JP2000152791A - ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ - Google Patents

ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ

Info

Publication number
JP2000152791A
JP2000152791A JP10336558A JP33655898A JP2000152791A JP 2000152791 A JP2000152791 A JP 2000152791A JP 10336558 A JP10336558 A JP 10336558A JP 33655898 A JP33655898 A JP 33655898A JP 2000152791 A JP2000152791 A JP 2000152791A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
enzyme
host cell
acid fragment
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP10336558A
Other languages
English (en)
Inventor
Beiko Viitanen Paul
ポール・ベイコ・ビータネン
Brian Jordan Douglas
ダグラス・ブライアン・ジヨーダン
Only Bakotto Karen
カレン・オンリー・バコツト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Priority to JP10336558A priority Critical patent/JP2000152791A/ja
Priority to EP98310187A priority patent/EP1010760A1/en
Publication of JP2000152791A publication Critical patent/JP2000152791A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物及び菌類のリボフラビン生合成経路の最
終的および最後から２番目の酵素すなわちルマジンシン
ターゼ（ＬＳ）およびリボフラビンシンターゼ（ＲＳ）
の提供。 【解決手段】 ＬＳタンパク質をコードする植物もしく
は真菌からの核酸断片、ＲＳタンパク質をコードする植
物もしくは真菌からの核酸断片、センスもしくはアンチ
センスの向きのＬＳの全部もしくは一部をコードするキ
メラ遺伝子、該キメラ遺伝子を用いる植物もしくは真菌
のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素の活性を
阻害する化合物の能力を評価方法、ならびに除草剤もし
くは殺真菌剤の候補を同定するためのインビボおよびイ
ンビトロの方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術的分野】本発明は植物および真菌の
分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、
植物もしくは真菌のリボフラビン生合成経路に関与する
タンパク質をコードする核酸断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】リボフラビンすなわちビタミンＢ2は、
水素化物、酸素および電子伝達反応を媒介する多数の主
流の代謝酵素に不可欠な補因子、フラビンモノヌクレオ
チド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド
（ＦＡＤ）の前駆体である。リボフラビン依存性酵素
は、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナ
ーゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+オキシドレダクター
ゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ複合体を包含する。結果として、脂肪酸
酸化、ＴＣＡ回路、ミトコンドリア電子伝達、光合成お
よび多数の他の細胞過程は、決定的に、補欠分子族とし
てＦＭＮもしくはＦＡＤのいずれかに依存性である。他
の注目すべきフラボタンパク質(flavoproteins)は、グ
ルタチオンレダクターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、
Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、スクアレンエポキシダ
ーゼ、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼおよびα−グ
リセロリン酸デヒドロゲナーゼを包含する。大腸菌(E.
coli)（リヒター(Richter)ら、J. Bacteriol. 174:4050
-4056(1992)）およびＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)
（サントス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1
995)）におけるリボフラビン生合成の遺伝子的崩壊(dis
ruption)は、リボフラビン補充によってのみ克服される
致死的表現型をもたらす。これは、リボフラビン欠乏で
発生するとみられる有害な多面発現性効果の全体的効果
(ensemble)を考慮すれば驚くべきことではない。
【０００３】リボフラビンは、植物ならびに細菌および
真菌を包含する多数の微生物により合成される（バッハ
ー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemistry of Flav
oproteins（ミュラー(Muiller, F.)編）、Vol.I、pp.21
5-259、ケミカル ラバーカンパニー(Chemical Rubber
Co.）、フロリダ州ボカレイトン(1990)）。鳥類、哺乳
動物および他の高等生物体はこのビタミンを合成するこ
とが不可能であり、そして、代わりに、それらの代謝的
欲求に合致させるのにその食餌摂取に頼るため、リボフ
ラビン生合成の原因である酵素は、将来の抗生物質、抗
真菌剤および除草剤の潜在的標的である。さらに、遠く
関連する植物および微生物の酵素が、強力な微生物特異
的阻害剤の開発において活用され得るという明瞭な特徴
を有することが可能である。かように、例えば植物から
のリボフラビン生合成酵素（１種もしくは複数）の構
造、機構、力学および基質結合特性の詳細な理解は、除
草剤として有用でありうる化合物の合理的設計の出発点
として役に立つであろう。真正の植物タンパク質（１種
もしくは複数）を手中に有することもまた、リボフラビ
ン生合成阻害剤の探究における化学物質のライブラリー
のインビトロスクリーニングのための価値ある道具を提
供するとみられる。
【０００４】細菌および真菌のリボフラビン生合成は40
年以上も集中的に研究されている（最近の総説について
は、バッハー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemist
ry of Flavoproteins（ミュラー(Muiller, F.)編）、Vo
l.I、pp.215-259および293-316、ケミカル ラバー カ
ンパニー(Chemical Rubber Co.）、フロリダ州ボカレイ
トン(1990)を参照）。この合成経路は７種の別個の酵素
触媒反応から成り、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴ
Ｐ）およびリブロース５−リン酸が最終的前駆体であ
る。リボフラビン生合成の第二および第三段階は細菌お
よび真菌において反対の順序で存在する一方、残存する
経路の中間体は双方の微生物において同一である。構造
的および機構的には、当該経路中の最後の２反応、すな
わち６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンシンター
ゼ（ＬＳ）およびリボフラビンシンターゼ（ＲＳ）によ
り触媒されるものが最もよく特徴づけられている。枯草
菌(B.subtilis)においては、これら２酵素は、約１MDa
の組み合わされた分子集団を伴う巨大球形粒子中で相互
に物理的に連合し（バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Che
m. 255:632-637(1980)；リツェルト(Ritsert)ら、J. Mo
l. Biol. 253、151-167(1995)；バッハー(Bacher)ら、B
iochem. Soc. Trans. 24(1):89-94(1996)）；二機能性
タンパク質複合体のＸ線構造は3.3オングストローム分
解能で決定されている（ラーデンシュタイン(Ladenstei
n)ら、J. Mol. Biol. 203:1045-1070）。ＬＳ／ＲＳ複
合体は中空の二十面体キャプシドを形成する12個の五量
体に組織化される60個のＬＳサブユニットから成る。単
一分子のＲＳすなわち３個の同一サブユニットの三量体
がこの構造の中央核中に閉じ込められて存する。力学的
研究は、この複合体内の２種の酵素の区画化が、おそら
く「基質チャネリング(substrate channeling)」を介し
て低基質濃度でのリボフラビン産生の全体的触媒効率を
向上させることを示す（キス(Kis)ら、J. Biol. Chem.
270:16788-16795(1995)）。二機能性ＬＳ／ＲＳ複合体
は他の微生物で観察されていないとは言え、最近、天然
の大腸菌(E. coli)ＬＳもまた60個の同一サブユニット
の中空の二十面体キャプシドとしてインビボで存在する
ことが示された（メルトル(Moertl)ら、J. Biol. Chem.
271:33201-33207(1996)）。
【０００５】リボフラビン生合成の終わりから２番目の
酵素ＬＳは、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−
リン酸の４−リビチルアミノ−５−アミノ−２，６−ジ
ヒドロキシピリミジン（ＲＡＡＤＰ）との縮合を触媒し
て、オルトリン酸および６，７−ジメチル−８−（１’
−Ｄ−リビチル）ルマジン（ＤＭＲＬ）のそれぞれ１モ
ルを生じる。後者はリボフラビンの直接の前駆体であ
る。ＬＳをコードする遺伝子は、大腸菌(E. coli)（タ
ウラ(Taura)ら、Mol. Gen. Genet. 234:429-432(199
2)）、Ａ．プリューロニューモニエ(A. pleuroneumonia
e)（フラー(Fuller)ら、J. Bacteriol. 177:7265-7270
(1995)）、Ｐ．ホスホレウム(P. phosphoreum)（リー(L
ee)ら、J. Bacteriol. 176:2100-2104(1994)、枯草菌
(B. subtilis)（ミロノフ(Mironov)ら、Dokl. Akad. Na
uk SSSR 305:482-487(1989)）、およびＳ．セレビシエ
(S. cerevisiae)（ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramire
z)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995)）を包含
する多数の微生物からクローニングされている。全ての
場合において、ＬＳ遺伝子産物のサブユニットの分子質
量(molecular mass)は小さく、大きさは約16〜17kDaの
範囲にわたる。多様なＬＳ相同物は全て共通にある構造
的特徴を共有する一方、一次アミノ酸配列レベルでのそ
れらの全体的相同性はむしろ乏しい。例えば、ジェネテ
ィクス コンピュータグループ ギャップ プログラム
(Genetics Computer Group Gap program)（ウィスコン
シン パッケージ バージョン9.0、ジェネティクス
コンピュータグループ(Genetics Computer Group)（Ｇ
ＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）で決定されるよ
うに、大腸菌(E. coli)ＬＳは、それぞれ、Ａ．プリュ
ーロニューモニエ(A. pleuroneumoniae)、Ｐ．ホスホレ
ウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)の相同タンパク質と58
％、65％、53％および36％のみ同一である。実際のとこ
ろ、これら５種のタンパク質の対での比較は、２種の最
も類似の相同物が72％の同一性のみを共有することを示
す。
【０００６】リボフラビン生合成の最終段階はＲＳによ
り媒介される。この酵素は２分子のＤＭＲＬの不均化を
触媒して１モルのリボフラビンおよびＲＡＡＤＰを生じ
る。後者の産物はまたＬＳの基質の１種でもあるという
ことが、上に示された枯草菌(B. subtilis)ＬＳ／ＲＳ
複合体の高められた触媒効率を部分的に説明する。ＲＳ
の結晶構造は決定されるべきままであるとは言え、天然
の細菌（バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632
-637(1980)）および真菌（サントス(Santos)ら、J. Bio
l. Chem. 270:437-444(1995)）のタンパク質は三量体で
あり、それぞれ３個の同一の約25kDaのサブユニットか
ら成ることが推測される。今日までに、ＲＳは約12種の
微生物からクローニングされているのみであり、また、
検査されている種の全てはそれらのＮ末端およびＣ末端
ドメインに著明な内部相同性を表す（ショト(Schott)
ら、J. Biol. Chem. 265:4204-4209(1990)；サントス(S
antos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1995)）。これ
らの観察結果を基礎として、ＲＳプロモーターの２個の
半分が遺伝子重複により生じていること、および、それ
ぞれがＤＭＲＬの基質結合部位を含有することが示唆さ
れている。しかしながら、この構造的類似性にもかかわ
らず、多様なＲＳタンパク質の全体的配列相同性は極め
て制限される。かように、大腸菌(E. coli)ＲＳタンパ
ク質は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)、Ｐ．ホスホ
レウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
Ｐ．レイオグナチ(P. leiognathi)におけるその対照物
に32％、36％、35％および31％のみ同一であり；後者の
４種のタンパク質のジェンバンク(GenBank)受託番号は
それぞれＺ２１６２１、Ｌ１１３９１、Ｘ５１５１０お
よびＭ９００９４である。
【０００７】リボフラビン生合成の最初に掛かり合った
酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼIIを除いて、事実上、高
等植物のリボフラビン生合成装置について何も知られて
いない。このタンパク質の遺伝子は、最近、アラビドプ
シスのｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた
（コバヤシ(Kobayashi)ら、Gene 160:303-304(199
5)）。クローニングされた植物遺伝子のタンパク質配列
は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、Ｐ．レイ
オグナチ(P. leiognathi)およびＰ．ホスホレウム(P. p
hosporeum)からの相同タンパク質に37〜58％のみ同一で
ある。完全長のｃＤＮＡ配列はいかなる他の植物のリボ
フラビン生合成酵素についても報告されていない一方、
ジェンバンク(GenBank)データベースは、植物ＬＳ遺伝
子に潜在的に対応する２種のＥＳＴｓ（発現された配列
標識(Expressed Sequence Tag)）を含有する。これらの
一方はトウゴマからでありかつ他者はアラビドプシスか
らである。
【０００８】トウゴマのｃＤＮＡクローン（ジェンバン
ク(GenBank)受託番号Ｔ１５１５２；ファン・デ・ルー
(van de Loo)ら、Plant Physiol. 108:1141-1150(199
5)）はその５’端で短くされ、そして、最低60個のＮ末
端アミノ酸残基に対応するＤＮＡを喪失している。アラ
ビドプシスのｃＤＮＡクローン（ジェンバンク(GenBan
k)受託番号Ｚ３４２３３；直接提出）は、国立バイオテ
クノロジー情報センター(National Center for Biotech
nology Information)（ＮＣＢＩ）により提供されたＴ
ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（基本
的局所的整列検索ツール(Basic Local Alignment Searc
h Tool)；アルチュール(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 2
15:403-410(1990)）検索により同定された。ＢＬＡＳＴ
検索について疑問の配列は翻訳された大腸菌(E. coli)
ＬＳ遺伝子（ジェンバンク(GenBank)受託番号Ｘ６４３
９５）であり、また、アラビドプシスのＥＳＴに対する
類似性の確率スコアはＰ＝0.45であった。不幸なこと
に、配列決定されたｃＤＮＡ挿入物の部分はこのタンパ
ク質の最後の26個のＣ末端アミノ酸残基のみを含有し、
そのため、それが部分的ｃＤＮＡクローンか完全長ｃＤ
ＮＡクローンかは未知である。これらのクローンのいず
れもポリＡ末端(tail)を保有しないため、それらがｃＤ
ＮＡライブラリーの調製の間の何れかの点で導入され
た、汚染する微生物ＤＮＡを反映するということが可能
である。
【０００９】ＬＳとは対照的に、ＢＬＡＳＴ検索は、大
腸菌(E. coli)もしくは酵母のいずれかのＲＳに対する
有意の一次アミノ酸配列相同性でジェンバンク(GenBan
k)データベース中のいずれかの植物ＤＮＡ配列を同定す
ることに失敗した。しかしながら、ＲＳ活性は多様な植
物種からの抽出物で検出されており（プロート(Plaut,
G.)、Metabolic Pathways（グリーンバーグ(Greenberg,
D.M.)編）、vol II、p.673、アカデミックプレス(Acad
emic Press)、ニューヨーク(1961)）、また、ホウレン
ソウ相同物の部分的精製が記述されている（ミツダ(Mit
suda)ら、Methods Enzymol. 18b:539-543(1970)）。
【００１０】前述の論考から、植物のＬＳもしくはＲＳ
遺伝子／タンパク質、および、最も古典的なアプローチ
を使用していずれかの植物種からのＬＳもしくはＲＳを
コードする遺伝子の単離を可能にする既知の微生物相同
物に対するそれらの関係についてほとんど知られていな
いことが明らかである。後者は、相同的もしくは異種の
遺伝子でのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブ法(probing)、保存されたアミノ酸配列モ
チーフに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用
する目的の遺伝子のＰＣＲ増幅、および／もしくは微生
物宿主で発現されたｃＤＮＡ挿入物の免疫学的検出を包
含する。不幸なことに、これらの技術は植物のＬＳもし
くはＲＳ遺伝子の単離に非常に有用であることが期待さ
れないとみられる。なぜなら、それらは全て、同一の機
能を有する既知のタンパク質および遺伝子との有意の構
造的類似性（すなわちＤＮＡもしくはアミノ酸配列）の
存在にひどく頼っているからである。ＬＳおよびＲＳタ
ンパク質は微生物のなかでさえ双方とも非常に不十分に
保存されているという観察結果を考えれば、既知の微生
物相同物が高等植物におけるそれらの対照物と有意の構
造的類似性を共有するとみられることは高度にありそう
でない。
【００１１】高等真核生物から他の代謝経路における生
合成の遺伝子をクローニングするのに使用されている代
替のアプローチは、目的の酵素活性が不十分である微生
物突然変異体の相補による。この戦略は、崩壊された宿
主遺伝子および目的の標的遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の間の機能的類似性にのみ頼るため、同一の反
応を触媒する構造的に非類似性のタンパク質をクローニ
ングするのに理想的に適する。機能的相補のためには、
ｃＤＮＡライブラリーを、微生物宿主中でｃＤＮＡの発
現を指図し得るベクター中に構築する。このプラスミド
ライブラリーをその後、突然変異体の細菌に導入し、そ
してもはや表現型的に突然変異体でないコロニーを選択
する。実際のところ、ＬＳ（ガルシア・ラミレズ(Garci
a-Ramirez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(199
5)）および酵母のＲＳ（サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995)）ならびにアラビドプシスＧ
ＴＰシクロヒドロラーゼII（コバヤシ(Kobayashi)ら、G
ene 160:303-304(1995)）は、全て、微生物のリボフラ
ビン栄養要求体の機能的相補によりクローニングされ
た。この戦略はまた、リシン生合成（フリッシュ(Frisc
h)ら、Mol. Gen. Genet.228:287-293(1991)）、プリン
生合成（アイミ(Aimi)ら、J. Biol. Chem. 265:9011-90
14(1990)）およびトリプトファン生合成（ニヨギ(Niyog
i)ら、Plant Cell5:1011-1027(1993)）を包含する他の
代謝経路に関与する高等真核生物から遺伝子を単離する
のにも役立っており、また、グルタミンシンセターゼ
（スヌスタッド(Snustad)ら、Genetics 120:1111-1124
(1988)）、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（デ
ラウネイ(Delauney)ら、Mol. Genet. 221:299-305(199
0)）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（フリッシュ(F
risch)ら、Mol. Gen. Genet. 228:287-293(1991)）、３
−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（エレルシュ
トローム(Ellerstrom)ら、Plant Mol. Biol. 18:557-56
6(1992)）およびジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ
（ミネ(Minet)ら、Plant J. 2:417-422(1992)）を包含
する多様な植物遺伝子の単離においてもまた成功裏に使
用されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】機能的相補によるクロ
ーニングの明らかな魅力的な特徴にもかかわらず、この
アプローチが高等植物のＬＳおよびＲＳ遺伝子に適用さ
れる場合に役立たないかも知れない理由が存在する。第
一に、真核生物のｃＤＮＡ配列は、好ましいコドン使用
頻度における差異を包含する多様な理由から、突然変異
体の細菌中で十分なレベルで発現されないかも知れな
い。第二に、クローニングされた真核生物の遺伝子は、
例えば酵素活性が微生物宿主により実施されないアセチ
ル化、グリコシル化もしくはホルホリル化のような翻訳
後修飾を必要とする場合は機能的ポリペプチドを産生し
ない可能性がある。第三に、異種植物タンパク質は宿主
に致死性でありうるのでその発現を不可能にする。第四
に、真核生物のタンパク質は、折り畳みの問題、封入体
形成もしくは多様な他の理由のため、外来の微生物環境
中でその本来のコンホメーションを達成することに失敗
しうる。高等植物のＬＳおよびＲＳ酵素は、微生物宿主
に存在しない葉緑体、ミトコンドリアもしくは何らかの
他のオルガネラに翻訳後に標的化される(targeted)、核
にコードされる(nuclear-encoded)タンパク質であるこ
ともまた可能である。これが事実でありかつオルガネラ
に標的化される配列のタンパク質分解的除去が酵素活性
に必要とされる場合は、機能的相補によるこれらの遺伝
子のクローニングは可能でないであろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、リボフラビン
生合成に関与する植物もしくは真菌の酵素をコードする
単離された核酸断片に関する。とりわけ、本発明は、植
物もしくは真菌のＬＳをコードする単離された核酸断片
に関し、植物はホウレンソウ、タバコもしくはアラビド
プシスであり、また、真菌はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)である。本発明はまた、植物もしく
は真菌のＲＳをコードする単離された核酸断片にも関
し、植物はホウレンソウもしくはアラビドプシスであ
り、また、真菌はマグナポルテ グリセア(Magnaporthe
grisea)である。加えて、本発明は、植物もしくは真菌
のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素をコード
する核酸断片に相補的である核酸断片に関する。
【００１４】植物のＬＳ酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、（ａ）配列番号２、配列番号４および
配列番号６から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片；（ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類
似である単離された核酸断片；（ｃ）配列番号２、配列
番号４および配列番号６から成る群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも72％の同一性を有するポリペプチ
ドをコードする単離された核酸断片；ならびに（ｄ）
（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的である単離され
た核酸断片である。
【００１５】植物のＲＳ酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、（ａ）配列番号８および配列番号１０
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは
本質的部分をコードする単離された核酸断片；（ｂ）配
配列番号８および配列番号１０から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片；（ｃ）配列番号８および配列番号１０から成る
群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70％の同一
性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断
片；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相
補的である単離された核酸断片である。
【００１６】真菌のＲＳ酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、（ａ）配列番号１２に述べられるアミ
ノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離さ
れた核酸断片；（ｂ）配列番号１２に示されているアミ
ノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本質
的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部分
に相同である単離された核酸断片；（ｃ）（ａ）もしく
は（ｂ）に相補的である単離された核酸断片である。
【００１７】真菌のＬＳ酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、（ａ）配列番号３８に示されているア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片；（ｂ）配列番号３８に示されているア
ミノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本
質的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部
分に相同である単離された核酸断片；および（ｃ）
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸断
片である。
【００１８】別の態様において、本発明は、適する調節
配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌のＬＳ
酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素をコードするキ
メラ遺伝子、あるいは、当該酵素をコードする核酸断片
に相補的である核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子に関
し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質転換されない宿主
細胞で産生されるレベルから改変される（すなわち増加
もしくは減少される）レベルの形質転換された宿主細胞
でのコードされた酵素の産生をもたらす。
【００１９】さらなる態様において、本発明は、適する
調節配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌の
ＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素をコードす
るキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んで成る形質転換さ
れた宿主細胞に関し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質
転換された宿主細胞での植物のＬＳ酵素または植物もし
くは真菌のＲＳ酵素の改変されたレベルの産生をもたら
す。形質転換された宿主細胞は真核生物もしくは原核生
物起源のものであり得、そして高等植物および微生物由
来の細胞を包含する。本発明はまた、高等植物の形質転
換された宿主細胞およびこうした形質転換された植物由
来の種子から生じる形質転換された植物も包含する。
【００２０】本発明の付加的な一態様は、ａ）宿主細胞
を、適する調節配列に操作可能に連結された、植物もし
くは真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素
をコードするキメラ遺伝子で形質転換すること；そして
ｂ）このキメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質転
換された宿主細胞を成長させることであって、このキメ
ラ遺伝子の発現が形質転換された細胞でのＬＳもしくは
ＲＳの改変されたレベルの産生をもたらすことを含んで
成る、形質転換された宿主細胞における植物もしくは真
菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素の発現
のレベルを改変する方法に関する。
【００２１】本発明の付加的な一態様は、植物もしくは
真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
ードする核酸断片を得る方法に関する。
【００２２】加えて、（ａ）適する微生物宿主の内因性
ＬＳもしくはＲＳ遺伝子を崩壊させて微生物宿主細胞の
成長を添加されたリボフラビンに依存性とすること；
（ｂ）段階（ａ）の改変された微生物宿主細胞を、植物
もしくは真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ
酵素をコードする単離された核酸断片を含むキメラ遺伝
子であって、微生物宿主細胞中でのその発現を可能にす
る、最低１個の適する調節配列に操作可能に連結された
キメラ遺伝子で形質転換すること；（ｃ）キメラ遺伝子
すなわち植物もしくは真菌のＬＳもしくはＲＳ遺伝子の
発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換された宿主
細胞を成長させること；（ｄ）形質転換された微生物宿
主細胞を、宿主細胞が指数的に増殖している際にかつ添
加されたリボフラビンの存在および非存在の双方におい
て、十分に制御された実験により目的の化合物に接触さ
せること；（ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で
成長された場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の
成長を阻害する目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もし
くは真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素
の活性を阻害し、そしてかように作物保護化学物質とし
てはたらく化合物を除草性もしくは殺真菌性の候補と同
定するためのインビボの方法が提供される。適する単離
された核酸断片は上に述べられたものである。このイン
ビボアッセイに適する微生物宿主は、後述される大腸菌
(E. coli)のＬＳおよびＲＳのリボフラビン栄養要求体
を包含し、その双方は通常は成長のためにリボフラビン
の補充を必要とする。これらの突然変異体に導入される
機能性の植物もしくは真菌遺伝子の特異的阻害が、その
後、形質転換された宿主細胞が添加されたリボフラビン
の存在下および非存在下双方で成長される平行アッセイ
で直接評価され得る。リボフラビン補充の非存在下での
み代謝活性（成長）に影響を及ぼす阻害性化合物は潜在
的な除草剤および／もしくは殺真菌剤を表す。
【００２３】代替の態様において、（ａ）宿主細胞を、
植物もしくは真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌の
ＲＳ酵素をコードする核酸断片を含むキメラ遺伝子であ
って、最低１個の適する調節配列に操作可能に連結され
たキメラ遺伝子で形質転換すること；（ｂ）当該キメラ
遺伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換さ
れた宿主細胞を成長させて植物もしくは真菌のＬＳ酵素
または植物もしくは真菌のＲＳ酵素の産生をもたらすこ
と；（ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される植
物もしくは真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲ
Ｓ酵素を精製すること；（ｄ）この酵素を目的の化合物
と接触させること；そして（ｅ）目的の化合物の非存在
下でのそれぞれの酵素の活性に関して植物もしくは真菌
のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素の活性を
低下させる目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もしくは
真菌のＬＳ酵素または植物もしくは真菌のＲＳ酵素の活
性を阻害しそしてかように作物保護化学物質としてはた
らく化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候補と同定する
ためのインビトロ法が提供される。こうした低下された
活性は、その化合物が作物保護化学物質として潜在的に
有用であることを示す。適する単離された核酸断片は上
に述べられたものである。
【００２４】図１〜４はＧＣＧ積み重ねプログラム(GCG
Pileup program)（ジェネティクスコンピュータ グル
ープ(Genetics Computer Group)、ウィスコンシン州マ
ディソン）で生じられた一次アミノ酸配列の整列を示
す。
【００２５】図１は既知の微生物ＲＳ相同物およびクロ
ーニングされたホウレンソウＲＳ前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
【００２６】図２は既知の微生物ＬＳ相同物およびクロ
ーニングされたホウレンソウＬＳ前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
【００２７】図３はホウレンソウおよびアラビドプシス
のＲＳ前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示
す。囲まれた残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列
（例えば輸送ペプチド(transit peptide)）を示す。
【００２８】図４はホウレンソウ、タバコおよびアラビ
ドプシスのＬＳ前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の
整列を示す。囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的
化された配列（例えば輸送ペプチド）を示す。
【００２９】以下の配列の記述およびこれに付属された
配列表は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第37条§1.821〜1.825に述べら
れるような特許出願におけるヌクレオチドおよび／もし
くはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。配列
の記述は、Nucleic Acids Research 13:3021-3030(198
5)およびBiochemical Journal 219(2):345-373(1984)
（これらは引用により本明細書に組み込まれる）に記述
されたＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢの基準に従って定義される
ように、ヌクレオチド配列文字について１文字記号を、
またアミノ酸について３文字記号を含有する。本発明
は、ジェネティクスコンピュータ グループ(Genetics
Computer Group)（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディ
ソンからのウィスコンシン パッケージ バージョン9.
0ソフトウェアを利用した。
【００３０】配列番号１は成熟ホウレンソウＬＳをコー
ドするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
である。
【００３１】配列番号２は成熟ホウレンソウＬＳをコー
ドするクローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列
である。
【００３２】配列番号３は成熟タバコＬＳをコードする
クローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列であ
る。
【００３３】配列番号４は成熟タバコＬＳをコードする
クローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列であ
る。
【００３４】配列番号５は成熟アラビドプシスＬＳをコ
ードするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配
列である。
【００３５】配列番号６は成熟アラビドプシスＬＳをコ
ードするクローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸配
列である。
【００３６】配列番号７は成熟ホウレンソウＲＳをコー
ドするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
である。
【００３７】配列番号８は成熟ホウレンソウＲＳをコー
ドするクローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列
である。
【００３８】配列番号９は成熟アラビドプシスＲＳをコ
ードするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配
列である。
【００３９】配列番号１０は成熟アラビドプシスＲＳを
コードするクローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸
配列である。
【００４０】配列番号１１はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)ＲＳをコードするクローニングされ
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００４１】配列番号１２はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)ＲＳをコードするクローニングされ
たｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００４２】配列番号１３はジェンバンク(GenBank)受
託番号Ｘ６４３９５を有する大腸菌(E. coli)ＬＳの増
幅に有用な５’プライマーである。
【００４３】配列番号１４はジェンバンク(GenBank)受
託番号Ｘ６４３９５を有する大腸菌(E. coli)ＬＳの増
幅に有用な３’プライマーである。
【００４４】配列番号１５はジェンバンク(GenBank)受
託番号Ｘ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＲＳの増
幅に有用な５’プライマーである。
【００４５】配列番号１６はジェンバンク(GenBank)受
託番号Ｘ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＲＳの増
幅に有用な３’プライマーである。
【００４６】配列番号１７は、ＮｏｔＩ切断部位での、
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号Ｘ６４３９５
およびＸ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＬＳおよ
びＲＳ遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるＤＮＡ断片
の導入に有用な５’プライマーである。
【００４７】配列番号１８は、ＮｏｔＩ切断部位での、
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号Ｘ６４３９５
およびＸ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＬＳおよ
びＲＳ遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるＤＮＡ断片
の導入に有用な３’プライマーである。
【００４８】配列番号１９は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号Ｘ６４３９５を有する大腸菌(E. coli)ＬＳの
中央のＮｏｔＩ切断部位の導入に有用なＰＣＲプライマ
ーの１種である（ヌクレオチド2273〜2290にハイブリダ
イゼーションする）。
【００４９】配列番号２０は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号Ｘ６４３９５を有する大腸菌(E. coli)ＬＳの
中央のＮｏｔＩ切断部位の導入に有用なＰＣＲプライマ
ーの１種である（ヌクレオチド2243〜2261にハイブリダ
イゼーションする）。
【００５０】配列番号２１は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号Ｘ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＲＳの
中央のＮｏｔＩ切断部位の導入に有用なＰＣＲプライマ
ーの１種である（ヌクレオチド1217〜1233にハイブリダ
イゼーションする）。
【００５１】配列番号２２は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号Ｘ６９１０９を有する大腸菌(E. coli)ＲＳの
中央のＮｏｔＩ切断部位の導入に有用なＰＣＲプライマ
ーの１種である（ヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする）。
【００５２】配列番号２３はクローニングされたホウレ
ンソウＲＳ前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
５’プライマーである。
【００５３】配列番号２４はクローニングされたホウレ
ンソウＲＳ前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
３’プライマーである。
【００５４】配列番号２５はクローニングされたホウレ
ンソウＬＳ前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
５’プライマーである。
【００５５】配列番号２６はクローニングされたホウレ
ンソウＬＳ前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
３’プライマーである。
【００５６】配列番号２７はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウＬＳ前駆体をコードするクローニングされた
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００５７】配列番号２８はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウＬＳ前駆体をコードするクローニングされた
ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００５８】配列番号２９はその輸送ペプチドを含むタ
バコＬＳ前駆体をコードするクローニングされたｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列である。
【００５９】配列番号３０はその輸送ペプチドを含むタ
バコＬＳ前駆体をコードするクローニングされたｃＤＮ
Ａの推定アミノ酸配列である。
【００６０】配列番号３１はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスＬＳ前駆体をコードするクローニングされ
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００６１】配列番号３２はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスＬＳ前駆体をコードするクローニングされ
たｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００６２】配列番号３３はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウＲＳ前駆体をコードするクローニングされた
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００６３】配列番号３４はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウＲＳ前駆体をコードするクローニングされた
ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００６４】配列番号３５はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスＲＳ前駆体をコードするクローニングされ
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００６５】配列番号３６はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスＲＳ前駆体をコードするクローニングされ
たｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００６６】配列番号３７はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)ＬＳをコードするクローニングされ
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００６７】配列番号３８はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)ＬＳをコードするクローニングされ
たｃＤＮＡの推定アミノ酸配列である。
【００６８】配列番号３９は植物ＬＳタンパク質に見出
される高度に保存されたＣ末端アミノ酸配列である。
【００６９】ルマジンシンターゼ（ＬＳ）およびリボフ
ラビンシンターゼ（ＲＳ）すなわちホウレンソウのリボ
フラビン生合成経路の最後と最後から２番目の酵素は、
大腸菌(E. coli)栄養要求体の機能相補の使用によりク
ローニングされている。
【００７０】それぞれＬＳタンパク質およびＲＳタンパ
ク質をコードする核酸断片が植物および真菌から単離さ
れている。他の植物および真菌からのＬＳおよびＲＳ遺
伝子は、今や、発明者により提供される配列との無作為
ｃＤＮＡ配列の比較により同定され得る。本発明は、当
該酵素経路に関する作物保護化学物質をスクリーニング
するためのこれらの核酸断片を使用するアッセイ、なら
びに宿主細胞中のＬＳおよびＲＳ酵素の産生のレベルを
改変する方法を包含する。
【００７１】本開示では多数の用語および略語が使用さ
れる。以下の定義が提供される。
【００７２】「ルマジンシンターゼ」はＬＳと略称され
る。
【００７３】「リボフラビンシンターゼ」はＲＳと略称
される。
【００７４】「フラビンモノヌクレオチド」はＦＭＮと
略称される。
【００７５】「フラビンアデニンジヌクレオチド」はＦ
ＡＤと略称される。
【００７６】「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略称
される。
【００７７】「発現された配列標識」はＥＳＴと略称さ
れる。
【００７８】「ジメチルスルホキシド」はＤＭＳＯと略
称される。
【００７９】「６，７−ジメチル−８−（１’−リビチ
ル）ルマジン」はＤＭＲＬと略称される。
【００８０】「４−リビチルアミノ−５−アミノ−２，
