CN101460620B

CN101460620B - 免疫刺激寡核苷酸及其药物用途

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Publication number: CN101460620B
Application number: CN2007800200966A
Authority: CN
Inventors: 岩村智胜; 成见英树; 益本创; 金田明仁; 曾根田明子; 审良静男
Original assignee: Osaka University NUC; Toray Industries Inc
Current assignee: Osaka University NUC; Toray Industries Inc
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2027-05-31
Also published as: EP2034015A1; ES2389112T3; US8592566B2; EP2034015B1; KR101065760B1; EP2034015A4; CA2653939C; CA2653939A1; PL2034015T3; AU2007268534A1; JP5161770B2; DK2034015T3; JPWO2007139190A1; AU2007268534B2; CN101460620A; KR20090018798A; US20090263413A1; WO2007139190A1

Abstract

本发明提供IFN诱导活性增强、且炎症性细胞因子诱导活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸以及含有该寡核苷酸的药物及其用途。即，本发明提供免疫刺激寡核苷酸及其药物用途，其特征在于：该免疫刺激寡核苷酸含有式5′-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′所示的碱基序列(X和Y各自独立，为0-10个核苷酸长，且不含有4个碱基或以上的连续的G的任意序列，X+Y的长度为6-20个核苷酸长，XCGY至少含有8个核苷酸长度的回文序列，长度为8-22个核苷酸长；P和Q为G以外的各自独立的一个核苷酸，M为6-10的整数，N为0-3的整数)、全长为16-37个核苷酸长度(SEQ ID NO.5的碱基序列除外)。

Description

免疫刺激寡核苷酸及其药物用途

技术领域

本发明涉及免疫刺激寡核苷酸及其药物用途，具体来说，涉及干扰素(IFN)诱导活性增强、且炎症性细胞因子诱导活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸，以及含有上述寡核苷酸的药物的用途。

背景技术

德永等人报道了特定类型的细菌性DNA可刺激免疫应答(Yamamoto等人.，Jpn.J.Cancer Res.1988 79：866-873)。免疫刺激活性所必须的细菌性DNA的主要成分是含有不受甲基化修饰的CpG二核苷酸基序(以下称为CpG)的特征性的短小序列结构。有报道指出合成的含有CpG的寡核苷酸诱导巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)生成I型IFN(IFN-α和IFN-β)和IFN-γ，具有NK细胞的细胞毒活性(日本特开平4-352724号公报)。另外，含有CpG的寡核苷酸不仅作用于巨噬细胞，也可作用于树状细胞或B细胞等，诱导细胞增殖活性、炎症性细胞因子的白细胞介素-12(以下称为IL-12)、肿瘤坏死因子-α(以下称为TNF-α)的生成、白细胞介素-6(以下称为IL-6)的生成(Klinman等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.1996 93：2879-2883)。由此，含有CpG的寡核苷酸诱导细胞性免疫、并且诱导Th1应答，因此可用于疫苗的佐剂或变应反应性疾病的治疗，另一方面，由于诱导生成TNF-α或IL-6，因此诱发败血症、发热、关节痛、肌肉痛或红肿等副作用的可能性也不容否定。

德永等人发现：在小鼠NK细胞的细胞毒活性中，含有由6个碱基的回文序列基序形成的CpG基序的寡核苷酸具有强活性，并报告：5′-AACGTT-3′(SEQ ID NO.92)、5′-AGCGCT-3′(SEQ ID NO.93)、5′-GACGTC-3′(SEQ ID NO.61)的序列最强(Yamamoto等人.，J.Immunol.1992 148：4072-4076)。还报道了其它类型的免疫调节寡核苷酸序列(国际公开第1998/018810号说明书、国际公开第2003/015711号说明书、国际公开第2004/058179号说明书)。

也进行了以增强寡核苷酸的活性为目的的研究。德永等人发现：在含有CpG的6个碱基的回文基序的外侧插入脱氧鸟苷酸的重复结构(polyG序列)，则NK细胞活性和ISN诱导活性增强(日本特开平4-352724号公报)。还明确了含有CpG的6个碱基序列的外侧的序列至少对活性有影响。

其它公知的含有CpG的序列已知有D型(或A型)和K型(或B型)的免疫刺激寡核苷酸(国际公开第2000/61151号说明书)。已知K型可活化B细胞。D型是在含有CpG的回文序列的外侧附加polyG序列，诱导树状细胞的I型IFN的生成，活化人NK细胞。对于D型的ISN诱导活性，3′末端一侧非常重要，3′末端一侧的polyG序列的长度必须为4个碱基以上(国际公开第2000/61151号说明书)。而在炎症性细胞因子IL-12或TNF-α的生成诱导活性中，3′末端一侧的polyG序列很重要，其效果的表达至少需要4个碱基以上的polyG序列(大韩民国KR2001-063153号公报)。因此，公知的提高免疫刺激活性的核苷酸序列、或者polyG序列的结构对于IFN的诱导和炎症性细胞因子的诱导的独立性并未明确。

又发现：回文基序为5′-GACGATCGTC-3′(SEQ ID NO.76)的免疫刺激核苷酸通过将最多10个最佳长度的polyG序列插入到5′末端和3′末端，比以往的非修饰型(修饰型的效果如后所述)的含有CpG的免疫刺激寡核苷酸具有更强的IFN-α诱导活性(日本特开2005-237328号公报)。还有公开称：为了使具有5′-GACGATCGTC-3′(SEQ ID NO.76)的免疫刺激核苷酸带来高的IFN-α诱导活性，最好是将8-10个G配置在3′末端一侧或5′末端一侧，但为了抑制免疫调节性细胞因子白细胞介素-10(以下称为IL-10)的生成，也可以存在于5′末端一侧(日本特开2005-237328号公报)。还有报告称：炎症性细胞因子TNF-α或IL-12的诱导活性与IFN-α诱导活性有较轻的相关性。这是由于，5′-GACGATCGTC-3′(SEQ ID NO.76)以外的回文基序中，polyG序列插入5′末端一侧的效果尚未明确。另外，含有CpG的寡核苷酸的使炎症性细胞因子的诱导活性减弱、且使IFN-γ和IFN-α两者的IFN诱导活性均增强的最佳的polyG序列的碱基数尚未有公开。

作为具有比以往的D型CpG高的免疫刺激活性的寡核苷酸，又发现了5′-GGTGCCGATCGGCAGGGGGG-3′(SEQ ID NO.1)(日本特愿2004-287102号公报)。该碱基序列的1个以及多个碱基被置换得到的衍生物也有公开。变换了3个以上的具体的序列尚未公开，但发现了置换了唯一的7个碱基的5′-GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG-3′(SEQID NO.5)，即使3′末端的polyG序列为3个碱基也具有IFN诱导活性(国际公开第2006/035939号说明书)。

其它的以活性增强为目的的研究中，已知寡核苷酸的化学修饰可带来稳定。天然存在的磷酸二酯核苷酸在细胞内和细胞培养基中由于各种核酸分解活性而容易被分解。因此，正在研究通过置换作为核酸分解活性的攻击靶的核苷酸之间的磷酸二酯键来实现稳定，并且结果导致的活性增加。经常使用的置换方法是置换为硫代磷酸酯。Klinman等人的研究中，通过硫代磷酸酯修饰免疫刺激寡核苷酸的回文基序外侧的polyG序列，显示免疫应答的诱导增强(国际公开第2000/61151号说明书)。

在使用TLR9敲除小鼠进行的研究中发现：含有非甲基化CpG的细菌性DNA受体是Toll样受体(TLR)家族成员之一TLR9(Hemmi等人.，Nature2000 408：740-745)。还明确了：活化人TLR9和小鼠TLR9的最佳的CpG序列现实为不同序列，存在种特异性(Bauer等人.，PNAS200198(16)：9237-9242)。在以对人的治疗为目的的开发中，CpG寡核苷酸必须对人TLR9显示高亲和性，但是在开发阶段中的使用动物的前临床实验中，可作用于小鼠等动物也是很重要的。

变应反应性疾病的治疗中，人们希望不采用目前大多使用的对症疗法，而希望为免疫调节型且有效的根治疗法。变应反应患者中，对于变应原的免疫应答存在于Th2，Th1的免疫应答受到抑制。因此，可诱导Th1免疫应答、抑制Th2免疫反应的治疗药有望对变应性体质的改善有效。有公开专利称：某一种类的含有非回文序列的CpG寡核苷酸(日本特开2003-286174号公报)或含有6个碱基回文5′-AACGTT-3′的CpG寡核苷酸(日本特表2002-500159号公报，Tighe等人J.AllergyClin.Immunol.2000 106：124-134)在小鼠哮喘模型中具有治疗效果。但是，上述免疫刺激寡核苷酸不仅诱导Th1反应，还诱发炎症性细胞因子，因此在给予药理作用的有效量时会表现不优选的副作用。

变应性症状的原因是肥胖细胞将含有组胺等的颗粒释放到细胞外(去颗粒)，该去颗粒的结果是引起肥胖细胞上的IgE与变应原结合。近年来，抗原特异性的调节性T细胞(Treg)的保持其免疫平衡的功能受到关注。例如通过Treg抑制IgE受体FcεRI介导的去颗粒等(Till等人.，J.Allergy Clin.Immunol.2004 113：1025-1034)。另外，IFN-α和IFN-β显示促进诱导IL-10的生成(Aman等人.，Blood.1996 87：4731-4736)。并且IL-10促进诱导IgG4或IgA生成细胞的分化，因此可以认为，免疫刺激核苷酸的变应反应治疗效果中，IL-10的诱导也是其机理之一。因此，适合变应反应治疗的免疫刺激核苷酸优选IFN-α诱导活性增强、也可保持IL-10诱导活性。

肝炎是指由病毒、酒精、药物、毒素以及自身免疫性等的原因而诱发的、包含肝脏炎症的疾病。

肝炎病毒导致的肝炎占大多数，特别是甲、乙、丙型较多，除此之外还已知存在丁、戊、己、庚型以及特发性肝炎病毒。另外，上述肝炎病毒可在RNA型、DNA型等多种不同的病毒家族之间扩散。

乙型病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)分别引发急性和慢性感染。急性肝炎伴随初期感染或慢性感染者的复发而表现症状。而在慢性丙型肝炎中，肝脏的炎症持续六个月以上，细胞破坏，伴随有肝功能的降低。HCV感染中，由急性肝炎向慢性肝炎发展的危险性高。针对上述状况，人们希望能够开发可对肝炎病毒感染症治疗早期介入和效果高的治疗方法。

丙型肝炎中，各种干扰素(以下称为IFN)制剂的单独治疗或IFN-α制剂与利巴韦林等的结合疗法是治疗手段的第一选择。联合治疗比单剂治疗有望获得持续性的反应，但是伴有更高的成本、更多的副作用。但是，即使进行这些治疗，也只有全部治疗患者的约60％具有治疗效果。有效果后如果中断治疗，则半数以上的患者复发。基于上述状况，人们希望进一步开发治疗药物。

CpG寡核苷酸在肝炎治疗中的效果有：通过诱导干扰素增强抗病毒效果、诱导对病毒感染细胞的细胞性免疫和对抗性细胞株出现的抵抗性等。关于CpG寡核苷酸对HBV或者HCV感染导致的肝炎的治疗用途，有日本特表2003-526662号公报和日本特表2006-515277号公报中的技术信息。前者公开了无需将CpG寡核苷酸(免疫活化序列：ISS)与肝炎病毒一起给予即可进行治疗的方法。后者公开了对干扰素疗法等的抗病毒药无效的慢性丙型肝炎个体进行处置的方法，关于对患者的有用性，开发编号CpG10101的临床实验成果已在2006年欧洲肝脏学会等中公开。但是，临床实验结果已经表明，CpG10101的单剂治疗效果与以往的治疗方法相比极为不足，聚乙二醇修饰的IFN-α制剂与利巴韦林和CpG寡核苷酸三剂的联合治疗与标准治疗方法—聚乙二醇修饰的IFN-α制剂与利巴韦林的成绩相比，有望有效性稍有提高，但是，与同其它抗病毒剂的联合用药(例如与聚合酶和蛋白酶等病毒酶的抑制剂的联合治疗)相比，并未得到充分的治疗效果。

