ES2649817T3 - Compuestos oligom¿¿ricos para la modulaci¿®n de la expresi¿®n de HIF-1¿Á - Google Patents

Compuestos oligom¿¿ricos para la modulaci¿®n de la expresi¿®n de HIF-1¿Á Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de HIF-1α en al menos un 20 % a un nivel de oligonucleótido de 100 nM, en el que la secuencia oligonucleotídica es TGGCAAGCATCCTGTA (SEQ ID NO. 55).

Description

Compuestos oligoméricos para la modulación de la expresión de HIF-1α
5 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud es una continuación de la solicitud provisional de EE. UU. con número de serie 60/370.126, presentada el 5 de abril de 2002, cuya solicitud se incorpora por completo en el presente documento como referencia.
Campo de la invención
La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de HIF-1α. En particular, la presente invención se refiere a compuestos oligoméricos y, preferentemente, dichos compuestos son
15 oligonucleótidos que se pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican HIF-1α. Los compuestos oligonucleotídicos han demostrado que modulan la expresión de HIF-1α y se divulgan preparaciones farmacéuticas de los mismos y su uso como tratamiento de enfermedades oncológicas y preeclampsia.
Antecedentes de la invención
Los tumores sólidos deben establecer un aporte sanguíneo y han potenciado que el metabolismo de la glucosa aumente más allá de unos pocos milímetros. La forma en que detectan la hipoxia y cómo responden activando genes inducibles por hipoxia y secretando factores angiogénicos para establecer un sistema sanguíneo es fundamental para la biología del cáncer. Muchos tumores contienen microambientes hipóxicos, que se han asociado
25 a la progresión maligna, la metástasis y la resistencia a la radioterapia y la quimioterapia.
El descubrimiento del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) ha ayudado a comprender la regulación de los genes inducibles por hipoxia (documentos US 5882914 y WO9639426; documento WO9948916). El HIF-1 se compone de dos subunidades, HIF-1α y HIF-1β, y se une a los elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) en potenciadores de genes que codifican factores angiogénicos tales como VEGF y proteínas relacionadas con la glucólisis tales como las enzimas glucolíticas y los transportadores de glucosa 1 y 3 (GLU-1 y 3).
Se ha demostrado que la regulación negativa genomodificada de HIF-1α mediante transferencia génica intratumoral de un plásmido de HIF-1α antisentido da lugar a la regulación negativa del VEGF y a una reducida densidad de
35 microvasos tumorales (documento WO 0076497, Sun X et al., Gene Therapy (2001) 8, 638-645). El plásmido contenía un fragmento de ADNc de 320 pb que codificaba el extremo 5’ de HIF-1α (nucleótidos 152-454, Genebank AF003698). Además, en la solicitud de patente internacional citada anteriormente se describió un procedimiento basado en que el vector de expresión se debería usar junto con un agente inmunoterapéutico. Sin embargo, un defecto importante del enfoque del plásmido de expresión es que no es adecuado como agente terapéutico debido a su tamaño y a la sensibilidad a las nucleasas del producto de expresión.
Además del plásmido que expresa un fragmento de HIF-1α, se han diseñado unos pocos oligonucleótidos antisentido dirigidos a HIF-1α como herramientas de investigación para estudiar un mecanismo biológico o diana biológica específicos. Por ejemplo, la inhibición antisentido de la expresión de HIF-1α en explantes hipóxicos ha 45 demostrado que inhibe la expresión de TGFβ (Caniggia, I., et al., J. of Clinical Investigation, marzo 2000, 105, 577587). En este estudio particular solo se sintetizó un oligonucleótido antisentido, un fosforotioato dirigido a la secuencia adyacente al codón de iniciación AUG del ARNm de HIF-1α. Las secuencias fueron 5’
-3’ de HIF-1α y la regulación negativa de HIF-1α se demostró a nivel de ARNm. Este oligonucleótido se ha usado para estudiar el papel de HIF-1α en la invasión y excrecencia del trofoblasto extravelloso, y se ha implicado en el papel potencial de HIF-1α en la preeclampsia (Caniggia, I. et al., Placenta (2000), 21, Suplemento A, Trophoblast Research 14, S25-S30).
Otro estudio, que usa la misma secuencia oligonucleotídica que anteriormente, demostró que la inhibición antisentido de HIF-1α daba como resultado la pérdida de receptores activados por proliferadores de peroxisomas
55 (PPAR) (Narravula, S. y Colgan S.P., J. of Immunology, 2001, 166, 7543-7548). El oligonucleótido mencionado anteriormente también se ha usado para demostrar que el níquel requiere HIF-1α para inducir el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) (Andrew, A.S. Klei L.R., Barchowsky A., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L607-L615, 2001).
También se ha usado un oligonucleótido antisentido único para estudiar las dos variantes de empalme del factor
inducible por hipoxia HIF-1α como potencial compañero de dimerización de oligonucleótido antisentido fue la modificación de fosforotioato de la secuencia: 5’tratamiento de las células con este oligonucleótido dio como resultado la inhibición de la incorporación de [3H]timidina, pero no tuvo un efecto sobre la apoptosis en células normóxicas (Drutel et al. (2000) Eur. J. Neurosci. 12,
65 3701-3708).
Además, un oligonucleótido antisentido único para HIF-1α ha demostrado que inhibe la expresión génica incrementada de la endotelina cardíaca (ET)-1 y se ha barajado la hipótesis de que HIF-1α estuviera implicado en la expresión miocárdica incrementada del gen ET-1 en la insuficiencia cardíaca (Kakinuma, Y. et al., Circulation, 2001;
5 103, 2387-2394). El oligonucleótido antisentido tenía la siguiente secuencia:
Se han descrito oligonucleótidos adicionales capaces de inhibir la síntesis de HIF-1-alfa sin divulgar las secuencias oligonucleotídicas como tales; véase, por ejemplo, Kang et al. 2001 Circulation vol. 104(17) pp. 1157 y Hoeg et al. 2002 Proc of Am. Assoc. Cancer Res. Vol. 43 p. 962. Hoeg et al. se refiere específicamente a oligonucleótidos
10 antisentido de ANB dirigidos a HIF-1-alfa. Actualmente no se conocen agentes antisentido terapéuticos que inhiban eficazmente la síntesis de HIF-1α y que se puedan usar para el tratamiento de una enfermedad. En consecuencia, existe la necesidad de obtener agentes capaces de inhibir eficazmente que se use la función de HIF-1α en el tratamiento de, por ejemplo, el cáncer y la preeclampsia.
15 Resumen de la invención
La presente invención se dirige a un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de HIF-1α en al menos un 20 % a un nivel de oligonucleótido de 100 nM, en el que la secuencia oligonucleotídica es (SEQ ID NO. 55). También se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras 20 composiciones que comprenden los oligonucleótidos antisentido de la invención. Se proporcionan adicionalmente procedimientos de modulación de la expresión de HIF-1α en células o tejidos que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con los oligonucleótidos antisentido o composiciones de la invención. También se divulgan procedimientos de tratamiento de un animal o un ser humano que se sospecha que tienen o son propensos a tener una enfermedad o afección asociada a la expresión de HIF-1α administrando una cantidad terapéutica o 25 profilácticamente eficaz de los oligonucleótidos antisentido o composiciones de la invención. Adicionalmente, se proporcionan procedimientos de uso de los oligonucleótidos antisentido para la inhibición de la expresión de HIF-1α y para el tratamiento de enfermedades asociadas a la expresión de HIF-1α. Los ejemplos de dichas enfermedades son diferentes tipos de cáncer, particularmente cánceres comunes, como, por ejemplo, cáncer primario y metastásico de mama, colorrectal, de próstata, de páncreas, otros cánceres Gl, tumores pulmonares,
30 cervicouterinos, ováricos y cerebrales, así como preeclampsia, enfermedad intestinal inflamatoria y enfermedad de Alzheimer. Otros ejemplos son cáncer de colon, hígado, tiroides, riñón, testículos, estómago, intestino, esófago, médula espinal, senos nasales, vejiga o vías urinarias.
Breve descripción de las figuras
35 La Figura 1 muestra un Western blot de la proteína HIF-1α. Las células se trataron con los diferentes oligonucleótidos a 100 nM durante 4 horas. Se dejó que las células crecieran durante 18 horas antes de exponerlas a hipoxia intensa durante 6 horas.
40 La Figura 2 muestra un Western blot de la proteína HIF-1α. Se trataron células U87 con tres de los oligonucleótidos a 200 nM durante 4 horas. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 18 horas inmediatamente después del tratamiento.
La Figura 3 muestra Western blot de HIF-1α, VEGF Glut 1 y proteína tubulina en células U87 tratadas con
45 oligonucleótido Cur0813. Las células se trataron con oligonucleótido durante 24 horas a 100 nM, 200 nM, 300 nM y 400 nM. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 18 horas inmediatamente después del tratamiento.
La Figura 4 muestra Western blot de HIF-1α y proteína tubulina en células U87 tratadas con oligonucleótidos con emparejamiento erróneo (Cur0960 y Cur0961). Las células se trataron con oligonucleótido durante 24 horas a
50 100 nM, 200 nM, 300 nM y 400 nM. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 18 horas inmediatamente después del tratamiento.
La Figura 5 muestra Western blot de HIF-1α, VEGF y proteína tubulina en células 15PC3 tratadas con oligonucleótido Cur813. Las células se trataron con oligonucleótido durante 16 horas a 125 nM, 25 nM, 5 nM y 1 nM.
55 Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 6 horas inmediatamente después del tratamiento.
La Figura 6 muestra Western blot de HIF-1α y proteína tubulina en células 15PC3 tratadas con diferentes oligonucleótidos a 5 nM durante 16 horas. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 6 horas inmediatamente después del tratamiento.
60 La Figura 7 muestra Western blot de HIF-1α y proteína tubulina en células U373 tratadas con diferentes oligonucleótidos a 100 nM durante 6 horas. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 20 horas inmediatamente después del tratamiento.
65 La Figura 8 muestra Western blot de HIF-1α y proteína tubulina en células U373 tratadas con diferentes
oligonucleótidos a 100 nM durante 6 horas. Las células se expusieron a hipoxia intensa durante 20 horas inmediatamente después del tratamiento.
La Figura 9 muestra curvas de crecimiento de xenoinjertos tumorales de U373 tratados con PBS o Cur813 a 5 5 mg/kg/día i.p. 1 vez al día durante 7 días. Las barras representan errores estándar.
La Figura 10 muestra la secuencia de HIF-1α humano, usando el número de acceso a GenBank NM_001530, incorporado en el presente documento como SEQ ID NO. 1.
10 Definición
Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico diana" abarca ADN que codifica el factor inducible por hipoxia o que codifica el factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α), ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN y también ADNc derivado de dicho ARN.
15 Como se usa en el presente documento, el término "gen" significa el gen que incluye exones, intrones, regiones 5’ y 3’ no codificantes y elementos reguladores y todas las variantes conocidas actualmente del mismo y cualquier variante adicional que se pueda elucidar.
20 Como se usa en el presente documento, el término “compuesto oligomérico” se refiere a un oligonucleótido que puede inducir un efecto terapéutico deseado en seres humanos a través de, por ejemplo, la unión mediante enlaces de hidrógeno a un gen diana “Chimeraplast” y “TFO”, al(a los) transcrito(s) de ARN de los “inhibidores antisentido” del gen diana, “ARNip”, “ribozimas” y “oligozimas” o bien a la(s) proteína(s) codificada(s) por el “aptámero”, Spiegelmer o “señuelo” del gen diana.
25 Como se usa en el presente documento, el término “ARNm” significa el(los) transcrito(s) de ARNm conocido(s) actualmente de un gen diana, y cualquier transcrito adicional que se pueda identificar.
Como se usa en el presente documento, el término "modulación" significa un incremento (estimulación) o una
30 reducción (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferente de modulación de la expresión génica y el ARNm es una diana preferente.
Como se usa en el presente documento, el término "dirigido a" un compuesto antisentido con respecto a un ácido nucleico diana particular significa proporcionar el oligonucleótido antisentido a la célula, animal o ser humano de
35 modo que el compuesto antisentido se pueda unir a y modular la función de su diana pretendida.
