JP6464103B2 - ワクチン接種用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、抗原及び/又はアジュバントの制御放出のための粒子を含むワクチン接種用組成物に関する。
ワクチン接種は、疾患に対抗する強力な方法である。世界保健機関(WHO)によれば、様々な抗原に対するワクチンが利用できるため、毎年約250万人の小児の生命が救われている。ワクチンは、予防的だけなく、例えば、腫瘍学に又はアルツハイマー病に治療的にも用いられている。免疫系は、最初に抗原を捕捉し、その後、病原体を巧みに除去する特殊化した細胞の複合ネットワークを増幅し、将来曝露した場合の当病原体の免疫記憶を最終的に作り出すことによって機能する。B細胞、マクロファージ及び樹状細胞(DC)等の抗原提示細胞(APC)は、抗原を捕捉し、これらを処理し、T細胞上に存在するT細胞受容体による認識のためにMHCクラスI及びII経路を経て表面上にこれらの抗原の断片を提示する。DCは、無感作T細胞を活性化するそれらの能力が特有である。樹状細胞(DC)は、したがって、ワクチン接種プロセスにおいて中心的な役割を果たす。この抗原提示プロセスは、一般的に抗原負荷DCのケモカイン依存的移動の後に局所リンパ節において起こる。また、抗原提示細胞(APC)は、細胞からの危険シグナルを感知し、再循環T細胞上の受容体による認識のためにそれらの表面上に存在する共刺激分子を介して共刺激シグナルを提示して、リンパ節における免疫応答を開始させる。危険シグナルに遭遇すると、未熟DCは、成熟期に変化し、それらの表面上に抗原を提示する。この工程は、通常、T細胞の活性化のための抹消組織からリンパ節へのDCの移動と同時である。抗原提示の直後にDCがリンパ節においてアポトーシスを受けると考えられている。
ワクチン組成物は、抗原に加えて、しばしばアジュバントを含む。アジュバントは、投与抗原へのレシピエントの免疫応答を促進又は増強する物質である。例えば、サブユニットワクチンは、適切な免疫応答のためにアジュバントの添加を必要とする。
ナノ粒子及びミクロ粒子は、ワクチン組成物に用いられている。D,L-乳酸-グリコール酸コポリマー(PLGA)からなる生分解性ナノ粒子は、抗原又はアジュバントをカプセル封入するために用いられている。また、オボアルブミン(OVA)を含むポリスチレンビーズが試験された。
ブロックコポリマーからなり、コアに免疫刺激DNAをカプセル封入し、ジスルフィド結合を介してペプチド抗原に結合するミセル(ペプチド架橋ミセル-PCM)PCMが開示された。高濃度のグルタチオンの存在下では、それらは、抗原性ペプチド及び免疫刺激DNAをAPCに送達する(Haoら、Int J Nanomedicine 2006、1:97〜103頁、Hirosueら、Vaccine 28 (2010) 7897〜7906頁)。しかし、ジスルフィド橋は、制御放出を可能にしない。
しかし、ワクチン接種におけるナノ粒子の使用は、いくつかの障害がある。例えば、十分な抗原が十分な免疫活性化をもたらす形で樹状細胞(DC)に提示されることが必要である。それにより、耐性又は自己免疫を避けることが好ましい。しばしば、長期の免疫化を要求するには数回のワクチン接種が必要である。
更に、それぞれの目的のために、ワクチン組成物は、最適化を必要とする。それは、免疫化の方法及び/又はアジュバントの適切な選択を必要とする。それは、予防又は治療等の使用の種類に非常に依存する。更に、自己免疫疾患及び耐性等の望ましくない副作用を回避することを試みる。
大部分のナノ粒子が投与後にマクロファージによって取り込まれるが、標的は、好ましくはDCであることも認められる。現在のナノ及びミクロ粒子の他の不都合な点は、それらが物理的にカプセル封入された抗原及び/又はアジュバントを含む、すなわち、抗原及び/又はアジュバントがナノ又はミクロ粒子によって共有結合により封入されていないことである。これは、放出プロファイルに対する制御が、全く存在しないか、又は最小限であることを意味するが、これは、最良の免疫系の提示/活性化に不可欠である。従来技術のナノ又はミクロ粒子の固有の生物学的不安定性のため、粒子を投与した場合に抗原及び/又はアジュバントの爆発的な放出があることがしばしば認められる。抗原及び/又はアジュバントの放出は、アジュバント及び抗原を提示することが最も有用である部位/細胞ではなく、投与部位で起こる。更に、従来技術のナノ粒子は、それら自体がすべて物理的集合であり、これは、粒子を一緒に保持する力が物理的力であって、共有結合性ではなく、したがって、しばしばこれらの粒子は、不安定である。更に、抗原及び/又はアジュバントは、ナノ粒子表面に主として物理的に吸着され、これは、共有結合よりはるかに安定でなく、制御放出を可能にせず、又ははるかにより低い程度である。更に、ナノ粒子自体は、単一分子実体と記載されているが、これらのナノ粒子の構造の完全性は、製造並びに物理的集合及びカプセル封入の方法によっているため、大部分は不明である。しばしば、これらのナノ粒子は、動物への投与後にかなりの程度まで崩壊する。ナノ粒子の不安定性は、すべての抗原が担体と結合しているとは限らないという結果になりうる。例えば、OVAの25%がリポソームと結合していなかったことが示された。トリメチルキトサン(TMC)ナノ粒子は、初日に約20%のOVAの爆発的な放出を示し、その後は、3週間にわたってさらなる検出できるOVAの放出を示さなかった。同様に、PLGAミクロスフェアは、即時のOVAの爆発的な放出をもたらし、これがそれぞれOVA単独又はOVA及びCpGの両方を負荷したミクロスフェアの総投与量の32%及び10%に達した。その後の3週間にさらなるタンパク質の放出は検出できなかった(MohananらJ. Control Rel (2010) 147巻3号、342〜349頁)。
他の不都合な点は、ナノ粒子の製造が抗原の構造に影響を及ぼす可能性があることである。例えば、ナノ粒子の調製方法の長所及び短所(Kundaら、Pharm Res (2013) 30、325〜341頁)を参照のこと。
標的細胞におけるナノ粒子の取り込みは、主としてサイズ及び組成依存的であり、したがって、サイズ及び組成の十分な制御が必要であると思われる。しかし、従来技術における多くのナノ粒子及び製造の方法については、サイズ及び/又は組成を制御することは可能ではない。実際、従来技術の粒子の大部分は、サイズの大きい分布を示し、それにより、粒子に基づくワクチン組成物を不均一にする、又はさらなる精製を必要とする。更にワクチン接種の目的のために、バッチ間の再現性を確保するために抗原及び/又はアジュバントのカプセル封入、並びに/又は標的物質の付着に対する厳格な制御がなければならない。従来技術のナノ粒子の大部分は、そのような厳格な制御を可能にせず、したがって、ワクチン接種の目的に適さず、頑健な治療反応をもたらすことを可能にしないものである。
しばしば、従来技術のナノ粒子については、例えば、爆発的な放出のために、免疫応答は十分に長くはなく、したがって、十分な免疫応答のためのさらなる増強スケジュールは必要でない。
国際公開第2010/138193号は、抗原提示細胞等の細胞における作用の部位を標的とし、pHに敏感な様態で合成ナノ担体から解離する免疫調節薬を含みうる合成ナノ担体の組成物を対象としている。国際公開第2010/138193号の合成ナノ担体は、APCにより優先的に取り込まれる。APCにより取り込まれた後、合成ナノ担体は、エンドサイトーシスによって、細胞外の中性pHと対照的に、より酸性になるエンドソーム/リソソームコンパートメント内に輸送されると推測される。これらの条件下では、免疫調節薬は、合成ナノ担体からのpH感受性解離を示し、合成ナノ担体から放出される。次いで、免疫調節薬は、エンドソーム/リソソームに結合している受容体と自由に相互作用し、所望の免疫応答を刺激することができる。しかし、国際公開第2010/138193号は、免疫調節薬が存在する場合のポリマーの架橋を開示していない。免疫調節薬がナノ粒子内に共有結合により封入されているシステムの開示は存在しない。国際公開第2010/138193号において、粒子は、最初に免疫調節薬をポリマーにコンジュゲートさせ、次いで、免疫調節薬-ポリマー複合体のナノ粒子を製造することにより製造している。したがって、国際公開第2010/138193号のシステムは、それぞれの異なる免疫調節薬ごとの異なるコンジュゲーションの経路を必要とする。
米国特許出願公開第2009/011993号は、ワクチン、免疫調節薬及び/又は抗原提示細胞を標的とする薬物等の活性薬を送達する粒子を対象としている。米国特許出願公開第2009/011993号は、両酸素原子がポリマー主鎖にあるようにケタール基が配置されている、ポリマー主鎖にケタール基を含む新たな種類の疎水性ポリマーを開示している。米国特許出願公開第2009/011993号は、ポリマーを免疫調節薬に架橋するための外部架橋剤の使用を開示しており、免疫調節薬の存在下でのポリマーの架橋工程を開示していない。
残念ながら、多種の(サブユニット)ワクチンに普遍的に適用することができる普遍的製剤は存在しないと思われる。従来技術のほとんどのシステムについて、粒子及びコンジュゲーションは、それぞれの異なる免疫調節薬について最適化を必要とする。これは、他の免疫調節薬を含む新たな粒子について広範囲に及ぶ研究を必要とし、異なる免疫調節薬間の差を生み出す。最適な製剤は、好ましくは防御免疫に必要な応答の種類及び意図する投与経路に依存する。粒径、アジュバントの選択並びに抗原及びアジュバントの共局在等の様々な製剤の態様は、好ましくは選択される投与経路に基づいて調節する。従来技術において記載されたナノ粒子は、1つの特定の抗原及び/又はアジュバント並びに1つの特定の投与経路に適しうるが、他の抗原/アジュバント及び/又は他の投与経路に対してしばしば不適切である。したがって、異なるワクチン接種経路について、毎回異なるナノ粒子を開発しなければならない。
国際公開第2010/033022号及び国際公開第2013/002636号は、デキサメタゾン及びパクリタキセル等の薬物を含む制御放出システムを開示しているが、抗原及び/又はアジュバントをポリマーマトリックス粒子に封入することができることを開示していない。
国際公開第2012/039602号は、国際公開第2010/033022号及び国際公開第2013/002636号に開示されているような共有結合性ポリマーマトリックス粒子に用いることができる生分解性リンカー分子を開示している。国際公開第2012/039602号は、そのようなシステムにおける抗原又はアジュバントを開示していない。
国際公開第2010/138193号 米国特許出願公開第2009/011993号 国際公開第2010/033022号 国際公開第2013/002636号 国際公開第2012/039602号 米国特許第7,425,581号 欧州特許出願第776400号
Haoら、Int J Nanomedicine 2006、1:97〜103頁 Hirosueら、Vaccine 28 (2010) 7897〜7906頁 MohananらJ. Control Rel (2010) 143巻3号、342〜349頁 Kundaら、Pharm Res (2013) 30、325〜341頁 Fogedら、EJPS、2012 Kimら、Polym. Adv. Technol.、10 (1999)、647〜654頁 Leeら、Macromol. Biosci. 6 (2006) 846〜854頁 Huら、Macromol. Biosci. 9 (2009)、456〜463頁 Kimら、J. Control. Rel. 138 (2009) 197〜204頁 Bonthaら、J. Control. Rel. 114 (2006) 163〜174頁 Leeら、Angew. Chem 121 (2009) 5413〜4516頁 Nishiyamaら、Cancer Res. 63 (2003)、8977〜8983頁 Miyataら、J. Control. Rel. 109 (2005) 15〜23頁 Censiら、J. Control Rel 148 (2010) e28〜e2 9頁 Censiら、J. Control Rel 140 (2009) 230〜236頁 Biomaterials 28 2007 5581〜5593頁
