔中、和在直肠腔中到达粘膜。将直径30nm的PPS核心的纳米颗粒施用至啮齿类动物的舌下粘膜，并通过荧光显微术来测定进入粘膜粘膜的穿透。另外，在轻度压力下借助钝头套管将纳米颗粒配制剂施用至舌下粘膜。图35展现了30nm的PPS核心的纳米颗粒在轻度压力下极其有效地穿透舌下粘膜，而100nm的PPS核心的纳米颗粒穿透不怎么有效。100nm的PPS核心的纳米颗粒的穿透比30nm的PPS核心的纳米颗粒所获得的要小得多。除了在组织屏障内如间质内的渗透之外，这些结果证明了超小纳米颗粒可用于穿透过组织屏障，诸如粘膜。在穿透粘膜(包括口腔粘膜)的情况下，穿透到粘膜层(以便被这里的抗原呈递细胞收集)及穿透过粘膜层(以便最终在引流淋巴结中收集)均令人关注。图35展现了很小的30nm纳米颗粒在轻度压力下施用时穿透到粘膜深处。虽然本实施例中在啮齿类动物中使用钝头套管，对于人，许多非常简单的装置，诸如弹性的或其它形式可变性杯状物(用手指按压，它们的开口侧在舌下组织上)可用于施加轻度的增强穿透的压力。
统计
除另行指明外，各实施例中的统计学显著性均通过实施双尾Student氏t检验来测定的。结果表示为平均值±SD，每种条件进行3-8次实验，除非另外指明。
载体、稀释剂、试剂盒
可使用药学可接受载体或赋形剂来实现本文中所述的各实施方式。赋形剂指用作治疗剂稀释剂或媒介的惰性物质。药学可接受载体一般与某种化合物一起使用，以使该化合物对于治疗或作为产品是有用的。通常，对于任何物质而言，药学可接受载体指与该物质组合以运送至动物的材料。常规的药学载体，水性、粉状或油性基质，增稠剂等等可能是必需的或想要的。在一些情况中，载体对于运送是至关重要的，例如用于使用于液体运送的不溶性化合物增溶；缓冲剂，用于控制物质的pH以保留其活性；或稀释剂，用于防止物质在贮存容器中的损失。然而，在其它情况中，载体是为了方便，例如为了更方便施用的液体。本文所述化合物的药学可接受盐可依照本领域技术人员知道的方法来合成。剩余的胺可以用钠、钾、或其它合适反荷离子来络合。如此，药学可接受组合物具有适合于对患者施用的载体、盐、或赋形剂。此外，此类组合物的惰性成分是生物相容的且无毒的。
本文所述纳米颗粒可以与根据预定施用形式及与常规药学实践一致而适当选择的合适的药学稀释剂、溶液、赋形剂、增量剂、或载体(在本文中称作药学可接受载体，或载体)混合施用。如此，可以以适合于口服、直肠、表面、静脉内注射、关节内注射、或胃肠外施用的形式来制备可运送的化合物。载体包括固体或液体，而且基于要使用的施用类型来选择载体的类型。可以包括合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、芳香剂、流动诱导剂、和熔化剂(melting agent)作为载体，例如用于丸剂。例如，活性成分可以与口服、无毒、药学可接受的惰性载体组合，诸如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、甘露醇、山梨醇等等。化合物可以以固体剂量形式诸如胶囊剂、片剂、和粉剂，或者以液体剂量形式诸如酏剂、糖浆剂、和混悬剂口服施用。也可以以无菌液体剂量形式胃肠外施用活性化合物。也可使用用于实现生理pH或渗量的缓冲剂。在使用中，可以通过如下的方法给患者提供纳米颗粒，该方法包括例如通过注射、口服、含服、作为栓剂、经皮、透皮贴剂、或表面(例如通过软膏剂或油膏剂)导入患者中。
可以将多个实施方式制备成试剂盒的一部分，该试剂盒具有用于制备和/或运送纳米颗粒的成分。试剂盒指用户实现预定任务所需要的材料的集合；可以例如在单一容器诸如盒、袋、或包中提供试剂盒。制备和/或使用纳米颗粒的说明可包括指导用户所需要的步骤，例如本文中别处描述的。可以在试剂盒中或分开地提供敷药器。敷药器的例子有注射器、棉签、擦纸、或产生轻微压力的装置。
参考文献
下述参考文献收入本文作为参考到与本申请明确公开的内容不抵触的程度。
[1]J.Banchereau，R.M.Steinman，″Dendritic cells and the control ofimmunity″，Nature 392(6673)(1998)245-252.
[2]J.G.Cyster，″Chemokines- Chemokines and cell migration in secondarylymphoid organs″，Science 286(5447)(1999)2098-2102.
[3]G.J.Randolph，V.Angeli，M.A.Swartz，″Dendritic-cell trafficking to lymphnodes through lymphatic vessels″，Nature Reviews Immunology 5(August 2005)(2005)617-628.
[4]L.Bonifaz，D.Bonnyay，K.Mahnke，M.Rivera，M.C.Nussenzweig，R.M.Steinman，″Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptorDEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on majorhistocompatibility complex class I products and peripheral CD8(+)T celltolerance″，Journal of Experimental Medicine 196(12)(2002)1627-1638.
[5]L.C.Bonifaz，D.P.Bonnyay，A.Charalambous，D.I.Darguste，S.Fujii，H.Soares，M.K.Brimnes，B.Moltedo，T.M.Moran，R.M.Steinman，″In vivotargeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptorimproves T cell vaccination″，J Exp Med 199(6)(2004)815-824.
