CN103209710B - 用于药物递送系统中组分的短暂连接的可调的、可生物降解的接头分子以及利用其制备的药物递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特定种类的可生物降解接头，其确保构建单元（building？block）和/或生物活性化合物在药物递送系统（DDS）例如基于聚合物微团（微胶粒）或水凝胶的DDS内的短暂稳定结合。另外，本发明涉及包含所述接头的化合物，这样的化合物优选为前药。而且，本发明涉及所述接头，尤其是所述可生物降解接头在药物递送系统中的应用。此外，本发明涉及包含能够释放活性成分的聚合物基质的受控释放系统，以及合成这些接头和制备这样的受控释放系统的方法，其中该活性成分通过所述接头共价结合于该聚合物基质的聚合物分子。

Description

用于药物递送系统中组分的短暂连接的可调的、可生物降解的接头分子以及利用其制备的药物递送系统
技术领域
本发明涉及一种特定种类的可生物降解接头，其确保构建单元(buildingblock)和/或生物活性组分在药物递送系统(DDS)(例如基于聚合物微团(微胶粒，micelles)或水凝胶的DDS)内的短暂稳定结合。此外，本发明涉及包含所述接头的化合物，这样的化合物优选是前药。此外，本发明涉及所述接头的制备方法和所述接头在药物递送系统中的应用，尤其是所述可生物降解的接头。而且，本发明涉及包含能够释放活性成分的聚合物基质的受控释放系统以及制备这样的受控释放系统的方法，其中该活性成分通过所述接头共价连接于该聚合物基质的聚合物分子。
背景技术
生物活性化合物向患者的递送经常受限于溶解度差、快速清除、高毒性的发生或它们的组合。通过将活性化合物包封(夹带，捕获)于适合的药物递送系统中能够缓解这些问题。
DDS(如聚合物微团和水凝胶体系)被认为是药物或其他适合的生物活性化合物的靶向递送的有前途的候选物。例如，基于可生物降解的热敏感聚羟丙基甲基丙烯酰胺乳酸酯或聚羟乙基甲基丙烯酰胺乳酸酯的聚合物微团能够包封大量的疏水性治疗化合物。在例如WO-01/09198和WO-2005/087825中描述了这样的体系。尤其是，以WO-2005/087825为例详细描述了基于疏水改性的PEG-聚甲基丙烯酰胺嵌段共聚物微团。在这两篇国际申请公开文本中描述的聚合物表现出温度敏感性和可生物降解性的独特组合，其分别为由其制备的递送系统提供了容易的载药性能和受控释放性能。
目前在对于选择性靶向疾病位点的药物载体系统的研究中探讨了这些和各种其他的优选纳米级颗粒。这种靶向递送的目的在于改善治疗效力并同时减少包封化合物的毒性反应曲线(toxicityprofile)。
不希望受限于特定理论，认为本发明的药物载体系统的类型在血流中形成长的循环系统并以受控方式释放其中存在的活性成分是必要的或至少是合乎需要的。也就是说，对于(在一次应用之后)使得活性成分的治疗水平在一段较长的时间内超过利用无活性成分时可达到水平的贮存系统(depotsystem)存在需要。这样的系统在释放可调时是重大优势，例如取决于活性成分的类型、释放速率和具体的(医学)适应症。
在疾病或病症与囊泡不规则有关或伴有囊泡不规则的情况下，长循环有可能会导致药物递送系统和活性成分从其释放占用的时间增加。鉴于此，应注意炎症和肿瘤生长期间的渗漏的血管和功能障碍的淋巴引流(lymphaticdrainage)提供了例如在静脉内给药后用于进入纳米颗粒的通路。这种所谓的高通透和滞留(enhancedpermeationandretention，EPR)效应使得累积的纳米载体能够在患病细胞附近释放药物。这种策略的关键方面在于纳米载体的长循环半衰期使得溢出的统计学概率增加。
所需的长循环特性能够例如通过纳米颗粒的致密亲水涂层以防止宿主免疫系统的清除来实现。在这方面，涂覆有聚乙二醇(PEG)涂层的脂质体被认为是黄金标准(goldenstandard)，因为其能够显示出8-12小时的循环半衰期以及在患病区域内可达5％-10％的注射剂量累积。
显然，当包封的药物分子相关联地存在直至载体到达靶位点时，只能实现靶区域中的药物浓度增加。在对药物载体系统的所述研究中，发现所评估的该系统能够在长循环时间内得到改善并且通过活性成分共价结合于该递送系统而在例如肿瘤组织中累积。
尤其是，Rijcken等人在Biomaterials2007,28,5581-5593中的标题为“可水解的核交联热敏聚合物微团：合成、表征和体内研究(Hydrolysablecore-crosslinkedthermosensitivepolymericmicelles:synthesis,characterisationandinvivostudies)”的文章中描述了已经证明了交联(例如微团核中的疏水改性的PEG-聚甲基丙烯酰胺嵌段共聚物的共价结合)实现了在小鼠静脉内给药后的长血液循环。另外，还发现空的交联微团在肿瘤组织中累积的程度比非交联微团要高6倍。
然而，这些交联微团核中药物化合物的非共价包封不能防止在注射后药物分子的立即迅速释放。在WO-2010/033022中，通过微团核中药物分子的共价包封得以证明，该药物能够真正地受益于延长的循环，由此使得肿瘤组织中的药物浓度升高。尤其是，在静脉内模型的情况下发现了升高25倍的药物浓度数据。
发明内容
本发明对这些已知系统进行了改进(例如下文中举例说明的紫杉醇(PTX)和地塞米松(DMS)；然而需要强调的是，本发明可用于包括药物的各种活性成分，并且因此可用于治疗所有种类的疾病和适应症)。这样的系统可利用任意种类的已知技术来应用，例如静脉内给药或灌注。这将确保例如聚合物微团和水凝胶的靶组织选择性得到改善。
具体而言，药物已被及时释放以使得其能够发挥其治疗作用。通过利用可生物降解连接，原来的药物分子会根据具体的受控释放曲线被释放。本发明旨在静脉内给予DDS，例如微团递送运载体，其随后在血液循环中保持较长时间并且在这些生理学条件(pH7.4)下根据预定速率释放包封的药物。因此，需要开发在生理学条件下在例如24-48小时内水解从而以受控方式释放原来的药物化合物的新型共价药物接头。这种可调性(tuneablility)需要药物(或另外的生物活性物质)、接头和/或聚合物化学连接的可调性。而且，药物递送系统中使用的分子自身需要是安全的并且不会引起短期或长期的毒性问题。
本发明涉及一种新型的可生物降解接头，其能够确保构建单元(buildingblock)和/或生物活性化合物在药物递送系统(DDS，例如聚合物微团或水凝胶)内的短暂稳定结合。在本文的描述中，“构建单元”是用于(半-)组装至药物递送系统内的组分，其为天然来源或合成来源，有可能(部分地)衍生具有反应性部分。公知的实例包括脂质、胆固醇、各种可能的聚合物(例如PLGA、PLA、壳聚糖)。在本文的描述中，“生物活性化合物”为天然来源或合成来源的化合物，其能够在体内发挥预防和/或治疗作用，并且被用于使体内的特定器官/通路可视化，或二者的组合。
尤其是，在第一方面，本发明涉及一种接头，包含(i)含OH部分，优选为羟基或羧酸部分，或含NH部分例如氨基或取代的NH基，其中该取代基为C1-C3烷基；(ii)二烷基化的硫原子；以及(iii)结合部分。这些接头在生理学条件下是可生物降解的。
更具体地，这些接头的一个重要特征是包封的(捕获的)化合物或药物递送系统组分的键接随后发生水解，从而导致该化合物释放和/或DDS去稳定化。可通过改变接头的类型来调整相应的水解动力学。
