CN117355339A - 用于将核酸有效细胞内递送至免疫细胞的树枝状肽缀合聚合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于将多核苷酸序列递送至细胞、具体为包括树突细胞的免疫细胞的纳米载体以及使用方法。相比现有技术的方法,这些方法提供了改善的递送和降低的毒性。本公开内容的方法提供了一种将核酸递送至细胞的系统,该系统由合成的PEG‑b‑PPS‑接头‑DP聚合物组成,用于生产包含与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇‑嵌段‑聚丙烯硫醚共聚物(PEG‑b‑PPS)的纳米结构。该系统提供了一种无毒的将多核苷酸递送至包括树突细胞的免疫细胞的体外方法,包括将细胞培养基中的细胞与纳米载体接触,其中该方法对细胞无毒。本发明中描述的方法可用于治疗需要基因治疗的受试者,包括向受试者施用有效量的包含多核苷酸的系统,其中多核苷酸含有用于基因治疗的感兴趣的基因。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2021年3月17日提交的美国临时申请号63/162,507的优先权,其公开内容通过引用全文并入本文。
关于美国联邦资助研究的声明
本发明是由美国国立卫生研究院授予的HL132390和美国国家科学基金会授予的1453576而在美国政府的支持下完成。美国政府对本发明拥有一定的权利。
发明背景
基因工程的最新突破为癌症免疫疗法、抗病毒疗法和DNA疫苗在治疗癌症和传染病方面提供了无与伦比的机会[1-4]。尽管正在进行大量基因编辑试验,但成功的基因治疗产品非常有限[5]。这主要归因于将核酸有效引入靶细胞的挑战。高效的DNA递送系统必须克服几个障碍,例如防止酶降解、细胞内化、从内溶酶体中逃逸和胞质货物释放。
作为天然基因递送载体(vehicle),病毒在基因表达方面表现出前所未有的性能;然而,插入诱变及其内在免疫原性等安全性问题,阻碍了它们在临床环境中的使用[6]。更重要的是,有限的DNA携带能力(<8kb)是基于病毒的载体(vector)的另一个重要限制[7]。为了克服病毒对应物的障碍,非病毒载体(vector)和合成载体(carrier)(包括脂质、聚合物、肽和无机纳米材料)因其有限的免疫原性、灵活的包装能力以及相对容易合成和制造而受到越来越多的关注[8]。然而,现有材料仍面临诸如无效的内体逃逸、实质性毒性和低基因转染/细胞表达等挑战,特别是在一些最令人兴奋的靶细胞类型中,例如在免疫细胞中。例如,阳离子脂质被认为是大多数永生化细胞系中用于核酸递送的最广泛使用的非病毒载体,但在许多血液和免疫细胞中仍然不好用(recalcitrant)[9]。因此,亟需将核酸递送至一些难以转染的细胞(如原代细胞和免疫细胞)的系统。
树枝状或支链阳离子肽拥有具有多个功能基团的三维(3D)架构,使其成为带高负电荷核酸的高效基因递送材料[10]。据报道,与直链结构相比,树枝状结构能够显著增强肽与DNA的相互作用,显著改善货物包装,并提高各种细胞类型的转染效率[11]。值得注意的是,各种参数会影响树枝状肽的活性,包括基于肽分支层的代(generation)、分子量、功能或分支单元以及电荷分布。例如,三代肽树枝状聚合物具有较低的分子量电荷比和电荷分布在整个树枝状结构上,被证明是DNA递送的最佳转染试剂[12]。尽管阳离子肽树枝状聚合物潜力明显,但它们主要通过静电相互作用与核酸复合,在血清中通常不稳定且具有潜在的细胞毒性,限制了它们在基因治疗中的应用。
存在对克服现有可用的递送系统所存在的上述问题的核酸递送系统的需要。
发明概述
本公开内容提供将核酸递送至细胞的组合物和方法。在一个方面,本公开内容提供一种用于生产纳米结构的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其包含与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS)。在一些方面,接头是二硫键(-ss-)。在一些方面,聚合物包括PEGm-b-PPSn,其中m和n各自是选自1-500的整数。
在其他方面,本公开内容提供一种用于将核酸递送至细胞的系统,该系统包含:(a)纳米结构,其包含通过接头与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS)(PEG-b-PPS-接头-DP);和(b)多核苷酸,其选自DNA和RNA。在一些方面,接头是在一些方面,接头是二硫键(例如PEG-b-PPS-ss-DP)。在一些方面,在体外实现递送。在具体的方面,该方法用于体外递送至免疫细胞,包括树突细胞。
在另一方面,本公开内容提供一种将多核苷酸序列递送至细胞的方法,该方法包括将多核苷酸通过本文所述的纳米结构与本文所述的细胞接触,以便对于细胞而言将多核苷酸并入细胞中。
在另一方面,本公开内容提供一种无毒的将多核苷酸递送至细胞的体外方法,该方法包括(a)将纳米载体(nanocarrier)与细胞培养基中的细胞接触,所述纳米载体包含:(i)缀合至DP肽的PEGm-b-PPSn,其中m和n是1-500的整数,和(ii)多核苷酸,并且(b)培养细胞足够长的时间以将多核苷酸递送至细胞核,其中该方法对细胞是无毒的。
在一些方面,该方法用于体外递送。在具体的方面,该方法用于体外递送至免疫细胞,包括树突细胞。
进一步的方面包括包含多核苷酸的细胞系统。
在进一步的实施方案中,本公开内容提供一种转染免疫细胞以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核的方法,该方法包括将本文所述的纳米载体系统与免疫细胞接触足够长的时间以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核。在一些方面,该方法在体外进行。
在又一个实施方案中,本公开内容提供一种治疗需要基因治疗的受试者的方法,该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的系统,其中该系统含有包含用于基因治疗的感兴趣的基因的多核苷酸。
从以下说明书中将体现本发明的上述和其它方面和优点。在说明书中,参考了构成本文一部分的附图,并且其中以示例的方式示出了本发明的优选实施方案。然而,这样的实施方案并不必然代表本发明的全部范围,因此参考权利要求书和本文来解释本发明的范围。
附图的简要说明
图1.显示PEGm-b-PPSn-ss-DP(PPDP)基因递送系统的设计和结构以及用于增强细胞内递送DNA的策略的示意图。
图2.DNA-PPDP纳米复合物在体外的细胞毒性。使用MTT测定在RAW264.7细胞中以不同的聚合物与DNA的比例(15:1、30:1、60:1、120:1)测定了DNA-PPDP纳米复合物的细胞活力。将未处理的细胞(对照)、裸DNA(DNA)、DNA-Lipofectamine 2k复合物(Lipo2K)、DNA-PEI复合物(分子量为25kDa的PEI,PEI与DNA的重量比为5:1和10:1)包括作为对照组。
图3.在不同免疫细胞中用PPDP纳米载体(nanovector)转染小尺寸质粒DNA。A,小尺寸质粒DNA的示意图(pCMV-EGFP,4.6Kb)。pCMV-EGFP含有CMV启动子、Neo/Kan抗性基因和EGFP报告基因。B,用有关RAW264.7巨噬细胞的荧光表达细胞的百分比评价了通过各种PPDP纳米载体转染DNA的效率。以60:1(PPDP:DNA)的重量比制备DNA-PPDP纳米复合物。以20:1(DP1:DNA)的重量比制备DNA-DP1复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。用相同量的DNA以不同PPDP与DNA的重量比(15:1、30:1、60:1、120:1)的DNA-PPDP2(C)和DNA-PPDP5(D)对RAW264.7巨噬细胞的转染效率。E-F,使用PPDP与DNA的重量比为60:1的PPDP2和PPDP5纳米载体用pCMV-EGFP(4.6Kb)转染骨髓来源的树突细胞(BMDC)的流式细胞术分析。引入裸DNA和DNA-Lipo2K复合物(Lipo2K)作为阴性和阳性对照组。对于所有转染实验,使用相同量的DNA。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001。
图4.在各种细胞中用PPDP纳米载体转染大尺寸质粒DNA。A,大尺寸质粒DNA的示意图(pEFS-RFP,11.7Kb)。pCMV-EGFP含有EFS启动子、NSL基因、Cas9表达基因、AMP抗性基因和RFP报告基因。B,用有关RAW264.7巨噬细胞的RFP阳性细胞的百分比评价了通过各种PPDP纳米载体转染pEFS-RFP(11.7Kb)质粒DNA的效率。以60:1(PPDP:DNA)的重量比制备DNA-PPDP纳米复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。C,PPDP2介导的将pEFS-RFP(11.7Kb)质粒DNA递送入RAW264.7巨噬细胞的代表性共聚焦图像。用相同量的DNA以不同PPDP与DNA的重量比(10:1、20:1、40:1、60:1、100:1)的DNA-PPDP2(D)和DNA-PPDP5(E)对RAW264.7巨噬细胞的转染效率。F,用重量比为60:1(PPDP:DNA)的PPDP2和PPDP5对NIH3T3成纤维细胞递送pEFS-RFP(11.7Kb)质粒DNA的转染效率。G,PPDP2介导的将pEFS-RFP(11.7Kb)质粒DNA递送入NIH3T3成纤维细胞的代表性共聚焦图像。H-I,使用PPDP与DNA的重量比为60:1的PPDP2和PPDP5纳米载体用pEFS-RFP(11.7Kb)转染骨髓来源的树突细胞(BMDC)的流式细胞术分析。引入裸DNA和DNA-Lipo2K复合物(Lipo2K)作为阴性和阳性对照组。对于所有转染实验,使用相同量的DNA。比例尺=10μm。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图5.RAW 264.7巨噬细胞中PPDP2/pDNA复合物的内体逃逸和胞质递送。采用使用PPDP2与pDNA重量比为60:1形成的PPDP2/AF488-标记的S-pDNA(pcDNA3.1,5.4kb)纳米复合物孵育RAW 264.7巨噬细胞。代表性共聚焦图像展示了在1小时、4小时和18小时的孵育时间段之后细胞内的PPDP2/S-pDNA复合物。使用LysoTracker红标记晚期内体/溶酶体。用DAPI染核(蓝)。绿色质粒DNA和红色内体/溶酶体的共聚焦在图像中呈现为黄色。比例尺=10μm。
图6.PEGm-b-PPSn-ss-树枝状肽(PPDP)聚合物合成的示意图。
图7.DNA-PPDP纳米复合物在体外的细胞毒性。使用MTT测定在RAW264.7细胞中以不同的聚合物与DNA的比例(15:1、30:1、60:1、120:1)测定了DNA-PPDP纳米复合物的细胞活力。
图8.(A)使用各种PPDP纳米载体用pCMV-EGFP(4.6Kb)转染RAW264.7巨噬细胞。通过流式细胞术测定平均荧光强度(MFI)。以60:1(PPDP:DNA)的重量比制备DNA-PPDP纳米复合物。以20:1(DP1:DNA)的重量比制备DNA-DP1复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。用相同量的DNA以不同PPDP与DNA的重量比(15:1、30:1、60:1、120:1)的DNA-PPDP2(B)和DNA-PPDP5(C)转染RAW264.7巨噬细胞的MFI。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001。
图9.使用PPDP与DNA的重量比为60:1的DNA-PPDP2和DNA-PPDP5转染骨髓树突细胞(BMDC)的MFI。Lipo2K用作阳性对照以递送pCMV-EGFP(4.6Kb)。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:*p<0.05。
图10.(A)使用各种PPDP纳米载体用pEFS-RFP(11.7Kb)转染RAW264.7巨噬细胞。通过流式细胞术测定平均荧光强度(MFI)。以60:1(PPDP:DNA)的重量比制备DNA-PPDP纳米复合物。以20:1(DP1:DNA)的重量比制备DNA-DP1复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。用相同量的DNA以不同PPDP与DNA的重量比(10:1、20:1、40:1、60:1、100:1)的DNA-PPDP2(B)和DNA-PPDP5(C)转染RAW264.7巨噬细胞的MFI。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图11.PPDP/L-pDNA纳米载体在成纤维细胞、树突细胞和T细胞中的转染。使用PPDP与pDNA的重量比为60:1的PPDP2和PPDP5纳米载体用L-pDNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7kb)转染NIH 3T3、BMDC和Jurkat T细胞。a)PPDP2/L-pDNA复合物的代表性共聚焦图像证明了L-pDNA在细胞摄取之后的转染。比例尺=20μm。b)NIH 3T3细胞中转染效率的百分比。c)流式细胞图和d)BMDC中转染细胞的百分比。e)流式细胞图和f)转染的Jurkat T细胞的百分比。裸pDNA和Lipo2K/pDNA复合物(Lipo2K)分别包括作为阴性和阳性对照。数据表示为平均值±SD(n=3-4)。由方差分析通过事后Tukey多重比较检验确定显著性(5%显著性水平)。***p<0.001,****p<0.001。比例尺=10μm。
图12.用PPDP与DNA的重量比为60:1的DNA-PPDP2和DNA-PPDP5转染NIH3T3成纤维细胞(A)和骨髓树突细胞(BMDC)的MFI。Lipo2K用作阳性对照以递送pEFS-RFP(11.7Kb)。所有统计数据均表示为平均值±s.d.。对于每个组,N=3。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图13.PEGn-b-PPSm-pds的1H NMR谱。1H NMR(400MHz.Chloroform-d);a)PPDP2,b)PPDP3,c)PPDP4,d)PPDP5,e)PPDP6,以及f)PPDP7.δ:3.6(s,68H,PEG),3.3(s,3H,PEG-OCH3),2.9(m,2H/单位,-S-CH2CH(CH3)-S-),2.6(m,1H/单位,-S-CH2CH(CH3)-S-),1.3(m,3H/单位,-S-CH2CH(CH3)-S-)。
图14.CD谱采集期间的高张力(HT)电压。展示了a)PPDP2和b)肽对照样品在收集谱期间的HT电压。
图15.PPDP/pDNA纳米载体的表征。不同的聚合物与pDNA的比例为1:1至60:1的PPDP/pDNA纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞。裸pDNA、Lipofectamine 2000/pDNA复合物(Lipo2K)、PEI/pDNA复合物(分子量为25kDa的PEI)和树枝状肽(DP1)/pDNA复合物包括作为对照组。优化PPDP与pDNA的配方。a)PPDP/S-pDNA复合物,b)PPDP/L-pDNA复合物。(三角形:PPDP/pDNA纳米复合物中包封良好的pDNA)。PPDP2和5的质量比对c)S-pDNA和d)L-pDNA在复合物的颗粒尺寸(红色)和ζ电位(蓝色)方面的作用。(星号:配方优化的比例)。来自冷冻透射电子显微镜的PPDP/pDNA纳米复合物的代表性图像。重量比为60:1(PPDP:pDNA)的e)PPDP/S-pDNA复合物和f)PPDP/L-pDNA复合物。比例尺(黑色)100nm。数据表示为平均值±SD(n=3)。
