KR20200138234A - 자기 조립 나노구조 백신 - Google Patents

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KR20200138234A
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Abstract

본 개시내용은 나노구조 및 나노구조-기초 백신을 제공한다. 본 개시내용의 일부 나노구조는 박테리아, 바이러스 및 병원체와 같은 감염성 병원체에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 항원을 표시한다. 본 개시내용의 일부 백신은 예를 들어 비제한적으로, 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 수막구균 또는 말라리아를 포함한 감염성 병원체에 의한 감염을 예방하거나 감염의 중증도를 저하시키는 데 유용하다. 항원은 융합 단백질로서 또는 본원에 개시된 다른 수단에 의한 것을 포함하여 비-공유적으로 또는 공유적으로 나노구조의 코어에 부착될 수 있다. 다량체성 항원은 선택적으로, 나노구조의 대칭축을 따라 표시될 수 있다. 또한, 단백질 및 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 백신 조성물, 및 투여 방법이 제공된다.

Description

자기 조립 나노구조 백신
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 2월 28일에 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 제62/636,757호 및 2018년 8월 30일에 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 제62/724,721호에 대해 우선권을 주장하며, 이들은 각각 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되어 있으며, .txt 형식의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2019년 2월 27일에 생성되고 약 373 킬로바이트 크기를 갖는 "ICVX_001_02WO_SeqList_ST25.txt" 명칭의 서열 목록을 함유한다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로, 백신 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 박테리아, 바이러스 및 기생충을 포함하는 다양한 감염성 병원체(infectious agent)의 항원성 단백질과 같은 항원에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 나노구조-기초 백신에 관한 것이다.
백신화는 박테리아, 바이러스 및 기생충을 포함하여 다양한 감염성 병원체에 의한 감염을 방지하거나 이러한 감염의 중증도를 저하시키는 데 사용되는 치료 양상이다. 새로운 백신의 개발은 중요한 상업적이고 공중 보건 영향을 가진다. 특히, 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스 및 말라리아는 이에 대한 백신이 이미 존재하거나, 개발중에 있거나, 바람직할 것인 감염성 병원체이다.
서브유닛 백신(subunit vaccine)은 단리된 항원, 통상 박테리아, 곤충 또는 포유류 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 단백질로부터 제조되는 백신이다. 전형적으로, 서브유닛 백신의 항원성 구성성분은 감염 시 자연 면역 반응을 유발하는 것으로 관찰된 감염성 병원체의 단백질로부터 선택되며, 그렇더라도 일부 경우에는 감염성 병원체의 다른 구성성분이 사용될 수 있다. 서브유닛 백신에 사용하기에 전형적인 항원은 표적 감염성 병원체의 표면 상에서 발현되는 단백질, 예컨대 바이러스의 표면-발현 외피 당단백질을 포함한다. 바람직하게는, 항원은 중화 항체에 대한 표적이다. 더욱 바람직하게는, 항원은 광범위 중화(broadly neutralizing) 항체에 대한 표적이어서, 항원에 대한 면역 반응은 다수의 계통(strain)의 감염성 병원체에 대한 면역력을 망라한다. 일부 경우, 서브유닛 백신에 N-연결 또는 O-연결되는 글리칸이 또한, 항원의 에피토프에 기여함으로써 또는 항원 상의 특정 에피토프에 대한 면역 반응을 입체 장해에 의해 가이드함으로써 백신화에 중요할 수 있다. 백신화에 반응하여 발생하는 면역 반응은 단백질 자체에 대해, 글리칸에 대해, 또는 단백질과 연결 글리칸 둘 다에 대해 지향될 수 있다. 서브유닛 백신은, 이들 백신이 살아 있는 병원체를 함유하지 않아 백신에 의한 환자의 감염에 대한 염려를 없애며; 이들 백신이 표준 유전자 조작 기법을 사용하여 설계될 수 있으며; 이들 백신이 다른 형태의 백신보다 더 균질하고; 이들 백신이 잘-특징화된 발현 시스템을 사용하여 표준화된 재조합 단백질 발현 생성 시스템에서 제조될 수 있다는 점을 포함하여 다양한 이점을 가진다. 일부 경우, 항원은 바람직한 항체, 예컨대 중화 항체 또는 광범위 중화 항체의 생성을 선호하도록 유전자 조작될 수 있다. 특히, X-선 결정분석, 전자 현미경, 또는 핵 자기 공명 실험에 의해 수득되는 관심 항원에 대한 구조적 정보는 서브유닛 백신의 합리적인 설계를 가이드하는 데 사용될 수 있다.
서브유닛 백신의 알려진 한계는, 유발된 면역 반응이 이따금 다른 유형의 백신, 예컨대 전(全)바이러스 백신, 생백신 또는 약독화 생백신에 대한 면역 반응보다 더 약할 수 있다는 것이다. 본 발명자들은, 나노구조-기초 백신이 대칭적 순차 어레이(symmetrically ordered array)에서 항원의 다가 표시를 통해 백신-유도 면역 반응의 약효 및 폭을 증가시키는 한편 서브유닛 백신의 이점을 이용하는 잠재성을 가짐을 인식하였고 본원에서 개시한다. 나노구조-기초 백신은 "나노입자 백신"의 한 형태이다. 본 개시내용에서, 나노구조-기초 백신은, 용어 나노입자 백신이 단백질계 또는 당단백질계 백신(예를 들어, 미국 특허 제US 9,441,019호 참조), 중합된 리포좀(예를 들어, 미국 특허 제7,285,289호 참조), 계면활성제 미쉘(예를 들어, 미국 특허 출원 제US 2004/0038406 A1호 참조), 및 합성 생분해성 입자(예를 들어, 미국 특허 제US 8,323,696호 참조)를 지칭하기 위해 당업계에서 사용되어 왔기 때문에 나노입자 백신으로부터 구별된다. 나노구조-기초 백신화는 유의한 상업적이고 공중 보건 영향을 갖는 백신화에서의 패러다임을 나타낸다. 그러므로, 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 병원체에 대해 면역 반응을 유발하기 위한; 그리고 예를 들어 비제한적으로 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 수막구균 및 말라리아를 포함하여 감염성 병원체에 의한 감염을 방지하거나 이러한 감염의 중증도를 저하시키기 위한 나노구조-기초 백신 및 이의 사용 방법에 대한 필요성이 존재한다.
나노구조, 백신, 이들의 사용 방법, 및 상기 나노구조를 제조하는 방법이 본원에 기재된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 제1 복수의 폴리펩타이드를 포함하는 나노구조를 제공하며, 여기서, 상기 제1 복수의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 대칭 오퍼레이터(symmetry operator)에 따라 배열되며; 상기 나노구조는 제1 복수의 항원을 포함하며; 각각의 제1 복수의 항원은 근위 단부 및 원위 단부를 가지고; 상기 항원의 근위 단부는 각각 제1 복수의 폴리펩타이드의 구성원에 부착된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 나노구조를 포함하는 백신을 제공하며, 여기서, 상기 백신은 감염성 병원체에 대한 중화 항체 반응을 유발할 수 있다. 일 구현예에서, 백신은 약제학적 조성물에서 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 감염성 병원체에 대한 면역력을 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용의 임의의 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 재조합 발현 시스템으로부터 정제된 구성성분의 시험관내 조립에 의해 본 개시내용의 임의의 나노구조를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 발현 시스템에서 모든 구성성분의 공동-발현에 의해 나노구조를 생성시키고 상기 나노구조를 정제함으로써 본 개시내용의 임의의 나노구조를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 나노구조의 일 구현예에서, 나노구조는 제2 복수의 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 제2 복수의 폴리펩타이드는 제1 복수의 폴리펩타이드에 부착된다. 일 구현예에서, 나노구조는 제2 복수의 항원을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 나노구조는 제2 복수의 항원을 추가로 포함하며, 각각의 제2 복수의 제2 항원은 근위 단부 및 원위 단부를 가지며, 상기 제2 항원의 근위 단부는 각각 제2 복수의 폴리펩타이드의 구성원에 부착되고, 선택적으로 항원의 근위 단부는 상기 항원의 N 말단 또는 상기 항원의 C 말단이다.
본 개시내용의 나노구조의 일 구현예에서, 복수의 항원은 복수의 항원성 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일 구현예에서, 나노구조의 항원성 단백질은 SEQ ID NO: 52-88 및 90-113 또는 이들의 변이체로부터 선택되거나; 항원성 단백질은 SEQ ID NO: 52-88 및 90-97로부터 선택되는 폴리펩타이드와 적어도 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 동일하거나; 항원성 단백질은 하기 중 임의의 것이다: HIV Env, RSV F, 인플루엔자 HA, EBV gp350, CMV gB, CMV UL128, CMV UL130, CMV UL131A, CMV gH, CMV gL, 라임 OspA, 백일해 독소, 뎅기 E, SARS S, MERS S, 자이르 에볼라바이러스 GP, 수단 에볼라바이러스 GP, 마버그 바이러스 GP, 한타 바이러스 Gn, 한타 바이러스 Gc, HepB 표면 항원, 홍역 H, 지카 외피 도메인 III, 말라리아 CSP, 말라리아 Pfs25, MenB fHbp, MenB NadA, MenB NHBA, 니파 바이러스 F, 니파 바이러스 G, 로타바이러스 VP4, 로타바이러스 VP8*, hMPV F, hMPV G, PV F, 또는 PV HN 8.
일 구현예에서, 나노구조는 항원의 표적 에피토프를 표시하도록 구성되고, 선택적으로, 표적 에피토프는 본원 하기에서 정의된 바와 같은 항체에 접근 가능하다. 나노구조가 복수의 항원성 단백질을 포함하는 임의의 구현예에서, 선택적으로 상기 나노구조는 제1 복수의 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유발하도록 구성되고, 상기 면역 반응은 상기 항원성 단백질의 표적 에피토프에 대해 우선적으로 지향적이다. 본 개시내용의 구현예에서, 표적 에피토프는 보존되거나, 중화 항체에 대한 에피토프이거나, 교차-반응성 항체에 대한 에피토프이거나, 광범위-중화(broadly-neutralizing) 항체에 대한 에피토프이다.
본 개시내용의 나노구조의 일 구현예에서, 복수의 항원은 계면-안정화 돌연변이(interface-stabilizing mutation), 이황화 결합을 초래하도록 구성된 상보적 시스테인 돌연변이, 루프의 결실, N-연결 글리코실화 부위의 첨가, N-연결 글리코실화 부위의 제거, 에피토프-파괴 돌연변이 및 에피토프-생성 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 복수의 항원은 항원성 올리고당을 포함한다.
본 개시내용의 백신의 일 구현예에서, 중화 항체 반응은 감염성 병원체에 의한 감염에 대해 보호적이다. 일 구현예에서, 중화 항체 반응은 다양한 계통(strain)의 감염성 병원체에 대해 광범위-중화적이다. 일 구현예에서, 감염성 병원체는 하기 중 임의의 것이다: 라임병, 백일해, 헤르페스바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 수막구균 또는 말라리아. 일 구현예에서, 감염성 병원체는 하기로부터 선택되는 바이러스이다: HIV, RSV, 인플루엔자, EBV, CMV, 뎅기, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스, 한타 바이러스, B형 간염, HPV, 홍역, 니파 바이러스, 로타바이러스, 메타뉴모 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 및 지카. 일 구현예에서, 감염성 병원체는 라임병 또는 백일해이다. 일 구현예에서, 감염성 병원체는 말라리아이다. 일 구현예에서, 감염성 병원체는 수막구균이다.
본 개시내용의 면역력을 생성시키는 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 아쥬반트를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 백신을 반복적으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 하기로부터 선택되는 제2 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하고: 나노입자계 백신, 단백질계 백신, 생백신, 약독화 생백신, 전병원체(whole germ) 백신, DNA 백신 또는 RNA 백신; 선택적으로 제1 백신은 프라임이고 제2 백신은 부스트이거나, 선택적으로 제2 백신은 프라임이고 제1 백신은 부스트이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 지향성 친화도 성숙(directed affinity maturation)을 유도한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 광범위-중화 면역 반응을 초래한다.
본 개시내용의 임의의 나노구조를 제조하는 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 순차적으로 또는 비-순차적으로 제1 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계, 제2 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 항원을 발현시키는 단계, 상기 제1 복수의 폴리펩타이드를 정제하는 단계, 상기 제1 복수의 항원을 정제하되, 단, 각각의 구성성분의 발현이 먼저이고 그 후에 해당 구성성분의 정제가 이어지는 단계; 그 후에 상기 제1 복수의 폴리펩타이드와 상기 제1 복수의 항원을 혼합하여 이로써 나노구조를 생성시키는 단계에 의해 나노구조의 시험관내 조립을 달성한다.
나노구조를 제조하는 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 순차적으로 또는 비-순차적으로 제1 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계, 제2 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 항원을 발현시키는 단계, 제3 재조합 발현 시스템에서 제2 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계, 상기 제1 복수의 폴리펩타이드를 정제하는 단계, 상기 제1 복수의 항원을 정제하는 단계, 상기 제2 복수의 폴리펩타이드를 정제하되, 단, 각각의 구성성분의 발현이 먼저이고 그 후에 해당 구성성분의 정제가 이어지는 단계; 및 상기 제1 복수의 폴리펩타이드, 상기 제1 복수의 항원, 및 상기 제2 복수의 폴리펩타이드를 혼합하여 이로써 나노구조를 생성시키는 단계에 의해 나노구조의 시험관내 조립을 달성한다. 선택적으로, 제1 재조합 발현 시스템 및 제2 재조합 발현 시스템은 동일하고, 제1 복수의 폴리펩타이드 및 제1 복수의 항원은 함께 정제된다.
나노구조를 제조하는 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 단일 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드 및 제1 복수의 항원을 발현시켜 이로써 나노구조를 생성시키는 단계, 및 상기 나노구조를 정제하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 단일 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드, 제1 복수의 항원 및 제2 복수의 폴리펩타이드를 발현시켜 이로써 나노구조를 생성시키는 단계, 및 상기 나노구조를 정제하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 선택적으로, 제1 복수의 폴리펩타이드 및 제1 복수의 항원은 단일 개방형 리딩프레임(reading frame)에 의해 인코딩되며; 선택적으로, 상기 단일 개방형 리딩프레임은 폴리펩타이드와 항원의 융합 단백질을 인코딩하고; 선택적으로, 상기단일 개방형 리딩프레임은 자가-절단형 펩타이드이다.
상기 단락은 본 발명의 모든 양태를 정의하고자 하는 것이 아니며, 부가적인 양태는 다른 부문, 예컨대 상세한 설명에 기재되어 있다. 전체 문헌은 일원화된 개시내용으로서 관련되고자 하며, 본원에 기재된 특질들의 모든 조합은 상기 특질의 조합이 본 문헌의 동일한 문장, 단락 또는 부문에서 함께 발견되지 않더라도 고려됨을 이해해야 한다. 본 발명은 상기 구체적인 단락에 의해 정의된 변동보다 더 좁은 범위에서 본 발명의 모든 구현예를 부가적인 양태로서 포함한다. 예를 들어, 속(genus)으로서 기재된 본 발명의 소정의 양태에서, 속의 모든 구성원은 개별적으로 본 발명의 일 양태임을 이해해야 한다.
도 1a는 시험관내 조립에 의한 항원-소유(bearing) 나노구조의 생성의 개략도를 도시한다. 주어진 나노구조의 2개 구성성분 또는 구성 요소(building block)는 개별적으로 발현되고 정제될 수 있으며, 이는 정제된 구성성분을 시험관내에서 혼합함으로써 나노구조의 조립을 개시시킬 수 있으며, 이 과정을 시험관내 조립으로 지칭한다. 일부 구현예에서, 나노구조의 2개 구성성분은 상이한 발현 숙주(예를 들어, 인간 HEK293F 세포 또는 박테리아 이. 콜라이 세포)에서 발현될 수 있다. 도면은 HEK293F 세포에서 생성된 항원-나노구조 삼량체 융합 단백질 및이. 콜라이에서 생성된 나노구조 오량체 단백질의 시험관내 조립을 통한 20개의 삼량체성 항원(60개의 항원 서브유닛)을 소유한 120-서브유닛 나노구조의 조립을 도시한다.
도 1b는 예시적인 나노구조 구성(architecture)을 도시한다.
도 2a 내지 도 2c는 조직 배양 상층액 내의 분비된 DS-Cav1(도 2a), DS-Cav1-폴돈(foldon)-T33-31A(도 2b) 및 DS-Cav1-T33-31A(도 2c) 융합 단백질의 검출을 예시하는 그래프를 도시한다. ELISA 검정법은 DS-Cav1(상단), DS-Cav-l-폴돈-T33-31A/T33-31B(하단 좌측) 및 DS-Cav-1-T33-31A/T33-31B(하단 우측)를 발현하는 세포로부터의 조직 배양 상층액에서 수행되었다. RSV F에 결합하는 4개의 상이한 모노클로날 항체는 상층액 내의 DS-Cav1 또는 DS-Cav1 융합 단백질의 존재를 평가하는 데 사용되었다. 그 결과는 잘-접혀진 RSV F 항원을 포함하는 단백질의 분비를 확증한다.
도 3은 DS-Cav1-I53-50A의 크기-배제 크로마토그래피를 도시한다. 고정화된(immobilized) 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 조직 배양 상층액으로부터 정제된 단백질은 Superose 6 10/300 GL 크기 배제 컬럼에 적용되었다. 단백질은 단일의 단분산 종(monodisperse species)으로서 용출되었다.
도 4는 시험관내-조립된 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한다. 정제된 DS-Cav1-I53-50A 및 I53-50B.4PT1 단백질은 대략 1:1 몰비에서 혼합되고, 4℃에서 밤새 인큐베이션된 다음, 세파크릴 S-500 16/60 HR 크기 배제 컬럼에 적용되었다. 조립된 나노구조는 약 65 mL의 단일, 단분산 피크로서 용출된 한편, 과량의 DS-Cav1-I53-50A 삼량체성 구성성분은 약 90 mL 용출되었다.
도 5는 시험관내-조립된 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 네거티브 염색 전자 현미경 사진 및 2-차원 클래스 평균(class average)을 도시한다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된 시험관내-조립된 DS-Cav1-I53-50 나노구조는 네거티브 염색 전자 현미경(상단)에 의해 이미지화되었다. 많은 나노구조의 평균화는, 나노구조의 I53-50 부분이 고도로 정돈되고 일관되어 있는 한편, 표시된 항원의 정밀한 3-차원 위치는 DS-Cav1-I53-50A 융합 단백질의 DS-Cav1 도메인과 I53-50A 도메인 사이의 링커의 가요성 성질로 인해 약간 변동됨을 나타내는 2-차원 클래스 평균(하단)을 산출하였다.