Como se usa en el presente documento, “hibridación” significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser Watson-Crick, Hoogsteen, enlaces de hidrógeno de Hoogsteen invertidos, etc. entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. Hace aproximadamente cincuenta años, Watson y Crick demostraron que el ácido 40 desoxirribonucleico (ADN) está compuesto de dos cadenas que se mantienen unidas en una configuración helicoidal mediante enlaces de hidrógeno formados entre nucleobases complementarias opuestas en las dos cadenas. Las cuatro nucleobases, comúnmente encontradas en el ADN, son guanina (G), adenina (A), timina (T) y citosina (C), de las cuales la nucleobase G se aparea con C, y la nucleobase A se aparea con T. En el ARN, la nucleobase timina se reemplaza por la nucleobase uracilo (U) que, de manera similar a la nucleobase T, se aparea con A. Los grupos
45 químicos de las nucleobases que participan en la formación de dúplex estándar constituyen la cara Watson-Crick. Un par de años más tarde, Hoogsteen demostró que las nucleobases de purina (G y A), además de su cara Watson-Crick, tienen una cara Hoogsteen que se puede reconocer desde fuera de un dúplex y se puede usar para unir oligonucleótidos de pirimidina por medio de enlaces de hidrógeno, formando así una estructura de triple hélice.
50 En el contexto de la presente invención, “complementario” se refiere a la capacidad de apareamiento preciso de dos secuencias nucleosídicas o nucleotídicas entre sí. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido se puede unir mediante enlaces de hidrógeno a un nucleótido en la posición correspondiente de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. El ADN o ARN y el oligonucleótido se consideran complementarios entre sí cuando un
55 número suficiente de nucleótidos del oligonucleótido pueden formar enlaces de hidrógeno con los nucleótidos correspondientes del ADN o ARN diana para posibilitar la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro
o in vivo, la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100 % complementaria a su ácido nucleico diana. De esta manera, los términos “complementario” y “hibridable específicamente” implican que el compuesto antisentido se una lo suficientemente fuerte y específicamente a la molécula diana para proporcionar la interferencia
60 deseada con la función normal de la diana, mientras se mantiene invariable la función de los ARNm no diana.
El término "análogos de ácidos nucleicos" se refiere a un ácido nucleico no natural que se une a un compuesto. Los análogos de ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 44294443) y Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213). El Esquema 1 ilustra ejemplos
65 seleccionados.
2'-MOE Fosforotioato 2'-Fluoro 2'-O-Metilo
CeNA APN
2'-AP AHN
Morfolino 3'-Fosforamidato
2'-F-AAN 2'-(3-Hidroxi)propilo
Boranofosfato
Esquema 1
El término “ANB” (ácido nucleico bloqueado) se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más análogos de nucleósidos bicíclicos, también denominado monómero de ANB. Los monómeros de ANB se describen en el
5 documento WO 9914226 y solicitudes posteriores, los documentos WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 y PCT/DK02/00488. Un ejemplo particular de un monómero de ANB de timidina es el (1S,3R,4R,7S)-7-hidroxi-1-hidroximetil-5-metil-3-(timin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2:2:1]heptano.
El término “oligonucleótido” se refiere, en el contexto de la presente invención, a un oligómero (también llamado
10 oligonucleótido) o polímero de ácido nucleico (por ejemplo, ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) o análogo de ácido nucleico de los conocidos en la técnica, preferentemente ácido nucleico bloqueado (ANB)
o una mezcla de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases naturales, azúcares y enlaces internucleosídicos (cadena principal), así como oligonucleótidos que tienen porciones no naturales que funcionan de manera similar o con funciones mejoradas específicas. A menudo son preferentes oligonucleótidos
15 modificados o sustituidos completa o parcialmente frente a las formas naturales debido a varias propiedades deseables de dichos oligonucleótidos, tales como, por ejemplo, la capacidad para atravesar una membrana celular, buena resistencia a las nucleasas extra-e intracelulares, alta afinidad y especificidad por el ácido nucleico diana. El análogo de ANB que presenta las propiedades mencionadas anteriormente es particularmente preferente.
Por el término "unidad" se entiende un monómero.
El término "al menos uno" comprende los números enteros mayores de o iguales a 1, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 5 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y así sucesivamente.
El término "tio-ANB" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 se selecciona entre S o -CH2-S-. El tio-ANB puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.
El término "amino-ANB" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 es -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-o -CH2-N(R)-, en los que R se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-4. El amino-ANB puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.
El término "oxi-ANB" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 15 representa O o -CH2-O-. El oxi-ANB puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.
El término "ena-ANB" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en el Esquema 2 es -CH2-O-.
El término "alfa-L-ANB" comprende un nucleótido bloqueado representado como se muestra en el Esquema 3.
El término “derivados de ANB” comprende todos los nucleótidos bloqueados del Esquema 2, excepto beta-Dmetilen-ANB, por ejemplo, tio-ANB, amino-ANB, alfa-L-oxi-ANB y ena-ANB.
Descripción detallada de la invención
25 La presente solicitud describe compuestos oligoméricos, particularmente oligonucleótidos antisentido, para su uso en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican HIF-1α. La modulación es fundamentalmente un cambio en la cantidad de HIF-1α producido. En un modo de realización, esto se logra proporcionando compuestos antisentido que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos que codifican HIF-1α. La modulación es preferentemente una inhibición de la expresión de HIF-1α, lo que da lugar a una reducción del número de proteínas funcionales producidas. HIF-1 puede estar implicado en la angiogénesis, así como en la proliferación de glóbulos rojos, proliferación celular, metabolismo del hierro, metabolismo energético y de la glucosa, regulación del pH, invasión de tejidos, apoptosis, resistencia a múltiples fármacos, respuesta al estrés celular o metabolismo de la matriz.
35 Los compuestos antisentido y otros compuestos oligoméricos descritos en la solicitud, que modulan la expresión de la diana, se identifican a través de experimentación o a través de un diseño racional basado en la información sobre la secuencia de la diana y en el conocimiento sobre la mejor manera de diseñar un compuesto oligomérico frente a una diana deseada. Asimismo, los motivos de secuencia en la diana que son complementarios a los compuestos oligoméricos descritos en la solicitud (denominados “puntos calientes”) son sitios para la unión a la diana.
Los compuestos oligoméricos descritos en la solicitud son SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
45 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 o 115 y sus secuencias se presentan en la Tabla 1 y la Tabla 2. Los compuestos oligoméricos descritos en la solicitud son potentes moduladores de la diana. Esto se demostró experimentalmente tanto in vitro como in vivo. La inhibición in vitro de la diana se muestra en la tabla 1 y en las Figuras 1-8 usando tres líneas celulares de cáncer diferentes. La Figura 9 muestra la regulación negativa in vivo de la diana. Además, los compuestos oligoméricos han demostrado ser potentes inhibidores a una concentración mucho menor que, por ejemplo, la condición estándar para los oligonucleótidos antisentido con fosforotioato. Las Figuras 5 y 6 muestran la inhibición de los compuestos de la invención hasta 5 nM. La inhibición de HIF-1α por los compuestos oligoméricos de la invención también puede inhibir la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que se sabe que está implicado en la angiogénesis y del transportador de glucosa 1 (GLUT-1) que
55 se sabe que está implicado en la captación de glucosa como se muestra en las Figuras 3 y 5. Diversos diseños de compuestos oligoméricos mostrados en la tabla 2 dirigidos a dos motivos se identificaron como potentes inhibidores de la diana, como se muestra en las Figuras 1 y 7. Se realizó un paseo génico usando los compuestos oligoméricos de la tabla 1, y el efecto de los potentes compuestos oligoméricos se muestra en la Figura 8. Todas las observaciones experimentales mencionadas anteriormente demuestran que los compuestos descritos en la solicitud pueden constituir el compuesto activo en una composición farmacéutica.
Además, los compuestos oligoméricos descritos en la solicitud pueden inhibir el HIF-1α bajo normoxia e hipoxia.
En un modo de realización de la invención, los oligonucleótidos antisentido contienen al menos una unidad química 65 llamada ANB (ácido nucleico bloqueado).
Monómero de ANB se refiere típicamente a un análogo de nucleósido bicíclico, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/14226 y solicitudes posteriores, los documentos WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 y PCT/DK02/00488, todos incorporados en el presente documento como referencia.
Las estructuras de monómeros de ANB preferentes se ejemplifican en el Esquema 2.
Esquema 2
10 X e Y se seleccionan independientemente entre los grupos -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2-o -CH-(si es parte de un doble enlace), -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2-o -CH2-CH-(si es parte de un doble enlace), -CH=CH-, en los que R se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-4. Los grupos asimétricos se pueden encontrar en cualquier orientación.
15 En el Esquema 2, los 4 centros quirales se muestran en una configuración fija. Sin embargo, en la presente invención también están comprendidos compuestos del Esquema general 2 en los que los centros quirales se encuentran en diferentes configuraciones. De esta manera, cada centro quiral del Esquema 2 puede existir en la configuración R o S. La definición de R (derecha) y S (izquierda) se describe en las Recomendaciones de la IUPAC
20 de 1974, Sección E, Estereoquímica Fundamental. Las reglas se pueden encontrar en Pure Appl. Chem. 45, 13-30 (1976) y en “Nomenclature of organic Chemistry” Pergamon, Nueva York, 1979.
Z y Z* se seleccionan independientemente entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector.
25 El enlace internucleosídico puede ser -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, S-CH2-CH2-Ο-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, en los
30 que RH se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-4.
Los grupos terminales se seleccionan independientemente entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-O-, Act-Ο-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, alquiltio C1-6, amino, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, mono-o di(alquil C1-6)amino, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido,
35 alqueniloxi C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquiniloxi C2-6 opcionalmente sustituido, monofosfato o monofosfato protegido, monotiofosfato o monotiofosfato protegido, difosfato o difosfato protegido, ditiofosfato o ditiofosfato protegido, trifosfato o trifosfato protegido, tritiofosfato o tritiofosfato protegido. Los ejemplos de dichos grupos protector en los residuos de fosfato son S-acetiltioetilo (SATE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE), intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
40 quelantes, grupos indicadores, ligandos, carboxi, sulfono, hidroximetilo, Prot-O-CH2-, Act-O-CH2-, aminometilo, ProtN(RH)-CH2-Act-N(RH)-CH2-, carboximetilo, sulfonometilo, en los que Prot es un grupo protector para -OH, -SH y NH(R), respectivamente, Act es un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH), respectivamente, y RH se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-6.
45 Los grupos protectores de sustituyentes hidroxi comprenden tritilo sustituido, tal como 4,4'-dimetoxitritiloxi (DMT), 4monometoxitritiloxi (MMT) y tritiloxi, 9-(9-fenil)xanteniloxi (pixilo) opcionalmente sustituido, metoxitetrahidropiraniloxi (mthp) opcionalmente sustituido, sililoxi tal como trimetilsililoxi (TMS), triisopropilsililoxi (TIPS), terc-butildimetilsililoxi (TBDMS), trietilsililoxi y fenildimetilsililoxi, éteres terc-butílicos, acetales (incluyendo dos grupos hidroxi), aciloxi tal como acetilo o acetilos sustituidos con halógeno, por ejemplo, cloroacetiloxi o fluoroacetiloxi, isobutiriloxi, pivaloiloxi,
50 benzoiloxi y benzoílos sustituidos, metoximetiloxi (MOM), éteres bencílicos o éteres bencílicos sustituidos tales como 2,6-diclorobenciloxi (2,6-Cl2Bzl). De manera alternativa, cuando Z o Z* es hidroxilo, se pueden proteger opcionalmente mediante fijación a un soporte sólido a través de un enlazador.
Cuando Z o Z* son grupos amino, los ejemplos ilustrativos de los grupos protectores amino son
55 fluorenilmetoxicarbonilamino (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), Z-benciloxicarbonilamino (Cbz), benciloxicarbonilaminos sustituidos tales como 2-clorobenciloxicarbonilamino (2-C1Z), monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino y 9-(9fenil)xantenilamino (pixilo).
60 En el modo de realización anterior, Act designa un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH). En un modo de
realización preferente, dichos activadores median acoplamientos a otros residuos, monómeros. Después de que dichas fijaciones se realicen con éxito, el grupo Act se convierte en un enlace internucleosídico. Dichos grupos de activación se seleccionan, por ejemplo, entre O-fosforamidita opcionalmente sustituida, O-fosforotriéster opcionalmente sustituido, O-fosforodiéster opcionalmente sustituido, H-fosfonato opcionalmente sustituido y O
5 fosfonato opcionalmente sustituido.
