JP2024512505A - 免疫細胞への核酸の効率的な細胞内送達のための樹状ペプチド結合ポリマー - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞、特に樹状細胞を含む免疫細胞にポリヌクレオチド配列を送達するためのナノキャリア及びその使用方法を提供する。方法は、従来の方法よりも改善された送達及び低減された毒性を提供する。本開示の方法は、樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合されたポリ（エチレングリコール）－ブロックポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）を含むナノ構造を製造するための合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーからなる、核酸を細胞に送達するためのシステムを提供する。システムは、ポリヌクレオチドを樹状細胞を含む免疫細胞に送達する非毒性インビトロ方法であって、細胞培養培地中の細胞をナノキャリアと接触させることを含み、細胞に対して非毒性である、方法を提供する。本発明に記載の方法は、遺伝子治療を必要とする対象を治療するために使用することができ、有効量の、ポリヌクレオチドを含むシステムを対象に投与することを含み、ポリヌクレオチドは遺伝子治療のための目的の遺伝子を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１７日に出願された米国仮出願第６３／１６２，５０７号に対する優先権を主張し、該米国仮出願の内容はその全体が参照により組み込まれる。

連邦政府支援による研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所から授与されたＨＬ１３２３９０及び国立科学財団から授与された１４５３５７６に基づく政府支援によりなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。

遺伝子工学における最近の飛躍的な進歩により、がん及び感染症の治療におけるがん免疫療法、抗ウイルス療法、及びＤＮＡワクチンに比類のない機会がもたらされている［１～４］。遺伝子編集に関する多数の治験が進行中であるにもかかわらず、成功した遺伝子治療製品は非常に限られている［５］。これは主に、標的細胞への核酸の効果的な導入の課題に因るものであった。効率的なＤＮＡ送達システムは、酵素分解からの保護、細胞内在化、エンドリソソームからの脱出、及びサイトゾルのカーゴ放出などのいくつかの障害を克服する必要がある。

天然の遺伝子送達媒体として、ウイルスは、遺伝子発現に関して先例のない性能を発揮する。しかしながら、挿入突然変異誘発及びその特有の免疫原性などの安全性の問題により、臨床環境での使用が妨げられている［６］。さらに重要なことは、ＤＮＡの担持能力が限られていること（＜８ｋｂ）が、ウイルスベースのベクターには別の重大な制限となっている［７］。ウイルス同等物の障害を克服するために、脂質、ポリマー、ペプチド、及び無機ナノ材料を含む非ウイルスベクター及び合成担体は、免疫原性が限定的であること、柔軟なパッケージング能力、並びに合成及び製造が比較的容易であることに起因して、ますます注目を集めている［８］。しかしながら、既存の材料は、依然として、非効率的なエンドソーム脱出、重大な毒性、並びに特に免疫細胞などの最も魅力的な標的細胞種のいくつかにおける遺伝子トランスフェクション／細胞発現が低いことなどの課題に直面している。例えば、カチオン性脂質はほとんどの不死化細胞株における核酸送達のために最も広く使用されている非ウイルスベクターと考えられているが、多くの血液細胞及び免疫細胞では扱いにくいままである［９］。したがって、初代細胞及び免疫細胞などのトランスフェクションが困難ないくつかの細胞に核酸を送達するシステムに対して高い需要がある。

樹状又は分岐カチオン性ペプチドは、複数の官能基を備えた三次元（３Ｄ）構造を有し、これらは高度に負に帯電した核酸のための効率的な遺伝子送達材料となる［１０］。樹状構造は、線状構造と比較して、ペプチドとＤＮＡとの相互作用を大幅に増強し、カーゴパッケージングを大幅に改善し、様々な細胞種におけるトランスフェクション効率を高めることが報告されている［１１］。特に、ペプチド分岐層に基づく世代、分子量、官能性単位又は分岐単位、及び電荷分布を含む、様々なパラメータが樹状ペプチドの活性に影響を与えるであろう。例えば、分子量と電荷との比がより低く、かつ、電荷が樹状構造全体に分布した第３世代ペプチドデンドリマーは、ＤＮＡ送達に最良なトランスフェクション試薬であることが実証されている［１２］。その明確な潜在力にもかかわらず、カチオン性ペプチドデンドリマーは主に静電相互作用によって核酸と複合体を形成し、該複合体は一般に血清中で不安定であり、潜在的な細胞毒性を伴うため、遺伝子治療での適用は制限される。

現在利用可能な送達システムに伴う上記の問題を克服する核酸送達システムに対するニーズが存在する。

本開示は、細胞に核酸を送達するための組成物及び方法を提供する。一態様では、本開示は、樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合したポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）を含むナノ構造を製造するための合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーを提供する。いくつかの態様では、リンカーは、ジスルフィド結合（ｓｓ）である。いくつかの態様では、ポリマーは、ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎを含み、ｍ及びｎは、それぞれ１～５００から選択される整数である。

別の態様では、本開示は、核酸を細胞に送達するためのシステムであって、（ａ）リンカーを介して樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合したポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ）を含むナノ構造、並びに（ｂ）ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、システムを提供する。いくつかの態様では、リンカーは、ジスルフィド結合である（例えば、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ）。いくつかの態様では、送達は、インビトロで達成される。特定の態様では、方法は、樹状細胞を含む免疫細胞へのインビトロ送達のためのものである。

別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチド配列を細胞に送達する方法であって、細胞がポリヌクレオチドを細胞中に取り込むために、本明細書に記載のナノ構造を介してポリヌクレオチドを本明細書に記載の細胞に接触させることを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドを細胞に送達する非毒性インビトロ方法であって、（ａ）細胞培養培地中の細胞を（ｉ）ＤＰペプチドに結合されたＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ（式中、ｍ及びｎは、１～５００の整数である）を含むナノキャリア及び（ｉｉ）ポリヌクレオチドと接触させることと、（ｂ）ポリヌクレオチドを細胞核に送達するのに十分な時間にわたって細胞を培養することとを含み、細胞に対して非毒性である、方法を提供する。

いくつかの態様では、方法は、インビトロ送達のためのものである。特定の態様では、方法は、樹状細胞を含む免疫細胞へのインビトロ送達のためのものである。

さらなる態様は、ポリヌクレオチドを含む細胞システムを含む。

さらなる実施形態では、本開示は、免疫細胞をトランスフェクトして、ポリヌクレオチド配列を免疫細胞の核に送達する方法であって、ポリヌクレオチド配列を免疫細胞の核に送達するのに十分な時間にわたって免疫細胞を本明細書に記載のナノキャリアシステムと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、インビトロである。

さらに別の実施形態では、本開示は、遺伝子治療を必要とする対象を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載のシステムを対象に投与することを含み、該システムが、遺伝子治療のための目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

本発明の前述及び他の態様及び利点は、以下の記載から明らかになるであろう。本記載では、本明細書の一部を形成する添付図面が参照され、図面には本発明の好ましい実施形態が例示として示される。しかしながら、そのような実施形態は必ずしも本発明の全ての範囲を表すものではないため、本発明の範囲を解釈するためには特許請求の範囲及び本明細書が参照される。

