BRPI0615958A2 - composição para aumentar a permeabilidade de paredes celulares, membranas celulares e membranas nucleares e método para detectar um alvo em uma célula - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçãO PARA AUMENTAR A PERMEABILIDADE DE PAREDES CELULARES, MEMBRANAS CELULARES E MEMBRANAS NUCLEARES E MéTODO PARA DETECTAR UM ALVO EM UMA CéLULA A presente invenção provê um método para permitir que partículas externas penetrem, mais eficientemente, à parede celular, membrana celular, membrana de organelas e/ou membrana nuclear de uma célula e que hibridize ou se ligue a um alvo complementar na célula. As células podem ser de uma cultura ou a partir de uma espécie obtida a partir de um paciente. A partícula externa pode ser uma sonda consistindo de, por exemplo, tanto individualmente quanto em qualquer combinação de dois ou mais de: DNA, RNA, ácidos nucléicos de peptídeos (PNA), glicopeptídeos, lipopeptídeos, glicolipidios e prions. O alvo é uma célula, um componente celular ou, preferivelmente, um patógeno ou componente de patógeno. O patógeno pode ser, por exemplo, bactéria, fungo, levedura ou vírus.

Description

"COMPOSIÇÃO PARA AUMENTAR A PERMEABILIDADE DE PAREDESCELULARES, MEMBRANAS CELULARES E MEMBRANAS NUCLEARES EMÉTODO PARA DETECTAR UM ALVO EM UMA CÉLULA" .Campo da invenção
A presente invenção refere-se a composições e métodospara melhorar a permeabilidade celular para partículasexternas incluindo as sondas da presente invenção.Histórico da invenção
As células são unidades básicas de todos os organismosvivos. Um atributo comum de quase todas as células é queelas são cercadas (ou delimitadas) por uma membranacitoplasmática. Esta membrana abriga o conteúdo internoda célula e regula o movimento de substâncias dentro efora da célula. Apenas aquelas moléculas que podemdifundir através da membrana ou são transportadas atravésdela podem mover-se dentro e fora da célula. Algumaspodem passar através do núcleo dos lipídios da membrana,mas outras devem passar através de poros. Outrasmoléculas devem ainda, cruzar a membrana ligada aos transportadores de maneira dependente de energia. Damesma forma, os núcleos e outras organelas celulares temmembranas para regular o fluxo de moléculas dentro e forada organela.
Fixação é um processo químico que "coloca" moléculascelulares em. um lugar de modo que a célula ou o tecidopossa então ser estudado. Muitos agentes que sãoutilizados como fixadores/fixantes (por exemplo, álcooistais como etanol e aldeídos tais como paraformaldeídos)trabalham através da reticulação das moléculas celulares,especialmente proteínas. Este processo de reticulaçãoprevine a degradação da estrutura celular. Váriosfixantes são mais adequados para a preservação demoléculas e diferentes estruturas celulares ou paradiferentes métodos de detecção. A escolha do fixante paraqualquer propósito particular será determinada através danatureza daquele propósito.
Infelizmente, os métodos atuais de fixação confundem,freqüentemente, a capacidade subseqüente de umpesquisador ou de um médico em detectar componentescelulares internos. Em outras palavras, a ação completaque previne a degradação da célula, fixação, também podecolocar uma barreira para muitos tipos de pesquisas e dediagnósticos que contam com a detecção de moléculas comgrandes tamanhos. Devido a isto, esforços têm sido feitospara permeabilizar as células ou fazer canais após afixação.
Métodos atuais de permeabilização da membrana celularapós a fixação não são eficazes para todas as espécies,são muito rigorosos (destruindo, assim, as estruturas aserem estudadas) e ou requerem equipamentos muito caros.Por exemplo, Hoffman, et al. (Patente U.S. No. 6,835,393)descreve o uso de polímeros de ácido policarboxílico e pHpara ruptura da membrana celular apenas para uso emamostras não fixadas. Connelly, et al., patentes U.S.Nos.: 5,597,688 e 5,422,277) descrevem o uso de umacomposição com o ácido sulfônico 2,4-dinitrobenzeno,ácido 2,4-dinitrobenzóico ou 2,4-dinitrofenol tanto parafixação quanto permeabilização da membrana celular, masestas composições limitam a escolha dos pesquisadores oudos médicos para o fixante e, assim, limitam aflexibilidade dos ensaios necessários. Os métodosmecânicos tais como sonicação, eletroporação, etc.,trabalham apenas usualmente, em amostras não fixadas erequerem equipamentos muito caros.
Além disso, os métodos de pesquisa e de diagnósticosdisponíveis da técnica anterior para muitos alvoscelulares, tais como patologias dependem das avaliaçõesmicroscópicas, parâmetros morfológicos celulares,características de coloração e da presença ou da ausênciade determinados alvos. Entretanto, muitos destes métodosde diagnóstico não são apurados ou suficientementesensíveis.
o que é necessário são composições e métodos para umapermeabilidade aperfeiçoada das membranas celulares dosespécimes para partículas externas, tais como moléculasde detecção marcadas. Além disso, o que é necessário sãocomposições e métodos para a detecção melhorada de alvoscelulares e de patógenos.
