KR101843385B1 - 면역원성 조성물 - Google Patents
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Abstract
소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 이루어지는 면역원성 미립자 및 계면활성제를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물로서, 계면활성제가 면역원성 미립자에 내포되어서 이루어지는 면역원성 조성물은 적은 항원량, 적은 투여 횟수이어도 생체 내에서의 높은 면역 활성화능을 갖는다.
Description
본 발명은 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체 및 계면활성제를 함유해서 이루어지는 면역원성 미립자를 유효 성분으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
항원의 면역 활성화능을 향상시키기 위해서 아쥬반트가 항원과 함께 사용되고 있다. 아쥬반트로서 높은 효과가 알려져 있는 것은 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)이지만 사균 및 오일 에멀젼으로 이루어지는 CFA는 투여 부위에 강한 염증 반응 및 궤양성의 종장(육아종) 형성이 생기는 등 강한 부작용이 있기 때문에 안전상의 염려가 있어 인간에게 사용하는 것은 허가되지 않고 있다. 그 때문에 인간에의 투여가 허가되어 있는 아쥬반트는 한정되어 있다.
인간에의 투여가 허가된 아쥬반트로서는 수산화 알루미늄 아쥬반트가 있지만, 이 아쥬반트는 면역 활성화 능력이 충분하다고는 말할 수 없어 면역을 획득시키기 위해서 반복 투여가 필요하다. 이 때문에 인간에게 사용할 수 있는 효율적이고 강력한 아쥬반트를 사용한 면역원성 조성물의 개발이 갈망되고 있다.
높은 면역 활성화능을 목표로 한 새로운 아쥬반트의 개발로서 항원을 미립자에 내포하는 방법이 시도되고 있다. 항원을 미립자화해서 투여함으로써 항원을 단독으로 투여하는 경우와 비교해서 항체 산생 등의 면역 반응이 높아지는 것이 보고되고 있지만 그 효과는 반드시 높은 것은 아니고 상술한 수산화 알루미늄 아쥬반트와 같은 정도의 효과가 보고되고 있을 뿐이다. 이것은 지금까지 검토되어 온 미립자, 예를 들면 소수성의 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 폴리머로 이루어지는 미립자는 단백 등의 친수성의 항원 분자를 효율적으로 구조를 유지한 상태로 내포시키는 것이 곤란하다는 것이 원인으로서 생각된다(비특허문헌 1).
최근, 양친매성 폴리머를 이용한 고분자량의 단백질을 높은 효율로 봉입시킬 수 있는 새로운 미립자 기술이 보고되어 있다(특허문헌 1, 2). 이 새로운 미립자에 대해서는 약물의 서방성능에 대한 검토가 이루어져 있지만 항원을 내포시켰을 경우의 아쥬반트 기능에 대해서는 전혀 검토가 이루어져 있지 않다. 또한, 항원을 포함하는 미립자가 아쥬반트로서 기능하는 메카니즘은 항원 분자를 서방하는 기능과 아울러 항원을 포함하는 미립자가 입자와 함께 면역 세포에 도입되어 세포 내에서 항원을 유리하는 메카니즘이 중요하게 생각되고 있고, 입자로부터의 약물 방출의 기능과 아쥬반트로서의 성능은 일치하지 않는다고 생각되고 있기 때문에 입자의 서방성능으로부터 아쥬반트 기능을 추측하는 것은 곤란하며, 기존의 미립자를 사용한 기술로 알루미늄 아쥬반트를 훨씬 능가하는 성능을 가진 효과적인 아쥬반트는 그 개발이 기다려지고 있음에도 불구하고 지금까지 실현되고 있지 않았다.
어드밴스드 드러그 딜리버리 리뷰, 2005년 57호, 391-410페이지
본 발명의 목적은 적은 항원량, 적은 투여 횟수로 높은 면역 활성화능을 갖는 면역원성 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 극복하기 위해서 본 발명자들은 소량의 항원을 사용해서 적은 투여 횟수로 높은 면역 활성화를 일으킬 수 있는 수단을 검토한 결과, 아쥬반트 미립자에 항원을 내포시킨 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 이루어지는 면역원성 미립자 및 계면활성제를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물이 생체 내에서 높은 면역 활성화능을 갖는 것을 발견했다. 즉, 본 발명은 이하와 같은 구성을 갖는다.
(1) 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 이루어지는 면역원성 미립자 및 계면활성제를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물로서, 계면활성제가 면역원성 미립자에 내포되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(2) (1)에 있어서, 상기 면역원성 미립자가 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 계면활성제가 지방산 에스테르 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 아쥬반트 미립자가 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 내부에 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수 부분의 외층을 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 다당인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 양친매성 폴리머가 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(7) (5) 또는 (6)에 있어서, 상기 다당이 덱스트란인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 계면활성제가 단당 및/또는 폴리에틸렌글리콜 구조를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 모노올레산 소르비탄, 트리올레산 소르비탄 및 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(11) 항원을 용해한 수계용매 A 또는 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B에 계면활성제를 용해하고, 그것들을 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정, 및 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거하는 공정에 의해 얻어지는 면역원성 미립자를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(12) 항원을 용해한 수계용매 A 및 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B를 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정, 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거해서 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 얻는 공정, 및 항원-아쥬반트 미립자 복합체 분산액 C를 표면 개질제를 용해한 액상 D에 도입해서 분산매를 제거하는 공정을 포함하는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 제조 공정에 있어서, 수계용매 A, 수비혼화성 유기용매 B 또는 분산액 C에 계면활성제를 용해시킴으로써 얻어지는 면역원성 미립자를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 종래보다 생체 내에서 강력한 면역 활성화가 가능해지는 면역원성 조성물이 제공된다.
도 1은 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 1.
도 2는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 2.
도 3은 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 3.
도 4는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 4.
도 5는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 5.
도 6은 OVA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가.
도 2는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 2.
도 3은 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 3.
도 4는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 4.
도 5는 CEA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가 5.
도 6은 OVA 함유 면역원성 미립자의 면역 평가.
본 발명은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 이루어지는 면역원성 미립자 및 계면활성제를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
우선, 아쥬반트 미립자를 구성하는 양친매성 폴리머에 대해서 설명한다. 양친매성이란 친수성과 소수성 양쪽 모두의 성질을 갖고 있다는 것이며, 친수성이란 임의의 부위의 물에의 용해도가 다른 부위보다 높을 때 그 부위를 친수성이라고 말한다. 친수 부위는 물에 가용인 것이 바람직하지만 난용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 높으면 된다. 또한, 소수성이란 임의의 부위의 물에의 용해도가 다른 부위보다 낮을 때 그 세그먼트를 소수성이라고 말한다. 소수성 부위는 물에 불용인 것이 바람직하지만 가용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 낮으면 된다.
양친매성 폴리머란 분자 전체로서 상술한 양친매성을 갖는 폴리머이다. 폴리머란 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트, 또는 그 양쪽이 최소 단위(모노머)의 반복 구조로 구성된 분자 구조인 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서의 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트를 가진 구조이면 좋고, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 연결된 직쇄상의 블록 폴리머이어도 좋으며, 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트, 또는 그 양쪽이 복수개 존재하는 분기를 가진 분기 폴리머, 친수성 세그먼트에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있거나, 또는 소수성 세그먼트에 복수의 친수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머이어도 좋다. 바람직하게는 친수성 세그먼트가 1개의 폴리머이고, 가장 바람직하게는 친수성 세그먼트, 소수성 세그먼트를 1개씩 갖는 직쇄상의 블록 폴리머 또는 친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머이다.
면역원성 조성물을 구성하는 양친매성 폴리머는 아쥬반트 미립자로서의 성질을 갖는 한은 친수 부분 또는 소수 부분, 또는 그 양쪽이 다른 구성 폴리머로 이루어지는 복수 종류의 양친매성 폴리머, 구성 폴리머는 같아도 복수 종류의 연결 양식을 가진 양친매성 폴리머의 집합이어도 좋지만, 안정된 성능을 달성시키고 생산성을 높이기 위해서는 적은 종류의 양친매성 폴리머의 집합인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 주로 2종류 이하의 양친매성 폴리머의 집합, 더욱 바람직하게는 주로 단일 종류의 양친매성 폴리머로 구성되어 있는 것이다.
본 발명에 있어서는 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 것을 특징으로 하고 있다. 폴리(히드록시산)이면 특별히 한정되지 않지만, 생체 투여시에 현저하게 유해한 영향을 주지 않는 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 여기서 말하는 생체 적합성이란 래트에 그 폴리머를 경구 투여할 경우의 LD50이 2,000㎎/㎏ 이상인 것을 가리킨다. 또한, 복수 종류의 히드록시산의 공중합체이어도 좋지만, 바람직하게는 2종류 이하의 히드록시산의 중합체이다. 바람직한 폴리(히드록시산)의 구체예로서는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(2-히드록시부티르산), 폴리(2-히드록시발레르산), 폴리(2-히드록시카프로산), 폴리(2-히드록시카프르산), 폴리(말산) 또는 이것들의 고분자 화합물의 유도체 및 공중합체를 예시할 수 있지만, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)의 공중합체가 보다 바람직하다. 또한, 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)인 경우 폴리(락트산-글리콜산)의 조성비(락트산/글리콜산)(몰/몰%)는 본 발명의 목적이 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 100/0~30/70인 것이 바람직하고, 60/40~40/60인 것이 보다 바람직하다.
