PT1080228E - MéTODO DE HIBRIDAÆO IN SITU PARA A DETECÆO DE áCIDO NUCLEICO ALVO - Google Patents

Description

Descrição "Método de hibridação in situ para a detecção de ácido nucleico alvo"

Antecedentes da invenção A hibridação é tradicionalmente percepcionada como o processo que, sob condições de reacção predeterminadas, duas cadeias parcial ou totalmente complementares de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), moléculas de ácido ribonucleico (ARN) e combinações de ADN e ARN, são separadas em cadeias simples, permitindo-se que hibridem, formando duplas hélices emparelhadas em bases. 0 termo "hibridação in situ", conforme utilizado, refere-se a uma técnica de hibridação que detecta de forma eficaz sequências de ácido nucleico especificas em células ou tecidos intactos. A técnica de hibridação in situ envolve a vantagem adicional de também oferecer informações morfológicas acerca das células intactas. A técnica de hibridação in situ foi descrita pela primeira vez por Gall e Padre (Proc. Nat. Acad. Sciences 63:378-83 (1969)) e Jone et al. (Nature 225: 946-8 (1969)). Ambos os -2- grupos observaram a formação e detecção de híbridos de ARN-ADN em preparados citológicos usando sondas marcadas radioactivamente. A técnica permite a detecção de ADN ou ARN em células individuais que contêm sequências específicas, numa população celular heterogénea. Também permite a determinação simultânea das características bioquímicas e morfológicas das células examinadas. Desde a sua descrição inicial, a hibridação in situ sofreu uma evolução contínua no que respeita à metodologia e aplicação. Actualmente, a técnica tem aplicação directa em muitas áreas da investigação biomédica e clínica, incluindo a biologia celular, o diagnóstico clínico, o desenvolvimento biológico, a genética e a virologia.

As metodologias para localização de intrões e exões de ARN em células cultivadas através de sondas marcadas por hapteno e fluorocromo, são descritas no artigo J. Cell Science, 104, 1187-1197 (1993) (Dirks et al) . A patente de invenção norte-americana n.° US-A-5449604 descreve o cromossoma 14 e marcadores genéticos e ensaios para a Doença de Alzheimer familiar. A patente de invenção norte-americana US-A-5264343 descreve um método de distinção de células normais e células cancerígenas. -3-

Um método optimizado de fixação para preparados de cromossomas de linhas celulares de hamster chinês, híbrido hamster chinês-humano e ratinho, é revelado em Cytogenet Cell Genet 41:181-184 (1986) (Korthof). J Clinicai Microbiology, Nov. 1996, p. 2791-2794 (Krause et al.) descreve a comparação de PCR com esfregaço sanguíneo e inoculação de animais de pequeno porte para diagnóstico de Babesia microti Parasitemia. A patente de invenção norte-americana n.° US-A-5629147 descreve o enriquecimento e identificação de células fetais em sangue materno para hibridação in situ. A patente de invenção WO-A-9002173 descreve um ensaio de um só passo de hibridação in situ.

Resumo da invenção

Um aspecto da presente invenção diz respeito a um método de detecção de um fragmento de ácido nucleico alvo directamente de uma amostra obtida num paciente para hibridação in situ. 0 método é composto por vários passos, que são realizados na ordem indicada. É depositada uma fracção da amostra numa lâmina. A amostra é fixada na lâmina com fixador, sendo que este inclui metanol-ácido -4- acético numa razão de entre 99:1 e entre 80:20. Os ácidos nucleicos da amostra fixa são colocados em contacto com um complexo de sonda especifico para o fragmento de ácido nucleico alvo, sob condições adequadas para hibridação. O complexo de sonda não hibridizado é removido da amostra. A amostra limpa é marcada com azul de Evans. O complexo de sonda hibridizada é visualmente detectado por microscopia, sendo que a presença do complexo de sonda é uma indicação da presença do fragmento do ácido nucleico alvo. Variantes distintas incluem a utilização do método com diferentes tampões de hibridação. Numa variante, é utilizado um tampão de hibridação essencialmente constituído por 10% a 50% de formamida, 2X SSC (pH 7,4), 1% de NP40. Numa outra variante, é utilizado um tampão de hibridação essencialmente constituído por 1,5 M a 4 M de tampão de GuSCN. Numa outra variante, é utilizado um tampão de hibridação essencialmente constituído por 2 M a β M de tampão de GuHCl. Outras variantes da invenção envolvem a utilização de sondas específicas para a identificação de patogénios da espécie Babesia numa amostra. Outras variantes incluem a detecção de ácidos nucleicos numa ampla variedade de amostras, incluindo soro, plasma, -5- expectoração, urina, líquido cefalorraquidiano, tecido, leite mamário e insectos, como as carraças.

