KR101268877B1 - 선천성 면역반응 및 자가면역의 억제를 위한 방법 및조성물 - Google Patents

선천성 면역반응 및 자가면역의 억제를 위한 방법 및조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 면역조절 폴리뉴클레오티드를 사용한 개체의 면역조절을 위한 방법을 제공한다.
폴리뉴클레오티드, 면역반응, 면역조절, 자가면역, TLR7/8, TLR9.

Description

선천성 면역반응 및 자가면역의 억제를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITION OF INNATE IMMUNE RESPONSES AND AUTOIMMUNITY}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2004년 9월 1일 출원된 미국 가특허출원 제60/606,833호의 이익을 주장하며, 이는 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다.
기술분야
본 발명은 면역조절 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이는 또한 면역반응을 조절하기 위한 폴리뉴클레오티드의 투여에 관한 것이다.
면역은 일반적으로 선천성 면역 또는 후천성 면역으로 분류될 수 있다. 선천성 면역반응은 통상적으로 감염 시 즉시 일어나서 감염성 질병에 대한 초기 방어벽을 제공하는 반면, 후천성 면역반응은 나중에 항원-특이적 작용세포의 발생 및 종종 장기간 보호 면역과 함께 일어난다. 선천성 면역반응은 지속적 보호 면역을 발생시키지는 않지만 나중에 발생하는 후천성 면역반응의 발생에서 역할을 하는 것처럼 보인다.
선천성 면역은 생식 계열 코딩 수용체를 사용하여 많은 병원균에 공통적인 특성을 인식하고 작용분자의 발현을 야기하는 신호전달을 활성화한다. 이들 작용분 자 중 일부는 결국 후천성 면역반응을 유도할 수 있다. Toll-유사 수용체(TLR)의 패밀리는 선천성 면역반응 신호화와 연관되어 있으며, 미생물의 리간드는 일부 포유동물 TLR에 대하여 확인되었다. 예를 들어, TLR2는 펩티도글리칸, 박테리아 리포펩티드 및 특정 형태의 지질다당체(LPS)와 상호작용하고, TLR3는 이중 가닥 RNA와 상호작용하며, TLR4는 LPS와 상호작용하고, TLR-5는 박테리아 플라젤린과 상호작용한다. 예를 들어, 문헌(Poltorak et al. (1998) Science 282:2085-2088; Akira et al. (2003) Immunol. Lett. 85:85-95; Alexopoulou et al. (2001) Nature 413:732-738; Hayashi et al. (2001) Nature 410:1099-1103)을 참조하라. TLR-7은 구아노신 유사체, 이미다조퀴놀린, 이미퀴모드 및 R-848과 같은 작은 항바이러스 화합물, 및 단일 가닥 바이러스 RNA에 의하여 활성화되고, TLR-8은 또한 R-848 및 단일 가닥 바이러스 RNA에 의하여 활성화된다. 예를 들어, 문헌(Lee et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651; Hemmi et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200; Jurk et al. (2002) Nat. Immunol. 3:499; Heil et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold et al. (2004) Science 303:1529-1531)을 참조하라. TLR-9는 박테리아 DNA 및 5'-CG-3' 서열을 함유한 면역조절 DNA와 같은 면역조절 핵산 분자를 인식하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌(Hemmi et al. (2000) Nature 408:740-745; Bauer et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9237-9242; Takeshita et al. (2001) J. Immunol. 167:3555-3558)을 참조하라. 게다가, 특정 TLR(예를 들어, TLR-1, TLR-2 및 TLR-6)은 그들의 미생물 리간드와 헤테로다이머화하고, 상호작용하며, 세포 활성화를 이끌어 TLP 패밀리의 리간드 레퍼트를 확장시 킬 수 있다. Ozinsky et al. (2000) J. Endotoxin Res. 6:393-396; Ozinsky et al. (2000) Proc. Natl. Acad. ScL USA 97:13766-13771.
메틸화되지 않은 5'-CG-3' 서열을 함유한 박테리아 DNA 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 면역자극 핵산(ISNA) 분자는 사이토카인 생산 및 수지상 세포와 대식세포 활성화와 같은 선천성 면역반응을 자극하여, 그 후 Th1 형 면역반응을 유도할 수 있다. 면역자극 핵산 분자는 포유동물 TLR 9 수용체와의 상호작용을 통한 면역반응 및 포유동물 TLR 9 수용체를 통한 신호화를 자극한다. Hemmi et al. (2000), 상기 참조. 포유동물 DNA는 명백하게는 CG 서열의 낮은 빈도 및 메틸화된 시토신을 가진 대부분의 CG 서열 때문에 일반적으로 면역자극 활성을 가지지 않는다. 따라서 포유동물 면역 시스템 세포는 TLR9 수용체를 통하여 자기 DNA와 박테리아 DNA를 구별하는 것처럼 보인다.
면역자극 핵산 분자는 관절염의 병인에 관련된다. 면역자극 핵산은 류마티즘성 인자(RF)로 알려진 자가항체의 부류를 생산하는 것들과 같은 자가반응 B 세포의 활성화의 역할을 하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 면역자극 핵산은 전신성 자가면역에서 역할을 하는 것으로 보인다. 게다가, 면역자극 핵산은 LPS의 독성을 증대시킬 수 있고 유전자 치료를 위한 벡터의 투여의 부작용에 기여할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Deng et al. (1999) Nature Med. 5:702-705, Leadbetter et al (2002) Nature 416:603-607, Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-4575, U.S. Pat. No. 6,225,292)를 참조하라.
선천성 면역반응의 원하지 않는 활성화를 포함한, 원하지 않는 면역 활성화 를 제어하는 전략을 식별할 필요가 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 및 공보는 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 이들 폴리뉴클레오티드를 사용한 개체의 면역반응을 억제하기 위한 방법, 및 특히, 사람에서 면역반응을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 면역조절 폴리뉴클레오티드(IRP)를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포하한 조성물을 포함한다. 본 조성물은 또한, 예를 들면 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 많은 다른 성분 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역조절 화합물(IRC)을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 면역조절 화합물 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 포함한다. 또한 조성물은 예를 들면 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 많은 다른 성분 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역계의 세포를 면역조절 서열(IRS)을 포함한 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한 면역반응을 억제하기 위한 방법을 제공하는데, 세포를 면역반응에 기여하는 세포로부터 반응을 억제하기에 효과적인 양으로 폴리뉴클레오티드와 접촉시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 개체에서 면역반응을 조절하는 데 충분한 양으로 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따른 면역조절은 선천성 면역반응의 원하지 않는 활성화와 연관된 장애로 고생하는 사람들을 포함한 개체에게 실시될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 개체에서 TLR7/8 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에게 TLR7/8 의존적 선천성 면역반응을 억제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 IRP 또는 IRC는 TLR7/8 부류의 IRS를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 개체에서 TLR9 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에게 TLR9 의존적 선천성 면역반응을 억제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 IRP 또는 IRC는 TLR9 부류의 IRS를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 개체에서 TLR9 의존적 사이토카인 생산 및 TLR7/8 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에게 TLR9 의존적 선천성 면역반응 및 TLR7/8 의존적 선천성 면역반응을 억제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 IRP 또는 IRC는 TLR7/8/9 부류의 IRS를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환을 가진 개체에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한, 자가면역 질환의 하나 이상의 징후를 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 투여는 SLE 및 류마티스 관절염을 포함한, 자가면역 질환의 하나 이상의 징후를 개선한다. 특정 구체예에서, SLE의 징후를 억제하는 데 효과적인 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물은 TLR7/8 부류 또는 TLR9 부류 또는 TLR7/8/9 부류의 면역조절 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환으로 진행할 위험이 있는 개체에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한, 자가면역 질환의 진행을 예방 또는 지연하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 투여는 자가면역 질환의 진행을 예방 또는 지연시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 염증 질환 또는 장애를 가진 개체에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한, 염증 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 투여는 염증 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 조성물은 만성 염증 질환 또는 장애의 증상을 개선하는 데 효과적이다.
다른 양태에서, 본 발명은 만성 병원균 감염 또는 질환을 가진 개체에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한, 만성 병원균 자극을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물의 투여는 말라리아 및 만성 바이러스 감염과 연관된 것을 포함한, 개체에서 만성 병원균 자극을 억제한다. 어떤 구체예에서, 만성 병원균 자극을 억제하기에 효과적인 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물은 TLR7/8 부류의 면역조절 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포 또는 형질세포모양 수지상 세포의 반응을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에 의하여 억제된 면역반응은 세포, 세포 성숙의 억제 및/또는 세포 증식의 억제에 의한 IL-6, IL-12, IFN-α 및/또는 TNF-α와 같은 사이토카인 생산의 억제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TLR9 의존적 세포 반응, TLR7/8 의존적 세포 반응, 및/또는 TLR7/8/9 의존적 세포 반응을 억제한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 일반적으로 (일반적으로 적합한 용기에) 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역조절 화합물을 포함하고, 개체의 면역조절시 면역조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역조절 화합물의 사용에 대한 설명서를 더 포함할 수 있다.
또한, 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿), 여기서 X1, X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1 = C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아니다. 올리고뉴클레오티드의 일부 구체예에서, X1은 C 또는 A이다. 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다:
GGNmX1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿), 여기서 각 m은 1부터 약 100까지의 정수 또는 1부터 약 20까지의 정수이고; 각 N은 뉴클레오티드이며, X1, X2 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아니다. 올리고뉴클레오티드의 일부 구체예에서, X1은 C 또는 A이다.
하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다: NiTCCNj(GG)kNmX1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿), 여기서 각 N은 뉴클레오티드이고, i는 1부터 약 50까지의 정수이며, j는 1부터 약 50까지의 정수이고, k는 0 또는 1이며, m은 1부터 약 20까지의 정수이고, X1, X2 및 X3은 뉴클레오티드이며, 단 X1이 C 또는 A라면, X2X3은 AA가 아니다. 올리고뉴클레오티드의 일부 구체예에서, X1은 C 또는 A이다. 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다: X1X2X3GGGGAA (SEQ ID NO:＿), 여기서 X1, X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X3=C 또는 A라면, X1, X2 및 X3는 GG가 아니다. 상기 올리고뉴클레오티드의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 G는 Z'=7-데아자G인 Z'에 의하여 대체된다.
서열 5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA- 3' (SEQ ID NO:＿(C661) 또는 적어도 10개의 그것의 염기 팔린드롬 부분을 포함한 이 서열의 부분을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'으로 구성된 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공되는데, 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한다(즉, 서열 Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한다). 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNmA-3'으로 구성된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNmCA-3으로 구성된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNmGCA-3'로 구성된다. 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공되고, 여기서 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 0부터 약 100까지의 정수이다. 올리고뉴클레오티드의 일부 구체예에서, 서열 N1-Nm은 서열 5'-TTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:＿)의 단편을 포함한다.
뉴클레오티드 서열 5'-TGCRRZNYY-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공되는데, 여기서 Z는 C를 제외한 어떤 뉴클레오티드이고, N은 어떤 뉴클레오티드이며, 또한 Z가 G 또는 이노신이 아닐 때, N은 구아노신 또는 이노신이다. 뉴클레오티드 서열 5'-TGCRRZNYm-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공되는데, 여기서 Z는 C를 제외한 어떤 뉴클레오티드이고, N은 어떤 뉴클레오티드이며, Y는 피리미딘 뉴클레오티드이고, m은 2부터 100까지의 정수이며, Z가 G 또는 이노신이 아닐 때, N은 구아노신 또는 이노신이다.
또한, 면역계의 세포를 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한 면역반응을 억제하는 방법이 본원에 제공된다: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿), 여기서 X1 X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아니며, 세포는 면역반응에 기여하는 세포로부터 반응을 억제하기에 효과적인 양으로 올리고뉴클레오티드와 접촉된다. 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법이 본원에 제공된다: (SEQ ID NO:＿), 여기서 X1 X2, 및 X3는 상기 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양인 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아니다.
각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5로부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'로 구성된 올리고뉴클레오티드를 상기 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법이 본원에 제공된다.
각 N은 뉴클레오티드이고, m은 0으로부터 약 100까지의 정수인, 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드를 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법이 본원이 제공된다.
개체에서 TLR7/8 의존적 선천성 면역반응을 억제하는 방법이 본원에 제공되는데, 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'로 구성된 올리고뉴클레오티드를 상기 개체에서 TLR7/8 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
개체에서 TLR9 의존적 선천성 면역반응을 억제하는 방법이 본원에 제공되는데, X1 X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아닌, 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드를 상기 개체에서 TLR9 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
개체에서 TLR9 의존적 선천성 면역반응 및 TLR7/8 의존적 면역반응을 억제하는 방법이 본원에 제공되는데, 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'로 구성된 올리고뉴클레오티드를 상기 개체에서 TLR9 의존적 사이토카인 생산 및 TLR7/8 의존적 사이토카인 생산을 억제하기에 충분한 양으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
자가면역 질환의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 X1 X2, 및 X3가 뉴클레오티드이고, X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아닌 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 낭창(SLE) 및 류마티스 관절염으로 구성된 군 중에서 선택된다. 자가면역 질환의 하나 이상의 징후를 개선하기 위한 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'으로 구성된 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 자가면역 질환의 하나 이상의 징후를 개선하기 위한 방법이 본원이 제공되는데, 이 방법은 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 0부터 약 100까지의 정수인 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 낭창(SLE) 및 류마티스 관절염으로 구성된 군 중에서 선택된다.
자가면역 질환의 진행을 예방 또는 지연시키는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 X1 X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, X1=C 또는 A라면, X2X3가 AA가 아닌, 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환으로 진행될 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
자가면역 질환의 진행을 예방 또는 지연시키는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 N이 뉴클레오티드이고, m은 5로부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'으로 구성된 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환으로 진행될 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
자가면역 질환의 진행을 예방 또는 지연시키는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 0부터 약 100까지의 정수인 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 자가면역 질환으로 진행될 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
염증 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 X1 X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아닌 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 염증 질환 또는 장애를 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 염증 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 개선하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 각 N이 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'로 구성된 올리고뉴클레오티드의 유효량을 염증 질환 또는 장애를 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 염증 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 각 N이 뉴클레오티드이고, m은 0부터 약 100까지의 정수인 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 염증 질환 또는 장애를 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
만성 병원균 자극을 억제하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 X1 X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아닌, 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유효량을 만성 병원균 감염 또는 질환을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한,
i. X1 X2, 및 X3는 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3는 AA가 아닌, 화학식의 뉴클레오티드 서열: X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드;
ii. 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 5부터 약 50까지의 정수이며, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 5'-TGCNm-3'으로 구성된 올리고뉴클레오티드; 또는
iii. 각 N은 뉴클레오티드이고, m은 0부터 약 100까지의 정수인 뉴클레오티드 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:＿)을 포함한 올리고뉴클레오티드
를 포함한 키트가 본원에 제공되는데, 올리고뉴클레오티드는 적합한 용기에 있으며, 상기 키트는 개체의 면역조절에서 올리고뉴클레오티드의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
도 1A-1B는 면역조절 핵산(ISNA)-자극된 세포로부터 IL-6 및 IL-12 생산의 IRP 억제를 나타내는 그래프이다. 도 1A는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(530), IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 SEQ ID NO:＿(C532)와 함께 자극된 쥐과 비장림프구의 결과를 도시한다. 도 1B는 ISNA SEQ ID NO:＿(C274) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(530), IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 SEQ ID NO:＿(C532)와 함께 자극된 쥐과 CD11c+ 세포의 결과를 도시한다.
도 2는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(530), IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:＿(C532)와 함께 자극된 사람 B 세포로부터의 IL-6 생산을 도시한 그래프이다.
도 3은 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께, 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 단독으로 주사된 마우스의 혈청에서의 IL-6 수준을 나타낸 그래프이다. IRP:ISNA 또는 IRP:공동투여된 대조군 올리고뉴클레오티드의 비율은 3:1부터 1:3까지 다양하다.
도 4는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드, 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 단독으로 주사된 마우스의 혈청의 IL-12 수준을 나타낸 그래프이다. IRP:ISNA 또는 IRP:공동투여된 대조군 올리고뉴클레오티드의 비율은 3:1부터 1:3까지 다양하다.
도 5는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께, 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 단독으로 주사된 마우스의 혈청의 TNF-α 수준을 나타낸 그래프이다. IRP:ISNA 또는 IRP:공동투여된 대조군 올리고뉴클레오티드의 비율은 3:1부터 1:3까지 다양하다.
도 6은 한 부위에서 피하로 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 그리고 동일한 부위 또는 상이한 부위에 투여된 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 IRP SEQ ID NO:＿(C869)로 주사된 마우스의 혈청의 IL-6를 나타낸 그래프이다.
도 7은 한 부위에서 피하로 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 그리고 동일한 부위 또는 상이한 부위에 투여된 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 IRP SEQ ID NO:＿(C869)로 주사된 마우스의 혈청의 IL-12를 나타낸 그래프이다.
도 8A-8B는 HSV-1 감염의 다양한 양에 반응하여 쥐과 CD11c+ 비장림프구에 의한 도 8A IFN-α 및 도 8B IL-12 생성을 나타낸 그래프를 도시한다.
도 9A-9C는 HSV-1 자극된 세포로부터 사이토카인 생성의 IRP 억제를 나타낸 그래프를 도시한다. 도 9A는 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 다양한 농도의 존재에서 HSV-1에 반응하여 쥐과 CD11c+ 비장림프구에 의한 IFN-α 생성을 도시한다. 도 9B는 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클 레오티드의 다양한 농도의 존재에서 HSV-1에 반응하여 쥐과 CD11c+ 비장림프구에 의한 IL-12 생성을 도시한다. 도 9C는 IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 다양한 농도의 존재에서 HSV-1에 반응하여 사람 PDC에 의한 IFN-α 생성을 도시한다.
도 10A-1OB는 인플루엔자 바이러스(PR/8) 자극된 세포로부터 사이토카인 생성의 IRP 억제를 나타낸 그래프를 도시한다. 도 10A는 인플루엔자 바이러스의 다양한 양에 반응하여 사람 PDC에 의한 IFN-α 생성을 도시한다. 도 10B는 IRP SEQ ID NO:)＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 다양한 농도의 존재에서 인플루엔자 바이러스에 반응하여 사람 PDC에 의한 IFN-α 생성을 도시한다.
도 11A-11B는 바이러스 자극된 사람 PDC 세포로부터 IFN-α 생성의 IRP 억제를 나타낸 그래프를 도시한다. 바이러스 단독, IRP SEQ ID NO:＿(C869), IRP SEQ ID NO:＿(C661) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재에서 HSV-1(도 11A, 그래프 왼쪽) 및 인플레엔자 바이러스(도 11B, 그래프 오른쪽)에 반응한 세포에 의한 IFN-α의 생성을 나타낸다.
도 12A-12B는 도 12A ISNA 또는 도 12B LPS, TLR4 자극제로 자극된 비장림프구로부터의 IL-6 생성에 대한 IRP의 효과를 나타낸 그래프를 도시한다. 자극된 세포를 ISNA 또는 LPS 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(530), IRP SEQ ID NO:＿(C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하였다.
도 13A-13D는 록소리빈, TLR7 자극제로 자극된 비장림프구로부터의 IL-6(도 13A-13B) 및 IL-12(도 13C-13D) 생성에 미친 IRP의 효과를 나타낸 그래프를 도시한 다. 자극된 세포를 록소리빈 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869)(도 13A-13C) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드(도 13B-13D)의 다양한 양과 함께 인큐베이션하였다.
도 14A-14D는 TLR7/8 자극제로 자극된 레스퀴모드(R848)로 자극된 비장림프구로부터의 IL-6(도 14A-14B) 및 IL-12(도 14C-14D) 생성에 미친 IRP의 효과를 나타낸 그래프를 도시한다. 자극된 세포를 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869)(도 14A-14C) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드(도 14B-14D)의 다양한 양과 함께 인큐베이션하였다.
도 15A-15D는 TLR 자극제 도 15A, ISNA(SEQ ID NO:＿(1018)), 도 15B, LPS, 도 15C, 록소리빈 및 도 15D, R848로 자극된 비장림프구로부터의 IL-6 생성에 미친 IRP의 효과를 나타낸 그래프를 도시한다. 자극된 세포를 지시된 TLR 자극제 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869), IRP SEQ ID NO:＿(C661) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하였다.
도 16A-16B는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018)-자극된 또는 R848-자극된 세포로부터의 IL-6 생성의 IRP 억제를 나타낸 그래프를 도시한다. 도 16A는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(C869), IRP SEQ ID NO:＿(C661) 또는 IRP SEQ ID NO:＿(954)로 함께 자극된 쥐과 비장림프구의 결과를 도시한다. 도 16B는 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(869), IRP SEQ ID NO:＿(661) 또는 IRP SEQ ID NO:＿(954)으로 함께 자극된 쥐과 비장림프구의 결과를 도시한다.
도 17A-17B는 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올 리고뉴클레오티드로 함께 주사한 뒤 1시간 지난 마우스의 혈청에서의 도 17A, IL-12 및 도 17B TNF-α 수준을 나타낸 그래프이다.
도 18은 D-갈락토사민 및 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 IRP SEQ ID NO:＿(869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 살아있는 마우스의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 19A-19B는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018)-자극된 또는 R848-자극된 세포로부터 IL-6 생성의 IRP 억제를 나타낸 그래프를 도시한다. 도 19A는 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954), IRP SEQ ID NO:＿(DV019: N-I), IRP SEQ ID NO:＿(DV020: N-2), IRP SEQ ID NO:＿(DV021: N-3), IRP SEQ ID NO:＿(DV022: N-4), IRP SEQ ID NO:＿(DV023:N-5) 또는 IRP SEQ ID NO:＿(DV024: N-6)로 함께 자극된 쥐과 비장림프구의 결과를 도시한다. 도 19B는 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954), IRP SEQ ID NO:＿(DVOl9), IRP SEQ ID NO:＿(DV020), IRP SEQ ID NO:＿(DV021), IRP SEQ ID NO:＿(DV022), IRP SEQ ID NO:＿(DV023) 또는 IRP SEQ ID NO:＿(DV024)로 함께 자극된 쥐과 비장림프구의 결과를 도시한다.
도 20은 IRP SEQ ID NO:＿(954)의 15 ㎍ 또는 45 ㎍로 1주일에 2회 주사한 후 살아있는 (NNZBxNZW)F1마우스의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 21은 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 100 ㎍으로 8-9개월째에 1주일에 3회 주사한 후 살아있는 (NZBxNZW)F1 마우스의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 22A-22B는 도 22A, ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 또는 도 22B, R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(869), IRP SEQ ID NO:＿(661), IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 사람 B 세포로부터 IL-6 생성을 나타낸 그래프이다.
도 23은 UV-비활성화된 HSV-1 바이러스 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 사람 PDC 세포로부터 IFN-α 생성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 열-비활성화된 인플루엔자 바이러스 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 사람 PDC 세포로부터 IFN-α 생성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 항-dsDNA 면역 복합체를 포함한 혈청 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 사람 PDC 세포로부터 IFN-α 생성을 나타낸 그래프이다.
도 26은 항-RNP 면역 복합체 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:＿(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 사람 PDC 세포로부터 IFN-α 생성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 ISNA SEQ ID NO:＿(1018) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:(869), IRP SEQ ID NO:＿(661), IRP SEQ ID NO:＿(954), IRP SEQ ID NO:＿(983), IRP SEQ ID NO:＿(984), IRP SEQ ID NO:＿(985), IRP SEQ ID NO:＿(986), IRP SEQ ID NO:＿(987), IRP SEQ ID NO:＿(988), IRP SEQ ID NO:＿(989), IRP SEQ ID NO:＿(990), IRP SEQ ID NO:＿(991) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 쥐과 비장림프구로부터 IL-6 생성을 나타낸 그래프이다.
도 28은 IRP SEQ ID NO:＿(869), IRP SEQ ID NO:＿(661), IRP SEQ ID NO:＿(954), IRP SEQ ID NO:＿(983), IRP SEQ ID NO:＿(984), IRP SEQ ID NO:＿(985), IRP SEQ ID NO:＿(986), IRP SEQ ID NO:＿(987), IRP SEQ ID NO:＿(988), IRP SEQ ID NO:＿(989), IRP SEQ ID NO:＿(990), IRP SEQ ID NO:＿(991) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 함께 자극된 쥐과 비장림프구로부터 IL-6 생성을 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명
우리는 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 이들 면역조절 폴리뉴클레오티드를 사용하여 개체, 특히 사람에서 면역반응을 조절하는 방법을 발견하였다. 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 특히 TLR7/8 및/또는 TLR9을 통한 신호전달에 관여하는 이들 반응을 포함한, 선천성 면역반응을 억제한다.
우리는 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 사람 세포를 포함한 면역 세포를 다양한 방식으로 효율적으로 조절한다는 것을 발견하였다. 우리는 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 사람 세포로부터의 IFN-α, IL-6, IL-12 및 TNF-α를 포함한 사이토카인 생성을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 TLR7/8 및/또는 TLR9 수용체를 통하여 자극된, 사이토카인 생성을 포함한 세포 반응을 억제한다. 우리는 또한 B 세포 및 형질세포모 양 수지상 세포를 포함한 면역조절 핵산으로 자극된 세포의 증식 및/또는 성숙을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 IRP는 감염 또는 유전자 치료 목적으로 투여된 핵산 벡터의 억제 때문에 존재하는 미생물 DNA와 같은 ISNA에 대한 면역반응의 억제에서 유용하다.
본 발명은 또한 개체에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 개체에서 자가면역 장애 및 만성 염증 장애를 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 IRP 및/또는 IRC를 포함한 키트가 또한 제공된다. 키트는 피험체에서 면역조절을 위한 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 투여하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
일반 기술
본 발명의 수행은, 달리 지시하지 않는 한, 본 분야의 기술 범주에 있는, 분자 생물학(재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 채용할 것이다. 이러한 기술들은 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); 및 Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)과 같은 문헌에 충분히 설명된다.
정의
본원에 사용된 단수는 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 예를 들어, IRP는 하나 이상의 IRP를 포함한다.
본원에 호환가능하게 사용된 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 RNA(dsRNA), 변형된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 선형 또는 환형으로 구성될 수 있고, 또는 올리고뉴클레오티드는 선형 및 환형 단편을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 에스테르와 같은 대체 결합이 또한 올리고뉴클레오티드에 사용될 수도 있지만, 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 통하여 결합된 뉴클레오시드의 폴리머이다. 뉴클레오시드는 당에 결합된 퓨린(아데닌(A) 또는 구아닌(G) 또는 이것의 유도체) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C) 또는 우라실(U), 또는 이것의 유도체)으로 구성된다. DNA에서 4개의 뉴클레오시드 단위체(또는 염기)는 디옥시아데노신, 디옥시구아노신, 디옥시티미딘, 및 디옥시시티딘으로 불린다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 인산에스테르이다.
본원에 사용된 용어 "면역자극 핵산" 또는 "면역자극 폴리뉴클레오티드"는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 측정된 측정가능한 면역반응에 영향 및/또는 기여하는 핵산 분자(예를 들면, 폴리뉴클레오티드)를 말한다. 측정가능한 면역반응의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 항체 생산, 사이토카인의 분비, NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구 등과 같은 림프구 집단의 활성화 또는 증식을 포함한다. 면역자극 핵산(ISNA) 서열은 선천성 면역반응을 자극하는 것으로 알려져 있는데, 특히 이들 반응은 세포에서 TLR-9 신호전달을 통하여 일어난다. 당업계에 공지된 바와 같이, 면역자극 핵산(ISNA) 분자는 박테리아와 같은 미생물 공급원으로부터 분리될 수 있고, 유전자 치료에 사용하기 위한 핵산 벡터에 존재할 수 있고, 또는 본원에 설명되고 당업계에 공지된 기술 및 장치를 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 면역자극 핵산 서열은 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하며, 이 디뉴클레오티드의 C는 메틸화되지 않는다. 따라서, 미생물 감염 및 투여된 DNA는 일부의 경우 선천성 면역반응의 자극을 초래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역자극" 또는 "면역반응을 자극하는"은 면역반응에 참여하는 세포 유형의 자극 및 특정 항원성 물질에 대한 면역반응의 증대를 포함한다. 면역자극 핵산에 의하여 자극된 면역반응은 일반적으로 "Th2-형" 면역반응에 반대되는, "TH1-형" 면역반응이다. Th1-형 면역반응은 보통 항원 및 활성화된 대식세포 작용에 대한 "지연된 유형 과민성" 반응을 특징으로 하고, IFN-γ, IL-2, IL-12, 및 TNF-β와 같은 Th1-연관 사이토카인의 증가된 수준에 의한 생화학적 수준에서 검출될 수 있다. Th2-유형 면역반응은 일반적으로 항체 생산의 고수준, 특히 IgE 항체 생산 및 증대된 호산구 수 및 활성화, 뿐만 아니라 IL-4, IL-5, 및 IL-13과 같은 Th2-연관 사이토카인의 발현과 연관된다.
