JP2008540558A - ミセルおよび粒子を用いた、活性物質の送達のための新規の戦略 - Google Patents
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Abstract
本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子(例えば、三次元粒子)およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。本発明によって、ケタール基を含む生分解性疎水性ポリケタール重合体が提供され、ここで、該重合体の各ケタール基は、該重合体骨格内に、2つの酸素原子を有する。
Description
本出願を通じて、様々な刊行物が、参考文献として引用されている。これらの刊行物の開示の全体は、本発明が属する最新技術をより十分に説明するために、本明細書により参考として本出願に援用されている。
本発明は、NIH/NIAIDの助成金AI048638、AI0564499、AI056947、AI057157、AI05726601、およびNIH/NIDDKの助成金DK057665の下の政府支援によって、行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
(発明の分野)
本発明は、活性物質(例えば、(i)ワクチン;(ii)免疫調節剤(生得免疫細胞(例えば、樹状細胞)の機能を調節するTLRリガンドもしくは合成分子、または細胞(例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞)内のシグナリングネットワークを調節する合成分子もしくはsiRNAを含む)および/あるいは;(iii)生得免疫および獲得免疫を調節するように、治療用環境または予防用環境において、抗原提示細胞を標的化する薬物)を送達するための戦略に基づいた粒子およびミセルに関する。
本発明は、活性物質(例えば、(i)ワクチン;(ii)免疫調節剤(生得免疫細胞(例えば、樹状細胞)の機能を調節するTLRリガンドもしくは合成分子、または細胞(例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞)内のシグナリングネットワークを調節する合成分子もしくはsiRNAを含む)および/あるいは;(iii)生得免疫および獲得免疫を調節するように、治療用環境または予防用環境において、抗原提示細胞を標的化する薬物)を送達するための戦略に基づいた粒子およびミセルに関する。
(発明の背景)
(ワクチン接種のために生得免疫を利用する)
免疫系の特徴は、質的に異なる型の免疫反応を惹起する能力である。従って、例えば、Tヘルパー1(すなわちTh1)免疫反応は、ウイルス感染細胞または腫瘍を殺傷する細胞傷害性「キラー」T細胞を刺激する。反対に、Tヘルパー2(すなわち、Th2)反応は、抗体産生(特に、細胞外の寄生虫もしくは細菌または毒素に対する保護を付与するIgE抗体の分泌)と関連している。さらに、T調節性反応は、強すぎる免疫反応を抑制し得、従って、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、またはセプシス様症状により引き起こされる免疫病理学症状を制限する。このような広範な型の免疫反応の存在、ならびにウイルス、腫瘍、細胞外の寄生虫および細菌に対する有効な保護を付与すること、ならびにアレルギー、自己免疫、移植およびセプシスにおける有害な免疫反応を調節することにおけるそれらの特異な役割を考慮に入れると、近代免疫学の「ロゼッタ石」は、様々な臨床上環境における有効な免疫反応を最適に誘導する方法を学ぶことである。
(ワクチン接種のために生得免疫を利用する)
免疫系の特徴は、質的に異なる型の免疫反応を惹起する能力である。従って、例えば、Tヘルパー1(すなわちTh1)免疫反応は、ウイルス感染細胞または腫瘍を殺傷する細胞傷害性「キラー」T細胞を刺激する。反対に、Tヘルパー2(すなわち、Th2)反応は、抗体産生(特に、細胞外の寄生虫もしくは細菌または毒素に対する保護を付与するIgE抗体の分泌)と関連している。さらに、T調節性反応は、強すぎる免疫反応を抑制し得、従って、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、またはセプシス様症状により引き起こされる免疫病理学症状を制限する。このような広範な型の免疫反応の存在、ならびにウイルス、腫瘍、細胞外の寄生虫および細菌に対する有効な保護を付与すること、ならびにアレルギー、自己免疫、移植およびセプシスにおける有害な免疫反応を調節することにおけるそれらの特異な役割を考慮に入れると、近代免疫学の「ロゼッタ石」は、様々な臨床上環境における有効な免疫反応を最適に誘導する方法を学ぶことである。
この意味において、免疫学における最近の進歩は、免疫反応の質と量との両者を制御することにおける生得免疫系の根本的な役割を明らかにした(非特許文献1)。このように、免疫系は、可溶性の分解された形態で注射されるほとんどの外来性のタンパク質に対して非反応性であるが、「アジュバント」と呼ばれる免疫刺激物質と一緒に注射される場合、これらの外来性のタンパク質は、強い免疫を誘導し得ることが、ずっと前から知られてきた。実際、アジュバントの本質は、その後の特定の型の免疫反応を決定するものであり、この特定の型の免疫反応は、細胞傷害性T細胞反応、抗体反応、または特定のクラスのTヘルパー反応に対して偏し得ることが公知であった。(非特許文献2;非特許文献3;非特許文献1)。アジュバントの重要性にも拘わらず、米国において臨床上の使用を許可されているアジュバントは、ミョウバン1つのみしか存在せず、そしてほとんどの他の実験的なアジュバントは、免疫細胞の強力な活性化を誘導するが、毒性をもまたもたらす、微生物または細菌の粗抽出物からなる。最近まで、このようなアジュバントの作用機構は、理解されていなかった。しかしながら、生得免疫における最近の進歩は、アジュバントがどのように作用するのかを理解することに関して概念的な枠組みを提供してきた。この問題の中核は、樹状細胞(DC)として公知の細胞の、希少であるが、広く分布したネットワークであり、これは、生得免疫系の必須構成成分を構成する。「天然のアジュバント」と呼ばれているDCは、微生物およびウイルスの構成成分を認識し得るレセプターを発現する。このようなレセプターとしては、微生物の刺激を「感知」し得、そしてDCおよび他の免疫細胞を活性化し得るToll様レセプター(TLR)、C型レクチン、およびキャタピラタンパク質(CATTERPILLAR protein)が挙げられる(非特許文献2;非特許文献3;非特許文献1)。DCが、免疫反応の質および量を調整することに必須の役割を果たすことは、今や明らかである。
現在、哺乳類に関して記載されている約13個のTLRが、存在する。DC上の異なるTLRを活性化することは、質的に異なる型の免疫反応を誘導する(前出のPulendranら,2001年;前出のDillonら,2004年;非特許文献4;非特許文献5)。従って、殆どのTLRを活性化することは、Th1反応を誘導し得;TLR3、7または9を活性化することは、ウイルス感染細胞および腫瘍を殺傷する細胞傷害性T細胞を誘導し得;そして得られる証拠は、TLR2を活性化することが、(ウイルスまたは細胞外の細菌もしくは寄生虫に対する保護を提供する抗体反応に関連している)Th2反応、または(強すぎる免疫反応を抑制し、従って、アレルギー、自己免疫、セプシス、および移植における制御できない免疫に対する保護を提供する)T調節性反応もしくは免疫寛容を生じる反応までも誘導することを示唆する。このように、DCならびにTLRおよび他の認識レセプターは、ワクチン学者および薬物開発者にとって魅力的な免疫調節の標的を代表する。従って、生得免疫系(例えば、DCおよびTLR)の基本的要素を開発する方法を学ぶことは、新規の薬物およびワクチンの開発において、最も重要である。
この概念から導出される重要な結論は、(最初に記録されたエドワード ジェンナーのワクチン接種試験以来)過去200年にわたり開発されてきたワクチンの大部分が、実験的に開発されてきたということである。従って、様々な災い(例えば、天然痘、ポリオ、TBおよび黄熱病)を制御することにおけるワクチンの成功にも拘らず、我々は、これらのワクチンがどのようにこのような有効な免疫を刺激するのかに対する科学的な理由について、全く知識を有していない。例えば、黄熱病ワクチン17D[YF−17D]は、最も有効な公知のワクチンの1つである。65年よりも前の黄熱病ワクチン17Dの開発以来、このワクチンは、世界中の4億人を超える人々に投与されてきた。その成功にも拘らず、その作用機構は、知られていない。従って、上記のように、ここ6年ほどの間に起こった生得免疫における目を見張る進歩は、我々に、21世紀の新興感染症および再興感染症に対する将来のワクチンを考案するために、このような知識を用いるという視点で、このような「黄金基準(gold standard)」ワクチンの作用方法(modus operandi)を理解するために用いる新しい見解を提供する。この意味において、我々の最近の知見は、非常に有効な黄熱病ワクチン(YF−17D)が、DC、および多数のTLR(TLR2、7、8および9を含む)の強力な刺激因子であることを示唆する(非特許文献6)。異なるTLRにより引き起こされる異なる型の免疫反応(前出のPulendranら,2001年;非特許文献4;前出のDillonら,2004年;非特許文献5)を考慮に入れた上で、多数のTLRを活性化することにより、YF−17Dが、広いスペクトルの免疫反応を誘導していることを推測することは、魅力的であった。実際、我々のデータは、YF−17Dが、広いスペクトルの生得免疫反応および獲得免疫反応(Th1細胞、Th2細胞、細胞傷害性T細胞、中和抗体)を引き起こし、異なるTLRが、異なる型のこの多価免疫を制御することを示唆する(非特許文献6)。このような広いスペクトルの免疫反応を誘発することはまた、現在ワクチンが存在しない他の感染(例えば、HIV、HCV、マラリア、TB、インフルエンザ、炭壊およびエボラ)に対する、または腫瘍に対するワクチンを設計するのに有利である可能性がある。従って、新興感染または再興感染に対する将来のワクチンを設計するための戦略は、多岐にわたる免疫反応を誘導するために、多数のTLRリガンドおよび抗原、ならびに免疫調節剤を組み込むことから利益を得うる。従って、重要な挑戦は、インビボでこのような免疫調節剤を送達する能力を有する送達システムの開発である。
(新規ワクチンのための送達システム)
ポリエステルおよびポリ無水物に基づいた薬物送達媒体は、それらの優れた生物適合性プロフィールおよび遅い加水分解速度に起因して、治療薬の持続型放出のために広く用いられてきた(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10)。しかしながら、多数の医学的適用(例えば、リソソームおよび腫瘍の酸性環境を標的化すること)は、迅速なpH感受性の分解を受ける薬物送達システムを必要とする(非特許文献11;非特許文献12)。薬物送達のために用いられる生分解性重合体の大部分は、生理的pH値で塩基により触媒される加水分解によって分解されるエステル結合から構成されているので、この必要条件を満たすことができない。エステルベースの物質(例えば、ポリ(乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリオルトエステル、およびポリ無水物)から作製される粒子は全て、分解する際に、多量の酸を生じる。このことは、タンパク質治療薬およびDNA治療薬の分解を引き起こし、この分解はまた、何週間から何ヶ月もかかる。成熟DCの寿命は、約2日なので、これらの物質は、ワクチン開発にとって理想的ではない。最近、ポリ(オルトエステル)およびポリ(β−アミノエステル)に基づくpH感受性疎水性マイクロ粒子が、細胞内薬物送達および腫瘍標的化のために首尾よく用いられてきており、従って、薬物送達のための酸感受性の生物物質の可能性を有することを示している(非特許文献13;非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16)。結果として、pH感受性生分解性重合体の合成のための新しい戦略を開発することにおける多大な関心が、存在する。
ポリエステルおよびポリ無水物に基づいた薬物送達媒体は、それらの優れた生物適合性プロフィールおよび遅い加水分解速度に起因して、治療薬の持続型放出のために広く用いられてきた(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10)。しかしながら、多数の医学的適用(例えば、リソソームおよび腫瘍の酸性環境を標的化すること)は、迅速なpH感受性の分解を受ける薬物送達システムを必要とする(非特許文献11;非特許文献12)。薬物送達のために用いられる生分解性重合体の大部分は、生理的pH値で塩基により触媒される加水分解によって分解されるエステル結合から構成されているので、この必要条件を満たすことができない。エステルベースの物質(例えば、ポリ(乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリオルトエステル、およびポリ無水物)から作製される粒子は全て、分解する際に、多量の酸を生じる。このことは、タンパク質治療薬およびDNA治療薬の分解を引き起こし、この分解はまた、何週間から何ヶ月もかかる。成熟DCの寿命は、約2日なので、これらの物質は、ワクチン開発にとって理想的ではない。最近、ポリ(オルトエステル)およびポリ(β−アミノエステル)に基づくpH感受性疎水性マイクロ粒子が、細胞内薬物送達および腫瘍標的化のために首尾よく用いられてきており、従って、薬物送達のための酸感受性の生物物質の可能性を有することを示している(非特許文献13;非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16)。結果として、pH感受性生分解性重合体の合成のための新しい戦略を開発することにおける多大な関心が、存在する。
組換えタンパク質、ペプチド抗原、またはこのようなワクチン抗原をコードするDNAワクチンに基づいたワクチンは、その抗原エピトープが規定されている感染症および腫瘍に対し、大いに治療の可能性を有する。このようなワクチンは、動物モデル、および現在開発中のこのようなワクチンに関する多数の臨床試験において、感染症に対する防御免疫を生じる能力を有していた(非特許文献17;非特許文献18;非特許文献19;非特許文献20)。しかしながら、それらの期待にも拘わらず、挑戦の多くは、有効な免疫反応を惹起するために、適切な型の抗原提示細胞を標的化するような、ペプチド、タンパク質、DNAワクチンおよびアジュバントの効率的な送達を懸念する。脂質結合体およびPLGAマイクロ粒子から構成されるペプチドワクチンに関して、期待できる結果が得られてきたが、依然として、新規のペプチドワクチン送達媒体開発について多大な需要が、存在する(非特許文献21;非特許文献22)。
Pulendran & Ahmed,Cell,2006年,124,p.849−863 Pulendran,Immunol.Rev.,2004年,199,p.227−250 Pulendran,J.Immunol.,2005年,175,p.2457−2465 Agrawalら,J.Immunol.,2003年,171,p.4984−4989 Dillonら,J.Clin.Immunol,2006年,116,p.916−928 Querecら,J.Exp.Med.,2006年,203,p.413−421 Anderson,J.M.ら,Adv.Drug Delivery Rev.,1997年,28,p.5−24 Jain,R.A.,Biomaterials,2000年,21,p.2475−2490 Mathiowitz,E.ら,J.Appl.Polym.ScL,1988,35,p.755−774 Berkland,C.ら,J.Controlled Release,2004年,94,p.129−141 Stubbs,M.ら,Mol.Med.Today,2000年,6,p.15−19 Leroux,J.−C.,Adv.Drug Delivery Rev.,2004年,56,p.925−926 Heller,J.ら,Biomacromolecules,2004年,5,p.1625−1632 Heller,J.ら,Adv.Drug Delivery Rev.,2002年,54,p.1015−1039 Berry,D.ら,Chem.Biol,2004年,11,p.487−498 Potineni,A.ら,J.Controlled Release,2003年,86,p.223−234 van Endert,PM,Biologicals,2001年,29,p.285−8 Purcell,AWら,Journal of Peptide Science,2003年,9,p.255−81 Shirai,M.ら,Journal of Virology,1994年,68,p.3334−42 Hunziker,IPら,International Immunology,2002年,14,p.615−26 Ertl,HCJら,Vaccine,1996年,14,p.879−85 Jackson,DCら,Vaccine,1997年,15,p.1697−705