在一种优选的实施方式中，该接头包含含OH部分例如羧酸、衍生的二烷基化硫原子和结合部分。这样的接头能够通过下式举例说明：
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A，
-其中，n和m为0至20的整数，并且优选为1至10。在优选的实施方式中，n为1-5的整数，更优选为1-3的整数；并且m为1-7的整数；更优选为1-5的整数；
-其中R1和R2彼此独立地选自孤电子对；氧部分如＝O；氮部分如＝N-Rx，其中Rx为原子的相同(均质)的或不相同(非均质)的基团，并且优选独立地为直链或支链C1-C6烷基，直链或支链C1-C6烯基，其中烷基或烯基可以可选地被一个或多个卤素基团、羟基、氨基或取代的氨基、羧酸基团、硝基或氰基取代；或芳香族基团，并且优选苯基，其可选地被一个或多个针对烷基和烯基所提到的取代基取代；或卤素基团，羟基，氨基，或取代的氨基(取代基为一个或两个C1-C3烷基)，羧酸基团，硝基，或氰基；
-其中A为结合部分；并且
-其中Q为直接键合、C＝O、C＝NH或C＝NRp基团，其中Rp为C1-C3烷基。在该式中，HO-Q基团可被HR9N-Q基团替代，其中R9可以为氢原子或C1-C3烷基。
在下式中，HO-Q基团为羧酸基团并且连接部分A为可聚合的甲基丙烯酸酯，该部分也可以如下示出的工作实例为例：
适合的结合基团为式–PL-RvC＝CRuRw的可聚合部分，其中–PL-为连接基团，如–O-、–NH–、取代的–N–，取代基为C1-C3烷基、–O-C(O)–、–O–(C(O))r-C6H26-，其中r为0或1，b为1至6的整数；Ru、Rv和Rw独立地代表氢原子或C1-C3基团。
通过包封的前药在交联步骤中经由可生物降解接头共价固定于微团核而避免了药物或其他生物活性组分从交联微团中的过早释放。为了实现微团核的交联后聚合物网络中的前药的共价结合以及受控释放，例如利用各种水解敏感性接头将可聚合的甲基丙烯酸酯基团连接于该药物。专门设计水解敏感性接头以能够精细调节药物从微团中的释放速率。更具体地，将甲基丙烯酸羟乙酯经由硫化物(DMSL1)、亚砜(DMSL2)和砜(DMSL3)酯结合于该药物分子，例如模型药物DMS，其易于改性并具有已被证实的抗肿瘤作用。硫原子的氧化程度的提高使其吸电子特性增加并从而使得附近酯键的水解速率增加。因此，我们发现这些接头不仅可生物降解而且还为本发明带来了较大的灵活性。
换言之，硫原子的衍生类型具有显著的影响。尤其是，我们发现能够获得硫的不同氧化状态并且可将其用于通过酯的羰基原子的电子密度增加或降低来初步确定附近酯的稳定性。重要的是，硫原子的衍生类型使得进一步的精细调整作用或失稳作用成为可能。此外，含有少于两个自由电子对的含硫接头有可能是手性的。典型的实例包括但不限于下表中所示出的：
在该表中，R3-R4独立地为氢原子、C1-C3烷基或具有一般推电子(斥电子，electronpushing)或给电子性质的其他部分，例如卤素取代基如氟取代基或炔部分。而且，(衍生的)硫原子在接头中相对于羧酸部分的位置(在本文上述化学式中被标示为n)和(衍生的)硫原子在接头中相对于结合部分A的位置(在本文上述化学式中被标示为m)能够被用于影响接头的可生物降解性和活性成分的释放。
上文中提到的这些所指出的变量不需要每次进行酯键形成的化学优化设计，而是可以使用药物/构建单元的单一结合方法来形成接头分子。本发明的基于二烷基化的硫的接头有可能在酯键、醚键或酰胺键附近进一步衍生有吸电子或给电子部分以用于受控药物递送的目的，其能够被用于通过附近的硫衍生物而影响所述键的水解敏感性的激活(失活)；其能够适应(tailor)所述键的水解敏感性以用于受控药物递送目的；并且就水解速率而言覆盖较宽的时间跨度。
在优选的实施方式中，本发明涉及包含所述接头的化合物，该街头通过其COOH基团偶联于地塞米松或紫杉醇。可替代地，该接头可含有(伯或仲)OH部分而药物含有COOH部分。然而，本发明不限于这些活性化合物；待包封的生物活性化合物的类型包括但不限于药物分子例如(糖)皮质激素型或化学静态(化学稳定，恒化，chemostatic)型、肽/蛋白、成像剂、遗传物质或它们的组合。
在第二方面，本发明涉及根据所述第一方面的化合物作为接头，尤其是作为可生物降解接头在药物递送系统中的应用。尤其是，这些化合物被用作可生物降解接头，其中该接头在生理学条件下是可生物降解的。“生理学条件”是指待用本发明的DDS进行治疗的有机体内存在的条件，对于人类而言，这些条件包括pH为约7.4且温度为约37℃。该接头存在于载体分子和活性成分之间；也就是说，该活性成分共价结合于基质材料并因此成为核交联系统的一部分。适合的活性成分为药物分子，例如(糖)皮质激素型或化学静态(化学稳定，chemostatic)型、肽/蛋白、成像剂、遗传物质或它们的组合。在该应用的一种优选实施方式中，该药物递送系统释放作为活性成分的地塞米松或紫杉醇。
为了利用本发明的接头分子合成和形成包含并释放活性成分的DDS，在构建单元和/或生物活性化合物上需要具有可用的功能性部分以使得能够结合于接头。本领域技术人员基于他们所具有的公知化学知识能够选择构建单元或生物活性化合物上的该功能性、反应性部分并且其可以是例如伯醇或仲醇或者伯胺或仲胺或者COOH基团。在一种优选的实施方式中，其为伯醇或仲醇、或者COOH基团。
在随后的步骤中，引发接头的羧酸部分和例如构建单元或生物活性化合物的醇部分之间的结合，从而形成酯键，其结合由以下的反应方案举例说明：
在该方案中，X可以为例如H或CH3而R1和R2具有上文中给出的含义。优选地，R1和R2不同时为H。
作为本发明的进一步的方面，上述一般连接导致获得了前药或经改性(修饰)的构建单元。
随后(逐步地)该前药或经改性的构建单元包封在DDS中并结合于DDS。这种类型的结合包括但不限于缩合反应(例如羧酸和醇部分)、(自由基)聚合反应、点击反应(clickreaction)以及将(衍生的)接头连接于聚合系统的类似方式。根据本发明的进一步的方面，所形成的键以可调速率被及时水解，如本文下文中详细描述的。
药物、构建单元或生物活性剂和递送系统组分的构建单元均能够经由上述类型的接头彼此共价连接。
这些步骤与形成WO-2010/033022的发明的方法是一致的，其中提供了本发明的DDS的详细制备方法，该文献通过引用的方式结合于本文作为参考。
因此，在两步过程中将本发明的可聚合药物或前药结合至DDS的核(如微团)中。首先，在例如微团形成后将疏水药物结合物物理地捕获于疏水核中。第二步，通过自由基聚合在该微团核中使聚合物交联并同时在新形成的缠结网络中使药物(前药)共聚。根据本发明，当装载容量为10％(w/w最终药物浓度/聚合物浓度)时获得较高的前药包封效率(95％)。正如通过动态光散射(dynamiclightscattering)所观察到的，所得到的微团是尺寸为约60-90nm的单分散性(多分散性指数小于0.1)微团。
因此，本发明的进一步的方面为包含聚合物基质的受控释放系统，其能够释放活性成分，其中该活性成分通过本发明的接头共价连接于该聚合物基质的聚合物分子。
本发明类型的接头的应用不限于能够形成微团的聚合物的应用：如本领域技术人员已知的，其还能够使得药物(分子)可生物降解包封于聚合纳米颗粒、微球、水凝胶或涂层或类似的DDS中。
