KR102266567B1 - 백신접종 조성물 - Google Patents

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KR102266567B1
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크리스챤 조안나 페르디난드 리즈켄
조세푸스 조안 마리아 홀트위스
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크리스탈 딜리버리 비.브이.
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Abstract

본 발명은 아주반트 및/또는 항원을 통합하는 폴리머 매트릭스를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물, 제조방법, 및 이용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 미셀, 나노입자, 미세구, 및 그 외의 형태의 방출 조절용 폴리머 장치와 같은 폴리머 담체 또는 폴리머 장치에 공유결합으로 트랩팽되거나 결합되는 아주반트 및/또는 항원을 형성하고; 아주반트 및 항원은 폴리머 담체 또는 폴리머 장치 내에 또는 폴리머 담체 또는 폴리머 장치에 공유결합된다.

Description

백신접종 조성물{VACCINATION COMPOSITION}
본 발명은 항원 및/또는 아주반트의 방출 조절용 입자를 포함하는 백신접종 조성물에 관한 것이다.
백신접종은 질병에 대한 강력한 방법이다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 다양한 항원에 대한 백신을 이용함으로써 매해 약 2,500,000명의 어린이의 생명을 구하고 있다. 백신은 예방에 사용될 뿐 아니라 예를 들면 종양 또는 알츠하이머 질병의 치료목적으로도 사용되고 있다. 면역계는 먼저 항원을 포획하고, 병원체 제거에 우수한 특이적 세포(specialized cell)의 복잡한 네트워크를 확장하고, 최종적으로 앞으로 노출될 경우에 제제의 면역 기억을 형성하는 작용을 한다. 항원 제시 세포(APC), 예를 들면, B 세포, 매크로파지 및 수지상 세포(DC)는, 항원을 취하고, T 세포 상에 존재하는 T 세포 수용체에 의해 인식하기 위해 MHC 분류 I 및 II 경로를 통해 표면 상에서 이러한 항원의 단편 및 이러한 항원을 처리한다. DC는 천연 T 세포를 활성화하는 특별한 능력을 갖는다. 따라서, 수지상 세포(DC)는 백신접종 공정에서 중요한 역할을 한다. 이러한 항원 제시 공정은 일반적으로 항원 로딩된 DC의 케모카인 의존 이동 후 영역 림프절(regional lymph node)에서 발생한다. 또한, 항원 제시 세포(APC)는 세포로부터 위험 신호를 인지하고, 재순환 T-세포에 대해 수용체가 인식하기 위해 이들의 표면에 제시된 보조자극 분자를 통해서 보조자극(co-stimulatory)신호를 제공하여 림프절에 면역 반응을 개시한다. 위험 신호를 받으면, 미숙한 DC가 이들의 표면 상에서 항원을 제시하는 성숙한 단계로 변화한다. 이러한 단계는 보통 말초조직으로부터 림프절로 DC의 이동과 동시에 발생하고 T 세포를 활성화한다. 항원을 제시하자마자 DC는 림프절에서 사멸하는 것을 알 수 있다.
백신 조성물은 종종 항원과 함께 아주반트를 포함한다. 아주반트는 투여된 항원을 수용하는 면역 반응을 향상시키거나 증가시키는 제제이다. 예를 들면, 하위유닛 백신(subunit vaccines)은 적절한 면역 반응을 위해 아주반트를 첨가할 필요가 있다.
나노입자 및 마이크로입자는 백신 조성물에 사용되고 있다. 폴리(D,L-락트-co-글리콜산)(PLGA)를 포함하는 생분해성 나노입자는 항원 또는 아주반트를 캡슐화하기 위해 사용되었다. 또한, 오발부민(OVA)을 포함하는 폴리스티렌 비드를 실험하였다.
미셀(펩티드 단면 미셀 PCM)은 블록 코폴리머로 이루어지는 것으로, 코어에 면역 자극 DNA를 캡슐화하고 디설피드 결합을 통해 펩티드 항원에 결합하는 것이 개시되어 있다. 고농도의 글루타티온의 존재하에서, 항원 펩티드 및 면역 자극 DNA를 APC로 전달한다(Hao et al, Int J Nanomedicine. 2006;1:97-103, Hirosue et al, Vaccine 28 (2010) 7897-7906). 그러나, 디설피드 가교 결합은 조절된 방출을 허용하지 않는다.
그러나, 백신접종에 나노입자가 사용되는 경우, 여전히 여러 문제가 있다. 예를 들면, 충분한 면역 활성화를 일으켜서 바람직하게 내성 또는 자가면역을 피하기 위해 충분한 항원이 수지상(DC)에 제시되어야 할 필요가 있다. 종종, 긴 시간 면역을 갖기 위해 다양한 백신접종이 필요하다.
또한, 각각의 목적을 위해, 백신 조성물은 최적화될 필요가 있다. 면역 방법 및/또는 아주반트의 적합한 선택이 필요하다. 백신 조성물은 예방 또는 치료의 사용 형태에 따라 매우 많이 다르다. 또한, 자가면역 질환 및 내성과 같은 원하지 않는 부작용을 피하는 것이 시도되고 있다.
대상이 바람직하게 DC이고 투여시 매크로파지가 대부분의 나노입자를 취하는 것을 알 수 있다. 기존의 나노입자 및 마이크로 입자의 또 다른 단점은, 물리적으로 캡슐화된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 것으로, 즉, 항원 및/또는 아주반트는 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 공유결합으로 트랩핑되지 않는다는 것이다. 이는, 우수한 면역계 제시/활성화에 대해 중요하지만, 방출 프로파일에 대한 조절이 전혀 또는 거의 되지 않는 것을 의미한다. 종종, 종래 기술의 나노입자 또는 마이크로 입자의 고유의 생물학적 불안정성으로 인해 입자가 투여되는 경우 항원 및/또는 아주반트가 갑작스럽게 방출되는 것을 알 수 있다. 항원 및/또는 아주반트는, 아주반트 및 항원을 제시하기 위한 가장 유용한 부위/세포가 아닌 투여 부위에서 방출한다. 또한, 종래 기술의 나노입자는 모두 물리적 집합체인데, 이는 함께 입자를 유지하는 힘이 물리적인 힘이고 공유 결합이 아니므로 종종 이러한 입자는 불안정하다. 또한, 항원 및/또는 아주반트는 나노입자 표면에 가장 물리적으로 흡착되고, 공유 결합보다 훨씬 덜 안정하고, 조절된 방출을 허용하지 않거나 훨씬 낮은 정도로 허용한다. 또한, 나노입자는 단분자 성분(entities)으로서 기재되지만, 이러한 나노입자의 구조적 완전성은 많이 알려져 있지 않은데, 이는 제조 방법 및 물리적 집합체 및 캡슐화 때문이다. 종종, 이러한 나노입자는 동물에 투여 후 크게 파괴된다. 나노입자의 불안정성으로 인해 모든 항원이 담체에 결합되지 않을 수 있다. 예를 들면, OVA의 25%는 리포좀과 결합되지 않았다. 트리메틸키토산(TMC) 나노입자는 1일 내에 약 20%의 OVA가 갑작스럽게 방출한 후 3일에 동안 OVA의 방출이 검출되지 않았다. 마찬가지로, PLGA 미세구는 중간 OVA 갑작스러운 방출을 일으키고, OVA 만 또는 OVA 및 CpG가 로딩된 미세구에 대해 총 투여량의 32% 및 10%에 이른다. 다음 3주동안 추가의 단백질 방출은 검출되지 않았다(Mohanan et al, J. Control Rel (2010) vol 147:3; 342-349).
또 다른 단점은, 나노입자 제조가 항원 구조에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들면, 나노입자의 제조방법의 장점 및 단점을 참조해라(Kunda et al, Pharm Res (2013) 30:325-341).
표적 세포 내의 나노입자의 취입은 크게 크기 및 조성물에 의존하고, 따라서 크기 및 조성물의 충분한 제어가 필요한 것을 알 수 있다. 그러나 종래기술에서 많은 나노입자 및 제조방법은 크기 및/또는 조성물을 제어할 수 없다. 실제로, 종래기술의 대부분의 입자는 크기 분포가 큰 것을 나타냄으로써, 입자에 기초한 백신 조성물은 이질성이 있고, 또는 추가의 정제를 필요로 한다. 또한, 백신접종 목적으로, 항원 및/또는 아주반트의 캡슐화를 위해 엄격하게 제어되어야 하고, 및/또는 배치간 재현성(batch to batch reproducibility)을 보장하기 위해 표적화 제제(targeting agent)의 부착이 필요하다. 종래 기술에서 대부분의 나노입자는 이러한 엄격한 제어를 할 수 없고, 따라서 백신접종 목적에 적합하지 않으며 안정한 치료반응에 적합하지 않다.
종종, 종래기술의 나노입자는, 예를 들면 갑작스러운 방출로 인해 면역반응이 충분히 길게 지속되지 않으므로, 충분한 면역 반응을 위해 추가의 활성화 스케쥴이 필요하다.
국제공개 공보 제2010/138193호는, 항원 제시 세포와 같은 세포 내에서 작용 부위를 표적으로 할 수 있는 합성 나노담체의 조성물에 관한 것으로, pH 민감한 방법으로 합성 나노담체로부터 해리하는 면역조절제를 포함한다. 국제공개 공보 제2010/138193호는의 이러한 합성 나노담체는 바람직하게 APC에 의해 취득된다. APC가 나노담체를 취득할 때에, 합성 나노담체는 세포 외측의 중성 pH와 달리 pH가 더 산성인 엔도솜/리소좀 구획으로 내포작용(endocytose)하는 것으로 추정된다. 이러한 조건 하에서, 면역조절제는 합성 나노담체로부터의 pH 민감한 해리를 나타내고 합성 나노담체로부터 방출된다. 이어서 면역조절제는 자유롭게 엔도솜/리포좀과 결합된 수용체와 상호작용하고 소망의 면역반응 자극한다. 그러나, 국제공개 공보 제2010/138193호는 면역조절제가 제시되는 경우 폴리머의 가교결합에 대해서는 개시되어 있지 않다. 면역조절제가 나노입자에 공유결합으로 트랩핑되는 시스템에 대해서는 개시되어 있지 않다. 국제공개 공보 제2010/138193호에서는 먼저 폴리머에 면역조절제를 컨쥬게이팅함으로써 입자를 제조한 후 면역조절제-폴리머 착체의 나노입자를 제조한다. 따라서, 국제공개 공보 제2010/138193호의 시스템은, 각각 상이한 면역조절제의 컨쥬게이션을 위해서 상이한 루트가 필요하다.
미국특허 제2009/011993호는 항원 제시 세포를 표적으로 하는 백신, 면역 조절제 및/또는 약물과 같은 활성 제제를 전달하는 입자에 관한 것이다. 미국특허 제2009/011993호는 폴리머 골격에 케탈기를 포함하는 새로운 형태의 소수성 폴리머를 개시하고, 케탈기는 산소 원자가 폴리머 골격에 위치하도록 배치한다. 미국특허 제2009/011993호는 폴리머를 면역조절제에 가교결합하는 외부 가교제의 사용에 대해 개시되어 있지만, 면역조절제의 존재하에서 폴리머의 가교결합 단계는 개시되어 있지 않다.
불운하게도, 보통 다양한(하위유닛) 백신에 적용될 수 있는 보편적인 제형이 없는 것으로 보인다. 종래 기술의 대부분의 시스템은, 입자 및 컨쥬게이션이 각각의 상이한 면역조절제에 대해 최적화할 필요가 있다. 이는, 또 다른 면역조절제를 포함하는 각각의 새로운 입자에 대한 고가의 연구를 필요로 하고 상이한 면역조절제 사이의 차이가 생긴다. 최적화된 제형은, 바람직하게 보호 면역에 대해 필요한 반응 형태 및 의도된 투여경로에 의존한다. 다양한 제형 형태, 예를 들면 입자 크기, 아주반트의 선택, 및 항원 및 아주반트의 공존(co-localization)은, 선택된 투여 경로에 기초해서 조절되는 것이 바람직하다. 종래 기술에 기재된 나노입자는 하나의 특정한 항원 및/또는 아주반트, 및 하나의 특정한 투여 경로에 적합하지만, 종종 또 다른 항원/아주반트 및/또는 그 외의 투여경로에 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 상이한 백신접종 경로에 대해, 각각 상이한 나노입자가 개발되어야 한다.
국제공개 공보 제2010/033022호 및 제2013/002636호는 덱사메타손 및 파클리탁셀과 같은 약물을 포함하는 조절된 방출 시스템이 개시되지만, 이들은 항원 및/또는 아주반트가 폴리머 매트릭스 입자에 트랩핑될 수 있는 것에 대해서는 개시되어 있지 않는다.
