CN101821392A - 在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序 - Google Patents

在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序 Download PDF

Info

Publication number
CN101821392A
CN101821392A CN200880111398A CN200880111398A CN101821392A CN 101821392 A CN101821392 A CN 101821392A CN 200880111398 A CN200880111398 A CN 200880111398A CN 200880111398 A CN200880111398 A CN 200880111398A CN 101821392 A CN101821392 A CN 101821392A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymkeric substance
composition
motif
seq
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880111398A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101821392B (zh
Inventor
马里恩·尤尔科
乔尔格·H·沃尔默
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Animal Health
Coley Pharmaceutical Group Inc
Original Assignee
Coley Pharmaceutical GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40351228&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101821392(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Coley Pharmaceutical GmbH filed Critical Coley Pharmaceutical GmbH
Publication of CN101821392A publication Critical patent/CN101821392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101821392B publication Critical patent/CN101821392B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

本发明提供了含有特定序列依赖性免疫刺激RNA基序的免疫刺激聚合物和所述免疫刺激聚合物的使用方法以及包含所述聚合物的组合物。所述序列依赖性免疫刺激RNA基序和包含所述基序的聚合物是TLR7和TLR7相关细胞因子IFN-α的有力的选择性诱导剂。

Description

在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的RNA序列基序
相关申请的交叉
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2007年8月13日的题目为“处在限定的核苷酸间键的环境下的诱导特异性免疫调节状况的序列基序”的美国临时申请第60/964,448号的优先权，本文通过参考并入其全部内容。
背景技术
Toll样受体(TLR)是一个高度保守的模式识别受体(PRR)多肽家族，它们识别病原体相关分子模式(PAMP)并且在哺乳动物的天然免疫中起着至关重要的作用。目前，已经鉴定出至少10个家族成员，这些成员被指定为TLR1～TLR10。各种TLR的胞浆域的特征是Toll-白细胞介素1受体(TIR)域(Medzhitov R等，(1998)Mol Cell2：253-8)。TLR对微生物入侵的识别引发了果蝇和哺乳动物中在进化中得到保留的信号级联的激活。据报道，含TIR域的衔接蛋白MyD88与TLR相关并将白细胞介素1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)募集至TLR。据信MyD88依赖性信号途径导致NF-B转录因子和c-Jun NH2端激酶(Jnk)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的激活，这些是免疫激活和产生炎性细胞因子的关键步骤。有关综述可参见Aderem A等(2000)Nature 406：782-87，和Akira S等(2004)Nat RevImmunol 4：499-511。
已经鉴定出许多特异性TLR配体。TLR2的配体包括肽聚糖和脂肽(Yoshimura A等(1999)J Immunol 163：1-5；Yoshimura A等(1999)JImmunol 163：1-5；Aliprantis AO等(1999)Science 285：736-9)。脂聚糖(LPS)是TLR4的配体(Poltorak A等(1998)Science 282：2085-8；HoshinoK等(1999)J Immunol162：3749-52)。细菌鞭毛蛋白是TLR5的配体(Hayashi F等(2001)Nature 410：1099-1103)。据报道肽聚糖不仅是TLR2的配体也是TLR6的配体(Ozinsky A等(2000)Proc Natl Acad SciUSA 97：13766-71；Takeuchi O等(2001)Int Immunol 13：933-40)。近来，据报道某些低分子量合成化合物即咪唑并喹啉类(咪喹莫特(R-837)和雷西莫特(R-848))是TLR7和TLR8的配体(Hemmi H等(2002)NatImmunol 3：196-200；Jurk M等(2002)Nat Immunol 3：499)。
从发现未甲基化的细菌DNA及其合成类似物(CpG DNA)是TLR9的配体开始(Hemmi H等(2000)Nature 408：740-5；Bauer S等(2001)Proc Natl AcadSci USA 98，9237-42)，已报道某些TLR的配体包括某些核酸分子。近来，已报道某些类型的RNA是以非序列依赖性或序列依赖性的方式的免疫刺激性的。此外，还报道了这些不同免疫刺激RNA会刺激TLR3、TLR7和TLR8。
发明内容
本发明广泛地涉及含有某些免疫刺激序列基序的免疫刺激聚合物，并且还涉及含有这类免疫刺激聚合物的免疫刺激组合物以及这些免疫刺激聚合物和组合物的使用方法。在本发明的某些方面，所述免疫刺激聚合物是免疫刺激寡核糖核苷酸(ORN)。本发明的免疫刺激聚合物可以用于需要刺激或提高免疫应答的任何场合或应用中。如下文所公开，本发明的免疫刺激聚合物可特别用于制备包含佐剂、疫苗和其它药物的药物组合物，该药物组合物用于治疗包括感染、癌症、过敏症和哮喘的多种病况。因此，在某些方面，本发明涉及包含本发明的免疫刺激聚合物的组合物以及它们的使用方法。
如下文所详细公开，本发明的免疫刺激聚合物的特征在于它们包含至少一个序列依赖性免疫刺激基序序列。据公开，序列依赖性免疫刺激基序序列和包含这些基序的聚合物是TLR7相关细胞因子干扰素α(IFN-α)的有力诱导物。
在一方面，本发明提供了一种包含含有rN1-rC-rU-rC-rA-rN2的长度为4～100单元的单链聚合物的组合物，其中所述聚合物在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA。在一个实施方式中，所述组合物还包含输送载具，其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡(noisome)、脂质复合体(lipoplexe)、聚合物复合体(polyplexe)、脂质聚合物复合体(lipopolyplexe)、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒(如纳米球或纳米胶囊)或聚合物微粒(如微球或微胶囊)，且其中所述组合物不含lipofectin。在一个实施方式中，N1包含至少一个A。在另一个实施方式中，N1包含至少一个C。在再一个实施方式中，N1包含至少一个G。在又一个实施方式中，N1包含至少一个T。在一个实施方式中，N2包含至少一个A。在另一个实施方式中，N2包含至少一个C。在再一个实施方式中，N2包含至少一个G。在又一个实施方式中，N2包含至少一个T。
在另一方面，本发明提供了一种包含含有免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4的长度为4～100单元的组合物，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。在一个实施方式中，所述组合物还包含输送载具，其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒(如纳米球或纳米胶囊)或聚合物微粒(如微球或微胶囊)，且其中所述组合物不含lipofectin。在一个实施方式中，X2是A。在一个实施方式中，X2是C。在另一个实施方式中，X2是G。在一个实施方式中，X3是A。在另一个实施方式中，X3是C。在又一个实施方式中，X3是G。在一个实施方式中，N3包含至少一个A。在另一个实施方式中，N3包含至少一个C。在再一个实施方式中，N3包含至少一个G。在又一个实施方式中，N3包含至少一个U。在一个实施方式中，N4包含至少一个A。在另一个实施方式中，N4包含至少一个C。在再一个实施方式中，N4包含至少一个G。在又一个实施方式中，N4包含至少一个U。
上述组合物可以包含其它要素或所述聚合物的修饰物。例如，在一个实施方式中，所述组合物还包含抗原。在一个实施方式中，所述抗原与所述聚合物接合。在一个实施方式中，rN1-rC-rU-rC-rA-rN2或rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4基序包含修饰的核苷碱基，所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。在另一个实施方式中，所述聚合物在rN1-rC-rU-rC-rA-rN2基序之外还包含至少一个修饰的核苷碱基，其中所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-位取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-位取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。
在另一个实施方式中，所述组合物还包含与该聚合物共价相连的亲脂部分。在一个实施方式中，所述亲脂部分选自胆甾烯基、棕榈酰基和脂肪酰基。在另一个实施方式中，所述聚合物不含CpG基序。在再一个实施方式中，所述聚合物不包含CCGAGCCGAGCUCACC(SEQ ID NO：35)。在一个实施方式中，所述聚合物的长度为4～20单元。在另一个实施方式中，所述聚合物的长度为10～25单元。在再一个实施方式中，所述聚合物的长度为15～19单元。在一个实施方式中，每个聚合物单元都是核糖核苷酸。在另一个实施方式中，聚合物单元是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在再一个实施方式中，所述脱氧核糖核苷酸包括处于所述聚合物的5’端的TCG基序。在又一个实施方式中，所述聚合物的至少一个单元是氨基酸。在一个实施方式中，所述聚合物与TLR9激动剂相连。在另一个实施方式中，所述TLR9激动剂是小分子。在再一个实施方式中，所述聚合物与TLR7激动剂相连。在又一个实施方式中，所述聚合物与TLR8激动剂相连。
在另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括使能产生IFN-α的免疫细胞与长度为4～100单元的单链聚合物接触，所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C，其中所述聚合物不与lipofectin一起配制。在一个实施方式中，所述聚合物包含至少一个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。在另一个实施方式中，所述聚合物包含1～5个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。在一个实施方式中，所述稳定化键处在5’端和/或3’端。
在又一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括使能产生干扰素α(IFN-α)的免疫细胞与长度为4～100单元的单链聚合物接触，所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C，其中所述聚合物不与lipofectin一起配制。
在一个实施方式中，上述方法不会导致免疫细胞应答于所述聚合物而产生显著量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(TNF-γ)或白细胞介素12(IL-12)。在某些实施方式中，所述方法在体内进行。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
在另一方面，本发明提供了一种哮喘治疗方法，所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ IDNO：34)，其中X1是A或C。
在再一方面，本发明提供了一种哮喘治疗方法，所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在一个实施方式中，上述哮喘治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用过敏原。在一个实施方式中，所述聚合物与所述过敏原接合。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
在另一方面，本发明提供了一种过敏病况的治疗方法，所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ IDNO：34)，其中X1是A或C。
在再一方面，本发明提供了一种过敏病况的治疗方法，所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在一个实施方式中，上述过敏病况的治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用过敏原。在一个实施方式中，所述聚合物与所述过敏原接合。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
在另一方面，本发明提供了一种癌症治疗方法，所述方法包括对患有癌症的受试对象施用癌症治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ IDNO：34)，其中X1是A或C。
在再一方面，本发明提供了一种癌症治疗方法，所述方法包括对患有癌症的受试对象施用癌症治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在一个实施方式中，上述癌症治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用癌抗原。在一个实施方式中，所述聚合物与所述抗原接合。在其它实施方式中，所述方法还包括对受试对象施用第二癌症药物。在一个实施方式中，所述癌症药物是卡铂、紫杉醇(paclitaxel)、顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素、泰素(taxol)和吉西他滨(gemcitabine)中的一种或多种。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
在另一方面，本发明提供了一种传染病治疗方法，所述方法包括对患有传染病的受试对象施用传染病治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ IDNO：34)，其中X1是A或C。
在又一方面，本发明提供了一种传染病治疗方法，所述方法包括对患有传染病的受试对象施用传染病治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在一个实施方式中，上述传染病治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用微生物抗原。在一个实施方式中，所述聚合物与所述抗原接合。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
在另一方面，本发明提供了一种用于在受试对象中诱导1型T辅助(Th1)样免疫应答的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在再一方面，本发明提供了一种用于在受试对象中诱导1型T辅助(Th1)样免疫应答的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
在一个实施方式中，上述Th1样免疫应答的诱导方法中的任何一种还可以包括对受试对象施用抗原。在一个实施方式中，所述聚合物与所述抗原接合。在某些实施方式中，将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。
本发明在其应用中不限于以下描述中所陈述或附图中所显示的要素的具体的构建和安排。本发明可以具有其它实施方式并且能以不同方式进行实践或实施。此外，本文所用的措辞和术语是出于说明性目的，不应将其视为限制性的。本文中“包括”、“包含”或者“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意在涵盖其后所列的项目及其等价物以及其它项目。
附图说明
图1是显示人外周血单核细胞(PBMC)与寡核糖核苷酸(ORN)接触之后该细胞中诱导产生IFN-α的图。将ORN(起始浓度：2μM+50μg/ml DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基-1]-N，N，N-三甲基甲硫酸铵))与人PBMC一起温育并在24小时后通过酶联免疫吸附检验(ELISA)测试上清液的IFN-α。所示为正对照(CCGUCUGUUGUGUGACUC；SEQID NO：1)和4个测试序列(SEQ ID NO：2～5，见表1)。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴显示以pg/ml为单位的IFN-α浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图2是显示通过ORN对IFN-α(图2A)和IL-12p40(图2B)的诱导的两幅图。所示为已知可诱导TLR 7相关细胞因子和TLR 8相关细胞因子两者的ORN(SEQ ID NO：1)以及诱导的TLR 7相关细胞因子比TLR 8相关细胞因子多的ORN(SEQ ID NO：3)。将人PBMC与ORN在存在DOTAP(2μM ORN和50μg/ml DOTAP)时一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度(图2A)和IL-12p40浓度(图2B)，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图3是显示人PBMC细胞与寡核糖核苷酸(ORN)接触后该细胞中诱导产生IFN-α的图。将ORN(起始浓度：2μM+25μg/ml)与人PBMC一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α。所示为SEQID NO：3和4个带有细微序列变异的ORN(SEQ ID NO：6、7、11和12，见表2)。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴显示以pg/ml为单位的IFN-α浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图4是显示通过ORN对IFN-α(图4A)和IL-12p40(图4B)的诱导的两幅图。所示为SEQ ID NO：3和带有细微序列变异的3个其它ORN(SEQ ID NO：8～10，见表3)。将人PBMC与ORN在存在DOTAP(2μMORN和25μg/ml DOTAP)时一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度(图4A)和IL-12p40浓度(图4B)，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图5是显示通过ORN对IFN-α(图5A)和IL-12p40(图5B)的诱导的两幅图。所示为SEQ ID NO：3和带有细微序列变异的3个其它ORN(SEQ ID NO：13～15，见表4)。将人PBMC与ORN在存在DOTAP(2μMORN和25μg/ml DOTAP)时一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度(图5A)和IL-12p40浓度(图5B)，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图6是显示通过ORN对IFN-α(图6A)和IL-12p40(图6B)的诱导的两幅图。所示为SEQ ID NO：3和带有细微序列变异的3个其它ORN(SEQ ID NO：19～21，见表5)。将人PBMC与ORN在存在DOTAP(2μMORN和25μg/ml DOTAP)时一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度(图6A)和IL-12p40浓度(图6B)，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图7是显示通过ORN对IFN-α(图7A和7B)和IL-12p40(图7C和7D)的诱导的两幅图。所示为SEQ ID NO：3和带有细微序列变异的6个其它ORN(SEQ ID NO：16～18和SEQ ID NO：22～24，见表3)。将人PBMC与ORN在存在DOTAP(2μM ORN和25μg/ml DOTAP)时一起温育并在24小时后通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度(图7A和7B)和IL-12p40浓度(图7C和7D)，x轴显示单位为μM的log ORN 浓度。
图8是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(GACACACACACUCACACACACACA；SEQ ID NO：27)进行的体外细胞因子诱导的4幅图。SEQ ID NO：27没有诱导显著的IL-12(图8A)、IL-6(图8B)、IL-2R(图8C)或IL-7(图8D)。结果与负对照(GACACACACACACACACACACACA；SEQ ID NO：25)、带有富含U的3’端的非UCA ORN(GACACACACACACACACACACUUU；SEQID NO：26)和正对照(UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU(均为硫代磷酸酯)；SEQ ID NO：28)进行比较。将3个健康捐血者的人PBMC与至多2μM的ORN在存在DOTAP时一起温育24小时。收集上清液并通过ELISA测定细胞因子或趋化因子的浓度。y轴是以pg/ml为单位的细胞因子或趋化因子的浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图9是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：27)进行的体外细胞因子诱导的4幅图。SEQ ID NO：27没有诱导显著的IL-10(图9A)、IL-15(图9B)、IL-12p40(图9C)或TNF-α(图9D)。结果与负对照(SEQ ID NO：25)、带有富含U的3’端的非UCA ORN(SEQID NO：26))和正对照(SEQ ID NO：28)进行比较。将3个健康捐血者的人PBMC与至多2μM的ORN在存在DOTAP时一起温育24小时。收集上清液并通过ELISA测定细胞因子或趋化因子的浓度。y轴是以pg/ml为单位的细胞因子或趋化因子的浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图10是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：27)进行的体外细胞因子诱导的4幅图。SEQ ID NO：27没有诱导显著的MIP-1α(图10B)、IFN-γ(图10C)或MIP-1β(图10D)，但是诱导了IFN-α(图10A)。结果与负对照(SEQ ID NO：25)、带有富含U的3’端的非UCAORN(SEQ ID NO：26))和正对照(SEQ ID NO：28)进行比较。将3个健康捐血者的人PBMC与至多2μM的ORN在存在DOTAP时一起温育24小时。收集上清液并通过ELISA测定细胞因子或趋化因子的浓度。y轴是以pg/ml为单位的细胞因子或趋化因子的浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图11是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：27)进行的体外细胞因子诱导的3幅图。SEQ ID NO：27没有诱导显著的MIG(图11C)，但是诱导了IP-10(图11A)和MCP-1(图11B)。结果与负对照(SEQ ID NO：25)、带有富含U的3’端的非UCA ORN(SEQ IDNO：26))和正对照(SEQ ID NO：28)进行比较。将3个健康捐血者的人PBMC与至多2μM的ORN在存在DOTAP时一起温育24小时。收集上清液并通过ELISA测定细胞因子或趋化因子的浓度。y轴是以pg/ml为单位的细胞因子或趋化因子的浓度，x轴显示单位为μM的log ORN浓度。