对于这些(载药)递送系统的应用，非限制性实例为(i)在体内给药(例如通过口服施加、在血流中注射或通过直接注射至器官或肿瘤中)后捕获在(交联)微团中的(药物)分子的受控释放；(ii)在静脉内给药(纳米凝胶)或在局部给药(大粒凝胶)后，捕获在(交联的)聚合水凝胶中的药物和/或蛋白的受控释放；和(iii)在用捕获的药物分子涂覆装置后，(药物)分子的受控释放。
在又进一步的方面，本发明涉及用于制备本发明接头的方法。在该方面的第一种实施方式中，使溴乙酸烷基酯(alkylbromoacetate)与巯基醇反应；所得到的醇随后与A-Cl反应，其中A为连接部分；并且除去(劈开，splitting)烷基。
在一种进一步的实施方式中，所获得的产物进一步被氧化，例如利用高碘酸钠。
在又一种实施方式中，使溴乙酸烷基酯与巯基醇反应，之后完全氧化硫原子，使得到的醇与A-Cl反应，其中A为结合部分并除去烷基。
这些方法均在实施例1中示出。
本发明的又一方面是一种制备这样的受控释放系统的方法，包括以下步骤：提供具有功能性部分以使得能够结合于接头的构建单元和/或生物活性化合物，该功能性部分优选为伯醇或仲醇或COOH；引发含-OH或含-NH部分之间的结合，如接头的羧酸部分和构建单元或生物活性化合物的所述功能性部分，从而形成前药或经改性(修饰)的构建单元；以及捕获至所述前药或经改性(修饰)的构建单元的聚合物基质中并与其结合。
由于所形成的连接(键)存在于聚合物基质和活性成分(药物、构建单元)之间，例如酯连接(酯键)，因此所形成的受控释放系统经历受控降解和释放。尤其是，该连接(键)(尤其是酯连接(酯键))在生理学条件下及时发生水解。
如上文中粗略描述的，本发明的一个重要方面是接头中的可水解基团附近的部分如酯基团(取代基)阻碍或促进了(酯)水解。从分子层面来说，该取代基为硫原子，其能够分别定位于接近或进一步来源于可水解连接(键)(通过上文中所示化学式中n的含义来反映)以降低或增加(酯)稳定性，并且其进一步通过用吸电子部分衍生而激活或通过用给电子部分衍生而失活。换言之，所述取代基的选择和位置使得能够实际上精细调节所需的水解速率。实践结果为(原始)药物分子的释放和/或DDS的崩解根据通过取代基的类型和位置来实际控制的速率发生。
本发明的构思将通过(但不限于)基于可生物降解的热敏性聚羟丙基甲基丙烯酰胺乳酸酯或聚羟乙基甲基丙酰胺乳酸酯聚合微团来举例说明。为了确保长循环和肿瘤累积，这些微团为核交联的。为了限制在将其引入到待治疗机体内(例如通过注射到机体内，如通过静脉内给药和/或以增加靶组织的敏感性)之后包封药物的快速消失，使用本发明的接头。
这种类型的聚合微团能够包封大量的(轻微)疏水性治疗化合物。在下文中，将使用地塞米松(DMS)和紫杉醇(PTX)作为示例性活性化合物。
示出了新型的DMS前药和PTX前药能够共价结合于交联微团的网络并显示出在体外实际受控释放(数天至数周之间)。
与用于游离药物的0.09小时和用于非共价包封的DMS的0.12小时相比，其在14小时的循环中具有非常长的半衰期，这表明前药与CCL微团的共价连接阻止了在血流中的过早突然释放。循环半衰期甚至显然长于立体化学稳定的脂质体中的磷酸地塞米松(MSN-P)(例如7.6小时)，其被认为是目前的金标准。因此，共交联的前药提供了显著增强的肿瘤累积(比游离药物高23倍)。通过与游离DSM-P相比，在皮下黑素瘤生长中的类似延迟证明了治疗效力。
尤其是，开发了基于可生物降解聚合物的聚合微团，其为衍生有低聚乳酸盐/酯侧链的热敏性聚(N-羟基烷基甲基丙烯酰胺)。这些具有热敏性嵌段和PEG-嵌段的嵌段共聚物在0℃是完全可溶于水的，而在加热至高于可调的相转变温度后能够迅速自组装为～70nm的小的单分散性微团。这种方法被应用于包封大量的疏水性药物，几乎全部的药物都被定量包封在微团核中。
如上文所述，这样的微团的稳定性已通过在利用可聚合的甲基丙烯酸酯基团改性热敏性嵌段之后嵌段共聚物的共价交联而得到增强。所得到的核交联微团显示出优异的体外稳定性同时完全保留了其可生物降解性。更重要的是，交联微团对于在小鼠中实现长血液循环(半衰期为13小时)以及高的持续的肿瘤累积是至关重要的。
本发明避免了在静脉内给予载药微团后由于微团的快速离解和/或药物的突然释放导致的过快清除。尤其是，通过共价包含的一系列可聚合DMS或PTX前药显示出地塞米松和紫杉醇的释放速率分别受到了实际控制。此外，这种负载有前药的微团复合物具有真正的长血液循环(t1/2～14h)，获得了显著延长的治疗水平期间，并且所述复合物能够在小鼠中高效率地靶向于皮下肿瘤组织。
根据本发明，当药物或其他疏水性化合物经由可生物降解接头被固定在微团内部时，这些物质显示出受益于核交联微团的增强的肿瘤累积。这种共价结合产生不会发生突然释放的真正的肿瘤靶向载体系统。当在小鼠中使用时，本发明明确地证明了对于肿瘤消退以及在风湿性关节炎小鼠模型中的治疗效力。
如本文上文中所述，可以通过将新型接头中的可水解(酯)键的敏感性调整为水解降解来控制释放速率。所使用的接头的准确类型将决定最终的受控释放曲线从而释放原始的活性化合物。
另外这种策略被广泛应用于含羟基-、-COOH和-NH的生物活性化合物。
长循环交联微团的可生物降解特性本身确保了其崩解为能够经由肾脏清除而除去的小片段。与作为纳米颗粒药物载体的黄金标准的脂质体相比，本发明的这种药物递送系统使得：
(i)延长的血液循环-贮存，其导致延长的血液/组织水平，例如泰素(紫杉醇注射液)6小时，PTXLx(本发明)可达60小时；以及
(ii)利用渗漏脉管系统在组织中较高累积，例如肿瘤和炎性组织。在毛细管渗透性增加位置处的被动累积使得微团平台期的适用性增加。
本发明的另一个有吸引力的性质是对于大量的疏水性化合物的几乎全部定量包封(quantitativeencapsulation)效率。
本发明不限于聚合微团。其他已知类型的药物递送运载体如聚合物-药物结合物也能够受益于本发明。合成适合的聚合物-药物结合物以及将其捕获在可能的药物递送系统的范围内包括在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的聚合微团起到实际载体的作用，起具有持续释放曲线、增强的组织累积和包埋的(embedded)受控释放机制。除了选择性药物递送之外，这开辟了实现机理研究以解决病理生理学环境和/或抗癌剂或消炎剂的药物间相互作用通路的顺序的许多可能性。
本发明的受控释放系统适合用于治疗包括但不限于选自以下构成的组中的疾病：癌症、感染、眼科疾病、病毒性感染、细菌性感染、真菌性感染、支原体(mucoplasma)感染、寄生虫感染、发炎、皮肤病、心血管疾病、中枢神经系统疾病、自身免疫疾病、增生性疾病、关节炎、精神病、银屑病、糖尿病、代谢紊乱、肺病、呼吸疾病、肺部疾病、COPD、肌肉骨骼系统疾病、气肿、浮肿、激素性疾病。本发明的受控释放系统还适用于麻醉剂的递送、用于治疗性或预防性接种疫苗。
在以下的工作实施例中，使用了以下的物质：