图16.PEGm-b-PPSn-ss-DP(PPDP)的表征。a)PEGm-b-PPSn-ss-DP(PPDP)聚合物的示意图。PPDP2的b)代表性冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)图像和c)尺寸分布。比例尺=100nm。d)PEG-b-PPS(绿色)、树枝状肽(黑色)和PPDP2(红色)的FT-IR谱。蓝色高亮的区域对应于酰胺I(1700-1600cm-1)和酰胺II(1590-1520cm-1)带。e)减去PEG-b-PPS贡献的PPDP2谱。圆二色性光谱法(CD)分析以f)组装的纳米结构或以g)游离形式的DP肽的螺旋结构。
图17.PPDP/pDNA纳米载体的凝胶阻滞测定。不同的聚合物与pDNA的比例为1:1至120:1的PPDP/pDNA纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞。树枝状肽(DP1)/pDNA复合物和PEI/pDNA复合物(分子量为25kDa的PEI)包括作为对照组。通过红色三角形指示PPDP/pDNA纳米复合物中包封良好的pDNA。a)PPDP/S-pDNA复合物,b)PPDP/L-pDNA复合物。
图18.PPDP/pDNA纳米载体在RAW 264.7细胞中的细胞毒性。使用不同的聚合物与pDNA比例(30:1、60:1、120:1)的PPDP/pDNA纳米复合物中96孔板中以3x104/孔的细胞密度将鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞在37℃孵育24小时。将未处理的细胞(对照)、Lipofectamine 2000/pDNA复合物(Lipo2K)、PEI/pDNA复合物(分子量为25kDa的PEI)和树枝状肽(DP1)/pDNA复合物包括作为对照组。然后通过MTT测定测量细胞活力。a)PPDP/S-pDNA复合物,b)PPDP/L-pDNA。(星号:配方优化的比例)。数据表示为平均值±SD(n=3)。
图19.PPDP/L-pDNA纳米载体在各种细胞系中的转染。使用PPDP与pDNA的重量比为60:1的PPDP2和PPDP5纳米载体用L-pDNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7Kb)转染NIH 3T3、BMDC和Jurkat。a)NIH3T3、b)BMDC和c)Jurkat细胞中转染效率的平均荧光强度(MFI)。引入裸pDNA和Lipo2K/pDNA复合物(Lipo2K)作为阴性和阳性对照组。通过流式细胞术分析转染效率。数据表示为平均值±SD(n=3)。双尾T检验用于统计分析:**p<0.01,***p<0.001。
图20.PPDP/L-pDNA纳米载体在各种细胞系中的转染。使用PPDP与pDNA的重量比为60:1的PPDP2和PPDP5纳米载体用L-pDNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7Kb)转染NIH 3T3、BMDC和Jurkat细胞。a)PPDP2/L-pDNA复合物的代表性共聚焦图像证明了L-pDNA在细胞摄取之后的转染。比例尺(白色)=20μm。b)NIH 3T3细胞中转染效率的百分比。BMDC的转染效率的c)图和d)百分比。Jurkat细胞的转染效率的e)图和f)百分比。引入裸pDNA和Lipo2K/pDNA复合物(Lipo2K)作为阴性和阳性对照组。通过流式细胞术分析转染效率。数据表示为平均值±SD(n=3-4)。双尾T检验用于统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图21.PPDP/pDNA纳米载体在RAW 264.7细胞中的转染。用所示的材料孵育鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞孵育48小时。a)小尺寸质粒DNA(pCMV-DsRed,4.6Kb)的示意图。pCMV-DsRed含有CMV启动子、Neo/Kan抗性基因和DsRed报告基因。b)用有关RAW 264.7细胞的荧光表达细胞的百分比评价了通过各种PPDP纳米载体转染S-pDNA的效率。以60:1(PPDP:pDNA)的重量比制备PPDP/S-pDNA纳米复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。不同PPDP与pDNA重量比(15:1、30:1、60:1、120:1)的c)PPDP2/S-pDNA和PPDP5/S-pDNA复合物的转染效率。d)大尺寸质粒DNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7Kb)的示意图。pL-CRISPR.EFS.tRFP含有EFS启动子、NSL基因、Cas9表达基因、AMP抗性基因和RFP报告基因。e)用有关RAW 264.7细胞的荧光表达细胞的百分比评价了通过各种PPDP纳米载体转染L-pDNA的效率。不同PPDP与pDNA重量比(10:1、40:1、60:1、100:1)的f)PPDP2/L-pDNA和PPDP5/L-pDNA复合物的转染效率。g)PPDP2/L-pDNA复合物(PPDP2与pDNA的重量比为60:1)的代表性共聚焦图像证明了L-pDNA在细胞摄取之后的转染。比例尺(白色)=20μm。通过流式细胞术分析转染效率。数据表示为平均值±SD(n=3)。双尾T检验用于统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图22.PPDP/pDNA纳米载体在RAW 264.7细胞中的转染。用所示的材料孵育鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞孵育48小时。a)用有关RAW 264.7细胞的平均荧光强度(MFI)评价了通过各种PPDP纳米载体转染S-pDNA的效率。以60:1(PPDP:pDNA)的重量比制备PPDP/S-pDNA纳米复合物。根据制造商的说明进行Lipo2K的转染。不同PPDP与pDNA重量比(15:1、30:1、60:1、120:1)的b)PPDP2/S-pDNA和PPDP5/S-pDNA复合物的转染效率。c)用有关RAW 264.7细胞的平均荧光强度(MFI)评价了通过各种PPDP纳米载体转染L-pDNA的效率。不同PPDP与pDNA重量比(10:1、40:1、60:1、100:1)的d)PPDP2/L-pDNA和PPDP 5/L-pDNA复合物的转染效率。通过流式细胞术分析转染效率。数据表示为平均值±SD(n=3)。双尾T检验用于统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图23.PPDP/pDNA纳米载体的Cryo-TEM图像。(a)是PPD2的图像,(b)是PPDP5的图像。比例尺(白色)=100nm。
图24.在基于巨噬细胞的筛选中,PPDP2和PPDP5比Lipo2K实现了更高的质粒DNA转染效率和报告基因表达水平。用指定的材料孵育RAW 264.7巨噬细胞48小时。a)含有CMV启动子和DsRed报告基因的模型小尺寸质粒DNA(pCMV-DsRed,4.6Kb)的示意图。b)定量为表达荧光报告蛋白的细胞的百分比的使用PPDP纳米载体(PPDP2-PPDP7)转染S-pDNA的效率。c)用表达DsRed报告基因的细胞的平均荧光强度(MFI)作图得到的S-pDNA的转染效率。d)在本研究中使用的含有EFS启动子以及NSL、Cas9和RFP报告基因的模型大尺寸质粒DNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7kb)的示意图。e)通过PPDP纳米载体转染L-pDNA的效率。f)表达RFP报告基因的细胞的转染效率和MFI。g)PPDP介导的质粒转染效率(左)和报告基因表达水平(右)与Lipo2K相比的倍数差异。在每个热图下方注释了PPDP2和PPDP5的排名。在所有情况下,均使用60:1的PPDP:pDNA重量比。数据表示为平均值±SD(n=3)。根据制造商的说明进行转染的使用。对于图(b,e),由方差分析通过事后Tukey多重比较检验确定显著性差异(5%显著性水平)。*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001,****p<0.0001。以指定的颜色呈现了与对照和pDNA(灰色条)、Lipo2k(红色条)和PPDP处理组(黑色条)内的比较。
图25.PPDP/pDNA纳米载体在RAW 264.7巨噬细胞中的细胞毒性。使用以不同的聚合物与pDNA比例(30:1、60:1、120:1)制备的PPDP/pDNA纳米复合物将RAW 264.7巨噬细胞在37℃孵育24小时。将未处理的细胞(对照)、Lipo2K/pDNA复合物(Lipo2K)、PEI/pDNA复合物(分子量为25kDa的PEI)和树枝状肽(DP)/pDNA复合物包括作为基准。然后通过MTT测定测量a)PPDP/S-pDNA复合物和b)PPDP/L-pDNA复合物的细胞活力。星号表示实验确定的最佳比例。数据表示为平均值±SD(n=3)。
图26.60:1PPDP:p-DNA的比例对于小和大质粒转染巨噬细胞都是最佳的。使用以指定PPDP:pDNA比例的与a)小模型质粒(S-pDNA;pCMV-DsRed,4.6kb)或b)大模型质粒(L-pDNA;pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7kb)复合的PPDP2(紫条图)或PPDP5(红条图)通过流式细胞术确定RAW 264.7巨噬细胞的转染效率。数据表示为平均值±SD(n=3)。由方差分析通过事后Tukey多重比较检验确定显著性差异(5%显著性水平)。*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001,****p<0.0001。c)用PPDP2/L-pDNA(60:1)或Lipo2K/L-pDNA转染的巨噬细胞的报告基因表达的代表性共聚焦图像。还呈现了细胞背景(对照)和用裸L-pDNA转染的细胞。比例尺=20μm。
图27.PEG-b-PPS缀合至树枝状肽(DP)形成PPDP之前和之后的凝胶渗透色谱(GPC)。以在N,N-二甲基甲酰胺中的10mM溴化锂作为流动相进行分析。使用具有折射率和紫外-可见检测器的PLgel柱进行GPC。a)PEG17-b-PPS80-pds b)PEG17-b-PPS80-ss-DP。
发明详述
已经用一个或多个优选实施方案描述了本发明,并且应当理解,除了那些明确说明的以外,许多等价物、替代物、变化和修改是可能的并且在本发明的范围内。
本文公开的是一种基于聚合物纳米载体的新型基因递送系统,其经改造用于有效胞质递送多核苷酸(图1)。与树枝状肽(DP)缀合的PEG-b-PPS聚合物(PPDP)组装成稳定的纳米结构,其通过在水性缓冲液中简单混合来包封核酸。该递送系统是增强生物医学研究和治疗应用中遗传材料负载和递送的绝佳平台,具有增强细胞内核酸向出了名的难以转染的免疫细胞递送的独特能力。
具体地,本文所述的递送多核苷酸的纳米载体平台是无毒的,并且允许对细胞、特别是免疫细胞进行有效的体外转染。这种细胞的体外转染允许在血清存在下进行,并且与细胞转染的目前的lipofectamine标准相比提供了更好的转染,后者是有毒的,并且出了名的因难以转染免疫细胞。Lipofectamine需要特殊的无血清培养基,并且转染后会导致毒性作用和低细胞活力。免疫细胞对其培养基条件非常敏感,因此本发明的方法和本发明的纳米载体的能够在血清存在下递送多核苷酸的能力是本文所述的PPDP的除了毒性低之外的一个显著优点。
如实施例中所述,优化的PPDP构建转染巨噬细胞、成纤维细胞、树突细胞和T细胞比领先的Lipo2K试剂更有效,毒性更小,而不管多核苷酸的尺寸如何并且在血清存在下的标准培养条件下。尽管阳离子肽树枝状聚合物具有潜力,但它们主要通过静电相互作用与核酸形成复合物,单独使用时通常在血清中不稳定,并且具有潜在的细胞毒性问题,限制了它们在基因治疗中的应用。
本公开内容提供了PEG-b-PPS-接头-DP合成聚合物,其能够生产能够用于多核苷酸递送的纳米结构。聚合物PEG-b-PPS-接头-DP包含与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS)。合适的接头可包括但不限于例如1)共价键2)离子键或对以下敏感3)酶降解/蛋白水解4)pH 5)温度6)光7)超声波8)盐浓度9)表面活性剂10)氧化11)水解。合适的接头和连接方法是本领域已知的。接头基团通常具有两个末端,其中末端中的一个包含基底(DNA)附接基团,并且其中末端中的另一个包含聚合物附接基团,其中聚合物附接基团。本发明并不限于任何特定的接头基团。实际上,考虑了使用各种接头基团,包括但不限于烷基、醚、聚醚、烷基酰胺基团或这些基团的组合。本发明并不限于使用本领域已知的任何特定基底(DNA)附接基团或聚合物附接基团。本发明考虑了可使用各种聚合物附接基团,包括但不限于胺、羟基、硫醇、羧酸、酯、酰胺、环氧化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯基团。在替代的实施方案中,接头包括三苯甲基部分、酯部分或CDM(羧化二甲基马来酸)部分。如本领域技术人员所理解的,可以使用替代接头部分来代替本文所述的二硫键接头。为便于撰写,本说明书将主要侧重于二硫键接头,但应当理解的是,在适用的情况下,可以用替代部分代替。
在优选实施方案中,接头优选为二硫键(ss),(例如PEG-b-PPS-ss-DP)。
可以通过已知的方法制备聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS),这些方法例如在Allen,S.et al.,Facile assembly and loading of theranosticpolymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation J.Control.Release2017.262:p.91-103中和在美国专利号10,633,493中描述的那些方法,上述文献就制备共聚物的方法而言通过引用将其全文并入本文。在实施例中描述了示例性合成。例如通过由PEG硫代乙酸酯引发并用PEG甲磺酸酯封端的丙烯硫醚的阴离子开环聚合制备PEG-b-PPS。通过在甲醇中沉淀纯化PEG-b-PPS。
如实施例所述,通过接头(例如二硫键)将PEG-b-PPS缀合至树枝状特异性支链阳离子肽(DP),以获得本文所述的PEG-b-PPS-接头-DP聚合物。
“树枝状肽”、“DP”或“支链阳离子肽”是具有多个功能基团的具有三维(3D)架构的肽。树枝状肽是支链寡阳离子肽,其在阳离子氨基酸的数量和类型(赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸)方面不同。本发明的树枝状肽具有三代,并且每个单元由与核酸发生相互作用的带正电的精氨酸(R)、具有缓冲能力的组氨酸(H)和具有膜结合能力以促进内体逃逸的亲脂性亮氨酸(L)和用于功能单元分支的赖氨酸组成。与直链肽相比,这些支链肽显示出更好的包封和转染效率。各种参数会影响树枝状肽的活性,包括基于肽分支层的代、分子量、功能或分支单元以及电荷分布。在一个实施方案中,缀合至PEG-b-PPS的树枝状肽是{[(RHL)2-KRHL]2-KRHL}2-KC-NH2(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中,PEG-b-PPS通过二硫键交换缀合至DP。在一些实施方案中,PEG-b-PPS与DP的比例为1:1至1:1000,优选约1:1至约1:500。在一些实施方案中,PEG-b-PPS与DP的比例为1:1、1:2、1:10、1:20、1:50、1:75、1:100、1:120、1:200、1:500、1:750等,包括其间的所有比例。