図１ ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ）遺伝子送達システムの設計及び構造、並びにＤＮＡの細胞内送達を増強するための戦略を示す概略図。 図２ インビトロでのＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体の細胞毒性。ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体の細胞生存率は、異なるポリマー対ＤＮＡ比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）で、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭＴＴアッセイを使用して決定した。未処理細胞（対照）、裸のＤＮＡ（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－リポフェクタミン２ｋ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）、ＤＮＡ－ＰＥＩ複合体（分子量２５ＫＤＡを有するＰＥＩ、５：１及び１０：１のＰＥＩ対ＤＮＡ重量比）を対照群として含めた。 図３ 様々な免疫細胞における、ＰＰＤＰナノベクターによる小さいサイズのプラスミドＤＮＡのトランスフェクション。Ａ、小さいサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ、４．６Ｋｂ）の概略図。ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰは、ＣＭＶプロモーター、Ｎｅｏ／Ｋａｎ耐性遺伝子、及びＥＧＦＰレポーター遺伝子を含む。Ｂ、様々なＰＰＤＰナノベクターによるＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７マクロファージでの蛍光発現細胞の割合で評価した。ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ）の重量比で調製した。ＤＮＡ－ＤＰ１複合体を２０：１（ＤＰ１：ＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の説明書に従って行った。ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの、同じ量のＤＮＡを有する異なるＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２（Ｃ）及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５（Ｄ）のトランスフェクション効率。Ｅ～Ｆ、６０：１のＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５ナノベクターを使用してｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ（４．６Ｋｂ）でトランスフェクトされた骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のフローサイトメトリー分析。裸のＤＮＡ及びＤＮＡ－Ｌｉｐｏ２Ｋ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）を陰性及び陽性対照群として導入した。すべてのトランスフェクション実験について同じ量のＤＮＡを使用した。すべての統計データは平均値±ＳＤとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図４ 様々な細胞における、ＰＰＤＰナノベクターによる大きいサイズのプラスミドＤＮＡのトランスフェクション。Ａ、大きなサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＦＳ－ＲＦＰ、１１．７Ｋｂ）の概略図。ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰは、ＥＦＳプロモーター、ＮＳＬ遺伝子、Ｃａｓ９発現遺伝子、ＡＭＰ耐性遺伝子、及びＲＦＰレポーター遺伝子を含む。Ｂ、様々なＰＰＤＰナノベクターによるｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）プラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７マクロファージでのＲＦＰ陽性細胞の割合で評価した。ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の説明書に従って行った。Ｃ、ＲＡＷ２６４．７マクロファージへのｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）プラスミドＤＮＡのＰＰＤＰ２媒介送達の代表的な共焦点画像。ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの、同じ量のＤＮＡを有する異なるＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比（１０：１、２０：１、４０：１、６０：１、１００：１）のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２（Ｄ）及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５（Ｅ）のトランスフェクション効率。Ｆ、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞での、６０：１（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ）の重量比のＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５で送達したｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）プラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率。Ｇ、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞へのｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）プラスミドＤＮＡのＰＰＤＰ２媒介送達の代表的な共焦点画像。Ｈ～Ｉ、６０：１のＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５ナノベクターを使用してｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）でトランスフェクトされた骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のフローサイトメトリー分析。裸のＤＮＡ及びＤＮＡ－Ｌｉｐｏ２Ｋ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）を陰性及び陽性対照群として導入した。すべてのトランスフェクション実験について同じ量のＤＮＡを使用した。スケールバー＝１０μｍ。すべての統計データは平均値±ＳＤとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図５ ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるＰＰＤＰ２／ｐＤＮＡ複合体のエンドソーム脱出及びサイトゾル送達。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、６０：１のＰＰＤＰ２対ｐＤＮＡ重量比を使用して形成されたＰＰＤＰ２／ＡＦ４８８標識Ｓ－ｐＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１、５．４ｋｂ）ナノ複合体とともにインキュベートした。代表的な共焦点画像は、１時間、４時間、及び１８時間のインキュベーション期間後の細胞内のＰＰＤＰ２／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体を示している。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ ｒｅｄを使用して、後期エンドソーム／リソソームを標識した。核をＤＡＰＩ（青）で染色した。緑色のプラスミドＤＮＡ及び赤色のエンド／リソソームの共局在は画像中で黄色で示される。スケールバー＝１０μｍ。 図６ ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｓｓ－樹状ペプチド（ＰＰＤＰ）ポリマー合成の概略図。 図７ インビトロでのＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体の細胞毒性。ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭＴＴアッセイを使用して、異なるポリマー対ＤＮＡ比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）で、ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体の細胞生存率を測定した。 図８ （Ａ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、様々なＰＰＤＰナノベクターを使用してｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ（４．６Ｋｂ）でトランスフェクトした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定した。ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ）の重量比で調製した。ＤＮＡ－ＤＰ１複合体を２０：１（ＤＰ１：ＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の指示に従って行った。同じ量のＤＮＡを有する異なるＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２（Ｂ）及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５（Ｃ）でトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＭＦＩ。すべての統計データは平均値±SDとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９ ６０：１のＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５でトランスフェクトした骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＭＦＩ。Ｌｉｐｏ２Ｋを陽性対照として使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ（４．６Ｋｂ）を送達した。すべての統計データは平均値±SDとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊ｐ＜０．０５。 図１０ （Ａ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、様々なＰＰＤＰナノベクターを使用してｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）でトランスフェクトした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定した。ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ）の重量比で調製した。ＤＮＡ－ＤＰ１複合体を２０：１（ＤＰ１：ＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の指示に従って行った。同じ量のＤＮＡを有する異なるＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比（１０：１、２０：１、４０：１、６０：１、１００：１）のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２（Ｂ）及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５（Ｃ）でトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＭＦＩ。すべての統計データは平均値±ＳＤとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１１ 線維芽細胞、樹状細胞、及びＴ細胞におけるＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡナノベクターのトランスフェクション。ＮＩＨ ３Ｔ３、ＢＭＤＣ、及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、６０：１のＰＰＤＰ対ｐＤＮＡの重量比を有するＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５ナノベクターを使用してＬ－ｐＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７ｋｂ）でトランスフェクトした。ａ）ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体の代表的な共焦点画像により、細胞取り込み後のＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクションが実証された。スケールバー＝２０μｍ。ｂ）ＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるトランスフェクション効率の割合。ｃ）フローサイトメトリーのヒストグラム、及びｄ）ＢＭＤＣにおけるトランスフェクトされた細胞の割合。ｅ）フローサイトメトリーのヒストグラム、及びｆ）トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の割合。裸のｐＤＮＡ及びＬｉｐｏ２Ｋ／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として含めた。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３～４）として示される。事後Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用したＡＮＯＶＡにより、有意性を決定した（５％有意性レベル）。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー＝１０μｍ。 図１２ ６０：１のＰＰＤＰ対ＤＮＡ重量比のＤＮＡ－ＰＰＤＰ２及びＤＮＡ－ＰＰＤＰ５でトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞（Ａ）及び骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）（Ｂ）のＭＦＩ。Ｌｉｐｏ２Ｋを陽性対照として使用して、ｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）を送達した。すべての統計データは平均値±ＳＤとして示される。各群についてＮ＝３。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１３ ＰＥＧ_ｎ－ｂ－ＰＰＳ_ｍ－ｐｄｓの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）；ａ）ＰＰＤＰ２、ｂ）ＰＰＤＰ３、ｃ）ＰＰＤＰ４、ｄ）ＰＰＤＰ５、ｅ）ＰＰＤＰ６、及びｆ）ＰＰＤＰ７。δ：３．６（ｓ、６８Ｈ、ＰＥＧ）、３．３（ｓ、３Ｈ、ＰＥＧ－ＯＣＨ_３）、２．９（ｍ、２Ｈ／単位、－Ｓ－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｓ－）、２．６（ｍ、１Ｈ／単位、－Ｓ－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｓ－）、１．３（ｍ、３Ｈ／単位、－Ｓ－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｓ－）。 図１４ ＣＤスペクトル取得時の高圧（ＨＴ）電圧。ａ）ＰＰＤＰ２及びｂ）ペプチド対照サンプルのスペクトル収集時のＨＴ電圧が示される。 図１５ ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターの特性評価。１：１～６０：１の異なるポリマー対ｐＤＮＡ比を有するＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体のアガロースゲル電気泳動の遅延。裸のｐＤＮＡ、リポフェクタミン２０００／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体（２５ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ）、及び樹状ペプチド（ＤＰ１）／ｐＤＮＡ複合体を対照群として含めた。ｐＤＮＡとのＰＰＤＰの配合の最適化。ａ）ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体、ｂ）ＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体。（三角形：ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体中の良好にカプセル化されたｐＤＮＡ）。複合体の粒子サイズ（赤）及びゼータ電位（青）に対する、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５対ｃ）Ｓ－ｐＤＮＡ及びｄ）Ｌ－ｐＤＮＡ質量比の影響。（アスタリスク：配合最適化の比）。クライオ透過型電子顕微鏡によるＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体の代表的な画像。６０：１（ＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ）の重量比のｅ）ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体及びｆ）ＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体。スケールバー（黒色）＝１００ｎｍ。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。 図１６ ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ）の特性評価。ａ）ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ）ポリマーの概略図。ＰＰＤＰ２のｂ）代表的なクライオ透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）画像及びｃ）サイズ分布。スケールバー＝１００ｎｍ。ｄ）ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ（緑色）、樹状ペプチド（黒色）、及びＰＰＤＰ２（赤色）のＦＴ－ＩＲスペクトル。青色で強調表示された領域は、アミドＩ（１７００～１６００ｃｍ^－１）及びアミドＩＩ（１５９０～１５２０ｃｍ^－１）のバンドに対応する。ｅ）ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳの寄与を差し引いたＰＰＤＰ２スペクトル。ｆ）組み立てられたナノ構造又はｇ）遊離形態のＤＰペプチドのＤＰペプチドの螺旋構造の円二色性（ＣＤ）分光分析。 図１７ ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターのゲル遅延アッセイ。１：１～１２０：１の異なるポリマー対ｐＤＮＡ比を有するＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体のアガロースゲル電気泳動の遅延。樹状ペプチド（ＤＰ１）／ｐＤＮＡ複合体及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体（２５ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ）を対照群として含めた。ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体中の良好にカプセル化されたｐＤＮＡは赤色の三角形で示されている。ａ）ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体、ｂ）ＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体。 図１８ ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターの細胞毒性。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を、異なるポリマー対ｐＤＮＡ比（３０：１、６０：１、１２０：１）を有するＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体とともに、９６ウェルプレート中、３×１０^４／ウェルの細胞密度で３７℃で２４時間インキュベートした。未処理細胞（対照）、リポフェクタミン２０００／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体（２５ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ）、及び樹状ペプチド（ＤＰ１）／ｐＤＮＡ複合体を対照群として含めた。次いで、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。ａ）ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体、ｂ）ＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体。（アスタリスク：配合最適化の比率）。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。 図１９ 様々な細胞株におけるＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡナノベクターのトランスフェクション。ＮＩＨ ３Ｔ３、ＢＭＤＭ、及びＪｕｒｋａｔを、６０：１のＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５ナノベクターを使用してＬ－ｐＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７Ｋｂ）でトランスフェクトした。ａ）ＮＩＨ ３Ｔ３、ｂ）ＢＭＤＣ、及びｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるトランスフェクション効率の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。裸のｐＤＮＡ及びＬｉｐｏ２Ｋ／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）を陰性及び陽性対照群として導入した。トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって分析した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２０ 様々な細胞株におけるＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡナノベクターのトランスフェクション。ＮＩＨ ３Ｔ３、ＢＭＤＣ、及びＪｕｒｋａｔ細胞を、６０：１のＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５ナノベクターを使用してＬ－ｐＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７Ｋｂ）でトランスフェクトした。ａ）ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体の代表的な共焦点画像により、細胞取り込み後のＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクションが実証された。スケールバー（白）＝２０μｍ。ｂ）ＮＩＨ ３Ｔ３におけるトランスフェクション効率の割合。ｃ）ヒストグラム及びｄ）ＢＭＤＣにおけるトランスフェクション効率の割合。ｅ）ヒストグラム及びｆ）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるトランスフェクション効率の割合。裸のｐＤＮＡ及びＬｉｐｏ２Ｋ／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）を陰性及び陽性対照群として導入した。トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって分析した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３－４）として示される。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２１ ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターのトランスフェクション。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を、示した材料とともに４８時間インキュベートした。ａ）小さいサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ、４．６Ｋｂ）の概略図。ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄは、ＣＭＶプロモーター、Ｎｅｏ／Ｋａｎ耐性遺伝子、及びＤｓＲｅｄレポーター遺伝子を含む。ｂ）様々なＰＰＤＰナノベクターによるＳ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７細胞での蛍光発現細胞の割合で評価した。ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の指示に従って行った。ｃ）異なるＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）のＰＰＤＰ２／Ｓ－ｐＤＮＡ及びＰＰＤＰ５／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率。ｄ）大きなサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７Ｋｂ）の概略図。ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰは、ＥＦＳプロモーター、ＮＳＬ遺伝子、Ｃａｓ９発現遺伝子、ＡＭＰ耐性遺伝子、及びＲＦＰレポーター遺伝子を含む。ｅ）様々なＰＰＤＰナノベクターによるＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７細胞での蛍光発現細胞の割合で評価した。ｆ）異なるＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比（１０：１、４０：１、６０：１、１００：１）のＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ及びＰＰＤＰ５／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率。ｇ）ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体（６０：１のＰＰＤＰ２対ｐＤＮＡ重量比を有する）の代表的な共焦点画像により、細胞取り込み後のＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクションが実証された。スケールバー（白）＝２０μｍ。トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって分析した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２２ ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターのトランスフェクション。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を、示した材料とともに４８時間インキュベートした。ａ）様々なＰＰＤＰナノベクターによるＳ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７細胞での平均蛍光強度（ＭＦＩ）で評価した。ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡナノ複合体を６０：１（ＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ）の重量比で調製した。Ｌｉｐｏ２Ｋによるトランスフェクションを製造元の指示に従って行った。ｂ）異なるＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比（１５：１、３０：１、６０：１、１２０：１）のＰＰＤＰ２／Ｓ－ｐＤＮＡ及びＰＰＤＰ５／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率。ｃ）様々なＰＰＤＰナノベクターによるＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率をＲＡＷ２６４．７細胞での平均蛍光強度（ＭＦＩ）で評価した。ｄ）異なるＰＰＤＰ対ｐＤＮＡ重量比（１０：１、４０：１、６０：１、１００：１）のＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体及びＰＰＤＰ５／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率。トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって分析した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。統計分析には両側ｔ検定を使用した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２３ ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクター画像のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像。（ａ）はＰＰＤ２の画像であり、（ｂ）はＰＰＤＰ５の画像である。スケールバー（白）＝１００ｎｍ。 図２４ ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は、マクロファージベースのスクリーニングにおいてＬｉｐｏ２Ｋよりも高いプラスミドＤＮＡトランスフェクション効率及びレポーター発現レベルを達成する。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、指定された材料とともに４８時間インキュベートした。ａ）ＣＭＶプロモーター及びＤｓＲｅｄレポーター遺伝子を含む小さいサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ、４．６ｋｂ）モデルの概略図。ｂ）蛍光レポータータンパク質を発現する細胞の割合として定量化された、ＰＰＤＰナノベクター（ＰＰＤＰ２～ＰＰＤＰ７）を使用したＳ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率。ｃ）ＤｓＲｅｄレポーターを発現する細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）とともにプロットされたＳ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率。ｄ）ＮＳＬ、Ｃａｓ９、及びＲＦＰレポーター遺伝子とともにＥＦＳプロモーターを含む、本研究で使用した大きなサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７ｋｂ）モデルの概略図。ｅ）ＰＰＤＰナノベクターによるＬ－ｐＤＮＡのトランスフェクション効率。ｆ）ＲＦＰレポーターを発現する細胞のトランスフェクション効率及びＭＦＩ。ｇ）Ｌｉｐｏ２Ｋと比較した、ＰＰＤＰ媒介プラスミドトランスフェクション効率（左）及びレポーター発現レベル（右）の倍数差。ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５のランクは各ヒートマップの下に注釈付きである。すべての場合において、６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ重量比を使用した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。使用したトランスフェクションを製造元の指示に従って行った。パネル（ｂ、ｅ）の場合、事後Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用したＡＮＯＶＡにより、有意差を決定した（５％有意性レベル）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照及びｐＤＮＡ（灰色のバー）、Ｌｉｐｏ２Ｋ（赤色のバー）との比較、並びにＰＰＤＰ処理群（黒色のバー）内の比較が、指定された色で示されている。 図２５ ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノベクターの細胞毒性。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、異なるポリマー対ｐＤＮＡ比（３０：１、６０：１、１２０：１）で調製したＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体とともに３７℃で２４時間インキュベートした。未処理細胞（対照）、Ｌｉｐｏ２Ｋ／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体（２５ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ）、及び樹状ペプチド（ＤＰ）／ｐＤＮＡ複合体をベンチマークとして含めた。次いで、ａ）ＰＰＤＰ／Ｓ－ｐＤＮＡ複合体及びｂ）ＰＰＤＰ／Ｌ－ｐＤＮＡ複合体についての細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。アスタリスクは実験的に決定された最適な比を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。 図２６ ６０：１のＰＰＤＰ：ｐ－ＤＮＡ比は、小さなプラスミド及び大きなプラスミドの両方でマクロファージのトランスフェクションに最適であった。ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるトランスフェクション効率を、指定されたＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比のａ）小さいモデルプラスミド（Ｓ－ｐＤＮＡ；ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ、４．６ｋｂ）又はｂ）大きなモデルプラスミド（Ｌ－ｐＤＮＡ；ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７ｋｂ）と複合体を形成したＰＰＤＰ２（紫色の棒グラフ）又はＰＰＤＰ５（赤色の棒グラフ）を使用して、フローサイトメトリーによって決定した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。事後Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用したＡＮＯＶＡにより、有意差を決定した（有意性レベル５％）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｃ）ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡ（６０：１）又はＬｉｐｏ２Ｋ／Ｌ－ｐＤＮＡでトランスフェクトされたマクロファージによるレポーター遺伝子発現の代表的な共焦点画像。細胞バックグラウンド（対照）及び裸のＬ－ｐＤＮＡでトランスフェクトされた細胞も示されている。スケールバー＝２０μｍ。 図２７ ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳを樹状ペプチド（ＤＰ）に結合させてＰＰＤＰを形成する前及び形成した後のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）。移動相としてＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の１０ｍＭ臭化リチウムを使用して分析を行った。屈折率及びＵＶ－Ｖｉｓ検出器を備えたＰＬｇｅｌカラムを使用してＧＰＣを行った。ａ）ＰＥＧ１７－ｂ－ＰＰＳ８０－ｐｄｓ、ｂ）ＰＥＧ１７－ｂ－ＰＰＳ８０－ｓｓ－ＤＰ。

本発明を１つ以上の好ましい実施形態に関して記載したが、明示的に述べられたもの以外に多くの等価、代替、変形、及び改変が可能であり、本発明の範囲内であると理解されるべきである。

本明細書では、ポリヌクレオチドの効率的なサイトゾル送達のために操作されたポリマーナノキャリアに基づく新規な遺伝子送達システムが開示される（図１）。樹状ペプチド（ＤＰ）と結合したＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマー（ＰＰＤＰ）は、水性緩衝液中で単に混合することにより、核酸をカプセル化する安定したナノ構造に組み立てられる。この送達システムは、トランスフェクションが難しいことで既知である免疫細胞への核酸の細胞内送達を増強する特有の機能を備えた、生物医学研究及び治療用途のための遺伝物質の充填及び送達を増強するための優れたプラットフォームとして機能する。

具体的には、ポリヌクレオチドを送達するための本明細書に記載のナノキャリアプラットフォームは非毒性であり、細胞、特に免疫細胞の効率的なインビトロトランスフェクションを可能にする。この細胞のインビトロトランスフェクションは血清の存在下で行うことが可能であり、毒性があり、かつ、免疫細胞のトランスフェクションが難しいことで既知である現在の細胞トランスフェクション標準のリポフェクタミンと比較して優れたトランスフェクションを提供する。リポフェクタミンは特別な無血清培地を必要とするため、トランスフェクション後に毒性効果が生じて細胞生存率が低下する。免疫細胞は培地条件に対して非常に感受性が高く、したがって、血清の存在下でポリヌクレオチドを送達することができる本発明の方法及び本発明のナノキャリアの能力は、低毒性に加えて、本明細書に記載のＰＰＤＰの重要な利点である。

実施例に記載されているように、最適化されたＰＰＤＰ構築物は、ポリヌクレオチドのサイズに関係なく、血清存在下での標準的な培養条件下において、主なＬｉｐｏ２Ｋ試薬よりも効率的かつ低い毒性でマクロファージ、線維芽細胞、樹状細胞、及びＴ細胞をトランスフェクトした。その潜在力にもかかわらず、カチオン性ペプチドデンドリマーは主に静電相互作用によって核酸と複合体を形成し、該複合体は単独で使用した場合に血清中で一般的に不安定であり、潜在的な細胞毒性の懸念を伴うため、遺伝子治療での適用が制限される。

本開示は、ポリヌクレオチド送達に使用することができるナノ構造を製造することができるＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ合成ポリマーを提供する。ポリマーＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰは、樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合したポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）を含む。好適なリンカーは、例えば、１）共有結合、２）イオン結合又は感受性、３）酵素分解／タンパク質分解、４）ｐＨ、５）温度、６）光、７）超音波、８）塩濃度、９）界面活性剤、１０）酸化、１１）加水分解を含むことができるが、これらに限定されない。好適なリンカー及び結合方法は当該技術分野で既知である。リンカー基は典型的には２つの末端を有し、一方の末端は基質（ＤＮＡ）結合基を含み、他方の末端はポリマー結合基を含む。本発明は、いかなる特定のリンカー基にも限定されない。実際、アルキル、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミド基、又はこれらの基の組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々なリンカー基の使用が企図される。本発明は、当該技術分野で既知である特定の基質（ＤＮＡ）結合基又はポリマー結合基の使用に限定されない。本発明は、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボン酸、エステル、アミド、エポキシド、イソシアネート、及びイソチオシアネート基を含むがこれらに限定されない、様々なポリマー結合基を使用し得ることが企図される。代替の実施形態では、リンカーは、トリチル部分、エステル部分、又はＣＤＭ（カルボキシル化ジメチルマレイン酸）部分を含む。当業者によって理解されるように、代替のリンカー部分を本明細書に記載のジスルフィドリンカーに代えて使用することができる。明細書作成の便宜上、本明細書は主にジスルフィドリンカーに焦点を当てるが、適用可能な場合には代替部分をそれと置き換えることができることを理解されたい。

好ましい実施形態では、リンカーは、好ましくはジスルフィド結合（ｓｓ）である（例えば、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ）。

ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）は、既知の方法、例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｆａｃｉｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｖｉａ ｍｕｌｔｉ－ｉｍｐｉｎｇｅｍｅｎｔ ｆｌａｓｈ ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１７．２６２：ｐ．９１－１０３及び米国特許第１０，６３３，４９３号（これらの各々は、コポリマーの製造方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法により調製することができる。例示的な合成は実施例に記載されている。例えば、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳは、チオ酢酸ＰＥＧによって開始され、かつ、メシル酸ＰＥＧでエンドキャップされる、プロピレンスルフィドのアニオン開環重合によって調製される。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳは、メタノール中での沈殿によって精製される。

本明細書に記載されるＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーを得るために、実施例に記載されるように、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳはリンカー（例えば、ジスルフィド結合）を介して樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）に結合される。

