KR20120022984A - Ｔｈ１ 편향 반응을 제공하는 면역나노치료법 - Google Patents

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KR20120022984A
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그레이슨 비. 립포드
로버트 엘. 브라츨러
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셀렉타 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

Th1 편향 면역 반응의 발생이 바람직한 질병의 치료를 위한, 합성 나노담체 조성물 및 관련 방법이 개시된다.

Description

Ｔｈ１ 편향 반응을 제공하는 면역나노치료법{IMMUNONANOTHERAPEUTICS PROVIDING A TH1-BIASED RESPONSE}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C.§119에 의거하여 2009년 4월 21일 출원된 미국 가출원 제61/214,229호의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 Th1 편향 면역 반응을 발생시키는 것이 바람직한 질병의 치료를 위한 합성 나노담체 조성물 및 관련 방법에 관한 것이다.
면역계 자체가 실제로 질병을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것처럼 보이는 많은 질병이 있다. 이것은 면역 자극이 활성화된 CD4 T 세포를 Th2 세포로 분화하여 그 후 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13과 같은 Th-2 관련 사이토카인의 분비를 야기할 때 발생할 수 있다. Th2 사이토카인의 존재 시 자극받은 B 세포는 임의의 항체 아이소유형(isotype), 특히 IgE를 선택적으로 생성함으로써 반응한다. 임의의 항원에 대한 IgE 의존 면역 반응과 Th2 사이토카인의 작용은 알레르기, 천식, 및 아토피성 피부염과 같은 아토피성 병태와 관련된 임상학적 증상을 유발할 수 있다. 게다가, 임의의 만성 전염병(infectious disease) 및 암과 같은 임의의 병태에서, 그러한 병태에 대해 더 좋은 결과를 초래하기 위해서는 증대된 Th1 반응이 요구된다.
바람직하지 않은 Th2 편향 면역 반응으로 특징지어지는 병태에 대한 몇몇 치료가 알려져 있지만, 개선된 치료법이 요구된다. 게다가, 대상체 면역계의 Th1 편향 반응이 차선이거나 또는 비효과적인 질병에 대하여 개선된 치료법이 또한 요구된다.
따라서, Th2 매개 질병과 대상 면역계의 증진된 Th1 편향 반응이 바람직한 질병에 대한 개선된 치료법을 제공하기 위한 개선된 조성물 및 관련 방법이 요구된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (1) 면역특징 표면(immunofeature surface), 및 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 병태의 치료를 위한 조성물로서, 상기 면역특징 표면은 병태의 치료와 관련된 항원을 병태의 치료와 관련된 항원의 후천성 면역 반응(adaptive immune response)을 야기하기에 충분한 양으로 포함하지 않는 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 병태를 앓고 있는 대상체를 식별하는 단계; (1) APC 표적화 특징(APC targeting feature) 및 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 병태의 치료와 관련된 항원의 공동투여(co-administration)를 더 포함하지 않는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Th1 편향 면역자극제와 APC 표적화 특징을 포함하는 합성 나노담체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및 대상체에 상기 조성물을 투여하는 때와 다른 때에 Th1 편향 반응이 요구되는 대상체에 항원을 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항원의 투여는 수동적 투여(passive administration) 또는 능동적 투여(active administration)를 포함하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 BALF 호산구 백분율(BALF eosinophil differential cell count)(총 세포의 %)을 나타낸다.
도 2는 최종 오브알부민 투여 후 18시간에서 BALF 내 사이토카인을 나타낸다.
본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 본 발명이 특별히 예시된 물질이나 공정 파라미터에 제한되지 않으며, 물론 그 자체를 변형할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 내에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 구현예를 기술하기 위함이며, 본 발명을 기술하는 대체 용어의 사용을 제한하고자 함이 아님을 또한 이해해야 한다.
상기 또는 하기에서 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
명세서 및 부가된 청구항에 사용된, 단수형("a," "an" 및 "the")은 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "중합체(a polymer)" 에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 분자의 혼합물을 포함하며, "용매(a solvent)"에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 용매의 혼합물을 포함하며, “접착제(an adhesive)”는 둘 이상의 그러한 물질의 혼합물 등을 포함한다.
A. 도입
본 발명자는 예기치 않게 그리고 놀랍게도 상기 언급된 문제점과 한계가 본원에 개시된 발명을 실시함으로써 극복될 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자는 예기치 않게 (1) 면역특징 표면(immunofeature surface) 및 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 병태의 치료를 위한 조성물로서, 상기 면역특징 표면은 상기 병태의 치료와 관련된 항원을 병태의 치료와 관련된 항원의 후천성 면역 반응(adaptive immune response)을 야기하기에 충분한 양으로 포함하지 않는 조성물과 관련된, 조성물 및 방법을 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
추가로, 본 발명자들은 예기치 않게, 병태를 앓고 있는 대상체를 식별하는 단계; (1) APC 표적화 특징(APC targeting feature) 및 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 병태의 치료와 관련된 항원의 공동투여(co-administration)를 더 포함하지 않는 방법에 관련된, 조성물 및 방법을 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
부가적으로, 본 발명자는 예기치 않게 Th1 편향 면역자극제와 APC 표적화 특징을 포함하는 합성 나노담체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및 대상체에 상기 조성물을 투여하는 때와 다른 때에 Th1 편향 반응이 요구되는 대상체에 항원을 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항원의 투여는 수동적 투여(passive administration) 또는 능동적 투여(active administration)를 포함하는 방법에 관련된 조성물 및 방법을 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
바람직하지 않은 Th2 편향 반응, 또는 차선의/비효과적인 Th1 반응으로 특징지어지는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 한 가지 접근은 Th2 세포의 분화 및 Th2 사이토카인의 작용을 방해하는 면역학적 중재(immunological intervention)이다. 이것은 Th1 세포 및 인터페론-감마, IL-12 및 IL-18을 포함하는Th1 관련 사이토카인을 생성하는 병태에 신체를 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 그러한 병태는 “Th1 편향 반응(Th1 biased response)”으로 지칭된다. 수지상 세포(dendritic cell)가 알레르기성 질병의 유도와 유지뿐만 아니라 Th1 반응으로의 치료 유도된 전환에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서, Th1 반응을 촉진시키기 위해 수지상 세포의 능력을 증가시키는 수지상 세포에 대한 치료가 알레르기 및 천식의 메커니즘에 기초한 치료를 위한 장래성 있는 방법을 제시한다.
본 발명에서, 본 발명자는 예기치 않게 보통은 Th2 편향 반응 또는 차선의/비효과적인 Th1 편향 반응을 발생시키는 병태 하에서 Th1 편향 반응을 유도하는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 면역나노치료법을 발견하였다. 이는 (1) APC 표적화 특징을 사용하여 항원을 제시하는 세포를 표적으로 하고, (2) 병태의 치료와 관련된 항원을 포함하지 않는 면역나노치료법을 포함하는 조성물의 사용을 통해서 달성된다. 대신에, 항원은 공동투여되지 않고, 오히려 통상적으로는 본 발명의 조성물의 투여와 다른 때에 별도로 대상체에 투여된다. 임의의 관련 구현예에서, 항원은 능동적으로 또는 수동적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여한 후 Th1 편향 상태는 일반적으로 병태의 치료와 관련된 항원을 대상에 능동적으로 또는 수동적으로 투여하기에 충분히 긴 시간 동안 지속한다. 구현예에서, Th1 편향 상태는 항원이 능동적으로 투여되는지 또는 수동적으로 투여되는 지와 무관하게 오래 지속될 수 있다.
실시예 1 내지7은 본 발명의 나노담체 및 이의 적용을 포함한 본 발명의 몇몇 상이한 특정 구현예를 상술한다. 실시예 8은 실험 천식의 치료에서 본 발명의 구현예의 사용을 상술한다.
본 발명은 이제 더욱 상세히 기재될 것이다.
B. 정의
“능동적 투여(active administration)”는 항원과 같은 물질을 직접적으로 대상체에 투여하거나 또는 대상체를 상기 물질에 노출시키게 하는 적극적인 행동을 취함으로써 항원과 같은 물질을 투여하는 것을 의미한다. 예를 들어, 알레르겐 또는 만성 감염원 항원을 대상체에 주사 또는 경구 복용(orally dosing)하는 것이 능동적 투여의 구현예이다. 다른 구현예에서, 종양 항원을 발생시켜 이에 대상체를 노출시키는 방식으로 대상체에서 종양 세포 사멸을 유도하는 것이 능동적 투여의 구현예이다.
"투여하는(administering)" 또는 "투여(administration)"는 (1) 약리적으로 유용한 방식으로 본 발명의 조성물과 같은 약리적 활성 물질을 대상체에 복용시키거나, (2) 약리적으로 유용한 방식으로 상기 물질을 대상체가 복용하도록 지시하거나, 또는 (3) 약리적으로 유용한 방식으로 상기 물질을 대상체가 자가 복용(self-dose)하도록 지시하는 것을 의미한다.
“알레르겐”은 알레르겐 특이적(allergen-specific) IgE에 결합하고, IgE 수용체를 지닌 세포를 활성화하여 히스타민의 방출뿐만 아니라 사이토카인 반응의 Th2 유형 양식을 가져오는 것으로 특징지어지는 즉각적인 과민반응을 촉발하는 물질을 의미한다. 그러한 즉각적인 과민반응에 포함되는 징후는 알레르기 및 알레르기성 천식과 같은 것이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역특징 표면은 알레르겐을 포함하지 않는다.
“병태의 치료와 관련된 항원”은 항원을 대상체에 투여한 후 대상체의 특정 병태를 치료 또는 완화할 후천성 면역 반응(adaptive immune response)(예를 들어, 선천성 면역 반응과 구별됨)에 대한 항원을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역특징 표면은 병태의 치료에 관련된 항원을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 조성물의 투여는 병태의 치료와 관련된 항원의 투여를 추가로 포함하지 않으며, 여기에서 항원은 나노담체에 결합되거나 또는 결합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 병태의 치료에 관련된 항원은 조성물이 투여되는 때와 다른 때에 투여된다. 구현예에서, 치료되어야 할 병태는 구체화될 필요가 없는데, 항원이 병태의 치료에 관련하여 알려져 있거나 또는 관련이 있을 것으로 예측되는 것이 요구조건이기 때문이다.
“Th1 편향 반응이 임상적으로 유익한 대상체에 대한 항원”은 전형적으로 대상체로부터 Th2 유형 사이토카인 반응을 도출해 내지만, Th1 유형 사이토카인 반응으로 특징지어지는 반응에 대한 편향은 임상적으로 유용할 항원을 의미한다. 일 구현예에서, Th1 편향 반응이 임상적으로 유익한 대상체에 대한 항원은 조성물을 투여하는 때와 다른 때에 대상체에 투여된다.
“APC 표적화 특징(APC targeting feature)”은, 제한되지 않는 예로 수지상 세포, SCS 마크로파지, 여포성 수지상 세포, 및 B 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포(“APC”)에 대하여 합성 나노담체를 표적화하는, 본 발명의 합성 나노담체에 포함되는 하나 이상의 부분을 의미한다. 구현예에서, APC 표적화 특징은 면역특징 표면(들) 및/또는 APC의 알려진 표적에 결합하는 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함할 수 있다.