양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 소수성 세그먼트와 마찬가지로 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 또한, 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 지속적인 아쥬반트능을 부여하기 위해서는 포유류 또는 조류의 생체 내 또는 세포 내에서 분해되기 어려운 난분해성 폴리머인 것이 바람직하다. 생체 적합성 분자로서 난분해성 폴리머의 구체예로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산 또는 난분해성의 다당(예를 들면, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란)을 예시할 수 있고, 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산 또는 폴리아미노산인 경우 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트 및 소수성 세그먼트를 1개씩 갖는 직쇄상의 블록 폴리머인 것이 바람직하며, 친수성 세그먼트가 다당인 경우 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머인 것이 바람직하다. 또한, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로서는 폴리에틸렌글리콜 또는 난분해성의 다당인 것이 바람직하고, 다당으로서는 덱스트란이 보다 바람직하다.
상기 폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트로 이루어지는 양친매성 폴리머는 폴리머 전체로서 수비혼화성의 성질인 것이 면역원성 조성물의 항원 내포성 및 생체 투여시의 지속성이 향상되기 때문에 바람직하다.
양친매성 폴리머에 있어서의 친수성 세그먼트의 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 직쇄상으로 결합한 블록 폴리머인 경우 바람직하게는 1,000~50,000이고, 보다 바람직하게는 2,000~15,000이다. 여기서, 용어 「블록」이란 폴리머 분자의 일부분으로 적어도 5개 이상의 모노머 단위로 이루어지고, 그 부분에 인접하는 다른 부분과 화학 구조상 또는 입체 배치상 다른 것을 말하며, 적어도 2 이상의 블록이 선상으로 연결되어서 생긴 폴리머를 블록 폴리머라 말한다. 블록 폴리머를 구성하는 각 블록 자체가 2종류 이상의 모노머 단위로 이루어지는 랜덤, 교대, 그라디언트 폴리머이어도 좋다. 본 발명에 있어서는 친수성 세그먼트를 형성하는 폴리머와 폴리히드록시산이 각각 1개씩 연결된 블록 폴리머인 것이 바람직하다.
또한, 친수성 세그먼트 주쇄에 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머인 경우 친수성 세그먼트의 평균 분자량은 바람직하게는 1,000~100,000이고, 보다 바람직하게는 2,000~50,000이며, 더욱 바람직하게는 10,000~40,000이다. 또한, 그래프트쇄의 수는 바람직하게는 2 내지 50이다. 그래프트쇄 수는 1H-NMR 측정에 의해서 얻어지는 친수성 세그먼트 주쇄와 소수성 세그먼트 주쇄의 비율 및 소수성 세그먼트의 평균 분자량과, 사용한 친수성 세그먼트 주쇄의 평균 분자량으로부터 구할 수 있다.
소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트의 바람직한 평균 분자량 비는 양친매성 폴리머에 따라서 다르지만 소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트가 직쇄상으로 연결된 블록 폴리머인 경우 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트의 평균 분자량 비는 1:1 이상이 바람직하고, 1:2 이상이 보다 바람직하며, 1:4 이상이 더욱 바람직하고, 특히 바람직한 것은 1:4 이상 1:25 이하이다.
친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트 그래프트쇄가 결합한 그래프트 폴리머인 경우 친수성 세그먼트 주쇄부와 소수성 세그먼트 그래프트쇄 전체의 평균 분자량 비가 1:3 이상이고 또한, 각 그래프트쇄의 평균 분자량이 2,500~40,000인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 전체의 평균 분자량 비가 1:5 이상이고, 각 그래프트쇄의 평균 분자량이 5,000~40,000이다.
또한, 상술한 평균 분자량이란 특별히 한정하지 않는 한 수 평균 분자량을 말한다. 수 평균 분자량이란 분자 크기의 웨이팅(weighting)을 고려하지 않은 방법으로 산출한 평균 분자량이고, 양친매성 폴리머 및 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머의 수 평균 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 측정한 폴리스티렌이나 풀루란 환산의 분자량으로서 구할 수 있다. 또한, 폴리(히드록시산)의 평균 분자량은 핵자기 공명(NMR) 측정에 의해 말단 잔기의 피크 적분값과 말단 잔기 이외의 피크 적분값의 비로 구할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 합성하면 좋고, 친수성 세그먼트로 되는 폴리머에 폴리(히드록시산) 폴리머를 첨가해서 축합 반응을 행해 제조하는 방법, 친수성 세그먼트로 되는 폴리머에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행해 제조하는 방법이나, 또한 반대로 폴리(히드록시산) 중합체인 소수성 세그먼트에 친수성 세그먼트를 구성하는 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하는 방법을 예로서 예시할 수 있다.
예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 양친매성 폴리머이면 주석 촉매 존재 하, 폴리에틸렌글리콜에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 양친매성 블록 폴리머를 제조하는 방법[Journal of Controlled Release, 71, p.203-211(2001년)]에 의해 제조할 수 있다.
또한 예를 들면, 다당 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머이면 이하의 (1), (2) 또는 (3)과 같이 해서 제조할 수 있다.
(1) 주석 촉매 존재 하, 다당에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 31, p.1032-1039(1998년)]
(2) 수산기의 대부분이 치환기로 보호된 다당의 일부 미보호의 수산기를 염기로 활성화 후 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 그래프트쇄를 도입하고, 최후에 보호기를 제거함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Polymer, 44, p.3927-3933(2003년)]
(3) 다당에 대해서 폴리(히드록시산)의 공중합체를 탈수제 및/또는 관능기의 활성화제를 사용해서 축합 반응시킴으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 33, p.3680-3685(2000년)].
이어서, 아쥬반트 미립자에 대해서 설명한다. 아쥬반트 미립자란 아쥬반트능을 갖는 미립자를 말하고, 아쥬반트능이란 항원을 생체 내에 투여했을 경우의 면역 응답을 항원 단독을 투여했을 때와 비교해서 높게 야기시킬 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 있어서는 아쥬반트 미립자는 양친매성 폴리머로 이루어지는 미립자인 것을 특징으로 하고, 또한 아쥬반트 미립자는 항원을 내포함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 형성하며, 그 복합체가 본 발명의 면역원성 조성물의 유효 성분인 미립자를 구성하는 것을 특징으로 하고 있다.
아쥬반트 미립자의 구조로서는 특별히 한정되지 않지만, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 아쥬반트 미립자의 내측에 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 가진 구조를 취할 경우 내포되는 항원이 안정되게 유지되기 때문에 바람직하다.
아쥬반트 미립자에 내포되는 항원의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 펩티드, 단백질, 당단백질, 당지질, 지질, 탄수화물, 핵산, 다당류 및 이것들을 포함하는 바이러스, 균체, 알레르기 원인 물질, 조직, 세포 등이면 좋다. 구체예를 들면 꽃가루 유래 항원, A형 간염 바이러스 유래 항원, B형 간염 바이러스 유래 항원, C형 간염 바이러스 유래 항원, D형 간염 바이러스 유래 항원, E형 간염 바이러스 유래 항원, F형 간염 바이러스 유래 항원, HIV 바이러스 유래 항원, 인플루엔자 바이러스 유래 항원, 헤르페스 바이러스(HSV-1, HSV-2) 유래 항원, 탄저균 유래 항원, 클라미디아 유래 항원, 폐렴 구균 유래 항원, 일본 뇌염 바이러스 유래 항원, 홍역 바이러스 유래 항원, 풍진 바이러스 유래 항원, 파상풍균 유래 항원, 수두 바이러스 유래 항원, SARS 바이러스 유래 항원, EB 바이러스 유래 항원, 유두종 바이러스 유래 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacterpylori)균 유래 항원, 광견병 바이러스 유래 항원, 웨스트 나일 바이러스 유래 항원, 한타 바이러스 유래 항원, 연쇄 구균 유래 항원, 포도상 구균 유래 항원, 백일해(Bordetellapertussis)균 유래 항원, 결핵균(Mycrobacteriumtuberculosis) 유래 항원, 말라리아 원충(Plasmodium) 유래 항원, 폴리오 바이러스 유래 항원, 각종 인축 공통 감염증 유래 항원, 암 항원, 각종 음식물 알레르기 유래 항원 등이다.
내포되는 항원은 단일일 필요는 없다. 이것은 본 발명의 응용을 생각했을 경우에 단독의 단백이나 펩티드가 아니라 암세포나, 세균, 바이러스 등 복수의 구성물로 구성된 것에 대한 면역 응답을 일으킬 경우가 있고, 이 경우는 면역 응답을 일으킬 수 있는 복수 종류의 단백질 등이나, 종류를 특정할 수 없는 혼합물이어도 좋다. 또한 적극적으로 복수 종류의 항원에 대한 면역 응답을 일으키는 것을 목적으로 해서 복수 종류의 항원을 함유시키는 것도 본 발명의 면역원성 조성물의 이용 형태의 하나이다. 바람직하게는 3종류 이하, 보다 바람직하게는 단일 종류인 항원이 아쥬반트 미립자에 내포된다.