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(発明の要旨)
本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子(例えば、三次元粒子)およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。
本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子(例えば、三次元粒子)およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。
(疎水性ポリケタール粒子)
本発明は、重合体の骨格内にケタール基を含む新規の型の疎水性重合体に向けられている。ここで、上記ケタール基は、両方の酸素原子が上記重合体の骨格内に位置する様式で、配置されている。
本発明は、重合体の骨格内にケタール基を含む新規の型の疎水性重合体に向けられている。ここで、上記ケタール基は、両方の酸素原子が上記重合体の骨格内に位置する様式で、配置されている。
さらに、このケタール重合体は、ケタールとジオールとの間のケタール交換反応により形成され得る。本発明に従って、1つ以上の型のケタールおよび/またはジオールは、ホモ重合体または共重合体の形成のために用いられ得る。
また、本発明により含まれるのは、他の重合体(例えば、PEG、ポリエステル、ポリアミド、多糖、ポリエーテル、またはポリ無水物)により連結されるポリケタール重合体である。その結果生じる重合体は、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、またはグラフト共重合体であり得る。ポリチオ−アミンケタール、ポリチオ−ヒドロキシルケタールおよびポリヒドロキシル−アミンケタールが混合したポリチオケタール重合体もまた、本発明の範囲内である。
本発明のポリケタール重合体は、水溶液中で加水分解して、低分子量、水溶性のアルコールおよびケトンになる。骨格内のケタール結合の利点は、このケタール結合が、ファゴソームの酸性条件下、1〜2日以内にpH5.0で分解することである。従って、ポリケタールはまた、腫瘍、炎症およびファゴリソソームの酸性環境を標的化するために、用いられ得る。この分解は、酸性分解産物を生じない。従って、上記ケタール重合体は、生物学的使用に適する。
(ミセル)
本発明はさらに、多数の重合体を含む新規の生分解性の架橋されたミセルを提供する。ここで、上記重合体は例えば、外部(external)架橋剤(すなわち、重合体鎖内に導入されない薬剤)により架橋されている。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
本発明はさらに、多数の重合体を含む新規の生分解性の架橋されたミセルを提供する。ここで、上記重合体は例えば、外部(external)架橋剤(すなわち、重合体鎖内に導入されない薬剤)により架橋されている。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
(発明の詳細な説明)
(定義)
本出願において用いられている全ての科学用語および専門用語は、そうでないことが記載されない限り、当該分野において一般的に用いられている意味を有する。本出願において用いられている、以下の語または句は、記載されている意味を有する。
(定義)
本出願において用いられている全ての科学用語および専門用語は、そうでないことが記載されない限り、当該分野において一般的に用いられている意味を有する。本出願において用いられている、以下の語または句は、記載されている意味を有する。
本明細書中に用いられている、用語「ミセル」は、液体培地中における異なる性質と関連づけられる少なくとも2つの異なる部分を有する重合体分子のコロイド状凝集物を指す。これらの性質の違いは、異なる疎水性/親水性、極性、荷電もしくは電荷の分布、または分子の溶解性に影響を与える他のパラメータに起因して、起こり得る。本発明のミセルは、二層から構成されるリポソームと区別され、これを除外する。
本明細書中に用いられている、用語「重合体」は、単量体分子の共有結合された配置を指す。この配置は、直鎖または分岐された形態で実現され得る。上記重合体は、1つの型の単量体分子からのみ構成されるホモ重合体であっても、2つ以上の異なる型の単量体が同じ重合体の鎖内で結合されている共重合体であってもよい。上記2つの異なる単量体が、交互の様式で配置される場合、その重合体は、交互共重合体と呼ばれる。ランダム共重合体において、上記2つの異なる単量体は、任意の順序で配置され得る。ブロック共重合体において、各型の単量体は、一緒にまとめられている。ブロック共重合体は、それらの末端で一緒に結合されている2つ以上のホモ重合体とみなされ得る。1つの単量体から作製される重合体鎖が、別の単量体の重合体鎖にグラフトされる場合、グラフト共重合体が、形成される。
本明細書中に用いられている、用語「粒子」または「三次元粒子」は、ナノ粒子および/またはマイクロ粒子を指す。標準的な定義によると、上記用語「ナノ粒子」は、寸法が100nmよりも小さい少なくとも1つの粒子のみを含む。この必要条件を満たさないより大きい粒子は、「マイクロ粒子」と呼ばれる。本発明は、ナノメートル(nm)およびミクロン(μm)のスケールのサイズである三次元粒子を提供する。
本明細書中に用いられている用語「ケタール」および「ジオール」は、アルキル基、シクロアルキル基およびアリール基を含むケタールおよびジオールを包含する。本明細書中に用いられている「アルキル基」または「脂肪族基」は、直鎖状または分岐鎖のアルキル基である。一実施形態において、直鎖アルキル基が、好ましい。上記アルキルの定義に含まれるのはまた、ヘテロ原子が窒素、酸素、リン、硫黄およびケイ素であり得るヘテロアルキル基である。
本明細書中に用いられている、用語「シクロアルキル基」または「脂環式基」は、環内に少なくとも3つの炭素原子を含む環構造のアルキルを表す。一実施形態において、5個または6個の炭素を有するシクロアルキル基が、好ましい。シクロアルキル基はまた、ヘテロ原子が窒素、酸素、リン、硫黄およびケイ素であり得る複素環式環を含む。
本明細書中に用いられている「アリール基」または「芳香族基」は、芳香族アリール環(例えば、フェニル)、複素環式芳香族環(例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、インドールおよびプリン)、および窒素、酸素、硫黄またはリンを含む複素環式環である。アルキル基、シクロアルキル基およびアリール基の定義に含まれるのは、置換されたアルキル基、シクロアルキル基およびアリール基である。これらの基は、1つ以上の置換を保有し得る。適切な置換基としては、ハロゲン類、アミン類、ヒドロキシル基、カルボン酸類、ニトロ基、カルボニル基および他のアルキル基、シクロアルキル基およびアリール基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載されている本発明がより十分に理解され得るために、以下の説明が、示されている。
(本発明の組成物)
本発明のポリケタール重合体
本発明は、各ケタール基が重合体骨格内に2つの酸素原子を有する多数のケタール基を含む、生分解性疎水性ポリケタール重合体を提供する。
本発明のポリケタール重合体
本発明は、各ケタール基が重合体骨格内に2つの酸素原子を有する多数のケタール基を含む、生分解性疎水性ポリケタール重合体を提供する。
適切なケタール基の例としては、2,2−ジオキシプロピル基、2,2−ジオキシブチル基、1,1−ジオキシシクロヘキシル基またはジオキシアセトフェニル基が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲内にはまた、1つ以上のヘテロ原子(例えば、窒素、硫黄、酸素およびハロゲン化物)を含む脂肪族ケタール、脂環式ケタールまたは芳香族ケタールを含むケタール重合体がある。
本発明の一実施形態において、上記重合体はさらに、アルキル基、アリール基、およびシクロアルキル基を含む化合物を含む。この実施形態において、上記化合物は、直接的に上記ケタール基に結合され得る。
適切なアルキル基の例としては、メチル基、エチル基およびブチル基が挙げられるが、これらに限定されない。適切なアリール基の例としては、置換されているかまたは非置換のベンジル基、フェニル基またはナフチル基(例えば、1,4−ジメチルベンゼン)が挙げられるが、これらに限定されない。適切なシクロアルキル基の例としては、置換されているかまたは非置換のシクロヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基(例えば、1,4−ジメチルシクロヘキシル基)が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、上記重合体は、ポリ(l,4−フェニレン−アセトン ジメチレンケタール)であり得る。この重合体は、2,2−ジメトキシプロパンおよび1,4−ベンゼン ジメタノールで合成され得る。上記重合体はまた、2,2−ジメトキシプロパンおよび1,4−シクロヘキサン ジメタノールで合成され得るポリ(l,4−シクロヘキサン−アセトン ジメチレンケタール)であり得る。
本発明はさらに、本発明のポリケタール重合体を含む生分解性粒子を提供する。上記粒子のサイズは、変化し得る。例えば、生分解性粒子は、ナノメートル(nm)またはミクロン(μm)のスケールで作製され得る。好ましい粒子サイズは、約50nmと1000nmとの間であり、より好ましくは、約200nmと600nmとの間である。
生分解性粒子を形成するための適切なポリケタール重合体の好ましいサイズは、約0.5kDaと約2MDaとの間であり、より好ましいのは、1kDaと約150kDaとの間であり、最も好ましいのは、約4kDaと約6kDaとの間である。本発明に従って、上記重合体における単量体の数は、約2から約20,000まで、好ましくは約10から約1,000まで、より好ましくは約10から約50までの範囲であり得る。
本発明のポリケタール重合体は、水溶液中で加水分解して、低分子量、水溶性のアルコールおよびケトンになる。例えば、ポリ(アルキル−アセトン ジメチレンケタール)の分解は、酸感受性であり、pH 7.4で102.0時間およびpH 5.0で35.0時間の半減期を有する。骨格内のケタール結合の利点は、このケタール結合が、ファゴソームの酸性条件下、1〜2日以内にpH5.0で分解することである。従って、ポリケタールはまた、腫瘍、炎症およびファゴリソソームの酸性環境を標的化するために、用いられ得る。この分解は、酸性分解産物を生じない。従って、上記ケタール重合体は、生物学的使用に適する。
本発明の実施に従って、上記ポリケタール重合体粒子はさらに、1つ以上の活性物質を含み得る。本明細書中に用いられている、用語「活性物質」は、タンパク質、ペプチド、核酸(DNAもしくはRNA)または有機分子、および他の合成核酸分子、siRNA分子、またはアンチセンス分子を指す。上記活性物質は、免疫調節剤(例えば、RIG−1またはTLR、またはC型レクチン(例えば、dectin−1およびDC−SIGN)またはキャタピラタンパク質に対する特異的リガンド、あるいは特異的TLRリガンドの組み合わせ、あるいはDCおよびマクロファージによる調節性シグナリングネットワークを阻害する合成分子またはsiRNA)であり得る。上記活性物質はさらに、組換えタンパク質、ワクチン抗原、DNAワクチン、またはワクチン自体(例えば、インフルエンザワクチン)を含み得る。最終的に、活性物質は、DCのサブセット(ランゲルハンス細胞、皮膚のDC、骨髄のDC、腸管のDC、形質細胞様DCを含む)、または単球およびマクロファージのサブセットを標的化するか、刺激するか、調節するかまたは阻害する抗体を含み得る。従って、これらの粒子の表面は、標的群(例えば、樹状細胞のサブセットに対する抗体、または樹状細胞もしくはマクロファージのサブセットを刺激するタンパク質(例えば、CD40L、DEC−205、CD11c、langerin、MARCO、33D1など))を含むように改変され得る。
適切な活性物質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(1)TLR(例えば、TLR−2、TLR−3、TLR−4、TLR−5、TLR−7、TLR−8、TLR−9、TLR−10、およびTLR−11)のアゴニストおよびアンタゴニスト、(2)住血吸虫の卵の抗原(SEA)により活性化されるレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、(3)これらの型のレセプターのいずれかの活性化により生じるシグナルを伝達する細胞内シグナリング経路の構成要素の発現または活性を刺激または阻害する分子、ならびに(4)1つ以上のこれらのシグナリング経路により誘導または安定化される転写因子を刺激または阻害する物質。
アゴニストの例としては、ペプチドグリカン(O.Takeuchiら,1999 Immunity 11:443−451)またはザイモサン(Dillonら,2006 J.Clin.Invest.116(4):916−28 A.Ozinskyら,2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13766−13771)が挙げられるが、これらに限定されない。アゴニストとしてはまた、細菌性リポペプチド(例えば、ジアシル化およびトリアシル化されたリポペプチド)、リポテイコ酸、リポアラビノマンナン、フェノール溶解性モジュリン(modulin)、グリコイノシトールホスホリピッド、糖脂質、ポーリン、Leptospira interrognsもしくはPorphyromonas gingivalis由来の不定型のLPS、またはHSP70も挙げられる(概説については、K Takedaら,2003 Annu.Rev.Immunol.21:335−376を参照のこと)。上記アゴニストは、単離および/または高度精製された分子であり得る。上記アゴニストは、分子全体またはそのフラグメント、あるいは天然に存在するアゴニストもしくは合成アゴニストを包含する。例としては、コレラ毒素の非毒性形態(Braunら,J.Exp.Med.189:541−552,1999)、Candida albicansの特定の形態(d’Ostianiら,J.Exp.Med.191:1661−1674,2000),またはP.gingivalis LPS(Pulendranら,J.Immunol 167:5067−5076,2001)が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌性リポペプチドの例としては、N末端システインの脂肪酸鎖が異なる細菌細胞壁リポペプチド(例えば、ジアシル化およびトリアシル化されたリポペプチド)が挙げられる。例えば、ジアシル化されたリポペプチドとしては、Mycoplasma fermentans由来のマクロファージ活性化リポペプチド 2キロダルトンもしくはそのフラグメントまたは合成アナログ(例えば、MALP2、Pam2CSK4、Pam2CGNNDESNISFKEK、およびPam2CGNNDESNISFKEK−SK4)が挙げられる。トリアシル化されたリポペプチドとしては、Pam3cys{S−[2,3−ビス(パルミトイルオキシ)−(2−RS)−プロピル]−N−パルミトイル−R−Cys−S−Ser−Lys4−OH)}(Takeuchiら,2001 International Immunology 13:933−940)が挙げられる。
ある実施形態において、上記アゴニストは、特異的に、TLR−2またはSEAにより結合されるレセプター(SEAに関して、MacDonaldら,J.Immunol.167:1982−1988,2001を参照のこと)に作用する。ここでもまた、上記アゴニストは、天然のリガンド、その生物学的に活性なフラグメント、または低分子もしくは合成の分子であり得るが、これらに限定されない。他の有用なアゴニストとしては、コレラ毒素の非毒性形態(Braunら,J.Exp.Med.189:541−552,1999)、Candida albicansの特定の形態(d’Ostianiら,J.Exp.Med.191:1661−1674,2000)、またはPorphyromonas gingivalis LPS(Pulendranら,J.Immunol.167:5067−5076.2001)が挙げられ得る。これらの物質は、IL−12(p70)を誘導できず、Th2−様反応を刺激できない。