국제공개 공보 제2012/039602호는 국제공개 공보 제2010/033022호 및 국제공개 공보 제2013/002636호에 개시된 것과 같은 공유결합 폴리머 매트릭스 입자에서 사용될 수 있는 생분해성 링커 분자가 개시되어 있다. 국제공개 공보 제2012/039602호는 이러한 시스템에서 항원 또는 아주반트를 개시하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 백신접종 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 상이한 투여 경로에 대해 쉽게 조절할 수 있는 백신접종 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 백신접종 조성물은 바람직하게 항원 및/또는 아주반트의 공유결합을 갖는 시스템을 제공하고, 아주반트 또는 항원에 국소 및 시공간 노출에 대해 충분히 조절하는 것을 보장한다. 본 발명의 또 다른 목적은 나노입자 및/또는 마이크로입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 조절된 방출 입자가 좁은 크기 분포를 갖는 백신 조성물을 제공하는 것이다. 또 다른 본 발명의 목적은 큰 크기 범위에 걸쳐서 예를 들면 소수성 및 친수성 화합물의 상이한 항원 및/또는 아주반트를 수용할 수 있는 백신접종 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 아주반트 및/또는 항원의 방출이 조절될 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 트랩핑된 아주반트 및/또는 항원이 자체의 독특한 방출 프로파일을 갖는 백신접종 조성물을 제공한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 입자(예를 들면 입자 표면)에 공유결합으로 부착된 표적화 제제를 포함하는 백신접종 조성물을 제공하는 것이다. 표적화 제제는 본 발명의 입자를 세포 또는 관심 부위, 예를 들면 APC에 향하게 할 수 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항원 및/또는 아주반트가 캡슐화될 수 있지만 입자의 일면 또는 앙면에 존재할 수 있는 백신접종 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 항원 및/또는 아주반트의 안전하고 및/또는 비파괴적인 백신접종 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 기재된 목적 중 하나 이상을 충족하는 백신접종 조성물을 제공한다.
제1형태에서, 본 발명은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제공하는 것으로, 입자는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다:
(i) 반응성 부위를 포함하는 항원 및/또는 아주반트를, 아주반트 및/또는 항원의 반응성 부위와 반응할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 폴리머 사슬을 포함하는 수용액 또는 분산액과 혼합하는 단계로, 폴리머 사슬은 분자내 또는 분자 사이에서 가교결합할 수 있는 것인, 단계; 및
(ii) 폴리머가 입자로 자가 조립(self-assemble)하고, 항원 및/또는 아주반트가 미셀의 코어 내에 캡슐화되는 조건으로 이러한 혼합물을 처리하는 단계,
(iii) 폴리머 매트릭스의 형성과 동시에 아주반트 및/또는 항원이 이러한 폴리머 매트릭스 내에, 즉 형성된 폴리머 네트워크에서 트랩핑되는 조건하에서, 입자 혼합물을 가교결합시켜 폴리머 매트릭스를 형성하는 단계.
폴리머 매트릭스는 형성된 폴리머 폴리머 네트워크이다. 항원 및/또는 아주반트는, 가교결합에 의해 형성된 폴리머 네트워크 내에서 폴리머 매트릭스 내에 트랩핑된다. 항원 및/또는 아주반트가 폴리머 사슬에 가교결합하고, 따라서 폴리머 네트워크 및 폴리머 매트릭스의 일부분을 형성한다.
제2형태에서, 본 발명은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 반응성 부위를 포함하는 항원 및/또는 아주반트를, 아주반트 및/또는 항원의 반응성 부위와 반응할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 폴리머 사슬을 포함하는 수용액 또는 분산액과 혼합하는 단계로, 폴리머 사슬은 분자내 또는 분자 사이에서 가교결합할 수 있는 것인, 단계; 및
(ii) 폴리머가 입자로 자가 조립하고, 항원 및/또는 아주반트가 미셀의 코어 내에 캡슐화되는 조건으로 이러한 혼합물을 처리하는 단계
(iii) 폴리머 매트릭스의 형성과 동시에 아주반트 및/또는 항원이 이러한 폴리머 매트릭스 내에, 즉 형성된 폴리머 네트워크에서 트랩핑되는 조건하에서, 입자 혼합물을 가교결합시켜 폴리머 매트릭스를 형성시키는 단계.
본 발명의 또 다른 형태에서, 본 발명은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 아주반트 및/또는 항원의 반응성 부위와 반응할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 폴리머 사슬을 포함하는 수용액 또는 분산액을 제공하는 단계로, 폴리머 사슬은 분자내 또는 분자 사이에서 가교결합할 수 있는 단계; 및
(ii) 이러한 혼합을, 폴리머가 입자로 자가 조립하는 조건으로 처리하는 단계,
(iii) 단계(ii)로부터의 입자를 항원 및/또는 아주반트가 입자 내에 캡슐화되도록 아주반트 및/항원을 포함하는 용액과 혼합하는 단계,
(iv) 폴리머 매트릭스의 형성과 동시에 아주반트 및/또는 항원이 이러한 폴리머 매트릭스 내에, 즉 형성된 폴리머 네트워크에서 트랩핑되는 조건하에서, 단계 (iii)으로부터의 입자 혼합물에, 폴리머 매트릭스를 가교 형성시키는 단계.
적합하게, 본 발명의 형태 및/또는 실시형태에서, 가교결합 후, 표적화 제제 및/또는 항원 및/또는 아주반트가 발생된 입자의 표면에 컨쥬게이트된다. 바람직하게, 컨쥬게이션은 공유결합이다. 적합하게, 폴리머 사슬은 가교결합 단계에서 반응하지 않는 반응성 부위를 포함하고, 표적화 제제 및/또는 항원 및/또는 아주반트를 형성되고 가교결합된 입자의 표면에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 가교결합 후, 추가의 결합기는 생성된 가교결합된 입자의 표면에 부착되어 표적화 제제 및/또는 항원 및/또는 아쥬반트를 가교결합된 입자의 표면에 컨쥬게이팅하기 위해 더 반응시킬 수 있다. 또한, 폴리머 사슬 상의 반응성 부위는 가교결합 단계 중에 블록화(blocked)될 수 있고 폴리머 네트워크가 형성되면 탈블록화(deblocked)될 수 있다. 탈블록화 반응성 부위는 표적화 제제 및/또는 항원 및/또는 아주반트와 반응할 수 있고 가교결합된 입자의 표면에 부착될 것이다. 또한, 표적화 제제 및/또는 항원 및/또는 아주반트는 가교결합된 입자의 폴리머 사슬에 컨쥬게이팅될 수 있는 반응성 부위를 포함할 수 있다.
또 다른 형태에서, 본 발명은 예방 방법으로서 백신 조성물의 사용에 관한 것이다.
또 다른 형태에서, 본 발명은 약물로서 사용하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 형태는 본 발명의 백신 조성물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 모든 형태 및/또는 실시형태에서, 폴리머는 폴리머 사슬당 적어도 하나의 반응성 부위를 포함한다. 또한, 본 발명의 모든 형태 및/또는 실시형태에서 아주반트 및/또는 항원은 적어도 하나의 반응성 부위를 포함한다. 유리하게, 아주반트 및/또는 항원은 가교결합 단계 중에 폴리머 매트릭스에 공유 결합으로 트랩핑된다. 가교결합 단계 중에 폴리머는 아주반트 및/또는 항원과 함께 네트워크를 형성하고, 이는 항원 및/또는 아주반트를 트랩핑하는 폴리머 매트릭스를 형성한다. 따라서, 항원 및/또는 아주반트는 가교결합 단계 중에 폴리머에 가교결합되어 항원 및/또는 아주반트는 폴리머 사슬에 공유결합되고, 형성된 네트워크 일부를 형성한다. 동시에, 폴리머 사슬은 서로 가교되어 폴리머 네트워크를 형성하고, 폴리머 및 트랩핑된 아주반트 및/또는 항원은 폴리머 매트릭스를 형성한다.
도 1은 시간 경과에 따라 류프롤리드를 방출하고 도시된 바와 같이 상이한 링커를 갖는다.
도 2는 PK 프로파일, 전신 노출시 지속적 방출, 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 3은 모노머 대 개시제의 비에 대한 입자크기 및 입자의 PDI를 도시한다.
본 발명은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제공한다. 입자는 항원 및/또는 아주반트를 입자의 내측 상에 공유결합으로 트랩핑할 수 있다. 또한, 입자의 외면 상에 항원 및/또는 아주반트를 제공할 수 있다. 본 발명의 조절된 방출 입자는 동시에 다수개의 상이한 항원 및/또는 아주반트를 하나의 입자 내에 전달하고, 상이한 항원 및/또는 아주반트가 동일한 부위에서 방출하는 것을 보장할 수 있다. 예를 들면 가교결합된 입자의 외측면에 특정한 표적화 제제의 구조에 의해서 특정한 표적 부위에 조절된 방출 입자를 표적으로 할 수 있다. 또한, 아주반트 및/또는 항원의 방출 프로파일은 원하는 대로 조정될 수 있다. 본 발명의 입자는 상이한 분자에 대해 상이한 링커를 사용할 수 있고, 각각의 아주반트 및/또는 항원에 대해서 소망의 방출을 제공한다. 일 시스템은 상이한 분자에 의해 제조될 수 있고, 각각은 자체 방출 프로파일을 갖는다. 본 발명의 시스템은 (치료)효과를 최적화하기 위해 실제 조절가능한 시스템을 제공한다.
본 발명의 백신접종 조성물은, 테일러 제조된 최적화된 백신접종 조성물에 대해 본질적으로 필요한 요소를 포함하기 때문에 독특한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 전체 제어에 의해 최적 방법으로 수지상 세포를 자극할 수 있다:
연속 또는 박동성으로 각 개별 코어 트랩핑된/표면 컨쥬게이팅된 화합물을 맞춤 제작 방출하는 상이한 링커 범위. 갑작스러운 방출이 방지되고, 또한 신체의 원하지않는 부위에서의 방출도 방지된다. 이는 원하지 않는 부작용, 예를 들면, 내성 및/또는 항원 및/또는 아주반트에 대한 과-반응을 줄일 수 있다.
항원, 아주반트 또는 세포 표적화 제제 또는 임의의 조합인 하나 이상의 특정 분자를 공유 결합 컨쥬게이팅하는 입자의 외부 표면에서 반응성 부위의 범위의 가능성
입자를 제조하는 방법은 매우 작은 입자 크기 분포를 갖는 특정한 크기를 갖는 입자를 제공하고, 백신접종 조성물의 특정한 효과를 분명히 평가하고 종래기술에서 개시된 바와 같은 이질성 나노입자 분산에서 나타낸, 작은 비율의 매우 큰 입자 또는 매우 작은 입자에 의한 원하지 않는 방해 부작용을 방지한다. 종래기술로부터 각각의 목적에 대해 백신접종 조성물은 최적화할 필요가 있는 것으로 보인다. 본 시스템은, 이러한 균일성, 안정성, 및 순도 때문에, 백신접종 조성물을 실제 최적화할 수 있는 이점을 제공한다. 백신 조성물은 훨씬 큰 입자 또는 작은 입자 또는 자유 항원및/또는 아주반트와 같은 불순물을 갖지 않는 것을 제조할 수 있다. 항원 또는 아주반트가 공유결합으로 트랩핑되기 때문에, 입자는 자유 항원 및/또는 아주반트로부터 쉽게 정제될 수 있다. 입자는 또한 보존 중에 시간 경과에 따라 안정한데, 이는 아주반트 및/또는 항원이 폴리머 매트릭스와 공유결합되어 있기 때문이다. 이와 같이 해서, 의도된 입자로부터 효과가 관찰되고 불순물로부터는 관찰되지 않는 것을 보장한다.
우수한 효과적인 면역 반응을 일으키기 위한 항원 및/또는 아주반트의 함께 전달. 본 입자는 항원 및 아주반트를 포함할 수 있다. 항원 및 아주반트는 폴리머 매트릭스 내에 트랩핑될 뿐 아니라 항원 또는 아주반트 또는 둘다가 폴리머 입자의 표면에 결합될 수 있다. 또한, 1개 초과의 아주반트 및/또는 항원은 폴리머 입자의 표면에 트랩핑되거나 결합될 수 있다. 입자를 생성하기 위한 본 방법은 형성된 입자의 표면 및 폴리머 매트릭스의 내측에 존재하는 항원 및 아주반트의 다수의 상이한 조합을 갖는 입자를 제공하기 위한 융통성을 제공한다. 가장 유효한 아주반트는 전달 시스템과 면역강화제를 결합함으로써 얻어지고 이들의 시너지 작용을 활용하는 것을 명확하게 알 수 있다. 입자 항원 전달 시스템 및 면역 강화 화합물로 이루어진 특정 형태의 조합 아주반트는 동물 연구 및 인간 임상 시험에서 강한 CD8+ T-세포 반응에 대한 가능성을 입증했다 (Foged et al, EJPS, 2012).