术语“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物,除非另有说明,否则如果它们的结构允许这种立体异构体形式,它们都以其D和L立体异构体的形式存在。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala或A),精氨酸(Arg或R),天冬酰胺(Asn或N),天冬氨酸(Asp或D),半胱氨酸(Cys或C),谷氨酰胺(Gln或Q),谷氨酸(Glu或E),甘氨酸(Gly或G),组氨酸(His或H),异亮氨酸(Ile或I),亮氨酸(Leu或L),赖氨酸(Lys或K),甲硫氨酸(Met或M),苯丙氨酸(Phe或F),脯氨酸(Pro或P),丝氨酸(Ser或S),苏氨酸(Thr或T),色氨酸(Trp或W),酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。
非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸(“tBuG”)、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸(“hPro”或“homoP”)、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸(“3Hyp”)、4-羟基脯氨酸(“4Hyp”)、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸(“MeAla”或“Nime”)、N-烷基甘氨酸(“NAG”),包括N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-烷基戊基甘氨酸(“NAPG”),包括N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸(“Norval”)、去甲亮氨酸(“Norleu”)、辛基甘氨酸(“OctG”)、鸟氨酸(“Orn”)、戊基甘氨酸(“pG”或“PGly”)、哌可酸、硫脯氨酸(“ThioP”或“tPro”)、高赖氨酸(“hLys”)和高精氨酸(“hArg”)。
术语“氨基酸类似物”是指这样的天然或非天然氨基酸,其中C端羧基、N端氨基和侧链生物活性基团中的一个或多个已被化学阻断(block),可逆或不可逆,或以其他方式修饰为另一生物活性基团。例如,天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物;N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物;或丙氨酸甲酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。其他氨基酸类似物包括甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。
本文所用的术语“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的寡聚物至短的聚合物。与其他氨基酸聚合物(例如,蛋白质、多肽等)相比,肽的长度约为50个氨基酸或更少。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或修饰氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白质或非天然(人工)序列的子序列。
本文所述的纳米载体可以包括连接至DP的PEGm-b-PPSn,其中m和n都是整数,各自选自1-500,或者约2-300,或者10-250。可以选择具体的m和n来提供具体比例的PEG和PPS以提供所需的具体纳米结构(例如,如本文所述聚合物泡囊(polymersome)、双连续纳米球、胶束、丝状胶束(filomicelle)等)。在一些实施方案中,接头是二硫键(-ss-),但也考虑了可以使用任何能够将肽结合到聚合物上的接头。
PEG-b-PPS-接头-DP聚合物可以通过动态光散射(DLS)和纳米颗粒跟踪分析(NTA)表征尺寸分布,并通过低温透射电子显微镜(cryoTEM)表征形态。治疗剂的负载和包封效率可以通过液相色谱质谱法表征。
可以通过不同的丙烯硫醚聚合、氧化或分支程度来制备各种类型的PEG-b-PPS-接头-DP聚合物。例如,纳米载体可以为以下形式:聚合物泡囊(PEG重量分数为约0.25至约0.45)、胶束(PEG重量分数在0.45以上)、双连续纳米球(PEG重量分数在0.25以下)、丝状胶束(PEG重量分数为约0.35至约0.45)、聚丙烯砜纳米凝胶(90%以上氧化的PPS均聚物)或由支链筏聚合的聚(寡聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)-b-聚(寡聚(丙烯硫醚)甲基丙烯酸酯)(POEGMA-POPSMA)组装的聚合物泡囊1-5。在一些实施方案中,嵌段共聚物的PEG重量分数约为0.25。本领域技术人员将能够确定适当的重量分数,并且可以与本文提供的实施例不同但仍在本发明的范围内。
在一些实施方案中,PEG-b-PPS-接头-DP聚合物是具有水性核和围绕水性核的脂质双层的疏水性和亲水性区域的聚合物泡囊。聚合物泡囊PEG-b-PPS-接头-DP聚合物的PEG重量分数可以为约0.25至约0.80。聚合物泡囊PEG-b-PPS-接头-DP聚合物的直径可以为约10nm至约300nm,或者直径为约30nm至约150nm,或者约30nm至约60nm,或者约60nm至约90nm,或者直径为约100nm至约150nm。在一些实施方案中,PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构是双连续纳米球(BCN),其特征为两个连续相:(i)穿过(ii)充分疏水内部体积的水性通道立方晶格。基于小角X射线散射(SAXS)分析,BCN具有由Bragg峰的相对间距比分别为√2、√4和√6确认的原始型立方内部组织(Im3m)。BCN是脂质立方体(cubosome)的聚合物等价物,并且是溶致的(lyotropic)。BCN能够并入疏水性和亲水性治疗剂。可以通过已知方法制备BCN,例如在Allen,S.et al.Benchmarking bicontinuous nanospheres againstpolymersomes for in vivo biodistribution and dual intracellular delivery oflipophilic and water soluble payloads.ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10,40,33857-33866中描述的那些方法,上述文献就连续纳米球结构的结构和特征而言通过引用将其全文并入本文。在一些实施方案中,接头是二硫键(PEG-b-PPS-ss-DP)。
在一些实施方案中,PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构是具有疏水/亲脂核和亲水性外部的胶束或丝状胶束。胶束或丝状胶束PEG-b-PPS-ss-DP纳米结构具有球形形态,并且通常比聚合物泡更小(例如小于50nm),疏水核可以装载核酸。合适地,胶束的PEG重量分数为约0.35至约0.45。可以通过已知方法制备胶束或丝状胶束,例如在Karabin,N.B.,Allen,S.,Kwon,H.et al.Sustained micellar delivery via inducible transitions innanostructure morphology.Nat Commun 9,624(2018)中描述的那些方法,上述文献通过引用并入本文。
本文公开的可以通过已知方法制备的PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构的其他合适的制备方法例如,Du,F.,et al.,(2019):Homopolymer Self-Assembly via Poly(propyleneSulfone)Networks.ChemRxiv.Preprint;Du F.et al.,Sequential intracellularrelease of water-soluble cargos from Shell-crosslinked polymersomes.J ControlRelease.2018;282:90-100;和Yi S.,et al,Tailoring Nanostructure Morphology forEnhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis.ACS Nano.2016;10(12):11290-11303,上述文献通过引用将其全文并入本文。
PEG-b-PPS聚合物提供PPS的疏水部分以稳定纳米结构和亲水性PEG冠以增强细胞摄取并降低毒性。因为在还原性细胞内环境中改善了内体逃逸和货物释放,PPS和DP之间可生物还原二硫键的整合提高了基因递送效率。
本公开内容提供包含待递送至细胞的多核苷酸的纳米载体系统。所述纳米载体系统包含缀合至DP的本文所述的PEG-b-PPS聚合物并且形成能够将多核苷酸递送至细胞、更优选地将多核苷酸递送至细胞的细胞核的结构。
本文所述的纳米载体系统可用于体外转染细胞、特别是免疫细胞。合适地,可以在血清存在下进行转染。进一步地,本文所述的纳米载体系统对于细胞是无毒的。在一些实施方案中,所述纳米载体系统导致对多核苷酸的高递送效率,特别是与本领域方法如lipofectamine相比。
本文所述的纳米载体系统以及使用方法对于被递送多核苷酸的细胞是无毒的。术语“无毒”是指纳米载体系统在孵育或与宿主细胞接触时不引起细胞凋亡或细胞死亡的能力。合适地,无毒系统是指能够保留与纳米载体系统接触的大多数细胞的活力并且能够并入多核苷酸的能力。合适地,术语无毒是指通过本领域已知的活/死或代谢测定(例如但不限于MMT测定)评估的不引起细胞活力的统计学显著降低。
本文公开的纳米载体也可以并入到药物组合物中。所公开的纳米载体或包含其的药物组合物可用于在有需要的受试者中进行基因治疗的方法中。所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂将取决于要使用的施用方式。合适的施用方式包括但不限于:局部、皮下、经皮、皮内、病灶内、关节内、腹膜内、膀胱内、经粘膜、牙龈、齿内、耳蜗内、经鼓室、器官内、硬膜外、鞘内、肌肉内、静脉内、血管内、骨内、眼周、肿瘤内、脑内和脑室内施用。在一些实施方案中,所公开的药物组合物以肠胃外方式施用。在一些实施方案中,肠胃外施用是通过鞘内施用、脑室内施用或实质内施用。在具体实施方案中,所公开的药物组合物是皮下施用的。在具体实施方案中,所公开的药物组合物是静脉内施用的。本文公开的药物组合物可以作为唯一的活性剂施用,也可以与其它药物制剂如用于治疗受试者遗传疾病的其它药剂组合施用。
所公开的纳米载体或包含其的药物组合物的待施用的量取决于各种因素,包括病症的严重程度、受试者的年龄、性别和体重、施用频率、治疗持续时间等。所公开的纳米载体或药物组合物可以以任何合适的剂量、频率和任何合适的持续时间施用,以达到所需的治疗效果,即治疗遗传疾病。所公开的纳米载体或药物组合物可以每天一次或每天多次施用。或者,并且优选地,纳米载体或药物组合物可以每周施用一次,持续至少2周。在其它实例中,纳米载体或药物组合物可以每天一次、每天两次、或每天三次或更多次施用。所公开的纳米载体或药物组合物可以每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次、每两周一次或每两周少于一次施用。所述纳米载体或药物组合物可以施用任何合适的持续时间,以达到所需的治疗效果,即治疗遗传疾病。例如,纳米载体或药物组合物可以施用给受试者一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十一天、十二天、十三天、两周、一个月、两个月、三个月、六个月、1年或1年以上。
可以使用所公开的纳米载体或包含其的药物组合物的任何合适的剂量。合适的剂量将取决于治疗剂、预期的治疗效果、个体的体重、个体的年龄等。一般而言,所公开的纳米载体或包含其的药物组合物的合适的剂量的范围可以为约0.025mg纳米载体/kg体重至200mg纳米载体/kg体重。例如,合适的剂量可以为约0.025mg/kg或0.03mg/kg或0.05mg/kg或0.10mg/kg或0.15mg/kg或0.30mg/kg至0.5mg/kg或0.75mg/kg或1.0mg/kg或1.25mg/kg或1.5mg/kg或1.75mg/kg或2.0mg/kg。在一些实施方案中,合适的剂量可以为1mg纳米载体/kg体重或3mg/kg或5mg/kg或10mg/kg或25mg/kg或50mg/kg或75mg/kg或100mg/kg或125mg/kg或150mg/kg或175mg/kg或200mg/kg。
在一些实施方案中,药物组合物或纳米载体可以静脉内施用。
递送系统
本文还描述了一种用于将核酸递送至细胞的纳米载体系统。该递送系统包含:(a)纳米结构,其包含与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)(即通过接头)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(本文所述的PEG-b-PPS),特别是通过二硫键(PEG-b-PPS-ss-DP)和(b)核酸。核酸选自DNA和RNA。在一些实施方案中,核酸是DNA。在一些实施方案中,核酸是编码感兴趣的基因产物或蛋白质的DNA。在一些实施方案中,核酸是DNA,而DNA是编码感兴趣的蛋白质、肽或其片段的质粒DNA、DNA构建体或多核苷酸序列。本发明人出乎意料地发现,可以通过使用本文描述的PEG-b-PPS-接头-DP(PEG-b-PPS-ss-DP)的纳米结构实现核酸的包封。在优选的实施方案中,纳米载体用于体外递送。
与市售转染剂如Lipo2K和PEI相比,本公开内容的递送纳米载体系统具有较低的细胞毒性。此外,本文公开的递送系统与未缀合的DP相比,在树突细胞或巨噬细胞中显示出无毒性作用。不受任何理论的约束,据信PEG-b-PPS-接头-DP聚合物上的PEG覆盖层可以抑制DP的潜在毒性。