Descrição minuciosa da invenção A presente invenção tem por base a descoberta de um método optimizado para a detecção directa da presença de um ácido nucleico alvo em células de amostras obtidas de um paciente (por exemplo, esfregaços sanguíneos, tecidos embebidos em parafina e carraças) através de hibridação in situ. 0 método em questão é particularmente adequado à detecção de sequências de nucleótidos específicas de patogénios, encontrados nas células sanguíneas ou tecidos infectados, usando sondas de oligonucleótidos, soluções de fixação pré-hibridação especiais, soluções de fixação pós-hibridação e protocolos. Mais especificamente, são descritas melhorias inéditas dos métodos tradicionais de fixação/pré-tratamento que utilizam compostos orgânicos e inorgânicos que permitem selectivamente a penetração das sondas de oligonucleótidos no interior dos agentes patogénicos, bacterianos ou protozoários, presentes no interior das células infectadas. Além disso, um procedimento de pós-fixação com azul de Evans após hibridação com sonda marcada com fluorescência, -6- permite que os organismos que retêm as sondas hibridizadas sejam facilmente visualizados no interior das células sanguíneas. A técnica de hibridação in situ e de detecção inédita e única descrita consiste num protocolo que permite a utilização de sondas de ADN e ARN recombinante com células, microrganismos ou secções de tecidos, e é compatível com a análise microscópica comum realizada em laboratórios de bacteriologia, parasitologia, histologia ou patologia. A presente invenção aplica uma sonda de ácido nucleico de uma sequência nucleotídica predeterminada às células (ou tecido) da amostra e à análise da amostra por microscopia, de forma a determinar quais as células (ou tecidos) dessa população contêm as sequências de ácidos nucleicos de interesse. Assim, nos esfregaços sanguíneos ou secções de tecidos infectados, os organismos patogénicos, como as bactérias, vírus, protozoários ou fungos, podem ser detectados no interior das células infectadas. Tais protocolos proporcionam um diagnóstico e informações científicas úteis, pois a presença ou ausência de um ácido nucleico específico pode, directa ou indirectamente correlacionar-se com uma ou mais células de estrutura e -7- morfologia observável e, desta forma, proporcionam uma base para um diagnóstico e prognóstico clínicos. 0 método para detecção de um fragmento directamente numa amostra é composto por múltiplos passos que deverão ser realizados na ordem especificada. Uma amostra, geralmente obtida de um paciente, é em primeiro lugar depositada numa lâmina. A amostra é fixada na lâmina com fixador. 0 fixador inclui metanol-ácido acético numa razão de cerca de 99:1 a 80:20. Uma vez fixada a amostra, os ácidos nucleicos da mesma são colocados em contacto com um complexo sonda específico para o fragmento de ácido nucleico alvo, sob condições adequadas para hibridação. O complexo sonda é composto por uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar para o ácido nucleico alvo hibridizar com o ácido nucleico alvo sob condições restringentes. O complexo sonda também é derivatizado com uma fracção que serve como marcador da presença da sonda. Após um adequado período de hibridação, a sonda não hibridizada é removida da amostra. A amostra é depois lavada com Azul de Evans para contra marcar as células hospedeiras, de forma a ver-se claramente a(s) sonda(s) marcada(s) por fluorescência ligada(s) aos ácidos nucleicos específicos dos patogénios que podem estar presentes no -8- interior da amostra (por exemplo, no interior das células da amostra) . Qualquer sonda que é hibridizada com o ácido nucleico da amostra fixa é, depois, visualmente detectada através de microscopia. A presença da sonda no interior da amostra é indicativa da presença do fragmento de ácido nucleico alvo. A contra-coloração das células de patogénios em simultâneo com o ensaio de hibridação in situ optimiza o método ao permitir uma determinação mais clara da localização do ácido nucleico alvo no interior da amostra. Tal informação ajuda, por exemplo, a providenciar uma determinação mais evidente da hibridação em background. Concluiu-se que a sensibilidade deste método consistia na detecção de pelo menos 10 cópias do ácido nucleico alvo. Este método é adequado a uma utilização com qualquer amostra obtida de um paciente. Tal inclui, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, sangue, soro, plasma, expectoração, urina, leite materno, fluido cérebro-espinal e tecido. Este método também é adequado para a detecção de um patogénio no interior das células de um insecto vector. A amostra é depositada numa lâmina através dos métodos padronizados, e é depois fixada na lâmina usando o fixador com metanol-ácido acético. -9- 0 objectivo de fixar as células ou tecido é o de preservar a morfologia das células ou tecido de forma a que o ARN seja retido no interior da matriz celular sob as condições rigorosas experimentadas durante a hibridação in situ. 0 método preferido utiliza, assim, um fixador capaz de preservar e reter os ácidos nucleicos da célula e, ao mesmo tempo, entrecruzar e/ou precipitar as proteínas na matriz celular de forma que a célula ou tecido permanece substancialmente numa configuração aberta para a penetração da sonda e subsequente hibridação.