본 발명에 있어서의 항원-아쥬반트 미립자 복합체는 아쥬반트 미립자를 구성하는 폴리머의 종류 및 조제방법에 따라 함유되는 항원의 유지성을 변화시킬 수 있다. 본 발명에 있어서의 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 면역원성을 초래하는 메카니즘으로서는 아쥬반트 미립자로부터 방출된 항원이 면역 담당 세포에 인식되는 과정이나, 아쥬반트 미립자와 함께 면역 담당 세포에 인식되는 과정 등 복수의 과정이 생각되고, 그들 과정의 상승 효과에 의해서도 높은 효과가 얻어진다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체가 면역 담당 세포에 항원을 인식시키는 과정은 그 과정마다 야기되는 면역 반응의 종류도 다르고, 생기게 하고 싶은 면역 반응의 종류나 투여 부위에 따라서 바람직한 과정을 선택하면 좋다. 즉, 항원은 항원-아쥬반트 미립자 복합체로부터 반드시 방출될 필요는 없고, 목적으로 하는 최선의 면역원성을 갖는 형태는 항원과 활성화시키고 싶은 면역 반응의 종류에 따라 최적화시키는 것이 바람직한 사용방법이다. 그러나 항원이 현저하게 빠르게 항원-아쥬반트 미립자 복합체로부터 방출될 경우는 본 발명의 양호한 성질인 장기간의 지속적인 면역 활성화 작용이 얻어지지 않기 때문에 항원-아쥬반트 미립자 복합체에 있어서의 항원의 10% 이상이 생체 내에 투여 1주일 후에도 복합체로서 유지되고 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 투여 1주일 후에 50% 이상이 내포되어 있는 것이다. 이것들의 방출 거동은 생체 내 환경을 모방한 인 비트로 평가에 의해 확인할 수 있다.
또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체는 그 복합체가 회합한 입자 상태에 있어서도 양호하게 효과를 달성하고, 여기서 말하는 회합이란 2 이상의 입자가 입자간력 또는 타물질을 통해서 결합하여 집합체를 형성하는 것이다. 입자간력은 특별히 한정되지 않지만, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스힘을 예시할 수 있다. 회합은 미립자끼리가 접하고 있는 상태에 한정되지 않고 미립자 사이에 미립자와 친화성을 갖는 물질이 존재하고 있어도 좋으며, 매트릭스에 미립자가 분산되어 있어도 좋다. 미립자에 친화성을 갖는 물질, 매트릭스로서는 폴리머가 바람직하고, 소수성 부분이 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머이며, 아쥬반트 미립자와 같은 구성 성분인 폴리머가 보다 바람직하고, 구체예로서 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 양친매성 폴리머, 폴리에틸렌글리콜과 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 블록 폴리머 또는 폴리(히드록시산)을 예시할 수 있다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체의 회합은 사용시에 재분리되는 상태이어도 좋고, 재분리되지 않는 상태이어도 좋다. 또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 형태가 그 복합체가 회합한 것을 모르는 상태이어도 그 제조 공정에 그 복합체를 회합시키는 공정을 포함할 경우 그 복합체가 회합한 입자라고 생각한다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 복합체가 회합한 입자의 평균 입경은 0.1~50㎛인 것이 바람직하고, 0.1~10㎛인 것이 보다 바람직하다. 특히, 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 평균 입경은 바람직하게는 0.1~1㎛, 보다 바람직하게는 0.1~0.5㎛이고, 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 평균 입경은 바람직하게는 0.1~50㎛, 보다 바람직하게는 0.1~10㎛, 더욱 바람직하게는 1~10㎛이다. 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 복합체가 회합한 입자의 평균 입경은 주사형 전자 현미경(SEM: 예를 들면, Hitachi, Ltd. 제품 S-4800)에 의한 화상 해석법을 사용해서 직접 평균 입경을 측정할 수 있다.
상기 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 복합체가 회합한 입자는 내포되는 항원의 면역원성을 증강하는 효과를 갖지만, 본 발명자는 상기 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 복합체가 회합한 입자로 이루어지는 면역원성 미립자(이하, 「면역원성 미립자」로 함)에 계면활성제를 유효 성분으로서 내포함으로써 내포되는 항원의 면역원성을 더욱 증강시킬 수 있는 것을 발견했다. 즉, 본 발명의 면역원성 조성물의 유효 성분인 면역원성 미립자에는 구성 성분으로서 계면활성제가 내포되는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에서 사용되는 계면활성제는 특별히 한정되는 것은 아니고, 구체예로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85, 모노올레산 글리세린, 모노올레산 소르비탄, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 모노스테아르산 에틸렌글리콜, 모노스테아르산 글리세린, 모노스테아르산 소르비탄, 모노스테아르산 프로필렌글리콜, 모노스테아르산 폴리에틸렌글리콜, 모노팔미트산 소르비탄, 모노미리스트산 글리세린, 모노라우르산 소르비탄, 모노라우르산 폴리에틸렌글리콜, 트리올레산 소르비탄, 트리스테아르산 소르비탄, 폴리옥시틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌글리콜 공중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 지방산 디에탄올아미드(스테아르산 디에탄올아미드, 올레산 디에탄올아미드, 라우르산 디에탄올아미드 등), 레시틴, 지방산 나트륨(스테아르산 나트륨, 올레산 나트륨, 라우르산 나트륨 등), 알킬황산 에스테르나트륨, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 알킬글리코시드 등을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 계면활성제는 1종류이어도 2종류 이상이어도 좋다.
또한, 본 발명에서 사용되는 계면활성제는 의약품 첨가물로서 실적이 있는 것이 바람직하다. 의약품 첨가물로서 실적이 있는 계면활성제의 구체예로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85, 모노올레산 글리세린, 모노올레산 소르비탄, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 모노스테아르산 에틸렌글리콜, 모노스테아르산 글리세린, 모노스테아르산 소르비탄, 모노스테아르산 프로필렌글리콜, 모노스테아르산 폴리에틸렌글리콜, 모노팔미트산 소르비탄, 모노미리스트산 글리세린, 모노라우르산 소르비탄, 모노라우르산 폴리에틸렌글리콜, 트리올레산 소르비탄, 트리스테아르산 소르비탄, 폴리옥시틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌글리콜 공중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 지방산 디에탄올아미드(스테아르산 디에탄올아미드, 올레산 디에탄올아미드, 라우르산 디에탄올아미드 등), 레시틴, 지방산 나트륨(스테아르산 나트륨, 올레산 나트륨, 라우르산 나트륨 등), 알킬황산 에스테르나트륨 등을 예시할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하다. 비이온성 계면활성제의 구체예로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85, 모노올레산 글리세린, 모노올레산 소르비탄, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 모노스테아르산 에틸렌글리콜, 모노스테아르산 글리세린, 모노스테아르산 소르비탄, 모노스테아르산 프로필렌글리콜, 모노스테아르산 폴리에틸렌글리콜, 모노팔미트산 소르비탄, 모노미리스트산 글리세린, 모노라우르산 소르비탄, 모노라우르산 폴리에틸렌글리콜, 트리올레산 소르비탄, 트리스테아르산 소르비탄, 폴리옥시틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌글리콜 공중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 지방산 디에탄올아미드(스테아르산 디에탄올아미드, 올레산 디에탄올아미드, 라우르산 디에탄올아미드 등) 등을 예시할 수 있다.
상기 계면활성제 중에서도 지방산 에스테르 구조를 포함하는 계면활성제가 바람직하게 사용된다. 지방산 에스테르 구조의 구체예로서는 라우르산 에스테르, 팔미트산 에스테르, 스테아르산 에스테르, 올레산 에스테르 또는 경화 피마자유를 예시할 수 있고, 바람직하게는 라우르산 에스테르, 올레산 에스테르 또는 경화 피마자유를 예시할 수 있다. 지방산 에스테르 구조를 포함하는 계면활성제의 구체예로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85, 모노올레산 글리세린, 모노올레산 소르비탄, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 모노스테아르산 에틸렌글리콜, 모노스테아르산 글리세린, 모노스테아르산 소르비탄, 모노스테아르산 프로필렌글리콜, 모노스테아르산 폴리에틸렌글리콜, 모노팔미트산 소르비탄, 모노미리스트산 글리세린, 모노라우르산 소르비탄, 모노라우르산 폴리에틸렌글리콜, 트리올레산 소르비탄, 트리스테아르산 소르비탄, 폴리옥시틸렌 경화 피마자유 등을 예시할 수 있다.
또한, 지방산 에스테르 이외의 구조로서는 생체 적합성의 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 계면활성제의 지방산 에스테르 이외의 생태 적합성 분자의 구체예로서는 아미노산, 핵산, 인산, 당(예를 들면, 수크로오스, 소르비톨, 만노오스 또는 글루코오스 등의 단당), 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린을 예시할 수 있지만, 바람직하게는 단당 및/또는 폴리에틸렌글리콜로 구성되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 소르비톨이다. 지방산 에스테르 이외의 구조로서 생체 적합성의 분자를 포함하는 계면활성제의 구체예로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85, 모노올레산 글리세린, 모노올레산 소르비탄, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 모노스테아르산 에틸렌글리콜, 모노스테아르산 글리세린, 모노스테아르산 소르비탄, 모노스테아르산 프로필렌글리콜, 모노스테아르산 폴리에틸렌글리콜, 모노팔미트산 소르비탄, 모노미리스트산 글리세린, 모노라우르산 소르비탄, 모노라우르산 폴리에틸렌글리콜, 트리올레산 소르비탄, 트리스테아르산 소르비탄, 폴리옥시틸렌 경화 피마자유 등을 예시할 수 있고, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 트리올레산 소르비탄 또는 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유가 바람직한 구체예로서 예시할 수 있다.
