KR20110031976A - Ｇｌｉ２를 표적화하는 ｒｎａ 길항제 - Google Patents

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KR20110031976A
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엔즌 파마슈티칼스, 인코포레이티드
산타리스 팔마 에이/에스
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Abstract

본 발명은 세포에서 GLI2 mRNA를 표적으로 하고, GLI2의 발현을 감소시키는, 올리고머성 화합물(올리고머)에 관한 것이다. GLI2 발현의 감소는 암과 같은, 과증식 질환과 같은, 특정 질병의 치료에 유용하다.

Description

ＧＬＩ２를 표적화하는 ＲＮＡ 길항제{RNA ANTAGONISTS TARGETING GLI２}
본 발명은 GLI2의 발현 조절용 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 세포에서 GLI2 mRNA를 표적화하여 GLI2의 감소된 발현을 유도하는 올리고머성 화합물(올리고머)과 관련된 것이다. GLI2 발현의 감소는 암과 같은, 다양한 질병에 유용하다.
관련 사례
본 출원은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는 2008년 7월 16일 제출된 미국 가출원 번호 61/081,135의 35 U.S.C. §119(e)에 따라 우선권을 주장한다. 또한, 본 출원은 2008년 7월 15일 제출된 EP 08104754의 우선권을 주장한다.
글리오마-관련 온코진 2(Glioma-Associated Oncogene 2; GLI2)는 GLI 징크 핑거를 포함하는 전사인자 중 하나로서, 많은 세포 유형 및 대부분의 기관에서 세포운명 결정(cell-fate determination), 증식(proliferation) 및 정형화(patterning)와 관련된다. 인간 GLI2 mRNA는 대체적인 스플라이스 변이체를 만들기 위해 대체적인 스플라이싱(splicing)을 겪는 것으로 알려져 있다. 피부 케라틴세포(keratinocyte)에서 GLI2를 과발현하는 형질전환 마우스는 다중 기저세포암을 발달하고, 이는 이런 암의 발달에서 GLI2 역할을 나타낸다.
US 6,440,739 및 WO03/008545는 다양한 GLI2를 표적화하는 2'-메톡시에틸-변형 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드를 기재하고, 이는 GLI2 발현과 관련된 질환의 치료에 유용할 수 있음을 나타낸다. Kim et al., 2007, Cancer Res. 67(8) 3583-3593은 2'-메톡시에틸-변형 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드가 GLI2를 특이적으로 다운-레귤레이트하고 시험관내(in vitro)에서 간암세포의 증식을 감소시키는데 사용되는 것을 보고하고 있다.
GLI2를 표적화하는 향상된 올리고머가 필요하다. 게다가, GLI1 및 GLI2를 모두 표적화하는 올리고머가 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 10 - 30 모노머(monomers)와 같은, 10 - 50 모노머의 올리고머로서, 이는 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머의 연속된 서열(첫번째 부위)를 포함하며, 여기서 상기 연속된 서열(첫번째 부위)은 서열번호 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 mRNA와 같은, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80%(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%) 동일한(상동적인), 올리고머를 제공한다. 따라서, 예를 들면, 상기 올리고머는 서열번호: 1로 기재된 서열을 갖는 단일가닥 핵산 분자의 부위에 혼성화한다.
본 발명은 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머의 올리고머로서, 이는 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머의 연속된 서열(첫번째 부위)를 포함하며, 여기서 상기 연속된 서열(첫번째 부위)은 서열번호 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 mRNA와 같은, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80%(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%) 동일(상동적인)하며; 그리고 여기서 첫번째 부위에서 적어도 하나의 모노머는 뉴클레오시드 유사체이고, 여기서 상기 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid; LNA) 모노머인, 올리고머를 제공한다. 따라서, 예를 들면, 상기 올리고머는 서열번호: 1로 기재된 서열을 갖는 단일가닥 핵산 분자의 부위에 혼성화한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머를 포함하고, 상기 올리고머에 공유적으로 접합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분이 부착된, 결합체(conjugate)를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를, 암 또는 다른 과증식 질환과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 위한 것과 같은, 약제로서의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를, 암과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명은 예를 들면 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 질환 또는 장애로부터 고통받거나 질환 또는 장애가 의심되는 동물 (질환 또는 장애로부터 고통받거나 질환 또는 장애가 의심되는 환자와 같은)에게 투여하는 것을 포함하는, 암과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머, 결합체, 또는 약학적 조성물을 세포사멸을 유도하기에 충분한 양으로 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다.
한가지 실시예에서, 질환 또는 장애 또는 증상은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 mRNA의 발현과 관련된 것이다.
본 발명은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3을 발현하는 세포에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 발현을 억제하기 위해 (예를 들면, GLI2 발현에 억제 효과를 야기하기 위해) 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3을 발현하는 세포에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GLI1 및 GLI2을 발현하는 세포에서 GLI1 및 GLI2 발현을 억제하기 위해 (예를 들면, GLI1 및 GLI2 모두의 발현에 억제 효과를 야기하기 위해) 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, GLI1 및 GLI2을 발현하는 세포에서 GLI1 및 GLI2을 모두 표적화하는 올리고머와 관련된다.
본 발명은 10 - 50 모노머의 올리고머로서, 10 - 50 연속적인 모노머의 첫번째 부위를 포함하며, 여기서 첫번째 부위의 서열은 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 동일한, 올리고머를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고머를 포함하고, 본 발명에 따른 올리고머에 공유적으로 접합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분("결합된 부분")이 부착된, 결합체를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제로서 용도를 위한 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다.
또한, 본 발명은 전립선암, 신경교종, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 하나 또는 그 이상의 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 전립선암, 신경교종, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 하나 또는 그 이상의 질환의 치료를 위한 사용을 위한 본 발명의 올리고머를 제공한다.
또한, 본 발명의 올리고머를 포함하는 약학적 및 다른 조성물이 제공된다. 또한, 제공되는 것은 유효한 양의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직에 접촉시키는 것을 포함하는 상기 세포 또는 조직에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현을 다운-레귤레이트하는 방법이다. 또한 제공되는 것은 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직에 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포 또는 조직에서 GLI1 및 GLI2의 발현을 다운-레귤레이트하는 방법이다.
또한, 기재되는 것은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 비-인간 동물 또는 인간에게 투여함으로써 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현 또는 과발현과 관련된, 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되거나 의심될 수 있는 동물 (비-인간 동물 또는 인간)을 치료하는 방법이다. 또한, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현을 억제하기 위해, 및 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 활성과 관련된 질환의 치료를 위해 올리고머를 이용하는 방법이 제공된다.
본 발명은 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 동물 (이를 필요로 하는 환자와 같은)에게 투여하는 것을 포함하는, 전립선암, 신경교종, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현을 다운-레귤레이션하는 효과를 위해, 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 이의 약학적 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현을 억제하는 (예를 들면, 다운-레귤레이팅)방법을 제공한다.
본 발명은 GLI1 및 GLI2의 발현을 다운-레귤레이션하는 효과를 위해, 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 이의 약학적 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직에서 GLI1 및 GLI2의 발현을 억제하는 (예를 들면, 다운-레귤레이팅)방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
올리고머 ( The Oligomer )
본 발명은 본 발명은 올리고머성 화합물(본 발명에서 올리고머로서 기재됨)을, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3를 암호화하는 핵산 분자 (서열번호: 1로 나타낸 GLI2 핵산; 서열번호: 2로 나타낸 GLI2 핵산; 서열번호: 134로 나타낸 GLI2 핵산과 같은), 및 상기 핵산 분자의 자연적으로 발생하는 변이체(variants)의 기능을 조절하는 용도로 사용한다. 본 발명의 문맥에서 용어 "올리고머(oligomer)"는, 둘 또는 그 이상의 모노머 (즉, 올리고뉴클레오티드)의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 나타낸다. 일부 실시예에서, 올리고머는 10 - 16 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 18 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 24 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 30 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 50 공유적으로 연결된 모노머들을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시예에서, 용어 "뉴클레오시드(nucleoside)", "뉴클레오티드(ucleotide)", "유닛(unit)" 및 "모노머(monomer)"는 상호 교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 모노머의 서열을 나타낼 때, A, T, G, C 또는 U와 같은 염기 서열로 나타내어지는 것이 인지될 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 당 부분, 염기 부분 및 포스페이트(phosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 인터뉴클레오티드 연결기(internucleotide linkage group)와 같은 공유적으로 연결된 기(연결기)를 포함하는 글리코시드를 의미하고, 이는 DNA 또는 RNA와 같은 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 및 본 발명에서 "뉴클레오티드 유사체"로 나타내는 변형된 당 및/또는 염기 부분을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 모두를 포함한다. 여기서, 단일 뉴클레오티드(유닛)은 또한 모노머 또는 핵산 유닛으로 나타낼 수 있다.
생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 당 부분 및 염기 부분을 포함하는 글리코시드를 나타내며, 올리고머의 뉴클레오티드들 사이 인터뉴클레오티드 연결에 의해 공유적으로 연결되는 "뉴클레오티드" 유닛을 나타낼 때 사용될 수 있다. 생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드"는 종종 핵산 모노머 또는 유닛을 나타내는데 사용되고, 그런 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 전형적으로 뉴클레오염기 서열 (즉, 당 골격 및 뉴클레오시드 사이 연결의 존재가 암시하는)을 나타내는 "뉴클레오티드 서열"과 같은, 염기를 나타낼 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 인터뉴클레오시드 연결기가 변형되는 올리고뉴클레오티드의 경우에 특히, 용어 "뉴클레오티드"는 용어 "뉴클레오티드"가 인터뉴클레오시드 연결의 존재 또는 특성을 명시할 때도 사용될 수 있는, "뉴클레오시드"를 나타낼 수 있다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않음에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드(올리고머)의 5' 말단 뉴클레오티드가 5' 뉴클레오티드 사이 연결기를 포함하지 않는다는 것을 이해할 수 있다.
용어 "모노머(monomer)"는 핵산에서 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드 및 디옥시뉴클레오시드 (총괄적으로, "뉴클레오시드")를 포함하고, 이는 변형된 당 또는 변형된 뉴클레오염기 중 어느 하나, 즉, 자연적으로 발생하는 비변형된 뉴클레오염기 (염기) 부분 (즉, 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실) 및 핵산에서 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오시드인 "뉴클레오시드 유사체"에 공유적으로 결합하는 리보스 당(ribose sugar) 또는 디옥시리보스 당(deoxyribose sugar)이고, 여기서 당 부분은 리보스 또는 디옥시리보스 당 (2' 치환 당과 같은, 두 고리의 당 또는 2' 변형된 당과 같은)과 다르거나, 또는 염기 부분이 변형된 것 (예를 들면, 5-메틸사이토신)이거나, 또는 둘 모두인, 화합물 중 어느 하나를 포함하지 않는다.
"RNA 모노머"는 리보스 당 및 비변형된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오시드이다.
"DNA 모노머"는 디옥시리보스 당 및 비변형된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오시드이다.