Os fixadores inéditos descritos são misturas dos compostos metanol e ácido acético, numa razão de cerca de 99:1 a 80:20. Quando são utilizados estes fixadores, não é necessário qualquer pré-tratamento, como acontece com as proteases, anidrido acético, etc. Numa variante preferida, o fixador é metanol-ácido acético numa razão de 95:5. Conforme utilizado, o termo "sonda" refere-se a ácidos nucleicos sintéticos ou biológicos (ADN, ARN, ou equivalentes dos mesmos) que possam ser concebidos de forma a conter determinadas sequências nucleotídicas que hibridam sob condições restringentes com as sequências de ácido nucleico alvo. 0 complexo sonda é definido como uma sonda que é derivatizada com um marcador para detecção. 0 -10- marcador está ligado à terminação 5', à terminação 3', internamente ou em qualquer combinação possível. A fracção preferida é um marcador de identificação como um marcador radioactivo (por exemplo, P32, l125, H3) , uma fracção de biotina ou uma fracção de fluoresceína. Em alternativa, o oligonucleotídeo possui uma cauda poli-deoxinucleotídeo que é utilizada na detecção do complexo sonda. Este pode também ser composto por uma multiplicidade de sequências de ácidos nucleicos diferentes, cada uma delas marcada com uma fracção de marcador. Pode ser benéfico marcar as diferentes sequências de ácido nucleico com uma fracção de marcador distinta. A sequência nucleotídica do oligonucleotídeo é substancialmente semelhante a pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. O ácido nucleico alvo é um ácido nucleico normalmente presente no interior da célula ou tecido fixados, ou em alternativa, não normalmente presente na célula ou tecido e associado a um estado anómalo ou patológico. Cada molécula do complexo sonda é preferivelmente composta por um fragmento de ADN ou ARN com uma dimensão entre cerca de 10 e entre 50 nucleotídeos. A quantidade total de complexo sonda utilizada é uma quantidade predeterminada que deverá exceder a quantidade -11 - estimada de alvo disponível que se esperaria encontrar no interior da amostra (cerca de 100:1), de maneira a conduzir de forma eficaz a reacção de hibridação e promover uma elevada taxa de hibridação entre sonda:alvo. O complexo sonda é posto em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada, geralmente através da adição de uma solução de complexo sonda na amostra. As condições adequadas para hibridação são aquelas que proporcionam um ambiente tamponado adequado. Alguns exemplos de tampões de hibridação adequados são: 1) um tampão que é constituído por entre cerca de 10% e entre 50% de formamida, 2X SSC (pH 7.4) e 1% de NP40; 2) um tampão que é constituído por entre cerca de 1,5 M e entre 4 M de tampão GuSCN; O tampão mãe de 5 M de GuSCN é composto por 5 M de GuSCN, 100 mM de Tris-HCl (pH 7.8), 40 mM de EDTA, 1% de NP40. Este tampão mãe é diluído na concentração molar indicada de GuSCN através da adição de água desionizada, para produzir as concentrações molares de tampão GuSCN supra referidas; 3) um tampão que é constituído por entre cerca de 2 e entre 6 M de tampão GuSCl; 8 M de tampão mãe de GuSCl -12- é constituído por 8 M de GuSCl, 200 mM de Tris-HCl (pH 7.8), 40 mM de EDTA, 1% de NP40. Este tampão mãe é diluído na concentração molar indicada de GuHCl através da adição de água desionizada, para produzir as concentrações molares de tampão GuSCl supra referidas; A concentração específica do tampão de hibridação varia consoante o complexo sonda e comprimento da sequência de ácido nucleico. A concentração exacta do tampão utilizado depende do Tm da sonda, da sequência da sonda, do comprimento da sonda e da temperatura de hibridação, e pode ser determinado pelos versados na arte através da realização de experiências rotineiras.

Deverá ter-se em conta que a utilização de formamida no fluido de hibridação permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito mais baixa do que aquela dos protocolos de hibridação de referência. A hibridação de um complexo sonda comum especificamente para o alvo (e não para as células hospedeiras) em fluido aquoso de hibridação, como o cloreto de sódio, geralmente exigiria uma temperatura de 60-65°C. A mesma hibridação realizada a -13 - 42°C em fluido de hibridação 1) supra, proporcionaria especificidade.

Deverá ter-se em conta que a utilização de GuSCN também permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito inferior do que aquela dos protocolos de hibridação de referência. Por exemplo, num procedimento comum, a hibridação da sonda especificamente para o alvo (e não nas células hospedeiras) em fluido aquoso de hibridação, como o cloreto de sódio, exigiria uma temperatura de aproximadamente 60-65"C. No entanto, a hibridação realizada no tampão de hibridação GuSCN ou GuHCl supra, a 37°C, proporcionaria especificidade para hibridação.

Após a conclusão da hibridação, a sonda não-hibridada é removida da amostra, geralmente através da aplicação de uma série de lavagens com tampão de lavagem. Encontra-se na esfera de conhecimentos dos versados da arte a determinação dos tampões de lavagem adequados. Tais tampões de lavagem incluem 0,3 M de cloreto de sódio, 0,03 M de citrato de sódio e 0,5% de NP40. Um outro tampão de lavagem é o tampão fosfato (PBS).