[6]M.J.Copland，M.A.Baird，T.Rades，J.L.McKenzie，B.Becker，F.Reck，P.C.Tyler，N.M.Davies，″Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells″，Vaccine 21(9-10)(2003)883-890.
[7]P.Elamanchili，M.Diwan，M.Cao，J.Samuel，″Characterization ofpoly(D，L-lactic-co-glycolic acid)based nanoparticulate system for enhanceddelivery of antigens to dendritic cells″，Vaccine 22(19)(2004)2406-2412.
[8]S.Faraasen，J.Voros，G.Csucs，M.Textor，H.P.Merkle，E.Walter，″Ligand-specific targeting of microspheres to phagocytes by surface modificationwith poly(L-lysine)-grafted poly(ethylene glycol)conjugate″，Pharm Res 20(2)(2003)237-246.
[9]Y.J.Kwon，E.James，N.Shastri，J.M.Frechet，″In vivo targeting of dendriticcells for activation of cellular immunity using vaccine carriers based onpH-responsive microparticles″，Proc Natl Acad Sci U S A 102(51)(2005)18264-18268.
[10]Y.J.Kwon，S.M.Standley，S.L.Goh，J.M.Frechet，″Enhanced antigenpresentation and immunostimulation of dendritic cells using acid-degradablecationic nanoparticles″，J Control Release 105(3)(2005)199-212.
[11]Y.J.Kwon，S.M.Standley，A.P.Goodwin，E.R.Gillies，J.M.Frechet，″Directed antigen presentation using polymeric microparticulate carriersdegradable at lysosomal pH for controlled immune responses″，Mol Pharm 2(1)(2005)83-91.
[12]C.L.van Broekhoven，C.R.Parish，C.Demangel，W.J.Britton，J.G.Altin，″Targeting dendritic cells with antigen-containing liposomes：a highly effectiveprocedure for induction of antitumor immunity and for tumor immunotherapy″，Cancer Res 64(12)(2004)4357-4365.
[13]C.Wang，Q.Ge，D.Ting，D.Nguyen，H.R.Shen，J.Z.Chen，H.N.Eisen，J.Heller，R.Langer，D.Putnam，″Molecularly engineered poly(ortho ester)microspheres for enhanced delivery of DNA vaccines″，Nature Materials 3(3)(2004)190-196.
[14]R.F.Wang，H.Y.Wang，″Enhancement of antitumor immunity by prolongingantigen presentation on dendritic cells″，Nature Biotechnology 20(2)(2002)149-154.
[15]N.S.Wilson，D.El-Sukkari，G.T.Belz，C.M.Smith，R.J.Steptoe，W.R.Heath，K.Shortman，J.A.Villadangos，″Most lymphoid organ dendritic cell types arephenotypically and functionally immature″，Blood 102(6)(2003)2187-2194.
[16]M.Sixt，N.Kanazawa，M.Seig，T.Samson，G.Roos，D.P.Reinhardt，R.Pabst，M.B.Lutz，L.Sorokin，″The conduit system transports soluble antigensfrom the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymphnode″，Immunity 22(1)(2005)19-29.
[17]D.W.Pack，″Timing is everything″，Nat Mater 3(3)(2004)133-134.
[18]H.C.Probst，J.Lagnel，G.Kollias，M.van den Broek，″Inducible transgenicmice reveal resting dendritic cells as potent inducers of CD8+ T cell tolerance″，Immunity 18(5)(2003)713-720.
[19]M.J.Copland，M.A.Baird，T.Rades，J.L.McKenzie，B.Becker，F.Reck，P.C.Tyler，N.M.Davies，″Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells″，Vaccine 21(9-10)(2003)883-890.
[20]M.A.Swartz，″The physiology of the lymphatic system″，Advanced Drug Delivery Reviews 50(1-2)(2001)3-20.
[21]C.J.H.Porter，″Drug delivery to the lymphatic system″，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 14(4)(1997)333-393.
[22]C.J.H.Porter，S.A.Charman，″Lymphatic transport of proteins aftersubcutaneous administration″，Journal of Pharmaceutical Sciences 89(3)(2000)297-310.
[23]M.Papisov，R.Weissleder，″Drug delivery to lymphatic tissue″，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 13(1-2)(1996)57-84.
[24]C.Oussoren，J.Zuidema，D.J.A.Crommelin，G.Storm，″Lymphatic uptakeand biodistribution of liposomes after subcutaneous injection.2.Influence ofliposomal size，lipid composition and lipid dose″，Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1328(2)(1997)261-272.
[25]A.E.Hawley，S.S.Davis，L.Illum，″Targeting of Colloids to Lymph-Nodes-Influence of Lymphatic Physiology and Colloidal Characteristics″，Advanced Drug Delivery Reviews 17(1)(1995)129-148.
[26]T.M.Allen，C.B.Hansen，L.S.S.Guo，″Subcutaneous Administration ofLiposomes-a Comparison with the Intravenous and Intraperitoneal Routes ofInjection″，Biochimica Et Biophysica Acta 1150(1)(1993)9-16.
[27]S.M.Moghimi，″Modulation of lymphatic distribution of subcutaneouslyinjected poloxamer 407-coated nanospheres：the effect of the ethylene oxidechain configuration″，Febs Letters 545(2-3)(2003)241-244.
[28]S.M.Moghimi，B.Bonnemain，″Subcutaneous and intravenous delivery ofdiagnostic agents to the lymphatic system：applications in lymphoscintigraphyand indirect lymphography″，Advanced Drug Delivery Reviews 37(1-3)(1999)295-312.
[29]Y.Nishioka，H.Yoshino，″Lymphatic targeting with nanoparticulate system″，Advanced Drug Delivery Reviews 47(1)(2001)55-64.