유력한 CD8+ T-세포 반응을 자극하는 것 외에, 면역강화제 및 전달 시스템의 함께 투여하는 것은, 특정한 경우에 안전성의 관점에서 유리할 수 있다. 동물 모델에서, 용해가능한 TLR 리간드에 기초한 아주반트는 전신 효과의 유도에 관련되고, 예를 들면 종양 괴사 인자 α의 독소 양의 분비이다. 가용성 TLR 길항물질의 주사시 나타나는 이러한 강한 사전-염증성 반응은 전체 APC 개체군(APC population)의 활성화로 인해 발생할 수 있는 반면, 전달 시스템은 전체 APC 개체군의 소수의 비율로 면역강화 효과에 집중하고, 전신 역효과를 방지할 수 있다. 본 발명의 입자는 면역강화의 활성에 집중하고 이러한 강력한 물질을 무해하게 하는 방법을 제공한다(Foged et al, EJPS, 2012).
본 발명의 백신 조성물은 긴 수명 CD8+기억 T 세포의 유도를 촉진할 수 있다(Foged et al, EJPS, 2012).
본 발명의 백신 조성물은 크로스 투과 현상을 유도할 수 있다. 본 발명의 입자는 체액성 면역 반응뿐 아니라 세포 반응을 자극할 수 있다.
가교결합 및/또는 표면 개질 후, 항원 및/또는 아주반트를 갖는 입자는 실제로 쉽게 정제할 수 있는 하나의 단일 매크로분자이다. 이러한 높은 순도는 상세하게 면역발생 활성화에 대한 작용의 기본 메카니즘(underlying mechanism)을 평가하는 것이 필요하고, 백신 안전성 및 약학적 특성의 점에서 다수의 이점을 나타낸다.
본 발명은 상이한 가교 전략의 범위를 허용하고, 예를 들면 펩티드 및 단백질과 같은 약한 분자(fragile molecules) 및 그 외의 민감한 분자를 트랩핑할 수 있다.
본 발명은 친수성 및 소수성 화합물의 범위 및 큰 입자 크기 범위에 대해 트랩핑할 수 있다. 본 발명의 입자는 친수성 또는 소수성 활성 제제로 제한되지 않는다. 아주반트 및/또는 항원의 폴리머 매트릭스에의 가교는 소수성 및 친수성 아주반트 및 항원을 폴리머 매트릭스 내로 트랩핑할 수 있다.
기존의 조절 방출 입자의 합성 절차는 매우 온화해서 항원 및/또는 아주반트가 충분히 보존되는 것을 보장한다. 비-라디칼 가교가 사용되어 민감한 아주반트 및/또는 항원을 줄일 수 있다.
항원은 종종 집합 또는 침전과 같은 물리적 변경 및 화학적 및 효소 분해에에 민감할 수 있다. 본 발명의 백신접종 조성물은 항원을 트랩핑하고 신체에 도입한 후 (효소)분해에 대해 보호할 수 있다. 입자는 매우 밀집되어 있기 때문에 입자의 코어에 효소의 침투를 억제하고, 따라서 단백질성 항원을 효과적으로 보호할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 컴팩트하고 완전해서 매크로파지 흡수(macrophage uptake)를 제한하고, 많은 DC 표적화가 가능하다. 본 발명의 입자는 종양 및 염증 조직 내에서 높은 축적뿐 아니라 긴 혈액 체류를 나타냈다.
본 발명의 입자는 가교로 인해 초기에 안정할 뿐 아니라 적절하게 생분해될 수 있다. 안정성에 의해 갑작스러운 방출을 방지하고 항원 및/또는 아주반트를 순환에서 더 길게 유지하고, 장기간에 걸쳐 올바른 표적 세포를 활성화할 가능성을 높인다. 적절하게, 항원 및/또는 아주반트와 같은 트랩핑된 화합물이 방출된다. 또한, 본 발명의 입자는 작은 단편으로 분해된다.
본 발명의 백신 조성물에서 링커 타입을 조절해서 항원 및/또는 아주반트 노출 동안 길게 지속하는 입자를 제조할 수 있다.
표면에 트랩핑 또는 컨쥬게이션으로 인해, 본 발명의 백신 조성물은 가용성 항원을 갖는 백신에 비해 면역 반응에 대한 항원 물질이 덜 필요로 할 수 있다. 또한, 표적화 제제는 표면에 결합되어 백신 입자가 관심 표적에 도달하는 것을 보장한다.
본 발명의 입자는, 전체 과잉(whole plethora)의 입자를 생성하기 위해 GMP-상용 3단계 방법에 의해 쉽게 치수 확장가능하다.
상이한 링커를 갖는 항원과 아주반트를 컨쥬게이팅할 수 있다. 아주반트 및/또는 항원의 상이한 방출 프로파일이 가능하다. 상이한 아주반트 및/또는 항원에 대해 상이한 링커를 사용하면, 항원 및/또는 아주반트에 대한 상이한 반응성 부위를 허용한다. 이는, 유도체 형성 및 정제에 대한 많은 조절 및 링커 특이성을 제공하고 큰 융통성을 발휘한다.
본 발명의 방법은 매우 융통성이 있다. 공유결합 컨쥬게이션 항원 및/또는 아주반트, 및 추가의 항원, 아주반트 및/또는 표면에의 표적화 제제의 추가의 공유결합 컨쥬게이션을 갖는 입자의 합성을 제공한다.
본 발명의 방법은, 관심 항원이 공유결합으로 트랩핑되고 본 발명의 입자 내에서 안정하기 때문에, 임의의 비공유결합 트랩핑된 항원, 아주반트 및/또는 관심 항원으로서의 리간드를 쉽게 정제 제거한다. 본 발명의 백신 조성물은 한번에 1 파라미터를 명확하게 평가할 수 있는 높은 배치간 재현성을 이용하여 우수하게 조절가능하고 또한 넓게 적용가능하다. 이는 쉽게 치료 용도의 최적화 및 생성의 최적화할 것이다.
본 발명에 따르면, 백신 조성물은 입자를 포함한다. 특히, 본 발명은 미셀, 나노입자, 미세구, 하이드로겔과 같은 폴리머 담체 또는 폴리머 장치, 및 그 외의 형태의 백신용 폴리머 담체 또는 폴리머 장치에 통합하거나 결합시에 바람직하게 공유결합해서 트랩핑되는 항원 및/또는 아주반트를 형성하고; 항원 및/또는 아주반트는 입자 내에 공유결합으로 트랩핑되고 및/또는 폴리머 장치 또는 담체에 결합된다.
바람직한 실시형태에서, 입자는 조절된 방출 시스템으로, 느린 방출, 지속 방출, 박동성(pulsatile) 방출, 및 지연 방출을 포함하는 모든 종류의 조절된 방출을 포함할 수 있다.
본 발명에 대해, 입자는 나노입자 및/또는 마이크로입자인 것으로 이해되어야 한다.
일반적으로, 입자는 직경에 따라 분류된다. 거친 입자는 10,000 내지 2,500 nm의 범위를 포함한다. 미세구와 같은 미세 입자는 2,500 내지 100 nm의 크기이다. 나노입자와 같은 초미세 입자는 1 내지 100 nm의 크기이다. 본 발명에 대해, 미세구는 100 내지 0.5 마이크로미터, 바람직하게는 50 내지 1 마이크로미터이고, 더 바람직하게는 25 내지 0.5 마이크로미터이고, 더 바람직하게는 10 내지 0.1 마이크로미터의 크기 범위이다. 나노입자는 0.1 내지 1000 nm이고, 바람직하게는 1 내지 500 nm, 더 바람직하게는 5 내지 250 nm, 더 바람직하게는 10 내지 200 nm, 더 바람직하게는 30 내지 150 nm의 크기 범위일 수 있다. 크기는 표적 세포가 취하는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 20 내지 200 nm 크기 범위의 바이러스 크기 입자는 보통 내포작용에 의해 취해지고, 세포 기반 면역 반응을 일으키는 반면, 500 nm 내지 5 마이크론 크기의 입자는 식세포작용 및/또는 마이크로 음세포작용에 의해 주로 취해지고, 인간 면역 반응을 촉진하는 경향이 있다. 특정 세포는 보통 입자를 취할 수 있는 상한 및 하한 크기를 갖는다. 당업자에게 이와 같은 조절 방법이 알려져 있다. 또한, 특정 세포가 본 발명의 입자를 취하는 것을 원하지 않는 경우, 당업자는 이러한 세포 크기 범위를 벗어난 크기를 선택할 수 있다. 본 발명의 입자는 특이적 세포를 표?Ю막? 하도록 소망의 크기로 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 입자는, 대부분의 입자가 소망의 입자크기를 갖고 소망의 세포를 표적으로 할 수 있도록 좁은 분포를 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 입자는 매우 좁은 크기 분포를 갖고, 이는 대부분의 입자가 동일한 크기를 갖는 것을 의미한다. 바람직하게, 입자는 다분산도(DPI)가 0.5 미만, 더 바람직하게 0.4 미만, 더욱 더 바람직하게 0.3 미만, 더욱 더 바람직하게 0.2 미만, 가장 바람직하게 0.1 미만, 또는 심지어 0.05 미만이다.
미셀과 같은 나노입자 백신 조성물은 질병에 대한 면역을 위해 뛰어난 후보인 것으로 고려된다. 본 발명의 입자는 소수성 및 친수성 화합물을 포함하는 다양한 항원 및/또는 아주반트를 포함할 수 있다. 적합한 입자는 국제 공개공보 제 2010/033022호에 기재되어 있다. 본 발명 및/또는 그 실시형태의 입자에서, 항원 및/또는 아주반트는 수성 환경에서 폴리머 상, 특히 폴리머 풍부 상, 비공유결합으로 트랩핑되고, 이어서 3D 폴리머 네트워크에 공유결합으로 컨쥬게이팅된다.
단계(ii)의 입자 형성에서, 항원 및/또는 항원은 물리적으로 또는 비공유적으로 트랩핑된다. 또 다른 방법에서, 아주반트 및/항원이 형성된 입자와 혼합하는 단계(iii)에서, 항원 및/또는 아주반트는 물리적 또는 비공유적으로 트랩핑된다. 가교 단계에서, 항원 및/또는 아주반트는 공유결합으로 트랩핑되고, 입자의 내측에 항원 및/또는 아주반트가 공유결합으로 트랩핑된 입자를 제공한다. 종래기술은, 가교 단계에서 항원 및/또는 아주반트 없이 수행되는 시스템을 개시하는 것을 주목해야 한다. 본 발명의 적용에서, 아주반트 및/또는 항원은 가교 단계 중에 존재하고 아주반트 및/또는 항원이 폴리머 매트릭스에 공유결합한다. 또한, 아주반트 및/또는 항원이 입자의 표면에 결합하는 경우, 아주반트 및/또는 항원이 입자의 폴리머 매트릭스에 공유결합된다.
폴리머 네트워크 내에 항원 및 아주반트의 공유결합 트랩핑의 이점은,
지속 노출해도 갑작스러운 방출이 없으며, 투여 빈도를 감소시킨다.
충분한 조절가능한 키네틱과 적절하게 항원 및/또는 아주반트를 방출하고, 다양한 항원 및/또는 다양한 아주반트를 트랩핑한다.
하나를 초과한 형태의 항원 및/또는 아주반트를 포함하고, 잠재적으로 상이한 방출속도를 갖고 특성을 조절할 수 있다.
입자는 예를 들면 특이적 세포에 대해 활발하게 표적으로 하기 위해 리간드와 같은 표적화 제제의 컨쥬게이션에 의해 표면 개질될 수 있다.
낮은 다분산도를 갖는 균일하고 조절가능한 입자 크기를 갖고, 생분해성이고, 역효과 없이 신체로부터 제거되는 비독성 단편으로 분해된다.
0.22㎛를 통한 여과에 의해 쉽게 멸균되고 동결건조 제형으로 쉽게 보존된다.
펩티드 및 그 외의 큰 및/또는 약한 분자는 가능한 항원 및/또는 아주반트로서 언급된다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 입자는 항원 및/또는 아주반트를 폴리머와 혼합한 후 이어서 폴리머를 가교해서 폴리머 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 가교는, 폴리머 및 아주반트 및/또는 항원과 수행할 수 있고, 자유 라디칼의 존재하에서 중합성 부위를 갖는 것이 유도되지만 그 외의 형태의 공유결합 컨쥬게이션 링커도 가능하다.
