KR20090018798A

KR20090018798A - 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그 의약 용도

Info

Publication number: KR20090018798A
Application number: KR1020087029105A
Authority: KR
Inventors: 토모카츠 이와무라; 히데키 나루미; 하지메 마스모토; 아키히토 카네다; 아키코 소네다; 시즈오 아키라
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤; 오사카 유니버시티
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2009-02-23
Also published as: DK2034015T3; PL2034015T3; EP2034015A4; ES2389112T3; CN101460620B; CA2653939A1; EP2034015A1; AU2007268534A1; KR101065760B1; WO2007139190A1; AU2007268534B2; CA2653939C; US8592566B2; CN101460620A; EP2034015B1; JP5161770B2; JPWO2007139190A1; US20090263413A1

Abstract

IFN 유도 활성이 증강되고 또한 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감된 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 이것을 함유하는 의약품과 그 용도를 제공한다. 즉, 본 발명은 식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'로 표시되는 염기서열로 이루어지고(X 및 Y는 서로 독립한 0 내지 10 뉴클레오티드 길이이고 또한 4염기 이상의 연속한 G를 포함하지 않는 임의의 서열이며, X+Y의 길이는 6 내지 20 뉴클레오티드 길이이다. XCGY는 적어도 8 뉴클레오티드 길이의 팔린드롬 서열을 포함하고, 길이가 8 내지 22 뉴클레오티드 길이이다. P 및 Q는 G 이외의 서로 독립한 1 뉴클레오티드이며, M은 6 내지 10의 정수이며, N은 0 내지 3의 정수이다.), 전체 길이가 16 내지 37 뉴클레오티드 길이인(서열번호 5 기재의 염기서열로 이루어진 것을 제외한다.) 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그 의약 용도를 제공한다.

면역자극 올리고뉴클레오티드

Description

면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그 의약 용도{IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDE AND PHARMACEUTICAL APPLICATION THEREOF}

본 발명은 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그 의약 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 인터페론(IFN) 유도 활성이 증강되고 또한 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감된 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약품과 그 용도에 관한 것이다.

토쿠나가 외에 의해서 특정 타입의 세균성 DNA는 면역응답을 자극하는 것이 보고되어 있다(야마모토 외, Jpn. J. Cancer Res. 1988 79:866-873). 면역자극 활성에 필수인 세균성 DNA의 주성분은 메틸화 수식을 받고 있지 않는 CpG 디뉴클레오티드 모티브(이하, CpG라고 기재함)를 포함하는 특징적인 짧은 서열구조이다. 합성한 CpG 함유 올리고뉴클레오티드에 관해서도 대식세포 및 내츄럴 킬러(NK) 세포의 I형 IFN(IFN-α와 IFN-β) 및 IFN-γ의 산생을 유도하여 NK 세포의 세포장해 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(일본 특허공개 평4-352724호 공보). 또한, CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 대식세포 뿐만 아니라 수상 세포나 B 세포 등에도 작용하여 세포증식 활성, 염증성 사이토카인의 인터류킨-12(이하, IL-12), 종양 괴사 인자-α(이하, TNF-α)의 산생, 인터류킨―6(이하, IL-6)의 산생을 유도하는 것이 보고 되어 있다(Klinman 외, Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 93:2879-2883). 이것으로부터, CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 세포성 면역을 유도하고 또한 Th1 응답을 유도하기 때문에 백신의 보조제(adjuvant) 또는 알레르기성 질환의 치료에 유용하지만, 한편으로는 TNF-α나 IL-6의 산생 유도에 의해 패혈증, 발열, 관절통, 근육통이나 발적 등의 부작용을 유발할 가능성도 부정할 수 없다.

토쿠나가 외는 마우스 NK 세포의 세포장해 활성에 있어서, 6염기 팔린드롬(palindrome) 모티브로 이루어진 CpG 모티브를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 강한 활성을 갖는 것을 발견하고, 5'-AACGTT-3'(서열번호 92), 5'-AGCGCT-3'(서열번호 93), 5'-GACGTC-3'(서열번호 61)의 서열이 가장 강한 것을 보고하고 있다(야먀모토 외, J. Immunol. 1992 148:4072-4076). 또한, 다른 타입의 면역조절 올리고뉴클레오티드 서열도 보고되어 있다(국제공개 제1998/018810호 팜플릿, 국제공개 제2003/015711호 팜플릿, 국제공개 제2004/058179호 팜플릿).

올리고뉴클레오티드의 활성증강을 목적으로 한 연구도 행해지고 있다. 토쿠나가 외는 CpG를 포함하는 6염기 팔린드롬 모티브의 외측에 데옥시구아닐산의 반복 구조(폴리G 서열)를 삽입하면 NK 세포 활성과 IFN 유도 활성이 증강하는 것을 발견하였다(일본 특허공개 평4-352724호 공보). 또한, CpG를 포함하는 6염기 서열의 외측의 서열이 적지 않게 활성에 영향을 미치는 것이 밝혀져 있다.

기타의 공지의 CpG 포함 서열로서는 D-타입(또는 A-타입) 및 K-타입(또는 B-타입)의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 있다(국제공개 제2000/61151호 팜플릿). K-타입은 B세포를 활성화하는 것이 알려져 있다. D-타입은 CpG를 포함하는 팔린드 롬 서열의 외측에 폴리G 서열이 부가되어 있어, 수상 세포의 I형 IFN의 산생을 유도하여 인간 NK 세포를 활성화시킨다. D-타입의 IFN 유도 활성에 관해서는 3' 말단측이 중요하게 되어 3' 말단측의 폴리G 서열의 길이는 4염기 이상 필요하다(국제공개 제2000/61151호 팜플릿). 한편, 염증성 사이토카인 IL-12나 TNF-α의 산생 유도 활성에 있어서도 3' 말단측의 폴리G 서열이 중요하고, 그 효과의 발현에는 적어도 4염기 이상의 폴리G 서열이 필요로 되고 있다(대한민국 KR2001-063153호 공보). 따라서, 공지의 면역자극 활성을 향상시키는 올리고뉴클레오티드의 서열, 또는 폴리G 서열의 구조는 IFN 유도와 염증성 사이토카인 유도의 독립성을 밝히고 있지 않다.

팔린드롬 모티브가 5'-GACGATCGTC-3'(서열번호 76)인 면역자극 뉴클레오티드는 10개까지의 최적 길이의 폴리G 서열을 5' 말단과 3' 말단에 삽입함으로써, 종래의 비수식형(수식형의 효과는 후술함)의 CpG 함유 면역자극 뉴클레오티드보다도 강력한 IFN-α 유도 활성을 갖는 것이 발견되어 있다(일본 특허공개2005-237328호 공보). 5'-GACGATCGTC-3'(서열번호 76)를 갖는 면역자극 뉴클레오티드에 높은 IFN-α 유도 활성을 유발하기 위해서는 G를 3' 말단측 또는 5' 말단측에 8~10개 두는 편이 좋지만, 면역제어성 사이토카인인 인터류킨-10(이하, IL-10)의 산생을 억제하기 위해서는 5' 말단측에 편재시키면 좋은 것이 개시되어 있다(일본 특허공개 2005-237328호 공보). 또한, 염증성 사이토카인 TNF-α나 IL-12의 유도 활성은 IFN-α 유도 활성과 완만하게 상관하는 것이 보고되어 있다. 이들은 5'-GACGATCGTC-3'(서열번호 76) 이외의 팔린드롬 모티브에 있어서 5' 말단측으로의 폴리G 서열 삽입의 효과를 밝히고 있지 않다. 또한, CpG 함유 올리고뉴클레오티드의 염증성 사이토카 인 유도 활성이 감약하고, 또한 IFN-γ와 IFN-α 모두의 IFN 유도 활성이 증강하는 최적의 폴리G 서열의 염기수는 개시되어 있지 않다.

종래의 D-타입 CpG 보다도 높은 면역자극 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드로서 5'-GGTGCCGATCGGCAGGGGGG-3'(서열번호 1)이 발견되어 있다.(일본 특허출원 2004-287102호 공보). 이 염기서열의 1개 또는 수개의 염기가 치환된 유도체에 관해서도 개시되어 있다. 3개 이상 변환된 구체적 서열은 개시되어 있지 않지만, 유일하게 7염기를 치환한 5'-GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG-3'(서열번호 5)은 3' 말단의 폴리G 서열이 3염기에서도 IFN 유도 활성을 갖는 것이 발견되어 있다(국제공개 제2006/035939호 팜플릿).

기타의 활성증강을 목적으로 한 연구로서는 올리고뉴클레오티드의 화학 수식에 의한 안정화가 알려져 있다. 천연에 존재하는 포스포디에스테르 뉴클레오티드는 세포내 및 세포배지 중에 있어서 각종 핵산 분해활성에 의해 분해되기 쉽다. 이 때문에, 핵산 분해활성의 공격 표적인 뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합을 치환하는 것에 의한 안정화, 또한 그 결과로서의 활성증가의 검토가 행해지고 있다. 빈번히 사용되고 있는 치환방법으로는 포스포로티오에이트로의 치환이다. Klinman 외의 연구에서는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 팔린드롬 모티브의 외측의 폴리G 서열을 포스포로티오에이트 수식함으로써, 면역응답의 유도가 증강되는 것을 나타내고 있다(국제공개 제2000/61151호 팜플릿).

비메틸화 CpG를 포함하는 세균성 DNA의 수용체는 Toll형태 수용체(TLR) 패밀리의 멤버 중 하나인 TLR9이다라는 것이 TLR9 녹아웃 마우스를 사용한 연구에서 발 견되어 있다(Hemmi 외, Nature 2000 408:740-745). 또한, 인간 TLR9와 마우스 TLR9를 활성화하는 최적의 CpG 서열은 다른 것이 나타내어져 종특이성의 존재도 밝혀져 있다(Bauer 외, PNAS 2001 98(16):9237-9242). 인간의 치료를 목적으로 한 개발에 있어서는 CpG 올리고뉴클레오티드가 인간 TLR9에 고친화성을 나타내는 것이 필수적이지만, 한편으로는 개발단계에 있어서의 동물을 사용한 전 임상시험에 있어서 마우스 등 동물에 작용하는 것도 중요하다.

알레르기성 질환의 치료에서는 현재 다용되고 있는 대증요법이 아니라 면역조절형이고 또한 유효한 근치요법이 소망되고 있다. 알레르기 환자는 알레르겐에 대한 면역응답이 Th2에 편중되어 있어 Th1 면역응답이 억제되어 있다. 따라서, Th1 면역응답을 유도하고 Th2 면역반응을 억제하는 치료제는 알레르기 체질의 개선에 유용하다. 어떤 종의 비팔린드롬 서열로 이루어진 CpG 올리고뉴클레오티드(일본 특허공개 2003-286174호 공보)나 6염기 팔린드롬 5'-AACGTT-3'을 포함하는 CpG 올리고뉴클레오티드(일본 특허공표 2002-500159호 공보, Tighe 외, J. Allergy Clin. Immunol. 2000 106:124-134)은 마우스 천식 모델에 있어서 치료효과를 갖는 것이 개시되어 있다. 그러나, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 Th1 반응을 유도할 뿐만 아니라 염증성 사이토카인을 유발하기 때문에 약리작용상 유효한 용량을 투여했을 경우 바람직하지 않은 부작용이 발현되는 것이 염려된다.

알레르기 증상은 비만세포가 히스타민 등을 함유하는 과립을 세포 밖으로 방출(탈과립)하는 것이 원인이며, 이 탈과립은 비만세포 상의 IgE와 알레르겐이 결합된 결과로서 야기된다. 최근, 항원 특이적인 제어성 T세포(Treg)는 그 면역 밸런스 를 유지하는 기능에 있어서 주목되고 있다. 예를 들면 Treg에 의한 IgE 수용체 FcεRI를 통한 탈과립의 억제 등이 열거된다(Till 외, J. Allergy Clin. Immunol. 2004 113:1025-1034). 또한, IFN-α 및 IFN-β는 IL-10의 산생 유도를 촉진하는 것이 나타나 있다(Aman 외, Blood. 1996 87:4731-4736). 또한, IL-10은 IgG4나 IgA 산생세포의 분화 유도를 촉진하므로, 면역자극 뉴클레오티드에 의한 알레르기 치료 효과는 IL-10의 유도도 그 기서 중 하나라고 생각되고 있다. 따라서, 알레르기 치료에 적합한 면역자극 뉴클레오티드는 IFN-α 유도 활성이 증강되어 IL-10 유도 활성도 유지하고 있는 것이 바람직하다.

간염이란 바이러스, 알콜, 약품, 독소 및 자기면역성 등의 원인에서 유발된 간장의 염증을 포함하는 증환을 가리킨다.

간염 바이러스에 의한 간염이 대다수를 차지하고, 특히 A, B, C형이 많지만, 그 외에도 D, E, F, G형, 및 특발성 간염 바이러스의 존재가 알려져 있다. 또한, 상기 간염 바이러스는 RNA형, DNA형 등 다수의 다른 바이러스·패밀리 사이에 퍼져 있다.

B형 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 및 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)은 각각 급성 및 만성 감염을 야기한다. 급성 간염은 초기 감염이나 만성적인 감염자에 있어서의 재발에 따라 증상이 발현된다. 한편, 만성 C형 간염에 있어서는 6개월 이상에 걸쳐서 간장의 염증이 계속되어 세포가 파괴되어서 간기능의 저하를 수반한다. HCV 감염에서는 급성 간염으로부터 만성 간염으로의 진행의 위험성이 높은 것도 문제이다. 이러한 상황으로부터, 간염 바이러스 감염증에 대한 치료의 조기 개입과 효과가 높은 치료법의 개발이 소망되고 있다.

C형 간염에 있어서는 각종의 인터페론(이하, IFN) 제제의 단독 치료나 IFN-α 제제와 리바비린의 병용 요법이 치료수단의 제 1 선택으로 이루어지고 있다. 병용치료는 단제 치료보다 지속적 반응을 기대할 수 있는 반면, 보다 고가이고, 보다 많은 부작용을 수반한다. 그러나, 이들 치료를 행해도, 전체 치료자의 약 60%에만 치료효과가 인정되었을 뿐이며, 효과가 나타난 후에 치료를 중지하면 반 정도 이상의 환자가 재연한다. 이러한 상황으로부터 새로운 치료약의 개발이 소망되고 있다.