图12是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：3)进行的体内细胞因子诱导的4幅图。SEQ ID NO：3在3小时和24小时的时间点诱导IFN-α(图12A和图12C)和IP-10(图12B和图12D)。将SEQ ID NO：3的活性与诱导TLR7相关细胞因子和TLR8相关细胞因子两者的2个ORN(GACACACACACACACACACACAUU；SEQ IDNO：30；和UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(硫代磷酸酯主链)；SEQID NO：33)以及主要诱导TLR8相关细胞因子的2个ORN(UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU；SEQ ID NO：31；和UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(硫代磷酸酯主链)；SEQ ID NO：32)的活性进行比较。x轴显示所用的ORN(包括作为负对照的盐水和DOTAP)，y轴显示以pg/ml为单位的细胞因子浓度。HBS：缓冲盐水。
图13是比较通过带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：3)进行的体内细胞因子诱导的5幅图。SEQ ID NO：3在3小时的时间点没有诱导显著量的TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6或IL-10(分别为图13A～E)。将SEQ ID NO：3的活性与诱导TLR7相关细胞因子和TLR8相关细胞因子两者的2个ORN(SEQ ID NO：30和33)以及主要诱导TLR8相关细胞因子的2个ORN(SEQ ID NO：31和32)的活性进行比较。x轴显示所用的ORN(包括作为负对照的盐水和DOTAP)，y轴显示以pg/ml为单位的细胞因子浓度。HBS：缓冲盐水。
图14是显示由带有免疫刺激UCA基序的ORN(SEQ ID NO：3)进行的体内脾细胞激活的4幅柱形图。SEQ ID NO：3激活脾CD3+T细胞(图14A和图14B)和DX5+B细胞(图14C和图14D)。将细胞从脾脏隔离并通过FACS分析进行分离。x轴显示所用的ORN(包括作为负对照的盐水和DOTAP)，y轴显示CD69+细胞％(A和C)或IL-12R+细胞％(B和D)。HBS：缓冲盐水。
图15是描绘包括在UCA基序中带有单个U的SEQ ID NO：27的指定ORN与带有至多3个U但没有UCA基序的其它ORN相比对IFN-α的诱导的图。y轴是以pg/ml为单位的IFN-α浓度，x轴显示以μM为单位的log ORN浓度。
图16是描绘在应答于指定的ORN或CpG ODN 1826(SEQ IDNO：34)时在TLR9敲除(TLR9KO)小鼠、TLR7敲除(TLR7KO)小鼠和对照C57BL/6小鼠中的IFN-α、IP-10、IL-12和IL-6的诱导的4幅柱形图。HBS：缓冲盐水。
图17是描绘在MyD88敲除(MyD88KO)小鼠和对照C57BL/6小鼠中的IFN-α和IP-10的诱导的柱形图。HBS：缓冲盐水。
具体实施方式
已说明免疫刺激寡核糖核苷酸(ORN)可能以TLR7依赖性和/或TLR8依赖性方式来刺激人类免疫系统。例如，含有富含GU且富含CU而缺乏聚G末端的基序的ORN可能作用于TLR7和TLR8。带有富含AU而缺乏聚G末端的ORN可能仅作用于TLR8。含有由聚G基序侧包围的免疫刺激RNA基序的ORN可能通过TLR7而非TLR8来刺激免疫应答。这些在存在如例如DOTAP等阳离子脂质体制剂时会产生大量的IFN-α。这种效应似乎经TLR7介导，这是因为产生IFN-α的类浆细胞树突细胞(pDC)表达TLR7但不表达TLR8。所观察到的其它细胞因子(例如，TNF-α、IL-12和IFN-γ)可能经TLR8介导。例如，单核细胞的激活很有可能是直接经TLR8介导的效应，因为据显示单核细胞表达TLR8而不表达TLR7并且在ssRNA刺激时分泌TNF-α。近来，已经鉴定出带有不同免疫特性(immune profile)并且具有用于激活RNA介导的应答的限定基序的ORN。某些这种ORN不会诱导人PBMC产生IFN-α，但却诱导显著量的TNF-α、IL-12和IFN-γ，这指向TLR8而非TLR7的刺激。
本发明涉及发现一类含有特异性RNA基序的聚合物，所述RNA基序能诱导称为TLR7介导应答(如由pDC产生IFN-α)的RNA介导免疫应答而不会诱导显著量的TLR8介导(即由表达TLR8的细胞产生的细胞因子的产生，例如由单核细胞产生的TNF-α)的免疫激活。如本文所用，“显著量”是指与由其它免疫刺激ORN产生的量不同的量。“不会诱导显著量的TLR8介导的免疫激活”是指：当与由上述那些含有富含GU和富含CU而缺乏聚G末端的ORN或可能刺激TLR8的其它ORN等ORN诱导的水平相比，免疫激活(例如，被诱导的TLR激活相关因子的水平)最小。因此，本发明的ORN诱导更少的对于RNA TLR8或TLR7/8配体(例如，促炎性细胞因子TNF-α、IL-6)而言是典型的细胞因子。在某些实施方式中，显著量是“明显重大量”。本文所述的聚合物类别是单链的、具有磷酸二酯主链并且具有含CUCA序列的免疫刺激RNA基序。
这一类别与特征是几乎排他性的TLR7样免疫应答的激活的免疫特性相关联。例如，如图4所示，本发明的聚合物SEQ ID NO：3在配制有DOTAP时诱导了极大量的IFN-α而没有明显诱导IL-12p40。相反，具有相似序列但缺乏免疫刺激CUCA基序的聚合物SEQ ID NO：8～10诱导了大量的IL-12p40。
已发现的这种新的免疫刺激基序仅在磷酸二酯主链的环境下是免疫刺激性的。有趣的是，已经发现，含有该基序的本发明的免疫刺激聚合物会产生强IFN-α应答但不会刺激其它典型细胞因子(例如那些应答于TLR8刺激而被诱导的细胞因子)。因此，在一方面，本发明提供了一种含有主要诱导TLR7相关细胞因子的免疫刺激基序并且具有磷酸二酯主链的免疫刺激聚合物。
在本发明的一方面，所述免疫刺激RNA基序是rN1-rC-rU-rC-rA-rN2，其中所述聚合物在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7(rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA)，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。在某些实施方式中，N1包含至少一个A、一个C或一个G。在其它实施方式中，N1包含至少一个T，例如，在RNA:DNA嵌合物中。在某些实施方式中，N2包含至少一个A、一个C、一个G或一个T。
在本发明的另一方面，所述免疫刺激RNA基序是rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3不存在或为选自由C、G和A构成的核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4不存在或为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。在某些实施方式中，所述聚合物不含CCGAGCCGAGCUCACC(SEQ IDNO：35)。在本发明的某些实施方式中，N3和N4各自独立地包含至少一个A、C、G或U。
在某些实施方式中，所述免疫刺激聚合物的长度为4～100单元。在其它实施方式中，所述免疫刺激聚合物的长度为4～20单元。在其它实施方式中，所述免疫刺激聚合物的长度为10～25单元。在其它实施方式中，所述免疫刺激聚合物的长度为15～19单元。
如下文实施例中更详细论述的那样，据发现所述免疫刺激基序的CUCA对于TLR7样免疫应答很重要。令人惊讶的是，免疫刺激效果对于磷酸二酯主链是特异性的，而对硫代磷酸酯主链则不是。在某些实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物具有多于一个的免疫刺激基序。
本发明的免疫刺激聚合物是单链的。根据本发明的方法，所述聚合物并非设计为包含与人类细胞中的编码序列互补的序列，并且因此不认为其是反义ORN或沉默RNA(siRNA)。“非互补”聚合物是不含能与靶标细胞中的一个特定编码区强力杂交(例如，不会在严格条件下杂交)的序列的聚合物。因此，施用非互补的聚合物不会造成基因沉默，尤其是因为本发明所述的聚合物与基因沉默所用的双链分子相比是单链的。
本发明的聚合物能够对诱导相对于背景而言显著量的IFN-α或IFN-α相关分子的免疫应答进行诱导。IFN-α相关分子是与IFN-α的表达有关的细胞因子或因子。这些分子包括但不限于MIP1-β、IP-10和MIP1-α。
本发明一般性涉及包含免疫刺激RNA基序的免疫刺激聚合物、含有一个或多个本发明的免疫刺激聚合物的免疫刺激组合物以及使用本发明的免疫刺激聚合物和免疫刺激组合物的方法。如本文所用，术语“RNA”是指通过3’-5’磷酸二酯键共价连接的两个以上的核糖核苷酸(即，各自包含与磷酸基相连的核糖和嘌呤或嘧啶核苷碱基(例如，鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)的分子)。
如上所述，RNA是指通过3’-5’磷酸二酯键联接的核糖核苷酸的聚合物。在某些实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物是RNA。在其它实施方式中，本发明提供了包含嵌合的DNA:RNA分子的免疫刺激组合物，所述嵌合DNA:RNA分子包含本发明的免疫刺激RNA基序。在本发明的一个实施方式中，DNA:RNA分子的脱氧核糖核苷酸残基包含处于所述聚合物的5’端的TCG基序。在一个实施方式中，嵌合DNA:RNA分子的DNA组分包含CpG核酸，即TLR9激动剂。在一个实施方式中，嵌合DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通过核苷酸间磷酸键共价连接。在另一个实施方式中，嵌合DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通过连接子(例如，非核苷酸连接子)共价连接。
在另一个实施方式中，所述聚合物的至少一个单元是氨基酸。
在某些实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物与不是CpG核酸的TLR9激动剂连接。在某些实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物与TLR7激动剂或TLR9激动剂连接。所述激动剂可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其可以是肽或小分子。免疫刺激聚合物可以与激动剂直接相连或者它们可以经由连接子相连。
本发明的免疫刺激聚合物可以涵盖各种相比于天然RNA和DNA的化学修饰和取代，这些化学修饰和取代涉及核苷酸间磷酸二酯键、β-D-核糖单元和/或天然核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例对于本领域技术人员是已知的，并且在以下文献中有所描述：例如，Uhlmann E等(1990)Chem Rev 90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties &Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST等(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol36：107-129；和Hunziker J等(1995)Mod Synth Methods 7：331-417。本发明的寡核苷酸可以具有一种或多种修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的相同序列的寡核苷酸相比，每种修饰位于特定的核苷酸间磷酸二酯键和/或特定的β-D-核糖单元和/或特定的天然核苷酸碱基位置。
例如，本发明涉及可以包含一种或多种修饰的寡核苷酸，其中每种修饰独立地选自：
a)以修饰的核苷酸间键代替位于核苷酸的3’端和/或5’端的核苷酸间磷酸二酯键，
b)以脱磷键代替位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯键，
c)以另一单元代替磷酸化糖主链中的磷酸化糖单元，
d)以修饰的糖单元代替β-D-核糖单元，和
e)以修饰的核苷酸碱基代替天然核苷酸碱基。
更详细的寡核苷酸化学修饰的实例如下。
在一个实施方式中，ORN可以具有至少一个稳定化的核苷酸间键。通常，该键是处在或靠近5’端或3’端并且不在免疫刺激基序内。位于核苷酸的3’端和/或5’端的核苷酸间磷酸二酯键可以由至少一个修饰的核苷酸间键替代，其中该修饰的核苷酸间键例如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、α-羟基苄基膦酸酯、磷酸(C1～C21)-O-烷基酯、磷酸[(C6～C12)芳基-(C1～C21)-O-烷基]酯、(C1～C8)烷基膦酸酯和/或(C6～C12)芳基膦酸酯键、(C7～C12)-α-羟甲基芳基(例如，WO 95/01363中所公开)，其中(C6～C12)芳基、(C6～C20)芳基和(C6～C14)芳基可选地由卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1和R2彼此独立地为氢、(C1～C18)烷基、(C6～C20)芳基、(C6～C14)芳基-(C1～C8)烷基，优选为氢、(C1～C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基和/或甲氧基乙基，或者R1和R2与携带它们的氮共同形成五～六元杂环，该五～六元杂环可以另外含有来自O、S和N的其它杂原子。在一个实施方式中，ORN具有1～5个稳定化键。
位于核苷酸的3’端和/或5’端的磷酸二酯键可由脱磷键替代(脱磷键在例如Uhlmann E和Peyman A所著“Methods in Molecular Biology”，第20卷，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，第16章，第355页起中有所描述)，其中脱磷键例如选自脱磷键甲缩醛、3’-硫代甲缩醛、甲基羟基胺、肟、亚甲基二甲基亚肼、二亚甲基砜和/或甲硅烷基。
来自磷酸化糖主链(即由磷酸化糖单元组成的磷酸化糖主链)的磷酸化糖单元(即β-D-核糖和核苷酸间磷酸二酯键共同形成磷酸化糖单元)可以由另一个单元替代，其中该另一单元例如适于构建“吗啉基衍生物”寡聚物(例如，Stirchak EP等(1989)Nucleic Acids Res 17：6129-41中所述)，即例如由吗啉基衍生物单元替代；或该另一单元适于构建聚酰胺核酸(“PNA”；例如Nielsen PE等(1994)Bioconjug Chem 5：3-7所述)，即例如由PNA主链单元替代，例如，由2-氨基乙基甘氨酸替代。
β-核糖单元或β-D-2’-脱氧核糖单元可以由修饰的糖单元替代，其中该修饰的糖单元是例如，β-D-核糖、α-D-2-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、′-O-(C1～C6)烷基核糖(2′-O-(C1～C6)烷基核糖优选为2′-O-甲基核糖)、′-O-(C2～C6)烯基核糖、2′-[O-(C1～C6)烷基-O-(C1～C6)烷基]核糖、2′-NH2-2′-脱氧核糖、β-D-呋喃木糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤藓吡喃己糖和碳环糖类似物(例如，Froehler J(1992)Am Chem Soc 114：8320中所述)和/或开链糖类似物(例如，Vandendriessche等(1993)Tetrahedron 49：7223中所述)和/或双环糖类似物(例如，Tarkov M等(1993)Helv Chim Acta 76：481中所述)。
核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶，例如，C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-位取代的嘌呤等修饰的碱基(Wagner RW等(1996)Nat Biotechnol14：840-4)。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以及其它的天然存在的核苷碱基和非天然存在的核苷碱基、带有和不带取代基的芳香部分。
在一个实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物可以在免疫刺激基序之外包含一个或多个修饰的核苷碱基，即A、C、G、T和U的衍生物。这些修饰的核苷碱基的具体实施方式包括但不限于5-位取代的胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未被取代或取代的5-炔基胞嘧啶)、6-位取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如，N4-乙基胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、带有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如，N，N’-丙炔胞嘧啶或吩噁嗪)以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)、胸腺嘧啶衍生物(例如，2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-位取代的胸腺嘧啶)、鸟苷衍生物(7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-位取代鸟嘌呤(如7-脱氮-7-(C2～C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8-位取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如，N2-甲基鸟嘌呤)、8-位取代的鸟嘌呤(例如，8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤)或腺苷衍生物(5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如，N6-甲基腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤))。碱基还可以由通用碱基(universal base，例如，4-甲基吲哚、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、P碱基和K碱基)、芳环体系(例如，苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)、芳环体系(例如，氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代。修饰的U核苷碱基是如二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或5-溴尿嘧啶等尿嘧啶衍生物。前述修饰的核苷碱基及其应答核苷可获自商业供应商。该列表旨在进行举例而不应被解读为限制性的。
本发明的组合物涵盖了具有或不具有二级或更高级的聚合物。例如，在一个实施方式中，所述聚合物包含核苷、核苷类似物或核苷和核苷类似物的组合的序列，该序列能形成由至少两个相邻的氢键碱基对提供的二级结构。在一个实施方式中，所述至少两个相邻的氢键碱基对涉及两组每组至少3个连续碱基。所涉及碱基的连续性性质在热力学上对于形成所谓的夹型(clamp)是有利的。然而，连续碱基可能并非必需的，特别是在具有高GC含量和/或较长的序列时。通常，序列中存在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基对。在一个实施方式中，氢键碱基对可以是经典Watson-Crick碱基对，即G-C、A-U或A-T。在其它实施方式中，氢键碱基对可以是非经典碱基对，例如，G-U、G-G、G-A或U-U。在另外的实施方式中，氢键碱基对可以是Hoogsteen碱基对或其它碱基对。
在一个实施方式中，二级结构是茎环(stem-loop)二级结构。茎环二级结构或发夹二级结构可以通过在互补或至少部分互补的序列之间的分子内氢键碱基配对而产生。互补序列或至少部分互补的序列分别代表完全反转重复序列或间断的反转重复序列。例如，具有由5′-X1-X2-X3...X3′-X2′-X1′-3′提供的碱基序列(其中X1和X1′、X2和X2′以及X3和X3′中的每一对都能形成氢键碱基对)的聚合物可以包含完全或间断的反转重复片段并且具有自身折叠并形成茎环二级结构的潜力。当存在两个以上的反转重复片段时，各个聚合物还能相互作用从而不仅形成二聚的分子间复合物还可形成更高级的分子间复合物或结构。本领域技术人员会认识到，可以选择条件和/或序列以便使一种二级结构类型比另一种二级结构类型更利于形成。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物与亲脂部分的接合物。在某些实施方式中，免疫刺激聚合物与亲脂部分共价连接。亲脂部分通常会出现在具有游离末端的免疫刺激ORN的一个以上的末端处，但在某些实施方式中，亲脂部分可以出现在免疫刺激聚合物的其它地方并因此不需要免疫刺激ORN具有游离末端。在一个实施方式中，免疫刺激聚合物具有3’端，而亲脂部分与该3’端共价相连。亲脂基团通常可以为胆甾烯基、修饰的胆甾烯基、胆固醇衍生物、还原胆固醇、带取代基的胆固醇、修饰的胆固醇、胆甾烷、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸酯、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、如类固醇等类异戊二烯、如维生素E等维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、如甘油三酯等脂肪酸酯、芘、卟啉、德克萨卟啉(Texaphyrine)、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、若丹明、德克萨斯红(Texas-Red)、地高辛、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花菁染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬。在某些实施方式中，亲脂部分选自胆甾烯基、棕榈酰基和脂肪酰基。据信在本发明的免疫刺激ORN中包含一个或多个这类亲脂部分会为其带来额外的抵抗核酸酶的降解的稳定性。当本发明的单个免疫刺激聚合物中存在两个以上的亲脂部分时，可以互相独立地选择每个亲脂部分。
在一个实施方式中，亲脂基团与免疫刺激聚合物的核苷酸的2’-位相连。亲脂基团可以替代性地或者附加性地与免疫刺激聚合物的核苷酸的杂环核苷碱基相连。亲脂部分可以经由任何合适的直接或间接链接与免疫刺激聚合物共价连接。在一个实施方式中，所述链接时直接链接并且是酯键或酰胺键。在一个实施方式中，所述链接是间接链接并且包括间隔区部分，例如，一个或多个无碱基核苷酸残基、寡聚乙二醇(如三聚乙二醇(间隔区9)或六聚乙二醇(间隔区18))或烷基二醇(如丁二醇)。
在一个实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物与阳离子脂质混合。在一个实施方式中，阳离子脂质是DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基-1]-N，N，N-三甲基甲硫酸铵)。据信DOTAP将聚合物转运至细胞内并特异性地运输至内体腔，DOTAP可以在内体腔中以pH依赖性方式释放该聚合物。一旦进入内体腔后，聚合物可以与某些胞内TLR相互作用，从而引发参与产生免疫应答的LTR介导信号转导途径。可以使用具有相似性质(包括向内体腔的运输)的其它试剂代替DOTAP或作为其补充。其它脂质制剂包括例如，(带有特异性DNA缩合增强子的非脂质体脂质)和