도 6a 내지 도 6c는 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 항원성을 도시하는 일련의 그래프를 도시한다. 예비융합-특이적 항체 MPE8, D25 및 RSD5를 포함하여 4개의 RSV F-특이적 모노클로날 항체를 사용한 ELISA(도 6a)에 의한 정제된 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 분석은, DS-Cav1 항원이 올바르게 접혀 있고 DS-Cav1-I53-50 나노구조 상에서 다가로(multivalently) 표시된 경우 예비융합 상태로 유지됨을 나타내었다. 이러한 발견은 다수의 RSV F-특이적 항체를 사용한 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 확증되었으며, 이는 삼량체성 DS-Cav1(도 6c)과 비교한 경우, DS-Cav1(도 6b)의 다가 표시가 항체의 해리율을 감소시키는 결합력(avidity) 효과를 초래함을 추가로 제안하였다.
도 7은 DS-Cav1-I53-50 나노구조로 면역화된 마우스로부터의 DS-Cav1-특이적 혈청 항체를 도시하는 그래프이다. 마우스 그룹은 부가적인 항원이 결여된 I53-50 나노구조, 삼량체성 DS-Cav1, 또는 33%, 66% 또는 100% 원자가(valency)에서 DS-Cav1 항원을 소유한 I53-50 나노구조로 면역화되었다. DS-Cav1-특이적 혈청 항체 역가는 DS-Cav1로 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 측정되었다. 각각의 마우스에 대한 혈청 항체 역가는 원형으로 그려져 있으며, 이때 각각의 그룹 내의 기하 평균은 수평선으로 그려져 있고 하단에 수치로 보고되어 있다.
도 8은 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 면역화에 의해 유발된 혈청 중화 활성을 도시하는 그래프이다. 마우스 그룹은 부가적인 항원이 결여된 I53-50 나노구조, 삼량체성 DS-Cav1, 또는 33%, 66% 또는 100% 원자가에서 DS-Cav1 항원을 소유한 I53-50 나노구조로 면역화되었다. 각각의 마우스에 대한 중화 역가는 원형으로 그려져 있으며, 이때 각각의 그룹 내의 기하 평균은 수평선으로 그려져 있다.
도 9a 내지 도 9b는 DS-Cav1-폴돈 I53-50 나노구조의 면역화에 의해 유발된 영장류 면역계에서의 면역원성을 도시하는 그래프이다. 히말라야 원숭이(Rhesus macaque)는 유리(free) DS-Cav1 삼량체 또는 100% 원자가에서 DS-Cav1을 표시하는 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조와 함께 0주째 및 4주째에 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조로 근육내 주사되었다. 두 경우 모두에서, DS-Cav1 항원의 용량은 50 μg이었고, 면역원은 MF59-유사, 스쿠알렌계 수-중-유 에멀젼 아쥬반트 SWE와 함께 제제화되었다. 6주째 및 16주째에 동물로부터 수득된 혈청은 항-DS-Cav1 항체 역가(도 9a) 및 RSV-중화 항체 역가(도 9a)에 대해 평가되었다.
도 10은 I53-50A에 융합된 경우 및/또는 정20면체 나노구조로 추가로 조립된 경우 DS-Cav1의 물리적 안정성을 도시하는 그래프이다. 동일한 농도(50 nM)의 DS-Cav1을 함유하는 삼량체성 DS-Cav1, 삼량체성 DS-Cav1-폴돈-I53-50A, 및 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조의 샘플은 4개의 분취물로 분할되고, 20℃, 50℃, 70℃ 또는 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 실온까지 냉각 후, D25 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 검정하였다.
도 11a 내지 도 11j는 나노구조의 물리적 안정성을 도시하는 그래프이다. 내재적 트립토판 형광에 의해 모니터링되는 구아니딘 하이드로클로라이드(GdnHCl)에서의 화학적 변성은 삼량체성 DS-Cav1(도 1a 및 도 1b), DS-Cav1-폴돈-I53-50A(도 1c 및 도 1d), DS-Cav1-폴돈-I53-50(도 1e 및 도 1f), I53-50(도 1g 및 도 1h), 및 I53-50A(도 1i 및 도 11j)의 물리적 안정성을 평가하기 위한 제2, 항체-독립적 기법으로서 사용되었다. 데이터는, I53-50A 나노구조 구성성분에 유전적으로 융합된 경우 DS-Cav1 항원의 우수한 물리적 안정성을 나타낸다.
본 개시내용은 나노구조 및 나노구조-기초 백신에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 나노구조는 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 병원체에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 항원을 표시한다. 본 개시내용의 일부 백신은 예를 들어 비제한적으로, 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 수막구균 및 말라리아를 포함한 감염성 병원체에 의한 감염을 방지하거나 감염의 중증도를 저하시키는 데 유용하다. 항원은 융합 단백질로서 또는 본원에 개시된 다른 수단에 의한 것을 포함하여 비-공유적으로 또는 공유적으로 나노구조의 코어에 부착될 수 있다. 다량체성 항원은 선택적으로, 나노구조의 대칭축을 따라 표시될 수 있다. 또한, 단백질 및 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 제제, 및 사용 방법이 제공된다.
본 발명이 추가로 기재되기 전에, 이 발명은 당연하게도 변동될 수 있는 기재된 특정 구현예에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명할 목적을 위한 것일 뿐이고 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한적인 것은 아니고자 함을 이해해야 한다.
1. 나노구조의 개요
본 발명의 나노구조는 항원 또는 항원 단편을 표시하도록 적응된 다량체성 단백질 조립체를 포함할 수 있다. 본 발명의 나노구조는 적어도 제1 복수의 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 복수의 폴리펩타이드는 자연-발생 단백질로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환 또는 하나 이상의 잔기의 N-말단 또는 C-말단에서의 첨가에 의해 유래될 수 있다. 일부 경우, 제1 복수의 폴리펩타이드는 컴퓨터 방법에 의해 드 노보(de novo)에서 결정된 유전자 서열을 포함한다. 이러한 제1 복수의 폴리펩타이드는 전체 나노구조를 형성할 수 있거나, 나노구조는 하나 이상의 부가적인 폴리펩타이드를 포함할 수 있어서, 상기 나노구조는 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 복수의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우, 제1 복수는 3-겹(fold) 회전 대칭과 관련된 삼량체를 형성할 것이고, 제2 복수는 5-겹 회전 대칭과 관련된 오량체를 형성할 것이다. 이들 하나 이상의 복수의 폴리펩타이드는 함께 배열될 수 있어서, 각각의 복수의 폴리펩타이드의 구성원은 대칭 오퍼레이터에 의해 서로 관련된다. 표적 대칭 구성에서 단백질 구성 요소의 대칭적 도킹(symmetrical docking)을 수반하는 자가-조립형 단백질 물질을 설계하는 일반적인 컴퓨터 방법은 미국 특허 공보 제US 2015/0356240 A1호에 개시되어 있다.
나노구조의 "코어"는 본원에서, 나노구조에 의해 표시되는 항원 또는 항원 단편을 함께 연결하는 나노구조의 중심부를 기재하기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 코어 및 표시된 항원은 동일한 폴리펩타이드이며, 이는 항원 그 자체가 나노구조로 자가-조립될 수 있음을 의미한다. 항원 자체를 자가-조립하도록 설계하는 이점은, 전체 나노구조가 백신의 항원성 구성성분으로서 작용한다는 점이다. 그러나 일 구현예에서, 본 개시내용의 나노구조의 코어는, 당업자가 백신에 포함시키기 위해 선택할 다양한 항원 중 임의의 항원의 표시를 위해 적응 가능한 일반적 플랫폼(generic platform)이다. 코어를 일반적 플랫폼으로 설계하는 이점은, 코어를 포함하는 하나 이상의 복수의 폴리펩타이드가 먼저 설계되고 최적화된 다음 상이한 항원에 적용될 수 있다는 점이다. 일부 경우, 동일한 폴리펩타이드는 "코어"의 일부를 형성한 다음, 항원의 부착을 위한 어댑터로서 그리고 항원(즉, 항원과의 융합 단백질) 자체로서 바깥쪽으로 연장될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 개시내용의 구현예에서, 항원은 감염성 병원체의 단백질, 당단백질 또는 올리고당류이다.
일부 경우, 코어가 항원의 부재 시 독립적으로 자가-조립할 수 있을 것이더라도, 자가-조립은 항원의 다량체화에 의해 추가로 촉진될 수 있다. 이는 예를 들어, 동종-삼량체성 항원(예컨대 HIV gp140, 인플루엔자 HA, 또는 RSV F 단백질)이 입자 상에 표시된 항원 또는 몇몇 항원 중 하나일 때의 경우일 것이다. 일부 경우, 나노구조의 3-겹 축을 따라 놓인 삼량체성 항원은 상기 항원의 적절한 접힘 및 구조 안정성(conformation stability)을 촉진하고 나노구조의 자가-조립을 협동 과정으로 만들며, 그런 점에서 항원은 부분적으로는 나노구조의 코어의 3-겹 축 상에서의 이의 표시로 인해 적절하게 삼량체화되고 나노구조는 적어도 부분적으로는 삼량체 단위 사이에서의 비-공유 또는 공유 상호작용에 의해 이의 조립된 형태에서 안정화된다. 일부 경우, 항원으로의 또는 나노구조 구성성분으로의 돌연변이의 도입은 선택적으로, 특히 시스테인 잔기가 분자내 이황화 결합을 생성하도록 위치한다면 조립체를 추가로 안정화시킬 수 있다. 일부 예에서, 이량체성, 삼량체성, 사량체성, 오량체성 또는 육량체성 항원은 매칭 2-겹, 3-겹, 4-겹, 5-겹 또는 6-겹 대칭 축을 갖도록 설계된 코어 상에 표시되어, 상기 코어는 항원의 네이티브 대칭(native symmetry)으로 다량체성 항원의 배열을 수용한다.
2. 나노구조의 다양한 비-제한적인 예
구현예의 비제한적인 예는 도 1a에 도시되어 있으며, 이 도면은 이. 콜라이 세포에서 재조합적으로 발현되는 오량체성 단백질 조립체(제2 복수의 폴리펩타이드)와 함께, 293F 세포에서 재조합적으로 발현되는 나노구조의 구성성분(제1 복수의 폴리펩타이드)에 유전적으로 융합된 RSV F 단백질을 도시하며, 이들 2개의 복수의 폴리펩타이드는 나노구조("설계된 나노입자 면역원")로 자가-조립하여 정20면체 코어 주변으로 20개의 F-단백질 삼량체를 표시하고 있다. 이 구현예에서, 코어는 일반적 설계를 갖는다. 하기 설명된 바와 같이, 다른 구현예에서, RSV F 단백질은 다른 또 다른 항원 단백질, 예컨대 또 다른 바이러스로부터의 삼량체성 당단백질로 대체된다. 일부 구현예에서, 나노구조는 HIV-1, HIV-2, EBV, CMV, RSV, 인플루엔자, 에볼라, 마버그, 뎅기, SARS, MERS, 한탄 또는 지카 바이러스의 삼량체성 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 나노구조는 비제한적으로 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스 또는 레트로바이러스를 포함한 이들 예시적인 바이러스 중 임의의 바이러스와 진화적으로 또는 서열 동일성에서 관련이 있는 바이러스의 삼량체성 당단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 나노구조는 막관통 단백질 또는 당단백질의 세포외 도메인 또는 도메인들 또는 이의 항원 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 나노구조는 비제한적으로, 나이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides)("수막구균"으로도 알려져 있음), B형 해모필루스 인플루엔자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함한 박테리아 병원체의 항원 단백질 또는 단백질 단편 또는 항원성 올리고당을 포함한다.
이러한 또는 유사한 나노구조와 함께 사용될 수 있는 삼량체성 항원은 일부 경우 비제한적으로, HIV gp140, 인플루엔자 HA, 뎅기 E 단백질, 또는 에볼라 sGP이다. 다른 삼량체성 항원이 사용되는 경우, 이들 삼량체성 항원은 선택적으로 나노구조의 3-겹 대칭 축 상에 놓일 수 있다. 일부 경우, 선택된 항원은 단량체성이지만 3-겹 축 상에 놓인다. 그러므로, 도 1a에 도시된 나노구조는 20개의 삼량체성 항원 또는 60개의 단량체성 항원을 표시할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 나노구조의 오량체성 복합체는 12개의 오량체성 항원 또는 70개의 단량체성 항원을 표시하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 나노구조는 삼량체성 항원의 20개 카피(copy) 및 오량체성 항원의 12개 카피를 포함한다.
2.1. 나노구조 코어
본 개시내용의 폴리펩타이드의 다른 잠재적인 배열은 도 1b에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 나노구조는 최대 8개의 삼량체; 8개의 삼량체 및 12개의 이량체; 6개의 사량체 및 12개의 이량체; 6개의 사량체 및 8개의 삼량체; 20개의 삼량체 및 30개의 이량체; 4개의 삼량체 및 6개의 이량체; 4개의 제1 삼량체 및 4개의 제2 삼량체, 또는 8개의 삼량체; 12개의 오량체 및 20개의 삼량체; 또는 12개의 오량체 및 30개의 이량체; 또는 4개의 삼량체의 표시를 위해 적응된다. 일부 경우, 대칭축 중 하나는 항원 표시에 사용되지 않으므로, 일부 구현예에서, 나노구조는 최대 8개의 삼량체; 12개의 이량체; 6개의 사량체; 20개의 삼량체; 30개의 이량체; 4개의 삼량체; 6개의 이량체; 8개의 삼량체; 또는 12개의 오량체의 표시를 위해 적응된다. 일부 경우, 단량체성 항원이 표시되므로, 나노구조는 최대 12, 24, 60, 또는 70개의 단량체성 항원의 표시를 위해 적응된다. 일부 경우, 나노구조는 혼합 복수의 폴리펩타이드를 포함하여, 그렇지 않다면 나노구조의 코어의 동일한 폴리펩타이드는 상이한 항원을 표시하거나 항원을 표시하지 않게 된다. 그러므로, 폴리펩타이드의 비에 따라, 일부 경우에 나노구조는 (예를 들어, I52 입자 상에서) 1 내지 130개 항원의 표시를 위해 적응되며, 이때 표시된 각각의 항원은 동일할 수 있거나 선택된 임의의 비에 비례하여 혼합 집단의 상이한 구성원일 수 있다. 항원은 재조합 발현 시스템에서 공동-발현되고 정제 전에 자가-조립될 수 있다. 대안적으로, 항원은 별개로 발현된 다음, 발현 숙주 및 연관된 오염물로부터의 정제 전 또는 정제 후에 함께 혼합될 수 있다. 다양한 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 항원이 표시된다. 비제한적인 예시적 나노구조는 문헌[Bale 등 Science 353:389-94 (2016)]; [Heinze 등 J. Phys. Chem B. 120:5945-5952 (2016)]; [King 등 Nature 510:103-108 (2014)]; 및 [King 등 Science 336:1171-71 (2012)]에서 제공된다.
2.2. 혼합된 나노구조
일부 구현예에서, 나노구조는 동일한 유기체로부터의 2개 이상의 항원, 예컨대 비제한적으로 HIV gp140 및 HIV gp41; 또는 에볼라 바이러스 GP1 및 GP2; 또는 홍역 H 및 F 단백질; 또는 CMV gB 및 CMV UL128, UL130, UL131A, gH(UL75) 및 gL(UL115)을 동일한 나노구조 상에 표시한다. 일부 경우, 나노구조는 재조합 발현 시스템에 대해 내인성인 프로테아제에 의한 또는 외인성적으로 공급된 프로테아제에 의한 전사-후 절단, 예컨대 RSV F 단백질 또는 인플루엔자 HA 단백질의 절단에 의해 생성되는 2개의 항원성 단백질 또는 당단백질을 표시한다.
일부 경우, 나노구조는 병원성 유기체의 2개 이상의 다양한 계통으로부터의 동일한 항원을 표시하도록 적응된다. 비제한적인 예에서, 동일한 나노구조는 동종삼량체성 단백질 항원의 혼합된 집단 또는 상이한 계통의 감염성 병원체로부터의 단백질 항원의 혼합된 이종이량체를 표시한다. 일 구현예에서, 나노구조는 H1N1 A형 인플루엔자의 HA 단백질 및 H3N2 A형 인플루엔자 단백질을 표시한다. 일 구현예에서, 나노구조는 A형 인플루엔자의 HA 단백질 및 B형 인플루엔자의 HA 단백질을 표시한다. 일 구현예에서, 다양한 계통의 HIV로부터의 gp140 단백질은 단일 나노구조 상에 표시된다. 2, 3, 4, 5 또는 6개 계통의 HIV는 동일한 나노구조에 의해 표시될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 혼합된 나노구조의 이점은, 상기 나노구조가 교차-반응성 또는 광범위 중화 면역 반응의 생성을 촉진한다는 점이다. 일부 경우, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 범용 인플루엔자 백신이다. 일부 경우, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 HIV 백신이다. 일부 경우, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 HIV에 대한 지속적 보호를 제공한다. 일부 경우, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 인플루엔자에 대한 지속적 보호를 제공한다. 일 구현예에서, 나노구조는 1형, 2형, 3형 및 4형 뎅기의 E 단백질의 표시를 위해 적응된다. 일 구현예에서, 나노구조-기초 백신은 각각의 1형, 2형, 3형 및 4형 뎅기로부터의 단백질 E를 개별적으로 표시하는 나노구조를 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 뎅기 출혈열 또는 뎅기 쇼크 증후군의 증가된 위험 없이 뎅기 바이러스에 대한 면역력을 제공한다.
혼합된 나노구조가 제조되는 경우, 예를 들어, 모든 H1N1 A형 인플루엔자 HA 단백질이 T33 입자의 하나의 3-겹 축 상에 표시되는 반면, 모든 H3N2 A형 인플루엔자 HA 단백질이 T33 입자의 다른 3-겹 축 상에 표시되는 것과 같이, 이종이량체화를 허용하기 보다는 동종체화(homomerization)를 계통-특이적 방식에서 보장하는 것이 유리할 수 있다. 이는 2개 이상의 복수의 폴리펩타이드를 나노구조의 코어로서 포함하는 나노구조의 사용에 의해 달성될 수 있으며, 이때 복수의 폴리펩타이드 각각은 상이한 항원에 부착된다. 대안적으로, 나노구조는 하나 이상의 대칭-파괴(symmetry-breaking) 돌연변이, 예컨대 놉-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이 또는 분자내 이황화 돌연변이로 조작될 수 있으며, 이러한 조작은 상이한 항원 사이에서 삼량체 형성을 방지하는 효과를 가진다. 해당 경우, 나노구조는 상기 나노구조 상의 대칭적으로 동등한 위치에서 상이한 계통으로부터의 다량체성 항원을 표시하지만, 나노구조 상의 각각의 위치는 동일한 균주로부터의 동종체(homoner)에 의해 점유되며, 계통간 이종체성(heteromeric) 항원은 무의미한 비율로만 존재하였다. 일부 경우, 항원 자체는 계통간 이종이량체화를 방지하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 나노구조는 예를 들어, 2009 H1N1 캘리포니아 인플루엔자로부터의 HA 단백질 및 1999 H1N1 칼레도니아 인플루엔자로부터의 HA 단백질과 같이 보존된 구조를 갖지만 다른 항원성을 갖는 2개의 항원성 단백질의 이종체화를 방지하기 위해 조작된다. 더욱이, 혼합된 나노구조가 생성되고 항원이 융합 단백질로서 표시되는 경우, 상이한 항원성 도메인을 갖는 나노구조의 코어를 형성하는 데 사용되는 동일한(또는 동등한) 도메인을 융합 단백질이 공유할 것이며 각각의 항원에 대해 하나가 나노구조 상에 표시되기 때문에 나노구조는 3개 이상의 상이한 단백질을 포함할 것이다.