Após a lavagem, a amostra pode ser corada com azul de Evans. Esta contra-coloração permite a visualização de organismos no interior das células que contêm as sondas - 14- hibridizadas. Este passo de marcação é geralmente aplicado quando é utilizada uma sonda marcada com fluorescência, para detectar os ácidos nucleicos específicos de um patogénio. Embora útil, a contra-coloração com azul de Evans não é necessária para o método supra. A sonda é detectada através dos meios adequados à fracção específica utilizada para marcar o complexo sonda. 0 método preferido para detectar uma sonda marcada por fluorescência utiliza filtros especiais, como um filtro azul (sonda marcada por fluorescência) e um filtro verde (sonda marcada com rodamina-X ou vermelho do Texas). Deverá ter-se em conta que a hibridação de sondas radioactivas em alvos pode ser detectada através de autoradiografia. As sondas marcadas por biotina podem ser detectadas através de sistemas de detecção enzimática, comercialmente disponíveis. 0 método supra descrito permitiu a detecção simultânea de diferentes patogénios numa só amostra clínica através da realização de uma reacção com um complexo sonda composta por uma pluralidade de diferentes sequências de ácidos nucleicos, cada uma delas marcadas com um marcador diferente. Para a detecção simultânea, os oligonucleótidos específicos dos diferentes ácidos nucleicos (de diferentes -15- patogénios) vulgarmente presentes numa amostra clínica podem ser concebidos de forma a que os valores Tm de todas as sequências do complexo sonda são bastante semelhantes. Cada oligonucleótido específico é, depois, marcado com uma diferente fracção detectável (por exemplo, diferentes fracções fluorescentes). A hibridação é realizada com os múltiplos componentes do complexo sonda. A amostra hibridizada é processada conforme supra descrito e a amostra é observada através dos meios adequados para a detecção dos diferentes oligonucleótidos marcados do complexo sonda (por exemplo, observados com recurso aos filtros adequados se forem utilizadas fracções fluorescentes diferentes) para detectar qual patogénio se encontra presente na amostra.

Os versados na arte deverão concluir que o protocolo de hibridação in situ inédito descrito é compatível com todos os métodos de detecção previamente conhecidos, bem como com aquele descrito. 0 protocolo de hibridação in situ foi concebido de forma a serem necessárias poucas manipulações e pode, consequentemente, ser realizado num curto espaço de tempo. É expectável que os reagentes sejam proporcionados sob a forma de um kit para realizar o protocolo que foi optimizado para uma máxima simplicidade e para uma -16- compatibilidade com uma ampla variedade de métodos de detecção. Também é expectável que tais kits preparados contendo os reagentes e sondas preparados para o efeito, sejam aplicáveis em laboratórios clinicos/de diagnóstico, onde a capacidade para detectar a presença (ou ausência) de ácidos nucleicos específicos serviria para identificar positiva ou negativamente os estados patológicos caracterizados pela presença de genes específicos. 0 actual diagnóstico de muitas patologias celulares depende de avaliações por microscopia, de parâmetros morfológicos celulares, das caracteristicas da marcação e da presença (ou ausência) de determinados antigénios. Muitos destes métodos de diagnóstico não são inteiramente rigorosos ou suficientemente sensíveis. A hibridação in situ usando o protocolo supra descrito e sondas específicas de patogénios permitirá uma identificação mais fácil e mais rigorosa dos patogénios em amostras. A presente invenção proporciona um protocolo simples de hibridação in situ que providencia características optimizadas de processamento, hibridação e detecção das amostras, bem como uma preservação morfológica optimizada da amostra comparativamente aos protocolos previamente descritos. As melhorias incluem: -17-

Maximizaçao da sensibilidade do ensaio através do aumento da eficácia da hibridaçao e detecção de "sinais" específicos e da redução do "ruído" não específico. 2) Maximização da retenção das sequências de ácidos nucleicos na amostra de célula ou tecido. 3) Maximização da preservação de outras características bioquímicas e morfológicas da amostra de célula ou tecido. 4) Minimização do tempo total e dos passos necessários para o protocolo.

Algumas características e vantagens específicas do método descrito, que o diferenciam dos métodos anteriores, são as seguintes: requer um protocolo de fixação simples, elimina o número de passos de pré-hibridação das amostras de células ou tecido sem quaisquer efeitos adversos. Os seguintes passos, geralmente utilizados na arte, foram eliminados ou optimizados: a incubação com proteases foi eliminada. A pré-hibridação foi eliminada. A incubação em anidrido acético foi eliminada. Este procedimento permite tempos de hibridação reduzidos e uma redução das lavagens -18- pós-hibridação de várias horas para poucos minutos à temperatura ambiente. Este procedimento possibilita o uso de sondas não radioactivas, que apresentam uma maior duração em armazenamento e não exigem um espaço de armazenamento especial. Pode ser utilizado o sistema de detecção directa através de microscopia sobre fundo negro ou podem ser adicionados alguns passos simples para detecção com microscopia de luz.

Um uso preferido do método supra diz respeito à detecção de Babesla microti em sangue infectado. Será evidente aos versados na arte que a nova metodologia é igualmente aplicável a uma ampla variedade de outros sistemas, culturas celulares e tecidos para hibridação de ácidos nucleicos específicos de interesse com preservação concomitante da integridade e morfologia celular.