CpG 올리고뉴클레오티드의 간염 치료에 있어서의 효과로서는 인터페론 유도에 의한 항바이러스 효과의 증강과 바이러스 감염 세포에 대한 세포성 면역의 유도 및 내성주의 출현에 대한 저항성 등이 열거된다. CpG 올리고뉴클레오티드의 HBV 또는 HCV 감염에 의한 간염 치료 용도에 관해서는 일본 특허공표 2003-526662호 공보 및 일본 특허공표 2006-515277호 공보에 있어서의 기술정보가 있다. 전자는 CpG 올리고뉴클레오티드(면역활성화 서열: ISS)를 간염 바이러스 항원과 함께는 투여하지 않고 치료하는 방법에 대해서 개시하고 있다. 후자는 인터페론 요법 등의 항바이러스제가 무효하였던 만성 C형 간염의 개체를 처치하는 방법에 대해서 개시하고 있고, 환자에서의 유용성에 대해서 개발 번호 CpG10101에 의한 임상시험 성적이 2006년 유럽 간장학회 외에서 개시되어 있다. 그러나, 임상시험 성적으로부터 CpG10101의 단제치료의 효과는 종래의 치료법과 비교하면 극히 불충분해서, 페그화 수식 IFN-α 제제와 리바비린과 CpG 올리고뉴클레오티드의 3제의 병용 치료는 표준적인 치료법인 페그화 수식 IFN-α 제제와 리바비린의 성적과 비교해서 약간의 유효성의 향상은 기대할 수 있지만, 다른 항바이러스제와의 병용(예를 들면, 폴리메라아제나 프로테아제 등 바이러스 효소의 조해제와의 병용 치료)과 비교해서 충분한 치료 효과가 얻어지지 않는 것이 이미 밝혀져 있다.

또한, 기존의 CpG 올리고뉴클레오티드는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-12나 IL-6의 산생 유도에 의해 패혈증, 발열, 관절통, 근육통이나 발적이나 예기하지 않은 부작용을 유발할 가능성도 부정할 수 없고, 실제로 마우스의 간염 모델을 사용한 시험예로부터 간염의 증상을 악화시키는 것이 나타나 있다(Abe 외, Fukushima J. Med. Sci. 2005 51:41-49). 따라서, 간염 치료에 알맞은 면역자극 활성이 향상되고 또한 부작용이 저감된 CpG 올리고뉴클레오티드의 창출이 소망되고 있다.

면역자극 올리고뉴클레오티드의 활성에 의존하고, 투여량, 투여회수를 저감하는 것이 가능해지고, 그 결과 독성 작용이 발생할 가능성의 저하, 또한 QOL을 상승시킬 가능성이 매우 높다.

이상의 것으로부터, 인간에 있어서 상술한 기존의 면역자극 서열과 비교하여 IFN 유도 활성이 향상되고 또한 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감된 서열을 찾아내는 것은 산업이용상 매우 유용하고 유익성이 매우 높다.

본 발명의 목적은 인터페론(IFN) 유도 활성이 증강되고 또한 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감된 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 이 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약품과 그 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, IFN 유도 활성에 있어서 CpG 모티브를 포함하는 서열의 외측의 5'-말단측이 중요한 것을 발견했다. 즉, 6염기 이상의 연속한 구아닌 서열의 5' 말단측으로의 삽입에 의해, 인터페론 유도 활성이 그 이외의 것보다도 우수한 올리고뉴클레오티드가 얻어지는 것을 확인했다. 검토를 더욱 진행한 결과, 폴리G 서열이 5'-말단측에는 염기수가 6 내지 10의 길이로 삽입되고, 3'-말단측에는 염기수가 0 내지 3의 길이로 삽입되어 있고, 또한 소정의 구조적 특징을 갖는 CpG 올리고뉴클레오티드는 종래 알려져 있는 D-타입 CpG 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드보다도 I형 IFN, 즉 IFN-α 및 IFN-β와 IFN-γ 유도활성이 증강되고 있고, 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감되어 있어, 더욱 높은 IgE 산생 억제 활성, Th2 억제 활성, 및 Th1 유도 활성을 갖는 것을 발견했다. 이들에 더해서, 간염 모델 마우스에 있어서의 시험 결과, 생체내에 있어서 간염치료 효과도 갖는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 각 발명을 제공하는 것이다.

[1] 식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'(식중, C는 시토신이며, G는 구아닌이다. X 및 Y는 서로 독립한 0 내지 10 뉴클레오티드 길이이고 또한 4염기 이상의 연속한 구아닌을 포함하지 않는 임의의 서열이며, X+Y의 길이는 6 내지 20 뉴클레오티드 길이이다. XCGY는 길이가 적어도 8 뉴클레오티드 길이의 팔린드롬 서열을 포함하고, 길이가 8 내지 22 뉴클레오티드 길이이다. P 및 Q는 구아닌 이외의 서로 독립한 1 뉴클레오티드이며, M은 6 내지 10의 정수이고, N은 0 내지 3의 정수이다. 또한, X와 Y의 뉴클레오티드 길이는 반드시 같지 않아도 좋음)으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 전체 길이가 16 내지 37 뉴클레오티드 길이인(단, 서열번호 5 기재의 염기서열(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)로 이루어진 것을 제외함) 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[2] 상기 M이 6 내지 8의 정수이고, 또한 전체 길이가 16 내지 35 뉴클레오티드 길이인 [1]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[3] 상기 XCGY의 길이가 9 또는 10 뉴클레오티드 길이이고, 또한 전체 길이가 17 내지 23 뉴클레오티드 길이인 [1] 또는 [2]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[4] 상기 XCGY가 CGATCG(서열번호 59), ATCGAT(서열번호 60) 및 GACGTC(서열번호 61)에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[5] 상기 XCGY가 CGATCG(서열번호 59)를 포함하는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[6] 상기 CGATCG(서열번호 59)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 7, 9 내지 11, 및 15 내지 18, 22, 24, 26, 28, 48, 50 내지 52, 54, 95 및 97로 표시되는 염기서열로 이루어진 [4] 또는 [5]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[7] 상기 CGATCG(서열번호 60)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열번호 30으로 표시되는 염기서열로 이루어진 [4]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[8] 상기 CGATCG(서열번호 61)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열번호 40 및 42로 표시되는 염기서열로 이루어진 [4]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[9] 서열번호 6, 7, 10 및 15 내지 17, 24, 26, 28, 48, 50 내지 52, 95, 및 97로 표시되는 염기서열로 이루어진 [4] 또는 [5]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[10] 전체 또는 일부의 뉴클레오티드 잔기 간의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[11] 5'-말단의 연속하는 G 서열의 뉴클레오티드 잔기 간의 적어도 일부의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 [10]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[12] 3'-말단의 뉴클레오티드 잔기 간의 적어도 일부의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 [10] 또는 [11]에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드.

[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 의약.

[14] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 알레르기 질환의 치료 또는 예방제.

[15] 상기 알레르기 질환이 화분 알레르기증인 [14]에 기재된 알레르기 질환의 치료 또는 예방제.

[16] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 보조제로서 포함하는 백신.

[17] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 간염 치료 또는 예방제.

[18] 상기 간염이 바이러스성 간염인 [17]에 기재된 간염 치료 또는 예방제.

[19] 상기 바이러스성 간염이 B형 또는 C형 간염인 [18]에 기재된 간염 치료 또는 예방제.

[20] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 알레르기 질환의 치료 또는 예방제로서의 사용.

[21] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 백신의 보조제로서의 사용.

[22] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 간염 치료 또는 예방제로서의 사용.

[23] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 알레르기 질환의 치료 또는 예방방법.

[24] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 백신에 대한 보조제로서 이용하는 방법.

[25] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 간염의 치료 또는 예방방법.

(발명의 효과)

본 발명에서 제공되는 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 IFN 유도 활성이 증강되어 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감되고, 또한 높은 IgE 산생 억제 활성, Th2 억제 활성, 및 Th1 유도 활성을 갖고 있는 등 우수한 면역자극 활성을 갖기 때문에 높은 치료 효과를 갖는다. 또한, 간염 모델 마우스에 있어서의 시험 결과, 체내에 있어서 간염치료 효과도 갖는 것도 증명되어 있다. 또한, 부작용의 위험성이 저감되어 있기 때문에 고용량의 사용이 가능하다. 따라서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 종래의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 비교해서 단기간에 고율 또한 안전한 백신 보조제로서 알레르기 질환 및/또는 간염의 치료, 및 예방이 가능해 진다.

도 1a는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 1b는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 1c는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 1d는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 1e는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오 티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 1f는 실시예 1에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 2는 실시예 2에 있어서 마우스 J774 세포주를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IL-12p40 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 3a는 실시예 3에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드(G6-PXCGYQ-G3) 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG(G2-PXCGYQ-G6)로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 3b는 실시예 3에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 등(G6-PXCGYQ-G3) 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG(G2-PXCGYQ-G6)로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 3c는 실시예 3에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드(G6/7-PXCGYQ-G2) 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG(G2/3-PXCGYQ-G6)로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 4는 실시예 4에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 5a는 실시예 7에 있어서 인간 PBMC를 본 발명 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 5b는 실시예 7에 있어서 인간 PBMC를 본 발명 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 5c는 실시예 7에 있어서 인간 PBMC를 본 발명 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 5d는 실시예 7에 있어서 인간 PBMC를 본 발명 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 6은 실시예 8에 있어서 인간 PBMC를 본 발명 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 7a는 실시예 9에 있어서 마우스 비세포를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 7b는 실시예 9에 있어서 마우스 비세포를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG로 자극하여 배양 상청 중의 IL-10 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 8a는 실시예 10에 있어서 마우스 J774 세포주를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드(G6-PXCGYQ-G3) 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG(G2- PXCGYQ-G6)로 자극하여 배양 상청 중의 IL-12 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 8b는 실시예 10에 있어서 마우스 J774 세포주를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드(G6-PXCGYQ-G3) 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG(G2-PXCGYQ-G6)로 자극하여 배양 상청 중의 TNF-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 9는 실시예 11에 있어서 마우스 J774 세포주를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG와 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극하여 배양 상청 중의 TNF-α 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 10은 실시예 12에 있어서 인간 PBMC를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG와 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 항CD40 항체와 IL-4와 함께 자극하여 배양 상청 중의 IgE 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 11은 실시예 13에 있어서 마우스를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 삼나무 화분 항원 Cry j 1로 처치하고, 알레르기 야기 후의 혈청 중의 IgE 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 12a는 실시예 13에 있어서 마우스를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 삼나무 화분 항원 Cry j 1로 처치한 후, 알레르기 야기 후에 적출한 비세포를 Cry j 1로 자극하여 배양 상청 중의 IFN-γ 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 12b는 실시예 13에 있어서 마우스를 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 삼나무 화분 항원 Cry j 1로 처치한 후, 알레르기 야기 후에 적출한 비세포를 Cry j 1로 자극하여 배양 상청 중의 IL-5 산생량을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 13은 실시예 14에 있어서 ConA 유발 마우스 간염 모델에 있어서 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 혈청중 ALT치의 상승에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타내는 도이다.

도 14a는 실시s예 15에 있어서 ConA 유발 마우스 간염 모델에 있어서 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 혈청중 ALT치의 상승에 미치는 영향을 비교 평가한 결과를 나타내는 도이다.

도 14b는 실시예 15에 있어서 ConA 유발 마우스 간염 모델에 있어서 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 혈청중 ALT치의 상승에 미치는 영향을 비교 평가한 결과를 나타내는 도이다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'(식중, C는 시토신이며, G는 구아닌이다. X 및 Y는 서로 독립한 0 내지 10 뉴클레오티드 길이이고, 또한 4염기 이상의 연속한 구아닌을 포함하지 않는 임의의 서열이며, X+Y의 길이는 6 내지 20 뉴클레오티드 길이이다. XCGY는 길이가 적어도 8 뉴클레오 티드 길이의 팔린드롬 서열을 포함하고, 길이가 8 내지 22 뉴클레오티드 길이이다. P 및 Q는 구아닌 이외의 서로 독립한 1 뉴클레오티드이며, M은 6 내지 10의 정수이며, N은 0 내지 3의 정수이다. 또한, X와 Y의 뉴클레오티드 길이는 반드시 같지 않아도 좋다.)으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 전체 길이가 16 내지 37 뉴클레오티드 길이인(단, 서열번호 5 기재의 염기서열(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)로 이루어진 것은 제외함) 것을 특징으로 한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'로 표시된다. 식중의 「5'-」은 5' 말단을, 「3'-」은 3' 말단을 나타낸다. 또한, C는 시토신이고, G는 구아닌이고, X와 Y는 서로 독립한 임의의 서열 및 길이로 이루어진 부분이며, P와 Q는 서로 독립한 임의의 뉴클레오티드이다. (G)_M과 (G)_N은 각각 구아닌(G)만으로 이루어진 연속하는 서열 부분을 나타내고, 각각의 M과 N은 구아닌의 수를 나타낸다. 즉, 상기 식은 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단의 염기서열을 일반화해서 나타낸 것이다. 또한, 본 발명에 있어서 「XCGY」란 상기 식중의 X, C, G 및 Y로 구성되는 서열 부분 전체를 의미하고, 「PXCGYQ」란 상기 식중의 P, X, C, G, Y 및 Q로 구성되는 서열 부분 전체를 의미한다. 또한, 상기 식에 관해 「길이」란 각 서열 부분을 구성하는 뉴클레오티드의 수(뉴클레오티드 길이)를 의미한다. 또한, 「X+Y의 길이」란 X의 길이와 Y의 길이의 합계를 의미하는 것으로 한다.

상기 식중, X와 Y의 길이는 각각 0 내지 10 뉴클레오티드 길이의 범위이다. 특히, 2~6 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다. X 및 Y의 서열은 각각 독립한 임의의 뉴클레오티드로 이루어진 것이면 좋지만, 4 염기 이상의 연속한 구아닌이 포함되지 않은 것이 필요하다. 또한, X+Y의 길이는 6 내지 20 뉴클레오티드 길이인 것이 필요하다. 6 내지 12 뉴클레오티드 길이가 바람직하고, 7 또는 8 뉴클레오티드 길이가 보다 바람직하고, 8 뉴클레오티드 길이가 가장 바람직하다. 또한, X와 Y의 뉴클레오티드 길이는 반드시 같지 않아도 좋다.