放射性同位素标记的3H-乙酸酐和14C-乙酸酐分别为Amersham(Roosendaal,荷兰)和PerkinElmer(Boston,USA)的产品。UltimaGold液体闪烁液(liquidscintillationcocktail)和可溶性组织增溶剂购自PerkinElmerBioscienceBV(Groningen,荷兰)。使用的地塞米松(>98％)、氘化水(D2O)和三氟乙酸(TFA)获自SigmaAldrich(Zwijndrecht,荷兰)。磷酸地塞米松(DMS-P)购自Bufa,Uitgeest，荷兰。过氧化氢和过硫酸钾(KPS)均获自Merck(KGaA,Darmstadt,德国)。使用如所述获得的紫杉醇(PTX,MPBiomedicalsInc,Illkirch,France)、泰素(Taxol，紫杉醇注射液)(MaynePharma,布鲁塞尔,比利时)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED,FlukaChemieAG,Buchs,瑞士)、乙腈(ACN,BiosolveLtd.,Valkenswaard,荷兰)。用pH5的缓冲液(乙酸铵,120mM)以1:1稀释获自BioradLaboratories(Hercules,USA)的十二烷基硫酸钠(SDS)的20％溶液。在使用前将全部缓冲液通过0.2μm过滤器过滤(Schleicher&SchuellMicroScienceGmbH,Dassel,德国)。
此外，在工作实施例中，用动态光散射(DLS)利用MalvernALV/CGS-3角度计来确定微团的平均粒径(Z平均)和多分散性指数(PD)。用Gemini300MHz谱仪(VarianAssociatesInc.,NMRInstruments,PaloAlto,CA,USA)来记录1H-NMR谱。在UltimaGold液体闪烁液中测定微团分散的放射性，并在PackardTricarb2200CA液体闪烁计数器中计数。
附图说明
图1是来自不同前药CCLPM的DMS释放曲线，其清楚地示出了DMS的释放速率取决于所使用的接头有很大差异。
图2示出了在37℃下在缓冲液pH7.4中负载PTX前药的HEMAmCCLPM的释放动力学。
图3示出负载PTXL2前药的HEMAm和HPMAmCCLPM在pH7.4缓冲液中在37℃下的PTX释放动力学。
图4示出了在多次(间隔3天)静脉内给予B16F10肿瘤荷瘤小鼠后，在HPMAm微团中共交联的DMSL2的相对肿瘤生长速率(左侧)和动物存活(右侧)。
图5示出了向其膝关节具有胶原抗体诱导的关节炎的小鼠单次静脉内注射10mgDMS/kg、作为游离药物或作为DMSL3(CD102)；作为安慰剂，向健康的无患病关节的小鼠静脉内注射盐水作为对照的实验结果。
图6a和图6b中示出了对应于释放的紫杉醇的曲线。以12.5mg/kg的剂量向小鼠静脉内给予PTXL1、PTXL2和PTXL3微团作为PTX(3只动物/取样时间)。作为对照，也给予泰素(紫杉醇注射液)和阿伯利斯(白蛋白型紫杉醇，Abraxane)作为对照。
图6c示出血液形态，其是当也需要保存捕获紫杉醇的微团时，在PTXL3的情况下观察到的。
图7示出健康大鼠在静脉内注射PTXL2微团后观察到的图案。
具体实施方式
实施例1-本发明接头的合成
根据以下途径合成本文上文中表格中举例说明的药物接头L1、L2和L3：
具体而言，对于L1，实施以下步骤：
2-(2-羟乙基硫)乙酸叔丁基酯(2)：在氮气氛下溴代乙酸叔丁基酯1(15g,0.077mol,1当量)和三乙胺(16g,0.16mol,2当量)溶解于CH2Cl2(100mL)中并冷却至0℃。将2-巯基乙醇(6.3g,0.081mol,1.05当量)缓慢加入到混合物中并将反应混合物温热至室温。再搅拌反应混合物1小时。通过TLC(乙酸乙酯(EtOAc):己烷(Hex),1:1(v/v),Rf:0.88)监测反应完成。分别用1MKCO3,pH10和1MNaOAcpH3.5进行碱提萃取和酸萃取两次。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥并通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。在真空下浓缩(CH2Cl2)滤液，得到9.2g(产率为62％)化合物2，其为无色油状物。
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)3.7(q,2H),3.18(s,2H),2.8(d,2H),1.47(s,9H)；1H-NMR(DMSO):δ(ppm)4.77(s,OH),3.52(s,2H),3.19(s,2H),2.62(t,2H),1.39(s,9H)
甲基丙烯酸2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基硫)乙基酯(3)：在氮气氛下在冰上将化合物2(8.6g,0.045mol,1当量)和三乙胺(9.05g,0.089mol,2当量)溶解于CH2Cl2(20mL)中。向混合物中缓慢加入甲基丙烯酰氯(5.6g,0.054mol,1.2当量)。将反应混合物温热至室温并搅拌2小时。通过TLC(EtOAc:Hex,1:1(v/v),Rf:0.86)确认反应完成。利用甲醇形成甲基丙烯酸甲酯以除去过量的甲基丙烯酰氯。用pH＝8的饱和NaHCO3溶液萃取化合物3两次。用盐水洗涤合并的有机层并用MgSO4干燥，通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。在真空下浓缩滤液。分别用EtOAc、Hex(己烷)和CH2Cl2进行共溶剂蒸发以除去挥发性杂质。获得10.5g(产率为90％)化合物3，其为黄色油状物。
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)6.12(s,H),5.58(s,H),4.34(t,2H),3.18(s,2H),2.93(t,2H),1.94(s,3H),1.47(s,9H)；13C-NMR(CDCl3):δ(ppm)18.5(CH3),28.2(CH3),31.0(CH2),35.1(CH2),63.5(CH2),81.9(CH2),126.1(C),136.3(C),167.3(C),169.6(C)
2-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基硫)乙酸(4):在氮气氛下在冰上将化合物3(2g,7.7mmol,1当量)缓慢溶解于三氟乙酸(TFA)(10mL)中。向反应混合物中加入痕量的对苯二甲酚单甲醚(对甲氧酚，MEHQ)以防止聚合。使反应混合物温热至室温并在55℃下搅拌该反应混合物2小时。通过TLC(CHCl3/MeOH/HOAc,9:1:0.1(v/v),Rf:0.17)监测反应完成。通过蒸发和与CH2Cl2共蒸发除去过量的TFA，并在硅胶柱(Hex/EtOAc,4:1(v/v))上纯化残余物。用MgSO4干燥纯的化合物4并通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。在真空下浓缩滤液。得到1g(产率为63％)化合物4，其为浅黄色油状物。
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)6.13(s,1H),5.59(s,1H),3.65(t,2H),3.34(s,2H),2.96(t,2H),1.95(s,3H)；1H-NMR(DMSO):δ(ppm)6.02(s,1H),5.67(s,1H),4.24(t,2H),3.3(s,2H),2.85(t,2H),1.86(s,3H)；13C-NMR(DMSO):δ(ppm)23.36(CH3),35.69(CH2),38.73(CH2),68.68(CH2),131.3(CH2),141.1(C),171.9(C),176.8(C)