Uma sonda oligonucleotídica composta por sequência de ADN que especificamente hibridiza com uma pequena subunidade do ARN ribossomal do B. microti é preferencialmente utilizada na detecção da presença do B. microti em células. Um complexo sonda adequado é:

5'-fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-fluoresceína-3' (SEQ ID NO: 1) -19-

Numa variante, este complexo sonda é colocado em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixa num tampão de hibridação de 2,5 M de GuSCN, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.8), 20 mM de EDTA e 1% de NP40 a 37 °C. Numa variante alternativa, este complexo sonda é colocado em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada num tampão de hibridação de 50% formamida, 2X SSC (pH 7.4), 20 mM de EDTA, 1% de NP40 a 42°C.

Outras sequências de oligonucleótidos adequados para utilização em complexos sonda alternados para a detecção da espécie Babesia são: B5: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCC-3' (SEQ ID NO:2) B6: 5'-AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' (SEQ ID NO:3) B7: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGAG-3' (SEQ ID NO:4) B8-1: 5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' (SEQ ID NO:5) B8-2: 5'-AATAAACGCAGCCAAGACAG-3' (SEQ ID NO:6)

As sequências B5, B6, B7 e os complementos das mesmas são adequados para detecção do B. microti. As sequências B8-1, B8-2 e os complementos das mesmas são adequadas para detecção do B.WA-1. Estas e outras sequências -20- oligonucleotídicas que podem ser utilizadas na detecção especifica de um fragmento de ácido nucleico alvo numa amostra encontram-se enumeradas no pedido de patente de invenção norte-americana solicitado simultaneamente com a presente descrição, com o titulo "Métodos optimizados para a detecção de um fragmento de ácido nucleico alvo". A sequência de ARN ribossomal é escolhida para utilização na detecção de patogénios Babesia graças à elevada abundância de rARN em células de B. microti (1000 a 10 000 cópias). Preferivelmente, o oligonucleótido do complexo sonda é uma sequência de ADN complementar ao rARN do B. microti. O oligonucleótido é preferivelmente marcado nas terminações 3' e 5' com fluoresceina. Será evidente que também poderá ser utilizada uma sonda oligonucleotidica de ARN.

Conforme supra discutido, a quantidade total da sonda é uma quantidade predeterminada que deverá exceder a quantidade estimada do rARN disponível que se julgue estar presente no interior da amostra (cerca de 100:1) para conduzir eficazmente a reacção de hibridação e para promover uma elevada taxa de hibridação entre sonda:alvo. Em termos quantitativos, isto requer que uma sonda composta por um oligonucleótido com 30 nucleoótidos seja utilizada em -21 - concentrações que variem entre 1-2 μg/ml de forma a produzir um sinal fiável acima do fundo.

Deverá ter-se em conta que a utilização de GuSCN também permite que a hibridação seja realizada a uma temperatura muito inferior àquela dos protocolos de hibridação padronizados. A hibridação da sonda especificamente com o alvo (e não com as células hospedeiras) em fluido de hibridação aquoso, como o cloreto de sódio, exigiria uma temperatura de 60-65°C. No entanto, a hibridação realizada no tampão de hibridação GuSCN ou GuHCl supra, a 37 °C, assegura especificidade.

Uma das vantagens do método de hibridação in situ diz respeito aos números relativamente reduzidos de células que compõem a amostra, podendo ser processadas muitas amostras idênticas ao longo de um curto espaço de tempo. 0 método de hibridação in situ descrito é extremamente simples. Os métodos da presente invenção também podem ser aplicados a qualquer tipo de amostra, incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os cortes de tecidos embebidos em parafina e amostras fixadas em acetona.

Exemplificação -22-

Exemplo 1: Detecçao de Babesia microti em sangue infectado.

Comparação de FISH vs. IFA e PCR A análise por hibridação in situ de fluorescência (FISH) da presente invenção foi comparada com o isolamento em dois passos e com o método de detecção por PCR e com a análise por imunofluorescência indirecta (IFA) quanto à detecção do patogénio B. microti. 0 ensaio FISH foi concebido de forma a detectar o ARN ribossomal especifico do B. microti num esfregaço sanguíneo completo. Utilizou-se o isolamento e o ensaio PCR para detectar o ADN específico do B. microti em sangue total, usando iniciadores ("primers") específicos do B. microti. Foram realizadas IFA's para a detecção dos anticorpos lgG e lgM no B. microti em soro de todos os pacientes de acordo com as recomendações do fabricante.

Os testes foram realizados num total de 221 amostras de sangue total de pacientes com suspeita de Babesiose. 0 resultado de um ensaio FISH era considerado positivo se a forma trofozoíta (anel) do B. microti ou a forma merozoíta (esporo) do B. microti, ou ambas as formas, fossem detectadas nos glóbulos vermelhos. As amostras eram -23- consideradas positivas pela IFA se as titulações do anticorpo do B. microti eram superiores a 1:80.