상기 식중, XCGY에는 팔린드롬 서열이 포함되는 것이 필요하다. 팔린드롬 서열이란 임의의 2염기 사이의 축에 대하여 좌우 대칭으로 상보적인 염기로 구성되는 염기서열 부분을 의미하고, 팔린드롬 서열이라고도 별칭되는 경우가 있다. 본 발명에 있어서, XCGY에 포함되는 팔린드롬 서열의 길이는 8 뉴클레오티드 길이 이상인 것이 필요하다. 또한, XCGY는 8 염기 이상의 팔린드롬 서열만으로 이루어져 있어도 좋고, 일부에 8 염기 이상의 팔린드롬 서열을 포함하는 한 반드시 완전하게 상보적이 아니어도 좋다.

XCGY는 CGATCG(서열번호 59), ATCGAT(서열번호 60) 및 GACGTC(서열번호 61)에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 특히, CGATCG(서열번호 59)을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 이들 서열 자체는 팔린드롬 서열이며, XCGY에 포함되는 팔린드롬 서열은 이들 서열을 일부로서 포함하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명에 있어서의 팔린드롬 서열의 예를 이하에 나타낸다. XCGY가 8 염기서열의 팔린드럼 서열로는 CCGATCGG(서열번호 62), GCGATCGC(서열번호 63), ACGATCGT(서열번호 64), CATCGATG(서열번호 65), GATCGATC(서열번호 66), ATCGCGAT(서열번호 67), GAACGTTC(서열번호 68), CAACGTTG(서열번호 69), AGCGCGCT(서열번호 70), ACGTACGT(서열번호 71), TAGCGCTA(서열번호 72), ACGGCCGT(서열번호 73), CGACGTCG(서열번호 74), CGTCGACG(서열번호 75)가 열거된다. 이 중, CCGATCGG, GCGATCGC, ACGATCGT, CATCGATG, CGACGTCG가 바람직하다. XCGY가 10 염기서열의 팔린드롬 서열로서는 GACGATCGTC(서열번호 76), G GCGATCGCC(서열번호 77), CGATCGATCG(서열번호 78), GATCGCGATC(서열번호 79), GCAACGTTGC(서열번호 80), GCATCGATGC(서열번호 81), CAGCGCGCTG(서열번호 82), GACGTACGTC(서열번호 83), CTAGCGCTAG(서열번호 84), CCCGATCGGG(서열번호 85), GACGGCCGTC(서열번호 86), GCCGATCGGC(서열번호 87), TCCGATCGGA(서열번호 88), ACGTCGACGT(서열번호 89), ACAACGTTGT(서열번호 90) 및 ACGACGTCGT(서열번호 91)가 열거된다. 이 중, GCCGATCGGC, CCCGATCGGG, TCCGATCGGA, GGCGATCGCC, GACGATCGTC, GCATCGATGC, ACGACGTCGT가 바람직하다. 또한, 팔린드롬 서열은 그 길이가 적어도 8 뉴클레오티드 길이인 서열이면 반드시 이들 구체예에 한정되지 않는다.

XCGY의 길이는 8 내지 22 뉴클레오티드 길이이고, 이 범위에서 X와 Y의 각각의 길이나 팔린드롬 서열의 종류에 따라서 조정할 수 있다. 바람직하게는, 8 내지 14 뉴클레오티드 길이가 바람직하고, 9 또는 10 뉴클레오티드 길이가 보다 바람직하고, 10 뉴클레오티드 길이가 가장 바람직하다.

상기 식중의 P 및 Q는 구아닌 이외의 1 뉴클레오티드이다. 구체적으로는 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C) 중 어느 하나이다.

상기 식중의 M은 6 내지 10의 정수이고, 6 내지 8인 것이 바람직하다. 상기 범위를 일탈하면, IFN 유도 활성이 불충분하게 되기 때문에 바람직하지 않다. 또한, N은 0 내지 3의 정수이다. 상기 범위를 일탈하면, 염증성 사이토카인 유도 활성을 충분히 저감시킬 수 없으므로 바람직하지 않다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 전체 길이는 16 내지 37 뉴클레오티드 길이이고, 상기 식중의 M이나 N, X나 Y의 길이 등에 따라 다르다. 상기와 같이 M이 6 내지 8의 범위인 경우에는 6 내지 35 뉴클레오티드 길이이다. 또한, XCGY의 길이가 9 또는 10 뉴클레오티드 길이인 경우에는 17 내지 23 뉴클레오티드 길이이다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 염기서열의 예로서, 바람직하게는 GGGGGGTGACGATCGTCGGG(서열번호 97: Mod92), GGGGGGTGACGATCGTCAGGG(서열번호 28: Mod46), GGGGGGTCCCGATCGGGAGGG(서열번호 22: Mod43), GGGGGGTTCCGATCGGAAGGG(서열번호 24: Mod44), GGGGGGTGGCGATCGCCAGGG(서열번호 26: Mod45), GGGGGGTGCATCGATGCAGGG(서열번호 30: Mod47), GGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(서열번호 6: Mod53), GGGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(서열번호 7: Mod54), GGGGGGTGCCGATCGGCAGG(서열번호 9: Mod40), GGGGGGGTGCCGATCGGCAGG(서열번호 10: Mod55), GGGGGGTGCCGATCGGCAG(서열번호 11: Mod41), GGGGGGTGCCGATCGGCA(서열번호 15: Mod61), GGGGGGGTGCCGATCGGCA(서열번호 16: Mod62), GGGGGGGGTGCCGATCGGCA(서열번호 17: Mod63), GGGGGGGGGGTGCCGATCGGCA(서열번호 18: Mod64), GGGGGGGACGACGTCGTCGG(서열번호 40: Mod71) 및 GGGGGGAACGACGTCGTTGG(서열번호 42: Mod73)을 열거할 수 있지만, 반드시 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 예컨대 식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'의 M이 7이고 N이 2인 경우 GGGGGGGAGCCGATCGGCTGG(서열번호 43), GGGGGGGAGCCGATCGGCAGG(서열번호 44), GGGGGGGTGCCGATCGGCTGG(서열번호 45), GGGGGGGAGCCGATCGGCCGG(서열번호 46), GGGGGGGCGCCGATCGGCCGG(서열번호 47), GGGGGGGTGACGATCGTCAGG(서열번호 48: Mod84), GGGGGGGTGACGATCGTCTGG(서열번호 49), GGGGGGGAGACGATCGTCAGG(서열번호 50: Mod85), GGGGGGGAGACGATCGTCTGG(서열번호 51: Mod83), GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(서열번호 52: Mod87), GGGGGGGTGACGATCGTTAGG(서열번호 53), GGGGGGGTCGACGTCGTGG(서열번호 100), GGGGGGGACGACGTCGTGG(서열번호 101) 및 GGGGGGGTCGACGTCGAGG(서열번호 102), GGGGGGGACGACGTCGTCGG(서열번호 105)이어도 좋고, 또한 M이 7이고 N이 3인 경우 GGGGGGGCGACGATCGTCGGG(서열번호 54), GGGGGGGTGACGATCGTCGGG(서열번호 94), GGGGGGGTCGACGTCGTGGG(서열번호 99) 및GGGGGGGTCGACGTCGAGGG(서열번호 107), M이 8이고 N이 1인 경우 GGGGGGGGCGACGATCGTCG(서열번호 95; Mod93), GGGGGGGGTGACGATCGTCG(서열번호 96), GGGGGGGGACGACGTCGTG(서열번호 103) 및 GGGGGGGGTCGACGTCGAG(서열번호 104)이어도 좋다. 또한, M이 8이고 N이 0인 경우 GGGGGGGGACGACGTCGTC(서열번호 106)이어도 좋다.

하기 실시예에 있어서 구체적으로 나타내는 바와 같이, 서열표의 서열번호 6, 7, 9 내지 11, 15 내지 18, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 42, 48, 50 내지 52, 54, 95 및 97로 표시되는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 상기 식에 있어서 PXCGYQ의 조건을 만족시키지만 그 밖의 조건을 만족시키지 않는 D-타입 CpG 서열보다도 IFN 유도 활성이 증강되어 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감하는 것이 확인되고 있다. 즉, IFN 유도 활성에 있어서는 올리고뉴클레오티드의 CpG 모티브를 포함하는 팔린드롬 서열이 필수적이지만, IFN 유도 활성의 증강과 염증성 사이토카인 유도 활성의 저감에 있어서는 그 외측에 삽입하는 폴리G 서열의 염기수가 중요하다. 따라서, 본 발명의 가장 중요한 부분은 폴리G 서열과 특정 팔린드롬 서열의 조합이 아니라, 최적의 폴리G 서열의 삽입 양식이다. 또한, 상기 열거한 올리고뉴클레오티드 중 서열번호 6, 7, 10 및 15 내지 17, 24, 26, 28, 48, 및 50 내지 52으로 표시되는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드, 그 중에서도 서열번호 6, 7, 10, 28, 48 및 50 내지 52의 올리고뉴클레오티드는 강한 인터페론(IFN) 유도 활성을 갖고 있어 특히 바람직하다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 잔기 간의 포스포디에스테르 결합, 각 뉴클레오티드의 리보스 당부, 염기부 중의 전부 또는 일부가 화학 수식되어 있어도 좋다. 단, XCGY의 C의 메틸화는 면역자극 활성이 소실되므로 바람직하지 않다. 이러한 수식된 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 적합한 실시형태로서는 뉴클레오티드 잔기 간의 포스포디에스테르 결합에 있어서의 인산기의 산소원자의 치환 및/또는 수식이며, 예를 들면 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스포르아미데이트를 열거할 수 있다. 포스포로티오에이트 수식은 5'-말단의 폴리G 서열(상기 식중의 (G)_M)의 일부 또는 모든 뉴클레오티드 잔기 간의 포 스포디에스테르 결합에 있어서 되어 있는 것이 바람직하다. 5'-말단의 폴리G 서열에 대해서는 상기 서열을 구성하는 모든 염기 간 또는 최말단의 포스포디에스테르 결합에 있어서 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것이 바람직하다. 3'-말단의 폴리G 서열에 대해서는 최말단의 염기를 제외한 일부 또는 모든 염기 간의 포스포디에스테르 결합에 있어서 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 일반식에 있어서의 N=0 또는 1의 올리고뉴클레오티드는 구아닌 이외의 3'-말단측의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있어도 좋다. 또한, 5'-말단의 폴리G 서열과 3'-말단측의 최말단의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 면역자극 활성을 갖는 한에 있어서는 CpG 디뉴클레오티드의 시토신(상기 식중의 중앙부의 C)에 있어서 메틸화 이외의 화학수식이 되어 있어도 좋다.

포스포디에스테르 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드의 분해는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 의해 매개된다. 뉴클레오티드 간 결합이 포스포로티오에이트 수식됨으로써 이들 뉴클레아제에 대하여 저항성을 획득하는 것이 알려져 있다. 일부의 뉴클레오티드 잔기 간이 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면5' 및 3' 말단의 뉴클레오티드 간이 포스포로티오에이트 수식 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드나 폴리G 서열의 뉴클레오티드 간이 포스포로티오에이트 수식 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드가 있고, 엑소뉴클레아제에 내성을 갖는다. 또한, 모든 뉴클레오티드 잔기 간이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 저항성을 갖는다. 뉴클레아제 내성의 CpG 올리 고뉴클레오티드는 안정하고, 예를 들면 표적 수용체에 작용하는 시간의 연장이나 일정한 농도를 유지하는 결과, 증강된 면역자극 활성을 나타낸다.

또한, 상기 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 상술한 염기서열에 관한 요건을 만족시키고 있으면, 면역자극 활성, 구체적으로는 증강된 IFN 유도 활성과 저감된 염증성 사이토카인 유도 활성을 갖는 한, 핵산 이외의 분자가 결합되어 있어도 좋다.