"잠김 핵산 모노머", "잠김 모노머" 또는 "LNA 모노머"는 하기 더 기재되어 있는, 두 고리의 당을 갖는 뉴클레오시드 유사체이다.
용어 "상응하는" 및 "상응하다"는 올리고머 또는 인접한 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 (첫번째 부위)의 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 (즉, 뉴클레오염기 또는 염기 서열, 및 i) 핵산 표적의 역상보의 서브-서열(sub-sequence), 및/또는 ii) 본 발명에서 제공되는 뉴클레오티드/뉴클레오시드의 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 추가적인 서열의 동등한 연속적인 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 사이 비교를 나타낸다. 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체는 그들의 동등하거나 상응하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드에 직접적으로 비교된다. 전형적으로 i) 또는 ii) 하에 추가적인 서열에 상응하는 첫번째 부위는 첫번째 부위의 길이 이상의 서열 (연속적인 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열)에 동일한 것이나, 본 발명에서 기재된 바와 같이, 일부 실시예에서는, 상응하는 서열에 대해 100% 상동성 (동일한)와 같은, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 적어도 99% 상동성과 같은, 적어도 80% 상동성이 될 수 있다.
용어 "상응하는 뉴클레오시드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오시드"는 뉴클레오티드 유사체에서의 염기 부분 및 뉴클레오시드에서 염기 부분이 동일한 것을 나타낸다. 예를 들면, "뉴클레오시드"는 아데닌에 연결된 2' 디옥시리보스 당을 포함하고, "상응하는 뉴클레오시드 유사체"는 예를 들면 아데닌 염기 부분에 연결된 변형된 당을 포함한다.
용어 "올리고머", "올리고머 화합물" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 예를 들면 포스페이트 기 (뉴클레오시드 사이 인산디에스테르 연결을 형성하는) 또는 포스포로티오에이트 기 (뉴클레오시드 사이 포스포로티오에이트 연결을 형성하는) 둘 또는 그 이상의 모노머의 공유 연결에 의해 형성되는 분자를 나타낸다. 올리고머는 10 - 16 모노머와 같은, 10 - 18 모노머와 같은, 10 - 24 모노머와 같은, 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머로 구성되거나 포함한다. 올리고머는 예를 들면, 9 - 16 모노머와 같은, 9 - 18 모노머와 같은, 9 - 24 모노머와 같은, 9 - 30 연속적인 모노머로 구성되는, 첫번째 부위 (연속적인 서열)로 구성되거나 포함한다.
일부 실시예에서, 용어 "연속적인 서열", "연속적인 모노머" 및 "부위"는 상호교환적이다.
일부 실시예에서, 올리고머는 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오시드 유사체, 또는 본 발명에 기재된 이의 혼합물을 포함한다. "LNA 올리고머" 또는 "LNA 올리고뉴클레오티드"는 하나 또는 그 이상의 LNA 모노머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
올리고머 내에 선택적으로 포함된 뉴클레오시드 유사체는 상응하는 뉴클레오시드에 유사하게 기능하거나, 또는 특이적인 개선된 기능을 가질 수 있다. 일부 또는 모든 모노머가 뉴클레오시드 유사체인, 올리고머는 세포막을 투과하는 활성, 세포 외부 및/또는 내부의 뉴클레아제에 대한 좋은 저항성 및 핵산 표적에 대한 높은 친화성 및 특이성과 같은, 상기 올리고머의 다양한 요구하는 특성 때문에 천연의 형태 보다 종종 바람직하다. LNA 모노머는, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 상기 언급된 특성을 제공하는 특히 바람직하다.
다양한 실시예에서, 올리고머 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체는, 즉, 올리고머가 표적 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 중에 기능적인 효과를 가지지 않는, 상응하는 천연의 뉴클레오시드에 대한 기능에서 "침묵" 또는 "동등한" 것이다. 그럼에도 불구하고, 상기 "동등한" 뉴클레오시드 유사체는, 예를 들면 제조에 보다 용이하거나 저렴하고, 또는 저장 또는 제조 조건 하에 더 안정적인 경우 유용하고, 이는 태그 또는 라벨을 포함할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 유사체는 올리고머가 발현을 억제하는 기능을 하는 중에; 예를 들면, 표적 핵산의 표적 부위에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 세포내 뉴클레아제와 같은, 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성, 및/또는 세포내로의 이동의 증가된 용이성을 제공함에 의해; 기능적인 효과를 가질 수 있다.
따라서, 다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 뉴클레오시드 모노머, 및 LNA 모노머와 같은 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체 모노머 또는 그 외 뉴클레오시드 유사체 모노머를 포함한다.
용어 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등과 같이, 1 이상 또는 1과 같은 정수를 포함한다. 다양한 실시예에 있어서, 본 발명의 올리고머의 표적 핵산 또는 단백질을 나타내는 경우, 용어 "적어도 하나"는 용어 "적어도 두 개" 및 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함한다. 마찬가지로 일부 실시예에서, 용어 "적어도 두 개"는 용어 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 올리고머는 첫번째 부위에서 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 연속적인 모노머로 구성되거나 포함한다.
일부 실시예에서, 올리고머는 13, 14, 15, 16 또는 24 연속적인 모노머와 같은, 13 - 17 또는 12 - 16 연속적인 모노머와 같은, 12 - 18 연속적인 모노머와 같은, 10 - 16 연속적인 모노머와 같은, 10 - 18 연속적인 모노머와 같은, 10 - 22 연속적인 모노머와 같은, 10 - 24 연속적인 모노머를 포함하거나 구성한다. 부위가 올리고머로 제공될 때, 연속적인 뉴클레오티드 서열 길이는 예를 들면, 10 및 30 모두를 포함하는 10 - 30으로부터 (또는 사이) 부위에서 제공되는 하위 및 상위 길이를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시예에서, 올리고머는 10, 11, 12, 13, 또는 14 연속적인 모노머를 포함하거나 구성한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 15, 16 또는 17 모노머와 같은, 18 모노머 이하와 같은, 20 모노머 이하와 같은, 22 모노머 이하와 같은, 24 모노머 이하로 구성된다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머는 20 모노머 이하를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 RNA 모노머를 포함하지 않는다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성된 것이다. 일부 실시예에서, 올리고머는 단일 가닥 분자이고, 예를 들면, 올리고머가 내부 듀플렉스(duplexes)를 형성하는 것과 같은 동일한 올리고머 내의 또다른 부분과 상보적인, 적어도 3, 4 또는 5개의 연속적인 모노머의 짧은 부위를 전형적으로 포함하지 않는다. 일부 실시예에서는 올리고머가, 즉, siRNA가 아닌 것과 같은, 본질적으로 이중 가닥이 아니다.
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 연속적으로 신장된 모노머 (첫번째 부위)로 구성되고, 이의 서열은 본 발명에서 기재된 서열번호에 의해 확인된 것이다 (예를 들면, 표 1 - 3 참조). 다른 실시예에서, 올리고머는 표적을 암호화하는 핵산 분자의 연속적으로 신장된 모노머로 구성되고, 하나 또는 그 이상의 추가적인 부위는 적어도 하나의 추가적인 모노머로 구성된다. 일부 실시예에서, 첫번째 부위의 서열은 본 발명에 기재된 서열번호에 의해 확인된 것이다.
갭머 고안( Gapmer Design )
전형적으로, 본 발명의 상기 올리고머는 갭머(gapmer)이다.
"갭머"는 본 발명에 기재된 부위 B와 같은, 적어도 6 또는 7 DNA 모노머의 부위와 같은, 하기 본 발명에 추가적으로 기재된 바와 같은, RNase를 모을 수 있는 모노머 (RNaseH와 같은)의 연속적인 신장을 포함하는 올리고머이다. 부위 B는 부위 A 및 C로 각각 나타내는 부위에 의해 5' 및 3'에서 모두 플랭크되고, 상기 부위 A 및 부위 C는 각각 1 - 6 사이의 뉴클레오시드 유사체와 같은, 친화성-증진 뉴클레오시드 유사체와 같은, 뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 구성한다. RNase는 바람직하게 대장균(E. coli) 또는 인간 RNaseH와 같은 RNaseH이다. RNaseH를 모으는 올리고머의 능력은 올리고머가 상보적인 RNA 분자 (mRNA 표적과 같은)와 듀플렉스를 형성할 때 결정된다.
일부 실시예에서, RNAse를 수집할 수 있는 모노머는 DNA 모노머, 알파-L-LNA(alpha-L-LNA) 모노머, C4' 알킬화 DNA (C4' alkylated DNA) 모노머 (본 발명에 참고문헌으로 통합되는, PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 참조), 및 UNA (unlocked nucleic acid) 뉴클레오티드 (본 발명에 참고문헌으로 통합되는, Fluiter et al ., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참조)로 구성되는 군으로부터 선택된다. UNA는 전형적으로, 당의 C2' - C3' 결합 (즉, C2' 및 C3' 결합 사이 공유의 탄소-탄소 결합)이 제거되어, 비잠금 "당" 잔기를 형성하는, 비잠금 핵산이다.
전형적으로, 갭머는 5'에서 3', A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C인 부위를 포함하고, 여기서: 부위 A (A)는 LNA 모노머와 같은, 1 - 6 뉴클레오시드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체로 구성되거나 또는 포함하고; 부위 B (B)는 DNA 모노머와 같은, RNAse(mRNA 표적과 같은, 상보적인 RNA 분자로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때)를 수집할 수 있는 적어도 5개의 연속적인 모노머로 구성되거나 또는 포함하고; 부위 C (C)는 LNA 모노머와 같은, 1 - 6 뉴클레오시드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체로 구성되거나 또는 포함하고; 존재하는 경우, 부위 D (D)는 DNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 모노머로 구성되거나 또는 포함한다.
다양한 실시예에서, 부위 A는 3 또는 4 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2 - 5 LNA 모노머와 같은, 2 ~ 5 사이의 뉴클레오시드 유사체와 같은, LNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드 유사체로 구성되고; 및/또는 부위 C는 3 또는 4 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2 - 5 LNA 모노머와 같은, LNA 모노머와 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오시드 유사체로 구성된다.
특정 실시예에서, 부위 B는 RNAse를 수집할 수 있는 10 또는 9 또는 8 연속적인 모노머와 같은, RNaseH, 또는 6-10, 또는 7-9 연속적인 모노머와 같은, RNAse를 수집할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 연속적인 모노머 (예를 들면, 연속적인 뉴클레오티드)로 구성하거나 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 1 - 12 DNA 모노머와 같은, 바람직하게는 4 - 12 DNA 모노머, 더욱 바람직하게는 7 - 10 DNA 모노머와 같은, 6 - 10 사이의 DNA 모노머, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 DNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 DNA 모노머로 구성되거나 포함한다.
다양한 실시예서, 부위 A는 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체로 구성되고, 부위 B는 7, 8, 9 또는 10 DNA 모노머로 구성되며, 부위 C는 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체로 구성된다. 이러한 고안은 (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3을 포함하고, DNA 모노머와 같은, 하나 또는 2 모노머를 가질 수 있는 부위 D를 추가적으로 포함할 수 있다.