Os resultados de cada teste são apresentados no Quadro 1. Das 221 amostras testadas por IFA, 38 foram consideradas positivas (titulações de 1:80 ou superiores) e 183 amostras foram consideradas negativas. Conforme demonstrado no Quadro 1, das 38 amostras consideradas positivas na IFA, 13 também foram determinadas positivas pela FISH. Destas 13 amostras, 11 também foram consideradas positivas pela análise por PCR. Além disso, seis amostras consideradas negativas através da FISH foram consideradas positivas através da análise por PCR. A sensibilidade da análise por FISH foi de 34% comparativamente à IFA. A sensibilidade da análise por PCR foi de 45%. Das 183 amostras consideradas negativas pela IFA, 60 amostras foram consideradas positivas pela FISH. Destas 60, 45 também foram consideradas positivas pela análise por PCR. Além disso, 26 amostras consideradas negativas pela análise FISH foram consideradas positivas pela análise por PCR.

Quadro 1: Comparação de PCR, FISH e IFA relativos a Babesia microti

Amostras Amostras PCR (+) FISH (+) PCR + FISH -24- IFA(+) 38 17 13 11 IFA (-) 183 71 60 45 # Amostras 221 87 63 56 Percentagem 17,19% 39,37% 28,51% 25,34% ( + ) A discrepância entre os resultados da IFA e da FISH não foram surpreendentes. 0 diagnóstico com base na resposta de anticorpos requer a seroconversão dos indivíduos infectados em relação à produção de anticorpos anti-B. microti. Com Babiose, semanas depois da mordida inicial, um paciente com febre pode não apresentar o anticorpo. 0 ensaio FISH de B. microti detecta o rARN do parasita e, ao mesmo tempo, é independente da resposta imunitária do hospedeiro. Assim, pode detectar uma infecção activa. Isto pode explicar por que é que 45 amostras positivas por FISH e PCR foram consideradas negativas pela IFA. Além disso, registaram-se 15 amostras positivas pela FISH mas negativas por PCR. É possível que estas amostras foram consideradas negativas pelo PCR devido à presença de inibidores ou devido à degradação do ADN durante o processamento. Também é possível que o método de detecção FISH produza resultados positivos falsos. Já que estas amostras foram consideradas negativas pela IFA, consideramos que estas 15 amostras -25- podem ser falsos positivos. Assumindo que estas 15 amostras eram "negativas verdadeiras", o ensaio FISH tem, ainda assim, uma especificidade de 93%. 0 teste com base em anticorpo policlonal não é altamente específico. Num estudo anterior, dos 45 pacientes considerados positivos pela IFA, 17 não apresentavam ADN específico do B. microti detectável por PCR (Krause et al., J. Clin. Microbiol. 34:2014-2016 (1996)).

Além disso, frequentemente os anticorpos persistem muito tempo depois de o parasita desaparecer. O ensaio FISH é um ensaio não amplificado e altamente específico que detecta o rARN específico do B. microti directamente em esfregaços de sangue total. Assim, não é surpreendente que 26 das 38 amostras positivas por IFA sejam negativas por FISH. A discrepância entre os resultados da FISH e os resultados do PCR não é surpreendente. O ensaio FISH é um ensaio não amplificado e altamente específico que detecta o rARN específico do B. microti no interior de glóbulos vermelhos. 0 PCR do B. microti é um ensaio amplificado que detecta quantidades diminutas de ADN parasita e, ao mesmo tempo, é independente da resposta imunitária do hospedeiro. Além disso, o PCR não depende da viabilidade do organismo. Assim, o PCR é mais sensível do que a FISH. Isto explicaria -26- por que é que 32 amostras positivas por PCR foram consideradas negativas pela FISH. Estas incluiam seis amostras positivas por IFA e 26 amostras negativas por IFA. Com base nos dados supra apresentados, 89 amostras (40%) foram consideradas "positivas verdadeiras" assumindo que a

especificidade do ensaio por PCR era de 10 0% e que a especificidade do ensaio FISH era de 93%. 0 ensaio FISH controla a infecção activa, e apresenta uma especificidade de 67% comparativamente ao PCR. Além disso, os dados demonstram claramente que a FISH é um ensaio mais sensivel e especifico do que a IFA. Estes resultados indicam que a técnica FISH da presente invenção é muito simples e fiável. Foram testadas várias amostras com diferentes patogénios -esfregaços de sangue total, culturas puras de mensentério de carraças infectadas e culturas de tecido - através do ensaio FISH para determinar a aplicabilidade geral desta metodologia. Em todas as amostras testadas, a análise FISH proporcionou resultados claros e rigorosos que foram confirmados pelos restantes ensaios. Métodos

Fixação/Pré-tratamento da célula. -27 -

Foram obtidos esfregaços sanguíneos finos e espessos a partir de sangue fresco tratado com EDTA através de uma técnica padronizada em lâminas de vidro. Os esfregaços foram secos ao ar livre e armazenados à temperatura ambiente até ao dia da experiência. Os esfregaços secos ao ar livre foram tratados com uma mistura de metanol:ácido acético (95:5) durante 10 minutos à temperatura ambiente. A solução em excesso foi removida, e as lâminas foram secas ao ar livre.