본원에 사용된 용어 "선천성 면역반응" 또는 "선천성 면역"은 세포 또는 개체가 병원균의 존재를 인식하고 반응하는 다양한 선천성 저항성 메커니즘을 포함한다. 본원에 사용된 "선천성 면역반응"은 세포가 병원균 연관된 분자 패턴 또는 신호를 인식할 때 일어나는 세포내 및 세포간 이벤트 및 반응을 포함한다. 선천성 면역반응에서 활성인 세포 수용체는 Toll-유사 수용체(TLR)의 패밀리를 포함하고, 본원에 기재된 일부 TLR에 대한 미생물 리간드가 확인되었다.
본원에 사용된 용어 "면역조절 서열" 또는 "IRS"는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 측정된 측정가능한 선천성 면역반응을 방해 및 억제하는 핵산 서열을 말한다. 본원에 사용된 "면역조절 폴리뉴클레오티드" 또는 "IRP"는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 측정된 측정가능한 선천성 면역반응을 방해 및 억제하는 적어도 하나의 IRS를 포함한 폴리뉴클레오티드를 말한다. TLR, 예를 들어 TLR-7, 8, 또는 9의 억제는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 리간드-수용체 결합의 차단 및 리간드-수용체 결합 후의 하류 신호 전달 경로의 억제에 의한 수용체 부위에서의 억제를 포함한다. 측정가능한 선천성 면역반응의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 사이토카인의 분비, NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구와 같은 림프구 집단의 활성화 또는 증식, 형질세포모양 수지상 세포와 같은 세포 집단의 성숙 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역조절 화합물" 또는 "IRC"는 면역조절 활성을 가지 고 IRS를 포함한 핵산 부분을 포함하는 분자를 말한다. IRC는 하나의 IRS 이상을 포함한 핵산 부분으로 구성될 수 있고, IRS로 구성될 수 있거나, 그 자체에 면역조절 활성을 갖지 않을 수 있다. IRC는 폴리뉴클레오티드("폴리뉴클레오티드 IRC")로 구성될 수 있거나 추가 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 IRC는 하나 이상의 핵산 부분을 혼입하는 화합물을 포함하는데, 이들 중 하나 이상은 비-뉴클레오티드 스페이서 부분에 공유결합된 IRC를 포함한다.
용어 "팔린드롬 서열" 또는 "팔린드롬"은 반복된 서열, 예를 들어, 염기, 예를 들어 A, 및 A', B 및 B', C 및 C', D 및 D'가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 ABCDD'C'B'A'인 핵산 서열을 말한다. 이러한 서열은 단일-가닥이거나 이중-가닥 구조이거나 어떤 조건 하에서 헤어핀 루프 구조일 수 있다. 예를 들면, 본원에 사용된 "8 염기 팔린드롬"은 팔린드롬 서열이 ABCDD'C'B'A'와 같은 길이가 8 염기인 핵산 서열을 말한다. 팔린드롬 서열은 비-팔린드롬 서열도 포함하는 폴리뉴클레오티드의 부분일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 팔린드롬 서열 부분 및 하나 이상의 비-팔린드롬 서열 부분을 함유할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 전부 팔란드롬일 수 있다. 하나 이상의 팔린드롬 서열 부분을 가진 폴리뉴클레오티드에서, 팔린드롬 서열 부분은 서로서로 오버랩될 수 있거나, 팔린드롬 서열 부분은 서로서로 오버랩되지 않을 수 있다.
용어 "3'"은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에서의 다른 영역 또는 위치로부터 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 3'(하류)에 있는 영역 또는 위치를 말한다. 용어 "5' 말단"은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단을 말한다.
용어 "콘쥬게이트"는 IRP 및/또는 IRC가 결합된 복합체를 말한다. 이러한 콘쥬게이트 결합은 공유 및/또는 비-공유 결합을 포함한다.
"보조제"는 항원과 같은 면역원성 인자에 첨가되었을 때, 혼합물에 노출하자마자 수용체 숙주에 있는 인자에 대한 면역반응을 비특이적으로 증대 또는 증가시키는 물질을 말한다.
용어 "펩티드"는 길이가 충분하고 펩티드가 합텐이든지 아니든지 생물학적 반응, 예를 들면 항체 생산 또는 사이토카인 활성에 영향을 미치는 조성물인 폴리펩티드이다. 전형적으로, 펩티드는 길이가 적어도 6 아미노산 잔기이다. 용어 "펩티드"는, 변형된 아미노산(자연적으로 또는 비자연적으로 발생하든지 간에)을 더 포함하고, 이러한 변형은, 한정하는 것은 아니지만, 인산화, 글리코실화, 페그화, 지질화 및 메틸화를 포함한다.
"전달 분자" 또는 "전달 비히클"은 특정 부위에 대한 그리고/또는 특정 타이밍에 관한 IRP 및/또는 IRC의 전달을 촉진, 허용, 및/또는 증대시키는 화학적 부분이다.
"개체"는 조류와 같은 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 사람이다. 포유동물은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류, 가축, 경주용 동물, 설치류 및 애완동물을 포함한다.
물질의 "효과적인 양" 또는 "충분한 양"은 임상 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 양 및 "효과적인 양"은 그것이 적용된 문맥 에 따른다. TLR-9 의존적 면역반응을 억제하는 조성물을 투여하는 문맥에서, IRP의 효과적인 양은 TLR-9를 통한 자극에 대한 세포 반응을 억제 또는 감소시키기에 충분한 양이다. TLR-7/8 의존적 면역반응을 억제하는 조성물을 투여하는 문맥에서, IRP의 효과적인 양은 TLR-7/8을 통한 자극에 대한 세포 반응을 억제 또는 감소시키기에 충분한 양이다. 효과적인 양은 하나 이상의 투여에서 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "병용 투여"는 면역반응을 조절하기 위하여 충분히 가까운 시간 내에 적어도 두 상이한 물질을 투여하는 것을 말한다. 바람직하게는, 병용 투여는 적어도 두 상이한 물질의 동시 투여를 말한다.
반응 또는 매개변수의 "억제" 또는 "방해"는 관심대상의 조건 또는 매개변수를 제외하고 동일한 조건과 비교할 때, 또는 대안적으로 다른 조건과 비교할 때 그 반응 또는 매개변수를 감소시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 면역조절 핵산 유도된 사이토카인 생성을 억제하는 IRP를 포함한 조성물은 예를 들어 면역조절 핵산 단독으로 유도된 사이토카인 생성과 비교할 때 사이토카인 생성을 감소시킨다. 다른 예로서, 선천성 면역반응과 연관된 사이토카인 생성을 억제하는 IRP를 포함한 조성물은 예를 들어 선천성 면역반응 단독으로 생성된 사이토카인의 범위 및/또는 수준과 비교할 때 사이토카인 생성의 범위 및/또는 수준을 감소시킨다. B 세포 "억제"는 예를 들어 감소된 B 세포 증식, 감소된 B 세포 활성화 및/또는 자극된 B 세포로부터 IL-6 및/또는 TNF-α와 같은 사이토카인의 감소된 생성을 포함한다. TLR 반응, 예를 들어 TLR-7, 8, 또는 9 반응의 억제는, 한정하는 것은 아니지만, 효과적인 리간드-수용체 결합을 방지 또는 차단함으로써 수용체 부위의 억제, 및 예를 들어 효과적인 리간드-수용체 결합 후 하류 신호전달 경로의 억제를 포함한다.
반응 또는 매개변수의 "자극"은 그 반응 또는 매개변수의 유도 및/또는 증대를 포함한다. 예를 들어, 선천성 면역반응 또는 Th1 반응과 같은 면역반응의 "자극"은 반응의 유도 및/또는 증대로부터 일어날 수 있는 반응의 감소를 의미한다. 유사하게, 사이토카인 또는 세포 유형(예를 들어 CTL)의 "자극"은 사이토카인 또는 세포 유형의 양 또는 수준의 증가를 의미한다. B 세포 "자극"은 예를 들어 증대된 B 세포 증식, 유도된 B 세포 활성화 및/또는 자극된 B 세포로부터 IL-6 및/또는 TNF-α와 같은 사이토카인의 증가된 생성을 포함한다.
본원에 사용되고, 당업계에 잘 이해된 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근이다. 이 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 검출되든지 안되든지 하나 이상의 징후의 완화 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환의 안정된(즉, 악화시키지 않는) 상태, 질환의 확산의 예방, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적으로든지 또는 전체적으로든지)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 기대되는 생존과 비교할 때 연장된 생존을 의미할 수 있다.
질병 또는 장애를 "완화한다"는 것은 장애를 치료하지 않은 것과 비교할 때, 장애 또는 질환 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상 발현이 감소되고/거나 진행의 시간 경과가 둔화되거나 연장되는 것을 의미한다. 특히 자가면역 질환 상황에서, 완화는 원하지 않은 면역반응의 조절 또는 감소시에 일어날 수 있는 것으로 당업자에게 잘 이해된다. 또한, 완화는 한 용량의 투여에 의하여 반드시 발생하는 것은 아니고, 종종 연속적인 용량의 투여시에 일어날 수 있다. 따라서, 반응 또는 장애를 완화하기에 충분한 양은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 그것의 유사어는 그것들의 포괄적 의미, 즉, 용어 "포함한다"와 동등 및 그것에 상응하는 유사어로 사용된다.
본 발명의 조성물
본 발명은 개체에서 선천성 면역반응을 조절하기 위한 면역조절 서열(IRS), 면역조절 폴리뉴클레오티드(IRP) 및 면역조절 화합물(IRC)을 제공한다. 본 발명의 각 IRP 및 IRC는 적어도 하나의 IRS를 포함한다.
본 발명의 조성물은 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역조절 화합물 단독(또는 2 이상의 IRP 및/또는 IRC의 조합)을 포함한다. 본 발명의 조성물은 IRP 또는 IRC 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 완충제를 포함한, 약학적으로 허용되는 첨가제는 본원에 기재되어 있고 당업계에 주지되어 있다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20판, Mack Publishing (2000).
면역조절 폴리뉴클레오티드 및 면역조절 화합물
본 발명에 따라서, IRP 또는 IRC는 적어도 하나의 면역조절 서열을 함유한다. 일부 예에서, 면역조절 서열(IRS)은 5'-G,C-3' 서열을 포함한다. 일부 예에서, IRS는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 또는 가까이에(즉, 5'-TGC) 적어도 하나의 TGC 트리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 예에서, IRS는 5'-GGGG-3' 서열을 포 함한다. 일부 예에서, IRS는 5'-GGGG-3' 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 일부 예에서, 5'-GGGG-3' 서열을 포함한 IRP 또는 IRC는 단일-가닥 형태로 사용될 때 특히 효과적이다. 일부 예에서, 5'-GGGG-3' 서열을 포함한 IRP 또는 IRC는 포스포티오에이트 백본으로 만들어질 때 특히 효과적이다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 IRP 및 IRC는 TLR-7 및/또는 TLR-8 의존적 세포 반응을 억제한다. 또한, 특정 IRP 및 IRC는 TLR-9 의존적 세포 반응을 억제하고, 특정 IRP 및 IRC는 TLR-7/8 의존적 세포 반응 및 TLR-9 의존적 세포 반응을 억제한다. 본원에 사용된 바와 같이, "TLR-7/8"은 "TLR-7 및/또는 TLR-8"을 말한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "TLR-7/8/9"는 "(TLR-7 및/또는 TLR-8) 및 TLR-9"를 말한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 어떤 IRP는 TLR4 의존적 세포 반응을 억제하지 않는다.
면역자극 핵산 및 선천성 면역반응의 다른 자극제는 당업계에 설명되어 있고, 그들의 활성은 사이토카인 분비, 항체 생산, NK 세포 활성화, B 세포 증식, T 세포 증식, 수지상 세포 성숙과 같은 선천성 면역반응의 다양한 면을 지시하는 표준 분석을 사용하여 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-3639; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423; Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-854; Hemmi et al. (2000), 상기 참조; Lee et al (2003), 상기 참조; WO 98/16247; WO 98/55495; WO 00/61 151 및 U.S. Pat. No. 6,225,292)를 참조하라. 따라서, 면역조절 서열, 폴리뉴클레 오티드 및/또는 화합물을 동정, 테스트 및/또는 확인하기 위해서 이들 및 다른 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, IRP 또는 IRC의 효과는 선천성 면역반응이 자극된 세포 또는 개체가 IRP 또는 IRC와 접촉될 때 결정될 수 있다.
본원에서 명백하게 전달되는 바와 같이, 본원에 기재된 화학식과 관련하여, 어떤 그리고 모든 매개변수는 독립적으로 선택되는 것으로 이해된다. 예를 들어, x=0-2라면, y는 x의 값(또는 화학식에서 어떤 다른 선택가능한 매개변수)과 상관없이 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, IRS를 포함한 IRP 또는 IRC는 적어도 하나의 포스포티오에이트 백본 결합을 가진 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 증명된 바와 같이, 발견된 IRS의 한 부류는 TLR9 의존적 세포 자극을 억제하는 데 특히 효과적이다. 따라서, 이 활성을 가진 IRS는 "TLR9 부류" IRS로 언급된다.
일부 구체예에서, IRS는 화학식의 서열 X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:1)을 포함할 수 있는데, X1 X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3은 AA가 아니다. 일부 구체예에서, IRS는 X1가 C 또는 A인 화학식의 서열 SEQ ID NO:1을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, IRS는 화학식의 서열 X1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:2)을 포함할 수 있는데, X1 X2, 및 X3가 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3은 AA가 아니고, X1은 C 또는 A이다.
일부 구체예에서, IRS는 화학식의 서열 GGNnX1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:3)을 포함 할 수 있는데, n은 1부터 약 100까지의 정수이고(바람직하게는 1부터 약 20까지), 각 N은 뉴클레오티드이며, X1 X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3은 AA가 아니다. 일부 구체예에서, IRS는 X1이 C 또는 A인 화학식의 서열 SEQ ID NO:3을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, IRS는 화학식의 서열: NiTCCNj(GG)kNmX1GGGGX2X3 (SEQ ID NO:4)을 포함할 수 있고, 각 N은 뉴클레오티드이고, i는 1부터 약 50까지의 정수이며, j는 1부터 약 50까지의 정수이고, k는 0 또는 1이며, m은 1부터 약 20까지의 정수이고, X1, X2, 및 X3은 뉴클레오티드이며, 단 X1=C 또는 A라면, X2X3은 AA가 아니다. 일부 구체예에서, IRS는 X1는 C 또는 A인 화학식의 서열 SEQ ID NO:4를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, IRS는 화학식의 서열: X1X2X3GGGGAA (SEQ ID NO:5)를 포함할 수 있는데, X1 X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, 단 X3=C 또는 A라면, X1X2는 GG가 아니다.
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 또는 5를 포함한 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 하기 서열을 포함한다:
5'-TCCTAACGGGGAAGT-3' (SEQ ID NO:10 (C827));
5'-TCCTAAGGGGGAAGT-3' (SEQ ID NO:11 (C828));
5'-TCCTAACGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:12 (C841));
5'-TCCTAACGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO:13 (C842));
5'-TCCTCAAGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO:14 (C843));
5'-TCCTCAAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:15 (C844));
5'-TCCTCATGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:16 (C845));
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:17 (C869));
5'-TCCTGGAGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO:18 (C870));
5'-TCCTGGAGGGGCCAT-3' (SEQ ID NO:19 (C871));
5'-TCCTGGAGGGGTCAT-3' (SEQ ID NO:20 (C872));
5'-TCCGGAAGGGGAAGT-3' (SEQ ID N0:21 (C873)); 및
5'-TCCGGAAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:22 (C874)).
일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 또는 5 중 어느 것의 서열을 포함할 수 있는데, 적어도 하나의 G는 7-데아자-dG로 대체된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, IRS는 서열 5'-TCCTGGAGZ'GGTTGT-3' (Z'=7-데아자-dG; SEQ ID NO:23 (C920))을 포함할 수 있다.
SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 또는 5를 포함하는 IRP들 또는 적어도 하나의 G가7-데아자-dG에 의하여 대체된 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 또는 5를 포함하는 IRP는 TLR9 의존적 세포 자극을 억제하는 데 특히 효과적이다. TLR9 의존적 세포 신호전달을 억제하는 데 특히 효과적인 다른 IRS는 하기를 포함한다:
5'-TGACTGTAGGCGGGGAAGATGA-3' (SEQ ID NO:24 (C533));
5'-GAGCAAGCTGGACCTTCCAT-3' (SEQ ID NO:25 (C707)); 및
5'-CCTCAAGCTTGAGZOG-3' (Z'=7-데아자-dG; SEQ ID NO:26 (C891)).
본원에 나타낸 바와 같이, 일부 IRS는 TLR7/8 의존적 세포 자극을 억제하는 데 특히 효과적이다. 따라서, 이 활성을 가진 IRS는 "TLR7/8 부류" IRS로 언급된다. 예를 들어, 서열 5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:27 (C661))을 포함한 올리고뉴클레오티드는 TLR7/8 의존적 세포 자극을 억제한다.
일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID의 NO:C661의 단편을 포함하고, 그것의 적어도 10 염기 팔린드롬 부분을 포함한다. 예를 들어, 이러한 서열은 하기 서열을 포함한다:
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAG-3' (SEQ ID NO:28 (C921));
5'-TGCTTGCAAGCTTGCA-3' (SEQ ID NO:29 (C922));
5'-GCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:30 (C935));
5'-CTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:31 (C936)); 및
5'-TTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:32 (C937)).
일부 구체예에서, IRP는 SEQ ID NO:27 (C661), 또는 그것의 단편으로 구성된다. 일부 구체예에서, IRP는 SEQ ID NO:27 (C661)의 단편으로 구성되고, 그것의 적어도 10 염기 팔린드롬 부분을 포함한다.
일부 구체예에서, TLR7/8 의존적 세포 자극을 억제하는 데 효과적인 IRP는 서열 5'-TGCNm-3'으로 구성되고, N은 뉴클레오티드이며, m은 5부터 약 50까지의 정수이고, 서열 N1-Nm은 적어도 하나의 GC 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에 서, 이러한 IRP는 서열 5'-TGCNmA-3', 서열 5'-TGCNmCA-3' 또는 5'-TGCNmGCA-3'으로 구성된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, IRP는 하기 서열로 구성될 수 있다:
5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:33 (C917));
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-3' (SEQ ID NO:34 (C918));
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:35 (C932));
5'-TGCTTAGCAGCTATGCAGCA-3' (SEQ ID NO:36 (C933)); 또는
5'-TGCAAGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:37 (C934)).
TLR7/8 의존적 세포 신호전달을 억제하는 데 또한 효과적인 다른 IRS 서열은 하기를 포함한다:
5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAGCTT-3' (SEQ ID NO:38 (C793));
5'-TGCTGCAAGCTTGCAGATGAT-3' (SEQ ID NO:39 (C794));
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGC-3' (SEQ ID NO:40 (C919));
5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAT-3' (SEQ ID NO:41 (C923));
5'-TGCTTGCAAGCTTG-3' (SEQ ID NO:42 (C930));
5'-AGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:43 (C938));
5'-TACTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:44 (C939));
5'-TGATTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:45 (C940));
5'-AAATTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:46 (C941));
5'-TGCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:47 (C945));
5'-AAATTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:48 (C951));
5'-TGATTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:49 (C959));
5'-TGATTGACAGATTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:50 (C960)); 및
5'-TGATTGACAGATTGACAGAC-3' (SEQ ID N0:51 (C961))
IRS의 다른 부류는 TLR7/8 및 TLR9 의존적 세포 자극 모두를 억제하는 데 특히 효과적인 것들을 포함한다. 따라서, 활성을 가진 IRS는 "TLR7/8/9 부류" IRS로 언급된다. 일부 예에서, TLR7/8 부류 IRS와 TLR9 부류 IRS의 조합은 TLR7/8/9 부류의 IRS를 초래한다.
IRS의 TLR7/8/9 부류는 각 N은 뉴클레오티디이고, m은 0부터 약 100까지, 일부 예에서, 0부터 약 50까지, 바람직하게는 0부터 약 20까지의 정수인, 서열 TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:6)을 포함하는 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, IRS는 서열 N1-Nm이 서열 5'-TTG AC AGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:7)의 단편을 포함하는 SEQ ID NO:6을 포함한다. SEQ ID NO:7의 단편은 서열, 예를 들어 TTGAC 또는 GCTTGA의 어떤 부분이다. 일부 구체예에서, SEQ ID NO:7의 단편은 예를 들어, TTGAC 또는 TTG를 포함한 SEQ ID NO:7의 5' 말단으로부터이다.
일부 구체예에서, IRS는 5'-TGCRRZNYY-3' (SEQ ID NO:8)을 포함하는데, Z는 C를 제외한 어떤 뉴클레오티드이고, N은 어떤 뉴클레오티드이며, Z는 G 또는 이노신이 아닐 때, N은 구아노신 또는 이노신이다. 다른 구체예에서, IRS는 서열 5'-TGCRRZN폴리(피리미딘)-3' (SEQ ID NO:9)을 포함하는데, Z는 C를 제외하고 어떤 뉴 클레오티드이고, N은 어떤 뉴클레오티드이며, Z가 G 또는 이노신이 아닐 때, N은 구아노신 또는 이노신이다.
TLR7/8/9 의존적 세포 신호전달을 억제하는 데 또한 효과적인 IRS 서열의 예는 하기를 포함한다:
5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:52 (C954));
5'-TGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:53 (C956));
5'-TGCTTGACATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO;54 (C957));
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:55 (C962));
5'-TGCTTGACAGCTTGATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:56 (C963));
5'-TGCTTGACAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:57 (C964));
5'-TGCTTGACAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:58 (C965));
5'-TGCTTGACAGCTTGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:59 (C966));
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:60 (C967));
5'-TGCITGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:61 (C968));
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO:62 (C969));
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:63 (C970));
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:64 (C971));
5'-TGCTTGCAAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:65 (C972)); 및
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCATCCTGGAGGGGTTGT-S' (SEQ ID NO:66 (C908))
본원에 설명된 바와 같이, 일부 IRP는 TLR9 의존적 세포 반응을 억제하는 데 특히 효과적이다. 이러한 IRP는, 한정하는 것은 아니지만, SEQ ID NO:24 (C533); SEQ ID NO:25 (C707); SEQ ID NO:86 (1019); SEQ ID NO:91 (C891); SEQ ID NO:10 (C827); SEQ ID NO:11 (C828); SEQ ID NO:12 (C841); SEQ ID NO:13 (C842); SEQ ID NO:14 (C843); SEQ ID NO:15 (C844); SEQ ID NO:16 (C845); SEQ ID NO:17 (C869);SEQ ID NO:18 (C870); SEQ ID NO:19 (871); SEQ ID NO:20 (C872); SEQ ID NO:21 (C873); SEQ ID NO:22 (C874); SEQ ID NO:23 (C920), 및 SEQ ID NO:66 (C908).
본원에 설명된 바와 같이, 일부 IRP는 TLR7/8 의존적 세포 반응을 억제하는 데 특히 효과적이다. 이러한 IRP는, 한정하는 것은 아니지만, SEQ ID NO:17 (C869); SEQ ID NO:23 (C920); SEQ ID NO:27 (C661); SEQ ID NO:38 (C793); SEQ ID NO:29 (C794); SEQ ID NO:33 (C917); SEQ ID NO:34 (C918); SEQ ID NO:40 (C919); SEQ ID NO:28 (C921); SEQ ID NO:29 (C922); SEQ ID NO:41 (C923), 및 SEQ ID NO:66 (C908)를 포함한다.
IRP는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 뿐만 아니라 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 또는 다른 변형된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. IRP는 선형일 수 있고, 고리형이거나 고리형 부분을 포함할 수 있고/거나 헤어핀 루프를 포함할 수 있다. IRP는 자연적으로 발생한 또는 변형된, 비자연적으로 발생한 염기를 함유할 수 있고, 변형된 당, 인산, 및/또는 말단을 함유할 수 있다. 다양한 이러한 변형은 본원에 설명된다.
IRP에 혼입된 헤테로사이클릭 염기 또는 핵산 염기는 자연적으로 발생하는 주요 퓨린 및 피리미딘 염기(즉, 전술한 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 및 구아닌)뿐만 아니라 상기 주요 염기의 자연적으로 발생 및 합성 변형일 수 있다. 따라서, IRP는 2'-디옥시유리딘 및/또는 2-아미노-2'-디옥시아데노신을 포함할 수 있다.
IRP는 적어도 하나의 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 염기"는 "염기 유사체"와 동의어인데, 예를 들어, "변형된 시토신"은 "시토신 유사체"와 동의어이다. 유사하게, "변형된" 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 본원에 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 "유사체"와 동의어로 정의된다. 염기 변형의 예는, 한정하는 것은 아니지만, IRP의 시토신의 C-5 및/또는 C-6에 전자를 끄는 부분을 첨가하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 전자를 끄는 부분은 할로겐, 예를 들어, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-이오도시토신이다. 염기 변형의 다른 예는, 한정하는 것은 아니지만, 면역조절 폴리뉴클레오티드의 우라실의 C-5 및/또는 C-6에 전자를 끄는 부분을 첨가하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 전자를 끄는 부분은 할로겐이다. 이러한 변형된 우라실은, 한정하는 것은 아니지만, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-이오도우라실을 포함할 수 있다.
염기 변형의 다른 예는, 한정하는 것은 아니지만, 6-티오-구아닌, 4-티오-티민, 및 4-티오-우라실을 포함한 염기에 하나 이상의 티올기를 첨가하는 것을 포함한다. 염기 변형의 다른 예는, 한정하는 것은 아니지만, N4-에틸시토신, 5-데아자구아닌, 및 5-히드록시시토신을 포함한다. 예를 들어, 문헌(Kandimalla et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813)을 참조하라.
IRP는 인산-변형된 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있는데, 이것의 일부는 폴리뉴클레오티드를 안정화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 구체예는 안정화된 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 포로스디에스테르 결합뿐만 아니라, 인산 변형은, 한정하는 것은 아니지만, 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트(가교 또는 비-가교), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하고, 어떤 조합으로 사용될 수 있다. 다른 비-인산 결합도 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본만을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 백본만을 포함한다. 일부 구체예에서, IRP는 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 결합의 조합과 같은 인산 백본에서의 인산 결합의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 IRP는 하나 이상의 리보뉴클레오티드(단일의 또는 주요 당 성분과 같은 리보스를 함유하는), 디옥시리보뉴클레오티드(주요 당 성분과 같은 디옥시리보스를 함유하는)를 포함할 수 있고, 또는 당업계에 공지된 바와 같이, 변형된 당 또는 당 유도체는 IRP에 혼입될 수 있다. 따라서, 리보스 및 디옥시리보스뿐만 아니라, 당 부분은 펜토스, 디옥시펜토스, 헥소스, 디옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 라이조스, 및 당 "유도체" 사이크로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태일 수 있다. IRP에서, 당 부분은 바람직하게는 리보스, 디옥시리보스, 아라비노스, 또는 2'-0-알킬리보스의 푸라노시드이고, 당은 α 또는 β 아노머성 형태로 각각의 헤테로고리 염기에 부착될 수 있다. 당 변형은, 한정하는 것은 아니지만, 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함한다. 예를 들어, IRP에서의 당 변형은, 한정하는 것은 아니지만, 2'-O-메틸-유리딘 및 2'-O-메틸-시티딘을 포함한다. 이들 당 또는 당 유사체의 제조 및 이러한 당 또는 유사체가 헤테로고리 염기(핵산 염기)에 부착된 각각의 "뉴클레오시드"는 그 자체로 공지되어 있어서 이러한 제조가 어떤 특정 예에 속할 수 있는 범위를 제외하고는 여기에 설명될 필요가 없다. 또한 당 변형이 이뤄져 IRP의 제조시 어떤 인산 변형과 조합될 수 있다.