上記アゴニストは、(Th反応(例えば、TH1)に対して免疫反応を偏向させる)TLR−4のアゴニストであり得、タキソール、ラウス肉腫ウイルス由来の融合タンパク質、MMTV由来のエンベロープタンパク質、Chlamydia pneumoniae由来のHsp60または宿主由来のHsp60もしくはHsp70が挙げられる。TLR−3を作動する他の宿主因子は、フィブロネクチンのIII型リピートエキストラドメイン(extra domain)A、ヒアルロン酸のオリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖フラグメント、およびフィブリノーゲンを含む。多数の合成化合物(例えば、イミダゾキノリン(イミキモドおよびR−848)、ロキソリビン、ブロピリミン、および核酸と構造的に関係する他の化合物)は、TLR−7のアゴニストとして作用する。
適切な活性物質のさらなる例としては、ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、Akt、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビターまたはその組み合わせが挙げられる。適切な活性物質としてはさらに、SOCS 1〜7タンパク質のインヒビターが挙げられ得る。このようなインヒビターは、低分子、またはペプチド、タンパク質または核酸(例えば、siRNAもしくはアンチセンス)であり得る。
上記アゴニストは、内因性リガンドでも外因性リガンドでもよく、それらの多くは、当該分野において公知である。下記の新規のスクリーニング方法(特に、TLRの結合または活性化を検出することを特色にする方法)は、他のリガンド(天然に存在する分子、そのフラグメントもしくは誘導体、抗体、他のペプチドもしくはタンパク質を含む複合体、または合成のリガンドのいずれであってもよい)を同定するために用いられ得る。例えば、TLR−2の外因性リガンドとしては、LPS(リポ多糖;グラム陰性細菌の外膜の構成成分)、酵母の粒子であるザイモサン、細菌のペプチドグリカン、細菌およびマイコプラズマに由来するリポタンパク質、およびTrypanosoma cruzi由来のGPIアンカーが挙げられ;内在性リガンドとしては、熱ショック(または「ストレス」)タンパク質(例として、例えば、細菌病原体またはマイコプラズマ病原体に由来するHsp60)およびサーファクタントタンパク質Aが挙げられる。TLR−3の外因性リガンドとしては、ポリ(I:C)(ウイルスdsNRA)が挙げられ;TLR−4の外因性リガンドとしては、LPS、およびRSウイルスが挙げられる(内因性リガンドとしては、ストレスタンパク質(例えば、Hsp60またはHsp70)、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒアルロン酸およびそのフラグメント、ならびにサーファクタントタンパク質Aが挙げられる)。フラゲリンは、TLR−5の外因性リガンドである。CpG(シトシン−グアニン リピート)DNAおよびdsDNAは、各々、TLR−9の外因性リガンドおよび内因性リガンドである。Zuany−Amorimら,Nature Reviews 1:797−807,2002,およびTakedaら,Ann.Rev.Immunol.21:355−376,2003を参照のこと。
適切な活性物質のさらなる例としては、(a)樹状細胞内のAP−1転写因子の発現または活性を阻害する物質、(b)AP−1転写因子の発現または活性を阻害する物質を含む培養物中で処理された樹状細胞、あるいは(c)(b)に記載されている通り処理された樹状細胞を含む培養物中で刺激された同系のT細胞が挙げられる。上記転写因子としては、c−fos、fos−B、Foxp3、またはc−junが挙げられ得、(上記転写因子または本明細書中に記載されている経路の任意の構成成分(これらの構成成分は当該分野において公知である)の)発現を阻害する物質は、c−fos、fos−B、Foxp3、もしくはc−junの発現(またはキナーゼ、ホスファターゼ、もしくは上記シグナリング経路の他の構成成分の発現)を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはRNAi分子であり得る。本発明の生分解性粒子に関連して議論されている阻害性活性物質はまた、抗体(またはその改変体(例えば、単鎖抗体もしくはヒト化抗体)であり得;好ましくは上記抗体は、モノクローナル抗体である)。
別の実施形態において、上記活性物質は、TLR2のシグナリングまたは活性化を弱める細胞内経路のアンタゴニスト(例えば、インヒビターまたはサプレッサ)である。上記アンタゴニストとしては、グラム陰性LPS、タキソール、RSVの融合タンパク質、MMTVのエンベロープタンパク質、HSP60、HSP70、フィブロネクチンのIII型リピートエキストラドメインA、ヒアルロン酸のオリゴ糖、硫酸ヘパリンのオリゴ糖フラグメント、フィブリノーゲンおよびフラゲリンが挙げられる(例えば、概説については、K Takedaら,2003 Annu.Rev.Immunol.21:335−376を参照のこと)。
さらなる実施形態において、上記活性物質は、SEAのシグナリングまたは活性化を弱める細胞内経路のアンタゴニストである。1つの他の実施形態において、その分子は、JNK 1/2経路のアンタゴニストである。別の実施形態において、上記分子は、p38およびERKを活性化するCpG DNAである(A−K Yiら,2002 The Journal of Immunology 168:4711−4720)。
別の実施形態において、上記活性物質は、樹状細胞の成熟を阻害し得、従って、IL12およびTh1反応を増大させ得るERK 1/2のインヒビターである。上記分子の例としては、PD98059およびU0126(A.Puig−Krogerら,2001 Blood 98:2175−2182)が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、上記活性物質は、c−fosのシグナリングを阻害し、従って、IL12およびTh1反応を増大させる。このようなとして分子は、c−fosのDEFドメイン変異体またはDEFドメイン変異を有する任意のポリペプチドが挙げられ(L.O.Murphyら,2002 Nature Cell Biology 4:556−564および補遺情報1〜3頁)、これらとしては、ラットのFra−1、およびFra−2;マウスのFosB、JunD、c−Jun、c−Myc、およびEgr−1;ならびにヒトのJunB、N−Myc、およびmPerlが挙げられる。
活性物質は、治療用遺伝子を含み得る。治療用遺伝子の例としては、自殺遺伝子が挙げられる。これらは、遺伝子配列であり、その発現により、腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞死を阻害するタンパク質または薬剤が生成される。自殺遺伝子としては、酵素をコードする遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。上記治療用遺伝子の目的は、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞を殺傷するか、あるいは直接的もしくは間接的に癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を殺傷するサイトカインまたは他の細胞傷害性物質を産生することである。
適切な癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子としては、neu、EGF、ras(H、K、およびN rasが挙げられる)、p53、網膜芽細胞腫腫瘍抑制遺伝子(Rb)、ウィルムス腫瘍遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ(PTPase)、ならびにnm23が挙げられる。適切な毒素としては、シュードモナス属の外毒素Aおよび外毒素S;ジフテリア毒素(DT);E.coliのLT毒素、志賀毒素、志賀類似毒素(SLT−1、−2)、リシン、アブリン、supporin、およびゲロニン(gelonin)が挙げられる。
活性物質は、酵素を含み得る。適切な酵素としては、チミジンキナーゼ(TK)、E.coli由来のキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(GPT)遺伝子もしくはE.coliのシトシンデアミナーゼ(CD)、またはヒポキサンチン ホスホリボシル トランスフェラーゼ(HPRT)が挙げられる。
活性物質は、サイトカインを含み得る。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、GM−CSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子(TNF)が挙げられる(Wong Gら,Science 1985;228:810);WO9323034(1993);Horisberger M.A.ら,Journal of Virology,1990年5月,64(3):1171−81;Li YPら,Journal of Immunology,1992年2月1日,148(3):788−94;Pizarro T.T.ら,Transplantation,1993年8月,56(2):399−404);(Breviario F.ら,Journal of Biological Chemistry,1992年11月5日,267(31):22190−7;Espinoza−Delgado I.ら,Journal of Immunology,1992年11月1日,149(9):2961−8;Algate P.A.ら,Blood,1994年5月1日,83(9):2459−68;Cluitmans F.H.ら,Annals of Hematology,1994年1月,68(6):293−8;Martinez O.M.ら,Transplantation,1993年5月,55(5):1159−66。
活性物質は、増殖因子を含み得る。増殖因子としては、トランスホーミング増殖因子α(TGF−α)およびβ(TGF−β)、サイトカインコロニー刺激因子が挙げられる(Shimane M.ら,Biochemical and Biophysical Research Communications,Feb.28,1994,199(1):26−32;Kay A.B.ら,Journal of Experimental Medicine,Mar.1,1991,173(3):775−8;de Wit Hら,1994 Feb.,86(2):259−64;Sprecher E.ら,Archives of Virology,1992,126(l−4):253−69)。
本発明の活性物質は、天然に存在しているか、合成であるか、または組換えにより生成され得、この活性物質としては、任意の微生物もしくはウイルスの構成成分またはその誘導体(微生物細胞またはウイルスの構造の一部分であるか、またはこれらにより生成される任意の構成成分(細胞壁、被膜タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、任意の毒性化合物もしくは非毒性化合物、炭水化物、タンパク質−炭水化物複合体、または微生物細胞もしくはウイルスの任意の他の構成成分が挙げられるが、これらに限定されない))が挙げられるが、これらに限定されない。上記微生物細胞またはウイルスは、病原性であり得る。
本発明は、本発明の粒子を生成するための方法を提供する。一実施形態において、上記方法は、a)ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成する工程;b)1つ以上の活性物質の存在下で、a)の重合体の重合体粒子を形成し、それによって、上記物質をカプセル化する工程を包含する。ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成するための適切な化学の例としては、単一エマルジョンまたは二重エマルジョンおよび非環式ジエン複分解を用いたアセタール交換反応(Heffernan MJ および Murthy N.,2005 Bioconjug.Chem.16(6):1340−2;Jain RA.,2000 Biomaterials.21(23):2475−90:Wagener K.B. および Gomez F.J.,「ADMET Polymerization」,Encyclopedia of Materials:Science and Technology,EJ.Kramer および C. Hawker編集,Elsevier,Oxford,5,48(2002))が挙げられる。
この方法のための適切なケタールの例としては、2,2−ジメトキシプロパン、2,2−ジメトキシブタン、1,1−ジメトキシシクロヘキサンまたはジメトキシアセトフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲内にあるのはまた、1つ以上のヘテロ原子(例えば、窒素、硫黄、酸素およびハロゲン化物)を含む脂肪族ケタール、脂環式ケタールまたは芳香族ケタールを含むケタール重合体である。
本発明の実施に従って、上記ジオールは、アルキル ジオール、アリール ジオールおよびシクロアルキル ジオールのいずれかであり得る。
ジオールの適切な例としては、1,4−ベンゼンジメタノール、1,4−シクロヘキサンジメタノール、1,5−ペンタン ジオール、1,4−ブタン ジオールまたは1,8−オクタン ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。
(本発明のミセル)
本発明はさらに、多数の重合体を含む生分解性の架橋されたミセルを提供する。上記重合体は、外部架橋剤により架橋され得る。本明細書中に用いられている外部架橋剤は、上記重合体鎖に導入されない薬剤である。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
本発明はさらに、多数の重合体を含む生分解性の架橋されたミセルを提供する。上記重合体は、外部架橋剤により架橋され得る。本明細書中に用いられている外部架橋剤は、上記重合体鎖に導入されない薬剤である。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
本発明の一局面において、適切な架橋剤は、少なくとも2つのチオール基を含む化合物である。適切な架橋剤の例としては、エチレングリコールジチオール、脂肪族ジチオール類、ケタール結合により連結されるジチオール類、およびジアミン含有分子が挙げられるが、これらに限定されない。チオール基の利点は、還元条件に対する感受性であり、従って、上記ミセルの容易な分解を可能にすることである。他の架橋戦略としては、アミン、エステル、カーボネート、チオエステル、シッフ塩基、ビシナルジオール、アルケンおよびアルキン、ケタール、ケタール オルトエステル、チオ−ケタール、チオ−オルトエステル、sily−ケタール、フェニル ボロン酸−ジオール複合体、炭素−炭素結合、スルホン、ホスファートを含む官能基、アジド、酵素で切断可能な結合、およびウレタンにより架橋することが挙げられるが、これらに限定されない。シッフ塩基、チオールおよびケトンが、本出願の一実施形態において好ましい(O’Reillyら,2005 Chem.Mater.,17(24):5976−5988;Hankerら,2005 Science 309(5738):1200−05;Le,Z.ら,2005 Langmuir 21(25):11999−12006;実施例1,図9)。
本発明の別の局面において、上記外部架橋剤は、抗原を含む。適切な抗原の例としては、タンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗原は、天然に存在し得るか、化学的に合成され得るかまたは組換えにより作製され得る。適切なタンパク質抗原またはペプチド抗原の特定の例としては、HIV抗原(例えば、gpl20タンパク質(またはそのフラグメント)、TATタンパク質(またはそのフラグメント)、NEFタンパク質(またはそのフラグメント)、HCVタンパク質(またはそのフラグメント)、およびenvタンパク質(またはそのフラグメント)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい抗原としては、そこにさらなるジスルフィド結合を作製するため、4つのさらなるシステイン残基を含むように化学的に合成および改変されたgpl20ペプチド抗原が挙げられる。架橋可能な基を有する任意の抗原が、用いられ得る。架橋可能な基を有しないかまたはほとんど有しない抗原が、架橋可能なチオール基、アジド、アルキン、アミン、マレイミド、ビニルスルホン、ケトン、ヒドラジンおよびチオエステルを含むように改変され得る(例えば、化学的に改変され得る)。