공유결합으로 트랩핑되고 및/또는 컨쥬게이팅된 항원 및/또는 아주반트를 갖는 입자는 상기 설명된 바와 같이 다수의 이점을 가질 수 있다. 얻어진 백신 조성물은 치료, 치유 또는 예방 특성을 가질 수 있다. 본 발명 및/또는 그 실시형태의 입자는 필요한 위치에 아주반트 및/또는 항원을 제공하기 위한 조절가능한 시스템을 제공할 수 있다. 또한, 입자는 항원 및/또는 리간드와 같은 그 외의 제제로 덮고, 소망의 위치 및/또는 특정한 세포 형태로 표적으로 할 수 있다. 입자 내에 항원 및/또는 아주반트의 트랩핑은, 예를 들면 경구 또는 피하 투여에 의해 백신접종에 적합한 이러한 화합물을 제조할 수 있다.
항원은 종종 단백질성이고 취약하다. 폴리머의 가교는 라디칼 가교에 의해 수행될 수 있다. 자유 라디칼 가교는 항원에 잠재적으로 해로울 수 있으므로 바람직하지 않을 수 있다.
대부분의 비-자유 라디칼 가교는 성장되지 않고(not propagating), 1 대 1 반응만을 형성한다.
단계(i)에서 폴리머 사슬은 바람직하게 서로 상호작용해서(하기 참조) 수성 상 중에서 폴리머 하위 상을 형성한다. 즉, 비교적 폴리머 사슬이 풍부한 상(polymer chain-rich phases) 및 비교적 폴리머 사슬이 부족한 상이 형성된다. 바람직한 실시형태에서, 항원 및/또는 아주반트는 폴리머 사슬 풍부 상에서 존재한다. 폴리머 사슬 풍부 하위 상에서 항원 및/또는 아주반트의 하위 위치는 항원 및/또는 아주반트와 폴리머 사슬 사이의 물리적 상호작용에 기초해서 발생한다.
단계(i)에서, 항원 및/또는 아주반트는 폴리머 사슬과 공유결합 컨쥬게이션을 형성하지 않는다. 가교 단계(ii) 또는 (iii)에서 항원 및/또는 아주반트 및 폴리머 사슬은 함께 3D 네트워크를 형성한다.
항원 및/또는 아주반트는, 폴리머 담체 또는 장치를 형성하는 폴리머 가교와 동시에, 바람직하게 폴리머 담체에 링커 분자를 통해 공유결합된다. 단계(ii) 또는 (iii)에서 형성된 가교된 항원 및/또는 아주반트 폴리머 컨쥬게이트는 비-가교된 폴리머 입자보다 높은 열역학 안정성을 나타낸다. 또한, 트랩핑된 항원 및/또는 아주반트 분자는 폴리머 담체에의 공유결합으로 인해 빠른 방출을 방지한다.
본 발명의 백신 조성물은 입자 형성 전에 단일 폴리머 사슬에 직접 항원 및/또는 아주반트를 결합할 필요는 없고, 감열성과 같은 사용된 폴리머의 초기 특성 및/또는 항원 및/또는 아주반트 로딩된 미셀의 형성의 용이성을 충분히 유지한다. 고정된 형태의 폴리머, 예를 들면, 감열성 생분해성 블록 코폴리머는, 항원 및/또는 아주반트 로딩된 장치의 조성물을 빠르고 쉽게 변화/최적화할 수 있는 널리 적용가능한 기반 기술을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 가교 후 폴리머 담체를 형성할 수 있는 폴리머 사슬과 비공유결합으로 상호작용할 수 있는 모든 항원 및/또는 아주반트에 적용할 수 있다. 수성 상에서, 폴리머 사슬(가교 단계 전)은 바람직하게 특정한 구조 또는 적어도 폴리머 사슬 풍부 도메인에서 집합하고; 항원 및/또는 아주반트는 이러한 집합체 내에서 위치한다. 모든 형태의 물리적 상호작용이 가능하다(하기 참조).
또 다른 요건은, 항원 및/또는 아주반트가 폴리머 입자의 베이스를 형성하는 폴리머 사슬의 부위와 반응할 수 있는 부위를 포함하는(또는 반응성 치환체로 개질될 수 있는) 것이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 및/또는 아주반트에 링커 분자, 바람직하게 생분해성 링커를 제공한다.
미셀 코어와 같은 담체의 코어에 항원 및/또는 아주반트의 공유결합 트랩핑함으로써, 항원 및/또는 아주반트는 초기에는 자유롭지 않지만, "갑작스러운 방출"을 갖지 않는다. 체내에서 가교된 담체의 연장된 체류 및/또는 혈액 순환으로부터의 이점을 갖고, 주입 부위 및/또는 혈액 흐름 내에 저장소(depot)로서 작용하고, 동시에 이는 표적 조직, 예를 들면, 종양, 림프절, 또는 염증 조직에 항원 및/또는 아주반트 농도를 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 동결건조함으로써 장기간 제품 안정성을 얻을 수 있다. 예를 들면, 항원 및/또는 아주반트 로딩된 입자를 포함하는 본 발명에 따른 백신 조성물은 모폴로지의 손실 없이 쉽게 동결건조되고 현탁되고, 건조 분말로서 장기간 수명이 얻어진다. 이는, 특히 개발도상국에서 냉장이 필요하지 않고 및/또는 건조 분말인 백신 조성물이 바람직하기 때문에 이점이 있다.
따라서, 본 발명은 입자가 수성 환경에서 폴리머 담체 내 항원 및/또는 아주반트의 비 공유 트랩핑에 의해 시작하고, 폴리머 담체의 폴리머 사슬은 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 비공유 트랩핑에 이어서 동시에 항원 및/또는 아주반트와 폴리머 사슬 사이의 가교 반응 및 폴리머 사슬 자체 사이의 가교반응에 의해 뒤엉킨 네트워크(intertwine network)를 형성한다. 바람직한 실시형태에서, 추가의 컨쥬게이션 단계가 수행되어 입자 표면에 항원 및/또는 아주반트 및/또는 표적 리간드를 컨쥬게이팅한다.
미셀과 같은 얻어진 항원 및/또는 아주반트 로딩된 폴리머 장치는, 항원 및/또는 아주반트의 미성숙 방출(갑작스러운 방출)이 나타나지 않지만, 예를 들면 비경구 투여시 주사 부위 및/또는 혈액 순환 부위에서 연장된 체류를 입증한다. 바람직한 실시형태에서, 항원 및/또는 아주반트는 적절하게 트랩핑된 화합물의 지속적으로 방출하는 적합한 링커를 포함하고, 바람직하게 특정한 방출 속도를 갖는다. 이는 예를 들면 (매우)향상된 수지상 세포(DC)를 표적으로 하고 림프절에서 축적하고 면역계를 활성화할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 항원 및/또는 아주반트는 폴리머 매트릭스에 링커를 통해 트랩핑되고, 바람직하게는 분해성 링커, 더 바람직하게는 생분해성 링커이다. 이러한 시스템은 아주반트 및/또는 항원의 박동성 또는 일정한 방출을 허용한다. 담체로부터 항원 및/또는 아주반트의 조절된 방출은 생리적 조건 하에서 항원 및/또는 아주반트와 폴리머 담체 사이의 바람직하게 분해성 링커 또는 결합기를 분할함으로써 또는 하기 상세하게 설명된 바와 같이 국소적 환경 트리거 또는 외부 자극에 의해 달성된다. 또한, 트랩핑은 자유 항원 및/또는 아주반트 및/또는 비공유결합으로 트랩핑된 항원 및/또는 아주반트의 정맥내 투여 직후에 존재하는 독성이 높은 항원 및/또는 아주반트 피크 레벨에 혈액의 노출을 방지한다. 보다 중요하게, 정상 조직에 시스템의 이동을 방지함으로써, 급성 독성 효과가 감소할 수 있다. 항원 및/또는 아주반트에 대한 그 외의 방법은 가교된 미셀 코어와 같은 가교된 폴리머 담체의 형성된 3차 네트워크에 가둠으로써 환경으로부터 충분히 보호되고, 따라서 미성숙 분해 및/또는 제거를 방지한다. 이러한 독특한 형태는 적합한 장소 및 시기에 예상된 유효 투여량으로 항원 및/또는 아주반트를 전달한다.
또한, 본 발명 및 그 실시형태의 바람직한 실시형태에서, 입자의 표면 상 아주반트 및/또는 항원은, 입자의 외측면에 존재하고 면역계에 이용가능하기 때문에 방출될 필요는 없다.
본 발명의 백신 조성물의 입자를 제조하는 방법은 2개의 본질적인 연속 단계를 포함한다.
제1단계에서, 가교 폴리머 및 항원 및/또는 아주반트는 수성 환경에서 혼합된다. 이는 항원 및/또는 아주반트를 선택적으로 적합한 용매 중에 수성 폴리머 용액 또는 분산액에 첨가함으로써 달성되는 것이 바람직하고, 적합한 용매로는 바람직하게 에탄올, 테트라하이드로푸란 또는 디메틸설폭시드와 같은 저급 알콜과 같은 수혼합성 용매 또는 물이다. 폴리머 및 항원 및/또는 아주반트는, 폴리머 및 항원 및/또는 아주반트가 밀착하고, 바람직한 실시형태에서 항원 및/또는 아주반트가 폴리머 사슬과 접촉과 접촉하도록 선택한다. 즉, 제1단계에서 폴리머 사슬과 항원 및/또는 아주반트 사이의 물리적 비-공유결합의 상호작용은 폴리머 장치의 특이적 영역에서 화합물을 선택적으로 위치시킨다.
제1단계에 따라, 항원 및/또는 아주반트를 형성하는 분자는 용액에서 폴리머 사슬 사이 및 내에 비공유결합으로 트랩핑된다. 본 설명 및 수반하는 청구항에서,"비공유 상호작용"의 개념은, 공유결합하지 않는 임의의 상호작용, 즉 원자 또는 결합 사이에 전자쌍의 공유를 수반하지 않는 임의의 결합을 의미한다. 비공유결합으로 상호작용으로는 소수성, 방향족, 수소 결합, 정전기, 입체착체 및 금속 이온 상호작용이다.
본 발명의 백신 조성물의 입자를 제조하는 방법의 제2 또는 제3의 필수 단계에서, 제1 단계 후, 비공유결합으로 트랩핑된 항원 및/또는 아주반트는 새롭게 형성한/형성된 폴리머 네트워크에 공유결합된다. 즉, 반응은 수행되고, 폴리머 사슬이 가교된다. 이는, 분자 사이 및 분자 내에서 발생할 수 있지만, 분자 사이의 가교는 분명히 바람직하고, 분자 사이의 가교를 선호하는 임의의 단계는 본 주장된 공정의 바람직한 실시형태이다. 가교 단계와 동시에, 항원 및/또는 아주반트의 반응성 부위는 폴리머 사슬에 가교되고, 폴리머 및 항원 및/또는 아주반트의 뒤엉킨 네트워크가 형성된다. 적합하게, 폴리머는 1개 초과의 반응성기를 포함하고, 1개 초과의 항원 및/또는 아주반트와 반응할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리머는 서로 반응할 수 있는 상이한 반응성기를 포함하고, 폴리머 및 항원/아주반트의 3D 네트워크를 형성한다. 2개 이상의 상이한 반응성기를 포함하는 폴리머가 사용될 수 있다. 또한, 상이한 반응성기는 상이한 폴리머에 존재할 수 있다.
이 단계는 개시제 및/또는 촉매가 필요하지만, 또한 물리적 상황에 의해 가교 및 컨쥬게이트를 형성하는 반응을 일으킬 수 있다. 개시제 및/또는 촉매가 필요한 경우, 이들은 항원 및/또는 아주반트와 함께 폴리머 용액에 첨가할 수 있지만, 더 이른 단계 또는 더 나중 단계에서 반응 시스템에 첨가할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 개시제가 자유 라디칼인 것은 아니고, 자유 라디칼은 항원 및/또는 아주반트 자체와 반응해서 이들의 특성을 변경시킬 수 있다. 특히, 티로신 및/또는 트립토판과 같은 민감한 아미노산에 대해서 사실이다. 방향족 측쇄 또는 설피드릴기는 보통 자유 라디칼에 대해 아미노산의 대부분의 반응성기인 것으로 고려된다.
항원 및/또는 아주반트의 적당량은 폴리머 및 항원 및/또는 아주반트의 중량에 대해 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 15 중량%, 예를 들면 1 내지 10 중량%이다. 항원 및/또는 아주반트의 통합 정도는 95 내지 100%일 수 있고, 유사한 양은 형성된 3D 네트워크에 통합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 양쪽성 폴리머는 용매 중에서 완전히 용해될 수 있다.