现有的CpG寡核苷酸通过诱导炎症性细胞因子TNF-α、IL-12或IL-6的生成，不可否定地可诱发败血症、发热、关节痛、肌肉痛或红肿或未预期的副作用，实际在使用小鼠肝炎模型进行的实验例中已显示肝炎症状恶化(Abe等人.，Fukushima J.Med.Sci.2005 51：41-49)。因此，人们希望能够创造出适合肝炎治疗的、免疫刺激活性提高、且副作用降低的CpG寡核苷酸。

免疫刺激寡核苷酸与活性相关，可以减轻给予量、给予次数，结果，发生毒性作用的可能性降低，QOL提高的可能性极高。

基于以上考虑，在人体中发现了与上述现有的免疫刺激序列相比，IFN诱导活性提高、且炎症性细胞因子诱导活性降低的序列，这在工业利用上非常有用，有益性极高。

发明内容

本发明的目的在于提供干扰素(IFN)诱导活性增强、且炎症性细胞因子诱导活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸，以及含有该免疫刺激寡核苷酸的药物及其用途。

本发明人为解决上述课题进行了深入的探讨，结果发现：在IFN诱导活性中，含有CpG基序的序列外侧的5′末端一侧很重要。即，通过将6个碱基或以上的连续鸟嘌呤序列插入到5′末端一侧，可得到干扰素诱导活性比除此之外的更为优异的寡核苷酸。进一步研究的结果发现：polyG序列以碱基数6-10的长度插入到5′末端一侧、以碱基数0-3的长度插入到3′末端一侧，且具有规定结构性特征的CpG寡核苷酸比以往已知的D型的含有CpG序列的寡核苷酸，I型IFN、即IFN-α和IFN-β和IFN-γ诱导活性增强，炎症性细胞因子诱导活性降低，并且具有高的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Th1诱导活性。除此之外，还发现肝炎模型小鼠的实验结果是在体内具有肝炎治疗效果，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下各发明。

免疫刺激寡核苷酸，其特征在于：该寡核苷酸含有式5′-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′所示的碱基序列，式中，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，X和Y是以各自独立的0-10个核苷酸长度、且不含有4个碱基以上连续的鸟嘌呤的任意的序列，X+Y的长度为6-20个核苷酸长度，XCGY含有长度至少为8个核苷酸长度的回文序列，是长度为8-22的核苷酸长度；P和Q是除鸟嘌呤以外的互相独立的单一核苷酸，M为6-10的整数，N为0-3的整数，X和Y的核苷酸长度未必相同；

该寡核苷酸的全长为16-37个核苷酸长度(含有SEQ ID NO.5的碱基序列(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)的序列除外)。

[1]的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述M是6-8的整数，且全长为16-35个核苷酸长度。

[1]或[2]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY的长度是9或10个核苷酸长度，且全长为17-23个核苷酸长度。

[1]-[3]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY含有选自CGATCG(SEQ ID NO.59)、ATCGAT(SEQ ID NO.60)和GACGTC(SEQ ID NO.61)中任一项的碱基序列。

[1]-[3]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY含有CGATCG(SEQ ID NO.59)。

[4]或[5]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQ ID NO.59)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQ ID NO.6、7、9-11以及15-18、22、24、26、28、48、50-52、54、95和97所示的碱基序列。

[4]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQID NO.60)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQ ID NO.30所示的碱基序列。

[4]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQID NO.61)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQ ID NO.40和42所示的碱基序列。

[4]或[5]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，该寡核苷酸含有SEQID NO.6、7、10以及15-17、24、26、28、48、50-52、95和97所示的碱基序列。

[1]-[9]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，所有或部分核苷酸残基之间的磷酸二酯键进行了硫代磷酸酯修饰。

[10]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，5′-末端的连续G序列的核苷酸残基之间至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯修饰。

[10]或[11]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，3′-末端的核苷酸残基之间至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯修饰。

药物，该药物含有[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

过敏性疾病的治疗或预防药，该药物含有[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

[14]所述的过敏性疾病的治疗或预防药，其中，上述过敏性疾病是花粉过敏症。

疫苗，该疫苗含有[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为佐剂。

肝炎的治疗或预防药，该药物含有[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

[17]所述的肝炎的治疗或预防药，其中，上述肝炎是病毒性肝炎。

[18]所述的肝炎的治疗或预防药，其中，上述病毒性肝炎是乙型或丙型肝炎。

[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为过敏性疾病的治疗或预防药的应用。

[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为疫苗佐剂的应用。

[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为肝炎的治疗或预防药的应用。

[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸对过敏性疾病的治疗或预防的方法。

利用[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为疫苗的佐剂的方法。

[1]-[12]中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸对肝炎的治疗或预防的方法。

本发明中提供的新型免疫刺激寡核苷酸使IFN诱导活性增强、炎症性细胞因子诱导活性降低，并具有高的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Th1诱导活性等，具有优异的免疫刺激活性，因此具有高的治疗效果。另外，肝炎模型小鼠的实验结果证明：在体内也具有肝炎治疗效果。并且副作用的危险性低，因此可以以高用量使用。因此，本发明的免疫刺激寡核苷酸与以往的免疫刺激寡核苷酸相比，可作为短期间、高效率且安全的疫苗佐剂用于过敏性疾病和/或肝炎的治疗和预防。

附图说明

图1-1是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图1-2是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图1-3是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图1-4是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图1-5是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图1-6是表示在实施例1中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图2是表示在实施例2中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激小鼠J774细胞株，测定培养上清中IL-12p40生成量的结果的图。

图3-1是表示在实施例3中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图3-2是表示在实施例3中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图3-3是表示在实施例3中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6/7-PXCGYQ-G2)和回文基序相同的D型CpG(G2/3-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图4是表示在实施例4中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图5-1是表示在实施例7中，用本发明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图5-2是表示在实施例7中，用本发明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图5-3是表示在实施例7中，用本发明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图5-4是表示在实施例7中，用本发明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图6是表示在实施例8中，用本发明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，测定培养上清中IFN-α生成量的结果的图。

图7-1是表示在实施例9中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG刺激小鼠脾细胞，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图7-2是表示在实施例9中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG刺激小鼠脾细胞，测定培养上清中IL-10生成量的结果的图。

图8-1是表示在实施例10中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激小鼠J774细胞株，测定培养上清中IL-12生成量的结果的图。

图8-2是表示在实施例10中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激小鼠J774细胞株，测定培养上清中TNF-α生成量的结果的图。

图9是表示在实施例11中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激小鼠J774细胞株，测定培养上清中TNF-α生成量的结果的图。

图10是表示在实施例12中，将本发明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG和公知的免疫刺激寡核苷酸与抗CD40抗体和IL-4一起刺激人PBMC，测定培养上清中IgE生成量的结果的图。

图11是表示在实施例13中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉树花粉抗原Cry j1处置小鼠，引发变应反应后测定血清中IgE生成量的结果的图。

图12-1是表示在实施例13中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉树花粉抗原Cry j1处置小鼠，引发变应反应，然后用Cry j1刺激摘取的脾脏细胞，测定培养上清中IFN-γ生成量的结果的图。

图12-2是表示在实施例13中，用本发明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉树花粉抗原Cry j1处置小鼠，引发变应反应，然后用Cry j1刺激摘取的脾脏细胞，测定培养上清中IL-5生成量的结果的图。

图13是表示在实施例14中、在ConA诱发小鼠肝炎模型中，评价本发明的免疫刺激寡核苷酸对于血清中ALT值的升高的影响的结果图。

图14-1是表示在实施例15中、在ConA诱发小鼠肝炎模型中，评价本发明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸对于血清中ALT值的升高的影响的结果图。

图14-2是表示在实施例15中、在ConA诱发小鼠肝炎模型中，评价本发明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸对于血清中ALT值的升高的影响的结果图。

具体实施方式

本发明的免疫刺激寡核苷酸的特征在于：含有式5-′(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′所示的碱基序列(C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，X和Y是以各自独立的0-10个核苷酸长度、且不含有4个碱基以上连续的鸟嘌呤的任意的序列，X+Y的长度为6-20个核苷酸长度，XCGY含有长度至少为8个核苷酸长度的回文序列，是长度为8-22的核苷酸长度；P和Q是除鸟嘌呤以外的互相独立的单一核苷酸，M为6-10的整数，N为0-3的整数，X和Y的核苷酸长度未必相同)，全长为16-37个核苷酸长度(含有SEQ ID NO.5的碱基序列(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)的序列除外)。

构成本发明的免疫刺激寡核苷酸的碱基序列由式5′-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′表示。式中的“5′-”表示5′末端，“3′-”表示3′末端。另外，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，X和Y为含有各自独立的任意序列和长度的部分，P和Q是各自独立的任意的核苷酸。(G)_M和(G)_N分别表示只含有鸟嘌呤(G)的连续的序列部分，各M和N表示鸟嘌呤的数目。即，上式是通式表示本发明的免疫刺激寡核苷酸的5′末端至3′末端的碱基序列。本发明中，“XCGY”是指上式中的由X、C、G和Y构成的序列部分全体，“PXCGYQ”是指上式中的由P、X、C、G、Y和Q构成的序列部分全体。上式中的“长度”是指构成各序列部分的核苷酸数目(核苷酸长度)。“X+Y的长度”是指X的长度和Y的长度的总和。

上式中，X和Y的长度分别为0-10个核苷酸长度的范围。特别优选2-6个核苷酸长度。X和Y的序列只要含有各自独立的任意的核苷酸即可，但必须是不含有4个碱基以上的连续的鸟嘌呤。并且X+Y的长度必须是6-20个核苷酸长度。优选6-12个核苷酸长度，更优选7或8个核苷酸长度，最优选8个核苷酸长度。X和Y的核苷酸长度未必相同。

上式中，XCGY必须含有回文序列。回文序列是指由相对于任意两个碱基之间的轴为左右对称的互补的碱基构成的碱基序列部分。本发明中，XCGY中所含的回文序列的长度必须是8个核苷酸长度以上。XCGY可以只含有8个碱基以上的回文序列，只要一部分中含有8个碱基以上的回文序列即可，不必完全互补。

XCGY优选含有选自CGATCG(SEQ ID NO.59)、ATCGAT(SEQID NO.60)和GACGTC(SEQ ID NO.61)中任意一种碱基序列。特别是最优选含有CGATCG(SEQ ID NO.59)。这些序列本身是回文序列，优选XCGY中所含的回文序列含有这些序列作为其一部分。