ミセル形成のために用いられる重合体は、ホモ重合体または共重合体(例えば、ブロック共重合体またはグラフト共重合体)であり得る。適切な重合体の例としては、PEGが開始剤として作用する原子転移重合化により合成された、PEGブロック共重合体(例えば、PEG−ポリアミノ酸(例えば、PEG−ポリリジン、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸またはPEG−ポリアルギニン);PEG−ポリエステル、PEG−ポリウレタン、PEG−PPO、改変されたまたは改変されていない、PEG−ポリアクリラートまたはPEG−ポリメタクリラート)が挙げられるが、これらに限定されない。重合体の架橋を促進するために、上記重合体は、化学基(アミン、エステル、カーボネート、チオエステル、シッフ塩基、ビシナルジオール、アルケンおよびアルキン、ケタール、ケタールまたはオルトエステル、チオ−ケタール、チオ−オルトエステル、sily−ケタール、フェニル ボロン酸−ジオール複合体、炭素−炭素結合、スルホン、ホスファート含有官能基、アジド、酵素で切断可能な結合、およびウレタンが挙げられるが、これらに限定されず、シッフ塩基、チオールおよびケトンが、本発明の一実施形態において好ましい)を含むように改変され得る。これらの基は、当該分野において公知の化学反応(例えば、とりわけ、Michael付加またはアシル化)によって導入され得る(実施例1、図9)。1つの好ましい実施形態において、上記改変された重合体は、PEG−ポリリジン チオピリダール(thiopyridal)(図9)である。
上記ポリメタクリラートブロックまたはポリアクリラートブロックは、ワクチン構成成分および架橋を用いた組立てを可能にするための改変を含み得る。例えば、ポリアクリラートブロックは、ポリジメチルアミノ−アクリラート−ポリ−グリシジル アクリラートからなるブロック共重合体であり得る。ワクチン構成成分を用いてミセルを形成する能力を有する様々なアクリラート単量体またはメタクリラート単量体から構成されるランダム共重合体のホモ重合体もまた、本発明の範囲内にある。
本発明の別の局面において、上記ミセルはさらに、1つ以上の活性物質を含み得る。適切な活性物質の例は、本明細書中に、上記される。
本発明の実施に従って、上記ミセルと上記活性物質との間の相互作用は、静電性または疎水性であり得るかあるいは重合体および物質の型に依存して、水素結合形成または分子認識に起因して生じ得る。このミセルの表面は、標的化群(例えば、樹状細胞に対する抗体、または樹状細胞もしくはマクロファージのサブセットを刺激するタンパク質(例えば、CD40L、DEC−205、CD11c、langerin、MARCO、33D1など))を含むように改変され得る。
上記ミセルは、2工程で生成され得る。最初に、目的の重合体は、適切な条件下で液体(用いられる重合体に依存して、極性の液体または非極性の液体)と接触されて、ミセルを形成し得る。ミセル形成後、上記ミセルは、本発明の生分解性ミセルを生成するために、外部架橋剤と架橋され得る。
一実施形態において、上記ミセルは、ペプチド抗原および免疫調節性分子を抗原提示細胞(APC)に送達するように設計される。この実施形態において、上記ミセルは、免疫調節性分子、ペプチド抗原および共重合体を含む。上記ペプチド抗原は、このペプチド抗原が効率的にカプセル化されてそのペプチド架橋されたミセル(PCM)となることを可能にし、また血清構成成分による分解に対してこれらのPCMを安定化する架橋剤として作用する。
別の実施形態において、上記ミセルは、免疫調節剤(多数のTLRリガンド、または分子(例えば、細胞(例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞)内のシグナリングネットワークを調節する合成の化合物またはsiRNA)が挙げられる)を用いて、ペプチドまたはタンパク質を一緒にカプセル化するために用いられ得る。樹状細胞およびマクロファージがファゴサイトーシスによりナノメートルのサイズの物質をしっかりと内在化するので、上記ミセルは、ナノメートルの寸法を有することによってこれらの細胞を標的化する。上記ミセルは、ジスルフィド結合を含む架橋剤により架橋され、この架橋剤は、これらのミセルを血清タンパク質により誘導される分解に対して安定化する。本発明のさらなる実施形態において、上記ミセルは、5〜50ミクロンのサイズを有する。
ファゴサイトーシス後、本発明の生分解性粒子およびミセルは、分解され、上記カプセル化された物質(例えば、ペプチドまたは抗原、および免疫刺激剤[例えば:ISS DNA、TLR 7/8、TLR 3リガンド(例えば、ss RNA)、TLR 2リガンド、および調節経路(例えば、ERK、c−FosまたはFoxp3の経路)のインヒビター])は、樹状細胞またはマクロファージ内に放出され、上記免疫調節剤は、抗原提示細胞を誘導して、様々なサイトカインを分泌させる。このシグナルの組み合わせが、最適なT細胞の活性化、ならびに調節性T細胞および樹状細胞の阻害をもたらす。
本発明のミセルは、免疫調節剤[例えば:ISS DNA、TLR 7/8リガンド(例えば、ss RNA)、TLR 2リガンド、および調節経路のインヒビター(例えば、ERK、c−FosもしくはFoxp3、PI3キナーゼ、Akt、SOCS 1〜7タンパク質のインヒビター)、またはsiRNA分子もしくはこのような調節経路を阻害するアンチセンス分子]と共に、活性物質(例えば、関係する病原体に由来する抗原から構成されたワクチン)を含み得る。
本発明はまた、タンパク質が上記ミセル中にカプセル化されるために適切な電荷を有するように、可逆的にこれらのタンパク質を改変するための方法を提供する。この戦略は、上記タンパク質のアミン基と化合物を反応させて、全てのアミン基についてさらなる負電荷を生成し、このタンパク質を負にすることに基づく。次いで、上記改変されたタンパク質は、上記ミセル中にカプセル化され、架橋され、次いで、上記タンパク質からその挿入された化合物を除去するために、pHが、低下される。本発明の一実施形態において、上記化合物は、アミン基は、シス−アコニチル(cis−aconityl)である。この群は、各アミン基に負電荷を付加し、ph 4.0で放出され得る。
標的化戦略のための例は、一端でのDNA結合ドメイン、およびタンパク質に結合され得るもう一端を有するヘテロ二官能性PEGを合成することを含む。次いで、このPEG鎖は、タンパク質に結合され、次いで、免疫刺激性DNAを含む予備形成されたミセルに組み立てられる。DNA結合ドメインの例としては、アクリジンまたはポリアクリジンが挙げられる。標的化リガンドの例としては、ガラクトース、マンノースリン酸、マンノース、ペプチド、および抗体が挙げられる。
本発明の生分解性粒子およびミセルのさらなる改変
上記生分解性粒子またはミセルはさらに、(1)DCもしくはマクロファージもしくは単球の特定のサブセット(ランゲルハンス細胞、皮膚のDC、骨髄のDC、形質細胞様DCを含む)上の特異的なレセプター、または(2)抗原提示細胞上の特異的なレセプター(例えば、DEC205、Langerin、DC−SIGN、dectin−1、33
D1、MARCO)を標的化する抗体または他の分子を組み込むように改変され得る。
上記生分解性粒子またはミセルはさらに、(1)DCもしくはマクロファージもしくは単球の特定のサブセット(ランゲルハンス細胞、皮膚のDC、骨髄のDC、形質細胞様DCを含む)上の特異的なレセプター、または(2)抗原提示細胞上の特異的なレセプター(例えば、DEC205、Langerin、DC−SIGN、dectin−1、33
D1、MARCO)を標的化する抗体または他の分子を組み込むように改変され得る。
(本発明の組成物を用いるための方法)
本発明はさらに、例えば、疾患を罹患している被験体を処置する(例えば、疾患に関連する症状を緩和する)ために活性物質を送達するために、本発明の粒子または本発明のミセルを介して、この被験体に、本発明の活性物質を送達するための方法を提供する。上記疾患は、HIV、マラリア、TB、SARS、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびHCVのいずれかであり得る。さらなる疾患または障害は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患、移植、糖尿病および癌に関連する障害または合併症のいずれかであり得る。自己免疫疾患の例としては、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびCOPDが挙げられる。
本発明はさらに、例えば、疾患を罹患している被験体を処置する(例えば、疾患に関連する症状を緩和する)ために活性物質を送達するために、本発明の粒子または本発明のミセルを介して、この被験体に、本発明の活性物質を送達するための方法を提供する。上記疾患は、HIV、マラリア、TB、SARS、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびHCVのいずれかであり得る。さらなる疾患または障害は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患、移植、糖尿病および癌に関連する障害または合併症のいずれかであり得る。自己免疫疾患の例としては、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびCOPDが挙げられる。
上記活性物質は、本発明の粒子を介して、様々な投与手段(静脈内、皮下、筋肉内、経口および吸入の手段が挙げられるが、これらに限定されない)により送達される。本発明の組成物のための最も有効な投与様式および投薬レジメンは、処置される疾患または障害の正確な位置、この疾患または障害の重症度および経過、被験体の健康および処置に対する反応、ならびにその処置する医師の判断に依存する。従って、この分子の用量は、個々の被験体に合わせて調節されるべきである。
表面積のmg/m2に基づいた、様々なサイズおよび種の動物に対する用量とヒトに対する用量との相互関係は、Freireich,E.J.ら,Cancer Chemother.,Rep.50(4):219−244(1966)に記載されている。上記投薬レジメンにおける調整は、腫瘍細胞の増殖阻害反応および殺傷反応を最適化するために行われ得る(例えば、用量が、分割され得、1日ベースで投与され得るか、またはこの用量が、その状況に比例して減少され得る(例えば、いくつかの分割された用量が、日ごとに投与され得るか、またはその特異的治療状況に依存して比例して減少され得る))。処置を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量が、計画の最適化によってさらに減少され得ることは、明らかである。
本明細書中に用いられている、用語「被験体」は、ヒト、任意の動物(例えば、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、および鳥類の被験体)、細胞または細胞組織を含み得る。本発明の実施に従って、上記活性物質は、上記被験体に(本発明の組成物を用いて)上記疾患もしくは障害の発症の前、後、またはその間に、送達または投与され得る。
本発明は、本発明の粒子またはミセルを介して活性物質を投与することによって免疫反応を調節するための方法を提供する。例えば、本発明の方法において、免疫反応は、被験体に、所望の活性物質を含む本発明の粒子もしくはミセルを送達または投与することにより、TLR依存的様式でTh免疫反応へと偏し得る。一実施形態において、TLRを発現する細胞は、Th免疫反応(例えば、Th0、Th2またはT調節性細胞免疫反応)に対する偏りをもたらす(本発明の粒子またはミセルにより送達される)物質と接触される。例えば、TLR−2、ERK 1/2、またはc−fosを活性化する物質(例えば、天然のリガンド、その生物学的に活性のフラグメント、または低分子もしくは合成の分子)。
上記のように、上記免疫反応は、レセプターの活性化からシグナリング経路の下流(例えば、TLR結合から下流またはTLR活性化もしくは認識から下流)の時点において、調節(regulate)または調節(modulate)され得る(例えば、Th免疫反応に対して偏向することを増大または縮小させる)。従って、患者はまた、下流のシグナリング経路の要素に対して細胞内で作用することにより免疫反応を偏向させる(本発明の組成物を用いて送達される)活性物質または活性物質の組み合わせを用いて、処置され得る。
本発明は、本発明の組成物を用いて送達される所望の活性物質を用いて、MAPキナーゼ経路のいずれか(ERK 1/2経路が挙げられる)の細胞シグナリング(例えば、活性化)を誘導することにより、Th2免疫反応に対して偏向させるための方法を提供する。誘導されるMAPキナーゼ経路は、MAPキナーゼ経路(ERK 1/2が挙げられる)のリン酸化される構成成分の量の増加および/または期間の延長により特徴付けられ得る。
本発明の方法の別の実施形態において、TH2免疫反応を調節する(regulate)ようにERK 1/2 MAPキナーゼ経路を調節(modulate)する活性物質が、本発明の組成物を介して送達され得る。この実施形態において、例として、TLR(例えば、TLR−2)のアゴニストは、TH2免疫反応を増大させるようにERK 1/2のリン酸化を誘導する。さらに本発明の方法の別の実施形態において、活性物質は、細胞内のc−FOS経路を調節(modulate)して、それによってTH2免疫反応を調節する(regulate)ように、本発明の組成物を介して送達され得る。この実施形態において、例として、c−fos経路のアゴニストは、TH2免疫反応を増大させるように、c−fosの発現および/またはc−fosのリン酸化を誘導する。さらに本発明の方法のさらなる実施形態において、活性物質は、TLR2またはその下流のシグナリング経路の要素(例えば、ERK 1/2 MAPキナーゼ経路およびc−FOS経路)に作用することによりTh2免疫反応を調節するように、本発明の組成物を介して送達され得る。例えば、本発明の組成物を介して送達される、上記活性物質は、IL−10の産生または活性を調節する(例えば、IL−10の産生を増加させるかまたはIL−10をアップレギュレーションする)ために用いられ得る。
一実施形態において、Th2免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、IL12の産生を媒介する(例えば、阻害する)p38および/もしくはJNK経路のシグナリングを弱めるかまたは阻害し、それによって、Th1反応に対して偏向させることを含む。別の実施形態において、Th2免疫反応に対して偏向させるための方法は、所望の活性物質(もしくはその組み合わせ)を含む本発明のミセルまたは粒子を投与することにより、IL12の産生を媒介し(例えば、阻害する)、それによってTh1反応に対して偏向させる、p38および/またはJNKのリン酸化された量を減少させるかまたは阻害すること、あるいは、p38および/またはJNKのリン酸化の持続時間を短縮または阻害することを含む。
本発明はまた、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することによって、MAPキナーゼ経路のいずれか(p38および/またはJNK経路が挙げられる)の細胞シグナリング(例えば、活性化)を誘導することにより、Th1免疫反応に対して偏向させるための方法を提供する。誘導されるp38および/またはJNK経路は、MAPキナーゼ経路(p38、および/またはJNKが挙げられる)のリン酸化された構成成分の量の増加および/または持続時間の延長により特徴付けられ得る。
一実施形態において、Th1免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、ERK 1/2および/またはc−fos経路のシグナリンを弱めるかまたは阻害することを含む。別の実施形態において、Th1免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、リン酸化されたERK 1/2および/またはc−fosの量を減少または阻害すること、あるいはERK 1/2および/またはc−fosのリン酸化の持続時間を短縮または阻害することを含む。