항원 및/또는 아주반트는 용매 중에서 존재할 수 있거나 상기 폴리머의 용해 후 또는 느슨한 미셀 내 자가 조립시 첨가될 수 있고, 항원 및/또는 아주반트는 폴리머 또는 미셀 용액에 일반적인 분포를 형성하고,
그 다음에, 이 시스템은 특정한 상황(예를 들면, 온도, pH, 용매)이 변화하고, 폴리머의 적어도 일부분이 폴리머의 그 외의 부분과 상이한 거동을 나타내고 클러스터링이 발생하고,
항원 및/또는 아주반트의 물리적 특성으로 인해, 이러한 항원 및/또는 아주반트는 새롭게 형성된 클러스터링된 폴리머 용액의 특정 영역 내에서 위치하고,
이와 같이 위치시킨 후, 가교가 발생해서 이들의 바람직한 영역 내에서 항원 및/또는 아주반트를 고정시킨다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서, 감열성 블록 코폴리머가 사용된다. 예를 들면, 항원 및/또는 아주반트는 수성 환경에서 혼합되고, 또한 비가교된 감열성 블록 코폴리머는 낮은 임계 용액 온도(LCST)보다 낮은 온도에서 존재하고, 또는 임계 미셀 형성 온도(CMT) 보다 낮은 온도에서 존재한다. 해당 LCST보다 낮은 온도에서 시스템이 용액 상태이고 해당 CMT보다 낮은 임의의 온도에서 미셀 형성은 발생하지 않는다. 그러나, 이러한 시스템을 가열함으로써, 입자 또는 미셀이 형성되고 이들의 소수성 코어 내에서 항원 및/또는 아주반트를 트랩핑한다. 또한, 항원 및/또는 아주반트 없이 단계(i)에서 빈 미셀이 형성된다. 이어서, 항원 및/또는 아주반트 용액이 빈 미셀에 첨가된다. 다음, 코어 내에 뒤엉킨 미셀 네트워크를 형성하는 가교 반응은 LCST 또는 CMT보다 높은 온도에서 수행한다. 이는, 폴리머 용액의 가열 전 또는 가교되지 않은 입자 또는 미셀 형성 후 개시제 및/또는 촉매 첨가에 의해 촉진될 수 있다. 처음 나노입자를 형성한 후 항원 및/또는 아주반트를 첨가한 후 가교하는 방법은 펩티드에 매우 적합할 수 있다.
본 발명 및 그 실시형태의 방법의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 폴리머는 입자를 제조하기 위해 엄격한 조건은 필요하지 않다. 적합하게, 입자는 유기 용매 및/또는 아주반트 및/또는 용매에 해를 끼칠 수 있는 그 외의 약품 또는 용매 없이 형성된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 폴리머 사슬은, 예를 들면 감열성 블록 코폴리머이다. 특히, 부분적으로 메타크릴화된 올리고락테이트 유닛을 갖는 PEG-b-폴리(N-하이드록시알킬 메타크릴아미드-올리고락테이트)에 기초한 코폴리머가 바람직하다. 그 외의 다양한 (메타)아크릴아미드 에스테르는, 감열성 블록, 예를 들면, 에스테르 및 바람직하게 HPMAm (하이드록시프로필 메타크릴아미드) 또는 HEMAm (하이드록시에틸메타크릴아미드), 및 N-(메타)아크릴로일 아미노산 에스테르의 (올리고)락테이트 에스테르를 구성하도록 사용될 수 있다. 바람직한 감열성 블록 코폴리머는 HPMAm-락테이트 폴리머와 같은 메타크릴레이트기에 의해 개질될 수 있는 기능성기를 함유하는 모노머로부터 유도된다.
사용될 수 있는 그 외의 형태의 기능성 감열성 (코)폴리머는, 소수성 개질된 폴리(N-하이드록시알킬)(메타)아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드(NIPAAm)와 반응성 기능기를 함유하는 모노머의 코폴리머 조성물(예를 들면, 산성 아크릴아미드 및 N-아크릴옥시숙신이미드와 같은 그 외의 부분) 또는 폴리(알킬) 2-옥사잘린 등의 유사한 코폴리머이다.
또한 바람직한 감열성기는 NIPAAm 및/또는 알킬-2-옥사솔린에 기초하고, 이러한 모노머는 하이드록실기, 카르복실기, 아민기 또는 숙신이미드기를 함유하는 (메타)아크릴아미드 또는 (메타)아크릴레이트와 같은 반응성 기능기를 함유하는 모노머와 반응할 수 있다.
적합한 감열성 폴리머는 미국 특허 제7,425,581호 및 유럽 특허 제1 776 400호에 기재되어 있다.
그러나, 또한 그 외의 형태의 양쪽성 블록 코폴리머 또는 이온성 미셀이, 반드시 감열성일 필요는 없고, 가교된 반응성기를 함유하거나 가교된 반응성기로 개질될 수 있는 것이 사용될 수 있다. 이러한 경우의 최신 방법은 입자 및/또는 미셀을 형성하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들면 직접적 용해, 투석, 염석 및 용매 증발이다.
이러한 그 외의 형태의 폴리머는 물 중에서 폴리머 풍부 상에 따르고(예를 들면, 소수성 상호작용 또는 이온 상호작용으로 인해), 반응성 부위를 포함하거나 반응성 부위, 예를 들면 PEG-PLA-메타크릴레이트(예를 들면, Kim et al., Polym. Adv. Technol., 10 (1999), 647-654에 상세하게 기재됨), 메타크릴화된 PLA-PEG-PLA (예를 들면, Lee et al. in Macromol. Biosci. 6 (2006) 846-854에 상세하게 기재됨), 메타크릴화된 PEG-poly 카프로락톤 (예를 들면 Hu et al. in Macromol. Biosci. 9 (2009), 456-463에 기재됨), 또한 폴리락트산, 폴리락트산 글리콜산 및/또는 폴리카프로락톤에 기초한 (블록 코)폴리머를 함유한 그 외의 반응성 부위를 결합하기 위해 사용될 수 있는 부위를 포함한다.
또한, 이온성 상호작용으로 인해 미셀을 형성할 수 있는 폴리머가 사용될 수 있고, 예를 들면 폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리메타크릴산 코폴리머의 블록 이오노머 착체, 및 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(아미노산)의 블록 코폴리머(예를 들면, Lee et al., Angew. Chem 121 (2009) 5413-4516; Nishiyama et al. in Cancer Res. 63 (2003), 8977-8983, 또는 Miyata et al., J. Control. Rel. 109 (2005) 15-23에 의해 교시됨)에 기초한 2가의 금속 양이온(예를 들면, Kim et al. in J. Control. Rel. 138 (2009) 197-204, and Bontha et al. in J. Control. Rel. 114 (2006) 163-174에 의해 기재됨) 폴리이온 착체이다.
일반적으로 적합한 용매 시스템에서 상이한 하위 상을 형성할 수 있는 모든 폴리머는 이러한 하위 상에서 선택적으로 위치할 있는 아주반트 및/또는 항원과 함께 사용될 수 있다.
폴리머 사슬 및 항원 및/또는 아주반트는, 반응성 부위를 함유하거나 함유하도록 개질될 수 있다. 사용된 폴리머는 아주반트 및/또는 항원의 반응성 기와 가교 및 반응할 수 있는 충분히 많은 반응성 치환체를 함유해야 한다. 예를 들면, 폴리머의 모노머 유닛의 10 내지 15%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 또는 45 내지 50%가 반응성 치환체를 갖는 경우에 적합한 결과가 얻어지지만, 모노머 유닛의 100% 이하가 반응성 치환체를 갖는 것이 유도될 수 있다. 예를 들면 모노머 유닛의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 반응성 치환체를 갖는 것이 유도될 수 있다. 또한, 모노머 유닛의 1 내지 10%, 2 내지 8%, 3 내지 7%, 4 내지 6%, 및 2 내지 5%가 반응성 치환체를 갖는 것이 유도될 수 있다.
아주반트 및/또는 항원은 아주반트/항원-폴리머 매트릭스가 형성되도록 바람직하게 폴리머에 가교할 수 있는 반응성 치환체를 갖는다. 본 발명 및 그 실시형태의 바람직한 실시형태에서, 아주반트 및/또는 항원은 가교할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위 또는 치환체를 갖는다. 바람직하게, 1개 초과, 예를 들면, 2, 3, 4, 또는 5 의 반응성 부위는 아주반트 및/또는 항원에 존재한다. 큰 분자는 작은 분자보다 더 많은 반응성 부위를 가질 수 있고, 따라서 반응성 부위의 양은 크게 아주반트 및/또는 항원의 크기에 의존한다. 항원 및 아주반트는 큰 생분자일 수 있으므로 5개 초과, 또는 심지어 10개 초과, 더욱 더 15개 초과, 또는 더욱 더 20개 초과, 더욱 더 25개 초과한 반응성 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 반응성 부위, 반응성 치환체, 및 반응성 기는 상호 교환해서 사용되고 모두는 또 다른 분자에 가교 및 결합하는 것과 같은 작용을 할 수 있는 기를 의미한다.
항원 및/또는 아주반트의 방출 속도는 쉽게 항원 및/또는 아주반트에 반응성 부위를 컨쥬게이팅하기 위해 상이한 형태의 링커를 사용함으로써 조절될 수 있다. 적합한 형태의 잘 알려진 분해성 링커 분자는 에스테르, 카르보네이트, 이민, 카르바메이트, 숙시네이트, 또는 오르토(옥심)에스테르, 케탈, 아세탈, 히드라존, 및 효소 분해성 링커(예를 들면, 펩티드) 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 모든 종류의 잘 알려진 자극에 민감한 링커, 예를 들면, 광/온도/초음파 민감한 링커 및 그 외의 링커도 사용될 수 있다. 항원 및/또는 아주반트를 개질하는 경우, 컨쥬게이션 형태를 주의하고, 방출시 항원 및/또는 아주반트만 방출시키고 충분한 활성을 보장하기 위한 그 외의 첨가제를 가질 수 있는 유도체를 방출시키지 않는다. 생분해성 링커를 사용함으로써, 원래의 항원 및/또는 아주반트는 특이적 조절된 방출 프로파일에 따라 방출되고 활성 및 특히 그 면역 또는 자극 효과를 발휘한다.
본 발명의 백신 조성물은, 미셀, 나노입자, 미세구, 하이드로겔과 같은 폴리머 담체, 및 그 외의 형태의 폴리머 담체, 또는 트랩핑된 항원 및/또는 아주반트의 코팅을 갖는 장치와 같은 조절 방출을 위해 트랩핑되거나 달리 통합된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 장치이다.
상기와 같이, 본 발명의 방법의 제2(또는 제3) 본질적 단계에서, 가교 및 컨쥬게이션이 행해진다. 자유 라디칼 개시제는, 항원 및/또는 아주반트와 반응하여 그 특성을 변경하기 때문에, 항원 및/또는 아주반트와 사용하기에 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 가교는 자유 라디칼 없이 수행될 수 있다. 바람직하게, 가교는 성장되지 않고, 예를 들면 반응당 1 결합만 형성한다. 적합한 가교는 Michael 부가에 의해 수행될 수 있다(Censi et al J. Contol Rel 148 (2010) e28-e29). 본 발명에 따른 적합한 가교는. 에스테르, 히드라진, 아미드, 쉬프(Schiff)-베이스, 이민, 아세탈 결합 및 이들의 임의의 잠재적인 상응하는 유도체를 포함한 유사한 생분해 결합으로부터 선택되는 하나의 결합을 초래하는 가교이다. 본 발명에 따른 적합한 가교는 알콜, 산, 카르복실, 히드록실, 아민, 히드라진 등으로부터 선택된 반응성 부위를 갖는 가교이다. 또한, 광중합성이 적합하다(Censi et al J. Control Rel 140 (2009) 230-236). 반응성 부위는 폴리머 사슬 및/또는 항원 및/또는 아주반트 내에 및/또는 결합 분자 상에 존재할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 링커 또는 폴리머는 하나를 초과한 반응성 부위를 포함하고 다수의 결합 형성한다. 적합한 예로는, 별 유사 구조, 예를 들면 OH 함유 폴리머 및/또는 항원 및/또는 아주반트와 반응성할 수 있는 8개 팔 COOH-유도된 PEG이다. 임의의 라디칼 없이, 밀집 3D 네트워크가 형성되고 민감한 화합물을 보호할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 반응 조건은 상당히 온화하고 수성 환경에서 발생하여 항원 및/또는 아주반트의 완전성을 보호한다. 바람직하게, 가교에 의해 생분해성 결합을 형성한다.
아주반트 및/또는 항원이 분해성 링커를 통해 트랩핑되는 경우, 치료적 활성 화합물의 일정한 방출이 보장된다. 아주반트 및/또는 항원의 담체로부터 조절된 방출은 생리적 조건하에서 아주반트 및/또는 항원과 같은 활성 성분과 폴리머 담체 사이에서 바람직하게 분해성 링커 또는 결합기의 분해에 의해 달성되고, 또는 하기 상세하게 설명된 국소적 환경 트리거 또는 외부 자극에 의해 달성된다. 적합한 분해성 링커는, 참조로 포함되어 있는 국제공개 공보 제2012/039602호에서 찾을 수 있다.