구현예에서, 마크로파지(“Mph”)의 알려진 타겟에 대한 표적화 모이어티는 마크로파지에서 현저하게 발현되어 있고/있거나 마크로파지에 존재하는(즉, 피막하동 Mph 마커(subcapsular sinus-Mph marker)) 임의의 실체(entity)(예를 들면, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 SCS-Mph 마커는, 그 제한되지 않는 예로 CD4(L3T4, W3/25, T4); CD9 (p24, DRAP-1, MRP-1); CD11a(LFA-1α, α L 인테그린 사슬); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mo1, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, p150, 95, AXb2); CDw12(p90-120); CD13(APN, gp150, EC 3.4.11.2); CD14(LPS-R); CD15(X-합텐, 루이스, X, SSEA-1, 3-FAL); CD15s(시알릴 루이스 X(Sialyl Lewis X)); CD15u(3' 설포 루이스 X); CD15su(6 설포-시알릴 루이스 X); CD16a(FCRIIIA); CD16b(FcgRIIIb); CDw17(락토실세라마이드, LacCer); CD18(인테그린 β2, CD11a,b,c β-서브유닛); CD26(DPP IV 엑토엔임(ectoeneyme), ADA 결합 단백질); CD29(혈소판 GPIIa, β-1 인테그린, GP); CD31(PECAM-1, 엔도캠(Endocam)); CD32(FCγRII); CD33(gp67); CD35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD36(GpIIIb, GPIV, PASIV); CD37(gp52-40); CD38(ADP-리보실 사이클라아제, T10); CD39(ATP디하이드로게나아제, NTP디하이드로게나아제-1); CD40(Bp50); CD43(시알로포린(Sialophorin), 류코시알린(Leukosialin)); CD44(EMCRII, H-CAM, Pgp-1); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-1); CD46(MCP); CD47(gp42, IAP, OA3, 뉴로필린(Neurophillin)); CD47R(MEM-133); CD48(Blast-1, Hulym3, BCM-1, OX-45); CD49a(VLA-1α, α1 인테그린); CD49b(VLA-2α, gpla, α2 인테그린); CD49c(VLA-3α, α3 인테그린); CD49e(VLA-5α, α5 인테그린); CD49f(VLA-6α, α6 인테그린, gplc); CD50(ICAM-3); CD51(인테그린 α, VNR-α, 비트로넥틴-Rα); CD52(CAMPATH-1, HE5); CD53(OX-44); CD54(ICAM-1); CD55(DAF); CD58(LFA-3); CD59(1F5Ag, H19, 프로텍틴, MACIF, MIRL, P-18); CD60a(GD3); CD60b(9-O-아세틸 GD3); CD61(GP IIIa, β3 인테그린); CD62L(L-셀렉틴, LAM-1, LECAM-1, MEL-14, Leu8, TQ1); CD63(LIMP, MLA1, gp55, NGA, LAMP-3, ME491); CD64 (FcγRI); CD65(세라마이드, VIM-2); CD65s(시알산화-CD65, VIM2); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD74(Ii, 비변형(invariant) 사슬); CD75(시알로 마스크된 락토사민(sialo-masked Lactosamine)); CD75S(α2,6 시알산화 락토사민); CD80(B7, B7-1, BB1); CD81(TAPA-1); CD82(4F9, C33, IA4, KAI1, R2); CD84(p75, GR6); CD85a(ILT5, LIR2, HL9); CD85d(ILT4, LIR2, MIR10); CD85j(ILT2, LIR1, MIR7); CD85k(ILT3, LIR5, HM18); CD86(B7-2/B70); CD87(uPAR); CD88(C5aR); CD89(IgA Fc 수용체, FcαR); CD91(α2M-R, LRP); CDw92(p70); CDw93(GR11); CD95(APO-1, FAS, TNFRSF6); CD97(BL-KDD/F12); CD98(4F2, FRP-1, RL-388); CD99(MIC2, E2); CD99R(CD99 Mab 제한됨(restricted)); CD100(SEMA4D); CD101(IGSF2, P126, V7); CD102(ICAM-2); CD111(PVRL1, HveC, PRR1, 넥틴 1, HIgR); CD112(HveB, PRR2, PVRL2, 넥틴2); CD114(CSF3R, G-CSRF, HG-CSFR); CD115(c-fms, CSF-1R, M-CSFR); CD116(GMCSFRα); CDw119(IFNγR, IFNγRA); CD120a(TNFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD121b(유형 2 IL-1R); CD122(IL2Rβ); CD123(IL-3Rα); CD124(IL-4Rα); CD127(p90, IL-7R, IL-7Rα); CD128a(IL-8Ra, CXCR1, (잠정적으로 CD181로 재명명됨)); CD128b(IL-8Rb, CSCR2, (잠정적으로 CD182 재명명됨)); CD130(gp130); CD131(커먼(Common) β 서브유닛); CD132(커먼 γ 사슬, IL-2Rγ); CDw136(MSP-R, RON, p158-ron); CDw137(4-1BB, ILA); CD139; CD141(트롬보모듈린(Thrombomodulin), 페토모듈린(Fetomodulin)); CD147(바시긴(Basigin), EMMPRIN, M6, OX47); CD148(HPTP-η, p260, DEP-1); CD155(PVR); CD156a(CD156, ADAM8, MS2); CD156b(TACE, ADAM17, cSVP); CDw156C(ADAM10); CD157(Mo5, BST-1); CD162(PSGL-1); CD164(MGC-24, MUC-24); CD165(AD2, gp37); CD168(RHAMM, IHABP, HMMR); CD169(시알로어드헤신(Sialoadhesin), Siglec-1); CD170(Siglec 5); CD171(L1CAM, NILE); CD172(SIRP-1α, MyD-1); CD172b(SIRPβ); CD180(RP105, Bgp95, Ly64); CD181(CXCR1, (이전에 CD128a로 알려짐)); CD182(CXCR2, (이전에 CD128b로 알려짐)); CD184(CXCR4, NPY3R); CD191(CCR1); CD192(CCR2); CD195(CCR5); CDw197(CCR7 (CDw197이었음)); CDw198(CCR8); CD204(MSR); CD205(DEC-25); CD206(MMR); CD207(랑게린(Langerin)); CDw210(CK); CD213a(CK); CDw217(CK); CD220(인슐린 R); CD221(IGF1 R); CD222(M6P-R, IGFII-R); CD224(GGT); CD226(DNAM-1, PTA1); CD230(프리온 단백질(Prion Protein(PrP)); CD232(VESP-R); CD244(2B4, P38, NAIL); CD245(p220/240); CD256(APRIL, TALL2, TNF (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 13); CD257(BLYS, TALL1, TNF (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 13b); CD261(TRAIL-R1, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10a); CD262(TRAIL-R2, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10b); CD263(TRAIL-R3, TNBF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10c); CD264(TRAIL-R4, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10d); CD265(TRANCE-R, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 11a); CD277(BT3.1, B7 패밀리: 부티로필린(Butyrophilin) 3); CD280(TEM22, ENDO180); CD281(TLR1, 톨 유사 수용체(TOLL-like receptor) 1); CD282(TLR2, 톨 유사 수용체 2); CD284(TLR4, 톨 유사 수용체 4); CD295(LEPR); CD298(ATP1B3, Na K ATP아제, β3 서브유닛); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD300e(CMRF-35L1); CD302(DCL1); CD305(LAIR1); CD312(EMR2); CD315(CD9P1); CD317(BST2); CD321(JAM1); CD322(JAM2); CDw328(Siglec7); CDw329(Siglec9); CD68(gp 110, 마크로시알린(Macrosialin)); 및/또는 만노스 수용체(mannose receptor)를 포함하며, 여기에서 괄호 안에 열거된 이름은 다른 이름을 나타낸다.
구현예에서, 수지상 세포(“DC”)의 알려진 타겟에 대한 표적화 모이어티는 DC에서 현저하게 발현되어 있고/있거나 DC에 존재하는(즉, DC 마커) 임의의 실체(entity)(예를 들면, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 DC 마커는, 그 제한되지 않는 예로 CD1a(R4, T6, HTA-1); CD1b(R1); CD1c(M241, R7); CD1d(R3); CD1e(R2); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mo1, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, p150, 95, AXb2); CDw117(락토실세라마이드, LacCer); CD19(B4); CD33(gp67); CD 35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD 36(GpIIIb, GPIV, PASIV); CD39(ATP디하이드로게나아제, NTP디하이드로게나아제-1); CD40(Bp50); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-1); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD49e(VLA-5α, α5 인테그린); CD58(LFA-3); CD64(FcγRI); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD73(엑토-5'-뉴클레오티다아제); CD74(Ii, 비변형 사슬); CD80(B7, B7-1, BB1); CD81(TAPA-1); CD83(HB15); CD85a(ILT5, LIR3, HL9); CD85d(ILT4, LIR2, MIR10); CD85j(ILT2, LIR1, MIR7); CD85k(ILT3, LIR5, HM18); CD86(B7-2/B70); CD88(C5aB); CD97(BL-KDD/F12); CD101(IGSF2, P126, V7); CD116(GM-CSFRα); CD120a(TMFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD123(IL-3Rα); CD139; CD148(HPTP-η, DEP-1); CD150(SLAM, IPO-3); CD156b(TACE, ADAM17, cSVP); CD157(Mo5, BST-1); CD167a(DDR1, trkE, cak); CD168(RHAMM, IHABP, HMMR); CD169(시알로어드헤신, Siglec-1); CD170(Siglec-5); CD171(L1CAM, NILE); CD172(SIRP-1α, MyD-1); CD172b(SIRPβ); CD180(RP105, Bgp95, Ly64); CD184(CXCR4, NPY3R); CD193(CCR3); CD196(CCR6); CD197(CCR7(ws CDw197)); CDw197(CCR7, EBI1, BLR2); CD200(OX2); CD205(DEC-205); CD206(MMR); CD207(랑게린(Langerin)); CD208(DC-LAMP); CD209(DCSIGN); CDw218a(IL18Rα); CDw218b(IL8Rβ); CD227(MUC1, PUM, PEM, EMA); CD230(프리온 단백질(PrP)); CD252(OX40L, TNF (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 4); CD258(LIGHT, TNF (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 14); CD265(TRANCE-R, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 11a); CD271(NGFR, p75, TNFR 슈퍼패밀리, 멤버 16); CD273(B7DC, PDL2); CD274(B7H1, PDL1); CD275(B7H2, ICOSL); CD276(B7H3); CD277(BT3.1, B7 패밀리: 부티로필린 3); CD283(TLR3, 톨 유사 수용체 3); CD289(TLR9, 톨 유사 수용체 9); CD295(LEPR); CD298(ATP1B3, Na K ATP아제 β3 서브유닛); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD301(MGL1, CLECSF14); CD302(DCL1); CD303(BDCA2); CD304(BDCA4); CD312(EMR2); CD317(BST2); CD319(CRACC, SLAMF7); CD320(8D6); 및 CD68(gp110, 마크로시알린); 클래스 II MHC; BDCA-1; Siglec-H를 포함하며, 여기에서 괄호 안에 열거된 이름은 다른 이름을 나타낸다.
구현예에서, 표적화는 B 세포에서 현저하게 발현되어 있고/있거나 B 세포에 존재하는(즉, B 세포 마커) 임의의 실체(entity)(예를 들면, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티로 달성될 수 있다. 예시적인 B 세포 마커는, 그 제한되지 않는 예로 CD1c(M241, R7); CD1d(R3); CD2(E-로제트(rosette) R, T11, LFA-2); CD5(T1, Tp67, Leu-1, Ly-1); CD6(T12); CD9(p24, DRAP-1, MRP-1); CD11a(LFA-1α, αL 인테그린 사슬); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mo1, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, P150, 95, AXb2); CDw17(락토실세라마이드, LacCer); CD18(인테그린 β2, CD11a, b, c β-서브유닛); CD19(B4); CD20(B1, Bp35); CD21(CR2, EBV-R, C3dR); CD22(BL-CAM, Lyb8, Siglec-2); CD23(FceRII, B6, BLAST-2, Leu-20); CD24(BBA-1, HSA); CD25(Tac 항원, IL-2Rα, p55); CD26(DPP IV 엑토엔임, ADA 결합 단백질); CD27(T14, S152); CD29(혈소판 GPIIa, β-1 인테그린, GP); CD31(PECAM-1, 엔도캠(Endocam)); CD32(FCγRII); CD35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD37(gp52-40); CD38(ADP리보실 사이클라아제(ADPribosyl cyclase), T10); CD39(ATP디하이드로게나아제, NTP디하이드로게나아제-1); CD40(Bp50); CD44(ECMRII, H-CAM, Pgp-1); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-1); CD46(MCP); CD47(gp42, IAP, OA3, 뉴로필린); CD47R(MEM-133); CD48(Blast-1, Hulym3, BCM-1, OX-45); CD49b(VLA-2α, gpla, α2 인테그린); CD49c(VLA-3α, α3 인테그린); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD50(ICAM-3); CD52(CAMPATH-1, HES); CD53(OX-44); CD54(ICAM-1); CD55(DAF); CD58(LFA-3); CD60a(GD3); CD62L(L-셀렉틴, LAM-1, LECAM-1, MEL-14, Leu8, TQ1); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD73(엑토-5'-뉴클레오티다아제); CD74(Ii, 비변형 사슬); CD75(시알로 마스크된 락토사민); CD75S(α2, 6 시알산화 락토사민); CD77(Pk 항원, BLA, CTH/Gb3); CD79a(Igα, MB1); CD79b(Igβ, B29); CD80; CD81(TAPA-1); CD82(4F9, C33, IA4, KAI1, R2); CD83(HB15); CD84(P75, GR6); CD85j(ILT2, LIR1, MIR7); CDw92(p70); CD95(APO-1, FAS, TNFRSF6); CD98(4F2, FRP-1, RL-388); CD99(MIC2, E2); CD100(SEMA4D); CD102(ICAM-2); CD108(SEMA7A, JMH 혈액 그룹 항원); CDw119(IFNγR, IFNγRa); CD120a(TNFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD121b(유형 2 IL-1R); CD122 (IL2Rβ); CD124(IL-4Rα); CD130(gp130); CD132(커먼(Common) γ 사슬, IL-2Rγ); CDw137(4-1BB, ILA); CD139; CD147(바시긴, EMMPRIN, M6, OX47); CD150(SLAM, IPO-3); CD162(PSGL-1); CD164(MGC-24, MUC-24); CD166(ALCAM, KG-CAM, SC-1, BEN, DM-GRASP); CD167a(DDR1, trkE, cak); CD171(L1CMA, NILE); CD175s(시알릴-Tn (S-Tn)); CD180(RP105, Bgp95, Ly64); CD184(CXCR4, NPY3R); CD185(CXCR5); CD192(CCR2); CD196(CCR6); CD197(CCR7(CDw197이었음)); CDw197(CCR7, EBI1, BLR2); CD200(OX2); CD205(DEC-205); CDw210(CK); CD213a(CK); CDw217(CK); CDw218a(IL18Rα); CDw218b(IL18Rβ); CD220(인슐린 R); CD221(IGF1 R); CD222(M6P-R, IGFII-R); CD224(GGT); CD225(Leu13); CD226(DNAM-1, PTA1); CD227(MUC1, PUM, PEM, EMA); CD229(Ly9); CD230(프리온 단백질(Prp)); CD232(VESP-R); CD245(p220/240); CD247(CD3 제타 사슬); CD261(TRAIL-R1, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10a); CD262(TRAIL-R2, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10b); CD263(TRAIL-R3, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10c); CD264(TRAIL-R4, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 10d); CD265(TRANCE-R, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 11a); CD267(TACI, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 13B); CD268(BAFFR, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 13C); CD269(BCMA, TNF-R 슈퍼패밀리, 멤버 16); CD275(B7H2, ICOSL); CD277(BT3.1.B7 패밀리: 부티로필린 3); CD295(LEPR); CD298(ATP1B3 Na K ATP아제 β3 서브유닛); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD305(LAIR1); CD307(IRTA2); CD315(CD9P1); CD316(EW12); CD317(BST2); CD319(CRACC, SLAMF7); CD321(JAM1); CD322(JAM2); CDw327(Siglec6, CD33L); CD68(gp 100, 마크로시알린); CXCR5; VLA-4; 클래스 II MHC; 표면 IgM; 표면 IgD; APRL; 및/또는 BAFF-R을 포함하며, 여기에서 괄호 안에 열거된 이름은 다른 이름을 나타낸다. 마커의 예는 본원의 다른 부분에서 제공되는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, B 세포 표적화는 활성화시 B 세포에 현저하게 발현되어 있고/있거나 B 세포에 존재하는(즉, 활성화된 B 세포 마커) 임의의 실체(entity)(예를 들면, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티로 달성될 수 있다. 예시적인 활성화된 B 세포 마커는, 그 제한되지 않는 예로 CD1a(R4, T6, HTA-1); CD1b(R1); CD15s(시알릴 루이스 X); CD15u(3' 설포 루이스 X); CD15su(6 설포-시알릴 루이스 X); CD30(Ber-H2, Ki-1); CD69(AIM, EA 1, MLR3, gp34/28, VEA); CD70(Ki-24, CD27 리간드); CD80(B7, B7-1, BB1); CD86(B7-2/B70); CD97(BLKDD/F12); CD125(IL-5Rα); CD126(IL-6Rα); CD138(신데칸-1(Syndecan-1), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(Heparan sulfate proteoglycan)); CD152(CTLA-4); CD252(OX40L, TNF(리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 4); CD253(TRAIL, TNF(리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 10); CD279 (PD1); CD289(TLR9, 톨 유사 수용체 9); 및 CD312(EMR2)를 포함하며, 여기에서 괄호 안에 열거된 이름은 다른 이름을 나타낸다. 마커의 예는 본원의 다른 부분에서 제공되는 것을 포함한다.