2.3. 부착 양상
본 개시내용의 나노구조는 유전자 융합으로서 또는 본원에 개시된 다른 수단에 의해서를 포함하여 다양한 방식으로 항원을 표시한다. 본원에 사용된 바와 같이, "~에 부착된"은 2개의 폴리펩타이드를 결합시키기 위한 당업계에 알려진 임의의 수단을 말한다. 결합은 직접적 또는 간접적, 가역적 또는 비가역적, 약한 또는 강한, 공유 또는 비-공유, 및 선택적 또는 비선택적일 수 있다.
일부 구현예에서, 부착은 나노구조를 포함하는 복수의 폴리펩타이드 중 하나에의 항원의 N-말단 또는 C-말단 융합을 생성하기 위해 유전자 조작에 의해 달성된다. 그러므로, 나노구조는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 복수의 항원을 표시하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 복수의 폴리펩타이드로 구성되거나 이로 본질적으로 구성될 수 있으며, 이때 복수의 항원 중 적어도 하나는 복수의 폴리펩타이드 중 적어도 하나에 유전적으로 융합된다. 일부 경우, 나노구조는 자가-조립할 수 있고 폴리펩타이드에 유전적으로 융합된 복수의 항원을 포함하는 하나의 복수의 폴리펩타이드로 본질적으로 구성된다. 일부 경우, 나노구조는 폴리펩타이드에 유전적으로 융합된 복수의 항원을 포함하는 제1 복수의 폴리펩타이드; 및 2-구성성분 나노구조로 공동-조립할 수 있는 제2 복수의 폴리펩타이드로 본질적으로 구성되며, 하나의 복수의 폴리펩타이드는 항원을 나노구조에 연결하고 다른 복수의 폴리펩타이드는 나노구조의 자가-조립을 촉진한다.
일부 구현예에서, 부착은 하나 이상의 복수의 폴리펩타이드와 하나 이상의 복수의 항원 사이의 번역-후 공유 부착에 의해 달성된다. 일부 경우, 화학적 가교는 항원을 나노구조 폴리펩타이드에 비-특이적으로 부착시키는 데 사용된다. 일부 경우, 화학적 가교는 항원을 나노구조 폴리펩타이드에 특이적으로 부착시키는 데 사용된다. 다양한 특이적인 및 비-특이적인 가교 화학, 예컨대 클릭(Click) 화학 및 다른 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 2개의 단백질을 연결하는 데 사용되는 임의의 가교 화학은 본원에 개시된 나노구조에서 사용하기 위해 적응될 수 있다. 특히, 면역공액체 또는 항체 약물 공액체의 생성에 사용되는 화학이 사용될 수 있다. 일부 경우, 항원-나노구조 공액체(ANC)는 절단 가능한 또는 비-절단 가능한 링커를 사용하여 생성된다. 항원을 담체에 공액시키는 과정 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 공보 제US 2008/0145373 A1호에 의해 제공된다. 일 구현예에서, 항원은 다당류이다. 일부 경우, 항원은 다당류이고, 나노구조는 합텐으로서 작용한다. 일 구현예에서, 표적 항원은 단백질이고, 다당류에의 표적 항원의 공액은 면역 반응을 증강시키는 데 사용된다. 단백질-다당류 공액체를 제조하는 과정은 예를 들어, 미국 특허 제6,248,334호에 제공된다. 일부 경우, 다당류에의 단백질의 공액은 다당류를 약한 면역원성 T-세포 독립적 항원으로부터 조력 T-세포를 동원하는 T-세포 의존적 항원으로 전환시키므로, 강화된 면역 반응을 자극한다. 문헌[J. M. Cruse, 등 (Editors), Conjugate Vaccines, Karger, Basel, (1989)]; 및 [R. W. Ellis, 등 (Editors), Development and Clinical Uses of Haemophilus B Conjugate Vaccines, Marcel Dekker, New York (1994)]를 참조한다.
일 구현예에서, 부착은 하나 이상의 복수의 폴리펩타이드와 하나 이상의 복수의 항원 사이의 비-공유 부착에 의해 달성된다. 일부 경우, 항원은 적어도 하나의 표면 상에서 음으로 하전되도록 조작되고 폴리펩타이드는 적어도 하나의 표면 상에서 양으로 하전되도록 조작되거나, 각각 양으로 그리고 음으로 하전되도록 조작된다. 이는 나노구조의 항원과 폴리펩타이드 사이의 분자간 결합을 정전력에 의해 촉진한다. 일부 경우, 형상 상보성은 항원을 나노구조에 연결시키기 위해 이용된다. 형상 상보성은 기존의 것이거나 합리적으로 설계될 수 있다. 일부 경우, 단백질-단백질 계면의 컴퓨터 설계는 부착을 달성하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 항원은 비오틴-표지되고 폴리펩타이드는 스트렙타비딘을 포함하거나, 그 반대이다. 일 구현예에서, 스트렙타비딘은 나노구조의 4-겹 축 상에서 유전자 융합에 의해 또는 그렇지 않다면 사량체로서 표시되고 비오틴-표지 항원은 단량체성, 이량체성 또는 사량체성이어서, 항원의 네이티브 다량체화에 적절한 구성에서 나노구조에의 결합을 가능하게 한다. 일부 경우, 단백질계 어댑터는 항원을 포착하는 데 사용된다. 일부 경우, 폴리펩타이드는, 항원에 융합되는 상보적 단백질에 결합할 수 있는 단백질에 융합된다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 로타바이러스 VP6 단백질에 결합하여 삼량체를 형성하고, 항원은 로타바이러스 VP7의 N-말단 펩타이드에 N-말단적으로 융합되어, 나노구조에의 항원의 삼량체-대-삼량체 결합을 가능하게 한다. 문헌[Chen 등 Molecular interactions in rotavirus assembly and uncoating seen by high-resolution cryo-EM. PNAS 2009 June, 106 (26) 10644-10648]을 참조한다.
일 구현예에서, 각각의 제1 복수의 항원성 단백질은 근위 단부 및 원위 단부를 가지고; 상기 항원성 단백질의 근위 단부는 각각 제1 복수의 폴리펩타이드의 구성원에 부착된다. 그러므로, 항원성 단백질의 원위 단부는 나노구조의 중심으로부터 가장 먼 항원의 부분으로서 정의된다. 일 구현예에서, 항원성 단백질은 표적 에피토프를 포함하고, 나노구조는 표적 에피토프를 표시하도록 구성된다. 일부 경우, 항원성 단백질은 하나 초과의 표적 에피토프를 포함할 수 있고, 나노구조는 각각의 표적 에피토프를 표시하도록 구성된다. 일부 경우, 원위 단부에 점진적으로 더 가까워지는 에피토프는 (이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만) 면역계에 선호적으로 접근 가능하다. 항원성 단백질의 원위 단부는 이의 N 말단 또는 이의 C 말단일 수 있거나, 어떤 말단도 아닐 수 있다. 그러므로, 항원성 단백질이 나노구조에 어떻게 부착되는지에 따라, 항원성 단백질은 임의의 배향으로 표시될 수 있다. 일부 경우, 항원성 단백질은, 하나 이상의 알려진 에피토프가 항원성 단백질의 원위 단부에서 또는 원위 단부 쪽으로 배향되도록 표시되어, 이들 에피토프(들)는 면역계에 선호적으로 접근 가능하다. 일부 경우, 배향은 바이러스에 관하여 바이러스 단백질의 배향을 반복(recapitulate)할 것이다. 그러므로, 인플루엔자 HA의 경우, 항원성 단백질 HA는 바이러스 전체에서의 HA의 배향과 유사하게 수용체 결합 부위가 상기 단백질의 원위 단부에 존재하도록 배향될 수 있거나, 대안적으로 인플루엔자 HA 단백질은 스템(stem) 에피토프가 면역계에 선호적으로 접근 가능하도록 배향될 수 있다. 배향의 선택은 면역계를 하나의 에피토프 또는 다른 에피토프에 지향시킬 수 있다. 이 예에서, 인플루엔자에 대한 면역 반응은 배향의 선택에 의해 수용체 결합 부위로 또는 스템으로 가이드될 수 있다. 유사하게는, 다른 항원의 배향이 면역 반응에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 항원의 배향은 바람직한 에피토프에 대해 표적화된 면역 반응을 초래한다. 일부 구현예에서, HIV의 경우, 항원성 단백질은 HIV-1 또는 HIV-2의 Env 단백질 또는 이의 항원 단편이다. 일부 경우 Env 또는 이의 단편의 배향은, 근위 단부가 Env 단백질 또는 이의 단편의 막-근위 단부가 되도록 HIV 비리온에 관하여 Env 단백질의 배향을 반복할 것이다. 일부 경우, 바람직한 에피토프는 CD4-결합 부위(CD4bs); Env의 삼량체 정점 상의 V2 프로테오글리칸 모이어티; Env의 고 만노스 패치 상의 V3 프로테오글리칸 모이어티; Env 막관통 도메인의 막 근위 외부 영역(MPER); 및 융합 펩타이드가 있거나 없는 gp120-gp41 계면으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우, 에피토프 선호도는 다른 수단, 예컨대 항원의 아미노산 서열 내에서를 포함하여 나노구조의 임의의 폴리펩타이드의 아미노선 서열 내에서의 예정된 위치에서 N-연결 글리칸 서열 모티프 N-X-[T/S]의 첨가 또는 차감(substration)에 의한 나노구조 상에서의 글리칸의 위치화에 의해 조절된다. 일부 경우, 근위 단부로부터 원위 단부까지의 중간 거리에서 발견되는 에피토프는 비제한적으로 나노구조의 전체 기하학적 특성, 표면 소수성, 표면 전하, 및 대상체에 내인적으로 존재하는 단백질 또는 백신 조성물에 외인적으로 제공되는 단백질의 경쟁적 결합을 포함한 다양한 고려사항에 따라 더욱 원위 위치하는 에피토프를 능가하여 바람직할 것이다. 본 개시내용은 단백질 구조의 모든 알려진 합리적인 설계 방법을 포괄하고, 전술한 내용은 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
2.4. 폴리펩타이드 서열의 나노구조
본 개시내용의 하나 이상의 복수의 폴리펩타이드는 다양한 아미노산 서열 중 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 미국 특허 공보 제US 2015/0356240 A1호는 나노구조를 설계하는 다양한 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 공보 제US 2016/0122392 A1호 및 국제 특허 공보 제WO 2014/124301 A1호에 개시된 바와 같이, SEQ ID NO:1-51의 단리된 폴리펩타이드는 짝(pair)으로 자가-조립하여 나노구조, 예컨대 정20면체 나노구조를 형성하는 이들의 능력에 대해 설계되었다. 상기 설계는, 조립되어 나노구조를 형성할 수 있는 폴리펩타이드 짝의 각각의 구성원에 대한 적합한 계면 잔기의 설계를 수반한다. 이렇게 해서 형성된 나노구조는, 제1 조립체 및 제2 조립체를 나노구조, 예컨대 정20면체 대칭을 갖는 나노구조로 배향시키는 대칭적으로 반복된, 비-천연, 비-공유 폴리펩타이드-폴리펩타이드 계면을 포함한다. 그러므로, 일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1-51로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 경우, N-말단 메티오닌 잔기는 선택적이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
표 1은 본 개시내용의 구현예로부터의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제공한다. 각각의 경우, 서열의 짝은 함께 I53 정20면체를 형성한다. 표 1에서 우측 컬럼은 결과적인 조립된 나노구조의 계면에 존재하는 것으로 식별된 각각의 예시적인 폴리펩타이드에서의 잔기 수를 식별한다("식별된 계면 잔기"). 알 수 있는 바와 같이, SEQ ID NO:1-34의 예시적인 폴리펩타이드에 대한 계면 잔기의 수는 4 내지 13의 범위이다. 다양한 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 이의 길이에 걸쳐 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 식별된 계면 위치(주어진 폴리펩타이드에 대한 계면 잔기의 수에 따라)에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 35-51은 본 개시내용의 구현예로부터의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 다른 아미노산 서열을 나타낸다. 다른 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-51로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 이의 길이에 걸쳐 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 적어도 20%, 25%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100%의 식별된 계면 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일반적으로 단백질의 경우에서와 같이, 폴리펩타이드는 나노구조로의 후속적인 조립을 교란시키지 않으면서 설계된 서열에서 일부 변동을 관용하는 것으로 예상되며: 특히 이러한 변동이 보존적 아미노산 치환을 포함하는 경우에 그러하다. 본원에 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 하기를 의미한다: 소수성 아미노산(Ala, Cys, Gly, Pro, Met, Val, Ile, Leu)은 다른 소수성 아미노산으로만 치환될 수 있으며; 벌키(bulky) 측쇄를 갖는 소수성 아미노산(Phe, Tyr, Trp)은 벌키 측쇄를 갖는 다른 소수성 아미노산으로만 치환될 수 있고; 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산(Arg, His, Lys)은 양으로 하전된 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있으며; 음으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산(Asp, Glu)은 음으로 하전된 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있고; 극성의 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산(Ser, Thr, Asn, Gln)은 극성의 비하전된 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있다.
본 발명의 나노구조의 다양한 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 하기 짝으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 변형된 버전(즉: 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 개시된 바와 같은 허용 가능한 변형: SEQ ID NO에 의해 나타낸 아미노산 서열과 이의 길이에 걸쳐 적어도 75% 동일하며 및/또는 적어도 하나의 식별된 계면 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드)을 포함한다:
SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 (I53-34A 및 I53-34B);
SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4 (I53-40A 및 I53-40B);
SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:24 (I53-40A 및 I53-40B.1);
SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:4 (I53-40A.1 및 I53-40B);
SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36 (I53-40A 속 및 I53-40B 속);
SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6 (I53-47A 및 I53-47B);
SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:27 (I53-47A 및 I53-47B.1);
SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:28 (I53-47A 및 I53-47B.1NegT2);
SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:6 (I53-47A.1 및 I53-47B);
SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:27 (I53-47A.1 및 I53-47B.1);
SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:28 (I53-47A.1 및 I53-47B.1NegT2);
SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:6 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B);
SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B.1);
SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:28 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B.1NegT2);
SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:38 (I53-47A 속 및 I53-47B 속);
SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8 (I53-50A 및 I53-50B);
SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:32 (I53-50A 및 I53-50B.1);
SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:33 (I53-50A 및 I53-50B.1NegT2);
SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:34 (I53-50A 및 I53-50B.4PosT1);
SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:8 (I53-50A.1 및 I53-50B);
SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:32 (I53-50A.1 및 I53-50B.1);
SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:33 (I53-50A.1 및 I53-50B.1NegT2);
SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:34 (I53-50A.1 및 I53-50B.4PosT1);
SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:8 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B);
SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:32 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.1);
SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:33 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.1NegT2);
SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:34 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.4PosT1);
SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:8 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B);
SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.1);
SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:33 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.1NegT2);
SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:34 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.4PosT1);
SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:40 (I53-50A 속 및 I53-50B 속);
SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10 (I53-51A 및 I53-51B);
SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12 (I52-03A 및 I52-03B);
SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14 (I52-32A 및 I52-32B);
SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16 (I52-33A 및 I52-33B)
SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:18 (I32-06A 및 I32-06B);
SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20 (I32-19A 및 I32-19B);
SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22 (I32-28A 및 I32-28B);
SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24 (I53-40A.1 및 I53-40B.1);
SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:42 (T32-28A 및 T32-28B);
SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44 (T33-09A 및 T33-09B);
SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46 (T33-15A 및 T33-15B);
SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48 (T33-21A 및 T33-21B);
SEQ ID NO:49 및 SEQ ID NO:50 (T33-28A 및 T32-28B); 및
SEQ ID NO:51 및 SEQ ID NO:44 (T33-31A 및 T33-09B (T33-31B로도 지칭됨))
일 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 이의 항원 단편은 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드와의 융합 단백질로서 발현된다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 이의 항원 단편은 융합 단백질의 N 말단에 존재하며, 그때마다 이 구성은 나노구조의 외부 상에서 하나 이상의 단백질 또는 이의 항원 단편의 제시를 용이하게 할 수 있다. 융합 단백질의 N 말단에서의 단백질의 존재에 대한 선호는, 단백질의 C 말단의 위치가 상기 단백질의 근위 단부에 있을 때마다 발생한다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 이의 항원 단편은 융합 단백질의 C 말단에 존재하며, 그때마다 이 구성은 나노구조의 외부 상에서 하나 이상의 단백질 또는 이의 항원 단편의 제시를 용이하게 할 수 있다. 융합 단백질의 C 말단에서의 단백질의 존재에 대한 선호는, 단백질의 M 말단의 위치가 상기 단백질의 근위 단부에 있을 때마다 발생한다.