본 발명에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가 면역자극 활성을 갖는다는 것은 인터페론(IFN) 유도 활성이 증강되고, 또한 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감되는 것을 의미한다. 여기에서, 염증성 사이토카인이란 인터류킨-12(이하, IL-12), 종양괴사 인자-α(이하, TNF-α), 인터류킨―6(이하, IL-6) 및 인터류킨-1β(이하, IL-1β)를 의미한다. 염증성이란 조직에 있어서의 발열의 유도나 세포의 침윤 및 활성화를 야기하는 성질을 말한다. 한편, 면역억제성이란 상기 염증반응을 억제하는 기능 또는 성질을 갖는 것을 의미한다. 인터류킨-10(이하, IL-10)은 면역억제성 사이토카인 중 하나이며, 기능적으로 염증성 사이토카인과는 다르다. IFN 유도 활성 또는 염증성 사이토카인 유도 활성이란, 예를 들면 인간에 있어서는 평균적인 반응성을 갖는 인간 검체의 말초혈 단핵구(PBMC), 마우스에 있어서는 골수 유래 수상 세포 또는 비세포 또는 CpG 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드에 감수성의 단구계 세포주 J774나 RAW264.7로부터의 각 사이토카인 산생을 유도하는 작용을 나타낸다. 본 발명에 있어서는, 인간 말초혈 단핵구(이하, PBMC)에 있어서의 면역자극 올리고뉴클레오티드 처치에 의한 IFN-α 및 IFN-γ의 산생 유도를 지 표로 한 활성으로서 나타낼 수 있다. 또한, 마우스 비세포에 있어서의 면역자극 올리고뉴클레오티드 처치에 의한 IFN-γ 및 IL-10의 산생 유도를 지표로 한 활성으로서 나타낼 수 있다. 또한, 마우스 수상 세포 및 J774 세포주에 있어서 면역자극 올리고뉴클레오티드 처치에 의해 인터류킨-12p40(이하, IL-12p40) 및 TNF-α의 산생 유도를 지표로 한 활성으로서 나타낼 수도 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 수개의 면역자극 올리고뉴클레오티드 서열의 활성을 비교할 때에 사용하는 증강된 IFN 유도 활성이란, 상기 세포를 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극했을 경우에 다른 것보다 저농도에서 다량의 IFN-α 및 IFN-γ를 유도하는 것을 나타낸다. 한편, 저감된 염증성 사이토카인 유도 활성이란 상기 세포를 면역자극 올리고뉴클레오티드로 자극했을 경우에 다른 것보다 소량의 IL-12p40 및 TNF-α를 유도하는 것을 말한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 PBMC로부터의 IFN-γ 및 IFN-α의 체외에서의 유도 활성을 평가하는 시험의 구체적 방법을 이하에 나타낸다. 인간 혈액으로부터 Histopaque 1077을 사용한 밀도구배 원심을 2000rpm, 실온에서 25분간 행하여 PBMC를 단리한다. 단리한 PBMC를 10% FCS를 넣은 RPMI1640 배지에서 1mL당 4.O×10⁶개의 세포가 포함되도록 조제후, 둥근 바닥의 96구멍 마이크로플레이트에 1웰당 4.0×10⁵개의 세포를 뿌리고, 면역자극 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 24시간 또는 7일간 자극하고, 각각 배양 상청을 회수한다. IFN-α와 IFN-γ의 산생량은 각각 24시간과 7일간의 자극후의 배양 상청을 이용하여 ELISA법 으로 정량한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 PBMC로부터의 IL-12 및 TNF-α의 체외에서의 유도 활성을 평가하는 시험의 구체적 방법을 이하에 나타낸다. 인간 혈액으로부터 Histopaque 1077을 사용한 밀도구배 원심을 2000rpm, 실온에서 25분간 행하여 PBMC를 단리한다. 단리한 PBMC를 10% FCS를 넣은 RPMI1640 배지에서 1mL당 2.0×10⁶개의 세포가 포함되도록 조제후, 평평한 바닥의 96구멍 마이크로플레이트에 1웰당 2.O×10⁵개의 세포를 뿌리고, 면역자극 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 8시간 또는 24시간 자극하고, 각각 배양 상청을 회수한다. IL-12 및 TNF-α의 산생량은 각각 8시간과 24시간의 자극후의 배양 상청을 이용하여 ELISA법으로 정량한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 마우스 비세포로부터의 IFN-γ 및 IL-10 산생 유도의 유무를 확인하는 수단으로서 체외에서의 유도 평가시험이 열거된다. 구체적 방법을 이하에 나타낸다. 숫컷 10-25주령의 CL57BL/6N 마우스의 비장을 적출하고, RPMI1640/FCS 10%가 들어간 페트리 접시로 옮긴다. 러빙 슬라이드 글라스 2매를 이용하여 비장을 갈아 으깨어 셀스트레이너로 거르면서 둥근바닥 원심관으로 옮긴다. 1000rpm에서 10분간 4℃에서 원심하고, 상청을 버리고 5mL의 용혈 버퍼(0.83% NH₄Cl과 170mM Tris-HCl, pH 7.65를 9 대 1로 혼합해서 조제함)를 가하고, 피펫팅 조작으로 세포 덩어리를 풀어서 현탁한다. 5분간 실온에서 인큐베이션한 후, 5mL의 배양액을 가하고 전도 혼화하고, 1000rpm에서 10분간 4℃에서 원 심한다. 상청을 버리고, 10mL의 배양액을 가하고, 피펫팅 조작으로 세포덩어리를 풀어서 현탁했다. 세정 조작을 2회 반복한 후에, 배양액으로 재현탁하고, 트립판 블루를 이용하여 세포수를 카운팅하고, 1mL당 생세포수가 4×10⁶이 되도록 조제한다. 둥근바닥의 96구멍 플레이트에 1웰당 4.0×10⁵개의 세포가 되도록 뿌리고, 면역자극 올리고뉴클레오티드를 첨가해서 3일간 자극한다. 자극 종료후, 배양 상청 중의 IFN-γ 및 IL-10의 농도를 ELISA법으로 정량한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 마우스 J774 세포로부터의 IL-12p40 및 TNF-α 산생 유도의 유무를 확인하는 수단으로서 체외에서의 유도 평가시험이 열거된다. J774 세포주는 배양액(RPMI1640, FCS 10%, 50㎛ 2-ME)으로 1mL당 1×10⁶개가 되도록 조정한다. 평평한 바닥 96구멍 멀티플레이트에 1웰당 1.0×10⁵개의 세포가 되도록 뿌리고, 면역자극 올리고뉴클레오티드를 첨가해서 4시간 또는 8시간 또는 48시간 자극한다. 자극 종료후, 배양 상청 중의 IL-12p40 및 TNF-α의 농도를 ELISA법으로 정량한다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 또는 종래의 기술 및 핵산 합성장치에 의해 합성할 수 있다. 이들 합성방법은 효소적 방법, 화학적 방법, 본 발명의 서열보다 긴 서열의 분해를 포함하지만, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 수식된 올리고뉴클레오티드도 종래의 기술에 있어서 합성된다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 포스포르아미데이트를 황으로 처리함으로써 포스포로티오에이트 수식된 올리고뉴클레오티드가 얻어지지만, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 이들 올리고뉴클레오티드의 합성기술, 수식기술은 본 명세서 중에 인용되고 있는 특허문헌, 비특허문헌에 있어서도 사용되고 있고, 그 밖에도 다수의 보고가 확인되는 공지의 기술이다.

상기한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 의약으로서의 사용을 목적이라고 한 올리고뉴클레오티드 복합체의 형태이어도 좋다. 복합체란 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드와 그 밖의 물질(예를 들면, 사이토카인류나 펩티드, 단백질 또는 비단백질로 이루어진 항원이 포함됨)의 혼합물 및 결합체, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드를 도입한 콜로이드 분산계 또는 지질 베이스계를 사용해도 좋다. 콜로이드 분산계에는 고분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로크로스페어, 비드가 열거된다. 또한, 지질 베이스계로서는, 예를 들면 수중유형 유제, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜이 선택되어도 좋지만, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 적합한 실시형태로서는 상기 복합체가 면역자극 올리고뉴클레오티드를 매봉한 리포솜이다. 매봉이란, 리포좀의 지질막 표면과의 결합, 지질막 중으로의 도입, 또는 리포솜의 내강으로의 도입을 나타낸다. 또한, 리포솜은 특정 기능 분자, 예를 들면 모노클로날 항체, 당, 당지질 또는 단백질에 의해 수식 또는 결합되어 있어도 좋다.

리포솜을 구성하는 지질로서는 리포솜을 구성하기 위해서 공지되어 있는 임의의 상용 지질을 단독으로 또는 복수 조합시켜서 사용할 수 있다. 예를 들면, 천연물, 예를 들면 난황, 대두 또는 기타의 동식물로부터 얻어지는 지질, 이들 지질을 수소첨가에 의해 불포화도를 저하시킨 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예 를 들면 스테롤류(예를 들면, 콜레스테롤), 포스파티딜에탄올아민류(예를 들면, 디 팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민), 포스파티딜이노시톨류, 포스파티딜콜린류(예를 들면, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린), 포스파티딜 글리세롤류, 포스파티딜세린류(예를 들면, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린), 포스파티드산류(예를 들면, 디 팔미토일 포스파티드산, 디스테아로일 포스파티드산), 스핑고미엘린류나 카르디올리핀 등이 열거되지만, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다.

리포솜의 제조는 공지의 방법을 사용한다. 와류법 및 초음파법이 일반적이지만, 그 밖에 에탄올 주입법, 에테르법, 메카노케미컬법, 가온법, 지질 용해법 및 역상 증발법 등을 적용할 수 있고, 이들을 조합하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, 와류법 및 초음파법에 있어서는 소정의 지질을 유기용제, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 혼합물, 예를 들면 메탄올과 클로로포름의 혼합물에 용해한 후, 상기 유기용제를 증발 제거함으로써 지질의 박층을 얻는다. 이 때, 상기 지질을 각종 조합, 농도 비율로 유기용제에 용해함으로써, 다양한 리포솜을 제조하는 것이 가능하다. 다음에, 이 지질의 박층에 수성 매체를 첨가하여 와류 처리 또는 초음파 처리함으로써 리포솜이 형성된다. 이 때, 상기 수성 매체에 리포솜 내에 매봉하는 물질을 혼입, 예를 들면 용해 또는 현탁시켜 둠으로써 물질을 리포솜에 매봉할 수 있다. 수성 매체에 용해되는 매봉 물질의 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 단백질에 있어서는 0.00375~375mg/mL, 면역자극 올리고뉴클레오티드에 있어서는 0.5㎍~5000㎍/mL인 것이 바람직하다. 또한, 일반적으로는 리포솜 입자지름 으로서는 0.01~10㎛의 범위내인 것이 바람직하다.

상기 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 각종 용도의 의약의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 실시형태의 하나의 바람직한 적응증으로서는 알레르기 질환이 열거된다. 알레르기 질환이란 화분, 진드기, 개나 고양이 등의 동물, 음식물, 하우스 더스트 등에 유래하는 항원 물질을 기인으로 해서 비염, 결막염, 피부염, 천식 등의 염증을 증상으로 하는 질환이다. 더욱 적합한 실시형태로서는 상기 알레르기 질환 중, 특히 화분 알레르기증의 치료 또는 예방제의 유효성분으로서의 용도를 열거할 수 있다. 화분 알레르기란 특히 삼나무 화분 유래의 단백질을 항원으로 하는 알레르기가 일반적이지만, 항원이 노송나무, 자작나무, 오리나무, 두드러기쑥, 쑥, 오리새 등의 다른 화분 유래 물질이어도 좋다.

예를 들면, 삼나무 화분 항원에서 감작한 마우스의 비세포를 삼나무 화분 항원으로 자극하면 통상은 항원 특이적인 Th2 응답의 지표가 되는 IL-5나 IL-4의 산생이 유도되어 Th1 응답의 지표가 되는 IFN-γ의 산생 유도는 확인할 수 없지만, 삼나무 화분 항원과 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드로 동시에 자극하면 IFN-γ가 효과적으로 유도되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 마우스에 처치한 후에, 항원과 알룸의 혼합액에서 Th2 반응을 야기하면, 혈청 중의 항원 특이적인 IgE의 산생이 억제되어 항원 특이적인 IgG2a가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 시험방법은 감작 및 치료용으로 처치하는 항원에 천식유발 항원을 사용했을 경우, 천식의 치료 효과를 확인할 수 있다.

따라서, 상기 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 각종 알레르기에 대 하여 높은 치료, 예방 효과를 나타낸다.

상기 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 단제로의 사용이나 상기한 알레르겐과 함께 사용해서 감감작 요법의 치료제로서의 사용도 가능하다.

또한, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 인간 세포의 IgE 산생을 억제하는 작용을 갖는다. 이러한 작용을 확인하기 위한 수단으로서, 체외에서의 IgE 산생의 억제활성을 평가하는 시험의 구체적 방법을 이하에 나타낸다. 상기 방법에 의해 인간 혈액으로부터 단리한 PBMC를 10% FCS를 넣은 RPMI1640 배지에서 1mL당 4.0×10⁶개의 세포가 포함되도록 조제한 후, 평평한 바닥의 96구멍 마이크로플레이트에 1웰당 4.0×10⁵개의 세포를 뿌리고, 인간 IL-4와 항 CD40 항체와 함께 면역자극 올리고뉴클레오티드를 첨가해서 14일간 자극하여 배양 상청을 회수한다. IgE의 산생량은 ELISA법으로 정량한다.

상기 발명의 실시형태의 하나의 바람직한 적응증으로서는 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 보조제로서 함유하는 백신이어도 좋다. 백신의 사용가능한 질환은 감염증 및 알레르기증이다. 감염증이란 바이러스, 세균, 진균, 및 원충 등을 원인으로 하여 발병하는 질환이지만 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 통상, 백신이란 환자에 투여하여 활성의 면역을 생성한다, 감염성 인자, 감염 인자가 있는 부분, 또는 동식물 유래의 인자를 함유하는 항원성 현탁액 또는 용액을 말한다. 백신을 구성하는 항원성 부분은 단백질, 펩티드, 지질, 다당, 핵산 중 어느 것 이어도 좋다. 바람직한 실시형태로서는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 면역자 극 올리고뉴클레오티드와 상기 백신의 혼합액이다. 또한, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 상기 백신의 항원성 부분의 복합체이어도 좋다.

또한, 실시형태의 하나의 바람직한 적응증은 간염, 구체적으로는 면역계의 활성화를 수반한 간염, 비바이러스성 간염 및/또는 바이러스성 간염이며, 더욱 바람직하게는 HBV 및/또는 HCV 감염에 의한 B형 간염 및/또는 C형 간염이다.

본 명세서의 HBV 및/또는 HCV 감염의 증상에는 급성 및 만성 간염을 성인으로 하는 증상이 포함된다. 바이러스성 간염의 임상증상은 황달, 복통, 권태감, 구역질 및 구토, 및 간염에 관계되는 임상적/검사 소견, 간효소 레벨의 상승(예를 들면, 알라닌·아미노트란스페라제(ALT), 아스파르트산 아미노트란스페라제(AST), 및/또는 락트산 데히드로게나제(LDH)), 빌리루빈의 상승, HCV 바이러스 혈증 또는 항원 레벨, 문맥압 항진증 및 식욕부진 등의 상승을 포함하지만 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 B형 간염 및/또는 C형 간염의 치료 효과는 상기한 임상 증상(예로서 황달, 권태감, 복통), 간염 관련의 검사소견(예로서 혈중 간효소 레벨), 바이러스 증폭 및 복제, 또는 바이러스의 양(역가)을 지표로 하여 평가할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 치료를 행하지 않은 개체와 비교하여, 본 발명에 의한 면역자극 올리고뉴클레오티드를 이용하여 치료를 한 개체는 B형 간염 및/C형 간염의 임상증상의 소실, 관해, 개선 또는 증상의 정도의 경감, 또한 이환 기간의 단축을 기대할 수 있다. 간염 관련 검사소견이나 바이러스 복제 및 바이러스 양에 관해서도 치료 효과로서 반영될 수 있다. 바이러스 역가의 감소 는 감염 부위 또는 개체로부터의 바이러스의 배제를 포함한다.