추가적인 갭머 고안은 WO2004/046160에 기재되어 있고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에 참조로서 통합되는, WO2008/113832 (US 가출원 60/977409로부터 우선권을 주장하는)는 '쇼트머(shortmer)' 갭머 올리고머로 나타낸다. 일부 실시예에서, 본 발명에 존재하는 올리고머는 쇼트머 갭머일 수 있다.
특정 실시예에서,올리고머는 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 모노머로 구성되고, 여기서 올리고머의 부위는 패턴 (5' - 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C이고, 여기서 부위 A는 LNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오시드 유사체로 구성되고; 부위 B는 RNaseH와 같은 RNAse를 수집할 수 있는 7, 8, 9 또는 10 연속적인 모노머로 구성되고; 부위 C는 LNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오시드 유사체로 구성된다. 존재하는 경우, 부위 D는 단일 DNA 모노머로 구성된다.
특정 실시예에서, 부위 A는 1개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 A는 2개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 A는 3개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 1개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 2개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 3개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 7개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 8개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 9개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 10개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 DNA 모노머와 같은, 1 - 10 DNA 모노머를 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 DNA 모노머와 같은, 1 - 9 DNA 모노머를 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 알파-L-배열(alpha-L-configuration)에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머가 알파-L-배열에 존재하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 알파-L-배열에 있는 부위 B에서 LNA 모노머는 알파-L-옥시 LNA 유닛이다. 특정 실시예에서, A-B-C 부위에 존재하는 모노머의 수는 (뉴클레오시드 유사체 모노머 - 부위 B - 뉴클레오시드 유사체 모노머): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 3-9-3, 4-9-1, 1-9-4, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 2-10-3, 3-10-2, 또는 3-10-3로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, A-B-C 부위에 존재하는 모노머의 수는 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, A 및 C는 각각 3 LNA 모노머로 구성되고, 부위 B는 8 또는 9 또는 10 뉴클레오시드 모노머, 바람직하게는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, A 및 C는 각각 2 LNA 모노머로 구성되고, 부위 B는 8 또는 9 뉴클레오시드 모노머, 바람직하게는 DNA 모노머로 구성된다.
다양한 실시예에서, 다른 갭머 고안은 2'-O-메톡시에틸-리보스 당(2'-O-methoxyethyl-ribose sugar, 2'MOE)를 포함하는 모노머 또는 2'-플루오로(fluoro)- 디옥시리보스 당을 포함하는 모노머와 같은, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오시드 유사체로 구성되는 부위 A 및/또는 C, 및 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 또는 4-12-4 모노머를 갖는 A-B-C 부위를 포함한다. 또 다른 갭머 고안은 본 발명에 참조로서 통합되는 WO 2007/146511A2에 기재되어 있다.
인터뉴클레오시드 연결( Internucleoside Linkages )
본 발명에 기재된 올리고머의 모노머는 연결기(linkage group)를 통해 결합된다. 적절하게, 각 모노머는 연결기를 통해 3' 인접한 모노머에 연결된다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 올리고머의 말단의 5' 모노머는, 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않음에도 불구하고, 5' 연결기를 포함하지 않는다.
용어 "연결기" 및 "인터뉴클레오시드 연결"는 두 연속적인 모노머를 서로 공유적으로 결합할 수 있는 기(group)를 나타낸다. 특히 바람직한 실시예는 포스페이트 기(phosphate groups)(인접한 뉴클레오시드 모노머 사이 포스포디에스테르를 형성하는) 및 포스포로티오에이트 기(phosphorothioate group)(인접한 뉴클레오시드 모노머 사이 포스포로티오에이트 연결을 형성하는)를 포함한다.
적절한 연결기는 WO2007/031091에 기재된 것을 포함하고, 예를 들면, 상기 결합기는 WO2007/031091(본 발명에 참조로서 통합된)의 34쪽의 첫 번째 단락에 목록으로 포함한다.
다양한 실시예에서, 정상적인 포스포디에스테르(phosphodiester)로부터, RNase H에 의해 절단되어, 표적 유전자의 발현의 RNase-매개 안티센스 억제를 허용하는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)와 같은, 뉴클레아제(nuclease) 공격에 더욱 저항성 있는 것으로 결합기를 변형하는 것이 바람직하다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 연결기를 포함하는 적절한 황(sulphur; S)이 바람직할 수 있다. 다양한 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 특히 갭머의 갭 부위 (B)를 위한 것이 바람직하다. 특정 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 플랭킹 부위 (A 및 C)에서 모노머들이 함께 연결되기 위해 사용된다. 다양한 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 부위 A 또는 C를 부위 D에 연결하기 위해, 및 부위 D 내에 모노머들을 함께 연결하기 위해 사용된다.
다양한 실시예에서, 부위 A, B 및 C는, 특히 예를 들면, 부위 A 및 C가 LNA 모노머를 포함하는 경우와 같이, 뉴클레오시드 유사체의 사용이 엔도 뉴클레아제 분해로부터 부위 A 및 C 내에 연결기를 보호하는 경우, 포스포디에스테르 연결과 같은, 포스포로티오에이트와 다른 연결기를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 올리고머의 인접한 모노머는 포스포로티오에이트 기에 의해 서로 연결된다.
뉴클레오시드 유사체 모노머들 사이 또는 인접 부위 (전형적으로 부위 A 및/또는 C 내)에서 포스포로티오에이트 골격(backbone), 특히 포스포로티오에이트 연결기로 올리고머내로 한 개 또는 두 개의 연결과 같은, 포스포디에스테르 연결의 삽입은, 올리고머의 생물학적 이용 가능성 및/또는 생물학적 분배를 변형시킬 수 있는 것을 알 수 있다 - 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/053314 참조.
상기에 언급된 실시예와 같은, 일부 실시예에서, 적절하고 특이적이지 않은 것을 나타내는 경우, 모든 잔여 연결기는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트, 또는 이들의 혼합물이다.
일부 실시예에서, 모든 인터뉴클레오티드 연결기는 포스포로티오에이트이다.
본 발명에 제공되는 바와 같이, 특이적 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 경우, 다양한 실시예에서 상기 연결기는 포스포로티오에이트 연결, 본 발명에 기재된 것과 같은 대체적인 연결이며, 상기 대체적인 연결은, 예를 들면, 특히 LNA 모노머와 같은 뉴클레오시드 유사체들 사이 연결을 위해, 포스페이트 (포스포디에스테르) 연결이 사용될 수 있다. 유사하게, 다양한 실시예에서, 본 발명에 기재된 바와 같이, 특이적 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 경우, LNA 모노머와 같은, 부위 A 또는 C에서 하나 또는 그 이상의 모노머는 5-메틸시토신 염기(5-methylcytosine base)를 포함하고, 상기 부위의 다른 모노머는 변형되지 않은 시토신 염기를 포함할 수 있다.
표적 핵산( Target Nucleic Acid )
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되고, 상기 기재된 바와 같이, 2 또는 그 이상의 모노머의 공유 연결에 의해 형성되는 분자로 정의된다. 2 또는 그 이상의 모노머를 포함하는 "핵산"은 특정 길이로 될 수 있으며, 용어는 본 발명에 기재된 길이를 갖는 "올리고머"로 총칭된다. 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적 이중 가닥 및 환 분자(circular molecule)를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명에 사용된, 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 1로 나타내는 서열을 갖는 핵산, 및 상기 핵산의 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이와 같은, 인간 GLI2과 같은, 포유류 GLI2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA(예를 들면, mRNA 또는 pre-mRNA)를 나타낸다. 특정 실시예에서, 포유류 GLI2는 마우스 GLI2이다.
일부 실시예에서, 본 발명에 사용된, 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 2로 나타내는 서열을 갖는 핵산, 및 상기 핵산의 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이와 같은, 인간 GLI1과 같은, 포유류 GLI1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA(예를 들면, mRNA 또는 pre-mRNA)를 나타낸다. 특정 실시예에서, 포유류 GLI1는 마우스 GLI1이다.
일부 실시예에서, 본 발명에 사용된, 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 134로 나타내는 서열을 갖는 핵산, 및 상기 핵산의 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이와 같은, 인간 GLI3과 같은, 포유류 GLI3 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA(예를 들면, mRNA 또는 pre-mRNA)를 나타낸다. 특정 실시예에서, 포유류 GLI3는 마우스 GLI3이다.
일부 실시예에서, 예를 들면 연구 또는 진단에 사용하는 경우, "표적 핵산"은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 올리고머는 전형적으로 표적 핵산에 혼성화(hybridising)될 수 있다.
예시적인 표적 핵산은 하기 표에 나타낸 유전자은행 등록번호(GenBank Accession numbers)갖는 포유류 GLI2를 암호화하는 핵산, 더하여 이의 상응하는 단백질 서열을 포함한다:
GenBank Accession Number
핵산 (mRNA/cDNA 서열)		 GenBank Accession Number
폴리펩티드 (추론된)
인간 NM_005270 version 4
(서열번호 1)		 NP_005261 version 2
마우스 M_001081125 version 1 NP_001074594 version 1
예시적인 표적 핵산은 하기 표에 나타낸 유전자은행 등록번호(GenBank Accession numbers)갖는 포유류 GLI1을 암호화하는 핵산, 더하여 이의 상응하는 단백질 서열을 포함한다:
GenBank Accession Number
핵산 (mRNA/cDNA 서열)		 GenBank Accession Number
폴리펩티드 (추론된)
인간 NM_005269 version 1
(서열번호 2)		 NP_005260 version 1
마우스 M_010296 version 2 NP_034426 version 2
붉은털원숭이 M_001116072 version 1 XP_001116072 version 1
예시적인 표적 핵산은 하기 표에 나타낸 유전자은행 등록번호(GenBank Accession numbers)갖는 포유류 GLI3를 암호화하는 핵산, 더하여 이의 상응하는 단백질 서열을 포함한다:
GenBank Accession Number
핵산 (mRNA/cDNA 서열)		 GenBank Accession Number
폴리펩티드 (추론된)
인간 NM_000168 version 4
(서열번호 134)		 _000159 version 3
마우스 M_008130 version 2 _032156 version 2
붉은털원숭이 M_001098108 version 1 _001098108 version 1
핵산에 대한 상기 기재된 유전자은행 등록번호는 cDNA 서열이고 mRNA 서열 자체가 아닌 것이 인지된다. 성숙 mRNA의 서열은 유라실 염기 (U)로 대체되는 티미딘 염기 (T)를 갖는 상응하는 cDNA 서열로부터 직접 유래될 수 있다.