이러한 링커는 하기 식을 들 수 있다:
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A,
- n 및 m 은 0 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1 내지 5의 정수이고, 더 바람직하게는 1 내지 3의 정수이고; m은 1 내지 7의 정수이고; 바람직하게는 1 내지 5의 정수이다;
- R1 및 R2 는 서로 독립적으로 고립 전자쌍, 산소 부위, 예를 들면 = O, 질소 부위, 예를 들면 =N-Rx으로부터 선택되고, Rx 는 원자의 균일성 또는 이질성 기이고, 바람직하게 독립적으로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알케닐이고, 알킬 또는 알케닐기는 선택적으로 하나 이상의 할로겐기, 하이드록실기, 아미노 또는 치환된 아미노기, 카르복실기, 니트로기 또는 시아노기로 치환될 수 있는 알킬 또는 알케닐기; 또는 방향족기(바람직하게 페닐기)는 알킬 및 알케닐기에 대해 언급된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 방향족기; 또는 할로겐기, 하이드록실기, 아미노기 또는 치환된 아미노기(치환기는 1개 또는 2개의 C1-C3 알킬기임), 카르복실산기, 니트로기, 또는 시아노기이고
- A는 컨쥬게이션 부위이고; 및
- Q 는 직접 결합, C=O, C=NH 또는 C=NRp 기이고, Rp 는 C1-C3알킬이다. 해당 식에서 HO-Q기는 HR9N-Q기로 치환될 수 있고, R9 는 수소원자 또는 C1-C3알킬기일 수 있다.
다음의 바람직한 링커 식에서, HO-Q 기는 카르복실산기이고, 컨쥬게이션 부위 A는 중합성 메타크릴레이트이고, 이러한 부위는 하기 작용 실시예에서 열거된다.
Figure 112015098120033-pct00001
상기 예는 제한되지 않고, 예를 들면 메타크릴레이트기는 본 명세서에 기재된 임의의 중합성 기로 치환될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 적합한 컨쥬게이션기는 식 -PL-RvC=CRuRw의 중합성 부위이고, -PL-은 결합기, 예를 들면 -O-, -NH-, 치환된 -N-이고, 치환기는 C1-C3 알킬, -O-C(O)-, -O- (C(O))r-C6H26-이고, r은 0 또는 1이고, b는 1 내지 6의 정수이고, Ru, Rv 및 Rw는 독립적으로 수소원자 또는 C1-C3기를 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, 추가의 단계는 입자의 외측면에 하나 이상의 화합물의 컨쥬게이션을 포함한다. 컨쥬게이션 단계에서, 아주반트, 항원 및/또는 표적 화합물은 폴리머의 반응성 부위에 컨쥬게이팅된다. 적합하게, 폴리머는 가교 단계 후 아주반트, 항원 및/또는 표적 화합물과 상호작용할 수 있는 반응성 부위를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리머의 말단은 적합하게 유도될 수 있는 항원, 아주반트 및/또는 표적 화합물과 상호작용할 수 있는 반응성 부위를 포함한다. 폴리머 말단의 반응성 부위는, 폴리머의 물리적-화학적 특성이 변화되지 않는 것을 보장하고, 추가의 기능성이 사용된다. 표면이 개질되지 않는 입자에 대해, 폴리머는 단부에 메톡시와 같은 비/반응성 부위를 갖는다. 적합 폴리머는 X-PEG-b-HPMAmLacx이고, X는 (Y-유도된) 화합물과 상호작용할 수 있는 임의의 반응성 부위일 수 있고, 안정한 또는 생분해성 결합을 형성한다. 후자는 화합물의 사용형태에 의존하고, 즉, 컨쥬게이션 생리활성에 무시할정도 영향을 미치는 경우, 생분해성 결합이 필요할 수 있는 반면, 리간드 억제시, 전체 입자의 완전한 세포간 취입(nteger intracellular uptake)을 보장하기 위해 적합한 결합이 필요하다.
바람직한 실시형태에서, X 폴리머의 비율이 0 내지 100%, 바람직한 셋팅에서 0 내지 50%, 더 바람직하게는 0 내지 20%일 수 있고, 표면에 컨쥬게이팅될 수 있는 반응성 부위 %를 위해 우수하게 조절하는 것이다.
이와 같이 해서, 입자는 항원 및/또는 아주반트를 트랩핑할 뿐 아니라 실제로 소망의 형태의 면역 반응을 유도하는 데 필요한 항원 제시 세포(APC)에 대한 입자를 표적으로 한다. 바람직한 실시형태에서, 아주반트, 항원, 및/또는 입자 표면 상의 표적 화합물은 링커, 바람직하게 분해성 링커로 이용된다. 입자 내측에 피팅되지 않고 입자의 내측에 트랩핑하는 데에 적합하지 않는 큰 항원 및/또는 아주반트의 경우, 입자의 표면에 컨쥬게이션하는 것이 매우 적합하다. 핵산의 경우, 바람직하게 분해성 링커를 통해 외측 표면에 컨쥬게이션하는 것이 매우 적합하다.
바람직한 실시형태에서 표적 화합물은 입자의 표면에 컨쥬게이팅된다. 표적 화합물은 수지상 세포(DC)를 적합하게 표적으로 할 수 있다. 인간 DC는 인간 백혈구 항원(HLA) DR(주 조직적합성 착체 분류 II)의 과-발현에 의해 식별된다. 또한, 골수성 DC를 식별하기 위한 특이적 마커는 CD11c+, CD1a+, BDCA-1+, BDCA-3+, HLA-DR+를 포함하는 반면, 형질세포 형태의 DC의 경우 CD11c-, HLADR+, BDCA-2+ 및 CD123+이다. 바람직한 실시형태에서, 표적 화합물은 CD11, CD1a, BDCA-1, BDCA-3, HLA-DR, BDCA-2 및 CD123, 톨-유사 수용체(toll-like receptors) (TLR), C-형태 렉틴 수용체 (CLR), 및 노드 유사 수용체(nod-like receptors) (NLR)에 결합하거나 결합될 수 있다. 적합한 표적 화합물은 표 1에 표시되어 있다.
Figure 112015098120033-pct00002
또한, 암 백신화에 적합한 표적 화합물은 만노오스/만난, 각 면역글로불린 분류에 대한 Fc 수용체에 대한 리간드, CD11c/CD18 및 DEC 205 수용체 표적, DC-SIGN 수용체 표적으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 소망의 표적 세포에 대해 적합한 표적 화합물을 인지하고 소망의 표적 화합물을 선택할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 표적 리간드, 표적 제제, 표적 화합물 또는 표적 기는 상호 교환해서 사용되고, 모두는 특이적 세포 또는 특이적 조직을 표적으로 할 수 있는 화합물을 의미한다.
바람직한 실시형태에서 항원은 펩티드 또는 단백질의 (부분)이다. 본 발명에 따르면, 펩티드는 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산의 폴리머이다. 이들은 단백질의 펩티드 결합된 동일한 것이지만, 일반적으로 길이가 더 짧다. 가장 짧은 펩티드는 디펩티드이고, 이는 단일 펩티드 결합에 의해 결합된 2개의 아미노산으로 구성된다. 본 발명에 따르면, 펩티드는 길이가 1000개 이하의 아미노산이고, 예를 들면 10 내지 500개 아미노산, 바람직하게 12 내지 450개 아미노산, 더 바람직하게 15 내지 400개 아미노산, 더 바람직하게 17 내지 375개 아미노산, 더 바람직하게 20 내지 350개 아미노산, 더 바람직하게 22 내지 300개 아미노산, 더 바람직하게 25 내지 20개 아미노산, 더 바람직하게 27 내지 225개 아미노산, 더 바람직하게 30 내지 200개 아미노산, 더 바람직하게 33 내지 175개 아미노산, 더 바람직하게 35 내지 150개 아미노산, 더 바람직하게 37 내지 150개 아미노산, 더 바람직하게 40 내지 125개 아미노산, 더 바람직하게 45 내지 100개 아미노산, 더 바람직하게 50 내지 85개 아미노산, 더 바람직하게 55 내지 75개 아미노산 및 가장 바람직하게 60 내지 70개 아미노산이다. 적합한 펩티드는 3 내지 100개 아미노산, 더 바람직하게 3 내지 90개 아미노산, 더 바람직하게 3 내지 80개 아미노산, 가장 바람직하게 3 내지 70개 아미노산이다. 펩티드는, 환상 펩티드가 아니면, 아미노 말단 및 카르복실 말단을 갖는다. 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 심지어 단백질은 본 발명에 따른 펩티드하에서 구상되는 것으로 이해된다.
항원 및 아주반트의 혼합물은 본 발명에 따르는 입자 내에서 트랩핑될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게, 항원 및/또는 아주반트는, 상기 기재된 폴리머의 폴리머 사슬과 물리적 비공유결합으로 상호작용하는 경향을 갖도록 하는 성질이 있어야 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 바람직하게 감열성 폴리머를 사용해서 소수성 화합물의 캡슐화에 특히 유용하다.
나노입자 기반 백신은 살아있는 바이러스 백신의 면역원성을 개괄하고, 지속적인 항원-아주반트 착체의 결과로서 경우에 따라 장수명 보호를 유도할 수 있다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물에서, 항원은 임의의 항원일 수 있다. 항원이 핵산이 경우, 항원은 입자의 표면에 바람직하게 컨쥬게이팅된다. 바람직한 실시형태에서, 항원은 약품, 박테리아 박테리아 배설(bateria baterialexcretions), 예를 들면 독소, LPS, 박테리오파지, 미코박테륨 항원, 오발부민, 바이러스, 또는 그 임의의 부분으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합하게 항원은 표면 단백질 또는 그 일부분으로서, 박테리아, 바이러스, 박테리오파지 및/또는 미코박테륨으로부터의 항원이다. 적합한 예로서는 디프테리아톡소이드, 디프테리아 CRM-197, 인간 유두종바이러스, 말라리아 바이러스 항원, 웨스트니일 바이러스, (재조합)헤파티티스 A 또는 B(표면 또는 코어 항원), 거세포바이러스, HIV, 탄저병, 광견병, 칸디다증, 인플루엔자(다양한 형태), 예를 들면 하위 유닛 유사 항체(hemagglutinin), 및 뉴라미니다아제, 또는 결핵, 예를 들면 Ad35-vectored 결핵(TB) AERAS-402로부터의 항원이다. 당업자는 백신 형태 및 투여 경로에 기초해서 적합한 항원을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 바람직한 실시형태에서, 입자는 하나를 초과한 항원을 포함할 수 있다. 동일한 질병 제제의 하나를 초과한 항원이 사용될 수 있고, 및/또는 멀티백신을 위해 상이한 질병 제제로부터의 항원이 사용될 수 있다
본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은, 바람직하게 아주반트를 포함한다. 공지의 아주반트는 박테리아 독소, 미립자, 식물 유도체 및 병원체 관련 분자패턴(PAMPs)에 이르는 매우 다양한 세트의 화합물이다. 잠재적인 아주반트의 유용한 데이타베이스는 Vaxjo이고 http://www.violinet.org/에서 찾을 수 있다. 데이타베이스 Vaxjo는 본원에 참고로 포함되어 있다.
아주반트의 구체예로는 코발트 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드 하이드레이트, 알루미늄포스페이트, 포타슘알루미늄 설페이트, 비활성 및 건조된 미코박테륨(보통 M. tuberculosis)(Freund'의 아주반트의 일부), CT: 콜레라 독소; 예를 들면 CTB: 콜레라 독소의 하위 유닛 B, LT: 대장균 열민감 독소, 이미퀴모드(Imiquimod), 몬타니드(Montanide), 예를 들면 MontanideTM ISA51, MF59 TM: 종래에 높은 HLB (폴리솔베이트 80) 및 낮은 HLB 계면활성제 (솔비탄 트리올레이트)의 혼합물에 의해 안정되는, 160 nm 액적 형태로 분산된 스쿠알렌 오일, AS02TM: 스쿠알렌 및 2개의 소수성 면역 아주반트, MPL1TM(LPS의 합성 유도체), 및 QS-21(정제된 사포닌 식물 추출물)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 아주반트는 백반 (알루미늄 하이드록사이드), 스쿠알렌 또는 MF59이다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 바람직한 실시형태에서 입자는 하나를 초과한 아주반트를 포함할 수 있다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은, 치료 및/또는 예방 목적으로 적합하게 사용될 수 있다. 사용 분야의 예로서, 종양, 결핵, 박테리아 감염, 디프테리아, 헤파티티스 B, 인플루엔자, HIV, HCV, 플라비바이러스(flavivirus), 웨스트니일바이러스, 댕기열 바이러스일 수 있다. 임의의 종류의 지시가 가능하고, 본 발명은 상기 나타낸 예로서 제한되지 않는 것으로 이해된다.