上述本发明的回文序列的例子如下所示。XCGY中，8个碱基序列的回文序列有：

　　　　　　　　　 CCGATCGG(SEQ ID NO.62)，GCGATCGC(SEQ IDNO.63)，ACGATCGT(SEQ ID NO.64)，CATCGATG(SEQ ID NO.65)，GATCGATC(SEQ ID NO.66)，ATCGCGAT(SEQ ID NO.67)，GAACGTTC(SEQ ID NO.68)，CAACGTTG(SEQ ID NO.69)，AGCGCGCT(SEQ ID NO.70)，ACGTACGT(SEQID NO.71)，TAGCGCTA(SEQ ID NO.72)，ACGGCCGT(SEQ ID NO.73)，CGACGTCG(SEQ ID NO.74)，CGTCGACG(SEQ ID NO.75)。其中优选CCGATCGG，GCGATCGC，ACGATCGT，CATCGATG，CGACGTCG。XCGY中，10个碱基序列的回文序列有：GACGATCGTC(SEQ IDNO.76)，GGCGATCGCC(SEQ ID NO.77)，CGATCGATCG(SEQ ID NO.78)，GATCGCGATC(SEQ ID NO.79)、GCAACGTTGC(SEQ ID NO.80)，GCATCGATGC(SEQ ID NO.81)，CAGCGCGCTG(SEQ ID NO.82)，GACGTACGTC(SEQ IDNO.83)，CTAGCGCTAG(SEQ ID NO.84)，CCCGATCGGG(SEQ ID NO.85)，GACGGCCGTC(SEQ ID NO.86)，GCCGATCGGC(SEQ ID NO.87)，TCCGATCGGA(SEQ ID NO.88)，ACGTCGACGT(SEQ ID NO.89)，ACAACGTTGT(SEQ ID NO.90)和ACGACGTCGT(SEQ ID NO.91)。其中优选GCCGATCGGC，CCCGATCGGG，TCCGATCGGA，GGCGATCGCC，GACGATCGTC，GCATCGATGC，ACGACGTCGT。

回文序列只要是其长度至少为8个核苷酸长度的序列即可，并不限于上述具体例子。

XCGY的长度是8-22个核苷酸长度，可根据X和Y的各长度或回文序列的种类在该范围内调整。优选8-14个核苷酸长度，更优选9或10个核苷酸长度，最优选10个核苷酸长度。

上式中的P和Q是除鸟嘌呤以外的一个核苷酸。具体有腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)的任意一种。

上式中的M是6-10的整数，优选6-8。脱离上述范围则IFN诱导活性不足，因此不优选。N为0-3的整数。脱离上述范围，则无法使炎症性细胞因子诱导活性充分降低，不优选。

本发明的免疫刺激寡核苷酸的全长是16-37个核苷酸长度，根据上式中的M或N、X或Y的长度等而不同。如上所述，M为6-8的范围时，全长是6-35个核苷酸长度。XCGY的长度为9或10个核苷酸长度时，全长是17-23个核苷酸长度。

本发明的免疫刺激寡核苷酸的碱基序列的例子优选

GGGGGGTGACGATCGTCGGG(SEQ ID NO.97：Mod92)，GGGGGGTGACGATCGTCAGGG(SEQ ID NO.28：Mod46)，GGGGGGTCCCGATCGGGAGGG(SEQ IDNO.22：Mod43)，GGGGGGTTCCGATCGGAAGGG(SEQ ID NO.24：Mod44)，GGGGGGTGGCGATCGCCAGGG(SEQ ID NO.26：Mod45)，GGGGGGTGCATCGATGCAGGG(SEQ ID NO.30：Mod47)，GGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(SEQ ID NO.6：Mod53)，GGGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(SBQ IDNO.7：Mod54)，GGGGGGTGCCGATCGGCAGG(SEQ ID NO.9：Mod40)，GGGGGGGTGCCGATCGGCAGG(SEQ ID NO.10：Mod55)，GGGGGGTGCCGATCGGCAG(SEQ ID NO.11：Mod41)，GGGGGGTGCCGATCGGCA(SEQ IDNO.15：Mod61)，GGGGGGGTGCCGATCGGCA(SEQ ID NO.16：Mod62)，GGGGGGGGTGCCGATCGGCA(SEQ ID NO.17：Mod63)，GGGGGGGGGGTGCCGATCGGCA(SEQ ID NO.18：Mod64)，GGGGGGGACGACGTCGTCGG(SEQ ID NO.40：Mod71)和GGGGGGAACGACGTCGTTGG(SEQ ID NO.42：Mod73)，但不限于此。例如式：5’-(G)_MPXCGYQ(G)_N -3’的M为7、N为2时，可以是GGGGGGGAGCCGATCGGCTGG(SEQ ID NO.43)，GGGGGGGAGCCGATCGGCAGG(SEQ ID NO.44)，GGGGGGGTGCCGATCGGCTGG(SEQ ID NO.45)，GGGGGGGAGCCGATCGGCCGG(SEQ ID NO.46)，GGGGGGGCGCCGATCGGCCGG(SEQ IDNO.47)，GGGGGGGTGACGATCGTCAGG(SEQ ID NO.48：Mod84)，GGGGGGGTGACGATCGTCTGG(SEQ ID NO.49)，GGGGGGGAGACGATCGTCAGG(SEQ ID NO.50：Mod85)，GGGGGGGAGACGATCGTCTGG(SEQ ID NO.51：Mod83)，GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(SEQ ID NO.52：Mod87)，GGGGGGGTGACGATCGTTAGG(SEQ ID NO.53)，GGGGGGGTCGACGTCGTGG(SEQ ID NO.100)，GGGGGGGACGACGTCGTGG(SEQ ID NO.101)和GGGGGGGTCGACGTCGAGG(SEQ ID NO.102)，GGGGGGGACGACGTCGTCGG(SEQ ID NO.105)， M为7、N为3时，可以是 GGGGGGGCGACGATCGTCGGG(SEQ ID NO.54)，GGGGGGGTGACGATCGTCGGG(SEQ ID NO.94)，GGGGGGGTCGACGTCGTGGG(SEQ ID NO.99)和GGGGGGGTCGACGTCGAGGG(SEQ ID NO.107)，M为8、N为1时，可以是GGGGGGGGCGACGATCGTCG(SEQ ID NO.95；Mod93)，GGGGGGGGTGACGATCGTCG(SEQ ID NO.96)，GGGGGGGGACGACGTCGTG(SEQ ID NO.103)和GGGGGGGGTCGACGTCGAG(SEQ ID NO.104)。M为8、N为0时，可以是GGGGGGGGACGACGTCGTC(SEQ ID NO.106)。

如下述实施例中具体所示，含有序列表的SEQ ID NO.6、7、9-11以及15-18、22、24、26、28、48、50-52、54、95和97所示的碱基序列的寡核苷酸可以确认比在上式中满足了PXCGYQ的条件、但未满足其它条件的D型CpG序列的IFN诱导活性增强，炎症性细胞因子诱导活性降低。即，在IFN诱导活性中，寡核苷酸的含有CpG基序的回文序列是必须的，在IFN诱导活性的增强和炎症性细胞因子诱导活性的降低中，重要的是插入到其外侧的polyG序列的碱基数。因此，本发明的最重要的部分不是polyG序列与特定的回文序列的组合，而是最佳的polyG序列的插入方式。另外，上述例举的寡核苷酸中，含有SEQID NO.6、7、10以及15-17、24、26、28、48、50-52的寡核苷酸、其中SEQ ID NO.6、7、10、28、48、50-52的寡核苷酸具有强的干扰素(IFN)诱导活性，特别优选。

本发明的免疫刺激寡核苷酸可以是核苷酸残基间的磷酸二酯键、各核苷酸的核糖部分、碱基部分中的全部或一部分可被化学修饰。不过，XCGY的C的甲基化使免疫刺激活性消失，不优选。上述被修饰的本发明的免疫刺激寡核苷酸的优选实施方案是在核苷酸残基间的磷酸二酯键中的磷酸基的氧原子的置换和/或修饰，例如有硫代磷酸酯、磷酸甲酯和亚磷酸酯。硫代磷酸酯修饰优选对5′-末端的polyG序列(上式中的(G)_M)的一部分或全部核苷酸残基之间的磷酸二酯键进行。对于5′-末端的polyG序列，优选构成该序列的全部碱基之间或该末端的磷酸二酯键进行硫代磷酸酯修饰。对于3′-末端的polyG序列，优选除去最末端的碱基之外的一部分或全部碱基之间的磷酸二酯键进行硫代磷酸酯修饰。另外，上述通式中的N＝0或1的寡核苷酸可以是鸟嘌呤以外的3′-末端一侧的磷酸二酯键进行硫代磷酸酯修饰。优选5′-末端的polyG序列和3′-末端一侧的最末端的磷酸二酯键进行硫代磷酸酯修饰。并且只要具有免疫刺激活性，CpG二核苷酸的胞嘧啶(上式中的中央部C)可以进行甲基化以外的化学修饰。

具有磷酸二酯骨架的核苷酸的分解通过核酸外切酶和核酸内切酶进行。已知核苷酸之间的键通过硫代磷酸酯修饰，可以获得对这些核酸酶获的抗性。一部分核苷酸残基之间被修饰得到的寡核苷酸例如有：5′和3′末端的核苷酸之间具有硫代磷酸酯修饰键的寡核苷酸、或polyG序列的核苷酸之间具有硫代磷酸酯修饰键的寡核苷酸，对核酸外切酶具有抗性。所有的核苷酸残基之间均被修饰的寡核苷酸对核酸外切酶和核酸内切酶具有抗性。核酸酶抗性的CpG寡核苷酸稳定，例如与靶受体作用的时间的延长或可保持一定的浓度，结果，显示增强的免疫刺激活性。

上述本发明的免疫刺激寡核苷酸只要满足上述碱基序列的相关要件，则具有免疫刺激活性、具体来说具有增强的IFN诱导活性和降低的炎症性细胞因子诱导活性，可以结合核苷酸以外的分子。

本发明中，免疫刺激寡核苷酸具有免疫刺激活性，这是指干扰素(IFN)诱导活性增强，且炎症性细胞因子诱导活性降低。这里，炎症性细胞因子是指白细胞介素-12(以下称为IL-12)、肿瘤坏死因子-α(以下称为TNF-α)、白细胞介素-6(以下称为IL-6)和白细胞介素-1β(以下称为IL-1β)。炎症性是指诱导组织发热或引起细胞浸润和活化的性质。免疫抑制性表示具有抑制上述炎症反应的功能或性质。白细胞介素-10(以下称为IL-10)是免疫抑制性细胞因子之一，其功能与炎症性细胞因子不同。IFN诱导活性或炎症性细胞因子诱导活性表示诱导来自人的具有平均反应性的人检样的末梢血单核细胞(PBMC)、小鼠的来自骨髓的树状细胞或脾脏细胞、或对具有CpG序列的免疫刺激寡核苷酸为感受性的单核细胞系细胞株J774或RAW264.7的各细胞因子的生成的作用。本发明中，可以以免疫刺激寡核苷酸的处置来诱导人末梢血单核细胞(以下称为PBMC)中IFN-α和IFN-γ的生成作为指标的活性表示。还可以以免疫刺激寡核苷酸的处置来诱导小鼠脾细胞中IFN-γ和IL-10的生成的活性表示。进一步可以以在小鼠树状细胞和J774细胞株中，通过免疫刺激寡核苷酸处置来诱导白细胞介素-12p40(以下称为IL-12p40)和TNF-α生成的作为指标的活性表示。本发明中，在将几种免疫刺激寡核苷酸序列的活性进行比较时所使用的增强的IFN诱导活性表示将上述细胞用免疫刺激寡核苷酸刺激时，在比其它更低浓度可以诱导大量的IFN-α和IFN-γ。而降低的炎症性细胞因子诱导活性是指将上述细胞用免疫刺激寡核苷酸刺激时，比其它诱导较少量的IL-12p40和TNF-α。

评价本发明的免疫刺激寡核苷酸体外诱导来自PBMC的IFN-γ和IFN-α的活性的实验的具体方法如下所示。使用Histopaque 1077、以2000rpm、在室温下进行25分钟的密度梯度离心，从人血液中分离PBMC。将分离的PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基制备成每1mL含有4.0×10⁶个细胞，然后在圆底的96孔板上每个孔接种4.0×10⁵个细胞，在免疫刺激寡核苷酸的存在下刺激24小时或7天，分别回收培养上清。分别使用刺激24小时和7天后的培养上清，通过ELISA法对IFNα和IFNγ的生成量进行定量。