평가방법으로서는 증상의 검출, 임상검사에 의한 간기능의 계측, 간생검, 간문맥압의 직접적 또는 간접적 계측, 및 바이러스 입자, 바이러스 핵산 또는 바이러스 항원 역가의 계측, 그리고 항바이러스 항체의 검출 및 계측을 포함하는 본 기술분야에 알려진 어느 하나의 수단이 선택될 수 있다. 복통 및 권태감 등의 자각적인 신체적 증상은 증상의 유무에 따라 판정하고, 황달은 정성 베이스, 빌리루빈의 혈중 또는 혈청중 레벨의 계측에 의해 정량화한다. 간염에 관한 검사소견, 예를 들면 혈액 또는 혈청중의 간효소는 AST 및 ALT 양은 혈액학적, 혈액 생화학적 및 조직학적 시험에 의해 계측한다. 혈액 또는 혈청 샘플 중의 바이러스 역가는 해당 기술영역에 있어서의 주지의 방법, 예를 들면 바이러스 입자의 정량화(예를 들면, 분리 및 가시화에 의할지 또는 DNase 저항성 입자의 분석), 혈액 또는 혈청 샘플 중의 바이러스 항원의 검출(ELISA법에 의한 항원량의 정량화), 혈액 또는 혈청 샘플 중의 항바이러스 항체의 검출, 또는 바이러스 핵산(RNA 및 DNA)의 검출(HCV 유전자 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭 또는 바이러스 특이적 프로브를 사용한 인시튜(in situ) 하이브리다이제이션)에 의해 계측한다. 간조직 생검에 있어서도 상기 방법으로 평가가능하다.

상기 발명의 치료제의 치료대상은 척추동물, 바람직하게는 표유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 인간 이외의 척추동물은, 예로서 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 원숭이, 래트 또는 마우스가 있지만, 반드시 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 HBV 및/또는 HCV 감염의 가능성이 있는 개체(예로서는 신체적 증상이 없을 경우나 HCV 캐리어인 모체 내의 태아), HBV 및/또는 HCV 감염이 확인된 개체, 상기한 B형 간염 및/또는 C형 간염의 임상증상을 수반하는 개체(예를 들면, 만성 간염이나 초기 감염 또는 만성 감염후의 재발 등에 의한 급성 간염을 포함함)에 투여될 수 있다. HBV 및/또는 HCV 감염 또는 그 증상의 정도에 따라, 면역자극 올리고뉴클레오티드의 투여는 여러 횟수로 된다. 또한, 면역자극 올리고뉴클레오티드를 사용한 치료는 인터페론 요법 등의 치료(및 그 효과)가 불충분했던 개체 또는 실패로 끝난 개체에도 사용할 수 있을 수 있다. 또한, 면역자극 올리고뉴클레오티드는 단회 또는 복수회 투여될 수 있다.

이러한 알레르기 질환 또는 간염의 예방·치료제로서 사용할 경우, 투여 경로는 특별하게 한정되지 않지만, 피하 주사, 피내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 환부 조직으로의 주입, 경구 투여, 경비 투여, 경안 투여 등, 경인두 투여, 경폐 투여, 경피 투여, 설하 투여 등이 바람직하다. 또한, 투여량은 환자의 증상, 치료 목적, 투여 경로 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 성인 1일당 올리고뉴클레오티드량으로서 0.1pmo1~10㎛ol, 바람직하게는 1pmo1~1㎛ol 정도이다. 보조제로서 사용할 경우의 투여량도 투여 목적, 투여 경로 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 상기와 같은 정도의 투여량이 좋다. 또한, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 통상 채용되는 제형을 제제하는 주지의 제제방법에 의해 제제된다.

또한, 이들 면역자극 올리고뉴클레오티드는 알레르기 질환의 치료 또는 예방제, 백신의 보조제 또는 간염의 치료 또는 예방제로서의 사용, 알레르기 질환의 치 료 또는 예방방법, 백신에 대한 보조제로서 이용하는 방법 또는 간염의 치료 또는 예방방법으로서도 사용할 수 있다.

실시예

이하에, 실시예를 상세하게 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 이하의 설명문 중에서 사용되고 있는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 서열의 약호 및 특성은 서열표에 기재되어 있다. 또한, 실시예 중에 기재되어 있는 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 서열, 약호 및 특성은 표 1에 나타냈다.

실시예 1: 인간 PBMC에 있어서의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 IFN 유도 활성에 필수인 5' 말단측 폴리G 서열의 염기수의 비교

각종의 염기수로 이루어진 폴리G 서열을 삽입한 CpG 올리고뉴클레오티드를 합성하여 IFN 유도 활성에 필수인 길이에 대해서 검토했다. 토쿠나와 외가 나타내고 있는 팔린드롬 서열 CGATCG(일본 특허공개 평4-352724호 공보의 서열 49 및 서열 15)를 포함하는 팔린드롬 서열 TGCCGATCGGCA의 외측의 양말단 또는 5' 말단측에만 포스포로티오에이트 수식된 폴리G 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 삽입한 면역유도 올리고뉴클레오티드 20종을 구축하였다(서열번호 1~20). 또한, Mod2(서열번호 1) 및 Mod33(서열번호 5)에 관해서는 국제공개 2006/035939 팜플릿에 IFN 유도 활성을 갖는 것이 나타내져 있다. 그리고, 이들 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 중 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 및 IFN-γ 산생의 유도 활성을 갖는 것을 스크리닝하였다(도 1a~도 1f, 표 2). IFN-α 및 IFN-γ 유도 활성의 평가는 인간 PBMC로부터의 IFN-α 및 IFN-γ의 체외에서의 유도 활성을 평가하는 시험의 구체적 방법으로서 나타낸 순서 및 조건에 따라서 각각 24시간 자극 및 7일간 자극한 배양 상청 중의 산생량을 베이스로 평가했다.

표 2에 표시된 IFN 산생량은 면역자극 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)에서의 값이다. 도 및 표 중의 서열 중의 소문자는 포스포로티오에이트 수식 염기를 나타낸다.

도 1a 및 도 1b는 Mod2(서열번호 1: 레인 2), Mod52(서열번호 2: 레인 3), Mod51(서열번호 3: 레인 4), Mod42(서열번호 4: 레인 5), Mod53(서열번호 6: 레인 6), Mod54(서열번호 7: 레인 7), Mod56(서열번호 8: 레인 8), Mod40(서열번호 9: 레인 9), 및 Mod55(서열번호 10: 레인 10)의, 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)일 때의 IFN-α 산생량, 및 동 농도가 300nM(최종 농도)일 때의 IFN-γ 산생량의 결과를 각각 나타낸다. IFN-α 유도 활성(표 2 및 도 1a)에 관해서, 3' 말단에 폴리G 서열이 3염기(N=3)인 군(도 1a, 레인 3~7)에서는 5' 말단에 폴리G 서열이 6염기 이상(M은 7 이상) 가진 것의 활성이 높았다(레인 6 및 7). 또한, 3' 말단에 폴리G 서열이 2염기(N=2)인 군(레인 8~10)에서는 5' 말단에 폴리G 서열을 6염기 이상 갖는 것의 활성이 높았다(레인 9, 10). 또한, 전형적인 D-타입 CpG 서열의 구조(M=2/N=6, 레인 2)를 갖는 Mod2와 비교하여, Mod52(M=3/N=3, 레인 3), Mod51(M=4/N=3, 레인 4) 및 Mod42(M=5/N=3, 레인 5)의 활성은 감약 또는 완전히 소실되므로, Mod2의 폴리G 서열 중 4 내지 6의 수 염기를 변환한 서열을 설계하는 것만으로는 반드시 증강된 IFN-α 유도 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드가 얻어지는 것은 아닌 것이 판명되었다. IFN-γ 유도 활성(도 1b) 에 관해서도, Mod56(서열번호 8, M=5/N=2, 레인 8)을 제외하고는 같은 경향이었다. 특히, Mod53(M=7/N=3, 레인 6), Mod54(M=8/N=3, 레인 7) 및 Mod55(M=7/N=2, 레인 10)의 IFN-γ 유도 활성은 3' 말단의 폴리G 서열의 길이가 6염기인 Mod2 보다도 유의하게 향상되었다(t검정: P<0.01). 이 결과는 올리고뉴클레오티드의 IFN 유도 활성은 5' 말단측에 의존하고, 적어도 6염기 이상의 길이의 폴리G 서열이 필요한 것을 나타내고 있다.

다음에, 5' 말단의 폴리G 서열의 길이와 IFN 유도 활성과의 관련에 대해서 명백하게 하기 위해서, 20염기까지의 폴리G 서열을 5' 말단에 삽입한 올리고뉴클레오티드에 대해서 IFN 유도 활성을 평가한 (도 1c 및 도 1d). 도 1c 및 도 1d에는 Mod2(레인 1), Mod61(서열번호 15: 레인 2), Mod62(서열번호 16: 레인 3), Mod63(서열번호 17: 레인 4), Mod64(서열번호 18: 레인 5), Mod65(서열번호 19: 레인 6), 및 Mod66(서열번호 20: 레인 7)의 올리고뉴클레오티드의 농도가 300nM(최종 농도)일 때의 IFN-α 산생량과 IFN-γ 산생량을 각각 나타낸다. 그 결과, 농도 300nM에 있어서, 8염기까지의 폴리G 서열을 가지지만 IFN-α 유도 활성은 유의하게 향상되고(도 1c, M=6~8/n=0, 레인 2~4), 염기수 10의 폴리G 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(M=10/N=0)는 Mod2를 약간 상회하는 활성을 나타내었다(도 1c, 레인 5). 한편, 12염기 이상(M=12 또는 20/N=0)에서는 거의 활성이 소실되었다(레인 6, 7). 또한, IFN-γ 유도 활성은 IFN-α 유도 활성과 같은 경향이었지만, 폴리G 서열이 12염기 이상에서도 종래의 D-타입 CpG 서열의 Mod2와 같은 정도의 활성이었다(도 1d, 레인 1, 6, 7).

또한, 3' 말단의 폴리G 서열의 염기수와 IFN 유도 활성의 관련에 대해서 평가했다. 도 1e 및 도 1f에는 Mod2(레인 2), Mod50(서열번호 14: 레인 3), Mod49(서열번호 13: 레인 4), Mod40(레인 5), Mod41(서열번호 11: 레인 6)의 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)일 때의 IFN-α 산생량과, 동 농도가 300nM(최종 농도)일 때의 IFN-γ 산생량을 각각 나타낸다. 5' 말단의 폴리G 서열의 길이를 2염기(Mod2:M=2/N=6, 레인 2)로부터 6염기(Mod50:M=6/N=6, 레인 3)로 하면 Mod55(M=7/N=2, 도 1a 및 도 1b의 레인 10 참조)와 동 정도로 IFN-α 및 IFN-γ의 산생량이 증가하였다(표 2, 도 1e 및 1f). 5' 말단측에 6염기의 폴리G 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(M=6/N=0~6)의 IFN-α 유도 활성은 3' 말단측의 폴리G 서열의 길이에도 의존하는 경향을 나타냈지만, 완전하게 소실하는 않고 Mod2를 초과하여 있었다(도 1e, 레인 3~6). 또한, 각 올리고뉴클레오티드의 농도 300nM에 있어서의 IFN-γ 유도 활성은 모두 Mod2를 초과하여 있었다(도 1f, 레인 2~6).

이상의 결과로부터, 5' 말단측의 폴리G 서열의 염기수(M)가 6 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8일 경우, 3' 말단측에 폴리G 서열이 전혀 없는 올리고뉴클레오티드(M=6~8/N=0)이어도, 상기 식중의 PXCGYQ 부분이 동일한 종래의 D-타입 CpG 서열 보다도 증강된 IFN 유도 활성을 갖는 것을 확인했다.

실시예 2: 마우스 J774 세포에 있어서의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 염증성 사이토카인 유도 활성에 필수인 3' 말단측 폴리G 서열의 염기수의 비교

5' 말단측에 길이가 6염기인 폴리G 서열을 삽입한 면역자극 올리고뉴클레오티드에 대해서, 상술한 마우스 J774 세포의 IL-12p40 산생 유도의 유무를 확인하는 수단으로서의 체외에서의 유도 평가시험을 했다. 즉, J774 세포주를 각 올리고뉴클레오티드로 48시간 자극하여 배양 상청 중의 염증성 사이토카인 IL-12(IL-12p40)의 산생량을 평가했다. 그 결과, (Mod50(레인 2), Mod49(서열번호 13: 레인 3), Mod48(서열번호 12: 레인 4), Mod33(서열번호 5: 레인 5), Mod40(레인 6), Mod41(레인 7))의 각각의 최종 농도 300nM에 있어서의 IL-12p40의 산생은 3' 말단측의 폴리G 서열의 염기수가 4 이상(M=6/N=4~6: 레인 2~4)으로 유도되었지만, 3 염기 이하(M=6/N=0~3: 레인 5~7)에서는 전혀 활성이 확인되지 않았다(도 2).

이상의 결과로부터, 3' 말단측의 폴리G 서열이 3염기 이하의 올리고뉴클레오티드는 5' 말단측에 6염기의 폴리G 서열이 삽입되어 있어도 염증성 사이토카인 유도 활성이 저감 또는 소실되는 것을 확인했다.

실시예 3: 팔린드롬 모티브로서 CGATCG, ATCGAT 및 GACGTC를 갖는 서열을 포함하는 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 등 및 D-타입 CpG 올리고뉴클레오티드의 인간 PBMC에 있어서의 IFN 산생 유도 효과의 비교

식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'의 P가 T(티민), Q가 A(아데닌)이며, XCGY가 10염기인 6종의 팔린드롬 모티브에, 각각 폴리G 서열이 5' 말단측에 6염기와 3' 말단측에 3염기를 삽입한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드(G6-PXCGYQ-G3, M=6/N=3), 및 폴리G 서열이 5' 말단측에 2염기이고 3' 말단측에 6염기 삽입한 D-타입 CpG 서열(D-type CpG: G2-PXCGYQ-G6, M=2/N=6)을 합성하여 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성을 평가했다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 팔린드롬 모티브는 서열표, 도 3a, 및 3b, 및 3c 중에 나타내고 있고, Mod29(서열번호 21) 및 Mod43(서열번호 22)은 레인 1의 CCCGATCGGG, Mod37(서열번호 23) 및 Mod44(서열번호 24)은 레인 2의 TCCGATCGGA, Mod38(서열번호 25), 및 Mod45(서열번호 26)은 레인 3의 GGCGATCGCC, Mod39(서열번호 27) 및 Mod46(서열번호 28)은 레인 4의 GACGATCGTC, D19(서열번호 29) 및 Mod47(서열번호 30)은 레인 5의 GCATCGATGC이다. 또한, 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 평가는 상기 올리고뉴클레오티드를 사용한 것 이외는 실시예 1과 같은 순서 및 조건에서 행했다.