“만성 감염원 항원(chronic infectious agent antigen)”은 사이토카인 반응의 Th2 유형 양상 또는 항원에 차선 및/또는 비효과적인 Th1 유형 반응으로 특징지어지는 만성 감염을 생성하는 감염원의 항원을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역특징 표면은 만성 감염원 항원을 포함하지 않는다. 구현예에서, 만성 감염원 항원은 레이시매니아 기생충(Leishmania parasite), 칸디다 알비칸스(candida albicans), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigates), 말라리아원충 기생충(plasmodium parasite), 톡소포자충(toxoplasma gondii), 미코박테리아(mycobacteria), HIV, HBV, HCV, EBV, CMV 및 주혈흡충(schistosoma trematodes)으로부터 유도된 항원을 포함한다.
“공동투여하다(co-administer)” 또는 “공동투여(co-administration)”는 병태의 치료와 관련된 항원을 대상체에 투여 한 후 24시간 이하, 바람직하게는 12시간 이하, 더욱 바람직하게는 6시간 이하 이내에 본 발명의 합성 나노담체를 대상체에 투여하는 것을 의미한다. 공동투여는 동일 투약 형태로 또는 별개의 투약 형태를 통해서 일어날 수 있다.
“결합된(coupled)”은 합성 나노담체에 부착된 또는 그 안에 포함됨을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 결합(coupling)은 공유(covalent)이다. 몇몇 구현예에서, 공유결합은 하나 이상의 링커로 매개된다. 몇몇 구현예에서, 결합은 비공유이다. 몇몇 구현예에서, 비공유 결합은 전하 상호작용(charge interaction), 친화력 상호작용(affinity interaction), 금속 배위(metal coordination), 물리적 흡착(physical adsorption), 호스트게스트 상호작용(hostguest interaction), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction), TT 스태킹 상호작용(TT stacking interaction), 수소 결합 상호작용(hydrogen bonding interaction), 반데르발스 상호작용(van der Waals interaction), 자기적 상호작용(magnetic interaction), 정전기적 상호작용(electrostatic interaction), 쌍극자-쌍극자 상호작용(dipole-dipole interaction), 및/또는 이의 조합으로 매개된다. 구현예에서, 결합은 종래의 기술을 사용하여 합성 나노담체 내에서의 캡슐화의 맥락에서 일어날 수 있다. 구현예에서, 면역자극제, T 세포 항원, 및 본 발명에 따른 면역특징 표면의 모이어티는 각각 개별적으로 또는 이의 조합으로 합성 나노담체에 결합될 수 있다.
“투약 형태(dosage form)”는 대상체에 투여하기에 적합한 매체(medium), 담체(carrier), 운반체(vehicle), 또는 장치 내에 있는 약(drug)을 의미한다.
“병태를 앓고 있는 대상체를 식별하는 것”은 대상체가 특정 의학적 병태를 가지고 있거나 또는 가질것 같은지 여부를 진단하거나 탐지하거나 또는 확인하는 것을 의미한다.
“면역특징 표면”은 다수의 모이어티를 포함하는 표면을 의미하며, 여기에서 (1) 면역특징 표면은 항체의 Fc 부분인 모이어티를 배제하고; (2) 모이어티는 포유류의 항원 제시 세포에 결합활성에 기초한 결합(avidity-based binding)을 제공하기에 유효한 양으로 존재한다.
결합활성에 기초한 결합(avidity-based binding)은 결합활성 효과에 기초한 결합이다(이러한 유형의 결합은 또한 “고 결합활성(high avidity)” 결합이라고도 불린다). 바람직한 구현예에서, 면역특징 표면의 존재는 (결합활성 효과(즉, “고 결합활성” 결합)에 기초한 결합의 존재를 확인할 수 있는 다른 방법들이 본 발명의 실시에 또한 사용될 수 있지만) 생체내 분석(in vivo assay) 후 다음의 시험관내 분석(in vitro assay)을 사용함으로써 결정될 수 있다.
생체내 분석은 면역특징 표면을 가진 합성 나노담체 한 세트와 대조군의 역할을 하는 다른 세트의 상이한 형광 표지를 지니는 두 세트의 합성 나노담체를 사용한다. 면역특징 표면이 생체내에서 항원 제시 세포에 대하여 합성 나노담체를 표적화 할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해서, 합성 나노담체의 두 세트 모두가 1:1로 혼합되고 마우스의 발바닥(footpad) 내로 주입되었다. 수지상 세포와 피막하동 마크로파지(subcapsular sinus macrophage) 상의 합성 나노담체 축적은 나노담체 주입 후 각각 1 내지 4시간 사이와 24시간 후의 시점에서 주입 마우스의 배출되는 슬와 림프절(draining popliteal lymph node)을 수확함으로써 측정한다. 림프절은 냉동 부위의 공초점 형광 면역조직학(confocal fluorescence immunohistology)용으로 처리하고, 마우스-CD11c의 형광 항체(클론 HL3, BD BIOSCIENCES？ 또는 마우스-CD169 (SEROTEC？의 클론 3D6.112)의 대비 염색제로 염색하며, ADOBE？ PHOTOSHOP？과 같은 적합한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 면적측정(planimetry)으로 분석한다. 만약 면역특징 표면을 포함하는 합성 나노담체가 대조군 나노담체보다 적어도 1.2배, 바람직하게는 적어도 1.5배, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 더 자주 수지상 세포 및/또는 피막하동 마크로파지와 회합한다면, 면역특징 표면에 의한 항원 제시 세포의 표적화가 성립된다.
바람직한 구현예에서, 생체내 분석을 수반하는 시험관내 분석을 통해, 면역특징 표면이 포함하는 모이어티, 또는 시험관내 항원 제시 세포 발현 표면 항원에 특이적인 항체(인간 수지상 세포에 대해서는 Miltenyi BIOTEC？의 항CD1c(BDCA-1) 클론 AD5-8E7, 마우스 수지상 세포에 대해서는 BD BIOSCIENCES？의 항CD11c(X 인테그린) 클론 HL3, 또는 쥣과의 피하막동 마크로파지에 대해서는 SEROTEC？의 항CD169 클론 3D6.112)로 코팅된 생체적합성 표면 상에서의 인간 또는 쥣과의 수지상 세포 또는 쥣과의 피막하동 마크로파지(집합적으로, “시험관내 항원 제시 세포(In Vitro Antigen Presenting Cells)”)의 고정화(immobilization)를 측정하여, (i) 면역특징 표면이 포함하는 모이어티로 코팅된 표면에 시험관내 항원 제시 세포를 최대로 고정화하는데 상응하는 최적 코팅 밀도가 탐지될 수 없거나 또는 항체 코팅된 표면에서 관측되는 것의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%이고; (ii) 만약 면역특징 표면에 의한 시험관내 항원 제시 세포의 고정화가 탐지될 수 있다면, 테스트되고 있는 면역특징 표면은 최대 결합의 절반을 지지하는 항체 코팅 밀도 보다 적어도 2 배, 바람직하게는 적어도 3 배, 더욱 바람직하게는 적어도 4배 더 큰 면역특징 표면이 포함하는 모이어티의 코팅 밀도에서 최대 결합의 절반을 지지한다.
면역특징 표면은 pH 7.2 내지7.4에서 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성으로 하전될 수 있다. 면역특징 표면은 동일한 모이어티, 또는 상이한 모이어티의 혼합물로 구성될 수 있다. 구현예에서, 면역특징 표면은 B 세포 항원을 포함할 수 있다. 면역특징 표면에 잠재적으로 유용한 모이어티의 예는 니코틴 및 이의 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기(예를 들어, 3급 아민), 시알릴락토스, 아비딘 및/또는 뉴트르아비딘(NeutrAvidin)과 같은 아비딘 유도체, 및 상기한 임의의 것의 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 면역특징 표면이 포함하는 모이어티는 본 발명의 나노담체의 표면에 결합된다. 다른 구현예에서, 면역특징 표면은 본 발명의 나노담체의 표면에 결합된다.
면역특징 표면이 포함하는 모이어티는 고 결합활성 결합을 부여한다는 것에 주목하여야 한다. 이 정의에서 구체적으로 정의되고 본 명세서에 걸쳐 일반적으로 기재된 바와 같이, 나노담체에 존재할 수 있는 모든 모이어티가 고 결합활성 결합을 부여하지는 않을 것이다. 따라서, 표면이 다수의 모이어티(종종 “어레이(array)”로 지칭됨)를 포함할 지라도, 이는 본래 그러한 표면이 본 발명의 정의 및 개시에 따른 결합을 부여함을 나타내는 데이터가 없는 면역특징 표면임을 의미하는 것은 아니다.
“면역자극제”는 항원에 대한 면역 반응은 조절하지만 항원 또는 항원으로부터 유도된 것이 아닌 제제를 의미한다. 본원에 사용된 “조절하다(Modulate)”는 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나, 지시하거나(directing) 또는 재지시(redirecting)하는 것을 나타낸다. 그러한 제제는 항원에 대한 면역 반응은 자극하지만(또는 증대시키지만) 항원 또는 항원에서 유도된 것은 아닌 면역자극제를 포함한다. 따라서, 면역자극제는 애쥬번트(adjuvant)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 합성 나노담체의 표면에 있고/있거나 합성 나노담체 안에 포함된다. 구현예에서, 면역자극제는 합성 나노담체에 결합된다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체의 모든 면역자극제는 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 다수의 상이한 유형의 면역자극제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 다수의 개별적인 면역자극제를 포함하며, 이들 모두 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 정확히 한 유형의 면역자극제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 두가지 유형의 구별되는 면역자극제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 두가지를 초과하는 유형의 구별되는 면역자극제를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질 막(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)을 포함하며, 여기에서 적어도 한 가지 유형의 면역자극제는 지질 막과 결합되어 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 한 가지 유형의 면역자극제는 지질 막 내에 포매되어 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 한 가지 유형의 면역자극제는 지질 이중층의 루멘 내에 포매되어 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질 막의 내부 표면에 결합된 적어도 한 가지 유형의 면역자극제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 적어도 한 가지 유형의 면역자극제는 합성 나노담체의 지질 막 내에 캡슐화된다. 몇몇 구현예에서, 적어도 한 가지 유형의 면역자극제는 합성 나노담체의 다수 위치에 위치할 수 있다. 이 기술분야의 당업자는 전술한 예들이 단지 다수의 면역자극제가 합성 나노담체의 상이한 로케일(locale)과 결합될 수 있는 많은 상이한 방법의 대표적인 것임을 이해할 것이다. 다수의 면역자극제는 합성 나노담체의 임의의 로케일의 조합에 위치할 수 있다.
“합성 나노담체의 최대 크기”는 합성 나노담체의 임의의 축을 따라서 측정된 나노담체의 가장 큰 크기를 의미한다. “합성 나노담체의 최소 크기”는 합성 나노담체의 임의의 축을 따라서 측정된 합성 나노담체의 가장 작은 크기를 의미한다. 예를 들어, 구형의 합성 나노담체에 대해서, 합성 나노담체의 최대 및 최소 크기는 실질적으로 동일할 것이며, 그 직경의 크기일 것이다. 유사하게, 입방형의 합성 나노담체에 대해서는, 합성 나노담체의 최소 크기는 그것의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 작은 것이 될 것이며, 한편 합성 나노담체의 최대 크기는 그것의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 큰 것이 될 것이다. 일 구현예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 크기가 100nm 초과이다. 일 구현예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 5㎛ 이하이다. 바람직하게 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 크기가 110nm 초과, 더욱 바람직하게는 120nm 초과, 더욱 바람직하게는 130nm 초과, 더욱 더 바람직하게는 150nm 초과이다. 바람직하게 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 3㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 2㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 1㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 800nm 이하, 더욱 바람직하게는 600nm 이하, 더욱 더 바람직하게는 500nm 이하이다. 바람직한 구현예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 100nm 이상, 더욱 바람직하게는 120nm 이상, 더욱 바람직하게는 130nm 이상, 더욱 바람직하게는 140nm 이상, 더욱 더 바람직하게는 150nm 이상이다. 합성 나노담체 크기의 측정은 합성 나노담체를 액체(통상적으로 수성) 매체에 현탁하고 동적 광 산란(예를 들어 Brookhaven ZetaPALS 기구를 사용)으로 얻어진다.
“비항원성 면역특징 표면”은 합성 나노담체의 표면에 존재할 때 T 세포 또는 B 세포를 활성화하는 모이어티를 포함하지 않거나 합성 나노담체의 표면에 존재할 때 T 세포 또는 B 세포를 활성화는 모이어티를 포함하지만 합성 나노담체가 T 세포 또는 B 세포를 활성화하기에 충분하지 않은 양으로 모이어티를 포함하는 면역특징 표면을 의미한다. 일 구현예에서, 인간 및 마우스 림프구의 활성화는 세포 표면 ‘활성화 마커’의 분석에 의해 탐지할 수 있다. 예를 들어, CD69(매우 초기의 활성화 항원)는 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 많이 발현되지만 증식하고 있지 않는 비활성화된 세포에서는 발현되지 않는 세포 표면 분자이다. 인간 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 마우스 비장 유래의 T 세포 및 B 세포의 활성화는 형광색소가 컨쥬게이트된 항CD69 항체를 사용하고 유동세포계측법을 사용한 분석으로 탐지할 수 있다. 활성화된 림프구는 비활성화된 대조 림프구에 비해 형광 강도의 증가가 2배 초과임을 보여준다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역특징 표면은 비항원성 면역특징 표면을 포함한다.
“수동적 투여”는 대상체가 스스로 대상체를 항원에 노출시키게 하는 방식으로 수행하도록 지시(directing), 또는 조처하여 항원과 같은 물질을 투여하는 것을 의미한다. 예를 들어, 일 구현예에서 알레르겐의 수동적 투여는 대상체가 그 또는 그녀 자신을 환경에 존재하는 알레르겐(즉, “환경 알레르겐(environmental allergen)에 노출되도록 지시함으로써 일어난다.