IRP는, 한정하는 것은 아니지만, 효소적 방법, 화학적 방법 및 더 큰 올리고뉴클레오티드 서열의 분해를 포함한 당업계에 주지된 기술 및 핵산 합성 장치를 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Ausubel et al. (1987); 및 Sambrook et al. (1989))을 참조하라. 효소적으로 조립할 때, 각각의 단위체를 예를 들어 T4 DNA 또는 RNA 리가제와 같은 리가제로 리게이션할 수 있다. U.S. Pat. No. 5,124,246. 올리고뉴클레오티드 분해는 U.S. Pat. No. 4,650,675에 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티를 뉴클레아제에 노출시킴으로써 이루어질 수 있다.
또한, IRP를 종래의 폴리뉴클레오티드 분리 과정을 사용하여 분리할 수 있다. 이러한 과정은, 한정하는 것은 아니지만, 공유 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화, 공유 구조적 특징을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝 및 중합효소 연쇄반응에 의한 특정 천연 서열 의 합성을 포함할 수 있다.
고리형 면역조절 폴리뉴클레오티드는 재조합 방법을 통하여 분리되고, 합성될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다. 고리형 IRP를 분리를 통하여 또는 재조합 방법을 통하여 얻을 경우, IRP는 바람직하게는 플라스미드일 것이다. 더 작은 고리형 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 문헌에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:2025-2029; 및 Wang et al (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333)을 참조하라.
폴리뉴클레오티드 및 변형된 폴리뉴클레오티드를 만들기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 포스포디에스테르 결합을 함유한 자연적으로 발생하는 DNA 또는 RNA는 일반적으로 적합한 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 3' 말단에 고형 지지체에 부착된 자라나는 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시기에 연속적으로 결합시키고, 이어서 인산 트리에스테르에 중간체 아인산 트리에스테르를 산화시킴으로써 합성된다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열이 합성되는 경우, 폴리뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 인산 트리에스테르기는 인산 디에스테르에 탈보호되며, 뉴클레오시드 염기는 수용성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다. 예를 들어, 문헌(Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401 및 U.S. Pat. No. 4,458,066)을 참조하라.
변형된 인산 결합 또는 비-인산 결합을 함유한 폴리뉴클레오티드의 합성은 또한 당업계에 공지되어 있다. 리뷰로서, 문헌(Matteucci (1997) "Oligonucleotides Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (DJ. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY)을 참조하라. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 당 또는 당 유사체 부분에 부착될 수 있는 인 유도체(또는 변형된 인기)는 1인산염, 2인산염, 3인산염, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트 등일 수 있다. 또한, 상기 기록된 인산 유사체의 제조 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드로의 이들의 혼입은 공지되어 있으며, 여기에 상세한 설명은 불필요하다. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; 및 Schultz et al (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성은 산화 단계가 황화 단계에 의하여 대체되는 것을 제외하고, 자연적으로 발생하는 올리고뉴클레오티드에 대한 전술한 것과 유사하다(Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190). 유사하게, 포스포트리에스테르 (Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665), 비-가교 포스포라미데이트 (Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247-7246), N3'-P5' 포스포라미디에트 (Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287) 및 포스포로디티오에이트(U.S. Pat. No. 5,453,496)와 같은 다른 인산염 유사체의 합성도 또한 설명되었 다. 다른 비-인 기재 변형된 올리고뉴클레오티드도 또한 사용될 수 있다(Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141).
당업자는 다양한 헤테로고리 염기를 포함한 많은 수의 "합성" 비-자연적 뉴클레오시드를 인식할 것이고, 다양한 당 부분(및 당 유사체)은 당업계에서 구입가능하며, 본 발명의 다른 기준이 만족되는 한, IRP는 자연적으로 발생하는 핵산의 주요 5 염기 성분 이외의 하나 또는 일부 헤테로고리 염기를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 IRP에서의 헤테로고리 염기는, 한정하는 것은 아니지만, 우라실-5-일, 시토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로[2.3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d]피리미딘-3-일기를 포함하고, 여기서 퓨린은 9번 위치를 통하여, 피리미딘은 1번 위치를 통하여, 피롤로피리미딘은 7번 위치를 통하여 그리고 피라졸로피리미딘은 1번 위치를 통하여 IRP의 당 부분에 부착된다.
염기-변형된 뉴클레오시드의 제조 및 전구체로서 상기 염기-변형된 뉴클레오시드를 사용한 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성은 예를 들어, U.S. Pat. No 4,910,300, 4,948,882, 및 5,093,232에 설명된다. 이들 염기-변형된 뉴클레오시드는 이들이 화학 합성에 의하여 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 내부 위치 내로 혼입될 수 있도록 설계되었다. 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 내부 위치에 존재하는 이러한 염기-변형된 뉴클레오시드는 펩티드의 부착을 위한 부위로서 작용할 수 있다. 이들의 당 부분에 변형된 뉴클레오시드도 또한 설명되었고(한정하는 것은 아니지만, U.S. Pat. No. 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 5,118,802를 포함한다) 유사하게 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 (염기 또는 염기쌍의) 하기 길이 중 약 어느 것 미만이다: 10,000; 5,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4. 일부 구체예에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 (염기 또는 염기쌍의) 하기 길이 중 약 어느 것 이상이다: 4; 5; 6, 7, 8, 9, 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000. 대안적으로, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 10,000; 5,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 1 1 ; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4의 상한 및 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500 중 독립적으로 선택된 하한을 가진 크기의 범위 중 어느 것일 수 있으며, 여기서 하한은 상한 미만이다. 일부 구체예에서, IRP는 바람직하게는 길이가 약 200 또는 그 미만의 염기이다.
또한 본 발명은 본원에 설명된 면역조절 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 설명된 것들 중 어떤 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 IRP를 합성할 수 있고(예를 들어, 고체 상태 합성을 사용하여) 임의의 정제 단계(들)를 더 포함할 수 있다. 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 면역조절 활성을 가지고 IRS를 포함한 핵산 부분을 포함한 면역조절 화합물(IRC)에 관한 것이다. 본 발명의 IRC는 하나 이상의 핵산 부분 및 하나 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 함유할 수 있다. 하기 화학식 I-VII에 설명된 중심 구조를 포함한, 다양한 구조 화학식을 따르는 화합물이 IRC로 사용하기 위하여 고려된다. 화학식 I-III은 "선형 IRC"에 대한 중심 서열을 나타낸다. 화학식 IV-VI는 "분지 IRC"에 대한 중심 서열을 나타낸다. 화학식 VII는 "단일-스페이서 IRC"에 대한 중심 구조를 나타낸다.
본원에 제공된 각 화학식에, "N"은 핵산 부분(5'→3' 또는 3'→5' 방향으로 방향지워진)을 가리키고 "S"는 비핵산 스페이서 부분을 가리킨다. 줄표("-")는 핵산 부분과 비-핵산 스페이서 부분 사이의 공유결합을 가리킨다. 이중 줄표("--")는 비-핵산 스페이서 부분과 적어도 2 핵산 부분 사이의 공유결합을 가리킨다. 삼중 줄표("---")는 비-핵산 스페이서 부분과 다중(즉, 적어도 3) 핵산 부분 사이의 공유결합을 가리킨다. 첨자는 상이하게 위치한 핵산 또는 비-핵산 스페이서 부분을 가리키는 데 사용된다. 그러나, 상이한 핵산 부분을 구별하기 위한 첨자의 사용은 그 부분이 반드시 상이한 구조 또는 서열을 가진다는 것을 지시하는 것으로 의도되지는 않는다. 유사하게, 상이한 스페이서 부분을 구별하기 위한 첨자의 사용은 그 부분이 반드시 상이한 구조를 가진다는 것을 가리키는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 아래의 화학식 II에서, 핵산 부분으로 지시된 N1 및 N2는 동일한 또는 상이한 구조를 가질 수 있고, 스페이서 부분으로 지시된 S1 및 S2는 동일한 또는 상이 한 구조를 가질 수 있다. 또한, 추가의 화학적 부분(예를 들어, 인산염, 모노뉴클레오티드, 추가 핵산 부분, 알킬, 아미노, 티오 또는 이황화기 또는 결합기, 및/또는 스페이서 부분)은 중심 구조의 말단에 공유결합할 수 있다.
선형 IRC는 중심 구조에서 비-핵산 스페이서 부분이 2 핵산 부분 이하에 공유결합된 구조를 가진다. 예시적 선형 IRC는 하기 화학식을 따른다:
N1-S1-N2 (I)
N1-S1-N2-S2-N3 (II)
N1-S2-N2-S2-[Nv-Sv]A (III)
여기서 A는 1 내지 약 100 사이의 정수이고, [Nv-Sv]는 비-핵산 스페이서 부분에 콘쥬게이션된 핵산 부분의 추가 반복을 가리킨다. 첨자 "v"는 N과 S가"[Nv-Sv]의 각각의 반복에서 독립적으로 선택되고, "A"는 종종 1 내지 약 10 사이, 종종 1 내지 3 사이, 종종 정확하게 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 일부 구체예에서, A는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 하한 및 10, 20, 50 또는 100(예를 들어, 3 내지 10 사이) 중 독립적으로 선택된 상한에 의하여 한정된 범위에서의 정수이다.
예시적 선형 IRC는 하기를 포함하며:
N1-HEG-N2-OH (Ia)
N1-HEG-N1-PO4 (Ib)
N1-HEG-N2-HEG (Ic)
HEG-N1-HEG-N1-HEG (Id)
N1-HEG-N2-(HEG)4-N3 (If)
(N1)2-글리세롤-N1-HEG-N1 (Ig)
N1-(HEG)15-T (Ii)
(N1-HEG)2-글리세롤-HEG-N2 (Ij)
N1-HEG-T-HEG-T (Ik)
여기서 HEG는 헥사-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. TEG는 테트라-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다.
바람직한 선형 IRC는 하기를 포함한다:
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:67 (C907, C661-HEG-C869);
5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:68 (C913, C917-HEG-C869);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:69 (C914, C918-HEG-C869);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGZGGTTGT-3' (SEQ ID NO:70 (C916, C661-HEG-C920); 및
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-HEG-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:71 (C928, C869-HEG-C661)
분지 IRC는 적어도 3 핵산 부분에 공유결합된 다원자가 스페이서 부분(Sp)을 포함한다. 예시적 분지 IRC는 하기 화학식에 따라서 설명된다:
[Nv]A---Sp (IV)
[Sv-Nv]---Sp (V)
(S1-N1)-Sp--(Nv)A (VI)
여기서 Sp는 "A" 양의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv Sv-Nv(핵산 부분에 공유결합된 스페이서 부분을 포함한)에 공유결합된 다원자가 스페이서이다. 화학식 IV 및 V의 경우, A는 적어도 3이다. 화학식 IV 및 V의 다양한 구체예에서, A는 3과 100 사이의 정수이지만, A는 약 3, 5. 10, 50, 또는 100의 하한 및 약 5, 7, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500 중 독립적으로 선택된 상한에 의하여 한정된 범위에서의 정수이거나 대안적으로 A는 500 이상일 수 있다. 화학식 VI의 경우, A는 적어도 2 이상, 2, 5, 10, 50, 또는 100의 하한 및 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500 중 독립적으로 선택된 상한에 의하여 한정된 범위, 또는 500 이상의 정수일 수 있다.
예시적 분지 IRC는 하기를 포함한다:
(N1)2-글리세롤-N1 (IVa)
(N2-HEG)2-글리세롤-N1 (IVb)
(N1-HEG-N2)2-글리세롤-N1 (IVc)
[(N1)2-글리세롤-N1]2-글리세롤-N1 (IVd)
바람직한 분지 IRC는 (5'-N1-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-5'-N1-3' 및 (5'-N1-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-5'-N1'을 포함한다.
단일 스페이서 IRC는 단일 스페이서 부분, 즉 하기에 공유결합으로 콘쥬게이션된 단일 핵산 부분이 있는 구조를 포함한다:
N1-S1 (VII)
바람직한 구체예에서, S1은 예를 들어, 하기에 설명된 바와 같이, 통상적으로 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의하여 연결된 더 작은 단위체(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스, C2 알킬-C12 알킬 하위단위체 등)를 포함한 멀티머의 구조를 가진다. 예를 들어, 아래의 화학식 VIIa를 참조하라. 멀티머는 이형 또는 동형일 수 있다. 한 구체예에서, 스페이서는 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포티오에이트 에스테르)에 의하여 결합된 헤테로머 또는 모노머 단위체이다(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스, C2 알킬 내지 C12 알킬 링커 등). 예를 들어, 아래의 화학식 VIIb를 참조하라.
예시적 단일 스페이서 IRC는 하기를 포함한다:
N1-(HEG)15 (VIIa)
N1-HEG-프로필-HEG-프로필-HEG (VIIb)
어떤 구체예에서, IRC의 말단 구조는 공유결합되어(예를 들어, 핵산 부분 대 핵산 부분; 스페이서 부분 대 스페이서 부분, 또는 핵산 부분 대 스페이서 부분), 환형 구조를 생성한다.
본 발명의 면역조절 조성물에 사용하기 위한 IRC는 하나 이상의 핵산 부분을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "핵산 부분"은 뉴클레오티드 모노머(즉, 모노뉴클레오티드) 또는 폴리머(즉, 적어도 2 인접하는 뉴클레오티드를 포함한)를 가리킨다. 본원에 설명된 바와 같이, 뉴클레오티드는 (1) 인산기에 에스테르 결합된 당에 결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 (2) 염기 및/또는 당 및/또는 인산 에스테르가 예를 들어, 아래에 기재된 유사체에 의하여 대체된 유사체를 포함한다. 하나 이상의 핵산 부분을 포함한 IRC에서, 핵산 부분은 동일하거나 상이할 수 있다.
면역조절 조성물에 혼입된 IRC에 사용된 핵산 부분은 본원에 개시된 IRS 서열 중 어떤 것을 포함할 수 있고, 추가로 6개 염기쌍 이하의 서열일 수 있다. 다중 핵산 부분을 포함한 IRC에서, 핵산 부분은 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. IRC가 하나 이상의 핵산 부분을 포함한 어떤 구체예에서, 오직 한 부분만 IRS를 포함할 필요가 있다.
다중 핵산 부분을 포함한 IRC에서, 핵산 부분은 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 다양한 구체예에서, 면역조절 조성물에 혼입된 IRC는 (a) 동일한 서열을 가진 핵산 부분, (b) 핵산 부분의 하나 이상의 반복, 또는 (c) 두 개 이상의 상이한 핵산 부분을 포함한다. 추가로, 단일 핵산 부분은 핵산 부분 내의 추가적 뉴클레오티드 염기에 의하여 인접하거나, 오버랩되거나, 분리될 수 있는 하나 이상의 IRS를 포함할 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 일부 IRP는 TLR9 의존적 세포 반응을 억제하는 데 특히 효과적이고 일부 IRP는 TLR7/8 의존적 세포 반응을 억제하는 데 특히 효과적이다. IRC는 하나 이상의 IRP를 포함할 수 있기 때문에, 다양한 활성을 가진 IRP는 특정 용도를 위하여 특정 활성을 가진 IRC를 생성하기 위하여 조합될 수 있다.
일부 예에서, IRC에서 두 IRP의 조합은 IRP 중 어떤 것 단독과는 다른 IRC의 면역조절 활성을 이끈다. 예를 들어, IRC SEQ ID NO:68(C913)은 HEG 부분을 통하여 IRP SEQ ID NO:17(C869)에 연결된 IRP SEQ ID NO:33(C917)을 함유한다. IRP SEQ ID NO:33(C917)는 TLR-7/8 의존적 세포 반응을 억제하지만, TLR-9 의존적 세포 반응을 억제하지는 않는다. IRP SEQ ID NO:17(C869)는 TLR-7/8 의존적 세포 반응보다 TLR-9 의존적 세포 반응에 더 큰 억제적 활성을 가진다. 그러나, IRC SEQ ID NO:68(C913)는 TLR-7/8 의존적 세포 반응 및 TLR-9 의존적 세포 반응 모두를 억제하는 데 매우 좋은 활성이 있다. IRC SEQ ID NO:69(C914) 및 그것의 성분 IRP SEQ ID NO:34(C918) 및 SEQ ID NO:17(C869)의 경우에도 또한 동일하다.
IRC는 핵산 부분에 공유결합된 하나 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 포함한다. 편의를 위해서, 비-핵산 스페이서 부분은 종종 본원에서 "스페이서" 또는 "스페이서 부분"으로 언급된다. 스페이서는 일반적으로 분자량이 약 50 내지 약 50,000, 전형적으로 약 75 내지 약 5000, 가장 흔히는 약 75 내지 약 500이고, 다 양한 구체예에서 하나, 두 개, 세 개, 또는 세 개 이상의 핵산 부분에 공유결합된다. 다양한 제제가 핵산 부분을 연결하는 데 적합하다. 예를 들어, "비-핵산 링커", "비-뉴클레오티드 링커" 또는 "원자가 플랫폼 분자"로 과학 문헌에 언급된 다양한 화합물은 IRC에서 스페이서로 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 스페이서는 다중 공유결합된 하위단위체를 포함하고 호모폴리머 또는 헤테로폴리머 구조를 가질 수 있다. 모노뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 핵산 부분과 인접 비-핵산 스페이서 부분 사이에 아무런 차이가 없을 거라는 것을 배제하지 않고, 비-핵산 스페이서의 정의에 포함되지 않는 것으로 이해될 것이다.
어떤 구체예에서, 스페이서는 하나 이상의 비염기성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(즉, 뉴클레오티드 염기가 결핍되어 있지만, 당과 인산 부분을 가진다). 예시적 비염기성 뉴클레오티드는 1'2'-디디옥시리보스, 1'-디옥시리보스, 1'-디옥시아라비노스 및 그것의 폴리머를 포함한다.
다른 적합한 스페이서는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 폴리글리콜, 선택적으로 치환된 폴리아민, 선택적으로 치환된 폴리알코올, 선택적으로 치환된 폴리아미드, 선택적으로 치환된 폴리에테르, 선택적으로 치환된 폴리이민, 선택적으로 치환된 폴리포스포디에스테르(예를 들어 폴리(1-포스포-3-프로판올)) 등을 포함ㅎ나다. 선택적 치환기는 알코올, 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 및 프로폭시), 직쇄 또는 분쇄 알킬(예를 들어 C1-C12 알킬), 아민, 아미노알킬(예를 들어 아미노 C1-C12 알킬), 포스포라미디트, 인산, 티오인산, 히드라지드, 히드라진, 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, 또는 I), 아미드, 알킬아미드(예를 들어, 아미 드 C1-C12 알킬), 카르복실산, 카르복실 에스테르, 카르복실 무수물, 카르복실산 할리드, 술포닐 할리드, 이미데이트 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 할로포메이트, 카르보디이미드 부가물, 카르보디이미드 부가물, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 할로아세틸, 알킬 할리드, 알킬 술포네이트, R1R2가 -C(=O)CH=CHC(=O)(말레이미드)인 NR1R2, 티오에테르, 시아노, 당(예를 들어, 만노스, 갈락토스, 및 글루코스), α,β-불포화 카르보닐, 알킬 수은, α,β-불포화 술폰을 포함한다.
적합한 스페이서는 폴리사이클릭 분자, 예를 들어 페닐 또는 사이클로헥실 환을 함유한 것을 포함할 수 있다. 스페이서는 폴리에테르, 예를 들어 폴리포스포프로판디올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 두 기능의 폴리사이클릭 분자, 예를 들어 두 기능의 펜탈렌, 인덴, 나프탈렌, 아줄렌, 헵탈렌, 비페닐렌, 어심인다센, 심-인다센, 아세나프틸렌, 플루오렌, 페날렌, 페난트렌, 안트라센, 플루오란텐, 아세페나트릴렌, 아세안트릴렌, 트리페닐렌, 피렌, 크리센, 나프타센, 티안트렌, 이소벤조푸란, 크로멘, 크산텐, 페녹사틴일 수 있고, 이것은 치환 또는 변형될 수 있거나 폴리에테르의 조합 및 폴리사이클릭 분자일 수 있다. 폴리사이클릭 분자는 C1-C5 알킬, C6 알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 할로겐 또는 할로알킬기로 치환 또는 폴리치환될 수 있다. 질소-함유 폴리헤테로사이클릭 분자(예를 들어, 인돌리진)는 통상적으로 적합한 스페이서가 아니다. 스페이서는 또한 폴리알코올, 예를 들어, 글리세롤 또는 펜타에리트리톨일 수 있다. 한 구체예에서, 스페이서는 1-포 스포프로판)3-인산 또는 1-포스포프로판)4-인산(테트라포스포프로판디올 및 펜타포스포프로판디올이라고도 함)을 포함한다. 한 구체예에서, 스페이서는 유도체화된 2.2'-에틸렌디옥시디에틸아민(EDDA)을 포함한다.
IRC에 유용한 비-핵산 스페이서의 구체적 예는 문헌(Cload et al. (1991 ) J Am. Chem. Soc. 113:6324; Richardson et al. (1991) J Am. Chem. Soc. 113:5109; Ma et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:2585; Ma et al. (1993) Biochemistry 32:1751 ; McCurdy et al. (1991) Nucleoside & Nucleotide 10:287; Jaschke et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34:301; Ono et al. (1991) Biochemistry 30:9914; 및 국제 공보 WO 89/02439)에 설명된 "링커"를 포함한다.
다른 적합한 스페이서는 문헌(Salunkhe et al. (1992) J. Am. Chem. Soc 114:8768; Nelson et al. (1996) Biochemistry 35:5339-5344; Bartley et al. (1997) Biochemistry 36:14502-511; Dagneaux et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:4506-12; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-59; Reynolds et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:760-65; Hendry et al.(1994) Biochem. Biophys. Acta 1219:405-12; Altmann et al (1995) Nucleic Acids Res. 23:4827-35)에 설명된 링커를 포함한다. 또 다른 적합한 스페이서는 유럽 특허 No. EP0313219B1 및 미국 특허 No. 6,117,657에 설명된다.
예시적 비-핵산 스페이서는 올리고-에틸렌 글리콜(예를 들어, 약 10, 약 20, 약 40, 약 50, 약 100 또는 약 200 에틸렌 글리콜 단위체를 포함한 트리에틸렌 글 리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, 및 다른 폴리머), 알킬 스페이서(예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실 , 및 다른 C2-C12 알킬 스페이서, 예를 들어, 대개 C2-C1O 알킬, 가장 흔히 C2-C6 알킬), 비염기성 뉴클레오티드 스페이서, 글리세롤에서 유래한 대칭 또는 비대칭 스페이서, 펜타에리트리톨 또는 1,3,5-트리히드록시사이클로헥산(예를 들어, 본원에 설명된 대칭 더블러 및 트레블러 스페이서 부분)을 포함한다. 스페이서는 또한 이종 또는 동종 올리고머 및 앞서 언급한 화합물의 폴리머(예를 들어, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트 또는 다른 결합으로 결합된)를 포함한다.
적합한 스페이서 부분은 특정 세포 또는 기관에 IRC에 대한 전하 및/또는 소수성에 기여하고(예를 들어, 개선된 안정도, 혈액에서의 더 긴 체류 시간), IRC에 대한 유리한 약동학 특성에 기여하고/거나 특정 세포 또는 기관에 IRC를 표적화한다. 스페이서 부분은 IRC를 원하는 약동학 특성 또는 원하는 형식의 투여(예를 들어, 경구 투여)에 대한 적합성에 맞추기 위하여 선택되거나 변형될 수 있다. 편의상, IRC가 실질적으로 화합물의 콘쥬게이트 및 인접 핵산 부분 또는 다른 스페이서 부분 성분을 포함한다는 인식과 함께, 스페이서(또는 스페이서 성분)는 종종 스페이서 성분이 유래된 화합물의 화학명으로 언급된다(예를 들어, 헥사에틸렌 글리콜)는 것을 독자는 이해할 것이다.
하나 이상의 스페이서 부분을 포함한 IRC에서, 스페이서는 동일하거나 상이 할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, IRC에 있는 비-핵산 스페이서 부분 모두는 동일한 구조를 가진다. 한 구체예에서, IRC는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개 또는 그 이상의 상이한 구조를 가진 비-핵산 스페이서 부분을 포함한다.
본 발명의 일부 고려된 구체예에서, IRC의 스페이서 부분은 특정 구조를 배제하도록 한정된다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 스페이서는 비염기성 뉴클레오티드 또는 비염기성 뉴클레오티드의 폴리머 이외의 것이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 스페이서는 올리고(에틸렌글리콜)(예를 들어, HEG, TEG 등) 또는 폴리(에틸렌글리콜) 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 C3 알킬 스페이서 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 폴리펩티드 이외의 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 면역원성 분자, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드는 스페이서 부분의 성분으로서 적합하지 않다. 그러나, 아래에 논의하는 바와 같이, 어떤 구체예에서, IRC는 "단백질성 IRC" 즉, 폴리펩티드를 포함한 스페이서 부분을 포함하는 것으로 고려된다. 그러나, 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 단백질이 아니고/거나 항원이 아니다(즉, 스페이서 부분은 IRC로부터 분리되지 않으면 항원이 아니다).
일반적으로, 적합한 스페이서 부분은 수용액(예를 들어, PBS, pH 7.0)에서 불용성 성분인 IRC를 제공하지 않는다. 따라서, 스페이서의 정의는 마이크로담체 또는 나노담체를 배제한다. 또한, 도데실 스페이서(디알코올 전구체 1,12-디히드록시도데케인으로 측정했을 때 용해도 < 5 mg/ml)와 같은 낮은 용해도를 가진 스페이 서 부분은 IRC의 친수성 및 활성을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 바람직하게는, 스페이서 부분은 디알코올 전구체로 측정했을 때 5 mg/ml 보다 훨씬 큰 용해도를 가진다(예를 들어, ≥20 mg/ml, ≥50 mg/ml 또는 ≥100 mg/ml).
IRC의 전하는 핵산 부분뿐만 아니라 비-핵산 스페이서 부분에서 인산, 티오인산, 또는 다른 기로 제공될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 비-핵산 스페이서 부분은 순 전하(예를 들어, pH7에서 측정했을 때 순 양전하 또는 순 음전하)를 운반한다. 한 유용한 구체예에서, IRC는 순 음전하를 가진다. 일부 구체예에서, IRC에서 스페이서 부분의 음 전하는 그것의 전하를 증가시키는 본원에 설명된 스페이서 하위단위체를 유도체화함으로써 증가된다. 예를 들어, 글리세롤은 두 핵산 부분에 공유결합될 수 있고, 남은 알코올은 활성화된 포스포라미디트와 반응할 수 있으며, 이어서 산화 또는 황화하여 인산 또는 티오인산을 각각 형성한다. IRC에서 비-핵산 스페이서 부분에 의하여 제공된 음전하는(즉, 하나 이상의 스페이서가 있을 때 전하의 합) IRC의 핵산 부분에 의하여 제공된 음전하보다 더 크다. 전하는 분자 화학식에 기초하여 계산될 수 있거나, 실험적으로, 예를 들어, 모세관 전기영동에 의하여 결정될 수 있다(Li, ed., 1992, Capillary electrophoresis, Principles, Practice and Application Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, pp202-206).
위에 기록한 바와 같이, 적합한 스페이서는 통상적으로 비-뉴클레오티드 "링커"로 언급된 화합물을 포함한 스페이서로서 유용한, 본원에 설명된 것들과 같은 더 작은 비-핵산(예를 들어, 비-뉴클레오티드) 화합물의 폴리머일 수 있다. 이러한 폴리머(즉, "다단위체 스페이서")는 이종 또는 동종일 수 있고, 종종 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의하여 연결된 모노머 단위체(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스 등)를 포함할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서 스페이서는 비-뉴클레오티드 단위체의 폴리머(예를 들어, 헤테로폴리머) 구조를 포함한다(예를 들어, 2 내지 약 100 단위체, 대안적으로 2 내지 약 50, 예를 들어, 2 내지 약 5, 대안적으로 예를 들어, 약 5 내지 약 50, 예를 들어, 약 5 내지 약 20).