したがって、本発明の目的は、ワクチン接種用組成物を提供することである。更に、本発明の目的は、異なる投与経路に対して容易に調節できるワクチン接種用組成物を提供することである。更に、ワクチン接種用組成物は、好ましくはシステムに抗原及び/又はアジュバントの共有結合をもたらし、それにより、アジュバント又は抗原への局所及び時空間曝露に対する十分な制御を保証する。本発明の他の目的は、ナノ及び/又はミクロ粒子を含むワクチン接種用組成物を提供することである。更に、本発明の他の目的は、制御放出粒子が狭い粒径分布を有するワクチン組成物を提供することである。本発明の他の目的は、異なる抗原及び/又はアジュバント、例えば、親水性及び疎水性化合物の両方に並びに大きい粒径範囲にわたり適合しうるワクチン接種用組成物を提供することである。更に、本発明の他の目的は、アジュバント及び/又は抗原の放出を制御することができるワクチン接種用組成物を提供することである。本発明の他の目的は、それぞれの封入されたアジュバント及び/又は抗原がそれ自体の特有の放出プロファイルを有する、ワクチン接種用組成物を提供することである。本発明の他の目的は、粒子に、例えば、その表面に共有結合した標的物質を含むワクチン接種用組成物を提供することである。標的物質は、本発明の粒子をAPCのような対象の細胞又は部位に誘導しうる。更に、本発明の他の目的は、抗原及び/又はアジュバントをカプセル封入することができるが、粒子の表面上に存在しても又は両方でもよい、ワクチン接種システムを提供することである。本発明の他の目的は、安全であり、且つ/又は抗原及び/若しくはアジュバントに対して非破壊的なワクチン接種用組成物を製造する方法を提供することである。
本発明は、上述の目的の1つ又は複数を満たすワクチン接種用組成物を提供する。
第1の態様において、本発明は、抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物であって、粒子が、
(i)反応性部分を含む抗原及び/又はアジュバントを、アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる、少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体と混合する工程と、
(ii)この混合物を、ポリマーが粒子に自己集合し、抗原及び/又はアジュバントがミセルのコアにカプセル封入される条件に供する工程と、
(iii)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程と
を含む方法により得られる、組成物を提供する。
ポリマーマトリックスは、形成されたポリマーネットワークである。したがって、抗原及び/又はアジュバントは、ポリマーマトリックスに、すなわち架橋により形成されたポリマーネットワークに封入されている。抗原及び/又はアジュバントは、ポリマー鎖に架橋し、それにより、ポリマーネットワーク及びポリマーマトリックスの一部も形成する。
第2の態様において、本発明は、抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物を製造する方法であって、
(i)反応性部分を含む抗原及び/又はアジュバントを、アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体と混合する工程と、
(ii)この混合物を、ポリマーが粒子に自己集合し、抗原及び/又はアジュバントがミセルのコアにカプセル封入される条件に供する工程と、
(iii)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で工程(ii)からの粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程と
を含む、方法を提供する。
本発明のさらなる態様において、本発明は、抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物を製造する方法であって、
(i)アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体を準備する工程と、
(ii)この混合物をポリマーが粒子に自己集合する条件に供する工程と、
(iii)抗原及び/又はアジュバントが粒子にカプセル封入されるように工程(ii)からの粒子をアジュバント及び/又は抗原を含む水溶液と混合する工程と、
(iv)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で工程(iii)からの粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程と
を含む、方法を提供する。
適切には、本発明のすべての態様及び/又は実施形態において、架橋後に、標的物質及び/又は抗原及び/又はアジュバントを生成粒子の表面にコンジュゲートさせる。好ましくはコンジュゲーションは、共有結合性である。適切には、ポリマー鎖は、架橋工程で反応せず、標的物質及び/又は抗原及び/又はアジュバントを形成され、架橋した粒子の表面に結合させるために用いることができる反応性部分を含む。或いは、架橋後に、さらなる結合基を、更に反応して、標的物質及び/又は抗原及び/又はアジュバントを架橋粒子の表面にコンジュゲートさせうる生成架橋粒子の表面に結合させる。また、ポリマー鎖上の反応性部分は、架橋工程中にブロックし、ポリマーネットワークが形成されたときに非ブロック化することができる。これらの非ブロック化反応性部分は、これらが架橋粒子の表面に結合するように標的物質及び/又は抗原及び/又はアジュバントと反応させることができる。更に、標的物質及び/又は抗原及び/又はアジュバントは、架橋粒子のポリマー鎖にコンジュゲートすることができる反応性部分を含みうる。
他の態様において、本発明は、予防的なワクチン組成物の使用に関する。
他の態様において、本発明は、医薬用としてのワクチン組成物に関する。
本発明の他の態様は、本発明のワクチン組成物を用いる治療の方法に関する。
本発明のすべての態様及び/又は実施形態において、ポリマーは、ポリマー鎖当たり少なくとも1つの反応性部分を含む。また、本発明のすべての態様及び/又は実施形態において、アジュバント及び/又は抗原は、少なくとも1つの反応性部分を含む。有利なことに、アジュバント及び/又は抗原は、架橋工程中にポリマーマトリックスに共有結合により封入される。架橋工程中に、ポリマーは、アジュバント及び/又は抗原と一緒にネットワークを形成し、これが抗原及び/又はアジュバントを封入されるポリマーマトリックスを形成する。抗原及び/又はアジュバントはまた、抗原及び/又はアジュバントがポリマー鎖に共有結合し、形成されたネットワークの一部を形成するように、架橋工程中にポリマーに架橋される。同時に、ポリマー鎖は、互いに架橋されて、ポリマーネットワークを形成し、ポリマー並びに封入されたアジュバント及び/又は抗原がポリマーマトリックスを形成する。
表示した異なるリンカーによる、ロイプロリドの経時的放出を示すグラフである。 PKプロファイル、全身曝露後の持続放出、用量反応曲線を示すグラフである。 モノマー:イニシエーター比及び粒子のPDIに対する粒径を示すグラフである。
本発明は、抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物を提供する。粒子は、粒子の内部に抗原及び/又はアジュバントを共有結合により封入されうる。更に、粒子は、粒子の外表面上にも抗原及び/又はアジュバントを保有しうる。本発明の制御放出粒子は、1つの粒子にいくつかの異なる抗原及び/又はアジュバントを同時に有し、それにより、異なる抗原及び/又はアジュバントが同じ部位において放出されることを保証しうる。例えば、架橋粒子の外表面への特定の標的物質のコンジュゲーションによって、制御放出粒子を特定の標的部位に対して標的指向化することも可能でありうる。更に、アジュバント及び/又は抗原の放出プロファイルは、所望の通りに調整することができる。本発明の粒子は、異なる分子に対して異なるリンカーを使用し、それにより、それぞれのアジュバント及び/又は抗原の所望の放出を可能にしうる。それぞれがそれ自体の放出プロファイルを有する、異なる分子を用いて1つのシステムを生成することができる。本発明のシステムは、(治療)効果の最適化のための真の調整可能なシステムを備えている。
本発明のワクチン接種用組成物は、個々の目的に合わせた最適化ワクチン接種製剤の必要な必須の要素を含むので独特である。本発明のワクチン接種用組成物は、以下に関する十分な制御により最適な形で樹状細胞の刺激を可能にする:
・ それぞれの個別のコア封入/表面コンジュゲート化合物の連続的又は脈動的な個々の目的に合わせた放出を可能にする、異なるリンカーの範囲。身体の望ましくない部位における放出に加えて、爆発的な放出を防ぐことができる。これは、抗原及び/又はアジュバントに対する耐性及び/又は過剰反応のような、望ましくない副作用を低減しうる。
・ 抗原、アジュバント若しくは細胞標的物質又はそれらの任意の組合せである、1つ又は複数の特定の分子の共有結合性コンジュゲーションを可能にする粒子の外表面における一連の反応性部分の可能性。
・ ワクチン接種用組成物の特定の効果の明確な評価を可能にし、従来技術において開示されたような、より不均一なナノ粒子分散体に存在するようなわずかな比率の非常に大きい又は非常に小さい粒子による望ましくないかく乱副作用を防ぐ、非常に小さい粒径分布を有する特定のサイズの粒子を提供する粒子を製造する方法。従来技術から、それぞれの目的ごとにワクチン接種用組成物が最適化を必要とすることは、明らかである。本システムは、その均一性、安定性及び純度により、ワクチン接種用組成物を真に最適化することができるという利点を有する。ワクチン組成物は、多くのより大きい若しくはより小さい粒子、或いは遊離の抗原及び/又はアジュバントのような不純物を伴わずに製造することができる。抗原又はアジュバントが共有結合により封入されているので、粒子は、遊離の抗原及び/又はアジュバントから容易に精製することができる。粒子はまた、遊離の抗原及び/又はアジュバントがポリマーマトリックスに共有結合しているので、保存中に経時的に安定である。このようにして、観察される効果が意図した粒子によるものであって、不純物によるものではないことを確信する。
・ 最良の有効免疫応答を誘発するための抗原及びアジュバントの共送達。本粒子は、抗原及びアジュバントの両方を含みうる。抗原及びアジュバントの両方をポリマーマトリックスに封入することができるだけでなく、抗原又はアジュバント又は両方をポリマー粒子の表面にも結合させることができる。更に、複数のアジュバント及び/又は抗原をポリマー粒子に封入又はその表面に結合させることができる。粒子を製造するための本方法は、ポリマーマトリックスの内部並びに形成された粒子の表面上に存在する抗原及びアジュバントのいくつかの異なる組合せを有する粒子を製造するための柔軟性を備えている。最も効率的なアジュバントは、送達システムと免疫増強物質とを組み合わせ、それにより、それらの相乗作用を活用することによって得られることが明らかになった。粒子状抗原送達システム及び免疫増強化合物からなる特定の種類の配合アジュバントは、動物試験並びにヒト臨床試験(Fogedら、EJPS、2012)の両方において強いCD8+ T細胞応答を発生させる可能性を示した。
・ 強力なCD8+ T細胞応答を刺激することに加えて、免疫増強物質と送達システムとの併用投与は、安全性の観点からも特定の場合に有益でありうる。動物モデルでは、可溶性TLRリガンドに基づくアジュバントは、全身的作用、例えば、毒性量の腫瘍壊死因子αの分泌の誘発を伴っていた。可溶性TLRアゴニストの注射後に認められたこの強い炎症誘発反応は、全APC集団の活性化に起因しておそらく起こると考えられるのに対して、送達システムは、全APC集団のうちのわずかな割合のAPC集団に免疫増強作用を集中させ、それにより全身性の副作用を防ぎうる。したがって、本発明の粒子は、免疫増強物質の活性を集中させ、それにより、これらの強力な物質を無害にする方法を提供する(Fogedら、EJPS、2012)。
・ 本発明のワクチン組成物は、長い寿命を持つCD8+記憶T細胞の誘導を促進しうる(Fogedら、EJPS、2012)。
・ 本発明のワクチン組成物は、交差浸透現象(cross penetration phenomenon)を誘導しうる。本発明の粒子は、体液性免疫応答だけでなく、細胞性応答も刺激しうる。
・ 架橋及び/又は表面修飾の後、抗原及び/又はアジュバントを有する粒子は、精製の容易さをもたらす、実際に1つの単一巨大分子である。この高純度は、免疫原性活性化に関する基礎をなす作用機序を詳細に評価するのに必須であるだけでなく、ワクチンの安全性及び薬学的特徴づけに関して重要な進歩も示すものである。
・ 本発明は、一連の異なる架橋戦略を可能にし、ペプチド及びタンパク質並びに他の感受性分子のような脆弱分子の封入も可能にする。
・ 本発明は、親水性並びに疎水性の、及び大きいサイズ範囲にわたる、一連の化合物の封入を可能にする。本発明の粒子は、親水性又は疎水性の活性物質に限定されない。ポリマーマトリックスへのアジュバント及び/又は抗原の架橋は、疎水性及び親水性アジュバント及び抗原の両方がポリマーマトリックスに封入されることを可能にする。
・ 本制御放出粒子の合成手順は、非常に穏やかであり、それにより、抗原及び/又はアジュバントが十分に保護されることを保証しうる。非ラジカル架橋を用い、それにより、感受性アジュバント及び/又は抗原を確保することができる。
・ 抗原は、しばしばタンパク質又はペプチドであり、化学的及び酵素的分解並びに凝集又は沈殿のような物理的変化を受けやすいことがありうる。本発明のワクチン接種用組成物は、抗原の封入をもたらし、それにより、身体への導入後の(酵素)分解からそれらを保護しうる。粒子は、非常に高密度であり、それにより、粒子のコアへの酵素の浸透を抑制し、ひいてはタンパク質性抗原を効果的に保護しうる。