농도 100nM에 있어서의 D-타입 CpG와 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드등의 활성을 측정한 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드(도 3a, G6-PXCGYQ-G3)는 평가한 모든 팔린드롬 모티브에 있어서 D-타입 CpG(G2-PXCGYQ-G6) 보다도 IFN-α의 유도 활성이 항진하여 D-타입 CpG의 1.4~74.5배의 범위로 증강되었다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드의 농도 100nM에 있어서의 IFN-γ 산생 유도 활성에 관해서도 IFN-α와 같은 경향을 나타냈다(도 3b).

또한, 상기 식중의 P가 A(아데닌), Q가 C(시토신) 또는 T(티민)이며, 8염기의 팔린드롬 모티브 CGACGTCG를 포함하는 2종의 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 D-타입 CpG의 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 유도 활성을 평가했다. 그 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 Mod71(서열번호 40, M=7/N=2)과 Mod73(서열번호 42, M=6/N=2)은 농도 300nM에 있어서 각각의 D-타입 CpG 서열인 Mod70(서열번호 39, M=3/N=6)과 Mod72(서열번호 41, M=2/N=6) 보다도 활성이 현저히 증강되었다(도 3c).

이들 결과는, 본 발명의 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 갖는 폴리G 서열의 삽입 양식이 특정 팔린드롬 구조에 비의존적으로 IFN 유도 활성을 증강시키는 것을 나타내고 있다.

실시예 4: 팔린드롬 모티브로서 CGATCG를 갖는 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 산생 유도 효과

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 최적의 서열에 대해서 검토했다. M=7 또한 N=2이며, XCGY가 GACGATCGTC인 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 P와 Q에 대해서 더욱 검토했다. P가 A(아데닌) 또한 Q가 T(티민)인 올리고뉴클레오티드(Mod83,서열번호 51), P가 T 또한 Q가 A인 올리고뉴클레오티드(Mod84, 서열번호 48), P와 Q가 함께 A인 올리고뉴클레오티드(Mod85, 서열번호 50), P가 C 또한 Q가 A인 올리고뉴클레오티드(Mod87, 서열번호 52)를 합성했다. 실시예 3에서 발견 한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 중에서도 특히 강한 IFN 유도 활성을 갖는 Mod46과 이들 올리고뉴클레오티드의 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 유도 활성에 대해서 비교 평가했다. 또한, 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 평가는 상술한 올리고뉴클레오티드를 사용한 것 및 IFN-α만을 측정한 것 이외는 실시예 1과 같은 순서 및 조건에서 행했다.

그 결과, 올리고뉴클레오티드의 농도 100nM에 있어서, Mod83, Mod84, Mod85 및 Mod87은 Mod46과 같은 정도의 IFN-α 유도 활성을 나타냈다(도 4). 이 결과는, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 P와 Q가 G 이외의 염기, 즉 A, T 및 C 중 어느 것이어도 좋고, 서로 상보적인 뉴클레오티드가 아니어도 강한 IFN-α 유도 활성을 갖는 것을 나타내고 있다.

실시예 5: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 G9-GACGATCGTC-G1 및 G7-GACGATCGTC-G3의 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 비교

본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 일본 특허공개 2005-237328호 공보에 있어서 강한 IFN-α 유도 활성을 갖는 서열로서 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 UG9-GACGATCGTC-Gl(서열번호 36) 및 G7-GACGATCGTC-G3(서열번호 98)의 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성을 비교했다.

G9-GACGATCGTC-G1 및 G7-GACGATCGTC-G3과 최근사의 서열을 갖고, 포스포로티오에이트 수식하지 않은 본 발명의 면역자극 올리고 올리고뉴클레오티드인 Mod92(서열번호 97) 및 Mod93(서열번호 95)을 합성하여, 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 유도 활성을 비교했다(표 3 및 표 4). 또한, 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 평가는 상술한 올리고뉴클레오티드를 사용한 것 이외는 실시예 1과 같은 순서 및 조건에서 행했다.

그 결과, Mod92 및 Mod93은 G7-GACGATCGTC-G3 및 G9-GACGATCGTC-G1에 비해서 높은 IFN-α 유도 활성을 나타냈다.

인간 PBMC로부터의 IFN-α 산생

CpG	서열 5'--3'	IFN-α(pg/mL)
Mod92	GGGGGGTGACGATCGTCGGG	3263.3±424.5
G7-GACGATCGTC-G3	GGGGGGGGACGATCGTCGGG	2515.1±307.0

표 3에 표시된 IFN 산생량은 면역자극 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)에서의 값이다. 모든 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에테르 수식 염기를 사용하고 있지 않다.

인간 PBM으로부터의 IFN-α 산생

CpG	서열 5'--3'	IFN-α(pg/mL)
Mod93	GGGGGGGGCGACGATCGTCG	2442.5±171.4
G9-GACGATCGTC-G1	GGGGGGGGGGACGATCGTCG	684.0±277.9

표 4에 표시된 IFN 산생량은 면역자극 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)에서의 값이다. 모든 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 수식 염기를 사용하지 않고 있다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 수식되어 있지 않아도 강한 IFN-α 유도 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다. 또한, 일반식에 있어서의 P와 Q가 G 이외의 염기인 것의 중요성이 나타났다. 따라서, GACGATCG 등의 우수한 IFN-α 유도 활성을 나타내는 팔린드롬 서열과 폴리G 서열 사이에 적어도 1염기의 뉴클레오티드를 삽입함으로써, IFN-α 유도 활성이 더욱 향상되는 것이 나타났다.

실시예 6: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 G9-GACGATCGTC-G1 및 G7-GACGATCGTC-G3의 인간 PBMC에 있어서의 IL-12 유도 활성의 비교

실시예 5에서 사용한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod93과 일본 특허공개 2005-237328호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 G9-GACGATCGTC-G1의 인간 PBMC에 있어서의 IL-12 유도 활성을 비교했다. 또한, 측정은 상술한 PBMC로부터의 IL-12의 체외에서의 유도 활성을 평가하는 시험의 구체적 방법에 따라 행했다.

그 결과, 본 발명의 Mod93은 IL-12의 산생을 전혀 유도하지 않고, 오히려 자극하지 않았던 대조와 비교해서 억제하는 경향을 나타냈다(표 5). 한편, G9-GACGATCGTC-G1은 약하나마 IL-12 산생의 증가가 확인되었다. 따라서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 인간에 있어서도 염증성 사이토카인의 유도 활성이 낮은 것이 나타났다.

표 5에 표시된 IL-12 산생량은 무자극(no CpG-ODN) 또는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 농도가 300nM(최종 농도)에서의 값이다. 모든 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 수식 염기를 사용하지 않고 있다.

면역자극 올리고뉴클레오티드의 단독 자극에서는 인간 말초혈 세포로부터의 현저한 IL-12 산생이 확인되지 않았으므로, 강력한 염증반응의 유도 인자인 엔도톡신의 리포폴리사카라이드(LPS)와 함께 자극하여 IL-12 산생에 미치는 영향을 평가했다. 즉, 상기한 방법에 따라서 단리한 PBMC를 10% FCS를 넣은 RPMI1640 배지에서 1mL당 2.0×10⁶개의 세포가 포함되도록 조제후, 둥근바닥의 96구멍 마이크로플레이트에 1웰당 2.0×10⁵개의 세포를 뿌리고, LPS와 면역자극 올리고뉴클레오티드의 공존하에서 24시간 처치해서 배양 상청을 회수하고, ELISA법으로 IL-12의 산생량을 정량했다. 면역자극 올리고뉴클레오티드는 Mod92, Mod93, G9-GACGATCGTC-G1 및 G7-GACGATCGTC-G3을 사용했다. 그 결과, 모든 면역자극 올리고뉴클레오티드에 있어서 LPS(50ng/mL) 자극으로 유도되는 IL-12 산생을 증강시키지 못하였다. 오히려, 그 산생을 억제하는 효과가 확인되고, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod93이 가장 강한 저해 활성을 나타냈다(표 6).

표 6에 표시된 IL-12 산생량은 LPS 존재하의 무자극(no CpG-ODN) 또는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 농도가 100nM(최종 농도)에서의 값이다. 모든 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 수식 염기를 사용하고 있지 않다.

이상의 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 인간에 있어서 염증성 사이토카인 유도 활성이 공지의 서열보다도 적고, 또한 항염증 작용을 갖는 것을 확인했다.

실시예 7: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 M26, M27, M26-GS, M27-GS, I1, 2006, 2395, 1018, C274, G9-GACGATCGTC-G1 및 D19의 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 비교

KR2001-0063153(대한민국 공개 특허)에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 M26(서열번호 37) 및 M27(서열번호 38)과 각각의 폴리G 서열의 뉴클레오티드 간을 포스포로티오에이트 수식한 M26-GS 및 M27-GS와, 실시예 1 및 3에서 발견된 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod55 및 Mod46의 IFN-α 유도 활성을 비교 평가했다. 또한, 본 실시예 5에서의 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 평가는 상술한 올리고뉴클레오티드를 사용한 것 및 IFN-α만을 측정한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서 및 조건에서 행했다. 그 결과, 올리고뉴클레오티드 농도 100nM에 있어서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드에 비해서 현저하게 높은 IFN-α 유도 활성을 나타냈다(도 5a).

다음에, 일본 특허공개 2005-237328호 공보에 있어서 강한 IFN-α 유도 활성을 갖는 대표적인 서열로서 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 G9-GACGATCGTC-G1(서열번호 36)과 실시예 1 및 3에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod53, Mod54, Mod55, Mod61, Mod62, Mod45, Mod46, Mod71 및 Mod73의 IFN-α 유도 활성을 비교 평가한 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 쪽이 농도 1μM에 있어서 높은 IFN-α 유도 활성을 나타냈다(도 5b).

또한, 일본 특허공표 평10-506265호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 I1과, 실시예 3에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod46과, Mod46과 동일한 팔린드롬 서열을 갖는 D-타입 CpG의 Mod39과, Mod33의 IFN-α 유도 활성을 비교 평가한 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 농도 30nM에 있어서 현저하게 높은 IFN-α 유도 활성을 나타낸 것에 반하여 다른 올리고뉴클레오티드는 거의 활성을 나타내지 않았다(도 5c).

또한, 국제공개 제00/61151호 팜플릿에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(D19), 일본 특허공표 2001-503267호 공보 및 국제공개 제1998/018810호 팜플릿에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(2006), 국제공개 제03/015711호 팜플릿에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(2395), 일본 특허공표 2002-517156호 공보 및 일본 특허공표 2002-500159호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(1018) 및 국제공개 제04/058179호 팜플릿에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(C274)과 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod46(서열번호 28)의 인간 PBMC의 IFN-α 유도 활성을 비교했다. 그 결과, 올리고뉴클레오티드 농도 100nM에 있어서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 가장 강한 IFN-α 유도 활성을 갖는 것을 확인하였다(도 5d).

이상의 결과, 공지의 CpG 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드보다도 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 쪽이 높은 IFN-α 유도 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.

실시예 8: 폴리G 서열과 팔린드롬 서열 GACGATCGTC를 갖는 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod46, Mod83, Mod85, Mod87과 공지의 CpG 올리고뉴클레오티드 G10, G3-6, G9-GACGATCGTC-G1, G1-GACGATCGTC-G9 및 2332의 인간 PBMC에 있어서의 IFN-α 유도 활성의 비교

팔린드롬 서열 GACGATCGTC의 외측에 폴리G 서열이 삽입된 공지의 CpG 올리고뉴클레오티드로서는 일본 특허공개 2005-237328호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 G9-GACGATCGTC-G1(서열번호 36) 및 G1-GACGATCGTC-G9(서열번호 55), 국제공개 제2005/014110호 팜플릿에 개시되어 있는 올리고뉴클레오티드 서열 G10(서열번호 56) 및 G3-6(서열번호 57)과, 일본 특허공표 2003-510290호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 2332(서열번호 58)가 있다. 여기에서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod46, Mod83, Mod85 및 Mod87과 상기 공지의 CpG 올리고뉴클레오티드의 IFN-α 유도 활성을 비교 평가했다. 또한, 인간 PBMC에 있어서의 IFN 유도 활성의 평가는 상술한 올리고뉴클레오티드를 사용한 것 및 IFN-α만을 측정한 것 이외는 실시예 1과 같은 순서 및 조건에서 행했다. 그 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 쪽이 올리고뉴클레오티드 농도 30nM에 있어서 높은 IFN-α 유도 활성을 나타냈다(도 6).

실시예 9: 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod2, Mod33, Mod39 및 Mod46의 마우스 비세포에 있어서의 사이토카인 산생 유도 활성의 비교

C57BL/6계통 유래의 마우스 비세포를 사용하여 실시예 1 및 3에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod46과, Mod33, D-타입 CpG인 Mod39 및 Mod2 사이에서 사이토카인 유도 활성을 비교 평가했다.

농도 100nM에 있어서의 D-타입 CpG와 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 IFN-γ 및 IL-10 유도 활성을 측정했다. 측정은 상술한 마우스의 비세포에 있어서의 IFN-γ 및 IL-10 산생 유도의 유무를 확인하는 구체적 수단으로서 열거한 순서 및 조건에 따라 행했다. 그 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod46의 IFN-γ 유도 활성은 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG인 Mod39 보다 증강하고 Mod33 보다도 크게 상회하고 있었다(도 7a). 한편, Mod33과 Mod46의 IL-10 유도 활성은 각각 Mod2나 Mod39의 유도 활성과 거의 동등했다(도 7b). 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 면역제어성 사이토카인 IL-10의 유도에 관해서는 염증성 사이토카인의 유도 메카니즘과 다를 가능성이 시사되었다.

이상의 결과는, 본 발명의 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 IL-10 유도 활성을 유지한 상태에서 팔린드롬 모티브 비의존적인 IFN 유도 활성이 증강하는 것을 나타내고 있다. 또한, 면역자극 활성은 CpG 서열에 의해 종특이성이 있지만, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 종차이에 영향을 주지 않고 IFN 유도 활성을 증강시키는 보편적인 구조인 것을 확인했다.