“약학적으로 허용되는 부형제”는 본 발명의 조성물에 첨가되어 조성물의 투여를 보다 용이하게 하는 약리학적 비활성 물질을 의미한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 제한되지 않는 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 희석제, 전분의 다양한 당 및 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
“대상체”는 인간 및 영장류와 같은 포유류; 조류; 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지와 같은 가축 동물 또는 농장 동물; 마우스, 쥐 및 기니아 피그와 같은 실험실 동물; 어류 등을 포함하는 동물이다.
“합성 나노담체(들)”는 자연에서 발견되지 않으며 적어도 크기가 5 마이크론 이하인 크기를 갖는 분리된 물체를 의미한다. 알부민 나노입자는 합성 나노담체로써 명백히 포함된다.
합성 나노담체는 이에 제한되지는 않지만, 하나 또는 다수의 지질 기반 나노입자, 중합성 나노입자, 금속성 나노입자, 계면활성제 기반 에멀젼, 덴드리머, 버키볼(buckyball), 나노와이어, 바이러스 유사 입자, 펩티드 또는 단백질 기반 입자(예컨대, 알부민 나노입자) 및/또는 지질 중합체 나노입자와 같은 나노물질의 조합을 사용하여 개발된 나노입자일 수 있다. 합성 나노담체는 다양하게 상이한 형태일 수 있으며, 그 제한되지 않는 예로 구형, 입방형, 피라미드형, 타원형, 원통형, 도넛형 등을 포함한다. 본 발명에 따른 합성 나노담체는 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 실시에서 사용을 위해 조정할 수 있는 합성 나노담체의 예는 (1) Gref et al.의 미국 특허 제5,543,158 호에 개시된 생분해성 나노입자, (2) Saltzman et al.의 공개된 미국 특허출원 제20060002852호의 중합성 나노입자, 또는 (4) DeSimone et al.의 공개된 미국 특허출원 제20090028910 호의 리소그래피로 만들어진 나노입자를 포함한다. 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체(complement)를 활성화하는 히드록실 기를 갖는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하는 히드록실 기가 아닌 모이어티로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체(complement)를 실질적으로 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 실질적으로 활성화하지 않는 모이어티로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체(complement)를 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하지 않는 모이어티로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다.
“T 세포 항원”은 T 세포에 의해 인지되거나 또는 T 세포 내의 면역 반응을 촉발하는 임의의 항원(예를 들어, 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합유전자복합체(major histocompatability complex molecule(MHC))에 결합되거나 또는 CD1 복합체에 결합된 항원 또는 이의 일부의 제시로 T 세포 위의 T 세포 또는 NKT 세포 상의 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원)을 의미한다. 몇몇 구현예에서, T 세포 항원인 항원은 또한 B 세포 항원이다. 다른 구현예에서, T 세포 항원이 또한 B 세포 항원이지는 않다. T 세포 항원은 일반적으로 단백질 또는 펩티드이다. T 세포 항원은 CD8+ T 세포 반응, CD4+ T 세포 반응, 또는 둘 다를 자극하는 항원일 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서 나노담체는 효과적으로 두 유형의 반응 모두를 자극할 수 있다. 몇몇 구현예에서, T 세포 항원은 ‘보편적’ T 세포 항원(즉, T 세포 도움의 자극을 통해 관련되지 않은 B 세포 항원에 증강된 반응을 생성할 수 있는 것)이다. 구현예에서, 보편적 T 세포 항원은 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 또는 파드레 펩티드(Padre peptide)에서 유도된 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다.
“Th1 편향 면역자극제”는 (1) Th1 유형 사이토카인으로 특징지어지는 반응에 대한 Th2 유형 사이토카인 반응으로 특징지어지는 반응으로부터의 면역 반응을 편향하거나, 또는 (2) 차선 및/또는 비효과적인 Th1 유형 반응을 증대하는 면역자극제를 의미한다.
임의의 구현예에서, Th1 편향 면역자극제는 인터루킨, 인터페론, 사이토카인 등일 수 있다. 특정 구현예에서, Th1 편향 면역자극제는 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9, TLR-10 및 TLR-11 작용제(agonist)와 같은 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)에 대한 천연 또는 합성 작용제일 수 있다.
특정 구현예에서, 합성 나노담체는 톨 유사 수용체(TLR) 7 및 8에 대한 작용제(“TLR 7/8 작용제”)를 포함한다. 유용성을 위해서 Tomai et al.의 미국 특허 제6,696,076호에 개시된 TLR 7/8 작용제 화합물이 유용하며, 그 제한되지 않는 예로 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬 이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민을 포함한다. 바람직한 Th1 편향 면역자극제는 이미퀴모드(imiquimod)와 R848을 포함한다.
특정 구현예에서, 합성 나노담체는 유형 I 인터페론 분비를 유도하고, T 세포 및 B 세포 활성화를 자극하여 증가된 항체 생성 및 세포 독성 T 세포 반응을 유도하는, CpG를 포함하는 면역자극 DNA 분자와 같은 톨 유사 수용체(TLR)-9에 대한 리간드를 포함한다(Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549; Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186:1623-1631; Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344; Roman et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nat. Med. 1997. 3:849-854; Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876; Lipford et al., Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol. 1998. 6:496-500). 구현예에서, CpG는 안정성을 증진시키고자 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages) 또는 개질된 염기와 같은 개질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,663,153호, 제6,194,388호, 제7,262,286호, 또는 제7,276,489호를 참조한다. 일정 구현예에서, 내성(tolerance) 보다 면역을 자극하기 위해서, DC 성숙(DC maturation)(나이브 T 세포(naive T cell)를 준비시키기 위해 필요) 및 항체 반응과 항바이러스성 면역을 증진하는, 유형 I 인터페론과 같은 사이토카인의 생산을 증진시키는 면역자극제를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 박테리아성 리포폴리사카라이드(LPS), VSV-G, 및/또는 HMGB-1과 같은 TLR-4 작용제일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 세포에 의해 방출되며 세포-세포 상호작용, 커뮤니케이션 및 다른 세포의 거동에 특이적 효과를 나타내는 소단백질 또는 생물학적 인자(5kD 내지20kD의 범위)인 사이토카인이다. 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 괴저성 세포에서 방출된 염증전 자극(proinflammatory stimuli)일 수 있다(예를 들어 요산염 결정). 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 보체 캐스케이드(complement cascade)(예를 들어, CD21, CD35 등)의 활성화된 성분일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 면역자극제는 면역 복합체의 활성화된 성분일 수 있다. 면역자극제는 또한 CD21 또는 CD35와 결합하는 분자와 같은 보체 수용체 작용제(complement receptor agonist)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 보체 수용체 작용제는 나노담체의 내재성 보체 옵소닌화(endogenous complement opsonization)를 유도한다. 면역자극제는 또한 사이토카인과 같은 사이토카인 수용체 작용제를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 사이토카인 수용체 작용제는 소분자, 항체, 융합 단백질, 또는 앱타머이다. 구현예에서, 면역자극제는 또한 그 제한되지 않는 예로 dsRNA 또는 poly I:C(TLR3 자극제(stimulant)), 및/또는 F. Heil et al., “Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8” Science 303(5663), 1526-1529 (2004); J. Vollmer et al., “Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides”(국제출원 WO 제2008033432호 A2); A. Forsbach et al., “Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway”(국제출원 WO 제2007062107호 A2); E. Uhlmann et al., “Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity”(미국 공개 특허출원 US 제2006241076호); G. Lipford et al., “Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections”(국제출원 WO 제2005097993호 A2); G. Lipford et al., “Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods”(국제출원 WO 제2003086280호 A2)에 개시된 것과 같은 면역자극 RNA 분자를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 애쥬번트(adjuvant)로 제형화된 백신 나노담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 명세서에 사용된 용어 “애쥬번트(adjuvant)”는 특정 항원을 구성하지는 않지만 투여된 항원의 면역 반응을 증강시키는 작용제(agent)를 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 백신 나노담체는 겔 유형 애쥬번트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트 등), 미생물 애쥬번트(microbial adjuvant)(예를 들어, CpG 모티프를 포함하는 면역조절 DNA 서열; 면역자극 RNA 분자; 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A)와 같은 엔도톡신; 콜레라 독소(cholera toxin), E. coli 열민감 독소(E. coli heat labile toxin), 및 백일해 독소(pertussis toxin)와 같은 엑소톡신; 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide) 등); 오일 에멀젼 및 유화제 기반 애쥬번트(예를 들어, Freund의 애쥬번트, MF59[Novartis], SAF 등); 미립자 애쥬번트(예를 들어, 리포솜, 생분해성 마이크로스피어, 사포닌 등); 합성 애쥬번트(예를 들어, 비이온성 블록 코폴리머, 뮤라밀 펩티드 유사체, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 합성 폴리뉴클레오티드 등) 및/또는 이의 조합과 같은 하나 이상의 애쥬번트와 함께 제형화된다.
“투여와 다른 때” 또는 “조성물이 투여되는 때와 다른 때”는 투여 전 또는 후의 약 30초를 초과하는 때, 바람직하게는 투여 전 또는 후의 약 1분을 초과하는 때, 더욱 바람직하게는 투여 전 또는 후의 5분을 초과하는 때, 더욱 더 바람직하게는 투여 전 또는 후의 1일을 초과하는 때, 더욱 더 바람직하게는 투여 전 또는 후의 2일을 초과하는 때, 더욱 더 바람직하게는 투여 전 또는 후의 1주를 초과하는 때, 더욱 더 바람직하게는 투여 전 또는 후의 1달을 초과하는 때를 의미한다.
“종양 항원”은 종양이 존재하는 대상체에서 특이적 면역 반응을 유도해내는 종양의 세포 표면 항원을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역특징 표면은 종양 항원을 포함하지 않는다.
“벡터 효과”는 병태의 치료와 관련된 합성 나노담체의 항원보다는 합성 나노담체에 원하지 않는 면역 반응을 일으키는 것을 의미한다. 합성 나노담체의 물질이 그 화학적 조성 또는 구조 때문에 강력한 체액성 면역 반응을 자극할 수 있을 때 벡터 효과가 발생할 수 있다. 한 상황에서, 벡터 효과를 유도하는 합성 담체는 병태의 치료와 관련된 항원과 다른 항원으로 면역계를 가득차게 할 것이며, 관련된 항원에 대해서는 약한 반응을 초래할 것이다. 다른 상황에서, 원하지 않는 면역 반응은 나노담체 자체에 대한 강한 반응이어서, 동일 대상체에 연속하여 사용하는데 있어서 나노담체가 비효과적이며, 아마도, 심지어는 위험하다. 따라서 임의의 구현예에서, 합성 나노담체의 표면(들)은 예를 들면 바이러스 코트 단백질과 같은 벡터 효과를 야기하는 물질을 주로 하여 또는 실질적으로 그러한 물질로 형성되지 않는다. 하지만, 본 발명의 합성 나노담체를 제조하는데 바이러스 코트 단백질과 같은 강한 면역성 물질이 사용될 수 있고, 벡터 효과를 피할 수 있는 상황에서는 합성 나노담체 자체가 벡터 효과를 감소시키거나 또는 제거할 수 있도록 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 벡터 효과 유도 물질(예를 들어, 바이러스 유사 입자에 사용되는 바이러스 코트 단백질)이 합성 나노담체의 표면으로부터 멀리 위치될 수 있거나 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 면역 변경(immune-altering) 분자로 코팅되어 나노담체의 실제 표면의 면역성을 줄여 만약 그렇지 않았다면 발생할 벡터 효과를 피할 수 있다.
C. 본 발명의 면역나노치료 조성물
본 발명에 따라서 광범위하게 다양한 합성 나노담체가 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 구체 또는 회전 타원체이다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 평평하거나 또는 플레이트 모양이다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 입방체 또는 입방(cubic)이다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 타원형(oval) 또는 타원(ellipse)이다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 원통, 원뿔, 또는 피라미드이다.
크기, 모양, 및/또는 조성의 관점에서 상대적으로 균일한 합성 나노담체의 개체군을 사용하여 각 합성 나노담체가 유사한 특징을 갖는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 합성 나노담체의 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 평균 직경 또는 평균 크기의 5%, 10%, 또는 20%의 범위 내에 최소 크기 또는 최대 크기를 가질 것이다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체의 개체군은 크기, 모양, 및/또는 조성에 대하여 이질적일 수 있다.
합성 나노담체는 고체이거나 또는 속이 비었을 수 있고 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 각 층은 다른 층(들)과 비교해 고유한 조성 및 고유한 특성을 가진다. 한 가지 예를 들자면, 합성 나노담체는 코어/쉘 구조를 가질 수 있고, 여기에서 코어는 일 층(예를 들어, 중합성 코어)이고 쉘은 제 2층(예를 들어, 지질 이중층 또는 단분자층)이다. 합성 나노담체는 다수의 상이한 층을 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 리포좀을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질 단분자층을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 미셀(micelle)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)으로 둘러싸인 중합성 매트릭스를 포함하는 코어를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)으로 둘러싸인 비중합성 코어(예를 들어, 금속 입자, 양자점(quantum dot), 세라믹 입자, 뼈 물질, 바이러스성 입자, 단백질, 핵산, 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 중합성 매트릭스를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 그러한 중합성 매트릭스는 코팅층(예를 들어, 리포좀, 지질 단분자층, 미셀 등)으로 둘러싸일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체의 다양한 요소는 중합성 매트릭스와 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 면역특징 표면, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 중합성 매트릭스와 공유 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 공유 결합은 링커에 의해 매개된다. 몇몇 구현예에서, 면역특징 표면, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 비공유적으로 중합성 매트릭스와 결합할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 면역특징 표면, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제는 중합성 매트릭스내에 캡슐화되거나, 중합성 매트릭스로 둘러싸이거나, 또는 중합성 매트릭스에서 분산될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 면역특징 표면, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제는 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반데르발스 힘 등에 의해 중합성 매트릭스와 회합할 수 있다.