・ 本発明のワクチン組成物は、緻密且つ完全であり、それによりマクロファージ取り込みを制限し、そのため、より多くのDC標的化が可能である。本発明の粒子は、長い血液滞留時間並びに腫瘍及び炎症組織における高い蓄積を示した。
・ 本発明の粒子は、架橋により最初は安定であるが、時を経れば生分解性でもある。安定性は、爆発的な放出を防ぎ、抗原及び/又はアジュバントを循環中により長時間保持し、それにより、より長期間にわたって適切な標的細胞を活性化する可能性を増大させる。時を経ると、抗原及び/又はアジュバントのような封入された化合物は、放出される。更に、本発明の粒子は、小断片に分解する。
・ 本発明のワクチン組成物において、リンカーの種類を適合させ、それにより、(より)長く持続する抗原及び/又はアジュバント曝露を有する粒子を製造することができる。
・ 封入又は表面へのコンジュゲーションにより、本発明のワクチン組成物は、可溶性抗原を有するワクチンよりも免疫応答のための少ない抗原物質を必要としうる。更に、標的物質を表面に結合させて、ワクチン粒子が対象の標的に到達することを保証することができる。
・ 本発明の粒子は、多数の粒子を得るためにGMP適合3工程アプローチにより容易にスケールアップすることができる。
・ 抗原及びアジュバントを異なるリンカーとコンジュゲートさせることが可能である。その結果、アジュバント及び/又は抗原の異なる放出プロファイルが可能である。異なるアジュバント及び/又は抗原に対して異なるリンカーを用いることによっても抗原及び/又はアジュバント上の異なる反応性部分が可能となる。これは、誘導体形成及び/又は精製に対するより高度の制御及びリンカーの特異性をもたらし、より大きい柔軟性を可能にする。
・ 本発明の方法は、非常に柔軟である。本発明の方法は、抗原及び/又はアジュバントの共有結合性コンジュゲーション、更に表面へのさらなる抗原、アジュバント及び/又は標的物質の共有結合性コンジュゲーションを有する粒子の合成を可能にする。
・ 本発明の方法は、非共有結合により封入された抗原、アジュバント及び/又はリガンドを除去するための容易な精製を可能する。その理由は、対象の抗原が共有結合により封入され、したがって、本発明の粒子中で安定であるためである。本発明のワクチン組成物は、極めて制御可能であり、一度に1つのパラメーターの明確な評価を可能にする高いバッチ間再現性により、広く適用可能でもある。これは、製造の最適化並びに治療上の使用の最適化を容易にする。
本発明によれば、ワクチン接種用組成物は、粒子を含む。特に、本発明は、抗原及び/又はアジュバントがポリマー担体又はポリマーデバイス、例えば、ミセル、ナノ粒子、ミクロスフェア、ヒドロゲル及び他の種類のポリマー担体又はワクチン接種用デバイスに好ましくは共有結合により封入、又は他の状態で組み込まれ、又は結合された状態をもたらす。抗原及び/又はアジュバントは、粒子内に共有結合により封入され、且つ/又はポリマーデバイス若しくは担体に結合されている。
好ましい実施形態において、粒子は、制御放出システムであり、徐放、持続、脈動及び遅延放出を含む、すべての種類の制御放出を含みうる。
本発明については、粒子がナノ粒子及び/又はミクロ粒子でありうることを理解すべきである。
一般的に、粒子は、直径により分類される。粗粒子は、10000〜2500ナノメートルの範囲に及ぶ。ミクロ粒子のような、微粒子は、2500〜100ナノメートルのサイズのものである。ナノ粒子のような、超微粒子は、1〜100ナノメートルのサイズのものである。本発明については、ミクロ粒子は、サイズが100〜0.5マイクロメートル、好ましくは50〜1マイクロメートル、より好ましくは25〜0.5マイクロメートル、より好ましくは10〜0.1マイクロメートルの範囲にある。ナノ粒子は、サイズが0.1〜1000ナノメートル、好ましくは1〜500ナノメートル、より好ましくは5〜250ナノメートル、より好ましくは10〜200ナノメートル、より好ましくは30〜150ナノメートルの範囲にありうる。サイズは、標的細胞により取り込まれる能力に影響を及ぼしうる。一般的にウイルスサイズの粒子は、20〜200nmのサイズ範囲にある。
粒子は、通常エンドサイトーシスにより取り込まれ、細胞性免疫応答をもたらすのに対して、500nm〜5μmのサイズを有する粒子は、主として食作用及び/又はマクロピノサイトーシスにより取り込まれ、体液性免疫応答を促進する可能性が高い。特定の細胞は、通常、取り込まれうる粒子の上及び下限のサイズを有する。当業者は、これをどのように調整するかを知っている。或いは、特定の細胞が本発明の粒子を取り込まないことを望む場合、当業者は、これらの細胞の範囲外のサイズを選択することができる。本発明の粒子は、特定の細胞を標的とすることを可能にする所望のサイズに調整することができる。更に、本発明の方法により製造される粒子は、大部分の粒子が所望の粒径を有し、したがって、所望の細胞を標的にしうるように、狭い分布を有する。
好ましい実施形態において、本発明の粒子は、大部分の粒子が同じサイズを有することを意味する、非常に狭い粒径分布を有する。好ましくは、粒子は、0.5未満、より好ましくは0.4未満、より好ましくは0.3未満、より好ましくは0.2未満、最も好ましくは0.1未満、又は更には0.05未満の多分散指数(DPI)を有する。
ミセルのようなナノ粒子状ワクチン組成物は、疾患に対する免疫化のための有望な候補であると考えられる。本発明の粒子は、疎水性及び親水性化合物を含む幅広い種類の抗原及び/又はアジュバントを含みうる。適切な粒子は、国際公開第2010/033022号に記載されている。本発明の粒子及び/又はその実施形態において、抗原及び/又はアジュバントは、最初に水性環境中でポリマー相、とりわけポリマーに富む相に非共有結合により封入され、その後、3次元ポリマーネットワークに共有結合によりコンジュゲートされる。
粒子の形成の工程(ii)において、抗原及び/又はアジュバントは、物理的に、又は非共有結合により封入される。或いは代替法において、抗原及び/又はアジュバントを形成された粒子と混合する工程(iii)において、抗原及び/又はアジュバントは、物理的に、又は非共有結合により封入される。架橋工程において、抗原及び/又はアジュバントは、共有結合により封入され、粒子を、抗原及び/又はアジュバントが粒子の内部に共有結合により封入された状態にさせる。従来技術が、最初に架橋工程を抗原及び/又はアジュバントの非存在下で実施する、システムを開示していることを注意すべきである。本出願の発明において、アジュバント及び/又は抗原は、架橋工程中に存在し、それにより、アジュバント及び/又は抗原をポリマーマトリックスに共有結合により結合させる。また、アジュバント及び/又は抗原を粒子の表面に結合させる場合、アジュバント及び/又は抗原は、粒子のポリマーマトリックスに共有結合により結合される。
ポリマーネットワークにおける抗原及びアジュバントの共有結合性封入の利点は、以下の事項を含む。
・ 爆発的な放出はないが、持続的曝露を示し、それにより投与の頻度を減少させること、
・ 多様な抗原及び/又は多様なアジュバントの封入を可能にする、時を経て十分に調整可能な動力学による抗原及び/又はアジュバントの放出、
・ 異なる放出速度、調整可能な特性を潜在的に有する、複数の種類の抗原及び/又はアジュバントを含むこと、
・ 粒子は、例えば、特定の細胞に能動的に対して標的指向化するためのリガンドのような、標的物質のコンジュゲーションによって表面修飾することができること、
・ 低い多分散指数を有し、生体適合性であり、有害効果を伴わずに身体から除去される無毒性断片に分解する均一且つ制御可能なサイズの粒子、
・ 0.22μmを通してのろ過により容易に滅菌され、凍結乾燥製剤の凍結体としての容易な保存、
・ ペプチド並びに他のより大きい且つ/又は脆弱な分子が可能な抗原及び/又はアジュバントであると言われること。
本発明の粒子及び/又はその実施形態は、最初に抗原及び/又はアジュバントをポリマーと混合し、その後、ポリマーを架橋させて、ポリマーマトリックスを形成させることにより調製される。架橋は、ポリマー並びにそれぞれが重合性部分により誘導体化されたアジュバント及び/又は抗原を用い、フリーラジカルイニシエーターの存在下で行うことができるが、他の種類の共有結合性コンジュゲーションリンカーも可能である。
共有結合により封入され、且つ/又はコンジュゲートされた抗原及び/又はアジュバントを有する粒子は、上で説明したようないくつかの利点を有しうる。得られるワクチン組成物は、治療、治癒又は予防特性を有しうる。本発明の粒子及び/又はその実施形態は、アジュバント及び/又は抗原をそれが必要とされる場所に供給するための調整可能なシステムを提供しうる。更に、粒子は、抗原並びに/又は所望の場所及び/若しくは特定の細胞型に対して標的指向化するためのリガンドのような他の物質により修飾することができる。粒子における抗原及び/又はアジュバントの封入は、これらの化合物を例えば、経口又は皮下投与によるワクチン接種に適するものにしうる。
抗原は、しばしばタンパク質性であり、したがって脆弱である。ポリマーの架橋は、フリーラジカル架橋により行うことができる。フリーラジカル架橋は、抗原に悪影響を与える可能性があり、したがって、好ましくない可能性がある。
ほとんどの非フリーラジカル架橋は、伝播性でなく、1対1反応を構成する。
工程(i)において、ポリマー鎖は、好ましくは互いに相互作用して(下文参照)、水相中でポリマーサブフェーズ(polymer sub phase)を形成する。すなわち、相対的にポリマー鎖に富む及び相対的にポリマー鎖に乏しい相が形成される。好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントは、ポリマー鎖に富む相に存在する。ポリマー鎖に富むサブフェーズにおける抗原及び/又はアジュバントのサブローケーション(sub-location)は、抗原及び/又はアジュバントとポリマー鎖との物理的相互作用に基づいて発生する。
工程(i)において、抗原及び/又はアジュバントは、ポリマー鎖との共有結合性コンジュゲートを形成しない。架橋工程(ii)又は(iii)においてのみ、抗原及び/又はアジュバントとポリマー鎖が一緒に3次元ネットワークを形成する。
抗原及び/又はアジュバントは、ポリマー担体又はデバイスを形成するポリマーの架橋と同時に、好ましくはリンカー分子を介してポリマー担体に共有結合する。工程(ii)又は(iii)で形成される架橋抗原及び/又はアジュバント-ポリマーコンジュゲートは、非架橋ポリマー粒子よりも高い熱力学的安定性を示す。更に、封入された抗原及び/又はアジュバント分子は、ポリマー担体への共有結合のため、急速な放出が妨げられる。
本発明のワクチン組成物は、粒子形成の前に単一ポリマー鎖への抗原及び/又はアジュバントの直接的なカップリングを必要とせず、それにより、温度感受性並びに/又は抗原及び/若しくはアジュバント負荷ミセル形成の容易さのような、用いられるポリマーの初期の特性を完全に保持する。固定型のポリマー、例えば、温度感受性生分解性ブロックコポリマーの使用は、抗原及び/又はアジュバント負荷デバイスの組成の速やか且つ容易な変更/最適化を可能にする広く適用できるプラットフォーム技術を提供する。
本発明のワクチン組成物は、架橋後にポリマー担体を形成することができるポリマー鎖と非共有結合的に相互作用することができるすべての抗原及び/又はアジュバントに適用できる。水性相において、ポリマー鎖(架橋工程の前の)は、好ましくは特定の構造に、又は少なくともポリマー鎖に富むドメインに集合し、抗原及び/又はアジュバントは、これらの集合に局在する。すべての種類の物理的相互作用が可能である(下記参照)。
唯一のさらなる要求事項は、抗原及び/又はアジュバントがポリマー粒子の基礎を形成するポリマー鎖の部分と反応することができる(又は反応性置換基により修飾することができる)部分を含むことである。
好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントは、リンカー分子、好ましくは分解性リンカーを具備している。
ミセルコアのような担体のコアへの抗原及び/又はアジュバントの共有結合性封入により、抗原及び/又はアジュバントは、最初に遊離した状態にならず、「爆発的放出」を示さない。それは、体内の架橋担体の長期の滞留及び/又は血液循環から恩恵を受け、それにより、注射部位における及び/又は血流中の貯留槽としての役割を果たすと同時に、これが標的組織、例えば、腫瘍、リンパ節又は炎症組織における抗原及び/又はアジュバント濃度の上昇をもたらしうる。更に、本発明のワクチン組成物は、これらを凍結乾燥に供することにより長期の製品安定性を獲得しうる。例えば、抗原及び/又はアジュバント負荷粒子を含む本発明によるワクチン組成物は、容易に凍結乾燥し、その後、形態の喪失を伴わずに懸濁することができ、乾燥粉末として、長い貯蔵寿命が得られる。これは、特に開発途上国において、冷蔵を必要とせず、且つ/又は乾燥粉末が好ましい、ワクチン組成物として有利である。