실례를 위해서, SEQ ID NO:17 (C869) 및 다단위체 스페이서를 함유한 IRC는 하기를 함유한다:
5' -TCCTGGAGGGGTTGT-(C3)15-T
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(글리세롤)15-T
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(TEG)8-T
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(HEG)4-T
여기서, (C3)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통하여 연결된 15 프로필 링커를 의미하고; (글리세롤)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통하여 연결된 15 글리세롤 링커를 의미하며; (TEG)8은 포스포로티오에이트 에스테르를 통하여 연결된 8 트리에틸렌글리콜 링커를 의미하고; (HEG)4는 포스포로티오에이트 에스테르를 통하여 연결된 4 헥사에틸렌글리콜 링커를 의미한다. 어떤 다단위체 스페이서는 순 음전하를 가지고, 음 전하는 예를 들어 에스테르-결합된 모노머 단위체의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
어떤 구체예에서, 스페이서 부분은 다원자가의 비-다핵산 스페이서 부분(즉, "다원자가 스페이서")이다. 본원에 사용된 경우, 다원자가 스페이서를 함유한 IRC는 세 개 이상의 핵산 부분에 공유결합된 스페이서를 함유한다. 다원자가 스페이서는 종종 당업계에서 "플랫폼 분자"로 언급된다. 다원자가 스페이서는 폴리머 또는 비폴리머일 수 있다. 적합한 분자의 예는 글리세롤 또는 치환된 글리세롤(예를 들어, 2-히드록시메틸 글리세롤, 레불리닐-글리세롤); 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타사이클로덱스트린, 1,3,5-트리히드록시사이클로헥산, 펜타에티트리톨 및 펜타에리트리톨의 유도체, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자사이클로 테트라데칸(Cyclam), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데케인(Cyclen), 폴리에틸렌이민, 1,3-디아미노-2-프로판올 및 치환된 유도체, 프로필옥시메틸에틸 화합물(예를 들어, "트레블러"), 소위 "Star PEG" 및 "bPEG"와 같은 폴리에틸렌 글리콜 유도체(예를 들어, Gnanou et al. (1988) Makromol. Chem. 189:2885; Rein et al. (WS) Acta Polymer 44:225; U.S. Pat. No. 5,171,264), 및 덴드리머를 포함한다.
덴드리머는 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 분지 구조를 얻기 위하여 다기능 모노머의 단계적 또는 반복 반응에 의하여 제조된, 화학적으로 규명된 구형 분자이다(예를 들어, Tomalia et al. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75를 참조하라). 다양한 덴드리머, 예를 들어, 아민-종결된 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민 및 폴리프로필렌이민 덴드리머는 공지되어 있다. 본 발명에 유용한 예 시적 덴드리머는 소위 "폴리(아미도아민) ("PAMAM") 덴드리머"를 포함한, U.S. Pat. No. 4.587,329; 5,338,532; 및 6,177,414에 설명된 것들과 같은 "밀집 별" 폴리머 또는 "별폭발" 폴리머를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 또 다른 멀티머 스페이서 분자는 U.S. Pat. No. 5,552,391; 및 PCT 출원 공보 WO 00/75105, WO 96/40197, WO 97/46251, WO 95/07073, 및 WO 00/34231에 개시된 것들과 같은 화학적으로 규명된, 비-폴리머 원자가 플랫폼 분자를 포함한다. 많은 다른 적합한 다원자가 스페이서가 사용될 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
핵산 부분을 플랫폼 분자에 콘쥬게이션하는 것은 통상적으로 핵산 부분 및 플랫폼 분자에 하나 이상의 교차결합 제제 및 기능기를 포함한, 어떤 방식으로든지 영향을 받을 수 있다. 결합기는 표준 합성 화학 기술을 사용하여 플랫폼에 첨가된다. 결합기는 표준 합성 기술을 사용하여 핵산 부분에 첨가될 수 있다.
다양한 원자가를 가진 다원자가 스페이서는 본 발명의 수행시 유용하고, 다양한 구체예에서, IRC의 다원자가 스페이서는 약 3 내지 약 400 핵산 부분, 종종 3 내지 100, 종종 3-50, 자주 3-10, 그리고 종종 400 이상의 핵산 부분에 결합된다. 다양한 구체예에서, 다원자가 스페이서는 10 이상, 25 이상, 50 이상, 또는 500 이상의 핵산 부분(동일하거나 상이할 수 있다)에 콘쥬게이션된다. IRC가 다원자가 스페이서를 포함한 어떤 구체예에서, 본 발명은 약간 상이한 분자 구조를 가진 IRC의 집단을 제공하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 덴드리머를 고 원자가 다원자가 스페이서로서 사용하여 IRC가 제조될 때, 즉, 각 덴드리머 분자에 결합된 다른 수(결정할 수 있는 범위 내 또는 주로 그 범위 내)의 핵산 부분을 포함한, 분자의 다소 이종인 혼합물이 생성된다.
핵산 부분에 결합하도록 유도체화된 다당류는 IRC에서 스페이서로 사용될 수 있다. 적합한 다당류는 자연적으로 발생하는 다당류(예를 들어, 덱스트란) 및 합성 다당류(예를 들어, 피콜)를 포함한다. 예를 들어, 아미노에틸카르복시메틸-피콜(AECM-Ficoll)은 Inman (1975) J. lmm. 114:704-709의 방법으로 제조될 수 있다. 그 후, AECM-Ficoll은 다른 두 기능의 교차결합 시약, 예를 들어, 6-말레이미도 카프로익 아실 N-히드록시 숙신이미드 에스테르와 반응할 수 있고, 그 다음, 티올-유도체화된 핵산 부분에 콘쥬게이션될 수 있다(Lee et al. (1980) Mol. Imm. 17:749-56 참조). 다른 다당류는 유사하게 변형될 수 있다.
일반적인 방법을 사용하여 IRC를 제조하는 것은 당업자의 능력 안에서 본 명세서 및 당업계의 지식에 의하여 잘 안내될 것이다. 핵산 부분(예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드)을 제조하기 위한 기술은 공지되어 있다. 핵산 부분은, 한정하는 것은 아니지만, 효소적 방법 및 화학적 방법 그리고 효소 및 화학적 접근법의 조합을 포함한 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유한 DNA 또는 RNA는 3'-말단에 고형 지지체에 부착된 자라나는 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시기에 적합한 뉴클레오시드 포스포라미디트를 순차적으로 결합하시키고, 그 후 중간 아인산 트리에스테르를 인산 트리에스테르로 산화시킴으로써 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 합성을 위한 유용한 고형 지지체는 Controlled Pore Glass(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티), 폴리스티렌 비드 매트릭스(Primer Support, Amersham Pharmacia, 뉴저지, 피 스카타웨이) 및 TentGel(Rapp Polymere GmbH, 독일, 튀빙엔)를 포함한다. 원하는 올리고뉴클레오티드가 합성되자마자, 올리고뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 인산 트리에스테르기는 인산 디에스테르에 탈보호되며, 뉴클레오시드 염기는 수용성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다.
예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유한 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드(핵산 부분)는 대체로 하기 단계의 반복적 되풀이에 의하여 합성된다: a) 3'-고형 지지체-결합된 뉴클레오시드 또는 핵산의 5' 히드록실기로부터 보호기의 제거, b) 5'-히드록실기에 활성화된 뉴클레오시드 포스포라미디트의 결합, 및 c) 아인산 트리에스테르의 인산 트리에스테르로의 산화, 및 d) 반응하지 않은 5'-히드록실기의 캡핑. 포스포로티오에이트 결합을 함유한 DNA 또는 RNA는 산화 단계가 황화 단계로 대체되는 것을 제외하고 전술한 바와 같이 제조된다. 원하는 올리고뉴클레오티드 서열이 합성되자마자, 올리고뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 인산 트리에스테르기는 인산 디에스테르에 탈보호되며, 뉴클레오시드 염기는 수용성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다. 예를 들어, 문헌(Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHESIS AND PROPERTIES (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4:194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4:1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699. 및 U.S. Pat. No. 4,458,066)을 참조하라. 특정 서열의 핵산 부분을 자동적으로 합성하는 프로그램가 능한 기계는 널리 사용가능하다. 그 예로는 Expedite 8909 자동화 DNA 합성기(Perseptive Biosystem, 메사츄세츠 프래밍톤); ABI 394(Applied Biosystems, Inc., 캘리포니아 포스터 시티); 및 OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech, 뉴저니 피스카타웨이)가 있다.
폴리뉴클레오티드는 예를 들면 산분해성 5'-보호기 및 3'-포스포라미디트를 함유한 염기-보호된 뉴클레오시드(모노머)를 사용하여, 3'에서 5' 방향으로 조립될 수 있다. 이러한 모노머의 예는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-3'-O-(N,N-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포라미디트를 포함하고, 보호된 뉴클레오시드의 예는, 한정하는 것은 아니지만, N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘, N2-이소부티틸구아노신, 티미딘, 및 우리딘을 포함한다. 이 경우에, 사용된 고형 지지체는 3'-결합된 보호된 뉴클레오시드를 함유한다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 산분해성 3'-보호기 및 5'-포스포라미디트를 함유한 염기-보호된 뉴클레오시드를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 조립될 수 있다. 이러한 모노머의 예는 3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포라미디트를 포함하고, 보호된 뉴클레오시드의 예는, 한정하는 것은 아니지만, N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘, N2-이소부티릴구아노신, 티미딘, 및 우리딘(Glen Research, 버지니아 스털링)을 포함한다. 이 경우에, 사용된 고형 지지체는 5'-결합된 보호된 뉴클레오시드를 함유한다. 고리형 핵산 성분은 분리되어, 재조합 방법을 통하여 합성될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 화학 합성은 문헌에 설명된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문 헌(Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029 및 Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333)을 참조하라.
비-핵산 스페이서 부분의 첨가는 일반적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 스페이서 부분을 첨가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 상기에 인용된 참고문헌에 설명된다. 예를 들어, 문헌(Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359)을 참조하라. 스페이서 부분과 핵산 부분 사이의 공유결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화, 포스포라미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 및 다른 결합을 포함한 많은 유형 중 어떤 것일 수 있다. 핵산 부분의 합성에 사용된 동일한 포스포라미디트형 화학을 사용하여 스페이서 부분(들)과 핵산 부분(들)을 결합시키는 것이 종종 편리할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 IRC는 포스포라미디트 화학을 사용한 자동 DNA 합성기(예를 들어, Expedite 8909; Perseptive Biosystems, 메사츄세츠 프레밍톤)를 사용하여 편리하게 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌(Beaucage, 1993, 상기 참조; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 상기 참조)을 참조하라). 그러나, 당업자는 자동 DNA 합성기로 수행된 동일한(또는 동등한) 합성 단계를 또한 원한다면 수동으로 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 합성에서, 스페이서의 한 말단은 통상적으로 4,4'-디메톡시트리틸기로 보호되고, 다른 말단은 포스포라미디트기를 함유한다.
필수 보호기 및 반응기를 가진 다양한 스페이서는 상업적으로 구입가능하며, 그 예로는 다음과 같다:
* 트리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 "TEG 스페이서"
9-O-(4,4'-디메톡시트리틸)트리에틸렌글리콜-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 22825 Davis Drive, 버지니아 스털링)
* 헥사에틸렌 글리콜 스페이서 또는 "HEG 스페이서"
18-O-(4,4'-디메톡시트리틸)헥사에틸렌글리콜-1-O-(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링)
* 프로필 스페이서
3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링);
* 부틸 스페이서
4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)부틸옥시-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, 메사츄세츠 애쉬랜드 호머 애비뉴 200)
* 헥실 스페이서
6-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)헥실옥시-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
* 2-(히드록시메틸)에틸 스페이서 또는 "HME 스페이서"
1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-3-(레불리닐옥시)-프로필옥시-2-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]; "비대칭 분지" 스페이서라고도 함
* "비염기성 뉴클레오티드 스페이서" 또는 "비염기성 스페이서"
5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-1,2-디디옥시리보스-3-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링)
* "대칭 분지 스페이서" 또는 "글리세롤 스페이서"
1,3-O,O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)글리세롤-2-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Chem Genes, 메사츄세츠 애쉬랜드)
* "트레블러 스페이서"
2,2,2-O,O,O-트리[3-O-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-1-
O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링)
* "대칭 더블러 스페이서"
1,3-O,O-비스[5-O-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링)
* "도데실 스페이서"
12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데실옥시-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미디트]
(Glen Research, 버지니아 스털링)
이들 및 다양한 다른 보호된 스페이서 부분 전구체(예를 들어, DMT 및 포스포라미디트기 보호기를 포함한)는 구입할 수 있고 또는 본원에 개시된 IRC를 제조하는 데 사용하기 위한 일반적인 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 기구는 원하는 순서대로 뉴클레오티드 모노머 및 스페이서를 첨가하는 제조업자의 지침에 따라서 프로그램된다.
포스포라미디트 화학의 사용이 특정 IRC의 제조에 편리하지만, 본 발명의 IRC는 합성 또는 제조의 어떤 특정 방법으로 제조된 화합물에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 유형의 핵산 부분에 콘쥬게이션된 다원자가 스페이서를 가진 IRC가 제조된다. 예를 들어, 두 개의 말레이미드기(티올-함유 폴리뉴클레오티드와 반응할 수 있는), 및 두 개의 활성화된 에스테르기(아미노-함유 핵산과 반응할 수 있는)를 함유한 플랫폼이 설명되었다(예를 들어, PCT 출원 공보 WO 95/07073 참조). 이들 두 활성화기는 서로서로 독립적으로 반응할 수 있다. 이것은 4 핵산 부분의 전체, 각 서열의 두 개를 함유한 IRC를 생성할 것이다.
두 다른 핵산 서열을 함유한 다원자가 스페이서를 가진 IRC는 또한 전술한 대칭 분지 스페이서 및 종래의 포스포라미디트 화학(예를 들어, 수동 또는 자동 방법을 사용하여)을 사용하여 제조될 수 있다. 대칭 분지 스페이서는 포스포라미디트 기 및 동일하고 동시에 제거되는 두 보호기를 함유한다. 한 접근법에서, 예를 들어, 첫 번째 핵산은 합성되어 대칭 분지 스페이서에 결합되고, 보호기는 스페이서로부터 제거된다. 그 후, (동일한 서열의) 두 개의 추가 핵산은 스페이서 상에 합성된다(각 단계에서 단일 핵산 부분의 합성에 사용된 시약의 양을 배로 사용하여).
유사한 방법은 세 개의 상이한 핵산 부분(하기에 핵산 I, II, 및 III으로 언급되는)을 다원자가 플랫폼(예를 들어, 비대칭 분지 스페이서)에 연결하는 데 사용될 수 있다. 이것은 자동 DNA 합성기를 사용하여 가장 편리하게 수행된다. 한 구체예에서, 비대칭 분지 스페이서는 포스포라미디트기 및 독립적으로 제거될 수 있는 두 직교 보호기를 함유한다. 첫 번째, 핵산 I이 합성되고, 그 후 비대칭 비대칭 분지 스페이서가 핵산 I에 결합되며, 그 후 핵산 II가 보호기 중 하나의 선택적 제거 후에 첨가된다. 핵산 II는 탈보호되고, 캡핑되며, 그 후 스페이서 상의 다른 보호기가 제거된다. 마지막으로, 핵산 III가 합성된다.
일부 구체예에서, 핵산 부분(들)은 합성되고, 반응성 결합기(예를 들어, 아미노, 카르복시, 티오, 이황화 등)가 표준 합성 화학 기술을 사용하여 첨가된다. 반응성 결합기(생성된 스페이서 부분의 일부를 형성하는 것으로 간주되는)는 추가 비-핵산 화합물에 콘쥬게이션되어 스페이서 부분을 형성한다. 결합기는 문헌에 설명된 또는 상업적으로 구입가능한 다양한 시약을 채용한 핵산 합성을 위한 표준 방법을 사용하여 핵산에 첨가된다. 그 예로는 보호된 아미노기, 카르복시기, 티올기, 또는 이황화기 및 포스포라미디트기를 함유한 시약이 있다. 이들 화합물이 활성화된 포스포라미디트기를 통하여 핵산 내로 혼입되고 탈보호되었을 때, 이들은 아미 노, 카르복실, 또는 티올 반응성있는 핵산을 제공한다.
다양한 길이의 친수성 링커는 예를 들어 핵산 부분과 플랫폼 분자를 연결하는 데 유용하다. 다양한 적합한 링커는 공지되어 있다. 적합한 링커는, 한정하는 것은 아니지만, 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 이러한 링커는 화학식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2를 가진 링커를 포함하는 데, 여기서 n = 0-200, m = 1 또는 2, R1 = H 또는 트리틸과 같은 보호기, R2 = H 또는 알킬 또는 아릴, 예를 들어, 4-니트로페닐 에스테르이다. 이들 링커는 티오에테르를 통하여 할로아세일, 말레이아미드 등과 같은 티올 반응기를 함유한 분자를 아미드 결합을 통하여 아미노기를 함유하는 두 번째 분자에 연결하는 데 유용하다. 부착의 순서는 다양할 수 있는데, 즉 티오에테르 결합은 아미드 결합이 형성되기 전에 또는 후에 형성될 수 있다. 다른 유용한 링커는 Sulfo-SMCC (술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복실레이트) Pierce Chemical Co. 제품 22322; Sulfo-EMCS (W-[ε-말레이미도카르프로일옥실 술포숙신이미드 에스테르) Pierce Chemical Co. 제품 22307; Sulfo-GMBS (N-[γ-말레이미도부티릴옥시] 술포숙신이미드 에스테르) Pierce Chemical Co. 제품 22324 (Pierce Chemical Co., 일리노이 록포드), 및 R = 알킬, 사이클릭 알킬, 에틸렌 글리콜의 폴리머 등인 일반 화학식 말레이미도-R-C(O)NHS 에스테르를 포함한다.
핵산 부분을 다원자가 스페이서에 공유결합시키기 위하여 특히 유용한 방법은 상기에 인용된 참고문헌에 설명된다.
어떤 구체예에서, 복수의 핵산 부분들이 직접적으로 또는 링커를 통하여 공유 콘쥬게이션되어 "단백질성 IRC"를 형성하는 다원자가 스페이서 부분으로 사용된다. 폴리펩티드는 담체(예를 들어, 알부민)일 수 있다. 전형적으로, 단백질성 IRC는 길이가 2 내지 7, 더 자주 4 내지 7 뉴클레오티드, 대안적으로 길이가 2 내지 6, 2 내지 5, 4 내지 6, 또는 4 내지 5 뉴클레오티드의 적어도 하나 및 대개 몇 개 또는 많은 핵산 부분을 포함하고/거나 하위의 구별된 면역조절 활성을 가지거나 구별된 면역조절 활성을 가지지 않는다. 단백질성 IRC를 제조하는 방법은 본 발명을 검토하면 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 핵산은 핵산 부분의 3' 또는 5' 말단(또는 핵산 부분에 있는 내부 위치의 적합하게 변형된 염기에)과 적합한 반응기를 가진 폴리펩티드(예를 들어, 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접 반응할 수 있는 N-히드록시숙신이미드 에스테르) 간의 결합을 포함한 당업계에 공지된 방법에 의하여 폴리펩티드 스페이서에 공유 콘쥬게이션될 수 있다. 다른 예로서, 폴리펩티드는 핵산 부분에 혼입된 아민, 티올, 또는 카르복실기를 통한 핵산 부분의 자유 5'-말단에 부착될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 본원에 설명된 스페이서 부분에 콘쥬게이션될 수 있다. 또한, 한 말단에 보호된 아민, 티올, 또는 카르복실을 포함한 결합기 및 포스포라미디트는 폴리뉴클레오티드의 히드록실기에 공유결합될 수 있고, 탈보호된 후, 기능성은 IRC를 펩티드에 공유 결합시키는 데 사용될 수 있다.
IRP 및/또는 IRC 복합체 및 조성물
IRP 또는 IRC는 세포에 IRP 또는 IRC 전달을 및/또는 세포에 의한 흡수를 향 상시키기 위하여 개체에 직접 투여될 수도 있고 또는 조성물 또는 복합체로 투여될 수도 있다. 또한, 조성물 또는 복합체는 세포로의 두 개 이상의 다른 IRP 및/또는 IRC 종의 공동-전달을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, IRC와 IRP의 혼합물은 적어도 하나의 IRC와 IRP 종을 전달하기 위하여 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 전달 조성물 또는 복합체는, 한정하는 것은 아니지만, 본원에 설명되고 당업계에 공지된 복합체 및 콜로이드 분산 시스템을 캡슐에 넣는 것을 포함한다. 이러한 전달 조성물 또는 복합체의 예는 수중유 에멀션, 미셀, 및 리포솜을 포함한다. 전달 조성물 또는 복합체는 또한 본원에 설명된 링커 분자, 플랫폼 분자, 나노입자 또는 마이크로입자에 결합된 IRP 및/또는 IRC를 포함한다. 이러한 결합은 공유 및 비-공유 결합 모두를 포함한다. 달리 지시하지 않는 한, IRP와 함께 사용하기 위해 본원에 설명된 복합체 및 조성물 제형은 또한 IRC와 함께 사용하기에 적합하다.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 링커 분자와 콘쥬게이션된다. IRP 및/또는 IRC 부분은 공유 및/또는 비공유 상호작용을 포함한, 다양한 방식으로 콘쥬게이트의 링커 부분과 결합될 수 있다.
부분들 간의 연결은 IRP 및/또는 IRC의 3' 또는 5' 말단에서 또는 IRP 및/또는 IRC에 있는 내부 위치의 적합하게 변형된 염기에서 이루어질 수 있다. 링커가 펩티드이고 적합한 반응기(예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 함유하면, 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접 반응할 수 있다. IRP 및/또는 IRC에 있는 시토신의 수와 위치에 따라서, 하나 이상의 잔기에서 특이적 결합이 이루어질 수 있다.
대안적으로, 당업계에 공지된 것들과 같은 변형된 올리고뉴클레오시드는 IRP 및/또는 IRC에 있는 말단 또는 내부 위치에 혼입될 수 있다. 이들은 차단된 작용기를 함유할 수 있으며, 이것은 차단이 해제될 때 관심대상의 링커에 존재하거나 부착될 수 있는 다양한 작용기와 반응한다.
링커가 펩티드인 경우, 콘쥬게이트의 이 부분은 고형 지지체 화학을 통하여 IRP 및/또는 IRC의 3' 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, IRP 부분은 지지체 상에 사전-합성된 펩티드 부분에 첨가될 수 있다. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; 및 Haralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505. 대안적으로, IRP는 3' 말단으로부터 연장되는 절단가능한 링커를 통하여 고형 지지체에 연결되도록 합성될 수 있다. 지지체로부터 IRP의 화학적 절단시, 말단 티올기는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 남겨지고(Zuckermann et al (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; 및 Corey et al. (1987) Science 238:1401-1403) 또는 말단 아미노기는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 남겨진다(Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794). 아미노-변형된 IRP 및/또는 IRC를 펩티드의 아미노기에 콘쥬게이션하는 것은 문헌(Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72)에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 티올-변형된 IRP 및/또는 IRC를 펩티드의 카르복실기에 콘쥬게이션하는 것은 문헌(Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press)에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 첨부된 말레이미드를 운반하는 올리고뉴클레오티드를 펩티드의 시스테인 잔기의 티올 측쇄에 결합시키는 것은 문헌(Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465)에 설명된다.
콘쥬게이트의 펩티드 링커 부분은 그것을 합성하는 동안 올리고뉴클레오티드로 혼입된 아민, 티올, 또는 카르복실기를 통하여 IRP 및/또는 IRC의 5' 말단에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드가 고형 지지체에 고정되는 경우, 한 말단에 보호된 아민, 티올, 또는 카르복실 및 다른 말단에 포스포라미디트를 포함한 연결기는 5'-히드록실에 공유결합된다. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; 및 U.S. Pat. No. 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 및 5,118,802. 탈보호에 이어서, 아민, 티올, 및 카르복실기는 올리고뉴클레오티드를 펩티드에 공유 결합시키는 데 사용될 수 있다. Benoit et al. (1987); 및 Sinah et al. (1991).
IRP 및/또는 IRC 콘쥬게이트는 또한 이온결합, 소수성 상호작용, 수소결합 및/또는 반데르발스 인력과 같은 비공유 상호작용을 통하여 형성될 수 있다.
비공유결합된 콘쥬게이트는 비오틴-스트렙타비딘 복합체와 같은 비공유 상호작용을 포함할 수 있다. 비오틴닐기는 예를 들어 IRP 및/또는 IRC의 변형된 염기에 부착될 수 있다. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. 스트렙타비딘 부분을 펩티드 부분에 혼입함으로써 스트렙타비딘 콘쥬게이션된 펩티드와 비 오틴닐화된 올리고뉴클레오티드의 비공유결합된 복합체를 형성할 수 있다.
또한, 비공유 결합은 올리고뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하전된 잔기를 포함한 링커 부분의 사용을 통하여 IRP 및/또는 IRC를 포함한 이온성 상호작용을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비공유 콘쥬게이션은 펩티드 링커의 일반적으로 음전하 IRP 및/또는 양전하 아미노산 잔기, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리히스티딘 잔기 사이에 이루어질 수 있다.
지질에 IRP 및/또는 IRC를 결합시키는 것은 표준 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 이들 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오티드-인지질 콘쥬게이트의 합성(Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), 올리고뉴클레오티드-지방산 콘쥬게이트(Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; 및 Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222), 및 올리고뉴클레오티드-스테롤 콘쥬게이트를 포함한다. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
올리고당에 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 것은 표준 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 이들 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 올리고당이 면역글로불린의 부분인, 올리고뉴클레오티드-올리고당 콘쥬게이트의 합성을 포함한다. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.
고리형 IRP 및/또는 IRC를 펩티드 링커에 결합시키는 것은 몇 가지 방식으로 이루어질 수 있다. 고리형 IRP 및/또는 IRC가 재조합 또는 화학적 방법을 사용하여 합성되는 경우, 변형된 뉴클레오시드가 적합하다. Ruth(1991) in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. 그 다음 표준 결합 기술은 고리형 IRP 및/또는 IRC를 펩티드에 연결하는 데 사용될 수 있다. Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1:165. 고리형 IRP 및/또는 IRC가 재조합 또는 화학적 방법을 사용하여 분리되거나 합성되는 경우, 결합은 펩티드 내로 혼입된 화학적으로 활성화 또는 광활성화 반응기(예를 들어, 카르벤, 라디칼)에 의하여 이루어질 수 있다.
펩티드 및 다른 분자를 올리고뉴클레오티드에 부착하기 위한 다른 방법은 (U.S. Pat. No. 5,391,723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for Nucleic Acids" in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; 및 Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146)을 참조하라.
IRP 및/또는 IRC는 다른 방식으로 직접 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 캡슐에 넣음으로써 직접 결합될 수 있다. 다른 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 플랫폼 분자에 결합함으로써 결합될 수 있다. "플랫폼 분자"("플랫폼"이라고도 함)는 IRP 및/또는 IRC의 부착을 허용하는 부위를 함유한 분자이다. 다른 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 표면, 바람직하게는 담체 입자상에 흡착에 의하여 직접 결합된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 IRP 및/또는 IRC와 관련하여 캡슐형 제제를 채용한다. 바람직하게는, IRP 및/또는 IRC 그리고 캡슐형 제제를 포함한 조성물은 보조제 수중유 에멀션, 미립자 및/또는 리포솜의 형태이다. 더 바람직하게는, IRP 및/또는 IRC를 캡슐에 넣는 보조제 수중유 에멀션, 미립자 및/또는 리포솜은 크기가 약 0.04 μum 내지 약 100 μm, 바람직하게는 다음 범위 중 어느 하나이다: 약 0.1 μm 내지 약 20 μm; 약 0.15 μm 내지 약 10 μm; 약 0.05 μm 내지 약 1.00 μm; 약 0.05 μm 내지 약 0.5 μm.