용어 "그의 자연적으로 발생하는 변이"는 마우스, 원숭이 및 바람직하게 인간과 같은, 포유류와 같은, 정의된 분류군내에 자연적으로 존재하는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3; 바람직하게 GLI2 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 변이를 나타낸다. 전형적으로, GLI2 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이"를 나타내는 경우, 용어는 염색체 전좌(translocation) 또는 중복(duplication)에 의해 크로모좀(Chromosome) Chr 2: 위치 2q14에서 발견되는 게놈 DNA를 암호화하는 GLI2의 대립유전자 변이, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 전형적으로, GLI1 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이"를 나타내는 경우, 용어는 염색체 전좌(translocation) 또는 중복(duplication)에 의해 크로모좀 Chr 12: 위치 12q13.2-q13.3에서 발견되는 게놈 DNA를 암호화하는 GLI1의 대립유전자 변이, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 전형적으로, GLI3 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이"를 나타내는 경우, 용어는 염색체 전좌(translocation) 또는 중복(duplication)에 의해 크로모좀 Chr 7: 위치 7p13에서 발견되는 게놈 DNA를 암호화하는 GLI3의 대립유전자 변이, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 또한, "자연적으로 발생하는 변이"는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing)으로부터 유래된 변이를 포함할 수 있다. 특이적인 폴리펩티드 서열과 관련되는 경우, 예를 들면, 용어는 신호 펩티드 절단, 단백질 가수분해의 절단, 당화 등과 같은 공동(co)- 또는 후(post)- 번역 변형에 의해, 공정될 수 있는 단백질의 자연적으로 발생하는 형태를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 기재된 올리고머는 올리고머의 단랭체와 표적 핵산의 모노머 사이, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍, 후그스틴(Hoogsteen) 수소결합 또는 역 후그스틴 수소결합 중 어느 하나에 의해 표적 핵산의 부위 ("표적 부위")에 결합한다. 또한, 상기 결합은 "혼성화(hybridisation)"로 나타낸다. 다른 기재가 없으면, 결합은 상보적인 염기들(즉, 티민 (DNA) 또는 유라실 (RNA)을 갖는 아데닌, 및 시토신을 갖는 구아닌)의 왓슨-크릭 염기쌍에 의한 것이며, 올리고머는 상기 올리고머의 서열이 표적 부위에 역상보의 서열에 동일하거나 부분적으로 동일하기 때문에 표적 부위에 결합하며; 본 발명의 목적을 위해, 상기 올리고머는 표적 부위에 "상보적인" 또는 "부분적으로 상보적인"인 것으로 나타내어지고, 상기 표적 부위에 대한 올리고머의 "상보성"의 백분율은 표적 부위의 서열의 역상보에 "동일한" (상동성) 백분율이다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "역상보(reverse complement)", "역상보적인" 및 "역상보성"은 "상보", "상보적인" 및 "상보성"과 상호교환적인 것이다.
본 발명의 문맥에서 명확히 하지 않는 경우, 본 발명에서 "표적 부위"는 하기 본 발명에 기재된 정렬 프로그램 및 파라미터를 이용하여, 특정 올리고머 (또는 이의 부위)의 서열의 역상보와 최적으로 정렬하는 서열을 갖는 표적 핵산의 부위일 수 있다.
본 발명의 올리고머 (또는 이의 부위) 및 본 발명에 기재된 바와 같은, 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3을 암호화하는 핵산의 표적 부위 사이 "상보성"의 정도를 결정하는데 있어서, "상보성" (또는 "상동성" 또는 "동일성")의 정도는 올리고머 (또는 이의 부위) 및 이와 최적으로 정렬하는 표적 부위 (또는 표적 부위에 역상보)의 서열 사이 동일성 백분율 (또는 상동성 백분율)로 발현된다. 백분율은 올리고머에서 연속적인 모노머의 총수에 의해 나누고, 100으로 곱하여, 2 서열 사이 동일한 것을 정렬된 염기의 수를 계산함으로써 산출된다. 이런 비교에서, 만약 갭(gap)이 존재하는 경우, 이런 갭은 갭내에 모노머의 수가 본 발명의 올리고머 및 표적 부위 사이 다른 부분 보다 다소 미스매치하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "상동적인" 및 "상동성"은 "동일성" 및 "동일한"과 상호교환적인 것이다.
아미노산 및 폴리뉴클레오티드 정렬, 백분율 서열 동일성 및 상보성의 정도는 표준 세팅을 이용하여 ClustalW 알고리즘을 이용하여 본 발명의 목적을 위해 결정될 수 있다: http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, 방법: Blosum 62 (단백질), 또는 뉴클레오티드/뉴클레오염기를 위한 DNAfull을 이용한, EMBOSS::물 (국소의): 갭 개방 = 10.0, 갭 연장 = 0.5.
본 발명의 문맥에 따라 이해될 수 있는 바와 같이, "미스매치(mismatch)"는 서열에서 비-동일성 (예를 들면, 올리고머와 그것이 결합하는 표적 부위의 역 상보 사이와 같은; 예를 들면, 2개의 정렬된 GLI2를 암호화하는 핵산의 염기 서열 사이와 같은), 또는 서열에서 비상보성 (예를 들면, 올리고머와 그것이 결합하는 표적 부위 사이와 같은)을 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 발명을 암호화하는 올리고머는 GLI2 표적 유전자를 발현하는 세포에서 하나 또는 그 이상의 GLI2 표적 유전자의 발현을 억제 (다운-레귤레이팅에 의한 것과 같은)할 수 있거나, 또는 GLI2 표적 유전자를 발현 (즉, 세포에 GLI2 표적 유전자의 GLI2 억압을 완화함에 의해)할 수 있다.
GLI2 mRNA를 표적화하는 올리고머는, 5' 비번역 리더, 엑손, 인트론 및 3' 비번역 테일과 같은, 표적 mRNA 핵산에 따르는 특정 부위에 혼성화될 수 있다. 그러나, GLI2 mRNA를 표적화하는 올리고머는 표적 핵산의 성숙한 mRNA 형태에 혼성화하는 것이 바람직하다.
GLI1 mRNA를 표적화하는 올리고머는, 5' 비번역 리더, 엑손, 인트론 및 3' 비번역 테일과 같은, 표적 mRNA 핵산에 따르는 특정 부위에 혼성화될 수 있다. 그러나, GLI1 mRNA를 표적화하는 올리고머는 표적 핵산의 성숙한 mRNA 형태에 혼성화하는 것이 바람직하다.
GLI3 mRNA를 표적화하는 올리고머는, 5' 비번역 리더, 엑손, 인트론 및 3' 비번역 테일과 같은, 표적 mRNA 핵산에 따르는 특정 부위에 혼성화될 수 있다. 그러나, GLI3 mRNA를 표적화하는 올리고머는 표적 핵산의 성숙한 mRNA 형태에 혼성화하는 것이 바람직하다.
일부 실시예에서, 본 발명에 다른 올리고머는 GLI3 mRNA를 표적화하지 않는다.
적절하게, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체는 GLI2 유전자의 발현을 다운-레귤레이팅 (예를 들면, 감소 또는 제거)할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 (또는 결합체)는 전형적으로 인간 세포와 같은, 포유류 세포에서 GLI2를 억제하는 효과가 있을 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체는, 표적 핵산에 결합하고, 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 GLI2 mRNA 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 GLI2 mRNA 발현 억제에 영향을 준다.
적절하게, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체는 GLI1 유전자의 발현을 다운-레귤레이팅 (예를 들면, 감소 또는 제거)할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 (또는 결합체)는 전형적으로 인간 세포와 같은, 포유류 세포에서 GLI1을 억제하는 효과가 있을 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체는, 표적 핵산에 결합하고, 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 GLI1 mRNA 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 GLI1 mRNA 발현 억제에 영향을 준다.
적절하게, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체는 GLI3 유전자의 발현을 다운-레귤레이팅 (예를 들면, 감소 또는 제거)할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 (또는 결합체)는 전형적으로 인간 세포와 같은, 포유류 세포에서 GLI3를 억제하는 효과가 있을 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체는, 표적 핵산에 결합하고, 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 GLI1 mRNA 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 GLI3 mRNA 발현 억제에 영향을 준다.
일부 실시예에서, 상기 억제는 올리고머 또는 이의 결합체의 약 0.8 nM 내지 약 20 nM과 같은, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM으로 이용될 때 보여진다. 본 발명에 기재된 바와 같은, 세포 유형은 인간 대장암 세포, 인간 교종 세포, 인간 유방암 세포, 인간 폐암 세포 또는 인간 전립선암 세포 (예를 들면, 시험관내 - 형질전환된 세포)와 같은, 암세포와 같은, 인간 세포이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 5 nM이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 25 nM이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 1 nM이다. 세포를 처리하는데 사용되는 올리고머의 농도는 실시예에 기재된 바와 같이, 형질전환 (리포펙톤)을 이용한 시험관내 세포 분석에서 수행되는 다양한 전형적인 실시예 내에 있는 것으로 지시될 수 있다. 형질전환 시약의 존재하에, 표적의 다운-레귤레이션을 확득하기 위해 요구되는 올리고머 농도는 전형적으로 5 mM과 같은, 1 및 25 mM 사이이다.
다양한 실시시예에서, mRNA 발현의 억제는 70% 억제 이하와 같은, 80% 억제 이하, 90% 억제 이하, 95% 억제 이하, 98% 억제 이하와 같은, 100% 이하(즉, 발현의 완전한 억제 이하)이다. 다양한 실시예에서 유전자 발현의 조절은, 예를 들면, 표적 단백질에 대하여 고조된 적절한 항체를 이용한 웨스턴 블랏(Western blot)에 의해 따르는 SDS-PAGE와 같은 방법을 통해, 단백질 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 대체적으로, 발현 수준의 조절은, 예를 들면, 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR을 통해 mRNA의 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. mRNA 수준을 통해 측정하는 경우, 약 0.8 nM 내지 약 20 nM 사이와 같은, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM 사이와 같은, 적절한 투여량을 이용하는 경우 다운-레귤레이션의 수준은, 다양한 실시예에서, 전형적으로, 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물의 부재하에서 정상 수준의 10 - 20% 사이의 수준이다.
따라서 본 발명은 GLI2 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 GLI2 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 다운-레귤레이션 또는 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 GLI2 단밸질 및/또는 mRNA의 발현을 다운-레귤레이션 또는 억제하기 위해, 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 상기 세포와 접촉하는 것을 포함한다.
본 발명은 GLI1 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 GLI1 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 다운-레귤레이션 또는 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 GLI1 단밸질 및/또는 mRNA의 발현을 다운-레귤레이션 또는 억제하기 위해, 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 상기 세포와 접촉하는 것을 포함한다.
본 발명은 GLI3 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 GLI3 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 다운-레귤레이션 또는 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 GLI3 단밸질 및/또는 mRNA의 발현을 다운-레귤레이션 또는 억제하기 위해, 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 상기 세포와 접촉하는 것을 포함한다.
적절하게는 세포는 인간 세포와 같은 포유류 세포이다. 접촉은, 다양한 실시예에서, 시험관내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 접촉은, 다양한 실시예에서, 생체내(in vivo)에서 일어날 수 있다.
서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 85, 86 (모든 서열 부분) 및 서열번호 91, 92 및 93 (고안) 및 서열번호 112, 113 및 114 (화합물)로 나타낸 뉴클레오염기를 갖는 올리고머는 GLI1 및 GLI2를 모두 표적화한다.