본 개시내용의 백신에 유용한 나노구조의 비제한적인 예는 미국 특허 제9,630,994호 및 미국 임시 특허 출원 제62/481,331호에 개시된 것들을 포함하며, 이들 문헌은 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
3. 항원
본 개시내용은 인간 또는 동물 질병과 관계 있는 다양한 알려진 박테리아, 바이러스 또는 기생충 중 임의의 것에 대한 나노구조-기초 백신을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 말라리아, 바이러스 수막염, 진균 수막염, 및 나이세리아 메닌지티데스("수막구균"으로도 알려져 있음), B형 해모필루스 인플루엔자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 및 리스테리아 모노사이토게네스를 포함하여 박테리아 수막염에 대한 백신에 관한 것이다. 각각의 이들 유기체에 대해, 보호적 면역 반응을 생성시킬 수 있는 항원(단백질 또는 다당류)은 알려져 있다. 본 개시내용은 나노구조-기초 백신 내로의 임의의 이들 항원-특히 항원성 단백질-의 혼입에 관한 것이다. 지침은 특히 감염 또는 백신화에 대한 면역 반응의 연구, 예컨대 결합 항체 또는 중화 항체의 단리, 항원 서열의 유전자 분석, 항원성 단백질 및 항체의 구조적 분석, 가장 특히 서브유닛 백신을 이용한 임상적 및 수의학적 경험으로부터 입수 가능하다. 몇몇 제한을 두고, 임의의 알려진 서브유닛 백신은 상기 제공된 표시 양상을 이용함으로써 본 개시내용의 나노구조와 함께 사용되기 위해 적응될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 나노구조에 직접적으로 또는 중간 단백질(예를 들어, 디프테리아 변독소, 파상풍 변독소, 또는 CRM197)을 통해 공액된 올리고당류(예를 들어, 수막구균 올리고당류)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 나노구조-기초 백신은 표 2에 제공된 목록으로부터의 항원 또는 항원 단편을 포함한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 구현예에서, 항원은 표 3에 제공된 바와 같은 SEQ ID NO: 52-88 및 90-113의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로부터 선택되는 항원성 단백질이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
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4. 조립 도메인 및 링커
일 구현예에서, 나노구조는 삼량체성 조립체를 포함한다. 삼량체성 조립체는 제1 폴리펩타이드의 3개 카피가 자가-결합하여 삼량체성 구성 요소를 형성하도록 유도하는 단백질-단백질 계면을 포함한다. 제1 폴리펩타이드의 각각의 카피는 제2 조립 도메인 상의 상보적인 표면-노출 계면과 상호작용하는 표면-노출 계면을 추가로 포함한다. King 등(문헌[Nature 510, 103-108, 2014]), Bale 등(문헌[Science 353, 389-394, 2016]), 및 특허 공보 제WO2014124301 A1호 및 제US20160122392 A1호에 기재된 바와 같이, 삼량체성 조립 도메인과 제2 조립 도메인 사이의 상보적인 단백질-단백질 계면은 표적 나노구조로의 삼량체성 조립 도메인의 다수의 카피 및 제2 조립 도메인의 조립을 구동한다. 일부 구현예에서, 나노구조의 삼량체성 조립 도메인의 각각의 카피는 항원성 단백질 또는 이의 항원 단편을 유전적 융합으로서 소유하고; 이들 나노구조는 단백질을 완전 원자가에서 표시한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 나노구조는 항원 단백질 또는 이의 항원 단편을 유전적 융합으로서 소유하는 삼량체성 조립 도메인의 하나 이상의 카피뿐만 아니라 항원성 단백질을 유전적 융합으로서 소유하지 않는 하나 이상의 삼량체성 조립 도메인을 포함하며; 이들 나노구조는 F 단백질을 부분 원자가에서 표시한다. 삼량체성 조립 도메인은 삼량체를 형성하고 제2 조립 도메인과 상호작용하여 표적 나노구조로의 조립을 구동하는 임의의 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 나노구조는 제US 20130274441 A1호, 제US 2015/0356240 A1호, 제US 2016/0122392 A1호, 제WO 2018/187325 A1호에 개시된 것들로부터 선택되는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 개시내용의 나노구조에서, 항원성 단백질 및 나노구조의 코어는 이들이 둘 다 단일 폴리펩타이드에 존재하도록 유전적으로 융합될 수 있다. 바람직하게는, 단백질과 나노구조의 코어 사이의 연결은 단백질 또는 이의 항원 단편이 나노구조의 외부 상에 표시되게 한다. 이와 같이, 나노구조의 코어에의 연결점은 형성된 나노구조의 코어의 외부 상에 있어야 한다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 광범위하게 다양한 폴리펩타이드 서열은 단백질 또는 이의 항원 단편 및 나노구조의 코어를 연결하는 데 사용될 수 있다. 이들 폴리펩타이드 서열은 링커로 지칭된다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있으며; 적절한 링커로서 역할을 하기 위한 아미노산 서열 요건은 없다. 단백질 또는 이의 항원 단편이 나노구조의 외부 상에 표시되게 하는 것 외에 링커가 나노구조의 코어에 대해 단백질 또는 이의 항원 단편의 강성(rigid) 상대 배향을 도입하는 요건은 없다. 일부 구현예에서, 링커는 F 단백질의 삼량체성 형태를 안정화시키는 데 일조하는 부가적인 삼량체화 도메인(예를 들어, T4 피브리틴(fibritin)의 폴돈 도메인)을 포함한다.
>T4 피브리틴 폴돈 도메인(링커 영역 내에서 선택적임) GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 89)
일부 구현예에서, 링커는 임의의 적합한 길이의 Gly-Ser 링커(즉, 글리신 및 세린 잔기로 구성된 링커)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Gly-Ser 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, Gly-Ser 링커는 GSGGSGSGSGGSGSG, GGSGGSGS 또는 GSGGSGSG의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
5. 나노구조의 조립
일부 구현예에서, 나노구조를 형성하는 데 사용하기 위한 복수의 폴리펩타이드의 하나 이상의 정제된 샘플은 수성 조건에서 대략 등몰 몰비로 혼합된다. 폴리펩타이드는 서로 상호작용하여, 표적 나노구조의 조립을 구동한다. 표적 나노구조의 성공적인 조립은 비제한적으로 크기 배제 크로마토그래피, 네이티브(비-변성) 겔 전기영동, 동적 광 산란, 다각도 광 산란, 분석적 초원심분리, 네거티브 염색 전자 현미경, 저온-전자 현미경 검사, 또는 X-선 결정학을 포함하여 단백질 또는 단백질 조립체의 물리적 크기를 평가하는 데 사용되는 보편적인 생화학적 또는 생물리학적 방법에 의해 시험관내 조립 반응을 분석함으로써 확증될 수 있다. 필요하다면, 조립된 나노구조는 비제한적으로 크기 배제 크로마토그래피, 분취 초원심분리, 접선 유동 여과, 또는 분취 겔 전기영동을 포함하여 단백질을 이의 물리적 크기에 의해 단리하는 데 보편적으로 사용되는 분취 기법을 사용하여, 시험관내 조립 반응에 존재하는 다른 종 또는 분자로부터 정제될 수 있다. 나노구조에서의 항원성 단백질의 존재는 비제한적으로 SDS-PAGE, 질량 분광법, 단백질 시퀀싱 또는 아미노산 분석을 포함하여 수용액에서 단백질 분자의 정체성(identity)을 결정하는 데 보편적으로 사용되는 기법에 의해 평가될 수 있다. 입자의 외부 상에서 단백질의 접근성, 뿐만 아니라 이의 형태(conformation) 또는 항원성은 비제한적으로 모노클로날 항체, 형태-특이적 모노클로날 항체, 또는 항원에 특이적인 항-혈청에 의한 결합을 포함하여 항원의 존재 및 형태를 검출하는 데 보편적으로 사용되는 기법에 의해 평가될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 나노구조는 상이한 항원성 단백질을 유전적 융합으로서 소유하는 2개 이상의 별도의 제1 폴리펩타이드를 포함하며; 이들 나노구조는 동일한 나노구조 상에서 다수의 상이한 단백질을 공동-표시한다. 이들 다중-항원 나노구조는 제1 폴리펩타이드의 혼합물과의 시험관내 조립을 수행함으로써 생성되며, 여기서 각각의 제1 폴리펩타이드는 2개 이상의 별개의 단백질 중 하나를 유전적 융합으로서 소유한다. 혼합물 내의 각각의 제1 폴리펩타이드의 분획은 결과적인 나노구조 내의 각각의 항원성 단백질의 평균 원자가를 결정한다. 주어진 샘플에서 각각의 단백질-소유 제1 폴리펩타이드의 존재 및 평균 원자가는 완전-원자가 나노구조에서 항원성 단백질의 존재를 평가하기 위해 상기 기재된 기법을 사용한 정량적 분석에 의해 평가될 수 있다.
다양한 구현예에서, 나노구조는 직경이 약 20 나노미터(nm) 내지 약 40 nm이며, 이때 내부 루멘은 가로로 약 15 nm 내지 약 32 nm이고 단백질 쉘 내의 공극 크기는 이의 최장 치수가 약 1 nm 내지 약 14 nm이다.
일 구현예에서, 나노구조는 정20면체 대칭을 갖는다. 이러한 구현예에서, 나노구조는 제1 폴리펩타이드의 60개 카피 및 제2 폴리펩타이드의 60개 카피를 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체 내의 동일한 제1 폴리펩타이드의 수는 각각의 제2 조립체 내의 동일한 제2 폴리펩타이드의 수와 상이하다. 예를 들어, 일 구현예에서, 나노구조는 12개의 제1 조립체 및 20개의 제2 조립체를 포함하며; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어, 동일한 제1 폴리펩타이드의 5개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어, 동일한 제2 폴리펩타이드의 3개 카피를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 나노구조는 12개의 제1 조립체 및 30개의 제2 조립체를 포함하며; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어, 동일한 제1 폴리펩타이드의 5개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어, 동일한 제2 폴리펩타이드의 2개 카피를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 나노구조는 20개의 제1 조립체 및 30개의 제2 조립체를 포함하며; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어, 동일한 제1 폴리펩타이드의 3개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어, 동일한 제2 폴리펩타이드의 2개 카피를 포함할 수 있다. 모든 이들 구현예는 규칙적인 정20면체 대칭을 갖는 합성 나노물질을 형성할 수 있다.
다양한 추가의 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 올리고머 상태는 하기와 같다:
I53-34A: 삼량체 + I53-34B: 오량체;
I53-40A: 오량체 + I53-40B: 삼량체;
I53-47A: 삼량체 + I53-47B: 오량체;
I53-50A: 삼량체 + I53-50B: 오량체;
I53-51A: 삼량체 + I53-51B: 오량체;
I32-06A: 이량체 + I32-06B: 삼량체;
I32-19A: 삼량체 + I32-19B: 이량체;
I32-28A: 삼량체 + I32-28B: 이량체;
I52-03A: 오량체 + I52-03B: 이량체;
I52-32A: 이량체 + I52-32B: 오량체; 및
I52-33A: 오량체 + I52-33B: 이량체
6. 핵산
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 단리된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단리된 핵산"은 게놈 내의 또는 cDNA 서열 내의 이들의 정상적인 주변 핵산 서열로부터 제거되었던 것들이다. 이러한 단리된 핵산 서열은 비제한적으로 polyA 서열, 변형된 코작(Kozak) 서열, 및 에피토프 태그, 외수송(export) 신호, 및 분비 신호, 핵 위치화 신호, 및 형질막 위치화 신호를 인코딩하는 서열을 포함하여, 인코딩된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진하는 데 유용한 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 본원의 교시에 기초하여, 어떤 핵산 서열이 본 개시내용의 단백질을 인코딩할 것인지는 당업자에게 명백해질 것이다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 적합한 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 유전자 생성물의 발현을 실시할 수 있는 임의의 조절 서열에 핵산 코딩 영역 또는 유전자를 작동적으로 연결하는 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 "조절 서열"은 핵산 분자의 발현을 실시할 수 있는 핵산 서열이다. 조절 서열은 이들 조절 서열이 이의 발현을 지향하는 작용을 하는 한 핵산 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 그러므로, 예를 들어, 전사는 되었으나 아직 번역되지 않은 개입 서열은 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 코딩 서열에 여전히 "작동적으로 연결되어 있는" 것으로 간주될 수 있다. 다른 이러한 조절 서열은 폴리아데닐화 신호, 종결 신호, 및 리보솜 결합 부위를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 발현 벡터는 비제한적으로 플라스미드 및 바이러스계 발현 벡터를 포함하여 당업계에 알려진 임의의 유형일 수 있다. 포유류 시스템에서 개시된 핵산 서열의 발현을 구동하는 데 사용되는 조절 서열은 구성적(비제한적으로 CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하여 여러 가지 프로모터 중 임의의 프로모터에 의해 구동됨) 또는 유도성(비제한적으로 테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드 반응성을 포함하여 많은 유도성 프로모터 중 임의의 유도성 프로모터에 의해 구동됨)일 수 있다. 원핵 세포를 형질감염시키는 데 사용되기 위한 발현 벡터의 작제 또한 당업계에 잘 알려져 있으므로, 표준 기법을 통해 달성될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; 문헌[Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.], 및 Ambion 1998 카탈로그(Ambion, Austin, TX) 참조). 발현 벡터는 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA 내로의 통합에 의해 복제 가능해야 한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드를 포함한다. 그러나, 본 개시내용은 동등한 기능의 역할을 하는 다른 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터를 포함하고자 한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 발현 벡터로 형질감염되었던 숙주 세포를 제공하며, 여기서, 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 상기 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 내로의 발현 벡터의 이러한 형질감염은 비제한적으로 표준 박테리아 형질전환, 칼슘 포스페이트 공동-침전, 전기천공, 또는 리포솜 매개 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 다중양이온성 매개 형질감염 또는 바이러스 매개 형질감염을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 기법을 통해 달성될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 등, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY]) 참조). 본 개시내용에 따른 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 본 개시내용의 부가적인 파트이다. 상기 방법은 (a) 폴리펩타이드의 발현에 도움이 되는 조건 하에 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 숙주를 배양하는 단계, 및 (b) 선택적으로, 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
7. 백신 및 투여
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 나노구조를 포함하는 백신을 제공한다. 이러한 조성물은 포유류(예를 들어, 인간)에서 항체를 발생시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 백신 조성물은 전형적으로, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 이러한 담체의 철저한 논의는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy]에서 입수 가능하다.
상기 조성물의 pH는 통상 약 4.5 내지 약 11, 예컨대 약 5 내지 약 11, 약 5.5 내지 약 11, 약 6 내지 약 11, 약 5 내지 약 10.5, 약 5.5 내지 약 10.5, 약 6 내지 약 10.5, 약 5 내지 약 10, 약 5.5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 5 내지 약 9.5, 약 5.5 내지 약 9.5, 약 6 내지 약 9.5, 약 5 내지 약 9, 약 5.5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 약 5 내지 약 8.5, 약 5.5 내지 약 8.5, 약 6 내지 약 8.5, 약 5 내지 약 8, 약 5.5 내지 약 8, 약 6 내지 약 8, 약 4.5, 약 5, 약 6.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 10.5, 약 11 등이다. 안정한 pH는 완충제, 예를 들어, Tris 완충제, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제 또는 히스티딘 완충제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 그러므로, 조성물은 일반적으로 완충제를 포함할 것이다.
조성물은 멸균적 및/또는 발열원 무함유일 수 있다. 조성물은 인간에 관하여 등장성일 수 있다.
백신 조성물은 면역학적 유효량의 이의 항원(들)을 포함한다. "면역학적 유효량"은 대상체에게 투여된 경우, 항원에 대한 항체 반응을 유발하는 데 효과적인 양이다. 이 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 조건, 이들 개체의 연령, 개체의 면역계가 항체를 합성하는 역량, 요망되는 보호도(degree of protection), 백신의 제제, 의료 상황에 대한 치료 의사의 평가, 및 다른 관계된 인자에 따라 다양할 수 있다. 그 양은 일상적인 시도를 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다. 본 개시내용의 조성물의 항원 함량은 일반적으로, 용량 당 단백질의 질량의 측면에서 표현될 것이다. 항원 당 10 내지 500 μg(예를 들어, 50 μg)의 용량이 유용할 수 있다.
백신 조성물은 면역학적 아쥬반트를 포함할 수 있다. 예시적인 아쥬반트는 하기를 포함한다: 1. 미네랄-함유 조성물; 2. 오일 에멀젼; 3. 사포닌 제제; 4. 비로좀 및 바이러스-유사 입자; 5. 박테리아 또는 미생물 유도체; 6. 생체접착제 및 점액접착제; 7. 리포솜; 8. 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 제제; 9. 폴리포스파젠(pcpp); 10. 무라밀 펩타이드; 11. 이미다조퀴놀론 화합물; 12. 티오세미카르바존 화합물; 13. 트립탄트린(tryptanthrin) 화합물; 14. 인간 면역조정제; 15. 지질펩타이드; 16. 벤조나프티리딘; 17. 미세입자; 18. 면역자극성 폴리뉴클레오타이드(예컨대 rna 또는 dna; 예를 들어, cpg-함유 올리고뉴클레오타이드).
예를 들어, 조성물은 암모늄 염 아쥬반트, 수-중-유 에멀젼(예를 들어, 스쿠알렌을 포함하는 수-중-유 에멀젼, 예컨대 MF59 또는 AS03), TLR7 효능제(예컨대 이미다조퀴놀린 또는 이미퀴모드(imiquimod)) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 적합한 암모늄 염은 하이드록사이드(예를 들어, 옥시하이드록사이드), 포스페이트(예를 들어, 하이드록시포스페이트, 오르토포스페이트)(예를 들어, 문헌[chapters 8 & 9 of Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum] 참조) 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 상기 염은 임의의 적합한 형태(예를 들어, 겔, 결정질, 비정질 등)를 취할 수 있으며, 이때 염에의 항원의 흡착은 일례이다. 환자에게 투여하기 위한 조성물 내 Al+++의 농도는 5 mg/ml 미만, 예를 들어, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml 등일 수 있다. 평균 범위는 0.3 내지 1 mg/ml이다. 최대 0.85 mg/용량이 바람직하다. 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트는 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합하다.
예시적인 아쥬반트는 아쥬-포스(Adju-Phos), 아듀멜름(adjumerlm), 알부민-헤파린 미세입자, 조류 글루칸, 알감물린(algammulin), 명반, 항원 제제, AS-2 아쥬반트, 자가 수지상 세포, 자가 PBMC, Avridine™, B7-2, BAK, BAY R1005, 부피바카인(bupivacaine), 부피바카인-HCl, BWZL, 칼시트리올, 칼슘 포스페이트 겔, CCR5 펩타이드, CFA, 콜레라 완전독소(CT) 및 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소 A1-서브유닛-단백질 A D-단편 융합 단백질, CpG, CRL1005, 사이토카인-함유 리포솜, D-무라팔미틴, DDA, DHEA, 디프테리아 변독소, DL-PGL, DMPC, DMPG, DOC/명반 복합체, 파울폭스(fowlpox), 프로인트 완전 아쥬반트, 감마 이눌린, 게르부(gerbu) 아쥬반트, GM-CSF, GMDP, hGM-CSF, hIL-12(N222L), hTNF-알파, IFA, pcDNA3 중 IFN-감마, IL-12 DNA, IL-12 플라스미드, IL-12/GMCSF 플라스미드(Sykes), pcDNA3 중 IL-2, IL-2/Ig 플라스미드, IL-2/Ig 단백질, IL-4, pcDNA3 중 IL-4, 이미퀴모드, ImmTher™, 공동자극 분자에 대한 항체를 함유하는 면역리포솜, 인터페론-감마, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-12, 인터루킨-2, 인터루킨-7, ISCOM(s)™, Iscoprep 7.0.3™, 키홀 림펫 헤모사이아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin), 지질계 아쥬반트, 리포솜, 록소리빈(Loxoribine), LT(R192G), LT-OA 또는 LT 경구 아쥬반트, LT-R192G, LTK63, LTK72, MF59, 몬타나이드(MONTANIDE) ISA 51, 몬타나이드 ISA 720, MPL.TM., MPL-SE, MTP-PE, MTP-PE 리포솜, 무라메타이드(murametide), 무라팔미틴, NAGO, nCT 네이티브 콜레라 독소, 비-이온성 계면활성제 베시클, 콜레라 독소 mCT-E112K의 무독성 돌연변이체 E1 12K, p-하이드록시벤조퀴산 메틸 에스테르, pCIL-10, pCIL12, pCMVmCAT1, pCMVN, 펩토머-NP, 플루란(Pleuran), PLG, PLGA, PGA 및 PLA, 플루로닉(Pluronic) L121, PMMA, PODDS™, 폴리 rA: 폴리 rU, 폴리소르베이트 80, 단백질 코클레에이트(Cochleate), QS-21, Quadri A 사포닌, Quil-A, 리하이드라겔(Rehydragel) HPA, 리하이드라겔 LV, RIBI, 리비라이크(Ribilike) 아쥬반트 시스템(MPL, TMD, CWS), S-28463, SAF-1, 스칼라보(Sclavo) 펩타이드, 센다이(Sendai) 프로테오리포솜, 센다이-함유 지질 매트릭스, 스팬(Span) 85, 스페콜(Specol), 스쿠알렌 1, 스쿠알렌 2, 스테아릴 티로신, 파상풍 변독소 (TT), Theramide™, 트레오닐 무라밀 디펩타이드(TMDP), Ty 입자, 및 왈터 리드(Walter Reed) 리포솜을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 아쥬반트의 선택은 치료될 대상체에 따라 달라진다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용 가능한 아쥬반트가 사용된다.