さらに、本発明は、TH2免疫反応を調節するための方法を提供し、この方法は、T細胞(例えば、ナイーブT細胞)と、本発明の組成物を介して送達される、ERK 1/2を活性化しならびに/またはc−fosもしくはc−fos経路を活性化するTLRアゴニスト(例えば、TLR−2アゴニスト)を含む培養物中で処理されたTLR陽性細胞(例えば、DC)とを接触させる工程を包含する。
さらに、本発明は、TH1免疫反応を調節するための方法を提供し、この方法は、T細胞(例えば、ナイーブT細胞)と、本発明の組成物を介して送達される、p38経路および/またはJNK経路を活性化するTLRアゴニスト(例えば、TLR−4アゴニスト)を含む培養物中で処理されたTLR陽性細胞(例えば、DC)とを接触させる工程を包含する。
本発明は、免疫に関係する状態または疾患(例えば、アレルギー、自己免疫疾患、および他の免疫に関係する状態(癌が挙げられる))を有する被験体を処置するための方法を提供し、この方法は、Th1、Th2もしくはTh0免疫反応に対してまたは反して偏向させるために、本発明の組成物を介して送達される、本発明の任意の物質を、この被験体に、有効量で投与する工程を包含する。上記被験体は、ウシ、ブタ、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト、ヒツジ、魚類または鳥類であり得る。
一実施形態において、強いTh2反応に関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Th1免疫反応に対して偏向させるようにこの被験体内の細胞シグナリングを活性化する、本発明の物質を用いて処置される。強いTh2反応により特徴付けられる疾患としては、アレルギー、喘息、および慢性閉塞性肺疾患(COPD(例えば、気腫または慢性気管支炎))が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、強いTh2反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Th2免疫反応に対して偏向させることを阻害する分子を用いて処置される。
一実施形態において、強いTh1反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Th2免疫反応に対して偏向させるようにこの被験体内の細胞シグナリングを活性化する本発明の物質を用いて、処置される。強いTh1反応により特徴付けられる疾患としては、糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、強いTh1反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Th1免疫反応に対して偏向させることを阻害する活性物質を用いて、処置される。
以下の実施例は、本発明を説明するために、ならびに当業者が同じものを作製および使用することを援助するために示されている。実施例は、他に本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。
(実施例1)
抗原を含む架橋されたミセルの合成
タンパク質抗原のオボアルブミンおよび免疫刺激性DNAを含む架橋されたミセルを、2工程のプロセスで合成した。最初に、ミセルを、陽イオン性ブロック共重合体のPEG−ポリリジン−チオピリダールと負に荷電したFITC−オボアルブミン(FITC−OVA)および免疫刺激性DNA(ISS−DNA)との間で形成した。これらのミセルは、濃度10mg/mlのPEG−ポリリジン−チオピリダール、濃度0.5mg/mlのFITC−OVAおよび濃度0.5mg/mlのISS−DNAを含んでいた。上記ミセルを1時間形成させ、次いで、このミセルを0.4mg/mlのジチオ−エチレン グリコールで架橋した。上記架橋反応をU.V.活性(342nm)によりモニタリングしたところ、チオピリダール基が1時間後に室温で量的に反応したことを示した。100kD spin−filter(centricon)により上記ミセルを遠心分離し、回収した溶液をFITC蛍光(励起 494nm、放射 510nm)について解析することにより、上記ミセル中のFITC−OVAのカプセル化効率を決定した。このことは、FITC−OVAの95%より多くが、上記ミセル中にカプセル化されたことを示した。
抗原を含む架橋されたミセルの合成
タンパク質抗原のオボアルブミンおよび免疫刺激性DNAを含む架橋されたミセルを、2工程のプロセスで合成した。最初に、ミセルを、陽イオン性ブロック共重合体のPEG−ポリリジン−チオピリダールと負に荷電したFITC−オボアルブミン(FITC−OVA)および免疫刺激性DNA(ISS−DNA)との間で形成した。これらのミセルは、濃度10mg/mlのPEG−ポリリジン−チオピリダール、濃度0.5mg/mlのFITC−OVAおよび濃度0.5mg/mlのISS−DNAを含んでいた。上記ミセルを1時間形成させ、次いで、このミセルを0.4mg/mlのジチオ−エチレン グリコールで架橋した。上記架橋反応をU.V.活性(342nm)によりモニタリングしたところ、チオピリダール基が1時間後に室温で量的に反応したことを示した。100kD spin−filter(centricon)により上記ミセルを遠心分離し、回収した溶液をFITC蛍光(励起 494nm、放射 510nm)について解析することにより、上記ミセル中のFITC−OVAのカプセル化効率を決定した。このことは、FITC−OVAの95%より多くが、上記ミセル中にカプセル化されたことを示した。
(実施例2)
ポリケタール粒子の合成(疎水性薬物の送達のための単一エマルジョン方法)
水中油型エマルジョン方法を用いて、粒子を、ポリ(l,4−フェニレン−アセトン ジメチレン ケタール)により合成した。簡単に言えば、10mgの2、1mgのERKインヒビターUO126および0.1gのクロロ−メチル フルオレセイン ジアセタート(CMFDA)を、0.5mLのCHCl3(0.1%のトリエチルアミンを含む)中に溶解させた。次いで、この溶液を、2mg/mlのポリビニル アルコール(PVA,31〜50 kDa,Aldrich)を含む5mLのpH 9緩衝液(10mM NaHCO3)に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2流れ下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。粒子サイズを、動的光散乱(dynamic light scattering)(DLS)により解析したところ、その平均直径が282nmであることを示した。
ポリケタール粒子の合成(疎水性薬物の送達のための単一エマルジョン方法)
水中油型エマルジョン方法を用いて、粒子を、ポリ(l,4−フェニレン−アセトン ジメチレン ケタール)により合成した。簡単に言えば、10mgの2、1mgのERKインヒビターUO126および0.1gのクロロ−メチル フルオレセイン ジアセタート(CMFDA)を、0.5mLのCHCl3(0.1%のトリエチルアミンを含む)中に溶解させた。次いで、この溶液を、2mg/mlのポリビニル アルコール(PVA,31〜50 kDa,Aldrich)を含む5mLのpH 9緩衝液(10mM NaHCO3)に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2流れ下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。粒子サイズを、動的光散乱(dynamic light scattering)(DLS)により解析したところ、その平均直径が282nmであることを示した。
(実施例3)
ポリケタール粒子の合成(親水性薬物の合成のための二重エマルジョン方法)
FITC−オボアルブミンを含むポリケタール粒子(PKN)を、二重エマルジョン方法を用いて作製した。最初に、500μLのクロロホルム中に溶解させた20mgのポリ(1,4−フェニレン アセトン ジメチレン ケタール)(PPADK)を、100μLのFITC−Ova溶液(約0.7mg)に添加した。この混合物を、40ワットで1分間超音波処理して、一次エマルジョンを形成した。次に、5mLの10mM pH9 リン酸ナトリウム緩衝液中の0.2% w/v ポリビニル アルコール(PVA, Aldrich)を添加し、そしてこの混合物を、40ワットで少なくとも1分間超音波処理して、二次エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、窒素通気下で4時間混合し、その後、その容量を、緩衝液を用いて5mLにした。2バッチのFITC−Ova含有PKNを、2バッチの無添加(plain)PKN(FITC−Ovaを含まない)と同様の様式で調製した。上記PKN懸濁物を、4℃で保管した。粒子のサイジングを、動的光散乱(DLS)により決定した。2バッチの、FITC−オボアルブミンをロードしたPKNは、426nmおよび462nmの有効な直径を有し、空のPKNバッチは、321nmおよび347nmであった。
ポリケタール粒子の合成(親水性薬物の合成のための二重エマルジョン方法)
FITC−オボアルブミンを含むポリケタール粒子(PKN)を、二重エマルジョン方法を用いて作製した。最初に、500μLのクロロホルム中に溶解させた20mgのポリ(1,4−フェニレン アセトン ジメチレン ケタール)(PPADK)を、100μLのFITC−Ova溶液(約0.7mg)に添加した。この混合物を、40ワットで1分間超音波処理して、一次エマルジョンを形成した。次に、5mLの10mM pH9 リン酸ナトリウム緩衝液中の0.2% w/v ポリビニル アルコール(PVA, Aldrich)を添加し、そしてこの混合物を、40ワットで少なくとも1分間超音波処理して、二次エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、窒素通気下で4時間混合し、その後、その容量を、緩衝液を用いて5mLにした。2バッチのFITC−Ova含有PKNを、2バッチの無添加(plain)PKN(FITC−Ovaを含まない)と同様の様式で調製した。上記PKN懸濁物を、4℃で保管した。粒子のサイジングを、動的光散乱(DLS)により決定した。2バッチの、FITC−オボアルブミンをロードしたPKNは、426nmおよび462nmの有効な直径を有し、空のPKNバッチは、321nmおよび347nmであった。
FITC−Ovaの標識
鶏卵アルブミン(オボアルブミン)を、次の通りに、フルオレセインを用いて標識した。オボアルブミンを、10mg/mLで200mM pH9 NaHCO3緩衝液中に溶解した。イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)を、10mg/mLでDMSO中に溶解した。次に、2.5mLのオボアルブミン溶液(25mg、0.56mmol)を、50μLのFITC/DMSO(0.5mg、1.28mmol)と共に少なくとも1時間30℃で混合した。この生成物を、Sephadex PD−10カラム中で濾過し、遊離色素を除去した;このカラムに、2.5mLの生成物をロードし、そして2.5mLの水で溶出した。得られたオボアルブミンの濃度は、約7mg/mLであった。497nmでのFITCの吸収を測定することにより、かつオボアルブミンの推定濃度を用いて、標識の程度を1.09と算出した。
鶏卵アルブミン(オボアルブミン)を、次の通りに、フルオレセインを用いて標識した。オボアルブミンを、10mg/mLで200mM pH9 NaHCO3緩衝液中に溶解した。イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)を、10mg/mLでDMSO中に溶解した。次に、2.5mLのオボアルブミン溶液(25mg、0.56mmol)を、50μLのFITC/DMSO(0.5mg、1.28mmol)と共に少なくとも1時間30℃で混合した。この生成物を、Sephadex PD−10カラム中で濾過し、遊離色素を除去した;このカラムに、2.5mLの生成物をロードし、そして2.5mLの水で溶出した。得られたオボアルブミンの濃度は、約7mg/mLであった。497nmでのFITCの吸収を測定することにより、かつオボアルブミンの推定濃度を用いて、標識の程度を1.09と算出した。
PKN中のFITC−Ovaのカプセル化の決定
2つのFITC−Ova PKNバッチを、5倍の水により希釈し、そして希釈した試料各々の一部分を、0.1μm Supor syringe filter (Pall Acrodisc)を通して濾過した。これらの濾過された試料および濾過されていない試料をさらに、10倍のpH9 リン酸ナトリウム緩衝液中に希釈し、そしてフルオレセインを、494nmの励起波長および520nmの放射波長で測定した(図1)。
2つのFITC−Ova PKNバッチを、5倍の水により希釈し、そして希釈した試料各々の一部分を、0.1μm Supor syringe filter (Pall Acrodisc)を通して濾過した。これらの濾過された試料および濾過されていない試料をさらに、10倍のpH9 リン酸ナトリウム緩衝液中に希釈し、そしてフルオレセインを、494nmの励起波長および520nmの放射波長で測定した(図1)。
上記カプセル化の効率を、上記濾過された試料および濾過されていない試料の蛍光強度を用いて、次の通りに、算出した:
(実施例4)
ケタール骨格の重合体(ポリケタール)の合成および分解
図2は、以下を示す:(A)ケタール中間体 1を生成するための1,4−ベンゼンジメタノールと2,2−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。(B)ポリケタール 2を生成するための1の段階的重合体化。副生成物のメタノールを蒸留することにより、反応工程AおよびBを進める。(C)溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物へのpH感受性の分解を表す。
ケタール骨格の重合体(ポリケタール)の合成および分解
図2は、以下を示す:(A)ケタール中間体 1を生成するための1,4−ベンゼンジメタノールと2,2−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。(B)ポリケタール 2を生成するための1の段階的重合体化。副生成物のメタノールを蒸留することにより、反応工程AおよびBを進める。(C)溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物へのpH感受性の分解を表す。
合成
上記ポリケタールを、ケタール交換反応(14)に基づいた新規の重合体化戦略により合成する。この反応は一般的に、低分子量のアルコールに保護基を導入するために用いられており、これまでは、重合体を合成するために用いられていなかった。しかしながら、本発明者らはここで、簡単に2,2−ジメトキシプロパン(DMP)をジオールと反応させることにより、上記ケタール交換反応が、酸感受性の重合体を合成するために用いられ得ることを明らかにする。本発明者らは、上記重合体化が図2の反応機構により起こることを提唱する。上記ケタール交換反応は、DMPのプロトン化およびその後のアルコールによる求核攻撃を含む平衡反応である。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、この平衡を、上記ケタール中間体 1の形成に対してシフトさせる。この反応が進むにつれて、1の分子は、段階的様式で結合して、2を形成する。
上記ポリケタールを、ケタール交換反応(14)に基づいた新規の重合体化戦略により合成する。この反応は一般的に、低分子量のアルコールに保護基を導入するために用いられており、これまでは、重合体を合成するために用いられていなかった。しかしながら、本発明者らはここで、簡単に2,2−ジメトキシプロパン(DMP)をジオールと反応させることにより、上記ケタール交換反応が、酸感受性の重合体を合成するために用いられ得ることを明らかにする。本発明者らは、上記重合体化が図2の反応機構により起こることを提唱する。上記ケタール交換反応は、DMPのプロトン化およびその後のアルコールによる求核攻撃を含む平衡反応である。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、この平衡を、上記ケタール中間体 1の形成に対してシフトさせる。この反応が進むにつれて、1の分子は、段階的様式で結合して、2を形成する。