En el presente contexto, el término "fosforamidita" significa un grupo de fórmula -P(ORx)-N(Ry)2, en el que Rx designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, metilo, 2-cianoetilo o bencilo, y cada uno de Ry designa grupos alquilo opcionalmente sustituidos, por ejemplo, etilo o isopropilo, o el grupo -N(Ry)2 forma un grupo
10 morfolino (-N(CH2CH2)2O). RX designa preferentemente 2-cianoetilo y los dos Ry son preferentemente idénticos y designan isopropilo. De esta manera, una fosforamidita especialmente pertinente es N,N-diisopropil-O-(2cianoetil)fosforamidita.
B constituye una nucleobase natural o no natural y se selecciona entre adenina, citosina, 5-metilcitosina, isocitosina,
15 pseudoisocitosina, guanina, timina, uracilo, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinil-6-fluoroluracilo, 5metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, 7-propin-7-desazaadenina, 7-propin-7desazaguanina, 2-cloro-6-aminopurina.
Las estructuras bicíclicas particularmente preferentes se muestran en el Esquema 3 a continuación: 20
cuando al menos un X = O
25 Esquema 3
en el que X es -O-, -S-, -NH-y N(RH),
Z y Z* se seleccionan independientemente entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector.
30 El enlace internucleotídico puede ser -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, en los que RH se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-4.
35 Los grupos terminales se seleccionan independientemente entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-Ο-, Act-Ο-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, alquiltio C1-6, amino, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, mono-o di(alquil C1-6)amino, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, monofosfato, monotiofosfato, difosfato, ditiofosfato, trifosfato, tritiofosfato opcionalmente sustituidos, en los que Prot es un grupo protector para -OH, -SH y
40 NH(RH), respectivamente, Act es un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH), respectivamente, y RH se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-6.
Los grupos protectores de sustituyentes hidroxi comprenden tritilo sustituido tal como 4,4'-dimetoxitritiloxi (DMT), 4monometoxitritiloxi (MMT), 9-(9-fenil)xanteniloxi (pixilo) opcionalmente sustituido, metoxitetrahidropiraniloxi (mthp)
45 opcionalmente sustituido, sililoxi tal como trimetilsililoxi (TMS), triisopropilsililoxi (TIPS), terc-butildimetilsililoxi (TBDMS), trietilsililoxi y fenildimetilsililoxi, éteres terc-butílicos, acetales (incluyendo dos grupos hidroxi), aciloxi tal como acetilo. De manera alternativa, cuando Z o Z* es hidroxilo, se pueden proteger opcionalmente mediante fijación a un soporte sólido a través de un enlazador.
50 Cuando Z o Z* son grupos amino, los ejemplos ilustrativos de los grupos protectores amino son fluorenilmetoxicarbonilamino (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino.
En el modo de realización anterior, Act designa un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH). En un modo de 55 realización preferente, dichos activadores median acoplamientos a otros residuos, monómeros. Después de que
dichas fijaciones se realicen con éxito, el grupo Act se convierte en un enlace internucleosídico. Dichos grupos de activación se seleccionan, por ejemplo, entre O-fosforamidita opcionalmente sustituida, O-fosforotriéster opcionalmente sustituido, O-fosforodiéster opcionalmente sustituido, H-fosfonato opcionalmente sustituido y Ofosfonato opcionalmente sustituido.
5 En el presente contexto, el término "fosforamidita" significa un grupo de fórmula -P(ORx)-N(Ry)2, en el que Rx designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, metilo, 2-cianoetilo, y cada uno de Ry designa grupos alquilo opcionalmente sustituidos, Rx designa preferentemente 2-cianoetilo y los dos Ry son preferentemente idénticos y designan isopropilo. De esta manera, una fosforamidita especialmente pertinente es N,N-diisopropil-O-(2cianoetil)fosforamidita.
B constituye una nucleobase natural o no natural y se selecciona entre adenina, citosina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, guanina, timina, uracilo, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, 2-cloro-6-aminopurina.
Principio terapéutico
Un experto en la técnica apreciará que los compuestos oligoméricos que contienen ANB se pueden usar para combatir enfermedades relacionadas con HIF-1α mediante muchos principios diferentes.
Por ejemplo, los compuestos oligoméricos con ANB se pueden diseñar como inhibidores antisentido, que son ácidos nucleicos monocatenarios que previenen la producción de una proteína que provoca enfermedad, interviniendo a nivel del ARNm. Además, se pueden diseñar como ribozimas u oligozimas, que son oligonucleótidos antisentido que, además del(de los) dominio(s) de unión a diana, comprenden una actividad catalítica que degrada el ARNm diana
25 (ribozimas) o comprenden una secuencia guía externa (EGS) que incorpora una enzima endógena (ARNasa P) que degrada el ARNm diana (oligozimas).
Los compuestos oligoméricos con ANB se pueden diseñar igualmente bien como ARNip, que son moléculas de ARN bicatenario pequeñas que son utilizadas por las células para silenciar genes endógenos o exógenos específicos mediante un mecanismo “de tipo antisentido” aún poco comprendido.
Los compuestos oligoméricos con ANB también se pueden diseñar como aptámeros (y una variación de los mismos, llamados Spiegelmer) que son ácidos nucleicos que, a través de enlaces de hidrógeno intramoleculares, adoptan estructuras tridimensionales que les permiten unirse a y bloquear sus dianas biológicas con alta afinidad y
35 especificidad. Además, los compuestos oligoméricos con ANB se pueden diseñar como señuelos, que son ácidos nucleicos bicatenarios pequeños que previenen que los factores de transcripción celular transactiven sus genes diana bloqueando selectivamente su sitio de unión a ADN.
Además, los compuestos oligoméricos con ANB se pueden diseñar como quimeraplastos, que son ácidos nucleicos monocatenarios pequeños que se pueden aparear específicamente con una secuencia génica diana y alterarla. Los compuestos oligoméricos que contienen ANB que explotan este principio pueden ser particularmente útiles para tratar enfermedades relacionadas con HIF-1α que están provocadas por una mutación en el gen HIF-1α.
Finalmente, los compuestos oligoméricos con ANB se pueden diseñar como TFO (oligonucleótidos formadores de
45 triples hélices), que son ácidos nucleicos que se unen a ADN bicatenario y previenen la producción de una proteína que provoca enfermedad, interviniendo a nivel de transcripción del ARN.
Dictados en parte por el principio terapéutico mediante el que se pretende que funcione el oligonucleótido, los compuestos oligoméricos con ANB de acuerdo con la presente invención comprenden preferentemente desde aproximadamente 8 a aproximadamente 60 nucleobases, es decir, desde aproximadamente 8 a aproximadamente 60 nucleósidos enlazados. Los compuestos particularmente preferentes son oligonucleótidos antisentido que comprenden desde aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases y, lo más preferentemente, son compuestos antisentido que comprenden aproximadamente 12-20 nucleobases.
55 Haciendo referencia a los principios anteriores mediante los que un compuesto oligomérico con ANB puede ejercer su acción terapéutica, la diana de la presente invención puede ser el gen HIF-1α, el ARNm o la proteína. En el modo de realización lo más preferente, los compuestos oligoméricos con ANB están diseñados como un inhibidor antisentido dirigido contra el pre-ARNm de HIF-1α o el ARNm de HIF-1α. Los oligonucleótidos descritos en la solicitud se pueden hibridar a cualquier sitio a lo largo del pre-ARNm o ARNm de HIF-1α, tales como sitios en el líder no traducido en 5’, exones, intrones y cola no traducida en 3´.
Los oligonucleótidos descritos en la solicitud se pueden hibridar a una porción del pre-ARNm o ARNm de HIF-1α humano que comprenda el sitio de iniciación de la traducción. Más preferentemente, el oligonucleótido para HIF-1α comprende una secuencia CAT, que es complementaria a la secuencia de iniciación AUG del pre-ARNm o ARN de 65 HIF-1α. Otros oligonucleótidos para HIF-1α se hibridan a una porción del sitio donante de empalme del pre-ARNm de HIF-1α humano. Otros oligonucleótidos para HIF-1α más se hibridan a una porción del sitio aceptor de empalme
del pre-ARNm de HIF-1α humano. Otros oligonucleótidos para HIF-1α se hibridan a porciones del pre-ARNm o ARNm de HIF-1α humano implicadas en la poliadenilación, el transporte o la degradación.
El experto en la técnica apreciará que los oligonucleótidos preferentes son los que se hibridan a una porción del pre5 ARNm o ARNm de HIF-1α cuya secuencia no se produce comúnmente en transcritos de genes no relacionados para mantener la especificidad del tratamiento.
El compuesto oligomérico descrito en la solicitud se diseña para que sea suficientemente complementario a la diana para proporcionar la respuesta clínica deseada, por ejemplo, el compuesto oligomérico se debe unir con suficiente fuerza y especificidad a su diana para dar el efecto deseado. Los compuestos que modulan HIF-1α también se pueden diseñar para modular también otros ácidos nucleicos específicos que no codifican HIF-1α.
Es preferente que el compuesto oligomérico descrito en la solicitud se diseñe de manera que se evite la hibridación de oligonucleótidos intra-e intermolecular.
15 En muchos casos, la identificación de un compuesto oligomérico con ANB eficaz en la modulación de la actividad de HIF-1α in vivo o clínicamente se basa en la información sobre secuencia del gen diana. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que dichos compuestos oligoméricos también se pueden identificar mediante pruebas empíricas. Como tales, los compuestos oligoméricos para HIF-1α que tienen, por ejemplo, menos homología de secuencia, nucleótidos más o menos modificados o longitudes más o menos largas en comparación con los de los modos de realización preferentes, pero que, no obstante, muestran respuestas en tratamientos clínicos, también están dentro del alcance de la invención.
Fármacos antisentido
25 Los compuestos oligoméricos descritos en la solicitud son fármacos antisentido adecuados. El diseño de un fármaco antisentido potente y seguro requiere el ajuste de diversos parámetros, tales como afinidad/especificidad, estabilidad en fluidos biológicos, captación celular, modo de acción, propiedades farmacocinéticas y toxicidad.
Afinidad y especificidad: el ANB con un enlace oximetileno 2’-O, 4’-C (β-D-oxi-ANB) presenta propiedades de unión sin precedentes hacia las secuencias diana de ADN y ARN. Asimismo, los derivados de ANB tales como amino-, tioy α-L-oxi-ANB muestran afinidades sin precedentes hacia ARN y ADN complementarios y, en el caso de tio-ANB, la afinidad hacia el ARN es incluso mejor que con β-D-oxi-ANB.
35 Además de estas destacables propiedades de hibridación, los monómeros de ANB se pueden mezclar y actuar de manera cooperativa con monómeros de ADN y ARN, y con otros análogos de ácidos nucleicos tales como monómeros de ARN modificados con 2'-O-alquilo. Como tales, los oligonucleótidos de la presente invención pueden estar compuestos enteramente de monómeros de β-D-oxi-ANB o pueden estar compuestos de β-D-oxi-ANB en cualquier combinación con ADN, ARN o análogos de ácidos nucleicos existentes que incluyan derivados de ANB tales como, por ejemplo, amino-, tio-y α-L-oxi-ANB. La afinidad de unión sin precedentes del ANB hacia secuencias diana de ADN o ARN y su capacidad para mezclarse libremente con ADN, ARN y una gama de análogos de ácidos nucleicos existentes tiene una gama de consecuencias importantes de acuerdo con la invención para el desarrollo de compuestos antisentido eficaces y seguros.
45 En primer lugar, en un modo de realización de la invención, se posibilita un acortamiento considerable de la longitud habitual de un oligonucleótido antisentido (desde 20-25 oligómeros hasta, por ejemplo, 12-15 oligómeros) sin comprometer la afinidad requerida para la actividad farmacológica. Dado que la especificidad intrínseca de un oligonucleótido está inversamente relacionada con su longitud, dicho acortamiento incrementa significativamente la especificidad del compuesto antisentido hacia su diana de ARN. Dado que la secuencia del genoma humano está disponible y que la anotación de sus genes progresa rápidamente, un modo de realización de la invención consiste en identificar las secuencias únicas lo más cortas posible en el ARNm diana.
En otro modo de realización, el uso de ANB para reducir el tamaño de los oligonucleótidos facilita significativamente el procedimiento y el precio de fabricación, proporcionando de esta manera la base para que la terapia antisentido
55 se convierta en una oferta de tratamiento comercialmente competitiva para una diversidad de enfermedades.
En otro modo de realización, la afinidad sin precedentes de ANB se puede usar para potenciar sustancialmente la capacidad de un oligonucleótido antisentido para hibridarse a su ARNm diana in vivo, reduciendo así significativamente el tiempo y el esfuerzo requeridos para identificar un compuesto activo en comparación con la situación con otros compuestos químicos.