Figure GPA00001094794900212
(新型作用树枝状聚合物技术)、
Figure GPA00001094794900213
(可以在穿过细胞膜时变为带正电荷的电荷可逆性颗粒)以及采用脂双层的稳定核酸脂颗粒(SNALP)。脂质体可从Gibco BRL商购，例如，
Figure GPA00001094794900214
和LIPOFECTACETM，它们由如N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)等阳离子脂质形成。脂质体的制备方法是本领域内公知的并且已在许多出版物中得到描述。此外，Gregoriadis G(1985)Trends Biotechnol 3：235-241也对脂质体进行了综述。在其它实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物与微粒、环糊精、纳米颗粒、非离子囊泡、树枝状聚合物、聚阳离子肽、病毒颗粒和类病毒颗粒或
Figure GPA00001094794900221
混合。
在一个实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物的形式是具有一级结构和二级结构的共价性闭合的哑铃形分子。如下文所述，在一个实施方式中，这类寡核糖核苷酸包含两个通过插入的双链片段连接的单链环。在一个实施方式中，至少一个单链环包含本发明的免疫刺激RNA基序。本发明的其它共价闭合的哑铃形分子包括嵌合DNA:RNA分子，在该嵌合DNA:RNA分子中，例如所述双链片段至少部分是DNA(例如，同二聚体dsDNA或异二聚体DNA:RNA)，并且至少一个单链环包含本发明的免疫刺激RNA基序。替代性地，所述嵌合分子的双链片段是RNA。
在某些实施方式中，免疫刺激聚合物是孤立的。孤立分子是基本纯净并且不带一般与其共同发现于天然或体内系统中的其它物质的分子，其程度对于其预期用途是实际并且适当的。特别地，免疫刺激聚合物足够的纯净并且所带的其它细胞生物组分足够少从而可用于例如制备药物制剂。由于孤立的本发明的免疫刺激聚合物可以与药物可接受载剂在药物制剂中共混，免疫刺激聚合物可以仅构成该制剂的较小的重量百分比。然而，免疫刺激聚合物是大体纯净的，因为已将其与可能与其在生物体系中相关的物质相分离。
为用于本发明，可以使用或者修改任何的本领域公知的多种方法来从头合成本发明的免疫刺激聚合物。例如，β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage SL等(1981)Tetrahedron Lett 22：1859)；核苷H-膦酸酯法(Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett 27：4051-4；Froehler BC等(1986)Nucl Acid Res 14：5399-407；Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett27：4055-8；Gaffney BL等(1988)Tetrahedron Lett 29：2619-22)。这些化学方法可以通过可商购的各种自动核酸合成仪进行。可用于本发明的其它合成方法公开于Uhlmann E等(1990)Chem Rev 90：544-84和Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165中。
寡核糖核苷酸合成可以在溶液中或固相基质上进行。在溶液中，优选块偶联反应(二聚体、三聚体、四聚体等)，而固相合成优选使用单体构建块以逐步法进行。如磷酸三酯法、H-膦酸酯法和亚磷酰胺法等不同化学方法都已有所描述(Eckstein F(1991)Oligonucleotides andAnalogues，A Practical Approach，IRL Press，Oxford)。尽管在磷酸三酯法中反应性磷基团处于+V氧化态，但在亚磷酰胺法和H-磷酸酯法的偶联反应中使用更具反应活性的磷+III衍生物。在后两种方法中，磷在偶联步骤之后被氧化而产生稳定的P(V)衍生物。如果氧化剂是碘/水/碱，则在脱保护后获得磷酸二酯。相反，如果氧化剂是如Beaucage试剂等硫化剂，则在脱保护后获得硫代磷酸酯。
一种有效的寡核糖核苷酸合成方法是采用亚磷酰胺化学的固相合成的组合，该方法最初是由Matteucci和Caruthers等描述用于寡聚脱氧核苷酸的(Matteucci等(1981)J Am Chem Soc 103：3185)。
寡核糖核苷酸的合成类似于寡脱氧核苷酸，区别之处在于寡核糖核苷酸中存在的2’-羟基必须由合适的羟基保护基进行保护。RNA单体构建块中的单体可以例如由2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护。然而，据报道使用含有2’-O-三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)基团(TOM保护基TM)的单体的RNA合成会产生更高的偶联效率，这是由于TOM保护基表现出比TBDMS基团更低的空间位阻。TBDMS保护基通过使用氟化物除去，而对于TOM基团可以在室温使用甲胺的乙醇/水溶液而实现快速脱保护。在寡聚(核糖)核苷酸合成中，优选从3’端向5’端的链延伸，这通过将具有3’-磷(III)基团或其活化衍生物的核糖核苷酸单元与另一个核苷酸单元的游离5’-羟基偶联而实现。
可以使用自动DNA/RNA合成仪来方便地进行合成。由此，可以使用合成仪供应商所推荐的合成循环。与脱氧核苷单体相比，对于核糖核苷亚磷酰胺单体的偶联时间更长(例如，400秒)。作为固体基质，可以使用
Figure GPA00001094794900231
的可控多孔玻璃(CPG)基质或如引物基质PS200(Amersham)等有机聚合物基质。固体基质通常含有通过其3’端连接的第一核苷，例如，5’-O-二甲氧基三苯甲基-N-6-苄氧基腺苷。在用三氯乙酸切下5’-O-二甲氧基三苯甲基后，使用例如5’-O-二甲氧基三苯甲基-N保护的2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基核苷-3’-O-亚磷酰胺。连续的反复循环之后，将完成的寡核糖核苷酸从基质切下并通过在30℃用浓氨/乙醇(体积比3∶1)处理24小时而脱保护。最后使用三乙胺/HF将TBDMS保护基切去。粗寡核糖核苷酸可以通过离子交换高压液相色谱(HPLC)、离子对反相HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化并通过质谱表征。
5’-接合物的合成直接通过在固相合成中将待联接的分子的亚磷酰胺与末端核苷酸的5’-羟基偶联而进行。如胆固醇、吖啶、生物素、补骨脂素、乙二醇或氨基烷基残基等配体的各种亚磷酰胺衍生物可以商购获得。替代性地，可以在固相合成期间引入氨基烷基官能团，这使得可以通过如活性酯、异硫氰酸酯或碘代乙酰胺等活化接合分子进行合成后衍生化。
3’端接合物的合成通常通过使用经相应修饰的固体基质(例如，商购的胆固醇衍生化固体基质)而完成。然而，接合也能在核苷酸间键、核苷碱基或核糖残基(例如，核糖的2’-位)处进行。
对于环状寡核糖核苷酸而言，可以使用标准亚磷酰胺化学方法在核苷酸PS固体基质(Glen Research)上进行寡核苷酸链的延伸。然后使用磷酸三酯偶联法(Alazzouzi等(1997)Nucleosides Nucleotides16：1513-14)在固体基质上进行环化反应。在最后用氢氧化铵脱保护后，基本上从溶液中得出的唯一产物就是所需的环状寡核苷酸。
本发明的环状寡核糖核苷酸包括闭合环形形式的RNA，并且还可以包括带有或不带双链RNA的单链RNA。例如，在一个实施方式中，环状寡核糖核苷酸包含双链RNA并且采取具有由介入的双链片段连接的两个单链环的哑铃构象。共价闭合的哑铃形CpG寡聚脱氧核苷酸已在美国专利第6,849,725号中进行了描述。在另一个实施方式中，环状寡核糖核苷酸包含双链RNA并且采取具有由介入的双链片段连接的三个以上的单链环的构象。在一个实施方式中，免疫刺激RNA基序位于一个或多个单链片段中。
本发明的免疫刺激聚合物可单独使用或与如佐剂等其它试剂组合使用。本文所用的佐剂是指除抗原以外的其它提高免疫细胞在应答于抗原时(例如，体液免疫应答和/或细胞免疫应答)的激活的物质。佐剂促进辅助细胞的累积和/或激活从而提高抗原特异性免疫应答。佐剂被用来提高疫苗(即用于诱导抵抗抗原的保护性免疫的含抗原组合物)的效力。
佐剂可以通过两种一般性机制工作，且给定的佐剂或佐剂制剂可以通过以一种或两种机制起作用。第一种机制是物理地影响抗原在产生抗原特异性免疫应答的细胞或位点处的分布，而这种机制可以是改变抗原的生物分布(包括靶向特定区域或细胞类型)的输送载具或者建立贮藏效应以使抗原被缓慢释放于体内从而延长免疫细胞与该抗原的接触。
这类佐剂包括但不限于明矾(氢氧化铝、磷酸铝)；包括由矿物油或非矿物油制成的油包水或水包油乳液的乳液类制剂。这些佐剂可以是以下水包油乳液，例如，Montanide ISA 720(Seppic，AirLiquide，巴黎，法国)；MF-59(以Span 85和Tween 80稳定化的水包角鲨烯乳液；Chiron Corporation，Emeryville，加利福尼亚州)；和PROVAX(稳定化洗涤剂和胶束形成剂；IDEC Pharmaceuticals Corporation，San Diego，加利福尼亚州)。这些佐剂还可以是以下油包水乳液，例如，Montanide ISA50(二缩甘露醇油酸酯和矿物油的油性组合物，Seppic)或MontanideISA 206(二缩甘露醇油酸酯和矿物油的油性组合物，Seppic)。
第二种佐剂机制是作为免疫应答调节剂或免疫刺激剂。这些会导致免疫细胞的激活从而更好地呈递、识别或应答于抗原，且因此提高了抗原特异性应答的动力学、数量级、表型或记忆(memory)。免疫应答调节剂通常通过如Toll样受体等特异性受体或数种其它非TLR途径之一(例如，RIG-I)而起作用，然而对于某些免疫应答调节剂而言途径尚未知。这类佐剂包括但不限于从皂树(Q.saponaria tree)的树皮提纯的皂苷(如QS21，一种采用HPLC分级时在第21峰洗脱的糖脂；Antigenics，Inc.，Worcester，马萨诸塞州)、聚[二(羧基苯氧基)]磷腈(PCPP聚合物；Virus Research Institute，USA)、Flt3配体和利什曼原虫延伸因子(纯化的利什曼原虫蛋白；Corixa Corporation，Seattle，华盛顿州)。
存在许多通过TLR起作用的佐剂。通过TLR4起作用的佐剂包括如单磷酰脂A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，蒙大拿州)和胞壁酰二肽(MDP；Ribi)等脂多糖衍生物；OM-174(与脂A相关的氨基葡萄糖二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士)。鞭毛蛋白是通过TLR5起作用的佐剂。双链RNA通过TLR3起作用。通过TLR7和/或TLR8起作用的佐剂包括单链RNA或寡核糖核苷酸(ORN)和包括咪唑并喹啉胺(例如，咪喹莫特、雷西莫特；3M)的识别并激活TLR的合成小分子量化合物。通过TLR9起作用的佐剂包括源自病毒或细菌的DNA或者如CpG ODN等合成寡聚脱氧核苷酸(ODN)。
同时具有物理效果和免疫刺激效果的佐剂是具有上述两种功能的那些化合物。这类佐剂包括但不限于ISCOMS(含有混合的皂苷、脂质并且形成带有能容纳抗原的孔的病毒尺寸的颗粒的免疫刺激复合物；CSL，Melbourne，澳大利亚)、Pam3Cys、SB-AS2(SmithKline Beecham佐剂体系#2，其为含有MPL和QS21的水包油乳液：SmithKlineBeecham Biologicals[SBB]，Rixensart，比利时)、SB-AS4(SmithKlineBeecham佐剂体系#4，含明矾和MPL；SBB，比利时)、如CRL 1005等形成胶束的非离子嵌段共聚物(这些共聚物含有由聚氧化乙烯链侧面包围的直链疏水性聚氧化丙烯，Vaxcel，Inc.，Norcross，佐治亚州)和Syntex佐剂制剂(SAF，含Tween 80和非离子嵌段共聚物的水包油乳液；Syntex Chemicals，Inc.，Boulder，科罗拉多州)、Montanide IMS(例如，IMS 1312，与可溶性免疫刺激剂混合的基于水的纳米颗粒，Seppic)以及许多下述输送载具。
此外，本发明还提供了包含本发明的免疫刺激聚合物和另一种佐剂的组合物，其中所述另一种佐剂是如壳聚糖等阳离子多糖或如鱼精蛋白等阳离子肽、聚酯、聚乳酸、聚乙醇酸或者一种或多种上述物质的共聚物。
此外，本发明还提供了包含本发明的免疫刺激聚合物和另一种佐剂的组合物，其中所述另一种佐剂是细胞因子。在一个实施方式中，所述组合物是本发明的免疫刺激聚合物和细胞因子的接合物。
细胞因子是由介导炎性反应和免疫反应的许多细胞类型产生的可溶性蛋白和糖蛋白。细胞因子介导免疫系统的细胞之间的通讯，在局部以及全身起作用以募集细胞并调节其功能和增殖。细胞因子的类别包括天然免疫的介质和调节剂、适应性免疫的介质和调节剂以及造血刺激剂。在细胞因子中包括有白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18和白细胞介素19～32(IL-19～L-32)等)、趋化因子(例如，IP-10、RANTES、MIP-1、MIP-1、MIP-3、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸细胞趋化因子、I-TAC和BCA-1等)以及包括1型干扰素(例如，IFN-α和IFN-β)、2型干扰素(例如，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)和各种集落刺激因子(包括GM-CSF、G-CSF和M-CSF)的其它细胞因子。
此外，本发明还提供了包含本发明的免疫刺激聚合物和免疫刺激CpG核酸的组合物。在一个实施方式中，该组合物是本发明的免疫刺激聚合物和CpG核酸的接合物，例如，RNA:DNA接合物。
本文所用的免疫刺激CpG核酸是指包含CpG基序并且刺激免疫系统的细胞的激活或增殖的天然或合成的DNA序列。免疫刺激CpG核酸已经在包括美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号和第6,339,068号的许多已发表的专利、已公布的专利申请和其它出版物中进行了描述。在一个实施方式中，免疫刺激CpG核酸是长度为6～100个核苷酸的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)。在一个实施方式中，免疫刺激CpG核酸是长度为8～40个核苷酸的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)。
在某些实施方式中，所述聚合物包含CG二核苷酸。在其它实施方式中，所述聚合物不带CG二核苷酸。
免疫刺激CpG核酸包括不同族的CpG核酸。一族CpG核酸可有力地激活B细胞但对于诱导IFN-α和NK细胞激活相对较弱；已将这一族称为B族。B族CpG核酸通常是完全稳定化的并且包含处于某些优选的碱基环境下的未甲基化的CpG二核苷酸。参见例如，美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号和第6,339,068号。另一族CpG核酸可有力地诱导IFN-α和NK细胞激活但对于刺激B细胞而言相对较弱；已将这一族称为A族。A族CpG核酸通常具有含磷酸二酯CpG二核苷酸的至少6个核苷酸的回文序列，并且在其5’端和/或3’端具有稳定化的聚G序列。参见例如，已公布的国际专利申请WO 01/22990。还有一族CpG核酸激活B细胞和NK细胞并且诱导IFN-α；已将这一族称为C族。首先被表征的C族CpG核酸通常是完全稳定化的，包含B族类型的序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。该族CpG核酸已在公布的美国专利申请2003/0148976中进行了描述，本文通过参考并入其全部内容。
免疫刺激CpG核酸还包括如公布的美国专利申请2003/0148976所披露的所谓的软CpG核酸和半软CpG核酸，本文通过参考并入其全部内容。这些软免疫刺激CpG核酸和半软免疫刺激CpG核酸包含了耐核酸酶和对核酸酶敏感的核苷酸间键，其中不同类型的键根据特定规则而设置。
在一方面，本发明提供了包含抗原和本发明的免疫刺激聚合物的疫苗。如本文所用的“抗原”是指能被T细胞抗原受体或B细胞抗原受体识别的任何分子。该术语广泛地包括被宿主免疫系统识别为外来物的任何类型的分子。抗原一般包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白、多肽、肽、多糖、多糖接合物、多糖和其它分子的肽模拟物和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂、多糖、糖、病毒和病毒提取物以及如寄生物等多细胞生物体还有过敏原。对于是蛋白、多肽或肽的抗原而言，这些抗原可以包含编码该抗原的核酸分子。更具体而言，抗原包括但不限于：癌抗原，包括癌细胞和表达于癌细胞内或其上的分子；微生物抗原，包括微生物和表达于微生物内或其上的分子；过敏原以及如自身反应性T细胞等其它疾病相关分子。因此，在某些实施方式中，本发明提供了用于癌症、传染病、过敏症、成瘾症、由异常折叠的蛋白引起的疾病、自身免疫疾病和胆固醇管理的疫苗。
抵抗传染病的疫苗可以是预防性或治疗性的。疫苗中的抗原可以是全活(减毒)的、全灭/失活的、重组减活的、亚基纯化的、亚基重组的或肽。疫苗还可以包含额外的佐剂或佐剂组合。额外的佐剂可以是具有贮藏效果的佐剂(例如，明矾)和免疫调节剂(例如，另一个TLR激动剂或通过非TLR途径起作用的免疫调节剂)或如免疫刺激复合物(
Figure GPA00001094794900281
)等具有这两种效果的佐剂。下文将对佐剂进行更详细的描述。
抵抗癌症的疫苗也可以是预防性或治疗性的。癌抗原可以是全细胞(个别DC疫苗)或者一种或多种多肽或肽。这些癌抗原通常附着于载剂分子。疫苗还可以包含如上述那些佐剂的额外的佐剂或佐剂组合。下文将对癌抗原进行更详细的描述。
对于用于治疗过敏症的疫苗而言，抗原是过敏原或部分过敏原。过敏原可以包含于输送载具之内或附着于其上。过敏原可以与免疫刺激聚合物相连。下文将对过敏原进行更详细的描述。
用于治疗成瘾症的疫苗可以用于治疗例如尼古丁成瘾、可卡因成瘾、脱氧麻黄碱或海洛因成瘾。在这些情况下，成瘾性分子是原分子或半抗原。用于包含在抵抗成瘾症的疫苗中的“抗原”通常是小分子并且可以与载剂蛋白或其它载剂颗粒接合，或可将其并入类病毒颗粒中。
用于治疗由异常折叠蛋白引起的疾病的疫苗可用于治疗如传染性海绵状脑病(克雅氏病(Creutzfeld-Jakob disease)的变种)等疾病。在该情形中，“抗原”是搔痒病朊病毒(scrapie prion)，它可以附着于载剂蛋白或活减毒载体。抗阿尔茨海默病的疫苗的一个实例是例如靶向β-淀粉样肽或蛋白的疫苗。
此外还提供了治疗自身免疫疾病的疫苗。这些疫苗可用于治疗其中自身免疫细胞所识别的分子已经被鉴定出的自身免疫疾病。例如，抵抗应答于髓磷脂的自身反应性T细胞的疫苗可用于治疗多发性硬化。
此外还提供了可用于治疗心血管疾病和病况的疫苗。该疫苗可以靶向如脂蛋白、胆固醇和参与胆固醇代谢的分子等已知有助于所述疾病的成病的分子。用于管理胆固醇的疫苗可以包含例如胆甾醇脂转移蛋白(CETP)作为抗原。CETP促进胆固醇从抗动脉硬化的含有载脂蛋白A-I的HDL颗粒向动脉硬化性的含载脂蛋白B的VLDL和LDL的交换。这类疫苗可被用于治疗高胆固醇或减缓动脉硬化的进展。所述疫苗可以用于治疗其中靶标分子已知的其它心血管疾病和病况。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物在制备对受试对象免疫接种用的药物中的用途。
在一方面，本发明提供了疫苗的制备方法。该方法包括将本发明的免疫刺激聚合物与抗原和可选的药物可接受载剂紧密结合。
在某些实施方式中，免疫刺激聚合物与抗原或过敏原接合。抗原与免疫刺激聚合物可以直接接合，或者它们可以通过连接子而间接接合。
如本文所用的“微生物抗原”是微生物的抗原并且包括但不限于病毒、细菌、寄生物和真菌。这类抗原包括无损微生物以及天然分离物和片段或其衍生物，还有与天然微生物抗原相同或相似并且诱导对于该微生物特异性的免疫应答的合成化合物。如果化合物诱导对于天然微生物抗原的免疫应答(体液应答和/或细胞应答)，则其与天然微生物抗原相似。这类抗原在本领域内常规使用并且是本领域普通技术人员所公知的。
病毒是通常包含核酸核和蛋白衣壳的小感染剂，但不是独立的生物体。病毒还能采取缺乏蛋白的感染性核酸的形式。病毒不能在缺乏能在其中复制的活细胞时存活。病毒通过胞吞或直接DNA(噬菌体)注入而进入特定的活细胞并繁殖从而导致疾病。繁殖的病毒随后可以被释放并感染其它细胞。某些病毒是含DNA病毒，其它病毒是含RNA病毒。在某些方面，本发明还意图治疗其中的疾病进展中涉及阮病毒的疾病，例如，牛海绵状脑病(即，疯牛病，BSE)或动物中的搔痒病感染或人类中的克雅氏病。
病毒包括但不限于肠道病毒(包括但不限于小核糖核酸病毒科，例如，脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒)、轮状病毒、腺病毒和肝炎病毒(例如，甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝病毒)。已在人类中发现的病毒的具体实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或者HIV-III)和如HIV-LP其它分离毒株等人类免疫缺陷病毒)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，造成胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；纤丝病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉热病毒和内罗毕病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝DNA病毒科(乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；和其它病毒如急性喉气管支气管炎病毒、甲病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、新城疫病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、禽流感病毒、SARS病毒、西尼罗病毒。
细菌是通过二分分裂无性繁殖的单细胞生物体。基于细胞的形态、染色反应、养料和代谢需求、抗原结构、化学组成和遗传同源性来对细胞进行分类和命名。基于细胞的形态学形式、可以将细胞非为三组，即球形(球菌)、直杆形(杆菌)和曲杆形或螺旋杆形(弧菌、弯曲杆菌、螺菌和螺旋体)。更常见的是基于细胞的染色反应而将其表征为两类生物体，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏(Gram)是指通常在微生物实验室中进行的染色方法。革兰氏阳性生物体在染色步骤后保持染色并呈现深紫色。革兰氏阴性生物体不会保持染色但会摄取复染剂(counter-stain)因而呈现粉色。
感染性细菌包括但不限于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌包括但不限于巴氏杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属。革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属和沙门氏菌属。感染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌、伯氏疏螺杆菌、嗜肺军团菌、分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生性李斯特菌、化脓性链球菌(A类链球菌)、无乳链球菌(B类链球菌)、链球菌(草绿色类)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌属、肠球菌属、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属、红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、拟杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、梅毒螺旋体、细弱密螺旋体、钩端螺旋体、立克次体和以色列放线菌。