콜로이드 분산 시스템, 예를 들어 미소구체, 비드, 거대분자 복합체, 나노캡슐 및 지질-기재 시스템, 예를 들어 수중유 에멀션, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜은 IRP 및/또는 IRC-함유 조성물의 효과적인 캡슐형을 제공할 수 있다.
캡슐형 조성물은 다양한 성분들 중 어느 것을 더 포함할 수 있다. 이들은, 한정하는 것은 아니지만, 명반, 지질, 인지질, 지질막 구조(LMS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 다른 폴리머, 예를 들어 폴리펩티드, 당펩티드 및 다당류를 포함한다.
캡슐형 성분에 적합한 폴리펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 당업계에 공지된 어떤 것도 포함하며, 한정하는 것은 아니지만, 지방산 결합 단백질을 포함한다. 변형된 폴리펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 당화, 인산화, 미리스틸화, 황화 및 수산화를 포함한 다양한 변형 중 어떤 것을 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, 적합한 폴리펩티드는 그것의 면역조절 활성을 보존하는 IRP 및/또는 IRC-함유 조성물을 보호하는 것이다. 결합 단백질의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA) 및 완두 알부민을 포함한다.
다른 적합한 폴리머는 약제학의 당업계에 공지된 어떤 것도 될 수 있으며, 한정하는 것은 아니지만, 자연 발생 폴리머, 예를 들어 덱스트란, 히드록시에틸 전분 및 다당류 및 합성 폴리머를 포함한다. 자연 발생 폴리머의 예는 단백질, 당펩티드, 다당류, 덱스트란 및 지질을 포함한다. 추가 폴리머는 합성 폴리머일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 합성 폴리머의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 폴리알킬 글리콜 (PAG), 예를 들어 PEG, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POP), 예를 들어 폴리옥시에틸화된 글리세롤 (POG), 폴리트리메틸렌 글리콜 (PTG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리아크릴산, 폴리에틸옥사졸린, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리아미노산, 폴리우레탄 및 폴리포스파젠을 포함한다. 또한 합성 폴리머는 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 호모폴리머, 코폴리머, 또는 두 개 이상의 다른 합성 모노머의 차단 코폴리머일 수 있다.
본 발명의 캡슐형 조성물에 사용하기 위한 PEG는 화학 공급업체에서 구입할 수 있거나 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "LMS"는 극성 지질의 극성 머리기가 경계면의 수상에 마주하도록 배열되어 막 구조를 형성한다. LMS의 예는 리포솜, 미셀, 코클리에이트(즉, 일반적으로 원통형 리포솜), 마이크로에멀션, 단층 소포, 다중층 소포 등을 포함한다.
본 발명의 선택적 콜로이드 분산 시스템은 리포솜이다. 본원에 사용된 바와 같이, "리포솜" 또는 "지질 소포"는 적어도 하나 및 가능하게는 하나 이상의 이중층 지질막으로 둘러싼 작은 소포이다. 리포솜은, 한정하는 것은 아니지만, 초음파분해, 압출, 또는 지질-세정제 복합체로부터의 세정제의 제거를 포함한, 당업계에 공지된 어떤 기술에 의하여 인지질, 당지질, 지질, 스테로이드, 예를 들어 콜레스테롤, 관련 분자 또는 이들의 조합으로부터 인공적으로 만들어질 수 있다. 리포솜은 또한 조직 표적화 성분과 같은 추가 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. "지질 막" 또는 "지질 이중층"은 오직 지질로만 구성될 필요는 없지만, 막의 일반 구조가 소수성 중심을 샌드위칭하는 두 친수성 면이라면, 한정하는 것은 아니지만, 콜레스테롤 및 다른 스테로이드, 지용성 화학물질, 어떤 길이의 단백질 및 다른 양친매성 분자를 포함한 어던 적합한 다른 성분을 추가로 함유할 수 있다. 막 구조의 일반적 논의는, 예를 들어 문헌(The Encyclopedia of Molecular Biology by J. Kendrew (1994))을 참조하라. 적합한 지질은, 예를 들어 문헌(Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdam)을 참조하라.
IRP 및/또는 IRC 조성물을 함유한 리포솜을 제조하기 위한 공정은 당업계에 공지되어 있다. 지질 소포는 당업계에 공지된 어떤 적합한 기술에 의하여 제조될 수 있다. 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 마이크로캡슐화, 마이크로유동화, LLC 방법, 에탄올 주입, 프레온 주입, "거품" 방법, 세제 투석, 수화, 초음파분해, 및 역상 증발을 포함한다. 문헌(Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68:715-724)을 검토하라. 기술들은 가장 바람직한 특성을 가진 소포를 제공하기 위하여 조합될 수 있다.
본 발명은 조직 또는 세포 표적화 성분을 함유한 LMS의 사용을 포함한다. 이러한 표적화 성분은 무결 동물, 기관 또는 세포 배양에 투여했을 때 다른 조직 또는 세포 부위에 우선하여 특정 조직 또는 세포 부위에 그것의 축적을 향상시키는 LMS의 성분이다. 표적화 성분은 일반적으로 리포솜 바깥으로부터 접근하기 쉽고, 따라서 바람직하게는 바깥 표면에 결합되거나 바깥 지질 이중층 내로 삽입된다. 표적화 성분은 특히 펩티드, 더 큰 펩티드의 한 영역, 세포 표면 분자 또는 마커에 특이적인 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편, 핵산, 탄수화물, 복합체 탄수화물의 한 영역, 특별한 지질, 또는 앞에서 언급한 분자들 중 어떤 것에 부착된 소분자, 예를 들어 약물, 호르몬, 또는 헵텐일 수 있다. 세포 유형-특이적 세포 표면 마커에 대한 특이성을 가진 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 당업계에 공지된 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.
LMS는 치료적 처치가 진행된 어떤 세포 유형, 예를 들어 면역반응을 조절 및/또는 관여할 수 있는 세포 유형으로 표적화될 수 있다. 이러한 표적 세포 및 기관은, 한정하는 것은 아니지만, APC, 예를 들어 대식세포, 수지상 세포 및 림프구, 림프 구조, 예를 들어 림프절 및 비장, 및 비림프 구조, 특히 수지상 세포가 발견된 것들을 포함한다.
본 발명의 LMS 조성물은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 계면활성제는 양이온, 음이온, 양친매성 또는 비이온성일 수 있다. 계면활성제의 바람직한 부류는 비이온성 계면활성제; 특히 수용성인 것이 바람직하다.
IRP 및/또는 IRC가 플랫폼 분자에 결합함으로써 직접 결합된 일부 구체예에서, 플랫폼은 단백질성 또는 비-단백질성(즉, 유기)일 수 있다. 단백질성 플랫폼의 알부민, 감마글로불린, 면역글로불린(IgG) 및 오브알부민을 포함한다. Borel et al. (1990) Immunol. Methods 126:159-168; Dumas et al. (1995) Arch. Dematol. Res. 287:123-128; Borel et al. (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:264-267; Borel et al. (1996) Ann. N. Y Acad. Sci 778:80-87. 플랫폼은 다원자가이어서(즉, 하나 이상의 결합 또는 연결 부위를 함유한다) 1 IRP 및/또는 IRC 이외에 대한 결합을 수용한다. 따라서, 플랫폼은 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상. 8 이상. 9 이상, 10 이상 결합 또는 연결 부위를 함유할 수 있다. 폴리머 플랫폼의 다른 예는 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 피콜, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알코올, 및 폴리 D-글루탐산/D-리신이다.
플랫폼 분자를 사용하는 원리는 당업계에 잘 이해되고 있다. 일반적으로, 플랫폼은 IRP 및/또는 IRC에 대한 적합한 결합 부위를 함유하거나, 함유하도록 유도체화된다. 게다가, 또는 대안적으로, IRP 및/또는 IRC는 적합한 연결기를 제공하도록 유도체화된다. 예를 들어, 단순 플랫폼은 펩티드와 같은 두 기능의 링커(즉, 두 결합 부위를 가진)이다.
플랫폼 분자는 생물학적으로 안정화될 수 있는데, 즉, 이것들은 치료 효능을 제공하는 데 종종 며칠 내지 몇 달의 생체내 배출 반감기를 보이고, 바람직하게는 정의된 조성물의 합성 단쇄로 구성된다. 이들은 일반적으로 약 200 내지 약 1,000,000, 바람직하게는 다음 범위 중 어떤 것의 분자량을 가질 수 있다: 약 200 내지 약 500,000; 약 200 내지 약 200,000; 약 200 내지 약 50,000 (또는 미만, 예를 들어 30,000). 원자가 플랫폼 분자의 예는 폴리머(또는 폴리머로 구성된다) 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 바람직하게는 약 200 내지 약 8000의 분자량을 가진), 폴리-D-리신, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, D-글루탐산과 D-리신 (3:2의 비율). 사용될 수 있는 다른 분자는 알부민 및 IgG이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 다른 플랫폼 분자는 U.S. Pat. No. 5,552,391에 개시된 화학적으로 규명된, 비폴리머 원자가 플랫폼 분자이다. 본 발명에서 사 용하기에 적합한 다른 동종 화학적으로 규명된 원자가 플랫폼 분자는 유도체화된 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민 (EDDA) 및 트리에틸렌 글리콜 (TEG)이다.
다른 적합한 원자가 플랫폼 분자는, 한정하는 것은 아니지만, 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타사이클로덱스트린, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸 (Cyclam) 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸 (Cyclen)을 포함한다.
대체로, 이들 플랫폼은 표준 화학합성 기술로 만들어진다. PEG는 유도체화되어 다원자가로 제조되어야 하고, 이는 표준 기술을 사용하여 달성된다. PEG, 알부민, 및 IgG와 같은 콘쥬게이트 합성에 적합한 일부 물질은 상업적으로 구입가능하다.
IRP 및/또는 IRC를 플랫폼 분자에 콘쥬게이션시키는 것은 전형적으로 IRP 및/또는 IRC 그리고 플랫폼 분자 상의 하나 이상의 교차결합제 및 기능기를 포함한, 어떤 방법으로든지 영향을 받을 수 있다. 플랫폼 그리고 IRP 및/또는 IRC는 적합한 결합기를 가져야 한다. 결합기는 표준 합성 화학을 사용하여 플랫폼에 첨가된다. 결합기는 표준 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술을 사용하여 폴리펩티드 플랫폼 및 IRP 및/또는 IRC에 첨가될 수 있다. 재조합 접근은 링커를 부착하기 위하여 번역 후 변형을 필요로 할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
예로서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 플랫폼에 결합시키기 위한 부위로 작용하는 아미노, 카르복실 또는 술프히드릴기와 같은 기능기를 함유한 아미노산 측쇄 부분을 함유한다. 이러한 작용기를 가진 잔기들은 폴리펩티드가 이들 기들을 이미 함유하지 않는 경우 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 이러한 잔기들은 펩티드 합성 분야에서 주지된 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술에 의하여 혼입될 수 있다. 폴리펩티드가 탄수화물 측쇄(들)를 가질 때(또는 플랫폼이 탄수화물인 경우), 작용성 아미노, 술프히드릴 및/또는 알데히드기는 종래 화학에 의하여 거기에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 1차 아미노기는 시아노보로수소화나트륨의 존재 하에 산화된 당을 에틸렌디아민과 반응시킴으로써 혼입될 수 있고, 설프히드릴은 시스테아민 디히드로클로리드의 반응, 이어서 표준 이황화물 환원제를 통한 환원에 의하여 혼입될 수 있으며, 한편 알데히드기는 과요오드산염 산화를 수반하며 발생될 수 있다. 유사한 방식으로, 플랫폼 분자는 또한 그것이 이미 적합한 작용기를 가지지 않는 경우, 작용기를 함유하도록 유도체화될 수 있다.
다양한 길이의 친수성 링커는 IRP 및/또는 IRC를 플랫폼 분자. 적합한 링커는 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 이러한 링커는 화학식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2를 가진 링커를 포함하는데, 여기서 n = 0-200, m = 1 또는 2, R1 = H 또는 트리틸과 같은 보호기, R2 = H 또는 알킬 또는 아릴, 예를 들어 4-니트로페닐 에스테르이다. 이들 링커는 예를 들어 티오에테르를 통하여 할로아세일, 말레이아미드와 같은 티올 반응기를 함유한 분자를 아미드 결합을 통하여 아미노기를 함유한 두 번째 분자에 연결하는 데 유용하다. 이들 링커는 부착 순서와 관련하여 유동적인데, 즉 티오에테르는 첫 번째부터 마지막까지 형성될 수 있다.
IRP 및/또는 IRC가 표면상에서의 흡착에 의하여 직접 결합된 구체예에서, 표면은 무기 또는 유기 중심으로 만들어진 담체 입자의 형태(예를 들어, 나노입자)일 수 있다. 이러한 나노입자의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 나노결정질 입자, 알킬시아노아크릴레이트의 중합화에 의하여 만들어진 나노입자 및 메틸리덴 말로네이트의 중합화에 의하여 만들어진 나노입자를 포함한다. IRP 및/또는 IRC가 흡착될 수 있는 추가 표면은, 한정하는 것은 아니지만, 활성화된 탄소 입자 및 단백질-세라믹 나노판을 포함한다. 담체 입자의 다른 예는 본원에 제공된다.
흡착된 분자를 세포에 전달하기 위한 목적으로 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 표면에 흡착시키는 것은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Douglas et al (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261; Hagiwara et al. (1987) In Vivo 1:241-252; Bousquet et al. (1999) Pharm Res. 16:141-147; 및 Kossovsky et al, U.S. Pat. No. 5,460,831)을 참조하라. 바람직하게는, 흡착제 표면을 포함한 물질은 생분해가능하다. IRP 및/또는 IRC를 표면에 흡착시키는 것은 이온성 및/또는 소수성 상호작용을 포함한 비공유 상호작용을 통하여 일어날 수 있다.
대체로, 나노입자와 같은 담체의 특징, 예를 들어 표면 전하, 입자 크기 및 분자량은 중합화 과정 동안의 중합화 조건, 모노머 농도 및 안정제의 존재에 의존한다 (Douglas et al, 1987). 담체 입자의 표면은 IRP 및/또는 IRC의 흡착을 허용 또는 향상시키기 위하여 표면 코팅으로 변형될 수 있다. 흡착된 IRP 및/또는 IRC를 가진 담체 입자는 다른 물질로 더 코팅될 수 있다. 이러한 다른 물질의 첨가는 피 험체에 투여될 때 입자의 반감기를 연장시킬 수 있고/거나 본원에 설명된 바와 같이 입자를 특정 세포 유형 또는 조직으로 표적화할 수 있다.
IRP 및/또는 IRC가 흡착될 수 있는 나노결정질 표면은 설명되어 있다(예를 들어, U.S. Pat. No. 5,460,831 참조). 나노결정질 중심 입자(1 μm 또는 그 미만의 직경)는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 약학적 제제의 흡착을 촉진하는 표면 에너지 변형층으로 코팅된다. 다른 흡착 표면은 알킬시아노아크릴레이트의 중합화로 만들어진 나노입자이다. 알킬시아노아크릴레이트는 음이온 중합화의 과정에 의하여 산성화된 수용성 매체에서 중합화될 수 있다. 중합화 조건에 따라서, 소립자들은 20 내지 3000 nm 범위의 크기를 가질 수 있고, 특이적 표면 특징 및 특이적 표면 전하를 가진 나노입자를 만드는 것이 가능하다(Douglas et al., 1987). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 소수성 양이온, 예를 들어 테트라페닐포스포늄 클로리드 또는 제4 암모늄염, 예를 들어 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드의 존재에서 폴리이소부틸- 및 폴리이소헥실시아노아크릴레이트 나노입자에 흡착될 수 있다. 이들 나노입자상에서의 올리고뉴클레오티드 흡착은 핵산 사슬의 음전하 인산기와 소수성 양이온 간의 이온쌍의 형성에 의하여 매개되는 것처럼 보인다. 예를 들어, 문헌(Lambert et al. (1998) Biochimie 80:969-976, Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11:1370-1378; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9:441-449)을 참조하라. 다른 흡착제 표면은 메틸리덴 말로네이트의 중합화에 의하여 만들어진 나노입자이다.
IRP 또는 IRC는 마이크로담체(MC) 복합체의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 IRP/MC 복합체 또는 IRC/MC 복합체를 포함한 조성물을 제공한다. IRP/MC 복합체는 마이크로담체의 표면에 결합된 IRP를 포함하고(즉, IRP는 MC에 캡슐화되지 않는다), 바람직하게는 각 마이크로담체에 결합된 IRP의 다중 분자를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상이한 IRP의 혼합물은 마이크로담체와 복합체를 이루어 하나 이상의 IRP 종에 결합될 수 있다. IRP와 MC 간의 결합은 공유 또는 비공유결합일 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, IRP는 변형 또는 유도체화될 수 있고 마이크로담체의 조성은 IRC/MC 복합체 형성에 필요한 원하는 유형의 결합을 수용하도록 선택 및/또는 변형될 수 있다. 이 동일한 설명은 IRC/MC 복합체에 적용된다. 어떤 구체예에서, IRC와 IRP의 혼합물은 마이크로담체가 적어도 하나의 IRC와 IRP 종에 결합되도록 마이크로담체와 복합체를 이룰 수 있다.
본 발명에 유용한 마이크로담체는 크기가 약 150, 120 또는 100 μm, 더 통상적으로 크기가 약 50-60 μm, 바람직하게는 크기가 약 10 μm이고, 순수한 물에 불용성이다. 본 발명에 사용된 마이크로담체는 비-생분해가능한 마이크로담체도 가능하지만 바람직하게는 생분해가능하다. 마이크로담체는 액체상 마이크로담체 예를 들어 생분해가능한 폴리머 또는 오일을 포함한 수중유 에멀션도 고려되지만, 통상적으로 고체상, 예를 들어 "비드" 또는 다른 입자들이다. 마이크로담체로 사용할 수 있는 다양한 생분해가능 및 비-생분해가능 물질은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 마이크로담체는 대체로 크기가 약 10 μm이고(예를 들어, 약 10 μm 미만의 평균 직경을 가지고, 또는 입자의 약 97% 이상이 10 μm 스크린 필터를 통과한다), 나노담체(즉, 크기가 약 1 μm의 담 체)를 포함한다. 바람직하게는, 약 9, 1, 5, 2, 또는 1 μm, 또는 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 nm의 상한과 약 4, 2, 또는 1 μm 또는 약 800, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25, 또는 10 nm 중에서 독립적으로 선택된 하한 내의 크기를 가진 마이크로담체가 선택되며, 여기서 하한은 상한 미만이다. 일부 구체예에서, 마이크로담체는 약 1.0-1.5 μm, 약 1.0-2.0 μm 또는 약 0.9-1.6 μm의 크기를 가진다. 어떤 바람직한 구체예에서, 마이크로담체는 약 10 nm 내지 약 5 μm 또는 약 25 nm 내지 약 4.5 μm, 약 1 μm, 약 1.2 μm, 약 1.4 μm, 약 1.5 μm, 약 1.6 μm, 약 1.8 μm, 약 2.0 μm, 약 2.5 μm 또는 약 4.5 μm의 크기를 가진다. 마이크로담체가 나노담체일 때, 바람직한 구체예는 약 25 내지 약 300 nm, 50 내지 약 200 nm, 약 50 nm 또는 약 200 nm의 나노담체를 포함한다.
고체상 생분해가능한 마이크로담체는, 한정하는 것은 아니지만, 생분해가능 폴리에스테르, 예를 들어 폴리(젖산), 폴리(글리콜산), 및 그것의 코폴리머(차단 코폴리머를 포함) 뿐만 아니라 폴리(젖산) 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 차단 코폴리머; 폴리오르토에스테르, 예를 들어 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU)에 기반한 폴리머; 폴리무수물, 예를 들어 세바식산과 같은 상대적으로 친수성인 모노머에 기반한 폴리(무수물) 폴리머; 폴리무수물 이미드, 예를 들어 글리신 또는 알라닌과 같은 아미노산을 혼입하는 세바식산-유래의 모노머에 기반한 폴리무수물 폴리머(즉, 아미노-말단 질소를 통한 이미드 결합에 의하여 세바식산에 결합된); 폴리무수물 에스테르; 폴리포스파젠, 특히 카르복시산기의 발생을 통하여 폴리머 백본의 분해를 촉매할 수 있는 가수분해-민감성 에스테르기를 함유한 폴리(포스파젠)(Schacht et al., (1996) Biolechnol. Bioeng. 1996:102); 및 폴리아미드, 예를 들어 폴리(젖산-co-리신)을 포함한 생분해가능한 포리로부터 제조될 수 있다.
한정하는 것은 아니지만, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 세라믹, 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 수산화인회석, 라텍스, 금 및 강자성 또는 상자성 물질을 포함한, 마이크로담체를 제조하기에 적합한 다양한 비-생분해가능한 물질은 또한 공지되어 있다. 어떤 구체예에서, 마이크로담체는 두 번째 물질(예를 들어, 폴리스티렌)로 캡슐화된 첫 번째 물질(예를 들어, 자성 물질)로 만들어질 수 있다.
고체상 미소구체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 에멀션-용매 추출/증발 기술에 의하여 그것들을 제조할 수 있다. 일반적으로, 이 기술에서, 생분해가능한 폴리머, 예를 들어 폴리무수물, 폴리(알킬-α-시아노아크릴레이트) 및 폴리(α-히드록시 에스테르), 예를 들어 폴리(젖산), 폴리(글리콜산), 폴리(D,L-락틱-co-글리콜산) 및 폴리(카프로락톤)은 적합한 유기 용매, 예를 들어 메틸렌 클로리드에 용해되어 에멀션의 분산상(DP)을 구성한다. DP는 고속 균질화에 의하여 용해된 계면활성제, 예를 들어 폴리비닐알코올 (PVA) 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)를 함유한 수용성 연속상(CP)의 초과 부피로 유화된다. CP에서 계면활성제는 분리되고 적당한 크기의 에멀션 방울의 형성을 보장한다. 그 다음 유기 용매는 CP 내로 추출되고 이어서 시스템 온도를 올림으로써 증발된다. 그 다음 고체 마이크로입자는 원심분리 또는 여과에 의하여 분리되고, 4℃에 저장하기 전에 예를 들어 동결건조 또는 진공건조 사용에 의하여 건조된다.
평균 크기, 크기 분포 및 건조된 미소구체의 표면 전하와 같은 물리화학적 특성을 결정할 수 있다. 크기 특성은 예를 들어 동적 빛 산란 기술에 의하여 결정되고, 표면 전하는 제타 포텐셜을 측정함으로써 결정되었다.
액상 마이크로담체는 리포솜, 미셀, 오일 방울 및 다른 지질 또는 생분해가능한 폴리머 또는 오일을 혼입하는 오일-기재 입자를 포함한다. 어떤 구체예에서, 생분해가능한 폴리머는 계면활성제이다. 다른 구체예에서, 액상 마이크로담체는 생분해가능한데, 이는 스쿠알렌 또는 식물성 기름과 같은 생분해가능한 오일을 포함하기 때문이다. 한 바람직한 액상 마이크로담체는 수중유 에멀션 내의 오일 방울이다. 바람직하게는, 마이크로담체로 사용된 수중유 에멀션은 스쿠알렌과 같은 생분해가능한 치환기를 포함한다.
공유결합된 IRP/MC 복합체는 당업계에 공지된 어떤 공유 교차결합 기술을 사용하여 결합될 수 있다. 전형적으로, IRP 부분은 추가 부분(예를 들어, 자유 아민, 카르복실 또는 술프히드릴기)을 혼입하거나 변형된(예를 들어, 포스포로티오에이트) 뉴클레오티드 염기를 혼입하도록 변형되어 IRP 부분이 마이크로담체에 연결될 수 있는 부위를 제공할 것이다. IRP와 복합체의 MC 부분 간의 결합은 IRP의 3' 또는 5'말단에서 또는 IRP의 내부 위치에 적합하게 변형된 염기에서 이루어질 수 있다. 또한 마이크로담체 상에 보통 존재하는 작용기도 사용될 수 있지만 마이크로담체는 대체로 공유결합이 형성될 수 있는 부분을 혼입하도록 변형된다. IRP/MC는 공 유 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 IRP를 마이크로담체와 인큐베이션함으로써 형성된다(예를 들어, 교차결합제의 존재에서 또는 IRP와 공유결합을 형성하는 활성화된 부분을 포함한 활성화된 마이크로담체의 사용에 의하여).
다양한 교차결합 기술은 당업계에 공지되어 있고, 아미노, 카르복실 및 술프히드릴기와 반응하는 교차결합기를 포함한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 교차결합제 및 교차결합 프로토콜의 선택은 IRP 및 마이크로담체의 구성뿐만 아니라 IRP/MC 복합체의 원하는 최종 구성에 의존할 것이다. 교차결합기는 호모이기능성이거나 헤테로이기능성일 수 있다. 호모이기능성 교차결합기가 사용될 때, 교차결합기는 IRP 및 MC 상에 동일한 부분을 이용한다(예를 들어, 알데히드 교차결합기는 IRP와 MC가 하나 이상의 자유 아민을 포함하는 경우 IRP와 MC를 공유결합시키는데 사용될 수 있다). 헤테로이기능성 교차결합기는 IRP 및 MC 상의 다른 부분을 이용하며(예를 들어, 말레이미도-N-히드록시숙신이미드 에스테르는 IRP 상의 자유 술프히드릴과 MC 상의 자유아민을 공유결합시키는 데 사용될 수 있다) 마이크로담체간 결합의 형성을 최소화한다. 대부분의 경우, 두 번째 교차결합 부분이 마이크로담체에 존재하지 않는 경우, 마이크로담체 상의 첫 번째 교차결합 부분과 IRP 상의 두 번째 교차결합 부분을 통하여 교차결합시키는 것이 바람직하다. IRP/MC 복합체를 생성하는 한 바람직한 방법은 헤테로이기능성 교차결합제와 인큐베이션함으로써 마이크로담체를 '활성화'하고, 그 후 반응에 적합한 조건 하에서 IRP와 활성화된 MC를 인큐베이션함으로써 IRP/MC 복합체를 형성하는 것이다. 교차결합기는 반응성 부분 사이에 "스페이서" 팔을 혼입시킬 수 있고, 또는 교차결합기 중의 두 반응성 부 분은 직접 결합될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, IRP 부분은 마이크로담체에 교차결합하기 위하여 하나 이상의 자유 술프히드릴(예를 들어, 5'-티올 변형된 염기 또는 링커에 의하여 제공된)을 포함하고, 마이크로담체는 자유 아민기를 포함한다. 이들 두 기와 반응하는 헤테로이기능성 교차결합기(예를 들어, 말레이이미드기 및 NHS-에스테르를 포함한 교차결합기), 예를 들어 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트는 MC를 활성화하고, 그 후 IRP를 공유 교차결합시켜 IRP/MC 복합체를 형성하는 데 사용된다.
비공유 IRP/MC 복합체는 보통 결합쌍이 IRP와 MC를 결합시키는 경우와 같이, 이온성(정전기) 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 인력, 또는 두 개 이상의 다른 상호작용의 조합을 포함한, 어떤 비공유결합 또는 상호작용에 의하여 결합될 수 있다.
바람직한 비공유 IRP/MC 복합체는 전형적으로 소수성 또는 정전기(이온성) 상호작용 또는 이들의 조합에 의하여(예를 들어, 결합쌍의 MC 사용에 결합된 IRP와 폴리뉴클레오티드 간의 염기쌍을 통하여) 복합체를 이룬다. 폴리뉴클레오티드의 백본의 친수성 성질 때문에, 복합체를 형성하기 위하여 소수성 상호작용에 의존하는 IRP/MC 복합체는 일반적으로 고 친수성 부분을 혼입하기 위하여 복합체의 IRP 부분의 변형을 요구한다. 바람직하게는, 소수성 부분은 생체친화적이고, 비면역원성이며, 조성물이 의도하고 있는 개체에서(예를 들어, 포유동물, 특히 사람에서 발견된다) 자연적으로 발생한다. 바람직한 소수성 부분의 예는 지질, 스테로이드, 스테 롤, 예를 들어 콜레스테롤 및 테르펜을 포함한다. 소수성 부분을 IRP에 결합시키는 방법은 물론 IRP의 구성 및 소수성 부분의 동일성에 의존할 것이다. 소수성 부분은 IRP에서 임의의 편리한 부분에, 바람직하게는 5' 또는 3' 말단에 첨가될 수 있고; IRP에 콜레스테롤 부분을 첨가하는 경우, 콜레스테롤 부분은 종래의 화학반응을 사용하여 바람직하게는 IRP의 5' 말단에 첨가된다(예를 들어, Godard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410 참조). 소수성 부분을 혼입하기 위하여 변형된 친수성 물질도 이용될 수 있지만, 바람직하게는, 소수성 결합에 의하여 연결된 IRP/MC 복합체에 사용하기 위한 마이크로담체는 오일 방울 또는 소수성 폴리머와 같은 소수성 물질로부터 만들어진다. 마이크로담체가 리포솜 또는 루멘을 포함한 다른 액체상 마이크로담체이고 IRP가 MC의 외부 표면과 결합하는 것이 바람직할 때, IRP/MC 복합체는 MC 제조 과정 동안 IRP의 캡슐화를 회피하기 위하여, MC의 제조 후에 IRP와 MC를 혼합함으로써 형성된다.