실시예 10: 본 발명의 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 J774 세포주에 있어서의 염증성 사이토카인 산생 유도 활성의 저감

실시예 3에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 등에 의한 염증성 사이토카인 산생의 유도 활성에 대해서 팔린드롬 모티브가 동일한 D-타입 CpG와 비교 평가했다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 팔린드롬 모티브는 서열표 및 도 8a 및 8b 중에 나타내져 있고, Mod37 및 Mod44는 레인 1의 TCCGATCGGA, Mod38 및 Mod45는 레인 2의 GGCGATCGCC, Mod39 및 Mod46은 레인 3의 GACGATCGTC이다. 또한, 평가는 상술한 마우스 J774 세포에 있어서의 IL-12와 TNF-α의 유도 활성을 평가하는 시험으로서 열거한 순서 및 조건에 따라 행했다. 그 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod44, Mod45 및 Mod46은 각각의 동일한 팔린드롬 서열을 갖는 D-타입 CpG의 Mod37, Mod38 및 Mod39과 비교하여, 농도 300nM에 있어서 IL-12(도 8a)와 TNF-α(도 8b)의 유도 활성이 모두 현저하게 억제되었다.

이상의 결과, 본 발명에서 발견한 폴리G 서열의 삽입 양식을 갖는 신규의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 동일한 팔린드롬 모티브로 이루어진 종래의 D-타입 CpG 보다도 저감된 염증성 사이토카인 유도 활성을 나타냈다.

실시예 11: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 2006, 2395, 1018 및 C274의 J774 세포주에 있어서의 TNF-α 유도 활성의 비교

실시예 8에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod46과 공지의 CpG 올리고뉴클레오티드의 TNF-α 유도 활성을 평가했다. J774 세포주에 각각의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 (최종 농도 300nM) 또는 양성 대조의 리포폴리사카라이드(LPS: 최종 농도 100ng/mL)로 8시간 자극 처치해서 배양 상청 중의 TNF-α 산생량을 측정했다. 그 밖의 순서 및 조건은 실시예 10과 같은 방법으로 했다. 그 결과, 실시예 4에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 2006(서열번호 31), 2395(서열번호 32), 1018(서열번호 33), C274(서열번호 34) 및 Mod39과 LPS와 비교하여, Mod46은 감약된 TNF-α 유도 활성을 나타냈다(도 9). 이것으로부터, 실시예 2 및 6에서 나타내는 결과도 고려하면, 3' 말단의 폴리G 서열의 염기수가 3염기 이하인 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 염증성 사이토카인의 유도 활성이 감약하는 것이 나타내졌다.

실시예 12: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87과 Mod39과 1018의 인간 PBMC에 있어서의 IgE 산생 억제 활성의 비교

실시예 8에서 발견한 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87과 공지의 CpG 올리고뉴클레오티드의 인간 IgE 산생 억제 활성을 상술한 체외에서의 IgE 산생의 억제 활성을 평가하는 시험의 구체적 방법으로서 나타낸 순서 및 조건에 따라서, 14일간 자극한 배양 상청 중의 산생량을 바탕으로 평가했다. 즉, PBMC를 10% FCS를 넣은 RPMI1640 배지에서 1mL당 4.0×10⁶개의 세포가 포함되도록 조제한 후, 평평한 바닥의 96구멍 마이크로플레이트에 1웰당 4.0×10⁵개의 세포를 뿌리고, 20ng/mL의 인간 IL-4와 0.2㎍/mL의 항CD40 항체와 함께 면역자극 올리고뉴클레오티드를 최종 농도가 30 또는 100nM이 되도록 첨가한 후, 14일간 자극해서 배양 상청 중의 IgE 산생량을 ELISA법으로 측정하였다(도 10).

그 결과, IL-4와 항CD40 항체로부터 유도되는 IgE 산생에 관해서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod87(도 10의 레인 5)은 국제공개 2006/035939 팜플릿에 나타나 있는 Mod2(도 10의 레인 3) 및 Mod39(레인 4), 일본 특허공표 2002-500159호 공보에 있어서 나타나 있는 1018(레인 6)이나 국제공개 제03/015711호 팜플릿에 나타나 있는 2395(레인 7)과 비교하여 IgE 산생량이 낮았다.

이상의 결과, 공지의 CpG 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드 보다도 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 쪽이 높은 IgE 산생 억제 활성을 갖고 있어, 인간의 알레르기 치료에 유효한 가능성을 나타냈다.

실시예 13: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 알레르기 모델 동물에 있어서의 IgE 산생 억제 효과의 확인

실시예 12에서 현저한 인간 IgE 억제 활성을 나타낸 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87의 알레르기 치료 효과에 대해서, 알레르겐에 특이적인 Th2반응을 마우스에 야기했을 때에 유도되는 혈청 중의 IgE량을 지표로 평가했다. 알레르겐은 삼나무 화분증의 알레르겐의 하나로서 알려진 삼나무 화분 항원 Cry j 1을 사용했다. Cry j 1의 정제는 공지의 방법(H. Yasueda et al. (1983) J. Allergey Clin. Immunol., 71, 77-86, M. Sakaguchi et al. (1990), 45, 309-312)에 준하여 행했다. 일본 특허공표 2002-517156호 공보에 있어서, 알레르기 치료효과를 향상시키는 수단으로서 항원과 면역자극 올리고뉴클레오티드를 근접화하는 방법이 개시되어 있다. 구체적으로는, 공유결합이나 리포솜 등의 마이크로캡슐을 사용한 방법이 있고, 국제공개 제2006/035939호 팜플릿에 있어서 Mod2와 Cry j 1을 봉입한 리포솜 복합체가 알레르겐에 폭로되었을 시에 유도되는 마우스의 혈중 IgE를 억제하는 것이 보고되어 있다. 이 IgE 억제 효과에 관해서는 공지의 CpG 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드에 비해서 강한 것이 확인되어 있다. 여기에서, 리포솜에 의한 근접화 기술을 이용하여 Mod87과 Mod2의 알레르기 치료 효과를 상기 시험방법에 의해 평가했다.

Cry j 1과 면역자극 올리고뉴클레오티드를 봉입한 리포솜 복합체의 조제는 이하와 같이 행했다. 또한, 음성 대조로서 면역자극 올리고뉴클레오티드를 봉입하지 않은 Cry j 1 봉입 리포솜 복합체를 조제했다. 콜레스테롤과 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)을 몰비로 1:1로 혼합하고, 클로로포름:메탄올(=2:1)액에 용해하고, 복숭아형 플라스크 내에서 지질 필름을 제작했다. 다음에, 지질 필름에 3.75mg/㎖의 Cry j 1 또는 Cry j 1과 10~20μM의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 혼합액을 첨가하고, 40℃에서 교반하여 리포솜을 제작했다. Mod87의 봉입량은 1조건(1xMod87)이며, Mod2에 관해서는 Mod87과 동 농도(1xMod2) 및 3배 농도(3xMod2)의 2조건에서 제작했다. 이들 리포솜을 정립장치의 압출기를 사용하여 1㎛의 필터에 0.2~1MPa의 범위에서 가압하면서 5회 정립을 행했다. 다음에, 리포솜액을 원심회법으로 얻은 후, PBS(-)로 3회 현탁, 원심, 상청제거함으로써 리포솜의 외측의 Cry j 1 및 면역자극 올리고뉴클레오티드를 제거했다. 얻어진 리포솜의 분석은 콜레스테롤량, Cry j 1, 면역자극 올리고뉴클레오티드의 측정을 각각 시판의 키트, 콜레스테롤 E 테스트와코(Wako Pure Chemical Co., Ltd., 439-17501), Modified Lowry Protein Assay Reagent Kit(Pierce, 23240), OliGreen ssDNA Quantitation Kit(Molecular Probes, O-11492)을 사용하여 행했다. 리포솜액의 Cry j 1이 1㎍당 1xMod87, 1xMod2 및 3xMod2의 양은 각각 4.751, 5.425, 및 16.867ng이었다.

이하의 실시예에서 나타내는 리포솜 복합체의 약기에 관해서는 아래와 같다. 「Cry j 1+1xMod2/L」이란 Cry j 1과 1xMod2의 조건에서 봉입한 리포솜 복합체이며, 「Cry j 1+3xMod2/L」이란 Cry j 1과 3xMod2의 조건에서 봉입한 리포솜 복합체이며, 「Cry j 1+1xMod87/L」이란 Cry j 1과 1xMod87의 조건에서 봉입한 리포솜 복합체이다. 「1x의 경우 」이란 Cry j 1이 1㎍당 면역자극 올리고뉴클레오티드를 약 5ng 함유하고 있는 것을 나타내고 있다. 「3x의 경우」란 Cry j 1이 1㎍당 면역자극 올리고뉴클레오티드를 1x의 3배량의 약 15ng 함유하고 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 「Cry j 1/L」이란 Cry j 1만을 리포솜에 봉입한 것이다. 또한, 「Cry j 1」이란 리포솜에 봉입하지 않고 Cry j 1을 직접 투여한 것을 나타낸다.

6주령의 BALB/c 마우스(Carles River Japan Inc.)에 각 피검물질을 1주간 간격으로 피검물질 투여 개시주를 0W로 하여 0, 1 및 2W의 3회 피내 투여(i.d.)를 했다. 피검물질은 Cry j 1, Cry j 1/L, Cry j 1+1xMod2/L, Cry j 1+3xMod2/L 및 Cry j 1+1xMod87/L을 Cry j 1 단백량이 1㎍/100μL이 되도록 PBS로 조제하고, 1회에 100μL씩 투여했다. 최후의 피검물질 처치로부터 1주간 후(3W)와 2주간 후(4W)의 2회에 걸쳐서 Cry j 1 및 알룸의 혼합액을 각 개체에 복강내 투여(i.p.)해서 Th2 반응의 야기를 행했다. 6W에 안저채혈하고, 혈액을 원심조작후 혈청으로하여 -20℃에서 동결보존했다. 얻어진 혈청은 Th2 반응의 지표인 혈청중 총 IgE량의 측정용 샘플로서 사용했다. 또한, 최후의 채혈후, 각 개체로부터 비장을 적출한 후, 각 개체의 비장을 적출해서 호모제네이트하고, 본 명세서 중 IFN-γ 및 IL-10산생 유도의 유무를 확인하는 구체적 수단 중에 기재되어 있는 조제방법에 따라서 비세포를 조제하였다(RPMI1640 배지, 10% 소 태아 혈청). 각 개체의 비세포 현탁액은 둥근바닥의 96구멍 멀티플레이트에 1웰당 4×10⁵ 세포가 되도록 뿌리고, Cry j 1 존재하(최종 농도 25㎍/ml)에서, CO₂ 인큐베이터 내에서 72시간의 배양을 행하고, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청 중의 IL-5(Th2 반응 지표)와 IFN-γ(Th1 반응 지표)를 ELISA법에 의해 측정했다.

6W의 혈청 중의 IgE량을 측정한 결과, Cry j 1 처치군의 IgE량은 비히클(vehicle) 투여군보다도 2배 이상 높은 값을 나타냈다. 또한, IgE량은 Cry j 1+1xMod87/L 처치군이 가장 낮고, Cry j 1+3xMod2/L, Cry j 1/L, Cry j 1+1xMod2/L의 순으로 낮은 값을 나타냈다(도 11). Cry j 1+1xMod2/L 투여군와 Cry j 1+1xMod87/L 투여군의 2군 간에서 통계 처리(t검정)를 행한 결과, IgE 산생량은 유의(P<0.05)하게 Cry j 1+1xMod87/L의 쪽이 낮았다.

다음에, 피검물질을 처치한 마우스의 Th2 반응 또는 Th1 반응의 유도를 확인하기 위해서, 마우스로부터 비장을 적출하고, Cry j 1 자극에 의해 배양 상청 중에 유도되는 비세포의 IL-5(Th2 반응 지표) 및 IFN-γ의 산생량을 측정하였다(도 12a). Th1 반응의 지표인 IFN-γ의 산생량을 측정한 결과, Cry j 1+1xMod87/L(14324.62pg±7444.07) 처치군이 가장 높고, 이어서 Cry j 1+3xMod2/L(3475.30pg±907.56)과 Cry j 1/L(1782.02pg±849.23)의 순으로 산생량이 증가하고 있었다. 또한, Cry j 1+1xMod87/L과 같은 면역자극 올리고뉴클레오티드량을 투여했음에도 불구하고, Cry j 1+3xMod2/L 처치군에서는 거의 산생이 확인되지 않았다.

다음에, IL-5의 산생량을 측정했다. 그 결과, Cry j 1/L은 전혀 IL-5의 산생을 억제하지 않았지만, 면역자극 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써 현저하게 감소했다. Cry j 1+1xMod87/L 투여군의 억제 활성이 가장 강했다. CpG 올리고뉴클레오티드와 Cry j 1을 내봉한 리포솜 복합체의 IL-5 억제 활성은 IFN-γ 유도 활성과 역상관하고, IgE 산생 억제 활성과 잘 상관하고 있었다. 또한, Cry j 1+1xMod2/L 투여군와 Cry j 1+1xMod87/L 투여군의 2군 간에서 통계처리(t검정)를 행한 결과, IL-5 산생량은 유의(P<0.05)하게 Cry j 1+1xMod87/L의 쪽이 낮았다(도 12b).

이들로부터, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 알레르겐을 봉입한 리포솜은 알레르겐에 폭로되었을 때의 Th2 반응 및 IgE 산생을 공지의 면역자극 뉴클레오티드와 알레르겐의 리포솜 내봉 알레르겐의 기술과 비교해서 보다 강력하게 억제하는 효과를 가져서 Th1 유도 활성을 강력하게 유도하는 것이 판명되었다.

이상의 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 동물을 사용한 알레르기 모델에 있어서 공지의 D-타입 CpG 올리고뉴클레오티드 보다도 IgE 산생 억제 활성, Th2 억제 활성과 Th1 유도 활성이 향상되어 있고, 또한 저용량에서 효과적인 치료 효과를 가지므로, 알레르기 질환을 가진 환자에 투여했을 경우 알레르기 질환의 치료 또는 예방제로서 유용한 것이 나타났다.

실시예 14: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 마우스에 있어서의 간염치료 효과

마우스의 간염 모델로서 일반적으로 이용되고 있는 콘카나발린 A(ConA) 유발 간염 모델을 이용하여 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드의 체내에서의 항염증효과에 대해서 평가했다. ConA 유발 간염 모델은 급격한 염증반응의 야기에 의한 간염을 발증하여 면역반응의 활성화를 동반하는 간염 모델로서 사용되고 있다. 또한, ConA 유발 간염 모델에 있어서 CpG 올리고뉴클레오티드를 평가한 시험(Abe et al., Fukushima J. Med. Sci. (2005)51, 41-49)에 있어서 K-타입 CpG인 1668(서열번호 108)이 역으로 간염의 증상을 악화시킨 결과를 나타낸 공지예가 있다. 또한, CpG를 함유하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 ConA 유발 간염 모델에 있어서 간염의 마커가 되는 ALT치의 상승을 억제했다고 하는 보고예는 개시되어 있지 않다.