면역원성 미립자에 있어서 계면활성제는 미립자에 내포되어 있다. 여기서 말하는 계면활성제의 내포란 미립자의 내부에 계면활성제가 존재하는 상태이고, 미립자 내부의 전체에 존재하고 있어도 좋으며, 미립자 내부의 일부에 편재하고 있어도 좋다. 계면활성제의 내포에 대해서는 미립자의 제조 공정에 계면활성제를 내포시키는 공정을 포함할 경우 계면활성제를 내포한 입자라고 생각한다. 면역원성 미립자에 있어서의 계면활성제의 양은 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위에 있어서는 특별히 제한은 없지만 면역원성 미립자의 제조 공정에 있어서의 양친매성 폴리머의 투입량에 대해서 바람직하게는 0.01~50%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1~20%(w/w), 더욱 바람직하게는 1~10%(w/w)이다. 면역원성 미립자 내의 계면활성제의 양은 양친매성 폴리머가 용해되는 용매를 사용해서 면역원성 미립자로부터 계면활성제를 추출하고, 그 추출액을 정제 후에 역상 칼럼을 사용해서 액체 크로마토그래피로 분석함으로써 그 추출액 내에 포함되는 계면활성제의 양을 측정한다. 상기 추출액 중에 포함되는 계면활성제의 양으로부터 면역원성 미립자의 제조 공정에 있어서의 양친매성 폴리머의 투입량에 대한 계면활성제의 양을 산출한다.
면역원성 미립자를 제조하는 방법으로서는 한정되지 않지만, 면역원성 미립자가 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 구성되는 경우의 예를 들면, (a) 항원을 용해한 수계용매 A와 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B를 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정 및 (b) 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거해서 면역원성 미립자를 얻는 공정을 포함하는 방법에 의해서 제조할 수 있다. 이하, 공정(a) 및 공정(b)에 대해서 설명한다.
공정(a)에 있어서의 수계용매 A에는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액을 사용한다. 상기 수용성 성분으로서, 예를 들면 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산 등을 예시할 수 있다.
또한, 공정(a)에 있어서의 수비혼화성 유기용매 B는 그 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이고 또한, 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머가 난용 또는 불용인 것이 바람직하며, 또한 동결 건조에 의해 휘산 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 수비혼화성 유기용매 B의 물에의 용해도는 바람직하게는 30g(수비혼화성 유기용매 B)/100㎖(물) 이하이다. 수비혼화성 유기용매 B의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화 메틸렌, 클로로포름을 예시할 수 있다.
수비혼화성 유기용매 B에 대한 수계용매 A의 비는 1,000:1~1:1, 바람직하게는 100:1~1:1이다. 상기 수비혼화성 유기용매 B 내의 양친매성 폴리머의 농도는 수비혼화성 유기용매 B, 양친매성 폴리머의 종류에 따라서 다르지만 0.01~90%(w/w), 바람직하게는 0.1~50%(w/w), 보다 바람직하게는 1~20%(w/w)이다.
계면활성제를 공정(a)에 사용하는 수계용매 A 및 수비혼화성 유기용매 B 중 어느 하나에 용해함으로써 면역원성 미립자에 내포시킬 수 있다. 공정(a)에 있어서 첨가되는 계면활성제의 양은 수비혼화성 유기용매 B에 용해되는 양친매성 폴리머 양에 대해서 바람직하게는 0.01~50%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1~20%(w/w), 더욱 바람직하게는 1~10%(w/w)이다.
공정(a)에 있어서의 수계용매 A, 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B에 의해 역상 에멀젼을 형성하는 공정에 있어서 제제학적 목적에 따라서 2종 이상의 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B에 의해 역상 에멀젼을 형성해도 좋다.
공정(a)에 있어서는 역상 에멀젼의 형성을 보조하여 균일하고 미소한 역상 에멀젼을 형성하는 목적을 위해서 공제(共劑)를 첨가할 수 있다. 공제로서는 탄소수 3~6의 알킬알콜, 탄소수 3~6의 알킬아민, 탄소수 3~6의 알킬카르복실산에서 선택되는 화합물이 바람직하다. 이들 공제의 알킬쇄의 구조는 특별히 한정되지 않고 직쇄 구조이어도 분기 구조이어도 좋으며, 포화 알킬이어도 불포화 알킬이어도 좋다. 본 발명에 있어서 공제로서는 tert-부탄올, iso-프로판올, 펜탄올이 특히 바람직하다.
공정(b)에 있어서 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 가열, 감압 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전 및, 그것들의 조합을 예시할 수 있다. 상기 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거하는 방법 중에서도 동결 건조는 역상 에멀젼 내의 입자의 합일 등에 의한 구조 변화가 적어 바람직하다. 동결 건조의 조건, 장치로서는 동결 과정과 감압 하에서의 건조 공정을 포함하는 것이고, 동결 건조의 상법인 예비 동결, 감압·저온 하에서의 1차 건조, 감압 하에서의 2차 건조를 거치는 공정이 특히 바람직하다. 예를 들면 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 수비혼화성 용매 분산체를 얻을 경우는 역상 에멀젼을 구성하는 수계용매 A와 수비혼화성 유기용매 B의 융점 이하로 냉각·동결하고, 이어서 감압 건조함으로써 동결 건조한 아쥬반트 미립자가 얻어진다. 예비 동결의 온도로서는 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만 -20℃ 이하가 바람직하다. 또한, 건조 과정에 있어서의 감압도도 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만 3,000㎩ 이하가 바람직하고, 500㎩ 이하가 건조 시간의 단축을 위해서 보다 바람직하다. 동결 건조에는 콜드 트랩을 구비한 진공 펌프와 접속 가능한 실험실용 동결 건조기나 의약품의 제조 등에 사용되는 선반식 진공 동결 건조기를 사용하는 것이 바람직하고, 액체 질소, 냉매 등에 의한 예비 동결된 후, 냉각 하 또는 실온에서 진공 펌프 등의 감압 장치로 감압 건조를 행하면 좋다.
또한, 면역원성 미립자가 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자로 구성되는 경우의 제조예를 들면, (a') 항원을 용해한 수계용매 A 및 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B를 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정, (b') 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거해서 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 얻는 공정, (c') 항원-아쥬반트 미립자 복합체 분산액 C를 표면 개질제를 포함하는 액상 D에 도입해서 분산매를 제거하는 공정에 의해 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 면역원성 미립자가 얻어진다.
공정(a')에 있어서의 수계용매 A 및 공정(b')에 있어서의 수비혼화성 유기용매는 상술한 공정(a) 및 공정(b)과 같은 조건이다.
공정(b')에 있어서 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거하는 방법으로서는 상술한 공정(b)의 방법과 같은 방법이 채용된다.
공정(c')에 있어서 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산시켜서 그 복합체 분산액 C를 조제하는 분산매로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 아쥬반트 미립자가 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수 부분을 외층에 갖는 경우는 그 구조를 보호할 목적으로 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이고 또한 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머를 실질적으로 용해하지 않는 용매인 것이 바람직하며, 그 경우 수비혼화성 유기용매이어도 수혼화성 유기용매이어도 좋다. 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이고 또한 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머를 실질적으로 용해하지 않는 용매의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화 메틸렌, 클로로포름, 디옥산, 톨루엔, 크실렌 등을 예시할 수 있다.
공정(c')에 있어서의 액상 D로서는 표면 개질제를 가용하고 또한, 분산액 C의 분산매보다 높은 비점을 갖는 것이 바람직하며, 수계용매, 수비혼화성 유기용매, 수혼화성 유기용매 중 어느 것이어도 좋다. 여기서 말하는 수계용매로서는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액이 바람직하고, 상기 수용성 성분으로서, 예를 들면 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산 등을 예시할 수 있다. 수비혼화성 유기용매로서는, 예를 들면 실리콘 오일, 참기름, 대두유, 콘유, 면실유, 코코넛유, 아마인유, 광물유, 피마자유, 경화 피마자유, 유동 파라핀, n-헥산, n-헵탄, 글리세롤, 올레산 등을 예시할 수 있다. 수혼화성 유기용매로서는, 예를 들면 글리세린, 아세톤, 에탄올, 아세트산, 디프로필렌글리콜, 트리에탄올아민, 트리에틸렌글리콜 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 본 발명에 있어서는 액상 D는 수계용매 또는 수혼화성 유기용매인 것이 바람직하다. 액상 D가 수계용매이고, 또한 분산매가 수비혼화성 유기용매인 경우에는 얻어지는 항원-아쥬반트 미립자 복합체 현탁액은 소위 솔리드 인 오일 인 워터(S/O/W)형 에멀젼으로 되며, 액상 D가 수비혼화성 유기용매 또는 수혼화성 유기용매이고 또한 분산매와 혼화되지 않을 경우에는 솔리드 인 오일 인 오일(S/O1/O2)형 에멀젼으로 된다.
계면활성제를 공정(a')에 사용하는 수계용매 A, 수비혼화성 유기용매 B 또는 공정(c')에 사용하는 분산액 C에 용해함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 면역원성 미립자에 내포시킬 수 있다. 한편, 계면활성제를 공정(c')에 사용하는 액상 D에 용해했을 경우에는 계면활성제는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 면역원성 미립자의 표면에 결합해 버리기 때문에 본 발명의 효과를 얻을 수 없다. 공정(a') 또는 공정(c')에 있어서 첨가되는 계면활성제의 양은 수비혼화성 유기용매에 용해되는 양친매성 폴리머 양에 대해서 바람직하게는 0.01~50%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1~20%(w/w), 더욱 바람직하게는 1~10%(w/w)이다.
공정(c')에 있어서 첨가되는 표면 개질제로서는 S/O/W형 에멀젼의 물-오일 계면 또는 S/O1/O2형 에멀젼의 오일-오일 계면을 안정화시키는 것이 바람직하고, 또한 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 콜로이드 안정성을 향상시키는 성질을 갖는 화합물인 것이 바람직하다. 여기서 콜로이드 안정성을 향상시킨다란 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 용매 내에 있어서의 응집을 막는 것 또는 지연시키는 것을 말한다. 또한 표면 개질제는 1종이어도 복수의 혼합물이어도 좋다.