寄生物是为生存而依赖于其它生物体的生物体，因此它们必须进入或感染另一个生物体以继续其生命周期。受感染的生物体(即宿主)为寄生物提供养料和栖息地。尽管从最广泛的意义上讲，术语寄生物可以包括所有感染物(即，细菌、病毒、真菌、原生动物和蠕虫)，但一般而言，该术语被用来仅指代原生动物、蠕虫和外寄生节肢动物(例如，蜱、螨等)。原生动物是既能在细胞内复制又能在细胞外、特别是血液、肠道或组织的胞外基质中复制的单细胞生物体。蠕虫是几乎总是在细胞外的多细胞生物体(一个例外是旋毛虫)。蠕虫一般需要离开原始宿主并传播到次级宿主以便进行复制。与上述这些类型相反，外寄生节肢动物与宿主体的外表面形成寄生关系。
寄生物包括胞内寄生物和专性胞内寄生物。寄生物的实例包括但不限于恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、微小巴贝虫、分歧巴贝虫、克氏锥虫、弓形虫、旋毛虫、硕大利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫和曼氏血吸虫。
真菌是真核生物体，仅少数真菌在脊椎哺乳动物中造成感染。由于真菌是真核生物体，因而它们与原核细菌在尺寸、结构组成、生命周期和繁殖机制上都显著不同。通常基于真菌的形态特征、繁殖模式和培养特性来将真菌分类。尽管真菌可能在受试对象中造成不同类型的疾病(例如，吸入真菌抗原后引起的呼吸道过敏症、因摄食如有毒蘑菇产生的毒伞(Amanita phalloides)毒素和毒蕈肽以及曲霉菌物种产生的黄曲霉毒素等毒性物质而引起的真菌中毒)，不是所有的真菌都会导致传染病。
感染性真菌能造成系统感染或浅表感染。原发性系统感染可能出现在正常健康的受试对象中，而机会性感染最常见于免疫低下的受试对象中。最普通的造成原发性系统感染的真菌物包括芽生菌属、球孢子菌属和组织胞浆菌属。在免疫低下或免疫抑制的受试对象中造成机会性感染的常见真菌包括但不限于白色念珠菌、新型隐球菌和各种曲霉菌物种。系统性真菌感染是对内脏的侵袭性感染。真菌生物体通常经肺、胃肠道或静脉导管进入体内。这些类型的感染可以由原发性致病真菌或机会性真菌引起。
浅表性真菌感染涉及真菌在外表面生长而不侵入内部组织。典型的浅表性真菌感染包括涉及皮肤、头发或指甲的皮肤真菌感染。
与真菌感染相关的疾病包括曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、着色芽生菌病、球孢子菌病、隐形菌病、真菌性眼部感染、真菌性头发、指甲和皮肤感染、组织胞浆菌病、洛博芽生菌病、足分支菌病、耳真菌病、副球孢子菌病、播散性马尔尼菲青霉菌感染、暗色丝孢菌病、鼻孢子菌病、孢子丝菌病和接合菌病。
其它医学相关微生物已在文献中进行了详尽描述，例如，参见C.G.A.Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，英国1983，本文通过参考并入其全部内容。上述的各个清单均为说明性而非旨在限制。
如本文所用，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”被可互换地用于指代如肽、蛋白或糖蛋白等与肿瘤细胞或癌细胞相关的化合物，所述化合物能在表达于抗原呈递细胞的表面时在主要组织相容性复合物(MHC)分子的环境中引发免疫应答。由癌细胞差异性表达的癌抗原由此可以被利用来靶向癌细胞。癌抗原是能潜在地刺激显著肿瘤特异性的免疫应答。某些癌抗原虽然不一定由正常细胞表达但由正常细胞编码。这些抗原可以被表征为通常在正常细胞中沉默(即，未表达)的抗原、仅在某些分化阶段表达的抗原以及如胚胎抗原和胎儿抗原等在某段时间表达的抗原。其它癌抗原由如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变体p53)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白等突变的细胞基因编码。还有一些其它癌抗原可以由如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些基因等病毒基因编码。
癌抗原可以通过制备癌细胞的粗提取物(例如，如Cohen PA等(1994)Cancer Res 54：1055-8中所述)、通过部分纯化抗原、通过重组技术或通过已知抗原的从头合成来从癌细胞制备。癌抗原包括但不限于经重组表达的抗原、其免疫原部分或整个肿瘤或癌或其细胞。这些抗原可以经重组来分离或制备，或者通过本领域内任何其它已知方法进行分离或制备。
肿瘤抗原的实例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素b、大肠相关抗原(CRC)---C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE肿瘤抗原族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE肿瘤抗原族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白和γ-联蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、结肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37(Connexin 37)、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、如人乳头瘤病毒蛋白等病毒产品、Smad肿瘤抗原族、lmp-1、P1A、EBV编码的细胞核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7以及c-erbB-2。本清单并非限制性的。
本文所用“过敏原”是能够引起特征为产生IgE的免疫应答的分子。过敏原也是能在易感性受试对象中诱发过敏应答或哮喘应答的物质。因此，在本发明的背景下，术语过敏原是指能引发由IgE抗体介导的过敏应答的特定类型的抗原。
过敏原的清单庞大，并且可以包括花粉、昆虫毒液、动物毛皮屑、真菌孢子和药物(例如，青霉素)。天然动物和植物过敏原的实例包括对于以下的属是特异性的蛋白：犬属(家犬)；尘螨属(例如，粉尘螨)；猫属(家猫)；豚草属(美洲豚草)；黑麦草属(例如，多年生黑麦草和多花黑麦草)；柳杉属(日本柳杉)；链格孢属(链格孢菌(Alternariaalternata))；桤木属；赤杨属(欧洲赤杨(Alnus gultinosa))；桦木属(疣皮桦)；栎属(美洲白栎)；木樨榄属(橄榄)；蒿属(艾蒿)；车前属(例如，长叶车前)；墙草属(例如，药用墙草(Parietaria officinalis)和欧蓍草)；小蠊属(例如，德国小蠊)；蜂属(例如，蜜蜂(Apis multiflorum))；柏木属(例如，丝柏、绿干柏和大果柏)；桧属(例如，Juniperus sabinoides、铅笔柏、欧洲刺柏和Juniperus ashei)、金钟柏属(例如，东方金钟柏(Thuya orientalis))、扁柏属(例如，日本扁柏)、大蠊属(例如，美洲大蠊)、冰草属(例如，匍匐冰草)、黑麦属(例如，黑麦)、小麦属(例如，小麦)、鸭茅属(例如，鸭茅)、羊茅属(例如，牛尾草)、早熟禾属(例如，草地早熟禾和加拿大早熟禾)、燕麦属(例如，燕麦)、绒毛草属(例如，绒毛草)、黄花茅属(例如，黄花茅)、燕麦草属(例如，花叶燕麦草)、剪股颖属(例如，小糠草)、梯牧草属(例如，梯牧草)、虉草属(例如，虉草)、雀稗属(例如，百喜草)、高粱属(例如，假高粱)和雀麦属(例如，无芒雀麦)。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物与抗原的接合物。在一个实施方式中，本发明的免疫刺激聚合物与抗原共价连接。免疫刺激聚合物与抗原之间的共价链接(covalent linkage)可以为任何合适类型的共价链接，条件是免疫刺激聚合物和抗原在如此相连时保持各单个组分的可测的功能活性。在一个实施方式中，所述共价链接为直接链接。在另一个实施方式中，所述共价链接为例如通过连接子部分的间接链接。经共价连接的免疫刺激聚合物和抗原可以在细胞内被处理而使一者从另一者释放。通过这种方式，与如果作为单独制剂或单独组分施用时的输送相比，各个组分向细胞的输送可以得到提高。在一个实施方式中，抗原是抗原本身，即其为预先形成的抗原。
在一方面，本发明提供了包含本发明的组合物以及输送载具的药物组合物。在各种实施方式中，输送载具可以选自阳离子脂、脂质体、脂螺旋(cochleate)、病毒颗粒、免疫刺激复合物(
Figure GPA00001094794900351
)、微粒、微球、纳米球、单层囊泡(LUV)、多层囊泡、乳化颗粒(emulsome)、以及聚阳离子肽、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒(如纳米球或纳米胶囊)、聚合物微粒(如微球或微胶囊)、壳聚糖、环糊精、非离子囊泡或
Figure GPA00001094794900352
以及可选的药物可接受载剂。
以下对药物可接受载剂进行讨论。本发明的药物组合物必要时可以再包含抗原。使用任何合适的方法来将本发明的组合物以及抗原(当其存在时)与输送载具结合。免疫刺激组合物可以被容纳在输送载具之内，或者可以将其呈现于或联结于输送载具的暴露于溶剂的表面。在一个实施方式中，将免疫刺激聚合物呈现于或联结于输送载具的暴露于溶剂的表面，而将抗原(当其存在时)容纳于输送载具内。在另一个实施方式中，将免疫刺激聚合物和抗原均呈现于或联结于输送载具的暴露于溶剂的表面。在再一个实施方式中，将抗原呈现于或联结于输送载具的暴露于溶剂的表面，而将免疫刺激聚合物容纳于输送载具内。在又一个实施方式中，将免疫刺激聚合物和抗原(如果包含有抗原)均容纳于输送载具内。
本发明还提供了本发明的免疫刺激组合物的使用方法。在一方面，本发明提供了激活免疫细胞的方法。根据本发明这一方面的方法包括使体外或体内的免疫细胞与有效量的本发明的组合物接触以便激活免疫细胞。本发明的组合物在必要时可以包含抗原。本文所用的“免疫细胞”是指任何能参与天然免疫相应或适应性免疫应答的源自骨髓的细胞。免疫系统的细胞包括但不限于树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B淋巴细胞、浆细胞、T淋巴细胞以及它们的前体细胞。在一个实施方式中，免疫细胞是能够产生IFN-α的免疫细胞，例如，类浆细胞树突细胞(pDC)。在某些实施方式中，免疫细胞是TLR7表达细胞。在本发明的背景下，所述方法不包括与可有效诱导治疗性显著的IFN-α生产的量的lipofectin的配制。在一个实施方式中，免疫细胞不会应答于所述聚合物而产生治疗性显著量的TNF-α。
如本文所用，术语“有效量”是指为产生所需的生物效果而必需或足够的物质量。有效量可以但不必限于在单次施用中施用的量。
在一个实施方式中，可以使用本发明的组合物通过诱导免疫细胞进入与免疫相应相关的激活态而激活该免疫细胞。激活免疫细胞是指既诱发也提高免疫相应。如本文所用，术语“免疫相应”是指反映出进行增殖、执行效应子免疫功能或产生参与免疫相应的基因产物的免疫细胞的激活的天然免疫应答或适应性免疫应答的任何方面。参与免疫应答的基因产物可以包括经分泌的产物(例如，抗体、细胞因子和趋化因子)以及具有免疫功能的特征的细胞内和细胞表面的分子(例如，某些抗原分化簇(CD)、转录因子和基因转录物)。术语“免疫应答”可以被用于单个细胞或细胞群。
细胞因子的产生可以由本领域公知的数种方法中的任何一种来进行评估，所述方法包括生物应答检验、酶联免疫吸附检验(ELISA)、细胞内荧光激活细胞分选(FACS)分析和逆转录酶/聚合物酶链式反应(RT-PCR)。在一个实施方式中，免疫应答涉及IFN-α的产生。
在一个实施方式中，免疫应答涉及免疫细胞激活的细胞表面标记物(例如，CD25、CD80、CD86和CD154)的上调。用于测定这类标记物的细胞表面表达的方法是本领域内公知的并且包括FACS分析。
为测定细胞或细胞群中的免疫应答，在一个实施方式中，该细胞或细胞群表达了TLR7。细胞可以天然地表达该TLR，或可以通过在该细胞内引入合适的该TLR用表达载体来操作该细胞以表达该TLR。在一个实施方式中，所述细胞或细胞群作为外周血单核细胞(PBMC)而获取。在一个实施方式中，所述细胞或细胞群作为表达所述TLR的细胞系获取。在一个实施方式中，所述细胞或细胞群作为表达所述TLR的瞬时转染物获取。在一个实施方式中，所述细胞或细胞群作为表达所述TLR的稳定转染物获取。
此外，为了用于测定细胞或细胞群内的免疫应答，方便的是在该细胞或细胞群中引入可应答于TLR的胞内信号转导的报告子(reporter)构建体。在一个实施方式中，这种报告子是置于NF-κB启动子的控制下的基因。在一个实施方式中，置于所述启动子的控制下的所述基因是荧光素酶。在合适的激活条件下，荧光素酶报告构建体得到表达并发出可以使用光度计进行定量测定的可检测光信号。这种报告子构建体和其它合适的报告子构建体可以商购。
本发明还考虑了使用无细胞的TLR激活检测方法。
在某些方面，本发明涉及用于治疗中的组合物和方法。本发明的免疫刺激组合物可以被单独使用或与其它治疗剂组合使用。可以将免疫刺激组合物与其它治疗剂同时施用或依次施用。当免疫刺激组合物和其它治疗剂同时施用时，可以将其在相同或不同的制剂中施用，但在同一时间进行施用。另外，当免疫刺激组合物和其它治疗剂同时施用时，可以将其通过相同或不同的施用途径进行施用，但在同一时间施用。当本发明的免疫刺激组合物的施用在时间上与其它治疗剂的施用相分开时，本发明的免疫刺激组合物与其它治疗剂依次得到施用。这些化合物的施用之间的时间间隔可能以数分钟计或者可以更长。在一个实施方式中，将本发明的免疫刺激组合物在施用其它治疗剂之前施用。在一个实施方式中，将本发明的免疫刺激组合物在施用其它治疗剂之后施用。另外，当本发明的免疫刺激组合物与其它治疗剂依次施用时，可以将其以相同或不同的施用途径进行施用。其它治疗剂包括但不限于佐剂、抗原、疫苗和可用于治疗感染、癌症、过敏症和哮喘的药物。
在一方面，本发明提供了对受试对象预防接种的方法。根据本发明的这一方面的方法包括对受试对象施用抗原和本发明的组合物。在一个实施方式中，抗原的施用包括施用编码该抗原的核酸。
本文所用“受试对象”是指脊椎动物。在各种实施方式中，受试对象是人类、非人类灵长类或其它哺乳动物。在某些实施方式中，受试对象是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛或马。
为用于对受试对象的预防接种，在一个实施方式中，本发明的组合物包含抗原。所述抗原可以与本发明的聚合物分离或与其共价连接。在一个实施方式中，本发明的组合物自身不包含该抗原。在该实施方式中，可以将所述抗原与本发明的组合物分开施用于受试对象，或者与本发明的组合物共同施用。分开的施用包括时间上的分开、施用位置或途径的分开或者既在时间上也在施用位置或途径上分开。当本发明的组合物与抗原在时间上分开施用时，可以将抗原在本发明的组合物之前或之后施用。在一个实施方式中，将抗原在施用本发明的组合物之后48小时～4周进行施用。所述方法还考虑了在抗原和组合物的初始施用之后施用一剂或多剂加强剂量的仅抗原、仅组合物或抗原与组合物。
本发明还考虑了通过对受试对象施用本发明的组合物来使受试对象准备好应对未来遭遇未知抗原的情形，其中所述组合物不包含抗原。根据该实施方式，使受试对象准备好对该受试对象以后遇到的抗原(例如，通过环境或职业接触)产生更强烈的应答。可以将这类方法用于例如易于接触微生物的旅行者、医务工作者和士兵。
在一个方面，本发明提供了治疗患有感染的受试对象的方法。根据本发明的该方面的方法包括对患有感染的受试对象施用有效量的本发明的组合物和感染药物以治疗该受试对象。
在一个方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物在制备用于治疗受试对象的感染的药物中的用途。
在一个方面，本发明提供了可用于治疗感染的组合物。根据该方面的组合物包含本发明的免疫刺激聚合物和感染药物。
如本文所用，关于患有疾病或病况的受试对象的术语“治疗”应指预防、改善或消除该受试对象中的疾病或病况的至少一个体征或症状。
患有传染病的受试对象是患有因其受感染性微生物的浅表性、局部性或系统性侵袭而产生的病症的受试对象。感染性微生物可以是如上所述的病毒、细菌、真菌或寄生物。
感染药物包括但不限于抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。如“抗感染剂”、“抗生素”、“抗菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生物剂”和“杀寄生物药”对于本领域普通技术人员具有公认的含义并且在标准医学教科书中得到定义。简言之，抗菌剂杀死或抑制细菌，并且包括抗生素以及其它具有类似功能的合成或天然化合物。抗病毒剂可以从天然来源分离或合成并且可用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂可用于治疗浅表性真菌感染以及机会性和原发性的系统性真菌感染。抗寄生物剂杀死或抑制寄生物。许多抗生素是作为次生代谢物(secondary metabolite)由如微生物等细胞产生的低分子量分子。通常，抗生素干扰对于微生物特异的但在宿主细胞中不存在的一种或多种功能或结构。
抗感染治疗的问题之一是用抗感染剂治疗的宿主中出现的副作用。例如，许多抗感染剂可以杀死或抑制广谱的微生物，并且并非对于特定的物种类型特异。采用这些类型的抗感染剂的治疗导致生存于宿主中的正常微生物群以及感染性微生物的杀伤。这些微生物群的损失可能导致疾病并发症并使宿主易于受到其它病原体感染，这是因为所述微生物群与感染性病原体相竞争并且充当对感染性病原体的屏障。其它副作用可能因这些化学物质在宿主的非微生物细胞或组织上的特异性或非特异性影响而产生。
抗感染剂的广泛使用的另一个问题是耐抗生素的微生物菌株的发展。目前，已经发展出耐万古霉素肠球菌、耐青霉素肺炎球菌、多抗性金黄色葡萄球菌和多抗性结核菌株，而它们正成为重大临床问题。抗感染剂的广泛使用将可能产生许多耐抗生素的细菌菌株。结果，新型抗感染策略将必须抗击这些微生物。
可有效杀死或抑制大范围的细菌的抗菌微生物称作广谱抗生素。其它类型的抗菌抗生素主要对于抵抗革兰氏阳性或革兰氏阴性类细菌有效。这些类型的抗生素称作窄谱抗生素。其它的可以有效抵抗单一生物体或疾病而不会抵抗其它类型细菌的抗生素称作有限谱(limited-spectrum)抗生素。
有时基于抗菌剂的主要作用模式来将其分类。通常，抗菌剂是细胞壁合成抑制剂、细胞膜合成抑制剂、蛋白合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂和竞争性抑制剂。细胞壁合成抑制剂抑制细胞壁合成过程中的一个步骤，且通常是细菌肽聚糖的合成中的一个步骤。细胞壁合成抑制剂包括β-内酰胺抗生素、天然青霉素、半合成青霉素、氨苄青霉素、克拉维酸、头孢菌素和杆菌肽。
β-内酰胺是抑制肽聚糖合成的最后一步的含四元β-内酰胺环的抗生素。β-内酰胺抗生素可以是合成的或天然的。由青霉菌产生的β-内酰胺抗生素是如青霉素G或青霉素V等天然青霉素。它们通过黄青霉的发酵而产生。天然青霉素具有窄谱活性并且通常可有效抵抗链球菌、淋球菌和葡萄球菌。还可有效抵抗革兰氏阳性细菌的其它类型天然青霉素包括青霉素F、X、K和O。
半合成青霉素通常是对由霉菌产生的分子6-氨基青霉烷酸的修饰。6-氨基青霉烷酸可以通过添加可产生具有并天然青霉素更广谱的活性或其它有利性质的青霉素的侧链来修饰。某些类型的半合成青霉素具有抵抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱，但被青霉素酶失活。这些半合成青霉素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、苯唑西林、美洛西林和哌拉西林。其它类型的半合成青霉素具有更窄的抵抗革兰氏阳性菌的活性，但具有经改进的性质从而其不会被青霉素酶失活。这些半合成青霉素包括例如，甲氧西林、双氯西林和萘夫西林。某些广谱半合成青霉素可以与如克拉维酸和舒巴坦等β-内酰胺酶抑制剂组合使用。β-内酰胺酶抑制没有抗微生物作用但是其起到抑制青霉素酶的作用，因而保护半合成青霉素不被降解。
另一类β-内酰胺抗生素是头孢菌素。头孢菌素对细菌β-内酰胺酶的降解敏感，因而并非总是单独有效的。然而，头孢菌素可抵抗青霉素酶。它们可有效抵抗多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。头孢菌素包括但不限于头孢噻吩、头孢氨苄、头孢孟多、头孢克洛、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢他美、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶和拉氧头孢。
杆菌肽是通过抑制胞璧肽亚基或肽聚糖从输送该亚基至膜外的分子释放而抑制细胞壁合成的另一类抗生素。尽管杆菌肽可有效抵抗革兰氏阳性菌，但其用途通常因其高毒性而限于局部施用。
碳青霉烯(carbapenem)是能够抑制细胞壁合成的另一种广谱β-内酰胺抗生素。碳青霉烯的实例包括但不限于亚胺培南(imipenem)。单胺菌素(monobactam)也是广谱β-内酰胺抗生素，并且包括euztreonam。一种由链霉菌产生的抗生素万古霉素也可通过抑制细胞膜合成而有效抵抗革兰氏阳性菌。
另一类抗菌剂是作为细胞膜抑制剂的抗菌剂。这些化合物瓦解细菌细胞膜的结构或抑制其功能。细胞膜抑制剂类抗菌剂的一个问题在于，它们在真核细胞和细菌中都能产生效果，这是由于细菌膜和真核生物膜中的磷脂的相似性而造成的。因此，这些化合物很少具有足够的特异性以允许这些化合物被系统性使用并且避免对于局部施用的高剂量使用。
一种临床上可用的细胞膜抑制剂是多粘菌素。多粘菌素通过结合膜磷脂而干扰膜的功能。多粘菌素主要有效抵抗革兰氏阴性菌并且通常被用于对毒性更低的抗生素抵抗的严重假单胞菌感染或假单胞菌感染中。与该化合物的系统性施用相关的严重副作用包括对肾脏和其它器官的损害。
其它细胞膜抑制剂包括主要用于治疗系统性真菌感染和念珠菌酵母感染的抗真菌剂两性霉素B和制霉菌素。咪唑类是另一类细胞膜抑制剂抗生素。咪唑类被用作抗菌剂以及抗真菌剂，例如，用于治疗酵母菌感染、皮肤寄生感染和系统性真菌感染。咪唑类包括但不限于克霉唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑和氟康唑。
许多抗菌剂是蛋白合成抑制剂。这些化合物阻止细菌合成结构蛋白和酶并因而造成对细菌细胞生长或功能或者细胞死亡的抑制。通常，这些化合物干扰转录或翻译过程。阻断转录的抗菌剂包括但不限于利福平和乙胺丁醇。抑制RNA聚合酶的利福平具有广谱活性并可有效抵抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及结核分枝杆菌。乙胺丁醇可有效抵抗结核分枝杆菌。
阻断翻译的抗菌剂干扰细菌核糖体以阻止mRNA被翻译为蛋白。这类化合物通常包括但不限于四环素、氯霉素、大环内酯类(例如，红霉素)和氨基糖苷类(例如，链霉素)。
氨基糖苷类是一类链霉菌属细菌产生的抗生素，例如，链霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星和庆大霉素。氨基糖苷类已被用于抵抗各种各样的由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌造成的细菌感染。链霉素被广泛用作治疗结核的主要药物。庆大霉素、尤其是与妥布霉素组合使用时用于抵抗许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌菌株，包括假单胞菌感染。卡那霉素用于抵抗包括耐青霉素的葡萄球菌的许多革兰氏阳性菌。限制其临床使用的氨基糖苷类的一个副作用是在对于实现效力所必要的剂量下，其过长使用已显示出对肾功能的损害并对听觉神经造成损伤从而导致失聪。
另一种类型的翻译抑制剂抗菌剂是四环素类。四环素类是可有效抵抗多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的一类广谱抗生素。四环素类的实例包括四环素、米诺环素、强力霉素和金霉素。它们对于治疗许多类型的细菌很重要，但对治疗莱姆病尤为重要。由于四环素类的低毒性和极小的直接副作用，它们已经被医学界过度使用和滥用从而导致许多问题。例如，其过度使用易导致大范围的耐药性的发展。
如大环内脂类等抗菌剂与50S核糖体亚基可逆地结合并抑制蛋白通过肽基转移酶的延伸和/或阻止不带电荷的tRNA从细菌核糖体释放。这些化合物包括红霉素、罗红霉素、克拉霉素、竹桃霉素和阿奇霉素。红霉素对于抵抗大多数革兰氏阳性菌(淋球菌、军团菌和嗜血杆菌)具有活性，但不能抵抗肠杆菌。阻断蛋白合成期间的肽键形成的林可霉素和克林霉素被用来抵抗革兰氏阳性菌。
另一种类型的翻译抑制剂是氯霉素。氯霉素与抑制细菌酶肽基转移酶的70S核糖体结合从而阻止蛋白合成期间的多肽链的生长。与氯霉素相关的一个严重副作用是再生障碍性贫血。再生障碍性贫血发展于可有效治疗少部分患者(1/50,000)的氯霉素剂量下。由于因贫血造成的死亡，曾经是广泛采用的处方抗生素的氯霉素现在较少使用。但由于其有效性，在危及生命的情况下(例如，伤寒症)仍会采用它。