하나의 적합한 면역학적 아쥬반트는 알루미늄 염에 흡착된, 제WO2011/027222호에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. Powell & Newman(1995)에서 개시된 것들 중 임의의 것을 포함하여 많은 추가의 아쥬반트가 사용될 수 있다.
조성물은 특히 다수의 용량 포맷으로 포장되는 경우 항미생물제를 포함할 수 있다. 항미생물제, 예컨대 티오메로살(thiomersal) 및 2-페녹시에탄올은 백신에서 흔히 발견되지만, 이따금 수은-무함유 보존제를 사용하거나 보존제를 전혀 사용하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
조성물은 세제, 예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로, 낮은 수준, 예를 들어, <0.01%으로 존재한다.
조성물은 장성(tonicity)을 제공하기 위해 나트륨 염(예를 들어, 소듐 클로라이드)을 포함할 수 있다. 10±2 mg/ml NaCl의 농도가 전형적이며, 예를 들어, 약 9 mg/ml이다.
일부 구현예에서, 백신 조성물 내 완충제는 Tris 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 아세테이트 완충제이다. 상기 조성물은 또한, 동결건조보호제(lyoprotectant), 예를 들어, 수크로스, 소르비톨 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물은 보존제, 예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메로살, 벤조산 및 이들의 다양한 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 글리신과 같은 벌킹제를 포함한다. 더욱 다른 구현예에서, 상기 조성물은 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트- 60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레아스테(trioleaste) 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 조성물은 또한, 장성 조정제, 예를 들어, 제제를 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투압성(isoosmotic)이 되게 하는 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 장성 조정제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 아르기닌, 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 부가적으로, 안정화제, 예를 들어, 동결건조된 형태 또는 액체 형태에서 나노구조의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 포함한다. 예시적인 안정화제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 메티오닌, 아르기닌, 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 감염성 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역학적 유효량의, 본원에 기재된 바와 같은 나노구조를 포함하는 본원에 기재된 면역학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 구현예에서, 면역 반응은 감염성 병원체에 대한 중화 항체의 생성을 포함한다. 소정의 구현예에서, 중화 항체는 보체-독립적이다.
면역 반응은 체액성 면역 반응, 세포-매개 면역 반응, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 각각의 전달되는 항원성 단백질에 대하여 유도된다. 세포-매개 면역 반응은 조력자 T-세포(Th) 반응, CD8+ 세포독성 T-세포(CTL) 반응, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하고, 항체는 중화 항체이다. 중화 항체는 세포의 바이러스 감염을 차단한다. 바이러스는 상피 세포 및 또한 섬유아세포를 감염시킨다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 두 세포 유형 모두의 감염을 감소시키거나 방지한다. 중화 항체 반응은 보체-의존적 또는 보체-독립적일 수 있다. 일부 구현예에서, 중화 항체 반응은 보체-독립적이다. 일부 구현예에서, 중화 항체 반응은 교차-중화적이며; 즉, 투여된 조성물에 대해 생성된 항체는 조성물에서 사용되는 계통 이외의 계통의 바이러스를 중화시킨다.
당업계에서 항체 약효의 유용한 척도는 "50% 중화 역가"이다. 50% 중화 역가를 결정하기 위해, 면역화된 동물로부터의 혈청은, 희석된 혈청이 세포 내로의 50%의 바이러스의 진입을 차단하는 능력을 어떻게 아직 보유할 수 있는지 평가하기 위해 희석된다. 예를 들어, 700의 역가는, 혈청이 700-배 희석된 후 50%의 바이러스를 중화시키는 능력을 보유하였음을 의미한다. 그러므로, 더 높은 역가는 더 강력한 중화 항체 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 역가는 약 200, 약 400, 약 600, 약 800, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 약 3000, 약 3500, 약 4000, 약 4500, 약 5000, 약 5500, 약 6000, 약 6500, 또는 약 7000의 하한을 갖는 범위에 있다. 50% 중화 역가 범위는 약 400, 약 600, 약 800, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 약 3000, 약 3500, 약 4000, 약 4500, 약 5000, 약 5500, 약 6000, 약 6500, 약 7000, 약 8000, 약 9000, 약 10000, 약 11000, 약 12000, 약 13000, 약 14000, 약 15000, 약 16000, 약 17000, 약 18000, 약 19000, 약 20000, 약 21000, 약 22000, 약 23000, 약 24000, 약 25000, 약 26000, 약 27000, 약 28000, 약 29000, 또는 약 30000의 상한을 가질 수 있다. 예를 들어, 50% 중화 역가는 약 3000 내지 약 25000일 수 있다. "약"은 언급된 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다.
본 개시내용의 조성물은 일반적으로, 대상체에게 직접적으로 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사에 의해(예를 들어, 피하로, 복강내로, 정맥내로, 근육내로, 또는 조직의 간질 공간에) 또는 임의의 다른 적합한 경로에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 근육내 투여는 예를 들어, 대퇴부 또는 상완에 사용될 수 있다. 주사는 주사바늘(예를 들어, 피하 주사바늘)을 통해 수행될 수 있으나, 주사바늘-무사용(free) 주사가 대안적으로 사용될 수 있다. 전형적인 근육내 투여량 부피는 0.5 ml이다.
투여량은 단일 용량 스케쥴 또는 다중 용량 스케쥴에 의해 수행될 수 있다. 다중 용량은 1차 면역화 스케쥴에서 및/또는 부스터 면역화 스케쥴에서 사용될 수 있다. 다중 용량 스케쥴에서, 다양한 용량은 동일한 또는 상이한 경로, 예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수 있다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등) 격차를 두고 투여될 것이다.
대상체는 동물, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 본원에 망라된 감염성 병원체가 광범위한 종에 걸쳐 문제가 될 수 있으므로, 예시적인 대상체는 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 닭, 고양이 또는 개를 포함한다. 백신이 예방적 용도를 위한 것인 경우, 인간은 바람직하게는 소아(예를 들어, 유아 또는 영아), 청소년, 또는 성인이며; 백신이 치료적 용도를 위한 것인 경우, 인간은 바람직하게는 청소년 또는 성인이다. 소아용 백신은 예를 들어, 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게도 투여될 수 있다.
본 개시내용의 백신은 예방적(즉, 질병을 방지함) 또는 치료적(즉, 질병의 증상을 감소시키거나 해소시킴)일 수 있다. 예방적이라는 용어는 특정 질환의 중증도를 감소시키거나 이의 발병을 방지하는 것으로 간주될 수 있다. 의심을 피하기 위해, 예방적이라는 용어는 또한, 예를 들어, 향후 감염의 중증도 또는 기간을 감소시킴으로써 이러한 감염의 효과를 경감시키는 백신을 지칭할 수 있다.
본원에 기재된 단리된 및/또는 정제된 나노구조는 단독으로 또는 혼합-양상 요법에서의 프라임 또는 부스트, 예컨대 RNA 프라임과 뒤이어 단백질 부스트로서 투여될 수 있다. 단백질-프라임/단백질-부스트 전략과 비교하여 RNA-프라임/단백질-부스트 전략의 이익은 예를 들어, 증가된 항체 역가, 더욱 균형잡힌 IgG1:IgG2a sub유형 프로파일, 바이러스 입자와 유사한 TH1-유형 CD4+ T 세포-매개 면역 반응의 유도, 및 비-중화 항체의 감소된 생성을 포함한다. RNA 프라임은, 조성물이 아쥬반트를 함유하거나 함유하지 않는 것과는 상관없이 상기 조성물의 면역원성을 증가시킬 수 있다.
RNA-프라임/단백질 부스트-전략에서, RNA 및 단백질은 동일한 표적 항원으로 지향된다. RNA를 전달하는 적합한 방식의 예는 바이러스-유사 레플리콘 입자(VRP), 알파바이러스 RNA, 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된 레플리콘 또는 제제화된 RNA, 예컨대 양이온성 나노에멀젼(CNE)과 함께 제제화된 레플리콘을 포함한다. 예를 들어, 오일 코어(예를 들어, 스쿠알렌을 포함함) 및 양이온성 지질(예를 들어, DOTAP, DMTAP, DSTAP, DC-콜레스테롤 등)을 포함하는 적합한 양이온성 수-중-유 나노에멀젼은 WO2012/006380에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 양이온성 지질, 리포솜, 코클레에이트, 비로좀, 면역-자극 복합체, 미세입자, 미세구체, 나노구체, 단층 소포, 다층 소포, 수-중-유 에멀젼, 유-중-수 에멀젼, 에멀좀(emulsome), 다중양이온성 펩타이드, 양이온성 나노에멀젼, 또는 이들의 조합에 캡슐화되거나 이에 결합되거나 그 위에 흡착된다.
또한, 핵산(예를 들어, RNA), 정제된 단백질, 및 본원에 기재된 정제된 나노구조의 투여를 위한 키트, 및 사용 설명서가 제공된다. 본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 조성물 또는 백신으로 예비-충전된 전달 장치를 제공한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 하나 이상의 부가적인 치료제와 조합되어 투여될 수 있다. 부가적인 치료제는 항생제 또는 항균제, 항구토제, 항진균제, 항염증제, 항바이러스제, 면역조절제, 사이토카인, 항우울제, 호르몬, 알킬화제, 대사길항제, 항종양 항생제, 항유사분열제, 토포이소머라제 억제제, 세포정지제, 항-침윤제, 항혈관신생제, 바이러스 복제의 증식 인자 기능 저해제의 저해제, 바이러스 효소 억제제, 항암제, α-인터페론, β-인터페론, 리바비린(ribavirin), 호르몬, 및 기타의 톨(toll)-유사 수용체 모듈레이터, 면역글로불린(Ig), 및 Ig 기능을 조정하는 항체(예컨대 항-IgE(오말리주맙(omalizumab)))을 포함할 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 포유류에서 예를 들어, 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 데 사용하기 위한 약제로서 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 포유류에서 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
치료적 치료의 효능을 체크하는 하나의 방식은 본원에 개시된 조성물 또는 백신의 투여 후 감염성 병원체에 의한 감염을 모니터링하는 단계를 수반한다. 예방적 치료의 효능을 체크하는 하나의 방식은 항원에 대한 면역 반응을 전신적으로 모니터링하는 단계(예컨대 IgG1 및 IgG2a 생성 수준을 모니터링하는 단계) 및/또는 점막적으로 모니터링하는 단계(예컨대 IgA 생성 수준을 모니터링하는 단계)를 수반한다. 전형적으로, 항원-특이적 혈청 항체 반응은 면역화-후이지만 공격(challenge)-전에 결정되는 반면, 항원-특이적 점막 항체 반응은 면역화-후 그리고 공격-후에 결정된다.
8. 용어
본원에서 언급된 모든 공개 문헌 및 특허는 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허가 참조에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 포함되는 것으로 제시된 바와 같이 이들 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 좌우할 것이다. 그러나, 본원에서 인용된 임의의 참조문헌, 논문, 공개 문헌, 특허, 특허 공보, 및 특허 출원의 언급은, 이들이 세계 임의의 국가에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 보편적인 일반 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것으로서 또는 임의의 형태의 제안으로서 취급되지 않으며 취급되어서도 안 된다.
본 출원 내에서, 다르게 언급되지 않는 한, 이용된 기법은 하기와 같은 몇몇 잘-알려진 임의의 참조문헌에서 발견될 수 있다: 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 등, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.)]; [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, 등 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed (RI. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, NJ.]), 및 Ambion 1998 카탈로그(Ambion, Austin, TX).
본 상세한 설명에서, 임의의 농도 범위, 퍼센트 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 다르게 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우 이의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "약"은 숫자 또는 수치 바로 앞에 놓이는 경우, 상기 숫자 또는 수치가 플러스 또는 마이너스 10% 범위임을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 단수형("a" 및 "an")은 다르게 나타내지 않는 한 나열된 구성성분 중 "하나 이상"을 지칭함을 이해해야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 상기 대안 중 하나, 둘 다 또는 이의 임의의 조합을 의미함을 이해해야 한다. 용어 "및/또는"은 상기 대안 중 하나 또는 둘 다를 의미함을 이해해야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의적으로 사용된다.
본원에 사용된 부문 제목은 단지 구조적인 목적을 위한 것일 뿐, 기재된 주제를 제한하는 것으로 여겨져서는 안 된다.
구체적으로 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 다양한 구현예에 보편적인 하기 용어 및 어구는 하기와 같이 정의된다:
본원에 사용된 바와 같이, 용어 단백질은 단백질 또는 당단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 면역원성이라는 용어는 특이적인 단백질, 또는 상기 특이적인 단백질과 높은 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대해 면역 반응을 유발하는 상기 특이적인 단백질 또는 이의 특이적인 영역의 능력을 지칭한다. 본 개시내용에 따르면, 높은 동일성 정도를 갖는 2개의 단백질은 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 백신 또는 나노구조에 대한 면역 반응은 대상체에서 백신에 존재하는 항원성 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발달이다. 본 개시내용의 목적을 위해, "체액성 면역 반응"은 분비형(IgA) 또는 IgG 분자를 포함한 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 지칭하는 한편, "세포성 면역 반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구 세포에 의해 매개되는 면역 반응이다. 세포성 면역력의 하나의 중요한 양태는 세포용해성 T-세포("CTL")에 의한 항원-특이적 반응을 수반한다. CTL은 주 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 인코딩되고 세포의 표면 상에 발현되는 단백질과 결합되어 제시되는 펩타이드 항원에 대해 특이성을 갖는다. CTL은 세포내 미생물의 파괴, 또는 이러한 미생물로 감염된 세포의 용해를 도우며, 유도하고, 촉진한다. 세포성 면역력의 또 다른 양태는 조력자 T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 수반한다. 조력자 T-세포는 표면 상에서 MHC 분자와 결합되어 펩타이드 항원을 표시하는 세포에 대한 비특이적 효과기 세포의 기능을 자극하고 이의 활성에 초점을 맞추는 것을 돕는 작용을 한다. 세포성 면역 반응은 또한, CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터의 것들을 포함하여 활성화된 T-세포 및/또는 다른 백혈구 세포에 의해 생성되는 사이토카인, 케모카인 및 다른 이러한 분자의 생성을 지칭한다.
그러므로, 면역학적 반응은 CTL, 및/또는 조력자 T-세포의 생성 또는 활성화를 자극하는 반응일 수 있다. 케모카인 및/또는 사이토카인의 생성 또한, 자극될 수 있다. 백신은 또한, 항체-매개 면역 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 면역학적 반응은 하기 효과 중 하나 이상을 포함할 수 있다: B-세포에 의한 항체(예를 들어, IgA 또는 IgG)의 생성; 및/또는 억제자, 세포독성 또는 조력자 T-세포 및 백신에 존재하는 헤마글루티닌 단백질에 대해 특이적으로 지향되는 T-세포의 활성화. 이들 반응은 감염성을 중화시키며, 및/또는 항체-보체, 또는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 매개하여, 면역화된 개체에 보호를 제공하는 역할을 할 수 있다. 이러한 반응은 당업계에 잘 알려진 표준 면역검정법 및 중화 검정법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 온전한 분자, 뿐만 아니라 이의 기능성 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, 또는 단일 도메인 분자, 예컨대 VH 및 VL을 포함한다. 용어 "항체"는 B-세포 수용체를 포괄한다. 용어 "항체"는 카멜리드(camelid) 항체를 추가로 포괄한다.
바이러스를 기재하는 데 있어서 본원에 사용된 바와 같이, 중화 항체는 바이러스가 1회(round)의 복제를 완료하는 것을 방지하는 항체이다. 본원에 정의된 바와 같이, 1회의 복제는, 바이러스가 숙주 세포에 부착하는 것에서 출발하여 새로 형성된 바이러스가 상기 숙주 세포로부터 출아(budding)하는 것으로 종료되는 바이러스의 생활 주기를 지칭한다. 생활 주기는 세포에 부착하는 단계, 세포에 진입하는 단계, 바이러스 단백질의 절단 및 재배열 단계, 바이러스 막과 엔도솜 막의 융합 단계, 세포질 내로의 바이러스 리보핵단백질의 방출 단계, 새로운 바이러스 입자의 형성 단계, 및 숙주 세포막으로부터 바이러스 입자의 출아 단계를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 광범위 중화 항체는 1개 초과의 유형, 하위유형 및/또는 계통의 박테리아, 바이러스 또는 기생충을 중화시키는 항체이다. 예를 들어, A형 인플루엔자 바이러스로부터의 인플루엔자 HA 단백질에 대해 유발된 광범위 중화 항체는 B형 또는 C형 바이러스를 중화시킬 수 있다. 추가의 예로서, 그룹 I 인플루엔자 바이러스로부터의 인플루엔자 HA 단백질에 대해 유발된 광범위 중화 항체는 그룹 2 바이러스를 중화시킬 수 있다. 부가적인 예로서, 하나의 하위유형 또는 계통의 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유발된 광범위 중화 항체는 또 다른 하위유형 또는 계통의 바이러스를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, H1 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유발된 광범위 중화 항체는 H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하위유형으로부터의 바이러스를 중화시킬 수 있다.
항원에 관하여, 당업자는 상이한 계통으로부터의 항원 단백질이 상기 단백질 내 돌연변이(삽입, 결실)로 인해 상이한 길이를 가질 수 있음을 이해한다. 그러므로, 상응하는 영역에 대한 기준은 비교되는 영역과 서열, 구조 및/또는 기능 면에서 동일하거나 거의 동일한(예를 들어, 적어도 95%, 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99% 동일한) 또 다른 단백질의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 에피토프에 관하여, 상이한 계통의 유기체로부터의 상응하는 단백질 내의 상응하는 영역은 동일한 잔기 수를 갖지 않을 수 있으나, 유사한 또는 거의 동일한 서열을 가질 것이고 동일한 기능을 수행할 것이다. 계통 사이에서의 서열 비교를 더 명확히 하기 위해, 아미노산 위치를 기준 서열과 연관시키는 넘버링 시스템이 당업자에 의해 사용된다. 상이한 계통으로부터의 항원 단백질 내 상응하는 아미노산 잔기는 상기 단백질의 N-말단 아미노산으로부터의 이들의 거리에 관하여 동일한 잔기 수를 갖지 않을 수 있다. 이러한 넘버링 시스템의 사용은 당업자에 의해 이해된다.