DMPと1,4−ベンゼンジメタノール(BDM)との代表的な重合体化により、48%の収率でポリケタール 2を得た。上記重合体化を、短い経路の蒸留ヘッドに結合した25mLの二首フラスコ内で実行した。10mLの温かい酢酸エチル中に溶解したBDM(1.0g、7.3mmol、Aldrich)を、100℃で保たれた10mLの蒸留されたベンゼンに添加した。次いで、550μLの酢酸エチル中に溶解した再結晶化されたp−トルエン スルホン酸(5.5mg、0.029mmol、Aldrich)を、添加した。酢酸エチルを蒸留して除いた後、上記反応を開始するために、蒸留されたDMP(900μL、7.4mmol、Aldrich)を添加した。DMPのさらなる容量(各容量は2mLのベンゼンおよび300〜500μLのDMPからなる)を、計量漏斗を介して添加した。各容量を、間に30分の間期を含む30〜40分の期間にわたって添加した。上記反応の全持続時間は、7時間であった。上記反応を、100μLのトリエチルアミンの添加により停止し、そして冷ヘキサン中に沈殿させた。この粗生成物を、真空濾過し、エーテルおよびヘキサンでリンスし、そして真空乾燥させて、600mgの白色固体生成物(収率48%)を得た。この回収した重合体を、GPCおよび1H NMRにより解析した。
図3Aは、1つのバッチ由来のGPCトレースを示す。このバッチにおいて、繰り返し単位22.5個の重合体化の程度に対して、Mw=4000および1.54の多分散度指数を得た。1H NMRスペクトル(図3B)は、2の繰り返し単位がジメチルケタール基(「6a」)を含むことを確認する。共に、GPCおよび1H NMRのデータは、成功したポリケタール 2の合成についての証拠を提供する。
加水分解
2の加水分解の速度論を、リソソーム(pH 5.0)および血流(pH 7.4)に対するpH値で測定した。ポリケタール 2を細かい粉末にひき、そしてこの粉末を、pH 7.4(ホスファート緩衝液)、pH 5.0(アセタート緩衝液)、およびpH 1.0(DCl)の重水素を入れた溶液に添加することにより、上記加水分解の速度を測定した。この懸濁物を37℃で攪拌し、データの点を3時間、24時間、48時間、および72時間でとった。各懸濁物を4分間、1800gで遠心分離し、そしてその上清を1H NMRにより解析した。これらのスペクトルは、BDMについてのピーク(7.24ppmおよび4.47ppm)ならびにアセトンについてのピーク(2.05ppm)を含んでいた。2つのBDMピークの積分の平均を用いて、加水分解の相対的な程度を決定した。この加水分解のパーセントを、pH 7.4または5.0の試料のBDMピークの平均をpH 1.0 対照バッチのBDMピークの平均で除算することにより算出した。
2の加水分解の速度論を、リソソーム(pH 5.0)および血流(pH 7.4)に対するpH値で測定した。ポリケタール 2を細かい粉末にひき、そしてこの粉末を、pH 7.4(ホスファート緩衝液)、pH 5.0(アセタート緩衝液)、およびpH 1.0(DCl)の重水素を入れた溶液に添加することにより、上記加水分解の速度を測定した。この懸濁物を37℃で攪拌し、データの点を3時間、24時間、48時間、および72時間でとった。各懸濁物を4分間、1800gで遠心分離し、そしてその上清を1H NMRにより解析した。これらのスペクトルは、BDMについてのピーク(7.24ppmおよび4.47ppm)ならびにアセトンについてのピーク(2.05ppm)を含んでいた。2つのBDMピークの積分の平均を用いて、加水分解の相対的な程度を決定した。この加水分解のパーセントを、pH 7.4または5.0の試料のBDMピークの平均をpH 1.0 対照バッチのBDMピークの平均で除算することにより算出した。
指数崩壊半減期を、pH 7.4で102時間およびpH 5.0で35時間と算出した。これは、pH 7.4から5.0までの3倍の速度増加を表す(図4)。2のpH感受性は、Kwonら,(9)により報告された水溶性ケタールに関するpH感受性よりも有意に小さい。本発明者らは、2のより小さいpH感受性がその水不溶性に起因すると仮定する。この水不溶性は、水の拡散を制限し、そしてpHに対して非感受性である別の速度制限工程をつくり出す。2から作製される物質内への水の拡散の速度論は、この粒子のサイズに依存し、そして本発明者らは、より小さい粒子が挽いた粒子よりも大きいpH感受性を有することを予測する。
(実施例5)
ミクロンサイズの粒子の合成
また、化合物2を、ミクロンサイズの粒子を合成するために用いた。水中油型エマルジョン方法(15)を、上記粒子を形成するために用いた。簡単に言うと、1mLのCHCl3(0.1% トリエチルアミンを含む)中に溶解させた50mgの2を、乳化剤として様々な量のポリビニル アルコール(PVA、31〜50kDa、Aldrich)を含む5mLの10mM NaHCO3 pH9緩衝液に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2フロー下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。
ミクロンサイズの粒子の合成
また、化合物2を、ミクロンサイズの粒子を合成するために用いた。水中油型エマルジョン方法(15)を、上記粒子を形成するために用いた。簡単に言うと、1mLのCHCl3(0.1% トリエチルアミンを含む)中に溶解させた50mgの2を、乳化剤として様々な量のポリビニル アルコール(PVA、31〜50kDa、Aldrich)を含む5mLの10mM NaHCO3 pH9緩衝液に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2フロー下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。
粒子のサイズを、動的光散乱(DLS)およびSEMにより解析した。10mLのpH 9緩衝液中に上記粒子懸濁物を希釈し、そしてより大きい粒子を安定させることにより、DLSの試料を調製した。次いで、各バイアルの液体部分に由来するアリコートを、DLSの粒子のサイジング(Brookhaven 90Plus particle sizer)のために希釈した。上記粒子懸濁物を10分間(5000g、4℃)で遠心分離し、蒸留水で洗浄し、そしてその回収したペレットを凍結乾燥することにより、SEMの試料を、PVA:ポリケタールの比率 0.2:1で作製した。
予測した通り、上記粒子サイズは、PVA対ポリケタールの比率に対して感受性であった。上記DLSの粒子の直径は、PVA:ポリケタールの比率 0.2:1、0.8:1、および2:1の各々を含む試料について、520nm、290nm、および280nmであった。上記0.2:1 バッチのSEM画像(図5Aおよび5B)は、上記ポリケタールが、粒子サイズの分布が直径0.5〜30μmの範囲にわたるミクロンサイズの粒子を形成することを確認する。
(実施例6)
ポリケタール粒子中のデキサメタゾンのカプセル化
抗炎症薬デキサメタゾン(Dex,Sigma)を、2を用いて作製された粒子中にカプセル化した。油相が5mg/mlの濃度のDexを含んでいたこと、およびPVA:ポリケタールの比率 1:1を用いたことを除いて上記の手順と同じ手順を用いて、Dexをロードした粒子を処方した。これらの粒子のSEM画像は、これらの粒子が直径200〜600nmであることを明らかにする(図5C)。DLSによる粒子のサイジングは、Dexをロードした粒子のバッチについての有効な直径 250nmを示した。上記Dexのカプセル化効率は、43〜53%の間の範囲にわたった。対照バッチを、ポリケタール/PVAのみおよびDexのみを用いて調製した。Dexのカプセル化を測定するために、各粒子バッチをpH 9緩衝液中に再懸濁し、次いで、アリコートをさらに希釈した。一部分を0.1μm Supor membrane Acrodisc syringe filter(Pall Corp.)を通して濾過し、そしてその濾液の242nmでの吸光度を、Shimadzu UV− 1700 spectrophotometerにより記録した。上記カプセル化効率を、(ADex−ADexPoly)/(ADex−APoly)として算出した。ここで、Aは242nmでの吸光度であり、下付き文字「Poly」、「Dex」、および「DexPoly」は、「ポリケタールのみ」、「Dexのみ」、および「Dex+ポリケタール」の試料を各々指す。これらの算出により、様々な試料についてのDexカプセル化効率 43%〜53%を得た。
ポリケタール粒子中のデキサメタゾンのカプセル化
抗炎症薬デキサメタゾン(Dex,Sigma)を、2を用いて作製された粒子中にカプセル化した。油相が5mg/mlの濃度のDexを含んでいたこと、およびPVA:ポリケタールの比率 1:1を用いたことを除いて上記の手順と同じ手順を用いて、Dexをロードした粒子を処方した。これらの粒子のSEM画像は、これらの粒子が直径200〜600nmであることを明らかにする(図5C)。DLSによる粒子のサイジングは、Dexをロードした粒子のバッチについての有効な直径 250nmを示した。上記Dexのカプセル化効率は、43〜53%の間の範囲にわたった。対照バッチを、ポリケタール/PVAのみおよびDexのみを用いて調製した。Dexのカプセル化を測定するために、各粒子バッチをpH 9緩衝液中に再懸濁し、次いで、アリコートをさらに希釈した。一部分を0.1μm Supor membrane Acrodisc syringe filter(Pall Corp.)を通して濾過し、そしてその濾液の242nmでの吸光度を、Shimadzu UV− 1700 spectrophotometerにより記録した。上記カプセル化効率を、(ADex−ADexPoly)/(ADex−APoly)として算出した。ここで、Aは242nmでの吸光度であり、下付き文字「Poly」、「Dex」、および「DexPoly」は、「ポリケタールのみ」、「Dexのみ」、および「Dex+ポリケタール」の試料を各々指す。これらの算出により、様々な試料についてのDexカプセル化効率 43%〜53%を得た。
実施例4〜6についての参考文献:
(1) Ahsan,F.;Rivas,I.P.;Khan,M.A.;Torres−Suarez,A.I.J.Controlled Release 2002,79,29−40.
(2) Prior,S.;Gander,B.;Blarer,N.;Merkle,H.P.;Subira,M.L.;Irache,J.M.;Gamazo,C.Eur.J.Pharm.Sci.2002,15,197−207.
(3) Hahn,S.K.;Jelacic,S.;Maier,R.V.;Stayton,P.S.;Hoffman,A.S.J.Biomater.Sci.Polymer Edn.2004,15,1111−1119.
(4) Walter,E.;Dreher,D.;Kok,M.;Thiele,L.;Kiama,S.G.;Gehr,P.;Merkle,H.P.J.Controlled Release 2001,76,149−168.
(5) van Apeldoorn,A.A.;van Manen,H.−J.;Bezemer,J.M.;de Bruijn,J.D.;van Blitterswijk,C.A.;Otto,C.J.Am.Chem.Soc.2004,126,13226−13227.
(6) Fu,K.;Pack,D.W.;Klibanov,A.M.;Langer,R.Pharm.Res.2000,17,100−106.
(7) Shenderova,A.;Burke,T.G.;Schwendeman,S.P.Pharm.Res.1999,16,241−248.
(8) Fife,T.H.;Jao,L.K.J.Org.Chem.1965,30,1492−1495.
(9) Kwon,Y.J.;Standley,S.M.;Goodwin,A.P.;Gillies,E.R.;Frechet,J.M.J.Mol Pharm.2005,2,83−91.
(10) Murthy,N.;Campbell,J.;Fausto,N.;Hoffman,A.S.;Stayton,P.S.Bioconjugate Chem.2003,14,412−419.
(11) Murthy,N.;Xu,M.;Schuck,S.;Kunisawa,J.;Shastri,N.;Frechet,J.M.J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,4995−5000.
(12) Standley,S.M.;Kwon,Y.J.;Murthy,N.;Kunisawa,J.;Shastri,N.;Guillaudeu,S.J.;Lau,L.;Frechet,J.M.J.Bioconjugate Chem.2004,75,1281−1288.
(13) Gillies,E.R.;Goodwin,A.P.;Frechet,J.M.J.Bioconjugate Chem.2004,15,1254−1263.
(14) Lorette,N.B.;Howard,W.L.J.Org.Chem.1960,25,521−525.
(15) Panyam,J.;Williams,D.;Dash,A.;Leslie−Pelecky,D.;Labhasetwar,V.J.Pharm.Sci.2004,93,1804−1814.
(図1〜15、17〜19および22〜24の実験の詳細)
図1は、濾過されたFITC−Ova含有PKNおよび濾過されていないFITC−Ova含有PKNの蛍光強度を示す棒グラフである(励起 494nm、放射 520nm)。示されているこれらのデータは、2つの試料の平均である。FITC−Ovaのカプセル化効率は、60%である。
(1) Ahsan,F.;Rivas,I.P.;Khan,M.A.;Torres−Suarez,A.I.J.Controlled Release 2002,79,29−40.
(2) Prior,S.;Gander,B.;Blarer,N.;Merkle,H.P.;Subira,M.L.;Irache,J.M.;Gamazo,C.Eur.J.Pharm.Sci.2002,15,197−207.
(3) Hahn,S.K.;Jelacic,S.;Maier,R.V.;Stayton,P.S.;Hoffman,A.S.J.Biomater.Sci.Polymer Edn.2004,15,1111−1119.
(4) Walter,E.;Dreher,D.;Kok,M.;Thiele,L.;Kiama,S.G.;Gehr,P.;Merkle,H.P.J.Controlled Release 2001,76,149−168.
(5) van Apeldoorn,A.A.;van Manen,H.−J.;Bezemer,J.M.;de Bruijn,J.D.;van Blitterswijk,C.A.;Otto,C.J.Am.Chem.Soc.2004,126,13226−13227.
(6) Fu,K.;Pack,D.W.;Klibanov,A.M.;Langer,R.Pharm.Res.2000,17,100−106.
(7) Shenderova,A.;Burke,T.G.;Schwendeman,S.P.Pharm.Res.1999,16,241−248.
(8) Fife,T.H.;Jao,L.K.J.Org.Chem.1965,30,1492−1495.
(9) Kwon,Y.J.;Standley,S.M.;Goodwin,A.P.;Gillies,E.R.;Frechet,J.M.J.Mol Pharm.2005,2,83−91.
(10) Murthy,N.;Campbell,J.;Fausto,N.;Hoffman,A.S.;Stayton,P.S.Bioconjugate Chem.2003,14,412−419.
(11) Murthy,N.;Xu,M.;Schuck,S.;Kunisawa,J.;Shastri,N.;Frechet,J.M.J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,4995−5000.
(12) Standley,S.M.;Kwon,Y.J.;Murthy,N.;Kunisawa,J.;Shastri,N.;Guillaudeu,S.J.;Lau,L.;Frechet,J.M.J.Bioconjugate Chem.2004,75,1281−1288.
(13) Gillies,E.R.;Goodwin,A.P.;Frechet,J.M.J.Bioconjugate Chem.2004,15,1254−1263.
(14) Lorette,N.B.;Howard,W.L.J.Org.Chem.1960,25,521−525.
(15) Panyam,J.;Williams,D.;Dash,A.;Leslie−Pelecky,D.;Labhasetwar,V.J.Pharm.Sci.2004,93,1804−1814.
