KR20140043962A

KR20140043962A - 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료

Info

Publication number: KR20140043962A
Application number: KR1020120106125A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 최윤재; 정종훈; 강상기; 박태은; 판가지 가르그
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2014-04-14
Also published as: KR101459833B1

Abstract

본 발명은 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(Polymannitol-based osmotically gene transporter, PMT) 및 이를 이용한 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 삼투압적 활성 만니톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도를 증강시켜, 세포내 섭취 경로를 촉진시켜 현저히 향상된 형질전환 효율을 나타낸다. 또한, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 세포질내 지속기간이 증가되어 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내므로 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료{Polymannitol-based osmotically gene transpoter and gene therapy using the same as a gene carrier}

본 발명은 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(Polymannitol-based osmotically gene transporter, PMT) 및 상기 유전자 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체 및 해당 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 유전자 전달체, 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 유전자 치료에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 치료 유전자로서 DNA는 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필요하다.

유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 형질전환 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스와의 복합체(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.

비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다.

최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA를 압축하여 나노입자를 형성함으로써 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질전환 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.

특히, 비바이러스성 벡터로 사용되는 대부분의 양이온성 고분자는 혈청 농도가 낮은 환경인 시험관 내에서는 높은 형질전환 효율을 나타내지만, 생체 내 환경에서는 혈청에 존재하는 각종 인자에 의하여 양이온성 고분자/유전자 복합체의 형질전환 효율이 심각하게 저해되어 유전자의 세포 내 유입이 원활하지 않다는 문제점이 있다. 이는 생체 내에서는 양이온성 고분자/유전자 복합체의 표면에 과도한 양전하가 발생하여 혈장 단백질 및 혈액 구성성분과의 비특이적 상호작용이 유발되기 때문이다. 따라서, 시험관 내의 무혈청 배지 또는 혈청이 매우 낮은 농도로 존재하는 환경이 아닌, 다량의 혈청이 존재하는 생체 내에서는 양이온성 고분자의 형질전환 효율이 현저히 저하되며, 이를 생체 내에 그대로 적용하는 경우에는 폐, 간 및 비장에서의 응집, 축적과, 나아가 망상내피계에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거를 유발할 수 있기 때문에, 상기 양이온성 고분자의 치료적 적용은 크게 제한되지 않을 수 없다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질전환 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 유전자의 낮은 발현 효과 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질전환 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 세포독성은 낮으면서 높은 형질전환 효율을 나타내는 유전자 전달체를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)에 만니톨계 유도체(mannitol-based derivative)의 마이클 부가반응에 의해 제조한 만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(polymannitol-based osmotically gene transporter, PMT)가 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내면서 만니톨 골격에 의한 삼투압 활성 및 폴리에틸렌이민 골격에 의한 양성자 스폰지 효과에 의해 현저히 향상된 형질전환 효율을 나타냄을 발견하고, 상기 만니톨계 삼투압적 유전자 전달체가 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 유전자 전달체로서 세포독성을 나타내지 않으면서 형질전환 효율이 현저히 향상된 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체에 치료 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 제공한다.

상기 식에서, n은 1 내지 500 사이의 정수이다.

본 발명에 따른 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)과 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 함유하는 만니톨계 유도체간의 마이클 부가반응(Micheal addtion reaction)에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)"은 일차, 이차 및 삼차 아미노기를 갖고, 1,000 내지 100,000 g/mol의 몰 질량을 갖는 양이온성 고분자로서, 플라스미드 DNA를 효과적으로 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, pH 반응성의 완충능력으로 인한 높은 유전자전달 효율을 가져 시험관 내 및 생체 내에서 유전자를 다양한 세포에 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명에서 폴리에틸렌이민은 하기 화학식 2로 표시되는 선형(linear) 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 분지형(branched)일 수 있으며, 그 분자량은 세포독성을 고려하여 저분자량, 바람직하게는 50 내지 10,000 Da(중량 평균 분자량 기준)이다. 폴리에틸렌이민은 물, 알코올, 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 테트라하이드로퓨란, 에스테르류 등에 용해되고, 고분자량의 탄화수소류, 올레산(oleic acid), 다이에틸에테르에는 용해되지 않는다.

본 발명에서 폴리에틸렌이민은 만니톨계 유도체와의 마이클 부가반응에서 마이클 공여체(Micheal donor)로 작용하고, 그 결과로서 합성된 공중합체에 높은 형질발현 효율, 낮은 세포독성 및 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)를 부여하는 역할을 담당한다.

본 발명의 용어, "만니톨계 유도체"는 만니톨 당알코올 골격을 포함하고 상기 당알코올 골격에 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 갖는 임의의 모든 화합물로서, 폴리에틸렌이민에 수식되어 최종적으로 수득되는 공중합체에 만니톨 골격을 부여할 수 있는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 만니톨계 유도체는 폴리에틸렌이민과 반응하여 마이클 부가반응에 의해 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체를 합성한다. 따라서, 만니톨계 유도체는 폴리에틸렌이민과의 마이클 부가반응에서 마이클 수용체(Micheal acceptor)로 작용한다. 본 발명에서 만니톨 골격은 공중합체에 친수성, 생분해성 및 삼투압 활성을 부여하고, 혈청 내 및 동결-건조 후 안정성을 증가시키는 역할을 담당한다.

본 발명에 적합한 만니톨계 유도체로는 만니톨 디아크릴레이트(mannitol diacrylate, MDA), 만니톨 디메타크릴레이트(mannitol dimethacrylate, MDM), 만니톨 트리아크릴레이트(mannitol triacrylate, MTA), 만니톨 트리메타크릴레이트(mannitol trimethacrylate, MTM), 만니톨 테트라아크릴레이트(mannitol tetracrylate, MTEA), 만니톨 테트라메타크릴레이트(mannitol tetramethacrylate, MTEM), 만니톨 펜타아크릴레이트(mannitol pentacrylate, MPA), 또는 만니톨 펜타메타크릴레이트(mannitol petamethacrylate, MPM) 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 4로 표시되는 만니톨 디아크릴레이트가 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)"는 폴리에틸렌이민의 아민기와 만니톨계 유도체의 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응에 의해 형성된 상기 화학식 1로 표시되는 공중합체를 지칭한다. 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 0.1 내지 0.9 분자의 만니톨계 유도체에 0.9 내지 0.1 분자의 폴리에틸렌이민이 결합된 형태가 반복된 구조를 갖는다. 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 만니톨 골격에 의한 삼투압 활성 및 폴리에틸렌이민(PEI) 골격에 의한 양성자 스폰지 효과로 인해 세포내 유입이 효율적으로 유도되어 현저히 향상된 형질전환 효율을 나타내고, 세포독성이 매우 낮아 유전자 전달체로서 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 효과적인 유전자 전달을 위해　1,000 내지 100,000 Da 범위의 분자량(중량 평균 분자량 기준)을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 1 내지 50 mV 범위의 제타 전위(zeta potential)를 갖는 것이 효과적인 유전자 전달을 위해 바람직하다. 상기 범위의 물리화학적 특성을 나타낼 때, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 유전자 전달체로서 세포의 엔도좀(endosome) 내에 효과적으로 유입될 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 저분자량 폴리에틸렌이민과 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 함유 만니톨계 유도체 사이의 마이클 부가반응에 의해 공중합체를 형성하는 단계를 포함하는, 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은,