광범위하게 다양한 중합체와 그 중합체로부터 중합성 매트릭스를 형성하는 방법이 약 전달 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 중합성 매트릭스는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 중합체는 천연 또는 비천연(합성) 중합체일 수 있다. 중합체는 단일중합체 또는 둘 이상의 단량체를 포함하는 공중합체일 수 있다. 시퀀스의 관점에서, 공중합체는 랜덤, 블록일 수 있거나 또는 랜덤 및 블록 시퀀스의 조합을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 중합체는 유기 중합체이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 중합체의 예는, 그 제한되지 않는 예로 폴리에틸렌, 폴리카보네이트(예를 들어, 폴리(1,3-디옥산-2온)), 폴리안하이드라이드(예를 들어, 폴리(세바식 안하이드라이드)(poly(sebacic 안하이드라이드)), 폴리하이드록시애시드(예를 들어, 폴리(β-하이드록시알카노에이트)), 폴리프로필퓨메레이트(polypropylfumerate), 폴리카프로락톤, 폴리아미드(예를 들어, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 및 폴리아민을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 따른 중합체는 21 C.F.R. § 177.2600 하에서 미국 FDA(U.S. Food and Drug Administration(FDA))가 인간에 사용하는 것을 승인한 중합체를 포함하며, 그 제한되지 않는 예로 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리(1,3-디옥산-2온)); 폴리안하이드라이드(예를 들어, 폴리(세바식 안하이드라이드)); 폴리에테르(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 친수성일 수 있다. 예를 들어, 중합체는 음이온기(예를 들어, 포스페이트기, 설페이트기, 카르복실레이트기); 양이온기 (예를 들어, 4급 아민기); 또는 극성기(예를 들어, 히드록실기, 티올기, 아민기)를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 친수성 중합성 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 합성 나노담체 내에 친수성 환경을 생성한다. 몇몇 구현예에서, 중합체는 소수성일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 소수성 중합성 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 합성 나노담체 내에 소수성 환경을 생성한다. 중합체의 친수성 또는 소수성의 선택은 합성 나노담체 내에 포함된(예를 들어, 결합된) 물질의 성질에 영향을 줄 수 있다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 하나 이상의 모이어티 및/또는 작용기(functional group)로 개질될 수 있다. 다양한 모이어티 또는 작용기가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 탄수화물, 및/또는 폴리사카라이드로부터 유도된 아크릴릭 폴리아세탈로 개질될 수 있다(Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301).
몇몇 구현예에서, 중합체는 지질 또는 지방산 기로 개질될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 지방산 기는 부티르산(butyric acid), 카프로산(caproic acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프릭산(capric acid), 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 베헨산(behenic acid), 또는 리그노세르산(lignoceric acid) 중 하나 이상일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 지방산 기는 팔미톨레산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid), 바크센산(vaccenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀레산(alpha-linoleic acid), 감마-리놀레산(gamma-linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 가돌레산(gadoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), 또는 에루스산(erucic acid) 중 하나 이상일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)와 같이 본원에서 집합적으로 “PLGA”로 칭해지는 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체; 및 본원에서 “PGA”로 칭해지는 글리콜산 단위를 포함하는 단일중합체 및 본원에서 집합적으로“PLA”로 칭해지는 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락타이드, 폴리-D-락타이드 및 폴리-D, L-락타이드와 같은 락트산 단위를 포함하는 단일중합체를 포함하는 폴리에스테르일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 예시적인 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리히드록시산; PEG 공중합체 및 락타이드와 글리콜라이드의 공중합체(예를 들어, PLA-PEG 공중합체, PGA-PEG 공중합체, PLGA-PEG 공중합체, 및 이의 유도체)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리안하이드라이드, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(오르토 에스테르)-PEG 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 공중합체, 폴리리신, 폴리리신-PEG 공중합체, 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌이민)-PEG 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 및 이의 유도체를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 PLGA일 수 있다. PLGA는 락트산과 글리콜산의 생체적합성 및 생분해성 공중합체이며, PLGA의 다양한 형태는 락트산:글리콜산의 비율로 특징지워진다. 락트산은 L-락트산, D-락트산, 또는 D,L-락트산일 수 있다. PLGA의 분해속도는 락트산:글리콜산 비율을 변경함으로써 조정할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 따라서 사용되는 PLGA는 대략 85:15, 대략 75:25, 대략 60:40, 대략 50:50, 대략 40:60, 대략 25:75, 또는 대략 15:85의 락트산:글리콜산의 비율로 특징지워진다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 하나 이상의 아크릴성 폴리머일 수 있다. 임의의 구현예에서, 아크릴성 폴리머는, 예를 들어 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 안하이드라이드), 메틸 메타크릴레이트, 폴리 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 폴리시아노아크릴레이트, 및 전술한 중합체의 하나 이상을 포함하는 조합을 포함한다. 아크릴성 중합체는 4급 암모늄기를 저함량 포함하는 아크릴릭 및 메타크릴산 에스테르의 완전히 중합된 공중합체를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 양이온성 중합체일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 중합체는 핵산(예를 들어, DNA, RNA 또는 이의 유도체)의 음으로 하전된 가닥을 축합 및/또는 보호할 수 있다. 폴리(리신)(Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; 및 Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), 폴리(에틸렌 이민)(PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), 및 폴리(아미도아민) 덴드리머(Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; 및 Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372)와 같은 아민 함유 중합체는 생리적 pH에서 양으로 하전되고, 핵산과 이온쌍을 형성하며, 다양한 세포주의 트렌스펙션을 매개한다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 양이온성 측쇄를 포함한 생분해성 폴리에스테르일 수 있다(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; 및 Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). 이러한 폴리에스테르의 예는 폴리(L-락타이드-코-L리신)(Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), 폴리(세린 에스테르)(Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633), 및 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633)를 포함한다.
이러한 중합체와 다른 중합체의 특성 및 이를 제조하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져있다(예를 들어, 미국 특허 제6,123,727호; 제5,804,178호; 제5,770,417호; 제5,736,372호; 제5,716,404호; 제6,095,148호; 제5,837,752호; 제5,902,599호; 제5,696,175호; 제5,514,378호; 제5,512,600호; 제5,399,665호; 제5,019,379호; 제5,010,167호; 제4,806,621호; 제4,638,045호; 및 제4,946,929호; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; 및 Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181 참조). 더욱 일반적으로, 임의의 적합한 중합체 합성의 다양한 방법이 Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; 및 미국 특허 제6,506,577호, 제6,632,922호, 제6,686,446호 및 제6,818,732호에 기재되어 있다.
몇몇 구현예에서, 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 중합체는 덴드리머일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 중합체는 실질적으로 서로 교차결합될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 중합체는 실질적으로 전혀 교차결합되지 않을 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 따라서 중합체는 교차결합 단계없이 사용될 수 있다. 본 발명의 합성 나노담체가 임의의 전술한 중합체 및 다른 중합체의 블록 공중합체, 그래프트 공중합체, 블렌드, 혼합물 및 또는 부가생성물을 포함할 수 있음이 추가로 이해되어야 한다. 이 기술분야의 당업자는 본원에 열거된 중합체는 예시적인 것으로, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 중합체의 목록을 다 포함한 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 중합성 성분을 포함하지 않을 수 있다. 몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자 등을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 비중합성 합성 나노담체는 금속 원자(예를 들어, 금 원자)의 집합체(aggregate)와 같은 비중합성 성분의 집합체이다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 양친매성 실체를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 양친매성 실체는 증가된 안정성, 개선된 균일성, 또는 증가된 점도로 합성 나노담체의 생산을 촉진할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 양친매성 실체는 지질 막(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)의 내부 표면과 회합할 수 있다. 본 발명에 따른 합성 나노담체를 만드는데 사용하기에 적합한 많은 양친매성 실체가 이 기술분야에 알려져 있다. 그러한 양친매성 실체는, 그 제한되지 않는 예로 포스포글리세라이드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC); 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄(DOTMA); 디올레오일 포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤(DPPG); 헥산데칸올; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 지방산 알코올; 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 팔미트산 또는 올레산과 같은 표면 활성 지방산; 지방산; 지방산 모노글리세라이드; 지방산 디글리세라이드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올리에이트(Span？85) 글리코콜레이트(glycocholate); 소르비탄 모노라우레이트(Span？20); 폴리소르베이트 20(Tween？20); 폴리소르베이트 60(Tween？60); 폴리소르베이트 65(Tween？65); 폴리소르베이트 80(Tween？80); 폴리소르베이트 85(Tween？85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 설팩틴; 폴록사머; 소르비탄 트리올리에이트와 같은 소르비탄 지방산 에스테르; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고미엘린(sphingomyelin); 포스파티딜에탄올아민(세팔린(cephalin)); 카르디오리핀(cardiolipin); 포스파티드산; 세레브로사이드(cerebroside); 디세틸포스페이트(dicetylphosphate); 디팔미토일 포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실-아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리시놀리에이트(glycerol ricinoleate); 헥사데실 스테아레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸옥사폴(tyloxapol); 폴리(에틸렌 글리콜)5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌글리콜)400-모노스테아레이트; 포스포리피드; 높은 계면활성제 특성을 가진 합성 및/또는 천연 세제; 디옥시콜레이트(deoxycholate); 시클로덱스트린(cyclodextrin); 카오트로픽 염(chaotropic salt); 이온쌍형성제(ion pairing agent); 및 이의 조합을 포함한다. 양친매성 실체 성분은 다른 양친매성 실체의 혼합물일 수 있다. 이 기술분야의 당업자는 이것이 예시적이며, 계면활성제 활성을 갖는 물질의 목록을 다 포함한 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 임의의 양친매성 실체가 본 발명에 따라서 사용된 합성 나노담체의 생성에 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 천연 또는 합성일 수 있다. 탄수화물은 유도화된 천연 탄수화물일 수 있다. 일정 구현예에서, 탄수화물은 모노사카라이드 또는 디사카라이드를 포함하며, 그 제한되지 않는 예로 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 셀비오스(cellbiose), 만노스, 크실로오스, 아라비노스, 글루코론산, 갈락토론산(galactoronic acid), 만누론산, 글로코사민, 갈라토사민 및 뉴라믹산(neuramic acid)을 포함한다. 일정 구현예에서, 탄수화물은 폴리사카라이드이며, 그 제한되지 않는 예로 풀루란, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시셀룰로오스(HC), 메틸셀룰로오스(MC), 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 전분, 히드록시에틸 전분, 카라기난, 글리콘, 아밀로스, 키토산, N,O-카르복실 메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 전분, 키틴, 헤파린, 곤약(konjac), 글루코만난, 푸스툴란(pustulan), 헤파린, 히알루론산, 커드란(curdlan) 및 크산탄을 포함한다. 일정 구현예에서, 탄수화물은 당 알코올이며, 그 제한되지 않는 예로 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 및 락티톨을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 중합성 매트릭스, 니코틴을 포함한 면역특징 표면, 및 R848을 포함하는 Th1 편향 면역자극제를 포함하며, 여기에서 R848은 합성 나노담체 내에 캡슐화되는 방식으로 합성 나노담체에 결합된다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체의 투여에 적합한 투약 형태 내에 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 결합된, 상기에서 언급한 합성 나노담체를 포함한다. 상기 구현예에서, 합성 나노담체는 회전 타원체의 형태이며, 최대 크기, 최소 크기, 및 직경 모두 평균 250nm이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 중합성 매트릭스, 흡착에 의해 합성 나노담체의 표면에 결합된 항CD11c 항체를 포함하는 표적화 모이어티, R848을 포함하는 Th1 편향 면역자극제를 포함하며, 여기에서 R848은 합성 나노담체 내에 캡슐화되는 방식으로 합성 나노담체에 결합된다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체의 투여에 적합한 투약 형태 내에 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 결합된, 상기에서 언급한 합성 나노담체를 포함한다. 상기 구현예에서, 합성 나노담체는 원통의 형태이며, 최대 크기는 300nm이고 최소 크기는 150nm이다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 본 발명의 합성 나노담체를 포함한다. 조성물은 종래의 약학 제조 및 합성 기술을 사용하여 유용한 투약 형태로 만들어질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 방부제와 함께 주입을 위해 무균 식염수에 현탁되어 있다.
D. 본 발명의 면역나노치료법의 제조 및 사용 방법
합성 나노담체는 이 기술분야에 알려진 광범위하게 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노담체는 나노침전(nanoprecipitation), 유체성 채널(fluidic channel)을 사용한 플로우 포커싱(flow focusing), 스프레이 건조(spray drying), 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발(single and double emulsion solvent evaporation), 용매추출(solvent extraction), 상 분리(phase separation), 밀링(milling), 마이크로에멀젼 절차, 미세제작(microfabrication), 나노제작(nanofabrication), 희생층(sacrificial layer), 단순 및 복잡 코아세르베이션(simple and complex coacervation), 및 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 다른 방법과 같은 방법으로 형성할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로는, 단분산성 반도체(monodisperse semiconductor), 전도성, 자성, 유기성 및 다른 나노물질의 수성 및 유기 용매 합성이 기재되어 있다(Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; 및 Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). 추가적인 방법이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Doubrow, Ed., “Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,” CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; and Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755, 및 또한 미국 특허 제5578325호 및 제6007845호 참조).
일정 구현예에서, 합성 나노담체는 나노침전 공정 또는 스프레이 건조로 합성된다. 합성 나노담체를 제조하는데 사용된 조건은 원하는 크기 또는 특징의 입자를 생성도록 변경될 수 있다(예를 들어, 소수성, 친수성, 외부 모폴로지, “끈적임(stickiness)”, 형태 등). 사용될 합성 나노담체를 제조하는 방법과 조건(예를 들어, 용매, 온도, 농도, 공기 흐름 속도 등)은 합성 나노담체 및/또는 중합체 매트릭스의 조성물에 결합될 물질에 따라 좌우된다.
상기한 임의의 방법으로 제조된 입자가 원하는 범위 밖의 크기 범위를 가진다면, 입자는 예를 들어 체를 사용하여 크기 조정을 할 수 있다.
결합은 다양한 다른 방식으로 달성할 수 있으며, 공유 또는 비공유일 수 있다. 그러한 결합은 본 발명의 합성 나노담체의 표면 또는 내에 배열될 수 있다. 본 발명의 나노담체의 요소(면역특징 표면을 구성하는 모이어티, 표적화 모이어티, 중합성 매트릭스 등)는 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합에 의해 서로 직접적으로 결합되거나, 하나 이상의 링커를 통해 결합될 수 있다. 합성 나노담체를 기능화하는 부가적인 방법은 Saltzman et al.의 공개된 미국 특허출원 제2006/0002852호, DeSimone et al.의 공개된 미국 특허출원 제2009/0028910호, 또는 Murthy et al.의 공개된 국제 특허출원 WO 제2008/127532호 A1로부터 변형될 수 있다.