したがって、本発明は、粒子が、水性環境中のポリマー担体における抗原及び/又はアジュバントの非共有結合性封入から出発し、それにより、ポリマー担体のポリマー鎖が少なくとも1つの反応性部分を含む、ワクチン組成物に関する。この非共有結合性封入に、抗原及び/又はアジュバントとポリマー鎖との間、及びポリマー鎖自体の間の同時の架橋反応が続き、それにより、からみ合ったネットワークが形成される。好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバント及び/又は標的リガンドを粒子の表面にコンジュゲートさせるために、さらなるコンジュゲーション工程を行う。
ミセルのような、得られる抗原及び/又はアジュバント負荷ポリマーデバイスは、抗原及び/又はアジュバントの早発放出(爆発的放出)を示さないが、例えば、非経口投与後に注射部位及び/又は血液循環における長期の滞留を示す。好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントは、好ましくはそれぞれがそれ自体の特定の放出速度での封入化合物の適時の持続放出を可能にする適切なリンカーを含む。これは、例えば、(著しく)増強された樹状細胞(DC)標的化及びリンパ節における蓄積、それによる免疫系の活性化をもたらしうる。
好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントは、リンカー、好ましくは分解性リンカー、より好ましくは生分解性リンカーを介してポリマーマトリックスに封入される。そのようなシステムは、抗原及び/又はアジュバントの脈動性又は持続性放出を可能にする。担体からの抗原及び/又はアジュバントの制御放出は、下文で説明し、詳述するように、生理的条件下での抗原及び/又はアジュバントとポリマー担体との間の好ましくは分解性リンカー又は結合基の切断により、或いは局所環境誘因又は外部刺激により達成される。更に、封入は、遊離抗原及び/又はアジュバントの静脈内投与の直後に、或いは非共有結合により封入された抗原及び/又はアジュバントに、さもなければ存在するような毒性高抗原及び/又はアジュバントピークレベルへの血液の曝露を妨げる。より重要なことに、正常組織へのシステムの移動を防ぐことによって、急性毒性作用を減少させることができる。逆に、抗原及び/又はアジュバントは、架橋ミセルコアのような架橋ポリマー担体の形成された3次元ネットワークにおける封入によって環境から十分に保護されており、それにより、早期の分解及び/又はクリアランスが妨げられる。これらの独特の態様により、適切な場所及び時間に、また予想される有効量で抗原及び/又はアジュバントが送達される。
或いは、本発明の好ましい実施形態及びその実施形態において、粒子の表面上の抗原及び/又はアジュバントは、粒子の外表面上に存在することによって免疫系に利用可能であるので、放出される必要がない。
本発明のワクチン組成物の粒子を製造する段階的方法は、2つの必須の連続工程を含む。
第1の工程において、架橋性ポリマーと抗原及び/又はアジュバントとを水性環境中で混合する。これは、好ましくは、場合によって好ましくは水又はエタノールのような低級アルコール、テトラヒドロフラン若しくはジメチルスルホキシド等の水混和性溶媒である適切な溶媒中、抗原及び/又はアジュバントを水性ポリマー溶液又は分散体に加えることによって達成される。ポリマーと抗原及び/又はアジュバントが緊密に接触する、好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントがポリマー鎖と接触するように、存在するポリマー並びに抗原及び/又はアジュバントを選択する。言い換えれば、第1の工程では、ポリマー鎖と抗原及び/又はアジュバントとの物理的な非共有結合性相互作用は、ポリマーデバイスの特定の領域における化合物の選択的局在化をもたらす。
第1の工程の結果として、抗原及び/又はアジュバントを形成する分子は、溶液中のポリマー鎖に且つそれらの間に非共有結合により封入される。本説明及び添付の特許請求の範囲において、「非共有結合性相互作用」という概念は、共有結合性でない相互作用、すなわち、結合が電子対の共有を伴わない原子又は結合間の結合を意味する。非共有結合性相互作用の例は、疎水性、芳香族、水素結合、静電、立体複合体及び金属-イオン相互作用である。
本発明のワクチン組成物の粒子を製造する方法の第2又は第3の必須工程において、第1の工程の後に、非共有結合的に封入された抗原及び/又はアジュバントを新たに形成する/形成されたポリマーネットワークに共有結合させる。すなわち、ポリマー鎖が架橋される、反応を行わせる。これは、分子間及び分子内の両方で起こりうるが、分子間架橋が明らかに好ましく、分子間架橋に有利な工程が現在本出願の特許請求の範囲に記載した方法の好ましい実施形態である。架橋工程と同時に、抗原及び/又はアジュバントの反応性部分もポリマー鎖に共架橋させ、ポリマーと抗原及び/又はアジュバントのからみ合ったネットワークが形成される。適切には、ポリマーは、複数の反応性基を含み、複数の抗原及び/又はアジュバントと反応しうる。好ましい実施形態において、ポリマーは、互いと反応することができる異なる反応性基を含み、それにより、ポリマーと抗原/アジュバントの3次元ネットワークを形成する。2つ以上の異なる反応性基を含むポリマーを用いることができる。更に、異なる反応性基が異なるポリマーに存在しうる。
この工程は、イニシエーター及び/又は触媒を必要としうるが、物理的環境も架橋及びコンジュゲートを形成する反応をもたらしうる。イニシエーター及び/又は触媒が必要である場合、これらは、抗原及び/又はアジュバントと一緒にポリマー溶液に加えることができるが、初期又は後期に反応系に加えることもできる。好ましい実施形態において、イニシエーターは、フリーラジカルでない。フリーラジカルは、抗原及び/又はアジュバントそれ自体と反応し、それにより、それらの特性を変化させうる。これは、チロシン及び/又はトリプトファンのような感受性アミノ酸について特に当てはまる。芳香族側鎖又はスルフヒドリル基は、それにより、フリーラジカルに対してアミノ酸の最も反応性の高い部分であると通常考えられている。
抗原及び/又はアジュバントの適切な量は、ポリマー+抗原及び/又はアジュバントの重量に対して1〜10重量%の量のような0.1〜30重量%、好ましくは0.5〜15重量%の量である。抗原及び/又はアジュバントの組み込みの程度が95〜100%と高いことがありうるので、同様の量が形成された3次元ネットワークに組み込まれうる。
本発明の好ましい方法によれば、両親媒性ポリマーは、溶媒に十分に溶解しうる。
抗原及び/又はアジュバントは、溶媒中に存在していてもよく又は前記ポリマーの溶解後に若しくは緩いミセルへの自己集合の後でさえ加えることができ、抗原及び/又はアジュバントは、ポリマー又はミセル溶液にわたって全体的な分布を形成し、
次いで、このシステムを、ポリマーの少なくとも一部がポリマーの他の部分と異なる挙動を示し、クラスタリングが起こる状況をもたらす特定の環境(例えば、温度、pH、溶媒)の変化にさらすことができ、
抗原及び/又はアジュバントの物理的特性により、これらの抗原及び/又はアジュバントは、新たに形成されたクラスター状のポリマー溶液の特定の領域に局在し、
この局在化の後、架橋が起こって、抗原及び/又はアジュバントをそれらの好ましい領域に固定する。
本発明の方法の好ましい実施形態において、温度感受性ブロックコポリマーを用いる。例えば、抗原及び/又はアジュバントを、非架橋温度感受性ブロックコポリマーも存在する水性環境中、その下限臨界溶液温度(LCST)より低い又はその臨界ミセル形成温度(CMT)より低い温度で混合する。このLCSTより低い温度では、システムは溶液中に存在し、このCMTより低い温度では、ミセル形成は起こらない。しかし、そのようなシステムを加熱することにより、粒子又はミセルが形成され、それにより、抗原及び/又はアジュバントをそれらの疎水性コアに封入する。或いは、抗原及び/又はアジュバントを含まない空のミセルを工程(i)で形成させる。その後、抗原及び/又はアジュバント溶液を空のミセルに加える。次に、LCST又はCMTより高い温度でコアにおけるからみ合ったミセルネットワークを形成する架橋反応も行わせる。この架橋反応は、ポリマー溶液の加熱の前又は非架橋粒子若しくはミセルの形成後に、イニシエーター及び/又は触媒を加えることによって加速させることができる。最初にナノ粒子を形成し、次に架橋反応の前に抗原及び/又はアジュバントを加える方法は、ペプチドに非常に適している可能性がある。
本発明の方法の他の好ましい実施形態及びその実施形態において、ポリマーは、粒子を製造するための過酷な条件を必要としない。適切には、粒子の形成は、抗原及び/又はアジュバントに悪影響を与える可能性がある有機溶媒及び/又は他の化学物質若しくは溶媒を用いない。本発明に用いることができる適切なポリマー鎖は、例えば、温度感受性ブロックコポリマーである。特に、部分的にメタクリル化されたオリゴラクテート単位を有するPEG-b-ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミドオリゴラクテート)に基づくコポリマーが好ましい。他の様々な(メタ)アクリルアミドエステルを用いて、温度感受性ブロック、例えば、HPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)又はHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)のエステル及び好ましくは(オリゴ)乳酸エステル並びにN-(メタ)アクリロイルアミノ酸エステルを構築することができる。好ましい温度感受性ブロックコポリマーは、HPMAm-ラクテートポリマーのように、メタクリレート基により修飾することができる官能基を含むモノマーから得られる。
用いることができる他の種類の機能性温度感受性(コ)ポリマーは、疎水的に修飾されたポリ(N-ヒドロキシアルキル) (メタ)アクリルアミド、反応性官能基(例えば、酸性アクリルアミド及びN-アクリルオキシスクシンイミドのような他の部分)を含むモノマーを有するN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)のコポリマー組成物又はポリ(アルキル)2-オキサザリンの同様のコポリマー等である。
さらなる好ましい温度感受性基は、モノマーを、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン又はスクシンイミド基を含む(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリレートのような反応性官能基を含むモノマーと反応させることができる、NIPAAm及び/又はアルキル-2-オキサキソリンに基づきうる。
適切な温度感受性ポリマーは、米国特許第7,425,581号及び欧州特許出願第776400号に記載されている。
しかし、必ずしも温度感受性でなく、架橋性反応性基を含む又はそれにより修飾することができる他の種類の両親媒性ブロックコポリマー又はイオン性ミセルも用いることができる。そのような場合、直接溶解、透析、塩析及び溶媒蒸発のような最新技術の方法を用いて、粒子及び/又はミセルを形成することができる。
水中のポリマーに富む相に適合し(例えば、疎水性相互作用又はイオン性相互作用により)、反応性部分を含む又は反応性部分を結合させるのに用いることができる部分を含むこれらの他の種類のポリマーは、例えば、PEG-PLA-メタクリレート(例えば、Kimら、Polym. Adv. Technol.、10 (1999)、647〜654頁に詳細に記載されているような)、メタクリル化PLA-PEG-PLA(例えば、Macromol. Biosci. 6 (2006) 846〜854頁においてLeeらにより記載されているような)、メタクリル化PEG-ポリカプロラクトン(例えば、Macromol. Biosci. 9 (2009)、456〜463頁にHuらにより記載されているような)並びにポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸及び/又はポリカプロラクトンに基づく他の反応性部分含有(ブロックコ)ポリマーである。
更に、ポリ(エチレンオキシド)-b-ポリメタクリル酸コポリマー及び二価金属カチオンのブロックイオノマー複合体(例えば、J. Control. Rel. 138 (2009) 197〜204頁にKimらにより及びJ. Control. Rel. 114 (2006) 163〜174頁にBonthaらにより記載されているような)、ポリ(エチレングリコール)及びポリ(アミノ酸)のブロックコポリマーに基づく多イオン性複合体(例えば、Leeら、Angew. Chem 121 (2009) 5413〜4516頁、Nishiyamaら、Cancer Res. 63 (2003)、8977〜8983頁又はMiyataら、J. Control. Rel. 109 (2005) 15〜23頁に教示されているような)のような、イオン性相互作用によりミセルを形成することができるポリマーを用いることができる。