评价本发明的免疫刺激寡核苷酸体外诱导来自PBMC的IL-12和TFN-α的活性的实验的具体方法如下所示。使用Histopaque 1077、以2000rpm、在室温下进行25分钟的密度梯度离心，从人血液中分离PBMC。将分离的PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基制备成每1mL含有2.0×10⁶个细胞，然后在平底的96孔板上每个孔接种2.0×10⁵个细胞，在免疫刺激寡核苷酸的存在下刺激8小时或24小时，分别回收培养上清。分别使用刺激8小时和24小时后的培养上清，通过ELISA法对IL-12和TFNα的生成量进行定量。

确认本发明的免疫刺激寡核苷酸是否诱导来自小鼠脾细胞的IFN-γ和IL-10的生成的方法有体外诱导评价实验。具体方法如下所示。摘取雄性10-25周龄CL57BL/6N小鼠的脾脏，转移至加入了RPMI1640/FCS10％的培养皿中。使用两片毛载玻片捣碎脾脏，边用细胞筛分散边转移至圆底离心管中。以1000rpm、在4℃下离心10分钟。舍去上清，加入5mL的溶血缓冲液(将0.83％NH₄Cl和170mMTris-HCl，pH 7.65按照9:1混合制备)，通过移液操作拆散细胞团，使其悬浮。在室温下温育5分钟，然后加入5mL的培养液，反转混合，以1000rpm、在4℃下离心10分钟。舍去上清，加入10mL培养液，通过移液操作拆散细胞团，悬浮。将洗涤操作重复2次，然后在培养液中再悬浮，用台盼蓝计数细胞数，制备1mL中活细胞数为4×10⁶。以每孔4.0×10⁵个细胞向圆底96孔板接种，添加免疫刺激寡核苷酸，刺激3天。刺激结束后，通过ELISA法对培养上清中的IFN-γ和IL-10的浓度进行定量。

确认本发明的免疫刺激寡核苷酸是否诱导来自小鼠J774细胞的IL-12p40和TNF-α的生成的方法有体外的诱导评价实验。J774细胞株用培养液(RPMI1640，FCS10％，50μM 2-ME)调节为每1mL含有1×10⁶个细胞。以每孔为1.0×10⁵个细胞接种在圆底96孔板中，添加免疫刺激寡核苷酸，刺激4小时或8小时或48小时。刺激结束后，通过ELISA法对培养上清中的IL-12p40和TNF-α的浓度进行定量。

本发明的免疫刺激寡核苷酸可通过以往的技术以及核酸合成装置合成。这些合成方法包含酶法、化学方法、比本发明的序列长的序列的分解，但并不限于此。修饰寡核苷酸也可以用以往的技术合成。例如将寡核苷酸亚磷酰胺用硫处理，可以得到硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸，但并不限于此。这些寡核苷酸的合成技术、修饰技术是在本说明书中引用的专利文献、非专利文献中使用的，其它也是已有很多报道的公知的技术。

上述本发明的免疫刺激寡核苷酸可以是为了作为药物应用而制成的核苷酸复合体的形态。复合体可以使用该免疫刺激寡核苷酸与其它物质(例如包含细胞因子类或由肽、蛋白质或非蛋白质形成的抗原)的混合物和结合体、摄入该免疫刺激寡核苷酸的胶体分散系统或脂基系统。胶体分散系统有高分子复合体、纳米胶囊、微胶囊(マイクロクロスフエア)、微珠。脂基系统例如可以选择水包油型乳剂、胶束、混合胶束以及脂质体，但并不限于此。优选的实施方案是上述复合体包埋免疫刺激寡核苷酸而成的脂质体。包埋是指与脂质体的脂膜表面结合，摄入到脂膜中或者摄入到脂质体内腔中。另外脂质体可以通过特定的功能分子例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质进行修饰或结合。

构成脂质体的脂类可以将已知构成脂质体的任意的常用脂类单独或多种组合使用。例如可使用天然物例如蛋黄、大豆或由其它动植物得到的脂类，将这些脂类氢化、使不饱和度降低的脂类。具体来说例如有甾醇类(例如胆甾醇)、磷脂酰乙醇胺类(例如二棕榈酰磷脂酰二乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺)、磷脂酰肌醇类、磷脂酰胆碱类(例如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油类、磷酰丝氨酸类(例如二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸)、磷酯酸类(例如二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸)、鞘磷脂类或心磷脂类等，但并不限于此。

脂质体的制备可采用公知的方法。通常是涡流法和超声波法，除此之外还可采用乙醇注入法、醚法、机械化学法、加温法、脂溶法或逆向蒸发法等，可以将它们组合使用。例如在涡流法和超声波法中，将规定的脂类溶解于有机溶剂例如甲醇、乙醇、氯仿或它们的混合物例如甲醇和氯仿的混合物中，然后蒸发除去该有机溶剂，可获得脂类的薄层。此时，通过将上述脂类进行各种组合，以不同的浓度比例溶解于有机溶剂中，由此可以制备各种脂质体。接着，向该脂类的薄层中加入水性介质，通过涡流处理或超声波处理形成脂质体。此时，向上述水性介质中混入、例如溶解或悬浮要包埋在脂质体中的物质，可以将物质埋入脂质体内。溶解于水性介质的包埋物质的浓度没有特别限定，蛋白质优选0.00375-375mg/mL，免疫刺激寡核苷酸则优选0.5μg-5000μg/mL。通常脂质体粒经优选0.01-10μm的范围内。

上述本发明的免疫刺激寡核苷酸可用作各种用途的药物的有效成分。实施方案之一的优选适应症是各种过敏性疾病。过敏性疾病起因于来自花粉、螨、犬或猫等动物，食物、室尘等的抗原物质，出现鼻炎、结膜炎、皮肤炎、哮喘等炎症的症状的疾病。更优选的实施方案是作为上述过敏性疾病、特别是花粉过敏症的治疗或预防药的有效成分的用途。花粉过敏通常是特别以来自杉树花粉的蛋白为抗原的变应反应，抗原也可以是来自扁柏、白桦、赤杨、猪草、艾草、鸭茅等的其它花粉的物质。

例如，将用杉树花粉抗原致敏的小鼠脾细胞用杉树花粉抗原刺激，则通常诱导生成作为抗原特异性Th2应答的指标的IL-5或IL-4，而无法确认是否诱导生成作为Th1应答指标的IFN-γ，但是如果用杉树花粉抗原和本发明的免疫刺激寡核苷酸同时刺激，则可确认有效地诱导IFN-γ。另外，将本发明的免疫刺激寡核苷酸对小鼠进行处置，然后用抗原和明矾的混合液引发Th2反应，则血清中抗原特异性的IgE的生成受到抑制，可见抗原特异性的IgG2a增加。在使用诱发哮喘的抗原作为致敏和治疗中进行处置的抗原时，该实验方法可以确认哮喘的治疗效果。

因此，上述本发明的免疫刺激寡核苷酸对于各种变应反应具有高的治疗、预防效果。

上述本发明的免疫刺激寡核苷酸可以单剂使用，也可以与上述变应原一起使用，用作脱敏疗法的治疗药。

并且，本发明的免疫刺激寡核苷酸具有抑制人细胞的IgE生成的作用。作为确认该作用的方法，体外评价IgE生成抑制活性的试验的具体方法如下所示。通过上述方法，将从人血液中分离的PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基制备成每1mL中含有4.0×10⁶个细胞，然后再以每孔4.0×10⁵个细胞接种到平底96孔板中，与人IL-4和抗CD40抗体一起添加免疫刺激寡核苷酸，刺激14天，回收培养上清。IgE的生成量通过ELISA法定量。

上述发明的实施方案的一个优选适应症可以是含有本发明的免疫刺激寡核苷酸作为佐剂的疫苗。可使用疫苗的疾病是感染症和过敏性疾病。感染症是由于病毒、细菌、真菌和原虫等原因而发病的疾病，但并不限于此。通常，疫苗是指给予患者、使其产生活性免疫的、含有感染性因子、具有感染因子的部分、或来自动植物的因子的抗原性悬浮液或溶液。构成疫苗的抗原性部分可以是蛋白质、肽、脂类、多糖、核酸的任意一种。优选的实施方案是本发明的免疫刺激寡核苷酸与上述疫苗的混合液，但并不限于此。还可以是本发明的免疫刺激寡核苷酸与上述疫苗的抗原性部分的复合体。

实施方案的一个优选适应症是肝炎、具体来说是免疫系统伴随有活化的肝炎、非病毒性肝炎和/或病毒性肝炎，进一步优选HBV和/或HCV感染导致的乙型肝炎和/或丙型肝炎。

本说明书的HBV和/或HCV感染的症状中包含以急性和慢性肝炎为成因的症状。病毒性肝炎的临床症状包含：黄疸、腹痛、倦怠感、恶心和呕吐、以及与肝炎相关的临床性/检查指标、肝酶水平升高(例如丙氨酸·氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、和/或乳酸脱氢酶(LDH))、胆红素升高、HCV病毒血症或抗原水平、门静脉高压症和食欲不振等，但并不限于此。

本发明的免疫刺激寡核苷酸对于乙型肝炎和/或丙型肝炎的治疗效果是以上述临床症状(例如黄疸、倦怠感、腹痛)、肝炎相关的检查指标(例如血液中肝酶水平)、病毒扩增和复制、或病毒量(效价)作为指标进行评价。即，与未进行本发明的治疗的个体比较，使用本发明的免疫刺激寡核苷酸进行治疗的个体，有望其乙型肝炎和/或丙型肝炎临床症状消失、缓解、改善或症状程度减轻，进一步有望缩短患病期间。肝炎相关的检查指标或病毒复制以及病毒量也可以作为治疗效果反映。病毒效价的降低包含从感染部位或个体排除病毒。

评价方法可以选择包含症状的检测、通过临床检查对肝功能的评测、肝活检、肝门静脉压的直接或间接测量、以及病毒颗粒、病毒核酸或病毒抗原效价的测量、以及抗病毒抗体的检测和测量的本技术领域已知的各种方法。腹痛或倦怠感等自觉症状通过症状的有无来判定，黄疸通过定性水平、血液或血清中胆红素水平的测定来定量。肝炎相关的检查指标、例如血液或血清中的肝酶AST和ALT的量通过血液学、血液生化学和组织学实验来测量。血液和血清样品中病毒效价可按照本技术领域中周知的方法、例如对病毒颗粒的定量(例如通过分离和可视化，或者DNase抗性颗粒的测定)、血液或血清样品中病毒抗原的检测(通过ELISA法对抗原量的定量)、血液或血清样品中抗病毒抗体的检测、或病毒核酸(RNA和DNA)的检测(使用HCV基因特异性引物的PCR扩增或使用病毒特异性探针的原位杂交)来测量。肝组织活检也可以通过上述方法评价。

上述发明的治疗药的治疗对象是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。人以外的脊椎动物有狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、大鼠或小鼠，但并不限于此。

本发明的免疫刺激寡核苷酸可以给予有HBV和/或HCV感染可能性的个体(例如没有身体性症状时或者为HCV载体的母体内的胎儿)、可见HBV和/或HCV感染的个体、伴有上述乙型肝炎和/或丙型肝炎临床症状的个体(例如包含慢性肝炎或初期感染或慢性感染后的复发等导致的急性肝炎)。根据HBV和/或HCV感染或其症状程度，免疫刺激寡核苷酸的给予可以以不同次数进行。使用免疫刺激寡核苷酸的治疗也可以用于干扰素疗法等治疗(及其效果)不充分的个体或失败的个体。并且免疫刺激寡核苷酸可以单次或多次给予。