1) 저분자량 폴리에틸렌이민과 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 함유 만니톨계 유도체 각각을 반응용매에 용해시키는 단계;

2) 만니톨계 유도체 용액을 폴리에틸렌이민 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및

3) 반응물로부터 형성된 공중합체를 분리하여 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 단계 1)은 마이클 공여체로서 저분자량 폴리에틸렌이민과 마이클 수용체로서 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 함유 만니톨계 유도체 사이의 마이클 부가반응을 위해, 폴리에틸렌이민과 만니톨계 유도체 각각을 반응용매에 용해시켜 반응용액을 제조하는 단계이다. 본 발명에 적합한 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 함유 만니톨계 유도체로는 만니톨계 유도체가 만니톨 디아크릴레이트(MDA), 만니톨 디메타크릴레이트(MDM), 만니톨 트리아크릴레이트(MTA), 만니톨 트리메타크릴레이트(MTM), 만니톨 테트라아크릴레이트(MTEA), 만니톨 테트라메타크릴레이트(MTEM), 만니톨 펜타아크릴레이트(MPA), 만니톨 펜타메타크릴레이트(MPM) 등이 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 만니톨 디아크릴레이트를 사용한다. 본 발명에 적합한 저분자량 폴리에틸렌이민은 50 내지 10,000 Da의 분자량(중량 평균 분자량 기준)을 갖는 선형 또는 분지형인 것이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용가능한 반응용매는 폴리에틸렌이민과 만니톨계 유도체와 반응하거나 이들을 분해하지 않으면서 이들을 용해시킬 수 있는 것이라면 임의의 반응용매를 적절히 선택하여 채용할 수 있다. 이러한 반응용매의 예로는 다이메틸설폭사이드, 무수 메틸알코올, 에틸알코올, 다이메틸포름아마이드, 다이옥산 등을 들 수 있다.

단계 2)는 단계 1)에서 제조된 폴리에틸렌이민 반응용액을 교반하면서 만니톨계 유도체 반응용액을 첨가하여 폴리에틸렌이민의 아민기와 만니톨계 유도체의 아크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응을 수행하는 단계이다. 본 발명에 적합한 마이클 부가반응은 40 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 수행한다. 본 발명에 따른 마이클 부가반응에서 폴리에틸렌이민과 만니톨계 유도체의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 제조한 폴리에틸렌이민 반응용액에 만니톨 디아크릴레이트 반응용액을 서서히 적하 첨가한 후, 80℃에서 24시간 동안 반응시켜 마이클 부가반응을 수행한다.

단계 3)은 단계 2)의 마이클 부가반응에 의해 형성된 공중합체를 분리하는 단계로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 수득된 반응물을 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 투석(투석막: Spectra/Por, MWCO = 3500)을 수행하여 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 분리한다. 이렇게 분리된 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 동결-건조되어 -25℃에 보관될 수 있는데, 동결-건조는 통상적으로 사용되는 동결-건조 방법 또는 동결-건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부생성물이 제거된 점성을 갖는 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 겔 투과 크로마토그래피로 분석한 결과, PMT 공중합체 분자량(중량 평균 분자량 기준)은 17,470 Da을 갖는 것으로 확인되었고, ¹H NMR로 분석한 결과, 상기 공중합체 내 폴리에틸렌이민 및 만니톨 디아크릴레이트의 화학적 조성은 각각 56 및 44 mol%인 것으로 나타났다(도 2 참고). 또한, 본 발명에 따른 PMT 공중합체 내 폴리에틸렌이민의 양성자에 대한 피크는 δ= 2.6 - 3.0 ppm에서, 만니톨 디아크릴레이트의 양성자에 대한 피크는 δ= 3.2 - 3.6 ppm에서 검출되었다(도 2 참고). 상기 결과는 폴리에틸렌이민과 만니톨 디아크릴레이트 사이의 마이클 부가반응에 의해 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 효과적으로 합성되었음을 나타내는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 상기 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다. 본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와의 복합체 형태로 전달이 가능한 유전자로는 질병과 관련된 치료 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해 치료 유전자와 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 1:0.5 내지 1:100, 바람직하게는 1:5 내지 1:30의 몰비로 반응시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 치료 유전자에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 몰비로 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체와 DNA를 반응시킨 결과, 이들의 몰비가 1:1 이상인 경우에 상기 폴리만니톨계 공중합체와 DNA의 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)가 가장 효과적으로 형성되고(도 3의 A 참고), DNA 가수분해 효소에 의한 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내 DNA가 효과적으로 보호되며(도 3의 B 참고), 형성된 유전자 전달 복합체가 구형 모양의 압축된 구조를 가짐을 확인하였다(도 4 참고). 또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 평균 150 내지 300 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포를 나타내어(표 1 참고) 유전자 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 표면 전하가 2.5 내지 41 mV의 양성 제타 전위(zeta potential)를 나타내어(표 2 참고) 음이온 세포 표면에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율을 조사하기 위해 다양한 몰비로 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 DNA를 반응시켜 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)를 형성한 후 이들의 형질전환 효율을 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석을 통해 조사하였다. 그 결과, DNA와 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 몰비를 다양하게 처리하였을때, 1:10 내지 1:40까지의 모든 몰비에서 비슷한 수준의 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 특히, 비교군으로 사용된 PEI 25K 처리군은 몰비가 증가함에 따라 유전자 전달 효율이 급격히 감소하는데 비해, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 몰비와 상관없이 일정하게 높은 형질전환 효율을 유지하였고, 혈청의 존재 하에서도 형질전환 효율이 급격히 감소한 PEI 25K 처리군에 비해 안정적으로 높은 형질전환 효율을 유지함을 확인하였다(도 5 참고). 상기 결과는 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 유전자 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질전환 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 이러한 형질전환 효율이 혈청의 존재 하에서도 안정적으로 높게 유지되어 생체 내 적용에 유리하게 사용될 수 있음을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 이렇게 높은 형질전환 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다.

이에 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 기작을 규명하기 위해, 엔도좀 양자 펌프 억제제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)을 이용하여 상기 공중합체의 완충능을 조사한 결과, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였다(도 6의 A 참고). 이는 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 양성자 스폰지 효과에 의해 엔도좀으로부터 세포질 내로 효과적으로 방출될 수 있음을 나타내는 것이다.

또한, 세포내 섭취 과정에서 PMT와 PEI로 제조한 유전체 전달 복합체의 기작이 동일한지 확인하기 위하여, 클라트린 세포내 섭취 저해제인 클로로프로마진(Chloropromazine, CH), Src 인산화효소 저해제인 제니스테인(Genistein, GE), 포낭 세포내 섭취 저해제로서 메틸-베타-사이클로덱스트린(Methyl-beta-cyclodextrin, M-b-CD), 또는 액상 세포내 섭취 저해제인 와트마닌(Wortmannin, WO)을 형질전환 전에 처리하여 두 복합체에 따른 형질전환 효율의 양상을 비교하였다(도 6의 B 내지 E 참고). 그 결과, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질도입 효율은 CH와 WO로 처리한 경우에는 거의 변하지 않았으나, GE와 M-b-CD를 처리하자 급격하게 감소하였다. 이는, PMT/DNA 복합체의 형질전환이 선택적 포낭 세포내 섭취 경로를 통해 일어난다는 것을 의미하며, 클라트린 또는 액상 세포내 섭취 경로는 관여도가 낮음을 의미한다. 대조적으로, PEI/DNA 복합체의 형질전환 효율은 CH, GE, M-b-CD, 그리고 WO의 4가지 모두의 처리에 따라 낮아지는 양상을 보이는데, 이는 비선택적 세포내 섭취 경로를 통해 일어난다는 것을 암시한다.