본 발명은 암과 같은, 과증식 질환의 치료를 위한, 또는 GLI1 및 GLI2 (및 선택적으로 GLI3)을 발현하는 세포에서 GLI1 및 GLI2 (및 선택적으로 GLI3)의 다운-레귤레이션을 위한 올리고머의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 인간 GLI1 및 GLI2 mRNA 서열 사이 상동성의 부위를 선별하는 것, 상기 상동성의 부위의 역상보인 뉴클레오염기 서열을 갖는 올리고머를 제공하는 것, 및 본 발명에 다른 올리고머를 제조하는 것을 포함하며, 여기서 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 GLI1 또는 GLI2 mRNA 표적 중 어느 하나의 상응하는 부위에 1 또는 2 이하의 미스매치를 가진다. 따라서 상기 상동성의 부위는 GLI1 및/또는 GLI2 mRNA 서열의 상응하는 부위에 1 또는 2 미스매치, 바람직하게 1 미스매치 또는 미스매치가 없는 것을 포함할 수 있다. 상기 상동성의 부위는 본 발명의 올리고머만 일 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 추가적으로 상동성의 부위의 선별을 포함하고, 여기서 상기 부위는 GLI3 mRNA의 상응하는 부위와 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4 미스매치를 가진다. 대체적으로, 상기 방법은 추가적으로 상동성의 부위의 선별을 포함하고, 여기서 상기 부위는 GLI3 mRNA의 상응하는 부위와 1 미스매치 또는 미스매치가 없는 것과 같은, 2 이하 미스매치를 가진다.
특정 실시예에서, 서열번호: 1의 표적 부위는 서열번호 1로 기재되는 서열: 1) 뉴클레오티드 909-926, 2) 뉴클레오티드s 933-948, 3) 뉴클레오티드s 1542-1555, 4) 뉴클레오티드 1568-1586, 5) 뉴클레오티드 1647-1663, 6) 뉴클레오티드 1695-1708, 7) 뉴클레오티드 1789-1809, 및 8) 뉴클레오티드 1839-1855로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 부위와 같은, 인간 GLI1 및 인간 GLI2 사이 완벽한 매치 - 또는 이의 서브 서열인 서열을 가지는 그런 부위를 포함한다.
일부 실시예에서, 서열번호: 1의 표적 부위는 인간 GLI1 및 인간 GLI2 사이 완벽한 매치 - 또는 이의 서브 서열인 서열을 가지는 그런 부위를 포함한다.
다양한 실시예에서, 서열번호: 1의 표적 부위는 인간 GLI1, 인간 GLI2 및 인간 GLI3 사이 완벽한 매치 - 또는 이의 서브 서열인 서열을 가지는 그런 부위를 포함한다.
본 발명의 올리고머는 첫번째 5 엑손에서 일어나는 GLI2의 대체적인 스플라이스 변이 때문에 엑손 1 - 5 (즉, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 1 - 831)을 표적화하지 않는 것이 바람직하다. 그러므로, 일부 실시예에서, 표적 부위는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 832로부터 3' 대부분의 뉴클레오티드까지 부위 내에서 발견된다. 전형적으로 올리고머는 mRNA 표적의 폴리(poly)A 테일(tail)을 표적화하지 않는다.
일부 실시예에서 본 발명의 올리고머는 GLI2 mRNA의 상응하는 부위에 100% 상보적인 뉴클레오염기를 가지고, GLI1 mRNA 표적의 상응하는 부위와 1 미스매치 또는 미스매치가 없는 것과 같은, 2 이하의 미스매치를 포함한다.
이런 실시예에서, 일부 측면에서, 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 GLI3 mRNA의 최적의 배열된 표적 부위의 뉴클레오염기 서열과 비교할 때, 0, 1 또는 2 미스매치를 포함하고, 또는 다른 측면에서, GLI3 mRNA의 최적의 배열된 표적 부위의 뉴클레오염기 서열에 비교할 때 3, 4 또는 5 미스매치와 같은, 적어도 2 미스매치를 포함할 수 있다.
적절하게, 올리고머는 서열번호: 1 (인간 GLI2) 및 서열번호: 2 (인간 GLI1)의 최적의 배열된 표적 부위의 염기 서열과 비교할 때, 1 이하의 미스매치 또는 미스매치가 없는 것과 같은, 2 이하의 미스매치를 갖는 염기 서열을 가지는 것으로 고려된다.
일부 실시예에서 본 발명의 올리고머는 서열번호 1의 최적의 배열된 표적 부위의 역상보의 서열과 비교할 때, 1 미스매치 또는 미스매치가 없는 것과 같은, 0, 1 또는 2 미스매치를 갖는 연속적인 뉴클레오염기, 및 서열번호 2의 최적의 배열된 표적 부위의 역상보의 서열과 비교할 때, 적어도 1 또는 적어도 3 또는 적어도 3 미스매치를 갖는 연속적인 뉴클레오염기를 가진다.
일부 실시예에서 본 발명의 올리고머는 서열번호 134의 최적의 배열된 표적 부위의 역상보의 서열과 비교할 때, 1 미스매치 또는 미스매치가 없는 것과 같은, 0, 1 또는 2 미스매치를 갖는 연속적인 뉴클레오염기, 및 서열번호 2의 최적의 배열된 표적 부위의 역상보의 서열과 비교할 때, 적어도 1 또는 적어도 3 또는 적어도 3 미스매치를 갖는 연속적인 뉴클레오염기를 가진다.
올리고머 서열( Oligomer Sequences )
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 서열번호: 3 내지 90으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 서열을 갖는다.
또한, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머에 (완전히 또는 완벽하게) 상보적이거나 부분적으로 상보적인 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 (예를 들면, GLI2를 암호화하는 DNA 또는 mRNA)을 제공한다. 특정 실시예에서, 올리고머는 대립유전자 변이 (GLI2 유전자가 인간 크로모좀 2: 좌 2q14로부터 유래된 mRNA와 같은)와 같은, GLI2 표적 부위의 변이에 결합한다. 특정 실시예에서, 올리고머는 대립유전자 변이 (GLI1 유전자가 인간 크로모좀 12: 좌 12q13.2-q13.3로부터 유래된 mRNA와 같은)와 같은, GLI1 표적 부위의 변이에 결합한다. 특정 실시예에서, 올리고머는 대립유전자 변이 (GLI3 유전자가 인간 크로모좀 17: 좌 7p13로부터 유래된 mRNA와 같은)와 같은, GLI3 표적 부위의 변이에 결합한다. 일부 실시예에서, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 표적 부위의 변이는 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134로 기재되는 서열을 갖는 표적 부위에 적어도 60%, 더 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 따라서, 다른 실시예에서, 본 발명의 몰리고머는 서열번호: 3 내지 90으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 비교하는 경우 1, 2 또는 3개의 염기에서 다른 서열을 가진다. 전형적으로, GLI2 표적 부위의 변이에 결합하는 본 발명의 올리고머는 GLI2를 억제 (예를 들면, 다운-레귤레이팅함에 의해)할 수 있다. 전형적으로, GLI1 표적 부위의 변이에 결합하는 본 발명의 올리고머는 GLI1을 억제 (예를 들면, 다운-레귤레이팅함에 의해)할 수 있다. 전형적으로, GLI3 표적 부위의 변이에 결합하는 본 발명의 올리고머는 GLI3을 억제 (예를 들면, 다운-레귤레이팅함에 의해)할 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 예를 들면, 서열번호: 91 - 132로 보여진 서열을 갖는 올리고머와 같은, LNA 올리고머이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 mRNA 및 단백질 발현의 잠재적 억제제이다. 일부 실시예에서, 어구 "잠재적 억제제"는 실시예 5의 리포펙타민 형질전환 분석에 의해 결정되는 바와 같이 5 nM 이하의 IC50을 갖는 올리고머를 나타낸다. 일부 실시예에서, IC50은 2 nM 이하와 같은, 4 nM 이하이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 서열번호: 118 또는 서열번호: 132의 서열을 갖는 LNA 올리고머이다.
다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134에서 표적 부위의 역상보의 서열에 일치하거나 부분적으로 일치하는 염기 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다. 다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 3 - 90로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다.
특정 실시예에서, 올리고머는 포유류 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 서열에 완전히 상보적인 (완벽하게 상보적인) 염기 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다.
그러나, 일부 실시예에서, 올리고머는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 표적 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위에 비교하여 1, 2, 3, 또는 4 (또는 그 이상) 미스매치를 포함하고, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 mRNA 또는 단백질 발현의 억제 효과를 위해, 표적 부위에 충분히 결합한다. 왓슨-크릭 수소결합된 듀플렉스에서 미스매치의 불안정성 효과는, 예를 들면, 올리고머의 증가된 길이 및/또는 올리고머 내에 존재하는, LNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드 유사체의 증가된 수에 의해 보상될 수 있다.
다양한 실시예에서, 상기 올리고머 염기 서열은, 예를 들면 포유류 GLI2 또는 GLI1 또는 GLI3을 암호화하는 표적 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위의 염기 서열에 비교하여 2 또는 그 이상의 미스매치와 같은, 3 이하를 포함한다.
일부 실시예에서, 올리고머 염기 서열은 포유류 GLI2를 암호화하는 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위의 염기 서열에 비교하는 경우, 하나 이하의 미스매치를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은, 서열번호: 3 - 90로 구성된 군으로부터 선택된 염기 서열에 대해, 100% 동일한 것과 같은, 적어도 99% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 85% 동일한 것과 같은, 적어도 80% 동일한 것이 바람직하다.
특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134에 존재하는 표적 부위의 역상보의 염기 서열에 대해, 100% 동일한 것과 같은, 적어도 99% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 85% 동일한 것과 같은, 적어도 80% 동일한 것이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134의 표적 부위에 대해, 100% 상보적인 (완벽하게 상보적인) 것과 같은, 적어도 99% 상보적인, 적어도 98% 상보적인, 적어도 97% 상보적인, 적어도 96% 상보적인, 적어도 95% 상보적인, 적어도 94% 상보적인, 적어도 93% 상보적인, 적어도 92% 상보적인, 적어도 91% 상보적인, 적어도 90% 상보적인, 적어도 85% 상보적인 것과 같은, 적어도 80% 상보적인 것이 바람직하다.
일부 실시예에서 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)는 서열번호: 3, 10, 19, 35, 59, 및 75로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지거나, 또는 서열번호: 3, 10, 19, 35, 59, 및 75의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위는, 선택된 서열 또는 이의 부위로 선택적으로 정렬하는 경우, 서열번호: 3, 10, 19, 35, 59, 및 75의 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열을 갖는 올리고머에서 이로부터 다른 (예를 들면, 미스매치인) 하나, 둘 또는 세개의 염기 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "첫번째 부위(first region)"은 올리고머의 일부 (서브-서열)을 나타낸다. 예를 들면, 서열번호: 19로 기재되는 16 모노머 서열은, 즉 서열번호: 19로 기재되는 서열을 포함하는 서열번호: 87로 기재되는 서열인, 서열번호: 87로 기재되는 24 모노머 서열의 서브서열이다.