표면 개질제는 친수성 폴리머 또는 양친매성 화합물인 것이 바람직하다.
표면 개질제인 친수성 폴리머로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산, 펩티드, 단백질, 당류 다당류 또는 어느 하나의 유연체인 것이 바람직하다. 상기 친수성 폴리머의 유연체로서는 친수성 폴리머를 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식한 것 등을 예시할 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
표면 개질제인 폴리에틸렌글리콜 유연체로서는 BASF Japan Ltd.에서 시판되는 "Pluronic"(BASF Japan Ltd.의 등록상표) 또는 그 동등품이 바람직하다.
표면 개질제인 폴리아미노산으로서는 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루탐산 또는 이것들의 유연체가 바람직하고, 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루탐산의 일부에 장쇄 알킬기를 도입한 유연체는 보다 바람직하다.
표면 개질제인 펩티드로서는 염기성 펩티드를 예시할 수 있고, 표면 개질제의 단백질로서는 젤라틴, 카제인 또는 알부민이 입자의 분산성 향상을 위해서 바람직하다. 그 이외에 단백질로서는 항체도 바람직한 일례로서 예시할 수 있다.
표면 개질제인 당류로서는 단당류, 올리고당류, 다당류가 바람직하다. 다당류로서는 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란이 바람직하고, 특히 콜레스테롤화 풀루란은 입자의 분산성 향상을 위해서 바람직하며, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란 중 어느 하나의 유연체가 바람직하다.
표면 개질제로서의 이들 펩티드, 단백질 또는 당류는 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식하거나 한 유연체나 상술한 친수성 폴리머나 양친매성 화합물을 수식한 유연체가 특히 바람직하다.
표면 개질제인 양친매성 화합물로서는 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌글리콜 공중합체, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 디지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 모노지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 디지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 활성제나, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 암모늄, 스테아릴 황산 나트륨 등의 알킬 황산염 또는 레시틴이 바람직하다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산시키는 분산매에 대한 액상 D의 용적비는 1,000:1~1:1,000, 바람직하게는 100:1~1:100이다. 또한, 이 용적비에 따라서 얻어지는 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 회합수는 변화하고, 액상 D의 비율이 높을수록 많은 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 수분산체가 얻어지며, 또한 적을 경우는 회합수가 적어지고, 용액비 1:4보다 액상 D의 비율이 작을 경우에는 대부분이 항원-아쥬반트 미립자 복합체 1개로 구성되는 입자의 수분산체로 되기 때문에 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자를 제조하는 일련의 과정에 있어서 액상 D의 용적비를 조정함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체와 그 복합체가 회합한 입자를 구분하여 만들 수 있다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체를 포함하는 분산매를 액상 D에 혼합시킬 경우에는 필요하면, 예를 들면 마그네틱 스터러 등의 교반 장치, 터빈형 교반기, 호모지나이저, 다공질막을 장비한 막 유화 장치 등을 사용해도 좋다.
액상 D에는 표면 개질제에 추가해서 제제학적인 목적에 따라서 각종 첨가물, 예를 들면 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당 등을 함유해도 좋다. 또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산시키는 분산매에는 상기 복합체의 분해 또는 붕괴에 의한 내포된 항원의 방출 속도의 제어를 목적으로 분산매에 가용인 각종 첨가제, 예를 들면 산성 화합물, 염기성 화합물, 양친매성 폴리머 또는 생분해성 폴리머 등을 함유해도 좋다.
그 이외에, 보다 미세한 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자를 제조할 목적으로 형성되는 솔리드 인 오일 인 워터(S/O/W)형 에멀젼 또는 솔리드 인 오일 인 오일(S/O1/O2)형 에멀젼의 유화 조작을 행해도 좋다. 유화방법은 안정된 에멀젼을 조제할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 교반에 의한 방법, 고압 호모지나이저, 고속 호모 믹서 등을 사용하는 방법 등을 예시할 수 있다.
항원-아쥬반트 미립자 복합체를 일단 분산매에 분산시켜서 얻어진 분산액 C를 표면 개질제를 포함하는 액상 D에 첨가했을 경우에는 분산매를 제거함으로써 소망의 아쥬반트 미립자가 회합한 입자의 현탁액이 얻어진다. 분산매를 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 액중 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전을 예시할 수 있고, 액중 건조, 동결 건조가 특히 바람직하다. 액상 D로서 수계용매를 사용했을 경우에는 본 공정에 의해 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 수계 분산체가 얻어진다.
또한, 표면 개질제가 면역원성 미립자에 결합하고 있는 것에 대해서도 바람직한 형태의 하나이다. 여기서 말하는 결합이란 비공유 결합이어도 공유 결합이어도 좋다. 비공유 결합은 바람직하게는 소수적인 상호 작용이지만 정전 상호 작용, 수소 결합, 반데르발스힘이어도 좋고, 그것들이 복합된 결합이어도 좋다. 비공유 결합에 있어서는 양친매성 폴리머를 포함하는 면역원성 미립자의 폴리(히드록시산)과 표면 개질제의 소수 부분이 소수적인 상호 작용에 의해 결합되어 있는 것이 바람직하고, 이 경우 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 분산매가 물, 완충액, 생리식염수, 표면 개질제 수용액 또는 친수성 용매인 미립자 분산체인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 면역원성 조성물이란 생체 내에서 면역 응답을 일으킬 수 있는 조성물이고, 상기 면역원성 미립자를 유효 성분으로서 포함하고 있다. 면역원성 조성물을 생성시키는 면역 응답의 종류는 한정되지 않는다. 생성시키는 면역 응답의 종류로서는 Th1형 면역 응답이나 Th2형 면역 응답이 있고, 항원이나 투여 부위, 투여방법의 종류에 따라서 어느 쪽의 면역 응답이 우위로 발생되는 것이 알려지지만, 본 발명은 Th1형, Th2형 양쪽 모두의 타입의 면역 응답을 발생시킬 수 있다. Th1형의 면역 반응은 실시예에서 나타낸 바와 같이 소입경의 본 발명의 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 복합체가 회합한 입자에 의해 효과적으로 발생시킬 수 있다. Th1형의 면역 응답과 Th2 면역 응답의 정도에 관해서는 기지의 다양한 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들면 마우스의 경우는 IgG2a 항체의 산생량이 Th1형 면역 응답의 지표로서 알려진다. 또한 Th2형 면역 응답의 지표로서는 IgG1 항체, 총 IgG 항체량이 지표로서 알려진다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역 활성화 물질을 더 포함함으로써 높은 면역 활성화 활성을 실현할 수 있다. 이것들의 면역 활성화 물질은 아쥬반트 미립자 밖에 있어도 좋고, 내포되어 있어도 좋지만, 아쥬반트 미립자에 내포되어 있는 것이 바람직하다. 면역 활성화 물질로서 예를 들면, 오일류, 알루미늄염, 칼슘염, 겔성 고분자, 면역 활성화 사이토카인, TLR 수용체 리간드 등 면역 활성화 물질로서 기능할 수 있는 것이면 한정되지 않지만, 면역 활성화 사이토카인 또는 TLR 수용체 리간드가 바람직하다.
면역 활성화 사이토카인으로서는 인터류킨 12, 인터페론 α, 인터류킨 18, TNF α, 인터류킨 6, NO, 인터페론 γ, 인터페론 β를 예시할 수 있다.
TLR 수용체 리간드로서는 리포단백질, poly I:C, poly I:CLC 등의 2개쇄 RNA, 플라젤린, 1개쇄 RNA, CpG, 프로필린, MPL, QS21, TDM이고, 바람직하게는 2개쇄 RNA, 1개쇄 RNA, CpG 등의 핵산이며, 보다 바람직하게는 CpG이다. 여기서 CpG란 바이러스, 세균 등에 존재하는 비메틸화 CpG(시토신-구아닌) 모티프 DNA를 나타낸다(일본 특허 공표 2001-503254호 공보 참조). CpG 모티프에는 다양한 유효 배열이 보고되고 있지만 배열의 종류는 면역 활성화능을 갖는 한은 제한되지 않고, 염기 아날로그를 사용한 것이어도 각종 수식체이어도 좋다.
본 발명의 면역원성 조성물을 의약품 조성물이나 백신으로서 사용하는 경우 양친매성 폴리머, 친수성 활성 물질, 표면 개질제, 분산매 이외에 제제학적으로 유용한 각종 첨가제를 함유하고 있어도 좋고, 첨가할 수 있는 첨가물로서 바람직하게는 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당이다.
본 발명의 면역원성 조성물을 사용해서 면역 응답을 일으키는 방법에 대해서는 한정되지 않고, 면역원성 조성물을 생체에 투여해도 좋고, 생체 밖에 적출한 면역 담당 세포에 접촉시켜도 좋다. 면역원성 조성물을 생체에 투여하는 방법으로서는 한정되지 않지만, 예를 들면 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경구 투여, 경피 투여, 설하 투여, 질내 투여, 복강내 투여, 림프절 투여 등이고, 바람직하게는 피내 투여 또는 피하 투여이다.
본 발명의 면역원성 조성물을 사용해서 면역 응답을 일으킬 경우의 사용 용량에 대해서는 목적으로 하는 면역 반응을 발생시키는데 필요한 항원량은 항원의 종류나 투여 방법, 투여 횟수에 따라서 적당히 설정되지만, 예를 들면 인간에 대해서 본 발명의 면역원성 조성물을 피하 투여해서 면역 응답을 유도할 경우 면역원성 조성물에 함유되는 항원량으로서 1회당 0.01~1,000㎍이 투여된다. 또한, 투여 횟수에 대해서도 사용 용량과 마찬가지로 적당히 설정되지만, 본 발명의 면역원성 조성물은 지속적으로 면역 응답을 발생시키는 작용을 갖고 있기 때문에 1~10회의 투여에 의해 면역 응답을 유도하는 것이 가능하다.