[30]C.Oussoren，G.Storm，″Liposomes to target the lymphatics bysubcutaneous administration″，Advanced Drug Delivery Reviews 50(2001)143-156.
[31]C.Oussoren，G.Storm，″Lymphatic uptake and biodistribution of liposomesafter subcutaneous injection .3. Influence of surface modification withpoly(ethyleneglycol)″，Pharmaceutical Research 14(10)(1997)1479-1484.
[32]S.M.Moghimi，A.E.Hawley，N.M.Christy，T.Gray，L.Illum，S.S.Davis，″Surface Engineered Nanospheres with Enhanced Drainage into Lymphatics andUptake by Macrophages of the Regional Lymph-Nodes″，Febs Letters 344(1)(1994)25-30.
[33]A.E.Hawley，L.Illum，S.S.Davis，″Preparation of biodegradable，surfaceengineered PLGA nanospheres with enhanced lymphatic drainage and lymphnode uptake″，Pharmaceutical Research 14(5)(1997)657-661.
[34]A.E.Hawley，L.Illum，S.S.Davis，″Lymph node localisation ofbiodegradable nanospheres surface modified with poloxamer and poloxamineblock co-polymers″，Febs Letters 400(3)(1997)319-323.
[35]L.Illum，A.E.Church，M.D.Butterworth，A.Arien，J.Whetstone，S.S.Davis，″Development of systems for targeting the regional lymph nodes for diagnosticimaging：In vivo behaviour of colloidal PEG-coated magnetite nanospheres in therat following interstitial administration″，Pharmaceutical Research 18(5)(2001)640-645.
[36]C.Oussoren，M.Velinova，G.Scherphof，J.J.van der Want，N.van Rooijen，G.Storm，″Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneousinjection-IV.Fate of liposomes in regional lymph nodes″，Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1370(2)(1998)259-272.
[37]C.Oussoren，G.Storm，″Role of macrophages in the localisation ofliposomes in lymph nodes after subcutaneous administration″，International Journal of Pharmaceutics 183(1)(1999)37-41.
[38]D.Hawiger，K.Inaba，Y.Dorsett，M.Guo，K.Mahnke，M.Rivera，J.V.Ravetch，R.M.Steinman，M.C.Nussenzweig，″Dendritic cells induce peripheral Tcell unresponsiveness under steady state conditions in vivo″，Journal of Experimental Medicine 194(6)(2001)769-779.
[39]A.Rehor，J.A.Hubbell，N.Tirelli，″Oxidation-sensitive polymericnanoparticles″，Langmuir 21(1)(2005)411-417.
[40]A.Rehor，N.Tirelli，J.A.Hubbell，″A new living emulsion polymerizationmechanism：Episulfide anionic polymerization″，Macromolecules 35(23)(2002)8688-8693.
[41]A.Napoli，M.Valentini，N.Tirelli，M.Muller，J.A.Hubbell，″Oxidation-responsive polymeric vesicles″，Nature Materials 3(3)(2004)183-189.
[42]W.L.Olszewski，″Lymph stasis pathophysiology，diagnosis and treatment″，CRC Press，Boca Raton etc.，1991.
[43]D.A.Berk，M.A.Swartz，A.J.Leu，R.K.Jain，″Transport in lymphaticcapillaries .2. Microscopic velocity measurement with fluorescencephotobleaching″，American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 39(1)(1996)H330-H337.
[44]M.A.Swartz，D.A.Berk，R.K.Jain，″Transport in lymphatic capillaries.1.Macroscopic measurements using residence time distribution theory″，American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 39(1)(1996)H324-H329.
[45]M.A.Swartz，A.Kaipainen，P.A.Netti，C.Brekken，Y.Boucher，A.J.Grodzinsky，R.K.Jain，″Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport：theoretical foundation and experimental validation″，Journal of Biomechanics32(12)(1999)1297-1307.
[46]V.Angeli，J.Llodra，J.X.Rong，K.Satoh，S.Ishii，T.Shimizu，E.A.Fisher，G.J.Randolph，″Dyslipidemia associated with atherosclerotic diseasesystemically alters dendritic cell mobilization″，Immunity 21(4)(2004)561-574.
[47]R.P.da Silva，S.Gordon，″Phagocytosis stimulates alternative glycosylationof macrosialin(mouse CD68)，a macrophage-specific endosomal protein″，Biochem J 338(Pt 3)(1999)687-694.
[48]C.L.Holness，R.P.da Silva，J.Fawcett，S.Gordon，D.L.Simmons，″Macrosialin，a mouse macrophage-restricted glycoprotein，is a member of thelamp/lgp family″，J Biol Chem 268(13)(1993)9661-9666.
[49]S.Rabinowitz，H.Horstmann，S.Gordon，G.Griffiths，″Immunocytochemical characterization of the endocytic and phagolysosomalcompartments in peritoneal macrophages″，J Cell Biol 116(1)(1992)95-112.
[50]S.S.Rabinowitz，S.Gordon，″Macrosialin，a macrophage-restrictedmembrane sialoprotein differentially glycosylated in response to inflammatorystimuli″，J Exp Med 174(4)(1991)827-836.
[51]M.Breel，R.E.Mebius，G.Kraal，″Dendritic Cells of the Mouse Recognizedby 2 Monoclonal-Antibodies″，European Journal of Immunology 17(11)(1987)1555-1559.
[52]K.Inaba，W.J.Swiggard，M.Inaba，J.Meltzer，A.Mirza，T.Sasagawa，M.C.Nussenzweig，R.M.Steinman，″Tissue Distribution of the Dec-205 Protein ThatIs Detected by the Monoclonal-Antibody Nldc-145.1.Expression on DendriticCells and Other Subsets of Mouse Leukocytes″，Cellular Immunology 163(1)(1995)148-156.