한편, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 삼투압적 활성 만니톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여하여 세포막을 순화시킴으로써 막 투과도의 개선에 의한 세포 재흡수를 촉진시킬 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명의 PMT 공중합체의 처리에 의한 세포의 눌린 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정한 결과, 만니톨 골격을 갖는 PMT/DNA 복합체가 순수 만니톨 처리에 의해 야기된 것과 동일한 방식으로 PCV를 감소시킴을 확인하였다(도 7 참고). 상기 결과로부터 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 만니톨 골격에 의한 삼투압 활성으로 인해 더욱 향상된 형질전환 효율을 나타내는 것임을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 세포독성을 다양한 세포주를 대상으로 조사한 결과, 비교군으로 사용된 PEI 25K보다 현저히 낮은 세포독성을 나타내었다(도 8 참고).

본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 시험관 내(in vitro) 형질도입 효율을 확인하기 위하여, PMT와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자를 1:1의 몰비로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PMT/GFP)를 제조한 후 이를 세포에 형질감염시키고 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 비교군인 PEI 25K/GFP 복합체 처리군에 비해 본 발명에 따른 PMT/GFP 복합체 처리군에서 현저히 증가된 GFP 신호가 검출되었고, 모든 처리군에서 어떠한 세포독성도 나타나지 않음을 확인하였다(도 9 참고).

본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 생체 내(in vivo) 형질전환 효율을 조사하기 위하여, 상기와 같이 제조된 유전자 전달 복합체(PMT/tGFP)를 정상 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후, 마우스로부터 적출된 폐에서 tGFP 신호를 형광현미경으로 관찰한 결과, 본 발명의 PMT/tGFP 복합체가 투여된 모든 마우스에서 tGFP 신호가 검출되었고, 특히 PEI 25K/tGFP 복합체에 비해 높은 tGFP 신호가 검출되었다(도 10 참고).

본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 유전자 전달 기작이 선택적 포낭 세포내 섭취에 의함이 상기에서 밝혀진 바, 이의 메커니즘을 카베올린-1의 인산화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 그 결과, 카베올린-1의 인산화는 일시적으로 PMT/DNA 복합체와 만니톨에 의해 유도되지만, PEI/DNA 복합체로 처리와 음성 대조군에서는 일어나지 않았다. 또한, 세포를 PMT/DNA 복합체로 처리하기 전에 Src 인산화효소 저해제(제니스테인, GE)로 선배양하여 카베올린-1이 인산화되지 않는 것을 확인함으로써 Src 인산화효소에 의해 해당 인산화가 일어남을 확인하였다(도 11 참고).

본 발명에 따른 폴리만니톨계 유전자 전달 복합체의 세포내 분포를 확인하기 위하여, FITC가 붙어있는 PMT/DNA 또는 PEI/DNA 복합체와 AlexaFluor 594가 붙어 있는 덱스트란 (리소좀의 마커)를 A549와 함께 배양한 후, 이를 공초점 현미경과 이미징 프로그램으로 살아있는 세포에서 관찰하였다. 그 결과, 비교군인 PEI/DNA 복합체의 리소좀으로 전달되는 비율이 PMT/DNA 복합체의 전달비율과 비교하여 3.8배 높음을 보여 주었다(도 12 참고). 이는 PMT/DNA 복합체가 PEI/DNA 복합체에 비해 리소좀으로 전달되는 비율이 낮아짐으로써 세포질 내 지속 시간이 증가하게 되어 유전자를 세포에 전달하는 데 있어 효율이 높을 것이라는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 DNA 분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 유전자 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도를 증강시켜, 세포내 섭취 경로를 촉진시키고, 세포질 내 지속기간이 증가되어 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질전환 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

이에 본 발명은, 하나의 양태로서, 상기 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달하도록 제제화된 상기 약학적 조성물의 에어로졸 제형을 제공한다.

흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 에어로졸 전달을 통한 유전자 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 유전자 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체에 치료 유전자로서 폐 질환, 특히 폐암과 관련된 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 에어로졸 방식으로 폐에 전달하면, 상기 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 유전자 치료요법이 필요한 개개인의 기도를 통해 폴리만니톨계 공중합체와 복합체를 형성한 치료 유전자와 같은 유전적 거대분자의 수성 분산제를 소립자 에어로졸을 통하여 전달하는 단계를 포함하는, 기도를 통해 유전자 치료 요법과 같은 치료법을 표적화하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 전달 방법에는 경구 흡입 및 비내 흡입 방법, 안면 마스크 또는 경구용 튜브에 의한 방법 및 산소를 투여하기 위해 사용되어 온 어린이용 산소 후드에 의한 방법이 포함될 수 있다. 일반적으로, 소립자 에어로졸은 분무화 공정에 의해서 창출되고, 이러한 분무화 공정은 제트 분무기에 의해 수행된다.

본 발명의 약학적 조성물은 수성 분산제를 개개인 또는 동물의 기도에 에어로졸 전달하도록 제조할 수 있다는 것을 특별히 고려해야 한다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 과도한 실험 없이 에어로졸 제형의 적당한 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 표적화된 유전자 치료 요법을 위해 생체 내에서 사용된 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 치료학적 유효량, 즉 치료 유전자를 효율적으로 발현시킴으로써 해당 질환을 없애거나 완화시키는 양으로 환자 또는 동물에게 투여된다. 용량 및 투여량 섭생은 질환의 종류, 특정한 폴리만니톨계 공중합체/DNA 복합체의 특징, 예를 들면, 이의 치료학적 지수, 환자, 환자의 병력 및 기타 요인들에 좌우될 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 전형적으로 약 0.01 내지 약 0.1 g/체중 kg일 것이다. 당해 조성물 및 제형은 미량의 부가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질(예: 완충제 및 방부제)을 함유할 수 있다.