本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链d的。多核苷酸包括但不限于:前信使RNA(pre-mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成RNA、基因组RNA(geRNA)、指导RNA、tracRNA、crRNA、sgRNA、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增的DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。所述多核苷酸优选编码感兴趣的蛋白质、肽或治疗靶标。在一些实施方案中,多核苷酸可以是载体或构建体。在一些实施方案中,多核苷酸可以是DNA载体。本文所用的术语“载体”是指能够增殖与其相连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及整合到已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”(或简称“载体”)。用于本发明的合适载体包括可操作地连接到编码感兴趣的蛋白质或肽的多核苷酸序列的启动子。术语载体涵盖“质粒”,这是最常用的载体形式。质粒是环状双链DNA环,其他DNA片段(例如,编码肽的片段)可以连接至其中。在一些实施方案中,载体是迷你环DNA(mcDNA)载体。迷你环DNA载体是游离体DNA载体,以环状表达盒形式产生,没有任何细菌质粒DNA主链。参见,例如SystemBiosciences,Mountain View CA,MN501A-1。与仅起作用几天的标准质粒载体相比,它们较小的分子尺寸可实现更高效的转染,并在数周内提供持续的表达。在一些实施方案中,本发明的载体还包括异源主链序列。本文所用的“异源核酸序列”是指非人核酸序列,例如,在人体内不天然存在的细菌、病毒或其他非人核酸序列。异源主链序列对于载体的增殖和/或编码肽的表达可能是必需的。许多常用的表达载体和质粒含有非人源核酸序列,包括CMV启动子等。多核苷酸是指长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000或至少为15,000个或更多个核苷酸的核苷酸的聚合形式,核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任何一种核苷酸的修饰形式,以及所有中间长度。很容易理解,在这种情况下,“中间长度”是指引用值之间的任何长度,例如6、7、8、9等、101、102、103等、151、152、153等、201、202、203等。在具体实施方案中,多核苷酸或变体与本文所述或本领域已知的参考序列具有至少或约50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%,76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,通常其中该变体维持参考序列的至少一种生物活性。
在一些实施方案中,多核苷酸可以是编码蛋白质的基因或cDNA,也可以是编码DNA或RNA序列的多核苷酸,所述蛋白质或DNA或RNA序列编码治疗剂。在一些实施方案中,多核苷酸可以是编码用于治疗的感兴趣的蛋白质的基因。
本文所用的术语“基因”可以指包含增强子、启动子、内含子、外显子等的多核苷酸序列。在具体实施方案中,术语“基因”是指编码多肽的多核苷酸序列,而不管该多核苷酸序列是否与编码该多肽的基因组序列相同。在具体实施方案中,术语“基因”是指cDNA。cDNA是编码蛋白质的多核苷酸,其不含内含子并且可以人工生产。
可以例如,通过在生理条件下混合核酸和纳米载体(即PEG-b-PPS-接头-DP)制备/装载递送系统。
本文所用的短语“生理条件”涉及在组织的细胞内和细胞外液中可能遇到的化学(例如,pH、离子强度)和生化(例如,酶浓度)条件的范围。对于大多数组织而言,生理pH的范围为约7.0至7.4。
递送系统可包含任何合适的PEG-b-PPS-接头-DP:核酸的质量比,其是达到所需效果所必需的。例如,递送系统可包含PEG-b-PPS-ss-DP:核酸的质量比(w/w)为5:1至130:1。例如,质量比可以是5:1、10:1、15:1、30:1、50:1、75:1、100:1、115:1、120:1或130:1。在具体实施方案中,PEG-b-PPS-ss-DP:核酸的质量比是15:1至120:1。所公开的含有PEG-b-PPS的递送系统与目前的递送方法相比具有以下优势,包括(i)无细胞毒性,(ii)能够装载大的货物,例如质粒,(iii)能够装载小的货物,例如核苷酸佐剂环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(环GMP-AMP或cGAMP),(iv)纳米载体的可控表面化学,以指定和避免细胞和生化相互作用,以及(v)触发有效载荷释放的被动和主动手段。细胞毒性是开发用于生物医学应用的基因递送载体的主要问题。这里公开的递送系统显示PPDP/DNA低于60:1的情况下没有毒性作用,而当PPDP/DNA高达120:1的情况下毒性作用最小(例如,PPDP/DNA=120/1的情况下细胞活力>80%)(图2)。相比之下,未缀合的DP甚至在较低的50:1的肽/DNA的重量比(DP/DNA=50/1)下导致较低的细胞活力。以PEG-b-PPS-接头-DP聚合物形成的纳米结构的细胞毒性比目前市售可得的转染剂Lipo2K(78%活力)和PEI(PEI/DNA=5:1为47%活力,并且PEI/DNA=10:1为22%活力)低得多。本发明人出乎意料地发现,PEG-b-PPS-接头-DP的纳米结构转发现的PEG覆盖层可以抑制DP的潜在毒性。
PEG-b-PPS-接头-DP中使用的聚合物聚乙二醇和聚丙烯硫醚已被广泛证明是惰性的。合适地,聚合物是PEGm-b-PPSn-接头-DP,其中m和n各自是选自1-500的整数。在一些实施方案中,接头是二硫键(-ss-)。
在进一步的实施方案中,本公开内容提供一种疫苗组合物,其包含载体、DNA抗原或免疫原以及佐剂。载体可以是本文所公开的PEG-b-PPS-接头-DP聚合物的纳米结构。不受任何理论的约束,在疫苗组合物中使用PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构作为载体可以增强DNA抗原或免疫原向感兴趣的细胞的递送。
合适的佐剂是本领域已知的,包括但不限于苏氨酸胞壁酰二肽(MDP)(Byars etal.,1987)、Ribi佐剂系统成分(Corixa Corp.,Seattle,Wash.)例如细胞壁骨架(CWS)成分、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、细菌脂多糖(LPS;例如来自大肠杆菌)或其组合。各种其它众所周知的佐剂也可以与本发明的方法和疫苗一起使用,例如氢氧化铝、皂苷、无定形羟基磷酸铝硫酸铝(AAHS)、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(Alum)及其组合。细胞因子(γ-IFN、GM-CSF、CSF等)、淋巴因子和白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、11-18、11-19、IL-20、IL-21和11-22)也被用作疫苗组合物中的佐剂和/或补充剂,并被考虑在本发明的范围内。例如,一种或多种不同的细胞因子和/或淋巴因子可以包含在包含本发明的一种或多种肽的组合物或疫苗中。
本文所用的术语“抗原”或“免疫原”是指包含肽、多肽或蛋白质的化合物或组合物,当以适当的量(“免疫原性有效量”)施用(或通过施用的核酸例如DNA疫苗在体内表达)的情况下具有“抗原性”或“免疫原性”,即能够单独或与另一种物质组合或连接或融合(可以一次或若干间隔多次施用)诱导、诱发、增强或增大细胞和/或体液免疫应答。免疫原性组合物可以包含至少约5个氨基酸的抗原肽、长度为10个氨基酸的肽、长度为15个氨基酸、长度为20个氨基酸或更长的多肽片段的。免疫原可以从疫苗载体重组表达,疫苗载体可以是包含可操作地连接到启动子例如表达盒的免疫原编码序列的裸DNA。
方法
本公开内容还在一些实施方案中提供了将核酸递送至细胞的方法,该方法包括将本文公开的递送系统与细胞接触或施用于细胞。在具体实施方案中,所述核酸是DNA。在具体实施方案中,所述细胞为免疫细胞。在具体实施方案中,所述细胞为树突细胞。在另一个实施方案中,所述细胞是巨噬细胞。
在进一步的实施方案中,提供了一种将多核苷酸序列递送至细胞的无毒体外方法。该方法包括将本文所述的纳米载体系统(包含纳米载体和多核苷酸,所述纳米载体包含共价连接至树枝状肽(DP)的PEGm-b-PPSn)与培养中的细胞接触;和培养细胞足够长的时间以使得细胞摄取纳米载体系统并将多核苷酸递送至细胞。在一些实施方案中,接触和培养步骤均在含有血清的培养基中进行。这对于包括树突细胞的免疫细胞很重要,它们对培养条件非常敏感。
在一些实施方案中,细胞是免疫细胞。合适的免疫细胞是本领域已知的,并且包括例如树突细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等。
“树突细胞”或“DC”是哺乳动物免疫系统的抗原呈递细胞。DC的功能是加工抗原物质并将其呈递在其表面以呈递给免疫系统的T细胞,并充当先天性免疫系统和适应性免疫系统之间的信使。DC在激活后表达抗原呈递所需的高水平分子,例如MHC II、CD80和CD86,并且在启动免疫应答方面非常有效。DC分布于包括粘膜组织的全身,其中发现它们位于上皮细胞屏障下方。已经发现DC在适应性免疫应答的逐渐下降、耐受性丧失和慢性炎症的发展中起作用。树突细胞可存在于正常动脉壁中和动脉粥样硬化病变内。
本公开内容还在一些实施方案中提供了转染免疫细胞以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核的方法,该方法包括将本文公开的系统与免疫细胞接触足够的时间以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核。在一些实施方案中,所述免疫细胞在体外。在一些实施方案中,所述免疫细胞在体内。
术语“转导”或“转染”是指外源性多核苷酸被引入细胞的能力,特别是被引入细胞的细胞核的能力。在一些实施方案中,当多核苷酸在细胞的细胞核内转录和翻译的情况下,它能够表达蛋白质。
当用编码蛋白质或包含转录成感兴趣的转录本的序列的核酸(质粒)转导的情况下,“转导”或“转染”细胞能够产生蛋白质和/或转录本。此外,当使用多核苷酸序列例如编码编码蛋白质的感兴趣的基因或转录为感兴趣的转录本的质粒转导的情况下,这样的细胞能够产生包括编码蛋白质或包含转录成感兴趣的转录本的序列的基因的载体,进而产生感兴趣的载体。在具体实施方案中,所述多核苷酸编码治疗剂。
本公开内容还在一些实施方案中提供了提供治疗需要基因治疗的受试者的方法,该方法包括向受试者施用本文所述的有效量的递送系统,其中递送系统包括包含用于基因治疗的感兴趣的基因的核酸。
在一些实施方案中,例如,包含多核苷酸的递送系统被施用于(或引入到)一种或多种感兴趣的细胞或组织类型中,以便破坏一个或多个感兴趣的基因或使得能够调节一个或多个感兴趣的基因,例如感兴趣的基因或与感兴趣的疾病相关的基因。
本文所用的术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少目前正在经历或患有特定病症或疾病状态的受试者的病症、疾病状态或其症状的量或严重程度。这些术语并不一定表示完全治疗(例如,完全消除病症、疾病或其症状)。“治疗”包括对疾病(例如,在包括人的哺乳动物中)的任何治疗或技术的任何施用或应用,并且包括抑制疾病,阻止其发展,缓解疾病,导致消退,或恢复或修复丧失、缺失或缺陷的功能或刺激低效的过程。
术语“受试者”或“患者”在本文中可互换使用,以指哺乳动物,优选为人,以通过本文所述的方法和组合物进行治疗。“哺乳动物”是指哺乳动物类的任何成员,包括但不限于人、非人灵长类动物,如黑猩猩和其他类人猿和猴子物种;农场动物,如牛、马、绵羊、山羊和猪;家畜,如兔子、狗和猫;实验动物,包括啮齿动物,如大鼠、小鼠和豚鼠等等。优选地,受试者是人。在一些实施方案中,受试者是需要基因治疗的哺乳动物。术语“受试者”并不表示具体的年龄或性别。在一个具体实施方案中,受试者是哺乳动物,优选是人。在合适的实施方案中,受试者是需要基因治疗的人。
本文所用的术语“包括”、“包含”或“具有”及其变体意在包括其后列出的要素及其等同要素以及其他要素。被叙述为“包括”、“包含”或“具有”某些元素的实施方案也被考虑为“基本上由”和“由”这些特定元素“组成”。
本文所用的“约”是指所述浓度范围的5-10%内或所述数字的5-10%内。
对于本领域技术人员来说,应该显而易见的是,除了已经描述的那些之外,还有许多附加的修改是不背离本发明的概念的。在解释本公开内容的情况下,所有术语都应以符合上下文的最广泛方式进行解释。术语“包含”的变体应解释为以非排他性方式指代要素、组件或步骤,因此所引用的要素、组件或步骤可以与未明确引用的其它要素、组件或步骤组合。被引用为“包含”某些元件的实施方案也被考虑为“基本上由”和“由”这些元件“组成”。术语“基本上由......组成”和“由......组成”的解释应符合MPEP和相关美国联邦巡回法院的解释。过渡短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤“以及那些对要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质性影响”的材料或步骤。“由......组成”是一个封闭的术语,其不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的要素中的“一个或两个”,即在某些情况下结合存在并在其他情况下分离存在的要素。与“和/或”一起列出的多个要素应以相同的方式解释,即“一个或多个”如此结合的要素。除了“和/或”条款具体指明的要素之外,还可以任选地存在其他要素,无论是否与具体指明的这些要素相关。因此,作为非限制性示例,对“A和/或B”的引用,当与诸如“包含”的开放式语言结合使用的情况下,可以在一个实施方案中仅指A(任选地包括B以外的要素);在另一个实施方案中,仅指B(任选地包括A以外的要素);在又一个实施方案中,指A和B两者(任选地包括其它要素)等。
如本文在说明书和权利要求书中使用的,“或”应理解为与上述定义的“和/或”具有相同的含义。例如,在将清单中的项目分开的情况下,“或”“和/或”应解释为具有包容性,即至少包括一个,但也包括许多要素或一系列要素中的一个以上的要素,以及任选的另外的未列入的项目。只有明确指出相反的术语,例如“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”,或者在权利要求中使用的“由......组成”,才指只包括许多要素或一系列要素中的恰好一个要素。一般而言,在前面有排他性术语,例如“任一”、“其中之一”、“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”的情况下,本文所用的术语“或”应仅解释为表示排他性替代方案(即“一个或另一个,但不是两个”)。
已经用一个或多个优选实施方案描述了本发明,并且应当理解的是,除了那些明确说明之外,许多等同物、替代物、变化和修改是可能的,并且在本发明的范围内。
以下实施例仅用于说明目的,并不旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上,本发明的各种修改除了本文所示和描述的那些之外,对于本领域技术人员来说将从前述描述和以下实施例变得显而易见,并且落入所附权利要求书的范围。
实施例1
基因工程的最新进展为癌症免疫疗法[1]、抗病毒疗法[2]和DNA疫苗[3]以及非医疗用途[4]提供了无与伦比的机会。尽管在基因组编辑领域正在进行大量试验,但成功的基因治疗产品非常有限[5-7]。这主要是由于与核酸在递送至靶细胞后有效表达紧密相关的挑战。此外,高效的DNA递送系统还必须克服几个障碍,例如防止酶降解、细胞内化、从内溶酶体中逃逸和胞质货物释放。基于质粒的基因治疗是一种很有前途的转染策略,其能够使用多合一质粒方法递送CRISPR/Cas9[8-10]用于稳定的基因组编辑[11]。然而,裸质粒DNA(pDNA)由于其负电荷、对酶降解的敏感性、限制通过病毒载体递送的大分子尺寸以及合成纳米技术的低包封效率,对细胞摄取有许多障碍[12,13]。
作为天然基因递送载体,病毒在基因表达方面表现出前所未有的性能;然而,各种问题[14]例如插入诱变[15]、内在免疫原性[16]和现存的针对病毒成分的宿主抗体[17],都会降低其在临床环境中的疗效和效用[18]。重要的是,有限的DNA携带能力(<8kb)[19]和制造挑战[20-23]对基于病毒的载体施加了额外的限制。因此,非病毒载体和合成载体(包括脂质、聚合物、肽和无机纳米材料)因其有限的免疫原性、灵活的包装能力和可扩展制造方法的适应性以及利用用于提高转染效率的多种细胞内递送机制而受到越来越多的关注[13,24-26]。然而,现有材料仍面临诸如低效的内体逃逸、实质性毒性和低基因转染/细胞表达等挑战。对于某些细胞类型,低转染问题尤其成问题,特别是免疫细胞,这些细胞非常需要作为各种治疗应用的靶标,包括疫苗接种和癌症免疫治疗。例如,阳离子脂质是大多数永生化细胞系中用于核酸递送的最广泛使用的非病毒载体,但许多血液和免疫细胞仍然不好用[27]。除了基于脂质的技术之外,许多聚合物转染试剂例如聚乙烯亚胺(PEI)长期以来一直存在细胞毒性问题[28-30]。因此,对能够在标准培养条件下将核酸递送至难以转染的细胞,特别是原代细胞和免疫细胞,而不会增加相关毒性的替代技术的需求很高。