ConA 유발 마우스 간염 모델의 조제와 혈청중 ALT치의 측정은 이하와 같이 하여 행했다.

5주령의 암컷의 BALB/c 마우스(Carles River Japan Inc.)를 사용했다. ConA를 투여하는 마우스는 투여 전일 저녁부터 ConA 투여 완료까지 절식으로 하고 ConA 투여 종료후에 급이를 재개했다. ConA를 투여하지 않는 군을 나이브(naive)군으로 했다. 면역자극 올리고뉴클레오티드는 ConA를 투여하는 3, 6, 24시간 전에 1회 행했다. 면역자극 올리고뉴클레오티드는 PBS(-)로 농도 10㎍/mL로 조정한 후, 100μL씩 마우스의 꼬리정맥 내에 주사했다. 한 마리당 1㎍를 투여했다. ConA는 용매에 생리식염수를 이용하여 농도 4mg/㎖로 조정한 후, 100μL 씩 마우스의 꼬리정맥 내에 투여했다. 한 마리당 0.4mg을 투여했다. ConA 투여로부터 24시간 후에 채혈하고, 얻어진 혈액을 10000rpm, 5분간 4℃에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 중의 ALT치는 FUJI Dry-Chem(DRI-CHEM 5500V, FujiFilm Co., Ltd.)으로 측정했다.

ConA 유발 간염 마우스 모델의 염증 야기로부터 24시간 후의 혈청중 ALT치의 상승을 평가한 결과(도 13), 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드인 Mod87(서열번호 52)은 처치 시간에 의존해서 혈청중 ALT치의 상승을 억제하였다(도 13, 레인 3~5). 3시간 전처치부터 ALT치 상승을 억제하는 경향이 확인되고(레인 5), 24시간 전처치는 혈청중 ALT치가 유의하게 낮고(레인 3), 비히클군에 있어서의 ALT치(레인 2)의 28.5%(t검정: p<0.05)이었다.

이상의 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 체내에 있어서 간염치료 효과를 갖는 것을 확인했다.

실시예 15: 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87과 2395, 1018 및 G9-GACGATCGTC-G1의 마우스에 있어서의 간염치료 효과의 비교

C형 만성 간염으로의 적용의 임상시험 중인 CpG10101과 동일 서열이며, 국제공개 제03/015711호 팜플릿 및 일본 특허공표 2006-515277호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(2395, 서열번호 32), 일본 특허공표 2003-526662호 공보에 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열(1018, 서열번호 33), 및 일본 특허공개2005-237328호 공보에 있어서 강한 IFN-α 유도 활성을 갖는 대표적인 서열로서 나타나 있는 올리고뉴클레오티드 서열 G9-GACGATCGTC-G1(서열번호 36)과 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87(서열번호 52)에 대해서, 마우스 ConA 유발 간염 모델을 사용한 간염치료 효과를 비교했다.

실시예 14에 나타나 있는 방법에 따라서, 면역자극 올리고뉴클레오티드의 간염치료 효과를 혈청중 ALT치의 상승의 억제를 지표로 평가했다. 우선, Mod87과 2395의 간염치료 효과를 비교 평가했다. 면역자극 올리고뉴클레오티드 1㎍을 ConA투여 6시간 전에 마우스에 처치하고, ConA에 의한 염증 야기후 24시간 후에 채혈해서 혈청 중의 ALT치를 측정했다. 그 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87(도 14a, 레인 3)은 유의하게 ALT치의 상승의 억제(t검정: p<0.05)하였지만, 2395(레인 4)는 전혀 효과가 없었다.

다음에, Mod87과 1018 및 G9-GACGATCGTC-G1의 간염치료 효과를 비교 평가했다. 면역자극 올리고뉴클레오티드 1㎍을 ConA 투여 24시간 전에 마우스에 처치하고, ConA에 의한 염증 야기후 24시간 후에 채혈해서 혈청 중의 ALT치를 측정했다. 그 결과, ALT치의 상승은 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드 Mod87(도 14b, 레인 3)이 가장 강하게 억제하고, 이어서 1018(도 14-2, 레인 4)과 G9-GACGATCGTC-G1(도 14b, 레인 5)의 순으로 억제 효과가 있었다. Mod87과 1018은 각각 ALT치 상승을 유의하게 억제(t검정, Mod87: p<0.01, 1018: p<0.05)하였지만, G9-GACGATCGTC-G1은 유의한 억제가 확인되지 않았다.

따라서, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG를 함유하는 공지의 면역자극 올리고뉴클레오티드보다도 강한 간염치료 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

실시예 6에 있어서의 인간 PBMC를 사용한 체외 비교시험으로부터, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 근사 서열보다도 IL-12의 산생을 억제하는 활성이 강한 것이 나타내어져, 체외 항염증 작용과 마우스의 간염치료 효과가 상관할 가능성이 보여졌다.

이상의 결과, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 우수한 인터페론 유도 활성 또한 저감된 염증성 사이토카인 유도 활성을 갖는 것에 더하여, 간염치료 작용을 갖는 것이 나타내어져, C형 간염의 환자에 투여했을 경우 C형 간염의 치료 또는 예방제로서 유용한 것이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> OSAKA UNIVERSITY Toray Industries, Inc. <120> Immune stimulating oligonucleotide and use thereof in pharmaceutical <130> PTRA-19361 <160> 108 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod2 <400> 1 ggtgccgatc ggcagggggg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod52 <400> 2 gggtgccgat cggcaggg 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod51 <400> 3 ggggtgccga tcggcaggg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod42 <400> 4 gggggtgccg atcggcaggg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod33 <400> 5 ggggggtgcc gatcggcagg g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod53 <400> 6 gggggggtgc cgatcggcag gg 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod54 <400> 7 ggggggggtg ccgatcggca ggg 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod56 <400> 8 gggggtgccg atcggcagg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod40 <400> 9 ggggggtgcc gatcggcagg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod55 <400> 10 gggggggtgc cgatcggcag g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod41 <400> 11 ggggggtgcc gatcggcag 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod48 <400> 12 ggggggtgcc gatcggcagg gg 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod49 <400> 13 ggggggtgcc gatcggcagg ggg 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod50 <400> 14 ggggggtgcc gatcggcagg gggg 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod61 <400> 15 ggggggtgcc gatcggca 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod62 <400> 16 gggggggtgc cgatcggca 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod63 <400> 17 ggggggggtg ccgatcggca 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod64 <400> 18 gggggggggg tgccgatcgg ca 22 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod65 <400> 19 gggggggggg ggtgccgatc ggca 24 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod66 <400> 20 gggggggggg gggggggggg tgccgatcgg ca 32 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod29 <400> 21 ggtcccgatc gggagggggg 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod43 <400> 22 ggggggtccc gatcgggagg g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod37 <400> 23 ggttccgatc ggaagggggg 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod44 <400> 24 ggggggttcc gatcggaagg g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod38 <400> 25 ggtggcgatc gccagggggg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod45 <400> 26 ggggggtggc gatcgccagg g 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod39 <400> 27 ggtgacgatc gtcagggggg 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod46 <400> 28 ggggggtgac gatcgtcagg g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> D19 <400> 29 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod47 <400> 30 ggggggtgca tcgatgcagg g 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2006 <400> 31 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2395 <400> 32 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1018 <400> 33 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> C274 <400> 34 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> I1 <400> 35 ggggtcaacg ttcagggggg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> G9-GACGATCGTC-G1 <400> 36 gggggggggg acgatcgtcg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M26 <400> 37 ggggggaaaa cgttcttcgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M27 <400> 38 ggggggggga aaacgttctt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod70 <400> 39 gggacgacgt cgtcgggggg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod71 <400> 40 gggggggacg acgtcgtcgg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod72 <400> 41 ggaacgacgt cgttgggggg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod73 <400> 42 ggggggaacg acgtcgttgg 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 43 gggggggagc cgatcggctg g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 44 gggggggagc cgatcggcag g 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 45 gggggggtgc cgatcggctg g 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 46 gggggggagc cgatcggccg g 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 47 gggggggcgc cgatcggccg g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod84 <400> 48 gggggggtga cgatcgtcag g 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-title <400> 49 gggggggtga cgatcgtctg g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod85 <400> 50 gggggggaga cgatcgtcag g 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod83 <400> 51 gggggggaga cgatcgtctg g 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod87 <400> 52 gggggggcga cgatcgtcag g 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 53 gggggggtga cgatcgttag g 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 54 gggggggcga cgatcgtcgg g 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> G1-GACGATCGTC-G9 <400> 55 ggacgatcgt cggggggggg 20 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> G10 <400> 56 gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> G3-6 <400> 57 ggggacgatc gtcgggggg 19 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2332 <400> 58 ggggacgatc gtcggggggg 20 <210> 59 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 59 cgatcg 6 <210> 60 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 60 atcgat 6 <210> 61 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 61 gacgtc 6 <210> 62 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 62 ccgatcgg 8 <210> 63 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 63 gcgatcgc 8 <210> 64 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 64 acgatcgt 8 <210> 65 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 65 catcgatg 8 <210> 66 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 66 gatcgatc 8 <210> 67 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 67 atcgcgat 8 <210> 68 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 68 gaacgttc 8 <210> 69 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 69 caacgttg 8 <210> 70 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 70 agcgcgct 8 <210> 71 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 71 acgtacgt 8 <210> 72 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 72 tagcgcta 8 <210> 73 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 73 acggccgt 8 <210> 74 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 74 cgacgtcg 8 <210> 75 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 75 cgtcgacg 8 <210> 76 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 76 gacgatcgtc 10 <210> 77 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 77 ggcgatcgcc 10 <210> 78 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 78 cgatcgatcg 10 <210> 79 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 79 gatcgcgatc 10 <210> 80 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 80 gcaacgttgc 10 <210> 81 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 81 gcatcgatgc 10 <210> 82 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 82 cagcgcgctg 10 <210> 83 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 83 gacgtacgtc 10 <210> 84 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 84 ctagcgctag 10 <210> 85 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 85 cccgatcggg 10 <210> 86 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 86 gacggccgtc 10 <210> 87 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 87 gccgatcggc 10 <210> 88 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 88 tccgatcgga 10 <210> 89 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 89 acgtcgacgt 10 <210> 90 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 90 acaacgttgt 10 <210> 91 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 91 acgacgtcgt 10 <210> 92 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 92 aacgtt 6 <210> 93 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> palindrome sequence <400> 93 agcgct 6 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 94 gggggggtga cgatcgtcgg g 21 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod93 <400> 95 ggggggggcg acgatcgtcg 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 96 ggggggggtg acgatcgtcg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mod92 <400> 97 ggggggtgac gatcgtcggg 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> G7-GACGATCGTC-G3 <400> 98 ggggggggac gatcgtcggg 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 99 gggggggtcg acgtcgtggg 20 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 100 gggggggtcg acgtcgtgg 19 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 101 gggggggacg acgtcgtgg 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 102 gggggggtcg acgtcgagg 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 103 ggggggggac gacgtcgtg 19 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 104 ggggggggtc gacgtcgag 19 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 105 gggggggacg acgtcgtcgg 20 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 106 ggggggggac gacgtcgtc 19 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non title <400> 107 gggggggtcg acgtcgaggg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1668 <400> 108 tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims

식: 5'-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3'[식중, C는 시토신이며, G는 구아닌이다. X 및 Y는 서로 독립한 0 내지 10 뉴클레오티드 길이이고 또한 4염기 이상의 연속한 구아닌을 포함하지 않는 임의의 서열이며, X+Y의 길이는 6 내지 20 뉴클레오티드 길이이다. XCGY는 길이가 적어도 8 뉴클레오티드 길이의 팔린드롬 서열을 포함하고, 길이가 8 내지 22 뉴클레오티드 길이이다. P 및 Q는 구아닌 이외의 서로 독립한 1 뉴클레오티드이며, M은 6 내지 10의 정수이고, N은 0 내지 3의 정수이다. 또한, X와 Y의 뉴클레오티드 길이는 반드시 같지 않아도 좋다.]으로 표시되는 염기서열로 이루어지고,

전체 길이가 16 내지 37 뉴클레오티드 길이인[단, 서열번호 5 기재의 염기서열(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)로 이루어진 것을 제외함] 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,

상기 M이 6 내지 8의 정수이고, 또한 전체 길이가 16 내지 35 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 XCGY의 길이가 9 또는 10 뉴클레오티드 길이이고, 또한 전체 길이가 17 내지 23 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 XCGY가 CGATCG(서열번호 59), ATCGAT(서열번호 60) 및 GACGTC(서열번호 61)에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 XCGY가 CGATCG(서열번호 59)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,

상기 CGATCG(서열번호 59)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 7, 9 내지 11, 및 15 내지 18, 22, 24, 26, 28, 48, 50 내지 52, 54, 95 및 97로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 4 항에 있어서,

상기 CGATCG(서열번호 60)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 30으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 4 항에 있어서,

상기 CGATCG(서열번호 61)를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가 서열번호 40 및 42로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,

서열번호 6, 7, 10, 15 내지 17, 24, 26, 28, 48, 50 내지 52, 95, 및 97로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

전체 또는 일부의 뉴클레오티드 잔기 간의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 10 항에 있어서,

5'-말단의 연속하는 G 서열의 뉴클레오티드 잔기 간의 적어도 일부의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

3'-말단의 뉴클레오티드 잔기 간의 적어도 일부의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 치료 또는 예방제.
제 14 항에 있어서,

상기 알레르기 질환이 화분 알레르기증인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 치료 또는 예방제.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 보조제로서 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 간염 치료 또는 예방제.
제 17 항에 있어서,

상기 간염이 바이러스성 간염인 것을 특징으로 하는 간염 치료 또는 예방제.
제 18 항에 있어서,

상기 바이러스성 간염이 B형 또는 C형 간염인 것을 특징으로 하는 간염 치료 또는 예방제.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 알레르기 질환의 치료 또는 예방제로서의 사용.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 백신의 보조제로서의 사용.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 간염 치료 또는 예방제로서의 사용.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티 드의 알레르기 질환의 치료 또는 예방방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드를 백신에 대한 보조제로서 이용하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역자극 올리고뉴클레오티드의 간염의 치료 또는 예방방법.