본 발명의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 삼투압적 활성 만니톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도를 증강시켜, 세포내 섭취 경로를 촉진시켜 현저히 향상된 형질전환 효율을 나타낸다. 또한, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 세포질내 지속기간이 증가되어 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내므로 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 폴리만니톨계 유전자 전달체(PMT)를 합성하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 2는 동결-건조된 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 구성을 ¹H-핵자기 공명(¹H-nuclear magnetic resonance, ¹H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany, 600 mHz)으로 분석한 그래프이다.
도 3은 폴리만니톨계 유전자 전달체(PMT)의 DNA 응축능 및 DNA 보호능력을 확인하는 도면이다. 구체적으로, 도 3의 A는 DNA 응축능을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하는 도면이고, 도 3의 B는 DNAse Ⅰ을 처리하였을 때 DNA를 보호하는지 여부를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 도면이다.
도 4는 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체와 pGL3 플라스미드 DNA를 10:1의 몰비(N/P 비율)로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)의 형태를 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 확인한 도면이다. 구체적으로, PMT/pGL3 복합체(도 4의 A), 동결-건조시킨 PMT/pGL3(도 4의 B), PEI/pGL3(도 4의 C), 동결-건조시킨 PEI-pGL3(도 4의 D)의 형태를 보여주는 도면이다..
도 5는 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율을 조사하기 위하여, 시험관 내 루시퍼라제 활성 분석(in vitro luciferase activity assay)을 수행한 도면이다. 각각 A549 세포(도 5의 A 및 D), HeLa 세포(도 5의 C), 및 N2a 세포(도 5의 B)에서 루시퍼라제 활성을 분석하였으며, A 내지 C는 N/P 비율에 따른 형질전환 효율을 D는 혈청 첨가 비율에 따른 형질전환 효율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 형질전환 기작 분석하기 위해서 확인한 도면이다. 구체적으로, 바필로마이신 A1(도 6의 A), 클로로프로마진(도 6의 B), 제니스테인(도 6의 C), 메틸-베타-사이클로덱스트린(도 6의 D), 와트마닌(도 6의 E)를 처리하여 형질전환 효율에 미치는 영향을 루시퍼라제 활성 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 7은 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 의한 세포 내 눌린 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정한 도면이다.
도 8은 다양한 세포에 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 처리한 후 세포 증식 분석(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 수행하여 세포 생존능 측정을 통해 전달체의 세포독성을 확인한 도면이다. 구체적으로, A549 세포(도 8의 A), N2a 세포(도 8의 B), 및 HeLa 세포(도 8의 C)에 다양한 N/P 비율의 PMT를 처리한 후 세포의 생존능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT) 및 PEI의 시험관 내 형질전환 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 PMT 및 PEI의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석한 도면이다. 도 9의 A는 FACS data 및 형광 현미경 관찰 결과이고, 도 9의 B는 형질전환된 세포의 비율을 비교한 그래프이다.
도 10은 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 에어로졸에 의한 생체 내 유전자전달 효율을 확인한 도면이다. 도 10의 A는 아무런 처리를 하지 않은 쥐의 폐 조직이고, 도 10의 B는 에어로졸로 PEI/tGFP 복합체를 처리한 쥐의 폐 조직이며, 도 10의 C는 에어로졸로 PMT/tGFP 복합체를 처리한 쥐의 폐 조직을 형광 현미경으로 확인한 도면이다.
도 11은 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체가 세포내 섭취되는 기작이 포낭 세포내 섭취를 촉진하여 일어나는 것인지 여부를 확인하기 위해, 이에 필수적인 단계인 카베올린-1의 인산화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 도면이다.
도 12는 세포에서 PMT와 PEI/DNA 복합체의 리소좀 전달을 추적하기 위해 형광 현미경으로 확인하는 도면이다. 도 12의 A는 FITC-PEI/DNA 복합체(녹색)와 리소좀(적색)을 나타내며, 도 12의 B는 FITC-PMT/DNA 복합체(녹색)와 리소좀(적색)을 나타낸다. 노란색의 점들은 복합체와 리소좀이 같이 존재할 때, 곧, 리소좀에 복합체가 이동한 것을 나타낸다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 만니톨 디아크릴레이트 및 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 제조 및 특성 분석

본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(polymannitol-based gene transporter, PMT)는 약간 변형한 마이클 부가반응에 따라 만니톨 디아크릴레이트(Mannitol diacrylate, MDA)와 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethylenimine, BPEI)을 반응시켜 합성하였다(도 1).

1-1. 만니톨 디아크릴레이트 제조

이를 위해서, 먼저 만니톨 디아크릴레이트를 제조하였다. 만니톨 디아크릴레이트는 만니톨(mannitol)과 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride)을 반응시켜 제조하였다. 간략히 설명하면, 무수 만니톨 1 g을 10 ml 피리딘 용액에 있는 상태에서 30 mL DMF에 녹였다. 30분간 교반시킨 후에, 7.5ml DMF에 녹인 아크릴로일 클로라이드를 적하 첨가하여 반응시켰다. 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 디에틸 에테르(diethyl ether)로 침전시킨 후에, 만니톨 디아크릴레이트(MDA)는 실온에서 하룻밤동안 건조시켰다.

MDA는 하기 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체를 제조하기 위한 가교제(crosslinking agent)로 역할을 하기 위해 먼저 제조되었다. 만니톨과 아크릴로일 클로라이드의 몰 비율을 1 : 2 로 조정하여, 디아크릴레이트가 만니톨의 1 및 6 위치의 히드록실기와만 반응하게 하였다.

1-2. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체 제조

상기에서 제조된 만니톨 디아크릴레이트(MDA)와 분지형 폴리에틸렌이민(BPEI, 1200kDa)을 마이클 부가 반응에 의해 합성했다. MDA(Mn:290)를 무수 DMSO에 녹여 무수 DMSO에 녹인 BPEI 용액에 몰농도 1:1의 비율로 적하 첨가하였다. 마이클 부가 반응은 80℃에서 24시간 동안 질소 거품(N₂)과 함께 이루어졌으며, 계속적으로 교반시켰다. 이로부터 수득된 공중합체를 투석막(Spectra/Por, MWCO = 3500)을 사용하여 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 5회 투석을 수행하여 미반응물을 제거하였고, 분리된 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 -20℃에서 3일간 동결-건조하였다. 마이클 부가 반응을 통해 MDA의 친핵성 디아크릴레이트 말단과 BPEI의 아민기를 반응시켰다.

1-3. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 특성 분석

동결-건조된 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 구성을 ¹H-핵자기 공명(¹H-nuclear magnetic resonance, ¹H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany, 600 mHz)으로 분석하였다. ¹H-NMR 분석을 위해 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 증류수에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 폴리만니톨의 양성자에 대한 피크가, δ= 3.2 - 3.6 ppm에서, 폴리에틸렌이민의 양성자에 대한 피크가 δ= 2.6 - 3.0 ppm에서 검출되어 폴리에틸렌이민과 폴리만니톨의 공중합체가 효과적으로 합성되었음을 확인하였다.

또한, PMT의 분자량은 TSKgel G5000PWxl-TSKgel G3000PWxl-C을 가지고 젤 투과 크로마토그래피 컬럼(GPC)을 이용하여 측정했다. 상기 GPC 분석은 0.1M NaNO₃를 이동상으로 하여 유량 1.0 ml/min으로 분석하였으며, 컬럼의 온도는 35℃로 유지했다.

상기와 같이 분석한 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 특성을 하기 표 1에 정리하였다.

구분	반응물(중량%)		몰비 MDA:PEI (mol/mol)	PEI 조성 (mol-%)^a	MDA 조성 (mol-%)^a	분자량 (Da)^b
	MDA	PEI
MDA/PEI	0.19	0.81	1:1	56	44	17470

^{a 1}H NMR 측정값, ^bGPC 측정값

상기 합성된 PMT는 용해도가 매우 높았으며,PMT는 에스테르 결합을 가지고 있어 산이나 알코올을 생성하거나 저분자량의 무독성 산물들을 만들어 내는 생리학적 환경에서 쉽게 가수분해되는 특성을 가졌다.