「樹状ペプチド」、「ＤＰ」、又は「分岐カチオン性ペプチド」は、複数の官能基を備えた三次元（３Ｄ）構造を有するペプチドである。樹状ペプチドは、カチオン性アミノ酸の数及び種類（リジン、アルギニン、オルニチン）が異なる分岐オリゴカチオン性ペプチドである。本発明の樹状ペプチドは、第３世代を有し、かつ、核酸との相互作用のための正に帯電したアルギニン（Ｒ）、緩衝能を有するヒスチジン（Ｈ）、及びエンドソーム脱出を促進する膜結合能を有する親油性ロイシン（Ｌ）、並びに官能性単位分岐（functional unit branching）のためのリジンから構成される各単位を有する。これらの分岐ペプチドは、直鎖ペプチドと比較して、遺伝子送達に関してより良好なカプセル化及びトランスフェクション効率を示す。ペプチド分岐層に基づく世代、分子量、官能性単位又は分岐単位、及び電荷分布を含む様々なパラメータが、樹状ペプチドの活性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳに結合した樹状ペプチドは、｛［（ＲＨＬ）２－ＫＲＨＬ］２－ＫＲＨＬ｝２－ＫＣ－ＮＨ_２（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳは、ジスルフィド交換によってＤＰに結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰ対ＤＰの比は、１：１～１：１０００、好ましくは約１：１～約１：５００である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ対ＤＰの比は、１：１、１：２、１：１０、１：２０、１：５０、１：７５、１：１００、１：１２０、１：２００、１：５００、１：７５０など（その間のすべての比を含む）である。

「アミノ酸」という用語は、別段の記載がない限り、構造が立体異性体形態を許容する場合、すべてのＤ及びＬ立体異性形態の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体を指す。天然アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）が含まれる。

非天然アミノ酸には、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、第３級ブチルグリシン（「ｔＢＵＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」又は「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ（ａｌｌｏ）－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」又は「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－メチルグリシンを含むＮ－アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルペンチルグリシンを含むＮ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」又は「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」又は「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が含まれるが、これらに限定されない。

「アミノ酸類似体」という用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、及び側鎖生物活性基のうちの１つ以上が可逆的若しくは不可逆的に化学的にブロックされているか又はその他では別の生理活性基へと修飾されている、天然又は非天然のアミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸－（ベータ－メチルエステル）はアスパラギン酸のアミノ酸類似体であり、Ｎ－エチルグリシンはグリシンのアミノ酸類似体であり、又はアラニンカルボキサミドはアラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体には、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホキシド、及びＳ－（カルボキシメチル）－システインスルホンが含まれる。

本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸のオリゴマーからアミノ酸の短いポリマーを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドは約５０アミノ酸以下の長さである。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／又は修飾アミノ酸を含み得る。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の部分配列又は非天然（人工）配列であり得る。

本明細書に記載のナノキャリアは、ＤＰに結合されたＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎを含むことができ、ｍ及びｎは両方とも、それぞれ１～５００、又は約２～３００、又は１０～２５０から選択される整数である。特定のｍ及びｎを選択して特定の比又はＰＥＧ及びＰＰＳを提供し、所望の特定のナノ構造（例えば、本明細書に記載のポリマーソーム、二連続ナノスフェア、ミセル、フィロミセルなど）を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合（－ｓｓ－）であるが、ペプチドをポリマーに結合することができる任意のリンカーを使用することができることが企図される。

ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーは、動的光散乱（ＤＬＳ）及びナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によってサイズ分布について特徴評価することができ、クライオ透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏＴＥＭ）によって形態について特徴評価することができる。治療薬の充填効率及びカプセル化効率は、液体クロマトグラフィー質量分析によって特徴評価することができる。

プロピレンスルフィドの重合、酸化、又は分岐の程度を変えることにより、様々な種類のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーを調製することができる。例えば、ナノキャリアは、ポリマーソーム（約０．２５～約０．４５のＰＥＧ重量分率）、ミセル（０．４５超のＰＥＧ重量分率）、二連続ナノスフェア（０．２５未満のＰＥＧ重量分率）、フィロミセル（約０．３５～約０．４５のＰＥＧ重量分率）、ポリプロピレンスルホンナノゲル（９０％超の酸化ＰＰＳホモポリマー）、又は分岐ラフト重合ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）－ｂ－ポリ（オリゴ（プロピレンスルフィド）メタクリレート）から組み立てられたポリマーソーム（ＰＯＥＧＭＡ－ＰＯＰＳＭＡ^１～５）の形態であり得る。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、約０．２５のＰＥＧ重量分率を有する。当業者は、適切な重量分率を決定することができ、本明細書に提供される例とは異なってもよいが、依然として本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーは、水性コアと、水性コアを取り囲む脂質二重層の疎水性領域及び親水性領域とを有するポリマーソームである。ポリマーソームＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーは、約０．２５～約０．８０のＰＥＧ重量分率を有することができる。ポリマーソームＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーは、約１０ｎｍ～約３００ｎｍ、又は約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、又は約３０ｎｍ～約６０ｎｍ、又は約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約１００ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰナノ構造は、２つの連続する相である（ｉ）横断する水性チャネルの立方格子、（ｉｉ）広範な疎水性内部容積によって特徴付けられる二連続ナノスフィア（ＢＣＮ）である。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）分析に基づき、ＢＣＮは、√２、√４、及び√６の相対間隔比でのブラッグピークによって確認した際に、プリミティブ型立方晶内部組織（Ｉｍ３ｍ）を有する。ＢＣＮは、脂質キュボソームのポリマー同等物であり、リオトロピックである。ＢＣＮは、疎水性治療薬及び親水性治療薬の両方を組み込むことができる。ＢＣＮは、既知の方法、例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ ｂｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｕａｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐａｙｌｏａｄｓ．ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１８，１０，４０，３３８５７-３３８６６（これは、連続ナノスフェア構造の構造及び特徴に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ）。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰナノ構造は、疎水性／親油性コア及び親水性外部を有するミセル又はフィロミセルである。ミセル又はフィロミセルＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰナノ構造は、球状の形態を有し、典型的にはポリマーソームよりも小さく（例えば、５０ｎｍ未満）、疎水性コアに核酸を充填することができる。ミセルは、好適には、約０．３５～約０．４５のＰＥＧ重量分率を有する。ミセル又はフィロミセルは、既知の方法、例えば、Ｋａｒａｂｉｎ，Ｎ．Ｂ．，Ａｌｌｅｎ，Ｓ．，Ｋｗｏｎ，Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９， ６２４（２０１８）（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって調製することができる。

本明細書に開示されるＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰナノ構造の他の好適な調製方法は、既知の方法、例えば、Ｄｕ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１９）：Ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｖｉａ Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｅ） Ｎｅｔｗｏｒｋｓ．ＣｈｅｍＲｘｉｖ．Ｐｒｅｐｒｉｎｔ；Ｄｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｇｏｓ ｆｒｏｍ Ｓｈｅｌｌ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１８；２８２：９０－１００；及びＹｉ Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１６；１０（１２）：１１２９０－１１３０３（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって調製することができる。

ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーは、ナノ構造を安定化するためのＰＰＳの疎水性部分及び細胞への取り込みを増強し、かつ、毒性を軽減するための親水性ＰＥＧコロナの両方を提供する。ＰＰＳとＤＰとの間に生体内還元性ジスルフィド結合を組み込むことによって還元性細胞内環境におけるエンドソーム脱出及びカーゴ放出が改善されるため、遺伝子送達効率が向上する。

本開示は、細胞に送達されるポリヌクレオチドを含むナノキャリアシステムを提供する。ナノキャリアシステムは、ＤＰに結合され、かつ、ポリヌクレオチドを細胞に送達することができる構造を形成する、より好ましくはポリヌクレオチドを細胞の核に送達することができる構造を形成する、本明細書に記載のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーを含む。

本明細書に記載のナノキャリアシステムは、細胞、特に免疫細胞のインビトロトランスフェクションに使用することができる。好適には、トランスフェクションは血清の存在下で行うことができる。さらに、本明細書に記載のナノキャリアシステムは、細胞に対して非毒性である。いくつかの実施形態では、ナノキャリアシステムは、特にリポフェクタミンなどの従来技術の方法と比較したとき、ポリヌクレオチドの高い送達効率をもたらす。

本明細書に記載のナノキャリアシステム及び使用方法は、ポリヌクレオチドが送達される細胞に対して非毒性である。「非毒性」という用語は、宿主細胞とともにインキュベートするか又は宿主細胞と接触させた場合に、ナノキャリアシステムがアポトーシス又は細胞死を引き起こさない能力を指す。好適には、非毒性システムは、ナノキャリアシステムと接触した細胞の大部分を生存可能に保持し、ポリヌクレオチドを組み込むことができる能力を指す。好適には、非毒性という用語は、当該技術分野で既知のｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ又は代謝アッセイ（例えば、限定されないが、ＭＭＴアッセイ）によって評価した際に、統計的に有意な細胞生存率減少を引き起こさないことを指す。

本明細書に開示されるナノキャリアはまた、医薬組成物に組み込まれ得る。開示されたナノキャリア又はそれを含む医薬組成物は、遺伝子治療を必要とする対象における遺伝子治療の方法に使用され得る。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、使用される投与方法に依存するであろう。好適な投与様式には、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、開示された医薬組成物は非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与は、髄腔内投与、脳室内投与、又は実質内投与による。特定の実施形態では、開示された医薬組成物は皮下投与される。特定の実施形態では、開示された医薬組成物は静脈内投与される。本明細書に開示される医薬組成物は、単独の活性薬剤として、又は対象における遺伝性疾患の治療に使用される他の薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

開示されるナノキャリア又はそれを含む医薬組成物の投与量は、状態の重症度、対象の年齢、性別、及び体重、投与頻度、治療期間などを含む様々な要因に依存する。開示されたナノキャリア又は医薬組成物は、所望の治療効果を達成するため、すなわち、遺伝性疾患を治療するために必要である、任意の好適な用量、頻度、及び任意の好適な期間で投与され得る。開示されたナノキャリア又は医薬組成物は、１日１回又は１日複数回投与され得る。あるいは、及び好ましくは、ナノキャリア又は医薬組成物は、少なくとも２週間にわたって週に１回投与され得る。他の例では、ナノキャリア又は医薬組成物は、１日１回、１日２回、又は１日３回以上投与され得る。開示されたナノキャリア又は医薬組成物は、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、週に１回、２週間に１回、又は２週間に１回未満投与され得る。ナノキャリア又は医薬組成物は、所望の治療効果を達成するために、すなわち、遺伝性疾患を治療するために、任意の好適な期間にわたって投与され得る。例えば、ナノキャリア又は医薬組成物は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、１年間、又は１年間超、対象に投与され得る。

開示されたナノキャリア又はそれを含む医薬組成物の任意の好適な用量が使用され得る。好適な用量は、治療薬、意図される治療効果、個体の体重、個体の年齢などに依存するであろう。一般に、開示されたナノキャリア又はそれを含む医薬組成物の好適な用量は、約０．０２５ｍｇナノキャリア／ｋｇ体重～２００ｍｇナノキャリア／ｋｇ体重の範囲であり得る。例えば、好適な用量は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．０３ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．０５ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．１０ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．１５ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．３０ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．７５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１．０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１．２５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１．５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１．７５ｍｇ／ｋｇ、又は２．０ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、好適な用量は、１ｍｇナノキャリア／ｋｇ体重、若しくは３ｍｇ／ｋｇ、若しくは５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ、若しくは２５ｍｇ／ｋｇ、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ、若しくは７５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１００ｍｇ／ｋｇ、若しくは１２５ｍｇ／ｋｇ、若しくは１５０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１７５ｍｇ／ｋｇ、又は２００ｍｇ／ｋｇであり得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物又はナノキャリアは静脈内投与され得る。

送達システム
核酸を細胞に送達するためのナノキャリアシステムも本明細書に記載される。送達システムは、（ａ）特にジスルフィド結合を介して（すなわち、リンカーを介して）樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合されたポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（本明細書に記載のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ）、及び（ｂ）核酸を含む。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、目的の遺伝子産物又はタンパク質をコードするＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡであり、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、又は目的のタンパク質、ペプチド、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチド配列である。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ）のナノ構造を使用することによって核酸のカプセル化を達成することができることを見出した。好ましい実施形態では、ナノキャリアはインビトロ送達に使用される。

本開示の送達ナノキャリアシステムは、Ｌｉｐｏ２Ｋ及びＰＥＩなどの市販のトランスフェクション剤と比較して、低い細胞毒性を有する。さらに、本明細書に開示される送達システムは、結合していないＤＰと比較して、樹状細胞又はマクロファージにおいて毒性効果を示さない。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーでのＰＥＧコーティングは、ＤＰの潜在的な毒性を抑制し得ると考えられる。

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇｅＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、又は組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、好ましくは、目的のタンパク質、ペプチド、又は治療標的をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター又は構築物であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡベクターであり得る。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、これが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」（又は単に「ベクター」）と称される。本発明で使用するのに好適なベクターは、目的のタンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に接続されたプロモーターを含む。ベクターという用語には、最も一般的に使用されるベクター形態である「プラスミド」が含まれる。プラスミドは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、該環状二本鎖ＤＮＡループには追加のＤＮＡセグメント（ペプチドをコードするものなど）が連結され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ミニサークルＤＮＡ（ｍｃＤＮＡ）ベクターである。ミニサークルＤＮＡベクターは、任意の細菌プラスミドＤＮＡ骨格を欠く環状発現カセットとして生成されるエピソーマルＤＮＡベクターである。例えば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ，ＭＮ５０１Ａ－１を参照のこと。その分子サイズが小さいことによって、より効率的なトランスフェクションが可能になり、数日間しか機能しない標準的なプラスミドベクターと比較して、数週間にわたる持続的な発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、異種骨格配列をさらに含む。本明細書で使用する場合、「異種核酸配列」とは、非ヒト核酸配列、例えば、細菌、ウイルス、又はヒトでは天然には見出されない他の非ヒト核酸配列を指す。異種骨格配列は、ベクターの増殖及び／又はコードされたペプチドの発現に必要であり得る。一般的に使用される多くの発現ベクター及びプラスミドは、非ヒト核酸配列、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、又は少なくとも１５，０００以上の長さ並びにすべて中間の長さのリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態のポリマー形態を指す。この文脈における「中間の長さ」とは、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの、記載された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は変異体は、本明細書に記載の参照配列又は当該技術分野で既知の参照配列と少なくとも又は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、典型的には、変異体は参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡ、又は治療薬をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、治療のための目的のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エキソンなどを含むポリヌクレオチド配列を指し得る。特定の実施形態では、「遺伝子」という用語は、ポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするゲノム配列と同一であるかどうかに関わらず、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、「遺伝子」という用語はｃＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、イントロンを含まず、人工的に生成され得る。

送達システムは、例えば、生理学的条件下で核酸とナノキャリア（すなわち、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ）とを混合することによって調製／充填することができる。

本明細書で使用する場合、「生理学的条件」という語句は、組織の細胞内液及び細胞外液において遭遇する可能性が高い化学的条件（例えば、ｐＨ、イオン強度）及び生化学的条件（例えば、酵素濃度）の範囲に関する。ほとんどの組織では、生理学的ｐＨは約７．０～７．４の範囲である。