树枝状或支链阳离子肽拥有具有多个功能基团的三维(3D)架构,使其非常适合递送带负电荷的核酸[31,32]。据报道,与直链DNA结合肽相比,树枝状结构能够显著增强肽与DNA的相互作用,显著改善货物包装,并提高各种细胞类型的转染效率[33]。值得注意的是,各种参数影响树枝状肽的活性和生物相容性,包括分子量、分支单元的功能以及电荷分布[32,34-37]。具体而言,第三代肽树枝状聚合物具有较低的分子量电荷比和电荷分布在整个树枝状结构上,已被证明是DNA递送的最佳转染试剂[36]。尽管阳离子肽树枝状聚合物具有潜力,但它们主要通过静电相互作用与核酸复合,单独使用的情况下在血清中通常不稳定且具有潜在的细胞毒性问题[38],限制了它们在基因治疗中的应用。
在本实施例中,我们证实开发了一种新型基因递送系统,其采用自组装嵌段共聚物纳米载体,通过掺入阳离子树枝状肽(DP)嵌段改造用于有效地胞质递送质粒DNA(图1)。我们已经证明聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚(PEG-b-PPS)纳米载体具有卓越的靶向巨噬细胞和树突细胞的能力[39-41],能够在细胞内递送各种的有效载荷[42-49],在人血液中是非免疫原性的[50],并且在非人灵长类动物[51]、人源化小鼠[52]和各种小鼠疾病模型[39]中既不引起炎症反应又是无毒的。
这项工作的动机是具有衣壳蛋白的天然病毒,这些衣壳蛋白利用带正电荷的区域携带基因,其将这种遗传物质包封在更高级的蛋白质框架/结构中,该框架/结构在很大程度上由疏水区域之间的非共价相互作用稳定[53-55]。我们证实疏水性PPS膜的高稳定性以及PEG和树枝状肽嵌段之间的体积差异允许在自组装的PEG-b-PPS纳米载体内部螯合(sequestering)大型遗传元件。
树枝状肽(DP)具有三代,并且每个单元由与基因发生相互作用的带正电的精氨酸(R)、具有缓冲能力的组氨酸(H)和具有膜结合能力以促进内体逃逸的亲脂性亮氨酸(L)和用于功能单元分支的赖氨酸组成。PEG-b-PPS聚合物能够不仅提供PPS的疏水部分以稳定纳米结构而且提供亲水性PEG冠以增强细胞摄取并降低毒性。因为在还原性细胞内环境中改善了内体逃逸和货物释放,PPS和DP之间可生物还原二硫键的整合能够提高基因递送效率。
使用半胱氨酸接头用功能性阳离子DP对PEG-b-PPS共聚物进行修饰(PEGm-b-PPSn-ss-DP,PPDP)(图1)。DP的每个单元由用于功能单位分支的赖氨酸、帮助结合膜并促进从内溶酶体区室逃逸的亲脂性亮氨酸[56]、具有缓冲能力和协助破坏内体膜的组氨酸残基[56]以及与带负电荷的DNA稳定相互作用的精氨酸组成。精氨酸残基在各种条件下与阴离子核酸相互作用,因为它们在细胞外环境(内化之前)和细胞内化后内溶酶体途径内遇到的所有pH条件下都带正电。除了我们技术的肽方面外,PEG-b-PPS聚合物还为基因递送提供了多种有用的功能。PEG-b-PPS通过其稳定纳米结构并能够在酸性内溶酶体区室内解组装的疏水性PPS嵌段提供氧化敏感性[42,43,46,47,49]。亲水性甲氧基封端的PEG冠用于提高生物相容性并降低毒性[50,51]。此外,我们在PPS的末端和DP之间并入了可生物还原二硫键,以改善还原细胞内区室内DP结合的pDNA从PEG-b-PPS纳米载体的释放。
我们合成了一个自组装PPDP聚合物文库,并充分研究了它们作为用于基因递送的非病毒纳米载体的功能。细胞转染实验以领先的市售产品Lipofectamine 2000(Lipo2K)为基准。此外,为了了解我们的基因递送平台是否与一系列DNA货物尺寸兼容,我们研究了小DNA质粒(S-pDNA;pCMV-DsRed,4.6kb)和大DNA质粒(L-pDNA;pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7kb)的转染效率。在对巨噬细胞作为模型免疫细胞类型的PPDP介导的转染性能进行全面筛选后,我们优化了性能最佳的纳米载体的配方,并在一系列多学科研究中阐明了其功能的机理细节。最后,在NIH 3T3成纤维细胞以及各种难以转染的免疫细胞类型(包括T细胞和原代骨髓来源的树突细胞(BMDC))中评估最佳PPDP纳米载体的功效。
通过在水性缓冲液中简单混合,将与DP缀合的PEG-PPS聚合物(PPDP)与质粒DNA组装成稳定纳米结构。我们假设PPDP除了增加疏水作用外,还可能通过静电相互作用增强DNA包封。为了研究PPDP对基因转染的疏水作用,我们合成了一系列具有各种疏水比并与DP缀合的PEG-PPS聚合物。筛选研究表明,与领先的市售产品(如Lipofectamine 2000)相比,优化的PPDP纳米结构在各种细胞类型(包括原代骨髓来源的树突细胞(BMDC))中实现了卓越的DNA递送效率。此外,我们的基因递送系统使得能够高效胞质递送范围为6.4kb至11.7kb的质粒DNA。因此,该基因递送系统可作为一个极好的平台,使得能够为生物医学研究和治疗性应用实现高效的基因工程。
结果与讨论
PDP的制备与表征
为了研究分子量和疏水性如何影响各种细胞类型的基因递送,在严格的无水条件下通过离子聚合,六种不同PEG分子量为750或2000以及20至80的各种PPS长度的PEG-b-PPS二嵌段共聚物(图6)。通过NMR和GPC对用吡啶基二硫化物封端的PEGm-b-PPSn聚合物(PEGm-b-PPSn-pds)进行了表征和验证(图13)。然后通过二硫键交换反应将含半胱氨酸的DP与PEGm-b-PPSn-pds缀合(图16)。为了简化本研究中的命名,如表1所示,具有不同分子量和疏水性的PEG-PPS-ss-DP聚合物被指定为PPDP2至PPDP7。
表1.PEGn-b-PPSm-ss-DP(PPDP)的理化特征。数据表示为平均值±SD(n=3)。
为了研究聚合物的DNA包封能力,首先通过将PPDP溶液以各种重量比(PPDP:DNA=1:1-120:1)混合到DNA溶液中来配制DNA-PPDP复合物(图17)。通过凝胶阻滞测定评估DNA-PPDP复合物的形成和稳定性(图15)。在该测定中,稳定形成的DNA-PPDP复合物将保留在上样孔中,而未结合的DNA将沿着琼脂糖凝胶向下迁移。将没有聚合物缀合的DP(DP1)和一系列PPDP聚合物(PPDP2至PPDP7)以各种聚合物与DNA重量比与PBS中的DNA混合。保护核酸免受酶/核酸酶细胞外或细胞内环境的侵害对于成功的基因递送至关重要。包封良好的DNA可以得到保护而免受EtBr染色。因此,凝胶阻滞测定还可以提供有关纳米结构保护DNA免受环境侵害的信息。图2显示,聚合物/DNA重量比超过15:1的PPDP纳米结构完全阻滞了DNA迁移。更重要的是,随着聚合物/DNA比例的增加,DNA荧光逐渐降低,表明更多的聚合物的DNA包封性增强。值得注意的是,在相同的聚合物/DNA比例下,DNA-PPDP2在孔中显示出最低的DNA荧光强度,表明它提供了最佳的结合能力和DNA保护。除了基因的包封和保护外,DNA-纳米载体复合物的尺寸对于细胞摄取也是必不可少的(图15c和15d)。
通过DLS测定了DNA-PPDP纳米复合物的流体动力学尺寸。PPDP文库通过在水性溶液中简单混合自组装成稳定的纳米结构。通过动态光散射(DLS)分析测量了PPDP聚合物的尺寸分布和ζ电位。由PPDP2-PPDP7聚合物形成的纳米结构在尺寸(约20至30nm)和ζ电位(约10至40mV)上有所不同,具体取决于聚合物变体的PEG分子量和PPS长度的不同组合。此外,使用同步辐射进行的小角X射线散射(SAXS)证明了球形核壳形态的存在。
细胞毒性是开发用于生物医学应用的基因递送载体的主要问题。我们已经评估了Raw264.7巨噬细胞中以一系列重量比与DNA复合的PPDP纳米结构的细胞毒性。MTT测定证明,DNA-PPDP纳米复合物在PPDP/DNA低于60:1的情况下没有毒性作用,而当PPDP/DNA高达120:1的情况下毒性作用最小(例如,PPDP/DNA=120/1的情况下细胞活力>80%)(图2、图7、图18)。然而,没有PEG-b-PPS聚合物缀合的DP表明,即使在较低的50:1的肽/DNA重量比下,细胞活力也较低。PPDP纳米结构的细胞毒性远低于市售转染剂Lipo2K(78%活力)和PEI(PEI/DNA=5:1的活力为47%,PEI/DNA=10:1的活力为22%)。所有数据都表明,在PPDP上并入PEG覆盖层可以抑制DP的潜在毒性。
用PPDP纳米结构进行基因递送——巨噬细胞PPDP转染性能和细胞毒性的基准测试
PPDP2和PPDP5的转染效率和报告蛋白表达水平明显高于Lipo2K
在培养的RAW264.7巨噬细胞中进行一系列筛选,以评估每种PPDP纳米载体作为基因递送载体的性能。按照制造商的建议,使用行业标准Lipo2K进行转染,以对PPDP平台的性能进行基准测试。此外,为了了解PPDP是否允许转染各种尺寸范围的pDNA,使用两种不同分子量的质粒进行筛选。为了评估PPDP纳米结构进行基因递送的能力,我们使用由作为小DNA系统的尺寸为4.7Kb的CMV启动子驱动的荧光(dsRed或EGFP)(图3A、图24、图21a,例如,S-pDNA(pCMV-DsRed,4.6kb)用作模型小质粒(图24,a-c;),而由作为大DNA系统的尺寸为11.7Kb的EFS启动子驱动的加RFP标签的CRISPR(图4A、图21d,L-pDNA(pL-CRISPR.EFS.tRFP,11.7kb)用作模型大质粒(图24,d-f;),其含有EFS(短延伸因子1α)启动子并共表达RFP与Cas9蛋白)。
通过轻轻移液吹吸预先形成的PPDP纳米结构与质粒,然后在室温下混合30分钟来形成PPDP/pDNA复合物。在补充血清的培养基中,使用各种PPDP纳米结构、树枝状肽对照和Lipo2K对照,用pCMV-dsRed(4.6kb)转染RAW264.7巨噬细胞。48小时后,使用流式细胞术测定转染效率,包括转染细胞的百分比和荧光转基因的表达。还定量了质粒编码荧光蛋白的表达水平,以了解转染的程度(图24c、f;)。巨噬细胞中的基因转染效率随着PPS含量的增加而提高。在图3B和图8A中,使用PPDP2的pCMV-dsRed(4.6kb)的转染效率明显高于使用PPDP5和任何其他PPDP纳米结构,其中45.3%的用DNA-PPDP2转染的dsRed阳性细胞,而25%的用DNA-PPDP5转染的dsRed阳性细胞(p<0.01)(图24b,)。对于巨噬细胞中pCMV-dsRed(4.6kb)的转染,PPDP2和PPDP5比市售转染剂Lipo2K有效得多(p<0.001)。与小尺寸质粒相比,PPDP2和PPDP5均表明它们在递送明显更大的pEFS-RFP质粒DNA(11.7kb)方面具有稳健性,巨噬细胞中的转染效率分别为47%和40%(图4B、图10A)。具体而言并且引人注目的是,PPDP2的转染效率是Lipo2K(4.8%,p<0.0001)的约10倍。与Lipo2K相比,通过PPDP2转染pEFS-RFP的巨噬细胞中更多的RFP蛋白表达可以使用CLSM进一步确认(图4C、图11A)。鉴于PPDP2(80)和PPDP5(74)的疏水性PPS长度比其他PPDP长,这些结果支持了我们的假设,即疏水性在PPDP聚合物的基因递送中起着至关重要的作用。用于pCMV-dsRed(4.6kb)和pEFS-RFP(11.7Kb)转染的最佳DNA-PPDP纳米复合物组成对于PPDP2和PPDP5是相同的(聚合物/DNA重量比为60:1)(图3C-D、图8B-C、图4D-E、图10B-C、图22)。因此,选择聚合物与DNA重量比为60:1的PPDP2和PPDP5来验证其对其他细胞类型的基因递送能力(图23)。在这些研究中,使用较大的L-pDNA质粒,PPDP2再次明显优于Lipo2K和所有其他PPDP构建体,实现了显著更高的RFP报告基因表达水平。
为了验证PPDP2/PPDP5作为潜在DNA递送载体的广泛适用性,我们测定了各种细胞系中不同尺寸的质粒DNA的转染(图19、图20)。在NIH3T3成纤维细胞中,PPDP2和PPDP5分别显示出69.6%和57.5%的转染效率,明显高于Lipo2K的12%的转染效率(p<0.0001)(图4F、图12A)。48小时后,在转染DNA-PPDP2的NIH3T3细胞中,RFP荧光表达也比DNA-Lipo2K更明显(图4G、图11B)。
由于免疫调节的独特作用,基因工程DC已被证明是下一代癌症和传染病疫苗的潜在有效策略。然而,基于DC的治疗的进展受到遗传操作原代DC的挑战的阻碍。如图3E-F所示,小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)的原代细胞通过PPDP2和PPDP5转染pCMV-EGFP(4.6kb),分别产生19.6%和13.8%的GFP+细胞,显著高于Lipo2K转染的6.8%的GFP+细胞(p<0.01)。即使使用有效的市售可得转染试剂在原代免疫细胞中进行大DNA转染更加困难,与裸质粒DNA(p<0.001)和Lipo2K(p<0.001)相比,PPDP2和PPDP5仍然可以显著改善大质粒DNA(pEFS-RFP,11.7kb)的递送和转染(图4H-I、图12B)。此外,在相同剂量的质粒和聚合物下,对于大pEFS-RFP递送,PPDP2导致30.7%的RFP阳性细胞,转染效率明显高于PPDP5(18.7%的RFP+)。
DNA的内体逃逸和胞质递送
值得注意的是,DNA的成功的内体逃逸和胞质递送对于有效的基因递送系统至关重要。由于PPDP2在这些纳米结构中具有最佳的转染能力,因此选择PPDP2来研究DNA货物的内化和定位。通过使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像可视化纳米复合物在不同时间点的细胞内分布来表征Alexa Fluor 488标记的DNA(488-DNA)PPDP2纳米复合物的细胞内运输。如图5所示,与巨噬细胞孵育1小时后,可以在胞质中观察到488-DNA荧光(绿色),与内体/溶酶体具有一定程度的共定位(黄色),表明488-DNA-PPDP2纳米复合物的有效内体逃逸。随着孵育时间的延长(4小时和18小时),更多的纳米复合物被释放到胞质中,并且一些纳米复合物仍然被困在内体/溶酶体囊泡中,表明从内体逃逸出的纳米复合物是时间依赖性的。
PPDP平台的细胞毒性低于市售Lipo2K和聚乙烯亚胺(PEI)试剂
研究了RAW264.7巨噬细胞中以不同重量比制备的PPDP/pDNA纳米复合物的细胞毒性(图25,a-b),其。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定研究PPDP/pDNA纳米复合物的细胞毒性。这些毒性研究以领先的市售可得转染试剂Lipo2K和阳离子聚乙烯亚胺(PEI)聚合物为基准。PEI(25kDa)被列为对照,因为它是一种广泛使用的聚合物转染试剂,其具有已知的毒性问题[28-30]。
PPDP/pDNA纳米复合物在60:1的重量比下通常是无毒的(细胞活力>80%)(PPDP:S-pDNA和L-pDNA),而PPDP/pDNA比值为120:1的纳米复合物的细胞活力较低(图25,a-b)。然而,即使肽/S-pDNA重量比低于60:1,未缀合的DP肽的细胞活力也观察到降低。这些结果表明,将DP与PEG-b-PPS共聚物缀合可显著降低肽的毒性。重要的是,PPDP/pDNA纳米复合物的细胞毒性远低于市售聚合物转染剂PEI(图25,a-b)。对于PPDP2,观察到聚合物与pDNA大质粒和小质粒二者的比例高达60:1的高细胞活力(约90-100%),其细胞毒性通常低于PPDP5(图25,a-b)。