본 개시내용에 따르면, 삼량체화 도메인은 단백질 또는 펩타이드에 접합(융합으로도 지칭됨)된 경우, 융합 단백질을 삼량체화 도메인을 함유하는 다른 융합 단백질과 상호작용시켜 삼량체 구조가 형성되게 하는 일련의 아미노산이다. 임의의 알려진 삼량체화 도메인이 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 삼량체화 도메인의 예는 HIV-1 gp41 삼량체화 도메인, SIV gp41 삼량체화 도메인, 에볼라 바이러스 gp-2 삼량체화 도메인, HTLV-1 gp-21 삼량체화 도메인, T4 피브리틴 삼량체화 도메인(즉, 폴돈), 효모 열 충격 전사 인자 삼량체화 도메인, 및 인간 콜라겐 삼량체화 도메인을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 변이체는 이의 서열이 기준 서열과 유사하지만 동일하지는 않은 단백질, 또는 핵산 분자를 지칭하며, 여기서, 변이체 단백질(또는 변이체 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질)의 활성은 유의하게 변경되지 않는다. 서열에서의 이들 변화는 자연 발생 변동일 수 있거나 이들 변화는 당업자에게 알려진 유전자 조작 기법을 사용하여 조작될 수 있다. 이러한 기법의 예는 문헌[Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T 등, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57)], 또는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 발견되며, 이들 문헌은 둘 다 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
변이체에 관하여, 아미노산 또는 핵산 서열에서의 임의의 유형의 변경은, 결과적인 변이체 단백질이 인플루엔자 바이러스에 대해 중화 항체를 유발하는 능력을 보유하는 한 허용 가능하다. 이러한 변화의 예는 결실, 삽입, 치환 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 단백질에 관하여, 당업자는 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 아미노산이 종종, 해당 단백질의 활성에 유의하게 영향을 주지 않으면서 단백질의 아미노 및/또는 카르복시 말단 단부로부터 제거될 수 있음을 잘 이해하고 있다. 유사하게는, 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 아미노산은 종종, 단백질의 활성에 유의하게 영향을 주지 않으면서 단백질 내에 삽입될 수 있다.
주지되는 바와 같이, 본 개시내용의 변이체 단백질은 본원에 개시된 나노구조 항원 단백질에 비해 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 임의의 아미노산 치환은 단백질의 활성이 유의하게 영향을 받지 않는 한 허용 가능하다. 이러한 측면에서, 아미노산은 이의 물리적 특성에 기초하여 그룹으로 분류될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 그룹의 예는 하전된 아미노산, 비하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산, 및 소수성 아미노산을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 치환을 함유하는 바람직한 변이체는 아미노산이 동일한 그룹의 아미노산으로 치환된 것들이다. 이러한 치환은 보존적 치환으로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 하기와 같이 약술된다: 알라닌(Ala; A), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 아르기닌(Arg; R), 시스테인(Cys; C), 글루탐산(Glu; E), 글루타민(Gln; Q), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프랄린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V). 본원에 사용된 바와 같이, "약"은 언급된 매개변수의 +/- 5%를 의미한다.
자연 발생 잔기는 보편적인 측쇄 특성에 기초하여 클래스로 나뉠 수 있다: 1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 예를 들어, 비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
아미노산 변화를 줄 때, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치 지수가 지정되었다. 수치 지수는 하기와 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 상호적인 생물학적 기능을 단백질에 부여하는 데 있어서 수치 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(문헌[Kyte 등, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31]). 소정의 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다고 알려져 있다. 수치 지수에 기초하여 변화를 주는 경우, 수치 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것들이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것들이 더욱 더 특히 바람직하다.
또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있으며, 특히 이로써 생성된 생물학적으로 기능적으로 등가의 단백질 또는 펩타이드가 본 경우에서와 같이 면역학적 개시내용에 사용하기 위한 것임을 이해한다. 단백질의 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이 단백질의 가장 큰 국지적 평균 친수성은 단백질의 면역원성 및 항원성, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다. 하기 친수성 값은 이들 아미노산 잔기에 지정되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변화를 주는 경우, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것들이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것들이 더욱 더 특히 바람직하다. 당업자는 또한, 친수성에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터의 에피토프를 식별할 수 있다.
요망되는 아미노산 치환(보존적 또는 비-보존적이든지 간에)은 이러한 치환이 요망되는 경우에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 HA 단백질의 중요한 잔기를 식별하거나 본원에 기재된 HA 단백질의 면역원성, 용해성 또는 안정성을 증가 또는 저하시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 하기 표 4에 제시된다.
Figure pct00017
본원에 사용된 바와 같이, "단백질의 활성에 유의하게 영향을 준다"는 어구는 단백질의 활성이 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%만큼 저하되는 것을 지칭한다. 본 개시내용에 관하여, 이러한 활성은 예를 들어, 바이러스에 대해 중화 항체를 유발하는 단백질의 능력으로서 측정될 수 있다. 이러한 활성은 바이러스에 대한 이러한 항체의 역가를 측정함으로써, 또는 유발된 항체에 의해 중화되는 유형, 하위유형 또는 계통의 수를 측정함으로써 측정될 수 있다. 항체 역가를 결정하는 방법 및 바이러스 중화 검정법을 수행하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 상기 기재된 활성 외에도, 측정될 수 있는 다른 활성은 적혈구 세포를 응집시키는 능력 및 세포에 대한 단백질의 결합 친화도를 포함한다. 이러한 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 융합 단백질은 단일 단백직을 제조하기 위해 펩타이드 결합을 통해 함께 접합되었던 적어도 2개의 무관한 단백질로부터의 아미노산 서열을 함유하는 재조합 단백질이다. 무관한(unrelated) 아미노산 서열은 서로 직접적으로 접합될 수 있거나 이러한 무관한 아미노산 서열은 링커 서열을 사용하여 접합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 단백질은, 이의 아미노산 서열이 이의 자연 환경(들)에서(예를 들어 세포 내부에서) 펩타이드 결합을 통해 함께 접합된 것으로 통상 발견되지 않는다면 무관하다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 구성하는 단량체성 서브유닛의 아미노산 서열, 및 항원 단백질의 아미노산 서열은 펩타이드 결합을 통해 함께 접합되는 것으로 통상 발견되지 않는다.
용어 개체, 대상체 및 환자는 당업계에 잘-인식되고 있고, 본원에서 감염에 취약한 임의의 인간 또는 다른 동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예는 인간, 및 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종을 포함하여 다른 영장류; 가축, 예컨대 소, 양, 돼지, 물개, 염소 및 말; 애완 동물, 예컨대 개 및 고양이; 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그를 포함한 실험 동물; 애완용, 야생 및 사냥용 조류, 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 가금류, 오리, 거위를 포함한 조류 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 용어 개체, 대상체 및 환자 자체는 특정 연령, 성별, 인종 등을 나타내지 않는다. 그러므로, 남성 또는 여성이든지 간에 임의의 연령의 개체가 본 개시내용에 의해 망라되고자 하고, 노인, 성인, 소아, 아기, 유아 및 영아를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 마찬가지로, 본 개시내용의 방법은 예를 들어, 코카시아인(백인), 아프리카-아메리카인(흑인), 토착 아메리카인, 토착 하와이인, 히스패닉계인, 라틴계인, 아시아인 및 유럽인을 포함한 임의의 인종에 적용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 백신화된 대상체는 박테리아, 바이러스 또는 기생충에 대한 보호 효과를 제공하고자 하는 백신을 투여받았던 대상체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 노출된, 노출 등의 용어는 박테리아, 바이러스 또는 기생충에 의해 감염되는 것으로 알려진 사람 또는 동물과 대상체가 접촉하게 되었음을 나타낸다.
본원에서 논의된 공개 문헌은 본 출원의 출원일 전에 이들 공개 문헌의 개시를 위해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도, 본 개시내용이 선행 개시내용 덕택에 이러한 공개 문헌을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으므로 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 상기 공개문헌이 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에서 참조로 포함된다.
명확성을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 기재된 본 개시내용의 소정의 특질은 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있음을 이해한다. 역으로, 간결성을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 개시내용의 다양한 특질은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 구현예의 모든 조합은 본 개시내용에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적이고 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다. 게다가, 모든 하위조합은 또한 본 개시내용에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 이러한 하위조합이 본원에서 개별적이고 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다.
본 개시내용은 하기 실시예에서 추가로 기재되며, 이러한 실시예는 청구항에 기재된 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다.
9. 실시예
9.1. 실시예 1: 호흡기 융합 바이러스(RSV)
9.1.1. 서열
본 개시내용의 구현예에서, RSV F 단백질은 제1 폴리펩타이드와의 융합 단백질로서 존재하며, 링커가 사용되고, F 단백질-링커 서열은 하기를 포함할 수 있다:
>DS-Cav1-폴돈 (SEQ ID NO: 90)
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다양한 추가의 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 제1 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 구성된다(괄호 안은 선택적인 잔기임):
>DS-Cav1-폴돈-T33-31A (SEQ ID NO: 91)
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>DS-Cav1-T33-31A (SEQ ID NO: 92)
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>DS-Cav1-T33-15B (SEQ ID NO: 94)
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>DS-Cav1-폴돈-I53-50A (SEQ ID NO: 95)
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>DS-Cav1-I53-50A (SEQ ID NO: 96)
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>DS-Cav1-I32-28A (SEQ ID NO: 97)
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>DS-Cav1-Tr-폴돈-T33-31A (SEQ ID NO: 101)
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>DS-Cav1-Tr-T33-31A (SEQ ID NO: 102)
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>DS-Cav1-Tr-폴돈-T33-15B (SEQ ID NO: 103)
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>DS-Cav1-Tr-I53-50A (SEQ ID NO: 106)
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>DS-Cav1-Tr-I32-28A (SEQ ID NO: 107)
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9.1.2. 방법
F 단백질 및 삼량체성 조립 도메인을 포함하는 삼량체성 구성 요소의 발현 및 스크리닝.
DS-Cav1 융합을 포함하고 결여된 삼량체성 구성 요소에 대한 인간 코돈-최적화된 서열을 Genscript로부터 주문하였다. 단일-구성성분 나노구조(즉, I3-01)에 대한 구성 요소를 하나의 CMV 프로모터를 함유하는 pcDNA3.1 벡터(ThermoFisher Scientific) 내로 클로닝한 한편, 2-구성성분 나노구조(예를 들어, I53-50)에 대한 구성 요소를 CMV 및 EF-1α 프로모터를 둘 다 함유하는 pBudCE4.1 벡터(ThermoFisher Scientific) 내로 클로닝하였다. 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용한 Expi293F 세포(ThermoFisher Scientific)의 일시적인 형질감염에 의해 재조합 단백질을 발현시켰다. 세포 배양물을 형질감염-후 5일째에 원심분리에 의해 수합하였다. 분비된 단백질을, 세포 상층액의 직접적 코팅을 사용하는 ELISA에 의해 또는 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 간략하게는, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc)를, 직접 ELISA를 위해 세포 상층액으로 코팅하거나 샌드위치 ELISA를 위해 뮤린 항-His 태그 모노클로날 항체(ThermoFisher Scientific)로 코팅하였다. 분비된 단백질을 인간 팔리비주맙(Palivizumab), MPE8, RSD5 및 D25 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 형질감염된 Expi293F 세포를 BD cytofix/cytoperm(BD Biosciences)으로 고정시키고 투과시키며, 인간 팔리비주맙, MPE8 및 D25 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하고, Alexa Fluor 647-공액 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. 염색된 세포를 FACS Fortessa 유세포분석기(BD Biosciences)를 이용하여 카운팅하였다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다. 세포주를 미코플라즈마 오염에 대해 일상적으로 시험하였다.
DS-Cav1-I53-50A의 발현 및 정제
선형 25-kDa 폴리에틸렌이민(PEI; Polysciences)을 사용한 293T(ATCC) 세포의 일시적인 형질감염에 의해 렌티바이러스를 생성하였다. 간략하게는, 4x 106개 세포를 10 cm 조직 배양 플레이트 상으로 평판배양하였다. 24시간 후, 3 μg의 psPAX2, 1.5 μg의 pMD2G(각각 Addgene 플라스미드 #12260 및 #12259) 및 6 μg의 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 500 pi 희석제(5 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH = 7.05) 및 42 μl의 PEI(1 mg/ml)에서 혼합하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, DNA/PEI 복합체를 플레이트에 적가하였다. 렌티바이러스를 형질감염-후 48시간째에 수합하고, 8000 g에서 18시간 동안의 저속 원심분리에 의해 100-배 농축시켰다. 표적 세포주의 형질도입을 10 mL의 성장 배지에 10 x 106개 세포를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크에서 수행하였다. 100 uL의 100x 렌티바이러스를 상기 플라스크에 첨가하고, 세포를 37℃, 8% CO2에서 4 내지 6시간 동안 진탕(225 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 20 mL의 성장 배지를 진탕 플라스크에 4 내지 6시간 동안 첨가하였다.
형질도입된 세포를, 4 L의 최종 배양 크기에 도달할 때까지 1 x 106개 세포/ml의 밀도까지 이틀마다 증식시켰다. 17일의 총 인큐베이션 후 최종 세포 농도(약 5 x 106개 세포/mL) 및 생존력(약 90% 생존)을 측정한 후 배지를 수합하였다. 세포 상층액을 저속 원심분리에 의해 수합하여, 상기 상층액으로부터 세포를 제거하였다. NaCl 및 NaN3를 각각 250 mM 및 0.02%의 최종 농도까지 첨가하였다. 상층액을 하나의 5 mL HisTrap FF Crude 컬럼(GE Healthsciences)에 걸쳐 AKTA Pure(GE Healthsciences)에 의해 5 ml/분으로 로딩하였다. 니켈 용출액을 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼(GE Healthsciences)에 적용하여, 표적 단백질을 크기-배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 크기-배제 정제된 표적 단백질을 액체 질소 내에서 순간 동결(snap frozen)시켰고 -80℃에서 저장하였다.
DS-Cav1-함유 나노구조의 시험관내 조립
100% 원자가 입자(정20면체 나노구조 당 20개의 DS-Cav1 삼량체)를, DS-Cav1-폴돈-I53-50A 삼량체와 I53-50B.4PT1 오량체를 각각 50 μM에서 혼합하고 4℃에서 밤새 흔들면서 인큐베이션함으로써 제조하였다. 일부 경우, 조립된 나노구조를, 25 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤을 포함하는 완충제에서 GE 세파크릴 S-500 HR 16/60 컬럼을 사용한 시험관내 조립 반응에 잔류하는 과량의 구성성분으로부터 정제하였다. 샘플 로드 및 SEC 분획을 환원제의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 피크 분획을 풀링(pool)하며, GE Vivaspin 20 30 kDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고, Agilent 8454 분광광도계를 사용하여 정량화하였다.
66% 원자가 입자(정20면체 나노구조 당 약 14개의 DS-Cav1 삼량체)를, DS-Cav1-폴돈-I53-50A 삼량체, I53-50A 삼량체, 및 I53-50B.4PosT1 오량체를 각각 50, 25 및 75 μM에서 혼합함으로써 제조하였다. 33% 원자가 입자(정20면체 나노구조 당 약 7개의 DS-Cav1 삼량체)를, DS-Cav1-폴돈-I53-50A 삼량체, I53-50A 삼량체, 및 I53-50B.4PosT1 오량체를 각각 25, 50 및 75 μM에서 혼합함으로써 제조하였다. 시험관내 조립 반응을 4℃에서 밤새 흔들면서 인큐베이션하였다. 일부 경우, 조립된 나노구조를, 25 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤을 포함하는 완충제에서 GE 세파크릴 S-500 HR 16/60 컬럼을 사용한 시험관내 조립 반응에 잔류하는 과량의 구성성분으로부터 정제하였다. 샘플 로드 및 SEC 분획을 환원제의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 피크 분획을 풀링(pool)하며, GE Vivaspin 20 30 kDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고, 4℃에서 약 21,000 g에서 10분 동안 원심분리한 후 Agilent 8454 분광광도계를 사용하여 정량화하였다. 그 후에, 샘플을 33% 원자가 입자의 경우 1.1 mg/mL에서 그리고 66% 원자가의 경우 0.6 mg/mL에서 1 mL 분취액에서 극저온 튜브로 이전시키며, 액체 질소 내에서 플래쉬 동결시키고, -80℃에서 저장하였다.
DS-Cav1-함유 나노구조의 전자 현미경
샘플을 25 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤을 사용하여 0.01 mg/mL까지 희석시킴으로써 네거티브 염색 EM용으로 제조하고, 3.5 μL를 글로-방전된, 구리, 탄소-코팅된 그리드 상에서 20초 동안 인큐베이션한 후, Whatman No. 1 필터 페이퍼 조각으로 액체를 블로팅시켰다. 샘플을 블로팅하는 수초 이내에, 3.5 μL의 염색 액적(2% w/v 우라닐 포르메이트)을 증착시키고 즉시 블로팅한 다음, 염색/블로팅의 제2 주기를 수행하였다.
원편광 이색성(CD; Circular dichroism) 분광편광법
F 단백질(0.5 mg m1-1)로부터의 CD 스펙트럼을 1 nm의 대역폭, 0.5 nm의 단계 크기, 및 단계 당 1 s에서 195 내지 260 nm의 파장에 걸쳐 Chirascan 분광편광계(Applied Photophysics) 상에서 기록하였다. 원자외선(far-ultraviolet) 영역 내의 스펙트럼은 평균 3개의 스캔을 필요로 하였고, 완충제로 수행된 블랭크 스펙트럼으로부터 차감되었다. 각각의 온도에서 1분 동안 평형화 후 1℃의 간격에서 스캔을 수행함으로써 열적 변성을 모니터링하였다. 데이터를 단순 1차 곡선에 적합화시켰다. ΔA222의 값을 20℃에서 기록된 값의 퍼센트로서 y 축 상에 나타낸다.