실시예 2: 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체/ DNA 복합체의 특성 분석

2-1. 폴리에틸렌이민 공중합체의 DNA 응축능

유전자 전달체의 가장 중요한 특징 중 하나는 플라스미드 DNA와 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력이다. 이에 상기 실시예 1에서 제조된 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 DNA 응축능을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 먼저, PMT 용액에 pGL3 플라스미드(5.3 kb, Promega)를 0.1, 0.5, 1, 5, 및 10의 다양한 몰비(N/P ratio)로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱(vortexing)해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응용액을 1% 아가로스 겔에 전기영동(100 V)을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 PMT와 반응시키지 않은 pGL3 플라스미드 단독을 사용하였다.

그 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 플라스미드 DNA에 대한 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 몰비가 1:1 이상인 경우에 DNA의 이동성이 완전히 지연되었는데, 이는 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체가 플라스미드 DNA를 효과적으로 응축시켜 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 아무런 지연 없이 겔을 통과하여 이동하였다. 상기 결과로부터 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해서는 플라스미드 DNA와 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 1:1 이상의 몰비로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

2-2. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체/ DNA 복합체의 DNA 보호효과

효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵산분해효소와 같은 효소 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내의 DNA가 보호되어야 한다. 이러한 DNA 보호효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 pGL3 플라스미드 DNA(0.2 mg)를 10:1의 몰비(N/P 비율)로 실온에서 30분간 반응시켜 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)를 제조하였다. 상기 유전자 전달 복합체 용액 4 ㎕ 또는 비반응 플라스미드 DNA 용액 4 ㎕에 DNase I 1 ㎕(2 유닛) 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 함유 DNase/Mg² ⁺ 분해 완충액(50 mM TrisCl, pH 7.6 및 10 mM MgCl₂) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양 교반기에서 인큐베이션하였다. 효소 반응을 중지시키기 위해, 모든 반응용액에 4 ㎕의 EDTA(250 mM)를 30분간 처리한 후, PMT와 DNA의 이온결합을 분리하기 위하여 1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, pH 7.2)를 혼합하여 최종 부피를 15 ㎕로 맞추고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응용액을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(running buffer)을 이용해 1% 아가로스 겔에서 1시간 동안 50 V로 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 3의 B에 나타난 바와 같이, 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 DNase I에 의해 완전히 분해된 반면(레인 3), 본 발명의 유전자 전달 복합체(PMT/DNA) 내의 DNA는 DNase I의 분해로부터 효과적으로 보호되었음을 알 수 있다(레인 5). 이러한 결과는 본 발명의 유전자 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 DNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.

2-3. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체/ DNA 복합체의 형태학적 분석

상기 실시예 2-1에서 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체와 pGL3 플라스미드 DNA를 10:1의 몰비(N/P 비율)로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PMT/DNA)의 형태를 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체(PMT/pGL3 및 동결건조 PMT/pGL3)는 비교군으로 사용된 PEI/DNA 복합체(PEI 25K/pGL3 및 동결건조 PEI 25K/pGL3)에 비해 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 플라스미드 DNA가 효과적으로 응축되어 균일한 구형의 압축된 구조를 가지고 있음을 확인하였다(도 4). 또한, 비교군으로 사용된 동결 건조된 PEI 25K/DNA 복합체는 입자들의 응집 현상이 야기되는 것과는 달리(도 4의 D), 본 발명의 PMT/DNA 복합체는 동결-건조 후에도 구조적 완전성(integrity) 및 안정성을 그대로 유지하였는데(도 4의 B), 이는 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT) 내 만니톨 골격에 의한 동결방지(cryoprotective) 기능에 의한 것이다.

유전자 전달 복합체의 입자 크기는 복합체가 표적 부위에 접근하고 이를 통과하는 데 중요한 요소로 복합체의 세포 내 유입에 필수적이다. 대부분의 유전자 전달 복합체는 세포 내 이입(endocytosis) 또는 포액작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 유입되기 때문에, 최적의 세포 내 유입을 위해서는 복합체의 크기가 일정 수준 이하인 것이 요구된다. 이에 동적 광 산란 분광 광도계(dynamic light scattering spectrophotometer, DLS-7000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 무혈청 조건에서 다양한 몰비(5, 10, 15, 및 20)로 제조된 유전자 전달 복합체와, 다양한 농도의 혈청 존재 하(0%, 10%, 20%, 및 30%)에서 제조된 유전자 전달 복합체의 입자 크기를 측정하였다. 이때, 온도는 20℃로 유지하고 산란각도(scattering angle) 20°로 측정하였다. 측정결과를 하기 표 1에 정리하였다.

PMT/DNA 복합체의 N/P 비율에 따른 입자 크기

PMT/DNA
N/P 비율	입자의 크기(nm)
5	173.5 ± 4.5
10	228.7 ± 9.6
15	239.5 ± 4.1
20	279.1 ± 7.8

PMT/DNA 복합체의 입자 크기는 PEI/DNA 복합체와는 달리 N/P 비율의 증가에 따라 N/P 30에서 279 nm까지 천천히 커지는데, 입체적으로 부피가 큰 폴리만니톨의 수산기가 척력을 일으키기 때문이다(표 2).

2-4. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체/ DNA 복합체의 표면 전하 측정

유전자 전달 복합체의 양성 표면 전하는 음이온 세포 표면에 결합하는데 필수적이고, 이는 복합체의 세포 내 유입을 용이하게 한다. 이에 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 플라스미드 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 형성된 유전자 전달 복합체(PMT/DNA) 및 비교군으로 PEI/DNA 복합체의 제타 전위(zeta potential)를 동적 광 산란 분광 광도계(DLS-7000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다. 측정결과를 하기 표 2에 정리하였다.

PMT/DNA 복합체와 PEI/DNA 복합체의 N/P 비율에 따른 제타 전위

PMT/DNA
N/P 비율	제타 전위(mV)
5	2.67 ± 0.1
10	17.8 ± 1.6
15	40.7 ± 4.5
20	31.6 ± 6.7

그 결과, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 플라스미드 DNA를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체가 가장 높은 양성의 제타 전위를 나타내었고, 그 값은 모두 양성값을 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 유전자 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 유전자 전달 복합체의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 뿐만 아니라, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집현상을 감소시키는 장점이 있다.

실시예 3: 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 시험관 내 형질전환 효율

3-1. 무혈청 조건 하의 형질전환 효율 분석

본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율을 조사하기 위하여, 무혈청 조건에서 시험관 내 루시퍼라제 활성 분석(in vitro luciferase activity assay)을 수행하였다.