对于L2，实施以下步骤：
2-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基亚磺酰基)乙酸(5):将乙腈(ACN)(10mL)中的化合物4(1g,4,9mmol,1当量)与溶解于H2O(10mL)中的高碘酸钠溶液(1.1g,4.9mmol,1当量)混合。在室温下搅拌反应混合物过夜。通过TLC(CHCl3/MeOH/TFA,75:25:0.1(v/v),Rf:0.23)确认反应完成。经由抽吸过滤过滤反应混合物以通过EtOAc除去碘酸钠盐，并用MgSO4干燥，通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。在真空下浓缩滤液并与CH2Cl2共蒸发。得到0.87g(产率为81％)化合物5，其为白色固体。
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)6.15(s,1H),5.64(s,1H),4.58(m,2H),3.9(d,1H),3.7(d,1H),3.39(m,2H),1.94(s,3H)；1H-NMR(DMSO):δ(ppm)6.04(s,1H),5.70(s,1H),4.4(m,2H),3.95(d,1H),3.74(d,H),3.17(m,2H),1.87(s,3H)；13C-NMR(DMSO):δ(ppm)23.34(CH3),55.38(CH2),61.67(CH2),62.83(CH2),131.78(CH2),140.96(C),171.64(C),172.93(C)
对于L3，实施以下步骤：
2-(2-羟乙基磺酰基)乙酸叔丁基酯(6)：将化合物2(2.0g,10.4mmol,1当量)溶解于ACN(20mL)和CCl4(20mL)中。向反应混合物中加入30mL水中的NaIO4(6.7g,31mmol,3当量)溶液并剧烈搅拌。一次加入RuCl3(43mg,0.21mmol,0.02当量)，两相混合成为乳液。然后将反应混合物加热至35℃并搅拌过夜。利用TLC(EtOAc/Hex,3:2,Rf值:6:0.16,2:0.53)监测反应。反应完成后，用醚(100mL)稀释反应混合物，剧烈搅拌15分钟，用MgSO4干燥并通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。用醚(3×30mL)洗涤残余物并在通风橱中在真空下浓缩滤液。之后在硅胶柱(EtOAc/Hex,3:2(v/v))上纯化。得到1.15g(产率为50％)化合物6，其为黄色油状物。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)5.17(s,OH),4.22(s,2H),3.80(t,2H),3.37(t,2H),1.42(s,9H)
甲基丙烯酸2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基磺酰基)乙基酯(7)：在氮气氛下将纯的化合物6(1g,4.6mmol,1当量)溶解于干燥的二氯甲烷(DCM)(10mL)。在冰上以如下顺序将三乙胺(0.93g,9.2mmol,2当量)和甲基丙烯酰氯(0.57g,5.5mmol,1.2当量)加入到反应混合物中。将反应混合物温热至室温并搅拌3小时。通过TLC(EtOAc/Hex,3:2(v/v),Rf值:7:0.69,6:0.27)确认反应完成。利用甲醇形成甲基丙烯酸甲酯以除去过量的甲基丙烯酰氯。进行两次碱萃取(NaHCO3,pH8)。用MgSO4干燥反应混合物并通过185mm的华特门(whatman)滤纸过滤。在真空下浓缩滤液。在硅胶柱(100％EtOAc)上纯化滤液。得到1.15g(产率为86％)化合物7，其为橙色油状物。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)6.06(s,1H),5.71(s,1H),4.48(t,2H),4.29(s,2H),3.69(t,2H),1.87(s,3H),1.42(s,9H)
2-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磺酰基)乙酸(8)：在氮气氛下将纯的化合物7(1.2g,3.9mmol)溶解于TFA(15mL)。向混合物中加入痕量的MEHQ并在55℃下搅拌反应3小时。通过TLC(EtOAc/Hex/TFA:60:40:0.1％(v/v),Rf:0.38)确认反应完成。在硅胶柱(EtOAc/Hex,3/2)上纯化反应混合物。得到0.6g(产率为65％)化合物8，其为黄色油状物。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)6.05(s,1H),5.71(s,1H),4.48(t,2H),4.29(s,2H),3.67(t,2H),1.86(s,3H)
实施例2–接头甲基丙烯酸2-(氯代羰基氧)乙基酯(HEMA-氯代甲酸酯)的合成
在0℃下将甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA,1.3g,10mmol)和三乙胺(1.1g,11mmol)在10mL氯仿中的溶液逐滴加入到碳酰氯(光气)(甲苯中的20％溶液，15.6ml,30mmol)在15mL氯仿的搅拌溶液中。在0℃下搅拌混合物1小时并随后将其置于50毫巴压力下以除去过量的碳酰氯。30分钟后，在减压下利用旋转蒸发器进一步浓缩混合物。将产物溶解于25mL的THF并过滤以除去固体Et3N·HCl。在减压下蒸发THF并通过Kugelrohr-蒸馏(90℃,0.6mmHg)纯化残余物，得到HEMA-氯甲酸酯，其为无色油状物(1.3g,67％)。
实施例3–前药的合成
使用地塞米松和紫杉醇作为模型药物化合物。利用所述接头衍生这些疏水性药物分子，从而形成可生物降解的前药：
在该合成方案中，R为单-或二氧化的硫；例如接头L1、L2或L3。
甲基丙烯酸2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-氟-11,17-二氢-10,13,16-三甲基-3-氧代-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊[α]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)-2-氧代乙基硫)乙基酯(DMSL1)：在氮气氛下将化合物4(0,25g,1.2mmol,1.05当量)和4-(二甲氨基)-吡啶(DMAP)(0.077g,0.63mmol,0.5当量)溶解于干燥的CH2Cl2(20mL)中。在冰上冷却反应混合物，然后向该混合物中加入N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(0.29g,1.4mmol,1.1当量)和溶解于干燥THF(20mL)中的DMS(0.5g,1.3mmol,1当量)。使反应恢复至室温并搅拌过夜，之后通过TLC(EtOAc/Hex,3:2(v/v),Rf:0.76)确认反应完成。蒸发大多数溶剂，剩余的混合物在15cm硅胶柱(EtOAc/Hex,3:2(v/v),Rf:0.44)上纯化。