某些抗菌剂干扰核酸合成或功能，例如，与DNA或RNA结合以致其信息不能被读取。这些抗菌剂包括但不限于喹诺酮类和复方新诺明(co-trimoxazole)(两者均为合成化学品)以及天然或半合成化学品利福霉素。喹诺酮类通过抑制DNA旋转酶(细菌产生其环状DNA所需的酶)而阻断细菌DNA复制。喹诺酮类是广谱的，其实例包括诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、萘啶酸和替马沙星。萘啶酸是与DNA旋转酶(拓扑异构酶)结合从而抑制DNA旋转酶活性的杀菌剂，DNA旋转酶对于DNA复制至关重要并且使得超螺旋可以弛豫并重新形成。萘啶酸的主要用途是治疗下尿路感染(UTI)，因为它可有效抵抗作为UTI的常见病因的数种类型的革兰氏阴性菌(例如，大肠杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌物种)。复方新诺明是磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的组合，它阻断形成DNA核苷酸所需的叶酸的细菌合成。利福霉素是具有抵抗革兰氏阳性菌(包括结核分枝杆菌和由脑膜炎奈瑟菌引起的脑膜炎)和某些革兰氏阴性菌的活性的利福霉素的衍生物。利福平与聚合酶的β亚基结合并阻断激活聚合酶所必需的第一核苷酸的加成，从而阻断mRNA合成。
另一类抗菌剂是充当细菌酶的竞争性抑制剂的化合物。所述竞争性抑制剂大多数均在结构上与细菌生长因子相似并且竞争进行结合但不在细胞中执行代谢功能。这些化合物包括磺酰胺和具有更高和更广的抗菌活性的磺胺的化学修饰形式。磺酰胺(例如，磺胺异噁唑和甲氧苄啶)可用于治疗肺炎链球菌、β-溶血性链球菌和大肠杆菌，并且已被用于治疗由大肠杆菌引起的单纯性尿路感染(UTI)和治疗脑膜炎球菌性脑膜炎。
抗病毒剂是防止由病毒引起的细胞感染或病毒在细胞内的复制的化合物。现有的抗病毒药比抗菌药少得多，这是由于病毒复制过程与宿主细胞内的DNA复制的关系极为密切，以至于非特异性抗病毒剂往往对于宿主有毒性。病毒感染过程中的数个阶段可以被抗病毒剂阻断或抑制。这些阶段包括：病毒对宿主细胞的附着(免疫球蛋白或结合肽)、病毒的脱壳(例如，金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(例如，干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(例如，核苷类似物)、新病毒蛋白的成熟(例如，蛋白酶抑制剂)和病毒的出芽和释放。
另一类抗病毒剂是核苷类似物。核苷类似物是与核苷相似的合成化合物，但其具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基。一旦核苷类似物进入细胞，它们被磷酸化，从而产生与正常核苷酸竞争以并入病毒DNA或RNA的三磷酸酯形式。一旦核苷类似物的三磷酸酯形式并入正在生长的核酸链，其导致与病毒聚合物酶的不可逆结合并因此造成链终止。核苷类似物包括但不限于阿昔洛韦(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)、更昔洛韦(可用于治疗巨细胞病毒)、碘苷、利巴韦林(可用于治疗呼吸道合胞病毒)、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷和齐多夫定(叠氮胸苷)。
另一类抗病毒剂包括如干扰素等细胞因子。干扰素是由受病毒感染细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过与受感染细胞相邻的细胞上的特异性受体的结合而发挥功能，从而导致细胞内的变化，这种变化保护细胞不受病毒感染。α-干扰素和β-干扰素还诱导受感染细胞表面上的I类和II类MHC分子的表达，从而导致抗原呈递的增加以用于宿主免疫细胞识别。α-干扰素和β-干扰素可作为重组形式获得并且已被用于治疗慢性乙肝和丙肝感染。在对于抗病毒治疗有效的剂量下，干扰素具有如发烧、不适和体重减轻等严重副作用。
免疫球蛋白治疗用于预防病毒感染。用于病毒感染的免疫球蛋白治疗与用于细菌感染的不同，这是因为免疫球蛋白治疗通过与胞外病毒粒子结合并避免其附着并进入易受病毒感染的细胞而发挥功能，而并非抗原特异性的。该治疗可用于在宿主中存在抗体的时段内避免病毒感染。通常，存在两类免疫球蛋白治疗，正常免疫球蛋白治疗和超免疫球蛋白治疗。正常免疫球蛋白治疗利用从正常捐血者的血清制备并汇集的抗体产物。该汇集抗体产物含有低滴度的针对大范围人类病毒(例如，甲肝、细小病毒、肠道病毒(尤其是新生儿中))的抗体。超免疫球蛋白治疗利用从具有高滴度的针对特定病毒的抗体的个体的血清制备的抗体。这些抗体其后被用于抵抗特定的病毒。超免疫球蛋白的实例包括带状疱疹免疫球蛋白(可用于预防免疫受伤的儿童和新生儿中的水痘)、人狂犬病免疫球蛋白(可用于对被狂犬病动物咬伤的受试对象的暴露后预防)、乙肝免疫球蛋白(可用于预防乙肝病毒，尤其是用于接触过该病毒的受试对象)和RSV免疫球蛋白(可用于治疗呼吸道合胞病毒感染)。
抗真菌剂可用于治疗和预防感染性真菌。有时通过抗真菌剂的作用机制而对其进行分类。某些抗真菌剂通过抑制葡萄糖合成酶而起着细胞壁抑制剂的作用。这些抗真菌剂包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂通过使膜整体去稳定化而起作用。这些抗真菌剂包括但不限于咪唑类(如克霉唑、舍他康唑、氟康唑、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑和伏立康唑)以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502、MK 991、普那米星、UK 292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌剂通过破坏甲壳质(例如，甲壳质酶)或免疫抑制(501乳膏)来起作用。
杀寄生物剂是直接杀死寄生物的试剂。这些化合物是本领域已知的并且通常可商购。可用于人类施用的杀寄生物剂的实例包括但不限于阿苯哒唑、两性霉素B、苄硝唑、硫氯酚、盐酸氯喹、磷酸氯喹、克林霉素、去氢依米丁、乙胺嗪、二氯尼特糠酸酯、依氟鸟氨酸、呋喃唑酮、糖皮质激素、卤泛曲林、双碘喹啉(iodoquinol)、伊维菌素、甲苯咪唑、甲氟喹、锑酸葡甲胺、硫胂密胺、美曲膦酯、甲硝唑、氯硝柳胺、硝呋莫司、羟氨喹、巴龙霉素、羟乙磺酸戊氧苯脒、哌嗪、吡喹酮、磷酸伯氨喹、氯胍、双羟萘酸噻嘧啶、乙胺嘧啶(pyrimethamine)-磺胺、乙胺嘧啶-磺胺多辛、盐酸阿的平、硫酸奎宁、葡萄糖酸奎尼丁、螺旋霉素、锑化葡萄糖酸钠(葡萄糖酸锑钠)、苏拉明、四环素、强力霉素、噻菌灵、替硝唑、甲氧苄啶-磺胺甲基异噁唑和锥虫胂胺。
所述聚合物还可用于抑制受试对象中的Th2样免疫应答。Th2型免疫应答至少部分地由Th2细胞因子IL-4和IL-5以及转换为IgE的抗体同种型表征。因此，抑制Th2样应答是指减少Th2细胞因子的产生和减少其它Th2影响。所述聚合物还能用于诱导Th1样免疫应答。Th1和Th2免疫应答是互相反调节的，从而使免疫应答倾向于Th1型免疫应答可以避免或改善Th2型免疫应答。
所述聚合物能用于治疗和预防自身免疫疾病。自身免疫疾病是这样的一类疾病：其中患者的自身抗体与宿主组织反应，或者其中免疫效应T细胞对于内源性自身肽具有自身反应性并导致组织的破坏。因此，针对受试对象自己的抗原(称为自身抗原)而引发免疫应答。自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本甲状腺炎、肺出血肾炎综合征、天疱疮(例如、寻常型天疱疮)、甲状腺机能亢进、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎、恶性贫血、特发性Addison病、自身免疫性不孕、肾小球肾炎(例如、新月体肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、修格兰氏综合征(
Figure GPA00001094794900461
syndrome)、胰岛素抵抗和自身免疫性糖尿病。
自身抗原是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此，在自身免疫疾病的背景下，针对自身抗原而引发的免疫应答是不合需要的免疫应答并促进正常组织的破坏和损伤，而针对癌抗原而引发的免疫应答是期望的免疫应答并促进肿瘤或癌的破坏。因此，在某些方面，本发明致力于治疗自身免疫病症，不推荐将所述聚合物与自身抗原、特别是那些作为自身免疫病症的靶标的自身抗原一同施用。
在其它情况下，可以将所述聚合物与低剂量的自身抗原一同输送。许多动物研究已经表明，低剂量抗原的粘膜施用可以造成免疫低反应性(hyporesponsiveness)或“耐受性”。活性机制可能是细胞因子介导的由Th1向Th2和Th3占主导(即，TGF-β支配的)的应答的免疫偏向(immunedeviation)。采用低剂量抗原输送的活性抑制还能抑制在自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎和SLE)的治疗中受到相当多关注的无关免疫应答(旁侧抑制)。旁侧抑制(bystander suppression)涉及Th1反调节的抑制细胞因子在局部环境中的分泌，其中促炎性Th1细胞因子以抗原特异性或抗原非特异性方式在该局部环境中释放。本文所用“耐受性”是用来指代这种现象。事实上，口服耐受性已经可以有效治疗多种动物自身免疫疾病，包括：实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性重症肌无力、胶原诱导关节炎(CIA)和胰岛素依赖性糖尿病。在这些模型中，对自身免疫疾病的预防和抑制与从Th1应答向Th2/Th3应答转移的抗原特异性体液和细胞应答。
本发明的组合物和方法可以单独使用或与可用于治疗癌症的其它试剂盒方法联合使用。在一方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试对象的方法。根据本发明的该方面的方法包括对患有癌症的受试对象施用有效量的本发明的组合物以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试对象的方法。根据本发明的该方面的方法包括对患有癌症的受试对象施用有效量的本发明的组合物和抗癌治疗以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物在制备用于治疗受试对象的癌症的药物中的用途。
在一方面，本发明提供了可用于治疗癌症的组合物。根据这一方面的组合物包含本发明的免疫刺激聚合物和癌症药物。
患有癌症的受试对象是具有可检测的癌性细胞的受试对象。癌症可以是恶性癌或非恶性癌。本文所用的“癌症”是指干扰身体器官和系统的正常功能作用的不受控细胞生长。从其原始位置迁移并种植到重要器官的癌症可能通过受影响的器官的功能恶化而最终导致受试对象的死亡。如白血病等造血癌症能够击败受试对象中的正常造血区室，由此导致造血损伤(以贫血、血小板减少和中性粒细胞减少的形式)而最终造成死亡。
转移瘤(metastasis)是与原发肿瘤位置不同的因癌细胞从原发肿瘤向身体其它部分传播而产生的癌细胞区域。在诊断原发肿瘤块时，可以监测受试对象中转移瘤的存在。除了监测特定症状以外，最常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层扫描(CT)、血和血小板计数、肝功能检查、胸X光和骨扫描来检测转移瘤。
癌症包括但不限于基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、大脑和中枢神经系统(CNS)癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌和直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如、小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如、唇癌、舌癌、口癌和咽癌)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症以及其他癌、腺癌和肉瘤。
本发明的免疫刺激组合物还可与抗癌治疗联合施用。抗癌治疗包括癌症药物、放射和外科手术。如本文所用，“癌症药物”是指为治疗癌症的目的而对受试对象施用的试剂。如本文所用，“治疗癌症”是指预防癌症的产生、减少癌症的症状和/或抑制已建立的癌症的生长。在其它方面，为了降低产生癌症的风险的目的而对处在产生癌症的风险中的受试对象施用癌症药物。本文描述了各种类型的用于癌症治疗的药物。出于本说明书的目的，将癌症药物分类为化学治疗剂、免疫治疗剂、癌疫苗、激素治疗和生物应答调节剂。
化学治疗剂可以选自但不限于：甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素、顺铂、不含糖的氯乙基亚硝脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博莱霉素、阿霉素、氮烯咪胺、泰素(Taxol)、fragyline、Meglamine GLA、戊柔比星、卡莫司汀和聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、诺消灵/米托蒽醌、Metaret/苏拉明、巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP 2202、FK 317、溶链菌制剂(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星、美他特龙/锶衍生物、泰道/替莫唑胺、Evacet/阿霉素脂质体、Yewtaxan/紫杉醇、泰素/紫杉醇、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、Cyclopax/口服紫杉醇、口服类紫杉醇(taxoid)、SPU-077/顺铂、HMR 1275/夫拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑、乙炔尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、开普拓/左旋咪唑、Camptosar/伊立替康、Tumodex/雷替曲塞(Raltitrexed)、Leustatin/克拉屈滨、Paxex/紫杉醇、Doxil/阿霉素脂质体、楷莱/阿霉素脂质体、福达华/氟达拉滨、泛艾霉素/表柔比星、脂质体阿糖胞苷(DepoCyt)、ZD1839、LU 79553/二萘二甲酰亚胺、LU 103793/海兔毒素、Caetyx/阿霉素脂质体、健择/吉西他滨、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘粒子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/美司那(Mesnex)/异环磷酰胺、卫萌(Vumon)/替尼泊苷、卡铂、Plantinol/顺铂、足叶乙甙(Vepeside)/依托泊苷、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多烯紫杉醇、鸟嘌呤阿拉伯糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝脲、如美法仑(melphalan)和环磷酰胺等烷基化剂、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖胞苷、更生霉素、盐酸柔红霉素、雌二醇氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟脲(羟基脲)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、干扰素α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸二氯甲基二乙胺(氮芥)、巯基嘌呤、美司钠、米托坦(o.p’-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸甲基苄肼、链脲霉素、柠檬酸三苯氧胺、硫鸟嘌呤、塞替派、硫酸长春花碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、促红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白细胞介素2、丙脒腙(甲基-GAG、甲基乙二醛二脒腙、MGBG)、喷司他丁(2’脱氧助间型霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。
免疫治疗剂可以选自但不限于：3622W94、4B5、ANA Ab、抗FLK-2、抗VEGF、ATRAGEN、AVASTIN(贝代单抗；Genentech)、BABS、BEC2、BEXXAR(托西莫单抗；GlaxoSmithKline)、C225、CAMPATH(阿来组单抗；Genzyme Corp.)、CEACIDE、CMA 676、EMD-72000、ERBITUX(西妥昔单抗；ImClone Systems，Inc.)、Gliomab-H、GNI-250、HERCEPTIN(曲妥珠单抗；Genentech)、IDEC-Y2B 8、ImmuRAIT-CEA、ior c5、ior egf.r3、ior t6、LDP-03、LymphoCide、MDX-11、MDX-22、MDX-210、MDX-220、MDX-260、MDX-447、MELIMMUNE-1、MELIMMUNE-2、Monopharm-C、NovoMAb-G2、Oncolym、OV103、Ovarex、Panorex、Pretarget、Quadramet、Ributaxin、RITUXAN(利妥普单抗；Genentech)、SMART 1D10Ab、SMARTABL 364Ab、SMARTM195、TNT和ZENAPAX(达利珠单抗；Roche)。
癌疫苗可选自但不限于：EGF、抗独特型癌疫苗、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神经节苷脂共轭疫苗、Her2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL癌疫苗(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、黑素瘤疫苗、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys。
本发明的组合物和方法可以单独使用或与可用于过敏治疗的其它试剂和方法联合使用。在一方面，本发明提供了治疗患有过敏病况的受试对象的方法。根据本发明此方面的方法包括对患有过敏病况的受试对象施用有效量的本发明的组合物以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了治疗患有过敏病况的受试对象的方法。根据本发明此方面的方法包括对患有过敏病况的受试对象施用有效量的本发明的组合物和抗过敏治疗以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物在制备用于治疗受试对象的过敏病况的药物中的用途。
在一方面，本发明提供了可用于治疗过敏病况的组合物。根据此方面的组合物包含本发明的免疫刺激聚合物和过敏药物。
“患有过敏病况的受试对象”应指正在经历或此前已经历了应答于过敏原的过敏反应的受试对象。“过敏病况”或“过敏”指对于物质(过敏原)的获得性超敏反应。过敏病况包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或鼻感冒、花粉症、过敏性结膜炎、支气管哮喘、荨麻疹和食物过敏、包括特异性皮炎的其它特异性病况、过敏反应(anaphylaxis)、药物过敏和血管性水肿。
过敏通常是与来自特定类别的免疫球蛋白(IgE)的抵抗过敏原的抗体的产生相关的表位病况。对普通气源性过敏原的IgE介导应答的产生也是一个表明易于产生哮喘的因素。如果过敏原与结合到嗜碱性粒细胞(在血液中循环)或肥大细胞(分散遍布固体组织中)表面的IgEFc受体(FcεR)的特异性IgE相遇，则所述细胞被激活，导致产生并释放如组胺、5-羟色胺和脂质介导剂等介导剂。
当IgE型组织敏化免疫球蛋白与外来过敏原反应时，过敏反应发生。IgE抗体与肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞结合，然后这些专门化细胞在受将抗体分子的末端桥联的过敏原刺激时释放该过敏反应的化学介导剂(血管活性胺)。组胺、血小板活化因子、花生四烯酸代谢物和5-羟色胺是公知的人类过敏反应的介导剂。组胺和其它血管活性胺一般储存于肥大细胞和嗜碱性白细胞中。肥大细胞分散遍布动物组织中，而嗜碱性粒细胞在血管系统内循环。这些细胞在细胞内制造并储存组胺，除非发生涉及IgE结合的专门化事件序列来引发其释放。
过敏反应的症状各异，取决于IgE与抗原反应的体内位置。如果反应沿呼吸道上皮发生，则症状通常为打喷嚏、咳嗽和哮喘反应。如果反应在消化道内发生，如在食物过敏的情形中，则通常为腹痛和腹泻。系统性过敏反应(例如，在蜂蜇或对过敏受试对象施用青霉素后)可能很严重且常常危及生命。
过敏与Th2型免疫应答(至少部分地由Th2细胞因子IL-4和IL-5表征)以及抗体同位型向IgE的转换有关。本发明的免疫刺激聚合物自身可用于治疗患有过敏病况的受试对象，因为该免疫刺激聚合物可以使免疫应答倾向于Th1型免疫应答。替代性地或除此以外，本发明的免疫刺激聚合物能与过敏原组合用于治疗患有过敏病况的受试对象。
本发明的免疫刺激组合物还可与抗过敏治疗联合施用。治疗或预防过敏的传统方法涉及了过敏药物或脱敏治疗。一些正在发展的治疗或预防过敏的治疗包括使用中和性抗IgE抗体。阻断过敏反应的化学介导剂的效果的抗组胺和其它药物帮助调节过敏症状的严重性但不能预防该过敏反应且对后续过敏应答没有效果。脱敏治疗通常通过皮下注射通过给予小剂量过敏原以便诱导抵抗该过敏原的IgG型应答。据信IgG抗体的存在帮助中和了IgE抗体诱导所导致的介导剂生成。最初，对受试对象用非常低剂量的过敏原进行治疗以避免引起严重反应，然后缓慢增加剂量。这类治疗因对所述受试对象实际上施用了造成过敏应答的化合物而有危险，且可能出现严重过敏反应。
过敏药物包括但不限于抗组胺类、糖皮质激素类和前列腺素诱导剂。抗组胺类是中和由肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放的组胺的化合物。这些化合物在本领域内是公知的且常用于过敏治疗。抗组胺类包括但不限于阿伐斯汀、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、betatastine、溴苯那敏、布克力嗪、西替利嗪、西替利嗪类似物、氯苯那敏、氯马斯汀、CS 560、赛庚啶、地氯雷他定、右氯苯那敏、依巴斯汀、依匹斯汀、非索非那定、HSR 609、羟嗪、左卡巴斯汀、氯雷他定、东莨菪碱、咪唑斯汀、去甲阿斯咪唑、苯茚胺、异丙嗪、吡拉明、特非那定和曲尼司特。
糖皮质激素类包括但不限于甲基强的松龙、强的松龙、泼尼松、倍氯米松、布地奈德、地塞米松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和去炎松。尽管地塞米松是有抗炎作用的糖皮质激素，由于其被高度吸收且在有效剂量时具有长期的抑制性副作用因而它不常用于治疗过敏或以吸入形式用于治疗哮喘。然而，地塞米松可根据本发明用于治疗过敏或哮喘，因为当将它与本发明的组合物联合施用时可以将其以低剂量施用以降低所述副作用。与糖皮质激素使用相关的一些副作用包括咳嗽、发声困难、口疮(念珠菌病)，以及在高剂量时的系统性副作用，如肾上腺抑制、葡萄糖耐受不良、骨质疏松、无菌性骨坏死、白内障形成、生长抑制、高血压、肌肉无力、皮肤变薄和易于瘀伤(Barnes & Peterson(1993)Am Rev Respir Dis 148：S1-S26；和Kamada AK等(1996)Am JRespir Crit Care Med 153：1739-48)。
本发明的组合物和方法可以单独使用或与可用于哮喘治疗的其它试剂和方法联合使用。在一方面，本发明提供了治疗患有哮喘的受试对象的方法。根据本发明此方面的方法包括对患有哮喘的受试对象施用有效量的本发明的组合物以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了治疗患有哮喘的受试对象的方法。根据本发明此方面的方法包括对患有哮喘的受试对象施用有效量的本发明的组合物和抗哮喘治疗以治疗该受试对象的步骤。
在一方面，本发明提供了本发明的免疫刺激聚合物在制备用于治疗受试对象的哮喘的药物中的用途。
在一方面，本发明提供了可用于治疗哮喘的组合物。根据该方面的组合物包括本发明的免疫刺激聚合物和哮喘药物。
本文所用的“哮喘”是指特征为气道发炎和狭窄以及气道对吸入剂反应性提高的呼吸系统病症。哮喘往往(但不是排他地)与特应性病况或过敏病况有关。哮喘的症状包括气流阻塞引起的喘气、气促、胸闷和咳嗽的反复发作。可通过观察如气道上皮的剥蚀、基底膜下胶原沉积、水肿、肥大细胞激活、炎症细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)浸润等一系列生理学变化来检测与哮喘相关的气道炎症。作为气道炎症的结果，哮喘患者往往会经受气道超反应性、气流限制、呼吸道症状和疾病慢性化。气流限制包括急性支气管收缩、气道水肿、粘膜堵塞形成和气道重塑，这些特点往往导致支气管阻塞。在某些哮喘情形中，可能出现亚基底膜纤维化，从而导致肺功能持续性异常。