En otro modo de realización, la afinidad sin precedentes de ANB se usa para potenciar la eficacia de los oligonucleótidos antisentido, permitiendo de esta manera el desarrollo de compuestos con ventanas terapéuticas más favorables que los que se encuentran actualmente en ensayos clínicos.
65 Cuando se diseñan como un inhibidor antisentido, los oligonucleótidos de la invención se unen al ácido nucleico
diana y modulan la expresión de su proteína análoga. Preferentemente, dicha modulación produce una inhibición de la expresión de al menos un 10 % o 20 % en comparación con el nivel de expresión normal, más preferentemente al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de inhibición en comparación con el nivel de expresión normal.
5 Típicamente, los oligonucleótidos de ANB de la invención contienen otros residuos distintos de β-D-oxi-ANB, tales como monómeros de ADN natural, monómeros de ARN, N3’-P5’-fosforamidatos, 2’-F, 2’-O-Me, 2’-O-metoxietilo (MOE), 2’-O-(3-aminopropilo) (AP), ácido hexitolnucleico (AHN), ácido 2’-F-arabinonucleico (2’-F-AAN) y Dciclohexenilnucleósido (CeNA). Además, el oligonucleótido con β-D-oxi-ANB modificado también puede contener otras unidades de ANB además de, o en lugar de, un grupo oxi-ANB. En particular, las unidades de ANB adicionales preferentes incluyen monómeros de tio-ANB o amino-ANB en las configuraciones D-β o L-α o combinaciones de las mismas o ena-ANB. En general, un oligonucleótido con ANB modificado contiene al menos aproximadamente un 5, 10, 15 o 20 por ciento de unidades de ANB, basándose en el número total de nucleótidos del oligonucleótido, más típicamente al menos aproximadamente un 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 por ciento de unidades de ANB,
15 basándose en el número total de bases del oligonucleótido.
Estabilidad en fluidos biológicos: un modo de realización de la invención incluye la incorporación de monómeros de ANB en un oligonucleótido de ADN o ARN estándar para incrementar la estabilidad del compuesto oligomérico resultante en fluidos biológicos, por ejemplo, aumentando la resistencia hacia las nucleasas (endonucleasas y exonucleasas). El grado de estabilidad depende del número de monómeros de ANB usados, de su posición en el oligonucleótido y del tipo de monómero de ANB usado. En comparación con el ADN y los fosforotioatos, se puede establecer el siguiente orden de capacidad para estabilizar un oligonucleótido frente a la degradación nucleolítica: ADN << fosforotioatos ~ oxi-ANB < α-L-ANB < amino-ANB < tio-ANB.
25 Dado el hecho de que el ANB es compatible con la síntesis de ADN estándar y que se mezcla libremente con muchos análogos de ácidos nucleicos existentes, la resistencia a las nucleasas de los compuestos oligoméricos con ANB se puede potenciar adicionalmente de acuerdo con la invención incorporando otros análogos que muestren una estabilidad incrementada frente a las nucleasas o bien explotando los enlaces internucleosídicos resistentes a las nucleasas, por ejemplo, los enlaces de fosforomonotioato, fosforoditioato y metilfosfonato, etc.
Modo de acción: los compuestos antisentido descritos en la solicitud pueden ejercer su acción terapéutica por medio de una diversidad de mecanismos y pueden ser capaces de combinar varios de ellos en el mismo compuesto. En un escenario, la unión del oligonucleótido a su diana (pre-ARNm o ARNm) actúa para prevenir la unión de otros factores (proteínas, otros ácidos nucleicos, etc.) necesarios para la adecuada función de la diana, es decir, actúa
35 mediante impedimento estérico. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido se puede unir a motivos de secuencia del pre-ARNm o ARNm que son importantes para el reconocimiento y la unión de factores transaccionales implicados en el empalme, la poliadenilación, el transporte celular, las modificaciones postranscripcionales de nucleósidos en el ARN, la protección del extremo 5’, la traducción, etc. En el caso del empalme del pre-ARNm, el resultado de la interacción entre el oligonucleótido y su diana puede la supresión de la expresión de una proteína no deseada, la generación de ARNm empalmado alternativo que codifique una proteína deseada o ambas. En otro modo de realización, la unión del oligonucleótido a su diana desactiva el proceso de traducción creando un bloqueo físico en la maquinaria ribosómica, es decir, la detención de la traducción.
En otro modo de realización más, la unión del oligonucleótido a su diana interfiere con la capacidad de los ARN de
45 adoptar estructuras secundarias y de orden superior que son importantes para su adecuada función, es decir, interferencia estructural. Por ejemplo, el oligonucleótido puede interferir con la formación de estructuras de horquilla que desempeñan papeles decisivos en diferentes funciones, tales como proporcionar estabilidad adicional al ARN o adoptar motivos de reconocimiento esenciales para diferentes proteínas.
En todavía otro modo de realización más, la unión del oligonucleótido inactiva la diana para procesos metabólicos celulares adicionales incorporando enzimas celulares que degradan el ARNm. Por ejemplo, el oligonucleótido puede comprender un segmento de nucleósidos que tenga la capacidad de incorporar ribonucleasa H (ARNasaH), que degrada la parte de ARN de un dúplex ADN/ARN. Asimismo, el oligonucleótido puede comprender un segmento que incorpore ARNsas bicatenarias, tales como, por ejemplo, ARNasa III o puede comprender una secuencia guía
55 externa (EGS) que incorpore una enzima endógena (ARNasa P) que degrade el ARNm diana. Además, el oligonucleótido puede comprender un motivo de secuencia que presente actividad catalítica de ARNasa o se pueden fijar restos a los oligonucleótidos que, cuando se acerquen a la diana por el acontecimiento de hibridación, desactiven las actividades metabólicas adicionales de la diana.
Se ha demostrado que β-D-oxi-ANB no tolera la actividad de ARNasaH. Sin embargo, esto se puede cambiar de acuerdo con la invención creando oligonucleótidos quiméricos compuestos de β-D-oxi-ANB y ADN, llamados "gápmeros". Un "gápmero" se basa en un tramo central de ADN de 4-12 nucleótidos o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH (el hueco) típicamente flanqueado por de 1 a 6 residuos de β-D-oxi-ANB (los flancos). Los flancos también se pueden construir con derivados de ANB. Existen otras construcciones 65 quiméricas de acuerdo con la invención que son capaces de actuar por medio de un mecanismo mediado por ARNasaH. Un "headmero" se define por un tramo contiguo de derivados de ANB o β-D-oxi-ANB en el extremo 5’
seguido de un tramo contiguo de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH hacia el extremo 3’, y un "tailmero" se define por un tramo contiguo de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH en el extremo 5’ seguido de un tramo contiguo de derivados de ANB o β-D-oxi-ANB hacia el extremo 3’. Otras quimeras de acuerdo con la invención, llamadas "míxmeros", que consisten en una
5 composición alternativa de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH y derivados de ANB y/o β-D-oxi-ANB, también pueden ser capaces de mediar en la unión a y escisión por la ARNasaH. Puesto que el α-L-ANB incorpora actividad de ARNasaH hasta determinado grado, se pueden requerir huecos más pequeños de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH para la construcción de los gápmeros y se puede introducir más flexibilidad en la construcción de los míxmeros.
Propiedades farmacocinéticas
La eficacia clínica de los oligonucleótidos antisentido depende en gran medida de su farmacocinética, por ejemplo, absorción, distribución, captación celular, metabolismo y excreción. A su vez, estos parámetros están gobernados
15 significativamente por la química subyacente y el tamaño y la estructura tridimensional del oligonucleótido.
Como se menciona anteriormente, el ANB de acuerdo con la invención no es un compuesto químico único, sino varios compuestos químicos relacionados que, aunque son molecularmente diferentes, en conjunto presentan una asombrosa afinidad hacia ADN y ARN complementarios. De esta manera, la familia de compuestos químicos de ANB es adecuada de manera única para el desarrollo de oligonucleótidos de acuerdo con la invención con propiedades farmacocinéticas adaptadas que explotan la alta afinidad de ANB para modular el tamaño de los compuestos activos o que explotan diferentes compuestos químicos de ANB para modular la composición molecular exacta de los compuestos activos. En el último caso, el uso de, por ejemplo, amino-ANB en lugar de oxi-ANB cambia la carga global del oligonucleótido y varía el comportamiento de captación y distribución. Asimismo, el uso de tio
25 ANB en lugar de oxi-ANB, incrementa la lipofilia del oligonucleótido y, de esta manera, influye en su capacidad para atravesar barreras lipófilas tales como, por ejemplo, la membrana celular.
La modulación de las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido de ANB de acuerdo con la invención se puede conseguir adicionalmente a través de la fijación de una diversidad de diferentes restos. Por ejemplo, la capacidad de los oligonucleótidos para atravesar la membrana celular se puede potenciar fijando, por ejemplo, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, un tioéter, una cadena alifática, un fosfolípido o una poliamina al oligonucleótido. Asimismo, la captación de oligonucleótidos de ANB en las células se puede potenciar conjugando restos al oligonucleótido que interacciona con moléculas de la membrana, mediando en el transporte en el citoplasma.
Propiedades farmacodinámicas
Las propiedades farmacodinámicas de acuerdo con la invención se pueden potenciar con grupos que mejoren la captación de oligómeros, potencien la bioestabilidad, tal como la resistencia potenciada de los oligómeros a la degradación, y/o incrementen la especificidad y afinidad de las características de hibridación de oligonucleótidos con la secuencia diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm.
Toxicología
45 Existen básicamente dos tipos de toxicidad asociada a oligonucleótidos antisentido: toxicidad dependiente de la secuencia, que implica la secuencia de bases, y toxicidad independiente de la secuencia y relacionada con la clase. Con la excepción de las cuestiones relacionadas con la inmunoestimulación por parte de motivos de secuencia CpG naturales, las toxicidades que han sido las más prominentes en el desarrollo de los oligonucleótidos antisentido son independientes de la secuencia, por ejemplo, relacionadas con la química del oligonucleótido y relacionadas con la dosis, el modo, la frecuencia y la duración de la administración. La clase de fosforotioatos de los oligonucleótidos se ha caracterizado particularmente bien y se ha descubierto que ejerce una serie de efectos adversos, tales como la activación del complemento, un PTT (tiempo de tromboplastina parcial) prolongado, trombocitopenia, hepatotoxicidad (elevación de las enzimas hepáticas), cardiotoxicidad, esplenomegalia e hiperplasia de las células reticuloendoteliales.
55 Como se ha mencionado anteriormente, la familia de compuestos químicos de ANB proporciona una afinidad sin precedentes, una bioestabilidad muy alta y la capacidad de modular la composición molecular exacta del oligonucleótido. En un modo de realización de la invención, los compuestos que contienen ANB posibilitan el desarrollo de oligonucleótidos que combinan alta potencia con pocos enlaces de fosforotioato, si hubiera alguno, y que, por lo tanto, es probable que muestren una eficacia y seguridad mejores que los compuestos antisentido existentes.
Fabricación
65 Los oligo-y polinucleótidos de la invención se pueden producir usando las técnicas de polimerización de la química de ácidos nucleicos bien conocidas por un experto en la técnica de la química orgánica. En general, se usan los
ciclos de oligomerización estándar del enfoque de la fosforamidita (S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223), pero también se puede usar, por ejemplo, la química de H-fosfonato y de fosforotriéster.
Para algunos monómeros de la invención se usaron un tiempo de acoplamiento más largo y/o acoplamientos repetidos con reactivos recién preparados y/o reactivos de acoplamiento más concentrados.
Las fosforamiditas empleadas se acoplaron con rendimientos de acoplamiento por etapas satisfactorios de > 98 %. La tiolación del fosfato se realiza intercambiando la oxidación normal, por ejemplo, yodo/piridina/H2O, usada en la síntesis de oligómeros de fosforodiéster por una oxidación que usa el reactivo de Beaucage (disponible comercialmente); otros reactivos sulfurización también están comprendidos. Los oligómeros con ANB con fosforotioato se sintetizaron eficazmente con rendimientos de acoplamiento por etapas ≥ 98 %.
Los oligonucleótidos de β-D-amino-ANB, β-D-tio-ANB, α-L-ANB y β-D-metilamino-ANB también se sintetizaron eficazmente con rendimientos de acoplamiento por etapas ≥ 98 % usando los procedimientos de fosforamidita.