６−ジヒドロキシピリミジン」はＲＡＡＤＰと略称され
る。
【００８１】「３，４−ジビドロキシブタノン４−リン
酸」はＤＨＢＰと略称される。
【００８２】「イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド」はＩＰＴＧと略称される。
【００８３】「ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動」はＳＤＳ−ＰＡＧＥと略称され
る。
【００８４】「読み取り枠」はＯＲＦと略称される。
【００８５】「単離された核酸断片」は、場合によって
は合成の非天然すなわち改変されたヌクレオチド塩基を
含有する、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡもしくは
ＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単
離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは
合成ＤＮＡの１種もしくはそれ以上の区分から成ってよ
い。
【００８６】「成熟」タンパク質はその輸送ペプチドを
含まない機能性のＬＳもしくはＲＳ酵素を指す。「前駆
体」タンパク質は天然もしくは外来性の輸送ペプチドを
含む成熟ペプチドを指す。「輸送ペプチド」という用語
はポリペプチドのアミノ末端の伸長を指し、これはその
ポリペプチドとともに翻訳されて前駆体ペプチドを形成
し、かつ、プラスチドもしくは葉緑体のようなオルガネ
ラによるその取り込みに必要とされる。
【００８７】「栄養要求性」は、微生物の成長、胞子形
成および結晶産生に必要な栄養要求を指す。本発明の目
的上、「栄養要求体」という用語は、本明細書では、成
長のためにリボフラビンの添加を必要とする生物体を意
味すると定義される。
【００８８】「宿主細胞」および「宿主生物体」という
用語は、外来すなわち異種の遺伝子を受領しかつそれら
の遺伝子を発現して活性の遺伝子産物を産生することが
可能な細胞を指す。適する宿主細胞は細菌および真菌の
ような微生物、ならびに植物細胞を包含する。
【００８９】「ルマジンシンターゼ」すなわち「ＬＳ」
という用語は、「６，７−ジメチル−８−リビチルルマ
ジンシンターゼ」と互換可能に使用され、そして、オル
トリン酸および６，７−ジメチル−８−（１’−Ｄ−リ
ビチル）ルマジン（ＤＭＲＬ）を生じさせる、３，４−
ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸の４−リビチル
アミノ−５−アミノ−２，６−ジヒドロキシピリミジン
（ＲＡＡＤＰ）との縮合を触媒する植物もしくは真菌の
酵素を指す。
【００９０】「リボフラビンシンターゼ」すなわち「Ｒ
Ｓ」という用語は、４−リビチルアミノ−５−アミノ−
２，６−ジヒドロキシピリミジン（ＲＡＡＤＰ）ととも
にリボフラビンおよび３，４−ジヒドロキシ−２−ブタ
ノン４−リン酸（ＤＨＢＰ）を生じさせる、６，７−ジ
メチル−８−（１’−Ｄ−リビチル）ルマジン（ＤＭＲ
Ｌ）の不均化を触媒する植物もしくは真菌の酵素を指
す。
【００９１】「代謝活性」という用語は、成長を支持す
るのに必要とされる通常の細胞活性を指す。本明細書で
使用されるように、代謝活性を阻害することができる作
物保護化学物質のような作用物質もまた、一般に細胞の
成長を阻害することができる。
【００９２】「本質的に類似の」という用語は、１個も
しくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が１個もしく
はそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、しかしその
ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能的特性
に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「本質的に類似
の」はまた、１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の変化が、アンチセンスもしくは同時サプレッション(c
o-suppression)技術による遺伝子発現の変化を媒介する
その核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片も指
す。「本質的に類似の」はまた、アンチセンスもしくは
同時サプレッション技術による遺伝子発現の変化または
生じるタンパク質分子の機能的特性の変化を媒介する能
力について生じる転写物の機能的特性に本質的に影響を
及ぼさない、1個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の欠失もしくは挿入のような本発明の核酸断片の修飾も
指す。従って、本発明は特定の例示的配列以上を包含す
ることが理解される。
【００９３】「本質的部分」は、当業者による配列の人
的評価もしくはＢＬＡＳＴ（基本的局所的整列検索ツー
ル(Basic Local Alignment Search Tool)；アルチュー
ル(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)；w
ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/もまた参照）のようなアル
ゴリズムを使用するコンピュータで自動化された配列の
比較および同定のいずれかによりポリペプチドもしくは
遺伝子の推定の同定を与えるのに十分なそのポリペプチ
ドのアミノ酸配列もしくは遺伝子のヌクレオチド配列を
含んで成る、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列を指
す。一般に、10個もしくはそれ以上の隣接するアミノ
酸、すなわち30個もしくはそれ以上のヌクレオチドが、
ポリペプチドもしくは核酸配列を既知のタンパク質もし
くは遺伝子と相同と推定的に同定するために必要であ
る。さらに、ヌクレオチド配列に関して、20〜30個の隣
接するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブが、遺伝子同定（例えばサザンハイ
ブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニー
もしくはバクテリオファージプラークのインシトゥハイ
ブリダイゼーション）の配列依存性の方法で使用されて
よい。加えて、短いオリゴヌクレオチド（一般に12塩基
もしくはより長い）が、そのプライマーを含んで成る特
定の核酸断片を得るためのＰＣＲの増幅プライマーとし
て使用されてよい。従って、ヌクレオチド配列の「本質
的部分」は、その配列を含んで成る核酸断片の特異的同
定および／もしくは単離を与える配列を十分に含んで成
る。本明細書は、１個もしくはそれ以上の特定の植物タ
ンパク質をコードする部分的もしくは完全なアミノ酸お
よびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告され
るような配列の利益を有する当業者は、今や、当業者に
既知の目的上開示された配列の全部もしくは本質的部分
を使用しうる。従って、本発明は、付随する配列表に報
告されたような完全な配列、ならびに上に定義されたよ
うなそれらの配列の本質的部分を含んで成る。
【００９４】例えば、遺伝子発現のアンチセンス抑圧お
よび同時サプレッションは、遺伝子のコーディング領域
全体未満を表す核酸断片を使用して、および抑圧される
べき遺伝子と100％の同一性を共有しない核酸断片によ
り成し遂げられうることが、当該技術分野で公知であ
る。さらに、与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸
の産生をもたらすがしかしコードされたタンパク質の機
能的特性に影響しない遺伝子の変化は当該技術分野で公
知である。かように、疎水性アミノ酸であるアミノ酸ア
ラニンのコドンは、グリシンのような別のより小さく疎
水性の残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイ
シンのようなより大きく疎水性の残基をコードするコド
ンにより置き換えられてよい。同様に、グルタミン酸の
代わりにアスパラギン酸のような、１個の負に荷電した
残基の別のものへの、もしくはアルギニンの代わりにリ
シンのような１個の正に荷電した残基の別のものへの置
換をもたらす変化はまた、機能的に同等な産物を産生す
ることも期待され得る。タンパク質分子のＮ末端および
Ｃ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化はまた、
そのタンパク質の活性を変えることが期待されないとみ
られる。提案された修飾のそれぞれは、コードされた産
物の生物学的活性の保持の決定でそうであるように、十
分に当該技術分野の慣例の技能内にある。さらに、当業
者は、本発明により包含される本質的に類似の配列はま
た、本明細書に例示される配列と緊縮条件下（0.1×Ｓ
ＳＣ、0.1％ＳＤＳ、65℃）でハイブリダイゼーション
するそれらの能力によっても定義されることを認識す
る。本発明の好ましい本質的に類似の核酸断片は、その
ＤＮＡ配列が本明細書で報告される核酸断片のＤＮＡ配
列に80％同一である核酸断片である。より好ましい核酸
断片は本明細書に報告される核酸断片のＤＮＡ配列に90
％同一である。本明細書に報告される核酸断片のＤＮＡ
配列に95％同一である核酸断片が最も好ましい。
【００９５】「コドン縮重」は、コードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列に影響することなくヌクレオチド配
列の変動を可能にする遺伝暗号中の冗長性を指す。従っ
て、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列
番号３８に述べられるようなＬＳもしくはＲＳ生合成酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードするいずれかの核酸断片に関する。当業者は、
与えられたアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使
用において特定の宿主細胞により表される「コドンの偏
り」を十分に知っている。従って、宿主細胞中での改良
された発現のため遺伝子を合成する場合、そのコドン使
用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくよ
うに遺伝子を設計することが望ましい。
【００９６】「パーセント同一性」という用語は、２種
のアミノ酸配列もしくは２種のヌクレオチド配列のいず
れかを比較する場合のアミノ酸もしくは塩基のいずれか
の同一の合致のパーセントを指す。
【００９７】「相補的」という用語は、相互にハイブリ
ダイゼーションすることが可能であるヌクレオチド塩基
の間の関係を記述するのに使用される。これゆえに、Ｄ
ＮＡに関して、アデノシンはチミジンに相補的でありか
つシトシンはグアニンに相補的である。
【００９８】「合成遺伝子」は、当業者に既知の処置を
使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単
位から集成され得る。これらの基礎単位は連結されかつ
アニーリングされて遺伝子区分を形成し、これはその後
酵素的に集成されて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡの配
列に関するところの「化学的に合成された」は、成分の
ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味す
る。ＤＮＡの人的な化学合成が十分に確立された処置を
使用して成し遂げられうるか、もしくは、自動化化学合
成が多数の商業的に入手可能な機械の１種を使用して実
施され得る。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏
りを反映するようなヌクレオチド配列の至適化を基礎と
して至適な遺伝子発現のため作られ得る。当業者は、コ
ドン使用頻度が宿主により好まれるコドンに偏らされる
場合、成功する遺伝子発現の見込みの真価を認める。好
ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合
は宿主細胞由来の遺伝子の検分を基礎とし得る。
【００９９】「遺伝子」は、コーディング配列に先立つ
（５’非翻訳配列）および後に続く（３’非翻訳配列）
調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸
断片を指す。「本来の遺伝子」はそれ自身の調節配列と
ともに天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ
遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコ
ーディング配列を含んで成る、生来の遺伝子でないいず
れかの遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる
起源由来である調節配列およびコーディング配列、もし
くは同一起源由来だがしかし天然に見出されるものと異
なる様式で配置される調節配列およびコーディング配列
を含んでよい。「内因性遺伝子」は生物体のゲノム中の
その天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺
伝子は宿主生物体中に通常は見出されない遺伝子を指す
が、しかしそれは遺伝子導入により宿主生物体に導入さ
れる。外来遺伝子は非本来の生物体に挿入された本来の
遺伝子もしくはキメラ遺伝子を含み得る。「トランス遺
伝子(transgene)」は形質転換処置によりゲノム中に導
入された遺伝子である。
【０１００】「コーディング配列」は特定のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コ
ーディング配列の上流（５’非翻訳配列）、内もしくは
下流（３’非翻訳配列）に配置されたヌクレオチド配列
を指し、また、これは、転写、ＲＮＡのプロセシングも
しくは安定性、または連合されたコーディング配列の翻
訳に影響する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダ
ー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を包
含しうる。
【０１０１】「プロモーター」はコーディング配列もし
くは機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ
配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター
配列の３’に配置される。プロモーター配列は近位およ
びより遠位の上流要素から成り、後者の要素はしばしば
エンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激し得かつプロモーターの内
在的要素またはプロモーターのレベルもしくは組織特異
性を高めるよう挿入された異種要素でありうるＤＮＡ配
列である。プロモーターは本来の遺伝子からそっくりそ
のまま得られうるか、もしくは、天然に見出される多様
なプロモーター由来の多様な要素から成りうるか、また
は合成ＤＮＡ区分さえ含みうる。多様なプロモーター
は、多様な組織もしくは細胞型または発達の多様な段階
で、あるいは多様な環境条件に反応して、遺伝子発現を
指図しうることが当業者により理解される。大部分の時
点で大部分の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーター
は普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞
中で有用な多様な型の新規プロモーターが定常的に発見
されており；多数の例はオカムロ(Okamuro)とゴールド
ベルグ(Goldberg)による編集物（Biochemistry of Plan
ts 15:1-82(1989)）で見出されうる。大部分の場合には
調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、
多様な長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有
しうることがさらに認識される。
【０１０２】「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモ
ーター配列とコーディング配列との間に配置されるＤＮ
Ａ配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流
の完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在する。翻訳
リーダー配列はｍＲＮＡに対する一次転写物のプロセシ
ング、ｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率に影響を及ぼ
しうる。翻訳リーダー配列の例が記述されている（ター
ナー(Turner)ら、Mol.Biotech. 3:225(1995)）。
【０１０３】「３’非翻訳配列」は、コーディング配列
の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、また、ポリアデ
ニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングもしく
は遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナル
をコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグ
ナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニ
ル酸域(tract)の付加に影響を及ぼすことにより特徴づ
けられる。多様な３’非翻訳配列の使用はインゲルブレ
ヒト(Ingelbrecht)ら、Plant Cell 1:671-680(1989)に
より例示される。
【０１０４】「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡ
ポリメラーゼで触媒される転写から生じる産物を指す。
ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである
場合はそれは一次転写物と称されるか、もしくは、それ
は一次転写物の転写後プロセリング由来のＲＮＡ配列で
あることができ、かつ、成熟ＲＮＡと称される。「メッ
センジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンを含ま
ずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指
す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的でありかつこれ
由来である二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、
ｍＲＮＡを包含しそして従って細胞によりタンパク質に
翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮ
Ａ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部もし
くは一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を封鎖す
るＲＮＡ転写物を指す（US 5,107,065）。アンチセンス
ＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のいずれかの部
分、すなわち５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イント
ロンもしくはコーディング配列とでありうる。「機能性
ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、
もしくは翻訳されないがそれでもなお細胞の過程に対し
影響を有する他のＲＮＡを指す。
【０１０５】「操作可能に連結される」という用語は、
一方の機能が他方により影響を及ぼされるような単一の
核酸断片上の核酸配列の連合を指す。例えば、プロモー
ターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼす
ことが可能である（すなわちコーディング配列がそのプ
ロモーターの転写制御下にある）場合にそのコーディン
グ配列と操作可能に連結される。コーディング配列は、
センスもしくはアンチセンスの向きで調節配列に操作可
能に連結され得る。
【０１０６】本明細書で使用されるところの「発現」と
いう用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮ
Ａ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄
積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻
訳も指しうる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク
質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮ
Ａ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常のすなわ
ち形質転換されない生物体での産生のレベルを越えるト
ランスジェニック生物体での遺伝子産物の産生を指す。
「同時サプレッション」は、同一のもしくは本質的に類
似の外来もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することが
可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（US 5,231,02
0）。
【０１０７】「変えられたレベル」は、正常のすなわち
形質転換されない生物体のものと異なる量もしくは比率
での生物体における遺伝子産物（１種もしくは複数）の
産生を指す。
【０１０８】「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝形
質をもたらす、核酸断片の宿主生物体のゲノムへの導入
を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体
は「トランスジェニック」生物体と称される。植物の形
質転換法の例は、アグロバクテリウム属(Agrobacteriu
m)媒介性形質転換（デブレルク(De Blaerc)ら、Meth.En
zymol. 143:277(1987)）および粒子加速(particle-acce
lerated)すなわち「ジーンガン(gene gun)」形質転換技
術（クライン(Klein)ら、Nature, London 327:70-73(19
87)；US 4,945,050）を包含する。
【０１０９】「目的の化合物」および「試験化合物」
は、除草剤もしくは殺真菌剤の作物保護化学物質として
のその潜在能力を評価する本アッセイでスクリーニング
されている物質を指す。
【０１１０】ホウレンソウＬＳが単離され、そして、当
業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為ｃＤＮＡ配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウＬＳの
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号２に提供される。他
の植物からのＬＳ遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウＬＳの配列との無作為ｃＤＮＡ配列の比
較により同定され得る。
【０１１１】タバコＬＳが単離され、そして、当業者に
公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するジェンバンク
(GenBank)データベースとの無作為ｃＤＮＡ配列の比較
により同定されている。成熟タバコＬＳのｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列は配列番号３に提供され、また、推定ア
ミノ酸配列は配列番号４に提供される。他の植物からの
ＬＳ遺伝子は、今や、本明細書に提供されるタバコＬＳ
の配列との無作為ｃＤＮＡ配列の比較により同定され得
る。
【０１１２】アラビドプシスＬＳが単離され、そして、
当業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為ｃＤＮＡ配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスＬ
ＳのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号５に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号６に提供され
る。他の植物からのＬＳ遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスＬＳの配列との無作為ｃＤＮＡ
配列の比較により同定され得る。