적합하게, 본 발명 및 그 실시형태는 예방을 위해 백신 조성물의 사용에 관한 것이다. 적합하게, 본 발명은 질병에 대한 면역을 위해 본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물의 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은 약제로서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은 질병에 대해 사용하기 위한 것이다. 본 발명은 발명의 백신 조성물을 대상에 사용 및/또는 투여하는 치료방법에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에서 질병은 암, 감염, 안과 질병, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 세균 감염, 미코플스마 감염, 기생충 감염, 염증, 피부과 질환, 심혈관 질환, 중추신경계 질환, 자가면역 질환, 증식성 질환, 관절염, 정신병, 건선, 당뇨병, 대사장애, 폐병(lung diseases), 호흡기 질환, 폐질환(pulmonary diseases), COPD, 근육골격계통 질환, 폐기종, 부종, 호르몬 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로 본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은 척수 손상, 심장마비, 허혈, 관절염, 세균 감염, 수술후 통증, 통증, 비-소세포 폐암(또는 소세포폐암, 방광암, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin`s lymphoma), 일반적 위장암, 결장암, 두경부암, 유방암, 일반적 고형암), 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병, 유방암, 뇌암, 일반적 백혈병, 간암, 췌장암, 결장암, 자궁경부암, 일반적 림프종, 난소암, 편팡상피세포암, 일반적 폐암, 췌장암, 방광암, 신장암, 간암, 소세포폐암, 위암, 호지킨 림프종, 비소세포폐암, 식도암, 부신암, 흑색종, 골수형성이상증후군, 유모세포 백혈병(hairy cell leukaemia), 일반적 피부, 방광, 두경부, 비소세포폐, 식도, 난소, 흑색종, 평활근육종, 담즙, 유방, 전립선, 전신 홍반성 낭창, 중피종, 및/또는 일반적 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 질병 치료에 적합하다.
또한, 본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은 눈의 질환, 감염 질환, 염증성 질환, 암, 심혈관 질환, 중추신경계에 의한 질환, 자가면역 질환 및/또는 요붕증, 다뇨증, 번갈증(polydipsia), 수술후 통증 및/또는 척수 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 질환 치료에 적합하다.
감염성 질환은 그램 음성 감염, 피부 감염, 및/또는 세균 감염을 포함하는 박테리아 감염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
염증 질환은 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 맹장염, 점액낭염, 대장염, 방광염, 피부염, 수막염, 정맥염, 비염, 건염, 편도선염, 및/또는 혈관염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
암은, 호르몬 민감성 전립선 암, 호르몬에 민감한 유방암, 비소 세포 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 비호지킨 림프종, 일반적인 위장암, 결장암, 두경부암, 유방암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 뇌암, 백혈병, 간암, 고환암, 소세포 폐암, 난소암, 자궁경부암, 편평상피 세포암, 췌장암, 신장암, 위암, 호지킨 림프종, 식도암, 부신피질 암, 흑색종, 골수 형성이상 증후군, 유모세포 백혈병 피부암, 평활근 육종, 전립선암, 전신 홍반성 낭창, 중피종, 및/또는 육종을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
눈 질환은 황반 변성, 급성 수술 후 내안구염 황반 부종 및/또는 백내장을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
심혈과 질환은, 혈관 수축, 말초 동맥 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 관상 동맥 질환, 심근 병증, 고혈압성 심장 질환, 심부전, 폐심장증(cor pulmonale), 심장 부정맥, 염증성 심장병, 심장 내막염, 염증성 심장 비대, 심근염, 심장 판막 질환, 뇌졸중 및 뇌 혈관 질환, 말초동맥 질환, 고혈압 및/또는 아테롬성 동맥 경화증을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
중주신경계에 의한 질환은, 뇌염, 폴리오, 신경퇴행성 질환, 예를 들면 알츠하이머 병, 근 위축성 측색 경화증, 자가 면역 및 염증성 질환, 예를 들면 다발성 경화증 또는 급성 파종성 뇌척수염, 및 유전 질환, 예를 들면, 크라베병, 헌팅턴병, 및/또는 부신 백질 이영양증을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
자가면역 질환은, 급성 뇌척수염 (ADEM), 애디슨 병, 무감마글로불린혈(Agammaglobulinemia), 원형 탈모증, 근위축성측색경화증, 강직성 척추염, 항 인지질 증후군, 항합성효소 증후군(Antisynthetase syndrome), 아토피 알레르기, 아토피성 피부염, 자가 면역 재생 불량성 빈혈, 자가 면역 심근증, 자가 면역 장 질환, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 자가 면역성 간염, 자가 면역 내이 질환, 자가 면역성 림프 증식성 증후군, 자가 면역 말초 신경 병증, 자가 면역성 췌장염, 자가 면역 다선 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome), 자가 면역 프로게스테론 피부염, 자가 면역성 혈소판 감소성 자반증, 면역 두드러기, 자가 면역 포도막염, Balo 질환 / Balo 동심 경화증, 베체트 병, 버거씨병, Bickerstaff의 뇌염, 블라우 증후군, 수포성 유사 천포창, 암, 캐슬 병, 소아 지방 변증, 샤가스 병, 만성 염증성 탈수 초성 다발성 신경 병증, 만성 재발성 다발성 골수염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 척 - 스트라우스 증후군, 흉터성 유사 천포창, 코간 증후군, 한랭 응집소 질환, 구성 요소 2 결핍, 접촉성 피부염, 두개골 동맥염, 크레스트 증후군, 크론병, 쿠싱 증후군, 피부 백혈구 파괴혈관염, Degos 병, Dercum 질환, 포진상 피부염, 피부 근염, 제1형 당뇨병, 확산 피부 전신 경화증, 드레슬러 증후군, 약물 유발 낭창, 원판형 홍반성 낭창, 습진, 자궁 내막증, 골부착부염 관련 관절염, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 후천성 수포성 표피 박리증, 결절 홍반, 태아 적아구증, 본태성 혼성 한랭 글로불린 혈증, 에반 증후군, 진행성 골화성 섬유형상이상, 섬유화 폐포염 (또는 특발성 폐 섬유증), 위염, 위장 유사 천포창, 거대 세포 동맥염, 사구체 신염, 항사구체기저막 증후군, 그레이브스 병, 길란 - 바레 증후군 (GBS), 하시모토 뇌병증, 하시모토 갑상선염, 헤노호 쉰라인 자반증, 임신 포진 일명 임신 유사 천포창, 한선염, 휴 - 스토빈 증후군, 저 감마 글로불린 혈증, 특발성 염증성 탈수 초성 질환, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (자가 면역 혈소판 감소성 자반병 참조), IgA 신병증, 봉입체 근염, 만성 염증성 탈수 초성 다발성 신경 병증, 간질성 방광염, 청소년 특발성 관절염 일명 청소년 류마티스 관절염, 가와사키병, 램버트 - 이튼 근육무력 증후군, 백혈구 혈관염, 편평 태선, 결화태선, 선형 IgA 질환 (LAD), 루게릭 병 (또한 근위축성 측색 경화증), Lupoid 간염 일명 자가 면역성 간염, 홍반성 낭창, 마지드 증후군, 메니에르병, 미세혈관다발혈관염(Microscopic polyangiitis), 밀러 피셔 증후군 (길란 - 바레 증후군, 혼합 결합 조직 질환, 국소성 경피증(Morphea), 무카-하베르만 질환(Mucha-Habermann disease) 일명 급성 두창상 태선양 비강진, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증[46][47], 시신경 척수염 (또한 데빅병(Devic's disease)), 신경근육긴장증, 반흔성 유사 천포창, 안구간대경련-근간대경련증후군, 오드 갑상선염, 재발성 류머티즘, PANDAS (연쇄상 구균 관련 소아 자가면역 정신 질환), 부신 생물 소뇌 변성, 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH), 패리 롬버그 증후군, 파서니지 - 터너 증후군, 평면부염(Pars planitis), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 정맥주위성 뇌척수염, POEMS 증후군, 결절성 다발 동맥염, 류마티스성 다발근통, 다발성 근육염, 원발성 담즙성 간경화증, 원발성 경화성 담관염, 진행성 염증성 신경 병증(Progressive inflammatory neuropathy), 건선, 건선 관절염, 괴저 농피증, 순수적혈구무형성증, 라스무센 뇌염, 레이노 현상, 재발성 다발 연골염, 라이터 증후군, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스 관절염, 류마티스 열, 유육종증, 정신 분열증, APS의 또 다른 형태의 슈미트 증후군, SCHNITZLER 증후군, 공막염, 경피증, 혈청병, 쇼그랜 증후군, 척추 관절 병증, 스틸병, 즉 청소년 류마티스 관절염, 전신근강직증후군, 아급성 심내막염(SBE), Susac 증후군, 열성호중구성피부병(Sweet's syndrome), 시든해 무도병, 즉 PANDAS, 교감성 안염, 전신 홍반성 낭창, 즉 홍반성 낭창, 타카야수 동맥염, 측두동맥염, (또한"거대 세포 동맥염"라고도 함), 혈소판 감소증, 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 대장염, (특발성 염증성 장 질환"IBD"의 두 가지 타입 중 하나), 혼합 결합 조직 질환과 상이한 미분화 결합 조직 질환, 미분화 척추 관절 병증, 두드러기 혈관염, 혈관염, 백반증, 및/또는 베게너 육아 종증을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
그 외의 질환은 요붕증, 다뇨증, 및/또는 번갈증, 소양증 수술 후 통증 및/또는 양측 마비를 포함한 척수 손상을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명 및/또는 그 실시형태의 백신 조성물은, 다양한 투여 경로에 대해서 적합하게 사용될 수 있다. 적합한 경로는 비경구, 정맥 내 (i.v.), 피하 (SC), 근육 내, 림프내(intralymphatic), 복강 내, 경구, 예를 들면 구강, 설하, 점막전달, 예를 들면, 비강내, 및 폐, 피부, 예를 들면, 국소, 경피, 경피이다.
명확하고 간결하게 설명하기 위해, 본원에 기재된 특성은 동일하거나 별도의 실시형태의 일부로서 기재되어 있고, 본 발명의 범위는 기재된 특징의 모두 또는 일부의 조합을 갖는 실시형태를 포함할 수 있는 것을 알 수 있다.
실험 데이터:
일례로, 본 발명의 방법의 구체적인 실시형태의 제형이 기재되어 있다. 어떤 점에서도 실시예가 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 가교된 나노입자 내에 공유결합으로 트랩핑된 류프롤리드
실시예 1은, 부분적으로 메타크릴레이트화 올리고라테이트 유닛을 갖는 감열성 PEG-b-폴리(N-하이드록시알킬 메타크릴아미드-올리고락테이트)에 기초한 코폴리머로부터 출발한다. 류프롤리드는 분해성 링커인 술폭시드-메타크릴레이트(국제공개 공보 제2012/039602호의 L2)에 부착된 반응성 부위로 유도된다. 상기 감열성 블록 코폴리머의 수용액은 이어서 폴리머 CMT 미만의 온도, 즉 미셀을 형성하지 않는 온도, 즉 0℃에서 농축된 소량의 테트라히드로푸란 중 류프롤리드의 용액(일반적으로 10:1체적비)과 혼합한다. 그 다음에, 개시제/촉매 용액(포타슘 퍼설페이트(KPS)-N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)을 첨가한 직후, 임계 미셀 형성 온도(CMT), 즉 20℃까지 빠르게 가열한다. 이와 같이 해서 단분산 폴리머 미셀을 형성하고(약 70 nm 크기, PDI 0.2 미만), 류프롤리드는 소수성 코어 중에서 비공유 결합으로 위치한다. 미셀 형성 후, 질소 분위기를 형성한다. 따라서, 개시제 라디칼은 반응성부위를 갖는 중합성 류프롤리드 및 메타크릴화 폴리머의 중합을 유도한다. 이러한 가교 공정에 의해 뒤엉킨 네트워크를 형성하고 미셀 코어의 내측에 공유결합으로 류프롤리드를 고정하고, 미셀 크기 또는 균일성에 영향을 미치지 않는다.
따라서, 류프롤리드는 가교된 미셀 내에 공유결합으로 트랩핑된다. 류프롤리드는 가수분해에 의해 방출되고, 미셀은 개질되지 않은 올리고락테이트 유닛의 (부분적인)가수분해 후 물리적 환경에서 수화에 의해서 팽창한다. 따라서, 류프롤리드의 방출 및 미셀의 분해가 동시에 발생한다. 이러한 분해는 국소적 환경 트리거 또는 외부 자극을 일으킬 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법은 미셀을 형성할 수 있는 사용으로, 이것으로 제한되지 않는다. 폴리머 나노입자, 마이크로입자, 하이드로겔 또는 코팅 내에서 (약물)분자의 비공유 결합 이어서 공유 결합을 일으킨다.