투여하는 생체는 인간이어도 인간 이외의 동물이어도 좋지만, 바람직하게는 인간 또는 가축, 애완 동물 또는 실험 동물로서 사육되고 있는 돼지, 소, 닭, 양, 말, 당나귀, 염소, 낙타, 개, 고양이, 페럿, 토끼, 원숭이, 래트, 마우스 또는 기니피그이다.
(실시예)
이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.
(실시예 1) 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)의 합성
(1-1) TMS-덱스트란(화합물(1))의 합성
덱스트란(NACALAI TESQUE, Inc., 나카라이 규격 특급 적합품, 수 평균 분자량 13,000, 5.0g)을 포름아미드(100㎖)에 첨가하고, 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔(100㎖)을 20분 걸쳐서 적하했다. 적하 종료 후 80℃에서 2시간 교반했다. 반응 종료 후 반응 용액을 실온으로 되돌리고, 분액 깔때기로 2층을 분리했다. 상층을 감압 하 농축한 후 메탄올(300㎖)을 첨가하고, 얻어진 고체를 여과, 건조하여 TMS-덱스트란(화합물(1))(11.4g)을 백색 고체로서 얻었다.
(1-2) 덱스트란-PLGA(화합물(2))의 합성
화합물(1)(0.5g)과 tert-부톡시칼륨(35㎎)을 가열 감압 하 2시간 건조 후 테트라히드로푸란(10㎖)을 첨가하고, 1.5시간 실온에서 교반했다. 이 용액에 (DL)-락티드(0.56g)와 글리콜리드(0.9g)의 테트라히드로푸란(15㎖) 용액을 적하하고, 5분간 교반 후 아세트산을 2방울 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후 용매를 감압 하 농축하고, 클로로포름-메탄올계 및 클로로포름-디에틸에테르계로 재침전 정제를 행함으로써 얻어지는 백색 고체를 클로로포름(9㎖)에 용해했다. 이 용액에 트리플루오로아세트산(1.0㎖)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반했다. 반응 종료 후 용매를 감압 하 증류 제거 후 잔사를 클로로포름(10㎖)에 용해하고, 0℃로 냉각한 디에틸에테르에 적하함으로써 얻어진 생성물을 여과함으로써 양친매성 폴리머인 덱스트란-PLGA를 백색 고체로서 얻었다(화합물(2)). 1H-NMR 측정에 의해 덱스트란-PLGA의 PLGA 그래프트쇄의 수 평균 분자량 5571, 그래프트쇄 수 30으로 결정했다.
(실시예 2) 면역원성 미립자(입자(1)~(10) 및 비교 입자(1), (2))의 조제
실시예 1의 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물(2)) 5㎎을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50㎎/㎖의 양친매성 폴리머 용액(B)을 조제했다. 양친매성 폴리머 용액(B)에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후 0.025%(w/v) CEA(태아성 암 항원)(COSMO BIO Co., Ltd.) 수용액(A) 50㎕를 적하하고, 볼텍스 믹서로 교반해서 역상 에멀젼을 제조했다.
그 역상 에멀젼을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜서 분산액(C)을 조제했다. 분산액(C)을 표 1에 나타내는 표면 개질제(폴리비닐알콜 또는 Pluronic F-68)를 10%(w/v) 포함하는 수용액 2㎖에 적하하고, 볼텍스 믹서로 교반·유화시켜서 S/O/W형 에멀젼을 조제했다. 그 S/O/W형 에멀젼으로부터 액중 건조에 의해 탄산 디메틸을 제거해서 면역원성 미립자 현탁액으로 했다. 그 현탁액을 15㎖ 튜브에 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에 입자를 10㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 입자를 재침전시켰다. 이 세정 조작을 또 한번 반복하여 상청을 제거한 후에 입자를 5%(w/v) 만니톨, 0.5%(w/v) 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 및 0.1%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 수용액 200㎕에 현탁시켰다. 그 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조함으로써 면역원성 미립자를 얻었다.
계면활성제는 표 1에 나타내는 바와 같이 CEA 수용액(A), 양친매성 폴리머 용액(B) 및 분산액(C) 중 어느 하나의 용액에 대해서 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 트리올레산 소르비탄, 모노올레산 소르비탄(모두 KANTO CHEMICAL Co., Inc. 제품) 및 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(NITTO CHEMICAL Co., Ltd. 제품) 중 어느 하나를 양친매성 폴리머 양에 대해서 10%(w/w)에 상당하는 500㎍을 용해했다.
(실시예 3) 면역원성 미립자에 있어서의 항원 내포율의 측정
<방법>
실시예 2의 방법으로 작성된 면역원성 미립자(입자(3)~(7) 및 비교 입자(2))를 200㎕의 인산 완충 생리식염수로 현탁하여 입자 현탁액을 조제했다. 입자 현탁액 100㎕를 에펜도르프 튜브에 옮기고, 1㎖의 증류수를 첨가해서 13,000rpm, 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후 입자를 1㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 입자를 재침전시켰다. 상청을 제거한 후 입자를 염화 메틸렌과 아세톤을 1:3의 비율로 혼합한 혼합 용액 0.5㎖에 용해시켰다. 그 입자 용해액을 13,000rpm, 10분간의 원심에 의해 CEA를 침전시켰다. 상청을 제거한 후 침전을 혼합 용액 0.5㎖에 용해하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 CEA를 재침전시켰다. 상청을 제거한 후 30분간 원심 건조를 행해서 CEA의 침전을 건조시켰다. CEA의 침전에 겔 전기 영동용 샘플링 버퍼(TEFCO사 제품)를 첨가해서 95℃에서 3분간 용해시킨 후에 폴리아크릴아미드겔(TEFCO사 제품)을 사용해서 겔 전기 영동을 행했다. 영동 후 콜로이드 CBB 염색 키트(TEFCO사 제품)를 사용해서 염색을 행하고, CEA의 입자에의 내포율을 산출하여 표 2에 나타냈다.
<결과>
면역원성 미립자의 항원(CEA) 내포율은 표 2와 같이 되어 어떤 계면활성제가 함유된 면역원성 미립자(입자(3)~(7))라도 계면활성제를 함유하고 있지 않은 입자(비교 입자(2))와 같은 정도의 내포율이고, 계면활성제는 면역원성 미립자에 있어서의 항원의 내포율에 악영향을 주지 않는 것이 나타났다.
(실시예 4) CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(1)
<방법>
실시예 2에서 작성된 폴리소르베이트 80 및 트리올레산 소르비탄을 함유하는 면역원성 미립자(입자(1), (2))를 200㎕의 인산 완충 생리식염수로 현탁해서 투여 용액으로 했다. 본 용액을 7주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC, Inc.)의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 계면활성제를 포함하지 않는 입자(비교 입자(1)), 또는 CEA 용액 50㎕와 아쥬반트로서 "Imject Alum"(Thermo Fisher Scientific K.K. 제품, 이하, Alum이라고도 말함) 50㎕를 혼합한 용액을 각각 Balb/C 마우스의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하여 항체가의 경시 변화를 도 1에 나타냈다.
투여한 마우스는 자유롭게 급이(給餌), 급수 가능한 환경에서 사육하여 경시적으로 꼬리 정맥에서 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 최종 농도 3.3IU/㎖의 헤파린을 첨가해서 5,000rpm에서 5분간 원심해서 혈장을 회수하여 혈장 내의 CEA에 대한 항체가를 측정했다. CEA에 대한 항체가는 이하의 방법으로 측정을 행했다. 96웰 마이크로 플레이트(Nunc사 제품 MaxiSorp)에 1㎍/㎖의 CEA 단백을 포함하는 PBS 용액 100㎕를 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 용액을 버리고, 0.5% BSA를 포함하는 PBS 400㎕를 넣어서 실온에서 2시간 블록킹을 행했다. 웰을 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS) 400㎕로 1회 세정 후 희석액(0.25% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 1,000배 내지 100,000배로 희석한 혈장 샘플 100㎕를 넣고, 실온에서 40분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후 HRP(서양 고추냉이 페록시다아제) 표식 항마우스 IgG 항체(Zymed사)(희석액으로 10,000배 희석) 100㎕을 넣고, 실온에서 20분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후 발색액(0.006% 과산화수소, 0.2㎎/㎖ 테트라메틸벤지딘을 포함하는 0.1M 아세트산-시트르산 나트륨 완충액(pH4.5))을 100㎕ 넣고, 실온에서 10분간 진탕 반응을 행했다. 1N 황산 100㎕를 첨가해서 반응을 정지하고, 마이크로 플레이트 리더를 사용해서 450㎚의 흡광도를 측정했다. 표준 샘플로서 단계 희석한 항CEA 단일클론 항체(Affinity Bioreagents사 제품 MA1-5308)를 동시에 측정하고, 이것을 검량선으로 해서 각 샘플 내의 항체량을 중량 농도(ng/㎖)로 환산했다.