一般的に、適切な溶媒系中で異なるサブフェーズを作ることができるすべてのポリマーは、そのようなサブフェーズ中に選択的に局在化しうる抗原及び/又はアジュバントと一緒に用いることができる。
ポリマー鎖並びに抗原及び/又はアジュバントは、これらの反応性部分を含むか、又は含むように修飾することができる。用いるポリマーは、架橋し、アジュバント及び/又は抗原の反応性基と反応することができる十分に高い数の反応性置換基を含むべきである。例えば、ポリマーのモノマー単位の10〜15%、15〜20%、20〜25%、25〜30%、30〜35%、35〜40%、40〜45%又は45〜50%が反応性置換基を有する場合に適切な結果が得られるが、モノマー単位の最大100%は、反応性置換基により誘導体化することができる。例えば、モノマー単位の50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%は、反応性置換基により誘導体化することができる。またモノマー単位の1〜10%、2〜8%、3〜7%、4〜6%及び2〜5%は、反応性置換基により誘導体化することができる。
またアジュバント及び/又は抗原は、アジュバント/抗原-ポリマーマトリックスが形成されるように好ましくはポリマーに架橋することができる反応性置換基を有する。本発明の好ましい実施形態及びその実施形態において、アジュバント及び/又は抗原は、架橋することができる少なくとも1つの反応性部分又は置換基を有する。好ましくは、2つ、3つ、4つ又は5つのような複数の反応性部分がアジュバント及び/又は抗原に存在する。より大きい分子は、より小さい分子よりも多い反応性部分を有する可能性があり、したがって、反応性部分の量は、アジュバント及び/又は抗原のサイズに主として依存することを理解すべきである。抗原及びアジュバントは、大きい生体分子である可能性があり、したがって、5超、又は10超、又は15超、又は20超、又は25超の反応性部分を含む可能性がある。本発明の文脈では、反応性部分、反応性置換基及び反応性基は、同義で用い、すべて他の分子への架橋及び結合のような作用を示すことができる基を意味する。
抗原及び/又はアジュバントの放出速度は、抗原及び/又はアジュバントに反応性部分をコンジュゲートさせるための異なる種類のリンカーを用いることによって容易に制御することができる。適切な種類の周知の分解性リンカー分子は、エステル、カーボネート、イミン、カルバメート、スクシネート若しくはオルト(オキシム)エステル、ケタール、アセタール、ヒドラゾン及び酵素分解性リンカー(例えば、ペプチド)又はこれらの組合せを含むが、これに限定されない。更に、光/温度/超音波感受性及び他のリンカーのようなすべての種類の周知の刺激感受性リンカーも用いることができる。抗原及び/又はアジュバントを修飾する場合、放出時に、その十分な活性を保証するために、抗原及び/又はアジュバントのみが放出され、他の活性を有する可能性がある誘導体が放出されないようにコンジュゲーションの種類に留意する。生分解性結合を用いることにより、最初の抗原及び/又はアジュバントは、特異的な制御放出プロファイルに従って放出され、その後、その活性及びとりわけその免疫原性又は刺激作用を発揮する。
本発明のワクチン組成物は、封入された抗原及び/又はアジュバントを含むコーティングを有するデバイスのような、制御放出のための封入された又は他の状態で組み込まれた抗原及び/又はアジュバントを含むミセル、ナノ粒子、ミクロスフェア、ヒドロゲルのようなポリマー担体並びに他の種類のポリマー担体又はデバイスである。
述べたように、本発明の方法の第2(又は第3)の必須の工程において、架橋及びコンジュゲーションが実施される。フリーラジカルイニシエーターは、抗原及び/又はアジュバントとともに用いるのに適していない可能性がある。その理由は、それらが抗原及び/又はアジュバント自体と反応し、それによってその特性を変化させる可能性があるからである。したがって、架橋は、フリーラジカルを用いずに行わせることができる。好ましい架橋は、非伝播性であり、例えば、1反応当たり1つの結合のみを形成する。適切な架橋は、マイケル付加によるものでありうる(Censiら、J. Control Rel 148 (2010) e28〜e29頁)。本発明による適切な架橋は、エステル、ヒドラジン、アミド、シッフ塩基、イミン、アセタール結合及びそれらの可能な対応する誘導体を含む類似の生分解性結合からなる群から選択される結合をもたらす架橋である。本発明による適切な架橋は、アルコール、酸、カルボキシル、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン等から選択される反応性部分との架橋である。光重合も適している(Censiら、J. Control Rel 140 (2009) 230〜236頁)。反応性部分は、ポリマー鎖及び/又は抗原及び/又はアジュバント及び/又は結合分子に存在しうる。好ましい実施形態において、リンカー又はポリマーは、複数の結合を形成するために複数の反応性部分を含む。適切な例は、星状構造、例えば、OH含有ポリマー及び/又は抗原及び/又はアジュバントと反応しうる8アームCOOH誘導体化PEGである。ラジカルを用いなければ、感受性化合物を保護しながら高密度の3次元ネットワークが形成されうる。
好ましい実施形態において、抗原及び/又はアジュバントの完全性を保護するために、反応条件は、かなり温和であり、水性環境で行われる。好ましくは架橋は、生分解性結合をもたらす。
アジュバント及び/又は抗原が分解性リンカーを介して封入される場合、治療効果のある化合物の持続的放出が保証される。担体からの抗原及び/又はアジュバントの制御放出は、下文で説明し、詳述するように生理的条件下でのアジュバント及び/又は抗原のような有効成分とポリマー担体との間の好ましくは分解性リンカー又は結合基の切断により、或いは局所環境誘因又は外部刺激により達成される。分解性リンカーの適切な例は、参照により組み込まれる、国際公開第2012/039602号に見いだすことができる。
そのようなリンカーは、以下の式により例示することができる。
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
式中、
- n及びmは、0〜20、好ましくは1〜10の整数であり、好ましい実施形態において、nは、1〜5、より好ましくは1〜3の整数であり、mは、1〜7、より好ましくは1〜5の整数であり、
- R1及びR2は、互いに独立に孤立電子対、=Oのような酸素部分、=N-Rxのような窒素部分から選択され、Rxは、原子の均一又は不均一基であり、好ましくは独立に直鎖状又は分枝状C1〜C6アルキル、直鎖状又は分枝状C1〜C6アルケニル(ここで、アルキル又はアルケニル基は、1つ若しくは複数のハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基により場合によって置換されていてもよい)、或いは芳香族基、好ましくはアルキル及びアルケニル基について述べた1つ又は複数の置換基により場合によって置換されたフェニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は、1つ又は2つのC1〜C3アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基であり、
- Aは、コンジュゲーション(conjunction)部分であり、
- Qは、直接結合、C=O、C=NH又はC=NRp基(Rpは、C1〜C3アルキルである)である。この式において、HO-Q基は、HR9N-Q基(R9は、水素原子又はC1〜C3アルキル基でありうる)により置き換え可能である。
以下の好ましいリンカーの式において、HO-Q基は、カルボン酸基であり、コンジュゲーション部分Aは、重合性メタクリレートであり、その部分は、下文における実施例においても例示されている。
Figure 0006464103
上記の例は、限定的なものでなく、例えば、メタクリレート基は、本明細書で述べたようなあらゆる重合性基で置換されていてもよいことを理解すべきである。適切なコンジュゲーション基は、式-PL-RvC=CRuRwの重合性部分であり、式中、-PL-は、-O-、-NH-、置換-N-のような結合基であり、置換基は、C1〜C3アルキル、-O-C(O)-、-O-(C(O))r-C6H26-であり、rは、0又は1であり、bは、1〜6の整数であり、Ru、Rv及びRwは、独立に水素原子又はC1〜C3基を表す。
好ましい実施形態において、さらなる工程は、粒子の外表面への1つ又は複数の化合物のコンジュゲーションを含む。コンジュゲーション工程において、アジュバント、抗原及び/又は標的化合物をポリマーの反応性部分にコンジュゲートさせる。適切には、ポリマーは、架橋工程の後にアジュバント、抗原及び/又は標的化合物と相互作用しうる反応性部分を含む。好ましい実施形態において、ポリマーの末端は、適切に誘導体化することができる抗原、アジュバント及び/又は標的化合物と相互作用しうる反応性部分を含む。ポリマーの末端の反応性部分は、さらなる機能性を用いながら、ポリマーの物理化学的特性が不変であることを保証する。表面が更に修飾されていない粒子については、ポリマーは、末端にメトキシのような非/反応性部分を有する。適切なポリマーは、X-PEG-b-HPMAmLacxであり、Xは、(Y誘導体化)化合物と相互作用し、安定又は生分解性結合をもたらしうる反応性部分でありうる。後者は、化合物の使用の種類に依存する。すなわち、その生物活性がコンジュゲーションにより負の影響を受ける場合には、それは、生分解性結合を必要とするのに対して、インターナライジングリガンドについては、全粒子の完全な細胞内取り込みを保証するために安定な結合が必要である。
好ましい実施形態において、X-ポリマーの百分率は、0〜100%、好ましい状況において0〜50%、より好ましくは0〜20%であり、表面にコンジュゲートさせることができる反応性部分の%に対する十分な対照(control)である。
このようにして、粒子は、抗原及び/又はアジュバントを封入するだけでなく、所望の種類の免疫応答を誘発するために必要である抗原提示細胞(APC)に対して粒子を実際に標的指向化する。好ましい実施形態において、粒子の表面上のアジュバント、抗原及び/又は標的化合物は、リンカー、好ましくは分解性リンカーとともに利用される。粒子の内部に適合せず、且つ/又は粒子の内部に封入されるのに適さない、大きい抗原及び/又はアジュバントについては、粒子の表面上のコンジュゲーションが非常に適している。核酸については、好ましくは分解性リンカーを介する、外表面へのコンジュゲーションが非常に適している。
好ましい実施形態において、標的化合物を粒子の表面にコンジュゲートさせる。標的化合物は、樹状細胞(DC)を適切に標的にしうる。ヒトDCは、ヒト白血病抗原(HLA)DR(主要組織適合遺伝子複合体クラスII)の過剰発現により同定される。更に、骨髄DCを同定するための特異的マーカーは、CD11c+、CD1a+、BDCA-1+、BDCA-3+、HLA-DR+を含むのに対して、形質細胞様DCについては、それらは、CD11c-、HLADR+、BDCA-2+及びCD123+である。好ましい実施形態において、標的化合物は、CD11、CD1a、BDCA-1、BDCA-3、HLA-DR、BDCA-2及びCD123、トル様受容体(TLR)、C型レクチン受容体(CLR)並びにノッド様受容体(NLR)に結合する又は結合することができる。適切な標的化合物をtable 1(表1)に示す。
Figure 0006464103
更に、がんワクチン接種用の適切な標的化合物は、マンノース/マンナン、各免疫グロブリンクラスのFc受容体に対するリガンド、CD11c/CD18及びDEC205受容体標的、DC-SIGN受容体標的からなる群から選択することができる。当業者は、所望の標的細胞に対する適切な標的化合物をよく知っており、所望の標的化合物を選択することができる。本発明の文脈において、標的リガンド、標的物質、標的化合物又は標的基は、同義で用い、すべて特定の細胞又は特定の組織を標的とすることができる化合物を意味する。