일부 실시예에서 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)는 서열번호: 85 - 90으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열을 갖는다. 다른 실시예에서, 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)의 서열은 선택된 서열 또는 이의 부위로 선택적으로 정렬하는 경우, 서열번호: 85 - 90으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열로부터 다른 하나, 둘 또는 세 개의 염기 부분을 포함한다.
다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호 3, 10, 19, 35, 59 및 75로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 동일하게 존재하는 염기 서열을 갖는, 12 - 16과 같은, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머의 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 3, 10, 19, 35, 59 및 75의 서열을 갖는 올리고머로부터 다른 하나, 둘 또는 세 개의 염기 부분을 포함하는 부위를 포함한다.
일부 실시예에서 첫번째 부위는 12 - 16 모노머와 같은, 12 - 18 모노머와 같은, 12 - 22 모노머와 같은, 12 - 24 모노머와 같은, 9 - 22 모노머와 같은, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29 연속적인 모노머로 구성된다. 적절하게, 일부 실시예에서, 첫번째 부위는 본 발명의 올리고머와 동일한 길이로 구성된다.
일부 실시예에서 올리고머는 올리고머의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 추가적인 모노머와 같은, 첫번째 부위의 5' 및/또는 3' 말단에 추가적인 모노머를 포함하며, 이는 표적 부위에 비상보적이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 표적에 상보적인 첫번째 부위를 포함하며, 이는 표적 부위에 상보적인 추가적인 모노머에 의해 플랭크된 5' 및/또는 3'이다. 일부 실시예에서 추가적인 5' 또는 3' 모노머는 DNA 또는 RNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드이다. 다양한 실시예에서, 5' 또는 3' 모노머는 본 발명의 갭머 올리고머의 문맥에서 기재된 바와 같은 부위 D를 나타낸다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 85에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 86에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 또는 15와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 87에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 88에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 89에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 90에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 9에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 16에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 17에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 18에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 34에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 35에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 50에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 51에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 52에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 53에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 54에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 55에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 56에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 57에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 58에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 59에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 74에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 75에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 이의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체( Nucleosides and Nucleoside analogues )
일부 실시예에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 및 "뉴클레오티드 유사체"는 상호교환적으로 사용된다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 모노머는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모유라실(5-bromouracil), 5-프로피닐유라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine), 크산틴(xanthine) 및 하이포크산틴(hypoxanthine)으로부터 선택되는 염기와 같은, 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오시드 유사체이다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 모노머는 변형된 당을 포함하는 뉴클레오시드 유사체이다.
일부 실시예에서, 올리고머의 적어도 2 연속적인 모노머 사이 연결은 포스포디에스테르 연결과는 다른 것이다.
특정 실시예에서, 올리고머는 변형된 염기를 갖는 적어도 하나의 모노머, 변형된 당을 갖는 적어도 하나의 모노머 (동일한 모노머일 수 있는), 및 비-자연적으로 발생하는 적어도 하나의 모노머 사이 연결을 포함한다.
뉴클레오시드 유사체의 특정 예로는, 예를 들면 Freier & Altmann; Nucl . Acid Res ., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr . Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213에 의해 기재되고, 도식(Scheme) 1 (뉴클레오티드로 보여지는 일부 뉴클레오시드 유사체)에 기재되어 있다.
Figure pct00001
도식 1
따라서 올리고머는 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드의 단순한 서열 - 바람직하게는 DNA 모노머 뿐만 아니라, RNA 모노머, 또는 뉴클레오시드 및 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체의 조합을 포함 또는 구성할 수 있다. 일부 실시예에서, 이런 뉴클레오시드 유사체는 표적 핵산의 표적 부위에 대한 올리고머의 친화성을 적절하게 증진시킨다.
적절하고 바람직한 뉴클레오시드 유사체의 예로는 WO2007/031091에 기재되어 있고, 이는 본 발명에 참조된다.
일부 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 2'-O-알킬-리보스 당(2'-O-alkyl-ribose sugars), 2'-아미노-디옥시리보스 당(2'-amino-deoxyribose sugars), 및 2'-플루오로-디옥시리보스 당(2'-fluoro-deoxyribose sugars)와 같은, 2' 치환기를 제공하기 위해, 변형된 당 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 결합 친화성을 증진시키는 두 고리의 당(bicyclic sugar)(LNA)을 포함하고, 또한 일부 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있다. 다양한 실시예에서, LNA 모노머는 옥시(oxy)-LNA(베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA과 같은), 및/또는 아미노(amino)-LNA(베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA과 같은) 및/또는 티오(thio)-LNA(베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA과 같은) 및/또는 ENA(베타-D-ENA 및 알파-L-ENA와 같은)로부터 선택된다. 특정 실시예에서, LNA 모노머는 beta-D-oxy-LNA이다. LNA 모노머는 추가적으로 하기 기재된다.
다양한 실시예에서, LNA 모노머 또는 2' 치환된 당을 포함하는 모노머와 같은, 올리고머에서 친화성을 증가시키는 뉴클레오시드 유사체의 통합, 또는 변형된 연결기의 통합은 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공한다. 다양한 실시예에서, 친화성을 증가시키는 뉴클레오시드 유사체의 통합은 올리고머의 크기를 줄이고, 또한 표적 서열의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 줄인다.
일부 실시예에서, 올리고머는 적어도 1개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고머는 적어도 2개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고머는, 예를 들면 6 또는 7개의 뉴클레오시드 유사체인, 적어도 3 - 8개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 다양한 실시예에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산 (LNA) 모노머; 예를 들면 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7 또는 8, 뉴클레오시드 유사체는 LNA 모노머이다. 일부 실시예에서, 모든 뉴클레오시드 유사체는 LNA 모노머이다.
바람직한 올리고머 염기 서열을 나타내는 경우, 특정 실시예에서, 올리고머는 올리고머/표적 부위 듀플렉스의 듀플렉스 안정성 (Tm)을 증가시키는, LNA 모노머 또는 다른 상응하는 뉴클레오시드 유사체와 같은 (즉, 친화성 증진시키는 뉴클레오시드 유사체), 상응하는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 것으로 인지될 것이다.
다양한 실시예에서, 올리고머의 염기서열과 표적 부위의 염기서열 사이 특정 미스매치 (즉, 비-상보성)이 존재하는 경우, 이는 본 발명에 기재된 바와 같은 부위 B 내에, 및/또는 본 발명에 기재된 바와 같은 부위 D 내에, 및/또는 움 모노머로 구성된 부위에, 및/또는 표적 부위에 상보적인 올리고머의 부위에 5' 또는 3' 부위에서와 같은, 친화성을 증진시키는 뉴클레오시드 유사체 (예를 들면, 부위 A 또는 C)를 포함하는 올리고머의 부위에서와 다르게 위치되는 것이 바람직하다.
일부 실시에서 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오시드 유사체 (본 발명에 기재된 부위 A 및 C와 같은)는, 예를 들면: 2'-O-알킬-리보스 당(2'-O-alkyl-ribose sugars)을 포함하는 모노머, 2'-아미노-디옥시리보스 당(2'-amino-deoxyribose sugars)을 포함하는 모노머, 2'-플루오로-디옥시리보스 당(2'-fluoro-deoxyribose sugars)을 포함하는 모노머, LNA 모노머, 아라비노스 당(rabinose sugars)을 포함하는 모노머("ANA 모노머"), 2'-플루오로-아라비노스 당(2'-fluoro-arabinose sugars)을 포함하는 모노머, d-아라비노-헥시톨 당(d-arabino-hexitol sugars)을 포함하는 모노머("HNA 모노머"), 본 발명에 참조로서 통합되는 Christensen, 2002. Nucl . Acids . Res. 2002 30: 4918-4925로 정의되는 바와 같은 인터칼레이팅 모노머(intercalating monomers), 및 2'-O-메톡시에틸 리보스(2'-O-methoxyethyl-ribose, 2'MOE) 당으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머에 존재하는 뉴클레오시드 유사체의 상기 형태 중 오직 하나, 또는 이의 부위가 있다.
특정 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 2'MOE 당, 2'-플루오로-디옥시리보스 당, 또는 LNA 당을 포함하고, 이러한 본 발명의 올리고머는 이러한 3가지 형태로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 특정 올리고머 실시예에서, 적어도 하나의 상기 뉴클레오시드 유사체는 2'-MOE-리보스 당을 포함하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2'-MOE-리보스 당을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 당을 포함하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2'-플루오로-디옥시리보스 당을 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 3 - 7 또는 4 내지 8 LNA 모노머, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 LNA 모노머와 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 잠금핵산(LNA) 모노머를 포함한다. 다양한 실시예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 모노머이다. 특정 실시예에서, 올리고머는 베타-D-옥시-LNA 모노머, 및 하나 또는 그 이상의 하기 LNA 모노머: 베타-D 또는 알파-L의 구성 또는 이의 조합 중 어느 하나의 티오-LNA 모노머, 아미노-LNA 모노머, 옥시-LNA 모노머, 및/또는 ENA 모노머를 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 모든 LNA 시토신 유닛은 5'메틸-시토신(5'methyl-Cytosine)이다. 특정 실시예에서, 올리고머에 모든 LNA 모노머의 시토신 염기 부분은 5-메틸시토신(5-methylcytosines)이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 올리고머는 LNA 및 DNA 모두를 포함한다. 전형적으로, LNA 및 DNA 모노머의 조합된 전체는 10 - 25, 바람직하게는 10 - 24, 바람직하게는 10 - 20, 바람직하게는 10 - 18, 더욱 바람직하게는 12 - 16이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 올리고머 또는 이의 부위는 적어도 하나의 LNA 모노머, 및 나머지 모노머는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 올리고머는 선택적으로 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 같은 변형된 연결기(linkage group)를 갖는 오직 LNA 모노머 및 뉴클레오시드 (RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 모노머와 같은)를 포함한다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 염기를 가진다.