送達システムは、所望の効果を達成するために必要な任意の好適な質量比のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ：核酸を含み得る。例えば、送達システムは、５：１～１３０：１の質量比（ｗ／ｗ）のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ：核酸を含み得る。例えば、質量比は、５：１、１０：１、１５：１、３０：１、５０：１、７５：１、１００：１、１１５：１、１２０：１、又は１３０：１であり得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ：核酸の質量比は、１５：１～１２０：１である。開示されたＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳを含む送達システムは、（Ｉ）細胞毒性がないこと、（ＩＩ）プラスミドなどの大きなカーゴを充填する能力、（ＩＩＩ）ヌクレオチドアジュバント環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（環状ＧＭＰ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰ）などの小さなカーゴを充填する能力、（ＩＶ）細胞相互作用及び生化学的相互作用を特定及び回避するためのナノキャリアの制御可能な表面化学、並びに（Ｖ）ペイロード放出を引き起こす受動的手段及び能動的手段の両方を含む、現在の送達方法に勝る利点を提供する。細胞毒性は、生物医学用途のための遺伝子送達ベクターの開発における主な懸念事項である。本明細書に開示される送達システムは、６０：１未満のＰＰＤＰ／ＤＮＡでは毒性効果を示さなかったが、１２０：１までのＰＰＤＰ／ＤＮＡの場合には最小限の毒性効果を示した（例えば、ＰＰＤＰ／ＤＮＡ＝１２０／１において細胞生存率＞８０％）（図２）。対照的に、結合していないＤＰは、５０：１の低いペプチド／ＤＮＡ重量比（ＤＰ／ＤＮＡ＝５０／１）でも低い細胞生存率をもらたす。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーを用いて形成されたナノ構造の細胞毒性は、現在市販されているトランスフェクション剤であるＬｉｐｏ２Ｋ（生存率７８％）及びＰＥＩ（ＰＥＩ／ＤＮＡ＝５：１では生存率４７％、及びＰＥＩ／ＤＮＡ＝１０：１では生存率２２％）よりもはるかに低かった。本発明者らは、驚くべきことに、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰのナノ構造中に見出されるＰＥＧコーティングがＤＰの潜在的な毒性を抑制することができることを見出した。

ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰに使用されるポリマーであるポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレンスルフィド）は、不活性であることが広く証明されている。好適には、ポリマーは、ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－リンカー－ＤＰであり、ｍ及びｎは、それぞれ１～５００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合（－ｓｓ－）である。

さらなる実施形態では、本開示は、担体、ＤＮＡ抗原又は免疫原、及びアジュバントを含む、ワクチン組成物を提供する。担体は、本明細書に開示されるＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマーのナノ構造であり得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、ワクチン組成物中の担体としてＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰナノ構造を使用することにより、目的の細胞へのＤＮＡ抗原又は免疫原の送達が増強され得る。

好適なアジュバントは当該技術分野で既知であり、該アジュバントには、スレオニルムラミルジペプチド（ＭＤＰ）（Ｂｙａｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、細胞壁骨格（ＣＷＳ）成分などのＲｉｂｉアジュバントシステム成分（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ；例えば大腸菌由来）、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。水酸化アルミニウム、サポニン、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ＡＡＨＳ）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、及びそれらの組み合わせなどの他の様々な周知のアジュバントもまた、本発明の方法及びワクチンで使用することができる。サイトカイン（ガンマ－ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦなど）、リンホカイン、及びインターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、１１－１８、１１－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、及び１１～２２）もワクチン組成物内のアジュバント及び／又は補助剤として使用されており、本発明の範囲内であることが企図される。例えば、１つ以上の異なるサイトカイン及び／又はリンホカインを本発明の１つ以上のペプチド又はワクチンを含む組成物に含めることができる。

本明細書で使用される「抗原」又は「免疫原」という用語は、適切な量（「免疫原として（immunogenically）有効な量」）、すなわち、細胞性免疫応答及び/若しくは体液性免疫応答を単独で若しくは組み合わせで誘導、誘発、増大、若しくは増加することができる量で投与された場合（若しくは投与された核酸、例えば、ＤＮＡワクチンによってインビボで発現された場合）、又は（１回若しくは数回の間隔で投与することができる）別の物質に連結若しくは融合させた場合、「抗原性」又は「免疫原性」であるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含む化合物又は組成物を指す。免疫原性組成物は、少なくとも約５アミノ酸の抗原ペプチド、長さ１０アミノ酸のペプチド、長さ１５アミノ酸、長さ２０アミノ酸以上のポリペプチド断片を含むことができる。免疫原は、ワクチンベクターから組換え発現させることができ、ワクチンベクターは、プロモーター、例えば、発現カセットに作動可能に連結された免疫原のコード配列を含む裸のＤＮＡであり得る。

方法
本開示はまた、いくつかの実施形態では、細胞に核酸を送達する方法であって、本明細書に開示される送達システムを細胞と接触させるか又は細胞に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、核酸はＤＮＡである。特定の実施形態では、細胞は免疫細胞である。特定の実施形態では、細胞は樹状細胞である。別の実施形態では、細胞はマクロファージである。

さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドを細胞に送達する非毒性インビトロ方法が提供される。方法は、培養物中の細胞を、本明細書に記載のナノキャリアシステム（例えば、樹状ペプチド（ＤＰ）に共有結合されたＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎを含むナノキャリア及びポリヌクレオチドを含む）と接触させることと、細胞がナノキャリアシステムを取り込んでポリヌクレオチドを細胞に送達するのに十分な時間にわたって細胞を培養することとを含む。いくつかの実施形態では、接触ステップ及び培養ステップの両方が血清を含む培養培地中で行われる。これは、培養条件に非常に感受性が高い樹状細胞を含む免疫細胞に重要である。

いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞である。好適な免疫細胞は当該技術分野で既知であり、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞などが含まれる。

「樹状細胞」又は「ＤＣ」は、哺乳動物の免疫系の抗原提示細胞である。ＤＣは、抗原物質を処理して、その表面上に該抗原物質を免疫系のＴ細胞に提示する機能を有し、自然免疫系と獲得免疫系との間のメッセンジャーとして機能する。ＤＣは、活性化時にＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの抗原提示に必要な分子を高レベルで発現し、免疫応答の開始に非常に有効である。ＤＣは、粘膜組織を含む体全体に分布しており、該粘膜組織では上皮細胞障壁の下に見出される。ＤＣは、適応免疫応答の進行性の低下、忍容性の喪失、及び慢性炎症の発症において役割を果たすことが見出されている。樹状細胞は、正常な動脈壁及びアテローム性動脈硬化病変内に存在し得る。

本開示は、いくつかの実施形態では、免疫細胞をトランスフェクトしてポリヌクレオチド配列を免疫細胞の核に送達する方法であって、ポリヌクレオチド配列を免疫細胞の核に送達するのに十分な時間にわたって免疫細胞を本明細書に開示されるシステムと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はインビトロにある。いくつかの実施形態では、免疫細胞はインビボにある。

「形質導入された」又は「トランスフェクトされた」という用語は、外因性ポリヌクレオチドが細胞に導入される能力、特に細胞の核に導入される能力を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞の核内で転写及び翻訳されたときにタンパク質を発現することができる。

「形質導入された」又は「トランスフェクトされた」細胞は、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される配列を含む核酸（プラスミド）で形質導入されたときに、タンパク質及び／又は転写物を産生することができる。さらに、このような細胞は、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される目的の遺伝子をコードするプラスミドなどのポリヌクレオチド配列で形質導入されたときに、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される配列を含む遺伝子を含むベクターを生成することができ、これにより目的のベクターが生成される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは治療薬をコードする。

本開示はまた、いくつかの実施形態では、遺伝子治療を必要とする対象を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の送達システムを対象に投与することを含み、送達システムが遺伝子治療のための目的の遺伝子を含む核酸を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドを含む送達システムは、目的の遺伝子又は目的の疾患に関連する遺伝子などの１つ以上の目的の遺伝子の制御を破壊するか又はその制御を可能にするために、１つ以上の目的の細胞種又は組織種に投与（又は導入）される。

本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、状態又は疾患状態を現在経験しているか又は患っている対象における特定の状態、疾患状態、又はその症状の量又は重症度を軽減することを指す。この用語は、必ずしも完全な治療（例えば、状態、疾患、又はその症状の完全な除去）を示すものではない。「治療」は、疾患（例えば、ヒトを含む哺乳動物における）のための治療薬又は技術の任意の投与又は適用を包含し、疾患の阻害、その発症の阻止、疾患の軽減、退行を生じさせること、又は機能の喪失、欠落、若しくは欠陥の回復若しくは修復、あるいは非効率なプロセスの刺激を含む。

「対象」又は「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される哺乳動物、好ましくはヒトを指す。「哺乳動物」とは、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタなどの家畜（farm animal）、ウサギ、イヌ、及びネコなどの家畜（domestic animal）、ラット、マウス、及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含むがこれらに限定されない、哺乳綱の任意のメンバーを意味する。好ましくは、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物である。「対象」という用語は、特定の年齢又は性別を指すものではない。特定の一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。好適な実施形態では、対象は、遺伝子治療を必要とするヒトである。

本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、又は「有する」という用語、及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される要素及びその等価物、並びに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「含む（including）」、「含む（comprising）」、又は「有する」と記載された実施形態はまた、それらの特定の要素「から本質的になる」及び「からなる」と考えられる。

本明細書で使用する場合、「約」は、記載された濃度範囲の５～１０％以内、又は記載された数値の５～１０％以内を意味する。

当業者には、本発明の趣旨から逸脱することなく、既に記載したもの以外の多くの追加の変更が可能であることが明らかである。本開示を解釈する際には、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広範な方法で解釈されるべきである。「含む」という用語の変形は、非排他的に要素、成分、又はステップを指すとして解釈されるべきであり、したがって、言及された要素、成分、又はステップは、明示的に言及されていない他の要素、成分、又はステップと組み合わされてもよい。特定の要素を「含む」と言及される実施形態はまた、それら「から本質的になる」及び「からなる」ことが企図される。「から本質的になる」及び「からなる」という用語は、ＭＰＥＰ及び関連する連邦巡回裁判所の解釈に沿って解釈されるべきである。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特定の材料又はステップ及び請求項に記載された発明の「基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。「からなる」は、特許請求の範囲で特定されていない要素、ステップ、又は成分を除外するクローズド（closed）用語である。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素の「いずれか又は両方」、すなわち、いくつかの場合には連繋的に（conjunctively ）存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて列挙されている複数の要素は、同じ様式で解釈され、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」と解釈される必要がある。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素に関連するか又は無関係であるかにかかわらず、他の要素が任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープエンド（open-ended）語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみを指してもよく（任意選択でＡ以外の要素を含む）、Ｂ）別の実施形態では、Ｂのみを指してもよく（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）を指してもよいなどである。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される「又は」は、上記で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解する必要がある。例えば、列挙中の項目を区切っている場合、「又は」又は「及び／又は」は包含的であり（inclusive）、すなわち、いくつかの要素又は要素の列挙のうちの少なくとも１つを含むだけでなく２つ以上を含み、任意選択で、追加の列挙されていない項目を含むと解釈される必要がある。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちのちょうど１つ」、又は特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」など、反対のことが明確に示された用語のみが、いくつかの要素又は要素の列挙のうちのちょうど１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちのちょうど１つ」などの排他性の用語が前に付いている場合にのみ、排他的選択肢（すなわち「どちらか一方であるが両方ではない」）を示すものとして解釈される。

本発明を１つ以上の好ましい実施形態に関して記載してきたが、明示的に述べられたもの以外にも多くの等価、代替、変形、及び変更が可能であり、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。

以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを何ら意図するものではない。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な変更は、上記の記載及び以下の実施例から当業者に明らかになるであろうし、添付の特許請求の範囲内に含まれる。

実施例１
遺伝子工学の最近の進歩により、がん免疫療法^［１］、抗ウイルス療法^［２］、及びＤＮＡワクチン^［３］、並びに非医療用途^［４］に比類のない機会がもたらされている。ゲノム編集の分野では多数の治験が進行中であるにもかかわらず、成功した遺伝子治療製品は非常に限られている^{［５～７］}。これは主に、標的細胞への送達後の核酸の効果的な発現をめぐる課題に因るものである。さらに、効率的なＤＮＡ送達システムは、酵素分解からの保護、細胞内在化、エンドリソソームからの脱出、サイトゾルのカーゴ放出などのいくつかの障害も克服する必要がある。プラスミドベースの遺伝子治療は、一体型（all-in-one）のプラスミドアプローチを使用した安定したゲノム編集のためにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９^{［８～１０］}を送達することができる有望なトランスフェクション戦略である^［１１］。しかしながら、裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、その負電荷、酵素分解の影響を受けやすいこと、ウイルスベクターを介した送達を制限する分子サイズが大きいこと、合成ナノテクノロジーにおけるカプセル化効率が低いことなどにより、細胞への取り込みに多くの障害を有している^{［１２，１３］}。

天然の遺伝子送達媒体として、ウイルスは遺伝子発現に関して先例のない性能を発揮する。しかしながら、挿入突然変異誘発^［１５］、特有の免疫原性^［１６］、及びウイルス成分に対する既存の宿主抗体^［１７］などの様々な問題^［１４］により、臨床環境での有効性及び有用性が低下し得る^［１８］。重要なことに、限られたＤＮＡ担持能力（＜８ＫＢ）^［１９］及び製造上の課題^{［２０～２３］}が、ウイルスベースのベクターにさらなる制限を課している。したがって、脂質、ポリマー、ペプチド、及び無機ナノ材料を含む非ウイルスベクター及び合成担体は、免疫原性が限定的であること、柔軟なパッケージング能力、スケーラブルな製造方法への順応性、及びトランスフェクション効率の改善のための細胞内送達の多様な機構へのアクセス^{［１３、２４～２６］}に起因して、ますます注目を集めている。しかしながら、既存の材料は依然として、非効率的なエンドソーム脱出、重大な毒性、及び低い遺伝子トランスフェクション／細胞発現などの課題に直面している。低いトランスフェクションの問題は、特定の細胞種、特にワクチン接種及びがん免疫療法を含む様々な治療用途の標的として強く望まれている免疫細胞に特に問題となる。例えば、カチオン性脂質は、ほとんどの不死化細胞株における核酸送達に最も広く使用されている非ウイルスベクターであるが、多くの血液細胞及び免疫細胞は依然として扱いにくいままである^［２７］。脂質ベースの技術は別として、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの多くのポリマートランスフェクション試薬は、細胞毒性の懸念に長い間悩まされてきた^{［２８～３０］}。したがって、毒性の増加を伴うことなく、トランスフェクションが困難な細胞、特に標準的な培養条件下で初代細胞及び免疫細胞に核酸を送達することができる代替技術に対する高い需要が存在する。

樹状又は分岐カチオン性ペプチドは、複数の官能基を備えた三次元（３Ｄ）構造を有し、これらは負に帯電した核酸の送達に好適なものとなる^{［３１，３２］}。樹状構造は、線状ＤＮＡ結合ペプチドと比較して、ペプチドとＤＮＡとの相互作用を大幅に増強し、カーゴパッキングを大幅に改善し、様々な細胞種においてトランスフェクション効率を高めることが報告されている^［３３］。特に、分子量、分岐単位の官能性、及び電荷分布を含む様々なパラメータが、樹状ペプチドの活性及び生体適合性に影響を与える^{［３２、３４～３７］}。特に、分子量と電荷との比が低く、かつ、電荷が樹状構造全体に分布している第３世代のペプチドデンドリマーは、ＤＮＡ送達に最良のトランスフェクション試薬であることが実証されている^［３６］。その潜在力にもかかわらず、カチオン性ペプチドデンドリマーは、主に静電相互作用によって核酸と複合体を形成し、該複合体は単独で使用した場合に一般に血清中で不安定であり、潜在的な細胞毒性の懸念を伴いため^［３８］、遺伝子治療での適用が制限される。

本実施例では、カチオン性樹状ペプチド（ＤＰ）ブロックの組み込みを介したプラスミドＤＮＡの効率的なサイトゾル送達のために操作された自己集合ブロックコポリマーナノキャリアを使用した、新規な遺伝子送達システムの開発を実証する（図１）。我々は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（硫化プロピレン）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）ナノキャリアが、マクロファージ及び樹状細胞を標的化する優れた能力を有し^{［３９～４１］}、多様なペイロードを細胞内に送達できることができ^{［４２～４９］}、ヒト血液中では非免疫原性であり^［５０］、非ヒト霊長類^［５１］、ヒト化マウス^［５２］、及び多様なマウス疾患モデルにおいて非炎症性及び非毒性の両方である^［３９］ことを実証した。