(図1〜15、17〜19および22〜24の実験の詳細)
図1は、濾過されたFITC−Ova含有PKNおよび濾過されていないFITC−Ova含有PKNの蛍光強度を示す棒グラフである(励起 494nm、放射 520nm)。示されているこれらのデータは、2つの試料の平均である。FITC−Ovaのカプセル化効率は、60%である。
図2は、ケタール骨格の重合体(ポリケタール)の合成および分解を示す模式図である。(A)ケタール中間体 1を生成するための1,4−ベンゼンジメタノールと2,2−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。(B)ポリケタール 2を生成するための1の段階的重合体化。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、反応工程AおよびBを進める。(C)溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物をもたらすpH感受性の分解を示す。
図3(A)は、THF中のポリケタール 2のGPCトレース(Shimadzu SCL−10A)を示す。ポリスチレン標準(Polymer Laboratories,Inc.)に基づき、Mw=4000、Mw/Mn=1.54。Y軸は、262nmでの相対的吸光度を示す。(B)は、CDCl3中のポリケタール 2の1H NMRスペクトル(Varian Mercury Vx 400);7.3ppm(4b)、4.5ppm(4c)、および1.5ppm(6a)での繰り返し単位のピークを示す。2.5および1.0でのピークは、ケタールの加水分解を防ぐために添加したトリエチルアミンに起因する。
図4は、pH1.0、5.0、および7.4でのポリケタール 2(微細にひいた粉末)の加水分解の速度論を示す線グラフである。指数崩壊半減期は、102時間(pH 7.4)および35時間(pH 5.0)である。pH 1.0の対照バッチは、最初の時点の前に完全に加水分解した。
図5は、ポリケタール2で作製された粒子のSEM画像を示す。(A、B)0.2:1のPVA:ポリケタール 2の比率を用いた粒子(粒子のサイズ:0.5〜30μm)。(C)1:1のPVA:ポリケタール 2を用いて作製した、デキサメタゾンをロードした粒子(粒子のサイズ:200〜500nm)。スケールバーは、(A)80μm、(B)3μm、および(C)4μmである。
図6は、粒子形成を示す概略図である。A.工程1:ポリケタールおよび薬物をクロロホルム中に溶解する;ポリビニル アルコールを水中に溶解する。B.工程2:クロロホルム溶液を水に添加し、そして超音波処理し、ミクロンサイズの小滴を生成する。工程3:クロロホルムを蒸発させ、粒子を生成する。
図7は、フルオレセインをロードしたポリケタール粒子が、肝臓に取り込まれることを示す。静脈内注射後の、PKNからのフルオレセインの放出を示すマウス肝臓組織切片。
図8は、ペプチド架橋されたミセルの設計および合成を示す概略図である。工程1:ISS DNAとIとを混合して、ミセル(架橋されていないミセル)を形成する。工程2:次いで、これらのミセルを抗原性ペプチド(II)で架橋して、免疫刺激分子とペプチド抗原との両者をカプセル化し得る送達システムを生成する。APCによるファゴサイトーシスの後、ペプチド架橋されたミセルは、それらの構成成分を放出する。
HIVペプチドワクチンを、ペプチド CGCRIQRGPGRAFVTIGKCGCG(II)を用いたPCM戦略を用いて合成した。上記ペプチドIIは、GP−120タンパク質に由来し、クラスI抗原とクラスII抗原の両者である配列 RIQRGPGRAFVTIGKを含む。最初に、0.5mlの50mM PBS中で、0.5mgのIを0.1mgのISS DNA(5−TCCATGACGTTCCTGACGTT−3)(電荷比率は15対1(−/+)であった)と混合することにより、IとISS−DNAとの間でミセルを形成した。Cumulants方法を用いた、これらのミセルの動的光散乱は、これらのミセルが57.0nmの平均直径を有することを示した。次いで、0.1mgのIIを上記ミセルに添加すること(等モル比のIIにおけるシステイン対Iにおけるチオピリダール基)により、これらのミセルを架橋した。ジスルフィド交換反応により、上記ペプチドIIを上記ミセルに組み込んだ。
図9は、PEG−ポリリジン チオピリダールの合成および性質決定を示す。A.PEG−ポリリジン チオピリダール(I)の合成。44マイクロモルのPEG−ポリ−l−リジン(PEG=5kdおよびポリ−l−リジン=5,000を含む)を、攪拌棒の備わった5mlの丸底フラスコ内で1mlのDMF中に溶解した(完全に上記重合体を溶解させるために、室温での一晩中の攪拌を必要とした)。次いで、415マイクロモルのヒドロキシル−エチル チオピリダール アクリラートおよび58μlのトリエチルアミンを、上記PEG−ポリ−l−リジン溶液に添加し、そしてこの反応を室温で24時間継続させた。上記反応溶液を15mlの氷冷したジエチルエーテル中に沈殿させることにより、この生成物を単離した。この収率は、88.2%であった。B.D2O中のPEG−PLL−チオピリダールの1H−NMRスペクトル。(A)の生成物を、D2Oにおける1H NMRにより解析した。ピリジンのプロトン(−NC5H4:δ=7.101ppm、7.629ppm、8.187ppm)対ポリ−l−リジンのα、β、γ−メチレンのプロトン(−CH2CH2CH2:δ=1.122ppm、1.285ppm、1.553ppm)のピーク強度の比率を比較することにより、アルキル化されたアミンのパーセンテージを決定した。これは、上記アミンの100%が反応したことを示した。C./D.架橋されていないPCM(C)およびペプチド架橋されたPCM(D)の動的光散乱解析。0.06mg/mlのPEG−ポリリジン チオピリダールおよび20μg/mlのISS DNAを含むpH 7.4の50mM PBS緩衝溶液を、調製し、そして200nm syringe filterを通して濾過した。次いで、この溶液を、Cumulant方法を用いて、動的光散乱(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments)により解析した(C)。次いで、0.12mgのペプチド抗原(II)を添加することにより、この溶液を架橋し、反応の3時間後、この溶液を、上記の通りのDLSにより解析した(架橋されたミセルのサイズおよびサイズの分布はDに示されている)。E.ペプチド抗原(II)におけるシステインの架橋反応。F.ペプチド抗原(II)とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応についてのUV解析。エッペンドルフチューブ内で、0.5mlの50mM NaH2PO4緩衝液(pH 7.4)中、0.5mgのIを0.1mgのISS DNAと混合することにより(アミン対ホスファートの比率15/1を表す)、ブロック共重合体ミセルを、IとISS DNAとの間で形成した。室温で2時間のインキュベーションの後、0.lmgのII(1:1のシステイン:チオピリダールの比率を表す)を上記ミセルに添加した。IIにおけるシステインと上記ミセル中のチオピリダール基との間の架橋反応を、342nmでのUV解析(放出されたチオピリドンを表す)により決定した。システイン基のパーセンテージを、以下の式により決定した:
図10は、ペプチドおよびDNAの放出におけるGSHの影響を示す。A.GSH感受性のペプチド放出。ファゴサイトーシス後にPCMがペプチド抗原を放出するかどうかを決定するために、GSHの存在に起因するPCMからのペプチドの刺激反応性放出を、調べた。PCMを、異なる濃度のGSHと共に24時間、50mM pH 7.4 PBS緩衝液中でインキュベートし、次いで、ペプチドの放出を決定するためにHPLCにより解析した。この図は、ペプチドの放出がGSHの存在により引き起こされることを明らかにする。10mM GSH(細胞内レベル)と共に行うPCMのインキュベーションはペプチドの71%の放出を誘導するが、緩衝液のみとのPCMのインキュベーションはペプチドの10%の放出のみしか引き起こさない。B.GSH感受性のDNA放出。PCMが血清ヌクレアーゼによる分解からカプセル化されたISS−DNAを保護する能力を、調べた。PCMを、(上記の通りに)合成し、そして10%の血清と共に12時間インキュベートし、次いで、カプセル化されたISS−DNAの安定性を決定するために、これらのPCMをゲル電気泳動により調べた。対照として、ISS−DNA自体を、血清と共にインキュベートした。この図は、ISS−DNA自体は、10%の血清中で完全に加水分解され(レーン 2)、対照的に、PCM中にカプセル化されたISS−DNAは、おそらく、ヌクレアーゼが上記ミセルに入るのを防ぐに違いない架橋の効果に起因して(レーン 3)、血清ヌクレアーゼから保護されることを明らかにする。C.ISS−DNAは、PCM中の血清ヌクレアーゼから保護される。PCM戦略の重要な利点は、架橋送達システムを生成することである。この架橋は、インビボでPCMを安定化するに違いない。分解に対するPCMの安定性を、負に荷電した重合体、ポリ(ビニル スルファート)(PVS)をPCMと混合することにより調べ、次いで、PVSにより置換されたISS−DNAの量を決定するために、この混合物を、ゲル電気泳動により解析した。対照として、PVSをまた、IIおよびISS−DNAからのみ構成された架橋されていないミセルと共にインキュベートした。図A、レーン 4は、PVSがISS−DNAおよびIIからのみ構成される架橋されていないミセルを破壊し得ることを明らかにする。対照的に、A、レーン 5は、おそらく、ペプチド架橋が、PVSが上記ミセル中に分散しISS−DNAを置き換えることを防ぐことに起因して、PVSが、PCM由来のISS−DNAを置換し得ないことを明らかにする。重要なことには、細胞内濃度のGSHと共のPCMのインキュベーションの後、PCMは、PVSの存在下で、カプセル化されたISS−DNAを放出する。このことは、ファゴサイトーシス後に上記ミセルがそれらの中身を放出する筈であることを明らかにする(bのレーン 2および3))。ISS−DNA対Iの電荷比率は、1対15(−/+)である;1μgのDNAを、各レーンにロードした;カプセル化されたISS−DNAの放出を誘導するために、GSH(100μM)レーン 3に添加した。全試料を、10%の血清と共に、室温で12時間インキュベートした。
図11は、ブロック共重合体ミセルを示す:A.PEG−ポリ(リジン−チオ−ピリジル)の化学構造。PEG鎖は、上記ミセルに対する安定性を与え、そしてポリリジンセグメントを、タンパク質およびDNAまたはRNAとの静電相互作用のために用いる。チオピリダール基は、結果として生じるジスルフィド結合を介した架橋のためである。B.工程I:PEG−ポリ(リジン−チオ−ピリダール)をDNAおよびタンパク質と混合し、その外側のPEGと共にミセルを形成する。C.工程II:ミセルを分子含有ジチオール(例えば、ジ−チオエチレン グリコール)と架橋する。D.架橋されたミセルを、血中よりも細胞内で一層高い濃度を有するグルタチオンにより還元する。
図12は、ミセルの免疫学を示す。A.DC由来のヒト単球によるSIINFEKL−CFSEミセルの取り込み。DC由来のヒトPBMC(培養6日目)を、4時間37℃で、濃度10μg/ml、5×10*5細胞/ウェル、96−Uウェル、RPMI/10% FCSで、SIINFEKL/CFSE ミセルを用いてパルスした。細胞を、洗浄し、この形態に固定し、そして共焦点顕微鏡イメージング用に調製した。B.DC由来のヒト単球による、SIINFEKLペプチドをカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。DC由来のヒトPBMC(培養6日目)を、4時間37℃で、濃度10μg/ml、5×10*5細胞/ウェル、96−Uウェル、RPMI/10% FCSで、無添加SIINFEKL/CFSE(1)またはSIINFEKL/CFSEを処方されたミセル(2、3)を用いてパルスした。細胞を、洗浄し、CD11cおよびHLADRについて染色した。細胞を、CD11c+細胞、HLADR+細胞に対してゲートし、そしてCFSEの蛍光について解析した。C.マウスのDCおよびマクロファージによる、SIINFEKLペプチドをカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。全マウスC57B1/6J FLT3−L脾臓を、37℃で、濃度1×10*6細胞/ウェル、96−Uウェル、RPMI/10% FCSで、1もしくは10μg/mlのCFSEで標識された無添加のSIINFEKL(1)またはペプチド(2,3)を処方されたミセルを用いて4時間(青線)パルスするか、あるいは処理しないでおいた(赤線)。細胞を、CD11cおよびCD11bについて染色し、そしてCFSE陽性蛍光について解析した。
図13は、SIINFEKLペプチドを処方されたミセルが、インビトロで強いT細胞反応を誘導することを示す棒グラフである。同系のC57B1/6J H−2b FLT3−Lの処置されたマウスに由来する精製されたCD11c+を、4時間、示された濃度および組み合わせの無添加SIINFEKLペプチドまたはSIINFEKLペプチドを処方されたミセルでパルスした。細胞を、洗浄し、そして、20時間(左のパネル)または96時間(右のパネル)、全OT−1脾臓細胞と共に培養した。細胞を、CD8および細胞内IFNγについて染色し、フローサイトメーターで解析した。グラフは、ミセル SIINFEKL 213.3(黒のバー)、ミセル SIINFEKL 213.2(灰色のバー)、無添加のSIINFEKL(白のバー)、培地(ドットのバー)がCD11c+DCを刺激したことを表す。
図14は、ミセルの免疫学を示す。A.マウスのDCおよびマクロファージによる、OVAタンパク質をカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。全マウスC57B1/6J FLT3−L脾臓細胞を、37℃、濃度1×10*6細胞/ウェル、96−U ウェル、RPMI/10% FCSで、1もしくは10μg/mlのFITCで標識された無添加のオボアルブミン(1)またはタンパク質を処方されたミセル(2)を用いて1時間(黒線)、5時間(点線)パルスするか、あるいは処理しないでおいた(影つき)。細胞を、CD11cおよびCD11bについて染色し、そしてFITC陽性蛍光について解析した。B.OVA/CpGをカプセル化されたミセルは、インビトロでDCを活性化する。全マウスC57B1/6J FLT3−L脾臓細胞を、1μg/mlの無添加OVA(1)、無添加OVA+lμgのCpG(2)またはOVAを処方されたミセル(3)またはミセル OVA+lμgのCpG(4)を用いて、24時間パルスした。CD11c+細胞を、CD80マーカーまたはCD86マーカーについて解析した。データは、アイソタイプの対照(影つき)、処理されていない細胞(灰色の線)または刺激で処理された細胞(黒線)を表す。
図15は、ポリケタール粒子の免疫学を示すグラフである。インビトロでの、マウスのDCおよびマクロファージによる、U0126をカプセル化されたポリケタール粒子(PKN)の取り込み。全マウスC57B1/6J FLT3−L脾臓細胞を、5時間37℃で、1×10*6細胞/ウェル、96−U ウェル、RPMI/10% FCSで、U0126 ERKインヒビターを保有する、1または10μg/mlのCMFDAで標識されたポリケタール粒子を用いて、パルスした。細胞を、CD11cおよびCD11bについて染色し、そしてCMFDA陽性蛍光について解析した。データは、細胞を処理された培地(影つき)または5時間の取り込み(黒線)を表す。
図17は、ミセルの免疫学を示す。A.抗原を処方されたミセルは、インビトロで強いT細胞反応を誘導する。同系のC57B1/6J H−2bマウス由来の精製されたCD11c+細胞を、4時間、示されている濃度およびオボアルブミンならびに無添加のCpGまたは処方されたミセルの組み合わせを用いてパルスした。細胞を洗浄し、1×10*5のCD11c+を、1×10*6の全OT−1(SIINFEKL 特異的)脾臓細胞と共に、5日間培養した。5日後、細胞を、BFA(5μg/ml)と共にSIINFEKL ペプチド(lμg/ml)で6時間再刺激し、そしてCD8および細胞内IFNγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメーター解析を表し;右のパネルは、これらのデータの概要を示す。B.抗原を処方されたミセルは、CD4+依存性のCD8+T細胞の誘導機構を克服する。同系のC57B1/6J H−2bマウス由来の精製されたCD11c+細胞を、示されている濃度およびオボアルブミンならびに無添加のCpGまたは処方されたミセルの組み合わせを用いて、4時間パルスした。細胞を洗浄し、1×10*5のCD11cを、5×10*5のCD8+ MACS精製されたOT−1脾臓細胞(約90%の精度)と共に、5日間培養した。5日後、細胞を、BFA(5μg/ml)と共にSIINFEKL ペプチド(lμg/ml)で6時間再刺激し、そしてCD8および細胞内IFNγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメーター解析を表し;右のパネルは、これらのデータの概要を示す。C.抗原を処方されたミセルは、インビボでDCを活性化する。C57B1/6Jマウス(2/群)に、無添加で5μg/マウスのオボアルブミン/CpGまたは500μl PBS中に処方されたミセルをi.v.注射した。脾臓を、注射後4時間および24時間後に摘出し、コラゲナーゼで処理し(30分/37℃)、ホモジナイズし、そして赤血球溶解緩衝液で処理した。CD11c+細胞を、CD80マーカーまたはCD86マーカーについて染色し、そしてフローサイトメーターを用いて解析した。データは、アイソタイプの対照(影つき)、処置されていないマウス(灰色の線)または抗原を注射されたマウス(黒線)を表す。