본 발명에 따라서 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 아미드 결합, 에스테르 결합, 디설파이드 결합 등을 형성하기 위해 링커가 사용될 수 있다. 링커는 탄소 원자 또는 헤테로원자(예를 들어, 질소, 산소, 황 등)를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 링커는 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 몇몇 구현예에서, 링커는 폴리알킬 링커이다. 임의의 구현예에서, 링커는 폴리에테르 링커이다. 임의의 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 링커이다. 일정구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커이다.
몇몇 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 몇몇 예를 들자면, 절단가능한 링커는 프로테아제로 절단할 수 있는 펩티드 링커, 뉴클레아즈 민감성 핵산 링커(nuclease sensitive nucleic acid linker), 리파아제 민감성 지질 링커(lipase sensitive lipid linker), 글리코시다아제 민감성 탄수화물 링커(glycosidase sensitive carbohydrate linker), pH 민감성 링커(pH sensitive linker), 히폭시아 민감성 링커(hypoxia sensitive linker), 광으로 절단가능한(photo-cleavable) 링커, 열 민감성 링커(heat-labile linker), 효소로 절단가능한(enzyme cleavable linker)(예를 들어, 에스테라제로 절단가능한 링커(esterase cleavable linker)), 초음파 민감성 링커, x선으로 절단가능한 링커(x-ray cleavable linker)등을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커가 아니다.
링커 또는 합성 나노담체의 다른 요소를 합성 나노담체에 결합하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일반적 전략은 수동적 흡착(예를 들어, 정전기적 상호작용을 경유하여), 다가 킬레이션(multivalent chelation), 특이적 결합쌍의 멤버 간의 고 친화력 비공유 결합(high affinity non-covalent binding between members of a specific binding pair), 공유결합 형성 등(Gao et al., 2005, Curr. Op. Biotechnol., 16:63)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 클릭 케미스트리(Click chemistry)가 물질을 합성 나노담체와 회합하는데 사용될 수 있다.
비공유 특이 결합 상호작용이 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자 또는 생체분자는 비오틴으로 기능화할 수 있고 다른 것은 스트렙타비딘으로 기능화할 수 있다. 이 두 모이어티는 특히 서로 비공유로 고친화력으로 결합하여, 입자 및 생체분자를 회합시킨다. 다른 특이 결합쌍을 유사하게 사용할 수 있다. 대안적으로, 히스티딘 태깅된 생체분자가 니켈-니트로트리아세트산(Ni-NTA)에 컨쥬게이트된 입자에 회합될 수 있다.
결합에 대한 추가적인 일반 정보는 American Chemical Society, Columbus OH, PO Box 3337, Columbus, OH, 43210가 출판한 journal Bioconjugate Chemistry; “Cross-Linking,” Pierce Chemical Technical Library(Pierce 웹사이트에서 입수가능하고, 본래 1994-95 Pierce Catalog에 공개되었으며, 그 안에 인용된 참조문헌); Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991; 및 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, 1996을 참조한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 합성 나노담체는 비공유 상호작용을 통해 면역특징 표면, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 다른 요소와 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 비공유 상호작용은 그 제한되지 않는 예로 전하 상호작용(charge interaction), 친화력 상호작용(affinity interaction), 금속 배위(metal coordination), 물리적 흡착(physical adsorption), 호스트게스트 상호작용(hostguest interaction), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction), TT 스태킹 상호작용(TT stacking interaction), 수소 결합 상호작용(hydrogen bonding interaction), 반데르발스 상호작용(van der Waals interaction), 자기적 상호작용(magnetic interaction), 정전기적 상호작용(electrostatic interaction), 쌍극자-쌍극자 상호작용(dipole-dipole interaction), 및/또는 이의 조합을 포함한다. 이러한 결합은 본 발명의 합성 나노담체 표면 또는 내부에 배열될 수 있다.
본 발명의 조성물이 임의의 적당한 방식으로 제조될 수 있고, 본 발명이 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 조성물로 제한하고자 함이 아님이 이해되어야 한다. 회합된 특정 모이어티의 특성에 주목하여 적절한 방법의 선택이 필요할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 무균 조건 하에서 제조된다. 이는 결과 조성물이 무균이며 비감염성임을 보증할 수 있어서, 비무균 조성물과 비교시 안전이 개선될 수 있다. 이것은 특히 합성 나노담체를 투여받는 대상체가 면역 결함이 있고, 감염을 앓고 있으며, 및/또는 감염에 민감할 때 유용한 안전한 수단을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 동결건조되어 활성을 잃지 않으면서 장기간에 걸친 기간 동안의 제형 전략에 따라서 현탁액 또는 동결건조 파우더로써 보관할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 투여 경로로 투여할 수 있으며, 그 제한되지 않는 예로 비경구(피하의, 근육 내의, 정맥 주사의, 또는 피내와 같은); 경구; 경비(transnasal), 경점막(transmucosal), 직장(rectal); 눈(ophthalmic), 또는 경피를 포함한다.
본 발명의 조성물을 사용하여 치료가능한 징후는 그 제한되지 않는 예로 사이토카인 방출의 Th2 양상으로부터 사이토카인 방출의 Th1 양상으로 편향하는 것이 바람직한 징후이다. 그러한 징후는 아토피성 병태 (비제한적인 예로 알레르기, 알레르기성 천식, 또는 아토피성 피부염); 천식; 만성 폐쇄성 폐질환(COPD, 예를 들어, 폐기종 또는 만성 기관지염); 및 만성 레슈마니아증, 칸디다증 또는 주혈흡충병과 같은 만성 감염원으로 인한 만성 감염과 말라리아, 톡소포자충, 마이코박테리아, HIV, HBV, HCV EBV 또는 CMV, 또는 상기 중 임의의 하나, 또는 상기 중 임의의 하위세트로 야기된 감염을포함한다.
본 발명의 조성물을 이용하여 치료가능한 다른 징후는 그 제한되지 않는 예로 대상체의 Th1 반응이 차선 및/또는 비효과적인 징후를 포함한다. 본 발명의 사용은 대상체의 Th1 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 그러한 징후는 다양한 암 및 유아, 노인, 암 환자, 면역억제 약물 또는 방사선을 투여받고 있는 개인, 혈액투석 환자 및 유전적 또는 특발성 면역기능이상이 있는 사람과 같이 손상되거나 차선의 면역성을 가진 집단을 포함한다.
본 발명의 조성물이 종래의 면역 치료와는 다른 방식으로 동작하는 것이 본 발명의 한 측면이다. 종래의 면역치료에서는 항원 및 면역자극제가 공동투여된다.
대조적으로, 본 발명의 구현예에서, 후천성면역 반응이 요구되는 항원은 본 발명의 조성물에 포함되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 그러한 항원은 본 발명의 면역특징 표면으로부터 배제되고, 그 결과 면역특징 표면은 병태의 치료와 관련된 항원을 포함하지 않는다.
게다가, 본 발명의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 나노담체에 결합되어 있거나 또는 나노담체에 결합되어 있지 않은, 병태의 치료와 관련된 항원의 투여를 추가로 포함하지 않는다.
일정 구현예에서, Th1 편향 반응이 요구되는 항원은 조성물이 투여되는 때와 다른 때에 투여되며, 항원의 투여는 수동적 투여 또는 능동적 투여를 포함한다.
각각의 경우에, 하나 이상의 항원의 투여와 시기적으로 분리된 하나 이상의 면역자극제의 투여가 하나 이상의 항원의 투여에 대한 Th1 편향 반응을 제공하는 것은 기대되지 않는다.
E. 실시예
실시예 1: PLA - R848 컨쥬게이트
교반 막대기(stir bar)와 콘덴서(condenser)가 구비된 두 목의 둥근바닥 플라스크에 이미다조퀴놀린 레시퀴모드(imidazoquinoline resiquimod)(R-848, 100mg, 3.18 X 10-4moles), D/L 락타이드(5.6gm, 3.89 X 10-2moles) 및 무수 소듐 설페이트(4.0gm)를 첨가하였다. 플라스크와 내용물은 진공에서 50℃에서 8시간 동안 건조하였다. 그 후 플라스크를 아르곤으로 플러싱(flush)하고, 톨루엔(100㎖)을 첨가하였다. 반응물을 모든 락타이드가 용해될 때까지 120℃로 설정된 오일 중탕에서 교반하였고, 그 후 피펫으로 주석 에틸헥사노에이트(75mg, 60㎕)를 첨가하였다. 그 후 아르곤 하에서 16시간 동안 가열을 지속하였다. 냉각 후, 물(20㎖)을 첨가하였고 30분 동안 교반을 지속하였다. 반응물을 추가 톨루엔(200㎖)으로 희석시키고, 그 후 물(200㎖)로 세척하였다. 그 후 차례로 톨루엔 용액은 5% 농도의 염산(200㎖)을 포함하는 10%의 소듐 클로라이드 용액으로 세척하였고, 그 후 포화 소듐 비카보네이트(200㎖)로 세척하였다. TLC(실리카, 메틸렌 클로라이드 내 10% 메탄올)는 용액이 자유 R-848을 함유하지 않음을 나타내었다. 용액을 마그네슘 설페이트 상에서 건조하고, 여과하며, 진공 하에 증발하여 3.59그램의 폴리락트산-R-848 컨쥬게이트를 제공하였다. 중합체의 일부를 염기에서 가수분해하고 R-848 함량이 HPLC로 조사되었다. R-848 농도 대 HPLC 반응의 표준 커브와의 비교로, 중합체는 중합체 그램 당 4.51mg의 R-848을 함유하는 것으로 측정되었다. GPC에 의해 측정된 중합체의 분자량은 약 19,000이었다.
실시예 2: 니코틴- PEG - PLA 컨쥬게이트
3-니코틴-PEG-PLA 중합체를 다음과 같이 합성하였다:
우선, JenKem？의 분자량 3.5KD(0.20gm, 5.7 X 10-5moles)을 가진 모노아미노 폴리(에틸렌 글리콜)과 과량의 4-카르복시코티닌(carboxycotinine)(0.126gm, 5.7 X 10-4moles)을 디메틸포름아미드(5.0㎖)에 용해시켰다. 용액을 교반하고 디시클로헥실카르보디이미드(0.124gm, 6.0 X 10-4moles)를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 물(0.10㎖)을 첨가하였고 교반을 추가 15분 동안 더 지속하였다. 디시클로헥실 우레아의 침전물을 여과로 제거하였고, 여과물은 진공 하에 증발시켰다. 잔여물을 메틸렌 클로라이드(4.0㎖)에 용해하고, 이 용액을 디에틸에테르(100㎖)에 첨가하였다. 이 용액을 냉장고에서 2 시간 동안 냉각하였고, 침전된 중합체를 여과로 분리하였다. 디에틸에테르로 세척한 후, 고체의 백색 중합체를 고 진공 하에서 건조하였다. 수득량은 0.188gm이었다. 이 중합체는 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
코티닌/PEG 중합체(0.20gm, 5.7 X 10-5moles)를 질소 하에서 건조 테트라하이드로퓨란(10㎖)에 용해시켰고, 용액은 테트라하이드로퓨란(2.0M 1.43㎖, 2.85 X 10-3moles)의 리튬 알루미늄 하이드라이드 용액을 첨가하면서 교반하였다. 리튬 알루미늄 하이드라이드의 첨가로 중합체가 젤라틴 덩어리로 침전되었다. 질소의 느린 기류 하에서 반응물을 80℃까지 가열하였고, 테트라하이드로퓨란을 증발시켰다. 잔여물은 그 후 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 물(0.5㎖)을 조심스럽게 첨가하였다. 수소 발생이 멈추면, 메틸렌 클로라이드(50㎖) 내 10% 메탄올을 첨가하였고, 중합체가 용해될 때까지 반응 혼합물을 교반하였다. 이 혼합물을 Celite？ 브랜드 규조토(EMD Inc.에서 Celite？ 545, 파트 # CX0574-3로 입수가능)를 통해서 여과하였고, 여과물은 진공 하에 건조될 때까지 증발하였다. 잔여물을 메틸렌 클로라이드(4.0㎖)에 용해시키고, 이 용액은 디에틸에테르(100㎖)에 천천히 첨가하였다. 백색의 유모성 고체로서 중합체를 분리하였고, 원심기로 분리하였다. 디에틸에테르로 세척한 후, 고체는 진공 하에 건조하였다. 수득량은 0.129gm이었다.
다음으로, 교반 막대기와 리플럭스 콘덴서(reflux condenser)가 구비된 100㎖의 둥근 바닥 플라스크를 PEG/니코틴 중합체(0.081gm, 2.2 X 10-5moles), D/L 락타이드(0.410gm, 2.85 X 10-3moles) 및 무수 소듐 설페이트(0.380gm)로 채웠다. 이것을 진공 하에 55℃에서 8시간 동안 건조시켰다. 플라스크를 냉각하였고, 아르곤으로 플러싱하였고, 그 후 건조 톨루엔(10㎖)을 첨가하였다. 플라스크를 120℃로 설정된 기름 중탕 안에 넣고, 락타이드가 용해되면, 주석 에틸헥사노에이트(5.5mg, 1.36 X 10- 5moles)를 첨가하였다. 120℃에서 16시간 동안 반응이 진행되도록 두었다. 실온까지 냉각시킨 후, 물(15㎖)을 첨가하였고, 30분 동안 교반을 지속하였다. 메틸렌 클로라이드(200㎖)를 첨가하였고, 분액깔때기 안에서 교반한 후, 상들이 안정되도록 두었다. 메틸렌 클로라이드 층을 분리하였고, 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조하였다. 건조제를 없애기 위하여 여과한 후, 여과물을 진공 하에 증발하어 무색 거품으로서 중합체를 제공하였다. 중합체를 테트라하이드로퓨란(10㎖)에 용해시키고, 이 용액을 교반하며 천천히 물(150㎖)에 첨가하였다. 침전된 중합체를 원심기로 분리하였고, 고체를 메틸렌 클로라이드(10㎖)에 용해하였다. 메틸렌 클로라이드를 진공 하에 제거하였고, 잔여물은 진공 하에 건조하였다. 3-니코틴-PEG-PLA 중합체 수득량은 0.38gm이었다.