本研究は、正に帯電した領域を利用して遺伝子を運搬するキャプシドタンパク質を有する天然ウイルスによって動機づけられ、これは、疎水性領域間の非共有結合相互作用によって主に安定化されているより高次のタンパク質フレームワーク／構造内にこの遺伝物質をカプセル化している^{［５３～５５］}。我々は、疎水性ＰＰＳ膜の高い安定性並びにＰＥＧ及び樹状ペプチドブロック間の体積差により、自己集合したＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳナノキャリアの内部に大きな遺伝要素を隔離保持することができることを実証する。

樹状ペプチド（ＤＰ）は、第３世代を有し、かつ、遺伝子と相互作用するための正に帯電したアルギニン（Ｒ）、緩衝能を有するヒスチジン（Ｈ）、及びエンドソーム脱出を促進するための膜結合能を有する親油性ロイシン（Ｌ）、並びに官能性単位分岐のためのリジンで構成されている各単位を有する。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーは、ナノ構造を安定化するためのＰＰＳの疎水性部分だけでなく、細胞への取り込みを増強し、かつ、毒性を軽減するための親水性ＰＥＧコロナも提供する。ＰＰＳとＤＰとの間に生体内還元性ジスルフィド結合を組み込むことにより、還元性細胞内環境におけるエンドソーム脱出及びカーゴ放出が改善されるため、遺伝子送達効率が向上し得る。

ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳコポリマーを、システインリンカーを使用して機能性カチオン性ＤＰで修飾した（ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｓｓ－ＤＰ、ＰＰＤＰ）（図１）。ＤＰの各単位は、官能性単位分岐のためのリジン、膜への結合を助け、エンドリソソームコンパートメントからの脱出を促進するための親油性ロイシン^［５６］、緩衝能力を有し、エンドソーム膜の破壊を助けるためのヒスチジン残基^［５６］、及び負に帯電したＤＮＡと安定して相互作用するためのアルギニンから構成されている。アルギニン残基は、細胞外環境（内在化する前）及び細胞内在化後にエンドリソソーム経路内で遭遇するすべてのｐＨ条件で正に帯電しているため、多様な条件下でアニオン性核酸と相互作用する。我々の技術のペプチド態様に加えて、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーは、遺伝子送達のための複数の有用な特徴に寄与する。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳは、ナノ構造を安定化し、かつ、酸性エンドリソソームコンパートメント内での分解を可能にする疎水性ＰＰＳブロックを介して、酸化感受性を提供する^{［４２、４３、４６、４７、４９］}。親水性メトキシ末端化ＰＥＧコロナは、生体適合性を改善し、かつ、毒性を軽減するように機能する^{［５０，５１］}。さらに、還元性細胞内コンパートメント内のＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳナノキャリアからのＤＰ結合ｐＤＮＡの放出を改善するために、ＰＰＳの末端とＤＰとの間に生物学的に還元可能なジスルフィド結合を組み込んだ。

自己集合ＰＰＤＰポリマーのライブラリーを合成し、遺伝子送達のための非ウイルスナノベクターとしての機能を徹底的に調べた。細胞トランスフェクション実験を主な市販製品であるリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２Ｋ）に対してベンチマークした。さらに、我々の遺伝子送達プラットフォームが様々なＤＮＡカーゴサイズと適合性があるかどうかを理解するために、小さなＤＮＡプラスミド（Ｓ－ｐＤＮＡ；ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ、４．６ｋｂ）及び大きなＤＮＡプラスミド（Ｌ－ｐＤＮＡ；ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７ｋｂ）のトランスフェクション効率を調べた。モデル免疫細胞種としてマクロファージにおけるＰＰＤＰ媒介トランスフェクション性能の包括的なスクリーニングを行った後、最高性能のナノベクターの配合を最適化し、一連の多角的な研究においてその機能の作用機序の詳細を解明する。最後に、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、並びにＴ細胞及び初代骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を含むトランスフェクションが困難な様々な免疫細胞種類において、最適なＰＰＤＰナノベクターの有効性を評価する。

ＤＰと結合されたＰＥＧ－ＰＰＳポリマー（ＰＰＤＰ）は、水性緩衝液中で単に混合することによって、プラスミドＤＮＡを有する安定なナノ構造に組み立てられる。我々は、ＰＰＤＰが疎水効果の増加に加えて、静電相互作用によりＤＮＡのカプセル化を増強し得ると仮説を立てた。遺伝子トランスフェクションに対するＰＰＤＰの疎水性効果を調べるために、様々な疎水比を有し、ＤＰと結合したＰＥＧ－ＰＰＳポリマーのファミリーを合成した。スクリーニング研究により、最適化されたＰＰＤＰナノ構造は、リポフェクタミン２０００などの主な市販製品のＤＮＡ送達効率と比較して、初代骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を含む様々な細胞種において優れたＤＮＡ送達効率を達成したことが明らかになった。さらに、我々の遺伝子送達システムにより、６．４ｋｂ～１１．７ｋｂの範囲のプラスミドＤＮＡの効率的なサイトゾル送達が可能になった。したがって、この遺伝子送達システムは、生物医学研究及び治療用途のための効率的な遺伝子工学を可能にする優れたプラットフォームとして機能し得る。

結果及び考察
ＰＤＰの調製及び特性評価
分子量及び疎水性が様々な細胞種における遺伝子送達にどのような影響を与えるかを調べるために、７５０又は２０００の異なるＰＥＧ分子量及び２０～８０の様々なＰＰＳ長を有する６つのＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳジブロックコポリマーを、厳密な無水条件下でのイオン重合により（図６）。ピリジルジスルフィドでエンドキャップされたＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎポリマー（ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｐｄｓ）をＮＭＲ及びＧＰＣによって特性評価し検証した（図１３）。次いで、ジスルフィド交換反応により、システイン含有ＤＰをＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎ－ｐｄｓと結合させた（図１６）。この研究での命名を簡略化するために、表１に示すように、様々な分子量及び疎水性を有するＰＥＧ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰポリマーをＰＰＤＰ２～ＰＰＤＰ７と称した。

ポリマーのＤＮＡカプセル化能力を調べるために、最初に、様々な重量比（ＰＰＤＰ：ＤＮＡ＝１：１～１２０：１）でＰＰＤＰ溶液をＤＮＡ溶液に混合することによってＤＮＡ－ＰＰＤＰ複合体を配合した（図１７）。ＤＮＡ－ＰＰＤＰ複合体の形成及び安定性をゲル遅延アッセイによって評価した（図１５）。このアッセイでは、安定して形成されたＤＮＡ－ＰＰＤＰ複合体は充填ウェルに残るが、結合していないＤＮＡはアガロースゲルの下に移動する。ポリマー結合を有しないＤＰ（ＤＰ１）及び一連のＰＰＤＰポリマー（ＰＰＤＰ２～ＰＰＤＰ７）を、ポリマーとＤＮＡとの様々な重量比でＰＢＳ中のＤＮＡと混合した。遺伝子送達を成功させるには、酵素／ヌクレアーゼの細胞外又は細胞内環境から核酸を保護することが重要である。良好にカプセル化されたＤＮＡはＥｔＢｒによる染色から保護することができる。したがって、ゲル遅延アッセイは、ナノ構造による環境からのＤＮＡ保護に関する情報も提供することができる。図２は、１５：１超のポリマー／ＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰナノ構造により、ＤＮＡ移動が完全に遅延されることを示している。より重要なことに、ポリマー／ＤＮＡ比の増加に伴ってＤＮＡ蛍光が徐々に減少し、より多くのポリマーに伴ってＤＮＡカプセル化が増強されたことを示唆している。注目すべきことに、同じポリマー／ＤＮＡ比では、ＤＮＡ－ＰＰＤＰ２がウェル中で最も低いＤＮＡ蛍光強度を示し、最良のＤＮＡの結合能力及び保護を提供することを示している。遺伝子のカプセル化及び保護以外に、ＤＮＡ－ナノベクター複合体のサイズも細胞への取り込みに不可欠である（図１５ｃ及び１５ｄ）。

ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体の流体力学的サイズをＤＬＳによって決定した。ＰＰＤＰライブラリーは、水溶液中で単に混合することによって、安定したナノ構造へと自己集合した。ＰＰＤＰポリマーのサイズ分布及びゼータ電位を動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって測定した。ＰＰＤＰ２～ＰＰＤＰ７ポリマーから形成されたナノ構造では、ポリマー変形物のＰＥＧ分子量及びＰＰＳ長の異なる組み合わせに応じて、サイズ（約２０～３０ｎｍ）及びゼータ電位（約１０～４０ｍＶ）が異なっていた。さらに、シンクロトロン放射光を使用して実施した小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）により、球状のコアシェル形態の存在が実証された。

細胞毒性は、生物医学用途のための遺伝子送達ベクターの開発における主な懸念事項である。様々な重量比でＤＮＡと複合体を形成したＰＰＤＰナノ構造の細胞毒性をＲａｗ２６４．７マクロファージにおいて評価した。ＭＴＴアッセイにより、ＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体は６０：１未満のＰＰＤＰ／ＤＮＡでは毒性効果を示さないが、ＰＰＤＰ／ＤＮＡが１２０：１までの場合は最小限の毒性効果を示すことが実証された（例えば、ＰＰＤＰ／ＤＮＡ＝１２０／１では細胞生存率＞８０％）（図２、図７、図１８）。しかしながら、ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーが結合していないＤＰは、５０：１の低いペプチド／ＤＮＡ重量比でも低い細胞生存率を示した。ＰＰＤＰナノ構造の細胞毒性は、市販のトランスフェクション剤Ｌｉｐｏ２Ｋ（生存率７８％）及びＰＥＩ（ＰＥＩ／ＤＮＡ＝５：１での生存率４７％、及びＰＥＩ／ＤＮＡ＝１０：１での生存率２２％）よりもはるかに低かった。すべてのデータは、ＰＰＤＰにＰＥＧコーティングを組み込むことによってＤＰの潜在的な毒性を抑制し得ることを示唆している。

ＰＰＤＰナノ構造による遺伝子送達－マクロファージにおけるＰＰＤＰトランスフェクション性能及び細胞毒性のベンチマーク
ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は、Ｌｉｐｏ２Ｋよりも有意に高いトランスフェクション効率及びレポータータンパク質発現レベルを達成する。

遺伝子送達ビヒクルとしての各ＰＰＤＰナノベクターの性能を評価するための、培養ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける一連のスクリーニング。製造元の推奨に従って業界標準のＬｉｐｏ２Ｋを使用したトランスフェクションを使用して、ＰＰＤＰプラットフォームの性能をベンチマークした。さらに、ＰＰＤＰによって様々なサイズ範囲のｐＤＮＡのトランスフェクションが可能になるかどうかを理解するために、２つの異なる分子量のプラスミドを使用してスクリーニングを行った。ＰＰＤＰナノ構造の遺伝子送達能力を評価するために、小さなＤＮＡシステムとしての４．７Ｋｂのサイズを有するＣＭＶプロモーターによって駆動される蛍光（ｄｓＲｅｄ又はＥＧＦＰ）（図３Ａ、図２４、図２１ａ、例えば、Ｓ－ｐＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ、４．６ｋｂ）を小さいプラスミドモデルとして使用し（図２４、ａ～ｃ；）、大きなＤＮＡシステムとしての１１．７ｋｂのサイズを有するＥＦＳプロモーターによって駆動されるＲＦＰタグ付きＣＲＩＳＰＲ（図４Ａ、図２１ｄ、Ｌ－ｐＤＮＡ（ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ、１１．７ｋｂ）を、ＥＦＳ（伸長因子１αショート（(elongation factor 1α short)）プロモーターを含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質と一緒にＲＦＰを共発現する、大きなプラスミドのモデルとして使用した（図２４、ｄ～ｆ；）。

ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡ複合体は、予め形成されたＰＰＤＰナノ構造をプラスミドとともに穏やかにピペッティングし、続いて室温で３０分間混合することによって形成された。血清を補充した培地において、様々なＰＰＤＰナノ構造、樹状ペプチド対照、及びＬｉｐｏ２Ｋ対照を使用したｐＣＭＶ－ｄｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）でＲＡＷ２６４．７マクロファージをトランスフェクトした。４８時間後、フローサイトメトリーを使用して、トランスフェクトされた細胞の割合及び蛍光導入遺伝子の発現を含むトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクションの程度を理解するために、プラスミドにコードされる蛍光タンパク質の発現レベルも定量化した（図２４ｃ、ｆ；）。遺伝子トランスフェクション効率は、マクロファージにおけるＰＰＳ含有量が増加するにつれて増加した。図３Ｂ及び図８Ａにおいて、ＰＰＤＰ２を使用したｐＣＭＶ－ｄｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）のトランスフェクション効率は、ＰＰＤＰ５及び他のＰＰＤＰナノ構造を使用した場合よりも有意に高く、ｄｓＲｅｄ陽性細胞の４５．３％がＤＮＡ－ＰＰＤＰ２でトランスフェクトされたが、ｄｓＲｅｄ陽性細胞の２５％がＤＮＡ－ＰＰＤＰ５でトランスフェクトされた（ｐ＜０．０１）（図２４ｂ）。マクロファージにおけるｐＣＭＶ－ｄｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）のトランスフェクションでは、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は、市販のトランスフェクション剤Ｌｉｐｏ２Ｋよりもはるかに効率的であった（ｐ＜０．００１）。小さいサイズのプラスミドと比較して、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は両方とも、非常に大きなｐＥＦＳ－ＲＦＰプラスミドＤＮＡ（１１．７ｋｂ）を送達することについて堅牢性を示し、マクロファージにおいてそれぞれ４７％及び４０％の高いトランスフェクション効率であった（図４Ｂ、図１０Ａ）。特にかつ驚くべきことに、ＰＰＤＰ２のトランスフェクション効率はＬｉｐｏ２Ｋよりも約１０倍高かった（４．８％、ｐ＜０．０００１）。ＰＰＤＰ２によるｐＥＦＳ－ＲＦＰでトランスフェクトされたマクロファージにおいて、Ｌｉｐｏ２Ｋと比較して、より多くのＲＦＰタンパク質発現をＣＬＳＭを使用してさらに確認することができる（図４Ｃ、図１１Ａ）。ＰＰＤＰ２（８０）及びＰＰＤＰ５（７４）の疎水性ＰＰＳの長さが他のＰＰＤＰよりも長いことを考慮すると、これらの結果は、疎水性がＰＰＤＰポリマーによる遺伝子送達において重要な役割を果たしているという我々の仮説を裏付けている。ｐＣＭＶ－ｄｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）及びｐＥＦＳ－ＲＦＰ（１１．７Ｋｂ）トランスフェクションのための最適なＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体組成は、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５の両方で同じであった（６０：１のポリマー／ＤＮＡ重量比）（図３Ｃ～Ｄ、図８Ｂ～Ｃ、図４Ｄ～Ｅ、図１０Ｂ～Ｃ、図２２）。したがって、他の細胞種への遺伝子送達の能力を検証するために、ポリマー対ＤＮＡ重量比が６０：１であるＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５を選択した（図２３）。ＰＰＤＰ２は、より大きなＬ－ｐＤＮＡプラスミドを使用したこれらの研究においても、Ｌｉｐｏ２Ｋ及び他のすべてのＰＰＤＰ構築物よりも有意に良好な性能を示し、有意に高いＲＦＰレポーター発現レベルを達成した。