用作上述过敏性疾病或作为肝炎的预防、治疗药时，给予途径没有特别限定，优选皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射、患部组织的注入、口服给予、经鼻给予、经眼给予、经咽喉给予、经肺给予、透皮给予、舌下给予等。给予量根据患者的症状、治疗目的、给予途径等适当选择，通常按照寡核苷酸的量，成人每天为0.1pmol-10μmol，优选1pmol-1μmol左右。用作佐剂时的给予量也根据给予目的、给予途径等适当选择，通常可以是与上述相同程度的给予量。另外，本发明的免疫刺激寡核苷酸可按照制成通常所采用的剂型的周知的制剂方法制成制剂。

这些免疫刺激寡核苷酸可用作过敏性疾病的治疗或预防药、疫苗的佐剂或肝炎的治疗或预防药，也可用作过敏性疾病的治疗或预防方法、作为疫苗佐剂而利用的方法、或肝炎的治疗或预防方法。

实施例

以下详细说明实施例。但本发明的技术范围并不限于这些实施例。

以下说明中所使用的免疫刺激寡核苷酸的序列的简称和特性记载于序列表中。实施例中所记载的公知的免疫刺激寡核苷酸的序列、简称和特性如表1所示。

[表1]

实施例1：人PBMC中免疫刺激寡核苷酸的IFN诱导活性所必须的5′末端侧polyG序列的碱基数的比较

合成插入了含有各种碱基数的polyG序列的CpG寡核苷酸，对于IFN诱导活性所必须的长度进行研究。构建20种免疫诱导寡核苷酸(SEQ ID NO.1-20)，该免疫诱导寡核苷酸是在含有德永等人给出的回文序列CGATCG(日本特开平4-352724号公报的序列49和序列15)的回文序列TGCCGATCGGCA的外侧两末端或只在5′末端一侧插入了含有硫代磷酸酯修饰的polyG序列的寡核苷酸。对于Mod2(SEQ ID NO.1)和Mod33(SEQ ID NO.5)，在国际公开2006/035939号说明书中显示其具有IFN诱导活性。含有这些序列的寡核苷酸中，筛选具有人PBMC中的IFN-α和IFN-γ生成诱导活性的序列(图1-1-图1-6，表2)。IFN-α和IFN-γ诱导活性的评价是按照评价人PBMC中的IFN-α和IFN-γ体外诱导活性实验的具体方法中给出的顺序和条件，根据分别刺激24小时和7天的培养上清中的生成量进行评价。

[表2]

表2所表示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的浓度为100nM(终浓度)下的值。图和表中的序列中的小写字母表示硫代磷酸酯修饰的碱基。

图1-1和图1-2是Mod2(SEQ ID NO.1，泳道2)、Mod52(SEQ IDNO.2，泳道3)、Mod51(SEQ ID NO.3，泳道4)、Mod42(SEQ ID NO.4，泳道5)、Mod53(SEQ ID NO.6，泳道6)、Mod54(SEQ ID NO.7，泳道7)、Mod56(SEQ ID NO.8，泳道8)、Mod40(SEQ ID NO.9，泳道9)和Mod55(SEQ ID NO.10，泳道10)在寡核苷酸浓度为100nM(终浓度)时IFN-α生成量，以及该浓度为300nM(终浓度)时IFN-γ生成量的结果。关于IFN-α诱导活性(表2和图1-1)，在3′末端的polyG序列有3个碱基(N＝3)的组(图1-1，泳道3-7)中，5′末端具有6个碱基以上(M为7以上)的polyG序列的组的活性高(泳道6和7)。在3′末端的polyG序列具有2个碱基(N＝2)的组(泳道8-10)中，5′末端具有6个碱基以上的polyG序列的活性高(泳道9、10)。并且，与具有典型的D型CpG序列的结构(M＝2/N＝6，泳道2)的Mod2比较，Mod52(M＝3/N＝3，泳道3)、Mod51(M＝4/N＝3，泳道4)和Mod42(M＝5/N＝3，泳道5)的活性减弱或完全消失，由此表明，仅凭设计为使Mod2的polyG序列中4-6个数目的碱基变换的序列，未必可以得到具有增强的IFN-α诱导活性的寡核苷酸。对于IFN-γ诱导活性(图1-2)，除Mod56(SEQ ID NO.8，M＝5/N＝2，泳道8)之外均有同样的倾向。特别是Mod53(M＝7/N＝3，泳道6)、Mod54(M＝8/N＝3，泳道7)和Mod55(M＝7/N＝2，泳道10)的IFN-γ诱导活性比3′末端的polyG序列长度为6个碱基的Mod2显著提高(t检测：P<0.01)。该结果显示，寡核苷酸的IFN诱导活性与5′末端一侧相关，至少6个碱基以上长度的polyG序列是必须的。

接着，为了明确5′末端的polyG序列的长度与IFN诱导活性的相关性，对于将最多20个碱基的polyG序列插入到5′末端所得的寡核苷酸进行IFN诱导活性评价(图1-3和图1-4)。图1-3和图1-4分别表示Mod2(泳道1)、Mod61(SEQ ID NO.15，泳道2)、Mod62(SEQ ID NO.16，泳道3)、Mod63(SEQ ID NO.17，泳道4)、Mod64(SEQ ID NO.18，泳道5)、Mod65(SEQ ID NO.19，泳道6)和Mod66(SEQ ID NO.20，泳道7)在寡核苷酸浓度为300nM(终浓度)时的IFN-α生成量和IFN-γ生成量。结果，在浓度300nM下，具有最多8个碱基的polyG序列的IFN-α诱导活性显著提高(图1-3，M＝6-8/N＝0，泳道2-4)，具有10个碱基的polyG序列的寡核苷酸(M＝10/N＝0)显示比Mod2稍高的活性(图1-3，泳道5)。而12个碱基以上(M＝12或20/N＝0)，则活性几乎消失(泳道6、7)。IFN-γ诱导活性与IFN-α诱导活性同样倾向，但polyG序列即使为12个碱基以上也显示与以往的D型CpG序列的Mod2相同程度的活性(图1-4，泳道1、6、7)。

又对3′末端的polyG序列的碱基数与IFN诱导活性的相关性进行了评价。图1-5以及图1-6分别表示Mod2(泳道2)、Mod50(SEQ IDNO.14，泳道3)、Mod49(SEQ ID NO.13，泳道4)、Mod40(泳道5)、Mod41(SEQ ID NO.11，泳道6)在寡核苷酸浓度为100nM(终浓度)时的IFN-α生成量和该浓度为300nM(终浓度)时的IFN-γ生成量。使5′末端的polyG序列的长度为2个碱基(Mod2：M＝2/N＝6，泳道2)-6个碱基(Mod50：M＝6/N＝6，泳道3)，则IFN-α和IFN-γ的生成量与Mod55(M＝7/N＝2，参照图1-1和图1-2的泳道10)同程度增加(表2，图1-5和1-6)。显示5′末端具有6个碱基的polyG序列的寡核苷酸(M＝6/N＝0-6)的IFN-α诱导活性与3′末端一侧的polyG序列的长度有相关倾向，但是不会完全消失，超过Mod2(图1-5，泳道3-6)。各寡核苷酸的浓度300nM下的IFN-γ诱导活性均超过Mod2(图1-6，泳道2-6)。

由以上结果确认，5′末端一侧的polyG序列的碱基数(M)为6-10、优选6-8时，3′末端一侧即使是完全没有polyG序列不的寡核苷酸(M＝6-8/N＝0)，也具有比上式中的PXCGYQ部分相同的以往的D型CpG序列更为增强的IFN诱导活性。

实施例2：小鼠J774细胞中免疫刺激寡核苷酸的炎症性细胞因子诱导活性所必须的3′末端侧polyG序列的碱基数的比较

对于在5′末端一侧插入长度为6个碱基的polyG序列的免疫刺激寡核苷酸，确认其是否诱导上述J774细胞的IL-12p40的生成的方法是进行体外诱导评价实验。即，将J774细胞株用各寡核苷酸刺激48小时，评价培养上清中的炎症性细胞因子IL-12(IL-12p40)的生成量。结果，(Mod50(泳道2)、Mod49(SEQ ID NO.13，泳道3)、Mod48(SEQ IDNO.12，泳道4)、Mod33(SEQ ID NO.5，泳道5)、Mod40(泳道6)、Mod41(泳道7))在各终浓度300nM下的IL-12p40的生成受3′末端一侧的polyG序列的碱基数为4以上(M＝6/N＝4-6：泳道2-4)的寡核苷酸诱导，3个碱基以下(M＝6/N＝0-3：泳道5-7)完全未见活性(图2)。

由以上结果可以确认，3′末端一侧的polyG序列为3个碱基以下的寡核苷酸即使在5′末端一侧有6个碱基的polyG序列插入，其炎症性细胞因子诱导活性也降低或消失。

实施例3：含具有CGATCG、ATCGAT和GACGTC的序列作为回文基序的本发明的刺激寡核苷酸等以及D型CpG寡核苷酸诱导人PBMC中IFN生成的效果的比较

在式5′-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′的P为T(胸腺嘧啶)、Q为A(腺嘌呤)、XCGY为10个碱基的6种回文基序中，各polyG序列插入到5′末端一侧6个碱基、插入到3′末端一侧3个碱基，合成本发明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3，M＝6/N＝3)；以及polyG序列插入到5′末端一侧2个碱基、插入到3′末端一侧6个碱基，合成D型CpG(D型CpG：G2-PXCGYQ-G6，M＝2/N＝6)，评价在人的PBMC中IFN诱导活性。各寡核苷酸的回文基序在序列表、图3-1、3-2和3-3中表示，Mod29(SEQID NO.21)和Mod43(SEQ ID NO.22)为泳道1的CCCGATCGGG，Mod37(SEQ ID NO.23)和Mod44(SEQ ID NO.24)为泳道2的TCCGATCGGA，Mod38(SEQ ID NO.25)和Mod45(SEQ ID NO.26)为泳道2的GGCGATCGCC，Mod39(SEQ ID NO.27)和Mod46(SEQ IDNO.28)为泳道4的GACGATCGTC，D19(SEQ ID NO.29)和Mod47(SEQ ID NO.30)为泳道5的GCATCGATGC。人PBMC的IFN诱导活性的评价除使用上述寡核苷酸之外，按照与实施例1同样的顺序和条件进行。

对浓度100nM下的D型CpG和本发明的免疫刺激寡核苷酸等的活性进行测定的结果显示，在所评价的全部回文基序中，本发明的免疫刺激寡核苷酸(图3-1，G6-PXCGYQ-G3)的IFN-α的诱导活性比D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)亢进，在D型CpG在1.4-74.5倍的范围内增强。另外，对于上述寡核苷酸浓度100nM下的IFN-γ生成诱导活性也显示与IFN-α同样的倾向(图3-2)。

进一步对上式中的P为A(腺嘌呤)、Q为C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)，含有8个碱基的回文基序CGACGTCG的两种本发明的免疫刺激寡核苷酸和D型CpG对人PBMC中的IFN-α的诱导活性进行评价。结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸的Mod71(SEQ ID NO.40，M＝7/N＝2)和Mod73(SEQ ID NO.42，M＝6/N＝2)在浓度300nM下，其活性分别比D型CpG序列Mod70(SEQ ID NO.39，M＝3/N＝6)和Mod72(SEQ IDNO.41，M＝2/N＝6)显著增强(图3-3)。