항원 및/또는 아주반트 로딩된 입자를 갖는 본 발명의 백신 조성물은 융통성이 있는 시스템으로, 표적 특이적 세포 및/또는 지시에 대해 항원 및/또는 아주반트 로딩된 나노입자, 예를 들면 치료 또는 백신 목적으로 지속적 방출(항원 및/또는 아주반트 로딩된 나노입자의 지속적 방출)하는 점액 접착 입자(바이러스 유사 입자를 갖는 백신접종의 경우 구강, 폐 또는 위장관)의 합리적인 디자인을 보장한다.
실시예 2: 류프롤리드 및 분해성 링커
류프롤리드는 펩티드 및 다소 친수성 화합물이다. 조절된 방출은 사용된 링커의 형태에 의존한다.
Figure 112015098120033-pct00003
입자는, L1은 분해성 링커로서 사용되는 것을 제외하고 실시예 1에 나타낸 바와 같이 제조된다. X는 류프롤리드이고, R=S인 반면, L2에서(실시예1) R=S0이다. 국제공개 공보 제2012/039602호 참조. 쥐의 체중 및 거동을 평가해서 안전성을 모니터링한다.
도 1은 시간경과에 따른 류프롤리드의 방출을 도시하고, 링커에 의한 방출의 저항성을 나타낸다.
도 2는 PK 프로파일, 전신 노출시 지속방출, 투여량 반응 곡선을 도시한다.
데이터는 건강한 쥐에 정맥 내 투여 후 얻어진다. 쥐의 체중 및 거동을 평가하여 안전성을 모니터링한다.
실시예3 : 미셀 나노입자 내에 공유결합으로 트랩핑된 옥트레오티드
옥트레오티드와 가교된 미셀은, 실시예1 또는 2의 류프롤리드와 가교된 미셀과 동일한 방법으로 제조된다. 데이터는 건강한 쥐에 정맥 내 투여 후 얻어진다. 쥐의 체중 및 거동을 평가하여 안전성을 모니터링한다. PK 프로파일, 전신 노출시 지속적 방출, 및 투여량 반응 곡선뿐 아니라, 시간 경과에 따른 옥트레오티드의 방출이 측정된다.
실시예 4: 미셀 나노입자 내에 공유결합으로 트랩핑된 엑세나티드
엑세나티드, 39개 아미노산 펩티드와 가교된 미셀은, 실시예1 또는 2의 류프롤리드와 가교된 미셀과 동일한 방법으로 제조된다. 생분해성 링커의 컨쥬게이션은 엑세나티드의 리신 부위에 아민 반응성 링커를 통해 발생한다. 64 nm 평균 크기 및 PDI 0.03인 입자가 얻어졌다. 엑세나티드 방출은 생리학적 조건하에서 실험관내에서 측정되었다. 엑세나티드는 4일에 걸쳐서 방출되었다.
실시예5 : DC 표적 세포(예를 들면, 수지상 세포)에 동시에 항원 및 아주반트의 전달
단계:
아주반트 및 항원은 L1 또는 L2와 같은 동일한 링커에 의해 유도된다. 유도된 아주반트 및 항원을, 부분적으로 메타크릴레이트화 올리고락테이트 유닛을 갖는 감열성 폴리머 PEG-b-폴리(N-하이드록시알킬 메타크릴아미드-올리고락테이트)와 혼합하고, 본질적으로 가교된 미셀을 실시예1에 기재된 바와 같이 제조한다. 아주반트 및 항원은 나노입자의 코어 내측에 공유결합으로 트랩핑된다.
나노입자는 비바스핀 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 정제해서 임의의 컨쥬게이팅되지 않은 아주반트 및/또는 항원을 제거하고 용액 내에 1형태의 나노입자만 형성한다.
나노입자는 건강한 쥐에 정맥 내 투여에 의해 동물 모델 내에서 실험하고, 실시예 2를 참조한다. PK 프로파일 및 시간에 걸친 방출을 시험하고, 대조군을 사용한다: 쥐의 체중 및 거동을 평가해서 안전성을 평가한다. 항체 역가를 측정한다.
실시예 6: 조절가능한 입자 크기
본 발명의 입자는 잘 조절되는 방법으로 제조될 수 있다(작은 입자, 적어도 30 nm 미만, 심지어 80 nm 이하). 모든 경우, 이러한 입자는 작은 다분산도를 갖는다(즉, 0.2 미만).
감열성 블록으로서 HPMAmDPx (HPMAmDP1 와 HPMAm2 의 이론적비는 53:47%.) 및 친수성 블록으로서 PEG5000 을 갖는 블록 코폴리머는, 상기 기재된 바와 같이 필수적으로 거대개시제로서 (mPEG5000)2-ABCPA를 사용해서 자유로운 라디칼 중합에 의해 제조했다.(Biomaterials 28 (2007) 5581-5593). 요약하면, 출발 물질(다양한 비율(mol/mol)의 모노머 및 거대개시제를 제조했다)의 농도는 유리 바이알 내에서 아세토니트릴 중 300 mg/mL 이었다. 용액은 적어도 10분 동안 질소로 플러싱하고, 70℃로 가열하고, 적어도 24 시간동안 교반했다. 이어서, 과량의 디에틸 에테르에 용액을 적하 첨가함으로써 폴리머를 침전시켰다. 원심분리 후, 잔류물을 진공 오븐에서 건조했다. 나중에, 폴리머를 물 중에 용해하고 물에 대해 24시간 동안 투석하고(12-14 kDa의 컷오프를 갖는 멤브레인), 동결건조에 의해 회수했다.
이어서, 메타크릴레이트기를, 이전에 기재된 바와 같이 메타크릴산 무수물을 락테이트 측쇄의 말단 하이드록실기와 반응시킴으로써 mPEG-b-p((HPMAmDP1)-co-(HPMAmDP2)) 의 감열성 블록의 부분에 결합시켰다.
얻어진 폴리머 길이는 상이한 모노머:개시제 비를 사용해서 매우 우수하게 조절되고, 이어서 도 3에 플로팅된 바와 같은 입자 크기를 결정했다.

Claims (22)

  1. 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 반응성 부위를 포함하는 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을, 상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합의 반응성 부위와 반응할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 폴리머 사슬을 포함하는 수용액 또는 분산액과 혼합하는 단계로, 상기 폴리머 사슬은 분자내(intramolecularly) 또는 분자 사이(intermolecularly)에서 더 가교결합할 수 있는 것인, 단계;
    (ii) 상기 폴리머가 입자로 자가 조립(self-assemble)하고, 상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합이 미셀의 코어 내에 캡슐화되는 조건으로 이러한 혼합물을 처리하는 단계; 및
    (iii) 폴리머 매트릭스의 형성과 동시에 상기 항원, 아주반트, 또는 이들의 조합이 이러한 폴리머 매트릭스 내에, 즉 형성된 폴리머 네트워크 내에 트랩핑되도록 하는 조건하에서, 입자 혼합물을 가교결합시켜 폴리머 매트릭스를 형성하는 단계;
    를 포함하는, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  2. 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 항원, 아주반트 또는 이들의 조합의 반응성 부위와 반응할 수 있는 적어도 하나의 반응성 부위를 포함하는 폴리머 사슬을 포함하는 수용액 또는 분산액을 제공하는 단계로, 상기 폴리머 사슬은 분자내 또는 분자 사이에서 더 가교결합할 수 있는 것인, 단계; 및
    (ii) 이러한 혼합물을, 상기 폴리머가 입자로 자가 조립하는 조건으로 처리하는 단계, 및
    (iii) 상기 단계(ii)로부터의 입자를 항원, 아주반트 또는 이들의 조합이 상기 입자 내에 캡슐화되도록 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 및
    (iv) 폴리머 매트릭스의 형성과 동시에 상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합이 이러한 폴리머 매트릭스 내에, 즉 형성된 폴리머 네트워크에서 트랩핑되는 조건하에서, 상기 단계 (iii)으로부터의 입자 혼합물을 가교 결합시켜 폴리머 매트릭스를 형성하는 단계,
    를 포함하는, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 가교결합은 자유 라디칼 없이 수행되거나, 또는 상기 가교결합은 성장되지 않는(non-propagating) 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 가교결합은, 디설피드(disulphide), 에스테르, 히드라진, 아미드, 쉬프 베이스(Schiff-base), 이민, 아세탈 결합 및 유사한 생분해성 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 결합을 형성하는 반응인 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 입자의 표면을, 표적화 제제; 또는 항원, 아주반트 또는 이들의 조합과 컨쥬게이팅하는 추가의 단계를 포함하는, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계(i)에서의 상기 폴리머 사슬은 연속적인 수성 상에서 폴리머 사슬이 풍부한 상(polymer chain-rich phases)을 형성하는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합은 상기 수성 상에 비해 상기 폴리머 상 중에 더 높은 농도로 존재하는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머 사슬은 감열성 폴리머 사슬인 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합은 수성 환경에서 혼합되고, 또한 비가교결합된 폴리머 사슬은 초기에 낮은 임계 용액 온도(LCST)보다 낮은 온도에서 존재하고, 그 후 상기 LCST보다 높은 온도에서 단계(ii)를 수행하거나; 또는 임계 미셀 형성 온도(CMT) 보다 낮은 온도에서 존재하고, 그 후 상기 CMT보다 높은 온도에서 단계(ii)를 수행하는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 감열성 폴리머 사슬은 N-하이드록시알킬-(메타)아크릴아미드 또는 N-(메타)아크릴로일 아미노산의 소수성 개질 에스테르에 기초한 (코)폴리머로부터 선택되는, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 폴리머 사슬은, HPMAm(하이드록시프로필메타크릴아미드) 또는 HEMAm(하이드록시에틸메타크릴아미드)의 (올리고)락테이트 에스테르 및 N-(메타)아크릴로일 아미노산 에스테르, N-이소프로필아크릴아미드 또는 알킬-2-옥사잘린을 포함하는 N-하이드록시알킬 메타크릴아미드-올리고락테이트, 폴리락트산(PLA)-메타크릴레이트, 메타크릴화 PLA-PEG-PLA, 메타크릴화 PEG-폴리 카프로락톤의 코폴리머와 같은 기능기를 포함하는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    미셀, 하이드로겔, 마이크로입자, 또는 상기 감열성 폴리머에 기초한 코팅 형성 폴리머를 사용하는, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머는 PEG와의 디- 또는 트리-블록 코폴리머인 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머 사슬; 또는 상기 아주반트, 항원 또는 이들의 조합은 알콜, 산, 아민, 카르복실, 하이드록실 또는 히드라진으로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 부위를 포함하는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 반응성 부위는 분해성 결합을 통해 상기 항원, 아주반트 또는 이들의 조합에 결합되는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 하기 식인 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
    HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
    (상기 식에서,
    - n 및 m 은 0 내지 20의 정수이고;
    - R1 및 R2 는 서로 독립적으로 고립 전자쌍; 산소 모이어티; 및 질소 모이어티로부터 선택되고;
    - A는 콘쥬게이션 부위이고; 및
    - Q 는 직접 결합, C=O, C=NH 또는 C=NRp 기이고, Rp 는 C1-C3알킬이고, 해당 식에서 HO-Q기는 HR9N-Q기로 치환될 수 있고, R9 는 수소원자 또는 C1-C3알킬기일 수 있다).
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 입자는 다분산도(DPI)가 0.5 미만인 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  18. 아주반트, 항원 또는 이들의 조합을 통합하는 폴리머 매트릭스를 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물로서, 상기 입자는 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해서 얻을 수 있는 것인, 백신접종 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 백신접종 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    예방 백신으로서 사용하기 위한 백신접종 조성물.
  21. 제16항에 있어서,
    산소 모이어티는 =O 인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
  22. 제16항에 있어서,
    질소 모이어티는 =N-Rx이고, Rx 는 서로 독립적으로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알케닐기, 방향족기, 할로겐기, 하이드록실기, 아미노기 또는 치환된 아미노기(치환기는 1개 또는 2개의 C1-C3 알킬기임), 카르복실산기, 니트로기, 또는 시아노기이고, 이때 상기 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐기는 하나 이상의 할로겐기, 하이드록실기, 아미노 또는 치환된 아미노기, 카르복실산기, 니트로기 또는 시아노기로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 상기 방향족기는 C1-C6 알킬기 및 C1-C6 알케닐기에 대해 언급된 치환체 중 하나 이상에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것인, 항원, 아주반트 또는 이들의 조합을 포함하는 입자를 포함하는 백신접종 조성물을 제조하는 방법.
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