过去几年的研究已揭示，哮喘可能因炎性细胞、介导剂以及位于气道内的其它细胞和组织之间的复杂相互作用而造成。肥大细胞、嗜酸性细胞、上皮细胞、巨噬细胞和活化T细胞都在与哮喘相关的炎性过程中起到重要作用(Djukanovic R等(1990)Am Rev Respir Dis142：434-457)。据信这些细胞能通过分泌预先形成的和新合成的能直接或间接地作用于局部组织的介导剂而影响气道功能。此外，还已经认识到，T淋巴细胞(Th2)亚群在通过释放选择性细胞因子并造成疾病慢性化来调节气道内过敏性炎症中起到重要作用(Robinson DS等(1992)N Engl J Med 326：298-304)。
哮喘是在发展的不同阶段出现的复杂病症，可基于症状程度将其分为急性、亚急性或慢性。急性炎性应答与气道内早期细胞募集相关。亚急性炎性应答与造成更持久性的炎症状况的细胞募集以及本地细胞激活相关。慢性炎性应答的特征在于可能在气道内造成永久性异常的持续性细胞损害水平和不断进行的修复进程。
“患有哮喘的受试对象”是患有特征为气道炎症和狭窄以及气道对吸入物的反应性增加的呼吸系统病症的受试对象。与引发哮喘有关的因素包括但不限于过敏原、低温、运动、病毒感染和SO2。
如上所述，哮喘可能与Th2型免疫应答(至少部分由Th2细胞因子IL-4和IL-5表征)以及抗体同位型向IgE的转换相关。Th1和Th2免疫应答是互相反调节的，从而使免疫应答倾向Th1型免疫应答能防止或减轻包括过敏的Th2型免疫应答。因此，本发明的修饰寡核糖核苷酸类似物自身可用于治疗患有哮喘的受试对象，这是因为所述类似物可以使免疫应答倾向Th1型免疫应答。替代性地或除此以外，本发明的修饰寡核糖核苷酸类似物能与过敏原组合使用以治疗患有哮喘的受试对象。
本发明的免疫刺激组合物还可与哮喘治疗联合施用。治疗或预防哮喘的传统方法涉及使用抗过敏治疗(如上所述)和包括吸入剂的许多其它试剂。
用于治疗哮喘的药物通常分为两类，快速缓解药物和长期控制药物。哮喘患者每日服用长期控制药物以达到和保持对持续性哮喘的控制。长期控制药物包括如糖皮质激素、色甘酸钠和奈多罗米等抗炎剂；如长效β2激动剂和甲基黄嘌呤等长效支气管扩张剂；以及白细胞三烯修饰剂。快速缓解药物包括短效β2激动剂、抗胆碱能药(anti-cholinergic)和系统性糖皮质激素。这些药物每种都与许多副作用相关，没有任何所述药物能单独或组合来预防或治愈哮喘。
哮喘药物包括但不限于PDE-4抑制剂、支气管扩张剂/β-2激动剂、K+通道开放剂、VLA-4拮抗剂、烯丙异戊酰脲拮抗剂、血栓素A2(TXA2)合成抑制剂、黄嘌呤、花生四烯酸拮抗剂、5脂氧合酶抑制剂、TXA2受体拮抗剂、TXA2拮抗剂、5-lipox激活蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂。
支气管扩张剂/β2激动剂是一类造成支气管扩张或平滑肌松弛的化合物。支气管扩张剂/β2激动剂包括但不限于沙美特罗、沙丁胺醇、沙丁胺醇、特布他林、D2522/福莫特罗、非诺特罗、比托特罗、吡布特罗甲基黄嘌呤和奥西那林。长效β2激动剂和支气管扩张剂是用于除所述抗炎治疗以外长期预防症状的化合物。长效β2激动剂包括但不限于沙美特罗和沙丁胺醇。这些化合物经常与糖皮质激素类组合使用且通常不在没有进行任何炎症治疗时使用。它们与如心动过速、骨骼肌战栗、低血钾和过量时的QTc间隙的延长等副作用有关。
包括例如茶碱的甲基黄嘌呤用于长期控制和预防症状。这些化合物引起由磷酸二酯酶抑制导致的支气管扩张和可能的腺苷拮抗。与剂量相关的急性毒性是这类化合物的重要问题。因此，必须监测常规血清浓度以便解释因代谢清除率的个体差异而产生的毒性和较窄治疗范围。副作用包括心动过速、快速性心律失常、恶心呕吐、中枢神经系统刺激、头痛、癫痫发作、呕血、高血糖和低血钾。短效β2激动剂包括但不限于沙丁胺醇、比托特罗、吡布特罗和特布他林。与短效β2激动剂的施用有关的一些副作用包括心动过速、骨骼肌战栗、低血钾、乳酸增多、头痛和高血糖。
色氨酸钠和奈多罗米作为长效控制药物主要用于预防由运动引发的哮喘症状或过敏原引发的过敏症状。据信这类化合物可通过干扰氯离子通道功能来阻断与过敏原的早期和晚期反应。它们还稳定肥大细胞膜并抑制来自嗜酸性粒细胞和上皮细胞的介导剂的激活与释放。通常需要四到六周的施用期以达到最大效果。
抗胆碱能药通常用于缓解急性支气管痉挛。据信这些化合物可通过对毒蕈碱(muscarinic cholinergic)受体的竞争性抑制来发挥功能。抗胆碱能药包括但不限于异丙托溴胺。这些化合物仅可缓和经胆碱能介导的支气管痉挛但不会改变任何与抗原的反应。副作用包括口干和呼吸道分泌物、某些个体中的喘气增加以及如果喷入眼时的视觉模糊。
本发明的免疫刺激聚合物还可用于治疗气道重塑。气道重塑由气道内的平滑肌细胞增殖和/或粘膜下增厚造成，且最终造成气道狭窄从而导致气流受限。本发明的免疫刺激聚合物可防止进一步的重塑甚至可能减少所述重塑过程产生的组织积累。
本发明的免疫刺激聚合物还可用于改善树突状细胞的存活、分化、激活和成熟。所述免疫刺激寡核糖核苷酸具有促进树突状细胞的细胞存活、分化、激活和成熟的独特能力。
本发明的免疫刺激聚合物还增加了自然杀伤细胞的溶解活性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。使用与对如癌细胞等细胞靶标特异的抗体组合的所述免疫刺激聚合物可执行ADCC。当对受试对象施用与抗体组合的所述免疫刺激聚合物时，该受试对象的免疫系统被诱导来杀死肿瘤细胞。可用于ADCC方法的抗体包括与体内细胞相互作用的抗体。许多这类对细胞靶标特异的抗体已在本领域内说明且许多可商购。在一个实施方式中，所述抗体是IgG抗体。
在某些方面，本发明提供了增强表位扩展的方法。本文所用“表位扩展”是指从起初集中的针对自身蛋白或外来蛋白的显性表位特异性免疫应答到该蛋白(分子内扩展)或其它蛋白(分子间扩展)上的亚显性和/或隐性表位的表位特异性的多元化。表位扩展导致多重表位特异性免疫应答。
免疫应答由初始放大期和使免疫系统回到体内平衡并产生记忆的后期下调期组成，其中初始放大期既可能是有害的(如自身免疫疾病)也可能是有益的(如预防接种)。表位扩展可能是两个时期的重要成分。在肿瘤背景下，表位扩展的增强使得受试对象的免疫系统可以确定最初没有被免疫系统在应答于原始治疗方案时识别的额外靶标表位，同时降低在肿瘤群中逃逸变异体的可能性并因此影响疾病进程。
本发明的寡核糖核苷酸可用于促进在诸如癌症、病毒感染和细菌感染以及过敏等治疗性有益的标志物中的表位扩展。在一个实施方式中，所述方法包括对受试对象施用包含抗原和佐剂的疫苗并随后对该受试对象施用至少两剂的可有效诱导多重表位特异性免疫应答的量的本发明的免疫刺激聚合物的步骤。在一个实施方式中，所述方法包括对受试对象施用包含肿瘤抗原和佐剂的疫苗并随后对该受试对象施用至少两剂的可有效诱导多重表位特异性免疫应答的量的本发明的免疫刺激聚合物的步骤。在一个实施方式中，所述方法涉及应用造成免疫系统抗原在受试对象中暴露的治疗方案，随后至少两次施用本发明的免疫刺激寡核糖核苷酸以诱导多重表位特异性免疫应答(即促进表位扩展)。在不同实施方式中，所述治疗方案是手术、放疗、化疗、其它癌症药物、疫苗或癌疫苗。
除后续免疫刺激剂治疗外，治疗方案可与免疫刺激剂联合实施。例如，当所述治疗方案为疫苗时，它可与佐剂联合施用。疫苗与佐剂的组合可以是混合物或分开施用，即注射(即相同引流区)。施用不必为同时的。如果使用非同时的注射，时机可能涉及在使用疫苗制剂之前预先注射佐剂。
当实施治疗方案后，开始免疫刺激单一治疗。最佳的频率、持续时间和施用位点将取决于靶标和其它因素，但可为例如在六个月至两年的时期中每月或隔月施用。替代性的是，可基于每日、每周或隔周进行施用，或可以在一天、一周或一月中多次施用。在某些情形中，施用的周期可取决于治疗的疗程，例如其可在一周、一月、一年或多年后结束。在其它情形中，所述单一治疗可以是如同使用静脉滴注那样的连续性的。免疫刺激剂可施用于对于靶标常用的引流区。
为用于治疗，根据化合物活性、施用方式、免疫目的(即预防性或治疗性)、病症的特性和严重性、受试对象的年龄和体重，对于受试对象的治疗可能必须采用不同剂量。给定剂量的施用可通过以独立剂量单元或几个较小剂量单元的形式单次施用。以数周或数月的特定间隔分开的多次剂量施用对提升抗原特异性免疫应答是常用的。
结合本文提供的教导，通过从各种活性化合物中进行选择和衡量如效力、相对生物利用度、患者体重、副作用的严重性和优选施用模式等因素，可以设计有效的预防性或治疗性治疗方案，所述治疗方案不会导致显著的毒性但对治疗具体受试对象完全有效。对任何具体应用的有效量可取决于诸如待治疗的疾病或病况、所施用的具体治疗剂、受试对象的尺寸或者疾病或病况的严重性等因素而有所不同。本领域普通技术人员能凭经验确定特定核酸和/或其它治疗剂的有效量而不必进行过度实验。
本文所述化合物的典型受试对象剂量为约0.1μg/日～10,000mg/日，更典型为约1μg/日～8000mg/日，而最典型为约10mg/日～100mg/日。就受试对象体重而言，典型剂量是约0.1μg/kg/周～20mg/kg/周，更典型的是约1mg/kg/周～10mg/kg/周，而最典型的是约1mg/kg/周～5mg/kg/周。
含核酸和/或其它化合物的药物组合物可以通过任何合适的药物施用途径来施用。可以利用多种施用途径。所选的具体模式当然将取决于所选的一种或多种具体试剂、待治疗的具体病况和治疗效力所需的剂量。一般而言，本发明的方法可使用医学可接受的任何施用模式来实施，所述医学可接受的任何施用模式是指产生有效的免疫应答水平而不会造成在临床上无法接受的副作用的任何模式。本文讨论了优选的施用模式。为用于治疗，可以通过将核酸和/或其它治疗剂输送到所需表面(例如，粘膜表面、系统性表面)的任何模式来对受试对象施用有效量的所述试剂。
本发明的药用组合物的施用可通过本领域熟练技术人员已知的任何方法来完成。施用途径包括但不限于口服、胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、舌下、气管内、吸入、皮下、眼、阴道和直肠途径。对于治疗或预防哮喘或过敏，所述化合物优选的是被吸入、吞咽或通过系统性途径施用。系统性途径包括口服和胃肠外途径。在某些实施方式中、主要在哮喘患者中，吸入型药物因其直接输送到肺(炎症位点)而优选。有几类装置常用于吸入施用。这些装置类型包括计量吸入器(MDI)、呼吸引发型MDI、干粉吸入器(DPI)、与MDI组合的间隔/保持腔和雾化器。
本发明的治疗剂可以在载体的帮助下输送到特定的组织、细胞类型和/或免疫系统。从最广义而言，“载体”是能协助将组合物转移至靶标细胞的任何载具。载体通常将免疫刺激核酸、抗体、抗原和/或病症特异性药物运送到靶标细胞，而相对于不存在该载体时所造成的降解程度而言降解减少。
一般而言，可用于本发明的载体分为两类：生物载体和化学/物理载体。生物载体和化学/物理载体可用于输送和/或摄取本发明的治疗剂。
大多数生物载体用于输送核酸，而这最适合于输送本身是免疫刺激核酸的治疗剂或包含免疫刺激核酸的治疗剂。
除本文讨论的生物载体外，化学/物理载体也可用于输送包括免疫刺激核酸、抗体、抗原和病症特异性药物的治疗剂。如本文所用，“化学/物理载体”指能输送核酸和/或其它药物的除源自细菌或病毒的分子以外的其它天然分子或合成分子。
本发明优选的化学/物理载体为胶体分散体系。胶体分散体系包括基于脂质的体系，所述基于脂质的体系包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体体系是脂质体。脂质体是可用作体内或体外输送载体的人工膜容器。据显示，尺寸为0.2μm～4.0μm的大多层囊泡(LUV)能封装较大的大分子。RNA、DNA和完整病毒粒子可以被封装于水性内部并以生物活性形式输送至细胞(Fraley等(1981)Trends Biochem Sci 6：77)。
可以通过将脂质体与如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白等特定配体偶联而将脂质体靶向特定组织。可用于将脂质体靶向免疫细胞的配体包括但不限于：与免疫细胞特异性受体和分子相互作用的完整分子或片段，例如，与免疫细胞的细胞表面标记物相互作用的抗体。这类配体可易于通过本领域技术人员公知的结合测试来鉴定。在其它实施方式中，可通过将脂质体与上文讨论的免疫治疗抗体中的一种偶联而将该脂质体靶向癌症。另外，载体可与靶向核的肽偶联，后者将该载体引导至寄主细胞核。
转染用脂质制剂可商购自QIAGEN，例如，EFFECTENETM(带特定DNA缩合增强子的非脂质体脂)和SUPERFECTTM(新型树枝状聚合物技术)。
脂质体可商购自Gibco BRL，例如，由如N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)等阳离子脂质形成的LIPOFECTINTM和LIPOFECTACETM。脂质体制备方法是本领域内公知的且已在许多出版物中进行了描述。在Gregoriadis G(1985)Trends Biotechnol 3：235-241中也对脂质体进行了综述。
具体包括N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基甲硫酸铵(DOTAP)的某些阳离子脂似乎在与本发明的修饰的寡核糖核苷酸类似物混合时尤其有优势。
在一个实施方式中，所述载具是适于植入或施用到哺乳动物接受体的生物相容性微粒或植入物。在PCT国际申请第PCT/US/03307号(公开第WO95/24929号，标题为“Polymeric Gene Delivery System”)中描述了可根据此方法使用的生物可侵蚀性(bioerodible)植入物的实例。PCT/US/03307描述了一种可用于在适当启动子控制下装载外源性基因的生物相容性、优选生物可降解性聚合物基质。
所述聚合物基质的优选形式是如微球(其中核酸和/或其它治疗剂分散在整个固体聚合物基质中)或微胶囊(其中核酸和/或其它治疗剂储存在聚合物外壳的核中)等微粒形式。用于装载治疗剂的聚合物基质的其它形式包括薄膜、涂层、凝胶、植入物和支架。选择聚合物基质装置的尺寸和组成以便在其中引入了所述基质的组织内产生有利的释放动力学。此外，所述聚合物基质的尺寸还可根据待用的输送方法(通常是注射到组织内或通过气溶胶将悬浮液施用到鼻部和/或肺部)来选择。当使用气溶胶途径时，优选的是将聚合物基质与核酸和/或治疗剂包封于表面活性剂载具内。可以选择聚合物基质组合物以使其既具有有利的降解速率又由生物粘附性材料形成，从而在将所述基质施用到受损的鼻表面和/或肺表面时进一步增加输送有效性。此外，还可以选择基质组合物以使其不是降解而是通过扩散在延长的时段中释放。在某些优选实施方式中，将核酸通过植入物来对受试对象施用而将其它治疗剂急性施用。适于输送(例如，口腔输送或粘膜输送)的生物相容性微球公开于Chickering等(1996)Biotech Bioeng 52：96-101和Mathiowitz E等(1997)Nature 386：410-414以及PCT专利申请WO97/03702中。
非生物可降解性和生物可降解性聚合物基质都可用于将核酸和/或治疗剂输送到受试对象。优选生物相容性基质。这些聚合物可为天然聚合物或合成聚合物。所述聚合物基于释放所需的时段(通常为数小时至一年以上的级别)来选择。通常，尤其是对于核酸剂而言，最理想的是数小时～3个月至12个月的时期中释放。所述聚合物在必要时处于能吸收多达其重量的约90％的水的水凝胶的形式中，且必要时与多价离子或其它聚合物交联。
特别受关注的生物粘附性聚合物包括H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell在Macromolecules，(1993)26：581-587中所描述的生物可侵蚀性水凝胶，本文并入其教导。这些聚合物包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白(glutin)、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸盐、壳聚糖、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二烷酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯和聚丙烯酸十八烷酯。
如果治疗剂是核酸，压缩剂的使用也是理想的。压缩剂也可以单独使用或者与生物载体或化学/物理载体组合使用。本文所用“压缩剂”是指如组胺等中和核酸上的负电荷并由此允许将核酸压缩为小颗粒的试剂。核酸的压缩有助于靶标细胞对该核酸的摄取。所述压缩剂可以单独使用(即以能更有效地被细胞摄取的形式输送核酸)，或更优选的是与一个或多个上述载体组合使用。
能用于协助核酸的摄取的其它示例性组合物包括磷酸钙和胞内运输的其它化学介导剂、微注射组合物、电穿孔和同源重组组合物(例如，用于将核酸整合到靶标细胞染色体内的预选位置)。
如上所述，可以将本发明的聚合物与输送载具共同配制。例如，已描述了下列输送载具：螺旋体、、
Figure GPA00001094794900601
Figure GPA00001094794900602
、活细菌载体(例如，沙门氏菌、大肠杆菌、卡介苗、志贺菌、乳酸杆菌)、活病毒载体(例如，痘苗、腺病毒、单纯疱疹病毒)、微球、核酸疫苗、聚合物(例如，羧甲基纤维素、壳聚糖)、聚合物环、蛋白体(proteosome)、氟化钠、转基因植物。在本发明的某些实施方式中，所述输送载具是脂质体、非离子囊泡、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、如纳米球或纳米胶囊等聚合物纳米颗粒、如微球或微胶囊等聚合物微粒。
本发明的制剂在药物可接受溶液中进行施用，所述溶液在常规上可以包含药物可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载剂、佐剂和可选的其它治疗成分。在某些实施方式中，所述组合物是无菌的。
术语“药物可接受载剂”是指适于对人或其它脊椎动物施用的一种或多种相容性固体或液体的填料、稀释剂或包封物质。术语载剂是指与活性成分混合以协助应用的天然或合成的有机或无机成分。药物组合物的组分还能以不存在会显著损害所需药物效率的相互作用的方式与本发明的化合物彼此共混。
对于口服施用，可以通过将所述活性化合物与本领域内公知的药物可接受载剂混合来容易地配制所述化合物(即，核酸、抗原、抗体和其它治疗剂)。这些载剂使本发明的化合物能被配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和悬浮剂等以便由待治疗的受试对象口服吞咽。口服用药物制剂可作为固体赋形剂获得，可选的是研磨所得混合物，在需要时加入适当助剂，其后加工颗粒混合物以获得片剂或糖锭剂核。适当赋形剂具体为诸如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖等填料；诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等纤维素制剂。如果需要，可以加入崩解剂，例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。必要时还可将所述口服制剂配制在生理盐水或缓冲液中以用于中和内部酸性状况，或者所述口服制剂可以不带任何载剂而施用。
为糖锭剂的核提供了适当包衣。出于此目的可以使用浓缩糖溶液，所述浓缩糖溶液可选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适当有机溶剂或溶剂混合物。可以在所述片剂或糖锭剂包衣中添加染料或色素用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药用制剂包括明胶制成的压入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和如甘油或山梨醇等增塑剂制成的密封软胶囊。压入配合胶囊可含有与如乳糖等填料、如淀粉等粘合剂和/或如滑石粉或硬脂酸镁等润滑剂以及可选的稳定剂共混的活性成分。在软胶囊中，所述活性化合物可以溶解或悬浮于如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇等适当液体中。另外，可以添加稳定剂。此外，还可以使用配制用于口服施用的微球。这类微球在本领域内已得到详尽定义。口服施用的所有制剂都应为适于这种施用的剂量。
对于口腔施用，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于吸入施用，可以将本发明所用化合物以气溶胶喷雾样形式使用适当推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体)从加压包或雾化器便利地输送。在加压气溶胶情况下，通过提供输送计定量的阀门可以确定剂量单元。用于吸入器或吹入器(insufflator)中的胶囊和药筒(例如，明胶制)可以被配制来包含所述化合物和如乳糖或淀粉等适当粉末基质的粉末混合物。
当意图将所述化合物系统性输送时，可以将其配制用于经注射(例如，团注)或持续输注的胃肠外施用。注射用制剂可以与添加的防腐剂一起以例如安瓿或多剂量容器中的单元剂量形式存在。所述组合物可以采取如油性或水性载具中的悬浮液、溶液或乳液等形式，且可以包含如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配方剂。
用于胃肠外施用的药物制剂包括水溶形式的活性化合物水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液可以制备成为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载具包括如芝麻油等脂肪油、如油酸乙酯或甘油三酯等合成脂肪酸酯或者脂质体。水性注射悬浮液可以包含如羟甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷等增加该悬浮液粘度的物质。必要时，所述悬浮液还可以含有适当的稳定剂或增加所述化合物的溶解性从而使得可以制备高度浓缩溶液的试剂。
替代性的是，所述活性化合物可以为粉末形式以用于在使用前用适当载具(例如无菌无热源水)重建。
此外，还可将所述化合物配制为例如包含常规栓剂基质(例如，可可脂或其它甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂的直肠或阴道组合物。
除前述制剂以外，还可将所述化合物配制为贮存制剂(depotpreparation)。可将这类长效制剂与合适的聚合物材料或疏水性材料(例如，作为可接受油中的乳液)或者离子交换树脂共同配制，或作为微溶衍生物(例如，微溶盐)来配制。
所述药物组合物还可包含适当的固相或凝胶相载剂或赋形剂。这类载剂或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和如聚乙二醇等聚合物。
合适的液体或固体药物制剂形式为例如，吸入用水溶液或盐水溶液、微胶囊封装形式、螺旋体封装形式、涂覆于微型金颗粒上、包含于脂质体中、雾化形式、气溶胶、用于植入皮肤内的丸剂或在尖锐物体上干燥以被刮擦进入皮肤的形式。所述药物组合物还可包括粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳化剂、悬浮剂、乳膏剂、滴剂或延缓释放活性化合物的制剂，在所述制剂中通常如上所述使用了如崩解剂、粘合剂、涂布剂、溶胀剂、润滑剂、增味剂、甜味剂或溶解化剂等赋形剂和添加剂和/或助剂。所述药用组合物适用于许多药物输送体系中。关于药物输送方法的简短综述，参见LangerR(1990)Science 249：1527-1533，本文通过参考并入其内容。
核酸和可选的其它治疗剂和/或抗原可以以自身施用(单纯施用)或以药物可接受盐的形式施用。当用于药物中时，所述盐应该为药物可接受的，但是可以方便地使用非药物可接受盐来制备其药物可接受盐。这类盐包括但不限于，从下列酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，这类盐还可被制备为碱金属盐或碱土金属盐，如羧基钠盐、钾盐或钙盐。
合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1％～2％重量/体积)；柠檬酸和盐(1％～3％重量/体积)；硼酸和盐(0.5％～2.5％重量/体积)；以及磷酸和盐(0.8％～2％重量/体积)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003％～0.03％重量/体积)；氯丁醇(0.3％～0.9％重量/体积)；对羟基苯甲酸(0.01％～0.25％重量/体积)和硫汞撒(0.004％～0.02％重量/体积)。
所述组合物可以方便地以单元剂量形式呈现且可由药物学领域内公知的任何方法制备。所有方法都包括将所述化合物与包含一个或多个附属成分的载剂结合的步骤。一般而言，通过将所述化合物与液体载剂和/或细分固体载剂均一地紧密地结合，然后在必要时将产品成型来制备所述组合物。液体剂量单元为瓶或安瓿。固体剂量单元为片、胶囊和栓。