这些结果显示，本发明的新型免疫刺激寡核苷酸所具有的polyG序列的插入方式与特定的回文结构非依赖性地使IFN诱导活性增强。

实施例4：具有CGATCG作为基序的本发明的免疫刺激寡核苷酸对于人PBMC中的IFN-α生成诱导的效果

对于本发明的免疫刺激寡核苷酸的最佳序列进行研究。进一步对M＝7且N＝2、XCGY为GACGATCGTC的本发明的免疫刺激寡核苷酸的P和Q进行研究。合成P为A(腺嘌呤)且Q为T(胸腺嘧啶)的寡核苷酸(Mod83，SEQ ID NO.51)、P为T且Q为A的寡核苷酸(Mod84，SEQ ID NO.48)、P和Q均为A的寡核苷酸(Mod85，SEQ ID NO.50)、P为C且Q为A的寡核苷酸(Mod87，SEQ ID NO.52)。对于在实施例3中发现的、在本发明的免疫刺激寡核苷酸中具有特别强的IFN诱导活性的Mod46和这些寡核苷酸对人PBMC中的IFN-α的诱导活性进行比较评价。人PBMC中的IFN诱导活性的评价是使用上述寡核苷酸、以及只测定IFN-α，除此之外按照与实施例1同样的顺序和条件进行。

结果，在寡核苷酸的浓度100nM下，Mod83、Mod84、Mod85和Mod87显示与Mod46相同程度的IFN-α诱导活性(图4)。结果显示，本发明的免疫刺激寡核苷酸的P和Q可以是G以外的碱基，即，可以是A、T和C的任意一种，即使不是互补的核苷酸也具有强的IFN-α诱导活性。

实施例5：本发明的免疫刺激寡核苷酸与G9-GACGATCGTC-G1以及G7-GACGATCGTC-G3对人PBMC的IFN诱导活性的比较

对本发明的免疫刺激寡核苷酸和日本特开2005-237328号公报中以具有强烈的IFN-α诱导活性的序列表示的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC-G1(SEQ ID NO.36)和G7-GACGATCGTC-G3(SEQID NO.98)对人PBMC中的IFN诱导活性进行比较。

合成具有与G9-GACGATCGTC-G1以及G7-GACGATCGTC-G3最近似的序列、未经硫代磷酸酯修饰的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod92(SEQ ID NO.97)和Mod93(SEQ ID NO.95)，比较人PBMC中的IFN-α诱导活性(表3和表4)。人PBMC中的IFN诱导活性的评价除使用上述寡核苷酸之外，其余均按照与实施例1同样的顺序和条件进行。

结果，Mod92和Mod93显示比G7-GACGATCGTC-G3和G9-GACGATCGTC-G1高的IFN-α诱导活性。

[表3]

表3.由人PBMC生成IFN-α

CpG	序列5′--3′	IFN-α(pg/mL)
			Mod92	GGGGGGTGACGATCGTCGGG	3263.3±424.5
G7-GACGATCGTC-G3	GGGGGGGGACGATCGTCGGG	2515.1±307.0

表3所示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的浓度为100nM(终浓度)下的值。各寡核苷酸均不使用硫代磷酸酯修饰碱基。

[表4]

表4.由人PBMC生成IFN-α

CpG	序列5′--3′	IFN-α(pg/mL)
			Mod93	GGGGGGGGCGACGATCGTCG	2442.5±171.4
G9-GACGATCGTC-G1	GGGGGGGGGGACGATCGTCG	684.0±277.9

表4所示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的浓度为100nM(终浓度)下的值。各寡核苷酸均不使用硫代磷酸酯修饰碱基。

由以上结果表明，本发明的免疫刺激寡核苷酸即使未进行硫代磷酸酯修饰也具有强的IFN-α诱导活性。还显示了通式中的P和Q为G以外的碱基的重要性。因此，通过在GACGATCG等显示优异的IFN-α诱导活性的回文序列和polyG序列之间插入至少一个碱基的核苷酸，可以使IFN-α诱导活性提高。

实施例6：本发明的免疫刺激寡核苷酸与G9-GACGATCGTC-G1和G7-GACGATCGTC-G3对人PBMC中的IL-12诱导活性的比较

对实施例5中使用的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod93和日本特开2005-237328号公报中所示的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC-G1对人PBMC中的IL-12诱导活性进行比较。测定可按照上述的体外评价对PBMC中的IL-12的诱导活性试验的具体方法进行。

结果，本发明的Mod93完全未诱导IL-12的生成，反之与未刺激的对照相比也显示了抑制的倾向(表5)。而G9-GACGATCGTC-G1较弱，但可见IL-12生成的增加。因此，本发明的免疫刺激寡核苷酸在人体中显示炎症性细胞因子诱导活性低。

[表5]

表5.由人PBMC生成IL-12

CpG	序列5′--3′	IL-12(pg/mL)
			no CpG-ODN		4.878±0.610
Mod93	GGGGGGGGCGACGATCGTCG	1.423±0.932
			G9-GACGATCGTC-G1	GGGGGGGGGGACGATCGTCG	5.895±0.704

表5所示的IL-12生成量是未刺激(不含CpG-ODN)或免疫刺激寡核苷酸的浓度为300nM(终浓度)下的值。各寡核苷酸均未使用硫代磷酸酯修饰碱基。

免疫刺激寡核苷酸单独刺激下，未见人末梢血细胞中显著的IL-12的生成，因此，与强的炎症反应诱导因子—内毒素的脂多糖(LPS)一起刺激，评价对IL-12生成的影响。即，将按照上述方法分离的PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基制备成每1mL含有2.0×10⁶个细胞，然后以每孔2.0×10⁵个细胞接种于圆底96孔板，在LPS和免疫刺激寡核苷酸的共存下处置24小时，回收培养上清，通过ELISA法对IL-12的生成量进行定量。免疫刺激寡核苷酸使用Mod92、Mod93、G9-GACGATCGTC-G1和G7-GACGATCGTC-G3。结果，在任何免疫刺激寡核苷酸中，LPS(50ng/mL)刺激下诱导的IL-12生成并未增强。相反可见抑制其生成的效果，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod93显示了最强的抑制活性(表6)。

[表6]

表6.LPS存在下CpG-ODN引起的由PBMC生成IL-12

CpG	序列5′--3′	IL-12(pg/mL)
			no CpG-ODN		620.2±49.9
Mod92	GGGGGGTGACGATCGTCGGG	535.6±44.9
			G7-GACGATCGTC-G3	GGGGGGGGACGATCGTCGGG	569.0±14.3
Mod93	GGGGGGGGCGACGATCGTCG	488.1±17.3
			G9-GAC GATCGTC-G1	GGGGGGGGGGACGATCGTCG	584.8±46.6

表6所示的IL-12生成量是在LPS存在下、未刺激(不含CpG-ODN)或免疫刺激寡核苷酸的浓度为100nM(终浓度)下的值。各寡核苷酸均未使用硫代磷酸酯修饰碱基。

以上结果可以确认，在人体中，本发明的免疫刺激寡核苷酸的炎症性细胞因子诱导活性比公知的序列小、且具有抗炎症作用。

实施例7：本发明的免疫刺激寡核苷酸与M26、M27、M26-GS、M27-GS、I1、2006、2395、1018、C274、G9-GACGATCGTC-G1和D19对人PBMC的IFN诱导活性的比较

对KR2001-0063153(大韩民国公开专利)中所示的寡核苷酸序列M26(SEQ ID NO.37)和M27(SEQ ID NO.38)与各polyG序列的核苷酸之间用硫代磷酸酯修饰得到的M26-GS以及M27-GS、实施例1和3中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod55和Mod46的IFN-α诱导活性进行比较评价。本实施例5中的人PBMC中的IFN诱导活性评价除使用上述寡核苷酸、以及只测定IFN-α之外，均按照与实施例1同样的顺序和条件进行。结果，寡核苷酸浓度100nM下，本发明的免疫刺激寡核苷酸与其它寡核苷酸相比显示显著高的IFN-α诱导活性(图5-1)。

下面，对于日本特开2005-237328号公报中以具有强IFN-α诱导活性的代表性序列而给出的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC-G1(SEQID NO.36)和在实施例1和3中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod53、Mod54、Mod55、Mod61、Mod62、Mod45、Mod46、Mod71和Mod73的IFN-α诱导活性进行比较评价，结果，显本发明的免疫刺激寡核苷酸在浓度1μM下显示高的IFN-α诱导活性(图5-2)。

对于日本特表平10-506265号公报中所示的寡核苷酸序列11、和实施例3中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46、以及与Mod46具有相同回文序列的D型CpG的Mod39、Mod33的IFN-α诱导活性进行比较评价，结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸在浓度30nM下显示显著高的IFN-α诱导活性，而其它寡核苷酸几乎不显示活性(图5-3)。

对国际公开第00/61151号说明书中所示的寡核苷酸序列(D19)、日本特表2001-503267号公报和国际公开第1998/018810号说明书中公开的寡核苷酸序列(2006)、国际公开第03/015711号说明书中公开的寡核苷酸序列(2395)、日本特表2002-517156号公报以及日本特表2002-500159号公报中所示的寡核苷酸序列(1018)、以及国际公开第04/058179号说明书中所示的寡核苷酸序列(C274)与本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46(SEQ ID NO.28)的人PBMC的IFN-α诱导活性进行比较。结果，寡核苷酸浓度100nM下，本发明的免疫刺激寡核苷酸具有最强的IFN-α诱导活性(图5-4)。

以上结果可知，本发明的免疫刺激寡核苷酸比具有公知的CpG序列的免疫刺激寡核苷酸均显示高的IFN-α诱导活性。

实施例8：具有polyG序列和回文序列GACGATCGTC的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46、Mod83、Mod85、Mod87和公知的CpG寡核苷酸G10、G3-6、G9-GACGATCGTC-G1、G1-GACGATCGTC-G9和2332的人PBMC中的IFN-α诱导活性的比较

在回文序列GACGATCGTC的外侧插入polyG序列所得的公知的CpG寡核苷酸有日本特开2005-237328号公报中公开的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC-G1(SEQ ID NO.36)和G1-GACGATCGTC-G9(SEQID NO.55)、国际公开第2005/014110号说明书中公开的寡核苷酸序列G10(SEQ ID NO.56)和G3-6(SEQ ID NO.57)、日本特表2003-510290号公报中公开的寡核苷酸2332(SEQ ID NO.58)。这里，对本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46、Mod83、Mod85和Mod87对公知的CpG寡核苷酸的IFN-α诱导活性进行比较评价。对于人PBMC的IFN的诱导活性的评价除使用上述寡核苷酸、以及只测定IFN-α之外，与实施例1按照同样的顺序和条件进行。结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸在寡核苷酸浓度30nM下显示高的IFN-α诱导活性(图6)。

实施例9：免疫刺激寡核苷酸Mod2、Mod33、Mod39和Mod46对小鼠脾脏细胞中细胞因子生成的诱导活性的比较

使用来自C57BL/6系统的小鼠脾细胞，对于实施例1和3中所发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46和Mod33、作为D型CpG的Mod39和Mod2之间进行细胞因子诱导活性比较评价。

测定浓度100nM下的D型CpG和本发明的免疫刺激寡核苷酸对IFN-γ和IL-10的诱导活性。测定是按照上述的确认小鼠脾细胞中是否诱导IFN-γ和IL-10生成的具体方法中例举的顺序和条件进行。结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46对IFN-γ的诱导活性比回文基序相同的D型CpG—Mod39增强，比Mod33有较大提高(图7-1)。而Mod33和Mod46的IL-10诱导活性分别与Mod2或Mod39的诱导活性大致同等(图7-2)。显示免疫刺激寡核苷酸对免疫调节性细胞因子IL-10的诱导与对炎症性细胞因子的诱导的机理可能不同。

以上结果显示，本发明的新型免疫刺激寡核苷酸在保持IL-10诱导活性的状态下使回文基序非依赖性的IFN诱导活性增强。另外，免疫刺激活性根据CpG序列的不同而具有种特异性，但本发明的免疫刺激寡核苷酸并不受这些种差异的影响，是可以使IFN诱导活性增强的普遍性结构。