【０１１３】マグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)ＬＳが単離され、そして、当業者に公知のＢＬＡＳ
Ｔアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為ｃＤＮＡ配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
ＬＳのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号３７に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号３８に提供
される。他の真菌からのＬＳ遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)ＬＳの配列との無作為ｃＤＮＡ配列の比較により同
定され得る。
【０１１４】ホウレンソウＲＳが単離され、そして、当
業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為ｃＤＮＡ配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウＲＳの
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号７に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号８に提供される。他
の植物からのＲＳ遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウＲＳの配列との無作為ｃＤＮＡ配列の比
較により同定され得る。
【０１１５】アラビドプシスＲＳが単離され、そして、
当業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為ｃＤＮＡ配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスＲ
ＳのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号９に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号１０に提供され
る。他の植物からのＲＳ遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスＲＳの配列との無作為ｃＤＮＡ
配列の比較により同定され得る。
【０１１６】マグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)ＲＳが単離され、そして、当業者に公知のＢＬＡＳ
Ｔアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為ｃＤＮＡ配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
ＲＳのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１１に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号１２に提供
される。他の真菌からのＲＳ遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)ＲＳの配列との無作為ｃＤＮＡ配列の比較により同
定され得る。
【０１１７】本発明の核酸断片が、同一もしくは他の植
物もしくは真菌種から相同的ＬＳおよびＲＳをコードす
るｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するのに使用されうる。
配列依存性プロトコールを使用する相同遺伝子の単離は
当該技術分野で公知である。配列依存性プロトコールの
例は、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅
技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは
リガーゼ連鎖反応）の多様な用途により例示されるよう
なＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法を包含するがしかしこれら
に制限されない。
【０１１８】例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡの
いずれかとしてのＬＳもしくはＲＳ遺伝子は、ＤＮＡハ
イブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部
もしくは一部を使用して当業者に公知の方法論を使用す
るいずれかの所望の植物（もしくは真菌）からのライブ
ラリーをスクリーニングすることにより直接単離され得
る。本ＬＳもしくはＲＳ配列を基礎とする特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法に
より設計かつ合成され得る（マニアティス(Maniatis)、
上記）。さらに、全体の配列は、ランダムプライマー、
ＤＮＡ標識、ニックトランスレーションもしくはエンド
ラベル技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプ
ローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用し
てＲＮＡプローブを合成するのに直接使用され得る。加
えて、特異的プライマーは、本配列の一部もしくは完全
長を増幅するために設計かつ使用され得る。生じる増幅
産物は、増幅反応の間に直接標識され得るか、もしくは
増幅反応後に標識され得、そして適切な緊縮の条件下で
完全長のｃＤＮＡもしくはゲノム断片を単離するための
プローブとして使用され得る。
【０１１９】加えて、本核酸断片の２種の短い区分が、
ＤＮＡもしくはＲＮＡから相同的ＬＳもしくはＲＳ遺伝
子をコードするより長い核酸断片を増幅するＰＣＲプロ
トコールで使用されてよい。ポリメラーゼ連鎖反応もま
た、クローニングされた核酸断片のライブラリーで実施
されてよく、ここで一方のプライマーの配列は本核酸断
片由来であり、かつ、他方のプライマーの配列は植物の
ＬＳもしくはＲＳをコードするｍＲＮＡ前駆体の３’端
へのポリアデニル酸域の存在を利用する。あるいは、第
二のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列
を基礎としてよい。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロト
コール（フローマン(Frohman)ら、Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA 85:8998(1988)）に従い、ＰＣＲを使用して転写
物の単一点と３’もしくは５’端との間の領域のコピー
を増幅することによりｃＤＮＡを生じさせ得る。３’お
よび５’の方向に向けられたプライマーが本配列から設
計され得る。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥもしくは
５’ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ）を使用して、特異的
３’もしくは５’ｃＤＮＡ断片が単離され得る（オハラ
(Ohara)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673(198
9)；ロー(Loh)ら、Science 243:217(1989)）。３’およ
び５’ＲＡＣＥ処置により生じられる産物が組み合わさ
れて完全長のｃＤＮＡを生じ得る（フローマン(Frohma
n)ら、Techniques 1:165(1989)）。
【０１２０】最後に、本ヌクレオチドおよび推定アミノ
酸の配列の入手可能性が、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの
免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の
部分を代表する合成ペプチドが合成されうる。これらの
ペプチドが、動物を免疫してこのアミノ酸配列を含んで
成るペプチドもしくはタンパク質に対する特異性をもつ
ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生する
のに使用され得る。これらの抗体はその後、ｃＤＮＡ発
現ライブラリーをスクリーニングして目的の完全長ｃＤ
ＮＡクローンを単離するのに使用され得る（ラーナー(L
erner)ら、Adv.Immunol. 36:1(1984)；マニアティス(Ma
niatis)）。
【０１２１】本発明の核酸断片はまた、本ＬＳもしくは
ＲＳタンパク質が通常より高もしくは低レベルで存在す
るトランスジェニック植物を創製するのにも使用されう
る。こうした操作は、考えられるところでは、リボフラ
ビン、それゆえに不可欠な補因子ＦＡＤおよびＦＭＮの
細胞内レベルを改変するとみられ、潜在的な商業的価値
の新規表現型を生ずる。あるいは、若干の応用において
は、特定の植物組織および／もしくは細胞型、またはそ
れらが通常は遭遇されないとみられる発達段階の間に、
本ＬＳもしくはＲＳタンパク質を発現することが望まし
いであろう。
【０１２２】本ＬＳもしくはＲＳの過剰発現は、最初
に、ＬＳもしくはＲＳコーディング領域が発達の所望の
段階で所望の組織中での遺伝子発現を指図することが可
能なプロモーターに操作可能に連結される、キメラ遺伝
子を構築することにより成し遂げられうる。便宜性の理
由から、このキメラ遺伝子は同一遺伝子由来のプロモー
ター配列および翻訳リーダー配列を含みうる。３’非翻
訳配列をコードする転写終止シグナルもまた提供されな
ければならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を
助長するため、１個もしくはそれ以上のイントロンも含
みうる。
【０１２３】本キメラ遺伝子を含んで成るプラスミドベ
クターがその後構築され得る。プラスミドベクターの選
択は宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方
法に依存性である。当業者は、キメラ遺伝子を含有する
宿主細胞を成功して形質転換し、選択しそして増殖させ
るためにプラスミドベクターに存在しなければならない
遺伝子要素を十分に知っている。当業者はまた、多様な
独立の形質転換事象が多様なレベルおよびパターンの発
現をもたらすことができること（ジョーンズ(Jones)
ら、EMBO J. 4:2411-2418(1985)；デアルメイダ(De Alm
eida)ら、Mol. Gen. Genetics 218:78-86(1989)）、そ
して従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパ
ターンを表す系列(line)を得るためにスクリーニングさ
れなければならないことも認識することができる。こう
したスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ
発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析
もしくは表現型分析により成し遂げられうる。
【０１２４】若干の応用については、ＬＳもしくはＲＳ
タンパク質を異なる細胞区画に向けること、または細胞
からのそれらの分泌を助長することが有用でありうる。
かように、上述されたキメラ遺伝子は、それらのコーデ
ィング領域への適切な細胞内性もしくは細胞外性に標的
化された配列の付加によりさらに修飾されうることが予
見される。これらは、葉緑体輸送ペプチド（キーグスト
ラ(Keegstra)ら、Cell56:247-253(1989)）、タンパク質
を小胞体に向かわせるシグナル配列（クリスピールス(C
hrispeels)ら、Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. 42:
21-53(1991)）および核局在化シグナル（ライケール(Ra
ikhel)ら、Plant Phys. 100:1627-1632(1992)）を包含
する。引用される参考文献はこれらのそれぞれの例を与
える一方、この列挙は網羅的でなく、そして利用すべき
より多くの目標を向けるシグナルが将来発見されうる。
下述されるように、植物のＬＳおよびＲＳは、双方とも
それらのＮ末端に葉緑体に対して標的化された配列を伴
う核にコードされた前駆体タンパク質として合成される
ことが、本発明において示される。従って、これらのタ
ンパク質は他の細胞区画に向かわせるための良好な候補
であるとみられる。あるいは、それらの葉緑体輸送ペプ
チドを単に除去することにより、ＬＳもしくはＲＳを独
占的に植物細胞質で発現させることが可能であるはずで
ある。
【０１２５】いくつかの応用に関しては植物でのＬＳも
しくはＲＳ遺伝子の発現を低下させるもしくは排除する
こともまた望ましいことができる。これを成し遂げるた
め、ＬＳもしくはＲＳのアンチセンスもしくは共抑制の
ため設計されたキメラ遺伝子が、これらの酵素の部分を
コードする遺伝子もしくは遺伝子断片を植物プロモータ
ー配列に連結することにより構築され得る。従って、Ｌ
ＳもしくはＲＳの全部もしくは一部のアンチセンスＲＮ
Ａを発現するよう設計されたキメラ遺伝子が、ＬＳもし
くはＲＳの遺伝子もしくは遺伝子断片を逆方向で植物プ
ロモーター配列に連結することにより構築され得る。同
時サプレッションもしくはアンチセンスキメラ遺伝子構
築物が、その後、公知の形質転換プロトコールを介して
植物中に導入されてＬＳもしくはＲＳ遺伝子産物の内因
性発現を低下もしくは排除し得る。
【０１２６】異種宿主細胞、とりわけ微生物宿主細胞で
産生されたＬＳもしくはＲＳタンパク質は、当業者に公
知の方法によりこの酵素に対する抗体を調製するのに使
用され得る。この抗体は、インシトゥで細胞中で、もし
くはインビトロで細胞抽出物中で、本ＬＳもしくはＲＳ
タンパク質を検出するのに有用であるとみられる。本Ｌ
ＳもしくはＲＳタンパク質の産生に好ましい異種宿主細
胞は微生物宿主である。微生物発現系、および外来タン
パク質の高レベル発現を指図する調節配列を含有する発
現ベクターは当業者に公知である。これらのいずれも、
本ＬＳもしくはＲＳの産生のためのキメラ遺伝子を構築
するのに使用され得る。これらのキメラ遺伝子はその
後、形質転換を介して適切な微生物中に導入されて本Ｌ
ＳもしくはＲＳタンパク質の高レベル発現を提供し得
る。
【０１２７】本ＬＳおよびＲＳ酵素の発現に適する微生
物宿主細胞は、これらの酵素をコードするキメラ遺伝子
の発現が可能であるいかなる細胞も包含する。こうした
細胞は、例えば酵母（例えばアスペルギルス属(Aspergi
llus)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(P
ichia)、カンジダ属(Candida)およびハンセヌラ属(Hans
enula)）、バチルス属(Bacillus)ならびに腸内細菌の構
成員（例えばエシェリキア属(Escherichia)、サルモネ
ラ属(Salmonella)およびシゲラ属(Shigella)）を包含す
る細菌および真菌双方を包含することができる。こうし
た宿主の形質転換および外来タンパク質の発現の方法は
当該技術分野で公知であり、また、適するプロトコール
の例は、Manual of Methods for General Bacteriology
（ゲルハルト(Gerhardt)ら、編、アメリカ微生物学会(A
merican Society for Microbiology)、ワシントンＤＣ
(1994)）、もしくはブルック(Brook, T.D.)、Biotechno
logy: A Textbook of Industrial Microbiology、第２
版、サイナウアー アソシエーツ インク(Sinauer Ass
ociates, Inc.)、メーン州サンダーランド(1989)）に見
出されうる。
【０１２８】適する微生物宿主細胞の形質転換に有用な
ベクターもしくはカセットは当該技術分野で公知であ
る。典型的には、このベクターもしくはカセットは、関
連する遺伝子の転写および翻訳を指図する配列、選択可
能なマーカー、ならびに自律複製もしくは染色体組込み
を可能にする配列を含有する。適するベクターは、転写
開始制御をもつ遺伝子の５’の領域および転写終止を制
御するＤＮＡ断片の３’の領域を含んで成る。双方の制
御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子由来で
ある場合が最も好ましいが、とは言えこうした制御領域
は産生宿主として選ばれた特定の種の本来の遺伝子由来
である必要がないことが理解されるべきである。
【０１２９】所望の宿主細胞において、ＲＳもしくはＬ
Ｓ酵素をコードする遺伝子の発現に至らせる(drive)の
に有用である、開始制御領域すなわちプロモーターは多
数であり、かつ当業者に馴染みである。事実上、ＣＹＣ
１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧ
Ｋ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲ
Ａ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰ１（サッカロミセス属(S
accharomyces)での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属
(Pichia)での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、
１ＰL、１ＰR、Ｔ7、ｔａｃおよびｔｒｃ（大腸菌(E. c
oli)での発現に有用）を包含するがこれらに制限されな
い、これらの遺伝子を動かす(drive)ことが可能ないか
なるプロモーターも本発明に適する。終止制御領域もま
た好ましい宿主の本来の多様な遺伝子由来でありうる。
場合によっては、終止部位は不必要であることができる
が、しかしながら包含される場合が最も好ましい。
【０１３０】本ＬＳおよびＲＳタンパク質は、除草剤も
しくは殺真菌剤として有用と判明しうる特定の化学物質
の設計および／もしくは同定を助長する道具として使用
され得る。これは、精製された本植物タンパク質由来で
ある構造的および／もしくは機構的情報から生じる強力
な酵素阻害剤の合理的設計および合成、または化学物質
のライブラリーの無作為インビトロスクリーニングのい
ずれかにより達成され得る。ＬＳおよびＲＳは植物およ
び微生物のリボフラビン生合成の最後の２段階を触媒
し、また、多数の重要な酸化還元酵素の不可欠な補欠分
子族であるＦＡＤおよびＦＭＮの産生に必要とされる。
結果として、本明細書に記述されるＬＳもしくはＲＳタ
ンパク質のいずれかの有意のインビボ阻害が、細胞の代
謝をひどく損ないかつおそらく植物もしくは真菌の死を
もたらすことができることが予期される。
【０１３１】本発明の核酸断片の全部もしくは一部はま
た、それらが一部である遺伝子を遺伝子的におよび物理
的にマッピングするためのプローブ、ならびに本ＬＳも
しくはＲＳの発現に連結される特徴についてのマーカー
としても使用されうる。こうした情報は、所望の表現型
をもつ系列を開発するための植物育種において有用であ
りうる。
【０１３２】例えば、本核酸断片は制限断片長多型（Ｒ
ＦＬＰ）マーカーとして使用されうる。制限酵素切断さ
れた植物ゲノムＤＮＡのサザンブロット（マニアティス
(Maniatis)）が本発明の核酸断片でプロービングされる
(probe)。生じるバンド形成(banding)パターンは、その
後、遺伝子地図を構築するために、マップメーカー(Map
Maker)（ランダー(Lander)ら、Genomics 1:174-181(198
7)）のようなコンピュータプログラムを使用する遺伝子
分析にかけられうる。加えて、本発明の核酸断片は、定
義された遺伝子交差(genetic cross)の親および子孫を
表す一組の個体の制限エンドヌクレアーゼ処理されたゲ
ノムＤＮＡを含有するサザンブロットに探りを入れるの
に使用されうる。ＤＮＡ多型の分離が示され、かつ、こ
の集団を使用して以前に得られた遺伝子地図における本
核酸配列の位置を計算するのに使用される（ボトシュタ
イン(Botstein)ら、Am. J. Hum. Genet. 32:314-331(19
80)）。
【０１３３】遺伝子マッピングでの使用のための植物遺
伝子由来プローブの調製および使用は、ベルナツキ(Ber
natzky)およびタンクスレー(Tanksley)により記述され
る（Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41(1986)）。多
数の出版物が、上に概説された方法論もしくはその変法
を使用する特異的ｃＤＮＡクローンの遺伝子マッピング
を記述する。例えば、Ｆ２交雑集団、戻し交雑集団、無
作為交配集団(randomlymated population)、近同遺伝子
系の系列(near isogenic lines)および他の個体の組が
マッピングに使用されうる。こうした方法論は当業者に
公知である。
【０１３４】本核酸配列由来の核酸プローブは物理的マ
ッピングにもまた使用されうる（すなわち物理的地図上
の配列の配置；ホーエイゼル(Hoheisel)ら、Nonmammali
an Genomic Analysis: A Practical Guide、pp.319-34
6、アカデミックプレス(1996)およびその中に引用され
る参考文献を参照）。
【０１３５】別の態様において、本核酸配列由来の核酸
プローブが、直接蛍光インシトゥハイブリダイゼーショ
ン（ＦＩＳＨ）マッピングで使用されうる。ＦＩＳＨマ
ッピングの現在の方法は大型のクローン（数ないし数百
kb）の使用を好むとは言え、感度における改良がより短
いプローブを使用するＦＩＳＨマッピングの実施を可能
にしうる。
【０１３６】遺伝子および物理的マッピングの多様な核
酸増幅を基礎とする方法が、本核酸配列を使用して実施
されうる。例は、対立遺伝子特異的増幅、ＰＣＲ増幅断
片の多型（ＣＡＰＳ）、対立遺伝子特異的連結、ヌクレ
オチド伸長反応、照射ハイブリッドマッピング(Radiati
on Hybrid Mapping)およびハッピーマッピング(HappyMa
pping)を包含する。これらの方法に関して、核酸断片の
配列は、増幅反応もしくはプライマー伸長反応での使用
のためのプライマー対を設計かつ調製するのに使用され
る。こうしたプライマーの設計は当業者に公知である。
ＰＣＲを基礎とした遺伝子マッピングを使用する方法に
おいて、本核酸配列に対応する領域でのマッピング交差
(mapping cross)の親の間のＤＮＡ配列の差異を同定す
ることが必要でありうる。これは、しかしながら、マッ
ピング法には一般に必要でない。こうした情報は所望の
表現型をもつ系列を開発するための植物育種において有
用でありうる。
【０１３７】
【実施例】本発明は以下の実施例でさらに定義され、こ
こで、別の方法で言明されない限り、全ての割合および
パーセントは重量であり、かつ、温度は摂氏である。こ
れらの実施例は本発明の好ましい態様を示す一方、具体
的な説明としてのみ与えられることが理解されるべきで
ある。上の論考及びこれらの実施例から、当業者は本発
明の本質の特徴を確かめ得、また、その技術思想および
範囲から離れることなく、それを多様な使用および条件
に適合させるよう本発明の多様な変更および改変をなし
得る。
【０１３８】ここで使用される標準的な組換えＤＮＡお
よび分子クローニングの技術は当該技術分野で公知であ
ることができ、また、サンブルック(Sambrook, J.)、フ
リッチュ(Fritsch, E.F.)とマニアティス(Maniatis,
T.)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(C
old Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプ
リングハーバー、1989；ならびに、シルハヴィ(T.J. Si
lhavy)、ベナン(M.L. Bennan)とエンクィスト(L.W.Enqu
ist)、Experiments with Gene Fusions、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー プレス(Cold Spring
Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド
スプリング(1984)およびアウスベル(Ausubel, F.M.)
ら、Current Protocols in Molecular Biology、グリー
ン パブリッシング アソシエーツ(Greene Publishing
Assoc.)およびウィレイ インターサイエンス(Wiley-I
nterscience)により出版(1987)により記述される。
【０１３９】遺伝子配列の操作は、ジェネティクス コ
ンピュータ グループ インク(Genetics Computer Gro
up Inc.)から入手可能なプログラム一式（ウィスコンシ
ンパッケージ バージョン9.0、ジェネティクス コン
ピュータ グループ(Genetics Computer Group)（ＧＣ
Ｇ）、ウィスコンシン州マディソン）を使用して成し遂
げられた。
【０１４０】略語の意味は以下のようである。すなわち
「ｓｅｃ」は秒（１もしくは複数）を意味し、「ｍｉ
ｎ」は分（１もしくは複数）を意味し、「ｈ」は時間
（１もしくは複数）を意味し、「ｄ」は日（１もしくは