好ましい実施形態において、抗原は、ペプチド又はタンパク質(の一部)である。本発明によれば、ペプチドは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸のポリマーである。それらは、タンパク質におけるものと同じペプチド結合を有するが、一般的に長さがより短い。最も短いペプチドは、単一ペプチド結合により結合された2つのアミノ酸からなるジペプチドである。本発明によれば、ペプチドは、最大1000アミノ酸長、例えば、10〜500アミノ酸、好ましくは12〜450アミノ酸、より好ましくは15〜400アミノ酸、より好ましくは17〜375アミノ酸、より好ましくは20〜350アミノ酸、より好ましくは22〜300アミノ酸、より好ましくは25〜250アミノ酸、より好ましくは27〜225アミノ酸、より好ましくは30〜200アミノ酸、より好ましくは33〜175アミノ酸、より好ましくは35〜150アミノ酸、より好ましくは37〜150アミノ酸、より好ましくは40〜125アミノ酸、より好ましくは45〜100アミノ酸、より好ましくは50〜85アミノ酸、より好ましくは55〜75アミノ酸、最も好ましくは60〜70アミノ酸でありうる。適切なペプチドは、3〜100アミノ酸、より好ましくは3〜90アミノ酸、より好ましくは3〜80アミノ酸、最も好ましくは3〜70アミノ酸を含む。ペプチドは、環状ペプチドでない限り、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する。ポリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、本発明によるペプチドという用語のもとに思い描かれることを理解すべきである。
抗原及びアジュバントの混合物を本発明による粒子に封入することができることを理解すべきである。好ましくは、抗原及び/又はアジュバントは、本明細書で上述したポリマーのポリマー鎖と物理的非共有結合的に相互作用する傾向があるような性質であるべきである。好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは温度感受性ポリマーを用いた疎水性化合物のカプセル封入に特に有用である。
ナノ粒子ベースのワクチンは、生ウイルスワクチンの免疫原性を反復し、おそらく持続性抗原-アジュバント複合体の結果として、長期持続性保護をもたらしうる。
本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態において、抗原は、あらゆる抗原でありうる。抗原が核酸である場合、抗原は、好ましくは粒子の表面にコンジュゲートされている。好ましい実施形態において、抗原は、化学物質、毒素のような細菌排泄物、LPS、バクテリオファージ、マイコバクテリア抗原、オボアルブミン、ウイルス又はそれらの任意の部分の群から選択することができる。適切には、抗原は、細菌、ウイルス、バクテリオファージ及び/又はマイコバクテリアの表面タンパク質又はその一部である。適切な例は、ジフテリアトキソイド、ジフテリアCRM-197、ヒト乳頭腫ウイルス、マラリアウイルス抗原、西ナイルウイルス、(組換え)A又はB型肝炎(表面又はコア抗原)、サイトメガロウイルス、HIV、炭疽、狂犬病、カンジダ症、インフルエンザ(種々の型)、例えば、血球凝集素のようなサブユニット、及びノイラミニダーゼ又は結核、例えば、Ad35ベクター結核(TB)AERAS-402からの抗原である。当業者は、ワクチンの種類及び投与経路に基づいて適切な抗原を選択することができる。
本発明の好ましい実施形態及び/又はその実施形態において、粒子は、複数の抗原を含みうる。同じ疾患病原体の複数の抗原を用いることができ、且つ/又は異なる疾患病原体の抗原を、例えば、マルチワクチンのために用いることができる。
本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、好ましくはアジュバントを含む。公知のアジュバントは、細菌毒素、微粒子、植物派生物及び病原体関連分子パターン(PAMP)等の多岐にわたる一連の非常に多様な化合物である。可能なアジュバントに関する有用なデータベースは、Vaxjoであり、http://www.violinet.org/に見いだすことができる。Vaxjoデータベースは、参照により本明細書に組み込まれる。
アジュバントの適切な例は、酸化コバルト、水酸化アルミニウム水和物、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、不活性化乾燥マイコバクテリア(通常ヒト型結核菌(M. tuberculosis))(フロイントアジュバントの一部)、CT:コレラ毒素;CTB:コレラ毒素のBサブユニットを含む、LT:大腸菌(Escherichia coli)易熱性毒素、イミキモド、Montanide(商標)ISA51を含むモンタナイド、MF59(商標): 高HLB(ポリソルベート80)及び低HLB界面活性剤(トリオレイン酸ソルビタン)の混合物により好都合に安定化された、160nm小滴の形で分散した、スクアレン油、AS02(商標):スクアレン及び2つの疎水性免疫アジュバント、MPS1TM、LPSの合成誘導体及びQS-21、精製サポニン植物エキスからなる群から選択することができる。好ましいアジュバントは、ミョーバン(水酸化アルミニウム)、スクアレン又はMF59である。
本発明の好ましい実施形態及び/又はその実施形態において、粒子は、複数のアジュバントを含みうる。
本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、治療及び/又は予防の目的のために適切に用いることができる。使用分野の例は、腫瘍学、結核、細菌感染、ジフテリア、B型肝炎、インフルエンザ、HIV、HCV、フラビウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルスでありうる。あらゆる種類の適応が可能でありうること、また本発明が上で示した例に限定されないことが理解される。
適切には、本発明及び/又はその実施形態は、予防的なワクチン組成物の使用に関する。適切には、本発明は、疾患に対する免疫化のための本発明のワクチン組成物の使用及び/又はその実施形態を対象とする。
更に、本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、医薬用である。好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、疾患治療用である。本発明はまた、本発明のワクチン組成物を用いる且つ/又は対象に投与する治療の方法に関する。
好ましい実施形態において、疾患は、がん、感染、眼科疾患、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、マイコプラズマ感染(mucoplasma infection)、寄生虫感染、炎症、皮膚科疾患、心血管疾患、中枢神経系の疾患、自己免疫疾患、増殖性疾患、関節炎、精神病、乾癬、糖尿病、代謝障害、肺病、呼吸器疾患、肺疾患、COPD、筋骨格系の疾患、気腫、浮腫、ホルモン疾患からなる群から選択される。より具体的には、本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、脊髄損傷、心臓発作、虚血、関節炎、真菌感染、術後疼痛、疼痛、非小細胞肺がん(又はがん-小細胞肺、膀胱、非ホジキンリンパ腫、消化管一般、結腸直腸、頭頸部、乳、固形一般)、急性リンパ球性及び急性骨髄性白血病、乳がん、脳がん、白血病一般、肝臓がん、膵臓がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、リンパ腫一般、卵巣がん、扁平上皮がん、肺がん一般、膵がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、小細胞肺がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、食道がん、副腎がん、黒色腫、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、皮膚、膀胱、頭頸部、非小細胞肺、食道、卵巣、黒色腫、平滑筋肉腫、胆管、乳、前立腺一般、全身性紅斑性狼瘡、中皮腫及び/又は肉腫一般からなる群から選択される疾患を含むが、これらに限定されない疾患の治療に適する。
更に、本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、眼の疾患、感染症、炎症性疾患、がん、心血管疾患、中枢神経系の疾患、自己免疫疾患及び/又は尿崩症、多尿症、多飲症、術後疼痛等の他の疾患及び/又は脊髄損傷からなる群から選択される疾患を含むが、これらに限定されない疾患の治療に適する。
感染症は、グラム陰性菌感染を含む細菌感染、皮膚の感染及び/又は真菌感染を含む群から選択することができる。
炎症性疾患は、関節リウマチ、I型糖尿病、II型糖尿病、虫垂炎、滑液包炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、髄膜炎、静脈炎、鼻炎、腱炎、扁桃炎及び/又は血管炎を含む群から選択することができる。
がんは、ホルモン感受性前立腺がん、ホルモン感受性乳がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、消化管がん一般、結腸直腸がん、頭頸部がん、乳がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、乳がん、脳がん、白血病、肝臓がん、精巣がん、小細胞肺癌腫、卵巣がん、子宮頸がん、扁平上皮がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、食道がん、副腎がん、黒色腫、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、皮膚がん、平滑筋肉腫、前立腺がん、全身性紅斑性狼瘡、中皮腫及び/又は肉腫を含む群から選択することができる。
眼の疾患は、黄斑変性、急性術後眼内炎、黄斑浮腫及び/又は白内障を含む群から選択することができる。
心血管疾患は、血管収縮、冠動脈性心疾患、虚血性心疾患、冠動脈疾患、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、心律動異常、炎症性心疾患、心内膜炎、炎症性心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、卒中及び脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧症及び/又はアテローム動脈硬化症を含む群から選択することができる。
中枢神経系の疾患は、脳炎、急性脊髄前角炎、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化症のような神経変性疾患、多発性硬化症又は急性散在性脳脊髄炎のような自己免疫及び炎症性疾患並びにクラッペ病、ハンチントン病のような遺伝性疾患、及び/又は副腎白質ジストロフィーを含む群から選択することができる。
自己免疫疾患は、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮側索硬化症、強直性脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、抗ARS抗体症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性末梢神経症、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じん麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロ疾患/バロ短縮性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッケンスタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性再発性多病巣性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素病、補体成分2欠乏症、接触皮膚炎、頭蓋動脈炎、CREST症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破壊性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、1型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、ドレスラー症候群、薬物誘発性狼瘡、円板状紅斑性狼瘡、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型寒冷グロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化線維異形成、線維化性肺胞隔炎(又は特発性肺線維症)、胃炎、消化管類天疱瘡、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン-バレー症候群(GBS)、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、ヒューズ-ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(自己免疫性血小板減少性紫斑病参照)、IgA腎症、封入体性筋炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート-イートン筋無力性症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