정전기 결합에 의하여 결합된 비공유 IRP/MC 복합체는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 백본의 높은 음전하를 이용한다. 따라서, 비공유결합된 IRP/MC 복합체에 사용하기 위한 마이크로담체는 대체로 생리학적 pH(예를 들어, 약 pH 6.8-7.4)에서 양전하(양이온)이다. 마이크로담체는 본래 양전하를 가질 수 있지만, 보통 양전하를 가지지 않은 화합물로부터 만들어진 마이크로담체는 양전하(양이온)가 되도록 유도체화되거나 아니면 변형될 수 있다. 예를 들어, 마이크로담체를 만드는 데 사용된 폴리머는 1차 아민과 같은 양전하기를 첨가하도록 유도체화될 수 있다. 대안적으로, 양전하 화합물은 제조하는 동안 마이크로담체의 제형에 혼입될 수 있다(예 를 들어, 양전하 계면활성제는 폴리(젖산)/폴리(글리콜산) 코폴리머의 제조과정에 사용되어 생성된 마이크로담체에 양전하를 부여할 수 있다).
예를 들어, 양이온 미소구체를 제조하기 위하여, 양이온 지질 또는 폴리머, 예를 들어, 1,2-디올레오일-1,2,3-트리메틸암모니오프로판 (DOTAP), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 또는 폴리리신이 이들 상태에서의 이들의 용해도에 따라서 DP 또는 CP에 첨가된다.
IRP/MC 복합체는 바람직하게는 수용성 혼합물에 폴리뉴클레오티드와 입자의 인큐베이션에 의하여 양이온 미소구체 상에 흡착시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 인큐베이션은 주변(실내) 온도(예를 들어, 약 20℃)를 포함한 어떤 원하는 조건 하에서 또는 냉동(예를 들어, 4℃) 하에서 수행될 수 있다. 양이온 미소구체와 폴리뉴클레오티드는 상대적으로 빠르게 결합하기 때문에, 인큐베이션은 밤새 그리고 더 긴 인큐베이션을 포함한 어떤 편리한 시간, 예를 들어 5, 10, 15분 동안이 될 수 있다. 예를 들어, IRP는 4℃에서 폴리뉴클레오티드와 입자의 밤새 수성 인큐베이션에 의하여 양이온 미소구체에 흡착될 수 있다. 그러나, 양이온 미소구체와 폴리뉴클레오티드가 자발적으로 결합하기 때문에, IRP/MC 복합체는 폴리뉴클레오티드와 MC의 단순 병용투여에 의하여 형성될 수 있다. 미소구체는 폴리뉴클레오티드 결합 전후의 크기 및 표면 전하를 특징으로 할 수 있다. 그 후 선택된 배치는 예를 들어 사람 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 마우스 비장림프구 분석에서 적합한 대조군에 대한 활성에 대하여 평가될 수 있다. 제형은 또한 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다.
뉴클레오티드 염기쌍에 의하여 연결된 비공유 IRP/MC 복합체는 종래의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 염기쌍을 이룬 IRP/MC 복합체는 IRP에 적어도 부분적으로 상보적인 결합된, 바람직하게는 공유결합된 폴리뉴클레오티드를 포함한 마이크로담체를 사용하여 생성된다. IRP와 포획 뉴클레오티드 간에 상보적인 단편은 바람직하게는 적어도 6, 8, 10 또는 15 연속 염기쌍, 더 바람직하게는 적어도 20 연속 염기쌍이다. 포획 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 어떤 방법에 의하여 MC에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 5' 또는 3' 말단에서 IRP에 공유결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 5'-GGGG-3' 서열을 포함한 IRP는 이 부분의 서열을 단일 가닥으로 보유할 것이다.
다른 구체예에서, 결합쌍은 IRP/MC 복합체에서 IRP와 MC를 결합하는 데 사용될 수 있다. 결합쌍은 수용체와 리간드, 항체와 항원(또는 에피토프), 또는 고 치환도(예를 들어, 약 10-8 미만의 Kd)로 결합하는 어떤 다른 결합쌍일 수 있다. 바람직한 결합쌍의 한 유형은 매우 단단한 복합체를 형성하는 비오틴과 스트렙타비딘 또는 비오틴과 아비딘이다. IRP/MC 복합체 결합을 매개하는 결합쌍을 사용할 때, IRP는 전형적으로 결합쌍의 한 구성원과 공유결합에 의하여 유도체화되고, MC는 결합쌍의 다른 구성원과 유도체화된다. 두 유도체화된 화합물의 혼합은 IRP/MC 복합체의 형성을 가져온다.
본 발명의 방법
본 발명은 개체에게 본원에 설명된 IRS-함유 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한, 개체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 사람에서의 면역반 응을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하여 제공된 면역조절 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 박테리아 DNA와 같은 면역조절 핵산 분자에 의하여 자극된 면역반응을 포함한 선천성 면역반응을 억제 및/또는 방해하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 TLR7/8 및/또는 TLR9 유도된 세포 반응을 방해하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 한정하는 것은 아니지만, 자가면역과 연관된 증상을 포함한, 원하지 않은 면역 활성화와 연관된 증상을 개선하기 위한 방법을 제공한다.
IRS-함유 폴리뉴클레오티드는 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 투여된다. 본원에 설명된 바와 같이, 면역반응의 조절은 체액성 및/또는 세포성일 수 있고, 당업계의 표준 기술을 사용하여 그리고 본원에 설명된 바와 같이 측정된다.
어떤 구체예에서, 개체는 원하지 않은 면역 활성화, 예를 들어 알레르기성 질환 또는 상태, 알레르기 및 천식과 연관된 장애로 고생한다. 알레르기성 질환 또는 천식이 있는 개체는 존재하는 알레르기성 질환 또는 천식의 인식가능한 증상을 가진 개체이다.
어떤 구체예에서, 개체는 원하지 않은 면역 활성화, 예를 들어 자가면역 질환 및 염증성 질환과 연관된 장애로 고생한다. 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 가진 개체는 존재하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 인식가능한 증상을 가진 개체이다.
자가면역 질환은 두 넓은 카테고리, 기관-특이성과 전신성으로 나눌 수 있다. 자가면역 질환은, 한정하는 것은 아니지만, 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 다발성 경화증(MS), 조기난소부전과 같은 면역-매개 불임, 경피증, 쇼그렌 증후군, 백반증, 탈모증(대머리), 다선성부전, 그레이브병, 갑상선기능저하증, 다발성근염, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 크론씨병 및 궤양성 대장염을 포함한 염증성 장질환, B형 간염바이러스(HBV) 및 C형 간염바이러스(HCV)와 연관된 것을 포함한 자가면역 간염, 뇌하수체기능저하증, 이식편대숙주병(GvHD), 심근염, 애디슨병, 자가면역 피부병, 포도막염, 악성빈혈, 및 부갑상선기능저하증을 포함한다.
자가면역 질환은 또한, 한정하는 것은 아니지만, 하시모토 갑상선염, 제1형 및 제2형 자가면역 다선성 증후군, 종양수반성 천포창, 수포성유천포창, 포진성 피부염, 선형 IgA 질환, 후천성수포성표피박리증, 결정성홍반, 천포창양임신, 반흔성 유천포창, 혼합된 필수 한냉글로불린혈증, 유아의 만성수포성질환, 용혈성빈혈, 혈소판감소성자반병, 굿패스쳐증후군, 자가면역성 호중구감소증, 중증근무력증, 람버트-이튼 근무력증 증후군, 경직-맨 증후군, 급성산재성뇌척수염, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발 신경근신경병증, 전도차단을 동반한 다발초점성 운동신경병증, 모노클로날 감마병증을 동반한 만성 신경병증, 옵소노클로누스-미오클로누스 증후군, 소뇌 변성, 뇌척수염, 망막증, 원발성 담즙성 간경화증, 경화성 담관염, 글루텐민감성창자병증, 강직성척추염, 반응성관절염, 다발성근염/피부근염, 혼합성 결합조직 질환, 베세증후군, 건선, 결절성 다발성 동맥염, 알레르기성 혈관염 및 육아종증(척-스트라우스 질환), 다발성혈관염 오버랩 증후군, 과민성 혈관염, 베게너육아종증, 측두동맥염, 다카야수 동맥염, 가와사키 질환, 중추신경계의 격리성 혈관염, 폐쇄성혈전혈관염, 유육종증, 사구체신염, 및 한랭병증을 포함할 수 있다. 이들 상태는 의학분야에 주지되어 있고, 예를 들어 문헌(Harrison's Principles of Internal Medicine, 14판, Fauci A S et al., eds., New York: McGraw-Hill, 1998)을 참조하라.
전신성 질환 SLE는 거의 모든 세포에 풍부한 항원에 대한 항체, 예를 들어 항-크로마틴 항체, 항-접합절단소체 항체, 항-리보솜 항체 및 항-DNA 항체의 존재를 특징으로 한다. 결과적으로, SLE의 효과는 다양한 조직, 예를 들어 피부 및 신장에서 확인된다. 자가반응성 T 세포는 또한 SLE 역할을 한다. 예를 들어, 쥐과 낭창 모델에서의 연구는 비-DNA 뉴클레오솜의 항원, 예를 들어 히스톤이 항-DNA 생산 B 세포를 유도할 수 있는 자가반응성 T 세포를 자극한다는 것을 보여주었다. IFN-α의 증가된 혈청 수준은 SLE 환자에서 관찰되었으며, 열과 피부 발진을 포함한 질병 활성 및 중증, 뿐만 아니라 질병 과정과 연관된 필수 마커(예를 들어, 항-dsDNA 항체 적정기)와의 상호관련성을 나타내었다. 또한 순환계에 존재하는 면역 복합체는 이들 환자에서 IFN-α를 유발할 수 있으며, 따라서 이 상승된 IFN-α의 만성적 존재를 유지할 수 있다. 두 상이한 유형의 면역복합체는 사람 PDC:DNA/항-DNA 항체 복합체 및 RNA/항-리보뉴클레오단백질-RNA 항체 복합체로부터 IFN-α를 유발하는 것으로 설명되었다. DNA가 TLR-9의 리간드이고 RNA가 TLR-7/8의 리간드이기 때문에, 만성적으로 IFN-α를 유도하고 그럼으로써 SLE의 원인병리론에 관여하기 위하여 이들 두 경로는 TLR-9 및 TLR-7/8 신호화를 이용하는 것으로 예상된다. 따라서, TLR-7/8 및 TLR-9 반응을 억제하는 데 효과적인 IRP 및/또는 IRC 조성물은 특히 SLE를 치료하는 데 효과적이다.
어떤 구체예에서, 개체는 자가면역 질환으로 진행할 위험에 있으며, IRP 또는 IRC는 자가면역 질환을 지연 또는 예방하기에 효과적인 양으로 투여된다. 자가면역 질환으로 진행할 위험이 있는 개체는, 예를 들어 자가면역 질환으로 진행할 유전적 또는 다른 경향을 가진 사람들을 포함한다. 사람에서, 특정 자가면역 질환에 대한 민감성은 일부가 특정 MHC 클래스 II 대립유전자와 가장 강하게 결합되고 다른 것들은 특정 MHC 클래스 I 대립유전자와 가장 강하게 결합되는 HLA 형과 연관된다. 예를 들어, 강직성척추염, 급성앞포도막염, 및 소아류마티스관절염은 HLA-B27, 굿패스쳐 증후군과 연관되고, MS는 HLA-DR2, 그레이브씨병, 중증근무력증과 연관되며, SLE는 HLA-DR3, 류마티스 관절염과 연관되고, 심상성 천포창은 HLA-DR4와 연관되며, 하시모토 갑상선염은 HLA-DR5과 연관된다. 자가면역 질환에 대한 다른 유전적 경향은 당업계에 공지되어 있으며 당업계에 주지된 분석과 방법에 의하여 이러한 경향성의 존재에 대하여 개체를 시험할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 자가면역으로 진행할 위험이 있는 개체는 확인될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명의 IRP는 한정하는 것은 아니지만, IL-6, IL-12, TNF-α, 및/또는 IFN-α를 포함한 사이토카인의 생성을 특히 방해할 수 있으며, B 세포 증식 및/또는 분화하는 형질세포모양 수지상 세포의 활성화를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IRP 및 IRC는 개체에서 면역조절 핵산에 대한 면역반응을 억제하는 데 특히 효과적이다.
자가면역 질환을 위한 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 사람 자가면역 질환에 가장 유사한 것처럼 보이는 동물 모델은 자발적으로 특정 질환 의 고 발병을 진행시키는 동물주를 포함한다. 이러한 모델의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 제1형 당뇨병에 유사한 질병으로 진행하는 비만하지 않은 당뇨병(NOD) 마우스, 및 낭창-유사 질병에 걸리기 쉬운 동물, 예를 들어 뉴질랜드 하이브리드, MRL-Faslpr 및 BXSB 마우스를 포함한다. 자가면역 질환이 유도된 동물 모델은, 한정하는 것은 아니지만, 다발성 경화증에 대한 모델인 실험용 자가면역성 뇌척수염(EAE), 류마티스 관절염의 모델인 콜라겐-유도된 관절염(CIA), 포도막염에 대한 모델인 실험용 자가면역 포도막염을 포함한다. 자가면역 질환을 위한 동물 모델은 또한 유전적 조작으로 만들어졌으며, 예를 들어 염증성장질환을 위한 IL-2/IL-10 녹아웃 마우스, SLE를 위한 Fas 또는 Fas 리간드 녹아웃, 및 류마티스 관절염에 대한 IL-1 수용체 길항제를 포함한다.
따라서, 당업계에서의 동물 모델 표준은 자가면역 장애의 치료를 위한 본 발명의 방법 및 조성물의 활성 및/또는 효과에 대한 스크리닝 및/또는 평가에 사용가능하다.
어떤 구체예에서, 개체는 만성 염증성 반응과 연관된 장애로 고생한다. IRP의 투여는 하나 이상의 선천성 면역반응 연관된 사이토카인의 수준을 감소시키는 면역조절을 야기하며, 이는 염증성 반응의 감소를 야기할 수 있다. 원하지 않은 면역반응 연관된 설명된 장애가 있는 개체의 면역조절은 장애의 하나 이상의 증상에서의 감소 또는 개선을 야기한다.
본 발명의 다른 구체예는 바이러스에 노출되거나 전염된 개체의 면역조절 치 료법에 관한 것이다. 바이러스에 노출되거나 전염된 개체에 IRP 또는 IRC를 투여하는 것은 바이러스 유도된 사이토카인 생성의 억제를 야기한다. 바이러스에 반응하여 생성된 사이토카인은 바이러스 감염에 적합한 환경에 기여할 수 있다. 바이러스-유도된 사이토카인 생성의 억제는 바이러스 감염을 제한 또는 예방하는 기능을 할 수 있다.
어떤 구체예에서, 개체는 만성 병원균 자극과 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 만성 바이러스 감염 및 말라리아와 연관된 것으로 고생한다. TLR-7/8 반응을 억제하는 데 효과적인 IRP 및/또는 IRC 조성물은 만성 병원균 자극과 관련된 질환 및 증상을 치료하는 데 특히 효과적일 수 있다.
본 발명의 방법은 항-염증제의 투여와 같은 장애를 돌보는 표준을 보충하는 다른 치료, 예를 들어 전신성 코르티코스테로이드 치료(예를 들어, 코르티손)와 조합하여 수행될 수 있다.
일부 상황에서, 자기항원에 대한 말초 관용은 상실(또는 파괴)되고 자가면역반응은 계속된다. 예를 들어, EAE에 대한 동물 모델에서, 선천성 면역 수용체 TLR9 또는 TLR4를 통한 항원 제시 세포(APC)의 활성화는 자기-관용을 파괴하고 EAE의 유도를 야기하는 것으로 나타났다(Waldner et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:990-997).
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 TLR9 의존적 세포 자극을 억제 또는 감소시키기 위한 방법을 제공한다. IRP의 투여는 하나 이상의 TLR9-연관된 사아토카인의 감소된 수준을 포함한 TLR9 의존적 세포 반응의 억제를 가져온다. TLR9 의존 적 세포 자극을 억제하는 데 사용하기에 적합한 IRP는 TLR9와 연관된 세포 반응을 방해 또는 억제하는 IRP이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 TLR7/8 의존적 세포 자극을 억제 또는 감소하기 위한 방법을 제공한다. IRP의 투여는 하나 이상의 TLR7/8-연관된 사이토카인의 감소된 수준을 포함한, TLR7/8 의존적 세포 반응의 억제를 가져온다. TLR7/8 의존적 세포 자극을 억제하는 데 사용하기에 적합한 IRP는 TLR7/8과 연관된 세포 반응을 방해 또는 억제하는 IRP이다.
본원에 나타낸 바와 같이, 일부 IRP는 TLR9 의존적 세포 반응과 TLR7/8 의존적 세포 반응 모두를 억제한다. 일부 IRP는 TLR9 의존적 세포 반응은 억제하지만, TLR7/8 의존적 세포 반응을 억제하지 않는다. 일부 IRP는 TLR7/8 의존적 세포 반응은 억제하지만, TLR9 의존적 세포 반응을 억제하지 않는다. 따라서, 특정 IRP는 특정 면역반응을 조절하기 위하여 투여될 수 있다.
투여 및 면역반응의 평가
IRP 또는 IRC는 본원에 설명된 다른 약학적 제제와 조합하여 투여될 수 있으며, 그것의 생리적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다(그리고, 본 발명은 이들 조성물을 포함한다). IRP 또는 IRC는 본원에 설명된 것들 중 어떤 것일 수 있다.
면역반응의 조절을 위한 모든 조성물에 관련하여, 특정 IRP 또는 IRC 제형의 효과적인 양 및 투여방법은 개체, 치료되는 상태 및 당업자에게 명백한 다른 인자에 따라서 다양할 수 있다. 고려해야 할 인자는 IRP 또는 IRC가 전달 분자와 함께 또는 공유결합되어 투여될 것인지 여부, 투여 경로 및 투여되는 복용횟수를 포함한 다. 이러한 인자는 당업계에 공지되어 있으며, 과도한 실험없이 이러한 결정을 하는 것은 당업계의 기술 범주 내에 있다. 적합한 투여량 범위는 면역반응의 원하는 조절(예를 들어, 면역조절 핵산에 반응한 IFN-α 또는 다른 사이토카인 생성의 억제)을 제공하는 양이다. 면역조절 핵산에 대한 면역반응의 억제가 바람직할 때, 적합한 투여량 범위는 면역조절 핵산에 의한 면역 자극의 원하는 억제를 제공하는 양이다. 대체로, 투여량은 투여된 IRP-함유 조성물의 전체 양보다는 환자에게 투여된 IRP의 양으로 결정된다. 투여된 IRP의 양으로 제공된, IRP의 유용한 투여량 범위는 예를 들어 다음 중 약 어느 것일 수 있다: 0.5 내지 10 mg/kg, 1 내지 9 mg/kg, 2 내지 8 mg/kg, 3 내지 7 mg/kg, 4 내지 6 mg/kg, 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 5 내지 10 mg/kg. 각 환자에게 제공된 절대량은 생물학적 이용가능성, 제거율 및 투여경로와 같은 약리학적 특성에 의존한다.
특정 IRP 또는 IRC 제형의 효과적인 양 및 투여 방법은 개별 환자, 원하는 결과 및/또는 장애 유형, 질병의 단계 및 당업자에게 명백한 다른 인자들에 따라서 다양할 수 있다. 특별한 사용에 유용한 투여 경로(들)는 당업자에게 명백할 것이다. 투여 경로는, 한정하는 것은 아니지만, 국소, 진피, 경피, 경점막, 상피, 비경구, 위장내, 및 경기관지와 경치조를 포함한 비인두와 폐를 포함한다. 적합한 투여량 범위는 혈액 수준으로 측정했을 때 약 1-50 μM의 조직 농도를 얻기에 충분한 IRP-함유 조성물을 제공하는 양이다. 각 환자에게 제공된 절대량은 생물학적 이용가능성, 제거율 및 투여경로와 같은 약리학적 특성에 의존한다.
본원에 설명된 바와 같이, 원하지 않은 면역 활성화가 일어나거나 일어날 가 능성이 있는 조직은 IRP 또는 IRC의 우선적 표적이다. 따라서, IRP 또는 IRC를 조직뿐만 아니라 림프절, 비장, 골수, 혈액에 투여하는 것은 투여의 우선적 부위이다.
본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 생리학적으로 허용되는 임플란트, 연고, 크림, 린스 및 겔을 포함한 국소 용도에 적합한 IRP 또는 IRC 제형을 제공한다. 진피 투여의 예시적 경로는 경피 전달, 상피 투여 및 피하 주사와 같은 최소 침습성의 경로들이다.
경피 투여는 IRP 또는 IRC가 피부를 통과하고 혈류로 들어갈 수 있도록 하는 크림, 린스, 겔 등을 사용함으로써 이루어진다. 경피 투여에 적합한 조성물은, 한정하는 것은 아니지만, 피부에 직접 바르거나 경피 장치(소위 "패치")와 같은 보호 담체내로 혼입되는 약학적으로 허용되는 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 포함한다. 적합한 크림, 연고 등의 예는, 예를 들어 의사처방참고서에서 확인할 수 있다. 또한 경피 전달은 예를 들어 수일 또는 그 이상의 기간 동안 파괴되지 않은 피부를 통하여 그들의 생성물을 계속 전달하는 상업적으로 구입가능한 패치를 사용하는 이온영동법에 의하여 이루어질 수 있다. 이 방법의 사용은 상대적으로 높은 농도의 약학적 조성물의 통제된 전달을 허용하고, 조합 약물의 주입을 허용하며, 흡수 프로모터의 동시 사용을 허용한다.
투여의 비경구 경로는, 한정하는 것은 아니지만, 중심정맥관, 정맥내, 근육내, 복강내, 진피내, 또는 피하 주사를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 IRP 또는 IRC의 제형은 대체로 주사하기 위해 USP 물 또는 물에서 제조되며, pH 완충액, 염 벌크제, 방부제, 및 다른 약학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 비경구 주사를 위한 면역조절 폴리뉴클레오티드는 주사용 식염수 및 인산 완충 식염수와 같은 약학적으로 허용되는 멸균 등장액에서 제조될 수 있다.
투여의 위장 경로는, 한정하는 것은 아니지만, 섭취 및 직장 경로를 포함하고, 예를 들어 약학적으로 허용되는 분말, 섭취용 알약 또는 액체 및 직장 투여용 좌약의 사용을 포함할 수 있다.
비인두 및 폐 투여는 흡입에 의하여 이루어지고, 비강내, 경기관지 및 경치조 경로와 같은 전달 경로를 포함한다. 본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 건조 분말 흡입 전달 시스템을 위한 분말 형태뿐만 아니라 에어로졸을 형성하기 위한 액체 현탁액을 포함한 흡입에 의한 투여에 적합한 IRP 또는 IRC의 제형을 포함한다. IRP 또는 IRC 제형의 흡입에 의한 투여에 적합한 장치는, 한정하는 것은 아니지만, 분무기, 기화기, 네뷸라이저, 및 건조 분말 흡입 전달 장치를 포함한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 본원에 설명된 투여 경로에 대하여 사용된 용액 또는 현탁액은 다음 성분 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용 물과 같은 멸균 희석액, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 인산과 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 삼투조절을 위한 제제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰 풀, 1회용 주사기 또는 다중 투여량 바이알에 동봉된다.
당업계에 주지된 바와 같이, 주사가능한 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용성 용액(수용액인 경우) 또는 분사 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분사의 즉각적 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리적 식염수, 살균수, Cremophor ELTM(BASF, 뉴저지 파시파니) 또는 인산완충식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 이것은 제조 및 보관 상태 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그것의 적합한 혼합물을 함유한 용매 또는 분산 매개체일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의하여, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의하여, 그리고 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 예방하는 것은 다양한 항박테리아 및 항곰팡이제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의하여 이루어질 수 있다. 조성물에 등장성 제제, 예를 들어 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것은 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 포함함으로써 이루어질 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 멸균 주사가능한 용액은 필요하다면 열거된 성 분들 중 하나 또는 조합된 적합한 용매에 필요한 양에 활성 화합물(들)을 혼입하고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 대체로, 분사는 기본 분사 매개체 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 다른 성분들을 함유한 멸균 비히클 내에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 그것의 사전 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 어떤 추가의 원하는 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
전술한 조성물 및 투여방법은, 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 IRP 및 IRC의 제형을 투여하는 방법을 설명하는 것을 의미한다. 다양한 조성물 및 장치를 설명하는 방법은 당업자의 능력 내에 있고 본원에 상세히 설명되지는 않는다.
면역 자극의 억제에 있어서 IRP 또는 IRC의 활성의 분석(정성적 및 정량적)은, 한정하는 것은 아니지만, B 세포와 같은 특정 세포 집단의 증식의 억제 또는 감소를 측정하는 단계, 수지상 세포(형질세포모양 수지상 세포를 포함) 및 T 세포와 같은 특정 세포 집단의 성숙의 억제를 측정하는 단계, 및 한정하는 것은 아니지만, IFN-α, TNF-α, IL-6, 및/또는 IL-12와 같은 사이토카인 생성의 억제를 측정하는 단계를 포함한 본원에 설명되거나 당업계에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 특정 유형의 세포 수의 측정은 예를 들어 형광-활성화 세포 분류법(FACS)으로 이루어질 수 있다. 특정 집단의 세포의 성숙의 측정은 마커, 예를 들어 세포 성숙의 특정 단계에 특이적인 세포 표면 마커의 발현을 결정함으로써 이루어질 수 있다. 세포 마커 발현은 예를 들어 FACS 분석에 의하여 특정 마커의 RNA 발현을 측정함으로써 또는 세포 표면 발현을 측정함으로써 측정될 수 있다. 수지상 세포의 성 숙을 측정하는 것은 예를 들어 문헌(Hartmann et al. (1999) Proc. Natl. Acad. ScL USA 96:9305-9310)에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 사이토카인 농도는 예를 들어 ELISA에 의하여 측정될 수 있다. 선천성 면역반응을 포함한 면역반응의 억제를 평가하는 이들 및 다른 분석은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 키트
본 발명은 키트를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 키트는 일반적으로 본원에 설명된 임의의 IRP 및/또는 IRC를 포함한 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 본원에 설명된 방법(예를 들어, 면역자극 핵산에 대한 반응의 억제, TLR-7/8 및/또는 TLR-9 의존적 반응의 억제, 자가면역 질환의 하나 이상의 증상의 개선, 만성 염증성 질환의 증상의 개선, 바이러스에 반응한 사이토카인 생성의 감소) 중 임의의 것에 대한 IRP 및/또는 IRC의 사용과 관련된 적합한 세트의 설명서, 일반적으로 명시된 설명서를 더 포함할 수 있다.
키트는 어떤 간편하고 적합한 포장으로 포장된 IRP 및/또는 IRC를 포함할 수 있다. 예를 들어, IRP 또는 IRC가 건조한 제형(예를 들어, 동결건조된 또는 건조된 분말)인 경우, IRP 또는 IRC가 탄력적 정지장치를 통하여 유체를 주사함으로써 쉽게 현탁될 수 있도록 탄력적 정지장치가 있는 바이알이 보통 사용된다. 비탄력적, 제거가능한 폐쇄장치(예를 들어, 봉인된 유리) 또는 탄력적 정지장치가 있는 앰풀이 IRP 또는 IRC의 액체 제형에 가장 편리하게 사용된다. 특정 장치, 예를 들어 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기), 주사기 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 포장이 또한 고려된다.