複数）を意味し、「μl」はマイクロリットルを意味
し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットル
を意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモ
ル濃度を意味し、「mmol」はミリモル（１もしくは複
数）を意味する。
【０１４１】実施例１ 大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳのＰＣＲクローニング 遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを使用して、高コピー数
プラスミドへの後の連結のためのそれらの隣接領域に唯
一の制限酵素切断部位を付加しつつ、ゲノムＤＮＡから
大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ遺伝子を増幅した。こ
の目的上使用されたプライマーは、大腸菌(E. coli)Ｌ
ＳおよびＲＳ遺伝子（それぞれジェンバンク(GenBank)
受託番号Ｘ６４３９５およびＸ６０１０９）の公表され
たＤＮＡ配列を基礎とし、かつ、以下のヌクレオチドか
ら成った。すなわち プライマー１（配列番号１３）：５’−ＣＧＡ ＡＧＧ
ＡＡＧ Ａｃｃ ａｔｇ ｇＣＣ ＡＴＴ ＡＴＴ
ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＣ−３’ プライマー２（配列番号１４）：５’−ＡＴＣ ＴＴＡ
ＣＴｇ ｔｃｇ ａｃＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ
ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＴＴ Ｃ−３’ プライマー３（配列番号１５）：５’−ＡＣＴ ＣＡＴ
ＴＴＡ ｃｃａ ｔｇｇ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＧＡ
ＴＴＧ ＴＡＣ ＡＧＧ ＧＣ−３’ プライマー４（配列番号１６）：５’−ＡＴＣ ＴＴＡ
ＣＴｇ ｔｃｇ ａｃＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＴＣ
ＴＧＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴ−３’ 下線をつけられた塩基は標的遺伝子にハイブリダイゼー
ションする一方、小文字はＰＣＲプライマーの端に付加
された制限酵素切断部位（ＮｃｏＩもしくはＳａｌＩ）
を示す。
【０１４２】ＬＳ遺伝子の増幅は、プライマー１および
２、ならびに大腸菌(E. coli)株Ｗ３１１０（キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978)）からのゲノムＤＮＡを使用して達成した。プ
ライマー１は遺伝子の開始でハイブリダイゼーション
し、かつ、このタンパク質の開始コドンにＮｃｏＩ部位
を導入する一方、プライマー２は反対端でハイブリダイ
ゼーションし、かつ、終止コドンを過ぎてすぐにＳａｌ
Ｉ部位を提供する。100μlのＰＣＲ反応は約100ngのゲ
ノムＤＮＡおよび0.5μMの最終濃度の双方のプライマー
を含有した。他の反応成分を、製造元のプロトコールに
従い、ジーンアンプ(GeneAmp)ＰＣＲ試薬キット（パー
キン エルマー(Perkin Elmer)）により提供した。増幅
を、ＤＮＡサーモサイクラー(Thermocycler)４８０（パ
ーキン エルマー(Perkin Elmer)）で28サイクル実施
し、それぞれは94℃で１分、53℃で２分および72℃で２
分を含んで成った。最終サイクルの後、72℃で７分の伸
長期間が存在した。ＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＳａｌ
Ｉで切断し、そして同様に切断されたｐＧＥＭ−５Ｚｆ
（＋）（プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディ
ソン）に連結した。後者は、それがＮｃｏＩおよびＳａ
ｌＩでの二重切断後にＮｏｔＩ切断部位を欠くため適す
るクローニングベクターとして選んだ（下を参照）。こ
の連結反応混合物を使用して大腸菌(E. coli)ＤＨ５α
コンピテント細胞（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）を形質
転換し、そして形質転換体を100μg/mLのアンピシリン
で補充されたＬＢ培地上で選択した。
【０１４３】大腸菌(E. coli)ＲＳ遺伝子を、プライマ
ー３および４を使用して類似の様式でゲノムＤＮＡから
増幅した。前者は当該タンパク質の開始コドンにＮｃｏ
Ｉ部位を導入する一方、後者は終止コドン直後にＳａｌ
Ｉ部位を提供する。ＰＣＲ産物のｐＧＥＭ−５Ｚｆ
（＋）への連結および生じる構築物でのＤＨ５αの形質
転換を包含するその後の段階は、正確に、上述されたと
おりであった。
【０１４４】クローニングされた大腸菌(E. coli)ＬＳ
およびＲＳ遺伝子をもつプラスミドを制限酵素切断分析
により同定した。プラスミドＤＮＡを、ウィザード(Wiz
ard)ＤＮＡ精製システム（（プロメガ(Promega)、ウィ
スコンシン州マディソン）を使用して多数のアンピシリ
ン耐性コロニーから単離し、そしてＮｃｏＩおよびＳａ
ｌＩでの切断にかけた。サンプルをアガロースゲル電気
泳動により分析し、そして正しい大きさの挿入物を生じ
る各遺伝子の代表的プラスミドを完全に配列決定してＰ
ＣＲの誤りの非存在を確かめた。クローニングの目的上
意図的に変えた５’および３’端のヌクレオチド以外
は、増幅された大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳの遺伝
子配列は文献に報告されたものと同一であった。
【０１４５】実施例２ 大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ遺伝子の挿入的不活性
化 リボフラビンを合成する能力を欠く細菌の栄養要求体を
創製するため、クローニングされた大腸菌(E. coli)Ｌ
ＳおよびＲＳ遺伝子を、挿入的不活性化(insertional i
nactivation)により非機能性とした。簡潔には、唯一の
ＮｏｔＩ部位を標的遺伝子のそれぞれのコーディング領
域の中央に導入し、そしてカナマイシン耐性を与えるＤ
ＮＡ断片を工作された部位に連結した。後者は商業的に
入手可能なカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カート
リッジ（ファルマシア(Pharmacia)）により提供し、こ
れはその端の双方にＮｏｔＩ切断部位を付加するようＰ
ＣＲにより修飾した。この修飾は、標準的ＰＣＲ反応で
プライマー５および６を使用して成し遂げ；下線を付け
られた部分はカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)にハ
イブリダイゼーションし、また、小文字はＮｏｔＩ切断
部位を示す。
【０１４６】プライマー５（配列番号１７）：５’−Ａ
ＡＣ ＴＡＧ ＡＴＣ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＡＧ
Ｃ ＣＡＣ ＧＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＡＡ Ａ−
３’ プライマー６（配列番号１８）：５’−ＧＡＣ ＡＡＡ
ＣＡＴ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＴＧＡ ＧＧＴ
ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ−３’ 増幅後、修飾されたカン(Kan)rジェンブロック(GenBloc
k)をＮｏｔＩで切断し、そして生じる断片をアガロース
ゲル電気泳動により精製した。
【０１４７】ＰＣＲプライマーはまた、２個の標的遺伝
子の中央に唯一のＮｏｔＩ切断部位を導入するのにも使
用した。これは、オフマン(Ochman)らによりPCR Protoc
ols:A Guide to Methods and Applications（インニス
(Innis)ら、編)pp.219-227、アカデミックプレス(Acade
mic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に完
全に記述される「逆ＰＣＲ(inverse PCR)」技術の応用
により成し遂げた。逆ＰＣＲの標的は通常は二本鎖環状
ＤＮＡ分子である。しかしながら、他のＰＣＲの応用と
対照的に、この２個のプライマーは、それらの３’端が
環状の鋳型全体の周囲を反対方向に伸長するよう相互か
ら離れて向けられる。プライマーが相互にすぐ隣接して
ハイブリダイゼーションするよう設計される場合、ベク
ター配列全体を包含しかつその開始および終止点として
元来のプライマー結合部位を有する直鎖状ＤＮＡ断片が
産生される。最終的な結果は条件として特定位置で環状
プラスミドを直鎖状にすることに類似である。適切なヌ
クレオチド配列を双方のＰＣＲプライマーのハイブリダ
イゼーションしない５’端に付属することにより、環状
の鋳型内のいずれかの所望の位置に唯一の制限酵素切断
部位を導入することが、従って可能である。
【０１４８】プライマー７および８（それぞれジェンバ
ンク(GenBank)受託番号Ｘ６４３９５のＤＮＡ配列のヌ
クレオチド2273〜2290およびヌクレオチド2243〜2261に
ハイブリダイゼーションする）を、大腸菌(E. coli)Ｌ
Ｓ遺伝子の中央にＮｏｔＩ切断部位を導入するよう設計
し；標的遺伝子にハイブリダイゼーションするヌクレオ
チドに下線を付け、また、ＮｏｔＩ切断部位を小文字で
示す。
【０１４９】プライマー７（配列番号１９）：５’−Ａ
ＡＣ ＴＡＧ ＡＴＣ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＧＧ
Ｔ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＧＴ ＧＧＴ−３’ プライマー８−ＬＳ（配列番号２０）：５’−ＧＡＣ
ＡＡＡ ＣＡＴ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＧＴＣ Ｇ
ＴＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＧＧＴ−３’ プライマー９および１０（それぞれジェンバンク(GenBa
nk)受託番号Ｘ６９１０９のＤＮＡ配列のヌクレオチド1
217〜1233およびヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする）を、大腸菌(E. coli)ＲＳ遺伝子の
中央にＮｏｔＩ切断部位を導入するのに使用した。
【０１５０】プライマー９（配列番号２１）：５’−Ａ
ＡＣ ＴＡＧ ＡＴＣ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＡＣ
Ｃ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣ−３’ プライマー１０（配列番号２２）：５’−ＧＡＣ ＡＡ
Ａ ＣＡＴ Ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ＧＡＣ ＣＴＧ
ＡＣＡ ＴＴＡ ＡＧＴ ＧＴＣ Ｃ−３’ 逆ＰＣＲのための環状の鋳型は、大腸菌(E. coli)ＬＳ
およびＲＳ遺伝子を含有するｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）構
築物であった。100μlのＰＣＲ反応は0.5ngのプラスミ
ドＤＮＡおよび0.5μMの最終濃度の適切なプライマーの
それぞれを含有した。増幅を、ＤＮＡサーモサイクラー
(Thermocycler)４８０（パーキン エルマー(Perkin El
mer)）で30サイクル実施し、それぞれは94℃で50秒、55
℃で１分および72℃で３分を含んで成った。ＰＣＲ産物
をＮｏｔＩで切断し、そして生じる断片をアガロースゲ
ル電気泳動により精製し；除去されたバンドは期待され
た大きさのものであった。次に、精製された断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ノヴァジェン(Novagen)）で再環化し
て機能性プラスミドを再生させ、そして連結反応混合物
のアリコートを使用して大腸菌(E. coli)ＤＨ５αコン
ピテント細胞（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）を形質転換
した。成長をアンピシリン（100μg/mL）を含有するＬ
Ｂ培地上で選択し、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉ、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩでの制限酵素切断分析のた
め多数の形質転換体から単離した。標的遺伝子のそれぞ
れについて、これらの酵素で正しい切断パターンを生じ
る代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
【０１５１】カナマイシン耐性遺伝子を挿入するため、
上述された２種のプラスミド構築物をＮｏｔＩで切断
し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。断
片のそれぞれをその後、４倍モル過剰の修飾されたカン
(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カートリッジとともに
個別にインキュベーションし、そしてＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（ノヴァジェン(Novagen)）の存在下に標準的連結反
応にかけた。連結反応混合物のアリコートを使用して大
腸菌(E. coli)ＤＨ５αコンピテント細胞（ギブコＢＲ
Ｌ(Gibco BRL)）を形質転換し、そして、成長を、カナ
マイシン（30μg/mL）およびアンピシリン（100μg/m
L）を含有するＬＢ培地上で選択した。崩壊された大腸
菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ遺伝子をもつプラスミドを
制限酵素切断分析により同定した。このプラスミドをＮ
ｃｏＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてその後アガロー
スゲル電気泳動にかけて、挿入されたカナマイシン耐性
遺伝子の存在をチェックした。正しい大きさの断片を生
じる代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
これらのプラスミドのＤＮＡ配列分析は、カナマイシン
耐性遺伝子が双方の標的遺伝子の正しい位置に挿入され
ていることを確認した。 実施例３ 大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ栄養要求体の発生 挿入的に不活性化された大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲ
Ｓ遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを使用して上述さ
れたプラスミド構築物から遊離させ、そしてアガロース
ゲル電気泳動により精製した。断片のそれぞれをその
後、製造元のプロトコールに従い、ＢＴＸトランスフェ
クター(Transfector)１００（バイオテクノロジーズ
アンド エクスペリメンタル リサーチ インク(Biote
chnologiesand Experimental Research Inc.)）を使用
して、電気穿孔法により、大腸菌(E. coli)株ＡＴＣＣ
４７００２（バルバス(Balbas)ら、Gene 136:211-213(1
993)に完全に記述されかつＪＣ７６２３（バッハマン(B
achmann, B.)によりE. coliand Salmonella typhimuriu
m: Cellular and Molecular Biology（ニードハート(Ni
edhardt)ら、編）p.2466、アメリカ微生物学会(America
n Society of Microbiology)、ワシントンＤＣ(1987)）
に記述される）と同遺伝子型）に個別に導入した。遺伝
子置換の最初のレシピエント(recipient)としてのこの
株の選択は、その十分に確立された高ｒｅｃ表現型、お
よび、高頻度の二重交差相同組換えを受ける関連する能
力を基礎とした（ワイマン(Wyman)ら、Proc. Natl. Aca
d.Sci. USA 82:2880-2884(1985)；バルバス(Balbas)
ら、Gene 136:211-213(1993)；バルバス(Balbas)ら、Ge
ne 172:65-69(1996)）。かように、挿入的に不活性化さ
れた大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ遺伝子は、カナマ
イシン選択下で、ＡＴＣＣ４７００２中のそれらの機能
性の染色体の対照物を効率的に置き換えることができる
ことが予期された。
【０１５２】電気穿孔法の後、形質転換された細胞を、
リボフラビン（400μg/mL）で補充された10mLのＳ．
Ｏ．Ｃ．培地（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）中に再懸濁
し、そして37℃で１時間インキュベーションした。カナ
マイシン耐性を、その後、リボフラビン（400μg/mL）
およびカナマイシン（30μg/mL）双方を含有したＬＢプ
レート上で37℃で選択し；コロニーは24〜48時間後に出
現した。正しい染色体組込み事象の表現型の検出をレプ
リカプレート作成(replica-plating)実験により成し遂
げた。崩壊された標的遺伝子のいずれかの二重交差相同
組換えから生じたリボフラビン栄養要求体は、カナマイ
シンに耐性、アンピシリンに感受性であり、かつ、添加
されたリボフラビンの存在下でのみ成長を表すと予期さ
れることができた。この表現型を表す代表的細菌コロニ
ーをさらなる研究のため選択した。
【０１５３】ＡＴＣＣ４７００２は大腸菌(E. coli)
「ノックアウト」を創製するのに優れた株である一方、
ｒｅｃＢＣＤ遺伝子座におけるその複数の突然変異はそ
れをＣｏｌＥ１型プラスミドを増殖させることを不可能
にする（バルバス(Balbas)ら、Gene 172:65-69(199
6)）。結果として、上述されたリボフラビン栄養要求体
は、機能的相補によりプラスミドｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングするのに適さない。この最終目標を達
成するため、従って、挿入的に不活性化されたＬＳおよ
びＲＳ遺伝子を、ＡＴＣＣ４７００２の染色体から適す
る野生型バックグラウンドに移動させることが必要であ
った。この操作を、Ｐ１vlr、およびミラー(Miller, J.
H)によりExperiments in Molecular Genetics、pp.201-
205、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コール
ドスプリングハーバー(1972)に完全に記述されるような
標準的方法論を使用して、一般化されたファージ導入に
より成し遂げた。大腸菌(E.coli)Ｗ３１１０（キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978)）を、挿入的に不活性化されたＬＳおよびＲＳ
遺伝子の受給体株として選択した。ファージ導入の後、
細菌の成長を、カナマイシン（35μg/mL）およびリボフ
ラビン（400μg/mL）で補充されたＬＢ培地上で選択し
た。崩壊された大腸菌(E. coli)ＬＳもしくはＲＳ遺伝
子をもつ安定な形質導入体をその後、ＡＴＣＣ４７００
２について上述されたものと類似のレプリカプレート作
成実験により同定した。かように、個々のコロニーを、
リボフラビン（400μg/mL）を含むもしくは含まない、
ＬＢ培地、クエン酸ナトリウム（7.5mM）、硫酸マグネ
シウム（1.5mM）およびカナマイシン（35μg/mL）を含
有するプレート上にまだらにした(patched)。さらなる
研究およびその後の相補クローニング（下を参照）のた
め選択したＬＳおよびＲＳリボフラビン栄養要求体は添
加されたリボフラビンの存在下で成長することのみ可能
であり、かつ、アンピシリン（100μg/mL）もしくはス
トレプトマイシン（25μg/mL）に耐性でなかった；スト
レプトマイシンに対する感受性はＷ３１１０の特徴であ
るがしかしＡＴＣＣ４７００２の特徴でない。
【０１５４】実施例４ 機能的相補によるホウレンソウＬＳおよびＲＳ遺伝子の
クローニング λ Ｚａｐ II中のホウレンソウ(Spinacea oleracea)
ｃＤＮＡ発現ライブラリーをストラタジーン(Stratagen
e)（カリフォルニア州ラホヤ）から得、そして製造元の
プロトコールに従って集団除去(mass excision)にかけ
た。除去に際し、遊離されたｃＤＮＡ挿入物は、アンピ
シリンに対する耐性を与えるプラスミドベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔに含有され、そしてイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での
誘導に際して大腸菌(E. coli)でのそれらの発現を可能
にする。除去されたプラスミドの生じる混合物をその
後、ＢＴＸトランスフェクター(Transfector)１００
（バイオテクノロジーズ アンド エクスペリメンタル
リサーチ インク(Biotechnologies and Experimenta
l Research Inc.)）および製造元の条件を使用して、大
腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳリボフラビン栄養要求体
（双方ともＷ３１１０の誘導体）に電気穿孔した。形質
転換された細胞を、Ｂアガー（クエン酸ナトリウム（7.
5mM）、硫酸マグネシウム（1.5mM）、カナマイシン（35
μg/mL）、アンピシリン（100μg/mL）およびＩＰＴＧ
（0.6mM）を含有するＬＢ培地）を含有したプレート上
で、添加されたリボフラビンの非存在下での成長につい
て選択した。37℃での48時間のインキュベーション期間
の後、細菌の成長を観察し、そして、リボフラビン非依
存性コロニーを、大腸菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ栄養
要求体についてそれぞれ約4.2×10-6および約3.1×10-7
の頻度で回収した。標的遺伝子のそれぞれについて、プ
ラスミドＤＮＡを代表的コロニーから単離し、そしてさ
らなる分析にかけた；選択されたプラスミドの双方は、
適切な大腸菌(E. coli)栄養要求体を高頻度でリボフラ
ビン原栄養性に形質転換することが可能であった。これ
らのプラスミドに含有されたｃＤＮＡ挿入物を、その
後、蛍光ジデオキシターミネーターおよび注文設計され
たプライマーを使用し、ＡＢＩ３７７自動化シークェン
サー（アプライド バイオシステムズ(Applied Biosyst
ems)）で完全に配列決定した。
【０１５５】大腸菌(E. coli)ＲＳ栄養要求体を救出し
た(rescue)およそ1.2kbpのホウレンソウｃＤＮＡ挿入物
は、明らかにリボフラビンシンターゼをコードする。こ
のタンパク質の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配
列およびその予測される一次アミノ酸配列がそれぞれ配
列番号３３および配列番号３４に述べられる。クローニ
ングされた植物タンパク質と、大腸菌(E. coli)、枯草
菌(B. subtilis)、Ｐ．レイオグナチ(P. leiognathi)、
Ｐ．ホスホレウム(P. phosphoreum)およびＳ．セレビシ
エ(S. cerevisiae)からのもの（ジェンバンク(GenBank)
受託番号、それぞれＸ６９１０９、Ｘ５１５１０、Ｍ９
００９４、Ｌ１１３９１およびＺ２１６２１）を包含す
る既知の微生物ＲＳ相同物との間に間違えようのない類
似性が存在する一方、若干の有意の差異もまた存在す
る。最も明らかなものは、ホウレンソウＲＳがずっとよ
り大きなタンパク質であるということである。微生物で
のその対照物と比較して、それはそのＮ末端に付加的な
69アミノ酸を保有する（図１）。このＮ末端ポリペプチ
ド伸長はＳｅｒおよびＴｈｒ残基が豊富で相対的に塩基
性であり、そしてそれ自体、葉緑体輸送ペプチドに似て
いる（ゲイヴェル(Gavel)ら、FEBS Lett. 261:455-458
(1990)）。この観察結果は、ホウレンソウＲＳは核にコ
ードされた前駆体タンパク質として合成され、そしてそ
の後葉緑体に目標を向けられ、そこでそれがその成熟形
態にタンパク質分解的にプロセシングされることを示唆
した。実際、図１に示される配列の整列（ジェネティク
ス コンピュータ グループ積み重ねプログラム(Genet
ics Computer Group Pileup program)で生じられる）を
基礎とすれば、成熟のための予測された切断部位はホウ
レンソウＲＳ前駆体のアミノ酸残基69と70との間に存在
し、22.8kDaの分子質量をもつ成熟ポリペプチド（配列
番号８）を生じさせる。この割り当て(assignment)が正