Sumário da invenção
Em uma configuração, a invenção permite a detecção de umalvo ou de um fragmento de alvo, diretamente a partir dascélulas em uma cultura de célula ou em um espécime obtidode um paciente, através de hibridização in si tu. Em umaconfiguração preferida, a célula é um patógeno. 0 métodoé compreendido de várias etapas que são realizadas,preferivelmente, mas não necessariamente, em uma listaordenada. Uma amostra de cultura ou de espécime édepositada sobre uma lâmina. A amostra é fixada sobre alâmina tanto por aquecimento quanto por um fixadorpadrão. 0 fixador pode ser, por exemplo, metanol, ácidoacético de metanol, acetona, formaldeído ou formalina. Aamostra fixada é tratada com as soluções IDF (ver,infra), corada ou sondada e observada. Alternativamente,o espécime é misturado com a solução IDF, incubada, entãountada ou de outro modo colocada sobre uma lâmina devidro, seca ao ar e fixada. A solução IDF podecompreender qualquer combinação dos reagentes a seguir:sais caotrópicos (por exemplo, tiosulfato de guanidina ouhidrocloreto) , detergentes iônicos (por exemplo, SDS)e/ou detergentes não iônicos (por exemplo, IPGEL,deoxicolato, colato ou sais biliares) ou outros reagentescom propriedades similares, metanol e ácido acético. Aconcentração de cada reagente na solução IDF depende, porexemplo, da parede celular do patógeno a ser detectado.
Apesar da presente invenção não estar limitada a qualquerteoria ou mecanismo, acredita-se que a solução IDF faz"canais" na parede celular e/ou nas membranas (celular ounuclear) do patógeno. Estes canais permitem que uma sondapenetre na parede celular e na membrana celular e entremno citoplasma e/ou no núcleo do patógeno. A sonda dapresente invenção pode compreender DNA, RNA, PNA,peptídeo, glicopeptídeo, lipoproteína, ou glicolipídeo ouuma mistura de qualquer um dos acima. Os alvos dascélulas fixadas na amostra são contatados com um complexode sonda (o complexo de sonda compreende agentes deligação específicos para o alvo) específico para o alvosob condições apropriadas para hibridização ou paraligação (por exemplo: como descrito na patente U.S. No.:6,165,723 de Shah e Harris, a qual é incorporada aqui porreferência). Sondas não-hibridizadas ou não-ligadas podementão ser lavadas a partir da amostra. Em umaconfiguração, a amostra lavada pode então ser corada comum contra-corante apropriado (por exemplo, Evans Blue,DAPI, permanganato de potássio, etc..). 0 complexo desonda hibridizada ou ligada é visualmente detectado por,por exemplo, microscópio, com a presença do complexo desonda sendo uma indicação da presença da célula alvo. 0método pode ser realizado com tampão de hibridizaçãodiferente, vários exemplos não-limitantes, estãodescritos aqui e na patente U.S. No.: 6,165,724 de Shah eHarris, a qual é incorporada aqui por referência. 0tampão de hibridização utilizado é determinado através danatureza da sonda utilizada. 0 método da presenteinvenção é útil para detectar as células, osconstituintes celulares e, preferivelmente, patógenos emum espécime. Exemplos, de complexos de sonda específicosnão limitantes estão descritos aqui e são úteis paradetectar os patógenos das espécies de Mycobacteria.Os métodos da presente invenção são úteis, por exemplo,na detecção dos ácidos nucléicos, peptídeos,glicopeptídeos, lipopeptídeos e glicolipídios a partir deuma ampla variedade de espécimes. Exemplos dos espécimesincluem, por exemplo, células, tipos de célula, tecidosou um patógeno ou patógenos de interesse incluindo ouderivados de, por exemplo, soro, plasma, saliva, urina,fluidos espinal cerebral, tecidos e leite de peito. Ascomposições e os métodos da presente invenção podem serutilizados em qualquer espécime de organismo incluindo,mas não limitado a, mamíferos, répteis, peixes, pássaros,plantas e insetos.
Em uma configuração, a presente invenção contempla umacomposição (solução IDF) para aumentar a permeabilidadeda parede celular, membranas celulares, membranas deorganelas e membranas nucleares, a referida composiçãocompreendendo em uma configuração: GuSCN (tiocianato deguanidina), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etileneoxi)etanol), ácido acético, metanol, colatode sódio e deoxicolato de sódio. A presente invençãocontempla ainda que o GuSCN está em uma concentração deaproximadamente 2,0 a 3,3 Μ; o Tris-HCL está em umaconcentração de aproximadamente 10 a 100 mM; o Tris-HCLtem um pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; o EDTA está emuma concentração de aproximadamente 5 a 50 mM; o IGEPAlestá em uma concentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 porcento; o ácido acético está em uma concentração deaproximadamente de 0,1 a 10,0 por cento; o metanol estáem uma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento;o colato de sódio está em uma concentração deaproximadamente 0,02 a 2,5 por cento e o deoxicolato desódio está em uma concentração de aproximadamente 0,02 a2,5 por cento.
Em uma outra configuração o tampão de GuSCN é recolocadocom o tampão GuHCL entre cerca de 2M a 6M. Ainda em umaoutra configuração IGEPAL é recolocado com SDS entrecerca de 0,01% a 2,0%. Ainda em uma outra configuraçãoGuSCN é utilizada em conjunto com GuHCL e/ou IGEPAL éutilizado em conjunto com SDS.