得到0.5g(产率为70％)DMSL1，其为白色蓬松固体。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)7.26(d,1H),6.22(d,1H),6.02(s,1H),5.98(s,1H*),5.68(s,1H*),5.39(s,1H),5.19(s,1H),5.18(d,1H),4.82(d,1H),4.27(t,2H*),3.51(s,2H*),2.91(t,2H*),1.87(s,3H*),1.46(s,3H),0.86(s,3H),0.78(d,3H)；13C-NMR(DMSO):δ(ppm)20.54(CH3),21.66(CH3),23.42(CH3*),28.44(CH3),32.73(CH2),35.61(CH2*),35.7(CH2),37.35(CH2),38.02(CH2*),39.19(CH),40.87(CH2),41.09(CH),48.73(CH),53.42(CH2),68.55(CH2*),74.11(CH),75.68(C),76.16(C),95.93(CH2),105.54(CH),107.85(C),129.52(C),131.43(CH2*),134.41(CH),141.14(C*),158.15(CH),171.77(C*),172.46(CH),174.93(C*),190.68(C)；ESI-MS:[M+H]+,计算值＝579.69d,实测值＝578.85d.[2M+H]+,计算值＝1158.38d,实测值＝1157.25d
甲基丙烯酸2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-氟-11,17-二氢-10,13,16-三甲基-3-氧代-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊[α]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)-2-氧代乙基亚磺酰基)乙基酯甲基丙烯酸酯(DMSL2)：在氮气氛下将化合物5(0.54g,2.4mmol,1.05当量)溶解于干燥THF(5mL)中并向溶液中加入DMAP(0.14g,1.2mmol,0.5当量)。在冰上冷却后，向混合物中加入干燥THF(25mL)中的地塞米松溶液(0.91g,2.3mmol,1当量)和DCC(0.525g,2.5mmol,1.1当量)。将反应混合物缓慢升温至室温并在室温下搅拌过夜。通过TLC(EtOAc/,20:1(v/v),Rf:0.24)确定反应完成。蒸发大多数溶剂，剩余的溶液在20cm硅胶柱(EtOAc/Hex,20:1(v/v))上纯化。得到1g(产率为73％)DMSL2，其为白色蓬松固体。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)7.29(d,1H),6.22(d,1H),6.05(s,1H),5.99(s,1H*),5.71(s,1H*),5.40(d,1H),5.19(s,OH),5.18(d,1H),4.88(d,1H),4.5(t,2H*),4.18(s,1H),4.15(d,1H*),4.00(d,1H*),2.86(s,1H),1.88(s,3H*),1.47(s,3H),0.87(s,3H),0.78(d,3H)；13C-NMR(DMSO):δ(ppm)20.51(CH3),21.62(CH3),23.32(CH3*),28.34(CH3),32.69(CH2),35.68(CH2*),35.84(CH2),37.32(CH2),39.80(CH),41.07(CH),48.72(CH),53.66(CH2),55.53(CH2*),61.67(CH2*),62.72(CH2*),74.11(CH),75.66(C),76.14(C),95.92(CH2),105.54(CH),107.85(C),129.53(C),131.78(CH*),134.42(CH),140.94(C*),158.17(CH),170.98(C*),171.60(CH*),172.48(C),190.71(C)；ESI-MS:[M+H]+,计算值＝595.69d,实测值＝595.10d.[2M+H]+,计算值＝1190.38d,实测值＝1189.65d
甲基丙烯酸2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-氟-11,17-二氢-10,13,16-三甲基-3-氧代-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊[α]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)-2-氧代乙基磺酰基)乙基酯(DMSL3)：在氮气氛下将化合物8(67mg,0.28mmol,1.05当量)溶解于干燥DCM(10mL)中，并向反应混合物中加入DMAP(0.017g,0.14mmol,0.5当量)。将地塞米松(0.11g,0.27mmol,1当量)溶解于干燥THF(10mL)中。在冰上冷却混合物，向该混合物中加入DCC(0.21g,0.46mmol,1.1当量)和地塞米松。在室温下搅拌反应过夜并通过TLC(EtOAc/Hex,7:3(v/v),Rf:0.47)确定反应完成。蒸发大多数溶剂，剩余的溶液在20cm硅胶柱(EtOAc/Hex,7:3(v/v))上纯化。得到0.1g(产率为60％)DMSL3，其为白色固体。
1H-NMR(DMSO):δ(ppm)7.29(d,1H),6.22(d,1H),6.05(s,1H),5.99(s,1H*),5.71(s,1H*),5.40(d,1H),5.19(s,OH),5.18(d,1H),4.88(d,1H),4.59(s,2H*),4.51(t,2H*),3.78(t,2H*),1.87(s,3H*),1.47(s,3H),0.87(s,3H),0.77(d,3H)；13C-NMR(DMSO):δ(ppm)(CH3),(CH3),15.79(CH3),16.93(CH3),18.55(CH2),23.63(CH2),25.16(CH2),27.98(CH2)30.96(CH),32.59(CH),34.04(CH),36.36(CH2),44.00(CH2),48.75(CH2),52.77(CH2),58.24(CH),70.09(C),71.40(C),91.18(CH2),(CH),124.80(C),127.25(C),129.69(CH),136.05(CH),153.42(C),163.23(CH),166.74(C),167.73(CH),185.96(C),204.66(C)；ESI-MS:[M+H]+,计算值＝611.69d，实测值＝611.05d.[2M+H]+,计算值＝1222.38d,实测值＝1221.20d
通过类似的方法制备相应的PTX系化合物。
当需要时，分别从PerkinElmer(波士顿,USA)和CamproScientificBV(Veenendaal,荷兰)获得放射性化合物3H-地塞米松(乙醇中的1mCi/mL)和14C-紫杉醇(14C-PTX)。在其他情况下，从SigmaAldrich(Zwijndrecht,荷兰)获得地塞米松，而从MPBiomedicalsInc.(Illkirch,法国)获得紫杉醇。