しいことは、全ての既知の微生物ＲＳ相同物が５ペプチ
ドモチーフＭｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅで
開始するという事実により強く支持され、このモチーフ
は機能に明らかに決定的である（サントス(Santos)ら、
J. Biol. Chem. 270:437-444(1995)）。
【０１５６】成熟ホウレンソウＲＳが葉緑体に局在化さ
れるという概念はまた、実験的証拠によっても支持され
る。かように、精製された組換えタンパク質（下を参
照）に対し向けられる抗体は、ホウレンソウの葉緑体抽
出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析にかけら
れる場合に、期待された大きさのポリペプチドと特異的
に相互作用する。他の実験は、ホウレンソウＲＳ前駆体
がプラスミドに組み入れられ(imported)、そこでそれは
その成熟形態にタンパク質分解的に切断されることを明
らかに示している。これらの研究において、完全長のホ
ウレンソウＲＳ前駆体を、クローニングされた遺伝子の
インビトロ転写／翻訳により［Ｓ35］−メチオニンで標
識し、そして、完全な単離されたホウレンソウ葉緑体を
使用するインビトロでのタンパク質の組み入れアッセイ
にかけた（クライン(Cline)ら、J.Biol. Chem. 260、36
91-3696(1988)；ビイタネン(Viitanen)ら、J. Biol. Ch
em.263、15000-15007(1988)）。
【０１５７】図１に示される多様な微生物相同物のう
ち、成熟ホウレンソウＲＳ（配列番号８）が、一次アミ
ノ酸配列レベルで酵母のタンパク質と最大の類似性を示
す（例えばおよそ47％の同一性）。対照的に、成熟ホウ
レンソウＲＳは、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtili
s)、Ｐ．レイオグナチ(P. leiognathi)およびＰ．ホス
ホレウム(P. phosphoreum)からの対応するタンパク質に
それぞれおよそ35％、42％、34％および40％のみ同一で
ある。植物タンパク質に独特であるＮ末端の葉緑体に対
して標的化された配列を考慮に入れれば、進化の相違は
より大きくさえなる。
【０１５８】類似の観察を、リボフラビン原栄養性を大
腸菌(E. coli)ＬＳ栄養要求体に回復することが可能で
あったホウレンソウｃＤＮＡ挿入物で行った。この場
合、救助するプラスミドのおよそ1.3kbpのＤＮＡ断片
は、通常よりずっと大きなＬＳ相同物をコードしたＯＲ
Ｆを含有し；後者のＤＮＡ配列および予測アミノ酸配列
がそれぞれ配列番号２７および配列番号２８に示され
る。ホウレンソウＲＳ前駆体での状況と類似して、クロ
ーニングされたホウレンソウＬＳの付加的長さ（酵母を
包含する微生物でのその相同物に関して）は、完全に、
Ｎ末端の葉緑体輸送ペプチド様伸長に帰される（図
２）。かように、高等植物のリボフラビン生合成の少な
くとも最後の２段階は葉緑体で起こる。免疫および葉緑
体タンパク質輸入実験（ホウレンソウＲＳについて上述
されたものに類似）は、ホウレンソウＬＳ前駆体もまた
プラスチドに標的化されたことを示したとは言え、この
場合は、成熟タンパク質の正確な開始を確実に予測する
ことがより困難である。既知の微生物ＬＳ相同物のなか
でさえ、最初の15〜20個のＮ末端アミノ酸残基が乏しく
保存されることが明らかである。にもかかわらず、図２
の配列の整列から、成熟に決定的な切断事象がホウレン
ソウＬＳ前駆体のＡｌａ６６とＶａｌ６７との間で起こ
り、およそ16.5kDaの予測された分子質量をもつポリペ
プチドを生じることがありそうである。この概念は実験
的に決定されるべきままである一方、この割り当てを基
礎とした成熟ホウレンソウＬＳの予測アミノ酸配列が配
列番号２に与えられる。その葉緑体に目標を向ける配列
なしでさえ、成熟ホウレンソウＬＳは、大腸菌(E. col
i)、Ａ．プリューロニューモニエ(A. pleuropneumonia
e)、枯草菌(B. subtilis)、Ｐ．ホスホレウム（P. phos
phoreum)およびＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)のその
対照物（例えば図２に示される他のタンパク質）にそれ
ぞれ49％、44％、43％および29％のみ同一であることに
注意せよ。
【０１５９】実施例５ 大腸菌(E. coli)での成熟ホウレンソウＬＳおよびＲＳ
の発現 実施例４で同定された、クローニングされたホウレンソ
ウＲＳ前駆体の葉緑体に対して標的化された配列を、プ
ライマー１１（配列番号２３）および１２（配列番号２
４）を使用する標準的ＰＣＲ反応により除去した。プラ
イマー１１（５’−ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＣＡ
ＴＡＴ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＧＴ Ｔ
ＧＡ Ａ−３’）（配列番号２３）は、ホウレンソウＲ
Ｓ前駆体のヌクレオチド208〜228（配列番号３３）にハ
イブリダイゼーションする。それは成熟タンパク質（配
列番号８）の予測された開始で大腸菌(E. coli)でタン
パク質合成を開始するよう設計され、かつ、クローニン
グの目的上、イニシエイターＭｅｔ残基から上流に唯一
のＮｄｅＩ部位を組み込む。プライマー１２（５’−Ｃ
ＡＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＡＴ
Ｇ ＴＧＡ ＡＴＴＴＧＧ ＴＡＧ ＧＡＴ Ｃ−
３’）（配列番号２４）は、ＯＲＦの他端でヌクレオチ
ド820〜840にハイブリダイゼーションし、そしてそのタ
ンパク質の終止コドンをちょうど過ぎて唯一のＢａｍＨ
Ｉ部位を導入する。ＰＣＲ増幅の標的は、ホウレンソウ
ＲＳ前駆体のｃＤＮＡ挿入物を含有する精製されたプラ
スミドであった。予測されたＰＣＲ産物はいかなる修飾
も伴わない完全長の成熟ホウレンソウＲＳをコードする
（配列番号８）。
【０１６０】類似の戦略を使用して、大腸菌(E. coli)
での発現のため、クローニングされたホウレンソウＬＳ
前駆体から輸送ペプチドを除去した。しかしながら、こ
の場合、予測された輸送ペプチド切断部位にイニシエイ
ターＭｅｔ残基をもつ短くされた植物タンパク質を提供
することもまた必要であった。なぜなら、天然に存在す
るものが欠けていたからである。これはプライマー１３
（配列番号２５）および１４（配列番号２６）を使用し
て、ホウレンソウＬＳ前駆体のｃＤＮＡ挿入物を含有す
る精製されたプラスミドを用いる標準的ＰＣＲ反応で成
し遂げられた。プライマー１３（５’−ＣＴＡ ＣＴＣ
ＡＴＴ ＴＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＣＴ
ＴＧＡ ＡＧＧ ＴＴＡ ＴＧＴ ＣＡＣ−３’）（配
列番号２５）はホウレンソウＬＳ前駆体のヌクレオチド
205〜224（配列番号２７）にハイブリダイゼーション
し、そして、成熟タンパク質（配列番号２）の予測され
る開始Ｖａｌ６７により現在のところ占有される位置に
イニシエイターＭｅｔ残基を導入する（配列番号２
８）。このプライマーはまた、導入されたイニシエイタ
ーＭｅｔ残基に唯一のＮｄｅＩ部位も提供し、そして２
番目のアミノ酸をＡｒｇからＡｓｎに変える。これらの
変化が酵素活性を損なわないとみられ、かつ、修飾され
た植物タンパク質の細菌の発現を実際に向上しうること
が推論された。なぜなら、大腸菌(E. coli)および枯草
菌(B. subtilis)双方のＬＳ相同物はジペプチド配列Ｍ
ｅｔ−Ａｓｎで開始するからである。プライマー１４
（５’−ＣＡＴＣＴＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＧＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴＧＡＴ ＧＴＴ
ＣＧ−３’）（配列番号２６）は、ホウレンソウＬＳ前
駆体の他端でヌクレオチド648〜667にハイブリダイゼー
ションし、そして終止コドンをちょうど過ぎて唯一のＢ
ａｍＨＩ部位を提供する。かように、最初の２アミノ酸
を除き、プライマー１３および１４で発生されるＰＣＲ
断片は、配列番号２に示されるものと同一の一次アミノ
酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。
【０１６１】２個の標的遺伝子の増幅後、このＰＣＲ断
片をＮｄｅＩおよびＢａｎＨＩで切断し、そして類似に
切断されたｐＥＴ−２４ａ（＋）（ノヴァジェン(Novag
en)）に個々に連結した。後者はＴ７プロモーターの制
御下にある高レベル大腸菌(E. coli)発現ベクターであ
る。この連結反応混合物のアリコートを、その後、製造
元のプロトコールに従い、ＢＴＸトランスフェクター(T
ransfector)１００（バイオテクノロジーズ アンド
エクスペリメンタル リサーチ インク(Biotechnologi
es and Experimental Research Inc.)）を使用して大腸
菌(E. coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換するのに使
用した。形質転換された細胞をカナマイシン（50μg/m
L）を含有するＬＢ培地上で培養し、そして37℃でイン
キュベーションして、単一のコロニーを得た。正しい挿
入物をもつプラスミドをもつクローンを、個々の再懸濁
されたコロニーおよび適切なプライマー対（すなわち、
成熟ホウレンソウＲＳ構築物についてプライマー１１お
よび１２、ならびに成熟ホウレンソウＬＳ構築物につい
てプライマー１３および１４）を使用するＰＣＲ反応に
より同定した。この処置の後、標的遺伝子のそれぞれの
代表的クローンをさらなる操作のため選択し、そしてこ
れらの２株を下述されるような組換えタンパク質の産生
のため使用した。これらの株からのプラスミドＤＮＡを
完全に配列決定してＰＣＲの誤りをチェックし、そして
双方の場合で見出されなかった。
【０１６２】成熟ホウレンソウＬＳおよびＲＳタンパク
質の過剰発現のため、上述されたＢＬ２１（ＤＥ３）株
をカナマイシン（50μg/mL）を含有するＬＢ培地で37℃
で成長させた。細胞を、約1.0のＡ600nmでＩＰＴＧ（１
mM）で誘導し、そして３時間後に遠心分離により収穫し
た。双方の植物タンパク質が総可溶性タンパク質の15％
を越えるレベルで細菌宿主中で十分に発現された。その
後の操作は０〜４℃でであった。組換えホウレンソウＲ
Ｓを含有する細胞ペレットを2.5体積の0.1Mリン酸カリ
ウム（ｐＨ7.2）、10mM亜硫酸ナトリウム、10mMＥＤＴ
Ａに再懸濁し、そしてフレンチ圧小室(French pressure
cell)を20,000psiで２回通過させた。破片を遠心分離
（105×g、１時間）により除去し、そして１mLあたり44
mgのタンパク質を含有する細胞を含まない抽出物をグリ
セロール（５％）で補充し、そして後の使用のため−80
℃で保存した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを
使用して、ロウリー(Lowry)らの方法(ロウリー(Lowry)
ら、J. Biol. Chem. 193:265-275(1951)）により測定し
た。組換えホウレンソウＬＳを含有する細胞ペレットを
同一の様式で崩壊させたが、しかし、細胞の再懸濁に使
用された緩衝液は100mMトリス−塩酸（ｐＨ7.7）、５mM
硫酸マグネシウム、0.03mg/mLＤＮアーゼＩ（シグマ(Si
gma)）、0.5mMフェニルメチルスルホニルフロリド、１m
Mジチオスレイトールであり、かつ、細胞を含まない抽
出物のタンパク質濃度は39mg/mLであった。細胞を含ま
ない抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、双方の植物タン
パク質が総可溶性タンパク質の20％を越えるレベルで細
菌宿主中で十分に発現されたことを示した。
【０１６３】実施例６ 組換え成熟ホウレンソウＲＳの精製 組換えホウレンソウＲＳを含有する大腸菌(E. coli)の
細胞を含まない抽出物のアリコート（0.5mL）を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で１：１に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター（ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192）を通
して濾過した。サンプル全体をその後、緩衝液Ｑ（50mM
トリス−塩酸、ｐＨ7.7、10mM亜硫酸ナトリウム、１mM
ＥＤＴＡ）で25℃で予め平衡化されたモノＱ(Mono Q)Ｈ
Ｒ５／５カラム（ファルマシアバイオテク インク(Pha
rmacia Biotech Inc)）に適用した。このカラムを０〜
1.0M塩化ナトリウム（緩衝液Ｑ中）の直線濃度勾配（30
mL）で1.0mL/分で展開し、そして１mLのフラクションを
収集した。ホウレンソウＲＳが溶出する濃度勾配の位置
を、15％ゲルおよびクマシーブルー染色を使用してＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（レムリ(Laemmli U)、Nature 227:680-68
5(1970)）により決定した。その後、0.167〜0.233M塩化
ナトリウムの間で溶出するカラムフラクションを合わ
せ、そしてセントリコン(Centricon)−１０（アミコン
インク(Amicon Inc)）で４℃で最終体積450μLに濃縮
した。次の段階で、この素材の半分を、0.3M塩化ナトリ
ウムを含有する緩衝液Ｑで予め平衡化された7.5×600mm
のＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（トーソー株
式会社(TOSOH Corp.)）に適用した。このカラムを1.0m
L/分（25℃）の流速で展開し、そして高度に精製された
ホウレンソウＲＳは15.2〜16.2分の間に溶出した。後者
を、サンプルの残存する半分を同一の様式で処理する間
氷上に保った。２個のゲル濾過カラムからのピークフラ
クションを合わせ、グリセロール（５％）で補充し、１
mLあたり6.6mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用
のため−80℃で保存した。精製されたタンパク質の収量
は2.9mgであり、細胞を含まない抽出物中に存在した総
タンパク質の13％に相当した。過負荷されたクマシー染
色ゲルの可視的検分は、最終調製物が95％以上純粋であ
ったことを示唆した。
【０１６４】精製された組換えホウレンソウＲＳのエド
マン分解は、その最初の21アミノ酸が、その構築で使用
されたＰＣＲ戦略に従い、配列番号８に示されるタンパ
ク質のものに同一であることを示した。これは、さら
に、組換えタンパク質のＮ末端が精製処置の間完全なま
まであったことを示す。電子スプレーイオン化質量分析
法により決定されるように、精製された組換えホウレン
ソウＲＳのプロモーターの分子質量は22808.3ダルト
ン、すなわちそのＤＮＡ配列から予測されたもの（2280
7.26ダルトン）と優れた一致にある値であった。大腸菌
(E. coli)（バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:
632-637(1980)）および酵母（サントス(Santos)ら、J.
Biol. Chem. 270:437-444(1995)）のＲＳ相同物（その
双方は天然の状態で三量体である）と類似して、組換え
ホウレンソウＲＳは65kDaの見かけの分子質量で分析的
ゲル濾過の間に溶出した。より重要には、成熟植物タン
パク質は触媒的に活性である。下述されるインビトロ酵
素アッセイにおいて、精製された組換えホウレンソウＲ
Ｓは25℃でおよそ0.08/秒の回転数を表した（プロモー
ターを基礎として）。比較として、37℃でのＳ．セレビ
シエ(S. cerevisiae)（サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995)）および枯草菌（B. subtili
s)（バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632-637
(1980)）のＲＳの報告された回転数は、それぞれ0.13/
秒および0.33/秒である。酵素反応が最低２のＱ１０
（温度係数）により特徴づけられると仮定すれば、これ
らの観察結果は、精製された組換えホウレンソウＲＳが
おそらく完全に活性であることを示唆する。
【０１６５】実施例７ 組換え成熟ホウレンソウＬＳの精製および物理的特性 組換えホウレンソウＬＳを含有する大腸菌(E. coli)の
細胞を含まない抽出物のアリコート（0.5mL）を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で１：１に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター（ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192）を通
して濾過した。サンプル全体をその後、組換えホウレン
ソウＲＳについて上述された同一の緩衝液および条件を
使用して、モノＱ(Mono Q)ＨＲ５／５カラムで分画し
た。0.367〜0.433M塩化ナトリウムの間に溶出する物質
を合わせ、450μLに濃縮し、そして、組換えホウレンソ
ウＲＳについて、正確に、上述されたように、ゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。高度に精製されたホウレ
ンソウＬＳは、10.15〜10.85分の間に溶出する鋭いピー
クとして大きさを分ける(sizing)カラムから出現し、そ
してこの物質をグリセロール（５％）で補充し、１mLあ
たり12.1mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用のた
め−80℃で保存した。精製されたタンパク質の最終的収
量は4.3mgであり（細胞を含まない抽出物に存在する総
タンパク質のほぼ22％）、そしてこの調製物はクマシー
染色ゲルから判断されるように本質的に均質であった。
【０１６６】成熟組換えホウレンソウＬＳのヌクレオチ
ド配列は、16534.71ダルトン、すなわち電子スプレーイ
オン化質量分析法を使用して精製されたタンパク質で得
られたもの（16536.3ダルトン）と事実上同一である値
を予測する。植物ＬＳが、大腸菌(E. coli)（メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(1996)）
および枯草菌(B. subtilis)（バッハー(Bacher)ら、J.
Biol. Chem. 255:632-637(1980)）相同物のように60個
の同一のサブユニットから成る中空の球状粒子を形成す
ると仮定すれば、その本来の分子質量は約992kDaである
はずである。実際のところ、分析的ゲル濾過の間、精製
された組換えホウレンソウＬＳは、約823kDaの見かけの
分子質量を表した。従って、このリボフラビン生合成酵
素の四次構造は細菌から高等植物までの進化で高度に保
存されていると思われるとみられる。エドマン分解は、
この組換えタンパク質の最初の２個のＮ末端アミノ酸残
基が、以前に記述されたように、ＰＣＲによりＶａｌ−
ＡｒｇからＭｅｔ−Ａｓｎに正しく変えられていたこと
を確認した。これらの置換および葉緑体に目標を向ける
配列の除去にもかかわらず、精製された組換えホウレン
ソウＬＳはなお触媒活性を保持した。25℃で、下述され
るインビトロ酵素アッセイを使用して、その回転数は0.
013/秒であった（プロモーターを基礎として）。この値
は、全て37℃で測定された、精製された大腸菌(E. col
i)、酵母および枯草菌(B. subtilis)の酵素について報
告された回転数（0.06/秒）と合理的一致にある（キス
(Kis)ら、Biochemistry 34:2883-2892(1995)；メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(199
6)）。かように、組換えホウレンソウＬＳもまた完全に
活性である可能性が非常に高い。
【０１６７】実施例８ ＲＳおよびＬＳの基質の調製 ６，７−ジメチル−８−（１’−Ｄ−リビチル）ルマジ
ン（ＤＭＲＬ）を、以前に記述されたように（プロート
(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、Methods
in Enzymology（マコーミック(McCormick, D.B.)とラ
イト(Wright, L.D.)、編）vol. 18、part B、pp.515-53
8、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨー
ク(1971)）合成し、そして、水ないしメタノールの濃度
勾配で展開されるＣ−18カラムでのＨＰＬＣにより精製
した。精製された物質をロトバップ(rotovap)で乾固と
し、そして後の使用のため−20℃で保存した。
【０１６８】４−リビチルアミノ−５−アミノ−２，６
−ジヒドロキシピリミジン（ＲＡＡＤＰ）を、触媒的水
素化（プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey,
R.A.)、Methods in Enzymology（マコーミック(McCormi
ck, D.B.)とライト(Wright,L.D.)、編）vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971)）により４−リビチルアミノ−
５−ニトロソ−２，６−ジヒドロキシピリミジンから調
製した。40mLの反応混合物は、10mM酢酸に溶解された0.
4mmolの後者の化合物および20mgの10％炭素上パラジウ
ム(palladium on carbon)を含有した。25℃での一夜の
インキュベーション期間（50psiの水素下での穏やかな
振とうを伴う）の後、触媒を濾過により除去し、そして
ＲＡＡＤＰを含有する濾液をアリコートで−80℃で保存
した。
【０１６９】３，４−ジヒドロキシブタノン４−リン酸
（ＤＨＢＰ）はＤ−リボース５−リン酸から酵素的に調
製した。反応混合物は、50mMトリス−塩酸（ｐＨ7.
5）、20mM塩化マグネシウム、20mMＤ−リボース５−リ
ン酸、10単位／mLホスホリボイソメラーゼ（シグマ(Sig
ma)、カタログ番号P7434）および0.3単位／mL大腸菌(E.
coli)ＤＨＢＰシンターゼを含有した。25℃で２時間
後、反応は完了に到達し、そしてＤＨＢＰを含有する溶
液のアリコートを−80℃で保存した。
【０１７０】実施例９ リボフラビンシンターゼアッセイ リボフラビンシンターゼアッセイを、50mMトリス−塩酸
（ｐＨ7.5）中に0.1mMＤＭＲＬを含有する１mLの反応混
合物を使用して25℃で行った。反応は精製された組換え
ホウレンソウＲＳの添加により開始し、そして反応の初
期速度を470nmで継続的に測定した。470nmで9500のモル
吸光係数（ε）を使用してリボフラビンの形成を計算し
た（プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.
A.)、Methods in Enzymology（マコーミック(McCormic
k, D.B.)とライト(Wright, L.D.)、編）vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971)）。
【０１７１】阻害剤のスクリーニングを96穴プレートで
実施した。潜在的阻害性化合物をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）に溶解し（10mg/mL）、そしてその後、１
％水性ＤＭＳＯ中0.1mg/mLの濃度まで水で連続的に希釈
した。反応混合物（計0.21mL）は、25℃で、0.115mLの1
00mMトリス−塩酸（ｐＨ7.5）中ＤＭＲＬ（0.035mM）お
よび0.085mLの潜在的阻害性化合物（0.1mg/mL）を含有
した。酵素で反応を開始する前に470nmでの吸光度を記
録した。反応を、0.01mLの精製された組換えホウレンソ
ウＲＳ（0.28mg/mL）で開始し、そして25℃で３分のイ
ンキュベーション後、プレートを470nmで読んだ。最初
の吸光度の読みを２番目から差し引いてリボフラビン形
成速度を与えた。96穴プレートのカラム１は化合物を含
有せず、そしてこれらの穴での反応は阻害されない対照
としてはたらいた。リボフラビン形成速度を低下させた
化合物（阻害されない対照反応に比較して）を１mLの確
認アッセイで追跡し、ＩＣ50を決定した。
【０１７２】実施例１０ ルマジンシンターゼアッセイ ルマジンシンターゼアッセイを、25℃で50mMトリス−塩
酸（ｐＨ7.5）中に0.05mMＲＡＡＤＰおよび0.05mMＤＨ
ＢＰを含有する１mLの反応混合物を使用して行った。反
応をその後、精製された組換えホウレンソウＬＳの添加
により開始し、そして反応の初期速度を408nmの吸光度
で継続的にモニターした。408nmで10,000のモル吸光係
数（ε）を使用してＤＭＲＬの形成速度を計算した（プ
ロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、M
ethods in Enzymology（マコーミック(McCormick, D.