[53]W.P.Jiang，W.J.Swiggard，C.Heufler，M.Peng，A.Mirza，R.M.Steinman，M.C.Nussenzweig，″The Receptor Dec-205 Expressed by Dendritic Cells andThymic Epithelial-Cells Is Involved in Antigen-Processing″，Nature 375(6527)(1995)151-155.
[54]W.P.Jiang，W.J.Swiggard，A.Mirza，M.Peng，R.M.Steinman，M.C.Nussenzweig，″Molecular Characterization of a 205-Kd Protein That Is Abundanton Dendritic Cells and Identified with the Nldc-145 Monoclonal-Antibody″，Journal of Cellular Biochemistry(1995)20-20.
[55]G.Kraal，M.Breel，M.Janse，G.Bruin，″Langerhans Cells，Veiled Cells，andInterdigitating Cells in the Mouse Recognized by a Monoclonal-Antibody″，Journal of Experimental Medicine 163(4)(1986)981-997.
[56]K.Mahnke，M.Guo，S.Lee，H.Sepulveda，S.L.Swain，M.Nussenzweig，R.M.Steinman，″The dendritic cell receptor for endocytosis，DEC-205，canrecycle and enhance antigen presentation via major histocompatibility complexclass II-positive lysosomal compartments″，Journal of Cell Biology 151(3)(2000)673-683.
[57]Y.Tabata，Y.Ikada，″Phagocytosis of Polymer Microspheres byMacrophages″，Advances in Polymer Science 94(1990)107-141.
[100]S.Cerritelli，A.Fontana，D.Velluto，M.Adrian，J.Dubochet，P.DeMaria，J.A.Hubbell，″Thermodynamic and kinetic effects in the aggregationbehavior of a poly(ethylene glycol-b-propylene suflide-b-ethylene glycol)ABAtriblock copolymer″，Macromolecules 38(18)(2005)7845-7851.
[102]A.Napoli，N.Tirelli，G.Kilcher，J.A.Hubbell，″New syntheticmethodologies for amphiphilic multiblock copolymers of ethylene glycol andpropylene sulfide″，Macromolecules 34(26)(2001)8913-8917.
[103]A.Napoli，N.Tirelli，E.Wehrli，J.A.Hubbell，″Lyotropic behavior inwater of amphiphilic ABA triblock copolymers based on poly(propylene sulfide)and poly(ethylene glycol)″，Langmuir 18(22)(2002)8324-8329.
[104]A.Napoli，M.Valentini，N.Tirelli，M.Muller，J.A.Hubbell，″Oxidation-responsive polymeric vesicles″，Nature Materials 3(3)(2004)183-189.
[105]K.Kataoka，A.Harada，Y.Nagasaki，″Block copolymer micelles fordrug delivery：design，characterization and biological significance″，Adv Drug Deliv Rev 47(1)(2001)113-131.
[106]A.N.Lukyanov，V.P.Torchilin，″Micelles from lipid derivatives ofwater-soluble polymers as delivery systems for poorly soluble drugs″，Adv Drug Deliv Rev 56(9)(2004)1273-1289.
[107]H.Otsuka，Y.Nagasaki，K.Kataoka，″PEGylated nanoparticles forbiological and pharmaceutical applications″，Adv Drug Deliv Rev 55(3)(2003)403-419.
[108]D.E.Discher，A.Eisenberg，″Polymer vesicles″，Science 297(5583)(2002)967-973.
[109]H.Lee，I.H.Jang，S.H.Ryu，T.G.Park，″N-terminal site-specificmono-PEGylation of epidermal growth factor″，Pharm Res 20(5)(2003)818-825.
[110]H.Lee，T.G.Park，″Preparation and characterization ofmono-PEGylated epidermal growth factor：evaluation of in vitro biologicactivity″，Pharm Res 19(6)(2002)845-851.
[111]M.J.Roberts，M.D.Bentley，J.M.Harris，″Chemistry for peptide andprotein PEGylation″，Adv Drug Deliv Rev 54(4)(2002)459-476.
[112]C.A.Janeway，″Immunobiology 5 the immune system in health anddisease″，Churchill Livingstone，Edinburgh，2001.
[113]L.C.Bonifaz，D.P.Bonnyay，A.Charalambous，D.I.Darguste，S.Fujii，H.Soares，M.K.Brimnes，B.Moltedo，T.M.Moran，R.M.Steinman，″In vivotargeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptorimproves T cell vaccination″，J Exp Med 199(6)(2004)815-824.
[114]D.Hawiger，K.Inaba，Y.Dorsett，M.Guo，K.Mahnke，M.Rivera，J.V.Ravetch，R.M.Steinman，M.C.Nussenzweig，″Dendritic cells induce peripheral Tcell unresponsiveness under steady state conditions in vivo″，Journal of Experimental Medicine 194(6)(2001)769-779.
[115]C.L.van Broekhoven，C.R.Parish，C.Demangel，W.J.Britton，J.G.Altin，″Targeting dendritic cells with antigen-containing liposomes：a highlyeffective procedure for induction of antitumor immunity and for tumorimmunotherapy″，Cancer Res 64(12)(2004)4357-4365.
[116]T.Fifis，A.Gamvrellis，B.Crimeen-Irwin，G.A.Pietersz，J.Li，P.L.Mottram，I.F.McKenzie，M.Plebanski.″Size dependant immunogenicity：therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors″，J Immunol 173(2004)3148-3154.