实施例4–聚合物合成
利用Rijcken等,在Biomacromolecules,2005.6(4):p.2343-2351中和在Biomaterials,2007.28(36):p.5581-5593中所描述制备所使用的嵌段共聚物。该聚合物含有亲水性单甲氧基-PEG嵌段(Mn为5000g/mol)和由N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMAm)的单乳酸酯(36％)和二乳酸酯(64％)构成或由N-2-羟乙基甲基丙酰胺(HEMAm)的单乳酸酯(20％)和二乳酸酯(80％)构成的热敏性嵌段。随后，在如前文中的Biomaterials参考文献所述与甲基丙烯酸酐反应后，部分(10-15％)乳酸酯侧链被甲基化。在所有情况下，嵌段共聚物的分子量和临界微团温度分别为～25kDa和8-12℃。3H-和14C-标记的甲基丙烯酰化嵌段共聚物利用如前文中的Biomaterials参考文献所述的3H-或14C-乙酸酐获得。
实施例5-载药微团的制备
在通用术语和典型实验中，嵌段共聚物基于PEG-b-聚(N-羟烷基甲基丙烯酰胺-低聚乳酸酯)，其具有部分甲基丙烯酰化的低聚乳酸酯单元(热敏性聚合物)。更具体地，使用两种类型的聚合物骨架：2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMAm)和2-羟乙基甲基丙烯酰胺(HEMAm)。将热敏性嵌段共聚物的水溶液与少量的上文所提到的前药在可与水混溶的有机溶剂(优选具有低沸腾温度，例如乙醇或四氢呋喃)中的浓溶液混合(通常为10:1体积比)。然后，加入引发剂溶液(KPS-TEMED，能够产生自由基，也可以使用其他的自由基引发剂)，之后立即快速加热至高于临界微团形成温度(CMT)。这可使得经由疏水相互作用形成其中前药为非共价地定位于疏水核中的单分散性聚合微团。在微团形成后，建立氮气气氛。从而引发剂自由基诱导甲基丙烯酰化的聚合物和可聚合前药化合物发生聚合。这种所谓的交联过程导致形成交缠的网络并且将前药共价地固定在交联微团核(CCLPM)的内部。
利用基于HPMAm或HEMAm(均为14％甲基丙烯酰化)的微团来制备负载DMS和DMS-前药的微团。将用冰冷却的聚合物的乙酸铵缓冲(pH5)溶液(8.3体积，在4℃溶解过夜)与KPS(0.45体积)和TEMED(0.25体积)混合。加入乙醇(1体积)中的DMS(前药)，之后迅速升温至50℃持续1分钟并剧烈搅拌。聚合物、KPS、TEMED和药物的最终浓度分别为20mg/mL、1.35mg/mL、3mg/mL和2mg/mL。随后构成每一微团的如Rijcken等在上文中引用的Biomaterials中的文章中所描述的在N2气氛下在室温下交联1小时。最优化KPS和TEMED浓度以确保完成甲基丙烯酸酯转化(如Stenekes和Hennink在Polymer,2000,41(15),5563-5569中所描述的)，而不会由于过早发生聚合而影响微团形态学。类似地，制备负载PTX和PTX-前药的微团。
如前文所描述的制备负载DMS-P的脂质体(Banciuetal.J.Contr.Release,2008,127(2),131-136；Schiffelersetal.,Neoplasia,2005,7(2),118-127)。简言之，将适量的二棕榈酰磷脂酰胆碱(LipoidGmbH,Ludwigshafen,德国)、胆固醇(Sigma,St.Louis,USA)以及聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(LipoidGmbH)分别以1.85:1.0:0.15的摩尔比在圆底烧瓶中溶解于乙醇中。通过旋转蒸发形成脂质膜。用100mg/mLDMS-P溶液将该膜水化。利用多个挤出步骤降低脂质体的尺寸通过最终孔尺寸为50nm的聚碳酸酯膜(Nuclepore,Pleasanton,USA)。通过动态光散射来确定脂质体的平均粒径。通过在4℃下分子量截断为10kDa的Slide-A-Lyzer盒中利用反复变化的缓冲液渗析除去未包封的DMS-P。萃取后的水相用于如前文所描述的[8]通过高效液相色谱来确定糖皮质激素磷酸酯含量，并且含有约5mg/mLDMS-P。
实施例6–体外释放研究
负载DMS-前药的HPMAm核交联(CCL)聚合微团(PM)(终浓度为DMS2mg/mL)在含有1％吐温的磷酸盐缓冲液(pH7.4,150mM)或含有1％吐温的硼酸盐缓冲液(pH8.4,150mM以及pH9.4150mM)中至少十倍稀释，并在37℃保温。通过在由BEHC18柱(直径为1.7μm，长度为50mm)构成的WatersAcquity系统上在50℃的柱温下用UPLC检测进行即时分析来检测DMS的释放。洗脱液为乙腈/H2O(23:77,v/v)，流速为1mL/min。样品体积为7.5μL。在246nm处进行UV检测。地塞米松校准曲线在0.2μg/mL至60μg/mL之间是线性的。
来自不同前药CCLPM的DMS释放曲线清楚地示出了DMS的释放速率取决于所使用的接头有很大差异(参见图1)。
UPLC之后DMS的及时释放示出了依赖于释放速率的明确接头，即DMSL1显示出非常慢的释放，而接头中硫原子的氧化程度提高使释放速率提高。具体的酯的水解速率是pH依赖性的，反之亦然，因为与在pH7.4时的水解速率相比，pH8.4时水解加速。在pH5时没有观察到不同DMS制剂的DMS释放(数据未示出)。而且，没有出现突然释放表明在所有情况下都完成了地塞米松前药的共价捕获。在不同的pH(例如7.4和8.4)和用于不同类型的微团(基于HPMAm和HEMAm)时都一致地观察到了相同的趋势。
因此，显示出能够容易地改变酯键的β位处的硫原子的氧化状态，从而产生具有不同水解稳定性程度的不同接头。例如，在生理学条件下，DMS的50％释放能够在大约1周(DMSL3)至大约4周(DMSL1)内变化。
而且，评价了负载PTX前药的HEMAmCCLPM的释放动力学。
(图2；示出了在37℃下在缓冲液pH7.4中负载PTX前药的HEMAmCCLPM的释放动力学)
PTX从HEMAmCCLPM中的释放还取决于在酯键β位处所使用的取代基类型。然而，PTX的全部释放比DMS的释放动力学要快得多。显然，连接于接头(位于接头附近)的药物的原子也受到发生水解的酯键敏感性的显著影响。
除此之外，如图3所示，显示出负载PTXL2前药的HEMAm和HPMAmCCLPM在pH7.4缓冲液中在37℃下的PTX释放动力学(每一条曲线平均4次独立测量)，接头水解的速率也受到聚合物的亲水性(水含量)的轻微影响，即通过所使用的聚合物类型(基于HPMAm或HEMAm)。HEMAm稍微更亲水，因此聚(HEMAm-乳酸酯)中的接头和乳酸侧链均更加迅速地被水解(还参见WO/2005/087825)。而且，乳酸侧链的水解速率影响微团核的亲水性(和水分摄取)增加速率。
总之，这些体外释放研究清楚地证明原始药物的释放动力学根据所使用的接头类型以及次要地根据聚合微团类型和所评价的药物类型的较大差异。
实施例7-静脉内注射负载DMSLx的聚合微团之后的治疗效力研究
肿瘤模型：