状IgA病(LAD)、ルーゲーリック病(別名筋萎縮性側索硬化症)、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、紅斑性狼瘡、マジュード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミラー-フィッシャー症候群、ギラン-バレー症候群参照、混合型結合組織病、斑状強皮症、ムッハ-ハーバーマン病、別名急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー[46][47]、視神経脊髄炎(別名デビック病)、神経ミオトニア、眼類天疱瘡、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、オルド(Ord's)甲状腺炎、回帰性リウマチ、PANDAS(連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害)、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、パリーロンベルグ症候群、パーソネージ-ターナー症候群、扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、真性赤血球系無形成症、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群APSの他の形、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、若年性関節リウマチ参照、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スザック症候群、スイート症候群、シディナム舞踏病PANDAS参照、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡参照、高安動脈炎、側頭動脈炎(別名「巨細胞動脈炎」)、血小板減少症、トローザ-ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎(特発性炎症性腸疾患「IBD」の2つの型の1つ)、混合性結合組織病と異なる未分類結合組織病、未分類脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、白斑及び/又はヴェーゲナー肉芽腫症を含む群から選択することができる。
他の疾患は、尿崩症、多尿症及び/又は多飲症、掻痒、術後疼痛及び/又は対麻痺を含む脊髄損傷を含む群から選択することができる。
本発明のワクチン組成物及び/又はその実施形態は、いくつかの投与経路について適切に用いることができる。適切な経路は、非経口、静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)、筋肉内、リンパ管内、腹腔内、口腔及び舌下を含む経口、鼻内及び肺のような粘膜送達、経皮(dermal)、例えば、局所、経皮(transdermal)、経皮(transcutaneous)である。
明瞭且つ簡潔な記述の目的のために、特徴は、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書で述べるが、本発明の範囲が、述べた特徴のすべて又は一部の組合せを有する実施形態を含みうることが理解されよう。
実験データ:
実施例として、本発明の方法の特定の実施形態の形成を述べる。実施例は、本発明に限定されると理解すべきではない。
ロイプロリドは架橋ナノ粒子に共有結合により封入される
この実施例では、部分メタクリル化オリゴラクテート単位を有する温度感受性PEG-b-ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクテート)に基づくコポリマーから開始する。ロイプロリドを、分解性リンカーであるスルホキシドメタクリレートに結合している反応性部分(国際公開第2012/039602号におけるL2)により誘導体化する。その後、前記温度感受性ブロックコポリマーの水溶液をポリマーCMTを下回る、すなわち、ミセル形成を可能にしない温度、すなわち、0℃でテトラヒドロフラン中ロイプロリドの少量の濃溶液(一般的に10:1容積比)と混合する。次いで、イニシエーター/触媒溶液(過硫酸カリウム(KPS)-N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED))を加え、その後直ちに臨界ミセル形成温度(CMT)より高い、すなわち、20℃に急速加熱する。これにより、ロイプロリドが疎水性コアに非共有結合的に局在化している単分散性ポリマーミセル(サイズが約70nm、PDIが0.2未満)の形成がもたらされる。ミセル形成の後に、窒素雰囲気を作る。それにより、イニシエーターラジカルは、メタクリル化ポリマー及び反応性部分を有する重合性ロイプロリドの重合を誘導する。この架橋プロセスが、からみ合ったネットワークを形成し、ミセルのサイズ又は均一性に影響を及ぼすことなく、ロイプロリドをミセルコア内部に共有結合により固定する。
それにより、ロイプロリドは、架橋ミセルに共有結合により封入される。ロイプロリドは、加水分解により放出され、ミセルは、非修飾オリゴラクテート単位の(部分的)加水分解の後に水和により生理的環境中で膨潤する。したがって、ロイプロリドの放出とミセルの分解は、並行して起こる。この開裂は、局所環境誘因又は外部刺激の結果でもありうる。
本発明の組成物及び/又は方法は、ミセルを形成しうるポリマーの使用に限定されない。それは、非共有結合性封入及びその後のポリマーナノ粒子、ミクロスフェア、ヒドロゲル又はコーティングにおける(薬物)分子の共有結合性架橋も可能にするものである。
抗原及び/又はアジュバント負荷粒子を含む本発明のワクチン組成物は、特定の細胞及び/又は適応、例えば、治療又はワクチン接種目的の持続放出用の粘液付着粒子(鼻、肺又は消化管、ウイルス様粒子を用いたワクチン接種の場合)、抗原及び/又はアジュバント負荷ナノ粒子の持続放出を標的とするための抗原及び/又はアジュバント負荷ナノ粒子の合理的設計を保証する柔軟なシステムである。
ロイプロリド及び分解性リンカー
ロイプロリドは、ペプチドであり、かなり親水性の化合物である。制御放出は、以下の用いるリンカーの種類に依存する。
Figure 0006464103
粒子は、L1を分解性リンカーとして用いることを除いて、実施例1で示した通りに製造する。Xは、ロイプロリドであり、R=Sであるのに対して、L2(実施例1)においてはR=SOである。国際公開第2012/039602号も参照のこと。安全性をモニターするためにラットの体重及び行動を評価する。
図1は、ロイプロリドの経時的放出を示し、リンカーを介した放出の持続可能性を示している。
図2は、PKプロファイル、全身曝露後の持続放出、用量反応曲線を示す。
データは、健常ラットへのi.v.投与後に得られる。安全性をモニターするためにラットの体重及び行動を評価する。
オクトレオチドはミセルナノ粒子に共有結合により封入される
オクトレオチドを含む架橋ミセルは、実施例1又は2のロイプロリドを含む架橋ミセルと同じ方法で製造する。データは、健常ラットへのi.v.投与後に得られる。安全性をモニターするためにラットの体重及び行動を評価する。オクトレオチドの経時的放出並びにPKプロファイル、全身曝露後の持続放出、用量反応曲線を測定する。
エキゼナチドはミセルナノ粒子に共有結合により封入される
39アミノ酸ペプチドであるエキゼナチドを含む架橋ミセルは、実施例1又は2のロイプロリドを含む架橋ミセルと同じ方法で製造する。エキゼナチドのリシン部分への生分解性リンカーのコンジュゲーションは、アミン反応性リンカーを介して起こる。64nmの平均サイズを有し、0.03のPDIを有する粒子を得た。エキゼナチドの放出は、生理的条件下でin vitroで測定した。エキゼナチドは、4日にわたって放出された。
DC標的細胞(例えば、樹状細胞)への抗原及びアジュバントの同時の送達
工程:
アジュバント及び抗原をL1又はL2のような同じリンカーにより誘導体化する。誘導体化アジュバント及び抗原を部分メタクリル化オリゴラクテート単位を有する温度感受性ポリマーPEG-b-ポリ(N-ヒドキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクテート)と混合し、実施例1で述べたのと本質的に同様に架橋ミセルを製造する。アジュバント及び抗原は、両方がナノ粒子のコアの内部に共有結合により封入される。
ナノ粒子をビバスピン又は接線流ろ過により精製して、非コンジュゲートアジュバント及び/又は抗原を除去し、1種類のみの溶液中ナノ粒子を得る。
ナノ粒子は、健常ラットにおけるi.v.投与により動物モデルで試験する。実施例2も参照のこと。経時的放出及びPKプロファイルを試験する。対照を用いる。安全性をモニターするためにラットの体重及び行動を評価する。抗体力価を測定する。
調整可能な粒径
本発明の粒子は、小さいもの(少なくとも30nmに至るまで)及び最大80nmのものと、非常に制御された方法で製造することができる。すべての場合において、これらの粒子は、低い多分散性(すなわち、0.2より低い)を有する。
温度感受性ブロックとしてのHPMAmDPx(HPMAmDP1とHPMAm2との理論比は53:47%)及び親水性ブロックとしてのmPEG5000を含むブロックコポリマーは、以前に記載された(Biomaterials 28 2007) 5581〜5593頁)のと本質的に同様にマクロイニシエーターとしての(mPEG5000)2-ABCPAを用いてフリーラジカル重合により製造した。手短に述べると、出発物質(モノマーとマクロイニシエーター、様々な比率(mol/mol)のものを調製した)の濃度は、気密ガラスバイアル中アセトニトリル中300mg/mLであった。溶液を窒素で少なくとも10分間フラッシュし、70℃に加熱し、24時間撹拌した。次に、過剰のジエチルエーテルに溶液を1滴ずつ加えることにより、ポリマーを沈殿させた。遠心分離後、残留物を真空オーブン中で乾燥した。その後、ポリマーを水に溶解し、水に対して少なくとも24時間透析し(12〜14kDaのカットオフを有する膜)、凍結乾燥により回収した。
その後、以前にも述べたように、メタクリル酸無水物とラクテート側鎖の末端ヒドロキシル基との反応によりメタクリレート基をmPEG-b-p((HPMAmDP1)-co-(HPMAmDP2))の温度感受性ブロックの部分にカップリングさせた。
得られたポリマー長は、異なるモノマー:イニシエーター比を用いることによって非常によく制御され、ひいては図3にプロットされているように粒径が決定された。

Claims (33)

  1. アジュバント及び/又は抗原を組み込むポリマーマトリックス含む粒子を含むワクチン接種用組成物であって、粒子が、
    (i)反応性部分を含む抗原及び/又はアジュバントを、アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間で相互に架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体と混合する工程と、
    (ii)この混合物を、ポリマーが粒子に自己集合し、抗原及び/又はアジュバントがミセルのコアにカプセル封入される条件に供する工程と、
    (iii)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程であって、架橋反応がポリマー鎖自体の間で生じ、かつ架橋反応がアジュバント及び/又は抗原とポリマー鎖との間で生じる工程
    を含む方法により得られ、工程(iii)において架橋がフリーラジカルイニシエーターを用いずに行われ、且つ/又は架橋が非伝播性である、ワクチン接種用組成物。
  2. 抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物を製造する方法であって、
    (i)反応性部分を含む抗原及び/又はアジュバントを、アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間で相互に架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体と混合する工程と、
    (ii)この混合物を、ポリマーが粒子に自己集合し、抗原及び/又はアジュバントがミセルのコアにカプセル封入される条件に供する工程と、
    (iii)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程であって、架橋反応がポリマー鎖自体の間で生じ、かつ架橋反応がアジュバント及び/又は抗原とポリマー鎖との間で生じる工程と
    を含み、工程(iii)において架橋がフリーラジカルイニシエーターを用いずに行われ、且つ/又は架橋が非伝播性である、方法。
  3. 抗原及び/又はアジュバントを含む粒子を含むワクチン接種用組成物を製造する方法であって、