Em uma configuração, a presente invenção contempla ummétodo para corar um alvo em uma célula, compreendendo:
a) contatar a célula com uma composição compreendendoGuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL(octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol), ácido acético,metanol e deoxicolato de sódio para criar uma célulapermeabi1i zada;
b) contatar a célula permeabilizada da etapa (a) com umagente ligante específico para se ligar ao referido alvo;e
c) detectar o referido agente ligante da etapa (b).Em outros aspectos, a invenção contempla que o alvo dométodo acima é selecionado de, por exemplo, ácidosnucléicos, ácidos nucléicos de peptídeos, peptídeos,glicoproteínas, lipídios, lipoproteínas, vírus, prions emicoplasma.
Em outras configurações, a presente invenção contemplaque os agentes de ligação são selecionados do grupoconsistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicos depeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, glicoproteínas,anticorpos ou fragmentos de anticorpos e lipídios.
O agente de ligação da presente invenção pode compreenderadicionalmente uma porção de detecção e, a porção dedetecção pode ser selecionada de um grupo compreendendo,por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadoresradioativos, corantes, metais coloidais, biotina/avidina,peroxidase de rábano silvestre, etc.. Em uma configuraçãopreferida, a detecção é via um anticorpo marcado comafinidade para o antígeno alvo. Um agente de ligaçãocompreendendo uma porção de detecção é definida aqui comoum complexo de sonda.
Em uma configuração uma amostra clínica é tratada com asolução IDF no tubo, seguido por ebulição para liberar oácido nucléico na solução. Esta técnica é eficaz paraalvos tais como micobactérias, fungos e leveduras querequerem Iise mecânica (por exemplo, através desonicação) ou incubações longas com enzimas para digerira parede celular, por exemplo. 0 alvo de interesse podeser purificado adicionalmente por (1) técnicas depurificação de DNA padrão ou (2) por hibridizaçãosanduíche usando sondas específicas. O DNA e o RNA alvopurificado podem então ser amplificados por PCR ou RT-PCRrespectivamente, se necessário, antes da detecção.
Em uma configuração mais preferida, o alvo é um ácidonucléico a partir do microorganismo Mycobacteriumtuberculosis e o agente de ligação é um oligonucleotídeo(ou sonda PNA) complementar aos ácidos nucléicos a partirdo microorganismo Mycobacterium tuberculosis.Em um outro aspecto, o método também compreende coloraçãoprofunda para melhor destacar ou visualizar a porção dedetecção. As colorações profundas e as técnicas decoloração são conhecidas daqueles técnicos no assunto.Descrição detalhada da invenção
A presente invenção é baseada na descoberta de um métodomelhorado para permitir que a sonda penetre na paredecelular e/ou na membrana celular de uma célula (porexemplo, um patógeno) para detectar diretamente apresença de um ácido nucléico alvo, proteína, peptídeo,lipopeptídeo, glicopeptídeo, lipidio, etc., em células apartir da cultura ou a partir de espécimes obtidas apartir de um indivíduo (por exemplo, esfregaço de sangue,biópsia, tecidos e pintas embebidos em parafina), porhibridização in si tu. 0 método inventado é,particularmente, bem apropriado para detecção deseqüências de nucleotídeos específicas para os patógenosque são encontrados dentro, por exemplo, da saliva, todoo sangue, fluido da espinha central (CSF), outros fluidoscorpóreos ou tecidos infectados. Mais especificamente,novos melhoramentos de métodos de fixação/pré-tratamentotradicionais são descritos, os quais permitem que assondas, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos penetremdentro das células (por exemplo, de patógenos tais comobactérias, vírus, fungos, leveduras e protozoários), osquais podem estar localizados tanto dentro, quanto forade células hospedeiras infectadas. Em adição, umprocedimento com um contra-corante (por exemplo, DAPI,Evans Blue, permanganato de potássio) após a hibridizaçãocom sonda marcada fluorescente permite ao organismo queretém as sondas hibridizadas para serem facilmentevisualizadas em cultura ou em amostras clínicas.
Os novos procedimentos e único pré-tratamento dehibridização in si tu, a técnica de detecção e ascomposições da presente invenção, aqui descritos permitemo uso de DNA recombinante, RNAi PNA, peptídeo,glicoproteínas, lipídios e sondas de glicolipídios emcélulas, microorganismos ou secções de tecidos e écompatível com o exame microscópico rotineiramenterealizado em bacteriologia, parasitologia, histologia outécnicas de laboratório de patologia. A presente invençãoaplica, por exemplo, uma sonda de ácido nucléico daseqüência de nucleotídeo pré-determinada para a amostracelular (ou tecido) e para o exame da amostra por, porexemplo, microscopia, microscopia eletrônica, citometriade fluxo ou imagem radioativa (por exemplo, filme deraio-X, fósforo imagem), para determinar quais as células(ou tecidos) dentro da população contendo os alvosespecíficos (por exemplo, seqüências de ácido nucléicos)de interesse. Assim, em todo o esfregaço infectado ousecções de tecidos, organismos patogênicos tais comobactérias, vírus, protozoários ou fungos podem serdetectados dentro das células infectadas. Taisprotocolos provêem diagnósticos e informações científicasúteis, uma vez que a presença ou a ausência de um ácidonucléico específico pode correlacionar com um ou maiscélulas de estrutura e morfologia observáveis e, nestecaminho, provê uma base para o prognóstico e odiagnóstico clínico.