먼저, 24-웰 플레이트에 10% FBS(HyClone), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 함유된 RPMI 1640(Gibco BRL) 배지를 첨가하고 A549 세포(도 5의 A 및 D), HeLa 세포(도 5의 C), 및 N2a 세포(도 5의 B)를 1.0×10⁵ 개/well의 밀도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 80~90% 밀도가 되기까지 배양하였다. 아울러, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT) 용액에 SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 발현이 유도되는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 pGL3 발현벡터(5.3 kb, Promega)를 10, 20, 30 및 40의 몰비로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱 해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하여 유전자 전달 복합체(PMT/GL3)를 제조하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 무혈청 배지 또는 제조된 유전자 전달 복합체(PMT/GL3) 1 ㎍를 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, PEI 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich) 및 리포펙타민(lipofectamine)을 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 신선한 완전 배지(complete media)로 교체하고 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이어서, 배지를 제거한 후, 각 웰에 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)을 100 ㎕씩 첨가하였다. 이후, 루시퍼라제 활성 분석은 제조사의 프로토콜에 따랐다. 간단히 요약하면, 상기 세포 용해 완충액을 넣고 -20℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 배양액을 1.5mL 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 14,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액은 새로운 튜브에 옮겨져 얼음에 보관한다. 이후 루시퍼라제 활성은 화학발관분석기(Autolumat, LB953; EG&G Berthold, Germany)를 이용하여 상대적 광단위(Relative Light Unit)을 측정하였다. 상대적 광단위는 BCA 측정방법에 의해 측정된 총 단백질에 비교하여 표준화했다(normalization). 서로 다른 혈청 농도(0%, 10%, 20%, 및 30%) 하에서의 형질전환은 A549에서 진행되었다. 실험은 3회 반복하여 진행했고 형질전환 활성도는 RLU/총단백질 mg으로 측정되었다.

그 결과, 도 5의 A, B, 및 C에 나타난 바와 같이, DNA와 PEI 25K의 반응 몰비가 증가할 수록 형성된 유전자 전달 복합체의 형질전환 효율이 감소하는 반면, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 DNA와의 반응 몰비가 증가하여도 PEI 25K보다는 높고, 리포펙타민과는 유사한 수준의 형질전환 효율을 나타남을 확인하였다. 이는 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 유전자 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질전환 효율을 나타냄을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 이렇게 높은 형질전환 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다. 또한, 도 5의 D에 나타난 바와 같이, 혈청 존재 하에서 PEI의 형질전환 효율이 현저히 감소하는 것과는 달리, 본 발명에 따른 PMT/DNA 복합체는 혈청 농도와 상관없이 높은 수준의 형질전환 효율을 유지하였다. 일반적으로 양이온성 고분자를 이용해 생체 내에 유전자를 전달하는 경우, 이들의 유전자 전달 복합체는 양이온성으로 인해 혈액 중에 존재하는 혈청단백질과 결합하게 되고, 그로 인해 크기가 커진 유전자 전달 복합체는 혈관의 막힘 또는 유전자 발현효율의 저하와 같은 문제점을 야기한다. 그러나, 본 발명에 따른 PMT/DNA 복합체는 혈청 존재 하에서도 응집체를 형성하지 않으므로 혈관의 막힘 또는 유전자 발현효율의 감소를 유발하지 않는 것으로 확인되었다.

3-2. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 형질전환 기작 분석( 엔도좀 양자 흡수 저해제)

PEI의 비교적 높은 형질전환 효과는 양자 스폰지 효과에 의해 엔도좀을 탈출하는 내재적 능력 때문이라고 알려져 있다. 이러한 효과는 엔도좀의 양자 및 Cl^-유입에 의한 산성화, 그에 따른 엔도좀의 팽윤 및 용혈작용에 이르는 동안 PEI가 완충작용을 하기 때문으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT) 또한 동일한 양성자 스폰지 효과에 따른 형질전환 기작을 갖는지 규명하기 위해, 상기 공중합체의 완충능을 조사하였다.

상기 실시예 3-1에서와 같이 24-웰 플레이트에 1.0×10⁵ 개/well로 접종하여 80%~90%의 밀도로 A549 세포를 배양한 후, DMSO에 희석된 엔도좀 양자 펌프 저해제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, vacuolar type H⁺ ATPase 특이적 저해제, 200 nM)을 혈청없는 배지에 첨가하여 15분간 배양했다. 상기와 동일하게 루시퍼라제 활성을 측정하여, 형질전환 효율을 측정하였다. 이때, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 PMT와 DNA가 10:1의 몰비(N/P 비율)로 제조된 것을 사용하였고, 비교군으로 역시 PEI 25K와 DNA가 10:1의 몰비(N/P 비율)로 제조된 것을 사용하였다.

그 결과, 도 6의 A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였다. 바필로마이신 A1을 처리함에 따라 엔도좀 내로의 양성자(H⁺)의 유입을 막으면 이에 따라 엔도좀의 산성화, 팽윤 및 용혈 작용이 일어나지 않게 된다. 곧, 바필로마이신 A1의 처리에 따라 PMT/DNA 복합체의 형질전환 효과가 급격히 감소되는 것은 엔도좀을 통해 세포 내로 들어간 PMT/DNA 복합체의 형질전환 능력이 양성자 스폰지 효과에 기초하고 있다는 것을 보여주는 것이다.

즉, 본 발명의 PMT가 높은 완충능을 가지고 있으며, 따라서 양성자 스폰지 효과에 의해 엔도좀으로부터 신속하게 방출되어 세포질 내로 유입될 수 있음을 나타내는 것이다.

3-3. 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 형질전환 기작 분석(세포 흡수 저해제 영향)

새포내 섭취 과정에서 PMT와 PEI로 제조한 유전체 전달 복합체를 비교하기 위해, 네 개의 세포 흡수 저해제를 형질전환 전에 처리해주었다.

상기 실시예 3-1에서와 같이 24-웰 플레이트에 1.0×10⁵ 개/well로 접종하여 80%~90%의 밀도로 A549 세포를 배양한 후, DMSO에 희석된 클라트린 세포내 섭취 저해제인 클로로프로마진(Chloropromazine, CH), Src 인산화효소 저해제인 제니스테인(Genistein, GE), 포낭 세포내 섭취 저해제로서 메틸-베타-사이클로덱스트린(Methyl-beta-cyclodextrin, M-b-CD), 액상 세포내 섭취 저해제인 와트마닌(Wortmannin, WO)을 혈청없는 배지에 첨가하여 15분간 배양했다. 상기와 동일하게 루시퍼라제 활성을 측정하여, 형질전환 효율을 측정하였다. 이때, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 PMT와 DNA가 10:1의 몰비(N/P 비율)로 제조된 것을 사용하였고, 비교군으로 역시 PEI 25K와 DNA가 10:1의 몰비(N/P 비율)로 제조된 것을 사용하였다.

그 결과, 도 6의 B, C, D, 및 E에 나타난 바와 같이, GE와 M-b-CD를 A549 세포에 처리한 경우, 본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 형질전환 효율은 급격하게 감소하였다. 반면에, PMT/DNA 복합체의 형질전환 효율은 CH와 WO로 처리한 세포내 섭취 경로에서는 거의 변하지 않았다.이는, PMT/DNA 복합체의 형질전환이 선택적 포낭 세포내 섭취 경로를 통해 일어난다는 것을 의미하며, 클라트린 또는 액상 세포내 섭취 경로는 관여도가 낮음을 의미한다. PMT/DNA 복합체와는 대조적으로, PEI/DNA 복합체의 형질전환 효율은 CH, GE, M-b-CD, 그리고 WO의 4가지 모두의 처리에 따라 낮아지는 양상을 보이는데, 이는 비선택적 세포내 섭취 경로를 암시한다. 이러한 결과는 PMT/DNA 복합체의 세포내 섭취 경로가 폴리만니톨 구조로 인해 비선택적 세포내 섭취에서 포낭 매개의 세포내 섭취로 바꾸었음을 보여주는 것이다.