LNA
용어 "LNA" 또는 "LNA 모노머"는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid)으로 알려진, 두 고리의 뉴클레오시드 유사체를 나타낸다. "LNA 올리고뉴클레오티드"의 문맥에서 사용되는 경우, LNA는 하나 또는 그 이상의 이런 두 고리의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. LNA 뉴클레오시드는 두 고리의 시스템을 형성하기 위해 리보스 당의 C2' 및 C4' 사이에 - 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 R4 * 및 R2 * 기 사이에, 연결기(가교와 같은)의 존재에 의해 특정된다
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물 (올리고머)에 사용되는 LNA는 일반적인 화학식 I의 구조를 가지는 것이 바람직하다
Figure pct00002
화학식 I
여기서 모든 키랄 중심(chiral centers)을 위해, 비대칭기(asymmetric groups)는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다;
여기서 X는 -O-, -S-, -N(RN *)-, -C(R6R6 *)-으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게 -O-이다;
B는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -4 알콕시(alkoxy), 선택적으로 치환된 C1 -4 알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C1 -4 아실옥시(acyloxy), 자연적으로 발생하는 것을 포함하는 뉴클레오염기 및 뉴클레오염기 유사체, DNA 인터칼레이터(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 선택되는 것이고, B는 뉴클레오염기 또는 뉴클레오염기 유사체이다;
P는 인터뉴클레오티드 연결, 또는 치환된 R5를 선택적으로 포함하거나 치환된 R5 *를 동일하게 적용가능한 5'-말단기와 같은, 인접한 모노머에 대한 인터뉴클레오티드 연결, 또는 5'-말단기를 나타낸다;
P*은 인접한 모노머에 대한 인터뉴클레오티드 연결, 또는 3'-말단기를 나타낸다;
R4 * 및 R2 *은 각각 모두 예를 들면, C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 ＞C=Z로부터 각 독립적으로 선택되는 1 - 4 그룹/원자로 구성되는 이가라디칼(biradical)과 같은 이가 연결기를 형성하며, 여기서 Z는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)-로부터 선택되는 것이고, Ra 및 Rb는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는 것이며, 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 형성할 수 있으며, 여기서 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
각각의 치환기 R1 *, R2, R3, R5, R5 *, R6 및 R6 *는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드옥시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카르복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카르바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands), 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 모두는 옥소(oxo), 티옥소(thioxo), 이미노(imino), 또는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있으며; 여기서 RN은 수소 및 C1 -4 알킬(alkyl)로부터 선택되고, 여기서 두 인접한(비-이중의) 치환기는 이중 결합에 따르는 추가적인 결합을 나타낼 수 있으며; 이의 염기성염(basic salts) 및 산부가염(acid addition salts)으로부터 독립적으로 선택된다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
본 발명에서 사용된 정의가 치환된 C1 -4-알킬, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C1 -12-알킬, 치환된 C2 -12-알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -12-알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -12-알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -4-알콕시, 치환된 C1 -4-아실옥시, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 메틸렌, 치환된 아실, 치환된 C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 아마이드인 경우, 적절한 치환기는 하나 또는 그 이상의 Rg 기를 포함하고, 여기서 각 Rg는 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, CN, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, C(=X)J1, C(=X)NJ1J2, CN, O-C(=O)NJ1J2, O-C(=X)J1, NJ1C(=NH)NJ1J2 및 NJ1C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되는 것이며, 여기서 X는 O 또는 S이고; J1 및 J2 각각은 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2-6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기(protecting group)로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 적절한 보호기는 heodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)에 의해 "유기합성에서 보호시"에 기재되어 있다.
일부 실시예에서, 연결기를 형성하는 R4 * 및 R2 * 모두는 C(RaRb)-C(RaRb)-, C(RaRb)-O-, C(RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S-, 및 C(RaRb)-C(RaRb)-O-로부터 선택되고, 여기서 여기서 Ra 및 Rb는 하기 정의된 바와 같다. 일부 실시예에서, Ra 및 Rb는 각각 수소 및 C1 - 6알킬로부터 독랍적으로 선택되는 것이고, 이는 각각 수소 및 메틸로부터 독랍적으로 선택되는 것이 더 바람직하다.
일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬, 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택된 것이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3는 각각 수소, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬, 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택된 것이다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3는 모두 수소이다.
일부 실시예에서, R5 및 R5 *는 각각 H, -CH3, -CH2-CH3,- CH2-O-CH3, 및 -CH=CH2로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 바람직하게, 일부 실시예에서, R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 수소이고, 나머지 기(R5 또는 R5* 각각)은 C1 -5 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알키닐 및 치환된 아실 (-C(=O)-)로부터 선택되는 것이고; 여기서 각 치환된 기는 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 및 N(H)C(=X)N(H)J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로, 모노 또는 폴리 치환된 것이며; 여기서 X는 O 또는 S이고, J1 및 J2 각각은 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기(protecting group)로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 메틸렌이고, 여기서 바람직한 치환기는 F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 및 N(H)C(O)N(H)J2로부터 독립적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 기를 포함한다. 일부 실시예에서 각 J1 및 J2는 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 메틸, 에틸 또는 메톡시메틸이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 에틸레닐(ethylenyl)이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 아실이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 C(=O)NJ1J2이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 상기 5' 변형된 두 고리의 부분의 예로는, 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는, WO 2007/134181에 기재되어 있다.
일부 실시예에서 B는 퓨린 또는 피리미딘, 또는 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘과 같은, 뉴클레오염기 유사체 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기, 또는 아데닌, 시토신, 티민, 아데닌, 유라실로부터 선택되는 뉴클레오염기, 및/또는 5-티아졸로-유라실(5-thiazolo-uracil), 2-티오-유리실(2-thio-uracil), 5-프로피닐-유라실(5-propynyl-uracil), 2'티오-티민(2'thio-thymine), 5-메틸-시토신(5-methyl cytosine), 5-티오놀로-시토신(5-thiozolo-cytosine), 5-프로피닐-시토신(5-propynyl-cytosine) 및 2,6-디아미노퓨린(2,6-diaminopurine)과 같은, 변형되거나 치환된 뉴클레오염기를 포함하는, 뉴클레오염기이다.
일부 실시예에서 R4 * 및 R2 *는 모두 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)- N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-O-, -C(RaRb)-S- 및 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-로부터 선택되는 연결기를 형성하고, 여기서 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 선택적으로 치환되고, 여기서 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-, -CH2-CH2- 및 -CH=CH-로부터 선택되는 연결기를 나타낸다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-N(Rc)-O-를 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고, 보다 바람직하게 Ra 및 Rb는 수소이며; 및 여기서 Rc는 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 선택된 것이며, 보다 바람직하게 Rc는 수소이다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-O-C(RcRd) -O-를 형성하고, 여기서 Ra, Rb, Rc, 및 Rd는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고, 보다 바람직하게 Ra, Rb, Rc, 및 Rd는 수소이다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 -CH(Z)-O-를 형성하고, 여기서 Z는 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 및 치환된 티올로부터 선택되는 것이고; 여기서 각각의 치환기는 할로겐, oxo, hydroxyl, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN로부터 독립적으로 선택된 선택적으로 보호된 치환기로 독립적으로 모노 또는 폴리 치환된 것이며, 여기서 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 일부 실시예에서, Z는 C1 -6 알킬 또는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 Z는 메틸이다. 일부 실시예에서 Z는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 상기 치환기는 C1 -6 알콕시이다. 일부 실시예에서 Z는 CH3OCH2-이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오시드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 US 7,399,845에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, 상기 및 WO 2007/134181에 나타낸 바와 같이, R1 *, R2, R3 *는 수소이고, R5, R5 * 중 어느 하나 도는 둘 모두는 수소와 다를 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 치환된 아미노기를 포함하는 연결기를 형성하고, 예를 들면, R4 * 및 R2 *는 모두 기 -CH2-N(Rc)-로 구성되거나 포함하며, 여기서 Rc는 C1 - 12 알킬옥시이다. 일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 -Cq3q4-NOR-를 형성하고, 여기서 q3 및 q4는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고; 여기서 각 치환기는 할로겐, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)N J1J2 및 N(H)C(=X=N(H)J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노 또는 폴리 치환된 것이며, 여기서 X는 O 또는 S이고; 및 여기서 J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 및 보호시로부터 독립적으로 선택된다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오티드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/150729에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, 상기 및 WO 2007/134181에 기재된 바와 같이, R1 *, R2, R3는 모두 수소이고, R5, R5 * 중 어느 하나 또는 둘 모두는 수소와 다른 것일 수 있다. 일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-O-를 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJ1 SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 선택된 것이고; 또는 Ra 및 Rb는 모두 =C(q3)(q4)이며; q3 및 q4는 각각 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이고; 각 치환기는 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2- C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노 또는 폴리 치환된 것이며; J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기로부터 독립적으로 선택된 것이다. 이런 화합물은 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2009/006478에 기재된다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 연결기 -Q-를 형성하고, 여기서 Q는 C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4) 또는 C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]이고; q1, q2, q3, q4는 각각 H, 할로겐, C1 -12 알킬, 치환된 C1 -12 alkyl, C2-12 알케닐, 치환된 C1 -12 알콕시, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)-NJ1J2, C(=O) J1, -C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되며; J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 및 보호기로부터 독립적으로 선택되는 것이고; 및 선택적으로 여기서 Q는 C(q1)(q2)(q3)(q4)이고 q3 또는 q4 중 어느 하나는 CH3이며 q3 또는 q4 중 적어도 다른 하나 또는 q1 및 q2 중 하나는 H와 다른 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오티드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/154401에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3는 모두 수소이고 R5, R5 * 중 어느 하나 또는 둘 모두는 상기 및 WO 2007/134181 또는 WO2009/067647에 나타낸 바와 같이 수소와 다른 것일 수 있다 {알파-L-두 고리 핵산 유사체(alpha-L-bicyclic nucleic acids analogs)}.
일부 바람직한 실시예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 존재하는 LNA 모노머는 바람직하게 일반적인 화학식 II의 구조를 가진다:
Figure pct00003
화학식 II
여기서 Y는 -O-, -CH2O-, -S-, -NH-, N(Re) 및 CH2-로부터 선택되는 것이고; Z 및 Z*는 인터뉴클레오티드 연결, RH, 말단기 및 보호기로부터 독립적으로 선택되는 것이며; B는 자연적 또는 비자연적 뉴클레오염기 부분 (뉴클레오염기)를 구성하고, RH는 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되며; Ra, Rb Rc, Rd 및 Re는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드옥시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카르복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카르바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands), 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고, 여기서 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb 모두는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있으며; 여기서 RN은 수소 및 C1 -4 알킬(alkyl)로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시예에서 Ra, Rb Rc, Rd 및 Re는 각각 수소 및 C1 -6 알킬(alkyl)로부터 독립적으로 선택되고, 더욱 바람직하게 메틸이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있으며, 예를 들면, 두 예시적인 입체화학적 이성질체는 베타-D 및 알파-L 아형을 포함하며, 이는 하기와 같이 기재될 수 있다:
Figure pct00004
구체적인 예시적 LNA 유닛은 하기에 보여진다 (도식 2에서):
Figure pct00005
도식 2
용어 "티오(thio)-LNA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오시드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "아미노(amino)-LNA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오시드를 포함하고, 여기서 R은 수소 및 C1 -4-알킬(alkyl)로부터 선택된다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "옥시(oxy)-LNA는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -O-로 나타내는 잠금 뉴클레오시드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "ENA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -CH2-O-(-CH2-O-의 산소 원자는 염기 B에 관하여 2'-위치에 접합된)인 잠금 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 예시적인 실시예에서 LNA는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA), 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA(beta-D-amino-LNA) 및 베타-D-티오-LNA(beta-D-thio-LNA)로부터 선택되는 것이고, 특히 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA)이다.
리보핵산분해효소 H 수집( RNAse H recruitment )
일부 실시예에서, 올리고머는 번역, 또는 다른 기작의 입체적 방해와 같은, 표적 mRNA의 비-리보핵산분해효소(non-RNase) 매개 분해를 통하여 기능한다; 그러나, 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 리보핵산분해효소 H(RNase H)와 같은, 엔도-리보핵산분해효소(RNase)와 같은, 하나 또는 그 이상의 RNAse 효소 또는 복합체를 선별할 수 있다.