실시예 3: 예언적 나노담체 제형( Prophetic nanocarrier formulation ) - 알레르기
Gerster et al.의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(aka R848)를 합성한다. PLA-PEG-니코틴 컨쥬게이트는 실시예 2에 따라서 제조한다. PLA는 D,L-락타이드(MW = 대략 15KD~18KD)를 사용한 고리 개환 중합에 의해 제조한다. PLA 구조는 NMR로 확인하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11KD~31KD, 85% 가수분해됨)을 VWR scientific으로부터 구매하였다. 오브알부민 펩티드 323 내지339는 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Part # 4064565)로부터 획득하였다. 이것들은 하기 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 내 레시퀴모드 @ 7.5mg/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 내 PLA-PEG-니코틴 @ 100mg/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 내 PLA 100mg/㎖
4. 물 내 오브알부민 펩티드 323~339 @ 10mg/㎖
5. 물 내 폴리비닐 알코올 @ 50mg/㎖.
용액 #1(0.4㎖), 용액 #2(0.4㎖), 용액 #3(0.4㎖) 및 용액 #4(0.1㎖)를 작은 바이얼(vial) 안에서 혼합하고, 혼합물은 Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 50% 진폭에서 초음파를 이용하여 분해하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)를 첨가하였고, Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 35% 진폭에서의 초음파 분해로 제 2 에멀젼을 형성하였다. 이것은 물(30㎖)을 함유한 비이커에 첨가하고 이 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노담체를 형성하였다. 나노담체 분산물의 일부(1.0㎖)를 물(14㎖)로 희석시키고, 이것을 막 컷오프가 100KD인 Amicon의 울트라 원심분리 장치(Ultra centrifugal filtration device) 안에서 원심분리로 농축하였다. 부피가 약 250㎕일 때, 물(15㎖)을 첨가하였고, 입자들은 다시 Amicon 장치를 사용하여 약 250㎕까지 농축하였다. 포스페이트 완충 식염수(pH = 7.5, 15㎖)로 2차 세척을 동일한 방식으로 행하였고, 최종 농축물은 포스페이트 완충 식염수로 총 부피 1.0㎖로 희석하였다. 이것은 농도가 약 2.7mg/㎖인 최종 나노담체 분산액을 제공한다.
그 후 합성 나노담체는 대상체에 근육 내 주입으로 투여하였다. 대상체로 하여금 그 자신을 두드러기쑥 꽃가루와 같은 환경 알레르겐에 노출시키도록 지시하였다. 환경 알레르겐에 노출시킨 후, 대상체는 환경 알레르겐의 다른 노출로 투여되었다. 환경 알레르겐 투여에 대한 Th1 편향 반응의 임의의 발생이 주목된다.
실시예 4: 예언적 나노담체 제형( Prophetic nanocarrier formulation ) - 알레르기
Gerster et al.의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(aka R848)를 합성한다. 카르복실화 폴리 락트산은 D,L-락타이드를 사용한 고리 개환 중합으로 제조하여 PLA-COOH(타겟 MW = 15~18KD)를 생성한다. 구조는 NMR로 확인하였다. PLA-PEG-메톡시 중합체는 D,L-락타이드(최종 중합체 MW 타겟 = 18~20KD)의 고리 개환 중합을 개시하는데 사용되는 메톡시-PEG(폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르, Aldrich Chemical의 아이템 20509, 대략 PEG의 MW = 2KD)를 사용하여 제조한다. 구조는 NMR로 확인하였다. 오브알부민 펩티드 323~339를 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. 파트 # 4064565)로부터 획득하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11KD~31KD, 85% 가수분해됨)은 VWR scientific로부터 구매하였다. 이것들은 하기 용액들을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 내 레시퀴모드 @ 7.5mg/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 내 PLA-PEG-메톡시 @ 100mg/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 내 PLA-COOH @ 100mg/㎖
4. 물 내 오브알부민 펩티드 323~339 @ 10mg/㎖
5. 물 내 폴리비닐 알코올 @ 50mg/㎖.
용액 #1(0.4㎖), 용액 #2(0.4㎖), 용액 #3(0.4㎖) 및 용액 #4(0.1㎖)를 작은 바이얼(vial) 안에서 혼합하고, 혼합물은 Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 50% 진폭에서 초음파를 이용하여 분해하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)을 첨가하였고, Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 35% 진폭에서의 초음파 분해로 제2 에멀젼을 형성하였다. 물(30㎖)을 함유한 비이커에 제2 에멀젼을 첨가하고 이 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노담체를 형성하였다. 나노담체 분산물의 일부(1.0㎖)를 물(14㎖)로 희석시키고, 이것을 막 컷오프가 100KD인 Amicon의 울트라 원심분리 장치(Ultra centrifugal filtration device) 안에서 원심분리로 농축하였다. 부피가 약 250㎕일 때, 물(15㎖)을 첨가하였고, 입자들은 다시 Amicon 장치를 사용하여 약 250㎕까지 농축하였다. 포스페이트 완충 식염수(pH = 6.5, 15㎖)로 2차 세척을 동일한 방식으로 행하였고, 최종 농축물은 포스페이트 완충 식염수(pH = 6.5)로 총 부피 5.0㎖로 희석하였다. 이것은 농도로 약 0.6mg/㎖인 최종 나노담체 분산액을 제공한다. 나노담체 분산액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, 200mg) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS, 70mg)를 첨가하였고, 이 혼합물은 실온에서 1/2 시간 동안 배양하였다. 나노담체는 PBS와 함께 원심분리로 세 번 세척하였다. 마지막 세척 후, 입자들은 PBS로 부피 1.0㎖로 희석하어 대략 3.0mg/㎖의 농도를 가진 NHS-활성화 나노담체의 현탁액을 제공한다. 이 현탁액에 안티-CD11c 항체(50㎕ @ 5μg/㎖, Miltenyi Biotec에서 입수가능한 안티-CD11c 항체 클론 MJ4-27G12)를 첨가한다. 현탁액은 냉장고에서 밤새 배양하였다. 결과 치환된 나노담체는 PBS 안에서 원심분리로 세 번 세척하였다. 마지막 세척 후, 입자들은 PBS로 부피 1.0㎖로 희석하여 대략2.7mg/㎖의 농도를 가진 안티-CD169 치환된 나노담체의 현탁액을 제공한다.
그 후 합성 나노담체는 대상체에 근육 내 주입으로 투여하였다. 대상으로 하여금 그 자신을 두드러기쑥 꽃가루와 같은 환경 알레르겐에 노출시키도록 지시하였다. 환경 알레르겐에 노출시킨 후, 대상체는 환경 알레르겐의 다른 노출로 투여되었다. 환경 알레르겐 투여에 대한 Th1 편향 반응의 임의의 발생이 주목된다.
실시예 5: 예언적 나노담체 제형( Prophetic nanocarrier formulation ) - 알레르기
미국 공개특허출원 제2009/0028910호의 변형된 교시에 따라서 합성 사다리꼴 나노담체는 다음과 같이 제조한다:
1-히드록시시클로헥실 페닐 케톤을 함유하는 PFPE-디메타크릴레이트(PFPE-DMA)를 200nm 사다리꼴 형태로 패턴화된 실리콘 기판에 부어서 패턴화된 퍼플루오로폴리에테르(PFPE) 몰드를 생성한다. 폴리(디메틸실록산) 몰드를 액체 PFPE-DMA를 원하는 영역으로 한정하기 위해 사용한다. 그 후 질소 퍼지(purge) 하에 10분 동안 UV 광(365nm)을 기구에 조사하였다. 완전히 경화된 PFPE-DMA 몰드는 실리콘 마스터로부터 방출한다. 별개로, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 디아크릴레이트(n=9)를 1 중량%의 광개시제, 1-히드록시시클로헥실 페닐 케톤과 블렌드한다. 레시퀴모드(R848, Gerster et al.의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 합성함)를 나노담체의 총 중합체 중량에 기초하여 1중량%의 양으로 첨가하고, 이 PEG-디아크릴레이트 모노머 용액에 첨가하고, 혼합물을 철저하게 혼합한다. 건조기 안에서 기상증착법으로 "피란하(piranha)" 용액(농축 황산:30% 과산화수소(aq)가 1:1인 용액)으로 세척된 실리콘 웨이퍼를 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란으로 20분 동안 처리함으로써 평평하고, 균일하며, 젖지 않은 표면을 생성하였다. 이후, 50㎕의 PEG 디아크릴레이트/R848/톡소이드 용액을 그 후 처리된 실리콘 웨이퍼 위에 두고, 패턴화된 PPE 몰드를 그 위에 두었다. 그 후 기판은 몰딩 기구 안에 두고 과잉의 PEG-디아크릴레이트/R848/톡소이드 용액을 배출시키기 위해서 작은 압력을 가한다. 그 후 질소 퍼지(purge) 하에서 10분 동안 UV 광(365nm)을 전체 기구에 조사하였다. 그 후 합성 나노담체를 몰드로부터 제거하고, 아세톤 내 5중량%의 카르보닐이미다졸의 용액이 있는 플라스크에 첨가하였다. 합성 나노담체는 24시간 동안 서서히 교반하였고, 그 후 합성 나노담체를 아세톤 용액으로부터 분리하고 실온에서 물에 현탁하였다. 이 현탁액에 과량의 항CD11c 항체(클론 MJ4-27G12, Miltenyi Biotec에서 입수가능)를 첨가하였고, 현탁액은 37℃까지 가열하였고 24시간 동안 서서히 교반하였다. 표지된 합성 나노담체는 그 후 현탁액으로부터 분리하였다.
그 후 합성 나노담체는 대상체에 근육 내 주입으로 투여하였다. 대상으로 하여금 그 자신을 두드러기쑥 꽃가루와 같은 환경 알레르겐에 노출시키도록 지시하였다. 환경 알레르겐에 노출시킨 후, 대상체는 환경 알레르겐의 다른 노출로 투여되었다. 환경 알레르겐 투여에 대한 Th1 편향 반응의 임의의 발생이 주목된다.
실시예 6: 예언적 나노담체 제형( Prophetic nanocarrier formulation) -- 암
Gerster et al.의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(aka R848)를 합성한다. PLA는 D,L-락타이드(MW = 대략 15KD~18KD)을 사용한 고리 개환 중합에 의해 제조한다. 구조는 NMR로 확인한다. PLA-PEG-메톡시 중합체는 D,L-락타이드(최종 중합체 MW 타겟 = 대략 18KD~20KD)의 고리 개환 중합 반응을 개시하는데 사용되는 메톡시-PEG(폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르, Aldrich Chemical의 아이템20509, 대략 PEG의 MW = 2KD)를 사용하여 제조한다. 구조는 NMR로 확인하였다. 오브알부민 펩티드 323~339가 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. 파트 # 4064565)로부터 획득하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11KD~31KD, 85% 가수분해됨)은 VWR scientific로부터 구매하였다. 이것들은 하기 용액들을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 내 레시퀴모드 @ 7.5mg/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 내 PLA-PEG-메톡시 @ 100mg/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 내 PLA @ 100mg/㎖
4. 물 내 오브알부민 펩티드 323 ~ 339 @ 10mg/㎖
5. 물 내 폴리비닐 알코올 @ 50mg/㎖.
용액 #1(0.4㎖), 용액 #2(0.4㎖), 용액 #3(0.4㎖) 및 용액 #4(0.1㎖)을 작은 바이얼(vial) 안에서 혼합하고, 혼합물은 Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 50% 진폭에서 초음파를 이용하여 분해하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)을 첨가하였고, Branson Digital Sonifier 250을 사용하여 40초 동안 35% 진폭에서의 초음파 분해로 제2 에멀젼을 형성하였다. 이것은 물(30㎖) 을 함유한 비이커에 첨가하고 이 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노담체를 형성하였다. 나노담체 분산물의 일부(1.0㎖)를 물(14㎖)로 희석시키고, 이것을 막 컷오프가 100KD인 Amicon의 울트라 원심분리 장치(Ultra centrifugal filtration device) 안에서 원심분리로 농축하였다. 부피가 약 250㎕일 때, 물(15㎖)을 첨가하였고, 입자들은 다시 Amicon 장치를 사용하여 약 250㎕까지 농축하였다. 포스페이트 완충 식염수(pH = 7.5, 15㎖)로 2차 세척을 동일한 방식으로 행하였고, 최종 농축물은 포스페이트 완충 식염수(pH = 7.5)로 총 부피 1.0㎖로 희석하였다. 이것은 농도로 약 2.7mg/㎖인 최종 나노담체 분산액을 제공한다.
그 후 합성 나노담체는 고형 종양이 있는 대상체에 근육 내 주입으로 투여하였다. 합성 나노담체의 주입 후 48시간에, 고형 종양을 붕괴시키기에 충분한 방사선에 대상체를 노출시켰다. 임의의 항종양 세포독성 T 세포의 생성이 주목된다.
실시예 7: 예언적 나노담체 제형( Prophetic nanocarrier formulation ) - 만성 레슈마니아증
미국 공개 특허출원 제20060002852호의 변형된 교시에 따라서 합성 나노담체는 다음과 같이 제조한다:
10mg/㎖의 아비딘을 2%의 디옥시콜레이트 완충제(deoxycholate buffer)를 함유하는 PBS 안의 10 배 과량의 NHS-팔미틱 애시드와 반응시킨다. 혼합물은 간략하게 초음파 처리하고 37℃에서 12시간 동안 서서히 혼합한다. 과량의 지방산과 가수분해 에스테르를 제거하기 위해서, 반응물은 0.15%의 디옥시콜레이트를 함유하는 PBS에 대하여 투석한다.
지방산 PLGA 입자의 제조를 위해서 변형된 이중 에멀젼 방법을 사용한다. 이 절차에서, 100㎕의 PBS 안에서 레시퀴모드(R848, Gerster et al.의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 합성함)를 나노담체 내 총 중합체 중량을 기준으로 1중량%의 양으로 첨가하고, 볼텍싱(vortexing) PLGA 용액(2㎖ MeCl2 내 100mg PLGA)에 한 방울씩 첨가한다. 이 혼합물은 그 후 얼음 위에서 세 차례 10초의 간격으로 초음파처리하였다. 이 때, 4㎖의 아비딘-팔미테이트/PVA 혼합물(2㎖의 5% PVA에 2㎖의 아비딘-팔미테이트)을 PLGA 용액에 천천히 첨가하였다. 그 후 이것은 10초 간격으로 세차례 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 물질은 교반하고 있는 100㎖의 0.3% PVA에 한 방울씩 첨가하였다. 이것을 상온에서 4시간 동안 격렬하게 교반시켜서 메틸렌 클로라이드를 증발시켰다. 결과 에멀젼은 그 후 15분 동안 12,000g 로 원심분리하여 정제하고, 그 후 탈이온수로 3회 세척하였다.