潜在的なＤＮＡ送達媒体としてのＰＰＤＰ２／ＰＰＤＰ５の幅広い適用性を検証するために、様々な細胞株における様々なサイズのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを決定した（図１９、図２０）。ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞では、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５はそれぞれ６９．６％及び５７．５％のトランスフェクション効率を示し、これらはＬｉｐｏ２Ｋの１２％のトランスフェクション効率よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図４Ｆ、図１２Ａ）。４８時間後には、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏ２ＫよりもＤＮＡ－ＰＰＤＰ２によってトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞においてより明るいＲＦＰ蛍光発現も見られた（図４Ｇ、図１１Ｂ）。

免疫調節の特有の役割により、遺伝子操作されたＤＣは、がん及び感染疾患における次世代ワクチンの潜在的に強力な戦略であることが示されている。しかしながら、ＤＣベースの治療の進歩は、初代ＤＣの遺伝子操作における課題によって妨げられている。図３Ｅ～Ｆに示すように、マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の初代細胞をＰＰＤＰ２によるｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ（４．６ｋｂ）でトランスフェクトし、ＰＰＤＰ５によって１９．６％及び１３．８％のＧＦＰ^＋細胞が得られ、これは、Ｌｉｐｏ２ＫによってトランスフェクトされたＧＦＰ^＋細胞の６．８％よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１）。強力な市販のトランスフェクション試薬による初代免疫細胞における大きなＤＮＡのトランスフェクションはより困難であるが、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は、裸のプラスミドＤＮＡ（ｐ＜０．００１）及びＬｉｐｏ２Ｋ（ｐ＜０．００１）と比較して、大きなプラスミドＤＮＡ（ｐＥＦＳ－ＲＦＰ、１１．７ｋｂ）の送達及びトランスフェクションを劇的に改善することができた（図４Ｈ～Ｉ、図１２Ｂ）。さらに、同じ用量のプラスミド及びポリマーでは、ＰＰＤＰ２は、大きなｐＥＦＳ－ＲＦＰの送達に対して３０．７％のＲＦＰ陽性細胞をもたらし、ＰＰＤＰ５（ＲＦＰ^＋の１８．７％）よりも有意に高いトランスフェクション効率であった。

エンドソーム脱出及びＤＮＡのサイトゾル送達
効率的な遺伝子送達システムには、エンドソーム脱出及びＤＮＡのサイトゾル送達の成功が重要であることは注目に値する。ナノ構造の中で最良のトランスフェクション能力のため、ＰＰＤＰ２を選択してＤＮＡカーゴの内在化及び局在化を調べた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ＤＮＡ（４８８－ＤＮＡ）ＰＰＤＰ２ナノ複合体の細胞内輸送は、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）イメージングを使用して、様々な時点でのナノ複合体の細胞内分布を視覚化することによって特性評価した。図５に示すように、マクロファージとともに１時間インキュベートした後、４８８－ＤＮＡの蛍光（緑色）がサイトゾルにおいて観察され、あるレベルのエンドソーム／リソソーム（黄色）との共局在が認められ、４８８－ＤＮＡ－ＰＰＤＰ２ナノ複合体の効率的なエンドソーム脱出が示唆された。インキュベーション時間がより長くなるにつれて（４時間及び１８時間）より多くのナノ複合体がサイトゾルに放出され、一部は依然として内部及びエンドソーム／リソソーム小胞に捕捉され、このことはエンドソームから脱出するナノ複合体が時間依存性であることを示している。

ＰＰＤＰプラットフォームは、市販のＬｉｐｏ２Ｋ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）試薬よりも細胞毒性が低い。
様々な重量比で調製したＰＰＤＰ／ＰＤＮＡナノ複合体の細胞毒性をＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞において調べた（図２５、ａ～ｂ）。３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して、ＰＰＤＰ／ＰＤＮＡナノ複合体の細胞毒性を検査した。これらの毒性研究は、主な市販トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏ２Ｋ及びカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーの両方に対してベンチマークした。ＰＥＩ（２５ＫＤＡ）は、既知の毒性の懸念を有する広く使用されているポリマートランスフェクション試薬であるため、対照として含めた^{［２８～３０］}。

ＰＰＤＰ／ＰＤＮＡナノ複合体は一般に、重量比６０：１（ＰＰＤＰ：Ｓ－ＰＤＮＡ及びＬ－ＰＤＮＡの両方）の下では非毒性（細胞生存率＞８０％）であったが、１２０：１のＰＰＤＰ／ＰＤＮＡ比を有するナノ複合体では細胞生存率がより低かった。（図２５、ａ～ｂ）。しかしながら、ペプチド／Ｓ－ｐＤＮＡの重量比が６０：１未満であっても、結合していないＤＰペプチドにおいても細胞生存率の低下が観察された。これらの結果は、ＤＰをＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳコポリマーに結合させることによってペプチドの毒性が有意に低下することを示唆している。重要なことに、ＰＰＤＰ／ＰＤＮＡナノ複合体の細胞毒性は市販のポリマートランスフェクション剤ＰＥＩよりもはるかに低かった（図２５、ａ～ｂ）。大きいプラスミド及び小さいプラスミドの両方において、ポリマー対ＰＤＮＡの比が６０：１までのＰＰＤＰ２では高い（約９０～１００％）細胞生存率が観察され、一般にＰＰＤＰ５よりも低い細胞毒性であった（図２５、ａ～ｂ）。

総合すると、スクリーニング研究の結果は、ＰＰＤＰ２およびＰＰＤＰ５が工業標準のトランスフェクション試薬を上回る技術であることを実証している。他のより毒性の高いＰＰＤＰポリマー変形物と比較してＰＰＤＰ２（８０単位）及びＰＰＤＰ５（７４単位）の疎水性ＰＰＳの長さがより長いことを考慮すると、疎水性の増加は、おそらく複合体の構造及び／又は安定性を調節することによって毒性の低減に役割を果たしている可能性がある。これらの初期のスクリーニング作業（ＥＦＦＯＲＴ）からＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５が見出されたことにより、これらのプロトタイプにその後の開発作業の焦点を当てた。進行中の研究では、ＰＰＤＰ２ナノベクターがＰＰＤＰ５を含む他のすべてのプロトタイプの性能を大幅に上回ったため、ＰＰＤＰ２ナノベクターが強調された（図２４ｃ、ｆ、ｇ）。さらに、ＰＰＤＰ２は、ＰＰＤＰ５よりもさらに低い細胞毒性を示しながら、より高いレベルで機能した（図２５）。

プラスミドＤＮＡ結合能力のためのＰＰＤＰポリマーの最適化－６０：１のポリマー対プラスミド比で形成されたＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体は、ｐＤＮＡに最適に結合し、安定したナノ構造を形成する。
ポリマーがプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）に結合して強度を増す能力を調べるために、次に、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用してＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体の形成及び安定性を調べた。このアッセイでは、電場を印加して電気泳動を開始すると、ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体が安定である場合にはＤＮＡはゲルのウェル中に残る。一方、ナノ複合体が不安定な場合、結合していないｐＤＮＡは、電場の存在下でアガロースゲルを下って正極に向かって移動する。最適に機能するために異なるプラスミドサイズが異なるポリマー対プラスミド比を必要とするかどうかを理解するために、これらの研究では、小さいプラスミド（Ｓ－ｐＤＮＡ、４．６ｋｂ）及び大きいプラスミド（Ｌ－ｐＤＮＡ、１１．７ｋｂ）の両方を使用した。ＥＭＳＡ実験のために、様々なポリマー対ｐＤＮＡの重量比（ＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ＝１：１～１２０：１）でＰＰＤＰとｐＤＮＡとを組み合わせることにより、ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡ複合体を配合した（図１５、ａ～ｂ）。

ｐＤＮＡの移動は、１５：１より大きいポリマー／ｐＤＮＡ重量比を有するＰＰＤＰナノ構造によって完全に妨げられた（図１５、ａ～ｂ）。特に、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）核酸染色に対するｐＤＮＡのアクセス容易性はポリマー／ｐＤＮＡ比の増加とともに徐々に低下し、このことは、よりコンパクトなナノ構造では、コポリマーの相対量の増加に応じてｐＤＮＡ結合が増強されたことを示唆している（図１５、ａ～ｂ）。これらの結果は、ＰＰＤＰポリマーがＳ－ｐＤＮＡ（図１５ａ）及びＬ－ｐＤＮＡ（図１５ｂ）に結合することができることを立証している。注目すべきことに、ＰＰＤＰ２／ｐＤＮＡ及びＰＰＤＰ５／ｐＤＮＡは、ウェル中で６０：１の重量比（ＰＰＤＰ：Ｓ－ｐＤＮＡとＬ－ｐＤＮＡの両方）で最も低いｐＤＮＡ蛍光強度を示し、最適なｐＤＮＡ結合能力を示した。

次に、粒子サイズ及びゼータ電位に対するＰＰＤＰポリマー対ｐＤＮＡの質量比の影響を調べた（図１５、ｃ～ｄ）。この比率が増加するにつれて、ナノ複合体のサイズは増加し、ゼータ電位はより正になった（図４、ｃ～ｄ）。ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡ比が１：１から６０：１に増加するにつれて、ナノ複合体は負の電荷から、中性、さらに正の電荷になった。ＥＭＳＡの結果（図１５、ａ～ｂ）、サイズ及びゼータ電位の特性評価（図１５、ｃ～ｄ）、並びに細胞毒性研究（図２５）に基づいて、さらなる遺伝子トランスフェクション研究のために６０：１の最適な比率を選択した。極低温透過電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＴＥＭ）によって観察されるように、Ｓ－ｐＤＮＡ又はＬ－ｐＤＮＡのいずれかを含む場合、６０：１ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体は球状かつ単分散のナノ構造であることが観察された（図１５、ｅ～ｆ；）。

本明細書に記載されるナノキャリアの直径及びゼータ電位は、広範囲のゼータ電位及び直径を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ナノキャリアは、＋８０～－８０のゼータ電位及び５ｎｍ～５００ｎｍの直径を有する。

ＰＰＤＰシステムは、自己集合及び静電複合体形成の両方を同時に用いる。自自己集合システムでは高い比率のポリマー対ペイロードが標準であるが、ＤＮＡ／ポリマー複合体には高い比率が必要である。ＰＰＤＰはこれら２つの中間であり、ＰＰＤＰは、複合体の集合に影響を与えるようにより多量のポリマーを必要とし、これがナノ構造の均一性を説明し得る（図１５）。

６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比により、インビトロで最適なトランスフェクション効率が達成される。
次に、最も性能の高いＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５構築物を使用して、ＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比と細胞トランスフェクション性能との関係を調べた。６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比は、ＥＭＳＡ研究においてプラスミドへの結合が最も安定していることが実証されたため、これらの研究でも最適に機能するだろうと仮説を立てた。さらに、６０：１超のより経済的ではないＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比が、配合物中に追加のコポリマーを必要とする犠牲を払って性能の利点を提供するかどうかも調べた。マクロファージをＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ複合体でトランスフェクトし、トランスフェクション効率（図２６、ａ～ｂ）及びプラスミドにコードされるレポータータンパク質の発現レベルをフローサイトメトリーによって定量した。

ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５の両方について、小さいモデルプラスミド（図２６ａ）及び大きいモデルプラスミド（図２６ｂ）の両方について、６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比で調製したナノベクターの場合に最も高いトランスフェクション効率が観察された。ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡの結果を除いて、６０：１の比は試験した他のすべてのＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比よりも有意に良好な性能を示した（図２６、ａ～ｂ）。例外の場合で、大きなＬ－ｐＤＮＡプラスミドのＰＰＤＰ２媒介トランスフェクションは高い１００：１比よりも６０：１比において効率的であったことに着目したが、この差は統計的に有意ではなかった（図２６ｂ）。それにもかかわらず、これらの結果は、６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡ比が小さいプラスミド及び大きいプラスミドの両方でのトランスフェクションに最適であり、ｐＤＮＡに対して使用するポリマーの量を増加させる利点がないことを実証している。共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）により、ＰＰＤＰ２を使用してＬ－ｐＤＮＡでトランスフェクトされたマクロファージにおけるＲＦＰタンパク質発現レベルがＬｉｐｏ２Ｋによって達成されるＲＦＰ発現レベルよりも大きいことがさらに確認された（図２６ｃ）。

ＰＰＤＰは、酸性条件下で特有の螺旋構造への無秩序秩序転移を引き起こし、ｐＤＮＡカーゴの細胞内放出を促進する。ＰＰＤＰナノベクターの樹状ペプチド複合体は、ｐＨ６．０下で特有の螺旋構造を採る。

予備スクリーニング及びポリマー対ＤＮＡ比率の最適化研究の結果により、６０：１のＰＰＤＰ：ｐＤＮＡで調製されたＰＰＤＰ２が他のすべてのナノベクター及び市販の試薬よりも一貫して優れていることが実証された。したがって、このＰＰＤＰ２製剤を、そのエンドリソソーム脱出特性の特性評価を試みる作用機序研究においてさらに研究した。ＤＰアミノ酸組成の生化学的特性（図１６ａ）に基づいて、このペプチドの立体構造が酸性度が高まる環境で変化するであろうという仮説を立てた。

ＰＰＤＰのｐＨ応答性構造を評価するために、球状ナノ構造をＰＰＤＰ２コポリマーから自己集合させ（図１６ｂ）、これは、ＤＬＳによって測定した場合に１９．６ｎｍの平均直径及び４８．０ｍＶの表面電荷を示した（図１６ｃ）。ＰＰＤＰ２ナノ構造のＤＰ成分は、溶液中のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法によって容易に検出可能である（図１６、ｄ～ｅ）。ＰＰＤＰ２ナノ構造は、ペプチド結合の特徴である１７００～１６００ｃｍ^－１バンド（Ｃ＝Ｏ伸縮）における予想されるアミドＩピークを示した（図６ｄ）。予想した通り、このピークはＤＰペプチド対照でも検出可能であったが、その強度は１８００～１７００ｃｍ^－１バンドにおけるより強いピークによって部分的に隠されていた。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳスペクトルをＰＰＤＰ２サンプルのスペクトルから減算することにより、螺旋二次構造の予備評価が可能になる。図６ｅに示される差分スペクトルでは、アミドＩバンド内の１６６０ｃｍ^－１付近において強いピークが観察される。これらの結果により、ＰＰＤＰ２が螺旋二次構造を採り得ることが示唆された。

次に、円二色性（ＣＤ）分光法を行って、樹状ペプチドが螺旋二次構造を採るかどうか、及びｐＨ７．５からｐＨ５．５への変化に応答して立体構造変化が起こるかどうかをより徹底的に調べた（図１６、ｆ～ｇ）。このｐＨ範囲は、徐々に酸性になるエンドリソソーム経路を通過するナノ構造との関連において特に興味深いものである。我々の生物物理学的研究では、ＰＰＤＰ２はいかなる条件下でも伝統的なαヘリックス二次構造を採らなかったが、これはＣＤスペクトルの２０８ｎｍ及び２２２ｎｍの２つの負のピークによって示される^［５７］（図１６ｆ）。