IRP 및/또는 IRC의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 투여량, 투여 스케쥴, 및 의도된 사용 방법에 대한 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. IRP 또는 IRC의 용기는 단위 용량, 벌크 포장(예를 들어, 다중 용량 포장) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로 표장에 명시된 설명서 또는 포장 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이)을 포함하지만, 기계-판독가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광 저장 디스크 상에 운반되는 설명서)도 허용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 키트는 투여용 복합체로서 예를 들어 캡슐화 물질, 마이크로담체 복합체 물질 등으로서 IRP 및/또는 IRC의 생산을 위한 물질을 포함한다. 일반적으로, 키트는 IRP 또는 IRC의 분리된 용기 및 복합체 물질(들)을 포함한다. IRP 또는 IRC 및 복합체는 바람직하게는 공급된 IRP 또는 IRC와 복합체 물질의 혼합시 IRP- 또는 IRC-복합체의 형성을 허용하는 형태로 공급된다. 이 형태는 IRP- 또는 IRC-복합체가 비공유결합으로 결합될 때 바람직하다. 이 형태는 또한 IRP- 또는 IRC-복합체가 헤테로이기능성 교차결합기를 통하여 교차결합될 때, IRP/IRC 또는 복합체가 "활성화된" 형태로 공급될 때(예를 들어, IRP/IRC와 반응한 부분이 이용가능하도록 헤테로이기능성 교차결합기에 연결될 때) 바람직하다.
하기 실시예는 본 발명을 한정하기 위해서가 아니라 설명하기 위하여 제공된다.
실시예 1: IRS -함유 폴리뉴클레오티드에 의한 세포의 선천성 면역반응의 조절
면역조절 폴리뉴클레오티드(IRP)(즉, 하나 이상의 IRS를 함유한 폴리뉴클레오티드) 또는 대조군 샘플을 사람 및 마우스 세포 상에서 선천성 면역반응의 면역조절(IR) 활성에 대하여 분석하였다. 사이토카인 반응, 세포 성숙 및 세포 증식을 포함한 선천성 면역반응의 몇몇 지표를 측정함으로써 IR 활성을 분석할 수 있었다. 달리 기록되지 않는 한, 시험된 폴리뉴클레오티드는 완전히 변형된 포스포로티오에이트 올리고디옥시뉴클레오티드이었다.
선천성 면역반응은 세포 배양에 면역조절 핵산(ISNA)을 첨가함으로써 분석된 세포에서 자극되었다. 그 후 IRP 또는 대조군 샘플은 세포 배양에 첨가되었다. 세포의 인큐베이션 후, 배양물 배지에 있는 특정 사이토카인의 수준, 세포 성숙 및/또는 증식의 상태에 대하여 배양물 배지 및/또는 세포를 시험하였다.
마우스 세포 분석의 경우, BALB/c 또는 C57B1/6 마우스 비장의 단편은 분해된 단편을 금속 스크린을 통하여 힘을 가함으로써 기계적으로 분산되었다. 분산된 비장림프구를 원심분리로 펠렛을 만든 후, 새 배지에 재현탁하였다(10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 1640, 50 단위체/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 0.05 mM β-머캅토에탄올). 일부 분석의 경우, Miltenyi Biotec(캘리포니아 오번, 제품번호 130-052-501)의 CD11c-코팅된 마이크로비드를 사용하고 제조업자의 지침을 따라서 비장림프구로부터 분리된, 정제된 쥐과 CD11c+ 세포를 분석에 사용하였다.
마우스 비장림프구를 96 웰 플레이트의 웰에 분배하였다(7 x 107 세포/ml). SEQ ID NO:＿(1018) 또는 SEQ ID NO:＿(C274)와 같은 ISNA를 세포에 0.7 μM의 농도로 첨가하였고, IRP 시험 샘플 또는 대조군 샘플을 세포에 첨가하였다. 세포를 추가 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 각 웰로부터 수확하였고, 면역분석 ELISA를 사용하여 IL-6 및 IL-12 사이토카인에 대하여 시험하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 항-IL-6 항체(제품번호 554400 및 554402, Pharmingen, 캘리포니아 샌디에고) 및 항-IL-12 항체(제품번호 551219 및 554476, Pharmingen, 샌디에고)를 사용하였고, 제조업자가 추천한 프로토콜을 사용하였다. 1.4 μM, 0.7 μM, 0.14 μM 및 0.07 μM을 포함한 다양한 농도에서, 또는 2:1, 1:1, 1:5, 및 1:10의 IRP:ISNA의 비율로 IRP를 시험하였다. 대조군 샘플은 ISNA 단독, IRP 단독, 배지 단독 및 ISNA도 IRS도 함유하지 않은 대조군 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:＿(C532)을 포함하였다.
IRP는 ISNA-자극된 쥐과 비장림프구 및 CD11c+ 세포로부터 IL-6 및 IL-12 분비를 억제한다. 쥐과 세포에 대한 이러한 분석 결과의 예는 도 1A-1B에 제시된다. 도 1A는 ISNA SEQ ID (1018) 단독 및 다양한 양의 두 상이한 IRP, SEQ ID NO:92 (530) 및 SEQ ID NO:17 (C869), 및 대조군 서열 SEQ ID (C532)와 함께 ISNA SEQ ID (1018)으로 자극된 비장림프구의 결과를 도시한다. 도 1B는 ISNA SEQ ID NO:＿5'-TCG TCG AAC GTT CGA GAT GAT-3' (C274) 단독 및 두 상이한 IRP(SEQ ID NO:92 (530) 및 SEQ ID NO: 17 (C869), 및 대조군 서열 SEQ ID (C532)와 함께 ISNA SEQ ID NO: (C274)으로 자극된 CD11C+ 세포의 결과를 도시한다. 도 1A 및 1B에 나타낸 바와 같이, IRP의 존재는 ISNA에 반응한 세포에 의하여 생성된 IL-6 및 IL-12의 양의 감소를 야기하였다. IRP에 의한 사이토카인 생성의 억제는 IRP의 투여량에 반응성이 있었다.
사람 세포 분석의 경우, 헤파린화된 주사기를 사용한 정맥 천자에 의하여 말초 혈액을 자원자로부터 수집하였다. 혈액을 FICOLL® (Amersham Pharmacia Biotech) 쿠션에 층을 만들어 원심분리하였다. FICOLL 계면에 위치한 PBMC를 수집한 후, 차가운 인산 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 세포를 재현탁하고, 48 또는 96 웰 플레이트에서 2 x 106 세포/mL에서 RPMI 1640으로 10% 열-비활성화된 사람 AB 혈청 플러스 50 단위체/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 300 ㎍/mL 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 1 x MEM 비-필수 아미노산(NEAA)과 함께 배양하였다.
사람 B 세포 및 사람 PDC를 문헌(Marshall et al. (2003) J. Leukoc Biol. 73:781-92)에 설명된 과정을 이용하여 분리하였다. 사람 B 세포를 분배하고, 인큐베이션하여, 배지를 각 웰로부터 수확하여 문헌(Marshall et al. (2003))에 설명된 바와 같이 ELISA에 의하여 IL-6 사이토카인 농도에 대하여 시험하였다. 2.8 μM, 0.7 μM 및 0.175 μM를 포함한 다양한 농도 또는 4:1, 1:1, 및 1:4의 비율로 IRP SEQ ID NO:92 (530) 및 SEQ ID NO:17 (869)를 시험하였다. 대조군 샘플은 ISNA SEQ ID (1018), IRP 단독 (SEQ ID NO:92 (530) 및 SEQ ID NO:17 (869), 배지 단독 및 ISNA나 IRS를 함유하지 않는 대조군 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID (532))를 포함하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, IRP 중 어떤 것의 존재는 ISNA-자극된 정제된 사람 B 세포에 의하여 생성된 IL-6의 양의 감소를 야기하였다.
IRP의 생체내 활성을 마우스에서 조사하였다. 1군의 마우스(그룹당 5 마리)를 각각 25 ㎍ ISNA SEQ ID (1018) 단독으로 또는 75 ㎍, 25 ㎍ 또는 8.5 ㎍ 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 IRP SEQ ID NO:17 (C869)와 조합하여 피하 주사하였다. 3:1, 1:1, 및 1:3의 IRP:ISNA의 비율을 동물에 병용 투여하였다. 다른 대조군 그룹을 식염수, 대조군 올리고뉴클레오티드 단독 또는 IRP SEQ ID NO:17 (C869) 단독으로 주사하였다. 핵산의 주사한 지 2 시간 후에 혈청을 수집하고, 혈청 중의 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 수준을 IL-6 및 IL-12에 대하여 이전에 설명한 면역 분석 및 마우스 항-TNF-α Quantikine(R&D System, Inc., 미네소타 미네아폴리스)을 사용하여 결정하였다. 이들 분석의 결과는 도 3-5에 도시된다. ISNA와 함께 IRP를 투여한 것은 ISNA를 단독으로 수용한 동물의 혈청에 있는 사이토카인의 양에 비해서 혈청에 있는 사이토카인의 각각의 양이 감소되는 결과를 가져왔다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 시험한 임의의 비율로 ISNA와 함께 IRP를 투여한 것은 ISNA를 단독으로 투여한 것과 비교하여 IL-6의 혈청 수준의 적어도 대략 6 배 감소를 가져왔다. 도 4는 IRP에 의한 IL-12 생성의 억제는 ISNA 단독 투여에 비해서 사이토카인의 감소를 가져오는 시험된 IRP:ISNA의 모든 비율에서 투여량 의존적이었다는 것을 나타낸다. 도 5는 시험된 IRP:ISNA의 모든 비율이 ISNA 단독 투여에 비해서 TNF-α의 감소를 가져왔다는 것을 나타낸다.
또한 IRP 및 ISNA를 동물의 별개 부위에서 동물에 투여했을 때 IRP의 생체내 활성을 조사하였다. 이 실험에서, 사이토카인 반응을 25 ㎍ ISNA SEQ ID (1018) 단독 또는 25 ㎍ IRP SEQ ID NO:17 (C869)과 조합하여 피하 주사한 마우스 군(1 군당 5 마리)에서 사이토카인 반응을 비교하였다. ISNA를 모든 동물에 피하 주사하는 동안, ISNA (SCl)와 동일한 측면에 피하로, ISNA (SC2)와 반대 측면에 피하로, 복강내로(IP), 정맥내로(IV), 근육내로(IM) 또는 비강내로(IN) IRP를 주사하였다. 대조군 그룹을 동일 측면에 피하로 식염수, IRP SEQ ID NO:17 (C869) 단독으로 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ISNA SEQ ID (1018)과 함께 주사하였다.
핵산을 주사한 지 2 시간 후 혈청을 수집하고 혈청 중의 IL-6 및 IL-12의 수준을 결정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 시험된 부위 모두에(즉, SC1, SC2, IP, IV, IM 및 IN) IRP를 투여한 것은 ISNA에 반응하여 생성된 IL-6의 양의 분명한 억제를 가져왔다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 시험된 부위 모두에 IRP를 투여한 것은 또한 ISNA에 반응한 혈청 IL-12의 양의 억제를 가져왔다.
시험관내 및 생체내에서 수행된 분석은 IRP가 ISNA의 자극 활성을 억제하기 위하여 동일한 시간 또는 동일한 부위에서 병용투여될 필요는 없다는 것을 보여준다.
실시예 2: IRP 활성 및 TLR -의존적 세포 반응
본원에 나타낸 바와 같이, IRP는 TLR-9 신호화와 연관된 활성 또는 반응을 억제한다. IRP 활성 및 TLR-9 및 다른 TLR과 연관된 활성 또는 반응을 더 조사하기 위하여 실험을 수행하였다.
제1형 단순포진 바이러스(HSV-I)로 감염된 쥐과 비장림프구 및 사람 PBMC 및 PDC는 IFN-α를 생성함으로써 반응하고, 이 반응은 TLR-9 신호화에 의존적이다. 인플루엔자 바이러스(균주 PR/8)로 감염된 쥐과 비장림프구 및 PBMC 및 PDC도 또한 IFN-α를 생성함으로써 반응하지만, 그러나 이 반응은 TLR-7/8 신호화에 의존적이고 TLR-9과는 관계없다. 감염된 세포에 의한 선천성 면역반응 사이토카인 생성에 대한 IRP의 효과를 조사하였다.
전술한 바와 같이 준비된 쥐과 CD11+ 비장림프구를 다양한 양의 HSV-1로 감염시켰다. 면역분석(PBL Biomedical Laboratories. 뉴저지 피스카다웨이)으로 측정된 IFN-α 및 세포에 의하여 생성된 IL-12의 양을 측정하고 감염에 사용된 바이러스의 양과 비교하였다. 도 8A-8B는 감염에 사용된 HSV-1(감염다중도, MOI)의 양에 반응한 IFN-α 및 IL-12의 생성의 예를 도시한다. HSV-1의 10 MOI로 감염된 세포는 IFN-α 및 IL-12 모두를 명백히 생성하였다.
그 후 쥐과 CD11+ 비장림프구를 IRP SEQ ID NO:17 (C869) (7, 3.5 또는 1.75 μM) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 다양한 양의 존재 하에서 10 MOI HSV-1로 감염시켰고, 생성된 IFN-α 및 IL-12의 양을 결정하였다. 도 9A 및 9B에 나타낸 바와 같이, IRP SEQ ID NO:C869는 시험한 각각의 농도에서 비장림프구로부터 IFN-α 및 IL-12의 생성을 명백하게 억제하였다. IRP SEQ ID NO:17 (C869)는 또한 도 9C에나타낸 바와 같이 HSV-1 감염된 사람 PDC로부터 IFN-α의 생성을 억제하였다. 이들 결과는 TLR-9 의존적 세포 반응을 억제하는 IRP SEQ ID NO:17 (C869)와 일치한다.
또한 사람 PDC를 다양한 양의 인플루엔자 바이러스(균주 PR/8)로 감염시켰다. 세포에 의하여 생성된 IFN-α의 양을 측정하고 감염에 사용된 바이러스의 양과 비교하였다. 도 10A는 감염에 사용된 인플루엔자 바이러스(감염다중도, MOI)의 양에 반응한 IFN-α의 생성의 예를 도시한다. 10 MOI의 인플루엔자 바이러스(균주 PR/8)로 감염된 세포는 감염에 반응하여 IFN-α를 명백하게 생성하였다.
그 후 사람 PDC를 IRP SEQ ID NO:17 (C869) (7, 3.5 또는 1.75 μM) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 다양한 양의 존재 하에서 10 MOI 인플루엔자 바이러스(균주 PR/8)로 감염시키고, 생성된 IFN-α의 양을 결정하였다. 도 10B에 나타낸 바와 같이, IRP SEQ ID NO:17 (C869)는 명백하게 세포로부터 IFN-α의 생성을 투여량-의존적 방식으로 억제하였다. 이들 결과는 TLR-7/8 의존적 세포 반응을 또한 억제하는 IRP SEQ ID NO:17 (C869)와 일치한다.
SEQ ID NO:27 (C661)는 HSV-1과 인플루엔자 바이러스(PR/8) 자극된 세포를 다르게 억제하는 것으로 확인되었다. 사람 PDC를 SEQ ID NO:17 (C869), SEQ ID NO:27 (C661) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 30 MOI로 HSV-1으로 감염시켰다. 일부 실험에서, 다른 농도의 HSV-1을 유사한 결과로 사용하였다. PDC를 문헌(Duramad et al. (2003) Blood 102:4487)에 설명된 바와 같이 농축시키고, 치사 UV-조사된 HSV-1과 인큐베이션하였다. 도 11A-11B에 나타낸 바와 같이, IRP SEQ ID NO:17 (C869)는 IFN-α 생성을 완전히 억제하였지만, SEQ ID NO:27 (C661)은 세포로부터 IFN-α의 생성에 아무런 효과를 나타내지 않았다. 사람 PDC를 SEQ ID NO:17 (C869), SEQ ID NO:27 (C661) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 인플루엔자 바이러스(PR/8)를 10 MOI로 감염시켰다. 도 11A-11B에 나타낸 바와 같이, 세포에 의한 IFN-α의 생성에 대한 SEQ ID NO:27 (C661)의 억제 효과는 IRP SEQ ID NO:17 (C869)의 효과와 비교가능하였다. 따라서, 상이한 IRP 종은 세포에 상이한 억제 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, IRP SEQ ID NO:27 (C661)은 TLR-7/8 의존적 세포 반응을 억제하지만, TLR-9 세포 반응은 억제하지 않았다.
쥐과 비장림프구는 TLR-4 자극을 통하여 LPS에 반응하여 IL-6를 생성한다. IRP SEQ ID NO:17 (C869) 및 SEQ ID NO:92 (530) 및 대조군 올리고뉴클레오티드를 LPS 자극 비장 세포에 의한 IL-6 생성에 미치는 그들의 효과에 대하여 시험하였다. 도 12A-12B에 도시된 바와 같이, 어떤 IRP도 LPS-자극된 비장 세포로부터 IL-6 생성을 억제하지 않았다. 대조적으로, 4배 낮은 농도의 어떤 IRP도 ISNA-자극된 비장 세포로부터 IL-6 생성을 억제하였다. 따라서, IRP SEQ ID NO:17 (C869) 또는 IRP SEQ ID NO:92 (530) 어떤 것도 TLR-4 의존적 세포 반응을 억제하지 않았다.
TLR-7/8 의존적 반응에 대한 IRP SEQ ID NO:17 (C869)의 효과를 두 TLR 활성제를 사용하여 조사하였다. 록소리빈(7-알릴-7,8-디히드로-8-옥소-구아노신)은 항-종양 반응에서 합성 보조제로 작용을 하고 TLR-7 의존적 신호전달 경로를 통하여 선택적으로 선천성 면역 시스템의 세포를 활성화하는 것으로 나타났다(Heil et al. (2003) Eur. J. Immunol 33:2987-2997). 쥐과 비장 세포를 다양한 농도의 IRP SEQ ID NO:17 (C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 록소리빈(100 μM)으로 자극하였고, 생성된 IL-6 및 IL-12의 양을 결정하였다. 도 13A-13D에 나타낸 바와 같이, IRP SEQ ID NO:17 (C869)은 세포로부터 IL-6의 생성을 투여량-의존적 방식으로 유도하였지만, 세포에 의한 IL-12 생성에는 영향을 미치지 않았다.
레시퀴모드(R-848)는 TLR-7 및 TLR-8 신호화의 자극제이다. 쥐과 비장 세포 를 다양한 농도의 IRP SEQ ID NO:17 (C869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 R-848(1 μM)로 자극하였고, 생성된 IL-6 및 IL-12를 결정하였다. 도 14A-14D에 나타낸 바와 같이, IRP SEQ ID NO:17 (C869)는 세포로부터 IL-6의 TLR-7/8 유도된 생성을 투여량-의존적 방식으로 억제하였지만, 세포에 의한 IL-12 생성에는 영향을 미치지 않았다.
다양한 TLR 자극의 억제에 대하여 시험했을 때, SEQ ID NO:27 (C661)는 다시 한번 TLR-7/8 의존적 세포 반응을 억제하지만 TLR-4-의존적 또는 TLR-9 의존적 세포 반응은 억제하지 않는 것으로 확인되었다. 도 15A-15D에 도시된 바와 같이, IRP SEQ ID NO:27 (C661)는 100 μM 록소리빈 자극된 비장 세포 및 1 μM R848 자극된 비장 세포로부터 IL-6 생성을 억제하였다. 이것은 SEQ ID NO:27 (C661)이 TLR-7/8 의존적 세포 반응을 억제하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 그러나, 도 15A-15D는 또한 SEQ ID NO:27 (C661)이 ISNA 자극된 비장 세포 또는 LPS 자극된 비장 세포로부터 IL-6 생성을 억제하지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, SEQ ID NO:27 (C661)은 TLR-9 또는 TLR-4 의존적 세포 반응을 억제하는 데 효과적이지 않다.
IRP SEQ ID NO:17 (C869)은 ISNA 자극, 바이러스 감염, 및 화학적 자극에 반응한 TLR-7/8 및 TLR-9 의존적 사이토카인 생성을 모두 억제한다. IRP SEQ ID NO:27 (C661)은 바이러스 감염, 화학적 자극 및 ISNA 자극에 반응한 TLR-7/8 의존적 사이토카인 생성은 억제하지만, TLR-9 의존적 사이토카인 생성은 억제하지 않는다. IRP SEQ ID NO:17 (C869), IRP SEQ ID NO:92 (530), IRP SEQ ID NO:27 (C661) 어떤 것도 TLR-4 의존적 IL-6 생성을 억제하지 않는다.
실시예 3: IRS -함유 폴리뉴클레오티드의 TLR -의존적 활성
일련의 실험에서, 마우스 비장림프구를 다양한 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 R848(TLR-7/8 신호화) 또는 ISNA SEQ ID (1018)(TLR-9 신호화)로 자극하였다. 표 1은 두 실험의 결과를 포함한다. 주어진 값은 R848 단독과의 IL-6 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 IL-6 반응의 백분율이다.
Figure 112007024021718-pct00001
표 2는 ISNA SEQ ID (1018)(TLR-9 신호화) 자극된 세포의 결과를 포함한다. 주어진 값은 ISNA 단독과의 IL-6 또는 IL-12 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 IL-6 또는 IL-12 반응의 백분율이다. I
Figure 112007024021718-pct00002
표 3은 3 실험의 결과를 포함한다. 주어진 값은 R848 단독과의 IL-6 반응(TLR-7/8 신호화)과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 IL-6 반응의 백분율이다
Figure 112012012350020-pct00039
표 4 및 5는 ISNA SEQ ID (1018)(TLR-9 신호화) 자극된 세포의 결과를 포함한다. 주어진 값은 ISNA 단독과의 IL-6 또는 IL-12 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재에서의 IL-6(표 4) 또는 IL-12(표 5) 반응의 백분율이다.
Figure 112012012350020-pct00040
Figure 112012012350020-pct00041
표 6은 예시적 IRS 및 TLR 신호화의 억제시 그들의 효과를 열거한다.
Figure 112007024021718-pct00006
Figure 112007024021718-pct00007
일련의 투여량-반응 실험에서, 마우스 비장림프구를 다양한 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 R848 (TLR-7/8 신호화) 또는 ISNA SEQ ID (1018) (TLR-9 신호화)로 자극하였다. 표 7은 다양한 비율의 IRP:ISNA의 존재 하에 IL-6 생성의 결과를 포함한다. 주어진 값은 ISNA 단독과의 IL-6 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 IL-6 반응의 백분율이다.
Figure 112012012350020-pct00042
표 8은 다양한 비율의 IRP:ISNA의 존재 하에 쥐과 비장림프구로부터 IL-12 생성의 결과를 포함한다. 주어진 값은 ISNA 단독과의 IL-12 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 IL-12 반응의 백분율이다.
Figure 112007024021718-pct00009
표 9는 R848(TLR 7/8 신호화)의 존재에서 다양한 농도의 IRP의 존재 하에 쥐과 비장림프구로부터의 IL-6 생성의 결과를 포함한다. 주어진 값은 R848 단독과의 IL-6 반응과 비교해서 IRP 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 IL-6 반응의 백분율이다.
Figure 112007024021718-pct00010
표 7-9에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:52 (C954). SEQ ID NO:53 (C956), SEQ ID NO:54 (C957) 및 SEQ ID NO:55-65 (C962-C972)은 TLR-7/8 및 TLR-9 의존적 세포 반응을 억제하는 데 특히 효과적이다.
실시예 4
쥐과 비장 세포를 ISNA SEQ ID (1018) (0.7 μM) 또는 R848 (1 μM) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:17 (869), IRP SEQ ID NO:27 (661), IRP SEQ ID NO:52 (954)의 증가된 양으로 함께 활성화하였다. 도 16A-16B에 도시된 바와 같이, IRP SEQ ID NO:17 (869) 및 IRP SEQ ID NO:52 (954)는 ISNA SEQ ID (1018)에 반응한 IL-6 생성의 강력한 억제제이고, IRP SEQ ID NO:27 (661) 및 IRP SEQ ID NO:52 (954)는 R848 활성화의 강력한 억제제이다.
1군의 마우스를 각각 R848의 2.5 ㎍ 단독으로 그리고 대조군 올리고 뉴클레오티드 또는 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 450-500 ㎍ 또는 100-150 ㎍과 조합하여 피하 주사하였다. 혈청을 R848을 주사한 지 1시간 후 수집하여 혈청 내의 IL-12 및 TNF-α의 수준을 앞서 설명한 면역분석을 사용하여 결정하였다. 이들 분석의 결과는 도 17A-17B에 도시된다. IRP를 R848과 투여한 것은 R848을 단독으로 수용한 동물의 혈청에서의 사이토카인의 양에 비해서 혈청에서의 각 사이토카인의 양의 감소를 가져왔다.
6 내지 12 주령 BALB/c 마우스를 식염수 중의 D-갈락토사민 20 mg을 복강내로 및 ISNA SEQ ID (1018) ISNA 50 ㎍을 피하로, 또는 IRP SEQ ID NO:52 (954) 또는 IRP SEQ ID NO:17 (869) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ODN의 200 ㎍, 100 ㎍ 또는 50 ㎍과 조합하여 주사하였다. 그 후 마우스를 7일 이상 생존에 대하여 평가하였다. 정상 마우스의 경우, 50 ㎍의 ISNA SEQ ID (1018)는 사망을 유도하지 않았지만, 마우스가 D-갈락토사민으로 사전처리될 때, 그것들은 염증에 쉽게 걸리고 빨리 죽는다. 도18에 도시된 바와 같이, IRS는 투여량 의존적 방식으로 사망을 예방할 수 있지만, 비활성 대조군-ODN는 그러지 못했다. 가장 높은 투여량에서(200 ㎍의 IRS) 마우스 100%, IRS 100 ㎍과 함께는 거의 90% 그리고 1:1 비율에서는 60% 이상이 보호되었다. 따라서 이들 데이터는 IRS의 강한 생체내 활성을 지지한다.
마우스 비장림프구를 ISNA SEQ ID (1018) (도 19A) 또는 R848 (도 19B) 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:52 (954)로 함께 또는 IRP SEQ ID NO:52 (954), IRP SEQ ID NO:＿(DVO19), IRP SEQ ID NO:＿(DV020), IRP SEQ ID NO:＿(DV021), IRP SEQ ID NO:＿(DV022); IRP SEQ ID NO:＿(DV023) 및 IRP SEQ ID NO:＿(DV024)의 분해 생성물로 함께 활성화하였다.
DV0 서열은 "IRS 954 N 마이너스 서열"이다(3' 말단이 결실된 N=1 내지 6 뉴클레오티드를 가진 IRS 954):
SEQ ID NO:＿DVO19: 5'-TGC TCC TGG AGG GGT TG
SEQ ID NO:＿DV020: 5'-TGC TCC TGG AGG GGT T
SEQ ID NO:＿DV021: 5'-TGC TCC TGG AGG GGT
SEQ ID NO:＿DV022: 5'-TGC TCC TGG AGG GG
SEQ ID NO:＿DV023: 5'-TGC TCC TGG AGG G
SEQ ID NO:＿DV024: 5'-TGC TCC TGG AGG
도 19A 및 19B에 도시된 바와 같이, 세포를 IRP SEQ ID NO:＿(DV024)의 약간의 억제 또는 아무런 억제 없이 IRP SEQ ID NO:＿52(954), IRP SEQ ID NO:＿(DVO19), IRP SEQ ID NO:＿(DV020), IRP SEQ ID NO:＿(DV021), IRP SEQ ID NO:＿(DV022), IRP SEQ ID NO:＿(DV023)의 존재 하에서 배양하였을 때, IL-6 생성은 감소되었다. 이것은 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 활성이 서열의 3'-말단의 분해 후에도 유지된다는 것을 제시한다.