図18は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。A.ワクチンを処方されたミセルは、インビボでの強いT細胞反応−CD8+IFNγ+を誘導する。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA(1)またはOVA+CpG(2)、ミセル OVA(3)、ミセル OVA/CpG(4)をs.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、36日目(ブースト 1)および84日目(ブースト 2)にブーストした。ブースト 2後6日目に血液を採取し、PBMCを、Histopaque gradient方法を用いて単離し、SIINFEKL ペプチド(lμg/ml)およびBFA(5μg/ml)を用いて6時間再刺激し、そしてCD8および細胞内IFNγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメトリー解析および選択されたマウスに対するゲート戦略を表し;右のパネルは、全CD8+T細胞のうちのCD8+IFNγ+細胞の%として、これらのデータの概要を示す。B.ワクチンを処方されたミセルは、インビボで強いT細胞反応−CD8+TNFα+を誘導する。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA(1)またはOVA+CpG(2)、ミセル OVA(3)、ミセル OVA/CpG(4)を、s.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、36日目(ブースト 1)および84日目(ブースト 2)にブーストした。ブースト 2後6日目に血液を採取し、PBMCを、Histopaque gradient方法を用いて単離した。4匹のマウス由来のPBMCをプールし、SIINFEKL ペプチド(lμg/ml)およびBFA(5μg/ml)を用いて6時間再刺激し、そしてCD8ならびに細胞内のTNFαおよびIL−10について染色した。左のパネルは、フローサイトメトリー解析および選択されたマウスに対するゲート戦略を表し;右のパネルは、全CD8+T細胞のうちのCD8+TNFα+細胞の%として、これらのデータの概要を示す。C.OVA/CpGワクチン接種後の特異的CD8+/IFNγ+T細胞の速度論。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA+CpG(灰色の線)およびミセル OVA/CpG(青の線)をs.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、0日目に初回免疫し、36日目(ブースト 1)および84日目(ブースト 2)にブーストした。初回免疫およびブーストの後の異なる日に血液を採取し、PBMCを、Histopaque gradient方法を用いて単離した。4匹のマウス由来のPBMCを、SIINFEKL ペプチド(lμg/ml)およびBFA(5μg/ml)を用いて6時間再刺激し、そしてCD8ならびに細胞内のIFNγについて染色した。パネルは、全CD8+T細胞のうちのCD8+IFNγ+細胞の%(SEMエラーバーを含む)として、これらのデータの概要を表す。D.OVA+UO126 PKNワクチン接種後の特異的CD8+/IFNγ+T細胞の速度論。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA+CpG(灰色の線)、ミセル OVA/CpG(青の線)およびミセル OVA+10μg UO126 PKN(赤の線)をs.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、0日目に初回免疫し、36日目(ブースト 1)および84日目(ブースト 2)にブーストした。初回免疫およびブーストの後の異なる日に血液を採取し、PBMCを、Histopaque gradient方法を用いて単離した。4匹のマウス由来のPBMCを、SIINFEKL ペプチド(lμg/ml)およびBFA(5μg/ml)を用いて6時間再刺激し、そしてCD8ならびに細胞内のIFNγについて染色した。パネルは、全CD8+T細胞のうちのCD8+IFNγ+細胞の%(SEMエラーバーを含む)として、これらのデータの概要を表す。E.ワクチンを処方されたミセルは、インビボで強い抗原特異的IgG抗体反応を誘導する。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA(1)またはOVA+CpG(2)、ミセル OVA(3)、ミセル OVA/CpG(4)ミセル OVA+10μgのPKN U0126(5)またはミセル OVA/CpG+10μgのPKN U0126(6)をs.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、36日目および84日目にブーストした。初回免疫(初回)後4週目、1回目のブースト(ブースト 1)後6週目および2回目のブースト後7週目(ブースト 2)に、瀉血を行った。個々のマウス由来の血清を、プールし、そしてプレートELISAを用いて、OVA特異的な全IgG抗体、IgG1抗体、IgG2a抗体およびIgG2b抗体の反応性について試験した。抗体反応性を、血清の連続的希釈物についての450nm 吸光度として測定した。データは、特異的抗OVA抗体の逆数として表されている。F.ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なIgE抗体反応およびIgM抗体反応を誘導する。4匹のC57B1/6Jマウスのコホートに、5μg/マウスのOVA(1)またはOVA+CpG (2)、ミセル OVA(3)、ミセル OVA/CpG(4)ミセル OVA+10μgのPKN U0126(5)またはミセル OVA/CpG+10μgのPKN U0126(6)をs.c.でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、36日目および84日目にブーストした。2回目のブースト後7週目に、瀉血を行った。個々のマウス由来の血清を、プールし、そしてプレートELISAを用いて、OVA特異的なIgE抗体およびIgM抗体の反応性について試験した。抗体反応性を、血清の連続的希釈物についての450nm 吸光度として測定した。データは、特異的抗OVA抗体の逆数として表されている。
図19は、シクロヘキサン ジメタノール由来のポリケタールを示す。A.シクロヘキサン ジメタノール由来のポリケタール(PCADKと呼ばれる)は、分解して、シクロヘキサン ジメタノールおよびアセトンになり、どちらも、ヒトの使用のためのFDA承認を有する。B.PCADKは酸感受性様式で分解する。PCADK内のケタール結合は、生理的pH条件下、週単位で加水分解する。PCADK内のケタール結合の加水分解を、4.5および7.4のpHでのH−NMRにより測定した。ファゴソームのpH 4.5で、PCADKのケタール結合は、10日後に約30%が加水分解される。この結果に基づいて、本発明者らは、CAT−PKNが、マクロファージによるファゴサイトーシス後4〜5週間以内に、完全に加水分解される筈であると予想する。
図22は、ほとんどのいかなる脂肪族ジオールをも含むポリケタールが、作製され得ることを示す化学的表記である。上記ポリケタールの疎水性は、その加水分解の速度論を決定する。
図23は、FITC標識されたポリケタールが、肝臓のマクロファージによりファゴサイトーシスされることを示す写真である。インビボでのクップファー細胞によるPKNのファゴサイトーシス。マウスに、FITC−PKNまたは空のPKNのいずれかを注射した。これらのマウスの肝臓を、組織学により解析した。左:点在する緑の蛍光により証明されるように、FITC−PKNは、クップファー細胞内に豊富に存在する(倍率 100×)。中央:空のPKNは、バックグラウンドの緑の蛍光をほとんど生じない(倍率 100×)。右:FITC(赤)についての免疫組織化学(IHC)は、クップファー細胞による取り込みを確認する(倍率 400×)。
図24.A.ポリケタール粒子中にカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをカプセル化するために用いられる二重エマルジョンの手順。ホモジナイザーを用いて、カタラーゼ(1mg/ml)の水溶液50μLを、1mLのクロロメタン中に溶解した75mgのPCADKからなる有機相中に分散させ、油中水型(w/o)エマルジョンを生成した。次いで、このw/oエマルジョンを、25mLの4% PVA溶液中に滴下し、そしてこの溶液を、ホモジナイザーを用いて機械的に攪拌した。次いで、この結果生じたw/o/wエマルジョンを、225mLの4% PVA溶液に注ぎ、そして塩化メチレンが蒸発するまで数時間、機械的に攪拌した。この結果生じた粒子を、遠心分離により単離し、凍結乾燥し、そしてSEM(B)により調べた。このタンパク質のカプセル化効率は、35%であった。これらのCAT−PKNは、約8ミクロンの平均直径を有する。B.カタラーゼ含有粒子のSEM画像、およびカタラーゼ含有粒子の蛍光顕微鏡画像。C.過酸化水素の240nmでの吸光度を減少させる能力により証明されるように、カタラーゼ粒子は酵素活性を有する。
Claims (61)
- ケタール基を含む生分解性疎水性ポリケタール重合体であって、ここで、該重合体の各ケタール基は、該重合体骨格内に、2つの酸素原子を有する、重合体。
- 請求項1に記載のポリケタール重合体を含む生分解性粒子。
- さらに1つ以上の活性物質を含む、請求項2に記載の粒子。
- 請求項1に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、2,2−ジオキシプロピル基である、重合体。
- 請求項1に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、アルキル基、アリール基およびシクロアルキル基からなる群から選択される基に結合している、重合体。
- 請求項1に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、1,4−ジメチルベンゼン基または1,4−ジメチルシクロヘキシル基に結合している、重合体。
- 請求項1に記載の重合体であって、ここで、該重合体は、ポリ(1,4−フェニレン−アセトン ジメチレン ケタール)またはポリ(1,4−シクロヘキサン−アセトン ジメチレン ケタール)である、重合体。
- 請求項2に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子である、粒子。
- 請求項8に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、約50〜1000nmのサイズである、粒子。
- 請求項8に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、約200〜600nmのサイズである、粒子。
- 請求項3に記載の粒子であって、ここで、該活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、粒子。
- 請求項11に記載の粒子であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、粒子。
- 請求項12に記載の粒子であって、ここで、前記免疫調節剤は、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
ならびに
b.樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター
c.RIG−1、dectin−1およびDC−SIGNを含む任意のC型レクチン、またはキャタピラタンパク質に対するリガンド
からなる群から選択される、粒子。 - 請求項13に記載の粒子であって、ここで、前記インヒビターは、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビター;または(b)SOCS 1、2、3、もしくは他のSOCSタンパク質のインヒビターからなる群から選択される、粒子。
- 請求項3に記載の粒子を生成およびカプセル化するための方法であって、
a.ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成する工程;ならびに
b.1つ以上の活性物質の存在下で、該(a)の重合体の粒子を形成し、それによって、請求項3に記載の該粒子を生成およびカプセル化する工程を包含する、方法。 - 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記ケタールは、2,2−ジメトキシプロパンである、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記ジオールは、アルキルジオール、アリールジオールおよびシクロアルキルジオールからなる群から選択される、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記ジオールは、1,4−ベンゼンジメタノールまたは1,4−シクロヘキサンジメタノールである、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記(a)の疎水性重合体は、ポリ(1,4−フェニレン−アセトン ジメチレン ケタール)またはポリ(l,4−シクロヘキサン−アセトン ジメチレン ケタール)である、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、方法。
- 請求項20に記載の方法であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、方法。
- 請求項21に記載の方法であって、ここで、前記免疫調節剤は、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
b.樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
c.RIG−1、dectin−1およびDC−SIGNなどの任意のC型レクチン、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、方法。 - 請求項22に記載の方法であって、ここで、前記インヒビターは、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、Akt、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか;あるいは(b)SOCS 1、2、もしくは3または任意のSOCSタンパク質のインヒビターである、方法。
- 請求項15に記載の方法により生成される生分解性粒子。
- 多数の重合体を含む生分解性架橋ミセルであって、ここで、該重合体は、外部架橋剤により架橋され、ここで、該外部架橋剤は、(a)少なくとも2つのチオール基または(b)抗原を含む、ミセル。
- さらに1つ以上の活性物質を含む、請求項25に記載のミセル。
- 請求項25に記載のミセルであって、ここで、前記重合体は、架橋可能なブロック共重合体またはグラフト共重合体である、ミセル。
- 請求項26に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、ポリヌクレオチドである、ミセル。
- 請求項27に記載のミセルであって、ここで、前記ブロック共重合体は、PEGを含む重合体である、ミセル。
- 請求項29に記載のミセルであって、ここで、前記PEGは、PEG−ポリ(リジン−チオ−ピリジル)である、ミセル。
- 請求項25に記載のミセルであって、ここで、前記抗原は、HIV抗原である、ミセル。
- 請求項26に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、ミセル。
- 請求項32に記載のミセルであって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、ミセル。
- 請求項33に記載のミセルであって、ここで、前記免疫調節剤は、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
b.樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
c.RIG−1、dectin−1およびDC−SIGNなどの任意のC型レクチン、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、ミセル。 - 請求項34に記載のミセルであって、ここで、前記インヒビターは、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか;あるいは(b)SOCS 1、2、もしくは3、または任意のSOCSタンパク質のインヒビターである、ミセル。
- 請求項25に記載のミセルを生成するための方法であって、以下の工程:
a.ミセルを形成するように、目的の重合体を反応させる工程;および
b.該ミセルと外部架橋剤とを架橋させる工程を包含する、方法。 - 請求項36に記載の方法であって、ここで、工程a)において、前記ミセルを形成するように、前記目的の重合体は、1つ以上の活性物質の存在下で反応させられる、方法。
- 請求項36に記載の方法であって、ここで、前記目的の重合体は、架橋可能なブロック共重合体である、方法。
- 請求項37に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、ポリヌクレオチドまたはsiRNAである、方法。
- 請求項38に記載の方法であって、ここで、前記ブロック共重合体は、PEGを含む重合体である、方法。
- 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記PEGは、PEG−ポリ(リジン−チオ−ピリジル)である、方法。
- 請求項37に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、方法。
- 請求項42に記載の方法であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、方法。
- 請求項43に記載の方法であって、ここで、前記免疫調節剤は、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11のいずれかまたはその組み合わせに対するリガンド、ならびに
b.樹状細胞、マクロファージまたは他の抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
c.RIG−1、任意のC型レクチン(例えば、dectin−1およびDC−SIGNを含む)、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、方法。 - 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記インヒビターは、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか;あるいは(b)SOCS 1、2、もしくは3、任意のSOCSタンパク質のインヒビターである、方法。
- 請求項36に記載の方法により生成される生分解性ミセル。
- 請求項3に記載の粒子を被験体内へ投与する工程を包含する、活性物質を該被験体に送達するための方法であって、該粒子は、その中の該活性物質が、放出され、そして該被験体に送達されるように、該被験体内で分解される、方法。
- 請求項25に記載のミセルを被験体内へ投与する工程を包含する、活性物質を該被験体に送達するための方法であって、該ミセルは、その中の該活性物質が、放出され、そして該被験体に送達されるように、該被験体内で分解される、方法。
- 請求項47または48に記載の方法によって、疾患または障害に作用し得る活性物質を送達することにより、該疾患または障害を患う被験体を処置する方法。
- 請求項49に記載の方法であって、ここで、前記疾患または障害は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、糖尿病および癌からなる群から選択される、方法。
- 請求項50に記載の方法であって、ここで、前記感染症は、HIV、マラリア、TB、SARS、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびHCVからなる群から選択される、方法。
- 請求項50に記載の方法であって、ここで、前記自己免疫疾患は、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびCOPDからなる群から選択される、方法。
- 請求項3に記載の粒子を含む薬学的組成物。
- 請求項25に記載のミセルを含む薬学的組成物。
- ミセル中に容易にカプセル化され得る、可逆的に改変された活性物質。
- ミセル中に容易にカプセル化されるようにタンパク質を可逆的に改変するための方法であって、該タンパク質のアミノ基を、該タンパク質における荷電部位の数を増加させる物質と反応させ、それによって、該タンパク質の電荷を変える工程を包含する、方法。
- 請求項56に記載の方法であって、ここで、前記荷電物質は、シス−アコニチルである、方法。
- 請求項3に記載の粒子であって、ここで、前記活性物質は、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子である、粒子。
- 請求項58に記載の粒子であって、ここで、前記核酸は、siRNAである、粒子。
- 請求項25に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子である、ミセル。
- 請求項60に記載のミセルであって、ここで、前記核酸は、siRNAである、ミセル。
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