O método para detectar um fragmento de ácido nucléicoalvo diretamente a partir de um espécime é compreendidopor etapas que são realizadas, preferivelmente, na ordemlistada. Um espécime, usualmente obtido a partir de umindivíduo, é primeiro depositado sobre uma lâmina. Aamostra é fixada sobre a lâmina com um fixador (porexemplo, metanol, ácido acético-metanol fixador ou umácido acético-formalina fixador). Uma vez que a amostra éfixada, as amostras de células são permeabilizadas com ascomposiçoes e métodos da presente invenção.
Alternativamente, a espécime é misturada com a solução deIDF em um tubo, incubada e então depositada sobre umalâmina, seca ao ar e fixada. Em seguida, as células sãocontatadas com uma sonda específica para o alvo sobcondições apropriadas para hibridização.
Após um período adequado de hibridização qualquer sondanão-hibridizada é lavada a partir da amostra. Em umaconfiguração preferida, a amostra é então contatada comum contra-corante (por exemplo, DAPI, Evans Blue,permanganato de potássio, etc.). Sem levar emconsideração se a amostra foi contra-corada, as sondasque são hibridizadas, ao alvo da amostra, são entãovisualmente detectadas por, por exemplo, microscopia. Apresença de sondas com a amostra é uma indicação dapresença do fragmento alvo. A contra-coloração daamostra ao mesmo tempo ou seqüencialmente com os ensaiosde hibridização in si tu da presente invenção melhora ométodo por permitir, por exemplo, uma determinaçãotransparente do local do alvo dentro da amostra. Talinformação auxilia, por exemplo, na provisão de umadeterminação nítida da hibridização antecedente.
Este método é apropriado para uso com qualquer espécime,obtida a partir de um indivíduo. Isto inclui, semlimitação, todo o sangue, soro, plasma, saliva, urina,leite de peito, fluido espinal cerebral e tecidos. Estemétodo é também apropriado para a detecção de um patógenoou outro alvo dentro das células de um inseto de vetor,célula de inseto, células de planta, fungo ou bactéria.
O propósito das células ou tecidos de fixação éimobilizar as células e preservar a morfologia dascélulas ou tecidos de modo que as células constituintestais como, por exemplo, RNA são retidos dentro da matrizcelular durante a hibridização in si tu. 0 métodopreferido utiliza assim um fixador que é capaz depreservar e reter ácidos nucléicos da célula e ao mesmotempo reticular e/ou precipitar as proteínas na matrizcelular de modo que a célula ou tecido permanecesubstancialmente em configuração aberta para a penetraçãoda sonda e subseqüente hibridização.Em uma configuração preferida, as sondas da presenteinvenção compreendem, por exemplo, ácidos nucléicosproduzidos biológica ou sinteticamente (DNA, RNA eequivalentes); ácidos nucléicos de peptídeos (PNA; eequivalentes); peptídeos (e equivalentes) que contémácido nucléico específico ou seqüências de peptídeos quehibridizam sob condições extremas para alvos celularesespecíficos. Em uma outra configuração, a sonda dapresente invenção compreende glicopeptídeos produzidossintética ou biologicamente, lipopeptídeos e prions oumoléculas do tipo prions (ou os equivalentes das mesmas)que se ligam sob condições extremas aos alvos específicosdentro da célula.
O complexo de sondas é definido como uma sonda quecompreende uma porção marcadora apropriada para detecção.Se a sonda for um ácido nucléico, a porção marcadora éligada tanto na extremidade 5', na extremidade 3'internamente, quanto em qualquer combinação das mesmas. Aporção marcadora preferida é um marcador identificáveltal como um radio-marcador (por exemplo, ρ32, I125, H3) , ummarcador de biotina ou um marcador fluorescente.
Alternativamente, a sonda tem uma cauda poli-deoxinucleotídeo marcada, a qual é utilizada paradetecção de um complexo de sondas. 0 complexo de sondaspode também estar compreendido em uma pluralidade deseqüências de ácido nucléico diferentes, PNA, peptídeos,glicopeptídeos, lipopeptídeos ou prions ou qualquercombinação dos mesmos compreendendo um ou mais marcadorescom uma porção marcada. Se mais do que uma das porções desonda for marcada, ela pode ser benéfica ao marcador decada porção de sonda com uma porção marcadora diferente.
A seqüência de nucleotídeos de uma sonda deoligonucleotídeos é substancialmente complementar a pelomenos uma porção do ácido nucléico alvo. 0 ácido nucléicoalvo é tanto um ácido nucléico normalmente presentedentro da célula fixada ou de um tecido, oualternativamente, um que não está presente normalmente nacélula ou no tecido e, está associado a um estado anormalou um estado patológico. Cada porção do complexo de sondaé, preferivelmente, compreendida em um DNA ou fragmentode RNA variando em um tamanho de cerca de 10-50nucleotídeos.
As sondas de peptídeos incluem, por exemplo, anticorpos eoutras moléculas conhecidas de ligação com um alvodefinido ou uma faixa de alvos. Exemplos de sondas não-anticorpos incluem, por exemplo, enzimas e substratos deenzimas e porções efetoras das mesmas. Adicionalmente, osfármacos ou os químicos conhecidos podem se ligarseletivamente às proteínas alvo (por exemplo,antibióticos podem se ligar às bactérias). Oslipopeptídeos, por exemplo, são úteis para a detecção dasporções de lipídio em uma célula incluindo organelasespecíficas ou porções de organelas e de bactériasinternalizada na célula. Os glicopeptídeos, por exemplo,interferem com a agregação das plaquetas e, portanto,pode ser utilizado nas moléculas alvo necessárias nafunção das plaquetas auxiliando, desse modo, na pesquisae no diagnóstico de anormalidades na coagulação. Osprions, ou as porções dos mesmos podem ser utilizados,por exemplo, como sondas para tecidos neurológicos.Igualmente, os prions podem ser alvos nas amostrasfixadas.