3-4. 삼투압 활성 측정

본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 삼투압 활성 만니톨톨 골격을 함유하는 생분해성 유전자 전달체이다. 이에 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 높은 삼투압에 대한 반응으로 형질전환 효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포 내 눌린 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정하였다.

먼저, A549 세포를 10% FBS 함유 DMEM 배지에 현탁한 후, 상이한 농도(2, 3, 및 5 mg)의 폴리만니톨 또는 동량의 순수 만니톨을 처리하였다. 상기 배양 혼합물을 37℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 세포를 1분간 미니-PCV 튜브에서 4500rpm에서 원심분리하여 세포의 용적 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 그 결과, 폴리만니톨은 2, 3, 및 5 mg을 투여하였을 경우에 각각 7%, 9%, 및 14%의 세포 용적 감소를 보였고, 순수 만니톨은 10%, 15%, 및 22%의 세포 용적 감소를 보였다. 즉, 폴리만니톨이 순수 만니톨과 비슷하게 세포 내 수분을 외부로 뽑아내는 능력이 있음을 확인하였다. 본 발명에 따른 PMT/DNA 복합체 존재 하의 PCV 감소는 PMT 중의 만니톨 골격이 세포막에 삼투압을 부여하여 세포막을 순화시킴으로써 막 투과도를 개선시키고, 그로 인해 세포 재흡수가 촉진된다는 가설의 설명이 될 수 있다.

실시예 4: 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 세포독성

본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 세포독성을 조사하기 위해, 실시예 3-1에서와 같이 DNA와 PMT의 다양한 몰비로 제조된 유전자 전달 복합체를 다양한 세포에 처리한 후 세포 증식 분석(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다.

먼저, A549 세포 (인간 폐 선암종 상피세포; ATCC number CCL-185)는 RPMI-1640 배지에서, HeLa 세포 (인간 경부 상피 암종 세포; ATCC number CCL-2)는 DMEM 배지에서, N2a 세포 (생쥐 신경모세포종 세포; ATCC number CCL-131)는 alpha-MEM에서 배양했다. 이때, 모든 배지에는 열처리 불활성화된 10%의 우태아혈청(FBS, HyClone, Logan, UT, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하였다. 배양된 A549, HeLa 및 N2a 세포를 1×10⁵ 개/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 80~90% 밀도로 키웠다. 별도로, 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT) 또는 PEI와 DNA를 서로 다른 N/P 비율로 혼합하여 유전자 전달 복합체를 제조하였다. 상기 배양한 세포 배지를 복합체를 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, MTT 시약을 각 well에 넣고 보라색 포르마잔(Formazan)으로 환원되도록 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO로 각 well에 포르마잔을 녹여내어, 색이 나는 용액은 96-웰 플레이트로 옮겨 VERSAmax tunable microplate reader(Sunnyvale, USA)로 광학 밀도를 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 PMT/DNA 복합체를 처리한 세포에서는 PMT의 몰비가 증가하여도(최대 40:1) 모든 세포에서 40% 이상의 세포 생존율이 나타난 반면, PEI 25K를 처리한 세포의 세포 생존율은 PEI의 몰비가 증가함에 따라 세포 생존율이 급격하게 감소하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)는 세포독성이 매우 낮아 생체적합성이 우수함을 확인하였다.

실시예 5: 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체의 시험관 내 및 생체 내 형질전환 효율 분석

5-1. 유세포측정에 의한 시험관 내 형질전환 분석

본 발명의 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 PMT의 GFP 발현을 유세포측정(flow cytometry)으로 분석하였다.

먼저, 본 발명의 PMT와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 몰비 10으로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PMT/tGFP)를 제조하였다. A549 세포를 상기 제조한 PMT/tGFP 복합체로 형질감염시킨 후 PBS로 세척하고 트립신을 처리하였다. FACS 캘리버 시스템(Calibur System)(Becton-Dickinson, San Joes, CA)을 이용하여 상기 세포로부터 발현된 GFP의 비율(%)을 기록하여 형질도입 효율을 평가하였다. 상기 실험을 3회 반복 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PMT/tGFP를 이용한 시험관 내 형질전환 효율이 35%에 달하며, 이는 비교군인 PEI/tGFP의 형질전환 효율의 다섯배에 달함을 확인하였다.

5-2. 에어로졸 전달에 의한 생체 내 형질도입 효율 분석

본 발명에 따른 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)의 에어로졸에 의한 생체 내 유전자전달 효율을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)와 GFP를 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 몰비 10으로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PMT/tGFP)를 제조하였다.

6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Breeding and Research Center)를 온도 23±2℃ 및 상대습도 50 ± 20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울국립대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-101211-2)에 의해 승인되었다. 에어로졸을 통한 유전자 전달 효율성을 확인하기 위해 마우스의 코 부위만 노출시키는 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 사용하였고, 4 마리의 마우스를 다음과 같이 무작위로 2개 군(각 군당 2 마리)으로 나누었다: PEI 25K/GFP 복합체 처리군; 및 PMT/GFP 복합체 처리군. 상기 각 군의 마우스에 1 mg의 DNA가 전달되도록 문헌에 사용된 방법에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(H.L. Jiang, 등 Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).

에어로졸 노출 24시간 후, 각 군의 마우스를 희생시키고 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액으로 관류시키고 용액에 담가 12시간 동안 고정시킨 후 30% 수크로스 용액에 담가 4℃에서 48시간 동안 보관하였다. 고정된 폐를 -20℃ 이하의 온도에서 OCT 화합물(Tissue-Tek OCT, Sakura)로 포매(embedding)한 후 마이크로톰(microtome)으로 절단하여 20 ㎛ 두께의 폐 조직 절편을 제조하였다. 조직병리학적 분석을 위해, 준비된 폐 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 tGFP 신호를 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, PEI/tGFP 복합체 처리군(도 10의 B)에 비해 본 발명의 PMT/tGFP의 복합체 처리군(도 10의 C)에서 강한 tGFP 신호가 검출되어 에어로졸 전달 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.

실시예 6: 카베올린 -1( pY 14)의 웨스턴 블랏팅 분석

포낭 세포내 섭취는 어떤 리간드나 세포 압박에 의해 자극 받아 촉진되는데, 이에 필수적인 단계로서 카베올린-1 단백질이 Src-인산화효소-매개의 인산화가 일어난다. 해당 인산화는 포낭의 발아에 필수적인 것으로 알려져 있다. 본 발명의 폴리만니톨계 유전자 전달 복합체가 선택적 포낭 세포내 섭취에 의해 세포내로 전달된다는 것이 상기 실시예에 의해서 확인되었는바, 이의 메커니즘을 카베올린-1의 인산화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.