<결과>
혈장 내의 항CEA 항체가의 평균치의 경시 변화를 도 1에 나타낸다. 폴리소르베이트 80을 함유한 입자(1) 및 트리올레산 소르비탄을 함유한 입자(2)는 8주일에 걸쳐서 지속적인 항체가 상승 효과를 나타내고, 비교예인 항원+Alum의 투여를 크게 상회했다. 또한 계면활성제를 포함하지 않는 비교 입자(1)에 비해서도 높은 항체가를 나타내고, 면역원성 미립자는 계면활성제를 함유함으로써 보다 강한 아쥬반트능을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 5) CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(2)
<방법>
실시예 2에서 작성된 면역원성 미립자(입자(3)~(7))를 실시예 4에 나타내는 방법으로 7주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC, Inc.)의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 계면활성제를 포함하지 않는 입자(비교 입자(2))를 Balb/C 마우스의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하여 도 2에서는 항체가의 평균치를 나타냈다. 채혈 및 항체가의 측정은 실시예 4에 나타낸 방법으로 행했다.
<결과>
투여 후 4주일째의 혈장 내의 항CEA 항체가의 평균치를 도 2에 나타낸다. 실시예 4에서 나타낸 폴리소르베이트 80 또는 트리올레산 소르비탄을 함유한 입자((3), (4))와 마찬가지로 폴리소르베이트 20, 모노올레산 소르비탄 또는 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유를 함유한 입자((5)~(7))에 있어서도 계면활성제를 함유하고 있지 않은 비교 입자(2)에 비해서 높은 항체가를 나타내고, 면역원성 미립자는 계면활성제를 함유함으로써 보다 강한 아쥬반트능을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 6) CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(3)
<방법>
실시예 2에서 작성된 폴리소르베이트 80을 함유하는 면역원성 미립자(입자(8)~(10))를 실시예 4에 나타낸 방법으로 7주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC, Inc.)의 풋패드에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 또한 비교예로서 항원 용액 50㎕와 Alum 50㎕를 혼합한 용액을 Balb/C 마우스의 풋패드에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 3마리의 마우스에 투여하여 도 3에서는 항체가의 평균치를 나타냈다. 항체가의 측정은 실시예 4에 나타낸 방법으로 행했다.
<결과>
투여 후 2주일째의 혈장 내의 항CEA 항체가의 평균치를 도 3에 나타낸다. 조제 공정에 있어서 폴리소르베이트 80을 용해한 용액의 다른 입자((8)~(10))의 항체가는 모두 비교예인 항원+Alum의 투여를 크게 상회했다. 즉, 계면활성제를 CEA 수용액(A), 양친매성 폴리머 용액(B) 및 분산액(C)의 어느 쪽에 용해했을 경우에나 얻어지는 면역원성 미립자는 강한 아쥬반트능을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 7) 면역원성 미립자에 함유되는 계면활성제의 측정
<방법>
실시예 2에서 제작한 폴리소르베이트 80을 함유하는 면역원성 미립자(입자(1))를 1㎖의 증류수에 현탁시켜서 13,000rpm, 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후 입자를 1㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 입자를 재침전시켰다. 상청을 제거한 후 입자를 100㎕의 아세트산 에틸에 용해시켰다. 상기 입자 용해액에 300㎕의 에탄올을 첨가한 후에 13,000rpm, 10분간의 원심에 의해 양친매성 폴리머를 침전시켰다. 상청을 회수하고, 감압 증류 제거에 의해 용매를 제거한 다음, 잔사를 100㎕의 증류수에 용해시킴으로써 입자 추출액을 작성했다. 그 입자 추출액을 역상 칼럼(YMC-Pack PROTEIN-RP, YMC사 제품)을 사용해서 고속 액체 크로마토그래피(Shimadzu Corporation 제품)에 의해 분석함으로써 면역원성 미립자에 포함되는 폴리소르베이트 80의 함량을 측정했다.
<결과>
고속 액체 크로마토그래피에 의한 분석에 의해 상기 입자 추출액 내에 0.24(w/v)%의 폴리소르베이트 80이 포함되어 있는 것이 확인되었다. 본 결과에서 면역원성 미립자를 구성하는 양친매성 폴리머의 투입량에 대해서 4.8(w/w)%의 폴리소르베이트 80이 면역원성 미립자 내에 포함되는 것이 분명해져서 실시예 2의 조제 공정에 있어서 첨가한 폴리소르베이트 80의 48%(w/w)가 면역원성 미립자 내에 포함되는 것이 나타났다.
(실시예 8) CEA 함유 면역원성 미립자(입자(11)~(15) 및 비교 입자(3)~(5))의 조제
실시예 1에서 작성된 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물(2)) 5㎎을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50㎎/㎖의 양친매성 폴리머 용액(B)을 조제했다. 양친매성 폴리머 용액(B)에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후 0.025%(w/v) CEA(태아성 암 항원)(COSMO BIO Co., Ltd.) 수용액(A) 50㎕를 적하하고, 볼텍스 믹서로 교반해서 역상 에멀젼을 제조했다.
상기 역상 에멀젼을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜서 분산액(C)을 조제했다. 분산액(C)을 표면 개질제(Pluronic F-68)를 10%(w/v) 포함하는 수용액(D) 2㎖에 적하하고, 볼텍스 믹서로 교반·유화시켜서 S/O/W형 에멀젼을 조제했다. 그 S/O/W형 에멀젼으로부터 액중 건조에 의해 탄산 디메틸을 제거해서 면역원성 미립자 현탁액으로 했다. 그 현탁액을 15㎖ 튜브에 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에 입자를 10㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 입자를 재침전시켰다. 이 세정 조작을 또 한번 반복하고, 상청을 제거한 후에 입자를 5%(w/v) 만니톨, 0.5%(w/v) 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 및 0.1%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 수용액(주사액(E)) 200㎕에 현탁시켰다. 그 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조함으로써 면역원성 미립자를 얻었다.
계면활성제는 표 3에 나타내는 바와 같이 CEA 수용액(A), 양친매성 폴리머 용액(B) 및 분산액(C) 중 어느 하나의 용액에 폴리소르베이트 80을 양친매성 폴리머 양에 대해서 10%(w/w), 1%(w/w) 및 0.1%(w/w) 중 어느 하나에 상당하는 양을 용해하여 입자(11)~(15)를 조제했다. 또한, 비교 입자로서 표면 개질제를 포함하는 수용액(D) 및 주사액(E) 중 어느 하나의 용액에 대해서 폴리소르베이트 80을 양친매성 폴리머 양에 대해서 10%(w/w)에 상당하는 양을 용해해서 계면활성제가 면역원성 미립자의 표면에 결합한 비교 입자(3), 계면활성제와 면역원성 미립자가 결합하지 않고 공존하고 있는 비교 입자(4)를 조제함과 아울러 면역원성 미립자의 조제의 공정 중에 계면활성제를 첨가하지 않은 비교 입자(5)를 조제했다.
(실시예 9) CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(4)
<방법>
실시예 8에서 작성된 면역원성 미립자(입자(11)~(13))를 실시예 4에 나타낸 방법으로 7주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC, Inc.)의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 계면활성제의 첨가방법이 다른 입자(비교 입자(3), (4))를 Balb/C 마우스의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하여 도 4에서는 항체가의 평균치를 나타냈다. 채혈 및 항체가의 측정은 실시예 4에 나타낸 방법으로 행했다.
<결과>
투여 후 5주일째의 혈장 내의 항CEA 항체가의 평균치를 도 4에 나타낸다. 계면활성제를 CEA 수용액(A), 폴리머 용액(B) 및 분산액(C)에 첨가한 입자(입자(11)~(13))의 경우에는 S/O/W형 에멀젼 내부에 계면활성제가 존재하기 때문에 계면활성제는 미립자에 내포되어 있다. 한편, 표면 개질제를 포함하는 수용액(D)에 첨가한 입자(비교 입자(3))의 경우에는 S/O/W형 에멀젼 외부에 폴리소르베이트 80이 존재하기 때문에 계면활성제는 미립자의 표면에 결합해서 존재하고 있다. 주사액(E)에 첨가한 입자(비교 입자(4))의 경우에는 계면활성제와 미립자가 결합하지 않고 공존하고 있다. 계면활성제를 내포한 면역원성 미립자(입자(11)~(13))는 계면활성제가 표면에 결합해서 존재하는 입자(비교 입자(3))나 계면활성제가 표면에 결합하지 않고 존재하고 있는 경우(비교 입자(4))에 비해 높은 항체가를 나타내기 때문에 본 발명에 있어서는 계면활성제가 면역원성 미립자에 내포되는 것이 중요하다는 것이 나타났다.
(실시예 10) CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(5)
<방법>
실시예 8에서 작성된 면역원성 미립자(입자(11), (14), (15))를 실시예 4에 나타낸 방법으로 7주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC, Inc.)의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 계면활성제를 포함하지 않는 입자(비교 입자(5))를 Balb/C 마우스의 등부 피하에 1마리당 CEA 5㎍이 되도록 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하여 도 5에서는 항체가의 평균치를 나타냈다. 채혈 및 항체가의 측정은 실시예 4에 나타낸 방법으로 행했다.
<결과>
투여 후 3주일째의 혈장 내의 항CEA 항체가의 평균치를 도 5에 나타낸다. 계면활성제를 내포한 입자(입자(11), (14), (15))는 계면활성제를 포함하지 않는 입자(비교 입자(5))에 비해서 높은 항체가를 나타냈다. 또한, 계면활성제를 내포한 입자간에는 계면활성제의 첨가량이 많은 입자가 보다 높은 항체가를 나타냄으로써 입자에 내포되는 계면활성제의 양이 많은 쪽이 보다 높은 효과가 얻어지는 것이 나타났다.