总的来说,我们的筛选研究结果证明,PPDP2和PPDP5是优于行业标准转染试剂的技术。鉴于与其他毒性更大的PPDP聚合物变体相比,PPDP2(80单位)和PPDP5(74单位)的疏水性PPS长度更长,因此增加的疏水性可能在降低毒性方面发挥作用,可能是通过调节复合物的结构和/或稳定性。在这些初步筛选工作中出现的PPDP2和PPDP5,使我们将后续开发工作重点放在这些原型上。接下来的工作强调了PPDP2纳米载体,因为它大大优于所有其他原型,包括PPDP5(图24c、f、g)。此外,PPDP2在更高的水平上表现其性能,同时表现出比PPDP5更低的细胞毒性(图25)。
PPDP聚合物对质粒DNA结合能力的优化-以60:1的聚合物与质粒的比例形成的PPDP/pDNA纳米复合物与pDNA最佳结合并形成稳定的纳米结构
为了研究聚合物结合和浓缩质粒DNA(pDNA)的能力,我们接下来使用电泳迁移率变动分析测定(EMSA)研究了PPDP/pDNA纳米复合物的形成和稳定性。在该测定中,如果PPDP/pDNA纳米复合物在施加电场开始电泳后是稳定的,则DNA将保留在凝胶的孔中。另一方面,如果纳米复合物不稳定,则未结合的pDNA将在电场存在下沿着琼脂糖凝胶向正极迁移。这些研究使用小质粒(S-pDNA,4.6kb)和大质粒(L-pDNA,11.7kb)来了解不同的质粒大小是否需要不同的聚合物与质粒的比例才能发挥最佳性能。通过将PPDP与pDNA以各种聚合物与pDNA重量比(PPDP:pDNA=1:1-120:1)组合来配制PPDP/pDNA复合物,用于EMSA实验(图15,a-b)。
pDNA的迁移完全被聚合物/pDNA重量比大于15:1的PPDP纳米结构所阻碍(图15,a-b)。值得注意的是,随着聚合物/pDNA比的增加,pDNA对核酸染色的可及性逐渐降低,这表明响应于共聚物相对量的增加,pDNA结合更紧凑的纳米结构得到增强(图15,a-b)。这些结果验证了PPDP聚合物能够与S-pDNA(图15a)和L-pDNA(图15b)结合。值得注意的是,在孔中,PPDP2/pDNA和PPDP5/pDNA在60:1的重量比(PPDP:S-pDNA和L-pDNA)下显示出最低的pDNA荧光强度,表明最佳的pDNA结合能力。
接下来,我们研究了PPDP聚合物与pDNA的质量比对颗粒尺寸和ζ电位的影响(图15,c-d)。随着质量比的增加,纳米复合物的尺寸增加,ζ电位变得更正(图4,c-d)。随着PPDP/pDNA的比例从1:1增加到60:1,纳米复合物从带负电荷、中性到带正电荷发生变化。根据EMSA结果(图15,a-b)、尺寸和ζ电位表征(图15,c-d)以及细胞毒性研究(图25),我们选择了60:1的最佳比例进行进一步的基因转染研究。当含有S-pDNA或L-pDNA的情况下,观察到60:1的PPDP/pDNA纳米复合物是球形和单分散纳米结构,如通过低温透射电子显微镜(cryoTEM)观察到的那样(图15,e-f;)。
本文描述的纳米载体的直径和ζ电位可以具有范围很宽的ζ电位和直径。例如,在一些实施方案中,纳米载体的ζ电位为+80至-80,直径为5nm至500nm。
PPDP系统同时使用自组装和静电复合。高的聚合物与有效载荷的比例是自组装系统的标准配置,但DNA/聚合物复合物需要高的比例。PPDP介于这两者之间,因为它需要更大量的聚合物,因此PPDP会影响复合物的组装,这可以解释纳米结构的均匀性(图15)。
60:1的PPDP:pDNA的比例可实现最佳的体外转染效率
接下来,我们使用性能最高的PPDP2和PPDP5构建体研究了PPDP:pDNA的比例与细胞转染性能之间的关系。我们假设60:1的PPDP:pDNA的比例在这些研究中也会表现最佳,因为它在EMSA研究中显示出最稳定的质粒结合。此外,我们还研究了经济性较差的超过60:1的PPDP:pDNA的比例是否会以在配方中需要额外的共聚物为代价来提供任何性能益处。用PPDP:pDNA复合物转染巨噬细胞,并通过流式细胞术定量编码报告蛋白的质粒的转染效率(图26,a-b)和表达水平。
对于PPDP2和PPDP5,观察到以60:1的PPDP:pDNA的比例制备的纳米载体对小模型质粒(图26a)和大模型质粒(图26b)的转染效率最高。除PPDP2/L-pDNA的结果例外之外,60:1的比例明显优于所有其他测试的PPDP:pDNA的比例(图26,a-b)。在例外的情况下,我们注意到PPDP2介导的大L-pDNA质粒转染在60:1的比例下比更高的100:1的比例更有效,尽管这种差异没有统计学意义(图26b)。尽管如此,这些结果表明,60:1的PPDP:pDNA的比例对于小质粒和大质粒的转染都是最佳的,并且增加使用的聚合物相对于pDNA的量没有任何好处。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步证实,使用PPDP2转染L-pDNA的巨噬细胞中的RFP蛋白表达水平大于Lipo2K实现的RFP表达水平(图26c)。
PPDP在酸性条件下经历无序到有序的转变为独特的螺旋构象,并促进pDNA货物的细胞内释放——PPDP纳米载体的树枝状肽缀合物在pH 6.0下具有独特的螺旋构象
我们的初步筛选和聚合物与DNA的比例优化研究的结果表明,以60:1的PPDP:pDNA制备的PPDP2始终优于所有其他纳米载体和市售试剂。因此,进一步在机理研究中研究了该PPDP2制剂,试图表征其内溶酶体逃逸特性。基于DP氨基酸组成的生化特性(图16a),我们假设该肽的构象在酸性渐增的环境中会发生变化。
为了评估PPDP的pH响应结构,由PPDP2共聚物自组装成球形纳米结构(图16b),通过DLS测量的平均直径为19.6nm,表面电荷为48.0mV(图16c)。PPDP2纳米结构的DP成分很容易通过傅里叶变换红外(FTIR)光谱法在溶液中检测到(图16,d-e)。PPDP2纳米结构在1700-1600cm-1带表现出预期的酰胺I峰(C=O拉伸),这是肽键的特征(图6d)。正如预期的那样,在DP肽对照中也可检测到该峰,尽管其强度被1800-1700cm-1带的更强峰部分掩盖。从PPDP2样品中减去PEG-b-PPS谱,使得能够初步评估螺旋二级结构。在图6e所呈现的差异谱图中,在酰胺I条带内在1660cm-1附近观察到一个强峰。这些结果表明,PPDP2可能采用螺旋二级结构。
接下来,我们进行了圆二色性(CD)光谱法,以更彻底地研究树枝状肽是否采用螺旋二级结构,以及是否响应于从pH 7.5到pH 5.5的转变而发生构象变化(图16,f-g)。在纳米结构通过逐渐变得更加酸性的内溶酶体途径运输的背景下,该pH范围特别有趣。在我们的生物物理研究中,PPDP2在任何情况下都没有采取传统的α-螺旋二级结构,这将由CD谱中208nm和222nm处的两个负峰表示[57](图16f)。
我们最初怀疑PPDP2本质上是无序的,这是许多肽和蛋白质普遍存在的特征[58-67]。相反,对PPDP2的CD谱的更仔细的研究提供了类似于PPII(聚脯氨酸II)样结构的不同、更深奥的螺旋结构的证据,PPII样结构可以由缺乏脯氨酸残基的肽形成[68],并且具有无序和有序状态的谱特征的特征组合(图16f)。采用无规卷曲状态的蛋白质和肽通常在200nm附近具有负峰。然而,通过220nm附近(但对于采用PPII样构象的缺乏脯氨酸的肽低至210nm[70])和197nm处的最小值[70]的特征正峰[69]揭示了PPII样螺旋结构,该特征正峰是一种谱特征,用于将这些特殊的螺旋构象与纯粹的无序状态区分开来。在我们的研究中,PPDP2在pH 7.5的情况下在约201nm处和在pH 6.5的情况下在约204nm处表现出一个强烈的负峰,而最酸性条件(pH 5.5)在约197nm处诱导强烈的左移至最小值。将PPDP2的CD谱与无序谱区分开来的关键特征是在pH 5.5下观察到的,其中在215nm处观察到一个强烈的正峰(图16f)。因此,在模拟更强酸性细胞内环境的条件下,PPDP2的CD谱在197nm处包含一个负峰,在215nm处包含一个正峰,这表明它在pH 6.5以下采用PPII样螺旋构象。这种解释与过去的研究一致,这些研究证明赖氨酸均聚物采用具有相似谱特征的PPII样螺旋结构[71-73],可以通过赖氨酸在主链中的构象[71]或通过静电相互作用[74]来稳定。由于树枝状肽内的赖氨酸侧链用于分支(图1),因此不可用于静电相互作用,因此树枝状肽主链内赖氨酸残基的化学键可能会促进PPII样螺旋构象的形成。
有趣的是,游离树枝状肽(未缀合对照)在pH 7.5和pH 6.5下在约195nm处出现一个峰,在pH 5.5下在约200nm处出现一个峰(图16g)。这种未缀合的树枝状肽在所有pH值下也表现出正峰(约215nm),表明它在所有条件下都具有PPII样螺旋结构。由于PPDP2的正峰仅在pH 5.5的情况下观察到,因此这些结果表明,将肽与聚合物缀合会使肽构象具有pH响应性。在基因递送技术的背景下,PPDP2的CD谱图中pH 7.5和pH 6.5下没有约215nm阳性峰,表明肽在到达酸性溶酶体区室之前是无序的。然而,一旦PPDP2到达溶酶体(pH<6),它就可以采用螺旋构象。这种在酸性环境中发生的PPDP2由无序到有序的转变可能为溶酶体逃逸提供一种机制。在所研究的所有pH值下,PPDP2中精氨酸(pKa约为9)的可离子化胍基团被质子化,并提供与DNA的稳定的静电相互作用。在低于6.0的pH下,组氨酸残基的咪唑基团(pKa约为6)应被质子化,并为与DNA的静电相互作用提供额外的手段。稳定酸性溶酶体区室内的PPDP2-DNA相互作用很重要,因为由于PPS的氧化,高级纳米结构在这些条件下会分解[42]。此外,还已知质子化的组氨酸残基与在膜结合中起作用的亮氨酸残基协同促进膜破坏[56,75]。因此,氧化介导的PPS疏水性损失以及树枝状肽在酸性条件下DNA结合和膜破坏能力的增强,都与溶酶体中采用PPII样螺旋相吻合。值得注意的是,已知螺旋构象可促进溶酶体区室中货物的胞质释放[76,77]。因此,我们得出结论,螺旋结构的形成与PPDP2的离子化氨基酸残基和PPDP2的氧化PPS部分的功能在低pH(pH<6)下协同作用,以促进DNA货物从溶酶体有效释放到胞质中。
PPDP通过内溶酶体途径运输并以时间依赖性方式将pDNA有效载荷释放到胞质中
我们试图研究使用pH响应性PPDP2纳米载体递送的DNA货物的细胞内化和定位。为此,使用CLSM成像来可视化PPDP2/Alexa Fluor 488标记的pDNA(pcDNA3.1,5.4kb)纳米复合物在不同时间点的细胞内运输。包括早期1小时和4小时的时间点以研究通过内溶酶体途径的纳米载体迁移以及内体逃逸的开始,而包括18小时的时间点以研究pDNA有效载荷的胞质积累随时间的变化(图5)。与RAW264.7巨噬细胞孵育1小时后,绿色荧光(Alexa Fluor488)主要被观察到为与内体/溶酶体区室共定位的点状体。在4小时和18小时的较长孵育时间,纳米复合物从内溶酶体区室逃逸并释放到胞质中。通过弥漫性绿色荧光的存在观察到胞质释放,弥漫性绿色荧光不再与内体/溶酶体区室共定位。一小部分纳米复合物在4小时和18小时的时间点仍被困在内体/溶酶体区室中。然而,与4小时相比,18小时的弥漫性绿色信号的强度要大得多,并且这种变化也与18小时共定位信号的减少相吻合。这些结果证明,Alexa Fluor 488标记的pDNA在通过PPDP2纳米复合物进行细胞内递送后,随着时间的推移有效并且渐增地从溶酶体中逃逸。
PPDP平台有效转染先天性免疫细胞和适应性免疫细胞
为了验证PPDP2和PPDP5作为潜在DNA递送载体的广泛适用性,我们评估了各种细胞系的L-pDNA转染(图11)。在血清存在下,在每种细胞类型的标准培养条件下进行转染。我们首先测试了NIH 3T3小鼠成纤维细胞,该细胞已广泛用于生物学研究中的DNA转染研究和重组蛋白表达。共聚焦成像显示,在通过PPDP2/L-pDNA转染的NIH 3T3细胞中,48小时后广泛的RFP荧光表达,但在相同时间点,裸L-pDNA和Lipo2K/L-pDNA则很小或没有可检测信号(图11a)。流式细胞术分析证明,PPDP2和PPDP5在成纤维细胞中的转染效率分别为69.6%和57.5%(图11b)。这些转染效率明显高于Lipo2K测得的12%的转染效率(图11b)。与我们在巨噬细胞中的结果一致,PPDP2转染成纤维细胞的效率明显高于PPDP5(图11b)。
接下来,我们研究了PPDP技术是否可以有效地转染树突细胞(DC)。开发促进遗传工程改造DC生产的技术引起了极大的兴趣,因为它们在免疫调节中具有独特和多功能的作用,并且它们在制造下一代癌症和传染病疫苗方面具有潜在用途。然而,原代DC的遗传操作仍然具有挑战性,并继续阻碍开发基于DC的疗法的进展。使用PPDP2和PPDP5用L-pDNA转染原代小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)(图11,c-d)。PPDP2介导的转染产生30.7%的RFP阳性(RFP+)细胞,而在用PPDP5转染后则产生18.7%的RFP+细胞(图11,c-d)。这些百分比显著高于裸质粒DNA和Lipo2K对照(图11,c-d)。
最后,我们研究了使用PPDP2和PPDP5用大质粒转染Jurkat T细胞(图11,e-f)。Jurkat T细胞是永生化的人T淋巴细胞,通常用于研究T细胞生物学和开发工程改造T细胞技术的原型。PPDP2和PPDP5增加了RFP+T细胞的百分比,与阴性对照组相比,流式细胞术直方图向右移动(图8e)。有趣的是,PPDP2和PPDP5的转染效率都显著高于Lipo2K(图11f)。虽然用大质粒通过PPDP5转染T细胞的效率略高于PPDP2,但这种转染差异没有显著差异(图11f)。在T细胞中观察到的这种趋势(图11f)与我们使用成纤维细胞和DC的观察不同,其中PPDP2的转染效率显著高于PPDP5(图11,b-d)。目前尚不清楚为什么PPDP2在用大质粒转染T细胞方面没有优势,然而,了解这种差异的机制超出了目前工作的范围。总之,这些结果证明,PPDP2和PPDP5显著改善了大质粒DNA分子向原代免疫细胞的递送,并实现了比市售可得转染试剂更高的转染效率(图11)。
实施例1结果的概述
我们开发并优化了一种聚合物纳米载体,作为用于各种免疫细胞类型的非病毒和无毒的质粒转染试剂,无需专门的培养条件或培养基。PPDP载体由与阳离子树枝状肽缀合的自组装PEG-b-PPS共聚物组成。树枝状肽的每个分支都有一个精氨酸末端,可通过静电相互作用与DNA稳定复合,赖氨酸分支主链在酸性环境中经历螺旋构象变化,可能有助于内体逃逸。这种溶酶体逃逸是pDNA扩散到细胞核中的先决条件,在那里它可以被转录并翻译成蛋白质产物,因此是任何有效的基因递送技术和转染试剂的基本特征。先前已证明由PEG-b-PPS共聚物组装的纳米载体增强各种治疗性有效载荷的胞质递送[40,43,52],而在这里,阳离子树枝状肽的缀合实现了对小(S-pDNA;4.6kb)和大(L-pDNA;11.7kb)的这种能力。筛选PPDP的尺寸和表面特性产生了PPDP2和PPDP5构建体,在使用巨噬细胞、成纤维细胞、原代BMDC和T细胞的体外研究中,发现这些构建体是增强转染的最佳选择,毒性显著低于市售标准lipofectamine。虽然发现PPDP2总体上更有效,但这两种构建体对于用大pDNA元件转染细胞特别有用。因此,PPDP是一种很有前途的非病毒载体,在高效的体外转染方面具有许多优势,包括极低的毒性、熟练胞质递送大遗传元件,以及在标准培养条件下对通常难以转染的免疫细胞群的功效。
此外,图27证明,预期到了聚合物的缀合。数据显示,我们的PEG-PPS聚合物与树枝状肽缀合前后,导致尺寸排阻色谱(SEC)色谱柱内的洗脱时间发生变化。这验证了预期聚合物的形成。
实验部分/方法
材料和细胞系:除非另有说明,否则所有化学品均从Sigma-Aldrich购买。从Peptide 2.0购买了序列为{[(RHL)2-KRHL]2-KRHL},2-KC-NH2的树枝状肽(DP)。从American Type Culture Collection(ATCC,Inc.)购买了小鼠巨噬细胞RAW 264.7、小鼠成纤维细胞NIH 3T3和人Jurkat T细胞。从Life Technologies购买了DMEM和RPMI 1640培养基、青霉素/链霉素抗生素和胎牛血清(FBS)以进行细胞培养。所有细胞培养基均在37℃和5%CO2下补充10%(v/v)胎牛血清(FBS)、青霉素(100IU/mL)和链霉素(100μg/mL)。