효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA)
항체 또는 혈청의 특이적인 결합을 시험하기 위해, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc)를, F 단백질 및 삼량체성 조립 도메인 또는 2 μg ml-1의 하기 정제된 단백질을 포함하는 삼량체성 구성 요소를 발현하는 세포로부터의 조직 배양 상층액의 일련의 희석물로 코팅하였다: 폴돈이 있는 Ds-Cav1, 삼량체성 제1 폴리펩타이드에 융합된 Ds-Cav1 또는 DS-Cav1-표시 나노구조. 플레이트를 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단시키고, 적정된 항체(D25, MPE8, 팔리비주맙, RSD5) 또는 뮤린 혈청, 뒤이어 AP-공액 염소 항-인간 IgG(Southern Biotech, 2040-04) 또는 염소 항-마우스 IgG(Southern Biotech, 1030-04)와 함께 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 플레이트를 PBS 완충제(Gibco, Invitrogen), 0.05% Tween-20으로 세척하며, 기질(p-NPP, Sigma)을 첨가하고, 플레이트를 405 nm에서 판독하였다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)
실험을 25℃에서 ProteON XPR-36 기기(Bio-Rad Laboratories) 장비 상에서 PBS 완충제(Gibco, Invitrogen), 0.05% Tween-20 내에서 수행하였다. D25 mAb를 1000 반응 단위(RU)에서 아민 커플링을 통해 GLM 센서 칩 표면 상에 고정하고, 단백질이 없는 블랭크 표면을 기준으로서 사용하기 위해 동일한 커플링 조건 하에 생성하였다. 모노클로날 항체(D25, MPE8, 팔리비주맙 및 131-2a)를 상이한 센서 채널 내에서 100 μl/분의 유속 및 50 nM의 농도로 주사하였다. 데이터를 Proteon 소프트웨어를 사용하여 가공하고, 데이터의 국지적 적합화(local fitting) 전에 블랭크 표면 및 완충제 단독 주사의 차감에 의해 이중 참조하였다.
백신화 및 혈청학적 분석
6 내지 9주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Harlan Laboratories Inc로부터 입수하였다. 모든 절차를 스위스 연방 수의학 사무실의 지침에 따라 그리고 국지적 윤리 승인을 받은 후 수행하였다. 마우스를 0일, 14일 및 28일째에 100 μL의 면역원 제제로 i.p. 면역화시켰다. Murine TLR9 리간드 효능제(ODN 1668, InvivoGen)를 이용하여 0일째의 프라이밍 주사를 수행하였다. 10, 20 및 40일째에 마우스에서 채혈하고, 항원-특이적 및 부위-특이적 IgG 역가를 ELISA에 의해 혈청 내에서 측정하였다. 중화 역가를 또한, 하기 기재된 바와 같이 HEp-2 세포 상에서 결정하였다.
바이러스 중화 검정법 및 현미경 분석
96-웰 편평-바닥 플레이트 내의 HEp-2 세포의 컨플루언트 레이어를 녹색 형광 단백질(RSV 계통 A2, Vira Tree#R121)과 함께 고정된 양의 인간 호흡기 융합 바이러스를 1의 MOI에서 감염시켰다. 감염-후 48시간째에 세포를 Hoechst(Sigma#H6024)로 염색시키고, 이미지를 BD Pathway 바이오이미징 시스템 상에서 획득하였다. 감염된 세포의 퍼센트를 BD AttoVision 소프트웨어에 의해 자동적으로 계산하였다. 상대 감염 세포를 항체 희석물에 대해 플로팅(plotting)함으로써, 감염된 세포의 수를 용량 반응 곡선으로서 플로팅하였다.
DS-Cav1-함유 나노구조의 안정성
80℃에서 1시간 동안 가열된 뚜껑(lid)을 갖는 PCR 사이클러에서 다양한 농도에서 단백질을 인큐베이션함으로써, 설계된 DS-Cav1-폴돈-I53-50의 예비융합 형태의 물리적 안정성을 평가하였다. 예비융합-특이적 항체 D25를 이용한 단백질의 직접 코팅 및 ELISA에 의해 잔류 예비융합 형태를 평가하였다.
통계학적 분석
샘플 크기를 사전결정하기 위해 어떠한 통계학적 방법도 사용하지 않았다. 2개 그룹의 비교를 위해 양측 비-모수 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정, 또는 3개 이상의 그룹을 비교하는 경우 크루스칼-왈리스(Kruskall-Wallis) 검정(및 던즈 포스트테스트(Dunn's posttest))을 사용하여 Prism 6(GraphPad Software)에 의해 데이터를 분석하였다.
9.1.3. 결과
F 단백질 및 삼량체성 조립 도메인을 포함하는 삼량체성 구성 요소
각각의 삼량체성 구성 요소가 삼량체성 조립 도메인에 유전적으로 융합된 F 단백질을 포함하는 몇몇 삼량체성 구성 요소는 ELISA 검정법에서 예비융합-특이적 모노클로날 항체 결합에 의해 판단된 바와 같이 잘-접혀진, 예비융합 형태에서 이들의 F 단백질과 함께 HEK293F 세포로부터 분비되는 것으로 밝혀졌다. 도 2는 DS-Cav1-폴돈, DS-Cav1-폴돈-T33-31A, 및 DS-Cav1-T33-31A를 발현하는 HEK293F 세포의 상층액을 분석하는 ELISA 데이터의 일례를 도시한다. 몇몇 다른 삼량체성 구성 요소는 잘-접혀진, 예비융합 F 단백질의 검출 가능한 분비를 산출하였다.
DS-Cav1-폴돈-I53-50A의 발현 및 정제
DS-Cav1-폴돈-I53-50A를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 대규모 발현용 HEK293F 세포를 형질도입시켰다. 분비된 단백질을 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 조직 배양 상층액으로부터 정제하였다. 크기 배제 크로마토그램(도 3)은 정제된 단백질이 단일의 단분산 종을 형성하였음을 나타내었다.
I53-50B.4PT1의 발현 및 정제
정20면체 I53-50-기초 나노구조의 조립을 구동하기 위해 I53-50A 또는 DS-Cav1-폴돈-I53-50A에서 삼량체성 조립 도메인과 상호작용하는 제2 조립 도메인을 포함하는 오량체성 단백질인 I53-50B.4PT1를 Bale 등 및 특허 공보 제US20160122392 A1호에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.
DS-Cav1-함유 I53-50 나노구조의 시험관내 조립 및 특징화
I53-50은 Bale 등에 의해 최근에 기재된 바와 같이, 20개의 삼량체성(I53-50A) 구성 요소 및 12개의 오량체성(I53-50B) 구성 요소를 포함하는 정20면체 대칭을 갖는 120-서브유닛 2-구성성분 나노구조이다. I53-50A의 N 말단을 I53-50 나노구조의 외부 상에 노출시켜, I53-530A N 말단에의 유전자 융합을 통해 나노구조 외부 상에서 항원의 표시를 가능하게 한다. 정제된 DS-Cav1-폴돈-I53-50A 및 I53-50B.4PT1를 시험관내에서 조립하여, 2개의 정제된 단백질을 다양한 몰비로 혼합함으로써 다양한 양의 DS-Cav1을 나노구조 외부 상에 표시하는 120-서브유닛 정20면체 나노구조를 형성하였다. 별개의 조제물에서, 100%(20개의 삼량체), 66%(약 14개의 삼량체) 및 33%(약 7개의 삼량체)의 결합가에서 DS-Cav1을 표시하는 나노구조를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 밤새 인큐베이션 후 시험관내 조립 반응에 존재하는 종을 크기 배제 크로마토그래피-다각도 광 산란(SEC-MALS), 동적 광 산란, 및 UV/vis 분광법을 포함한 몇몇 기법에 의해 평가하였다. 조립된, 120-서브유닛 나노구조를 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 시험관내 조립 반응으로부터 정제하였다(100% 원자가 나노구조를 사용하여 수득된 예시적인 크로마토그램은 도 4에 제시됨). 정제된 나노구조를 네거티브 염색 전자 현미경에 의해 특징화하고, 이는 DS-Cav1이 코어 정20면체 I53-50 조립체로부터 바깥쪽으로 돌출하는 돌기로서 명백하게 나타난 단분산 입자의 필드를 드러내었다(100% 원자가 입자를 사용하여 수득된 예시적인 현미경 사진은 도 5에 제시됨). 예비융합 형태에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 ELISA 검정법은, 나노구조 외부 상에 표시된 DS-Cav1이 잘-접혀졌고 항원적으로 온전하였음을 확증시켜 주었다(도 6). 모노클로날 항체 결합의 동역학을 평가하는 표면 플라즈몬 공명 실험은, 100% 원자가 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조로부터의 항체 해리가 아마도 나노구조 외부 상에서 DS-Cav1의 다가 제시로부터 유도되는 결합력 효과로 인해, DS-Cav1-폴돈 삼량체보다 더 느렸음을 드러내었다(도 6). 종합하여, 이들 실험은, DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조가, 잘-접혀진, 항원적으로 온전한 DS-Cav1 삼량체를 나노구조의 외부 상에 표시하는 단분산, 정20면체 나노구조를 형성하였음을 확증시켜 주었다. 이들 발견은, 동물에서 DS-Cav1에 대해 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 면역원으로서 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조의 유용성을 평가하는 실험을 동기화하였다.
DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조의 면역원성
33%, 66% 및 100% 원자가에서 DS-Cav1을 표시하는 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조를 상기 기재된 바와 같이 프라임-부스트 전략을 사용하여 마우스 내에 주사하였다. 부가적인 그룹의 마우스에게, DS-Cav1 특이적 반응에 대한 음성 대조군으로서 나노구조, 또는 표시된 DS-Cav1이 결여된 I53-50 나노구조에 의해 DS-Cav1에 대해 유도된 체액성 면역 반응에 대한 벤치마크로서 삼량체성 DS-Cav1-폴돈을 주사하였다. 주사 후 정의된 시점에서 마우스로부터 추출된 혈청의 ELISA 검정법을 사용하여, 주사된 동물의 혈청에 존재하는 DS-Cav1 특이적 항체 역가를 측정하였다(도 7). 예상된 바와 같이, 표시된 DS-Cav1이 결여된 I53-50 나노구조가 주사된 동물로부터의 혈청은 DS-Cav1에 특이적인 항체를 함유하지 않았다. 삼량체성 DS-Cav1-폴돈은 이전의 결과(McClellan 등)에 따라 DS-Cav1-특이적 항체를 유도하였다. 33%, 66% 및 100% 원자가 DS-Cav1 나노구조는 모두, 삼량체성 DS-Cav1-폴돈보다 더 높은 DS-Cav1-특이적 항체 역가를 유도하였으며, 이때 DS-Cav1 원자가가 증가함에 따라 상기 항체 역가가 증가하였다. DS-Cav1-특이적 역가는 DS-Cav1과 비교하여 100% 원자가 DS-Cav1-폴돈-I53-50 나노구조가 주사된 마우스에서 평균적으로 대략 2.5-배 더 높았다. 이들 결과는, 자가-조립형 단백질 나노구조 상에서 파라믹소바이러스 F 단백질이 다가 표시된 면역원이 동물에게 주사된 경우 더 높은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있음을 실증한다.
상기 기재된 일련의 면역원이 주사된 마우스로부터의 혈청을 또한, HEp-2 세포에서 표준 중화 검정법을 사용하여 중화 항체 역가의 존재에 대해 평가하였다(도 8). 혈청 중화 항체 역가의 경향은 DS-Cav1-특이적 결합 항체 역가에서 관찰된 경향과 고도로 상관관계가 있었다. 표시된 DS-Cav1이 결여된 I53-50 나노구조가 주사된 동물로부터의 혈청은 이들 혈청에서의 DS-Cav1-특이적 항체의 결여와 일관되게 바이러스를 중화시키지 않았다. 삼량체성 DS-Cav-l-폴돈이 주사된 동물로부터의 혈청은 바이러스를 3,030의 평균 역가(1/ID50)로 중화시켰다. 33%, 66% 및 100% 원자가 DS-Cav1-I53-50 나노구조는 삼량체성 DS-Cav1-폴돈보다 더 높은 중화 항체 역가를 유도하였으며, 이때 평균 역가는 각각 9,400, 20,000 및 30,500이었다. 이들 결과는, 자가-조립형 단백질 나노구조 상에서 파라믹소바이러스 F 단백질이 다가 표시된 면역원에 의해 유도된 더 높은 반응이 더 효과적인 바이러스 중화를 초래함을 실증한다.
I53-50A에의 융합에 의한 DS-Cav1의 물리적 안정화
예비융합 F의 주된 항원 특성을 고려하여, 본 발명자들은 2 가지의 직교(orthogonal) 접근법을 사용하여, I53-50A에 융합된 경우 및/또는 정20면체 나노구조로 추가로 조립된 경우 DS-Cav1의 물리적 안정성을 측정하였다. 제1 검정법은, 예비융합 F 안정성을 특징화하기 위해 이전에 사용되었던 접근법인 열적 스트레스 후 예비융합-특이적 mAb(D25)에 의한 결합의 보유(retention)를 측정하였다(McLellan 등 2013; Joyce 등 2016; Krarup 등 2015). 동일한 농도(50 nM)의 DS-Cav1을 함유하는 삼량체성 DS-Cav1, 삼량체성 DS-Cav1-I53-50A, 및 DS-Cav1-I53-50 나노구조의 샘플을 4개의 분취물로 분할하고, 20℃, 50℃, 70℃ 또는 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실온까지 냉각 후, D25 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 검정하였다. 본 발명자들은, 모든 샘플이 20℃ 및 50℃에서 D25에 동등하게 결합하였으나, DS-Cav1에 대해 이전에 보고된 바와 같이 80℃에서 1시간 후 D25에 대한 이들의 반응성 대부분을 상실하였음을 밝혀내었다(McLellan 등 2013; Joyce 등 2016)(도 10). 흥미롭게도, D25는 70℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 삼량체성 DS-Cav1에 결합할 수 없었지만, 삼량체성 DS-Cav1-I53-50A 및 DS-Cav1-I53-50 나노구조는 이들의 각각의 결합 신호 중 50% 및 80%를 보유하였다(도 10). DS-Cav1-I53-50 나노구조의 다가 성질은 삼량체성 DS-Cav1과의 직접적인 정량적 비교를 복잡하게 하는 한편, 이들 결과는 I53-50A 삼량체에의 유전적 융합이 DS-Cav1의 예비융합 형태를 추가로 안정화시킴을 나타내고, 이러한 증가된 안정성은 조립된 나노구조 면역원의 맥락에서 유지됨을 시사한다.
본 발명자들은 물리적 안정성을 평가하기 위한 제2, 항체-독립적 기법으로서 내재적 트립토판 형광에 의해 모니터링되는 구아니딘 하이드로클로라이드(GdnHCl)에서의 화학적 변성을 사용하였다. 0 내지 6.5 M GdnHCl에서 인큐베이션된 DS-Cav1로부터의 형광 방출의 분석은, 단백질이 2개의 미묘하게 구별되는 전이를 수행하고, 하나의 전이는 0.25 M과 2.25 M GdnHCl 사이에 존재하고 또 다른 전이는 2.25 M과 5.75 M 사이에 존재함을 드러내었다(도 11a 내지 도 11j). 대조적으로, 유일한 단일 전이는 2.25 M과 6.25 M GdnHCl 사이에서 발생하므로 삼량체성 DS-Cav1-I53-50A에 대해 명백하다(도 11a 내지 도 11j). DS-Cav1에 대해 관찰된 더 낮은 [GdnHCl]에서의 전이가 삼량체성 DS-Cav1-I53-50A로부터 부재하거나 단순히 더 높은 [GdnHCl]로 이동되는지는 현재로서 불분명하다. 그러나, DS-Cav1의 네이티브 형태는 삼량체성 I53-50A에의 유전적 융합에 의해 안정화된다는 것은 분명하여, 열적 스트레스 후 D25 결합을 측정함으로써 수득된 결과를 비춘다. DS-Cav1-I53-50 나노구조 및 I53-50 나노구조 단독(융합된 DS-Cav1이 결여됨)에 대한 데이터의 비교는, 정20면체 나노구조로의 조립 시 안정화가 유지됨을 나타내었다(도 11a 내지 도 11j). 이러한 효과의 근원은 I53-50A 삼량체의 극도의 안정성인 것 같다. I53-50A는 초호열성(hyperthermophilic) 박테리아 티. 마리티마(T. maritima)의 KDPG 알돌라제로부터 유도되고, 단지 매우 높은(≥5.75 M) GdnHCl 농도에서 형광 변화를 나타내기 시작하였다(도 11a 내지 도 11j).
본 발명자들은 GS 반복체(repeat)의 수 및 안정화 도메인, 예컨대 폴돈 모이어티에 대한 필요성을 평가하기 위해 첨가 작제물을 제조하였다.
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> RSV_F-10 (SEQ ID NO: 108)
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> RSV_F-11 (SEQ ID NO: 109)
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> RSV_F-12 (SEQ ID NO: 110)
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> RSV_F-13 (SEQ ID NO: 111)
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> RSV_F-14 (SEQ ID NO: 112)
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> RSV_F-15 (SEQ ID NO: 113)
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연구는 소규모의 일시적 형질감염에서의 발현 수율에 기초하였다. 관련 작제물을 발현할 수 있는 플라스미드를 NEB 5α 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시키고, LB + 카르베니실린 한천 플레이트 상에서 선별하였다. TB 배지에 박테리아 콜로니를 접종하고 다시 50 ug/mL 카르베니실린으로 선별함으로써 1 mL 배양물을 제조하였다. Qiagen Mini Prep 키트를 사용하여, 이들 키트의 프로토콜에 따라 이. 콜라이 배양물로부터 플라스미드를 정제하였다. Expi293F™ 세포(ThermoFisher)를, 페니실린(100 u/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 Expi293™ 발현 배지(ThermoFisher) 내에서 8% CO2, 37℃에서 125 rpm에서 진탕하면서 배양하였다.
형질감염 하루 전에, 세포를 2E6개 세포/mL의 농도로 접종하였다. 형질감염일에, 세포를 트립판 블루를 이용하는 Countess II(ThermoFisher)에 의해 카운팅하여, 세포 생존력을 결정하였다. 세포 농도를 2.5E6개 세포/mL까지 조정하고, 세포를 비처리된 12-웰 플레이트(Corning) 내로 1 mL 부피로 평판배양하였다. 각각의 웰 당 1 μg의 DNA 플라스미드를 Expifectamine™(ThermoFisher)을 제조업체의 설명에 따라 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 18시간째에, ThermoFisher's Expifectamine™ 형질감염 키트의 구성성분인 인핸서를 첨가하였다. 형질감염-후 5일째에 1 mL 배양물을 수합하고, 세포를 1,500xg, 4℃에서 5분 동안 원심분리에 의해 상층액으로부터 펠렛화하였다. PVDF 막이 있는 0.45 μM 필터를 통해 상층액을 여과하였다.
DS-Cav1-I53-50A 작제물을 함유하는 여과된 상층액을 10분 동안 2-머캅토에탄올과 함께 2x Laemmli 완충제에서 95℃에서 10분 동안 변성시키고 가열하였다. SDS-PAGE는 샘플 분획을 분리하였으며, 이를 니트로셀룰로스 막으로 이전시키고 팔리비주맙, 뒤이어 HRP에 공액된 항-인간 2차 항체로 프로브하였다. Clarity Western ECL 블로팅 기질(Bio-Rad)을 사용하여 블롯을 이미지화하였다.
DS-Cav1-I53-50A 작제물을 함유하는 여과된 상층액을 2-배 희석 시리즈에서 Nunc MaxiSorp 96-웰 플레이트에 결합시켰다. 예비융합 형태-특이적 항체 D25를 사용하여, DS-Cav1-I53-50A, 뒤이어 HRP에 공액된 2차 항-인간 항체를 검출하였다. 기질 TMB를 통해 단백질 수율을 비색적으로(colorimetrically) 결정하고, 흡광도를 450 nm에서 수집하였다.