La purificación de los compuestos oligoméricos con ANB se realizó usando cartuchos desechables de purificación en fase inversa y/o HPLC de fase reversa y/o precipitación con etanol o butanol. Se usó electroforesis en gel, HPLC de fase inversa, EM-MALDI y EM-ESI para verificar la pureza de los oligonucleótidos sintetizados. Además, los materiales de soporte sólido que tienen inmovilizados a los mismos una nucleobase opcionalmente protegida y ANB opcionalmente protegido en 5'-OH son especialmente interesantes como material para la síntesis de compuestos oligoméricos que contienen ANB, en los que se incluye un monómero de ANB en el extremo 3'. En este caso, el material de soporte sólido es preferentemente CPG, por ejemplo, un material de CPG fácilmente (comercialmente) disponible o poliestireno en el que una nucleobase protegida opcionalmente funcionalizada en 3' y ANB opcionalmente protegido en 5'-OH se enlazan usando las condiciones establecidas por el proveedor de ese material particular.
Indicaciones
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede usar para el tratamiento de muchas enfermedades diferentes. Por ejemplo, se ha descubierto que HIF-1α se sobreexpresa en diversos tumores humanos sólidos y en sus metástasis, por ejemplo, tumores de la mama, colon, próstata, páncreas, cerebro, pulmón, ovario, sistema gastrointestinal, cabeza y cuello, hígado, vejiga y el cuello uterino (Zhong, H. et al., Cancer Research 59, 5830-5835, 1999; Talks, K.L. et al., American Journal of Pathology 157(2), 411-421, 2000).
Los procedimientos de la invención se emplean preferentemente para el tratamiento o la profilaxis frente a enfermedades provocadas por cáncer, particularmente para el tratamiento del cáncer, que se puede producir en un tejido, tal como cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, hígado, cerebro, testículos, estómago, intestino, médula espinal, senos nasales, cuello uterino, vías urinarias u ovarios.
Además, la invención descrita en el presente documento abarca un procedimiento para prevenir o tratar el cáncer que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto oligomérico que modula HIF-1α, que incluye pero no está limitado a altas dosis del oligómero, a un ser humano que necesita dicho tratamiento. La invención abarca adicionalmente la administración durante un corto periodo de tiempo de un compuesto oligomérico que modula HIF-1α. Las células normales, no cancerosas, se dividen en una frecuencia característica para el tipo de células particular. Cuando una célula se ha transformado a un estado canceroso, se produce una proliferación celular incontrolada y una muerte celular reducida, y, por lo tanto, la división celular o el crecimiento celular prolíficos son un sello de un tipo de células cancerosas. Los ejemplos de tipos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda, tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple), carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma renal, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, cáncer cervicouterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cánceres de sitio primario no conocido, neoplasias, cánceres del sistema nervioso periférico, cánceres del sistema nervioso central, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma microcítico de pulmón, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma y retinoblastoma), enfermedad de las cadenas pesadas, metástasis o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por el crecimiento celular incontrolado o anómalo.
Composición farmacéutica
Se debe entender que la invención también se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos una construcción de oligonucleótidos antisentido de la invención como ingrediente activo. Se debe entender que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende opcionalmente un vehículo farmacéutico y que la
5 composición farmacéutica comprende opcionalmente compuestos antisentido adicionales, compuestos quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivíricos y/o compuestos inmunomoduladores.
Sales
El compuesto oligomérico comprendido en la presente invención se puede emplear en una diversidad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que conservan la actividad biológica deseada de los compuestos identificados en el presente documento y presentan mínimos efectos toxicológicos no deseados. Los ejemplos no limitantes de dichas sales se pueden formar con sales de adición de bases y aminoácidos orgánicos formadas con cationes de metal, tales como cinc, calcio, bismuto, bario,
15 magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares o con un catión formado a partir de amoníaco, N,N-dibenciletilendiamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de tannato de cinc o similar.
Profármacos
En un modo de realización de la invención, el compuesto oligomérico puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son, en virtud, iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos se reduce en comparación con los equivalentes neutros o lipófilos. Este “impedimento” de polaridad se puede evitar usando el enfoque del profármaco (véase, por ejemplo, Crooke, R.
25 M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, pp. 103140). En este enfoque, los oligonucleótidos se preparan de una manera protegida, de modo que el oligonucleótido sea neutro cuando se administra. Estos grupos protectores están diseñados de tal manera que se puedan eliminar para que el oligonucleótido sea captado por las células. Los ejemplos de dichos grupos protectores son Sacetiltioetilo (SATE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE). Estos grupos protectores son resistentes a las nucleasas y se eliminan selectivamente de manera intracelular.
Conjugados
En un modo de realización de la invención, el compuesto oligomérico se enlaza a ligandos/conjugados. De esta
35 manera, se incrementa la captación celular de los oligonucleótidos antisentido. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones terminales 5’/3’-OH, pero los ligandos también pueden tener lugar en los azúcares y/o las bases. En particular, el factor de crecimiento al que se puede conjugar el oligonucleótido antisentido puede comprender transferrina o folato. Se pueden preparar complejos transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos folatopolilisina-oligonucleótido para su captación por células que expresan altos niveles del receptor de transferrina o folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercaladores de dúplex, tales como acridina, poli-L-lisina, "protección de extremos" con uno o más grupos de enlace resistentes a nucleasas, tales como fosforomonotioato y similares.
La preparación de complejos de transferrina como vehículos de captación de oligonucleótidos en células se describe
45 por Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). La administración celular de conjugados folatomacromolécula mediante endocitosis mediada por receptor de folato, incluyendo la administración de un oligonucleótido antisentido, se describe por Low et al., patente de EE. UU. 5.108.921. Véase también Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991).
Formulaciones
La invención también incluye la formulación de uno o más compuestos oligonucleotídicos como se divulga en el presente documento. Los agentes aglutinantes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden comprender parte del fármaco formulado. Las cápsulas, comprimidos y pastillas, etc., pueden contener, por ejemplo, los
55 siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes edulcorantes o saborizantes. Para las cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un vehículo líquido como aceites grasos. Asimismo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden formar parte de la unidad de dosificación. Las formulaciones de oligonucleótidos también pueden ser emulsiones de los ingredientes farmacéuticos activos y un lípido que forme una emulsión micelar.
Un oligonucleótido de la invención se puede mezclar con cualquier material que no afecte a la acción deseada, o con un material que complemente la acción deseada. Estos pueden incluir otros fármacos, incluyendo otros compuestos nucleosídicos.
65 Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril,
tampones, reguladores de tonicidad y antibacterianos. El compuesto activo se puede preparar con vehículos que protejan frente a la degradación o eliminación inmediata del cuerpo, incluyendo implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los vehículos preferentes son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.
5 Preferentemente, se incluye un compuesto oligomérico en una formulación unitaria, tal como en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables, en una cantidad suficiente para la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz sin provocar efectos secundarios graves en el paciente tratado.
Administración
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que se vaya a tratar. La administración puede ser (a) oral
(b) pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante
15 nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica, incluyendo epidérmica, transdérmica, oftálmica y a través de las membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal; o (d) parenteral, incluyendo infusión o inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. En un modo de realización, el oligonucleótido activo se administra IV, IP, oral, tópica o como una inyección intravenosa rápida o se administra directamente en el órgano diana.
Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizaciones, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, pulverulentas u oleosas, espesantes y similares. También puede ser útil el uso de guantes, preservativos recubiertos y similares. Las
25 formulaciones tópicas preferentes incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se mezclan con un agente de administración tópica, tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen, pero no están restringidas a, polvos o granulado, microparticulados, nanopartículados, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tales como, pero no limitados a, potenciadores de la penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
35 Suministro
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen, pero no están limitados a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. El suministro del fármaco al tejido tumoral se puede potenciar mediante el suministro mediado por vehículos, incluyendo, pero no limitada a, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27).
45 Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los ingredientes activos con el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan mezclando uniforme y estrechamente los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y, entonces, si fuera necesario, conformando el producto.
Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en
55 medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Combinación de fármacos
Los oligonucleótidos de la invención se pueden usar para anular los efectos de la inducción de HIF-1α por hipoxia aguda inducida por el tratamiento de supresión de andrógenos en el cáncer de próstata.
Los oligonucleótidos de la invención también se pueden conjugar con sustancias farmacéuticas activas, por ejemplo, 65 aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
Los compuestos oligoméricos que contienen ANB son útiles para una serie de aplicaciones terapéuticas, como se indica anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido con ANB modificado a un mamífero, particularmente un ser humano.
5 En un determinado modo de realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar individualmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleótido) o en combinación con uno o más de dichos agentes quimioterapéuticos adicionales o en combinación con radioterapia. Todos los agentes quimioterapéuticos conocidos por un experto en la técnica se incorporan en el presente documento como tratamientos de combinación con el compuesto de acuerdo con la invención.
15 Los fármacos antinflamatorios, incluyendo, pero no limitados a, fármacos antinflamatorios no esteroides y corticoesteroides, fármacos antivíricos y fármacos inmunomoduladores, también se pueden combinar en las composiciones de la invención. Dos o más compuestos combinados se pueden usar conjunta o secuencialmente.
En otro modo de realización, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Dos o más compuestos combinados se pueden usar conjunta o secuencialmente.
25 Dosificación
La dosificación depende de la gravedad y el grado de respuesta de la enfermedad que se va a tratar, y del curso del tratamiento que dura desde varios días a varios meses, o hasta que se consiga una cura o una atenuación de la enfermedad. La pauta posológica óptima se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente.
Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. En general, se puede estimar basándose en las CE50 que han resultado eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es desde 0,01 µg a 1 g por kg de peso corporal, y se puede administrar una o más
35 veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 10 años o por infusión continua durante horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la dosificación se pueden estimar basándose en los tiempos de residencia y las concentraciones medidos del fármaco en tejidos o fluidos corporales. Después de un tratamiento con éxito, puede ser deseable que el paciente se someta a un tratamiento de mantenimiento para prevenir la recidiva de la enfermedad.
Usos
Los compuestos oligoméricos que contienen ANB de la presente invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis. En investigación, los oligonucleótidos antisentido se
45 pueden usar para inhibir específicamente la síntesis de los genes HIF-1α en células y animales de laboratorio, facilitando así el análisis funcional de la diana o una valoración de su utilidad como diana para intervención terapéutica. En el diagnóstico, los oligonucleótidos antisentido se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión de HIF-1α en células y tejidos mediante inmunoelectrotransferencia, hibridación in situ o técnicas similares. Para el tratamiento, un animal o un ser humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que se puede tratar modulando la expresión de HIF-1α se somete a tratamiento administrando compuestos antisentido de acuerdo con la presente invención. Adicionalmente, se proporcionan procedimientos de tratamiento de un animal, en particular, ratón y rata, y tratamiento de un ser humano que se sospecha que tienen o son propensos a tener una enfermedad o afección asociada a la expresión de HIF-1α administrando una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención
Procedimientos
Los procedimientos de la invención se emplean preferentemente para el tratamiento o profilaxis frente a enfermedades provocadas por una enfermedad. La solicitud describe un procedimiento de inhibición de la expresión de HIF-1α en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el compuesto de la invención, de modo que se inhiba la expresión de HIF-1α. Además, en la solicitud se describe otro procedimiento de modulación de la expresión de un gen implicado en una enfermedad que comprende poner en contacto el gen o ARN del gen con un compuesto oligomérico en el que dicho compuesto tiene una secuencia que comprende al menos una porción de 8 nucleobases de SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
65 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 o 115, con lo que se modula la expresión génica. Estos compuestos pueden comprender una o más unidades de ANB. El compuesto se puede hibridar con ARN mensajero del gen para inhibir la expresión del mismo. Otro modo de realización es un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece o es 5 susceptible de padecer una enfermedad oncológica, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido dirigido a HIF-1α que comprende una o más unidades de ANB. Los procedimientos descritos se pueden dirigir a cánceres comunes, como, por ejemplo, cáncer primario y metastásico de mama, colorrectal, de próstata, de páncreas, otros cánceres Gl, tumores en el pulmón, cervicouterinos, ováricos, cerebrales, en cabeza y cuello, en el cuello uterino, el colon, el hígado, la tiroides, el riñón, los testículos, el estómago, el intestino, el esófago, la médula espinal, los senos nasales, la vejiga o las vías urinarias, así como preeclampsia, enfermedad intestinal inflamatoria y enfermedad de Alzheimer. El procedimiento también puede modular la angiogénesis, así como la proliferación de glóbulos rojos, proliferación celular, metabolismo del hierro, metabolismo energético y de la glucosa, regulación del pH, invasión de tejidos, apoptosis, resistencia a múltiples fármacos, respuesta al estrés celular o metabolismo de la matriz, que comprende poner en contacto una célula con
15 el compuesto antisentido que reivindica la invención de modo que se module la célula.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Síntesis de monómeros
La preparación de los monómeros mostrados en el Esquema 2, en los que Y y X son -O-y Z y Z* están -Oprotegidos se describe en gran detalle en la referencia, Koshkin et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8504-8512;
25 Sørensen et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (10), 2164-2176; Pedersen et al., Synthesis, 2002, 6, 802-809 y las referencias encontradas en los mismos, en los que los grupos protectores de Z y Z* son respectivamente oxi-N,Ndiisopropil-O-(2-cianoetil)fosforamidita y dimetoxitritiloxi. La preparación de monómeros del Esquema 2, en los que X es -O-e Y es -S-y -N(CH3)-se describe en Rosenbohm et al. Org. Biomol. Chem., 2003, 1, 655-663.
Ejemplo 2
Síntesis de oligonucleótidos de ANB
Todas las síntesis de oligonucleótidos se llevaron a cabo en una escala de 1 μmol en una plataforma de
35 instrumentos MOSS Expedite. Los procedimientos de síntesis se llevaron a cabo esencialmente como se describe en el manual del instrumento. Los monómeros de ANB usados se sintetizaron de acuerdo con Koshin A.A. et al J. Org. Chem., 2001, 66, 8504-8512.
Preparación del hemiéster de succinilo de ANB
El monómero de 5’-O-Dmt-3’-hidroxi-ANB (500 mg), anhídrido succínico (1,2 eq.) y DMAP (1,2 eq.) se disolvieron en DCM (35 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de las extracciones con NaH2PO4 0,1 M, pH 5,5 (2x), y salmuera (1x), la fase orgánica se secó adicionalmente con Na2SO4 anhidro, se filtró y evaporó. El derivado hemiéster se obtuvo con un rendimiento de un 95 % y se usó sin ninguna purificación adicional.
Preparación de la resina de ANB-CPG
El derivado hemiéster preparado anteriormente (90 μmol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF, se añadieron DIEA y pyBOP (90 μmol) y se mezclaron entre sí durante 1 min. Esta mezcla preactivada se combinó con LCAA-CPG (500 Å, tamaño de malla 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1,5 h a temperatura ambiente, el soporte se separó por filtración y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después del secado, se determinó la carga, y resultó ser de 57 µmol/g.
Ciclos de fosforotioato
55 Se desprotegieron 5'-O-Dmt (A(bz), C(bz), G(ibu) y T) enlazados a CPG (vidrio de poro controlado) usando una solución de ácido tricloroacético al 3 % (v/v) en diclorometano. La resina se lavó con acetonitrilo. El acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz)) o T-β-cianoetilfosforamidita) se realizó usando una solución 0,08 M de la amidita 5'-O-Dmt-protegida en acetonitrilo y se realizó la activación usando DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M). El acoplamiento se llevó a cabo en 2 minutos. La tiolación se llevó a cabo usando el reactivo de Beaucage (0,05 M en acetonitrilo) y se dejó reaccionar durante 3 minutos. El soporte se lavó exhaustivamente con acetonitrilo y se llevó a cabo la posterior protección usando una solución de anhídrido acético en THF (CAP A) y Nmetilimidazol/piridina/THF (1:1:8) (CAP B) para proteger los grupos 5’-hidroxilo sin reaccionar. A continuación, se repitió la etapa de protección y se finalizó el ciclo mediante lavado con acetonitrilo.
Ciclos de ANB
Se desprotegió 5'-O-Dmt (locA(bz), locC(bz), locG(ibu) o locT) enlazado a CPG (vidrio de poro controlado) usando el mismo procedimiento que anteriormente. El acoplamiento se realizó usando 5'-O-Dmt (locA(bz), locC(bz), locG(ibu)
o locT)-β-cianoetilfosforamidita (0,1 M en acetonitrilo) y se realizó la activación mediante DCI (0,25 M en acetonitrilo).
5 El acoplamiento se prolongó durante 7 minutos. La protección se realizó usando anhídrido acético en THF (CAP A) y una solución de N-metilimidazol/piridina/THF (1:1:8) (CAP B) durante 30 s. El fosfito triéster se oxida al fosfato triéster más estable usando una solución de I2 y piridina en THF durante 30 s. El soporte se lavó con acetonitrilo y se repitió la etapa de protección. El ciclo se finalizó con un lavado exhaustivo con acetonitrilo. Abreviaturas: Dmt: dimetoxitritilo y DCI: 4,5-dicianoimidazol.
Desprotección y escisión de oligonucleótidos
Los oligómeros se escindieron del soporte y el grupo protector de β-cianoetilo se eliminó tratando el soporte con NH4OH al 35 % durante 1 h a temperatura ambiente. El soporte se separó por filtración y los grupos protectores de 15 base se eliminaron elevando la temperatura a 65 ºC durante 4 horas. La solución de oligonucleótidos se evaporó entonces a sequedad.
Purificación de oligonucleótidos
20 Los oligonucleótidos se purificaron mediante RP-HPLC (fase inversa) o AIE (intercambio aniónico).
RP-HPLC: Columna: VYDAC™ ref. 218TP1010 (vydac) Caudal: 3 ml/min Tampón: A acetato de amonio 0,1 M pH 7,6
B acetonitrilo
Gradiente: Tiempo 0 10 18 22 23 28 %deB 05 30 100 100 0
IE: Columna: Resource™ 15Q (amersham pharmacia biotech) Caudal: 1,2 ml/min Tampón: A NaOH 0,1 M
B NaOH 0,1 M, NaCl 2,0 M
Gradiente: Tiempo 01 27 28 32 33 %deB 025 55 100 100 0
25 Abreviaturas Dmt: Dimetoxitritilo DCI: 4,5-dicianoimidazol DMAP: 4-dimetilaminopiridina DCM: Diclorometano DMF: Dimetilformamida THF: Tetrahidrofurano DIEA: N,N-diisopropiletilamina PyBOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio Bz: Benzoílo Ibu: Isobutirilo Beaucage: 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido A(bz), C(bz), G(ibu) o T: Monómeros de ANB (ANB, ácido nucleico bloqueado)
Ejemplo 3. Cultivo celular
Los compuestos antisentido y su efecto sobre la expresión del ácido nucleico diana se pueden someter a prueba en
30 cualquiera de una diversidad de tipos de células siempre que la proteína o ácido nucleico diana estén presentes en niveles medibles. Esto se puede determinar de manera rutinaria usando, por ejemplo, análisis por RT-PCR o Northern blot o Western blot. Los siguientes tipos de células se proporcionan con propósitos ilustrativos, pero se pueden usar de manera rutinaria otros tipos de células, siempre que la diana se exprese en el tipo de células elegido.
35 Las líneas celulares se cultivaron en el medio apropiado como se describe a continuación y se mantuvieron a 37 ºC a un 95-98 % de humedad y un 5 % de CO2. Las células se sometieron a pases de manera rutinaria 2-3 veces por
semana.
U87-MG: La línea celular de glioblastoma humana U87-MG se cultivó en medio de Eagle modificado (MEM) con sales de Earle y suero bovino fetal (FCS) al 10 %.
5 U373: La línea celular de glioblastoma humana U373 se cultivó en medio de Eagle modificado (MEM) con sales de Earle y suero bovino fetal (FCS) al 10 %.
15PC3: La línea celular de cáncer de próstata humana 15PC3 fue donada amablemente por el Dr. F. Baas, 10 Laboratorio de Neurociencia, AMC, (Países Bajos) y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal (FBS) al 10 %
+ Glutamax I + gentamicina.
Cultivo celular anaerobio: Para monitorizar los cambios en la expresión de HIF en condiciones de hipoxia, las células se cultivaron en condiciones anaerobias a un nivel de O2 de un 0,1-1,5 % en una bolsa de incubación (Merck) con 15 Anaerocult (Merck) añadido para unirse químicamente a O2. Las condiciones anaerobias se obtuvieron en 1-2 horas. Las células se sometieron a anoxia durante 6 o 18 horas.
Ejemplo 4
20 Tratamiento con el oligonucleótido antisentido
Las células (descritas anteriormente) se trataron con oligonucleótido usando la formulación de liposomas catiónicos LipofectAMINE 2000 (Gibco) como vehículo de transfección. Las células se sembraron en placas de Petri de cultivo celular de 100 mm x 20 mm (Corning) o placas de 6 pocillos (NUNC) y se trataron cuando la confluencia fue de un 25 90 %. Las concentraciones de oligonucleótido usadas variaban desde 1 nM a 400 nM de concentración final. La formulación de complejos oligonucleótido-lípido se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando MEM libre de suero y una concentración final de lípidos de 5 μg/ml en 6 ml de volumen total. Las células se incubaron a 37ºC durante 4 o 24 horas y se detuvo el tratamiento por eliminación del medio de cultivo que contenía oligonucleótidos. Se lavaron las células y se añadió MEM que contenía suero. Después del tratamiento con el
30 oligonucleótido, se dejó que las células se recuperaran durante 18 horas antes de que se sometieran a anoxia durante 6 horas o bien se sometieron directamente a anoxia durante 18 horas.
Ejemplo 5
35 Extracción del ARN total
El ARN total se aisló usando el minikit RNeasy (por ejemplo, ref. 74104 de Qiagen) o bien usando el reactivo Trizol (por ejemplo, ref. 15596 de Life technologies). Para el aislamiento de ARN a partir de líneas celulares, RNeasy es el procedimiento preferente; para muestras de tejido, Trizol es el procedimiento preferente. El ARN total se aisló a partir
40 de líneas celulares usando el minikit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Las muestras de tejido se homogeneizaron usando un homogeneizador Ultra Turrax T8 (por ejemplo, IKA Analysen technik) y se aisló el ARN total usando el protocolo del reactivo Trizol proporcionado por el fabricante.
Ejemplo 6
Síntesis de ADNc de primera cadena
La síntesis de primera cadena se realizó usando el kit OmniScript Reverse Transcriptase (ref. 205113, Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
50 Para cada muestra, se ajustaron 0,5 μg de ARN total a 12 μl cada uno con H2O libre de ARNasa y se mezclaron con 2 μl de poli(dT)12-18 (2,5 µg/ml) (Life Technologies, Gibco BRL, Roskilde, DK), 2 μl de mezcla de dNTP (5 mM cada dNTP), 2 μl 10x tampón RT, 1 μl de INHIBIDOR de ARNasa RNAguard™ (33,3 U/ml), (ref. 27-0816-01, Amersham Pharmacia Biotech, Horsholm, DK) y 1 µl de OmniScript Reverse Transcriptase (4 U/µl) seguido de incubación a
55 37 °C durante 60 minutos e inactivación por calor de la enzima a 93 °C durante 5 minutos.
Ejemplo 7
Análisis de la modulación antisentido de la expresión de HIF-1α
60 La modulación antisentido de la expresión de HIF-1α se puede someter a ensayo en una diversidad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de HIF-1α se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, el análisis por Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real. En la actualidad es preferente la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar sobre ARNm o
65 ARN celular total.
Los procedimientos de aislamiento del ARN y análisis de ARN, tales como el análisis por Northern blot, son rutinarios en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.
El análisis cuantitativo en tiempo real (PCR) se puede lograr convenientemente usando el sistema de detección por 5 PCR en tiempo real iQ Multi-Color, disponible comercialmente en BioRAD.
Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de Ha-ras
La cuantificación de los niveles de ARNm se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección por PCR en tiempo real iQ Multi-Color (BioRAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica bien conocida en la técnica y se enseña, por ejemplo, en Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.
15 La mezcla maestra de PCR Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2x se obtuvo de la ref. 11730 de Invitrogen. Los cebadores y las sondas de TaqMan® se obtuvieron de MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania.
Las sondas y los cebadores para HIF-1α humano se diseñaron para que se hibridaran a una secuencia Ha-ras humana usando la información de secuencia publicada (número de acceso a GenBank NM_001530, incorporado en el presente documento como SEQ ID NO. 1).
Para el HIF-1α humano, los cebadores de PCR fueron:
cebador directo: 5’- -3’ (concentración final en el ensayo: 0,9 µM) (SEQ ID NO.
25 116),; cebador inverso: 5’--3’ (concentración final en el ensayo: 0,9 µM) (SEQ ID NO. 117) y la sonda de PCR fue: 5’-FAM--TAMRA-3’ (concentración final en el ensayo: 0,1 µM) (SEQ ID NO. 118).
La cantidad de ARNm de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se usó como un control endógeno para normalizar cualquier varianza en la preparación de las muestras.
El contenido de muestra de ARNm de GAPDH humana se cuantificó usando el reactivo de ensayo de GAPDH humana ABI Prism Pre-Developed TaqMan (ref. 4310884E de Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
35 Para la cuantificación de ARNm de GAPDH de ratón, se diseñaron los siguientes cebadores y sondas: cebador
-
3’ (concentración final de 0,3 µM), cebador antisentido 5’final de 0,6 µM), sonda de TaqMan 5’-FAM
-TAMRA-3’ (concentración final de 0,2 µM).
PCR en tiempo real
El ADNc de la síntesis de primera cadena realizada como se describe en el ejemplo 8 se diluyó 2-20 veces y se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores y la sonda se mezclaron con 2 x Platinum
45 Quantitative PCR SuperMix UDG (ref. 11730, Invitrogen) y se añadieron a 3,3 µl de ADNc hasta un volumen final de 25 µl. Cada muestra se analizó por triplicado. El ensayo de diluciones de 2 veces de un ADNc que se había preparado sobre material purificado a partir de una línea celular que expresaba el ARN de interés generó curvas estándar para los ensayos. Se usó H2O estéril en lugar de ADNc para el control sin molde. Programa de PCR: 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C, 15 segundos, 60 °C, 1 minuto.
Las cantidades relativas de la secuencia de ARNm diana se determinaron a partir del ciclo umbral calculado usando el software del sistema de detección en tiempo real iCycler iQ.
Ejemplo 8
Análisis por Western blot de los niveles de proteína HIF-1α
Los niveles de proteína de HIF-1α se pueden cuantificar de una diversidad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis por Western blot (inmunotransferencia), ELISA, RIA (radioinmunoensayo) o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a HIF-1α se pueden identificar y obtener a partir de una diversidad de fuentes, tales como Upstate Biotechnologies (Fake Placid, EE. UU.), Novus Biologicals (Fittleton, Colorado, EE. UU.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, EE. UU.) o se pueden preparar mediante procedimientos de generación de anticuerpos convencionales.
65 Para medir el efecto del tratamiento con los oligonucleótidos antisentido frente a HIF-1α, se determinaron los niveles
de proteína de HIF-1α en células tratadas y no tratadas usando Western blot.
Después del tratamiento con el oligonucleótido como se describe anteriormente, se obtuvieron las células raspando con una varilla de vidrio en solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo que contenía 0,37 mg/ml 5 del inhibidor de proteasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).
Las células obtenidas se lavaron en 1 ml de PBS que contenía PMSF como se describe anteriormente y los sedimentos celulares se mantuvieron congelados a -80 ºC.
10 Para la extracción de proteínas, se disolvieron los sedimentos celulares congelados en 3 volúmenes de tampón de lisis enfriado con hielo (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet P 40 (NP-40) al 1 %, SDS al 0,1 %, desoxicolato de sodio al 1 % (p/v), ditiotreitol (DTT) 1 mM, combinación completa inhibidora de proteínas (Boehringer Mannheim)). Las muestras se sometieron a ultrasonidos 2-3 veces durante 5-10 segundos en un homogeneizador ultrasónico Vibra Cell 50 (Sonics & Materials Inc.). El lisado se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
15 La concentración de proteínas del lisado de proteínas se determinó usando el kit de ensayo BCA Protein (Pierce) como describe el fabricante.
Electroforesis en gel con SDS:
20 Las muestras de proteínas preparadas como se describe anteriormente se descongelaron sobre hielo y se desnaturalizaron a 70 ºC durante 10 min.
Las muestras se cargaron sobre 1,0 mm de gel NuPage Bis-Tris al 10 % (NOVEX) y los geles se hicieron migrar en tampón de migración, tampón de migración NuPage MES SDS o bien tampón de migración NuPage MOPS SDS 25 (ambos de NOVEX) dependiendo de la separación deseada de las proteínas en un módulo de electroforesis de minicélulas Xcell II (NOVEX).
En la cámara interna del módulo de electroforesis se añadió antioxidante NuPage (NOVEX) al tampón de migración a una concentración final de 2,5 μl/ml. Para la referencia de tamaños, se cargó en el gel SeeBlue Plus2 Prestained 30 Standard (Invitrogen). La electroforesis se ejecutó a 160 V durante 2 horas.
Electrotransferencia semiseca:
Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de
35 vinilideno) (PVDF) mediante electrotransferencia semiseca. El gel se equilibró en tampón de transferencia NuPage (NOVEX) hasta la electrotransferencia. El procedimiento de electrotransferencia se llevó a cabo en una célula de transferencia semiseca Trans-blot SD (BioRAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se almacenó a 4 ºC hasta su uso posterior.
40 Inmunodetección:
Para detectar la proteína deseada, la membrana se incubó con anticuerpos policlonales o monoclonales frente a la proteína. La membrana se bloqueó en tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 2,5 % y BSA al 5 % disueltos en tampón TS (NaCl 150 mM, base Tris 10 mM, pH 7,4)) durante 1 hora con agitación. Entonces, la 45 membrana se lavó 2 x 15 min en tampón TS a temperatura ambiente y se incubó durante la noche con anticuerpo primario en tampón TS-Tween20 con NaN3 al 0,1 % a 4 °C. Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales primarios y concentraciones/diluciones: anti-Glut1 de ratón (de T. Ploug, The Panum Institute, Copenhague, Dinamarca) 1:20, 1 μg/ml anti-HIF-1α de ratón (H72320, Transduction Laboratories), anti-α-tubulina de ratón (T9026, Sigma) 1:10.000. Después de la incubación con el anticuerpo primario, la membrana se lavó en tampón TS50 Tween20 durante 15 minutos seguido de 2 lavados adicionales de 5 minutos cada uno con agitación a temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se incubó con una dilución 1:5000 del anticuerpo secundario, anticuerpo policlonal caprino anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con peroxidasa (P0447, DAKO A/S) durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces, la membrana se lavó en tampón TS-Tween20 durante 15 minutos seguido de 3 lavados adicionales durante 5 minutos cada uno con agitación a temperatura ambiente. Después del último lavado, 55 la membrana se incubó con ECL+ Plus (Amersham) durante 5 minutos seguido de una exploración inmediata con un STORM 840 (Molecular Dynamics Inc.). La membrana se deshibridó en tampón de deshibridación (2-mercaptoetanol 100 mM, SDS al 2 %, base Tris 62,5 mM) a pH 6,7 por incubación con baja agitación durante 30 minutos a 50 ºC. Después de lavar en tampón TS-Tween20 durante 2 x 10 minutos a temperatura ambiente, la membrana se secó y se selló en una bolsa de plástico y se almacenó a 4 ºC. Los niveles de expresión de proteínas se cuantificaron en
60 relación con la expresión de una proteína constitutiva usando el software Image Quant, versión 5,0 (Molecular Dynamics Inc).
Ejemplo 9
65 Inhibición antisentido de la expresión de HIF-1α humano por oligonucleótidos
De acuerdo con la presente invención, se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirse a diferentes regiones del ARN de HIF-1α humano, usando secuencias publicadas (número de acceso a GenBank NM_001530, incorporado en el presente documento como SEQ ID NO. 1 y Figura 7). Los oligonucleótidos de 16 nucleótidos de longitud se muestran en la Tabla 1 y tienen un SEQ ID NO. Los oligonucleótidos están diseñados para que sean 5 particularmente potentes como oligonucleótidos antisentido, particularmente cuando se sintetizan usando nucleótidos artificiales tales como ANB o fosforotioatos, etc. El “sitio diana” indica el primer número de nucleótido en la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido. Los compuestos se analizaron en cuanto a sus efectos sobre los niveles de proteína HIF-1α mediante análisis por Western blot como se describe en otros ejemplos en el presente documento. 10
Tabla 1. Inhibición de los niveles de proteína HIF-1α humana por oligonucleótidos antisentido
SEQ ID NO./n.º Cureon
% de inhibición de oligonucleót ido 100 nM Sitio diana Secuencia oligonucleotídica 5’-3’ Diseño de oligonucleótidos 5’-3’
SEQ ID NO. 2/2651
92 234
SEQ ID NO. 3/2627
94 2256
SEQ ID NO. 4
251
SEQ ID NO. 5
250
SEQ ID NO. 6
49
SEQ ID NO. 7
231
SEQ ID NO. 8
233
SEQ ID NO. 9
2017
SEQ ID NO. 10
1471
SEQ ID NO. 11
6
SEQ ID NO. 12/2654
96 153
SEQ ID NO. 13
1937
SEQ ID NO. 14
1965
SEQ ID NO. 15
1744
SEQ ID NO. 16
1821
SEQ ID NO. 17
2050
SEQ ID NO. 18
2182
SEQ ID NO. 19
2317
SEQ ID NO. 20
2506
SEQ ID NO. 21
2621
SEQ ID NO. 22/2655
93 2680
SEQ ID NO. 23/2656
93 2783
SEQ ID NO. 24
2837
SEQ ID NO. 25
3067
SEQ ID NO. 26
3100
SEQ ID NO. 27
3169
SEQ ID NO. 28
3356
SEQ ID NO. 29
3360
SEQ ID NO. 30
3426
SEQ ID NO. 31
3437
SEQ ID NO. 32
3531
SEQ ID NO. 33
170
SEQ ID NO. 34
3582
SEQ ID NO. 35
3704
SEQ ID NO. 36
3845
SEQ ID NO. 37
2369
SEQ ID NO. 38
2848
SEQ ID NO. 38
2413
SEQ ID NO. 40
2919
SEQ ID NO. 41
2986
SEQ ID NO. 42
2720
SEQ ID NO. 43
286
SEQ ID NO./n.º Cureon
% de inhibición de oligonucleót ido 100 nM Sitio diana Secuencia oligonucleotídica 5’-3’ Diseño de oligonucleótidos 5’-3’
SEQ ID NO. 44
3032
SEQ ID NO. 45
3228
SEQ ID NO. 46
3299
SEQ ID NO. 47
3490
SEQ ID NO. 48
3610
SEQ ID NO. 49
3677
SEQ ID NO. 50
3786
SEQ ID NO. 51
3874
SEQ ID NO. 52
384
SEQ ID NO. 53/2657
87 479
SEQ ID NO. 54/2658
84 917
SEQ ID NO. 55/2659
95 1177
SEQ ID NO. 56/2660
93 1505
SEQ ID NO. 57
2095
SEQ ID NO. 58
2116
SEQ ID NO. 59/2661
86 2223
SEQ ID NO. 60/2662
79 2477
SEQ ID NO. 61/2663
85 2553
SEQ ID NO. 62
98
SEQ ID NO. 63
349
SEQ ID NO. 64
412
SEQ ID NO. 65
516
SEQ ID NO. 66
574
SEQ ID NO. 67
747
SEQ ID NO. 68
638
SEQ ID NO. 69
700
SEQ ID NO. 70
809
SEQ ID NO. 71
871
SEQ ID NO. 72
968
SEQ ID NO. 73
1104
SEQ ID NO. 74
1057
SEQ ID NO. 75
1003
SEQ ID NO. 76
1163
SEQ ID NO. 77
1221
SEQ ID NO. 78
1284
SEQ ID NO. 79
1322
SEQ ID NO. 80
1383
SEQ ID NO. 81
1440
SEQ ID NO. 82
1559
SEQ ID NO. 83
1613
SEQ ID NO. 84
1669
SEQ ID NO. 85
1702
SEQ ID NO. 86
1783
SEQ ID NO. 87
1804
SEQ ID NO. 88
1887
SEQ ID NO. 114/Cur2652
97 3091
SEQ ID NO. 115/Cur2653
90 293
Son preferentes las secuencias que demostraron una inhibición de la expresión de HIF-1α de al menos un 20 % en este experimento (véanse también las Figuras 1-9). Los sitios diana que son complementarios de estas secuencias preferentes se denominan en el presente documento “puntos calientes” y, por lo tanto, son sitios preferentes para que los compuestos de la presente invención se dirijan a ellos.
Ejemplo 10
Inhibición antisentido de HIF-1α por fosforotioato, oligonucleótidos que contienen ANB u oligonucleótidos quiméricos que tienen al menos un segmento de ANB y al menos un segmento de fosforotioato
10 De acuerdo con la presente invención, también se sintetizó una segunda serie de oligonucleótidos antisentido (Tabla 2). Estas series de compuestos son oligonucleótidos de fosforotioato modificados completamente, oligonucleótidos de ANB modificados completamente u oligonucleótidos quiméricos de 16 nucleótidos de longitud dirigidos a dos sitios diferentes. Los oligonucleótidos quiméricos son un “gápmero” (GM), “headmero” (WM5) o “tailmero” (WM3)
15 compuestos por una región que consiste en fosforotioatos (P═S) que está flanqueada en uno o ambos lados por un segmento de ANB. Estos segmentos están compuestos de nucleótidos oxi-ANB. Algunos de los oligonucleótidos también tenían un color fluorescente (FAM) incorporado. También se diseñaron oligonucleótidos con emparejamiento erróneo (MM). Todas las citosinas en oxi-ANB están metiladas en la posición C5 de las nucleobases. Los compuestos se analizaron en cuanto a su efecto sobre los niveles de proteína HIF-1α mediante
20 Western blot como se describe en otros ejemplos en el presente documento. El “sitio diana” indica el primer número de nucleótido en la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido.
Tabla 2. Inhibición de los niveles de proteína HIF-1α humana por oligonucleótidos con fosforotioato, oligonucleótidos que contienen ANB u oligonucleótidos quiméricos que tienen uno o dos segmentos de
25 ANB y un segmento de fosforotioato (el enlace de cadena principal es P=0 a menos que se indique lo contrario, s: enlace P=S, letras minúsculas, ácido desoxinucleico, letras mayúsculas, oxi-ANB).
Denominación
SEQ NO. % de inhibición de oligonucleótido 100 nM Sitio diana y diseño Secuencia y diseño 5’-3’
Cur0805
SEQ ID 89 24 234 FM
Cur0806
SEQ ID 90 21 234 PS
Cur0807
SEQ ID 91 234 GM
Cur0808
SEQ ID 92 234 FAM
Cur0809
SEQ ID 93 34 234 WM5
Cur0810
SEQ ID 94 54 234 WM3
Cur0811
SEQ ID 95 24 2256 FM
Cur0812
SEQ ID 96 2256 PS
Cur0813
SEQ ID 97 86 2256 GM
Cur0814
SEQ ID 98 2256 FAM
Cur0815
SEQ ID 99 2256 WM5
Cur0816
SEQ ID 100 37 2256 WM3
Cur0959
SEQ ID 101 234 MM1
Cur0960
SEQ ID 102 234 MM2
Cur0961
SEQ ID 103 2256 MM1
Cur0962
SEQ ID 104 2256 MM2
Cur2627
SEQ ID 3 94 2256 GM
Cur2628
SEQ ID 105 95 2256 GM
Cur2629
SEQ ID 106 96 2256 GM
Cur2630
SEQ ID 107 95 2256 GM
Cur2631
SEQ ID 108 95 2256 GM
Cur2632
SEQ ID 109 94 2256 GM
Cur2633
SEQ ID 110 94 2256 GM
Cur2634
SEQ ID 111 91 2256 GM
Cur2635
SEQ ID 112 94 2256 WM5
Cur2412
SEQ ID 113 2256 GM
Como se muestra en la Tabla 2 y las Figuras 1-6, la mayor parte de los SEQ ID NO. 89-104 demostraron al menos un 20 % de inhibición de la expresión de HIF-1α en este experimento y, por lo tanto, son preferentes. Los sitios diana que son complementarios de estas secuencias preferentes se denominan en el presente documento “puntos
5 calientes” y, por lo tanto, son sitios preferentes para que los compuestos de la presente invención se dirijan a ellos.
Ejemplo 11
Compuestos oligoméricos de eficacia in vivo dirigidos a HIF-1α
10 El efecto del tratamiento con el oligonucleótido sobre el crecimiento de xenoinjertos tumorales en ratones atímicos se puede medir usando diferentes líneas celulares tumorales. Los ejemplos de dichas líneas celulares son las líneas celulares tumorales humanas U87 (glioblastoma), U373 (glioblastoma), 15PC3 (cáncer de próstata) y CPH 54A (carcinoma microcítico de pulmón) y la línea celular tumoral murina B16 (melanoma).
15 Tratamiento de xenoinjertos tumorales subcutáneos en ratones atímicos usando oligonucleótidos que contienen ANB.
Las células tumorales se implantaron de forma subcutánea y, entonces, se sometieron a pases en serie mediante
20 tres trasplantes consecutivos. Se implantaron fragmentos tumorales de 1 mm de forma subcutánea con una aguja trócar en ratones atímicos NMRI. De forma alternativa, las células cancerosas, típicamente 106 células suspendidas en 300 µl de matrigel (BD Bioscience), se inyectaron subcutáneamente en los costados de los ratones atímicos NMRI.
25 Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal o subcutánea de oligonucleótido a diversas dosis, con una dosis máxima de 5 mg/kg/día o mediante administración de hasta 5 mg/kg/día durante hasta 28 días usando bombas osmóticas ALZET implantadas de forma subcutánea. El tratamiento individual de los ratones comenzó cuando el volumen tumoral alcanzó 50 mm3. El tratamiento con PBS se inició cuando el volumen tumoral medio del grupo de control alcanzó 50 mm3. El experimento se terminó cuando los tumores de cualquier grupo alcanzaron los tamaños
30 máximos permitidos. Los tamaños tumorales de todos los ratones se midieron diariamente mediante mediciones con calibre. El efecto del tratamiento se midió como la tasa de crecimiento tumoral y tamaño tumoral. Los ratones tratados con oligonucleótido se sacrificaron 24 horas después de la última inyección de oligonucleótido.
Al final del periodo de tratamiento, los ratones se anestesiaron y los tumores se extirparon y se congelaron 35 inmediatamente en nitrógeno líquido para el análisis diana.
Resultados: Los ratones que portaban xenoinjertos tumorales de U373 se trataron con Cur813 (SEQ ID NO. 97) 5 mg/kg/día, i.p. x 1 vez al día durante 7 días o PBS 100 μl/10 g/día, i.p. x 1 vez al día durante 7 días. Se trataron cinco ratones de cada grupo. La evaluación tumoral se llevó a cabo como se describe anteriormente. Las curvas de
40 crecimiento tumoral se muestran en la Figura 9.
Comparación de tamaños tumorales (prueba t)
Día Valor de p
45 4 0,0477 5 0,0156 6 0,0354 7 0,0461
50 Análisis de Kaplan Meier:
Acontecimiento terminal: Tamaño tumoral 150 mm3:
Grupo n.º Censurado Mediana de Supervivencia, acontecimientos días
PBS5 05 5
Cur813 5 14 7
Prueba de rango logarítmico para distribuciones de igualdad de supervivencia: P = 0,0138
Tratamiento de xenoinjertos tumorales intracraneales en ratones atímicos usando oligonucleótidos que 5 contienen ANB.
Las células tumorales se implantaron intracranealmente en ratones atímicos NMRI y el tratamiento con el oligonucleótido se inició 1 semana después de la implantación. Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal o subcutánea de oligonucleótido a diversas dosis, con una dosis máxima 2 mg/kg, o PBS. El número
10 de tratamientos depende de la tasa de crecimiento tumoral en el grupo de control. El experimento se terminó cuando los tumores de cualquier grupo alcanzaron los tamaños máximos permitidos o hasta que se produjo la muerte en cualquier grupo. El efecto del tratamiento se midió como tiempo hasta el deterioro neurológico crónico. Los ratones tratados con oligonucleótido se sacrificaron 24 horas después de la última inyección de oligonucleótido.
15 Ejemplo 12
Análisis in vivo: inhibición del nivel de proteína HIF-1α en células tumorales humanas cultivadas in vivo por tratamiento sistémico con oligonucleótidos antisentido
20 Los tumores se homogeneizaron en tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM [pH 7,5]; Triton X-100 al 2 %; 1/100 v/v de Protease Inhibitor Cocktail Set III (Calbiochem); 1/100 v/v de Protease Inhibitor Cocktail Set II (Calbiochem)) a 4 ºC con el uso de un homogeneizador de tejidos accionado por motor. Se aplicaron 500 μl de tampón de lisis por cada 100 mg de tejido tumoral. Los lisados tumorales se centrifugaron a 13.000 g durante 5 min a 4 °C para eliminar los desechos tisulares. Las concentraciones de proteínas de los extractos tumorales se determinaron usando el kit de
25 reactivos de ensayo BCA Protein (Pierce, Rockford). El análisis por Western blot de la expresión de proteínas diana se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8.
La presente invención se ha descrito con especificidad de acuerdo con algunos de sus modos de realización preferentes. Por lo tanto, los siguientes ejemplos solo sirven para ilustrar la invención y no pretenden limitar la
30 misma.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de HIF-1α en al menos un 20% a un nivel de
    oligonucleótido de 100 nM, en el que la secuencia oligonucleotídica es TGGCAAGCATCCTGTA (SEQ ID NO. 55). 5
  2. 2.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto comprende al menos una unidad de análogo de ácido nucleico, tal como al menos una unidad de ácido nucleico bloqueado (ANB).
  3. 3.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la unidad de ANB es oxi-ANB, tio-ANB, amino-ANB, en las configuraciones D-β o L-α o combinaciones de las mismas o ena-ANB.
  4. 4.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que al menos cuatro nucleótidos son unidades de ANB.
    15 5. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que los enlaces internucleosídicos son enlaces de fosforotioato.
  5. 6.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el oligonucleótido comprende un segmento de nucleósidos que tienen la capacidad de incorporar ARNasaH.
  6. 7.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto es un oligonucleótido antisentido que es un gápmero.
  7. 8.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 7, que consiste en o comprende un tramo central
    25 de ADN de 4-12 nucleótidos o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la ARNasaH (el hueco) flanqueado por de 1 a 6 residuos de beta-D-oxi ANB.
  8. 9.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia oligonucleotídica TGGCAAGCATCCTGTA es un gápmero que comprende un tramo central de ADN de 412 nucleótidos que tiene la capacidad de incorporar ARNasaH (el hueco) flanqueado por de 1 a 6 residuos de betaD-oxi ANB, en el que los enlaces internucleosídicos son enlaces de fosforotioato.
  9. 10.
    El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 9, que está representado por la siguiente fórmula:
    TsGsGsCsasasgscsastscscsTsGsTsA, en la que los enlaces internucleosídicos (s) son enlaces de fosforotioato. 35
  10. 11.
    Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente un vehículo, diluyente o sal farmacéuticamente aceptables.
  11. 12.
    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el oligonucleótido está enlazado a un conjugado.
  12. 13.
    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el oligonucleótido está en forma de un profármaco.
    45 14. Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para su uso como un medicamento.
  13. 15. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para su uso en el tratamiento del cáncer
    o sospecha de cáncer, tal como seleccionado entre cáncer primario y metastásico de mama, colorrectal, de próstata, de páncreas, otros cánceres Gl, tumores en el pulmón, cervicouterinos, ováricos, cerebrales, en cabeza y cuello, en el cuello uterino, el colon, el hígado, la tiroides, el riñón, los testículos, el estómago, el intestino, el esófago, la médula espinal, los senos nasales, la vejiga o las vías urinarias.
    55 16. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre preeclampsia, enfermedad intestinal inflamatoria y enfermedad de Alzheimer.
  14. 17. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para su uso en tratamiento, en el que el tratamiento modula la angiogénesis, proliferación de glóbulos rojos, proliferación celular, metabolismo del hierro, metabolismo energético y de la glucosa, regulación del pH, invasión de tejidos, apoptosis, resistencia a múltiples fármacos, respuesta al estrés celular o metabolismo de la matriz.
    65 18. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 17 para su uso en tratamiento, en el que el tratamiento se combina con la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales.
  15. 19. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 17 para su uso en tratamiento, en el que el tratamiento se combina con la administración de uno o más fármacos seleccionados entre fármacos antinflamatorios, fármacos antinflamatorios no esteroides, corticoesteroides, fármacos antivíricos y fármacos
    5 inmunomoduladores.
  16. 20. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 19 para su uso en tratamiento, en el que el tratamiento inhibe la proliferación de células cancerosas.
    10 21. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 20 para su uso en tratamiento, en el que el tratamiento incluye una dosis de oligonucleótido desde 0,01 μg a 11 g por kg de peso corporal.
    Figura 1/10
    Western blot
    HIF-1α
    α-tubulina
    Canti
    Concentración de oligonucleótido
    dad
    1 relati 0,8 va de 0,6 prote 0,4 0,2
    ína 0
    HIF1alfa
    Figura 4/10
    Western blot
    Cur0960 Cur0961 1Oligonucleótido
    HIF-1α α-tubulina
    B: Cur813 5 mg/kg/día, i.p. x 1 diaria amente durante 7 días 5 A: PBS, 100 µl/10 g/día, i.p. x 1 diariiamente durante 7 días
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