质粒:小质粒DNA:从Clontech Laboratories购买了pCMV-DsRed(4.6kb),从Thermo Fisher Scientific购买了不带荧光标签的pcDNA3.1(5.4kb)。大质粒DNA(L-pDNA):从Addgene购买了pL-CRISPR.EFS.tRFP(11.7kb)。所有质粒均在DH5α感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)中繁殖。使用NanoDrop 2000仪器(Thermo FisherScientific)通过测量260nm处的吸光度来确定质粒DNA浓度。
小鼠原代骨髓来源的树突细胞的产生:如前所述制备骨髓来源的树突细胞(BMDC)[78]。简而言之,从幼稚C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory)的胫骨和股骨中收集骨髓细胞。然后将细胞重悬于原代培养基(补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100IU/mL)和链霉素(100mg/mL)、B-Me(50Um)、L-Gln(2×10-3m)、GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(10ng/mL)的RPMI1640培养基)中。将细胞以密度为1×106个细胞/mL在100mm培养皿中培养,并在37℃与5%CO2下孵育7天。7天后,收获、洗涤非贴壁和松散贴壁细胞(imDC)并用于体外实验。
PEG-b-PPS-s-s-DP(PPDP)聚合物的合成:如先前所述合成嵌段共聚物PEGm-b-PPSn [39,43,79,80]。简言之,通过甲氧基PEG-OH(MW=750或2000)的硫代乙酸酯改性制备了聚乙二醇(PEG)基引发剂。用甲醇钠对PEG硫代乙酸酯引发剂进行脱保护,以展示引发硫代酸酯。调整反应中使用的丙烯硫醚(PPS)的量以聚合所需的嵌段长度。聚合由过量的2,2′-二硫代二吡啶(5当量)封端。然后通过在冷甲醇或乙醚中双重沉淀来纯化所获得的嵌段共聚物(PEG17-b-PPS80-pds,PEG17-b-PPS51-pds,PEG17-b-PPS42-pds,PEG45-b-PPS74-pds,PEG45-b-PPS48-pds,PEG45-b-PPS25-pds)。所有聚合物均采用1H NMR(CDCl3)表征。将树枝状肽(DP)经二硫键交换来缀合至不同PEG-b-PPS聚合物。将PEG-b-PPS(50-100mg)与DP(1.2当量)在三乙胺/二甲基甲酰胺(DMF)(0.1/1mL)中反应。在冷乙醚中重复沉淀来纯化肽-聚合物缀合物,以除去2-吡啶硫酮。将真空干燥的肽-聚合物缀合物分散在水(分子生物学级)中,然后使用Slide-A-Lyzer透析盒(20K MWCO,Thermo Fisher Scientific)对水透析以除去未反应的肽。纯化后,将PEG-PPS-ss-DP缀合物冻干。
PPDP纳米结构的制备:在这些研究中使用了各种PPDP聚合物,包括PEG17-b-PPS80-ss-DP(PPDP2),PEG17-b-PPS51-ss-DP(PPDP3),PEG17-b-PPS42-ss-DP(PPDP4),PEG45-b-PPS74-ss-DP(PPDP5),PEG45-b-PPS48-ss-DP(PPDP6)和PEG45-b-PPS25-ss-DP(PPDP7)。将指定的PPDP聚合物溶解在水(分子生物学级)中,以制备浓度为10mg/mL的聚合物储液。通过将PPDP载体和pDNA溶液用水稀释至50μL的体积,然后以范围为1至120的聚合物与DNA质量比(w/w)混合,来形成质粒DNA-PPDP纳米复合物(DNA-PPDP)。通过轻轻移液吹吸30秒,然后在室温下孵育30分钟步骤,形成所得DNA-PPDP复合物。
PPDP纳米结构形态和理化性质的表征:使用Zetasizer Nano仪器(MalvernInstruments)测量了PPDP纳米结构的尺寸分布和ζ电位。采用低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)表征纳米结构形态。简言之,将200目莱西碳网格在Pelco easiGlow辉光放电器(TedPella Inc.)中以0.24mBar的腔室压力在15mA辉光放电30秒。用4μL样品制备网格,并使用FEI Vitrobot Mark III冷冻深度冷冻(plunge freeze)装置将网格放入液态乙烷中深度冷冻5秒,点偏移为0.5mm。深度冷冻后,将网格加载到Gatan 626.5冷冻转移支架中,并在-172℃下在JEOL JEM1230 LaB6发射TEM(JEOL USA,Inc.)中以100kV进行成像。使用GatanOrius 2k x 2k相机采集数据。
小角X射线散射(SAXS):SAXS在Argonne National Laboratory(Argonne,IL,USA)的Advanced Photon Source(APS)在DuPont-Northwestern-Dow Collaborative AccessTeam(DND-CAT)的光束线上进行。使用约7.5m的样品到检测器的距离。硅酸银(Silverbehenate)衍射图用于校准q范围。使用3秒的曝光时间用10keV X射线照射样品。以0.001-分析数据。PRIMUS2.8.3和SasView 5.0软件分别用于数据缩减和模型拟合。核心壳球模型与数据拟合。按照既定程序进行建模[41,47,50]。
pH依赖性肽构象变化的表征:通过Nicolet iS50 FTIR Spectrometer(ThermoScientific)采集FT-IR谱。获得PPDP2、肽和PEG-b-PPS的液体样品的谱。在2000-600cm-1的范围对每个样品收集64次扫描。对于圆二色性(CD)光谱法研究,在水中制备PEG-b-PPS、肽和PPDP2,并在分析前将pH调节至5.5、6.5和7.5。在石英比色皿(0.1cm光程)中制备样品并且使用Jasco J-815 CD Spectrometer进行CD光谱法。使用以下参数通过在190-300nm波长范围内的连续扫描收集数据:扫描速度为100nm/min,数字积分时间为2秒,带宽为2nm,并且数据间距为0.5nm。监测高张力(HT)电压,以确保在线性范围内收集数据。
电泳迁移率变动分析测定(EMSA):通过EMSA测定PPDP/pDNA纳米复合物的稳定性。如本方法部分其他地方所述,以不同的PPDP与pDNA的重量比制备PPDP/pDNA纳米复合物。对于每种样品使用相同量的pDNA(0.5μg)。将获得的纳米复合物(10μL)与上样缓冲液混合并上样到浸没在Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液(40mM Tris-碱,20mM乙酸,1mM EDTA钠盐)中的含有核酸染料的1%琼脂糖凝胶上。电泳在100V的恒定电压下进行30分钟(Bio-Rad,Inc.)。使用LAS 4010凝胶成像系统(GE Healthcare)对凝胶进行成像。
细胞活力测定:使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定确定了用各种PPDP/pDNA、Lipofectamine 2000/pDNA复合物(Lipo2K)、PEI/pDNA复合物(分子量为25kDa的PEI)和树枝状肽(DP1)/pDNA复合物转染的细胞的相对活力。将细胞接种在96孔板中,接种密度为100μL培养基中每孔30,000个细胞。然后将细胞在指定条件下处理,孵育时间段为24小时(用0.2μg的DNA):裸pDNA,Lipofectamine 2000/DNA,PEI(25kDa)/DNA(w/w为5:1至10:1),DP1/DNA(w/w为10:1至50:1),PPDP2/DNA(w/w为30:1至120:1),PPDP3/DNA(w/w为30:1至120:1),PPDP4/DNA(w/w为30:1至120:1),PPDP5/DNA(w/w为30:1至120:1),PPDP6/DNA(w/w为30:1至120:1),PPDP7/DNA(w/w为30:1至120:1)。24小时后,将细胞用MTT试剂(PBS中5mg/mL,每孔10μL)孵育4小时。DMSO(200μL)用于溶解在每个孔中形成的所得甲臜晶体。使用SpectraMax M3多模式酶标仪(Molecular Devices,LLC)测量560nm光的吸光度。细胞活力计算为与未处理对照相比的活力百分比。
体外细胞转染:在这些研究中,pCMV-DsRed(4.6kb)用作小质粒,pL.CRISPR.EFS.tRFP(11.7kb)用作大质粒。在24孔板中,以105个细胞/孔接种RAW 264.7、BMDC和Jurkat细胞,以5x104个细胞/孔接种NIH 3T3成纤维细胞。对于每种转染样品,按如下方式制备PPDP-质粒DNA纳米复合物(PPDP/DNA)。稀释PPDP储液(3μL的10mg/ml的PPDP于50μL的不含血清的PRMI或DMEM培养基中)和质粒DNA储液(0.25μL的2mg/ml的pDNA于不含血清的PRMI或DMEM培养基中)。通过将50μL稀释的PPDP悬浮液加入到50μL稀释的pDNA溶液中来制备PPDP/DNA纳米复合物。通过轻轻移液吹吸30秒,然后在室温下孵育30分钟,形成所得PPDP/DNA纳米复合物。根据制造商的说明制备Lipofectamine 2000-pDNA复合物。简言之,稀释质粒DNA储液(0.25μL的2mg/ml的pDNA于50μL的不含血清的PRMI或DMEM培养基中)并轻轻混合。稀释1μl的Lipofectamine 2000于50μL的不含血清的PRMI或DMEM培养基中并轻轻混合。孵育5分钟之后,将稀释的pDNA与稀释的Lipofectamine 2000合并,轻轻混合,并在室温下孵育20分钟。将100μl的裸质粒、Lipo2K/DNA、PPDP2/DNA、PPDP3/DNA、PPDP4/DNA、PPDP5/DNA、PPDP6/DNA、PPDP7/DNA(PPDP/DNA w/w 60:1)悬浮液与400μl含有血清的完全培养基混合并添加到每个孔(每孔500ng质粒于500μl培养基中)。转染48小时的时间段之后,使用BD LSRFortessa 6-Laser流式细胞仪(BD Biosciences)通过流式细胞术定量转染效率(DsRed+和RFP+细胞的百分比)和平均荧光强度(MFI)。使用FlowJo软件来分析所采集的流式细胞术数据。将RAW 264.7和NIH 3T3细胞以104个细胞/孔种板于8孔Chamber slides(Thermo Fisher Scientific)并在使用前培养24小时,以进行共聚焦显微镜分析。然后,以每孔500ng质粒用裸质粒、Lipo2K/DNA和PPDP2/DNA(PPDP2/DNA w/w 60:1)分别转染细胞。48小时后,用NucBlueTMLive ReadyProbesTMReagent(细胞核染料,一滴)在黑暗中复染细胞15分钟。在Leica TCS SP8共聚焦显微镜以40X油浸物镜采集图像。
细胞内化分析:使用制造商的程序用Alexa Fluor 488TMUlysisTMNucleic AcidLabelling Kit(Thermo Fisher Scientific)荧光标记小质粒DNA(pcDNA3.1,5.4kb)。以每孔20,000个细胞在8孔Chamber slides(Thermo Fisher Scientific)中准备RAW 264.7细胞并在使用前培养24小时。如上所述,将Alexa Fluor 488标记的pDNA(488-DNA)与PPDP2(PPDP2:质粒w/w 60:1)或Lipo2K(Lipo2K:质粒v/w 6μl/μg)混合。将所获得的488-pDNAPPDP2复合物(488-pDNA-PPDP2)、488-pDNA和488-pDNA-Lipo2K与细胞孵育指定的1小时、4小时或18小时的孵育时间段。每孔的488-pDNA的浓度为1μg/mL。孵育后,用PBS洗涤细胞两次,随后用LysoTrackerTMRed DND-99(1:5000稀释,300μL DMEM)孵育30分钟。之后,用PBS洗涤细胞两次,并在黑暗中每孔用在300μL PBS中的NucBlueTMLive ReadyProbesTM试剂(细胞核染料,1滴)孵育15分钟。在Leica TCS SP8共聚焦显微镜以63X油浸物镜采集图像。
统计分析:使用GraphPad Prism软件(版本8)进行数据分析。数据以平均值±SD表示。使用适当的统计检验确定显著性,如相应的图例中所述。
实施例1的参考文献
参考文献
[1]R.S.Riley,C.H.June,R.Langer,M.J.Mitchell,Nat Rev Drug Discov 2019,18,175.
[2]R.A.Larocca,P.Abbink,J.P.S.Peron,P.M.de A.Zanotto,M.J.Iampietro,A.Badamchi-Zadeh,M.Boyd,D.Ng’ang’a,M.Kirilova,R.Nityanandam,N.B.Mercado,Z.Li,E.T.Moseley,C.A.Bricault,E.N.Borducchi,P.B.Giglio,D.Jetton,G.Neubauer,J.P.Nkolola,L.F.Maxfield,R.A.De La Barrera,R.G.Jarman,K.H.Eckels,N.L.Michael,S.J.Thomas,D.H.Barouch,Nature 2016,536,474.
[3]T.R.F.Smith,A.Patel,S.Ramos,D.Elwood,X.Zhu,J.Yan,E.N.Gary,S.N.Walker,K.Schultheis,M.Purwar,Z.Xu,J.Walters,P.Bhojnagarwala,M.Yang,N.Chokkalingam,P.Pezzoli,E.Parzych,E.L.Reuschel,A.Doan,N.Tursi,M.Vasquez,J.Choi,E.Tello-Ruiz,I.Maricic,M.A.Bah,Y.Wu,D.Amante,D.H.Park,Y.Dia,A.R.Ali,F.I.Zaidi,A.Generotti,K.Y.Kim,T.A.Herring,S.Reeder,V.M.Andrade,K.Buttigieg,G.Zhao,J.-M.Wu,D.Li,L.Bao,J.Liu,W.Deng,C.Qin,A.S.Brown,M.Khoshnejad,N.Wang,J.Chu,D.Wrapp,J.S.McLellan,K.Muthumani,B.Wang,M.W.Carroll,J.J.Kim,J.Boyer,D.W.Kulp,L.M.P.F.Humeau,D.B.Weiner,K.E.Broderick,Nat Commun 2020,11,2601.
[4]S.Chang,E.L.Mahon,H.A.MacKay,W.H.Rottmann,S.H.Strauss,P.M.Pijut,W.A.Powell,V.Coffey,H.Lu,S.D.Mansfield,T.J.Jones,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant2018,54,341.
[5]C.E.Dunbar,K.A.High,J.K.Joung,D.B.Kohn,K.Ozawa,M.Sadelain,Sciencen.d.,359,DOI 10.1126/science.aan4672.
[6]T.I.Cornu,C.Mussolino,T.Cathomen,Nat Med 2017,23,415.