实施例10：本发明的新型免疫刺激寡核苷酸对J774细胞株中的炎症性细胞因子的生成诱导活性的降低

对于实施例3中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸对炎症性细胞因子生成的诱导活性，是与回文基序相同的D型CpG进行比较评价。各寡核苷酸的回文基序如序列表和图8-1和8-2中所示，Mod37和Mod44是泳道1的TCCGATCGGA，Mod38和Mod45是泳道2的GGCGATCGCC，Mod39和Mod46是泳道3的GACGATCGTC。评价是按照上述评价小鼠J774细胞中IL-12和TNF-α诱导活性的实验中例举的顺序和条件进行。结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod44、Mod45和Mod46分别与具有相同回文序列的D型CpG—Mod37、Mod38和Mod39比较，在浓度300nM下，IL-12(图8-1)和TNF-α(图8-2)的诱导活性均显著受到抑制。

以上的结果显示，本发明所发明的具有polyG序列插入式样的新型免疫刺激寡核苷酸比含有相同回文基序的以往的D型CpG显示更低的炎症性细胞因子诱导活性。

实施例11：本发明的免疫刺激寡核苷酸与2006、2395、1018和C274对J774细胞株中TNF-α的诱导活性的比较

对实施例8 中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod46和公知的CpG寡核苷酸的TNF-α诱导活性进行评价。分别将各免疫刺激寡核苷酸以(终浓度300nM)或阳性对照脂多糖(LPS：终浓度100ng/mL)对J774细胞株刺激处置8小时，测定培养上清中TNF-α生成量。其它的顺序和条件与实施例10同样。结果，实施例4中所示的寡核苷酸序列2006(SEQ ID NO.31)、2395(SEQ ID NO.32)、1018(SEQ ID NO.33)、C274(SEQ ID NO.34)和Mod39与LPS相比，Mod46显示减弱的TNF-α诱导活性(图9)。由此，结合考虑实施例2和6所示的结果，显示3′末端的polyG序列的碱基数为3个碱基以下的本发明的免疫刺激寡核苷酸的炎症性细胞因子诱导活性减弱。

实施例12：本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87和Mod39和1018对人PBMC中IgE生成的抑制活性的比较

按照上述评价体外IgE生成抑制活性的实验的具体方法所示的顺序和条件，根据刺激14天后培养上清中的生成量，对实施例8中发现的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87和公知的CpG寡核苷酸对人IgE生成的抑制活性进行评价。即，将PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基制备成1mL中含有4.0×10⁶个细胞，然后以每孔4.0×10⁵个细胞接种到平底96孔板中，与20ng/mL人IL-4和0.2μg/mL的抗CD40抗体一起添加免疫刺激寡核苷酸，使终浓度为30或100nM，然后刺激14天，通过ELISA法测定培养上清中IgE的生成量(图10)。

结果，对于由IL-4和抗CD40抗体所诱导的IgE的生成，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(图10的泳道5)与国际公开2006/035939说明书中所示的Mod2(图10的泳道3)、Mod39(泳道4)、日本特表2002-500159号公报中公开的1018(泳道6)或国际公开第03/015711号说明书中公开的2395(泳道6)相比，IgE的生成量低。

以上结果显示，本发明的免疫刺激寡核苷酸比具有公知的CpG序列的免疫刺激寡核苷酸具有高的IgE生成抑制活性，显示对人的变应反应治疗有效的可能性。

实施例13：本发明的免疫刺激寡核苷酸对变应性疾病模型动物的IgE生成抑制效果的确认

对于实施例12 中显示显著的人IgE抑制活性的本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87的变应反应治疗效果，以在小鼠中诱发变应原特异性的Th2反应时所诱导的血清中的IgE的量作为指标进行评价。变应原使用已知为杉树花粉症的变应原一种的杉树花粉抗原Cry j1。Cry j1的纯化可按照公知的方法(H.Yasueda等人.(1983)J.Allcrgcy Clin.Immunol.，71，77-86；M.Sakaguchi等人.(1990)，45，309-312)进行。在日本特表2002-517156号公报中公开了作为提高变应反应治疗效果的方法，使抗原与免疫刺激寡核苷酸接近的方法。具体来说有使用共价键或脂质体等微胶囊的方法，在国际公开第2006/035939号说明书中报道了包埋Mod2和Cry j1的脂质体复合体抑制暴露于变应原中时所诱导的小鼠血液中IgE。对于该IgE的抑制效果，已确认比公知的具有CpG序列的寡核苷酸强。因此，采用通过脂质体与其接近的技术，通过上述实验方法评价Mod87和Mod2的变应反应治疗效果。

包埋有Cry j1和免疫刺激寡核苷酸的脂质体复合物体的制备如下进行。作为阴性对照，制备未包埋免疫刺激寡核苷酸的Cry j1脂质体复合体。将胆甾醇与二棕榈酰磷酰胆碱(DPPC)按照摩尔比1:1混合，溶解于氯仿:甲醇(＝2:1)溶液中，在茄形烧瓶内制备脂类膜。接着，向脂类膜中加入混合3.75mg/mL的Cry j1或Cry j1与10-20μM的免疫刺激寡核苷酸的混合液，在40℃下搅拌，制备脂质体。Mod87的包埋量为1条件(1xMod87)，Mod2按照与Mod87相同浓度(1×Mod2)和3倍浓度(3×Mod2)的2条件制备。对这些脂质体，用整粒装置挤出机，边在0.2-1MPa的范围内对1μm的滤器加压边进行5次整粒。接着通过离心法回收脂质体液，在PBS(-)中悬浮、离心、除去上清3次，由此除去脂质体外侧的Cry j1和免疫刺激寡核苷酸。所得脂质体的分析是通过市售的试剂盒、胆甾醇Eテストワコ—(和光纯药，439-17501)、Modified Lowry Protein Assay Reagent Kit(Pierce，23240)、OliGreenssDNA Quantitation Kit(分子探针，O-11492)分别进行胆甾醇量、Cry j1、免疫刺激寡核苷酸的测定。脂质体液中，每1μgCry j1中，1×Mod87、1×Mod2和3×Mod2的量分别为4.751、5.425和16.867ng。

以下的实施例中所示的脂质体复合体的简称如下。“Cryj1+1×Mod2/L”是指在Cry j1和1×Mod2的条件下包埋的脂质体复合体，“Cry j1+3×Mod2/L”是指在Cry j1和3×Mod2的条件下包埋的脂质体复合体，“Cry j1+1×Mod87/L”是指在Cry j1和1×Mod87的条件下包埋的脂质体复合体。“1×的情形”表示每1μg Cry j1中含有约5ng免疫刺激寡核苷酸。“3×的情形”表示每1μg Cry j1中含有1×的3倍量约15ng免疫刺激寡核苷酸。“Cry j1/L”是指只将Cry j1包埋入脂质体中。“Cryj1”是指不包埋到脂质体中而只接给予Cry j1。

对于6 周龄的BALB/c小鼠(日本チヤ—ルズリバ—)以1周的间隔给予各供试物质，以开始给予供试物质的周为0W，在0、1和2W三次进行皮内给予(i.d.)。供试物质是将Cry j1、Cry j1/L、Cry j1+1×Mod2/L、Cry j1+3×Mod2/L以及Cry j1+1×Mod87/L用PBS制备成Cry j1蛋白量为1μg/100μL，每次各给予100μL。最后的供试物质处置1周后(3W)和2周后(4W)分两次对于各固体腹腔内给予(i.p.)Cry j1和明矾混合液，诱发Th2反应。在6W时进行眼底采血，将血液进行离心操作，以血清的形式在-20℃下冷冻保存。所得血清用作作为Th2反应指标的血清中总IgE量的测定样品。最后采血后，由各个体中摘出脾脏，摘取各个体的脾脏，匀浆，按照本说明书中确认是否诱导IFN-γ和IL-10生成的具体方法中所述的制备方法，制备脾细胞(RPMI1640培养基，10％胎牛血清)。各个体的脾细胞悬浮液是以每孔4×10⁵个细胞接种于圆底96孔板中，在Cry j1存在下(终浓度25μg/mL)，在CO₂培养箱内进行72小时培养，回收培养上清。回收的培养上清中的IL-5(Th2反应指标)和IFN-γ(Th1反应指标)通过ELISA法测定。

测定6W时的血清中IgE的量，结果，Cry j1处置组的IgE的量比载体给予组显示2倍以上的高值。IgE的量中，Cry j1+1×Mod87/L处置组最低，Cry j1+3×Mod2/L、Cry j1/L、Cry j1+1×Mod2/L依次显示低值(图11)。Cry j1+1×Mod2/L给予组和Cry j1+1×Mod87/L给予组两组间进行统计处理(t检测)的结果显示，IgE的生成量中，Cry j1+1×Mod87/L显著(p<0.05)低。

接着，为了确认供试物质对处置的小鼠的Th2反应或Th1反应的诱导，从小鼠中摘取脾脏，用Cry j1刺激，测定培养上清中诱导的脾细胞的IL-5(Th2反应指标)和IFN-γ的生成量(图12-1)。测定作为Th1反应指标的IFN-γ的生成量，结果，Cry j1+1×Mod87/L(14324.62pg±7444.07)处置组最高，接着按照Cry j1+3×Mod2/L(3475.30pg±907.56)和Cry j1+L(1782.02pg±849.23)顺序，生成量依次增加。另外，给予与Cry j1+1×Mod87/L同样量免疫刺激寡核苷酸，在Cry j1+3×Mod2/L处置组中几乎未见生成。

接着测定IL-5的生成量。结果，Cry j1/L完全未抑制IL-5的生成，但是通过添加免疫刺激寡核苷酸则显著减少。Cry j1+1×Mod87/L给予组的抑制活性最强。包埋有CpG寡核苷酸和Cry j1的脂质体复合物对IL-5的抑制活性与IFN-γ诱导活性逆相关，与IgE生成抑制活性良好相关。Cry j1+1×Mod2/L给予组和Cry j1+1×Mod87/L给予组两组间进行统计处理(t检测)，结果IL-5的生成量在Cry j1+1×Mod87/L组中显著(P<0.05)低(图12-2)。

由此表明，包埋本发明的免疫刺激寡核苷酸和变应原的脂质体与公知的免疫刺激寡核苷酸和变应原的脂质体包埋变应原的技术比较，具有强烈抑制暴露于变应原中时的Th2反应和IgE生成的效果，可强烈诱导Th1诱导活性。

以上结果显示，本发明的免疫刺激寡核苷酸在使用动物的过敏模型中，比公知的D型CpG寡核苷酸的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Th1诱导活性提高，且低用量具有有效的治疗效果，因此给予具有过敏性疾病的患者时，可用作过敏性疾病的治疗或预防药。

实施例14：本发明的免疫刺激寡核苷酸对小鼠肝炎的治疗效果

使用通常作为小鼠的肝炎模型而利用的伴刀豆凝集素A(ConA)诱发肝炎模型，对本发明的免疫刺激寡核苷酸的体内抗炎症效果进行评价。ConA诱发肝炎模型是由于引发剧烈的炎症反应来使肝炎发病，作为伴随有免疫反应活化的肝炎模型使用。另外，在ConA诱发肝炎模型中，在评价CpG寡核苷酸的实验中(Abe等人，Fukushima J.Med.Sci.(2005)51，41-49)中，有K型的CpG—1688(SEQ ID NO.108)显示反而使肝炎的症状恶化的结果的公知例。另外，并未见到含有CpG的免疫刺激寡核苷酸在ConA诱发肝炎模型中可以抑制肝炎标志ALT值升高的报道。