Em uma configuração preferida, a sonda ê adicionada àsamostras no excesso do alvo (por exemplo, 10:1, 100:1 ou1000:1). Isto é dirigido à reação de hibridizaçãoeficiente e promove uma alta taxa de ligação sonda:alvo.
O complexo de sonda (compreendendo, por exemplo, DNA, RNAe ou PNA) é contatado com o alvo da amostra (por exemplo,ácidos nucléicos) da amostra fixada, geralmente atravésda adição de uma solução do complexo de sonda sob aamostra. As condições exemplificativas apropriadas paraa hibridização são àquelas nas quais as soluções provêemo meio de tamponamento apropriado. Alguns exemplos detampões hibridizações apropriados são:1) um tampão compreende entre cerca de 10% e 50% deformamida, 2X.SSC (pH 7,4), e 1% de NP40;
2) um tampão compreende entre cerca de 1,5 M e 4M dotampão GuSCN;
5 M do tampão de armazenamento de GuSCN são produzidos apartir de 5 M de GuSCN, 100 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 40mM de EDTA, 1% de NP40. Este tampão estoque é diluído emuma molaridade indicada de GusCN por adição de IxTE, umpH 7,8 para produzir molaridades do tampão de GuSCN acimareferenciadas.
3) um tampão compreendendo entre cerca de 2 a 5 M dotampão GuHCl.
8 M do tampão estoque de GuHCl é feito a partir de 8 M deGuHCl, 200 mM de Tris-HCl, (pH 7,8), 40 mM de EDTA, 1% deNP40. Este tampão estoque é diluído para a molaridade deGuHCl através da adição de 1 xTE com pH 7,8 para produziras molaridades do tampão GuHCl acima referenciado.
4) um tampão compreendendo uma mistura de formamida (2 0-50%) e do tampão GuSCN (por exemplo, 0,5M a 3M).
5) um tampão compreendendo uma mistura de tampão GuSCN(por exemplo, 0,5 M a 3M) e tampão GuHCl (por exemplo, IMa 5M) .
A composição específica e a concentração do tampão dehibridização variam com o tipo de sonda ou complexo desonda utilizado. A composição e a concentração do tampãoutilizado são, também, dependentes do Tm (ponto de fusão:temperatura na qual separa-se a fita dupla do DNAformando duas fitas simples complementares) da sonda,seqüência de sonda, comprimento de sonda e a temperaturade hibridização e pode ser determinado por um técnico noassunto, através do curso de não mais do que umexperimento de rotina de laboratório.
A presente invenção não está limitada a qualquertemperatura de hibridização particular. Entretanto, deveser apreciado que o uso de formamida no tampão dehibridização permite que a hibridização seja conduzida emuma temperatura muito mais baixa do que os protocolos dehibridização padrões. Por exemplo, a hibridização de umcomplexo de sonda especificamente proporcional ao alvo (enão à célula hospedeira) em tampão de hibridizaçãoaquoso, tal como cloreto de sódio, requereria,geralmente, uma temperatura de cerca de 60-65°C. A mesmahibridização realizada a cerca de 420C em um fluido dehibridização (1) acima, proveria especificidadeequivalente.
Igualmente, o uso de GuSCN também permite a hibridizaçãoa ser realizada em uma temperatura muito mais baixa doque os protocolos de hibridização padrões. Por exemplo,em um procedimento proporcional, à hibridização da sondaespecificamente ao alvo (e não à célula hospedeira) emtampão de hibridização aquoso tal como cloreto de sódiopoderia requerer temperaturas de aproximadamente 60-65°C.Entretanto, a mesma hibridização realizada no GuSCN outampão de hibridização GuHCl acima, em cerca de 37°Cproverá especificidade equivalente de hibridização.
Após a hibridização ser completada, a sonda não-hibridizada é lavada a partir da amostra, geralmenteatravés da aplicação de uma série de lavagens com umtampão de lavagem. Ela está dentro de meios conhecidosdos técnicos no assunto para determinar os tampões delavagem e tempos de lavagens apropriados. Em uma configuração, o tampão de lavagem compreende 0,3 M decloreto de sódio, 0,03 M de citrato de sódio, e 0,1% deSDS. Um outro tampão de lavagem apropriado compreendesalina de fosfato tamponada (PBS).
Após a lavagem, a amostra pode ser contra-corada. Em umaconfiguração, a contra-coloração do fungo melhora avisualização da sonda hibridizada. As contra-coloraçõespreferidas, são, por exemplo, DAPI, Evans Blue epermanganato de potássio. Outras contra-coloraçõesapropriadas são conhecidas dos técnicos no assunto. Estaetapa de coloração é geralmente aplicada quando uma sondacom marcação fluorescente é utilizada para detectar osácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas elipoproteínas que são específicas para um alvo. Apesar deauxiliar, as contra-colorações não são requeridas para asconfigurações da presente invenção.