[7]H.Li,Y.Yang,W.Hong,M.Huang,M.Wu,X.Zhao,Signal Transduction andTargeted Therapy 2020,5,1.
[8]G.J.Knott,J.A.Doudna,Science 2018,361,866.
[9]L.Cong,F.Zhang,Methods Mol Biol 2015,1239,197.
[10]C.Liu,L.Zhang,H.Liu,K.Cheng,J Control Release 2017,266,17.
[11]B.H.Yip,Biomolecules 2020,10,DOI 10.3390/biom10060839.
[12]H.Song,M.Yu,Y.Lu,Z.Gu,Y.Yang,M.Zhang,J.Fu,C.Yu,J.Am.Chem.Soc.2017,139,18247.
[13]B.Shi,M.Zheng,W.Tao,R.Chung,D.Jin,D.Ghaffari,O.C.Farokhzad,Biomacromolecules 2017,18,2231.
[14]R.M.David,A.T.Doherty,Toxicological Sciences 2017,155,315.
[15]A.Baldo,E.van den Akker,H.E.Bergmans,F.Lim,K.Pauwels,Curr GeneTher 2013,13,385.
[16]J.L.Shirley,Y.P.de Jong,C.Terhorst,R.W.Herzog,Molecular Therapy2020,28,709.
[17]N.F.Nidetz,M.C.McGee,L.V.Tse,C.Li,L.Cong,Y.Li,W.Huang,Pharmacology&Therapeutics 2020,207,107453.
[18]R.Goswami,G.Subramanian,L.Silayeva,I.Newkirk,D.Doctor,K.Chawla,S.Chattopadhyay,D.Chandra,N.Chilukuri,V.Betapudi,Front.Oncol.2019,9,DOI10.3389/fonc.2019.00297.
[19]N.Nayerossadat,T.Maedeh,P.A.Ali,Adv Biomed Res 2012,1,DOI10.4103/2277-9175.98152.
[20]E.Ayuso,Mol Ther Methods Clin Dev 2016,3,15049.
[21]M.G.Moleirinho,R.J.S.Silva,P.M.Alves,M.J.T.Carrondo,C.Peixoto,Expert Opin Biol Ther 2020,20,451.
[22]A.Srivastava,K.M.G.Mallela,N.Deorkar,G.Brophy,J Pharm Sci 2021,DOI 10.1016/j.xphs.2021.03.024.
[23]J.C.M.van der Loo,J.F.Wright,Hum Mol Genet 2016,25,R42.
[24]Y.Zhang,A.Satterlee,L.Huang,Mol Ther 2012,20,1298.
[25]M.Ramamoorth,A.Narvekar,J Clin Diagn Res 2015,9,GE01.
[26]A.B.Hil,M.Chen,C.-K.Chen,B.A.Pfeifer,C.H.Jones,Trends Biotechnol2016,34,91.
[27]M.P.Stewart,A.Sharei,X.Ding,G.Sahay,R.Langer,K.F.Jensen,Nature2016,538,183.
[28]O.Boussif,F.Lezoualc’h,M.A.Zanta,M.D.Mergny,D.Scherman,B.Demeneix,J.P.Behr,Proc Natl Acad Sci U S A 1995,92,7297.
[29]D.Fischer,T.Bieber,Y.Li,H.P.T.Kissel,Pharm Res 1999,16,1273.
[30]W.T.Godbey,K.K.Wu,A.G.Mikos,J Biomed Mater Res 1999,45,268.
[31]X.Xu,Y.Jian,Y.Li,X.Zhang,Z.Tu,Z.Gu,ACS Nano 2014,8,9255.
[32]H.Zeng,M.E.Johnson,N.J.Oldenhuis,T.N.Tiambeng,Z.Guan,ACSCent.Sci.2015,1,303.
[33]D.Zhou,L.Cutlar,Y.Gao,W.Wang,J.O’Keeffe-Ahern,S.McMahon,B.Duarte,F.Larcher,B.J.Rodriguez,U.Greiser,W.Wang,Science Advances 2016,2,e1600102.
[34]S.Wang,R.Chen,Chem Mater 2017,29,5806.
[35]N.Malik,R.Wiwattanapatapee,R.Klopsch,K.Lorenz,H.Frey,J.W.Weener,E.W.Meijer,W.Paulus,R.Duncan,J Control Release 2000,65,133.
[36]A.Kwok,G.A.Eggimann,J.-L.Reymond,T.Darbre,F.Hollfelder,ACS Nano2013,7,4668.
[37]E.Abbasi,S.F.Aval,A.Akbarzadeh,M.Milani,H.T.Nasrabadi,S.W.Joo,Y.Hanifehpour,K.Nejati-Koshki,R.Pashaei-Asl,Nanoscale Res Lett 2014,9,247.
[38]K.Madaan,S.Kumar,N.Poonia,V.Lather,D.Pandita,J Pharm BioalliedSci 2014,6,139.
[39]S.Yi,S.D.Allen,Y.-G.Liu,B.Z.Ouyang,X.Li,P.Augsornworawat,E.B.Thorp,E.A.Scott,ACS Nano 2016,10,11290.
[40]S.Yi,X.Zhang,M.H.Sangji,Y.Liu,S.D.Allen,B.Xiao,S.Bobbala,C.L.Braverman,L.Cai,P.I.Hecker,M.DeBerge,E.B.Thorp,R.E.Temel,S.I.Stupp,E.A.Scott,Adv Funct Mater 2019,29,1904399.
[41]M.P.Vincent,S.Bobbala,N.B.Karabin,M.Frey,Y.Liu,J.O.Navidzadeh,T.Stack,E.A.Scott,Nat Commun 2021,12,648.
[42]A.E.Vasdekis,E.A.Scott,C.P.O’Neil,D.Psaltis,Jeffrey.A.Hubbell,ACSNano 2012,6,7850.
[43]E.A.Scott,A.Stano,M.Gillard,A.C.Maio-Liu,M.A.Swartz,J.A.Hubbell,Biomaterials 2012,33,6211.
[44]S.Allen,O.Osorio,Y.-G.Liu,E.Scott,J Control Release 2017,262,91.
[45]S.Allen,M.Vincent,E.Scott,J Vis Exp 2018,e57793.
[46]S.Bobbala,S.D.Allen,S.Yi,M.Vincent,M.Frey,N.B.Karabin,E.A.Scott,Nanoscale 2020,12,5332.
[47]T.Stack,M.Vincent,A.Vahabikashi,G.Li,K.M.Perkumas,W.D.Stamer,M.Johnson,E.Scott,Small 2020,2004205.
[48]T.Stack,Y.Liu,M.Frey,S.Bobbala,M.Vincent,E.Scott,NanoscaleHoriz.2021,6,393.
[49]M.P.Vincent,T.Stack,A.Vahabikashi,G.Li,K.M.Perkumas,R.Ren,H.Gong,W.D.Stamer,M.Johnson,E.A.Scott,bioRxiv 2021,2021.05.19.444878.
[50]M.P.Vincent,N.B.Karabin,S.D.Allen,B.Sharan,M.A.Frey,S.Yi,Y.Yang,E.A.Scott,Adv Ther 2021,2100062,DOI 10.1002/adtp.202100062.
[51]S.D.Allen,Y.-G.Liu,S.Bobbala,L.Cai,P.I.Hecker,R.Temel,E.A.Scott,Nano Res.2018,11,5689.
[52]D.J.Dowling,E.A.Scott,A.Scheid,I.Bergelson,S.Joshi,C.Pietrasanta,S.Brightman,G.Sanchez-Schmitz,S.D.Van Haren,J.D.Kats,C.Guiducci,A.deTitta,D.K.Bonner,S.Hirosue,M.A.Swartz,J.A.Hubbell,O.Levy,Journal of Allergyand Clinical Immunology 2017,140,1339.
[53]J.D.Perlmutter,M.F.Hagan,Annu Rev Phys Chem 2015,66,217.
[54]R.D.R.L.Carneiro,M.H.Moreira,M.Ribeiro-Alves,S.Rossetto,F.L.Palhano,T.Domitrovic,Scientific Reports 2020,10,5470.
[55]M.G.Rossmann,Q Rev Biophys 2013,46,133.
[56]J.E.Summerton,Ann N Y Acad Sci 2005,1058,62.
[57]S.W.Provencher,J.Biochemistry 1981,20,33.
[58]V.N.Uversky,J.R.Gillespie,A.L.Fink,Proteins:Structure,Function,and Genetics 2000,41,415.
[59]A.K.Dunker,J.D.Lawson,C.J.Brown,R.M.Williams,P.Romero,J.S.Oh,C.J.Oldfield,A.M.Campen,C.M.Ratliff,K.W.Hipps,J.Ausio,M.S.Nissen,R.Reeves,C.Kang,C.R.Kissinger,R.W.Bailey,M.D.Griswold,W.Chiu,E.C.Garner,Z.Obradovic,Journal of Molecular Graphics and Modelling 2001,19,26.
[60]R.Linding,J.Schymkowitz,F.Rousseau,F.Diella,L.Serrano,J Mol Biol2004,342,345.
[61]V.N.Uversky,C.J.Oldfield,A.K.Dunker,Journal of MolecularRecognition 2005,18,343.
[62]M.E.Oates,P.Romero,T.Ishida,M.Ghalwash,M.J.Mizianty,B.Xue,Z.Dosztányi,V.N.Uversky,Z.Obradovic,L.Kurgan,A.K.Dunker,J.Gough,Nucleic AcidsResearch 2012,41,D508.
[63]M.Vincent,S.Schnell,Scientific Data 2016,3,160045.
[64]M.Vincent,M.Whidden,S.Schnell,Biophysical Chemistry 2016,213,6.
[65]M.Vincent,S.Schnell,2017,DOI 10.1101/060699.
[66]M.Vincent,V.N.Uversky,S.Schnell,Proteomics 2019,19,e1800415.
[67]B.Wang,S.A.Merillat,M.Vincent,A.K.Huber,V.Basrur,D.Mangelberger,L.Zeng,K.Elenitoba-Johnson,R.A.Miller,D.N.Irani,A.A.Dlugosz,S.Schnell,K.M.Scaglione,H.L.Paulson,Journal of Biological Chemistry 2016,291,3030.
[68]P.Kumar,M.Bansal,J Struct Biol 2016,196,414.
[69]J.L.S.Lopes,A.J.Miles,L.Whitmore,B.A.Wallace,Protein Science2014,23,1765.
[70]M.Lella,R.Mahalakshmi,J Pept Sci 2017,108,DOI https://doi.org/10.1002/bip.22894.
[71]A.L.Rucker,T.P.Creamer,Protein Sci 2002,11,980.
[72]M.L.GIFfany,S.Krimm,Biopolymers 1968,6,1767.
[73]M.L.GIFfany,S.Krimm,Biopolymers 1972,11,2309.
[74]A.I.Arunkumar,T.K.Kumar,C.Yu,Biochim Biophys Acta 1997,1338,69.
[75]A.Erazo-Oliveras,N.Muthukrishnan,R.Baker,T.-Y.Wang,J.-P.Pellois,Pharmaceuticals(Basel)2012,5,1177.
[76]N.Ohmori,T.Niidome,A.Wada,T.Hirayama,T.Hatakeyama,H.Aoyagi,Biochem Biophys Res Commun 1997,235,726.
[77]A.El-Sayed,S.Futaki,H.Harashima,AAPS J 2009,11,13.
[78]A.Napoli,N.Tirelli,G.Kilcher,A.Hubbell,Macromolecules 2001,34,8913.
[79]S.Cerritelli,D.Velluto,J.A.Hubbell,Biomacromolecules 2007,8,1966.
[80]S.Cerritelli,C.P.O’Neil,D.Velluto,A.Fontana,M.Adrian,J.Dubochet,J.A.Hubbell,Langmuir 2009,25,11328.
Claims (29)
1.一种用于生产纳米结构的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其包含与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS)。
2.根据权利要求1所述的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其中通过接头缀合PEG-b-PPS,任选地,其中接头是二硫键(-ss-)。
3.根据权利要求1所述的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其中
(a)PEG-b-PPS的PEG重量分数为0.17-0.45;
(b)PEG-b-PPS的PPS重量分数为0.25-0.80;或
(c)(a)和(b)二者。
4.根据前述权利要求中任一项所述的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其中DP是SEQID NO:1的肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的合成PEG-b-PPS-接头-DP聚合物,其中聚合物是PEGm-b-PPSn,其中m和n各自是选自1-500的整数。
6.一种用于将核酸递送至细胞的纳米载体系统,该系统包含:
(a)纳米结构,其包含根据权利要求1-5中任一项所述的与树枝状特异性支链阳离子肽(DP)缀合的聚乙二醇-嵌段-聚丙烯硫醚共聚物(PEG-b-PPS);和
(b)核酸,其选自DNA和RNA。
7.根据权利要求6所述的纳米载体系统,其中PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构的PEG重量分数为0.17-0.45。
8.根据权利要求6或7所述的纳米载体系统,其中PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构的PPS重量分数为0.25-0.80。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的纳米载体系统,其中PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构的DP是SEQ ID NO:1的肽。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的纳米载体系统,其中多核苷酸是DNA,优选地,其中DNA是编码感兴趣的蛋白质、肽或其片段的质粒DNA、DNA构建体或多核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的纳米载体系统,其中PEG-b-PPS-ss-DP:DNA的质量比(w/w)为5:1至50:1。
12.根据权利要求10所述的纳米载体系统,其中PEG-b-PPS-ss-DP:DNA的质量比(w/w)为15:1至120:1。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的纳米载体系统,其中聚合物组分是PEGm-b-PPSn,其中m和n各自是选自1-500的整数。
14.一种用于将多核苷酸序列递送至细胞的方法,该方法包括将根据权利要求6-13中任一项所述的纳米载体系统与细胞接触或施用于细胞。
15.根据权利要求14所述的方法,其中PEG-b-PPS-接头-DP纳米结构的DP是SEQ ID NO:1的肽。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中多核苷酸是DNA或RNA。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法,其中PEG-b-PPS-接头-DP:DNA的质量比(w/w)为5:1至50:1。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法,其中PEG-b-PPS-接头-DP:DNA的质量比(w/w)为15:1至120:1。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法,其中与没有缀合DP相比,缀合DP不对细胞产生细胞毒性。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法,其中细胞是免疫细胞,优选地,细胞是树突细胞。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法,其中细胞在体外。
22.一种转染免疫细胞以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核的方法,该方法包括将根据权利要求6-13中任一项所述的系统与免疫细胞接触足够长的时间以将多核苷酸序列递送至免疫细胞的细胞核。
23.根据权利要求22所述的方法,其中细胞在体外。
24.根据权利要求21或22所述的方法,其中多核苷酸编码治疗剂或细胞因子。
25.一种无毒的转导细胞的方法,该方法包括:
a)将根据权利要求6-12中任一项所述的纳米载体系统与培养中的细胞接触,和
b)培养细胞足够长的时间以使得多核苷酸被递送至细胞,其中纳米载体对于细胞是无毒的。
26.根据权利要求25所述的方法,其中在步骤(a)和(b),在包含血清的培养基中培养细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中该方法在体外进行。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法,其中至少50%的细胞转导有多核苷酸。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法,其中细胞是免疫细胞,优选地,细胞是树突细胞。
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