(NZBxNZW)F1 마우스를 아무런 처리도 하지 않거나 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 15 ㎍ 또는 45 ㎍으로 1주일에 2회 처리하였다. 처리는 질환의 첫 번째 징후가 마우스에 나타났을 때 4-5 개월 나이에 시작하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 처리가 없을 때 항-dsDNA 자기항체의 혈청의 수준은 시간에 따라 증가하였다. IRP SEQ ID NO:52 (954)로 주사한 마우스는 자기항체의 수준을 감소시켰는데, 이는 이 낭창에 걸리기 쉬운 마우스의 질환의 진행에 영향을 미치는 그것의 능력을 나타낸다.
8-9개월되고 이미 질병에 걸린(NZBxNZW)F1 마우스를 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 100 ㎍ 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 주 3회 주사하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, IRP SEQ ID NO:52 (954)를 통한 치료는 대조군 올리고뉴클레오티드에 비해서 마우스의 사망률을 감소시켰다.
정제된 사람 B 세포를 ISNA SEQ ID (1018) 또는 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:17 (869), IRP SEQ ID NO:27 (661), IRP SEQ ID NO:52 (954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 활성화하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 억제 활성의 패턴은 마우스 및 사람에서 유사하다. 특히, IRP SEQ ID NO:52 (954)는 두 자극으로 자극된 사람 B 세포로부터 IL-6 생성을 억제하였다.
사람 PDC를 UV-비활성화된 HSV-1 바이러스 단독으로(MOI:5) 그리고 IRP SEQ ID NO:52 (954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 감염시켰다. 도 23은 바이러스 단독에 반응한 IFN-α의 생성에 대한 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 강한 억제 효과의 예를 도시한다.
사람 PDC를 열-비활성화된 인플루엔자 바이러스 단독으로(MOI:2) 그리고 IRP SEQ ID NO:52 (954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 감염시켰다. 도 24는 바이러스 단독에 반응한 IFN-α의 생성에 대한 IRP SEQ ID NO:52 (954)의 강한 억제 효과의 예를 도시한다.
사람 PDC를 항-dsDNA 양성 SLE 환자로부터 얻어진 10% 혈청 단독 및 IRP SEQ ID NO:52(954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 존재하에 UV-조사된(60 mJ) U937 세포의 존재 하에서 배양하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 항-dsDNA를 함유한 혈청은 PDC를 활성화하고 IFN-α를 유도할 수 있다. 그러나, 배양물에 첨가됐을 때, IRP SEQ ID NO:52(954)는 IRP SEQ ID NO:52 (954)는 IFN-α 반응을 억제할 수 있었지만, 대조군 올리고뉴클레오티드는 아무런 영향을 미치지 않았다. 이것은 IRP SEQ ID NO:52 (954)가 SLE 환자의 샘플을 사용하여 이 시험관내 분석에 PDC 활성화를 현저히 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
사람 PDC를 항-RNP 양성 SLE 환자로부터 정제된 IgG의 0.5 mg/ml 단독 및 IRP SEQ ID NO:52 (954) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 존재 하에 UV-조사(60 mJ) U937 세포의 존재 하에서 배양하였다. IgG를 HiTrap 단백질 G HP 칼럼(GE Healthcare, 위스콘신 와우케샤)를 사용하여 환자의 혈청으로부터 정제하였다. 정제되었을 때, IgG를 탈염하고 그 후 정량하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 항-RNP-특이적 IgG는 PDC를 활성화하고 IFN-α를 유도할 수 있었다. 그러나, 배양물에 첨가됐을 때, IRP SEQ ID NO:52 (954)는 IFN-α 반응을 억제할 수 있었지만, 대조군 올리고뉴클레오티드는 아무런 영향을 미치지 않았다. 이것은 IRP SEQ ID NO:52 (954)가 SLE 환자의 샘플을 사용하여 이 시험관내 분석에 PDC 활성화를 현저히 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
쥐과 비장림프구를 ISNA SEQ ID (1018) 또는 R848 단독으로 그리고 IRP SEQ ID NO:17 (869), IRP SEQ ID NO:77 (661), IRP SEQ ID NO:52 (954), IRP SEQ ID NO:＿(983), IRP SEQ ID NO:＿(984), IRP SEQ ID NO:＿(985), IRP SEQ ID NO:＿(986), IRP SEQ ID NO:＿(987), IRP SEQ ID NO:＿(988), IRP SEQ ID NO:＿(989), IRP SEQ ID NO:＿(990), IRP SEQ ID NO:＿(991) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드와 함께 활성화하였다. 도 27 및 도 28에 도시된 바와 같이, 비-뉴클레오티드기의 첨가는 반응의 수준을 조절할 수는 있지만 활성의 손실을 완료시키도록 이끌지는 않았다.
앞서 말한 발명은 명료하게 하고 이해를 돕기 위해서 설명과 예로서 다소 상세하게 설명되었지만, 어떤 변화 및 변형이라도 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 설명과 예들은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dynavax Technologies Corporation Barrat, Franck Coffman, Robert L. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITION OF INNATE IMMUNE RESPONSES AND AUTOIMMUNITY <130> 377882003447 <140> KR 10-2007-7006947 <141> 2005-08-24 <150> US 60/606,833 <151> 2004-09-01 <160> 123 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 6,7 <223> n = A, T, C or G and if base at position 1 is C or A then bases at positions 6 and 7 cannot both be A <400> 1 nggggnn 7 <210> 2 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> n = A or C <220> <221> misc_feature <222> 6,7 <223> n = A, T, C or G, but bases at positions 6 and 7 cannot both be A <400> 2 nggggnn 7 <210> 3 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> (4)...(102) <223> n = absent or A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 103 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 108,109 <223> n = A, T, C or G and if base at position 103 is A or C then bases at positions 108 and 109 cannot both be A <400> 3 ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnggggnn 109 <210> 4 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> (2)...(50) <223> n = absent or A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 54 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> (55)...(103) <223> n = absent or A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 104,105 <223> n = sequence absent or G <220> <221> misc_feature <222> 106 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> (107)...(125) <223> n = absent or A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 126 <223> n = A, T, C or G <220> <221> misc_feature <222> 131,132 <223> n = A, T, C or G and if base at position 126 is A or C then bases at positions 131 and 132 cannot both be A <400> 4 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnngggg nn 132 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 1,2 <223> n = A, T, C or G and if base at position 3 is C or A then bases at positions 1 and 2 cannot both be G <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> n = A, T, C or G <400> 5 nnnggggaa 9 <210> 6 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)...(103) <223> n = absent or A, T, C or G <400> 6 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntcctgga ggggttgt 118 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 ttgacagctt gacagca 17 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 4,5 <223> n = A or G <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> n = A, T or G or inosine <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n = A, T, C, G or inosine and when base at position 6 is not G or inosine then base at position 7 is guanosine or inosine <220> <221> misc_feature <222> 8,9 <223> n = T or C <400> 8 tgcnnnnnn 9 <210> 9 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 4,5 <223> n = G or A <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> n = A, T, G or inosine <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n = A, T, C, G or inosine and when base at position 6 is not G or inosine the base at position 7 is guanosine or inosine <220> <221> misc_feature <222> 8,9 <223> n = C or T <220> <221> misc_feature <222> (10)...(107) <223> n = absent, C or T <400> 9 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 107 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 tcctaacggg gaagt 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 tcctaagggg gaagt 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 tcctaacggg gttgt 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 tcctaacggg gctgt 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 tcctcaaggg gctgt 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 tcctcaaggg gttgt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 tcctcatggg gttgt 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 tcctggaggg gttgt 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 tcctggaggg gctgt 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 tcctggaggg gccat 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 tcctggaggg gtcat 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 tccggaaggg gaagt 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 tccggaaggg gttgt 15 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> n = 7-deaza-dG <400> 23 tcctggagng gttgt 15 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 tgactgtagg cggggaagat ga 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 25 gagcaagctg gaccttccat 20 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> n = 7-deaza-dG <400> 26 cctcaagctt gagngg 16 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 tgcttgcaag cttgcaagca 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 tgcttgcaag cttgcaag 18 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 tgcttgcaag cttgca 16 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 30 gcttgcaagc ttgcaagca 19 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 cttgcaagct tgcaagca 18 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 ttgcaagctt gcaagca 17 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 33 tgcttgcaag ctagcaagca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 34 tgcttgcaag cttgctagca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 tgcttgacag cttgacagca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 tgcttagcag ctatgcagca 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 37 tgcaagcaag ctagcaagca 20 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 tgcaagcttg caagcttgca agctt 25 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 tgctgcaagc ttgcagatga t 21 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 tgcttgcaag cttgcaagc 19 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 tgcaagcttg caagcttgca at 22 <210> 42 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 tgcttgcaag cttg 14 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 43 agcttgcaag cttgcaagca 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 44 tacttgcaag cttgcaagca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 45 tgattgcaag cttgcaagca 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 46 aaattgcaag cttgcaagca 20 <210> 47 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 47 tgctggaggg gttgt 15 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 48 aaattgacag cttgacagca 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 49 tgattgacag cttgacagca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 50 tgattgacag attgacagca 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 51 tgattgacag attgacagac 20 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 52 tgctcctgga ggggttgt 18 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 53 tgcttgtcct ggaggggttg t 21 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 54 tgcttgacat cctggagggg ttgt 24 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 55 tgcttgacag cttgacagtc ctggaggggt tgt 33 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 56 tgcttgacag cttgatcctg gaggggttgt 30 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 57 tgcttgacag cttcctggag gggttgt 27 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 58 tgcttgacag cttgctcctg gaggggttgt 30 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 59 tgcttgacag cttgcttgtc ctggaggggt tgt 33 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 60 tgcttgacag cttgacagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 61 tgcttgacag cttgacagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 62 tgcttgacag cttgacagca tcctggaggg gt 32 <210> 63 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 63 tgcttgacag cttgacagca tcctggaggg g 31 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 64 tgcttgcaag cttgctcctg gaggggttgt 30 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 65 tgcttgcaag cttcctggag gggttgt 27 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 66 tgcttgcaag cttgcaagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 20,21 <223> Bases at positions 20 and 21 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 67 tgcttgcaag cttgcaagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 20,21 <223> Bases at positions 20 and 21 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 68 tgcttgcaag ctagcaagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 20,21 <223> Bases at positions 20 and 21 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 69 tgcttgcaag cttgctagca tcctggaggg gttgt 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 20,21 <223> Bases at positions 20 and 21 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <220> <221> misc_feature <222> 29 <223> n = 7-deaza-dG <400> 70 tgcttgcaag cttgctagca tcctggagng gttgt 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 15,16 <223> Bases at positions 15 and 16 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 71 tcctggaggg gttgttgctt gcaagcttgc aagca 35 <210> 72 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 72 tgcttgcaag c 11 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 73 cttgcaagct tgcaag 16 <210> 74 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 74 tgcaagcttg ca 12 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 75 tgctcctgca ggttaagt 18 <210> 76 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 76 tactggaggg gttgt 15 <210> 77 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 77 ttctggaggg gttgt 15 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> n = 7-deaza-dG <400> 78 tgctgctgga gnggttgt 18 <210> 79 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> n = 7-deaza-dG <400> 79 tgctggagng gttgt 15 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 80 tgactgtgaa ccttagagat ga 22 <210> 81 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 81 gctagagctt aggct 15 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 82 gcggcgggcg gcgcgcgccc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 83 gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 84 ccggccggcc ggccggccgg 20 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 85 tgactgtgaa ggttagagat ga 22 <210> 86 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 86 cctcaagctt gagggg 16 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 87 ttagggttag ggttagggtt aggg 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 88 ttagggttag ggttagggtt aggg 24 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 89 cctcaagctt gagggg 16 <210> 90 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 90 tcctgcaggt taagt 15 <210> 91 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 91 tcctggcggg gaagt 15 <210> 92 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> n = 7-deaza-dG <400> 92 tcctggcgng gaagt 15 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 93 tcctggcgag gaagt 15 <210> 94 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 94 tcctggcggg aaagt 15 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 95 tcctggcgga aaagt 15 <210> 96 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 96 tcctggaggg gaagt 15 <210> 97 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 97 tcctggcggg gaagt 15 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 98 tcctgctgga ggggttgt 18 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 99 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 100 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 100 tgctcctgga ggggttg 17 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 101 tgctcctgga ggggtt 16 <210> 102 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 102 tgctcctgga ggggt 15 <210> 103 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 103 tgctcctgga gggg 14 <210> 104 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 104 tgctcctgga ggg 13 <210> 105 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 105 tgctcctgga gg 12 <210> 106 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 3,4 <223> Bases at positions 3 and 4 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 106 tgctggaggg gttgt 15 <210> 107 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 3,4 <223> Bases at positions 3 and 4 are linked by tetra-(etylene glycol) <400> 107 tgctggaggg gttgt 15 <210> 108 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> n = ddd <400> 108 tgcntggagg ggttgt 16 <210> 109 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 109 gctcctggag gggttgt 17 <210> 110 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 110 ctcctggagg ggttgt 16 <210> 111 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 111 aaatcctgga ggggttgt 18 <210> 112 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n = d <400> 112 tcctggnggg gttgt 15 <210> 113 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n = dd <400> 113 tcctggnggg gttgt 15 <210> 114 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Two hexa-(ethylene glycol) moieties are linked to base at position 18 <400> 114 tgctcctgga ggggttgt 18 <210> 115 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 15,16 <223> Bases 15 and 16 are linked by 15 propyl linkers connected via phosphorothioate esters <400> 115 tcctggaggg gttgtt 16 <210> 116 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 15,16 <223> Bases at positions 15 and 16 are linked by 15 glycerol linkers connected via phosphorothioate esters <400> 116 tcctggaggg gttgtt 16 <210> 117 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 15,16 <223> Bases at positions 15 and 16 are linked by 8 triehyleneglycol linkers connected via phosphorothioate esters <400> 117 tcctggaggg gttgtt 16 <210> 118 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 15,16 <223> Bases at positions 15 and 16 are linked by 4 hexaethyleneglycol linkers connnected via phosophothioate esters <400> 118 tcctggaggg gttgtt 16 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 119 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 120 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)...(53) <223> n = absent or A, T, C or G wherein n comprises at least one gc dinucleotide and bases at positions (4)...(8) can not be absent <400> 120 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 53 <210> 121 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)...(53) <223> n = absent or A, T, C or G wherein n comprises at least one gc dinucleotide and bases at positions (4)...(8) can not be absent <400> 121 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnna 54 <210> 122 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)...(53) <223> n = absent or A, T, C or G wherein n comprises at least one gc dinucleotide and bases at positions (4)...(8) can not be absent <400> 122 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnca 55 <210> 123 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)...(53) <223> n = absent or A, T, C or G wherein n comprises at least one gc dinucleotide and bases at positions (4)...(8) can not be absent <400> 123 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngca 56

Claims (43)

  1. 개체에서 TLR7/8-의존성 면역반응을 억제하기 위한 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 200개 염기 또는 염기쌍 미만이며, 면역조절 서열을 포함하고, 면역조절 서열이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 적어도 하나의 TGC 트리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    상기 올리고뉴클레오티드는 하기 (a) 또는 (b)를 포함하고,
    (a) 5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:27),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAG-3' (SEQ ID NO:28),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCA-3' (SEQ ID NO:29),
    5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:33),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-3' (SEQ ID NO:34),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:35),
    5'-TGCTTAGCAGCTATGCAGCA-3' (SEQ ID NO:36),
    5'-TGCAAGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:37),
    5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCA AGCTT-3' (SEQ ID NO:38),
    5'-TGCTGCAAGCTTGCAGATGAT-3' (SEQ ID NO:39),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGC-3' (SEQ ID NO:40),
    5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAT-3' (SEQ ID NO:41),
    5'-TGCTTGCAAGCTTG-3' (SEQ ID NO:42),
    5'-TGCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:47),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:52),
    5'-TGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:53),
    5'-TGCTTGACATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:54),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:55),
    5'-TGCTTGACAGCTTGATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:56),
    5'-TGCTTGACAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:57),
    5'-TGCTTGACAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:58),
    5'-TGCTTGACAGCTTGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:59),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:60),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:62),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO:63),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:64),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:65),
    5'-TGCTTGCAAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:66),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:67),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:68),
    5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:69),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:70),
    5'-TGCTGCTGGAGZ'GGTTGT-3' (SEQ ID NO:78),
    5'-TGCTGGAGZ'GGTTGT-3' (SEQ ID NO:79),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTTG-3' (SEQ ID NO:100),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTT-3' (SEQ ID NO:101),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO:102),
    5'-TGCTCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:103),
    5'-TGCTCCTGGAGGG-3' (SEQ ID NO:104), 및
    5'-TGCTCCTGGAGG-3' (SEQ ID NO:105)로 이루어지는 군에서 선택되는 서열,
    (b) 상기 (a)에서 5' 말단의 TGC 이외에 한개 또는 두개의 주요 염기가 각각 자연발생적 또는 비자연발생적 변형체로 치환된 서열,
    상기 (a)에서 HEG는 헥사-(에틸렌글리콜)이고, Z'는 7-데아자-dG인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 면역반응이 자가면역 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 면역반응의 억제가 자가면역 질환의 하나 이상의 증상을 완화하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 2 항에 있어서, 면역반응의 억제가 자가면역 질환의 발생을 방지하거나, 또는 늦추는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 2 항에 있어서, 자가면역 질환이 전신성 홍반성 낭창(SLE), 류마티스 관절염 및 자가면역 피부병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 면역반응이 만성적인 병원균 자극과 관련된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 면역반응이 염증 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 50개 염기 또는 염기쌍 길이 이하인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 상기 (a)에서 5' 말단의 TGC 이외에 한개 또는 두개의 주요 염기가 각각 자연발생적 또는 비자연발생적 변형체로 치환된 서열인 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5'-TGCTCCTGGAGG-3' (SEQ ID NO:105)을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:105에서 5' 말단의 TGC 이외에 한개 또는 두개의 주요 염기가 각각 자연발생적 또는 비자연발생적 변형체로 치환된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:52),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTTG-3' (SEQ ID NO:100),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTT-3' (SEQ ID NO:101),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO:102),
    5'-TGCTCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:103),
    5'-TGCTCCTGGAGGG-3' (SEQ ID NO:104) 및
    5'-TGCTCCTGGAGG-3' (SEQ ID NO:105)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:27),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAG-3' (SEQ ID NO:28),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCA-3' (SEQ ID NO:29),
    5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:33),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-3' (SEQ ID NO:34),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO:35),
    5'-TGCTTAGCAGCTATGCAGCA-3' (SEQ ID NO:36),
    5'-TGCAAGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO:37),
    5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCA AGCTT-3' (SEQ ID NO:38),
    5'-TGCTGCAAGCTTGCAGATGAT-3' (SEQ ID NO:39),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGC-3' (SEQ ID NO:40),
    5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAT-3' (SEQ ID NO:41),
    5'-TGCTTGCAAGCTTG-3' (SEQ ID NO:42),
    5'-TGCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:47),
    5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:52),
    5'-TGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:53),
    5'-TGCTTGACATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:54),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:55),
    5'-TGCTTGACAGCTTGATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:56),
    5'-TGCTTGACAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:57),
    5'-TGCTTGACAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:58),
    5'-TGCTTGACAGCTTGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:59),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:60),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:62),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO:63),
    5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:64),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:65),
    5'-TGCTTGCAAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:66),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:67),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:68),
    5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:69),
    5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO:70),
    5'-TGCTGCTGGAGZ'GGTTGT-3' (SEQ ID NO:78); 및
    5'-TGCTGGAGZ'GGTTGT-3' (SEQ ID NO:79)
    로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 HEG는 헥사-(에틸렌글리콜)이고, Z'는 7-데아자-dG인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 인산염-변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 결합만을 함유하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 사람인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 20개 염기 또는 염기쌍 길이 미만인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 TLR9-의존성 면역반응을 억제하기 위한 것임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  18. 제 17 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5'-GGGG-3' 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  19. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 30개 염기 또는 염기쌍 길이 미만인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  20. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 40개 염기 또는 염기쌍 길이 미만인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  21. 제 18 항에 있어서, 5'-GGGG-3' 서열의 적어도 하나의 G가 7-데아자-dG로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  22. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 50개 염기 길이 이하인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028742A2 (en) 2004-09-01 2006-03-16 Dynavax Technologies Corporation Methods and conpositions for inhibition of innate immune responses and autoimmunity
AU2005316503A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
DE102005005642A1 (de) * 2005-02-06 2006-08-10 Phenion Gmbh & Co. Kg Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen enthaltend Nukleinsäuren, die zur Ausbildung von stem-loop-Sekundärstrukturen geeignete Sequenzen umfassen
AU2006220835B2 (en) * 2005-03-04 2012-01-19 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (ISS) wherein the ISS are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
ES2330884T3 (es) 2005-07-01 2009-12-16 Index Pharmaceuticals Ab Modulacion de la respuesta a los esteroides.
ATE476193T1 (de) 2005-07-01 2010-08-15 Index Pharmaceuticals Ab Immunstimulatorisches verfahren
US8357665B2 (en) 2005-10-12 2013-01-22 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
CA2625969A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Index Pharmaceuticals Ab Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease
US8853375B2 (en) * 2007-08-15 2014-10-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Toll like receptor modulators
EP2361980B1 (en) * 2007-10-26 2016-12-07 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
US8030289B2 (en) 2008-08-06 2011-10-04 Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd. Oligonucleotide and use thereof
PL2154144T3 (pl) * 2008-08-06 2015-04-30 Changchun Huapu Biotechnology Co Ltd Oligonukleotydy i ich zastosowanie
CN102281880A (zh) * 2008-10-06 2011-12-14 艾德拉药物股份有限公司 类Toll受体抑制剂在高胆固醇血症和高脂血症及相关疾病的预防和治疗中的用途
EP2451974A2 (en) * 2009-07-08 2012-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-based compounds as inhibitors of toll-like receptors
EA201291357A1 (ru) * 2010-06-16 2013-11-29 Дайнэвокс Текнолоджиз Корпорейшн Способы лечения с применением ингибиторов tlr7 и/или tlr9
WO2011159328A1 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of treatment using tlr7 and/or tlr9 inhibitors
CN105061534A (zh) 2010-09-22 2015-11-18 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
KR101985382B1 (ko) 2010-11-19 2019-06-03 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 톨-유사 수용체 기반 면역 반응을 조절하기 위한 면역 조절 올리고뉴클레오타이드(ｉｒｏ) 화합물
US8980865B2 (en) 2011-12-22 2015-03-17 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleotide analogs
US8916538B2 (en) 2012-03-21 2014-12-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of a thiophosphoramidate nucleotide prodrug
EP2827876A4 (en) 2012-03-22 2015-10-28 Alios Biopharma Inc PHARMACEUTICAL COMBINATIONS WITH A THIONUCLEOTIDE ANALOG
US9228184B2 (en) * 2012-09-29 2016-01-05 Dynavax Technologies Corporation Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
US9868955B2 (en) 2012-09-29 2018-01-16 Dynavax Technologies Corporation Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
EP2754714A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Inhibitory oligonucleotides and their use in therapy
EP3302497A4 (en) 2015-06-01 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. EXCLUSION OF EXON INDUCED PAT TECHNOLOGY ANTISENSE IN COLLAGEN TYPE VII
WO2017173334A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc receptor-mediated drug delivery
AU2017277647B2 (en) 2016-06-08 2023-07-27 President And Fellows Of Harvard College Engineered viral vector reduces induction of inflammatory and immune responses
US11370794B2 (en) 2016-11-11 2022-06-28 Dynavax Technologies Corporation Toll-like receptor antagonist compounds and methods of use
JP6886854B2 (ja) * 2017-04-13 2021-06-16 シスメックス株式会社 被検物質の情報取得方法
CN111511918A (zh) 2017-11-08 2020-08-07 哈佛学院院长及董事 抑制病毒载体诱导的炎症反应的组合物和方法
US11863189B2 (en) * 2021-03-05 2024-01-02 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Input buffer circuit

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014322A1 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Japan Science And Technology Corporation PORPHYRIN COMPOUNDS CONSISTING OF PORPHYRIN RINGS FUSED IN A SINGLE DIRECTION BY THREE BONDS, I.E., ONE MESO-MESO CARBON BOND AND TWO β-β CARBON BONDS AND PROCESS FOR THEIR SYNTHESIS
WO2002095010A2 (en) 2001-03-21 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US20030087848A1 (en) * 2000-02-03 2003-05-08 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
WO2004047734A3 (en) 2002-11-21 2004-08-12 Bayhill Therapeutics Inc Methods and immune modulatory nucleic acid compositions for preventing and treating disease

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5015733A (en) 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US5118800A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4587329A (en) 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US5093232A (en) * 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US5338532A (en) 1986-08-18 1994-08-16 The Dow Chemical Company Starburst conjugates
US6312679B1 (en) * 1986-08-18 2001-11-06 The Dow Chemical Company Dense star polymer conjugates as dyes
PT88550A (pt) 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5278302A (en) * 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5552391A (en) 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5460831A (en) 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
US6096722A (en) * 1990-08-14 2000-08-01 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of cell adhesion molecule expression and treatment of cell adhesion molecule-associated diseases
CA2169645A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Nassim Usman Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5874409A (en) 1995-06-07 1999-02-23 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
JP2000512981A (ja) 1996-06-06 2000-10-03 ラ ホヤ ファーマシューティカル カンパニー ａＰＬ免疫応答性ペプチド、その結合体およびａＰＬ抗体媒介病理のための処置方法
AU4992197A (en) 1996-10-11 1998-05-11 Regents Of The University Of California, The Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
US6489304B2 (en) * 1997-05-01 2002-12-03 Hybridon, Inc. Hyperstructure-forming carriers
DK1003850T3 (da) 1997-06-06 2009-09-07 Univ California Inhibitorer af DNA-immunstimulatorisk sekvensaktivitet
US6080580A (en) * 1998-10-05 2000-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression
US6458953B1 (en) 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
AU4343700A (en) 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
CA2376057A1 (en) 1999-06-08 2000-12-14 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising aminooxy groups
AP1775A (en) 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
WO2001068697A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Gorczynski Reginald M Methods and compositions for immunoregulation
WO2002010438A2 (en) * 2000-07-28 2002-02-07 The Johns Hopkins University Serial analysis of transcript expression using long tags
ES2649817T3 (es) 2002-04-05 2018-01-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Compuestos oligom¿¿ricos para la modulaci¿®n de la expresi¿®n de HIF-1¿Á
SE0201701D0 (sv) 2002-06-05 2002-06-05 Gotovax Ab Treatment of epithelial tumors and infections
WO2003103586A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
CA2494911A1 (en) * 2002-08-12 2004-02-19 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, methods of making, and methods of use thereof
SG173219A1 (en) * 2002-12-23 2011-08-29 Dynavax Tech Corp Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US20070009899A1 (en) * 2003-10-02 2007-01-11 Mounts William M Nucleic acid arrays for detecting gene expression in animal models of inflammatory diseases
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
AU2005220910A1 (en) 2004-03-05 2005-09-22 Archemix Corp. Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics
US20060193821A1 (en) * 2004-03-05 2006-08-31 Diener John L Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics
WO2006028742A2 (en) 2004-09-01 2006-03-16 Dynavax Technologies Corporation Methods and conpositions for inhibition of innate immune responses and autoimmunity
AU2005316503A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
US7786089B2 (en) 2005-12-20 2010-08-31 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of immune modulatory oligonucleotides (IMO™) containing different lengths of palindromic segments
US20100184209A1 (en) 2006-02-17 2010-07-22 Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
CA2648585C (en) 2006-04-07 2017-07-25 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory rna (simra) compounds for tlr7 and tlr8
EP2361980B1 (en) 2007-10-26 2016-12-07 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030087848A1 (en) * 2000-02-03 2003-05-08 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
WO2002014322A1 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Japan Science And Technology Corporation PORPHYRIN COMPOUNDS CONSISTING OF PORPHYRIN RINGS FUSED IN A SINGLE DIRECTION BY THREE BONDS, I.E., ONE MESO-MESO CARBON BOND AND TWO β-β CARBON BONDS AND PROCESS FOR THEIR SYNTHESIS
WO2002095010A2 (en) 2001-03-21 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
WO2004047734A3 (en) 2002-11-21 2004-08-12 Bayhill Therapeutics Inc Methods and immune modulatory nucleic acid compositions for preventing and treating disease

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