皮下B16F10-黑素瘤的荷瘤小鼠(见上文)在肿瘤为100-200mm3的情况下接受尾部静脉内注射。剂量和配方为10mg/kg的共价捕获于核交联HPMAm微团中的DMSL2、10mg/kg游离DMS-P或盐水(对于每个组，n＝5-6)。如上文所述在pH5缓冲液中制备负载DMSL2的微团。在给药前分别用NaOH和NaCl将微团溶液调节为pH7.4且离子强度为300毫渗摩尔(mOsmolar)。每天用测径器测量肿瘤尺寸，并且每天评估体重。每3天重复一次注射直至2000mm3的人类终点(humanendpoint)。在对照组中，小鼠在开始治疗后第6天就已达到了该终点。在负载DMSL2的微团的情况下，治疗继续进行直至20天，即至少6次注射。
尤其是，对于治疗效力研究，配方之一显示出良好的体外释放曲线，即在HPMAm微团中共交联的DMSL2与游离DMS和PBS相比(图4；示出了在多次(间隔3天)静脉内给予B16F10肿瘤荷瘤小鼠后，在HPMAm微团中共交联的DMSL2的相对肿瘤生长速率(左侧)和动物存活(右侧))。
根据KaplanMeier分析(图4，右侧)，DMSL2微团与PBS相比具有显著的(p＝0.041)治疗效果。与游离DMS-P相比，其还具有朝向较高效力的趋势，但是并不显著(图4，左侧)。尽管经常给予微团制剂(多达6次)，但并未观察到任何局部或系统毒性的迹象。另外，在每天测量后没有观察到体重损失。
RA模型：
向其膝关节具有胶原抗体诱导的关节炎的小鼠单次静脉内注射10mgDMS/kg，作为游离药物或作为DMSL3(CD102)。作为安慰剂，向健康的无患病关节(non-affectjoint)的小鼠静脉内注射盐水作为对照。结果清晰地显示，在静脉内注射后，只有DMSL3PM导致显著的(几乎全部)关节炎症状(此处关节肿胀)的抑制。这表明与游离地塞米松相比更为优异的药代动力学行为(较长时期内的释放速率以及在炎性组织中的增强累积)。图5中示出了结果。
实施例8-静脉内给予负载PTXLx的聚合物微团后的PK和治疗效力研究
在体内药代动力学研究中，在治疗效力研究中用泰素(紫杉醇注射液)和PBS针对皮下B16F10肿瘤荷瘤小鼠测定静脉内给予PTXL2PM制剂后的紫杉醇血药水平(～10mg/kg紫杉醇)作为对照。从这个角度来看下表：
尤其是，该表示出了向皮下B16F10肿瘤荷瘤小鼠静脉内给予泰素(紫杉醇注射液)或PTXL2前药CCLPM制剂后的紫杉醇血药水平(如通过LC-MS测定的，定量限(LOQ)<10.3ng/mL，n为3-5)。游离紫杉醇的这些药代动力学数据表明，负载PTX前药的CCLPM的长血液驻留和PTX的受控释放。
健康小鼠静脉内注射
以12.5mg/kg的剂量向小鼠静脉内给予PTXL1、PTXL2和PTXL3微团作为PTX(3只动物/取样时间)。作为对照，也给予泰素(紫杉醇注射液)和阿伯利斯(白蛋白型紫杉醇，Abraxane)作为对照，它们为目前商品化的紫杉醇制剂。在注射后的不同时间点收集血液样品和不同的器官(肝、脾)。
图6a和图6b中示出了对应于释放的紫杉醇的曲线。
当也需要保存捕获紫杉醇的微团时，在PTXL3的情况下，观察到如图6c所示的血液形态(血液曲线，bloodpattern)。
捕获并释放的紫杉醇明确地表明了PTXLx微团的长循环特性，其反过来又表明紫杉醇在微团中受到保护而不会发生降解。
上表中示出了与目前的商品化制剂相比延长的血液循环的明确指示。而且，观察到了可调的释放速率，在缓慢释放PTXL1的情况下紫杉醇的量最小，而在(就目前的程度而言)最快速释放PTXL3的情况下释放的紫杉醇的量最大。
健康小鼠腹膜内注射(i.p.)和皮下注射(s.c.)
类似地，还皮下和腹膜内给予PTXl1微团，使得产生血药水平，其中紫杉醇也及时受控释放。这表明，即使在其他不同的给药途径后，释放机制也真正是一般性的。
健康大鼠-静脉内注射
在静脉内注射PTXL2微团后观察图7所示的图案(曲线)。
最重要的结果和结论是：长血液循环特性；以及血液中的紫杉醇释放％等于在小鼠中释放的％：即，观察到相同的释放机制。
对于这些接头在不同实施方式中的应用而言，最重要的是，在单次或重复给予小鼠和大鼠后，新型接头分子在各种临床前毒性研究中表现出是完全安全的。而且，即使是在增加剂量后，也没有观察到局部或系统性影响，从而表明这些类型的接头以及它们的可生物降解片段均不会导致任何显著的副作用。

Claims (13)

1.一种接头作为在药物递送系统中的接头的应用，所述接头具有下式：
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A，
-其中n和m为0至20的整数；
-其中R1和R2彼此独立地选自孤对电子、氧部分和氮部分；
-其中A为结合部分，所述结合部分为可聚合的甲基丙烯酸酯部分；并且
-其中Q为直接键合、或者C＝O、C＝NH或C＝NRp基团，其中Rp为C1-C3烷基，
其中，所述接头通过其–OH、–COOH或–NH基团偶联于生物活性分子。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氧部分为＝O。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氮部分为＝N-Rx，其中Rx为原子的相同或不相同基团，独立地为直链或支链C1-C6烷基，直链或支链C1-C6烯基；或芳香族基团；或卤素基团，羟基，氨基，或取代的氨基，羧酸基团，硝基，或氰基。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述烷基、烯基或芳香族基团被一个或多个卤素基团、羟基、氨基或取代的氨基、羧酸基团、硝基或氰基取代。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中，所述接头是可生物降解接头。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中，所述药物递送系统释放药物分子、肽、蛋白、成像剂、基因构建体或它们的组合。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中所述药物递送系统释放作为活性成分的地塞米松或紫杉醇。
8.包含能够释放活性成分的聚合物基质的受控释放系统，其中，所述活性成分通过权利要求1所述的接头共价连接于所述聚合物基质的聚合物分子。
9.一种制备权利要求8所述的受控释放系统的方法，包括以下步骤：提供具有功能性部分以使得能够结合于所述接头的构建单元和/或生物活性化合物，引发所述接头的含-OH或含-NH部分和所述构建单元或生物活性化合物的所述功能性部分之间的结合，从而形成前药或经改性的构建单元；以及将所述前药或经改性的构建单元包封在聚合物基质中并将所述前药或经改性的构建单元与所述聚合物基质结合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述功能性部分为伯醇或仲醇或COOH。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述接头包含羧酸部分。
12.如权利要求1限定的接头的应用，其中，所述生物活性分子是糖皮质激素或化学治疗剂。
13.根据权利要求12所述的接头的应用，其中，所述生物活性分子是地塞米松或紫杉醇。
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