[117]M.Gadjeva，A.W.Dodds，A.Taniguchi-Sidle，A.C.Willis，D.E.Isenman，S.K.A.Law.″The covalent binding reaction of complement component C3″，J Immunol 161(1998)985-990.
[118]A.Kidane and K.Park.″Complement activation by PEO-grafted glasssurfaces″，J Biomed Mat Res 48(1999)640-647.
[119]D.T.O′Hagan and N.M.Valiante.″Recent advances in the discover anddelivery of vaccine adjuvants″，Nat Rev Drug Disc 2(2003)727-738.
[120]R.J.Ulevitch.″Therapeutics targeting the innate immune system″，Nat Rev Immunol 4(2004)512-520.
[121]A.Pashine，N.M.Valiante，J.B.Ulmer.″Targeting the innate immuneresponse with improved vaccine adjuvants″，Nat Med 11(4)(2005)563-568.
[122].Janeway，C.A.“Immunobiology 5 the immune system in health anddisease”(Churchill Livingstone，Edinburgh，2001).
[123]Larsen，C.P.et al.“Long-term acceptance of skin and cardiac allograftsafter blocking CD40 and CD28 pathways”.Nature 381(1996)，434-8.
[124]Hackstein，H.& Thomson，A.W.“Dendritic cells：emergingpharmacological targets of immunosuppressive drugs”.Nat Rev Immunol4(2004)，24-34.
[125]Duperrier，K.et al.“Immunosuppressive agents mediate reducedallostimulatory properties of myeloid-derived dendritic cells despite induction ofdivergent molecular phenotypes”.Mol Immunol 42(2005)，1531-40.
[126]Piemonti，L.et al.“Glucocorticoids affect human dendritic celldifferentiation and maturation”.J Immunol 162(1999)，6473-81.
[127]K.Duperrier，A.Farre，J.Bienvenu，N.Bleyzac，J.Bernaud，L.Gebuhrer，D.Rigal，A.Eljaafari，“Cyclosporin A inhibits dendritic cell maturationpromoted by TNF-alpha or LPS but not by double-stranded RNA or CD40L”，J Leukoc Biol 72(5)(2002)953-961.
[128]J.I.Lee，R.W.Ganster，D.A.Geller，G.J.Burckart，A.W.Thomson，L.Lu，“Cyclosporine A inhibits the expression of costimulatory molecules on invitro-generated dendritic cells：association with reduced nuclear translocation ofnuclear factor kappa B”，Transplantation 68(9)(1999)1255-1263.
[129]A.Panhans-Gross，N.Novak，S.Kraft，T.Bieber，“Human epidermalLangerhans′cells are targets for the immunosuppressive macrolide tacrolimus(FK506)”，J Allergy Clin Immunol 107(2)(2001)345-352.
[130]G.Szabo，C.Gavala，P.Mandrekar，“Tacrolimus and cyclosporine Ainhibit allostimulatory capacity and cytokine production of human myeloiddendritic cells”，J Investig Med 49(5)(2001)442-449.
[131]A.M.Woltman，J.W.de Fijter，S.W.Kamerling，L.C.Paul，M.R.Daha，C.van Kooten，“The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on thedifferentiation of human dendritic cells”，Eur J Immunol 30(7)(2000)1807-1812.
[132] G.Kwon，M.Naito，M.Yokoyama，T.Okano，Y.Sakurai，K.Kataoka，“Block copolymer micelles for drug delivery：loading and release ofdoxorubicin”，Journal of Controlled Release 48(1997)195-201.
[133]G.S.Kwon，M.Naito，M.Yokoyama，T.Okano，Y.Sakurai，K.Kataoka，“Physical entrapment of adriamycin in AB block copolymer micelles”，Pharm Res 12(2)(1995)192-195.
[134]M.B.Villiers，C.L.Villiers，A.M.Laharie，P.N.Marche，“Differentstimulating effects of complement C3b and complete Freund’s adjuvant onantibody response”，Immunopharmac 42(1999)151-157.
[135]P.W.Dempsey，M.E.Allison，S.Akkaraju，C.C.Goodnow，D.T.Fearon，“C3d of complement as a molecular adjuvant：bridging innate and acquiredimmunity”，Science 271(5247)(1996)348-350.
[136]K.M.Haas，F.R.Toapanta，J.A.Olivier，J.C.Poe，J.H.Weis，D.R.Karp，J.F.Bower，T.M.Ross，T.F.Tedder.“C3d functions as a molecular-adjuvant in theabsence of CD21/35 expression”，J Immunol 172(10)(2004)5833-5837.
[137]C.H.Nielsen，E.M.Fischer，R.G.Q.Leslie.“The role of complement in theacquired immune response”，Immunology 100(2000)4-12.
[138]M.Kopf，B.Abel，A.Gallimore，M.Carroll，M.F.Bachmann.“Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration tocontrol acute influenza virus infection”，Nat Med 8(4)(2002)373-378.
[139]T.Segura，L.D.Shea.“Surface tethered DNA complexes for enhanced genedelivery”，Bioconj Chem，13(3)(2002)621-629.
[140]D.Putnam.“Polymers for gene delivery across length scales”，Nat Mat，5(2006)439-451.
[141]H.Kobayashi，M.W.Brechbiel.“Nano-sized MRI contrast agents withdendrimer cores”，Adv Drug Delivery Rev.57(2005)2271-2286.
[142]T.Dutta，N.K.Jain.“Targeting potential and anti-HIV activity oflamivudine loaded mannoxylated poly(propyleneimine)dendrimer”.Biochim Biophys Acta xx(2007)xxx-xxx.
[143]A.K.Patri，A.Myc，J.Beals，T.P.Thomas，N.H.Bander，J.R.Baker.“Synthesis and in vitro testing of J591 antibody-dendrimer conjugates fortargeted prostate cancer therapy”.Bioconjugate Chem 15(2004)1174-1181.