A sonda é detectada através de meios apropriados para aporção específica utilizada para marcar o complexo desonda. 0 método preferido para a detecção das sondasmarcadas com fluorescente, por exemplo, empregandofiltros microscópicos especiais, verde, vermelho e azul(ou seja, microscopia de fluorescência). As sondas radio-marcadas hibridizadas podem ser detectadas por,porexemplo, auto-radiografia e fósforo-imagem. As sondasmarcadas com biotina podem ser detectadas através desistemas de detecção enzimática e os referidos sistemasde detecção estão comercialmente disponíveis.
O método descrito acima permite a detecção simultânea dediferentes patógenos em uma amostra clínica única,através da realização de uma reação com um complexo desonda que é compreendido de uma pluralidade de diferentesseqüências de ácido nucléico, cada um marcado com umaporção marcadora diferente. Para detecção simultânea,sondas diferentes de oligonucleotídeo, que sãoespecificas para os ácidos nucléicos diferentes, emdiferentes alvos, presentes comumente no espécime, podemser construídas de modo que o valor de Tm (ponto defusão) de toda a seqüência do complexo de sonda é muitosimilar. Cada um dos oligonucleotídeos específicos éentão marcado com uma porção detectável diferente (porexemplo, diferentes porções fluorescentes). Ahibridização é realizada com os componentes múltiplos docomplexo de sonda. A amostra hibridizada é processadacomo descrito acima e a amostra é observada através demeios apropriados para a detecção de diferentesoligonucleotídeos marcados do complexo de sonda (porexemplo, observado pelo uso de filtros apropriados sediferentes porções fluorescentes forem utilizadas) paradetectar qual dos alvos está presente na amostra.Será reconhecido pelos praticantes destes novosprotocolos de pré-tratamento para uso com o protocolo dehibridização in si tu descrito aqui é compatível com todosos métodos previamente conhecidos da detecção bem como osaqui descritos não são limitados pelo método de detecçãoutilizado. O protocolo de hibridização in si tu foieficiente de modo que manipulações mínimas sãonecessárias e podem, portanto, ser realizadas em um curtoperíodo de tempo. Configurações da presente invençãotambém abrangem kits compreendendo as composições dapresente invenção. As referidas composições quandoprovidas na forma de um kit permitirão a prática devárias configurações dos protocolos apresentados aquiincluindo àquelas que foram otimizadas para asimplicidade e para compatibilidade com uma amplavariedade de métodos de detecção. Também é esperado queos referidos kits preparados contenham reagentesespecificamente preparados e sondas que serão aplicáveisem laboratórios clínicos/de diagnóstico, onde acapacidade de detectar a presença ou a ausência dosácidos nucléicos específicos serve para identificarpositivamente ou negativamente estados patológicoscaracterizados pela presença de alvos específicos.
Os métodos de diagnósticos disponíveis da técnicaanterior para muitas patologias celulares dependem dasavaliações microscópicas, parâmetros morfológicoscelulares, características de coloração, e a presença oua ausência de determinados alvos. Entretanto, muitosdestes métodos de diagnósticos não são inteiramenteexatos ou suficientemente sensíveis. A hibridização insi tu, usando o protocolo descrito acima e as sondasespecíficas para patógenos permitirão facilitar aidentificação mais apurada dos alvos (incluindo, mas nãolimitado aos, patógenos) nas amostras.
A presente invenção provê um protocolo de pré-tratamentosimples para uso nos protocolos de hibridização in si tu ecaracterísticas de detecção quando comparado comprotocolos descritos previamente. A melhora incluimaximizar a sensibilidade dos ensaios através do aumentoda eficiência de hibridização e detecção de "sinal"específico. Apesar da presente invenção não estarlimitada a qualquer mecanismo particular, acredita-se quea sensibilidade aumentada é devido ã melhora nahibridização devido à melhora na penetração da sondadentro das células e, ao mesmo tempo, da maximização daretenção do alvo (por exemplo, seqüências de ácidonucléico) na célula ou no tecido, e da maximização napreservação de outras características bioquímicas emorfológicas da amostra de célula ou de tecido.Experimental:
Um uso preferido e não-limitativo do método acima está nadetecção de Mycobacterium tuberculosis, a partir de umacultura ou a partir da saliva. Deverá ser entendido eapreciado por um técnico no assunto, que a novametodologia é aplicável, igualmente, a uma amplavariedade de outros sistemas, de células, de culturas detecidos e de tecidos para hibridização de ácidosnucléicos específicos (ou detecção de outros componentescelulares das células alvos, tecidos ou patógenos) deinteresse com preservação concomitante da integridade emorfologia celular.
EXEMPLO
A cultura ou a saliva processada do paciente foiesfregada sobre uma placa de vidro e ar seco. As célulascultivadas foram lavadas e concentradas através decentrifugação. As células lavadas foram suspensas emtampão fosfato com BSA. Para resultar em células inativasas células suspensas foram fervidas durante 15 minutos a100°C.
Método 1 de preparação da amostra:
A saliva foi processada tanto por (1) NALC/NaOH quantopor (2) NALC/NaOH seguido por fervura da salivaprocessada durante 15 minutos a 100T8C para resultar emuma amostra inativa ou (3) com uma solução caotrópica talcomo hidrocloreto de guanidina ou tiosulfato(resumidamente, 2-3 volumes de 5M de GuSCN ou 8M de GuHClpara a saliva foram misturados). A amostra foi incubada a37°C durante 20 minutos. A amostra foi centrifugada paraempelotar as células. As células foram lavadas com salinafosfato tamponada. As células lavadas foram suspensas emsalina fosfata tamponada com 1% de BSA ou (4) uma soluçãocaotrópica tal como hidrocloreto de guanidina outiosulfato seguido por fervura (a mesma que na etapa 3,acima) exceto pelas células suspensas em salina tamponadacom 1% de BSA serem fervidas durante 15 minutos a IOO0Cpara matar a Mycobac terium. A cultura preparada ou aamostra de saliva foi então corada sobre a lâmina devidro e seca ao ar.