    (i)アジュバント及び/又は抗原の反応性部分と反応することができる少なくとも1つの反応性部分を含み、更に分子内又は分子間で相互に架橋することができるポリマー鎖を含む水溶液又は水性分散体を準備する工程と、
    (ii)前記水溶液又は水性分散体をポリマーが粒子に自己集合する条件に供する工程と、
    (iii)抗原及び/又はアジュバントが粒子にカプセル封入されるように工程(ii)からの粒子をアジュバント及び/又は抗原を含む水溶液と混合する工程と、
    (iv)ポリマーマトリックスの形成と同時にアジュバント及び/又は抗原がこのポリマーマトリックスに、すなわち、形成されたポリマーネットワークに封入されるような条件下で工程(iii)からの粒子混合物を架橋に供して、ポリマーマトリックスを形成する工程であって、架橋反応がポリマー鎖自体の間で生じ、かつ架橋反応がアジュバント及び/又は抗原とポリマー鎖との間で生じる工程と
    を含み、工程(iv)において架橋がフリーラジカルイニシエーターを用いずに行われ、且つ/又は架橋が非伝播性である、方法。
  4. 架橋がジスルフィド、エステル、ヒドラジン、アミド、シッフ塩基、イミン、アセタール結合及びそれらの対応する誘導体を含む類似の生分解性結合からなる群から選択される結合をそれにより形成する反応である、請求項1に記載の組成物。
  5. 粒子の表面を標的物質及び/又はアジュバント及び/又は抗原とコンジュゲートさせる工程を更に含む、請求項1若しくは4に記載の組成物。
  6. 工程(i)におけるポリマー鎖が連続水性相におけるポリマー鎖に富む相を形成する、請求項1、4若しくは5に記載の組成物。
  7. アジュバント及び/又は抗原が水性相と比べてポリマー相においてより高濃度で存在し、好ましくはポリマー相に本質的に存在する、請求項1及び4から6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. ポリマー鎖が温度感受性ポリマー鎖である、請求項1及び4から7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. アジュバント及び/又は抗原を、非架橋ポリマー鎖も最初に存在する水性環境中で、下限臨界溶液温度(LCST)より低い温度で混合し、その後に工程(ii)をLCSTより高い温度で行う、又は臨界ミセル形成温度(CMT)より低い温度で混合し、その後に工程(ii)をCMTより高い温度で行う、請求項1及び4から8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 温度感受性ポリマー鎖がN-ヒドロキシアルキル(メタ)アクリルアミド又はN-(メタ)アクリロイルアミノ酸の疎水的に修飾されたエステルに基づく(コ)ポリマーから選択される、請求項8又は9に記載の組成物。
  11. ポリマー鎖がHPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)又はHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)の(オリゴ)乳酸エステルを含む、N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクテートの(コ)ポリマー並びにN-(メタ)アクリロイルアミノ酸エステル、N-イソプロピルアクリルアミド及び/又はアルキル-2-オキサザリン、ポリ乳酸(PLA)-メタクリレート、メタクリレート化PLA-PEG-PLAならびにメタクリレート化PEG-ポリカプロラクトンから選択される官能基を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記温度感受性ポリマーに基づくポリマーを形成するミセル、ヒドロゲル、ミクロ粒子及び/又はコーティングを用いる、請求項7から11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. ポリマーがPEGを含むジ又はトリブロックコポリマーである、請求項1及び4から12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. ポリマー鎖及び/又はアジュバント及び/又は抗原がアルコール、酸、アミン、カルボキシル、ヒドロキシル又はヒドラジンからなる群から選択される反応性部分を含む、請求項1及び4から13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記反応性部分が分解性結合を介して抗原及び/又はアジュバントにカップリングしている、請求項1及び4から14のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 分解性結合が
    HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
    であり、式中、
    - n及びmは、0〜20、好ましくは1〜10の整数であり、好ましい実施形態において、nは、1〜5、より好ましくは1〜3の整数であり、mは、1〜7、より好ましくは1〜5の整数であり、
    - R1及びR2は、互いに独立に孤立電子対、=Oのような酸素部分、=N-Rxのような窒素部分から選択され、Rxは、原子の均一又は不均一基であり、好ましくは独立に直鎖状又は分枝状C1〜C6アルキル、直鎖状又は分枝状C1〜C6アルケニル (ここで、アルキル又はアルケニル基は、1つ若しくは複数のハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基により場合によって置換されていてもよい)、或いは芳香族基、好ましくはアルキル及びアルケニル基について述べた1つ又は複数の置換基により場合によって置換されたフェニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は、1つ又は2つのC1〜C3アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基であり、
    - Aは、コンジュゲーション部分であり、
    - Qは、直接結合、C=O、C=NH又はC=NRp基(Rpは、C1〜C3アルキルである)であり、
    HO-Q基が、HR9N-Q基、(R9は、水素原子又はC1〜C3アルキル基でありうる)により置き換え可能である、請求項15に記載の組成物。
  17. 粒子が0.5未満、より好ましくは0.4未満、より好ましくは0.3未満、より好ましくは0.2未満、最も好ましくは0.1未満、又は更には0.05未満の多分散指数(DPI)を有する、請求項1及び4から16のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 医薬用の、請求項1及び4から17のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 予防的な使用のための、請求項1及び4から17のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 架橋がジスルフィド、エステル、ヒドラジン、アミド、シッフ塩基、イミン、アセタール結合及びそれらの対応する誘導体を含む類似の生分解性結合からなる群から選択される結合をそれにより形成する反応である、請求項2又は3に記載の方法。
  21. 粒子の表面を標的物質及び/又はアジュバント及び/又は抗原とコンジュゲートさせる工程を更に含む、請求項2、3及び20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程(i)におけるポリマー鎖が連続水性相におけるポリマー鎖に富む相を形成する、請求項2、3、20及び21のいずれか一項に記載の方法。
  23. アジュバント及び/又は抗原が水性相と比べてポリマー相においてより高濃度で存在し、好ましくはポリマー相に本質的に存在する、請求項2、3及び20から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. ポリマー鎖が温度感受性ポリマー鎖である、請求項2、3及び20から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. アジュバント及び/又は抗原を、非架橋ポリマー鎖も最初に存在する水性環境中で、下限臨界溶液温度(LCST)より低い温度で混合し、その後に工程(ii)をLCSTより高い温度で行う、又は臨界ミセル形成温度(CMT)より低い温度で混合し、その後に工程(ii)をCMTより高い温度で行う、請求項2、3及び20から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 温度感受性ポリマー鎖がN-ヒドロキシアルキル(メタ)アクリルアミド又はN-(メタ)アクリロイルアミノ酸の疎水的に修飾されたエステルに基づく(コ)ポリマーから選択される、請求項24又は25に記載の方法。
  27. ポリマー鎖がHPMAm(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)又はHEMAm(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)の(オリゴ)乳酸エステルを含む、N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクテートの(コ)ポリマー並びにN-(メタ)アクリロイルアミノ酸エステル、N-イソプロピルアクリルアミド及び/又はアルキル-2-オキサザリン、ポリ乳酸(PLA)-メタクリレート、メタクリレート化PLA-PEG-PLAならびにメタクリレート化PEG-ポリカプロラクトンから選択される官能基を含む、請求項2、3及び20から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記温度感受性ポリマーに基づくポリマーを形成するミセル、ヒドロゲル、ミクロ粒子及び/又はコーティングを用いる、請求項2、3及び20から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. ポリマーがPEGを含むジ又はトリブロックコポリマーである、請求項2、3及び20から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. ポリマー鎖及び/又はアジュバント及び/又は抗原がアルコール、酸、アミン、カルボキシル、ヒドロキシル又はヒドラジンからなる群から選択される反応性部分を含む、請求項2、3及び20から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記反応性部分が分解性結合を介して抗原及び/又はアジュバントにカップリングしている、請求項2、3及び20から30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 分解性結合が
    HOQ-(C n H 2n )-S(R 1 )(R 2 )-(C m H 2m )-CH 2 -A
    であり、式中、
    - n及びmは、0〜20、好ましくは1〜10の整数であり、好ましい実施形態において、nは、1〜5、より好ましくは1〜3の整数であり、mは、1〜7、より好ましくは1〜5の整数であり、
    - R 1 及びR 2 は、互いに独立に孤立電子対、=Oのような酸素部分、=N-R x のような窒素部分から選択され、R x は、原子の均一又は不均一基であり、好ましくは独立に直鎖状又は分枝状C 1 〜C 6 アルキル、直鎖状又は分枝状C 1 〜C 6 アルケニル (ここで、アルキル又はアルケニル基は、1つ若しくは複数のハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基により場合によって置換されていてもよい)、或いは芳香族基、好ましくはアルキル及びアルケニル基について述べた1つ又は複数の置換基により場合によって置換されたフェニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は、1つ又は2つのC 1 〜C 3 アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基であり、
    - Aは、コンジュゲーション部分であり、
    - Qは、直接結合、C=O、C=NH又はC=NR p 基(R p は、C 1 〜C 3 アルキルである)であり、
    HO-Q基が、HR 9 N-Q基、(R 9 は、水素原子又はC 1 〜C 3 アルキル基でありうる)により置き換え可能である、請求項31に記載の方法。
  33. 粒子が0.5未満、より好ましくは0.4未満、より好ましくは0.3未満、より好ましくは0.2未満、最も好ましくは0.1未満、又は更には0.05未満の多分散指数(DPI)を有する、請求項2、3及び20から32のいずれか一項に記載の方法。
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