[144]C.Plank，K.Mechtler，F.C.Szoka，E.Wagner.“Activation of thecomplement system by synthetic DNA complexes：a potential barrier forintravenous gene delivery”.Hum.Gene Ther.7(1996)1437-1446.
[145]R.Duncan，L.Isso.“Dendrimer biocompatibility and toxicity”.Adv.Drug Delivery Rev.57(2005)2215-2237.

Claims (15)

1.供导入哺乳动物中的医药组合物，其包含
合成纳米颗粒的集合，所述纳米颗粒具有小于70nm的平均粒径，且包含抗原和具有能激活哺乳动物补体的官能基的合成聚合物，所述官能基处于所述纳米颗粒外部，
所述组合物还包含位于纳米颗粒表面和危险信号之间的二硫键或者位于纳米颗粒表面和抗原之间的二硫键。
2.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒是微团，其中所述微团包含亲水性聚合物和疏水性聚合物的嵌段共聚物。
3.权利要求2的组合物，其中所述亲水性聚合物包含聚氧化乙烯，而所述疏水性聚合物包含聚(硫化丙烯)。
4.权利要求3的组合物，其进一步包含用所述微团封装的治疗剂。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物不含所述合成聚合物以外的佐剂。
6.权利要求1的组合物，其中所述官能基在哺乳动物中诱导Th-1应答。
7.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒包含疏水性部分和与该疏水性部分联合的疏水性危险信号。
8.权利要求1的组合物，其中所述合成聚合物包含聚氧化烯、聚乙二醇、PLURONIC、或聚硫化丙烯。
9.权利要求1的组合物，其中所述合成聚合物包含PLURONIC-F127。
10.权利要求1的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原或传染病抗原。
11.权利要求1的组合物，其中所述颗粒进一步包含选自下组的危险信号：炎性细胞因子和Toll样受体的配体。
12.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒不含特异性结合细胞的靶向配体，所述抗原是肿瘤免疫疗法或传染病的抗原，且进一步包含选自下组的危险信号：炎性细胞因子和Toll样受体的配体。
13.权利要求1的组合物，其中所述合成聚合物包含至少一种疏水性嵌段和至少一种亲水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物在水溶液中自我装配以形成所述颗粒。
14.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒包含疏水性核心和亲水性壳冠，其中所述核心由聚(硫化丙烯)构成，而所述亲水性壳冠由所述合成聚合物构成，所述合成聚合物包含聚乙二醇，且其中所述官能基包含亲核体。
15.权利要求14的组合物，其中所述抗原选自胱天蛋白酶-8、MAGE-1、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1或存活素。
CN200980143261.6A 2008-08-29 2009-08-28 用于免疫疗法的纳米颗粒 Active CN102202653B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/231,310 2008-08-29
US12/231,310 US8323696B2 (en) 2008-08-29 2008-08-29 Nanoparticles for immunotherapy
PCT/US2009/055301 WO2010025324A2 (en) 2008-08-29 2009-08-28 Nanoparticles for immunotherapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102202653A CN102202653A (zh) 2011-09-28
CN102202653B true CN102202653B (zh) 2015-09-02

Family

ID=41722294

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980143261.6A Active CN102202653B (zh) 2008-08-29 2009-08-28 用于免疫疗法的纳米颗粒

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8323696B2 (zh)
EP (1) EP2341897B1 (zh)
JP (1) JP5806934B2 (zh)
CN (1) CN102202653B (zh)
AU (1) AU2009285628B2 (zh)
CA (1) CA2735318C (zh)
WO (1) WO2010025324A2 (zh)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6993506B2 (en) 2000-12-05 2006-01-31 Jgr Acquisition, Inc. Method and device utilizing polymorphic data in e-commerce
US9271929B2 (en) * 2008-11-25 2016-03-01 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Block copolymers and uses thereof
MX2011007559A (es) * 2009-01-20 2011-12-06 Myelin Repair Foundation Inc Composiciones y metodos para induccion de tolerancia antigeno-especifica.
KR20120022984A (ko) * 2009-04-21 2012-03-12 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. Ｔｈ１ 편향 반응을 제공하는 면역나노치료법
AU2010254549B2 (en) * 2009-05-27 2016-10-20 Selecta Biosciences, Inc. Nanocarriers possessing components with different rates of release
JP5568338B2 (ja) * 2010-03-09 2014-08-06 株式会社 資生堂 ポリマーソーム及び製造方法
MX2012013713A (es) 2010-05-26 2013-01-28 Selecta Biosciences Inc Composiciones de nanovehiculos con adyuvante no acoplado.