A amostra foi fixada através do metanol ou do ácidoacético-metanol ou do etanol. 0 esfregaço corado foitratado com a solução IDF (como descrita Supra) durante10 minutos. Após 10 minutos o esfregaço foi lavado 3vezes com PBS e seco ao ar.
Método 2 de preparação da amostra:Um volume de saliva não-processada de paciente foimisturada com dois volumes da solução IDF (supra) em umtubo e incubada a temperatura ambiente (20-25°C) durante15 minutos. A mistura IDF-saliva foi então esfregadasobre a lâmina de vidro, seca ao ar e fixada com metanol.
O tratamento IDF do esfregaço fixado antes dahibridização foi omitido. Antes da hibridização da lâminafoi lavada com PBS três vezes.
Método 3 de preparação da amostra:
A mistura IDF-saliva fixada com metanol em uma lâmina devidro foi tratada com 2% de glutaraldeído em PBS durante5 minutos a 20-25°c (temperatura ambiente) , então lavadacom PBS três vezes e seca ao ar. O tratamento IDF doesfregaço fixado antes da hibridização foi omitido.
Método 4 de preparação da amostra:
Um volume de uma saliva não-processada de paciente foimisturada com dois volumes de uma solução IDF ((supra) emum tubo e incubada a cerca de 20-25°C (temperaturaambiente) durante 15 minutos. A mistura IDF-saliva foientão fervida durante 15 minutos para liberar os ácidosnucléicos na solução e ao mesmo tempo render uma amostranão-infecciosa. Os ácidos nucléicos podem ser purificadosatravés de técnicas padrões a partir da amostra fervidaou do ácido nucléico alvo de interesse que pode serselecionado pela hibridização sanduíche usando sondasespecíficas e contas magnéticas como descrito por Shah etal., (Ahah J. S., King W., Liu J., Smith J., Serpe G., ePopoff S., e (1997). Ensaios melhorados, patente norte-americana No.: U.S. 5,629,156), a qual é incorporada aquipor referência). 0 alvo purificado pode ser amplificadopor PCR (para o DNA alvo) ou RT-PCR (para um RNA alvo).Sondagem das amostras
Uma sonda de oligonucleotídeo compreendendo de umaseqüência de DNA que hibridiza especificamente ao Rnaribossomal 2 3 S de Mycobacterium tuberculosis comodescrito por Shah, Nietupski e Liu (Patente U.S. No.5,521,3 00) são preferivelmente utilizadas na detecção dapresença de M. tuberculosis nas células. Os exemplos deum complexo de sonda apropriado são:Pl. Sonda TB
5'-Rhodamin Green - AGA-ACA-CGC-CAC-TAT-TCA-CAC-GCG-CGT-ATG-C-3' [SEQ.ID.NO:1] 66,5cP2- Tb-I 51-2c
5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.N0:2]
P3. Sonda de Mycobacterium
5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-3' [SEQ.ID.N0:3] 68,7c
P4 - gênero Myeobaeterium - 54.1c5'-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ.ID.NO.:4]P5 - Sonda de Burkholderia
5'-FAM-CTT-GGC-TCT-AAT-ACA-GTC-GG-3' [SEQ.ID.NO.:5] tm52cSonda de PNA
Em uma configuração, este complexo de sonda foi contatadocom os ácidos nucléicos da amostra fixada/pré-tratada emum tampão de hibridização de 2,5 M GusSCN, 50 mM de Tris(ph 7,8), 20 mM de EDTA e 1% de NP40 a 37°C. Em umaconfiguração alternativa, este complexo de sonda foicontatado com os ácidos nucléicos da amostra fixada em umtempão de hibridização de 50% de formamida, 2X SSC (pH7,4), 20 mM de EDTA, 1% de NP40 a 42°C.
Exemplos de uma seqüência de oligonucleotídeo apropriadopara uso em um complexo de sonda alternativo para adetecção de espécies de Micobacteria são:P2 - Tb-I 51-2c
5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.NO:2]
P3. Sonda de Mycobacterium
5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-15 3' [SEQ.ID.N0:3] 68,7c
P4 - gênero Mycobaeterium - 54.1c5' -Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ.ID.NO. :4]
SEQ. ID. Nos.: 3 e 4 e os complementos das mesmas sãoapropriadas para a detecção de Myeobaeterium sp.
SEQ.ID.Nos.: 1 e 2 e complementos das mesmas sãoapropriados para a detecção de M. tubereulosis.
SEQ.ID.NO: 5 é apropriada para a detecção de Burkholderiasp.
A seqüência de RNA ribossomal é escolhida para uso nadetecção dos patógenos Myeobaeterium devido à altaabundância do rRNA em células bacterianas (1,000-10,000cópias). Preferivelmente o oligonucleotídeo do complexode sonda é um DNA com uma seqüência complementar ao rRNAde M. tubereulosis. 0 oligonucleotídeo é preferivelmentemarcado nas extremidades 3' e 5' com fluoresceína. Seráreconhecido que uma sonda de oligonucleotídeo de RNA podeser utilizada bem como.