ConA诱发小鼠肝炎模型的制备和血清中ALT值的测定如下进行。

使用5周龄的雌性BALB/c小鼠(日本チヤ—ルズリバ—)。对于给予ConA的小鼠是在给予前一天的傍晚开始至给予ConA完成期间使其断食，在给予ConA结束后重新给饵。未给予ConA的组为原态组。免疫刺激寡核苷酸是在给予ConA3、6、24小时之前进行一次给予。免疫刺激寡核苷酸用PBS(-)调节为浓度10μg/mL，然后以各100μL注射到小鼠尾静脉内。每只给予1μg。ConA使用生理盐水作为溶剂，制备成浓度4mg/mL，然后以各100μL给予小鼠尾静脉内。每只给予0.4mg。给予ConA24小时后采血，将所得血液以10000rpm、在4℃下离心5分钟，得到血清。血清中的ALT值用フジドライゲム(DRI-CHEM 5500V，富士フイルム)测定。

ConA诱发肝炎小鼠模型自诱发炎症24小时后评价血清中ALT值的升高，结果(图13)可见，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(SEQ IDNO.52)与处置时间相关，抑制血清中ALT值的升高(图13，泳道3-5)。提前3小时处置后即可见抑制ALT值升高的倾向(泳道5)，24小时前处置，则血清中ALT值显著降低(泳道3)，为载体组中ALT值(泳道2)的28.5％(t检测：p<0.05)。

以上结果确认，本发明的免疫刺激寡核苷酸在体内具有肝炎治疗效果。

实施例15：本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87和2395、1018以及G9-GACCGATCGTC-G1对于小鼠的肝炎治疗效果的比较

对于与适用于丙型慢性肝炎并与临床实验中的CpG10101为同一序列、国际公开第03/015711号说明书和日本特表2006-515277号公报中公开的寡核苷酸序列(2395，SEQ ID NO.32)、日本特表2003-526662号公报中公开的寡核苷酸序列(1018，SEQ ID NO.33)、以及日本特开2005-237328号公报中作为具有强的IFN-α诱导活性的代表性序列所公开的寡核苷酸序列G9-GACCGATCGTC-G1(SEQ ID NO.36)、本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(SEQ ID NO.52)，进行使用小鼠ConA诱发肝炎模型的肝炎治疗效果比较。

按照实施例14 所示的方法，以抑制血清中ALT值的升高为指标，评价免疫刺激寡核苷酸的肝炎治疗效果。首先对Mod87和2395的肝炎治疗效果进行比较评价。给予ConA 6小时之前，将1μg免疫刺激寡核苷酸对小鼠进行处置，在ConA引发炎症24小时后采血，测定血清中ALT值。结果，本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(图14-1，泳道3)显著抑制了ALT值的升高(t检测：p<0.05)，而2395(泳道4)完全没有效果。

接着，对Mod87和1018以及G9-GACGATCGTC-G1的肝炎治疗效果进行比较评价。在给予ConA24小时之前.将1μg免疫刺激寡核苷酸对小鼠进行处置，在ConA引发炎症24小时后采血，测定血清中ALT值。结果，ALT值的升高被本发明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(图14-2，泳道3)最强烈抑制，接着是按照1018(图14-2，泳道4)和G9-GACGATCGTC-G1(图14-2，泳道5)的顺序依次具有抑制效果。Mod87和1018分别显著抑制ALT值的升高(t检测，：Mod87：p<0.01，1018：p<0.05)，但G9-GACGATCGTC-G1并未见显著抑制。

由此确认，本发明的免疫刺激寡核苷酸比含有CpG的公知的免疫刺激寡核苷酸显示更强的肝炎治疗效果。

实施例6 中的使用人PBMC的体外比较实验中可知，本发明的免疫刺激寡核苷酸显示比近似序列的抑制IL-12生成的活性强，显示体外的抗炎症作用与小鼠肝炎的治疗效果存在相关可能性。

以上结果表明，本发明的免疫刺激寡核苷酸具有优异的干扰素诱导活性且较低的炎症性细胞因子诱导活性，并且具有肝炎治疗作用，在给予丙型肝炎患者时可用作丙型肝炎的治疗或预防药。

序列表

<110>大阪大学

东丽株式会社

<120>免疫刺激寡核苷酸及其药物用途

<130>PTRA-19361

<160>108

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod2

<400>1

ggtgccgatc ggcagggggg 20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod52

<400>2

gggtgccgat cggcaggg 18

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod51

<400>3

ggggtgccga tcggcaggg 19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod42

<400>4

gggggtgccg atcggcaggg 20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod33

<400>5

ggggggtgcc gatcggcagg g 21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod53

<400>6

gggggggtgc cgatcggcag gg 22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod54

<400>7

ggggggggtg ccgatcggca ggg 23

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod56

<400>8

gggggtgccg atcggcagg 19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod40

<400>9

ggggggtgcc gatcggcagg 20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod55

<400>10

gggggggtgc cgatcggcag g 21

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod41

<400>11

ggggggtgcc gatcggcag 19

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod48

<400>12

ggggggtgcc gatcggcagg gg 22

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod49

<400>13

ggggggtgcc gatcggcagg ggg 23

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod50

<400>14

ggggggtgcc gatcggcagg gggg 24

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod61

<400>15

ggggggtgcc gatcggca 18

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod62

<400>16

gggggggtgc cgatcggca 19

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod63

<400>17

ggggggggtg ccgatcggca 20

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod64

<400>18

gggggggggg tgccgatcgg ca 22

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod65

<400>19

gggggggggg ggtgccgatc ggca 24

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod66

<400>20

gggggggggg gggggggggg tgccgatcgg ca 32

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod29

<400>21

ggtcccgatc gggagggggg 20

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod43

<400>22

ggggggtccc gatcgggagg g 21

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod37

<400>23

ggttccgatc ggaagggggg 20

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod44

<400>24

ggggggttcc gatcggaagg g 21

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod38

<400>25

ggtggcgatc gccagggggg 20

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod45

<400>26

ggggggtggc gatcgccagg g 21

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod39

<400>27

ggtgacgatc gtcagggggg 20

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod46

<400>28

ggggggtgac gatcgtcagg g 21

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>D19

<400>29

ggtgcatcga tgcagggggg 20

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod47

<400>30

ggggggtgca tcgatgcagg g 21

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2006

<400>31

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210>32

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2395

<400>32

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1018

<400>33

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C274

<400>34

tcgtcgaacg ttcgagatga t 21

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I1

<400>35

ggggtcaacg ttcagggggg 20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G9-GACGATCGTC-G1

<400>36

gggggggggg acgatcgtcg 20

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M26

<400>37

ggggggaaaa cgttcttcgc 20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M27

<400>38

ggggggggga aaacgttctt 20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod70

<400>39

gggacgacgt cgtcgggggg 20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod71

<400>40

gggggggacg acgtcgtcgg 20

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod72

<400>41

ggaacgacgt cgttgggggg 20

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod73

<400>42

ggggggaacg acgtcgttgg 20

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>43

gggggggagc cgatcggctg g 21

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>44

gggggggagc cgatcggcag g 21

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>45

gggggggtgc cgatcggctg g 21

<210>46

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>46

gggggggagc cgatcggccg g 21

<210>47

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>47

gggggggcgc cgatcggccg g 21

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod84

<400>48

gggggggtga cgatcgtcag g 21

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>49

gggggggtga cgatcgtctg g 21

<210>50

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod85

<400>50

gggggggaga cgatcgtcag g 21

<210>51

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod83

<400>51

gggggggaga cgatcgtctg g 21

<210>52

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod87

<400>52

gggggggcga cgatcgtcag g 21

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>53

gggggggtga cgatcgttag g 21

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>54

gggggggcga cgatcgtcgg g 21

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G1-GACGATCGTC-G9

<400>55

ggacgatcgt cggggggggg 20

<210>56

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G10

<400>56

gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30

<210>57

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3-6

<400>57

ggggacgatc gtcgggggg 19

<210>58

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2332

<400>58

ggggacgatc gtcggggggg 20

<210>59

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>59

cgatcg 6

<210>60

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>60

atcgat 6

<210>61

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>61

gacgtc 6

<210>62

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>62

ccgatcgg 8

<210>63

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>63

gcgatcgc 8

<210>64

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>64

acgatcgt 8

<210>65

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>65

catcgatg 8

<210>66

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>66

gatcgatc 8

<210>67

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>67

atcgcgat 8

<210>68

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>68

gaacgttc 8

<210>69

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>69

caacgttg 8

<210>70

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>70

agcgcgct 8

<210>71

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>71

acgtacgt 8

<210>72

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>72

tagcgcta 8

<210>73

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>73

acggccgt 8

<210>74

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>74

cgacgtcg 8

<210>75

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>75

cgtcgacg 8

<210>76

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>76

gacgatcgtc 10

<210>77

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>77

ggcgatcgcc 10

<210>78

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>78

cgatcgatcg 10

<210>79

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>79

gatcgcgatc 10

<210>80

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>80

gcaacgttgc 10

<210>81

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>81

gcatcgatgc 10

<210>82

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>82

cagcgcgctg 10

<210>83

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>83

gacgtacgtc 10

<210>84

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>84

ctagcgctag 10

<210>85

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>85

cccgatcggg 10

<210>86

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>86

gacggccgtc 10

<210>87

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>87

gccgatcggc 10

<210>88

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>88

tccgatcgga 10

<210>89

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>89

acgtcgacgt 10

<210>90

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>90

acaacgttgt 10

<210>91

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>91

acgacgtcgt 10

<210>92

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>92

aacgtt 6

<210>93

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>回文序列

<400>93

agcgct 6

<210>94

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>94

gggggggtga cgatcgtcgg g 21

<210>95

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod93

<400>95

ggggggggcg acgatcgtcg 20

<210>96

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>96

ggggggggtg acgatcgtcg 20

<210>97

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Mod92

<400>97

ggggggtgac gatcgtcggg 20

<210>98

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G7-GACGATCGTC-G3

<400>98

ggggggggac gatcgtcggg 20

<210>99

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>99

gggggggtcg acgtcgtggg 20

<210>100

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>100

gggggggtcg acgtcgtgg 19

<210>101

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>101

gggggggacg acgtcgtgg 19

<210>102

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>102

gggggggtcg acgtcgagg 19

<210>103

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>103

ggggggggac gacgtcgtg 19

<210>104

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>104

ggggggggtc gacgtcgag 19

<210>105

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>105

gggggggacg acgtcgtcgg 20

<210>106

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>106

ggggggggac gacgtcgtc 19

<210>107

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>未命名

<400>107

gggggggtcg acgtcgaggg 20

<210>108

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1668

<400>108

tccatgacgt tcctgatgct 20

2

Claims

1.免疫刺激寡核苷酸，其中，该免疫刺激寡核苷酸由选自SEQ ID NO：24、26、28、52、95和97所示的碱基序列构成。

2.权利要求1所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，所有或部分核苷酸残基之间的磷酸二酯键进行了硫代磷酸酯修饰。

3.权利要求2所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，5’-末端的连续G序列的核苷酸残基之间至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯修饰。

4.权利要求2所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，3’-末端的核苷酸残基之间至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯修饰。

5.权利要求3所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，3’-末端的核苷酸残基之间至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯修饰。

6.药物，该药物含有权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

7.过敏性疾病的治疗或预防药，该药物含有权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

8.权利要求7所述的过敏性疾病的治疗或预防药，其中，上述过敏性疾病是花粉过敏症。

9.疫苗，该疫苗含有权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为佐剂。

10.肝炎的治疗或预防药，该药物含有权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸作为有效成分。

11.权利要求10所述的肝炎的治疗或预防药，其中，上述肝炎是病毒性肝炎。

12.权利要求11所述的肝炎的治疗或预防药，其中，上述病毒性肝炎是乙型或丙型肝炎。

13.权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸在制备过敏性疾病的治疗或预防药中的应用。

14.权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸在制备疫苗佐剂中的应用。

15.权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激寡核苷酸在制备肝炎的治疗或预防药中的应用。