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
CA2807942C (en) 2010-08-10 2021-07-27 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Erythrocyte-binding therapeutics
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
CA3118108C (en) 2010-11-12 2024-02-20 Oncour Pharma, Inc. Modified immune-modulating particles comprising poly(lactic acid)
CN113018452A (zh) 2011-04-29 2021-06-25 西莱克塔生物科技公司 用于效应性t细胞的抗原特异性缺失的致耐受性合成纳米载体
WO2013009690A2 (en) 2011-07-09 2013-01-17 The Regents Of The University Of California Leukemia stem cell targeting ligands and methods of use
EA201490381A1 (ru) 2011-07-29 2014-06-30 Селекта Байосайенсиз, Инк. Синтетические наноносители, которые стимулируют формирование гуморального иммунного ответа и иммунного ответа, опосредованного цитотоксическими т-лимфоцитами (ctl)
AU2012304313A1 (en) * 2011-09-08 2014-03-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for modulating immune responses
WO2013036827A2 (en) 2011-09-08 2013-03-14 The Regents Of The University Of California Fungal-specific metalloproteases and uses thereof
AU2013220079B2 (en) 2012-02-15 2017-10-05 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Erythrocyte-binding therapeutics
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
EP2841098A4 (en) 2012-04-23 2016-03-02 Allertein Therapeutics Llc NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF ALLERGIES
EP2674167A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-18 PLS-Design GmbH Controlled activation of complement components for use as endogenous adjuvant
KR20220166879A (ko) 2012-06-21 2022-12-19 노쓰웨스턴유니버시티 펩티드 접합된 입자
US9879062B2 (en) 2012-07-03 2018-01-30 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Protein-binding peptide isolated from placenta growth factor
US9540428B2 (en) 2012-07-03 2017-01-10 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Extracellular matrix heparin-binding domains
US9758606B2 (en) 2012-07-31 2017-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cyclopropenium polymers and methods for making the same
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
CN105263476A (zh) 2013-03-13 2016-01-20 库尔制药开发公司 用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒
EP3760223A1 (en) 2013-04-03 2021-01-06 N-Fold Llc Nanoparticle composition for desensitizing a subject to peanut allergens
US20160045613A1 (en) * 2013-04-05 2016-02-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Particles having peg-ylated surfaces modified for lymphatic trafficking
US20160058856A1 (en) * 2013-04-05 2016-03-03 Kyushu University, National University Corporation Anti-tumor dna vaccine
CA2910575C (en) 2013-05-03 2023-10-24 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers and therapeutic macromolecules for reduced or enhanced pharmacodynamic effects
AU2014262164B2 (en) * 2013-05-03 2020-02-27 Selecta Biosciences, Inc. Dosing combinations for reducing undesired humoral immune responses
US10543175B1 (en) * 2013-05-17 2020-01-28 Degama Berrier Ltd. Film composition and methods for producing the same
HUE047329T2 (hu) 2013-08-13 2020-04-28 Univ Northwestern Peptiddel konjugált részecskék
SG11201603487YA (en) 2013-11-04 2016-05-30 Uti Limited Partnership Methods and compositions for sustained immunotherapy
ES2874884T3 (es) 2014-02-21 2021-11-05 Ecole Polytechnique Fed De Lausanne Epfl Epfl Tto Compuestos terapéuticos dirigidos a la glucosa
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
WO2015153632A1 (en) * 2014-03-31 2015-10-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Particles that enhance immune responses by increasing cytotoxic t-cell function or production of interferon gamma therefrom
IL292577A (en) 2014-09-07 2022-06-01 Selecta Biosciences Inc Methods and preparations for attenuating immune responses of gene editing in an antiviral transfer system
BR112017005385A2 (pt) 2014-09-18 2017-12-19 3M Innovative Properties Co composição aquosa de revestimento, método para proteger uma superfície metálica, método de limpeza e proteção de uma superfície metálica e artigos
US10695288B2 (en) * 2014-11-19 2020-06-30 Vanderbilt University Reactive oxygen species (ROS)-responsive compositions and methods thereof
CN107847582A (zh) 2015-05-06 2018-03-27 优迪有限合伙公司 用于持续疗法的纳米颗粒组合物
JP2018533490A (ja) * 2015-07-21 2018-11-15 ディエヌピー１２３・カンパニーＤＮＰ１２３ Ｃｏｍｐａｎｙ プログラム可能な自己組織化パッチナノ粒子と、それに関連する装置、システム、及び方法
EP3347047A1 (en) 2015-09-09 2018-07-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression vector delivery system and use thereof for inducing an immune response
CN106939075B (zh) 2015-12-31 2019-09-17 银谷制药有限责任公司 一种亲水性聚酯及其嵌段共聚物
US11472856B2 (en) 2016-06-13 2022-10-18 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
BR112019018748A2 (pt) 2017-03-11 2020-04-07 Selecta Biosciences Inc métodos e composições relacionados ao tratamento combinado com anti-inflamatórios e nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor
US20180280488A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 University of Alaska Anchorage Methods and Compositions for Binding Complement C3 for Targeting of Immune Cells
US11253579B2 (en) 2017-06-16 2022-02-22 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
WO2019006371A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 City Of Hope COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MACROPHAGE ACTIVITY
US11925693B2 (en) 2017-07-27 2024-03-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Polymeric nanoparticles for enhanced cancer immunotherapy
CN111432836A (zh) 2017-09-05 2020-07-17 转矩医疗股份有限公司 治疗性蛋白质组合物及其制备和使用方法
US11850263B2 (en) 2017-11-10 2023-12-26 Emory University Nanoparticles conjugated with vasoactive intestinal peptide antagonists
WO2019094938A2 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The University Of Chicago Methods and compositions for the treatment of wounds
BR112020013405A2 (pt) 2018-01-25 2020-12-01 Acm Biolabs Pte Ltd. polimerossomas compreendendo um antígeno encapsulado solúvel, assim como métodos de sua fabricação e uso
KR20200138234A (ko) 2018-02-28 2020-12-09 유니버시티 오브 워싱톤 자기 조립 나노구조 백신
CN112996539A (zh) * 2018-09-12 2021-06-18 Acm生物实验室私人有限公司 包含共价结合的抗原的聚合物囊泡以及其制备方法和用途
US11672861B2 (en) * 2018-10-15 2023-06-13 The George Washington University Prussian blue nanoparticles functionalized with immune signals and applications thereof
EP4007597A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 ACM Biolabs Pte Ltd A method of eliciting an immune response by administering a population of polymersomes having an associated antigen together with a population of polymersomes having an associated adjuvant as well as compositions comprising the two populations of polymersomes
GB201918963D0 (en) * 2019-12-20 2020-02-05 Provost Fellows Scholars And Other Members Of Board Of Trinity College Dublin Polymeric nanoparticles as vaccine adjuvants
WO2021146749A1 (en) * 2020-01-13 2021-07-22 The University Of Chicago Toll-like receptor agonist formulations and methods of use
WO2021214339A2 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Acm Biolabs Pte Ltd Vaccine against human-pathogenic coronaviruses
WO2022020545A2 (en) * 2020-07-22 2022-01-27 Texas Tech University System Coronavirus vaccine
WO2022047401A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 The University Of Chicago Targeted, intracellular delivery of therapeutic peptides using supramolecular nanomaterials
MX2023005633A (es) 2020-11-13 2023-05-24 Icosavax Inc Vacuna de nanoparticula a base de proteinas contra metapneumovirus.