其它输送体系可包括按时释放、延迟释放或持续释放的输送体系。这些体系能避免所述化合物的反复施用，对受试对象和医师更加便利。许多类型的释放输送体系是本领域普通技术人员已知的且可利用的。它们包括基于聚合物的体系，例如，聚丙交酯乙交酯、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。在例如美国专利第5,075,109号中描述了含有药物的上述聚合物的微胶囊。输送体系还包括非聚合物体系：包括甾醇(如胆固醇和胆固醇酯)和脂肪酸或中性脂肪(如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)的脂类；水凝胶释放体系；硅橡胶体系；基于肽的体系；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；以及部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀性体系，其中本发明的试剂包含于处于基质内的形式中，例如，美国专利第4,452,775号、第4,675,189号和第5,736,152号中所描述的体系；和(b)扩散性体系，其中活性成分以受控速率从聚合物中渗出，例如，美国专利第3,854,480号、第5,133,974号和第5,407,686号中所描述的体系。另外，可使用泵类硬件输送体系，其中某些被改造以用于植入。
通过以下实施例对本发明进行进一步说明，而不应将它们视为对本发明的进一步限制。在此通过参考特意并入本申请所引用所有参考(包括参考文献、已颁布专利、已公布专利申请和审理中的专利申请)的全部内容。
实施例
TLR7和TLR8识别单链RNA或短寡核糖核苷酸(ORN)。对表达TLR7和/或TLR8的免疫细胞的温育导致诱导细胞因子的生成。由于这两种受体的表达模式不同，据推测TLR7介导的信号转导会刺激人pDC产生的IFN-α的生成，而TLR8主要造成产生IL-12、TNF-α和IFN-γ的mDC和单核细胞的激活。已经说明了特异性诱导TLR8和TLR7/8活性的RNA基序的存在。以下实施例显示了对主链特异性的额外基序的鉴定。一个重要的发现在于，含有该RNA基序的聚合物主要诱导IFN-α，从而支持其为没有刺激显著的促炎性细胞因子水平的有力免疫刺激基序。
方法
ELISA检验：
将人PBMC与连续稀释的ORN在DOTAP存在时(从2μM ORN和25μg/ml DOTAP开始)进行温育，24小时后通过ELISA检验上清液的IFN-α和IL-12p40。显示了3个捐献者的平均值±SEM。
细胞因子检测
将人PBMC以约5×106细胞/mL的浓度重悬并添加至圆底96孔板(250μl/孔)。将PBMC与连续稀释的ORN在DOTAP存在时(从2μMORN和25μg/ml DOTAP开始)温育，24小时后收集培养上清液(SN)。如不立即使用，在需要使用之前将SN在-20℃下保存。
使用用于IL-12p40的商购ELISA试剂盒(来自BD Biosciences，Heidelberg，德国)或用于IFN-α的采用商购抗体(PBL，New Brunswick，NJ，美国)开发的自制ELISA试剂盒来评估SN中的细胞因子的量。
为了对大范围的细胞因子和趋化因子进行分析，使用来自Bio-Rad(Munich，德国)的luminex系统和来自Biosource(Solingen，德国)的Multiplex试剂盒进行复合分析(multiplex analysis)。
实施例1：诱导TLR7介导但非TLR-8介导的细胞因子的免疫刺激聚合物的鉴定
对4个ORN和正对照测试其诱导IFN-α的能力(序列参见表1)。将ORN与人PBMC一同温育，并通过ELISA检验上清液的IFN-α。ORN SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5具有相同的碱基序列，但SEQ IDNO：5具有硫代磷酸酯(PS)主链，而ORN SEQ ID NO：3具有磷酸二酯(PO)主链。令人吃惊的是，与正对照ODN SEQ ID NO：1相比，SEQ IDNO：5仅诱导了背景水平的IFN-α，而SEQ ID NO：3诱导了最大的IFN-α水平，SEQ ID NO：1在硫代磷酸酯主链内具有优化的富含GU的基序(图1)。这些数据表明，对于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的ORN序列而言，PO主链产生了显著的IFN-α诱导。
此外，还对两个其它带有PO主链的ORN(SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4)测试了其诱导IFN-α的能力，且据显示其仅诱导极低水平的IFN-α。如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列比较所示，一个尿苷(U)的存在极大提高了IFN-α的诱导。尿苷核苷酸被嵌入特定的序列基序内。在该基序之外存在的一个U显著减少了IFN-α的生成，如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4的序列比较所示。
ORN SEQ ID NO：3主要诱导IFN-α的生成(很可能是由TLR7介导)(也见图2A)，但诱导极少的其它(TLR8介导的)细胞因子，例如，IL-12(图2B)、TNF-α(未显示)或IFN-γ(未显示)。
表1
  SEQ ID NO：1   rC*rC*rG*rU*rC*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rA*rC*rU*rC
  SEQ IDNO：2   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rA-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ IDNO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：4   rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA-rU-rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA-rA
  SEQ IDNO：5   rA*rA*rA*rC*rG*rC*rU*rC*rA*rG*rC*rC*rA*rA*rA*rG*rC*rA*rG
ORN主链：“-”表示磷酸二酯，“*”表示硫代磷酸酯。
实施例2：新的免疫刺激RNA基序：CUCA的鉴定
为了确定最佳的主链特异性免疫刺激基序，设计了ORN并测试其诱导IFN-α的能力。与此前鉴定的RNA基序相反，所确定的新基序对于带有磷酸二酯主链的ORN是独特和特异性的(图3)。将人PBMC与ORN一起温育，并通过ELISA检验上清液的IFN-α。确定了一个令人惊讶的短基序UCA。显示出了该序列内腺嘌呤碱基的存在的重要性。对SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：6的比较(见表2)表明，最佳基序包含一个在UC的3’侧的碱基。对SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的比较确证了在该尿苷的3’侧的胞苷的重要性。
表2
  SEQ ID NO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：6   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rA-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rU-rC
  SEQ ID NO：7   rA-rC-rG-rC-rA-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rU-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：11   rG-rC-rC-rA-rC-rC-rG-rA-rG-rC-rU-rG-rA-rA-rG-rG-rC-rA-rC-rC
  SEQ ID NO：12   rG-rC-rC-rA-rC-rC-rG-rA-rG-rC-rU-rC-rA-rA-rG-rG-rC-rA-rC-rC
对所提出的最小基序的中心C进行交换，在UGA(SEQ ID NO：8)和UAA(SEQ ID NO：9)的情形中，这种交换导致在这些ORN的环境中IFN-α诱导活性的损失，而在UUA(SEQ ID NO：10)的情形中，这种交换导致在这些ORN的环境中IFN-α应答的减少(见图4)。SEQ ID NO：10的低IFN-α诱导最有可能是由于含有两个U的基序GCUU的存在。
这些ORN还显示出，新确定的所述最小基序对于偏向于IFN-α的免疫应答的诱导非常具有特异性，这是由于所有的3个在基序中不带C的PO ORN(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)比含有UCA基序的亲本ORN SEQ ID NO：3诱导了高得多的IL-12水平(见表3)。
表3
  SEQ ID NO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：8   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rG-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：9   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rA-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：10   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rU-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
对序列变化的进一步测试得到的数据显示出，UCA基序的腺苷部分对于IFN-α活性很重要(图5，表4中的序列)。将人PBMC与ORN温育，通过ELISA测试上清液的IFN-α和IL-12p40。将UCA基序内的腺苷用C或G替换(SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14)产生了仅诱导背景水平的IFN-α的ORN。SEQ ID NO：15(UCU)诱导了适度的IFN-α量，但其诱导量少于SEQ ID NO：3的诱导量。该诱导很可能是由于额外的序列UCUG的产生。同样地，由SEQ ID NO：3诱导的IL-12与SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15相比非常低。
表4
  SEQ ID NO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：13   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rC-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：14   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rG-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：15   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rU-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
为进一步评估最小基序周围的其他核苷酸的必要，测试了在3’和5’处带有核苷酸修饰的UCA基序的与IL-12相比的IFN-α诱导活性(序列如表5所示)。如图6所示，在最小基序UCA的5’区仅存在胞苷(CUCA，SEQ ID NO：3)或尿苷核苷酸(UUCA，SEQ ID NO：21)产生具有高IFN-α诱导性质的ORN。然而，在该位置仅不存在尿苷时观察到了所述的ORN诱导大量IFN-α而不诱导大量IL-12p40的意外活性，因为UUCA基序导致IFN-α和IL-12两者的大量生成。
表5
 SEQ ID NO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
 SEQ ID NO：19   rA-rA-rA-rC-rG-rG-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
 SEQ ID NO：20   rA-rA-rA-rC-rG-rA-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
 SEQ ID NO：21   rA-rA-rA-rC-rG-rU-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
其它序列分析显示，4聚体基序CUCA相邻的核苷酸位置似乎没有那么重要并且不会影响ORN诱导IFN-α产生的能力(表6)。然而，这些核苷酸的确影响IL-12的产生，如图7所示。不管是在CUCA基序的5’侧(图7A，SEQ ID NO：22、23和24)还是在其3’侧(图7B，SEQID NO：16、17和18)的核苷酸似乎均未影响IFN-α诱导活性。这些核苷酸似乎仅影响IL-12诱导。因此，对于最优的TLR7特异性诱导特性而言，这些位置应该如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：18中那样优选不是尿苷，因为这些ORN显示出相对较强的IL-12诱导能力(图7C和图7D)。
表6
  SEQ ID NO：3   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：16   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rA-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：17   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rC-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：18   rA-rA-rA-rC-rG-rC-rU-rC-rA-rU-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：22   rA-rA-rA-rC-rA-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：23   rA-rA-rA-rC-rC-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
  SEQ ID NO：24   rA-rA-rA-rC-rU-rC-rU-rC-rA-rG-rC-rC-rA-rA-rA-rG-rC-rA-rG
实施例3：CUCA基序ORN的细胞因子状况
测试了免疫刺激CUCA基序ORN SEQ ID NO：27(GACACACACACUCACACACACACA)诱导各种细胞因子的能力。比较ORN SEQ ID NO：27与负对照(GACACACACACACACACACACACA；SEQ ID NO：25)、带有富含U的3’末端的非UCA ORN(GACACACACACACACACACACUUU；SEQID NO：26)和正对照(GACACACACACUCACACACACACA；SEQ IDNO：28)的细胞因子诱导。将3个健康捐血者的人PBMC与连续稀释的ORN在DOTAP(从2μM ORN和25μg/ml DOTAP开始)的存在下一起温育24h。收集SN并通过ELISA测定多种细胞因子或趋化因子的细胞因子浓度或趋化因子浓度。SEQ ID NO：27诱导了IFN-α以及较小程度的IFN-α相关分子IP-10和MCP-1。
为分析更大的细胞因子和趋化因子组，采用Luminex系统Multiplex试剂盒进行了多元分析。在对Luminex数据的初始非定量评估中使用了两个捐献者。结果汇总于下表7中。同样地，SEQ ID NO：27仅诱导IFN-α和IP-10以及较小程度的MIP-1。
表7
  SEQ IDNO：25   SEQ IDNO：26   SEQ IDNO：28   SEQ IDNO：27   DOTAP
  IL-1B   -   +   +++   -   -
  IL-1Ra   -   -   -   -   -
  IL-2   -   -   -   -   -
  IL-2R   -   +   +++   -   -
  IL-4   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.
  IL-5   -   -   -
  IL-6   -   +   +++   -   -
  IL-7   -   ++   +++   -   +
  IL-8   -   +   +   -   +
  IL-10   -   -   +++   -   -
  IL-12p40   -   -   +++   -   -
  IL-13   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.
  IL-15   -   +   +++   -   -
  IL-17   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.
  TNF-α   -   -   +++   -   -
  IFN-α   -   -   +++   ++   -
  IFN-γ   -   -   +++   -   -
  GMCSF   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.
  SEQ IDNO：25   SEQ IDNO：26   SEQ IDNO：28   SEQ IDNO：27   DOTAP
  SEQ IDNO：25   SEQ IDNO：26   SEQ IDNO：28   SEQ IDNO：27   DOTAP
  MIP-1a   -   +   +++   -   -
  MIP-1b   -   +   +++   -   -
  IP-10   -   -   +   ++   +
  MIG   -   +   +++   -   -
  Eotaxin   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.   n.d.
  Rantes   -   -   +   -   +
  MCP-1   -   +   ++   +   +
n.d.＝未检测到
实施例4：带有UCA基序的ORN的显著Th1细胞因子和趋化因子诱导
测试了带有UCA基序的ORN在体内的细胞因子和趋化因子诱导。将BALB/c小鼠分为每组5只的两组，并进行ORN、DOTAP或缓冲盐水(HBS)静脉内施用。注射后3小时对第一组动物取血并使用适当的细胞因子特异性ELISA确定IP-10、IFN-α、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6和IL-10的血清水平。注射后24小时对第二组动物取血并确定IFN-α和IL-10的血清水平。将UCA ORN SEQ ID NO：3诱导细胞因子和趋化因子的能力与诱导TLR7相关细胞因子和TLR8相关细胞因子两者的两个ORN(GACACACACACACACACACACAUU；SEQ IDNO：30；和UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(硫代磷酸酯主链)；SEQID NO：33))以及主要诱导TLR8相关细胞因子的两个ORN(UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU；SEQ ID NO：31；和UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(磷酸二酯主链)；SEQ ID NO：32)进行比较。此外，还将CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT；SEQ ID NO：36)用作对照。SEQ ID NO：3在3小时和24小时的时间点均诱导IFN-α(图12A和图12C)和IP-10(图12B和图12D)，但在3小时时间点没有诱导显著量的TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6或IL-10(分别为图13A～E)。因此，SEQ ID NO：3仅诱导IFN-α和IFN-α相关细胞因子。
另外，据显示UCA ORN会激活来自脾脏的B细胞和T细胞。SEQID NO：3激活脾CD3+T细胞(图14A和图14B)和DX5+B细胞(图14C和图14D)。
实施例5：存在UCA基序而不仅是存在U对于IFN-α的诱导很重要
在该实验中显示，1～3个尿苷的存在不足以诱导IFN-α。将来自3个健康捐献者的人PBMC与不同量的ORN(SEQ ID NO：26～30，表8)在DOTAP(起始浓度：2μM ORN+25μg/ml DOTAP，在PBS中1∶3连续稀释)的存在下一起温育24h。用适当的ELISA测定上清液中的IFN-α。
表8
SEQ ID NO：26   rG-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rU-rU-rU
SEQ ID NO：27   rG-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rU-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA
SEQ ID NO：28   rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU
SEQ ID NO：29   rG-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rU
SEQ ID NO：30   rG-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rC-rA-rU-rU
结果如图15所示。尽管在SEQ ID NO：26、29和30中存在多达3个尿苷，这些不带UCA基序的ORN没有诱导IFN-α。相反，仅含有嵌入于UCA基序中的一个U的SEQ ID NO：27却诱导了显著量的IFN-α。
实施例6：体内细胞因子诱导具有强TLR-7依赖性
在该实验中显示，TLR-7缺乏的小鼠不对本发明的ORN产生反应。将TLR9敲除(TLR9KO)和TLR7敲除(TLR7KO)的小鼠与C57BL/6背景小鼠和C57BL/6对照小鼠回交(backcross)(每组n＝4)，其后用100μg的选定ORN(SEQ ID NO：3、28或31)或作为正对照的在DOTAP(Sigma)中为1∶2的CpG ODN 1826(SEQ ID NO：36)或作为负对照的缓冲盐水(HBS)进行静脉内注射。注射后3小时，获取血浆并使用适当的Luminex和ELISA分析IFN-α、IP-10、IL-12和IL-6。
结果如图16所示。TLR7KO小鼠在应答于SEQ ID NO：3、28或31时基本没有显示出IFN-α、IP-10、IL-12或IL-6的诱导，而在应答于CpG ODN时却显示出对这些相同细胞因子的强劲诱导。相反，TLR9KO小鼠在应答于SEQ ID NO：3、28或31时显示出不同程度的IFN-α、IP-10、IL-12和IL-6的诱导，但在应答于CpG ODN时却对这些相同细胞因子没有诱导。对照C57BL/6小鼠在应答于SEQ ID NO：3、28或31时显示出不同程度的IFN-α、IP-10、IL-12和IL-6的诱导，而在应答于CpG ODN时显示出对这些相同细胞因子的强劲诱导。
实施例7：体内细胞因子诱导具有强MyD88依赖性
在该实验中显示，MyD88缺乏的小鼠不与本发明的ORN反应。MyD88敲除(MyD88KO)的小鼠与C57BL/6背景小鼠和C57BL/6对照小鼠回交(每组n＝4)，其后用100μg的选定ORN(SEQ ID NO：3、28或31)或作为正对照的在DOTAP(Sigma)中为1∶2的CpG ODN 1826(SEQ ID NO：36)或作为负对照的缓冲盐水(HBS)进行静脉内注射。注射后3小时，获取血浆并使用适当的Luminex和ELISA分析IFN-α和IP-10。
结果如图17所示。MyD88KO小鼠在应答于SEQ ID NO：3、28或31时基本没有显示出IFN-α或IP-10的诱导，而在应答于CpG ODN时情况类似。相反，对照C57BL/6小鼠在应答于SEQ ID NO：3、28或31时以及应答于CpG ODN时均显示出强劲的IFN-α和IP-10诱导。
总而言之，本发明已经确定了一种新的负责诱导IFN-α(很可能是TLR7介导)而几乎不激活如IL-12、IFN-γ或TNF-α等其它细胞因子(很可能是TLR8介导)的主链特异性基序。决定这些性质的最小基序是rU-rC-rA。主链是磷酸二酯。基于该数据的最优基序是rN-rC-rU-rC-rA-rN，其中N＝C、A、G但不是U(对于最小的TLR8介导的细胞因子应答而言)。
由此已经对本发明的至少一个实施方式的几个方面进行了描述，应该理解的是，本领域技术人员将易于进行各种变化、修改和改进。这些变化、修改和改进应该是本公开的一部分，且应该处于本发明的主旨和范围内。因此，前述说明和附图仅仅是示例性的。
序列表
<110>科勒制药有限责任公司
 