Tampões de hibridação e hibridação. A hibridação foi realizada em (1) 50% de formamida, 2 x SSC, pH 7.4, 1% NP40 e 1-2 pg/ml da sonda de B. microti, ou (2) 2,5 M de GuSCN, 50 mM de Tris, 20 mM de EDTA, 1% de NP40, pH 7.8 e 1-2 pg/ml da sonda de B. microti.

Aplicou-se 25 μΐ do fluido de hibridação (1) por lâmina. A lâmina foi depois coberta com uma lamelae incubada em câmara húmida a 42 °C durante 30 minutos. (Nota: Se se aplicou 25 μΐ de fluido de hibridação (2) por lâmina, a hibridação realiza-se a 37°C durante 30 minutos). -28-

Seguência das sondas.

Uma sonda oligonucleotídica de ADN complementar do B. microti, marcada nas terminações 3' e 5' com fluoresceína foi sintetizada através do método padronizado. A sequência de ácido nucleico da sonda encontra-se listada: 5'-fluoresceina-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-fluoresceína-3' (SEQ ID NO: 1)

Lavagens pós-hibridação.

Após conclusão da hibridação, as lamelas foram retiradas e as lâminas foram lavadas três vezes individualmente com um tampão de lavagem, pH 7.4 (0,3 M de cloreto de sódio, 0,03 M de citrato de sódio, 0,5% de NP40) à temperatura ambiente, durante 2 minutos cada. Depois da terceira lavagem, as lâminas foram lavadas em tampão fosfato, pH 7.2 (PBS) durante 2 minutos à temperatura ambiente. Por fim, as lâminas lavadas foram colocadas num frasco tipo Coplin contendo PBS e azul de Evans (30 ml de PBS + 3 gotas de 0,1% de azul de Evans em PBS) . As lâminas foram secas com papel de filtro e adicionaram-se 2 gotas de fixador por -29- lâmina e cobriu-se com uma lamela. As lâminas foram armazenadas durante cerca de 10 minutos na escuridão à temperatura ambiente e posteriormente vistas sob campo escuro a 40x. Método de detecção de células hibridizadas in situ. A sonda marcada por fluorescência foi detectada por microscopia usando filtros especiais como o filtro azul (sonda marcada por fluorescência) e um filtro verde (sonda marcada com rodamina-X ou vermelho do Texas).

Detecção de ADN de B. microti em amostras clínicas através de PCR.

As amostras de sangue total tratado com EDTA foram tratadas com 5 M de tampão GuSCN, pH 7.4 (100 mM de Tris-HCl, pH

7.8, 40 mM de EDTA, 5 M de GuSCN e 1% de sarcosil) . A

concentração de GuSCN foi ajustada a 2,5 M, com água ou TE (pH 7.8). Os tubos das amostras foram centrifugados durante 30 segundos e posteriormente aquecidos a 85°C durante 10 minutos para desnaturar o ADN. A temperatura foi reduzida para 65°C e permitiu-se que as amostras se equilibrassem -30- durante 5 minutos. Adicionou-se a cada amostra 40 μΐ de sonda de ADN de B. microti B2 (1 μg/ml) , marcada com biotina na terminação 5'. A amostra mais sonda foi deixada a uma temperatura de 65°C durante mais 5 minutos. A amostra foi depois incubada a 37 °C durante mais três horas para permitir a hibridação das sondas com os ácidos nucleicos específicos complementares do B. microti. A sonda e quaisquer ácidos nucleicos hibridados foram, depois, capturados em partículas paramagnéticas derivatizadas com estreptavidina (10 pg/ml a 100 pg/ml) através da diluição da concentração de GuSCN para 1,25 M de GuSCN. As partículas ligadas à sonda foram lavadas uma vez com tampão de lavagem GuSCN (1,25 M de tampão GuSCN, 0,1% de BSA) , seguido de 2 lavagens com 0,1 x tampão SSCN (0,015 M de NaCl, 0,0015 M de citrato de Na, 0,1% de BSA, 0,1% de NP40, pH 7.4), e depois lavadas uma vez com 0,1 x tampão SSC (0,015 M de NaCl, 0,0015 M de citrato de Na, pH 7.4). Depois dos passos de lavagem, os ácidos nucleicos hibridizados na sonda foram libertados através da adição de 100 μΐ de água desionizada. 10 μΐ da solução contendo os ácidos nucleicos libertados foi sujeita a amplificação por PCR usando os procedimentos -31 - padronizados. Observou-se que o limite de detecção era de um organismo por amostra testada.

Sondas e iniciadores ("primers") de PCR para detecção do B. microti por PCR. A sonda utilizada foi uma sonda oligonucleotidica de ADN marcada na terminação 5' com biotina, a sequência nucleotidica 5'-ATAGGTCAGAAACTTGAATGATACATCGAAGGC-3' (SEQ ID NO:7) .

Os iniciadores ("primers") de PCR eram constituídos por oligonucleotidos de ADN com a sequência 5' - GTTATAGTTTATTTGATGTTCGTT-3' (SEQ ID NO:8) e 5' - AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' (SEQ ID N0:3).

Ensaio de imunofluorescência.

Realizaram-se ensaios de imunofluorescência para os anticorpos lgG e lgM do B. microti no soro de todos os pacientes, de acordo com as recomendações do fabricante (MRL Diagnostics, CA). -32-

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 5449604 A [0004] • US 5264343 A [0005] • US 5629147 A [0008] • WO 9002173 A [0009]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • Gall, Padre. Proc. Nat. Acad. Sciences, 1969, vol. 63, 378-83 [0002] • Jone et al. Nature, 1969, vol. 225, 946-8 [0002] • Dirks. J. Cell Science, 1993, vol. 104, 1187-1197 [0003] • Korthof. Cytogenet Cell Genet, 1986, vol. 41, 181-184 [0006] • Krause. J. Clinicai Microbiology, 1996, 2791-2794 [0007] • Krause et al. J. Clinicai Microbiology, 1996, vol. 34, 2014-2016 [0045]

Lisboa, 16/07/2010

Claims (10)

1. Reivindicações 1. Método para a detecção de um fragmento de ácido nucleico alvo directamente a partir de um espécime proveniente de um paciente através de hibridação in situ, que inclui os seguintes passos: a) depósito de uma amostra do espécime numa lâmina; b) fixação da amostra na lâmina com fixador, sendo que o fixador inclui metanol-ácido acético numa razão de 99:1 a 80:20; c) colocação dos ácidos nucleicos da amostra fixada em contacto com uma sonda de ácido nucleico marcada especifica para o fragmento de ácido nucleico alvo, sob condições adequadas para hibridação; d) remoção por lavagem da sonda de ácido nucleico marcada não hibridizada da amostra; e) coloração da amostra lavada com azul de Evans; e f) detecção visual do complexo da sonda hibridada por microscopia, sendo que a presença do complexo da sonda é uma indicação da presença do fragmento de ácido nucleico alvo.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o fixador é metanol- -2- ácido acético numa razão de 95:5 a 99:1.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que (a) a sonda de ácido nucleico marcada é colocada em contacto com os ácido núcleicos da amostra fixada num tampão constituído essencialmente por 10% a 50% de formamida, 2X SSC (pH 7,4), 1% NP40, ou (b) a sonda de ácido nucleico marcada é colocada em contacto com os ácido núcleicos da amostra fixada num tampão constituído essencialmente por 1,5 Ma 4 M de tampão GuSCN; ou (c) a sonda de ácido nucleico marcada é colocada em contacto com os ácido núcleicos da amostra fixada num tampão constituído essencialmente por 2 M a 6 M de tampão GuSCl; ou (d) a sonda de ácido nucleico marcada inclui um oligonucleótido ligado a um marcador fluorescente.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a sonda de ácido nucleico marcada inclui um ácido nucleico ligado a biotina.
5. 5. Método da reivindicação 1, em que o ácido nucleico alvo específico para um agente patogénico com o qual existem suspeitas de o paciente estar infectado e, opcionalmente, em que o agente patogénico é B. microti e o complexo sonda é 5'-fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-fluoresceína-3'.
6. 6. Método da reivindicação 5, em que (a) a sonda de ácido nucleico marcada é colocada em -3- contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada num tampão constituído essencialmente por 2,5 M de GuSCN, 50 mM de Tris (pH 7,8), 20 mM de EDTA e 1% de NP40 a 37°C; ou (b) a sonda de ácido nucleico marcada é colocada em contacto com os ácidos nucleicos da amostra fixada num tampão constituído essencialmente por 50% de formamida, 2X SSC (pH 7,4), 20 mM de EDTA, 1% de NP40 a 42 °C.
7. 7. Método da reivindicação 3, em que a sonda de ácido nucleico marcada inclui uma série de diferentes sequências de ácido nucleico, cada uma delas marcada com um marcador fluorescente distinto.
8. 8. Método da reivindicação 5, em que o agente patogénico é Babesia e o complexo sonda inclui um ou mais dos seguintes oligonucleótidos ou suas sequências complementares: B5: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCC-3' (SEQ ID N°:2) B6: 5'-AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' (SEQ ID N°:3) B7: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGAG-3' (SEQ ID N°:4) B8-1: 5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' (SEQ ID N°:5) B8-2: 5'-AATAAACGCAGCCAAGACAG-3' (SEQ ID N°:6)
9. 9. Método da reivindicação 8, em que (a) o agente patogénico é B. microti e a sonda de ácido nucleico marcada inclui um ou mais dos seguintes -4- oligonucleótidos ou suas sequências complementares: B5: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCC-3' (SEQ ID N°:2) B6: 5'-AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' (SEQ ID N°:3) B7: 5'-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGAG-3' (SEQ ID N°:4); ou (b) o agente patogénico é B. WA-1 e o complexo da sonda inclui 5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' (SEQ ID N°:5).
10. 10. Método da reivindicação 1, em que o espécime é qualquer uma entre sangue total, soro, plasma, expectoração, urina, líquido cefalorraquidiano, tecido e leite materno; ou é obtida a partir de uma carraça. Lisboa, 16/07/2010