JP2024500360A (ja) 2020-12-11 2024-01-09 エイシーエム バイオラブズ プライベート リミテッド 関連づけられた抗原および関連づけられたアジュバントを有する２つのポリマーソーム集団を投与することによる、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の調整方法
EP4288033A1 (en) 2021-02-02 2023-12-13 ACM Biolabs Pte Ltd Sole use of polymersome associated adjuvant for stimulating an immune response
JP2024512505A (ja) * 2021-03-17 2024-03-19 ノースウェスタン ユニバーシティ 免疫細胞への核酸の効率的な細胞内送達のための樹状ペプチド結合ポリマー
CN117440798A (zh) 2021-04-12 2024-01-23 Acm 生物实验室私人有限公司 包含可溶性被包封多核苷酸和可电离的脂质的聚合物囊泡及其制备方法和用途
WO2022264098A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Indian Institute Of Science Nano and micro-particles to promote phagocytic activity of an immune cell
CN114259463B (zh) * 2022-02-11 2023-03-28 山东大学 一种靶向补体蛋白发挥抗炎作用的PF-HA-diSE水凝胶及其制备方法与应用
WO2023225562A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Icosavax, Inc. Multivalent vaccine for paramyxoviruses and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000510449A (ja) * 1996-04-10 2000-08-15 南カリフォルニア大学 増殖性硝子体網膜症に対する遺伝子治療
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
GB9718129D0 (en) * 1997-08-27 1997-10-29 Isis Innovation Branched structures
US6333051B1 (en) * 1998-09-03 2001-12-25 Supratek Pharma, Inc. Nanogel networks and biological agent compositions thereof
TWI221854B (en) * 2000-05-26 2004-10-11 Anawrahta Biotech Co Ltd Lac shuttle vectors, kit for expression of a heterologous gene and DNA vaccine carrier containing the same
US6998115B2 (en) * 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
EP1515981A2 (en) * 2001-01-31 2005-03-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel molecules of the pyrin/nbs/lrr protein family and uses thereof
WO2002067908A1 (en) * 2001-02-26 2002-09-06 Duke University Novel dendritic polymers and their biomedical uses
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
US20040247624A1 (en) * 2003-06-05 2004-12-09 Unger Evan Charles Methods of making pharmaceutical formulations for the delivery of drugs having low aqueous solubility
WO2005020933A2 (en) * 2003-09-02 2005-03-10 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery
GB2407500A (en) * 2003-11-03 2005-05-04 Ist Superiore Sanita Use of microparticles for antigen delivery
US7846201B2 (en) * 2004-02-20 2010-12-07 The Children's Hospital Of Philadelphia Magnetically-driven biodegradable gene delivery nanoparticles formulated with surface-attached polycationic complex
US20060204443A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Methods for tumor treatment using dendrimer conjugates
EP1891141B1 (en) 2005-05-31 2016-11-16 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Triblock copolymers for cytoplasmic delivery of gene-based drugs
US8021689B2 (en) * 2006-02-21 2011-09-20 Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (“EPFL”) Nanoparticles for immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009285628A1 (en) 2010-03-04
JP5806934B2 (ja) 2015-11-10
EP2341897A2 (en) 2011-07-13
CN102202653A (zh) 2011-09-28
AU2009285628B2 (en) 2015-04-02
EP2341897A4 (en) 2013-06-19
WO2010025324A3 (en) 2010-06-24
US20100055189A1 (en) 2010-03-04
JP2012501341A (ja) 2012-01-19
WO2010025324A2 (en) 2010-03-04
US8323696B2 (en) 2012-12-04
EP2341897B1 (en) 2021-02-17
CA2735318C (en) 2017-10-31
CA2735318A1 (en) 2010-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102202653B (zh) 用于免疫疗法的纳米颗粒
CN101437491B (zh) 用于免疫疗法的纳米颗粒
US11389517B2 (en) Peptide conjugated particles
AU2016379413B2 (en) Covalent polymer-antigen conjugated particles
Moura et al. Functionalized branched polymers: promising immunomodulatory tools for the treatment of cancer and immune disorders
Andrianov et al. Molecular-level interactions of polyphosphazene immunoadjuvants and their potential role in antigen presentation and cell stimulation
Kapadia et al. Reduction sensitive PEG hydrogels for codelivery of antigen and adjuvant to induce potent CTLs
JP2019504895A (ja) スギ花粉エピトープを封入するｔｉｍｐ（組織性メタロプロテアーゼ阻害因子）
Vemireddy et al. Cationic pH-responsive polycaprolactone nanoparticles as intranasal antigen delivery system for potent humoral and cellular immunity against recombinant tetravalent dengue antigen
Stahl et al. Enzyme-triggered antigen release enhances cross-presentation by dendritic cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant