PT1924252E - Método para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas - Google Patents

Método para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas Download PDF

Info

Publication number
PT1924252E
PT1924252E PT06788834T PT06788834T PT1924252E PT 1924252 E PT1924252 E PT 1924252E PT 06788834 T PT06788834 T PT 06788834T PT 06788834 T PT06788834 T PT 06788834T PT 1924252 E PT1924252 E PT 1924252E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
cell
present
target
concentration
probe
Prior art date
Application number
PT06788834T
Other languages
English (en)
Inventor
Jyotsana S Shah
Helena Weltman
Original Assignee
Id Fish Technology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Id Fish Technology Inc filed Critical Id Fish Technology Inc
Publication of PT1924252E publication Critical patent/PT1924252E/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria

Description

1
DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA MELHORAR A PERMEABILIDADE CELULAR A PARTÍCULAS ESTRANHAS"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e métodos para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas incluindo as sondas da presente invenção.
ANTECEDENTES
As células são as unidades básicas de todos os organismos vivos. O atributo comum de quase todas as células é que as mesmas são cercadas (ou delimitadas) por uma membrana citoplasmática. Esta membrana abriga o conteúdo interno da célula e regula o movimento de substâncias para dentro e para fora da célula. Apenas aquelas moléculas que se podem difundir através da membrana ou são transportadas através da mesma podem mover-se para dentro e para fora da célula. Algumas podem passar através do núcleo lipídico da membrana, mas outras têm de passar através de poros. Outras moléculas têm ainda de cruzar a membrana ligadas a transportadores de uma maneira dependente de energia. Do mesmo modo, o núcleo e outros organelos celulares têm membranas para regular o fluxo de moléculas para dentro e para fora do organelo. 2
Fixação é um processo químico que "coloca" moléculas celulares em posição de modo que a célula ou tecido possa então ser estudado. A maior parte dos agentes que são utilizados como fixadores (por exemplo, álcoois tais como etanol e aldeídos tais como paraformaldeído) funcionam pela reticulação das moléculas celulares, especialmente s proteínas. Este processo de reticulação evita a degradação da estrutura celular. Vários fixadores são mais adequados para a preservação de diferentes moléculas e estruturas celulares e para diferentes métodos de detecção. 0 fixador escolhido para qualquer finalidade particular será determinado pela natureza daquela finalidade.
Infelizmente, os métodos actuais de fixação muitas vezes dificultam a capacidade subsequente de um pesquisador ou médico clínico em detectar componentes celulares internos. Em outras palavras, a própria acção que evita a degradação da célula, a fixação, também pode interpor uma barreira aos muitos tipos de investigação e diagnóstico que se recorrem a moléculas de tamanhos maiores para detecção. Devido a isto, têm sido feitos esforços para permeabilizar células ou fazer canais após a fixação.
Os métodos actuais de permeabilização da membrana celular depois da fixação não são eficazes para todas as espécies, são muito rigorosos (destruindo, desse modo, as estruturas a serem estudadas) e/ou requerem equipamentos muito caros. Por exemplo, Hoffman, et al. Patente U.S. N° 6,835,393) divulgam a utilização de polímeros de ácido policarboxílico e pH para romper membranas celulares apenas para utilização em amostras não fixadas. Connelly, et al. (Patente U.S. Nos. 5 597 688 e 5 422 277) divulgam a 3 utilização de uma composição com ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfónico, ácido 2,4-dinitrobenzóico ou 2,4-dinitrofenol tanto para fixação e permeabilização, mas estas composições limitam a escolha do pesquisador ou médico clínico e, desse modo, limitam necessariamente a flexibilidade do ensaio. Métodos mecânicos, tais como sonicação, electroporação, etc., de um modo geral só funcionam em amostras não fixadas e requerem equipamentos caros.
Além disso, os métodos de pesquisa e diagnóstico disponíveis na técnica anterior para muitos alvos celulares tais como patologias dependem de avaliações microscópicas, parâmetros morfológicos celulares, características de coloração e a presença ou ausência de certos alvos. No entanto, muitos desses métodos de diagnóstico não são inteiramente precisos ou suficientemente sensíveis. 0 que é necessário são composições e métodos para a permeabilidade melhorada de membranas celulares de espécies a partículas estranhas tais como moléculas de detecção marcadas. Além disso, o que é necessário são composições e métodos para a detecção melhorada de alvos celulares e patogénios.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Numa forma de realização, a invenção permite a detecção do alvo ou fragmento do alvo, directamente a partir de células numa cultura de células ou espécime obtido de um doente, por meio de hibridação in situ. Numa forma de realização preferida, a célula é um patogénio. 0 método é compreendido de várias etapas que são realizadas, 4 preferencialmente, mas não necessariamente, na ordem listada. Uma amostra da cultura ou espécime é depositada sobre uma lâmina. A amostra é fixada sobre a lâmina por calor ou com um fixador padrão. 0 fixador pode ser, por exemplo, metanol, metanol ácido acético, acetona, formaldeido ou formalina. A amostra fixada é tratada com as soluções IDF (ver, Infra) , corada ou sondada e observada. Alternativamente, o espécime é misturado com solução IDF, incubado, depois espalhado ou então colocado sobre uma lâmina de vidro, seco ao ar e fixado. A solução IDF pode compreender qualquer combinação dos seguintes reagentes: sais caotrópicos (por exemplo, tiossulfato ou cloridrato de guanidina), detergentes iónicos (por exemplo, SDS) e/ou detergentes não iónicos (por exemplo, IPGEL, desoxicolato, colato ou sais biliares) ou outros reagentes com propriedades similares, metanol e ácido acético. A concentração de cada reagente na solução IDF depende, por exemplo, da parede celular do patogénio a ser detectado. Embora a presente invenção não esteja limitada por qualquer teoria ou mecanismo, acredita-se que a solução IDF faz "canais" na parede celular e/ou nas membranas (celular e nuclear) do patogénio. Estes canais permitem que uma sonda penetre a parede celular e membrana celular e entre no citoplasma e/ou no núcleo do patogénio. A sonda da presente invenção pode compreender ADN, ARN, ANP, péptido, glicopéptido, lipoproteína ou glicolipido ou uma mistura de qualquer um dos acima mencionados. Os alvos das células fixadas na amostra são postos em contacto com um complexo de sonda (o complexo de sonda compreende agentes de ligação específicos para o alvo) específico para o alvo em condições apropriadas para hibridação ou ligação (por exemplo: como 5 descrito na Patente U.S. N° 6 165 723, de Shah e Harris) . A sonda não hibridada ou não ligada pode então ser lavada a partir da amostra. Numa forma de realização, a amostra lavada pode então ser corada com um contra-corante apropriado (por exemplo, Evans Blue, DAPI, permanganato de potássio, etc.). 0 complexo de sonda hibridada ou ligada é visualmente detectado, por exemplo, por microscópio, com a presença do complexo de sonda sendo uma indicação da presença da célula alvo. O método pode ser realização com diferentes tampões de hibridação, vários exemplos dos quais são revelados nesse documento e na Patente U.S. N° 6 165 723 de Shah e Harris, que é aqui dada como incorporada por citação. 0 tampão de hibridação utilizado é determinado pela natureza da sonda utilizada. 0 método da presente invenção é útil para detectar células, constituintes celulares e, preferencialmente, patogénios num espécime. Complexos de sondas exemplificativos, específicos são revelados nesse documento que são úteis para detectar patogénios da espécie Mycobacteria.
Os métodos da presente invenção são úteis, por exemplo, na detecção de ácidos nucleicos, péptidos, glicopéptidos, lipopéptidos e glicolípidos de uma ampla variedade de espécimes. Espécimes exemplificativos incluem, por exemplo, células, tipos de células, tecidos ou um patogénio ou patogénios de interesse incluindo ou derivados, por exemplo, do soro, plasma, esputo, urina, fluidos cérebro-espinais, tecidos e leite materno. As composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados em espécimes provenientes de qualquer organismo incluindo mamíferos, répteis, peixes, pássaros, plantas e insectos. 6
Numa forma de realização, a presente invenção contempla uma composição (solução IDF) para aumentar a permeabilidade das paredes celulares, membranas celulares, membranas dos organelos e membranas nucleares, a referida composição compreendendo numa forma de realização: GuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sódio e desoxicolato de sódio. A presente invenção contempla ainda que o GuSCN está presente numa concentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 Μ; o Tris-HCL está presente numa concentração de aproximadamente 10 a 100 mM; o Tris-HCL está presente a um pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; o EDTA está presente numa concentração de aproximadamente 5 a 50 mM; o IGEPAL está presente numa concentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento; o ácido acético está presente numa concentração de aproximadamente 0,1 a 10,0 por cento; o metanol está presente numa concentração de aproximadamente 20 a 50 por cento; o colato de sódio está presente numa concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 por cento e o desoxicolato de sódio está presente numa concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 por cento.
Em outra forma de realização o tampão GuSCN é substituído pelo tampão GuHCL entre cerca de 2 M a 6 M. Ainda em outra forma de realização o IGEPAL é substituído por SDS entre cerca de 0,01% a 2,0%. Ainda em outra forma de realização o GuSCN é utilizado em conjunto com GuHCL e/ou IGEPAL é utilizado em conjunto com SDS.
Numa forma de realização, a presente invenção contempla um método para corar um alvo numa célula, que compreende: a) pôr a célula em contacto com uma composição que compreende 7
GuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol) , ácido acético, metanol e desoxicolato de sódio para criar uma célula permeabilizada; b) pôr a célula permeabilizada da etapa (a) em contacto com um agente de ligação especifico para ligação ao referido alvo; e, c) detectar o referido agente de ligação da etapa (b) .
Em outros aspectos, a invenção contempla que o alvo do método acima é seleccionado, por exemplo, de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptidicos, péptidos, glicoproteinas, lipidos, lipoproteinas, vírus, priões e micoplasma.
Em outras formas de realização, a presente invenção contempla que o agente de ligação é seleccionado de um grupo que consiste em ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptidicos, péptidos, glicoproteinas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos e lipidos. 0 agente de ligação da presente invenção pode compreender, adicionalmente, uma unidade de detecção e a unidade de detecção pode ser seleccionada de um grupo que compreende, por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos, corantes, metais coloidais, biotina/avidina, peroxidase do rábano silvestre, etc. Numa forma de realização preferida, a detecção é por meio de um anticorpo marcado com afinidade para o antigénio alvo. Um agente de ligação que compreende uma unidade de detecção é definido nesse documento como um complexo de sonda.
Numa forma de realização uma amostra clínica é tratada com solução IDF no tubo, seguido por ebulição para libertar o ácido nucleico na solução. Esta técnica é eficaz para alvos 8 tais como Mycobacteria, fungos e leveduras que requerem lise mecânica (por exemplo, por sonicação) ou incubações longas com enzimas para digerir as paredes celulares, por exemplo. 0 alvo de interesse pode ser ainda purificado por meio de (1) técnicas padrão de purificação de ADN ou (2) por hibridação sanduíche utilizando sondas específicas. 0 ADN e ARN alvos purificados podem então ser amplificados por PCR ou RT-PCR respectivamente, se necessários, antes da detecção.
Numa forma de realização mais preferida, o alvo é um ácido nucleico do microrganismo Mycobacterium tuberculosis e o agente de ligação é um oligonucleótido (ou sonda ANP) complementar aos ácidos nucleicos do microrganismo Mycobacterium tuberculosis.
Num outro aspecto, o método também compreende coloração de fundo para melhor destacar ou visualizar a unidade de detecção. As colorações de fundo e as técnicas de coloração são conhecidas dos especialistas na técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção tem por base a descoberta de um método melhorado para permitir que a sonda penetre a parede celular e/ou membrana celular de uma célula (por exemplo, um patogénio) para detectar directamente a presença de um alvo ácido nucleico, proteína, péptido, lipopéptido, glicopéptido, lípido, etc., em células provenientes de cultura ou de espécimes obtidos de um indivíduo (por exemplo, esfregaço de sangue, biopsias, tecidos embebidos em parafinas e carraças), por meio de hibridação in situ. O método da invenção é particularmente apropriado para detectar sequências de 9 nucleótidos específicas a patogénios que são encontrados, por exemplo, em esputo, sangue inteiro, fluido da espinha central (CSF), outros fluidos corporais ou tecidos infectados. Mais especificamente, são descritos novos melhoramentos dos métodos de fixação/pré-tratamento tradicionais os quais permitem que as sondas (por exemplo, sondas de oligonucleótidos) penetrem dentro das células (por exemplo, patogénios tais como bactérias, vírus, fungos, leveduras e protozoários), que podem estar localizadas dentro ou fora das células hospedeiras infectadas. Além disso, um procedimento com um contra-corante (por exemplo, DAPI, Evans Blue, permanganato de potássio) depois da hibridação com sonda marcada com fluorescência permite que os organismos que retêm as sondas hibridadas sejam facilmente visualizados em cultura ou amostras clínicas.
Os novos e únicos procedimentos de pré-tratamento de hibridação ín situ, técnicas de detecção e composições da presente invenção descritos nesse documento permitem a utilização de ADN recombinante, ARN, ANP, péptido, glicoproteínas, lípidos e sondas de glicolípidos em células, microrganismos ou secções de tecidos e é compatível com exame microscópico realizado rotineiramente em laboratórios de bacteriologia, parasitologia, histologia ou patologia. A presente invenção aplica, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico de sequência de nucleótido pré-determinada para a amostra celular (ou de tecido) e para o exame da amostra, por exemplo, por meio de microscopia, microscopia electrónica, citometria de fluxo ou imagem radioactiva (por exemplo, filme de raio-X, sistema de imagem por fósforo), para determinar que células (ou tecidos) na população contêm os alvos 10 específicos (por exemplo, sequências de ácido nucleico) de interesse. Desse modo, nos esfregaços de sangue inteiro infectado ou secções de tecidos, podem ser detectados organismos patogénicos tais como bactérias, vírus, protozoários ou fungos no interior das células infectadas. Tais protocolos proporcionam diagnóstico e informações científicas úteis uma vez que a presença ou a ausência de um ácido nucleico específico pode correlacionar com uma ou mais células de estrutura e morfologia observáveis e, desse modo, proporcionar uma base para diagnóstico e prognóstico clínicos. O método para detectar um fragmento de ácido nucleico alvo directamente de um espécime é compreendido de etapas que devem ser realizadas, preferencialmente, na ordem listada. Um espécime, geralmente obtido de um indivíduo, é primeiro depositado sobre uma lâmina. A amostra é fixada na lâmina com fixador (por exemplo, metanol, fixador metanol-ácido acético, ou um fixador formalina-ácido acético). Assim que a amostra está fixada, as células da amostra são permeabilizadas com as composições e métodos da presente invenção. Alternativamente, o espécime é misturado com solução IDF num tubo, incubado e depois depositado sobre uma lâmina, seco ao ar e fixado. Em seguida, as células são postas em contacto com uma sonda específica para o alvo em condições apropriadas para hibridação. etc.). Independentemente se a
Depois de um período adequado de hibridação qualquer sonda não hibridada é lavada da amostra. Numa forma de realização preferida, a amostra é então posta em contacto com um contra-corante (por exemplo, DAPI, Evans Blue, permanganato de potássio, 11 amostra foi contra-corada, as sondas que são hibridadas ao alvo da amostra são então detectadas visualmente, por exemplo, por microscopia. A presença de sonda no interior da amostra é uma indicação da presença do fragmento alvo. A contra-coloração da amostra concomitantemente ou sequencialmente com o ensaio de hibridação in situ da presente invenção melhora o método permitindo, por exemplo, uma determinação mais clara da localização do alvo no interior da amostra. Tais informações auxiliam, por exemplo, a proporcionar uma determinação mais clara da hibridação de fundo.
Este método é adequado para utilização com qualquer espécimen obtida de um indivíduo. Isto inclui sangue inteiro, soro, plasma, esputo, urina, leite materno, fluido cérebro-espinal e tecido. Este método é também adequado para a detecção de um patogénio ou outro alvo no interior das células de um insecto vector, células de insecto, células de plantas, fungos e bactérias. A finalidade de fixar células ou tecidos é imobilizar as células e preservar a morfologia das células ou tecido de modo que os constituintes das células tais como, por exemplo, ARN são retidos no interior da matriz celular durante a hibridação in situ. Desse modo, o método preferido utiliza um fixador que é capaz de preservar e reter os ácidos nucleicos da célula e ao mesmo tempo reticular e/ou precipitar as proteínas na matriz celular de tal modo que a célula ou tecido permanece substancialmente em configuração aberta para a penetração da sonda e subsequente hibridação.
Numa forma de realização preferida, as sondas da presente invenção compreendem, por exemplo, ácidos nucleicos 12 produzidos de forma sintética ou biológica (ADN, ARN, e equivalentes); ácidos nucleicos peptidicos (ANP; e equivalentes); péptidos (e equivalentes) que contêm ácido nucleico ou sequência de péptido especifica que hibridam sob condições restringentes com alvos celulares específicos. Em outra forma de realização, as sondas da presente invenção compreendem glicopéptidos produzidos de forma sintética ou biológica, lipopéptidos e priões ou moléculas similares a priões (ou os seus equivalentes) que se ligam sob condições restringentes a alvos específicos no interior da célula. 0 complexo de sonda é definido como uma sonda que compreende um grupo marcador adequado para detecção. Se a sonda for um ácido nucleico, o grupo marcador está ligado tanto à extremidade 5', a extremidade 3', internamente, como em qualquer combinação da mesma. O grupo marcador preferido é um marcador identificável tal como um rádio-marcador (por exemplo, p32, I125, H3) , um marcador de biotina ou um marcador fluorescente. Alternativamente, a sonda tem uma cauda de poli-desoxinucleótido marcada que é utilizada para a detecção do complexo de sonda. 0 complexo de sonda também pode ser compreendido de uma pluralidade de sequências de ácido nucleicos diferentes, ANP, péptidos, glicopéptidos, lipopéptidos ou priões ou qualquer combinação dos mesmos que compreende um ou mais marcados com um grupo marcador. Se uma ou mais das unidades de sonda forem marcadas pode ser benéfico marcar cada uma das unidades de sonda com um grupo marcadora diferente. A sequência de nucleótidos de uma sonda de oligonucleótidos é substancialmente complementar a pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. 0 ácido nucleico alvo é um 13 ácido nucleico normalmente presente no interior da célula fixada ou tecido, ou alternativamente, um que não está normalmente presente na célula ou tecido e está associado com um estado anormal ou patológico. Cada molécula do complexo de sonda é preferencialmente compreendida de um ADN ou fragmento de ARN que varia em tamanho de cerca de 10 a 50 nucleótidos.
As sondas de péptidos incluem, por exemplo, anticorpos e outras moléculas conhecidas de ligação a alvo definido ou série de alvos. Exemplos de sondas não-anticorpos incluem, por exemplo, enzimas e substratos de enzimas e as porções efectoras das mesmas. Além disso, fármacos ou químicos conhecidos podem selectivamente ligar-se a proteínas alvo (por exemplo, antibióticos podem ligar-se a bactérias). Os lipopéptidos, por exemplo, são úteis para a detecção de unidades lipídicas numa célula incluindo organelos específicos ou porções de organelos e bactérias internalizados numa célula. Os glicopéptidos, por exemplo, interferem com a agregação de plaquetas e, desse modo, podem ser utilizados para atingir células necessárias na função plaquetária, desse modo auxiliando na pesquisa e diagnóstico de anormalidades de coagulação. Os priões, ou porções dos mesmos, podem ser utilizados, por exemplo, como sondas para tecidos neurológicos. Do mesmo modo, os priões podem ser alvos em amostras fixadas.
Numa forma de realização preferida, a sonda é adicionada à amostra em excesso do alvo (por exemplo, 10:1, 100:1 ou 1000:1). Isto é para accionar a reacção de hibridação de forma eficaz e promover uma alta taxa de ligação sonda:alvo. 14 0 complexo de sonda (que compreende, por exemplo, ADN, ARN ou ANP) é posto em contacto com o alvo da amostra (por exemplo, ácidos nucleicos) da amostra fixada, em geral por meio da adição de uma solução de complexo de sonda na amostra. Condições exemplificativas apropriadas para hibridação são soluções que proporcionam o ambiente tamponado apropriado. Alguns exemplos de tampões de hibridação são: 1) um tampão que compreende entre cerca de 10% e 50% de formamida, 2X.SSC (pH 7,4), e 1% de NP40; 2) um tampão que compreende entre cerca de 1,5 M e 4 M de tampão GuSCN;
Tampão de reserva GuSCN 5 M é feito de GuSCN 5 M, Tris-HCl 100 mM (pH 7,8), EDTA 40 mM, 1% de NP40. Este tampão de reserva é diluído à molaridade indicada de GuSCN por meio da adição de lxTE pH 7,8 para produzir as molaridades do tampão GuSCN acima referidas. 3) um tampão que compreende entre cerca de 2 a 6 M de tampão GuHCl. O tampão de reserva GuHCl 8 M é feito de GuHCl 8 M, Tris-HCl 200 mM, (pH 7,8), EDTA 40 mM, 1% de NP40. Este tampão de reserva é diluído à molaridade indicada de GuHCl por meio da adição de lxTE pH 7,8 para produzir as molaridades do tampão GuHCl acima referidas. 15 4) um tampão que compreende uma mistura de formamida (20 - 50%) e tampão GuSCN (por exemplo, 0,5 M a 3 M) 5) um tampão que compreende uma mistura de tampão GuSCN, (por exemplo, 0,5 M a 3 M) e tampão GuHCL (por exemplo, 1 M a 5 M) A composição e a concentração especificas do tampão de hibridação variam com o tipo de sonda ou complexo de sonda utilizado. A composição e a concentração do tampão utilizado são, também, dependentes do Tm (ponto de fusão: a temperatura na qual o ADN de cadeia dupla separa-se formando duas cadeias simples complementares) da sonda, sequência da sonda, comprimento da sonda e temperatura de hibridação e podem ser determinadas por um especialista na técnica através do curso de não mais do que experimentação de rotina. A presente invenção não está limitada a qualquer temperatura de hibridação particular. No entanto, deve ser entendido que a utilização de formamida no tampão de hibridação permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito mais baixa do que os protocolos de hibridação padrão. Por exemplo, a hibridação de um complexo de sonda médio especificamente ao alvo (e não às células hospedeiras) em tampão de hibridação aquoso tal como cloreto de sódio exigiria, em geral, uma temperatura de cerca de 60 a 65 °C. A mesma hibridação realizada a cerca de 42 °C no fluido de hibridação 1) acima descrito, proporcionaria especificidade equivalente.
Do mesmo modo, a utilização de GuSCN também permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito mais 16 baixa do que os protocolos de hibridação padrão. Por exemplo, num procedimento médio, a hibridação da sonda especificamente ao alvo (e não às células hospedeiras) em tampão de hibridação aquoso tal como cloreto de sódio exigiria temperaturas de aproximadamente 60 a 65 °C. No entanto, a mesma hibridação realizada no tampão de hibridação GuSCN ou GuHCl acima descritos, a cerca de 37 °C proporcionará especificidade equivalente de hibridação.
Depois de a hibridação estar completa, a sonda não hibridada é lavada da amostra, em geral por meio da aplicação de uma série de lavagens com um tampão de lavagem. Está no âmbito dos especialistas na técnica determinar os tampões de lavagem e os tempos de lavagens apropriados. Numa forma de realização, o tampão de lavagem compreende cloreto de sódio 0,3 M, citrato de sódio 0,03 M, e 0,1% de SDS. Um outro tampão de lavagem apropriado compreende solução salina tamponada com fosfato (PBS).
Após a lavagem, a amostra pode ser contra-corada. Numa forma de realização, a contra-coloração do fundo aumenta a visualização das sondas hibridadas. Os contra-corantes preferidos são, por exemplo, DAPI, Evans Blue e permanganato de potássio. Outros contra-corantes apropriados são conhecidos dos especialistas na técnica. Esta etapa de coloração é em geral aplicada quando uma sonda com marcação fluorescente é utilizada para detectar ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas e lipoproteínas que são específicas para um alvo. Embora útil, os contra-corantes não são necessários para as formas de realização da presente invenção. 17 A sonda é detectada através de meios apropriados para a unidade especifica utilizada para marcar o complexo de sonda. 0 método preferido para detectar sondas com marcação fluorescente, por exemplo, emprega filtros microscópicos especiais verdes, vermelhos e azuis (isto é, microscopia fluorescente). Sondas rádio-marcadas hibridadas podem ser detectadas, por exemplo, por auto-radiografia, e fósforo-imagem. As sondas marcadas com biotina podem ser detectadas por sistemas de detecção enzimáticos e tais sistemas de detecção enzimáticos estão comercialmente disponíveis. 0 método descrito acima permite a detecção simultânea de patogénios diferentes numa única amostra clínica realizando uma reacção com um complexo de sonda que é compreendido de uma pluralidade de sequências de ácido nucleico diferentes, cada uma delas marcada com um grupo marcador diferente. Para a detecção simultânea de sondas de oligonucleótidos diferentes, que são específicas para os ácidos nucleicos diferentes dos diferentes alvos habitualmente presentes no espécime, as mesmas podem ser concebidas de tal modo que os valores do Tm (ponto de fusão) de todas as sequências do complexo de sonda sejam muito similares. Cada oligonucleótido específico é então marcado com uma unidade detectável diferente (por exemplo, unidades fluorescentes diferentes) . A hibridação é realizada com os componentes múltiplos do complexo de sonda. A amostra hibridada é processada conforme descrito acima e a amostra é observada por meios apropriados para a detecção dos diferentes oligonucleótidos marcados do complexo de sonda (por exemplo, observado utilizando filtros apropriados se 18 unidades fluorescentes apropriadas forem utilizadas) para detectar qual dos alvos está presente na amostra.
Será entendido pelos especialistas na técnica que o novo protocolo de pré-tratamento para utilização com o protocolo de hibridação in situ descrito nesse documento é compatível com todos os métodos anteriormente conhecidos de detecção, bem como aqueles descritos nesse documento e não é limitado pelo método de detecção utilizado. 0 protocolo de hibridação in situ foi optimizado de tal modo que menos manipulações são necessárias e pode, desse modo, ser realizado em pouco tempo. As formas de realização da presente invenção também abrangem kits que compreendem as composições da presente invenção. Tais composições quando proporcionadas na forma de um kit permitirão a prática de várias formas de realização dos protocolos apresentados nesse documento incluindo aqueles que foram optimizados para simplicidade e para compatibilidade com uma ampla variedade de métodos de detecção. Espera-se também que tais kits preparados contendo reagentes e sondas preparados especificamente serão aplicáveis em laboratórios clínicos/de diagnóstico, onde a capacidade de detectar a presença ou a ausência de ácidos nucleicos específicos serviria para identificar, de forma positiva ou negativa, estados patológicos caracterizados pela presença de alvos específicos.
Os métodos de diagnósticos disponíveis da técnica anterior para muitas patologias celulares dependem de avaliações microscópicas, parâmetros morfológicos celulares, características de coloração e da presença ou ausência de certos alvos. No entanto, muitos desses métodos de diagnósticos não são inteiramente precisos ou suficientemente 19 sensíveis. A hibridação in situ utilizando o protocolo acima descrito e sondas específicas para patogénio permitirão a identificação mais fácil e mais exacta de alvos (incluindo, mas não limitado a patogénios) em amostras. A presente invenção proporciona um protocolo de pré-tratamento simples para utilização em protocolos de hibridação in situ que proporciona penetração melhorada de sonda dentro de células e, desse modo, melhora as características de hibridação e detecção em comparação com protocolos anteriormente descritos. As melhoras incluem maximizar a sensibilidade do ensaio por meio do aumento da eficiência de hibridação e detecção de "sinal" específico. Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular, acredita-se que a sensibilidade aumentada é devido à hibridação melhorada devido à penetração melhorada da sonda dentro das células e, ao mesmo tempo, retenção maximizada do alvo (por exemplo, sequências de ácido nucleico) na célula ou tecido e maximização da preservação das outras características bioquímicas e morfológicas da amostra da célula ou tecido.
PARTE EXPERIMENTAL
Uma utilização preferida não limitativa do método acima descrito é a detecção de Mycobacteríum tuberculosis proveniente de uma cultura ou de esputo. Será entendido e considerado por um especialista na técnica que a nova metodologia é igualmente aplicável a uma ampla variedade de outros sistemas, células, culturas de tecidos e tecidos para hibridação de ácidos nucleicos específicos (ou detecção de 20 outros componentes celulares das células alvo, tecidos ou patogénios) de interesse com preservação concomitante da integridade e morfologia celular.
Exemplo A cultura ou esputo processado do doente foi espalhada sobre uma placa de vidro e seca ao ar. As células cultivadas foram lavadas e concentradas por centrifugação. As células lavadas foram suspensas em tampão fosfato com BSA. Para tornar as células inactivas as células suspensas foram fervidas durante 15 minutos a 100 °C. Método 1 de Preparação de Amostra O esputo foi processado tanto por 1) NALC/NaOH ou 2) NALC/NaOH seguido por ebulição do esputo processado durante 15 minutos a 100 °C para tornar a amostra inactiva ou 3) com uma solução caotrópica tal como cloridrato ou tiossulfato de guanidina (em resumo, foram misturados 2 a 3 volumes de GuSCN 5 M ou GuHCL 8 M para esputo). A amostra foi incubada a 37 °C durante 20 minutos. A amostra foi centrifugada para granular as células. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato. As células lavadas foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato com 1% de BSA ou 4) uma solução caotrópica tal como cloridrato ou tiossulfato de guanidina seguido por ebulição (o mesmo que a etapa 3, acima) excepto que as células suspensas em solução salina tamponada com fosfato com 1% de BSA são fervidas durante 15 minutos a 100 °C para matar a Mycobacteria. A cultura preparada ou a 21 amostra de esputo foi então espalhada sobre uma lâmina de vidro e seca ao ar. A amostra foi fixada por metanol ou metanol-ácido acético ou etanol. 0 esfregação fixado foi tratado com a solução IDF (conforme revelado supra) durante 10 minutos. Depois de 10 minutos o esfregaço foi lavado 3 vezes com PBS e seco ao ar. Método 2 de Preparação de Amostra
Um volume de um esputo não processado de um doente foi misturado com dois volumes de solução IDF (supra) num tubo e incubado à temperatura ambiente (20 a 25 °C) durante 15 minutos. A mistura de esputo-IDF foi então espalhada sobre uma lâmina de vidro, seca ao ar e fixada com metanol. 0 tratamento com IDF do esfregaço fixado antes da hibridação foi omitido. Antes da hibridação a lâmina foi lavada três vezes com PBS. Método 3 de Preparação de Amostra A mistura de esputo-IDF fixada com etanol sobre uma lâmina de vidro foi tratada com 2% de glutaraldeido em PBS durante 5 minutos a uma temperatura de 20 a 25 °C (temperatura ambiente), depois lavada três vezes com PBS e seca ao ar. O tratamento com IDF do esfregaço fixado antes da hibridação foi omitido. Método 4 de Preparação de Amostra
Um volume de um esputo não processado de um doente foi misturado com dois volumes de solução IDF (supra) num tubo e 22 incubado à temperatura ambiente (20 a 25 °C) durante 15 minutos. A mistura de esputo-IDF é fervida durante 15 minutos para libertar ácidos nucleicos em solução e ao mesmo tempo tornar a amostra não infecciosa. Os ácidos nucleicos podem ser purificados por técnicas padrão a partir da amostra fervida ou o ácido nucleico alvo de interesse pode ser seleccionado por hibridação sanduíche utilizando sondas específicas e pérolas magnéticas, conforme descrito por Shah et al. (Shah J. S., King W., Liu J., Smith J., Serpe G. e Popoff S. e (1997). Assay improvements, Patente U.S. N° 5, 629, 156) que é aqui dada como incorporada por citação) . O alvo purificado pode ser amplificado por PCR (para um alvo de ADN) ou RT-PCR (para um alvo de ARN).
Sondagem das Amostras
Uma sonda de oligonucleótido compreendida de uma sequência de ADN que especificamente híbrida ao RNA ribossómico 23 S de Mycobacterium tuberculosis, conforme descrito por Shah, Nietupski e Liu (Patente U.S. N° 5,521,300) é de preferência utilizada na detecção da presença de M. tuberculosis em células. Exemplos de um complexo de sonda adequado são:
PI. Sonda TB 5'-Rhodamin Green-AGA-ACA-CGC-CAC-TAT-TCA-CAC-GCG-CGT-ATG-C-3' [SEQ ID NO: 1] 66.5c P2 - Tb-1 51-2c 5'-Rhodamin Green-TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3' [SEQ ID NO: 2] 23 Ρ3. Sonda de Mycobacterium 5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-3' [SEQ ID NO: 3] 68.7c P4 - género Mycobacterium -54.1c 5’-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ ID NO: 4] P5 - Sonda de Burkholderia 5'-FAM-CTT-GGC-TCT-AAT-ACA-GTC-GG-S' [SEQ ID NO: 5] tm52c
Sonda de ANP.
Numa forma de realização, este complexo de sonda foi posto em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada/pré-tratada num tampão de hibridação de GuSCN 2,5 M, Tris 50 mM (pH 7,8), EDTA 20 mM, e 1% de NP40, a 37 °C. Numa forma de realização alternativa, este complexo de sonda foi posto em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada num tampão de hibridação de 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), EDTA 20 mM, e 1% de NP40, a 42 °C.
Exemplos de sequências de oligonucleótidos adequadas para utilização em complexos de sonda alternativos para a detecção de espécies de Mycobacteria são: P2 - Tb-1 51-2c 5'-Rhodamin Green-TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-S' [SEQ ID NO: 2] 24 Ρ3. Sonda de Mycobacterium 5' -Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-3 ' [SEQ ID NO: 3] 68.7c P4 - género Mycobacterium -54.1c 5'-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ ID NO: 4]
As SEQ ID NOs: 3 e 4 e os seus complementos, são adequadas para a detecção de Mycobacteria sp. As SEQ ID NOs: 1 e 2 e os seus complementos, são adequadas para a detecção M. tuberculosis. A SEQ ID NO: 5 é adequada para a detecção de
Burkholderia sp. A sequência de ARN ribossómico é seleccionada para utilização na detecção dos patogénios de Mycobacteria devido à alta abundância de ARNr nas células bacterianas (1.000-10.000 cópias). Preferencialmente, o oligonucleótido do complexo de sonda é um ADN com uma sequência complementar ao ARNr de M. tuberculosis. O oligonucleótido é preferencialmente marcado na extremidade 3' e 5' com fluoresceína. Será entendido que uma sonda de oligonucleótido de ARN também pode ser utilizada.
Conforme discutido acima, a quantidade da sonda total é uma quantidade predeterminada que deve exceder a quantidade estimada do ARNr disponível que se acredita estar no interior da amostra (cerca de 100:1) a fim de accionar a reacção de hibridação de forma eficaz e para promover uma alta taxa de emparelhamento de sonda:alvo. Em termos quantitativos, isto requer que a sonda compreendida de um oligonucleótido com 30 nucleótidos de comprimento seja utilizada em concentrações 25 que variam de 1 a 10 pg/mL para produzir sinal fiável acima do fundo.
Deve ser entendido que a utilização de GuSCN também permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito mais baixa do que os protocolos de hibridação padrão. A hibridação da sonda especificada especificamente ao alvo (e não às células hospedeiras) em fluido de hibridação aquosa tal como cloreto de sódio exigiria uma temperatura de cerca de 60 a 65 °C. No entanto, a hibridação realizada no tampão de hibridação GuSCN ou GuHCL acima descritos em cerca de 37 °C assegura especificidade.
Uma das vantagens do método de hibridação in situ é que números relativamente pequenos de células compreendem uma amostra e grandes números de amostras idênticas podem ser processadas durante um curto período de tempo. O método único de hibridação in situ descrito é extremamente simples. Os métodos da presente invenção também podem ser aplicados a qualquer tipo de amostra, incluindo, sem limitação, secções de tecido embebidas em parafina, amostras fixadas em acetona.
Os resultados desses experimentos mostram a detecção do alvo (ADN do patogénio) nas amostras testadas e a não detecção do alvo em amostras de controlo. A detecção do alvo é consistentemente melhor nas amostras tratadas com as soluções IDF da presente invenção. Um especialista na técnica apreciará, entenderá e saberá que as soluções IDF da presente invenção podem ser utilizadas em qualquer situação que exija a entrada efectiva de uma sonda (ou outro objecto similar) dentro de uma célula, patogénio (por exemplo, localizado numa célula) ou organelo, sem experimentação indevida. 26
Deve ficar evidente a partir do precedente que a presente invenção proporciona composições e métodos para aumentar a permeabilidade de células, paredes celulares, membranas celulares, organelos e membranas de organelos para auxiliar, por exemplo, na detecção de componentes celulares e/ou patogénios. 27
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de Patente citados na descrição • US 6835393 B, Hoffman [0005] • US 5597688 A, Connelly [0005] • US 5422277 A [0005] • US 6165723 A, Shah and Harris [0008] • US 5629156 A [0047] • US 5521300 A, Shah, Nietupski and Liu [0048]

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para aumentar a permeabilidade de paredes celulares, membranas celulares e membranas nucleares, a referida composição compreendendo: GuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sódio e desoxicolato de sódio.
2. Composição de acordo com a Reivindicação 1, em que: a) o referido GuSCN está presente numa concentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 M; e/ou b) o referido Tris-HCL está presente numa concentração de aproximadamente 10 a 100 mM; e/ou c) o referido Tris-HCL está presente a um pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; e/ou d) o referido EDTA está presente numa concentração de aproximadamente 5 a 50 mM; e/ou e) o referido IGEPAL está presente numa concentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento; e/ou f) o referido ácido acético está presente numa concentração de aproximadamente 1,0 a 10 por cento; e/ou g) o referido metanol está presente numa concentração de aproximadamente 20 a 50 por cento; e/ou h) o referido colato de sódio está presente numa concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 por cento; e/ou 2 i) o referido desoxicolato de sódio está presente numa concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 por cento.
3. Método de coloração de um alvo numa célula, que compreende: a) pôr a célula em contacto com uma composição que compreende GuSCN (tiocianato de guanidina), Tris- HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sódio e desoxicolato de sódio para criar uma célula permeabilizada; b) pôr a célula permeabilizada da etapa (a) em contacto com um agente de ligação especifico para ligação ao referido alvo; e, c) detectar o referido agente de ligação da etapa (b).
4. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido alvo é seleccionado de um grupo que consiste em ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptidicos, péptidos, glicoproteinas, lipidos, lipoproteinas, vírus e priões.
5. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido agente de ligação é seleccionado de um grupo que consiste em ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptidicos, péptidos, lipoproteinas, glicoproteinas e lipidos; e/ou o referido agente de ligação adicionalmente compreende um grupo de detecção; e em que em cujo caso opcionalmente 3 o grupo de detecção é seleccionada de um grupo que consiste em marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos, corantes, metais coloidais, biotina/avidina e peroxidase de rábano silvestre.
6. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que a referida detecção é feita por meio de um anticorpo marcado com afinidade para o referido agente de ligação.
7. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que a composição compreende a composição de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2.
8. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido alvo é um ácido nucleico do microrganismo Mycobacterium tuberculosis
9 . Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido agente de ligação é um oligonucleótido complementar a um ácido nucleico do microrganismo Mycobacterium tuberculosis.
10. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido método compreende adicionalmente uma coloração de fundo.
PT06788834T 2005-07-28 2006-07-27 Método para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas PT1924252E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70332905P 2005-07-28 2005-07-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1924252E true PT1924252E (pt) 2011-12-16

Family

ID=37709226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT06788834T PT1924252E (pt) 2005-07-28 2006-07-27 Método para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8632963B2 (pt)
EP (1) EP1924252B1 (pt)
JP (1) JP5132557B2 (pt)
CN (1) CN101272773A (pt)
AT (1) ATE523193T1 (pt)
AU (1) AU2006275632B2 (pt)
BR (1) BRPI0615958B8 (pt)
CA (1) CA2641599C (pt)
CY (1) CY1111959T1 (pt)
DK (1) DK1924252T3 (pt)
ES (1) ES2372538T3 (pt)
PL (1) PL1924252T3 (pt)
PT (1) PT1924252E (pt)
SI (1) SI1924252T1 (pt)
WO (1) WO2007016379A2 (pt)
ZA (1) ZA200801859B (pt)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8758990B2 (en) * 2005-07-28 2014-06-24 Id-Fish Technology, Inc. Methods for detecting and differentiating Mycobacterium genus and Mycobacterium avium complex in a sample or culture
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8323901B2 (en) * 2006-11-30 2012-12-04 Id-Fish Technology, Inc. Nucleic acid probes and methods for detecting plasmodium parasites
US7927801B2 (en) 2006-11-30 2011-04-19 Id-Fish Technology, Inc. Nucleic acid probes and methods for detecting Plasmodium parasites
JP5241100B2 (ja) * 2006-12-28 2013-07-17 シスメックス株式会社 抗原賦活化液、抗原賦活化方法及び細胞の検出方法
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
ES2552858T3 (es) * 2007-10-01 2015-12-02 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Recogida de muestras biológicas y sistema de transporte y métodos de uso
WO2010064146A2 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
IN2012DN00720A (pt) 2009-07-06 2015-06-19 Ontorii Inc
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
RU2014105311A (ru) 2011-07-19 2015-08-27 Уэйв Лайф Сайенсес Пте. Лтд. Способы синтеза функционализованных нуклеиновых кислот
PT2872485T (pt) 2012-07-13 2021-03-05 Wave Life Sciences Ltd Grupo auxiliar assimétrico
SG11201500243WA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Shin Nippon Biomedical Lab Ltd Chiral nucleic acid adjuvant
CA2878945A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Wave Life Sciences Pte. Ltd. Chiral control
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
CN106068325B (zh) 2014-01-16 2021-07-09 波涛生命科学有限公司 手性设计
CN107367417B (zh) * 2017-07-14 2021-06-22 上海市松江区中心医院 一种超声引导下穿刺细胞快速固定剂组合物及其制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5521300A (en) * 1991-08-13 1996-05-28 Norval B. Galloway Oligonucleotides complementary to mycobacterial nucleic acids
US5422277A (en) * 1992-03-27 1995-06-06 Ortho Diagnostic Systems Inc. Cell fixative composition and method of staining cells without destroying the cell surface
JPH08503606A (ja) * 1992-10-09 1996-04-23 アモコ・コーポレーション 検定法
US6538107B1 (en) * 1994-09-30 2003-03-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. G protein coupled receptor protein production, and use thereof
US6720355B2 (en) * 1997-02-21 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Sodium dodecyl sulfate compositions for inactivating prions
DE69941447D1 (de) * 1998-01-05 2009-11-05 Univ Washington Erhöhter transport unter benutzung membranzerstörender stoffe
US5985571A (en) * 1998-02-04 1999-11-16 Ludwig Institute For Cancer Research Method for determining multiple myeloma by assaying for expression of mage genes
PT1080228E (pt) * 1998-05-18 2010-07-22 Igenex Inc MéTODO DE HIBRIDAÆO IN SITU PARA A DETECÆO DE áCIDO NUCLEICO ALVO
WO2005054466A2 (en) * 2003-07-25 2005-06-16 Ambion, Inc. Methods and compositions for preparing rna from a fixed sample
US7130725B2 (en) * 2004-12-17 2006-10-31 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method for correcting control surface angle measurements in single viewpoint photogrammetry

Also Published As

Publication number Publication date
EP1924252B1 (en) 2011-09-07
SI1924252T1 (sl) 2011-12-30
CN101272773A (zh) 2008-09-24
JP2009502177A (ja) 2009-01-29
US8632963B2 (en) 2014-01-21
BRPI0615958B1 (pt) 2020-11-10
AU2006275632A1 (en) 2007-02-08
EP1924252A2 (en) 2008-05-28
WO2007016379A3 (en) 2007-07-12
DK1924252T3 (da) 2011-11-14
CA2641599A1 (en) 2007-02-08
CA2641599C (en) 2012-07-10
EP1924252A4 (en) 2010-03-17
ATE523193T1 (de) 2011-09-15
ES2372538T3 (es) 2012-01-23
WO2007016379A2 (en) 2007-02-08
JP5132557B2 (ja) 2013-01-30
ZA200801859B (en) 2009-07-29
BRPI0615958B8 (pt) 2021-05-25
CY1111959T1 (el) 2015-11-04
BRPI0615958A2 (pt) 2011-05-31
AU2006275632B2 (en) 2011-11-03
US20070042358A1 (en) 2007-02-22
PL1924252T3 (pl) 2012-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT1924252E (pt) Método para melhorar a permeabilidade celular a partículas estranhas
ES2344873T3 (es) Procedimiento de hibridacion in situ para detectar un acido nucleico diana.
JP3934605B2 (ja) 感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法
JPH10503655A (ja) ミコバクテリアの検出
JPH07177900A (ja) 水性懸濁液中でのインサイチューハイブリダイゼーションによる迅速微生物診断方法
US8758990B2 (en) Methods for detecting and differentiating Mycobacterium genus and Mycobacterium avium complex in a sample or culture
JPWO2002101037A1 (ja) 食細胞機能の評価方法およびその利用
US20050170346A1 (en) Method and a kit for determination of a microbial count
JP2010515451A (ja) 大腸菌検出用ｄｎａチップ
US5358846A (en) Methods for diagnosing infectous diseases and methods for detecting and identifying microorganisms
CN112239776A (zh) 一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法及试剂盒
MX2008001353A (en) Method for improving cell permeability to foreign particles
JP4104377B2 (ja) シュードモナス・アエルギノーザ菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法
WO2014093291A1 (en) Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
CN109797202A (zh) 一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法
JP2010515452A (ja) スタフィロコッカス・アウレウス検出用ｄｎａチップ
Rajesh et al. In Situ Hybridisation-A Review
Kit DNA PROBE HYBRIDIZATION/DETECTION SYSTEM IN SITU KIT
PT103767A (pt) Sonda de ácido péptido nucleico (pna), estojo e método para detecção específica de helicobacter pylori e respectivas aplicações.
JP2004173626A (ja) エシェリヒアコリ菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法
JP2003247994A (ja) 標的核酸の検出方法
JP2003247998A (ja) 標的核酸の検出方法