(실시예 11) 면역원성 미립자에 함유되는 계면활성제의 측정(2)
<방법>
실시예 8에서 제작한 면역원성 미립자(입자(11)~(13) 및 비교 입자(3))를 사용해서 실시예 7에 나타낸 방법으로 면역원성 미립자에 포함되는 폴리소르베이트 80의 함량을 측정했다.
<결과>
고속 액체 크로마토그래피에 의한 분석에 의해 면역원성 미립자를 구성하는 양친매성 폴리머의 투입량 및 제조 공정에서 첨가한 양에 대한 폴리소르베이트 80의 함량을 표 4에 나타낸다. 계면활성제를 CEA 수용액(A), 폴리머 용액(B) 및 분산액(C)에 첨가한 입자(입자(11)~(13))에서는 조제 공정에서 계면활성제는 미립자에 내포되어 있기 때문에 실시예 8의 조제 공정에 있어서 첨가한 계면활성제의 약 30%(w/w)가 입자에 포함되는 것이 나타났다. 한편, 계면활성제를 표면 개질제를 포함하는 수용액(D)에 첨가한 입자(비교 입자(3))에서는 계면활성제가 미립자의 표면에 결합해 버리기 때문에 조제 공정에서 첨가한 계면활성제의 약 3%밖에 포함되지 않는 것이 나타났다.
(실시예 12) OVA 함유 면역원성 미립자(입자(16)~(18) 및 비교 입자(6))의 조제
실시예 1에서 작성된 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물(2)) 5㎎을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50㎎/㎖의 양친매성 폴리머 용액(B)을 조제했다. 양친매성 폴리머 용액(B)에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후 0.25%(w/v) OVA(난백 알부민)(Sigma사) 수용액(A) 50㎕를 적하하고(OVA 투입량: 125㎍), 볼텍스 믹서로 교반해서 역상 에멀젼을 제조했다.
상기 역상 에멀젼을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜서 분산액을 조제했다. 분산액을 표면 개질제(Pluronic F-68)를 10%(w/v) 포함하는 수용액(C) 2㎖에 적하하고, 볼텍스 믹서로 교반·유화시켜서 S/O/W형 에멀젼을 조제했다. 그 S/O/W형 에멀젼으로부터 액중 건조에 의해 탄산 디메틸을 제거해서 면역원성 미립자 현탁액으로 했다. 그 현탁액을 가지 플라스크에 옮기고, 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에서 24시간 동결 건조함으로써 면역원성 미립자를 얻었다.
계면활성제는 표 5에 나타내는 바와 같이 OVA 수용액(A) 및 양친매성 폴리머 용액(B) 중 어느 하나에 대해서 폴리소르베이트 80, 모노올레산 소르비탄(모두 KANTO CHEMICAL Co., Inc. 제품) 및 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(NITTO CHEMICAL Co., Ltd. 제품) 중 어느 하나를 양친매성 폴리머 양에 대해서 10%(w/w)에 상당하는 500㎍을 용해했다.
(실시예 13) OVA 함유 면역원성 조성물의 마우스 복강 매크로파지를 사용한 인 비트로 자극 시험
<방법>
마우스 복강 매크로파지를 사용한 인 비트로 자극 시험을 이하에 나타내는 방법으로 행했다. 수컷 Balb/c 마우스 12주령의 복강 내에 26G 주사 바늘(TERUMO사)을 사용해서 자극액으로서 티오글리콜산 배지(GIBCO사) 5㎖를 투여하여 자유 급이 하에서 72시간 사육했다. 드라이 아이스를 사용해서 안락사시킨 마우스의 복강 내에 26G 주사 바늘을 사용해서 PBS 용액(0℃, 필터 여과 완료) 10㎖를 주입한 다음, 마우스 복부를 마사지하면서 5분간 방치했다. 그 후, 마이크로 피펫을 사용해서 마우스 복강 세포를 포함하는 용액을 회수했다.
회수한 용액은 냉각 원심기(Hitachi, Ltd. 제품, himac CF16RX)를 사용해서 4℃, 400g×5분의 조건에서 원심하여 마우스 복강 세포를 침전시킨 다음 상청을 제거하고, 다시 RPMI 1640배지(GIBCO사)(이하, 세정 용액) 10㎖를 첨가해서 재현탁시켰다. 다시 400g×5분, 4℃의 조건에서 원심하여 상청을 제거한 후 24웰 플레이트(IWAKI&Co., Ltd. 마이크로플레이트, Flat Bottom Tissue culture Treated, Polystyrene)에 1웰당 8×105세포가 되도록 5% FBS(SIGMA사), 100단위/㎖ 페니실린(Invitrogen), 100단위/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 RPMI 1640배지(이하, 배양 배지) 1㎖와 함께 파종했다. 파종한 플레이트는 CO2인큐베이터(NAPCO사)를 사용해서 5% CO2, 37℃, 습도 100%의 조건(매크로파지 배양 조건)에서 3시간 인큐베이팅하고, 그 후 마이크로 피펫을 사용해서 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되지 않은 세포를 제거 후 플레이트에 접착된 마우스 복강 매크로파지만으로 했다. 세포는 배양 배지를 첨가해서 매크로파지 배양 조건에서 5일간 인큐베이팅한 후에 실험에 사용했다.
세포에 첨가하는 입자로서는 실시예 12에서 제작한 계면활성제를 내포한 면역원성 미립자(입자(16)~(18))의 동결 건조 상태의 것을 전처리해서 사용했다. 구체적으로는 1.5㎖ 튜브에 입자를 구성하는 양친매성 폴리머 양으로 3㎎ 상당의 입자를 칭량해서 세정 용액을 첨가하여 0℃로 사전에 냉각한 다음, 8400g, 10분의 조건에서 3회 세정 후 마우스 복강 매크로파지를 파종한 24웰 플레이트 1웰당에 500㎕의 배양 배지와 함께 첨가했다. 비교예로서는 계면활성제를 포함하지 않는 입자(비교 입자(6))를 마찬가지로 첨가했다.
또한, 다른 비교예(비교예(1)~(3))로서 표 6에 나타낸 바와 같이 마우스 복강 매크로파지를 파종한 24웰 플레이트 1웰당, 입자(16)~(18)에 포함되는 OVA 양과 같은 75㎍(양친매성 폴리머 투입량과 OVA 투입량의 중량비로부터 환산)의 OVA 및 300㎍의 폴리소르베이트 80, 모노올레산 소르비탄 및 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 중 어느 하나를 500㎕의 배양 배지와 함께 첨가하고, 또한 비교예(4)로서 75㎍의 OVA를 500㎕의 배양 배지와 함께 첨가했다.
입자를 첨가한 세포를 24시간 배양한 다음, 배지를 회수하여 배지에 포함되는 TNFα량을 ELISA에서 측정했다. ELISA에 의한 측정에는 Thermo Fisher Scientific K.K.의 키트를 사용했다.
<결과>
배지 내의 TNFα의 농도를 도 6에 나타낸다. 계면활성제를 내포한 입자(입자(16)~(18))는 내포하지 않은 입자(비교 입자(6))에 비해 높은 TNFα 농도를 나타냈다. TNFα는 면역 유도를 행하는 사이토카인의 1종이고, 입자에 계면활성제를 내포함으로써 효율적으로 면역이 유도되는 것이 나타났다. 또한, 입자화되어 있지 않은 항원 및 계면활성제를 첨가한 비교예(비교예(1)~(4))에서는 TNFα의 농도가 입자화했을 경우에 비해서 낮음으로써 면역의 유도에는 입자화가 중요하다는 것이 나타났다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 면역원성 조성물은 감염증이나 암 등의 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 이용할 수 있다.
Claims (12)
- 소수성 세그먼트는 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체로 이루어지는 면역원성 미립자 및 계면활성제를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물로서:
상기 소수성 세그먼트인 상기 폴리(히드록시산)은 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)이고,
상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 폴리에틸렌글리콜 또는 다당이고,
상기 계면활성제는 상기 면역원성 미립자에 내포되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 면역원성 미립자는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 계면활성제는 지방산 에스테르 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 아쥬반트 미립자는 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 내부에 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수 부분의 외층을 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 다당인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 5 항에 있어서,
상기 다당은 덱스트란인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 폴리(히드록시산)은 폴리(락트산-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 계면활성제는 단당 및 폴리에틸렌글리콜 구조 중 적어도 어느 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 모노올레산 소르비탄, 트리올레산 소르비탄 및 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물. - 항원을 용해한 수계용매 A 또는 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B에 계면활성제를 용해하고, 그것들을 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정, 및 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거하는 공정에 의해 얻어지는 면역원성 미립자로서, 상기 소수성 세그먼트인 상기 폴리(히드록시산)은 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)이고, 상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 폴리에틸렌글리콜 또는 다당인 면역원성 미립자를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 항원을 용해한 수계용매 A 및 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기용매 B를 혼합함으로써 역상 에멀젼을 형성하는 공정, 역상 에멀젼으로부터 용매를 제거해서 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 얻는 공정, 및 항원-아쥬반트 미립자 복합체 분산액 C를 표면 개질제를 용해한 액상 D에 도입해서 분산매를 제거하는 공정을 포함하는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 제조 공정에 의해 제조되는 면역원성 미립자로서, 상기 공정 중, 상기 수계용매 A, 상기 수비혼화성 유기용매 B 또는 상기 분산액 C에 계면활성제를 용해시킴으로써 얻어지는 면역원성 미립자이고, 상기 소수성 세그먼트인 상기 폴리(히드록시산)은 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)이고, 상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 폴리에틸렌글리콜 또는 다당인 면역원성 미립자를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
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