我々は当初、ＰＰＤＰ２が本質的に無秩序であると考えていたが、これは多くのペプチド及びタンパク質の広く共通する特徴である^{［５８～６７］}。代わりに、ＰＰＤＰ２ ＣＤスペクトルを詳しく調べることにより、プロリン残基を欠くペプチドによって形成することができ^［６８］、かつ、無秩序状態及び秩序状態のスペクトル特徴の特徴的な組み合わせを有する、ＰＰＩＩ（ポリプロリンＩＩ）様構造のものに似た、異なるより難解な種類の螺旋構造の証拠が得られた（図１６ｆ）。ランダムコイル状態を採るタンパク質及びペプチドは、一般に２００ｎｍ付近に負のピークを有する。しかしながら、ＰＰＩＩ様螺旋構造は、これらの特殊な螺旋構造を純粋に無秩序な状態から区別するために使用されるスペクトルシグネチャである、２２０ｎｍ付近の特徴的な正のピーク^［６９］（しかしながら、ＰＰＩＩ様の立体構造を採るプロリンを欠くペプチドの場合は２１０ｎｍの低いピーク^［７０］）及び１９７ｎｍ^［７０］の最小値によって明らかになる。我々の研究では、ＰＰＤＰ２は、ｐＨ７．５では約２０１ｎｍ及びｐＨ６．５では約２０４ｎｍにおいて強い負のピークを示したが、最も酸性の条件（ｐＨ５．５）によって約１９７ｎｍにおいて最小値への強い左方シフトが誘導された。ＰＰＤＰ２ ＣＤスペクトルを無秩序なスペクトルから区別する重要な特徴がｐＨ５．５で観察され、この場合、強い正のピークが２１５ｎｍで観察される（図１６ｆ）。したがって、ＰＰＤＰ２ ＣＤスペクトルは、より強い酸性の細胞内環境を模倣した条件下では１９７ｎｍの負のピーク及び２１５ｎｍの正のピークの両方を含み、このことは、それがｐＨ６．５未満ではＰＰＩＩ様螺旋構造を採ることを示唆している。この解釈は、リジンホモポリマーが、骨格中のリジンの立体構造^［７１］又は静電相互作用^［７４］によって安定化することができる、同様のスペクトル特徴を有するＰＰＩＩ様螺旋構造を採ることを実証した過去の研究と一致している^{［７１～７３］}。樹状ペプチド内のリジン側鎖は分岐のために用いられており（図１）、したがって、静電相互作用のために利用可能ではないため、樹状ペプチド主鎖内のリジン残基の化学結合がＰＰＩＩ様螺旋構造の形成を促進する可能性が高い。

興味深いことに、遊離樹状ペプチド（結合していない対照）は、ｐＨ７．５及びｐＨ６．５では約１９５ｎｍにおいてピークを示し、ｐＨ５．５では約２００ｎｍにおいてピークを示す（図１６ｇ）。この非結合樹状ペプチドはまた、すべてのｐＨ値で正のピーク（約２１５ｎｍ）を示し、このことは、それがすべての条件下でＰＰＩＩ様螺旋構造を有することを示唆している。ＰＰＤＰ２では正のピークがｐＨ５．５でのみ観察されるため、これらの結果はペプチドをポリマーに結合させることによってペプチドの立体構造がｐＨ応答性になったことを示唆している。遺伝子送達技術の関連では、ＰＰＤＰ２ ＣＤスペクトルにおいてｐＨ７．５及びｐＨ６．５で約２１５ｎｍの陽性ピークが存在しないことは、酸性リソソームコンパートメントに到達する前にペプチドが無秩序であることを示唆している。しかしながら、ＰＰＤＰ２は、リソソーム（ｐＨ＜６）に到達すると螺旋構造を採ることができる。酸性環境において起こるこのＰＰＤＰ２の無秩序から秩序への移行は、リソソーム脱出の作用機序を提供し得る。調べたすべてのｐＨ値で、ＰＰＤＰ２中のアルギニンのイオン化可能なグアニジノ基（ｐＫａ約９）はプロトン化され、ＤＮＡとの安定した静電相互作用を提供する。ｐＨ６．０未満では、ヒスチジン残基のイミダゾール基（ｐＫａ～６）がプロトン化され、ＤＮＡとの静電相互作用のための追加の手段が提供されるはずである。酸性リソソームコンパートメント内でのＰＰＤＰ２－ＤＮＡ相互作用の安定化は、これらの条件下では高次のナノ構造がＰＰＳの酸化により分解するので重要である^［４２］。さらに、プロトン化されたヒスチジン残基は、膜結合に役割を果たすロイシン残基と協調して膜破壊を促進することも既知である^{［５６，７５］}。その結果、酸性条件下での樹状ペプチドのＰＰＳ疎水性の酸化媒介性喪失並びにＤＮＡ結合及び膜破壊能力の増強はすべて、リソソーム内でＰＰＩＩ様ヘリックスを採ることと一致している。注目すべきことに、螺旋立体構造はリソソームコンパートメントからのカーゴの細胞質放出を促進することが既知である^{［７６，７７］}。したがって、我々は、螺旋構造の形成が、低ｐＨ（ｐＨ＜６）ではＰＰＤＰ２のイオン化アミノ酸残基及び酸化ＰＰＳ部分の官能基と相乗的に作用し、細胞質へのＤＮＡカーゴの効率的なリソソーム放出を促進すると結論付けている。

ＰＰＤＰはエンドリソソーム経路を通過し、時間依存的にｐＤＮＡペイロードを細胞質に放出する。
我々は、ｐＨ応答性ＰＰＤＰ２ナノベクターを使用して送達されたＤＮＡカーゴの細胞内在化及び局在化を調べることを試みた。この目的のために、ＣＬＳＭイメージングを使用して、異なる時点でのＰＰＤＰ２／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ｐＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１、５．４ｋｂ）ナノ複合体の細胞内輸送を視覚化した。エンドリソソーム経路を通るナノベクターの移動及びエンドソーム脱出の開始を調べるために初期の１時間及び４時間の時点を含めた一方、ｐＤＮＡペイロードの細胞質蓄積の経時的変化を調べるために１８時間の時点を含めた（図５）。ＲＡＷ２６４．７マクロファージとともに１時間インキュベートした後、エンドソーム／リソソームコンパートメントと共局在する小領域として、緑色蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８）が主に観察された。４時間及び１８時間の長いインキュベーション時間では、ナノ複合体がエンドリソソームコンパートメントから脱出し、サイトゾルに放出された。細胞質放出は、エンドソーム／リソソームコンパートメントとは共局在しない散在緑色蛍光の存在によって観察される。ナノ複合体の一部は、４時間及び１８時間の時点で依然としてエンドソーム／リソソームコンパートメント内に捕捉された。しかしながら、散在緑色シグナルの強度は４時間と比較して１８時間ではるかに大きく、この変化は１８時間での共局在シグナルの減少とも一致した。これらの結果により、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ｐＤＮＡが、ＰＰＤＰ２ナノ複合体による細胞内送達後、時間の経過とともにリソソームから効率的に増々脱出することが実証される。

ＰＰＤＰプラットフォームは自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方を効率的にトランスフェクトする。
潜在的なＤＮＡ送達ベクターとしてのＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５の幅広い適用を検証するために、様々な細胞株のＬ－ｐＤＮＡトランスフェクションを評価した（図１１）。血清存在下での各細胞種の標準的な培養条件下で、トランスフェクションを行った。最初に、生物学研究におけるＤＮＡトランスフェクション研究及び組換えタンパク質発現に広く使用されているＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞を試験した。共焦点イメージングにより、ＰＰＤＰ２／Ｌ－ｐＤＮＡによってトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞において４８時間後に広範なＲＦＰ蛍光発現が明らかになったが、同じ時点でＮａｋｅｄＬ－ｐＤＮＡ及びＬｉｐｏ２Ｋ／Ｌ－ｐＤＮＡについては検出可能なシグナルが最小限であったか又は全く検出されなかった（図１１ａ）。フローサイトメトリー分析により、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５が線維芽細胞においてそれぞれ６９．６％及び５７．５％のトランスフェクション効率を示すことが実証された（図１１ｂ）。これらのトランスフェクション効率は、Ｌｉｐｏ２Ｋについて決定された１２％のトランスフェクション効率よりも有意に高かった（図１１ｂ）。マクロファージにおける結果と一致して、ＰＰＤＰ２はＰＰＤＰ５の効率よりも有意に高い効率で線維芽細胞をトランスフェクトした（図１１ｂ）。

次に、ＰＰＤＰ技術が樹状細胞（ＤＣ）を効率的にトランスフェクトすることできるかどうかを調べた。遺伝子操作されたＤＣの生成を促進する技術の開発は、免疫制御におけるＤＣの特有かつ多様な役割のため、並びにがん及び感染疾患の次世代ワクチンの作製における潜在的な使用のため、非常に興味深いものとなっている。しかしながら、初代ＤＣの遺伝子操作は依然として困難であり、ＤＣベースの治療法の開発の進歩を妨げ続けている。初代マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５を使用してＬ－ｐＤＮＡでトランスフェクトした（図１１、ｃ～ｄ）。ＰＰＤＰ２媒介トランスフェクションによって３０．７％のＲＦＰ陽性（ＲＦＰ＋）細胞が得られたが、ＰＰＤＰ５によるトランスフェクション後は１８．７％の細胞がＲＦＰ＋であった（図１１、ｃ～ｄ）。これらの割合は、裸のプラスミドＤＮＡ及びＬｉｐｏ２Ｋ対照の両方よりも有意に高かった（図１１、ｃ～ｄ）。

最後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に大きなプラスミドをトランスフェクトするためのＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５の使用を調べた（図１１、ｅ～ｆ）。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は不死化ヒトＴリンパ球であり、これはＴ細胞生物学の研究及び操作されたＴ細胞技術のプロトタイプの開発に一般的に使用される。陰性対照群と比較してフローサイトメトリーのヒストグラムでの右へのシフトによって観察されるように、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５はＲＦＰ＋Ｔ細胞の割合を増加させた（図８ｅ）。興味深いことに、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５は両方とも、Ｌｉｐｏ２Ｋによって達成されるトランスフェクション効率よりも有意に高いトランスフェクション効率を達成した（図１１ｆ）。ＰＰＤＰ５はＰＰＤＰ２よりわずかにより効率的に大きなプラスミドでＴ細胞をトランスフェクトしたが、トランスフェクションのこの差は有意な差ではなかった（図１１ｆ）。Ｔ細胞について観察されたこの傾向（図１１ｆ）は、ＰＰＤＰ２がＰＰＤＰ５よりも有意に高いトランスフェクション効率を達成した、線維芽細胞及びＤＣを使用した我々の観察とは異なる（図１１、ｂ～ｄ）。ＰＰＤＰ２が大きなプラスミドによるＴ細胞のトランスフェクションにも優れていない理由は明らかではないが、この差異の作用機序を理解することは本研究の範囲外である。纏めると、これらの結果は、ＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５により、初代免疫細胞への大きなプラスミドＤＮＡ分子の送達が劇的に改善され、市販のトランスフェクション試薬よりも高いトランスフェクション効率が達成されることを実証している（図１１）。

実施例１の結果の概要
我々は、特殊な培養条件又は培地を必要とせずに、様々な免疫細胞種に対する非ウイルスかつ非毒性のプラスミドトランスフェクション試薬としてのポリマーナノベクターを開発し、最適化した。ＰＰＤＰビヒクルは、カチオン性樹状ペプチドに結合された自己集合ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳコポリマーから構成される。樹状ペプチドの各分岐は、静電相互作用によってＤＮＡと安定した複合体を形成するためのアルギニン末端を有し、リジン分岐骨格は酸性環境で螺旋立体構造変化を受け、これがエンドソーム脱出を助け得る。このリソソーム脱出は、ｐＤＮＡが核内に拡散し、そこでタンパク質産物に転写及び翻訳されるための前提条件であり、したがって、任意の効果的な遺伝子送達技術及びトランスフェクション試薬の不可欠の特徴である。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳコポリマーから組み立てられたナノキャリアが様々な治療ペイロードのサイトゾル送達を増強することは以前に実証されており^{［４０，４３，５２］}、本明細書では、カチオン性樹状ペプチドの結合により、小さいもの（Ｓ－ｐＤＮＡ；４．６ｋｂ）及び大きいもの（Ｌ－ｐＤＮＡ；１１．７ｋｂ）の両方に対してこの能力が達成される。ＰＰＤＰのサイズ及び表面特性をスクリーニングすることによってＰＰＤＰ２及びＰＰＤＰ５構築物が得られ、これらは、インビトロでマクロファージ、線維芽細胞、初代ＢＭＤＣ、及びＴ細胞を使用したインビトロの研究において、市販の標準リポフェクタミンよりも毒性が大幅に低く、トランスフェクションの増強に最適であることが見出された。全体的にはＰＰＤＰ２の方が効率的であることが見出されたが、両方の構築物は細胞を大きなｐＤＮＡエレメントでトランスフェクトするのに特に有用であった。したがって、ＰＰＤＰは、非常に低い毒性、大きな遺伝要素の優れたサイトゾル送達、典型的には免疫細胞集団をトランスフェクトすることが困難な標準的な培養条件下での有効性を含む、効率的なインビトロトランスフェクションのための多くの利点を備えた有望な非ウイルスベクターである。

さらに、図２７は、ポリマー結合が予想されることを実証している。データは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム内の溶出時間の変化をもたらす、樹状ペプチドへのＰＥＧ－ＰＰＳポリマーの結合の前後を示している。これにより、予想されたポリマーの形成が確認される。

実験セクション／方法
材料及び細胞株：別途明記しない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。｛［（ＲＨＬ）_２－ＫＲＨＬ］_２－ＫＲＨＬ｝_２－ＫＣ－ＮＨ_２の配列を有する樹状ペプチド（ＤＰ）はＰｅｐｔｉｄｅ２．０から購入した。マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７、マウス線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、及びヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｉｎｃ．）から購入した。細胞培養のため、ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ１６４０培地、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。すべての細胞培養培地には、３７℃、５％ＣＯ_２で１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充した。

プラスミド：小さいプラスミドＤＮＡ：ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）はＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、蛍光タグを有さないｐｃＤＮＡ３．１（５．４ｋｂ）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。大きなプラスミドＤＮＡ（Ｌ－ｐＤＮＡ）：ｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ（１１．７ｋｂ）はＡｄｄｇｅｎｅから購入した。すべてのプラスミドをＤＨ５αコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。プラスミドＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定された。

マウス初代骨髄由来樹状細胞の生成：骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を以前に記載されているように調製した^［７８］。簡単に述べると、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を収集した。次いで、細胞を一次培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、Ｂ－Ｍｅ（５０μｍ）、Ｌ－Ｇｌｎ（２×１０^－３ｍ）、ＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、並びにＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地）に再懸濁した。細胞を１００ｍｍペトリ皿中で１×１０^６細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃、５％ＣＯ_２で７日間インキュベートした。７日後、非接着細胞及び緩く接着した細胞（ｉｍＤＣ）を回収し、洗浄し、インビトロ実験に使用した。

ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓ－ｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ）ポリマーの合成：ブロックコポリマーＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎを以前に記載されているようにして合成した^{［３９、４３、７９、８０］}。簡単に述べると、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースの開始剤をメトキシＰＥＧ－ＯＨ（ＭＷ＝７５０又は２０００）のチオアセテート修飾によって調製した。ＰＥＧチオアセテート開始剤をナトリウムメトキシドによって脱保護し、開始チオレートが明らかになった。反応に使用されるプロピレンスルフィド（ＰＰＳ）の量は、所望のブロック長を重合するように調整された。過剰の２，２’－ジチオジピリジン（５当量）により、重合をエンドキャップした。次いで、得られたブロックコポリマー（ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_８０－ｐｄｓ、ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_５１－ｐｄｓ、ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_４２－ｐｄｓ、ＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_７４－ｐｄｓ、ＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_４８－ｐｄｓ、ＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_２５－ｐｄｓ）を冷メタノール又はジエチルエーテル中での二重沈殿によって精製した。すべてのポリマーを^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）によって特性評価した。樹状ペプチド（ＤＰ）を、ジスルフィド交換により、異なるＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳポリマーに結合させた。ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ（５０～１００ｍｇ）をトリエチルアミン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．１／１ｍＬ）中でＤＰ（１．２当量）と反応させた。冷ジエチルエーテル中で沈殿を繰り返すことによってペプチド－ポリマー結合体を精製し、２－ピリジエンチオンを除去した。真空乾燥したペプチド－ポリマー複合体を水（分子生物学グレード）に分散させ、次いでＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（２０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して水に対して透析して、未反応のペプチドを除去した。精製後、ＰＥＧ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ複合体を凍結乾燥した。