<120>在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的RNA序列基序
 
<130>PC19793A
 
<150>US 60/964,448
<151>2007-08-13
 
<160>36
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>18
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>1
ccgucuguug ugugacuc    18
 
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>2
aaacgcacag ccaaagcag   19
 
<210>3
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>3
aaacgcucag ccaaagcag   19
 
<210>4
<211>18
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>4
aaaaaaaaua aaaaaaaa    18
 
<210>5
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>硫代磷酸酯骨架
 
<400>5
aaacgcucag ccaaagcag    19
 
<210>6
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>6
aaacgcacag ccaaagcuc   19
 
<210>7
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>7
acgcacagcc aaagcucag   19
 
<210>8
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>8
aaacgcugag ccaaagcag    19
 
<210>9
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>9
aaacgcuaag ccaaagcag    19
 
<210>10
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>10
aaacgcuuag ccaaagcag   19
 
<210>11
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>11
gccaccgagc ugaaggcacc  20
 
<210>12
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>12
gccaccgagc ucaaggcacc  20
 
<210>13
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>13
aaacgcuccg ccaaagcag    19
 
<210>14
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>14
aaacgcucgg ccaaagcag    19
 
<210>15
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>15
aaacgcucug ccaaagcag    19
 
<210>16
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>16
aaacgcucaa ccaaagcag    19
 
<210>17
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>17
aaacgcucac ccaaagcag    19
<210>18
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>18
aaacgcucau ccaaagcag    19
 
<210>19
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>19
aaacggucag ccaaagcag    19
 
<210>20
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>20
aaacgaucag ccaaagcag    19
 
<210>21
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>21
aaacguucag ccaaagcag    19
 
<210>22
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>22
aaacacucag ccaaagcag          19
 
<210>23
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>23
aaacccucag ccaaagcag          19
 
<210>24
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>24
aaacucucag ccaaagcag          19
 
<210>25
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>25
gacacacaca cacacacaca caca    24
 
<210>26
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>26
gacacacaca cacacacaca cuuu   24
 
<210>27
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>27
gacacacaca cucacacaca caca    24
 
<210>28
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>硫代磷酸酯骨架
 
<400>28
uuguuguugu uguuguuguu        20
 
<210>29
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>29
gacacacaca cacacacaca cacu   24
 
<210>30
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>30
gacacacaca cacacacaca cauu   24
 
<210>31
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>31
uuguuguugu uguuguuguu    20
 
<210>32
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>32
uuauuauuau uauuauuauu    20
 
<210>33
<211>20
<212>RNA    
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>硫代磷酸酯骨架
 
<400>33
uuauuauuau uauuauuauu    20
 
<210>34
<211>14
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>34
uuaucguamc ucac          14
 
<210>35
<211>16
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>35
ccgagccgag cucacc         16
 
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成寡核苷酸
 
<400>36
tccatgacgt tcctgacgtt     20

Claims (106)

1.一种组合物，所述组合物包含：
包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA，和
输送载具，其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒或聚合物微粒，且其中所述组合物不含lipofectin。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含抗原。
3.如权利要求2所述的组合物，所述抗原与聚合物接合。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述rN1-rC-rU-rC-rA-rN2基序包含修饰的核苷碱基，所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物在rN1-rC-rU-rC-rA-rN2基序之外还包含至少一个修饰的核苷碱基，其中所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-位取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-位取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。
6.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含与所述聚合物共价相连的亲脂部分。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述亲脂部分选自胆甾烯基、棕榈酰基和脂肪酰基。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物不包含CpG基序。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物不包含CCGAGCCGAGCUCACC(SEQ ID NO：35)。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物的长度为4～20单元。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物的长度为10～25单元。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物的长度为15～19单元。
13.如权利要求1所述的组合物，其中每个聚合物单元都是核糖核苷酸。
14.如权利要求1所述的组合物，其中聚合物单元是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述脱氧核糖核苷酸包括处于所述聚合物的5’端的TCG基序。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物的至少一个单元是氨基酸。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物与TLR9激动剂相连。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述TLR9激动剂是小分子。
19.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物与TLR7激动剂相连。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物与TLR8激动剂相连。
21.如权利要求1所述的组合物，其中N1包含至少一个A。
22.如权利要求1所述的组合物，其中N1包含至少一个C。
23.如权利要求1所述的组合物，其中N1包含至少一个G。
24.如权利要求1所述的组合物，其中N1包含至少一个T。
25.如权利要求1所述的组合物，其中N2包含至少一个A。
26.如权利要求1所述的组合物，其中N2包含至少一个C。
27.如权利要求1所述的组合物，其中N2包含至少一个G。
28.如权利要求1所述的组合物，其中N2包含至少一个T。
29.一种组合物，所述组合物包含：
包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4的长度为4～100单元的单链聚合物，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C，和
输送载具，其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒或聚合物微粒，且其中所述组合物不含lipofectin。
30.如权利要求29所述的组合物，所述组合物还包含抗原。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗原与聚合物接合。
32.如权利要求29所述的组合物，其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4基序包含修饰的核苷碱基，所述修饰的核苷碱基所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。
33.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物在rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4基序之外还包含至少一个修饰的核苷碱基，其中所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-位取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-位取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。
34.如权利要求29所述的组合物，所述组合物还包含与所述聚合物共价相连的亲脂部分。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述亲脂部分选自胆甾烯基、棕榈酰基和脂肪酰基。
36.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物不包含CpG基序。
37.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物不包含CCGAGCCGAGCUCACC(SEQ ID NO：35)。
38.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物的长度为4～20单元。
39.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物的长度为10～25单元。
40.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物的长度为15～19单元。
41.如权利要求29所述的组合物，其中每个聚合物单元都是核糖核苷酸。
42.如权利要求29所述的组合物，其中聚合物单元是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述脱氧核糖核苷酸包括处于所述聚合物的5’端的TCG基序。
44.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物的至少一个单元是氨基酸。
45.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物与TLR9激动剂相连。
46.如权利要求29所述的组合物，其中所述TLR9激动剂是小分子。
47.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物与TLR7激动剂相连。
48.如权利要求29所述的组合物，其中所述聚合物与TLR8激动剂相连。
49.如权利要求29所述的组合物，其中X2是A。
50.如权利要求29所述的组合物，其中X2是C。
51.如权利要求29所述的组合物，其中X2是G。
52.如权利要求29所述的组合物，其中X3是A。
53.如权利要求29所述的组合物，其中X3是C。
54.如权利要求29所述的组合物，其中X3是G。
55.如权利要求29所述的组合物，其中N3包含至少一个A。
56.如权利要求29所述的组合物，其中N3包含至少一个C。
57.如权利要求29所述的组合物，其中N3包含至少一个G。
58.如权利要求29所述的组合物，其中N3包含至少一个U。
59.如权利要求29所述的组合物，其中N4包含至少一个A。
60.如权利要求29所述的组合物，其中N4包含至少一个C。
61.如权利要求29所述的组合物，其中N4包含至少一个G。
62.如权利要求29所述的组合物，其中N4包含至少一个U。
63.一种方法，所述方法包括使能产生干扰素α(IFN-α)的免疫细胞与长度为4～100单元的单链聚合物接触，所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C，其中所述聚合物不与lipofectin一起配制。
64.一种方法，所述方法包括使能产生干扰素α(IFN-α)的免疫细胞与长度为4～100单元的单链聚合物接触，所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C，其中所述聚合物不与lipofectin一起配制。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述免疫细胞应答于所述聚合物而不产生显著量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
66.如权利要求63或64所述的方法，其中所述免疫细胞应答于所述聚合物而不产生显著量的干扰素γ(TNF-γ)。
67.如权利要求63或64所述的方法，其中所述免疫细胞应答于所述聚合物而不产生显著量的白细胞介素12(IL-12)。
68.如权利要求63或64所述的方法，其中所述方法在体内进行。
69.如权利要求63所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
70.如权利要求64所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
71.如权利要求63或64所述的方法，其中所述聚合物包含至少一个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述稳定化键处在5’端和/或3’端。
73.如权利要求63或64所述的方法，其中所述聚合物包含1～5个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述稳定化键处在5’端和/或3’端。
75.一种哮喘治疗方法，所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
76.一种哮喘治疗方法，所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA  或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
77.如权利要求75或76所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用过敏原。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述聚合物与所述抗原接合。
79.如权利要求75所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
80.如权利要求76所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
81.一种过敏病况的治疗方法，所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
82.一种过敏病况的治疗方法，所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
83.如权利要求81或82所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用过敏原。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述聚合物与所述过敏原接合。
85.如权利要求81所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
86.如权利要求82所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
87.一种癌症治疗方法，所述方法包括对患有癌症的受试对象施用癌症治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
88.一种癌症治疗方法，所述方法包括对患有癌症的受试对象施用癌症治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
89.如权利要求87或88所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用癌抗原。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述聚合物与所述抗原接合。
91.如权利要求87或88所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用第二癌症药物。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述癌症药物是卡铂、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素、泰素和吉西他滨中的一种或多种。
93.如权利要求87所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
94.如权利要求88所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
95.一种传染病治疗方法，所述方法包括对患有传染病的受试对象施用传染病治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
96.一种传染病治疗方法，所述方法包括对患有传染病的受试对象施用传染病治疗用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
97.如权利要求95或96所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用微生物抗原。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述聚合物与所述抗原接合。
99.如权利要求95所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
100.如权利要求96所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
101.一种用于在受试对象中诱导Th1样免疫应答的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN1-rC-rU-rC-rA-rN2并且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链，其中N1和N2中的至少一个不是A7，且其中rN1-rC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
102.一种用于在受试对象中诱导Th1样免疫应答的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的长度为4～100单元的单链聚合物，其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4，其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸，其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸，其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序，且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAX1CUCAC(SEQ ID NO：34)，其中X1是A或C。
103.如权利要求101或102所述的方法，所述方法还包括对受试对象施用抗原。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述聚合物与所述抗原接合。
105.如权利要求101所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
106.如权利要求102所述的方法，其中将所述聚合物以权利要求1～62中任一项所述的组合物的形式进行施用。
CN2008801113989A 2007-08-13 2008-08-08 在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序 Active CN101821392B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96444807P 2007-08-13 2007-08-13
US60/964,448 2007-08-13
PCT/IB2008/002104 WO2009022216A2 (en) 2007-08-13 2008-08-08 Rna sequence motifs in the context of defined internucleotide linkages inducing specific immune modulatory profiles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101821392A true CN101821392A (zh) 2010-09-01
CN101821392B CN101821392B (zh) 2013-04-17

Family

ID=40351228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008801113989A Active CN101821392B (zh) 2007-08-13 2008-08-08 在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序

Country Status (23)

Country Link
US (3) US8128944B2 (zh)
EP (1) EP2179039B1 (zh)
JP (1) JP4847609B2 (zh)
KR (1) KR20100045508A (zh)
CN (1) CN101821392B (zh)
AR (1) AR067928A1 (zh)
AU (1) AU2008288241B2 (zh)
BR (1) BRPI0814260B8 (zh)
CA (1) CA2696630C (zh)
CL (1) CL2008002371A1 (zh)
CO (1) CO6260153A2 (zh)
DK (1) DK2179039T3 (zh)
ES (1) ES2703876T3 (zh)
HK (1) HK1143741A1 (zh)
MX (1) MX2010001014A (zh)
NZ (1) NZ582972A (zh)
PL (1) PL2179039T3 (zh)
PT (1) PT2179039T (zh)
RU (1) RU2435851C2 (zh)
SI (1) SI2179039T1 (zh)
TR (1) TR201820474T4 (zh)
TW (1) TW200916106A (zh)
WO (1) WO2009022216A2 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ582972A (en) 2007-08-13 2011-09-30 Coley Pharm Gmbh Rna sequence motifs in the context of defined internucleotide linkages inducing specific immune modulatory profiles
WO2009027105A2 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Neurimmune Therapeutics Ag Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
WO2009105641A2 (en) 2008-02-20 2009-08-27 New York University Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity
US9844592B2 (en) * 2011-07-18 2017-12-19 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Bacterial RNAs as vaccine adjuvants
KR102290205B1 (ko) 2014-06-04 2021-08-20 엑시큐어, 인크. 예방 또는 치료 용도를 위한 리포솜성 구형 핵산에 의한 면역 조절인자의 다가 전달
WO2016081911A2 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
SG11202004773SA (en) 2017-12-15 2020-06-29 Bayer Animal Health Gmbh Immunostimulatory compositions
WO2024030844A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 University Of Mississippi Choline carboxylic acid based ionic liquids as antimicrobial agents

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1446162B1 (en) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharmaceutical GmbH Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
IL164354A0 (en) * 2002-04-04 2005-12-18 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
KR20040097116A (ko) 2002-04-12 2004-11-17 아이신에이더블류 가부시키가이샤 차량 탑재 장치용 전원 관리 시스템
DE10229872A1 (de) * 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
JP2006512927A (ja) * 2002-12-11 2006-04-20 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド ５’ｃｐｇ核酸およびその使用方法
EP2363141A1 (en) * 2003-07-15 2011-09-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compsition comprising two oligonucleotides linked directly at their 3'ends wherein at leat one oligonucleotide has an accessible 5'end and the compound further comprising IL-2 used for synergistically stimulating an immune response in a patient.
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
JP2007526253A (ja) * 2004-02-19 2007-09-13 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性ウイルスｒｎａオリゴヌクレオチド
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
EP1924284A1 (en) 2005-09-14 2008-05-28 Hartmann, Gunther Compositions comprising immunostimulatory rna oligonucleotides and methods for producing said rna oligonucleotides
WO2007062107A2 (en) * 2005-11-25 2007-05-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
NZ582972A (en) * 2007-08-13 2011-09-30 Coley Pharm Gmbh Rna sequence motifs in the context of defined internucleotide linkages inducing specific immune modulatory profiles

Also Published As

Publication number Publication date
RU2435851C2 (ru) 2011-12-10
US8466124B2 (en) 2013-06-18
NZ582972A (en) 2011-09-30
RU2010104618A (ru) 2011-09-20
EP2179039B1 (en) 2018-10-31
ES2703876T3 (es) 2019-03-12
US20120258140A1 (en) 2012-10-11
CL2008002371A1 (es) 2009-07-03
WO2009022216A2 (en) 2009-02-19
PT2179039T (pt) 2019-01-11
KR20100045508A (ko) 2010-05-03
JP4847609B2 (ja) 2011-12-28
CA2696630A1 (en) 2009-02-19
BRPI0814260B1 (pt) 2019-11-12
US20100272785A1 (en) 2010-10-28
AU2008288241B2 (en) 2011-12-01
US20120121648A1 (en) 2012-05-17
JP2010536739A (ja) 2010-12-02
BRPI0814260B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0814260A2 (pt) 2015-03-31
DK2179039T3 (en) 2019-01-07
WO2009022216A3 (en) 2009-06-04
EP2179039A2 (en) 2010-04-28
MX2010001014A (es) 2010-03-01
CN101821392B (zh) 2013-04-17
US8128944B2 (en) 2012-03-06
AR067928A1 (es) 2009-10-28
PL2179039T3 (pl) 2019-03-29
CA2696630C (en) 2014-04-01
SI2179039T1 (sl) 2019-01-31
TR201820474T4 (tr) 2019-01-21
AU2008288241A1 (en) 2009-02-19
WO2009022216A9 (en) 2009-04-30
CO6260153A2 (es) 2011-03-22
HK1143741A1 (en) 2011-01-14
TW200916106A (en) 2009-04-16
US8227447B2 (en) 2012-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102517292B (zh) 免疫刺激性寡核糖核苷酸
CN101821392B (zh) 在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序
CN101558157A (zh) 寡核糖核苷酸及其应用
CN101340931A (zh) 使用连接寡核苷酸调节tlr介导的免疫应答
CN101160401A (zh) 免疫刺激寡核苷酸
CN101310019A (zh) 具有磷酸二酯主链的免疫刺激性单链核糖核酸
CN101331229B (zh) 免疫刺激性寡核糖核苷酸
MX2008006770A (en) Immunostimulatory oligoribonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1143741

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PFIZER ANIMAL HEALTH S. A.

Free format text: FORMER OWNER: COLEY PHARM GMBH

Effective date: 20130620

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: ZOTIS BELGIUM CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME: PFIZER ANIMAL HEALTH S. A.

CP03 Change of name, title or address

Address after: Belgian Lupin

Patentee after: COLEY PHARMACEUTICAL Group Inc.

Address before: Louvain Leuven Belgium

Patentee before: Pfizer Animal Health

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20130620

Address after: Louvain Leuven Belgium

Patentee after: Pfizer Animal Health

Address before: Dusseldorf

Patentee before: Coley Pharmaceutical GmbH

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1143741

Country of ref document: HK