B.)とライト(Wright, L.D.)、編）vol. 18、part B、p
p.515-538、アカデミックプレス(Academic Press)、ニ
ューヨーク(1971)）。
【０１７３】阻害剤のスクリーニングを96穴プレートで
実施する。潜在的阻害性化合物を10％水性ＤＭＳＯに１
mg/mLの濃度に溶解する。反応混合物（計0.21mL）を、2
5℃で、0.005mLの潜在的阻害性化合物（1.0mg/mL）を50
mMトリス−塩酸（ｐＨ7.5）中に0.05mMＤＨＢＰ、0.05m
MＲＡＡＤＰを含有する0.195mLの溶液に添加することに
より調製する。反応を、その後、0.01mLの精製された組
換えホウレンソウＬＳ（1.6mg/mL）で開始し、そして反
応の進行を408nmで５分間継続的にモニターする。96穴
プレートのカラム１は試験化合物を含有せず、そしてこ
れらの穴でのＤＭＲＬ形成速度は阻害されない対照とし
てはたらく。ＤＭＲＬ形成速度を低下させる化合物（阻
害されない対照に比較して）を、１mLの確認アッセイで
追跡し、ＩＣ50を決定する。
【０１７４】実施例１１ 他の植物および真菌のＲＳおよびＬＳ遺伝子 実施例４に記述された方法論を使用して、いくつかの他
の植物および真菌のＬＳおよびＲＳのｃＤＮＡが、大腸
菌(E. coli)リボフラビン栄養要求体の機能的相補によ
りクローニングされている。これらは、アラビドプシス
ＲＳ、タバコＬＳおよびアラビドプシスＬＳの核にコー
ドされた前駆体タンパク質、ならびに、コメ胚真菌マグ
ナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)からの完全長
成熟ＲＳおよびＬＳタンパク質を包含する。これらのタ
ンパク質のＯＲＦのヌクレオチド配列は、それぞれ配列
番号３５、配列番号２９、配列番号３１、配列番号１１
および配列番号３７に詳細に記録され、また、それらの
対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３６、配列番
号３０、配列番号３２、配列番号１２および配列番号３
８に与えられる。それからアラビドプシスＬＳおよびＲ
Ｓ遺伝子ならびにタバコＬＳ遺伝子がクローニングされ
たλ ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ストラタジーン(S
tratagene)から商業的に入手可能である（それぞれカタ
ログ番号937010および936002）。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthe grisea)ＲＳ遺伝子が得られた
ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、λ ＺｉｐＬｏｘベクタ
ー（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）中にポリリンカー領域
のＮｏｔＩとＳａｌＩ切断部位との間に含有され、そし
て慣用方法（マニアティス(Maniatis)）を使用して、単
離されたｍＲＮＡから調製した。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthegrisea)ＬＳ遺伝子が得られた
ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ストラタジーン(Stratag
ene)から入手可能なプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位
との間にクローニングし、そしてまた標準的処置（マニ
アティス(Maniatis)）を使用して、単離されたｍＲＮＡ
から調製した。ホウレンソウＬＳおよびＲＳ前駆体遺伝
子のクローニングについて上述されたように（実施例４
でのように）、多様なλ ｃＤＮＡ発現ライブラリーを
まず集団除去を受けさせてプラスミドｃＤＮＡライブラ
リーを生じさせ、これをその後電気穿孔法を介して大腸
菌(E. coli)ＬＳおよびＲＳ栄養要求体（Ｗ３１１０誘
導体）に導入した。この処置の後、形質転換体を、添加
されたリボフラビンの非存在下での成長について（Ｂア
ガーを含有するプレート上で）選択し、そして救助する
プラスミドのｃＤＮＡ挿入物を単離し、かつ注文設計さ
れたいプライマーを使用して完全に配列決定した。
【０１７５】図３に示されるように、クローニングされ
たホウレンソウおよびアラビドプシスのＲＳは非常に類
似である。双方のタンパク質は、それらのＮ末端に葉緑
体に目標を向ける配列（図３中の囲まれた残基）をもつ
より大きな分子量の前駆体として合成される。２個の植
物種の輸送ペプチドは匹敵する長さのものであるとは言
え、それらは高度に互いに異なり、また、一次アミノ酸
配列のレベルで相互にほとんど類似度をもたない。対照
的に、成熟ホウレンソウおよびアラビドプシスのＲＳは
十分に保存され、それらの残基のほぼ70％が同一であ
る。これらの観察結果は驚くことでない。なぜなら、リ
ブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキ
シゲナーゼ（マズール(Mazur)ら、Nucl. Acids Res. 1
3:2373-2386(1985)）の小サブユニットの前駆体を包含
する、大部分の核にコードされる葉緑体タンパク質は、
その分子の成熟部分でよりそれらの葉緑体に対して標的
化された配列でずっとより大きな種間の(species-to-sp
ecies)変動を表すからである。２種の植物ＲＳ相同物は
また、現在配列決定されている細菌および真菌のＲＳ相
同物に存在しない多数のポリペプチドモチーフも保有す
る。植物に独特であるこれらの高度に保存された領域の
いくつかが高等植物のＲＳの触媒および／もしくは調節
特性に特異的に影響し、それにより除草剤として有用で
あり得る酵素阻害剤の設計に価値ある洞察を提供しうる
ことが可能である。
【０１７６】また機能的相補によりクローニングされた
ホウレンソウ、タバコおよびアラビドプシスのＬＳ前駆
体タンパク質の比較は類似の状況を提供する（図４）。
再度、３種の前駆体の葉緑体輸送ペプチドは乏しく保存
され（囲まれた残基）る一方、成熟タンパク質はアミノ
酸配列レベルで72〜76％の同一性を表す。加えて、全３
種の植物タンパク質は、それらのＣ末端にアミノ酸残基
の独特の伸長（例えばＡＳＬＦＥＨＨＬＫ（配列番号３
９））、すなわち微生物ＬＳ相同物で高度に相互に異な
るポリペプチドの領域を保有する。これら９残基が３種
の異なる植物種について同一であることは、それらが高
等植物タンパク質の機能性に特に重要でありうることを
示唆する。この観察結果を基礎とすれば、本明細書に記
述される精製された植物ＬＳタンパク質でのさらなる構
造的および機械的研究が、特異的に除草性である酵素阻
害剤の合理的設計を大きく補助することができることが
予期される。
【０１７７】本発明までに配列決定されていた唯一の真
菌のＬＳおよびＲＳ相同物はＳ．セレビシエ(S. cerevi
siae)のものである（ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramir
ez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995)；サン
トス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(199
5)）。これらのタンパク質は、機能的相補により本研究
でクローニングされたマグナポルテ グリセア(Magnapo
rthe grisea)ＬＳおよびＲＳタンパク質にほとんど類似
度をもたない。２種の真菌のＲＳ相同物は一次アミノ酸
配列レベルで47％のみ同一である。類似の保存の程度
は、マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)と
Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)のＬＳタンパク質との
間で観察される（51％同一性）一方、前者は、他の既知
の微生物相同物より有意に長い。さらに、このタンパク
質の付加的長さは、高等植物のＬＳおよびＲＳ前駆体に
ついて上述されたような切断可能なＮ末端の目標に向け
る配列の存在のためではない。代わりに、それは、その
タンパク質のほぼ中央の右に挿入されていると思われる
独特のポリペプチド区分を保有し；他のＬＳ相同物との
配列の整列を基礎とすれば、付加的残基（主としてＳｅ
ｒおよびＴｈｒから成る）はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)ＬＳのアミノ酸74〜104に対応する
（配列番号３８）。この観察結果の重要性は未だ理解さ
れないが、しかし、それは、コメ胚の処理での使用のた
めの新規殺真菌剤の開発において実用的応用性を有し得
る。
【０１７８】なお、本発明の主要な特徴もしくは態様を
以下に挙げる。
【０１７９】１．（ａ）配列番号２、配列番号４および
配列番号６から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片； （ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６から成
る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類似で
ある単離された核酸断片； （ｃ）配列番号２、配列番号４および配列番号６から成
る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも72％の同
一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
断片；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物ＬＳ
酵素をコードする単離された核酸断片。
【０１８０】２．配列番号１、配列番号３および配列番
号５から成る群から選択される、前記１の単離された核
酸断片。
【０１８１】３．植物がホウレンソウ、タバコもしくは
アラビドプシスである、植物のＬＳ酵素をコードする前
記１の単離された核酸断片。
【０１８２】４．前記１の単離された核酸断片によりコ
ードされるポリペプチド。
【０１８３】５．配列番号２、配列番号４および配列番
号６から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくと
も72％の同一性を有する、請求項２のポリペプチド。
【０１８４】６．配列番号２、配列番号４および配列番
号６から成る群から選択される、請求項２のポリペプチ
ド。
【０１８５】７．適する調節配列に操作可能に連結され
た、前記１の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺
伝子。
【０１８６】８．宿主細胞および前記４のキメラ遺伝子
を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【０１８７】９．宿主細胞が植物細胞である、前記５の
形質転換された宿主細胞。
【０１８８】１０．宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記５の形質転換された宿主細胞。
【０１８９】１１．（ａ）宿主細胞を請求項４のキメラ
遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のＬＳ酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のＬＳ酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
【０１９０】１２．（ａ）前記１の核酸断片でｃＤＮＡ
もしくはゲノムライブラリーに探りを入れること； （ｂ）前記１の核酸断片とハイブリダイゼーションする
ＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るｃ
ＤＮＡもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のＬＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする核酸断片を得る方法
であって、配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断片
が、植物のＬＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする方法。
【０１９１】１３．（ａ）配列番号１、配列番号３およ
び配列番号５から成る群から選択される配列の一部に対
応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；
そして（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、およびクローニングベクターの配列を表すプライマ
ーを使用して、クローニングベクターに存在するｃＤＮ
Ａ挿入物を増幅すること、を含んで成る、植物のＬＳ酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードする核酸断片を得る方法であって、増幅された
ｃＤＮＡ挿入物が植物のＬＳ酵素をコードするアミノ酸
配列の一部をコードする方法。
【０１９２】１４．前記７もしくは８の方法の産物。
【０１９３】１５．前記１の単離された核酸断片により
コードされる植物のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 （ａ）適する微生物宿主細胞の内因性ＬＳ遺伝子を崩壊
させて微生物宿主細胞の成長を添加されたリボフラビン
に依存性とすること； （ｂ）段階（ａ）の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のＬＳ酵素をコードしかつ微生物宿主細胞によるその発
現を可能にする最低１個の適する調節配列に操作可能に
連結された、前記１の単離された核酸断片を含んで成る
キメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ植物ＬＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること； （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
【０１９４】１６．核酸断片が配列番号１、配列番号３
および配列番号５から成る群から選択され、かつ、ＬＳ
酵素が、配列番号２、配列番号４および配列番号６から
成る群から選択される、前記１０の方法。
【０１９５】１７．前記１の単離された核酸断片により
コードされる植物のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 （ａ）宿主細胞を、植物のＬＳ酵素をコードする前記１
の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質
転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低１個の
適する調節配列に操作可能に連結され； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
（ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、植物の
ＬＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される植物の
ＬＳ酵素を精製すること； （ｄ）植物のＬＳ酵素を目的の化合物と接触させるこ
と；そして （ｅ）目的の化合物の非存在下での植物のＬＳ酵素の活
性に関して植物のＬＳ酵素の活性を低下させる目的の化
合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
る方法。
【０１９６】１８．核酸断片が、配列番号１、配列番号
３および配列番号５から成る群から選択され、かつ、Ｌ
Ｓ酵素が、配列番号２、配列番号４および配列番号６か
ら成る群から選択される、前記１１の方法。
【０１９７】１９．（ａ）配列番号８および配列番号１
０から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしく
は本質的部分をコードする単離された核酸断片； （ｂ）配列番号８および配列番号１０から成る群から選
択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする単離された核酸断片に本質的に類似である単離さ
れた核酸断片； （ｃ）配列番号８および配列番号１０から成る群から選
択されるアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性を有す
るポリペプチドをコードする単離された核酸断片；なら
びに （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物のＲ
Ｓ酵素をコードする単離された植物の核酸断片。
【０１９８】２０．配列番号７および配列番号９から成
る群から選択される、前記１９の単離された核酸断片。
【０１９９】２１．植物がホウレンソウもしくはアラビ
ドプシスである、植物のＲＳ酵素をコードする前記１９
の単離された核酸断片。
【０２００】２２．前記１９の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
【０２０１】２３．配列番号８および配列番号１０から
成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70％の
同一性を有する、前記２２のポリペプチド。
【０２０２】２４．配列番号８および配列番号１０から
成る群から選択される、前記２２のポリペプチド。
【０２０３】２５．適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記１９の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【０２０４】２６．宿主細胞および前記２５のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【０２０５】２７．宿主細胞が植物細胞である、前記２
６の形質転換された宿主細胞。
【０２０６】２８．宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記２６の形質転換された宿主細胞。
【０２０７】２９．（ａ）宿主細胞を前記２５のキメラ
遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のＲＳ酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のＲＳ酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
【０２０８】３０．（ａ）前記１９の核酸断片でｃＤＮ
Ａもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること； （ｂ）前記１９の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るｃ
ＤＮＡもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断
片が、植物のＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
【０２０９】３１．（ａ）配列番号７および配列番号９
から成る群から選択される配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成すること；そして（ｂ）
段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、およびク
ローニングベクターの配列を表すプライマーを使用し
て、クローニングベクターに存在するｃＤＮＡ挿入物を
増幅すること、を含んで成る、植物のＲＳ酵素をコード
するアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードす
る核酸断片を得る方法であって、増幅されたｃＤＮＡ挿
入物が植物のＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の一部
をコードする方法。
【０２１０】３２．前記３０もしくは３１の方法の産
物。
【０２１１】３３．前記１９の単離された核酸断片によ
りコードされる植物のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
を除草剤の候補と同定するためのインビボの方法であっ
て、当該方法は、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＲＳ遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること； （ｂ）段階（ａ）の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のＲＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記１９の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ植物ＲＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
【０２１２】３４．核酸断片が配列番号７および配列番
号９から成る群から選択され、かつ、ＲＳ酵素が配列番
号８および配列番号１０から成る群から選択される、前
記３３の方法。
【０２１３】３５．前記１９の核酸断片によりコードさ
れる植物のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物を除草剤の
候補と同定するためのインビトロの方法であって、当該
方法は、 （ａ）適する微生物宿主細胞を、植物のＲＳ酵素をコー
ドする前記１９の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で
形質転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低１
個の適する調節配列に操作可能に連結され； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
（ａ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長させて、
植物のＲＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された微生物宿主細胞により発現される
植物のＲＳ酵素を精製すること；（ｄ）植物のＲＳ酵素
を目的の化合物と接触させること；そして（ｅ）目的の
化合物の非存在下での植物のＲＳ酵素の活性に関して植
物のＲＳ酵素の活性を低下させる目的の化合物を除草剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
【０２１４】３６．核酸断片が配列番号７および配列番
号９から成る群から選択され、かつ、ＲＳ酵素が配列番
号８および配列番号１０から成る群から選択される、前
記３５の方法。
【０２１５】３７．（ａ）配列番号１２に述べられるア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片； （ｂ）配列番号１２に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片； （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のＲＳ酵素を
コードする単離された核酸断片。３８．配列番号１１に
述べられるような、前記３７の単離された核酸断片。
【０２１６】３９．マグナポルテ グリセア(Magnaport
he grisea)から得られる真菌のＲＳ酵素をコードする、
前記３７の単離された核酸断片。
【０２１７】４０．前記３７の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
【０２１８】４１．配列番号１２に述べられるようなア
ミノ酸配列を有する、前記４０のポリペプチド。
【０２１９】４２．適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記３７の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【０２２０】４３．宿主細胞および前記４２のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【０２２１】４４．宿主細胞が植物細胞である、前記４
３の形質転換された宿主細胞。
【０２２２】４５．宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記４３の形質転換された宿主細胞。
【０２２３】４６．（ａ）宿主細胞を前記４２のキメラ
遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のＲＳの発現レベルを変える方法であっ
て、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関してマ
グナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)ＲＳ酵素の
変えられたレベルの産生をもたらす方法。
【０２２４】４７．（ａ）前記３７の単離された核酸断
片でｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーに探りを入れ
ること； （ｂ）前記３７の単離された核酸断片とハイブリダイゼ
ーションするＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るｃ
ＤＮＡもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のＲＳをコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方法で
あって、配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断片
が、真菌のＲＳをコードするアミノ酸配列の全部もしく
は本質的に全部をコードする方法。
【０２２５】４８．（ａ）配列番号１１に述べられる配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること；そして（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオ
チドプライマー、およびクローニングベクターの配列を
表すプライマーを使用して、クローニングベクターに存
在するｃＤＮＡ挿入物を増幅すること、を含んで成る、
真菌のＲＳをコードするアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする核酸断片を得る方法であって、増
幅されたｃＤＮＡ挿入物がマグナポルテ グリセア(Mag
naporthe grisea)ＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
【０２２６】４９．前記４７もしくは４８の方法の産
物。
【０２２７】５０．前記３７の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＲＳ遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること； （ｂ）段階（ａ）の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のＲＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記３７の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ真菌ＲＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された宿主細胞の成長を阻害する目
的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を
含んで成る方法。
【０２２８】５１．単離された核酸断片が配列番号１１
の配列に対応し、かつ、ＲＳ酵素断片が配列番号１２の
配列に対応する、前記５０の方法。
【０２２９】５２．前記３７の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
を同定するためのインビトロの方法であって、当該方法
は、 （ａ）宿主細胞を、真菌のＲＳ酵素をコードする前記３
７の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形
質転換することであって、当該遺伝子は最低１個の適す
る調節配列に操作可能に連結され； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
（ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
ＲＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
ＲＳ酵素を精製すること；（ｄ）真菌のＲＳ酵素を化合
物と接触させること；そして（ｅ）目的の化合物の非存
在下での真菌のＲＳ酵素の活性に関して真菌のＲＳ酵素
の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候補と同
定すること、の段階を含んで成る方法。
【０２３０】５３．単離された核酸断片が配列番号１１
の配列に対応し、かつ、真菌のＲＳ酵素断片が配列番号
１２の配列に対応する、前記５２の方法。
【０２３１】５４．（ａ）配列番号３８に述べられるア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片； （ｂ）配列番号３８に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のＬＳ酵素を
コードする単離された核酸断片。５５．配列番号３７に
述べられるような、前記５４の単離された核酸断片。
【０２３２】５６．マグナポルテ グリセア(Magnaport
he grisea)から得られる真菌のＬＳ酵素をコードする、
前記５４の単離された核酸断片。
【０２３３】５７．前記５４の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
【０２３４】５８．配列番号３８に述べられるようなア
ミノ酸配列を有する、前記６０のポリペプチド。
【０２３５】５９．適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記５４の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【０２３６】６０．宿主細胞および前記５９のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【０２３７】６１．宿主細胞が植物細胞である、前記６
０の形質転換された宿主細胞。
【０２３８】６２．宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記６０の形質転換された宿主細胞。
【０２３９】６３．（ａ）宿主細胞を前記５９のキメラ
遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のＬＳ酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現に関して真菌の
ＬＳ酵素の変えられたレベルの産生をもたらす方法。
【０２４０】６４．（ａ）前記５４の核酸断片でｃＤＮ
Ａもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること； （ｂ）前記５４の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るｃ
ＤＮＡもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のＬＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断
片が、真菌のLＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
【０２４１】６５．（ａ）配列番号３７に述べられる配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること；そして （ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、お
よびクローニングベクターの配列を表すプライマーを使
用して、クローニングベクターに存在するｃＤＮＡ挿入
物を増幅すること、を含んで成る、真菌のＬＳ酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする核酸断片を得る方法であって、増幅されたｃＤＮ
Ａ挿入物が真菌のＬＳ酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
【０２４２】６６．前記６４もしくは６５の方法の産
物。
【０２４３】６７．前記５４の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＬＳ遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること； （ｂ）段階（ａ）の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のＬＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記５４の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ真菌ＬＳ遺伝子の発現に適する条件下で段
階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長させる
こと； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の
段階を含んで成る方法。
【０２４４】６８．単離された核酸断片が配列番号３７
の配列に対応し、かつ、ＬＳ酵素断片が配列番号３８の
配列に対応する、前記６７の方法。
【０２４５】６９．前記５４の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 （ａ）宿主細胞を、真菌のＬＳ酵素をコードする前記５
４の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質転換する
ことであって、この遺伝子は最低１個の適する調節配列
に操作可能に連結され； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
（ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
ＬＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
ＬＳ酵素を精製すること；（ｄ）真菌のＬＳ酵素を目的
の化合物と接触させること；そして（ｅ）目的の化合物
の非存在下での真菌のＬＳ酵素の活性に関して真菌のＬ
Ｓ酵素の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
【０２４６】７０．単離された核酸断片が配列番号３７
の配列に対応し、かつ、真菌のＬＳ酵素断片が配列番号
３８の配列に対応する、前記６９の方法。
【０２４７】７１．（ａ）配列番号２７、配列番号２
９、配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片； （ｂ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配
列番号３３および配列番号３５から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片；ならびに （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、単離された核酸断
片。
【０２４８】７２．配列番号２８、配列番号３０、配列
番号３２、配列番号３４および配列番号３６から成る群
から選択される、前記７１の単離された核酸断片。
【０２４９】７３．前記７１の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
【０２５０】７４．配列番号２７、配列番号２９、配列
番号３１、配列番号３３および配列番号３５から成る群
から選択される、前記７３のポリペプチド。
【０２５１】
【表１】
【０２５２】
【表２】
【０２５３】
【表３】
【０２５４】
【表４】
【０２５５】
【表５】
【０２５６】
【表６】
【０２５７】
【表７】
【０２５８】
【表８】
【０２５９】
【表９】
【０２６０】
【表１０】
【０２６１】
【表１１】
【０２６２】
【表１２】
【０２６３】
【表１３】
【０２６４】
【表１４】
【０２６５】
【表１５】
【０２６６】
【表１６】
【０２６７】
【表１７】
【０２６８】
【表１８】
【０２６９】
【表１９】
【０２７０】
【表２０】
【０２７１】
【表２１】
【０２７２】
【表２２】
【０２７３】
【表２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】既知の微生物ＲＳ相同物およびクローニングさ
れたホウレンソウＲＳ前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
【図２】既知の微生物ＬＳ相同物およびクローニングさ
れたホウレンソウＬＳ前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
【図３】ホウレンソウおよびアラビドプシスＲＳ前駆体
タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。囲まれた
残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列（例えば輸送ペ
プチド(transit peptide))を示す。
【図４】ホウレンソウ、タバコおよびアラビドプシスＬ
Ｓ前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。
囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的化された配列
（例えば輸送ペプチド)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダグラス・ブライアン・ジヨーダン アメリカ合衆国デラウエア州19802ウイル ミントン・ノースハリソンストリート2715 (72)発明者 カレン・オンリー・バコツト アメリカ合衆国ペンシルベニア州19350ラ ンデンバーグ・マーサーミルロード191 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA11 BA10 CA04 CA20 DA06 EA04 FA01 FA10 GA14 HA03 HA12 HA20 4B050 CC03 CC04 DD03 DD13 LL03 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ06 QQ07 QQ26 QQ95 QR41 QR55 QR62 QR69 QR75 QR80 QS12 QS24 QS34 4B065 AA26X AA58Y AA88Y AB01 AC14 BA03 BB13 BC50 CA29 CA46 CA47

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２、配列番号４および配
    列番号６から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部
    もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断片； （ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６から成
    る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
    部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類似で
    ある単離された核酸断片； （ｃ）配列番号２、配列番号４および配列番号６から成
    る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも72％の同
    一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
    断片；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的である単
    離された核酸断片から成る群から選択される、植物ＬＳ
    酵素をコードする単離された核酸断片。
  2. 【請求項２】 請求項１の単離された核酸断片によりコ
    ードされるポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列番号２、配列番号４および配列番号
    ６から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも
    72％の同一性を有する、請求項２のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 適する調節配列に操作可能に連結され
    た、請求項１の単離された核酸断片を含んで成るキメラ
    遺伝子。
  5. 【請求項５】 宿主細胞および請求項４のキメラ遺伝子
    を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
  6. 【請求項６】 （ａ）宿主細胞を請求項４のキメラ遺伝
    子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺伝子
    の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換された宿
    主細胞を成長させること、を含んで成り、形質転換され
    ない宿主細胞の発現レベルに関して形質転換された宿主
    細胞での植物のＬＳ酵素の改変されたレベルの産生をも
    たらす宿主細胞における植物のＬＳ酵素の発現レベルを
    変える方法。
  7. 【請求項７】 （ａ）請求項１の核酸断片でｃＤＮＡも
    しくはゲノムライブラリーをプロービングすること； （ｂ）請求項１の核酸断片とハイブリダイゼーションす
    るＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含むｃＤＮＡ
    もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
    り、配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断片が、植
    物のＬＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは
    本質的に全部をコードする、植物のＬＳ酵素をコードす
    るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
    核酸断片を得る方法。
  8. 【請求項８】 （ａ）配列番号１、配列番号３および配
    列番号５から成る群から選択される配列の一部に対応す
    るオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；そし
    て（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、
    およびクローニングベクターの配列に相当するプライマ
    ーを使用して、クローニングベクター中に存在するｃＤ
    ＮＡ挿入物を増幅すること、を含んで成り、増幅された
    ｃＤＮＡ挿入物が植物のＬＳ酵素をコードするアミノ酸
    配列の一部をコードする、植物のＬＳ酵素をコードする
    アミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核
    酸断片を得る方法。
  9. 【請求項９】 請求項７もしくは８の方法の産物。
  10. 【請求項１０】 請求項１の単離された核酸断片により
    コードされる植物のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物を
    除草剤の候補として同定するためのインビボの方法であ
    って、 （ａ）適する微生物宿主細胞の内因性ＬＳ遺伝子を崩壊
    させて微生物宿主細胞の成長を添加されたリボフラビン
    に依存性とすること； （ｂ）段階（ａ）の改変された微生物宿主細胞を、植物
    のＬＳ酵素をコードしかつ微生物宿主細胞によるその発
    現を可能にする最低１個の適する調節配列に操作可能に
    連結された、請求項１の単離された核酸断片を含んで成
    るキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ植物ＬＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
    で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
    せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
    それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
    フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
    合物に接触させること； （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
    場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
    する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
    階を含んで成る方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１の単離された核酸断片により
    コードされる植物のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物を
    除草剤の候補として同定するためのインビトロの方法で
    あって、 （ａ）宿主細胞を、植物のＬＳ酵素をコードする請求項
    １の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子であ
    って、かつ最低１個の適する調節配列に操作可能に連結
    されたキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
    （ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、植物の
    ＬＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される植物の
    ＬＳ酵素を精製すること； （ｄ）植物のＬＳ酵素を目的の化合物と接触させるこ
    と；そして （ｅ）目的の化合物の非存在下での植物のＬＳ酵素の活
    性に関して植物のＬＳ酵素の活性を低下させる目的の化
    合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
    る方法。
  12. 【請求項１２】 （ａ）配列番号８および配列番号１０
    から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは
    本質的部分をコードする単離された核酸断片； （ｂ）配列番号８および配列番号１０から成る群から選
    択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
    ドする単離された核酸断片に本質的に類似である単離さ
    れた核酸断片； （ｃ）配列番号８および配列番号１０から成る群から選
    択されるアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性を有す
    るポリペプチドをコードする単離された核酸断片；なら
    びに （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的である単
    離された核酸断片から成る群から選択される、植物ＲＳ
    酵素をコードする単離された植物の核酸断片。
  13. 【請求項１３】 請求項１２の単離された核酸断片によ
    りコードされるポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 適する調節配列に操作可能に連結され
    た、請求項１２の単離された核酸断片を含んで成るキメ
    ラ遺伝子。
  15. 【請求項１５】 宿主細胞および請求項１４のキメラ遺
    伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 （ａ）宿主細胞を請求項１４のキメラ
    遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
    伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
    た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
    転換されない宿主細胞の発現レベルに関して形質転換さ
    れた宿主細胞での植物のＲＳ酵素の改変されたレベルの
    産生をもたらす、宿主細胞における植物のＲＳ酵素の発
    現レベルを改変する方法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）請求項１２の核酸断片でｃＤＮ
    Ａもしくはゲノムライブラリーをプロービングするこ
    と； （ｂ）請求項１２の核酸断片とハイブリダイゼーション
    するＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含むｃＤＮＡ
    もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
    り、かつ配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断片
    が、植物のＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
    しくは本質的に全部をコードする、植物のＲＳ酵素をコ
    ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
    ードする核酸断片を得る方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）配列番号７および配列番号９か
    ら成る群から選択される配列の一部に対応するオリゴヌ
    クレオチドプライマーを合成すること；そして（ｂ）段
    階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、およびクロ
    ーニングベクターの配列に相当するプライマーを使用し
    て、クローニングベクター中に存在するｃＤＮＡ挿入物
    を増幅すること、を含んで成り、かつ増幅されたｃＤＮ
    Ａ挿入物が植物のＲＳ酵素をコードするアミノ酸配列の
    一部をコードする、植物のＲＳ酵素をコードするアミノ
    酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核酸断片
    を得る方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１２の単離された核酸断片によ
    りコードされる植物のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
    を除草剤の候補と同定するためのインビボの方法であっ
    て、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＲＳ遺伝子を崩壊させ
    て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
    とすること； （ｂ）段階（ａ）の改変された微生物宿主細胞を、植物
    のＲＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
    胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
    列に操作可能に連結された、請求項１２の核酸断片を含
    むキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ植物ＲＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
    で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
    せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
    それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
    フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
    合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
    場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
    する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
    階を含んで成る方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１２の核酸断片によりコードさ
    れる植物のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物を除草剤の
    候補と同定するためのインビトロの方法であって、 （ａ）適する微生物宿主細胞を、植物のＲＳ酵素をコー
    ドする請求項１２の核酸断片を含むキメラ遺伝子であっ
    て、最低１個の適する調節配列に操作可能に連結された
    キメラ遺伝子で形質転換すること； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
    （ａ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長させて、
    植物のＲＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された微生物宿主細胞により発現される
    植物のＲＳ酵素を精製すること； （ｄ）植物のＲＳ酵素を目的の化合物と接触させるこ
    と；そして （ｅ）目的の化合物の非存在下での植物のＲＳ酵素の活
    性に関して植物のＲＳ酵素の活性を低下させる目的の化
    合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
    る方法。
  21. 【請求項２１】 （ａ）配列番号１２に示されているア
    ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
    された核酸断片； （ｂ）配列番号１２に示されているアミノ酸配列の全部
    をコードする単離された核酸断片に本質的に類似である
    か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
    離された核酸断片； （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
    核酸断片から成る群から選択される、真菌のＲＳ酵素を
    コードする単離された核酸断片。
  22. 【請求項２２】 請求項２１の単離された核酸断片によ
    りコードされるポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 適する調節配列に操作可能に連結され
    る、請求項２１の単離された核酸断片を含んで成るキメ
    ラ遺伝子。
  24. 【請求項２４】 宿主細胞および請求項２３のキメラ遺
    伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 （ａ）宿主細胞を請求項２３のキメラ
    遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
    伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
    た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
    転換されない宿主細胞の発現レベルに関してマグナポル
    テ グリセア(Magnaporthe grisea)ＲＳ酵素の改変され
    たレベルの産生をもたらす、宿主細胞における真菌のＲ
    Ｓの発現レベルを改変する方法。
  26. 【請求項２６】 （ａ）請求項２１の単離された核酸断
    片でｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをプロービン
    グすること； （ｂ）請求項２１の単離された核酸断片とハイブリダイ
    ゼーションするＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るｃ
    ＤＮＡもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
    で成り、かつ配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断
    片が、真菌のＲＳをコードするアミノ酸配列の全部もし
    くは本質的に全部をコードする、真菌のＲＳをコードす
    るアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコードす
    る核酸断片を得る方法。
  27. 【請求項２７】 （ａ）配列番号１１に示されている配
    列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
    成すること；そして（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオ
    チドプライマー、およびクローニングベクターの配列に
    相当するプライマーを使用して、クローニングベクター
    に存在するｃＤＮＡ挿入物を増幅すること、を含んで成
    り、かつ増幅されたｃＤＮＡ挿入物がマグナポルテ グ
    リセア(Magnaporthe grisea)ＲＳ酵素をコードするアミ
    ノ酸配列の一部をコードする、真菌のＲＳをコードする
    アミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核
    酸断片を得る方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２１の単離された核酸断片によ
    りコードされる真菌のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
    を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
    って、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＲＳ遺伝子を崩壊させ
    て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
    とすること； （ｂ）段階（ａ）の改変された微生物宿主細胞を、真菌
    のＲＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
    胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
    列に操作可能に連結された、請求項２１の核酸断片を含
    むキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ真菌ＲＳ遺伝子の発現を可能にする条件下
    で段階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
    せること； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
    それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
    フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
    合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
    場合にのみ形質転換された宿主細胞の成長を阻害する目
    的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を
    含んで成る方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２１の単離された核酸断片によ
    りコードされる真菌のＲＳ酵素の活性を阻害する化合物
    を同定するためのインビトロの方法であって、 （ａ）宿主細胞を、真菌のＲＳ酵素をコードする請求項
    ２１の単離された核酸断片を含むキメラ遺伝子であっ
    て、最低１個の適する調節配列に操作可能に連結された
    キメラ遺伝子で形質転換すること； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
    （ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
    ＲＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
    ＲＳ酵素を精製すること； （ｄ）真菌のＲＳ酵素を化合物と接触させること；そし
    て （ｅ）目的の化合物の非存在下での真菌のＲＳ酵素の活
    性に関して真菌のＲＳ酵素の活性を低下させる目的の化
    合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を含んで
    成る方法。
  30. 【請求項３０】 （ａ）配列番号３８に示されているア
    ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
    された核酸断片； （ｂ）配列番号３８に示されているアミノ酸配列の全部
    をコードする単離された核酸断片に本質的に類似である
    か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
    離された核酸断片；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
    核酸断片から成る群から選択される、真菌のＬＳ酵素を
    コードする単離された核酸断片。
  31. 【請求項３１】 請求項３０の単離された核酸断片によ
    りコードされるポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 適する調節配列に操作可能に連結され
    た、請求項３０の単離された核酸断片を含んで成るキメ
    ラ遺伝子。
  33. 【請求項３３】 宿主細胞および請求項３２のキメラ遺
    伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
  34. 【請求項３４】 （ａ）宿主細胞を請求項３２のキメラ
    遺伝子で形質転換すること；そして（ｂ）このキメラ遺
    伝子の発現に適する条件下で段階（ａ）の形質転換され
    た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
    転換されない宿主細胞の発現に関して真菌のＬＳ酵素の
    改変されたレベルの産生をもたらす、宿主細胞における
    真菌のＬＳ酵素の発現レベルを改変する方法。
  35. 【請求項３５】 （ａ）請求項３０の核酸断片でｃＤＮ
    Ａもしくはゲノムライブラリーをプロービングするこ
    と； （ｂ）請求項３０の核酸断片とハイブリダイゼーション
    するＤＮＡクローンを同定すること；そして （ｃ）段階（ｂ）で同定されたクローンを含むｃＤＮＡ
    もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
    り、かつ配列決定されたｃＤＮＡもしくはゲノム断片
    が、真菌のLＳ酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
    しくは本質的に全部をコードする、真菌のＬＳ酵素をコ
    ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
    ードする核酸断片を得る方法。
  36. 【請求項３６】 （ａ）配列番号３７に示されている配
    列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
    成すること；そして（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオ
    チドプライマー、およびクローニングベクターの配列に
    相当するプライマーを使用して、クローニングベクター
    に存在するｃＤＮＡ挿入物を増幅すること、を含んで成
    り、かつ増幅されたｃＤＮＡ挿入物が真菌のＬＳ酵素を
    コードするアミノ酸配列の一部をコードする、真菌のＬ
    Ｓ酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的
    部分をコードする核酸断片を得る方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３０の単離された核酸断片によ
    りコードされる真菌のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物
    を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
    って、 （ａ）適する微生物宿主の内因性ＬＳ遺伝子を崩壊させ
    て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
    とすること； （ｂ）段階（ａ）の改変された微生物宿主細胞を、真菌
    のＬＳ酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
    胞によるその発現を可能にする最低１個の適する調節配
    列に操作可能に連結された、請求項３０の核酸断片を含
    むキメラ遺伝子で形質転換すること； （ｃ）キメラ真菌ＬＳ遺伝子の発現に適する条件下で段
    階（ｂ）の形質転換された微生物宿主細胞を成長させる
    こと； （ｄ）段階（ｃ）の形質転換された微生物宿主細胞を、
    それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
    フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
    合物に接触させること；そして （ｅ）添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
    場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
    する目的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の
    段階を含んで成る方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３０の単離された核酸断片によ
    りコードされる真菌のＬＳ酵素の活性を阻害する化合物
    を殺真菌剤の候補と同定するためのインビトロの方法で
    あって、 （ａ）宿主細胞を、真菌のＬＳ酵素をコードする請求項
    ３０の核酸断片を含むキメラ遺伝子であって、最低１個
    の適する調節配列に操作可能に連結されたキメラ遺伝子
    で形質転換すること； （ｂ）当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
    （ａ）の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
    ＬＳ酵素の産生をもたらすこと； （ｃ）形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
    ＬＳ酵素を精製すること； （ｄ）真菌のＬＳ酵素を目的の化合物と接触させるこ
    と；そして （ｅ）目的の化合物の非存在下での真菌のＬＳ酵素の活
    性に関して真菌のＬＳ酵素の活性を低下させる目的の化
    合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を含んで
    成る方法。
  39. 【請求項３９】 （ａ）配列番号２７、配列番号２９、
    配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５から成
    る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
    部分をコードする単離された核酸断片； （ｂ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配
    列番号３３および配列番号３５から成る群から選択され
    るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
    単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
    酸断片；ならびに （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された
    核酸断片から成る群から選択される、単離された核酸断
    片。
JP10336558A 1998-11-11 1998-11-11 ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ Pending JP2000152791A (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10336558A JP2000152791A (ja) 1998-11-11 1998-11-11 ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ
EP98310187A EP1010760A1 (en) 1998-11-11 1998-12-11 Lumazine synthase and riboflavin synthase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10336558A JP2000152791A (ja) 1998-11-11 1998-11-11 ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ
EP98310187A EP1010760A1 (en) 1998-11-11 1998-12-11 Lumazine synthase and riboflavin synthase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2000152791A true JP2000152791A (ja) 2000-06-06

Family

ID=26151527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10336558A Pending JP2000152791A (ja) 1998-11-11 1998-11-11 ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP1010760A1 (ja)
JP (1) JP2000152791A (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19942175A1 (de) * 1999-09-03 2001-03-08 Adelbert Bacher Methode zum Auffinden von Inhibitoren der Riboflavinbiosynthese
DE19954059A1 (de) * 1999-11-10 2001-05-17 Adelbert Bacher Riboflavinsynthase-Gene und Inhibitoren
US9630994B2 (en) 2014-11-03 2017-04-25 University Of Washington Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures
BR112019020661A2 (pt) 2017-04-04 2020-05-05 University Of Washington nanoestruturas de proteína de auto-montagem que exibem proteínas f de paramixovírus e/ou pneumovírus e seu uso
AU2019228551A1 (en) 2018-02-28 2020-10-15 University Of Washington Self-assembling nanostructure vaccines

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4238904A1 (de) * 1992-11-19 1994-05-26 Basf Ag Riboflavin-Synthese in Hefen

Also Published As

Publication number Publication date
EP1010760A1 (en) 2000-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019253858B2 (en) Novel cytochrome p450 fusion protein
EP1897951B1 (en) Composition and methods for producing steviol and steviol glycosides
Richter et al. Biosynthesis of riboflavin: cloning, sequencing, and expression of the gene coding for 3, 4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase of Escherichia coli
US6642434B1 (en) Transgenic plants with γ-tocopherol methyltransferase
AU6780198A (en) Chimeric genes and methods for increasing the lysine content of the seeds of plants
EP0967281B1 (en) 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase
US6838276B2 (en) Isolated nucleic acids encoding methylenetetrahydrofolate dehydrogenase enzymes
AU759068B2 (en) Methods and compositions for producing plants and microorganisms that express feedback insensitive threonine dehydratase/deaminase
HUT62930A (en) Process for producing histidinol dehydrogenase protein and dna, as well as their muteins and process for producing transgenic plants comprising same
JP2000152791A (ja) ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ
US6271031B1 (en) Quinolinate metabolism enzymes
US6146866A (en) Lumazine synthase and riboflavin synthase
US6204039B1 (en) Plant isocitrate dehydrogenase homologs
US6323013B1 (en) Lumazine synthase and riboflavin synthase
US6350597B1 (en) Riboflavin synthase genes and enzymes and methods of use
US6682891B2 (en) Methods of identifying nucleic acid sequences encoding plant riboflavin synthase enzymes
US6171839B1 (en) Soybean glutathione-S-transferase enzymes
JP4517100B2 (ja) ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするポリヌクレオチド
US6482646B1 (en) Plant proteins that interact with nuclear matrix proteins and function as transcriptional activators
WO2003087376A1 (fr) Cafeine synthase et utilisation correspondante
EP1117811A1 (en) Soybean glutathione-s-transferase enzymes
US20040010822A1 (en) Hydroperoxyde lyases
WO2002103001A1 (en) Gdp-mannose-3',5'-epimerase and methods of use thereof
US6403859B1 (en) Vitamin B metabolism proteins
US6790619B2 (en) Plant phosphomevalonate kinases