예비융합-특이적 mAb D25(데이터는 제시되지 않음)의 발현 수율 및 결합은, 모든 작제물이 양호하게 발현되고 예비융합 형태에 존재함을 나타낸다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이종성 삼량체화 도메인(예를 들어, 폴돈)은 전형적으로, 예비융합 F 작제물의 적절한 발현 및 접힘에 필요하다. 본 발명자들의 결과는, I53-50A 나노구조 구성성분이 폴돈과 같은 삼량체화 도메인의 사용 없이 DS-Cav1의 발현 및 적절한 접힘을 지지할 수 있음을 나타낸다. 이들 작제물에의 D25의 결합은, 이들이 항원적으로 온전하고, DS-Cav1-폴돈-I53-50 융합 폴리펩타이드를 포함하는 나노구조와 유사하게, 중화 항체를 포함하여 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 예상될 것임을 시사한다.
9.2. 실시예 2: 사이토메갈로바이러스 (CMV)
CMV용 단백질계 백신은 예를 들어, 미국 특허 공보 제US 2016/0159864 A1호 및 제US 2017/0369532 A1호; 국제 특허 공보 제WO 2016/092460 A3호; 및 문헌[Kirchmeier 등 Enveloped virus-like particle expression of human cytomegalovirus glycoprotein B antigen induces antibodies with potent and broad neutralizing activity. Clin Vaccine Immunol. 2014; 21(2):174-80]에 기재되어 있다. gB의 동종삼량체 복합체, 삼량체성 gH/gL/gO 복합체, 또는 오량체성 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A 복합체는 CMV 백신화를 위한 3 가지 주요 표적인 것으로 간주된다.
이들 표적 중 제1 표적인 gB는 몇몇 소수성 표면을 포함하는 삼량체성 구조를 형성한다. gB의 세포외 도메인의 C 말단은 막관통 영역에 근접해 있고, 분자의 3-겹 축 근처에 놓인다. 문헌[Chandramouli 등 Structure of HCMV glycoprotein B in the postfusion conformation bound to a neutralizing human antibody. Nat Commun. 2015 Sep 14;6:8176]을 참조한다. 링커에 대한 gB의 막관통 영역의 치환에 의해, CMV의 gB 단백질은 나노구조의 3-겹 축에서 또는 3-겹 축 부근에서 유리 N 말단을 갖는 나노구조에 N-말단적으로 연결된다. 결과적인 나노구조는 이의 표면 상에 gB 삼량체의 20개 카피를 표시하고, CMV gB에 대한 면역 반응을 효과적으로 유발한다. 국제 특허 공보 제WO 2016/092460 A3호에 기재된 바와 같은 gB 단백질에의 돌연변이는 나노구조-기초 백신의 용해성 및 면역원성을 향상시킨다.
이들 표적 중 제2 표적인 삼량체성 gH/gL/gO 복합체, 및 이들 표적 중 제3 표적인 오량체성 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A는 gO 또는 pUL128/pUL130/pUL131A과 함께 외피 당단백질 gH/gL의 상호 배타적인 상호작용에 의해 형성된다. 문헌[Ciferri 등 Structural and biochemical studies of HCMV gH/gL/gO and Pentamer reveal mutually exclusive cell entry complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 1767-1772 (2015)]를 참조한다. gH 구성성분은 섬유아세포와 내피/상피 세포 둘 다의 감염을 중화시키는 항체에 의해 표적화된다. UL 영역은 상피 세포 및 내피 세포 감염의 강력한 중화 항체에 대한 결합 부위를 함유한다.
gH 구성성분은 나노구조 폴리펩타이드에의 유전자 융합으로서 발현되고, gL/gO 또는 gL/pUL128/pUL130/pUL131A는 공동-발현된다. 발현된 단백질은 gH/gL/gO 또는 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A 나노구조-기초 백신으로 각각 자가-조립된다. 나노구조의 발현 및 올바른 접힘은 MSL-109 항체 또는 이의 Fab 단편을 상기 나노구조에 결합함으로써 평가된다. 오량체성 복합체의 올바른 접힘 및 항원성은 문헌[Chandramouli 등 Structural basis for potent antibody-mediated neutralization of human cytomegalovirus Sci. Immunol. 2, eaan1457 (2017)]에 기재된 항체 및 Fab 단편을 사용하여 평가된다.
9.3. 실시예 3: 엡스타인-바 바이러스 (EBV)
엡스타인-바 바이러스(EBV)는 주요 세계적인 건강 문제를 나타낸다. 세계적으로 매년 전염성 단핵구증(infectious mononucleosis) 및 약 200,000 사례의 암이 연관되어 있으나, 백신은 이용 가능하지 않다. 면역력의 주요 표적은 보체 수용체 2(CR2/CD21)를 통해 B 세포에의 부착을 매개하는 EBV 당단백질 350/220(gp350)이다. 문헌[Kanekiyo 등 Rational Design of an Epstein-Barr Virus Vaccine Targeting the Receptor-Binding Site. Cell 162(5):1090-1100 (2015)]를 참조한다. gp350 엑토도메인 또는 gp350의 D123 단편은 N-말단 또는 C-말단 융합으로서 나노구조 폴리펩타이드에의 유전자 융합으로서 발현된다. 결과적인 유전자 융합은 발현되며, 조립되고, 나노구조-기초 백신으로 제제화된다. 항원성은 모노클로날 항체 72A1 및 2L10을 사용하여 결정된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Washington King, Neil Baker, David Stewart, Lance <120> SELF-ASSSEMBLING NANOSTRUCTURE VACCINES <130> IPA201220-US <150> US 62/724,721 <151> 2018-08-30 <150> US 62/636,757 <151> 2018-02-28 <160> 113 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 1 Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr 20 25 30 Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr 35 40 45 Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu 50 55 60 Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu 65 70 75 80 Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val 85 90 95 Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu 100 105 110 Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu 115 120 125 Lys Phe Phe Pro 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nanostructure polypeptide <400> 50 Met Pro Val Ile Gln Thr Phe Val Ser Thr Pro Leu Asp His His Lys 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Ala Ile Ile Tyr Arg Ile Val Thr Arg Val Val Leu 20 25 30 Gly Lys Pro Glu Asp Leu Val Met Met Thr Phe His Asp Ser Thr Pro 35 40 45 Met His Phe Phe Gly Ser Thr Asp Pro Val Ala Cys Val Arg Val Glu 50 55 60 Ala Leu Gly Gly Tyr Gly Pro Ser Glu Pro Glu Lys Val Thr Ser Ile 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Ile Thr Ala Val Cys Gly Ile Val Ala Asp Arg Ile 85 90 95 Phe Val Leu Tyr Phe Ser Pro Leu His Cys Gly Trp Asn Gly Thr Asn 100 105 110 Phe <210> 51 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed nanostructure polypeptide <400> 51 Met Glu Glu Val Val Leu Ile Thr Val Pro Ser Ala Leu Val Ala Val 1 5 10 15 Lys Ile Ala His Ala Leu Val Glu Glu Arg Leu Ala Ala Cys Val Asn 20 25 30 Ile Val Pro Gly Leu Thr Ser Ile Tyr Arg Glu Glu Gly Ser Val Val 35 40 45 Ser Asp His Glu Leu Leu Leu Leu Val Lys Thr Thr Thr Asp Ala Phe 50 55 60 Pro Lys Leu Lys Glu 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syncytial virus type A <400> 56 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Asn Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 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Tyr Met Pro Gly Val 580 585 590 Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile 595 600 605 Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala 610 615 620 Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val 625 630 635 640 Asn Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val 645 650 655 Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu 660 665 670 Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 675 680 685 <210> 111 <211> 680 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F-13 DS-Cav1-foldon-10GS-HelExt-50A <400> 111 Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile 20 25 30 Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp 35 40 45 Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala 50 55 60 Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn 65 70 75 80 Arg Ala Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile 85 90 95 Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val 100 105 110 Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser 115 120 125 Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys 130 135 140 Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn 165 170 175 Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr 180 185 190 Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn 210 215 220 Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile 225 230 235 240 Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val 245 250 255 Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr 260 265 270 Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly 275 280 285 Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu 290 295 300 Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser 305 310 315 320 Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn 325 330 335 Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser 340 345 350 Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr 355 360 365 Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser 370 375 380 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 385 390 395 400 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 405 410 415 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro 420 425 430 Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn 435 440 445 Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Gly Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu 465 470 475 480 Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val 485 490 495 Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His 500 505 510 Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys 515 520 525 Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr 530 535 540 Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu 545 550 555 560 Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Cys Lys 565 570 575 Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu 580 585 590 Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly 595 600 605 Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro 610 615 620 Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys 625 630 635 640 Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu 645 650 655 Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val 660 665 670 Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 675 680 <210> 112 <211> 712 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV_F-14 DS-Cav1-foldon-15GS-HelExt-50A <400> 112 Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile 20 25 30 Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp 35 40 45 Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala 50 55 60 Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn 65 70 75 80 Arg Ala Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile 85 90 95 Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val 100 105 110 Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser 115 120 125 Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys 130 135 140 Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn 165 170 175 Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr 180 185 190 Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn 210 215 220 Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile 225 230 235 240 Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val 245 250 255 Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr 260 265 270 Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly 275 280 285 Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu 290 295 300 Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser 305 310 315 320 Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn 325 330 335 Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser 340 345 350 Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr 355 360 365 Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser 370 375 380 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 385 390 395 400 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 405 410 415 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro 420 425 430 Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn 435 440 445 Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp 450 455 460 Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr 465 470 475 480 Phe Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 485 490 495 Gly Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu 500 505 510 Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val 515 520 525 Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His 530 535 540 Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys 545 550 555 560 Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr 565 570 575 Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu 580 585 590 Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Cys Lys 595 600 605 Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu 610 615 620 Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly 625 630 635 640 Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro 645 650 655 Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys 660 665 670 Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu 675 680 685 Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val 690 695 700 Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 705 710 <210> 113 <211> 717 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F-15 DS-Cav1-foldon-20GS-HelExt-50A <400> 113 Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile 20 25 30 Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp 35 40 45 Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala 50 55 60 Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn 65 70 75 80 Arg Ala Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile 85 90 95 Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val 100 105 110 Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser 115 120 125 Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys 130 135 140 Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn 165 170 175 Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr 180 185 190 Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn 210 215 220 Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile 225 230 235 240 Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val 245 250 255 Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr 260 265 270 Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly 275 280 285 Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu 290 295 300 Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser 305 310 315 320 Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn 325 330 335 Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser 340 345 350 Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr 355 360 365 Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser 370 375 380 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 385 390 395 400 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 405 410 415 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro 420 425 430 Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn 435 440 445 Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp 450 455 460 Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr 465 470 475 480 Phe Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 485 490 495 Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala 500 505 510 Arg Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 515 520 525 Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 530 535 540 Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 545 550 555 560 Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 565 570 575 Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 580 585 590 Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 595 600 605 Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 610 615 620 Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu 625 630 635 640 Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 645 650 655 Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 660 665 670 Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 675 680 685 Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 690 695 700 Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 705 710 715

Claims (43)

  1. 제1 복수의 폴리펩타이드를 포함하는 나노구조로서, 여기서,
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 대칭 오퍼레이터(symmetry operator)에 따라 배열되며;
    상기 나노구조는 제1 복수의 항원을 포함하며;
    각각의 상기 제1 복수의 항원은 근위 단부(proximal end) 및 원위 단부(distal end)를 갖고;
    상기 항원의 근위 단부는 각각 상기 제1 복수의 폴리펩타이드의 구성원(member)에 부착되는, 나노구조.
  2. 제1항에 있어서, 제2 복수의 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 복수의 폴리펩타이드는 상기 제1 복수의 폴리펩타이드에 부착되는, 나노구조.
  3. 제1항에 있어서, 제2 복수의 항원을 추가로 포함하는, 나노구조.
  4. 제1항에 있어서, 제2 복수의 항원을 추가로 포함하며, 여기서,
    각각의 제2 복수의 제2 항원은 근위 단부 및 원위 단부를 갖고,
    상기 제2 항원의 근위 단부는 각각 상기 제2 복수의 폴리펩타이드의 구성원에 부착되는, 나노구조.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원의 근위 단부는 상기 항원의 N 말단인, 나노구조.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원의 근위 단부는 상기 항원의 C 말단인, 나노구조.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 항원은 복수의 항원성 단백질 또는 이의 항원 단편인, 나노구조.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 SEQ ID NO: 52-56, 59-85,88 및 90-113의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로부터 선택되는, 나노구조.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 SEQ ID NO: 52-56, 59-85, 88 및 90-113으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 적어도 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 동일한 것인, 나노구조.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항원성 단백질은,
    a) HIV Env,
    b) RSV F,
    c) EBV gp350,
    d) CMV gB,
    e) CMV UL128,
    f) CMV UL130,
    g) CMV UL131A,
    h) CMV gH,
    i) CMV gL,
    j) 라임 OspA,
    k) 백일해 독소,
    l) 뎅기 E,
    m) SARS S,
    n) MERS S,
    o) 자이르 에볼라바이러스 GP,
    p) 수단 에볼라바이러스 GP,
    q) 마버그 바이러스 GP,
    r) 한타 바이러스 Gn,
    s) 한타 바이러스 Gc,
    t) HepB 표면 항원,
    u) 홍역 H,
    v) 지카 외피 도메인 III,
    w) 말라리아 CSP,
    x) 말라리아 Pfs25,
    y) 니파 바이러스 F,
    z) 니파 바이러스 G,
    aa) 로타바이러스 VP4,
    bb) 로타바이러스 VP8*,
    cc) hMPV F,
    dd) hMPV G,
    ee) PV F,
    ff) PV HN,
    gg) MenB fHbp,
    hh) MenB NadA, 및
    ii) MenB NHBA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노구조.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 복수의 항원은 표적 에피토프를 포함하고, 상기 나노구조는 표적 에피토프를 표시하도록 구성되는, 나노구조.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 에피토프는 항체에 접근 가능한 것인, 나노구조.
  13. 제11항에 있어서, 상기 나노구조는 제1 복수의 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유발하도록 구성되고, 상기 면역 반응은 표적 에피토프에 대해 우선적으로 지향되는, 나노구조.
  14. 제11항에 있어서, 상기 표적 에피토프는 보존되는 것인, 나노구조.
  15. 제11항에 있어서, 상기 표적 에피토프는 중화 항체에 대한 에피토프인, 나노구조.
  16. 제11항에 있어서, 상기 표적 에피토프는 교차-반응성 항체에 대한 에피토프인, 나노구조.
  17. 제11항에 있어서, 상기 표적 에피토프는 광범위-중화 항체(broadly-neutralizing antibody)에 대한 에피토프인, 나노구조.
  18. 제1항에 있어서, 상기 복수의 항원은 계면-안정화 돌연변이(interface-stabilizing mutation), 이황화 결합을 초래하도록 구성된 상보적 시스테인 돌연변이, 루프의 결실, N-연결 글리코실화 부위의 첨가, N-연결 글리코실화 부위의 제거, 에피토프-파괴 돌연변이 및 에피토프-생성 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 나노구조.
  19. 제1항에 있어서, 상기 복수의 항원은 항원성 올리고당을 포함하는, 나노구조.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 나노구조를 포함하는 백신으로서, 상기 백신은 감염성 병원체(infectious agents)에 대한 중화 항체 반응을 유발할 수 있는, 백신.
  21. 제20항에 있어서, 상기 중화 항체 반응은 감염성 병원체에 의한 감염에 대해 보호적인 것인, 백신.
  22. 제20항에 있어서, 상기 중화 항체 반응은 다양한 계통(strain)의 감염성 병원체에 대해 광범위-중화적인 것인, 백신.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 감염성 병원체는 라임병, 백일해, 헤르페스바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 수막구균 및 말라리아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 감염성 병원체는,
    a) HIV,
    b) RSV,
    c) EBV,
    d) CMV,
    e) 뎅기,
    f) 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스,
    g) 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스,
    h) 에볼라 바이러스,
    i) 마버그 바이러스,
    j) 한타 바이러스,
    k) B형 간염,
    l) HPV,
    m) 홍역,
    n) 니파 바이러스,
    o) 로타바이러스,
    p) 메타뉴모 바이러스, 및
    q) 지카로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스인, 백신.
  25. 제20항에 있어서, 상기 감염성 병원체는 라임병 또는 백일해인, 백신.
  26. 제20항에 있어서, 상기 감염성 병원체는 말라리아인, 백신.
  27. 대상체에서 감염성 병원체에 대한 면역력을 생성시키는 방법으로서, 상기 방법은 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 아쥬반트를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 백신을 반복적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 제2 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 백신은 나노입자계 백신, 단백질계 백신, 생백신, 약독화 생백신, 전병원체(whole germ) 백신, DNA 백신 또는 RNA 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 백신은 프라임(prime)이고, 상기 제2 백신은 부스트(boost)인, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제2 백신은 프라임이고, 상기 제1 백신은 부스트인, 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 지향성 친화도 성숙(directed affinity maturation)을 유도하는, 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 광범위-중화 면역 반응을 초래하는, 방법.
  35. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항의 백신을 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 시험관내 조립에 의해 제1항의 나노구조를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계,
    제2 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 항원을 발현시키는 단계,
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드를 정제하는 단계,
    상기 제1 복수의 항원을 정제하는 단계, 및
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드 및 상기 제1 복수의 항원을 혼합하는 단계;
    이로써 나노구조를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 시험관내 조립에 의해 제2항의 나노구조를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계,
    제2 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 항원을 발현시키는 단계,
    제3 재조합 발현 시스템에서 제2 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계,
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드를 정제하는 단계,
    상기 제1 복수의 항원을 정제하는 단계,
    상기 제2 복수의 폴리펩타이드를 정제하는 단계, 및
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드, 상기 제1 복수의 항원 및 상기 제2 복수의 폴리펩타이드를 혼합하는 단계;
    이로써 나노구조를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 제1 재조합 발현 시스템 및 상기 제2 재조합 발현 시스템은 동일하고,
    상기 제1 복수의 폴리펩타이드 및 상기 제1 복수의 항원은 함께 정제되는, 방법.
  39. 공동-발현에 의해 제1항의 나노구조를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    단일 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드 및 제1 복수의 항원을 발현시키는 단계,
    이로써 나노구조를 생성시키는 단계, 및
    상기 나노구조를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 공동-발현에 의해 제2항의 나노구조를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    단일 재조합 발현 시스템에서 제1 복수의 폴리펩타이드, 제1 복수의 항원, 및 제2 복수의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계,
    이로써 나노구조를 생성시키는 단계, 및
    상기 나노구조를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복수의 폴리펩타이드 및 상기 제1 복수의 항원은 단일 개방형 리딩프레임(reading frame)에 의해 인코딩되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 단일 개방형 리딩프레임은 상기 폴리펩타이드와 상기 항원의 융합 단백질을 인코딩하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 단일 개방형 리딩프레임은 자가-절단형 펩타이드를 인코딩하는, 방법.
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