A549 세포를 형질전환 하거나 형질전환하기 전에 제니스테인(GE)로 30분간 처리하고, 세포를 양성 대조군으로써 고장성 상태를 위해 600 mM 만니톨로 10분 동안 처리했다. 이에 PMT/DNA 복합체 또는 PEI/DNA 복합체를 N/P 비율 20으로 30분간 처리하여 형질전환 시켰다. 상기 세포를 단백질 분해효소 억제제와 탈인산 효소 억제제를 포함하는 RIPA(radio immunoprecipitation assay) 용액으로 녹여 단백질을 추출했다. 용액을 넣고 얼음에서 30분간 정치시키고 5분 동안 가볍게 섞어준 다음에 4℃에서 14,000 rpm으로 25분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질의 농도는 bicinchoninic acid(BCA) 분석을 통해 측정하여 동량의 단백질을 DTT를 포함하는 5x 샘플 완충용액에 섞어 SDS-PAGE 젤(15%)로 분리시켰다. 해당 분리시킨 젤의 단백질을 니트로셀룰로오즈 막으로 트랜스퍼(transfer)시켰고, Tween 20과 알부민이 들어간 Tris 완충용액으로 밤새 블락킹(blocking)하였다. 이에, 1차 항체인 인산화-카베올린1(pY14) IgG(토끼 다중 클론 항체) 또는 액틴 IgG(토끼 다중 클론 항체)를 상기 블락킹된 막에 붙여주고, 15분씩 3차례 헹궈주었다(washing). 이 후, 2차 항체인 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체를 1시간 동안 처리하고, 이를 다시 헹궈주고 이를 발광 화상 분석기 LAS-3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 시각화하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 카베올린-1의 인산화는 일시적으로 PMT/DNA 복합체와 만니톨(양성 대조군)에 의해 유도되지만(레인 3 및 5), 반면 PEI/DNA 복합체로 처리와 음성 대조군에서는 확인되지 않았다. 카베올린-1의 인산화가 Src 인산화효소에 의해 매개되는지는 확인하기 위해, 세포를 PMT/DNA 복합체로 처리하기 전에 Src 인산화효소 저해제(제니스테인, GE)로 선배양한 경우에는 카베올린-1이 인산화되지 않는 것을 확인하여 Src 인산화효소에 의해 해당 인산화가 일어남을 확인하였다.

실시예 7: 폴리만니톨계 유전자 전달 복합체의 세포내 분포 분석

A549 세포에서 PMT와 PEI/DNA 복합체의 리소좀 전달을 추적하기 위해 형광 현미경 분석을 했다. FITC가 붙어있는 PMT/DNA 또는 PEI/DNA 복합체와 AlexaFluor 594가 붙어 있는 덱스트란 (리소좀의 마커)를 A549와 함께 배양했고, 두 복합체의 리소좀 전달 속도를 사진 복구 공초점 현미경과 이미징 프로그램으로 살아있는 세포에서 관찰하고 정량했다. 구체적으로는, PMT와 PEI를 pH 8.0 중탄산나트륨 완충용액에 녹인 FITC 형광으로 실온에서 12시간 동안 표지시켰다. 표지시킨 혼합물을 투석막(MW 제한 3500)으로 섭씨 4도에서 24시간 동안 여과하여, 걸러진 여과물을 3일 동안 감압동결건조시켰다. 세포는 커버 글라스-바닥 배양 접시(cover glass-bottom culture dish, 35 mm)에 접종시켜 80% 밀도로 키웠다. 이를, 12시간 동안 알렉사-덱스트란 594(Alexa-dextran 594, 50 ㎍/ml)에서 배양한 후에, FITC-PMT/pGL3 또는 FITC-PEI/pGL3 복합체를 3시간 동안 처리하여 형질전환 시켰다. 리소좀 안에 복합체의 동일위치를 Image Restoration Microscopy(DeltaVision RT, AppliedPrecision, USA)를 이용해서 관찰했고 ImageJ program (NIH Image, Bethesda, MD)을 이용해서 정량했다.

도 12에 나타난 바와 같이, PMT/DNA 또는 PEI/DNA는 세포질 영역에서 녹색으로 보이고, 리소좀은 붉은색 신호로 표시되었다. 비록 노란색 신호가 PMT/DNA와 PEI/DNA 복합체 처리 집단에서 관찰되었지만, 그것은 PMT/DNA 또는 PEI/DNA가 리소좀과 같은 위치에 자리한 신호로서 생각되며, 리소좀으로의 상기 두 복합체의 전달 비율이 달랐다. PEI/DNA 복합체의 리소좀으로 전달되는 비율이 PMT/DNA 복합체의 전달비율과 비교하여 3.8배 높음을 보여 주었다. 이 결과는 PMT/DNA 복합체가 PEI/DNA 복합체에 비해 리소좀으로 전달되는 비율이 낮아짐으로써 세포질 내 지속 시간이 증가하게 되어 유전자를 세포에 전달하는 데 있어 장점이 있을 것이라는 것을 보여준다.

상기 결과들을 종합하면, 폴리만니톨계 삼투압 유전자 전달체는 균질의 입자를 형성하고 세포 독성이 기존 PEI를 이용한 유전자 전달체에 비하여 현저히 감소되며, 세포질내 존재하는 시간이 증가하여 월등히 우수한 유전자 전달 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있다. 무엇보다, 시험관 내 및 생체 내 유전자 전달 효율실험에서 우수한 효과를 가짐을 확인하였다. 곧, 상기와 같은 결과들은 기존 PEI가 아닌 폴리만니톨을 부착시긴 PEI를 사용하여 유전자 전달 효과가 증대시키고, 세포 독성을 현저히 감소시킬 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT):
<화학식 1>

상기 식에서, n은 1 내지 500 사이의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 전달체가 1,000 내지 100,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT).
1) 만니톨계 유도체와 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI) 각각을 반응용매에 용해시키는 단계;
2) 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 만니톨계 유도체 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
3) 반응물로부터 형성된 공중합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)를 제조하는 방법.
제3항에 있어서, 단계 1)에서 만니톨계 유도체가 만니톨 당알코올 골격을 포함하고 상기 당알코올 골격에 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 만니톨계 유도체가 만니톨 디아크릴레이트(mannitol diacrylate, MDA), 만니톨 디메타크릴레이트(mannitol dimethacrylate, MDM), 만니톨 트리아크릴레이트(mannitol triacrylate, MTA), 만니톨 트리메타크릴레이트(mannitol trimethacrylate, MTM), 만니톨 테트라아크릴레이트(mannitol tetracrylate, MTEA), 만니톨 테트라메타크릴레이트(mannitol tetramethacrylate, MTEM), 만니톨 펜타아크릴레이트(mannitol pentacrylate, MPA) 및 만니톨 펜타메타크릴레이트(mannitol petamethacrylate, MPM)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 만니톨계 유도체가 하기 화학식 4로 표시되는 만니톨 디아크릴레이트(MDA)인 것인 방법:
<화학식 4>
제3항에 있어서, 단계 1)에서 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)이 50 내지 10,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 선형 또는 분지형인 것인 방법.
제3항에 있어서, 단계 1)에서 반응용매가 다이메틸설폭사이드, 무수 메틸알코올, 에틸알코올, 다이메틸포름아마이드 및 다이옥산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 단계 2)에서 마이클 부가반응이 40 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 수행되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 단계 2)에서 만니톨계 유도체와 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)의 반응 몰비가 1:0.1 내지 1:10인 것인 방법.
제1항의 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체.
제11항에 있어서, 상기 치료 유전자와 생분해성 폴리만니톨계 삼투압적 유전자 전달체(PMT)가 1:0.5 내지 1:100의 몰비로 결합되는 것인 유전자 전달 복합체.
제11항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 150 내지 300 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인 유전자 전달 복합체.
제11항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 1 내지 50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것인 유전자 전달 복합체.
제11항의 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 에어로졸 전달에 의해 표적 부위에 전달되도록 제형화된 약학적 조성물.