비오티닐화 항CD11c 항체를 다음과 같이 제조하였다. 비오틴-NHS는 사용 바로 전에 1mg/㎖로 DMSO에 용해하였다. 항CD11c 항체(클론 MJ4-27G12, Miltenyi Biotec 에서 입수가능)를 1/10 희석으로 용액에 첨가하였고 비오틴-NHS에 대하여 30분 동안 얼음에서 배양하거나 또는 실온에서 pH 7.5~8.5로 2시간 동안 배양하였다. PBS 또는 HEPES를 완충제로 사용할 수 있다. 반응은 트리스(Tris)로 퀀칭한다.
그 후 결과 합성 나노담체를 실온에서 물에 현탁시키고, 과량의 비오티닐화 항CD169 항체(50㎕ @ 5μg/㎖, 상술한 바와 같이 제조함)를 현탁액에 첨가하였다. 현탁액은 37℃까지 가열하였고 24시간 동안 서서히 교반하였다. 표지된 합성 나노담체는 그 후 현탁액으로부터 분리하였다.
그 후 합성 나노담체는 사이토카인 발현에 있어서 Th2 편향 양상으로 특징지워지는 만성 레슈마니아증을 앓고 있는 대상체에 근육 내 주입으로 투여하였다. 임의의 적절한 항체의 생성이 주목된다.
실시예 8: R848 을 가진 나노담체를 사용한 천식의 치료( Treatment of asthma using nanocarriers with R848 )
천식 반응을 Th2 표현형으로부터 Th1 표현형으로 변형하기 위해서 R848 함유 나노담체가 사용될 수 있는지를 결정하기 위해서 R848을 함유하는 합성 나노담체를 사용하였다. 0일과 14일에 마우스(BALB/c; 그룹당 5 마우스)를 복강 내로(i.p.) 200㎕ PBS 내의 20㎍의 오브알부민과 2mg의 Imject？ alum (Pierce, Rockford, IL)으로 오브알부민에 대해 사전감작하였다(presensitized)(그룹 3~9; 마우스의 실험 그룹과 나노담체 조성물을 함유한 각각의 치료의 설명을 위해서는 표 1과 2를 참조). 대조 마우스는 200㎕의 PBS(그룹 1) 또는 200㎕의 PBS 내의 2mg의 Imject？ alum(그룹 2)을 복강 내로 투여받았다. 27, 28, 및 29일에, 마우스는 PBS(치료에 대한 음성 대조군)(그룹 1~4), CpG(OD 1826, 100㎕ 내 30㎍ i.p.; 치료에 대한 양성 대조군)(그룹 5), R848을 가진 니코틴-나노담체(100㎕ 내 100㎍ i.p.)(그룹 6), R848을 가진 니코틴-나노담체(비강을 통해(i.n.) 60㎕ 내 100㎍(그룹 7), R848이 없는 니코틴-나노담체(100㎕ 내 100㎍ i.p.)(그룹 8), 또는 R848이 없는 니코틴-나노담체(60㎕ 내 100㎍ i.n.)(그룹 9)로 처리하였다. R848을 가진 니코틴-나노담체는 4.4%의 R848을 포함하였다. R848은 PLGA(Mw 4.1 kD)에 컨쥬케이트하였다. 나노담체 중합체 조성물은 실시예 1~3의 교시에 따라서 만들어지며, 25%의 PLA-PEG-니코틴과 75%의 PLA 중합체(Boehringer Ingelheim의 R202H 또는 Lakeshore Biomaterials의 100 DL 2A; 양 버전 모두 20kD의 Mw를 가지며 자유-카르복실산 말단을 가진다)를 포함하였다.
폐 백혈구 침윤(lung leukocyte infiltration)의 측정을 위해서, 마우스는 28, 29, 및 30일에 60㎕의 PBS 내 50㎍의 오브알부민으로 i.n. 투여하였다(그룹 2 및 4~9). 대조군 마우스(그룹 1과 3)는 60㎕의 PBS를 i.n. 투여받았다. 32일에, 마지막 오브알부민 투여 후 48시간에, 마우스는 안락사시키고 시료를 채취하였다. 사이토카인 분석을 위해서, 시료는 31일, 마지막 오브알부민 투여로부터 18시간에 시료를 채취하였다. 폐는 백혈구 백분율 산정 및 사이토카인 분석을 위한 사이토스핀용 기관지 폐포 세척액(BALF)을 수집하기 위해 3mM EDTA를 함유하는 1㎖의 PBS로 3회 세척하였다. BALF의 사이토스핀 슬라이드는 Diff-Quik(Dade Behring)으로 착색하였고, 백혈구 백분율 산정을 행하였다. 잔여의 BALF는 사이토카인 분석에 필요할 때까지 -20℃에 보관하였다. BALF 사이토카인(IL-12p40, IL-4, IL-13, 및 IL-5)은 제조업자(BD Biosciences 및 R & D Systems) 지시에 따라서 ELISA로 측정하였다.
천식의 유도 및/또는 치료를 위한 치료 그룹. 48 시간의 실험을 위해 니코틴-나노담체(R848은 없음)로 i.p. 처리되거나 또는 18 시간의 사이토카인 실험을 위해 R848(100㎕ 내 50㎍)로 처리된 그룹 8
그룹. #
(5마우스/그룹)		 감작 주입 경로 치료 투입 경로 시험물질 투여 경로
1 PBS(200㎕); i.p. PBS
i.n.		 PBS
i.n.
2 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. PBS
i.n.		 OVA
i.n.
3 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum (2mg); i.p. PBS
i.n.		 PBS
i.n.
4 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. PBS
i.n.		 OVA
i.n.
5 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. CpG (100㎕ 내 30 ㎍)
i.p.		 OVA
i.n.
6 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. Nic-NP
w/R848
i.p.		 OVA
i.n.
7 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. Nic-NP
w/R848
i.n.		 OVA
i.n.
8 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. Nic-NP
(R848 없음)
i.p. (48 시간 실험) 또는
R848 (100㎕ 내 50㎍)
i.p. (18 시간 실험)		 OVA
i.n.
9 OVA(20μg) + 200㎕ PBS 내 Alum(2mg); i.p. Nic-NP
(R848 없음)
i.n.		 OVA
i.n.
천식의 치료에 사용되는 나노담체의 조성
나노담체 로트 번호
(마우스 처리 그룹)		 S0864-66-3
(그룹 6 & 7)		 S0845-3-2
(그룹 8 & 9)
펩티드 없음 없음
TLR 작용제(R848) S0833-78A
R848(50%)		 없음
PLA-PEG-Nic S0835-33
(25%)		 S0835-04
(25%)
팽화 중합체 100 DL 2A
(25%)		 R2O2H
(75%)
결과: 마지막 오브알부민 투여 후 48시간에 BALF 내에 존재하는 호산구의 비례수를 결정하기 위해 백혈구 백분율 산정을 행하였다. 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스(그룹 4)는 대조군 마우스(그룹 1, 2, 및 3; 총 세포의 1% 미만의 호산구와 비교해볼 때 최종 투여 후 48시간에서 백혈구가 BALF 안에 엄청나게 유입되었다(총 세포의 68.4% ± 7.6%))(p < 0.0001; 도 1). 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 오브알부민이 투여되고 난 후 CpG i.p.로 처리하는 것(그룹 5)이 백혈구의 엄청난 감소를 가져왔다(29.2% ± 12.4%)(p < 0.0001; 도 1). 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 오브알부민이 투여되고 난 후 R848이 있는 나노담체로 i.p.(그룹 6) 또는 i.n.(그룹 7) 처리하는 것이 백혈구의 엄청난 감소를 가져왔다(각각 28.0% ± 15.2% 및 21.2% ± 7.3%)(p < 0.0001; 도 1). 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 R848이 없는 나노담체로 i.p.(그룹 8) 또는 i.n.(그룹 9)로 처리하는 것이 백혈구 유입에 영향을 주지 않았다(각각 67.3% ± 4.1% 및 52.5% ± 10.7%)(p > 0.05; 도 1).
최종 오브알부민 투여 후 18시간에 BALF 사이토카인 레벨을 측정하였다. 치료가 사이토카인 발현에 있어서 Th2 사이토카인 프로파일의 Th1 사이토카인 프로파일로의 이동을 가져오는지를 결정하기 위해서 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, 및 IL-13)과 Th1 사이토카인(IL-12p40)을 측정하였다. 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스(그룹 4)는 대조군 마우스(그룹 1, 2, 및 3)과 비교해볼 때 IL-4, IL-5, 및 IL-13 의 레벨이 증가하였다(도 2a 내지 2c). 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 오브알부민이 투여되고 난 후 CpG i.p.(그룹 5) 또는 R848 i.p.(그룹 8) 처리로 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 BALF 레벨이 감소하였다(도 2a 내지 2c). 오브알부민으로 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 오브알부민이 투여되고 난 후 R848이 있는 나노담체의 i.p.(그룹 6) 또는 i.n.(그룹 7) 처리로 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 BALF 레벨이 감소하였다(도 2a~c). 오브알부민에 사전감작되고 오브알부민이 투여된 마우스와 비교해볼 때 R848이 없는 나노담체 i.n.(그룹 9) 처리로 IL-4 레벨이 감소하지는 않았지만, IL-5 및 IL-13 레벨은 감소하였다(도 2a 내지 2c). R848 이 있는 나노담체로 i.n. 처리된 마우스는 모든 다른 마우스 그룹과 비교할 때 증가된 IL-12p40 레벨을 가졌다(도 2d).
전체적으로, 이러한 결과는 오브알부민에 사전감작된 마우스를 R848을 함유하는 나노담체로 i.p. 또는 i.n.으로 치료하여 BALF 내의 감소된 호산구, 감소된 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, 및 IL-13), 및 증가된 Th1 사이토카인(IL-12p40)을 가져옴을 보여준다. 이러한 나노담체로 치료하는 것은 CpG 또는 R848 i.p.로 치료하는 것에 필적하였다.

Claims (68)

  1. (1) 면역특징 표면(immunofeature surface)과 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 병태의 치료를 위한 조성물로, 면역특징 표면이 병태의 치료와 관련된 항원을 병태의 치료와 관련된 항원에 대한 후천성 면역 반응(adaptive immune response)을 야기하기에 충분한 양으로 포함하지 않는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 면역특징 표면이 병태의 치료에 관련된 항원을 포함하지 않는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 알레르겐을 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 종양 항원을 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 만성 감염원(chronic infectious agent) 항원을 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 면역특징 표면이 비항원성(non-antigenic) 면역특징 표면을 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 하나 이상, CpG, 면역자극 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 시료 내 합성 나노담체의 총수에 기초한 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%의 최소 크기는 100nm 초과인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 알레르겐을 포함하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 종양 항원을 포함하는 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 만성 감염원 항원을 포함하는 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 면역특징 표면이 비항원성 면역특징 표면을 포함하는 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 조성물.
  18. 제12항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 조성물.
  19. 제12항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 하나 이상, CpG, 면역자극 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 조성물.
  20. 제12항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 조성물.
  21. 제12항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 조성물.
  22. 제1항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 알레르겐을 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 종양 항원을 포함하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 만성 감염원 항원을 포함하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 비항원성 면역특징 표면을 포함하는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 방법.
  28. 제22항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 방법.
  29. 제22항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 하나 이상, CpG, 면역촉진 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 방법.
  30. 제22항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 방법.
  31. 제22항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 방법.
  32. 제22항에 있어서, 시료 내 합성 나노담체의 총수에 기초한 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%의 최소 크기는 100nm 초과인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 알레르겐을 포함하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 종양 항원을 포함하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 만성 감염원 항원을 포함하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 면역특징 표면이 비항원성 면역특징 표면을 포함하는 방법.
  37. 제32항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 방법.
  39. 제32항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합된(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합된(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 하나 이상, CpG, 면역촉진 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 방법.
  40. 제32항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 방법.
  41. 제32항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 방법.
  42. 병태를 앓고 있는 대상체를 식별하는 단계;
    (1) APC 표적화 특징(APC targeting feature)과 (2) 합성 나노담체에 결합된 Th1 편향 면역자극제(Th1 biasing immunostimulatory agent)를 포함하는 합성 나노담체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로,
    상기 조성물의 투여는 병태의 치료와 관련된 항원의 공동투여(co-administration)를 더 포함하지 않는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 하나 이상, CpG, 면역자극 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 방법.
  46. 제42항에 있어서, APC 표적화 특징은 면역특징 표면을 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 방법.
  48. 제42항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 방법.
  49. 제42항에 있어서, 시료 내 합성 나노담체의 총수에 기초한 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%의 최소 크기는 100nm 초과인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 병태의 치료에 관련된 항원이 조성물이 투여되는 때와 다른 때에 투여되는 방법.
  51. 제49항에 있어서, 합성 나노담체가 T 세포 항원을 더 포함하는 방법.
  52. 제49항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 적어도 하나, CpG, 면역자극 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1를 포함하는 방법.
  54. 제49항에 있어서, APC 표적화 특징이 면역특징 표면을 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 방법.
  56. 제49항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 방법.
  57. Th1 편향 면역자극제와 APC 표적화 특징을 포함하는 합성 나노담체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및
    상기 대상체에 조성물을 투여하는 때와 다른 때에 Th1 편향 반응이 임상적으로 유익한 대상체에 항원을 투여하는 단계를 포함하는 방법으로,
    상기 항원의 투여는 수동적 투여(passive administration) 또는 능동적 투여(active administration)를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 합성 나노담체가 중합성 매트릭스를 포함하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, Th1 편향 면역자극제는 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합(fused) 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-교상결합(bridged) 이미다조퀴놀린 아민 중 적어도 하나, CpG, 면역자극 RNA, 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), VSV-G, 또는 HMGB-1을 포함하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, APC 표적화 특징이 면역특징 표면을 포함하는 방법.
  61. 제57항에 있어서, 면역특징 표면이 니코틴 및 그 유도체, 메톡시기, 양으로 하전된 아민기, 시알릴락토스, 및 아비딘 및/또는 아비딘 유도체, 및 상기의 임의의 잔기를 포함하는 방법.
  62. 제57항에 있어서, 합성 나노담체가 구체, 입방체, 원통, 원뿔, 또는 피라미드인 합성 나노담체를 포함하는 방법.
  63. 제57항에 있어서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%의 최소 크기는 100nm 초과인 방법.
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