Como discutido acima, a quantidade de sonda total é umaquantidade predeterminada que excederia a quantidadeestimada do rRNA disponível acreditado estar dentro daamostra (cerca de 100:1) de modo a dirigir a reação dehibridização eficientemente e para promover uma alta taxade sonda/anelamento alvo. Em termos quantitativos, istorequer que uma sonda compreendida de um oligonucleotídeolongo de 3 0 nucleotídeos a ser utilizado em concentraçõesvariando de 1-10 μg/ml para produzir um sinal confiávelanteriormente descrito.
Deveria ser apreciado que o uso de GuSCN também permite ahibridização a ser realizada em uma temperatura muitomais baixa do que os protocolos de hibridização padrões.A hibridização da sonda especificada especificamente aoalvo (e não à célula hospedeira) em fluido dehibridização aquoso tal como cloreto de sódio seriarequerer uma temperatura de cerca de 60-65°C. Entretanto,a hibridização realizada no tampão de hibridização GuSCNou GuHCl acima, em cerca de 3 7 0C assegurando aespecificidade.
Uma das vantagens do método de hibridização in si tu é queo número relativamente pequeno de células compreende umaamostra e um grande número de amostras idênticas pode serprocessado durante um curto período de tempo. 0 únicométodo de hibridização in si tu descrito é extremamentesimples. Os métodos da presente invenção também podemser aplicados em qualquer tipo de amostra, incluindo, semlimitação, secções de tecidos embebidos em parafina,amostras fixadas em acetona.
Os resultados destes experimentos mostram que a detecçãodo alvo (DNA patógeno) nas amostras testadas e a nãodetecção do alvo nas amostras controle. A detecção doalvo é consistentemente melhor nas amostras tratadas comas soluções IDF da presente invenção. Um técnico noassunto irá apreciar, entendimento e conhecimento dassoluções IDF da presente invenção pode ser utilizado emqualquer situação requerendo a entrada efetiva de umasonda (ou outro objeto similar) dentro de uma célula,patógeno (por exemplo, localizado em uma célula) ou emuma organela sem uma experimentação indevida.
Deverá ser evidente a partir do produzido que a presenteinvenção provê composições e métodos para aumentar apermeabilidade de células, paredes celulares, membranascelulares, organelas e membranas de organelas paraauxiliar, por exemplo, na detecção de componentescelulares e/ou patógenos.

Claims (30)

1. Composição para aumentar a permeabilidade de paredescelulares, membranas celulares e membranas nucleares,caracterizada pelo fato de compreender: GuSCN (tiocianatode guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etilenooxi)etanol), ácido acético, metanol, colatode sódio e deoxicolato de sódio.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido GuSCN estar em umaconcentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 M.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido Tris-HCl estar emuma concentração de aproximadamente 10 a 100 mM.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido Tris-HCl estar emum pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido EDTA estar em umaconcentração de aproximadamente 5 a 50 mM.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido IGEPAL estar em umaconcentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido ácido acético estarem uma concentração de aproximadamente 1,0 a 10 porcento.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido metanol estar emuma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido colato de sódioestar em uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5por cento.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido deoxicolato estarem uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 porcento.
11. Método para detectar um alvo em uma célula,caracterizado pelo fato de compreender:a) contatar a célula com uma composição compreendendoGuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL(octilfenoxi poli (etilenooxi)etanol), ácido acético,metanol, colato de sódio e deoxicolato de sódio paracriar uma célula permeabilizada;b) contatar a célula permeabilizada da etapa (a) com umagente ligante específico para se ligar ao referido alvo;ec) detectar o referido agente ligante da etapa (b).
12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o alvo ser selecionado dogrupo consistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicospeptídicos, peptídeos, glicoproteínas, lipídeos,lipoproteínas, glicoproteínas, vírus, e prions.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o alvo ser selecionado dogrupo consistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicospeptídicos, peptídeos, lipoproteínas, glicoproteínas elipídeos.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido agente ligantecompreender adicionalmente uma porção de detecção.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de a porção de detecção serselecionada do grupo consistindo de marcadoresfluorescentes, marcadores radioativos, corantes, metaiscoloidais, biotina/avidina e peroxidase de raiz forte.
16. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de a dita detecção ser via umanticorpo marcado com afinidade pelo referido agenteligante.
17. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido GuSCN estar em umaconcentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 M.
18. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido Tris-HCl estar emuma concentração de aproximadamente 10 a 100 mM.
19. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido Tris-HCl estar emum pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.
20. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido EDTA estar em umaconcentração de aproximadamente 5 a 50 mM.
21. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido IGEPAL estar em umaconcentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento.
22. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido ácido acético estarem uma concentração de aproximadamente 1,0 a 10 porcento.
23. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido metanol estar emuma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento.
24. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido colato de sódioestar em uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5por cento.
25. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido deoxicolato estarem uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 porcento.
26. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido alvo ser um ácidonucléico do microorganismo Mycobacterium tuberculosis.
27. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido agente ligante serum oligonucleotídeo complementar ao ácido nucléico domicroorganismo Mycobacterium tuberculosis.
28. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umcorante de fundo.
29. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o agente ligante ser umoligonucleotídeo complementar a um ácido nucléico aomicroorganismo de Mycobacterium sp.
30. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o agente de ligação ser umoligonucleotídeo complementar a um ácido nucléico defungo.
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