ＰＰＤＰナノ構造の調製：これらの研究では、ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_８０－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ２）、ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_５１－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ３）、ＰＥＧ_１７－ｂ－ＰＰＳ_４２－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ４）、ＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_７４－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ５）、ＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_４８－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ６）、及びＰＥＧ_４５－ｂ－ＰＰＳ_２５－ｓｓ－ＤＰ（ＰＰＤＰ７）を含む、様々なＰＰＤＰポリマーを使用した。指定されたＰＰＤＰポリマーを水（分子生物学グレード）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度のストック溶液を調製した。プラスミドＤＮＡ－ＰＰＤＰナノ複合体（ＤＮＡ－ＰＰＤＰ）は、ＰＰＤＰベクター及びｐＤＮＡ溶液の両方を水で５０μＬの体積まで希釈することによって形成され、その後、１～１２０の範囲のポリマー対ＤＮＡの質量比（ｗ／ｗ）で混合した。得られたＤＮＡ－ＰＰＤＰ複合体は、３０秒間穏やかにピペッティングし、続いて室温で３０分間インキュベートすることによって形成された。

ＰＰＤＰナノ構造の形態及び物理化学的特性の特性評価：ＰＰＤＰナノ構造のサイズ分布及びゼータ電位をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。クライオ透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を行って、ナノ構造の形態を特性評価した。簡単に述べると、２００メッシュのレース状カーボングリッドをＰｅｌｃｏ ｅａｓｉＧｌｏｗグロー放電器（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）中で１５ｍＡ、０．２４ｍＢａｒのチャンバー圧力で３０秒間グロー放電させた。グリッドを４μＬのサンプルで調製し、ＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ ＭａｒｋＩＩＩクライオプランジ凍結装置を使用して０．５ｍｍのブロットオフセットで５秒間、液体エタン中にプランジ凍結した。プランジ凍結後、グリッドをＧａｔａｎ６２６．５クライオトランスファーホルダーに充填し、－１７２℃で、ＪＥＯＬ ＪＥＭ１２３０ＬａＢ６発光ＴＥＭ（ＪＥＯＬＵＳＡ，Ｉｎｃ．）において１００ｋＶでイメージングした。Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ２ｋ×２ｋカメラを使用してデータを取得した。

小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）：ＳＡＸＳは、アルゴンヌ国立研究所（米国イリノイ州アルゴンヌ）の高度光子源（ＡＰＳ）でのＤｕＰｏｎｔ－Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ－Ｄｏｗ共同アクセスチーム（ＤＮＤ－ＣＡＴ）ビームラインで行った。約７．５ｍのサンプルから検出器までの距離を使用した。ベヘン酸銀回折パターンを使用して、ｑレンジを校正した。３秒の露光時間を使用して、サンプルに１０ｋｅＶのＸ線を照射した。データを０．００１～０．５Åで分析した。ＰＲＩＭＵＳ２．８．３ソフトウェア及びＳａｓＶｉｅｗ５．０ソフトウェアをそれぞれ、データ削減及びモデルフィッティングに使用した。コアシェル球モデルをデータにフィッティングさせた。確立された手順に従ってモデリングを行った^{［４１、４７、５０］}。

ｐＨ依存性ペプチド立体構造変化の特性評価：ＦＴ－ＩＲスペクトルをＮｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５０ ＦＴＩＲ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって取得した。ＰＰＤＰ２、ペプチド、及びＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳの液体サンプルについてスペクトルを得た。サンプルごとに、２０００～６００ｃｍ^－１の範囲で６４回のスキャンを収集した。円二色性（ＣＤ）分光法研究では、分析前にＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ、ペプチド、及びＰＰＤＰ２を水中でｐＨ５．５、６．５、及び７．５に調整して調製した。サンプルを石英キュベット（光路長０．１ｃｍ）中に調製し、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５ＣＤ分光計を使用してＣＤ分光法を行った。１００ｎｍ／分のスキャン速度、２秒のデジタル積分時間、２ｎｍのバンド幅、及び０．５ｎｍデータピッチを使用して、１９０～３００ｎｍの波長範囲で連続スキャンによってデータを収集した。高圧（ＨＴ）電圧を監視して、データが線形範囲内で収集されたことを確かめた。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体の安定性をＥＭＳＡによって測定した。この方法セクションの他の箇所で記載されているように、ＰＰＤＰ／ｐＤＮＡナノ複合体をＰＰＤＰ対ｐＤＮＡの異なる重量比で調製した。各サンプルについて同量のｐＤＮＡ（０．５μｇ）を使用した。得られたナノ複合体（１０μＬ）を充填バッファーと混合し、トリス－酢酸－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファー（４０ｍＭ トリス塩基、２０ｍＭ酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム）に浸漬したＧｅｌＲｅｄ（登録商標）核酸染色を含む１％アガロースゲルに充填した。電気泳動を１００Ｖの定電圧で３０分間行った（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）。ＬＡＳ４０１０ゲルイメージングシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してゲルをイメージングした。

細胞生存率アッセイ：３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して、様々なＰＰＤＰ／ｐＤＮＡ、リポフェクタミン２０００／ｐＤＮＡ複合体（Ｌｉｐｏ２Ｋ）、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体（２５ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ）、及び樹状ペプチド（ＤＰ１）／ｐＤＮＡ複合体でトランスフェクトされた細胞の相対生存率を決定した。１００μＬの培地中、１ウェルあたり３０，０００細胞の播種密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種した。次いで、指定された条件下で、２４時間のインキュベーション期間（０．２μｇのＤＮＡとともに）にわたって、細胞を処理した：裸のｐＤＮＡ、リポフェクタミン２０００／ＤＮＡ、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）／ＤＮＡ（５：１～１０：１のｗ／ｗ）、ＤＰ１／ＤＮＡ（１０：１～５０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ２／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ３／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ４／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ５／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ６／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）、ＰＰＤＰ７／ＤＮＡ（３０：１～１２０：１のｗ／ｗ）。２４時間後、細胞をＭＴＴ試薬（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ、１ウェル当たり１０μＬ）とともに４時間インキュベートした。ＤＭＳＯ（２００μＬ）を使用して、各ウェルにおいて形成された得られたホルマザン結晶を溶解した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を使用して、５６０ｎｍの光の吸光度を測定した。細胞生存率は、未処理の対照と比較した生存率パーセントとして計算した。

インビトロでの細胞トランスフェクション：これらの研究では、ｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ（４．６ｋｂ）を小さなプラスミドとして使用し、ｐＬ．ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ｔＲＦＰ（１１．７ｋｂ）を大きなプラスミドとして使用した。ＲＡＷ２６４．７、ＢＭＤＣ、及びＪｕｒｋａｔ細胞を１０^５細胞／ウェルでプレーティングし、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞を５×１０^４細胞／ウェルで２４ウェルプレート中でプレーティングした。各トランスフェクションサンプルについて、ＰＰＤＰ－プラスミドＤＮＡナノ複合体（ＰＰＤＰ／ＤＮＡ）を次のように調製した：ＰＰＤＰのストック溶液（血清を含まない５０μＬのＰＲＭＩ又はＤＭＥＭ培地中の１０ｍｇ／ｍｌ ＰＰＤＰ ３μＬ）及びプラスミドＤＮＡストック溶液（血清を含まないＰＲＭＩ又はＤＭＥＭ培地中の２ｍｇ／ｍｌ ｐＤＮＡ ０．２５μＬ）を希釈する。５０μＬの希釈ＰＰＤＰ懸濁液を５０μＬの希釈ｐＤＮＡ溶液に添加することによって、ＰＰＤＰ／ＤＮＡナノ複合体を調製した。得られたＰＰＤＰ／ＤＮＡナノ複合体を３０秒間穏やかにピペッティングすることによって形成し、次いで、室温で３０分間インキュベートした。リポフェクタミン２０００－ｐＤＮＡ複合体を製造元の説明書に従って調製した。簡単に述べると、プラスミドＤＮＡストック溶液（血清を含まない５０μＬＰＲＭＩ又はＤＭＥＭ培地中の２ｍｇ／ｍｌ ｐＤＮＡ ０．２５μＬ）を希釈し、穏やかに混合する。リポフェクタミン２０００１μｌを血清を含まない５０μＬのＰＲＭＩ又はＤＭＥＭ培地で希釈し、穏やかに混合する。５分間インキュベートした後、希釈ｐＤＮＡを希釈リポフェクタミン２０００と合わせ、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートする。１００μｌの裸のプラスミド、Ｌｉｐｏ２Ｋ／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ２／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ３／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ４／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ５／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ６／ＤＮＡ、ＰＰＤＰ７／ＤＮＡ（ＰＰＤＰ／ＤＮＡについて６０：１のｗ／ｗ）懸濁液を４００μｌの血清を含む完全培地と混合し、各ウェルに添加した（１ウェルあたり５００μｌ培地中に５００ｎｇのプラスミド）。４８時間のトランスフェクション期間後、トランスフェクション効率（ＤｓＲｅｄ＋及びＲＦＰ＋細胞の割合）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ６－Ｌａｓｅｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって定量した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、取得したフローサイトメトリーデータを分析した。共焦点顕微鏡分析では、ＲＡＷ２６４．７細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１０^４細胞／ウェルでプレーティングし、使用前に２４時間培養した。次いで、１ウェル当たり５００ｎｇのプラスミドを用いて、裸のプラスミド、Ｌｉｐｏ２Ｋ／ＤＮＡ、及びＰＰＤＰ２／ＤＮＡ（ＰＰＤＰ２／ＤＮＡについて６０：１のｗ／ｗ）でそれぞれ、細胞をトランスフェクトした。４８時間後、暗所で１５分間、ＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（核染色、１滴）で細胞を対比染色した。４０倍油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡でイメージングを取得した。

細胞内在化分析：小さなプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１、５．４ｋｂ）を、製造元の手順を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）Ｕｌｉｅｓ（商標）核酸標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で蛍光標識した。ＲＡＷ２６４．７細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１ウェルあたり２０，０００細胞で調製し、使用前に２４時間培養した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ｐＤＮＡ（４８８－ＤＮＡ）を上記のＰＰＤＰ２（ＰＰＤＰ２：プラスミドについて６０：１のｗ／ｗ）又はＬｉｐｏ２Ｋ（Ｌｉｐｏ２Ｋ：プラスミドについて６μｌ／μｇのｖ／ｗ）と混合した。得られた４８８－ｐＤＮＡＰＰＤＰ２複合体（４８８－ｐＤＮＡ－ＰＰＤＰ２）、４８８－ｐＤＮＡ、及び４８８－ｐＤＮＡ－Ｌｉｐｏ２Ｋを、指定された１時間、４時間、又は１８時間のインキュベーション期間にわたって細胞とともにインキュベートした。４８８－ｐＤＮＡの濃度は各ウェルについて１μｇ／ｍＬであった。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）ＲｅｄＤＮＤ－９９（１：５０００希釈、３００μＬのＤＭＥＭ）とともに３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ウェルあたり３００μＬＰＢＳ中のＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（核染色、１滴）とともに暗所で１５分間インキュベートした。６３倍油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡でイメージングを取得した。

統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）をデータ分析に使用した。データは平均値±ＳＤとして示される。対応する図の凡例に記載されているように、適切な統計検定を使用して有意性を決定した。

実施例１の参考文献
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Claims (29)

1. 樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合したポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）を含むナノ構造を製造するための合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマー。
2. 前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳが、リンカーを介して結合されており、任意選択で、前記リンカーが、ジスルフィド結合（－ｓｓ－）である、請求項１に記載の合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマー。
3. （ａ）前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳが、０．１７～０．４５のＰＥＧ重量分率を有し、（ｂ）前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳが、０．２５～０．８０のＰＰＳ重量分率を有し、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方である、請求項１に記載の合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマー。
4. 前記ＤＰが、配列番号１のペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマー。
5. 前記ポリマーが、ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎであり、ｍ及びｎが、それぞれ１～５００から選択される整数である、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰポリマー。
6. 核酸を細胞に送達するためのナノキャリアシステムであって、
   （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の樹状特異的分岐カチオン性ペプチド（ＤＰ）と結合したポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレンスルフィド）コポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ）を含むナノ構造、及び
   （ｂ）ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される核酸
   を含む、ナノキャリアシステム。
7. 前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰのナノ構造が、０．１７～０．４５のＰＥＧ重量分率を有する、請求項６に記載のナノキャリアシステム。
8. 前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰのナノ構造が、０．２５～０．８０のＰＰＳ重量分率を有する、請求項６又は７に記載のナノキャリアシステム。
9. 前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰのナノ構造の前記ＤＰが、配列番号１のペプチドである、請求項６～８のいずれか一項に記載のナノキャリアシステム。
10. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡであり、好ましくは、前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、又は目的のタンパク質、ペプチド、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチド配列である、請求項６～９のいずれか一項に記載のナノキャリアシステム。
11. ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ：ＤＮＡの質量比（ｗ／ｗ）が、５：１～５０：１である、請求項１０に記載のナノキャリアシステム。
12. ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－ｓｓ－ＤＰ：ＤＮＡの質量比（ｗ／ｗ）が、１５：１～１２０：１である、請求項１０に記載のナノキャリアシステム。
13. 前記ポリマー成分が、ＰＥＧ_ｍ－ｂ－ＰＰＳ_ｎであり、ｍ及びｎが、それぞれ１～５００から選択される整数である、請求項６～１２のいずれか一項に記載のナノキャリアシステム。
14. ポリヌクレオチド配列を細胞に送達する方法であって、請求項６～１３のいずれか一項に記載のナノキャリアシステムを前記細胞と接触させるか、又は前記細胞に投与することを含む、方法。
15. 前記ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰのナノ構造の前記ＤＰが、配列番号１のペプチドである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ：ＤＮＡの質量比（ｗ／ｗ）が、５：１～５０：１である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ＰＥＧ－ｂ－ＰＰＳ－リンカー－ＤＰ：ＤＮＡの質量比（ｗ／ｗ）が、１５：１～１２０：１である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記結合されたＤＰが、結合されていないＤＰと比較して、前記細胞に細胞毒性をもたらさない、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記細胞が、免疫細胞、好ましくは樹状細胞である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記細胞が、インビトロにある、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 免疫細胞をトランスフェクトしてポリヌクレオチド配列を該免疫細胞の核に送達する方法であって、前記ポリヌクレオチド配列を前記免疫細胞の核に送達するのに十分な時間にわたって前記免疫細胞を請求項６～１３のいずれか一項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
23. 前記免疫細胞が、インビトロにある、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ポリヌクレオチドが、治療薬又はサイトカインをコードする、請求項２１又は２２に記載の方法。
25. 細胞に形質導入する非毒性方法であって、
    ａ）培養物中の前記細胞を請求項６～１２のいずれか一項に記載のナノキャリアシステムと接触させることと、
    ｂ）ポリヌクレオチドが前記細胞に送達されるのに十分な時間にわたって前記細胞を培養することであって、前記ナノキャリアは前記細胞に対して非毒性である、前記培養することと
    を含む、方法。
26. ステップ（ａ）及び（ｂ）において、前記細胞が血清を含む培地中で培養される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記方法が、インビトロである、請求項２５又は２６に記載の方法。
28. 前記細胞の少なくとも５０％に、前記ポリヌクレオチドが形質導入される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記細胞が、免疫細胞、好ましくは樹状細胞である、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。