전형적으로, 올리고머는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머를 포함하는, 적어도 8 또는 적어도 9 연속적인 모노머와 같은, 적어도 7 연속적인 모노머와 같은, 적어도 6 부위를 포함하고, 이는 표적 RNA의 표적 부위와 듀플렉스(duplex)를 형성하는 경우, RNase를 수집할 수 있다. RNase를 수집할 수 있는 올리고머의 부위는 본 발명에 기재된 갭머(gapmer)의 문맥에서 나타낸 바와 같은, 부위 B일 수 있다. 일부 실시예에서, 부위 B와 같은, RNase를 수집할 수 있는 올리고머의 부위는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 모노머로 구성된다.
EP 1 222 309는 시험관 내(in vitro)에서 RNase H 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 이는 RNase H를 수집하는 본 발명의 올리고머의 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 부위와 접촉되는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, 본 발명에 참조로서 통합되는 EP 1 222 309의 실시예에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결기(linkage groups)를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 초기속도(initial rate)는, 적어도 10% 또는 20% 이상과 같은, 적어도 5%와 같은, 적어도 1%와 같은, pmol/ℓ/min으로 측정되는 바와 같은, 초기 속도를 갖는다.
일부 실시예에서, 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 표적 부위를 RNaseH와 접촉시키는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, pmol/ℓ/min로 측정되는 RNaseH 초기속도는, EP 1 222 309의 실시예 91 - 95에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 바와 같은, 적어도 10% 이하 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5% 이하와 같은, 적어도 1% 이하이다.
다른 실시예에서, 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 표적 부위를 RNaseH와 접촉시키는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, pmol/ℓ/min로 측정되는 RNaseH 초기속도는, EP 1 222 309의 실시예 91 - 95에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 바와 같은, 적어도 80%와 같은, 적어도 60%와 같은, 적어도 40%와 같은, 적어도 20%이다.
전형적으로, 표적 RNA의 상보적인 표적 부위와 듀플렉스를 형성하고 RNase를 수집할 수 있는, 올리고머의 부위는 DNA 모노머 및 선택적으로 LNA 모노머를 포함하고, 표적 부위와 DNA/RNA-유사 듀플렉스를 형성한다. LNA 모노머는 바람직하게 알파-L-배열(alpha-L configuration)에 있고, 특히 바람직하게 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy LNA)일 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체 모두를 포함하고, 갭머(gapmer), 헤드머(headmer) 또는 믹스머(mixmer)의 형태일 수 있다.
"헤드머(headmer)"는 부위 X의 3'-대부분의 모노머에 연결된 부위 Y의 5'-대부분의 모노머를 갖는, 부위 X 및 이에 연속적인 부위 Y를 포함하는 올리고머로 정의된다. 부위 X는 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장을 포함하고 부위 Y는 RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머 (적어도 7 연속적인 모노머)의 연속적인 신장를 포함한다.
"테일머(tailmer)"는 부위 X의 3'-대부분의 모노머에 연결된 부위 Y의 5'-대부분의 모노머를 갖는, 부위 X 및 이에 연속적인 부위 Y를 포함하는 올리고머로 정의된다. 부위 X는 RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머 (적어도 7 연속적인 모노머)의 연속적인 신장를 포함하고, 부위 Y는 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장을 포함한다.
그 외 "키메릭(chemeric)" 올리고머는 (i) RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 변형된 뉴클레오시드 유사체 모노머, 및 (ii) 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체 모노머의 대체 조성물로 구성되는 "믹스머(mixmers)"라고 불린다.
일부 실시예에서, 표적 부위에 대한 올리고머의 친화성을 증진시키는 것에 더하여, 일부 뉴클레오티드 유사체는 RNase (예를 들면, RNase H) 결합 및 절단을 매개한다. α-L-LNA 모노머가 특정 확장에 대해 RNase 활성을 수집하기 때문에, 일부 실시예에서, α-L-LNA 모노머를 포함하는 올리고머의 갭머 부위 (예를 들면, 본 발명에 언급된 부위 B)는 RNaseH에 의해 인식 및 절단되는 몇몇의 모노머로 구성되고, 믹스머 컨스트럭션(construction)에 더욱 높은 유연성이 도입된다.
결합체( Conjugates )
본 발명의 문맥에서, 용어 "결합체"는 핵산 또는 모노머 ("접합된 부분(conjugated moieties)") 자체가 아닌 하나 또는 그 이상의 부분에 대해, 본 발명에 기재된 바와 같은 올리고머의 공유 접합("접합(conjugation)")에 의해 형성되는 화합물을 나타낸다. 이런 접합된 부분의 예로는 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 폴리머, 또는 이의 조합을 포함한다. 전형적으로 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 제공되는 것은, 본 발명에 기재된 바와 같은, 올리고머를 포함하는 결합체, 상기 올리고머에 공유적으로 접합된, 핵산 또는 모노머가 아닌 적어도 하나의 접합된 부분이다. 그러므로, 특정 실시예에서 본 발명의 올리고머는 본 발명에 기재된 바와 같은 특정된 염기의 서열을 가지는 연속적인 모노머로 구성되고, 상기 결합체는 올리고머에 공유적으로 접합된 적어도 하나의 접합된 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예서, 올리고머는 올리고머성 화합물의 세포의 흡수를 증가시키는 부분에 접합된다. WO2007/031091은 적절한 리간드 및 결합체 (부분)을 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
다양한 실시예에서, 접합 (접합된 부분에 대해)은 본 발명의 올리고머의 활성, 세포의 분배 또는 세포의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 부분은 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 부분과 같은 지질 부분, 콜린산, 티오에스터(thioester), 예를 들면, 헥실-s-트리틸티올(Hexyl-s-tritylthiol), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들면, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 언데실 잔기(undecyl residues), 인지질(phospholipids), 예를 들면, 디-헥사데실-랙-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸암모늄 1, 2-디-o-헥사데실-랙-글리세로-3-h-포스포네이트(triethylammonium 1,2-di-o-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate), 폴리아민(polyamine) 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(polyethylene glycol chain), 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid), 팔미틸 부분(palmityl moiety), 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)을 포함하나 이에 한정하지 아니다.
특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들면, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨제, 항박테리아 또는 항생제와 같은, 활성 약제 물질에 접합될 수 있다.
특정 실시예에서 접합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시예에서, 접합된 부분은, 길이에 있어서 3 - 10 아미노산 잔기와 같은, 2 - 20과 같은, 1 - 50의 양전하 펩티드와 같은, 양전하 폴리머, 및/또는 폴리에틸글리콜(polyethylglycol, PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol)과 같은 폴리알킬렌옥사이드(polyalkylene oxide)를 포함 또는 구성한다 - 본 발명에서 참조로서 통합되는 WO 2008/034123 참조. 적절하게는 폴리알킬렌옥사이드와 같은, 양전하 폴리머는 WO 2008/034123에 기재된 방출가능한 링커(linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 올리고머에 접합될 수 있다.
실시예 중에, 하기 부분은 본 발명의 결합체에 사용될 수 있다:
Figure pct00006
활성화된 올리고머( Activated oligomers )
본 발명에서 사용되는, 용어 "활성화된 올리고머(Activated oligomer)"는 본 발명에 기재된 결합체를 형성하기 위해, 올리고머를 하나 또는 그 이상의 접합된 부분, 즉, 핵산 또는 모노머 자체가 아닌 부분에 공유 결합할 수 있게 하는, 적어도 하나의 기능적 부분(functional moiety)에 공유적으로 결합되는 본 발명의 올리고머를 나타낸다. 전형적으로는, 기능적 부분은 예를 들면, 아데닌(adenine) 염기의 3'-하이드록실(hydroxyl)기 또는 엑소사이클릭(exocyclic) NH2기를 통해 올리고머에 공유적으로 결합할 수 있는 화학기(chemical group), 바람직하게는 친수성인 스페이서(spacer), 및 결합된 부분에 결합할 수 있는 말단기 (예를 들면, 아미노(amino), 설피드릴(sulphydryl) 또는 하이드록실(hydroxyl)기)를 포함할 것이다. 일부 실시예에서, 이런 말단기는 보호되지 않으며, 예를 들면 NH2 기이다. 다른 실시예에서, 말단기는 예를 들면, Theodora W Greene 및 Peter G M Wuts에 의한 "Protective Groups in Organic Synthesis" 3판(John Wiley & Sons, 1999)에 기재된 것과 같은 임의의 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 하이드록실 보호기의 예로는 아세테이트 에스터(acetate ester)와 같은 에스터, 벤질(benzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 또는 트리페닐메틸(triphenylmethyl)과 같은 아랄킬(aralkyl)기, 및 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl)을 포함한다. 적절한 아미노 보호기의 예로는 벤질(benzyl), 알파-메틸벤질(alpha-methylbenzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 터트- 부트옥시카모닐(tert-butoxycarbonyl), 및 트리콜로아세틸(trichloroacetyl) 또는 트리플루오로아세틸(trifluoroacetyl)과 같은 아실(acyl)기를 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 부분은 자가절단(self-cleaving)된다. 다른 실시예에서, 기능적 부분은 생물 분해성이다. 예를 들면, 미국 특허 제 7,087,229호를 참조하고, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합된다.
일부 실시예서, 본 발명의 올리고머는 올리고머의 5' 말단에서 접합된 부분의 공유 결합을 하기 위해 5' 말단에서 활성화 (즉, 기능화)된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 기능화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 백본(backbone)을 따라 또는 이종고리(heterocyclic) 염기 부분에서 기능화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 5' 말단, 3' 말단, 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 위치에서 기능화될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능적 부분에 공유적으로 접합되는 하나 또는 그 이상의 모노머가 합성되는 동안 통합됨으로써 합성된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능화되지 않는 모노머로 합성되고, 상기 올리고머는 합성의 완결에 따라 기능화된다.
일부 실시예에서, 올리고머는 아미노알킬(aminoalkyl) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 기능화되고, 여기서 알킬 부분은 화학식 (CH2)w를 갖고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있으며, 여기서 기능기는 에스터기 (-O-C(O)-(CH2)wNH)를 통해 올리고머에 접합된다.
다른 실시예에서, 올리고머는 (CH2)w-설피드릴 (SH) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 기능화되고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있으며, 여기서 기능기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wSH)를 통해 올리고머에 접합된다. 일부 실시예에서, 설피드릴로 활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩티드 (다이설파이드 결합의 형성을 통해)와 같은 폴리머 부분으로 접합된다.
상기 기재된 바와 같은 방해된 에스터를 포함하는 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히, PCT 출원번호 WO 2008/034122 및 이의 실시예에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있고, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합된다.
적어도 하나의 기능적 부분에 공유적으로 연결된 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히, 미국 출원번호 2004/0235773, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되고, Zhao et al . (2007) J. Controlled Release 119:143-152; 및 Zhao et al . (2005) Bioconjugate Chem. 16:758-766에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재된 것과 같이 실질적으로 기능화 시약(reagent), 즉, 보호된 또는 비보호된 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 포함하는 반대편 말단에 친수성 스페이서(spacer) 사슬을 통해 연결된 하나의 말단에 포스포라미다이트(phosphoramidite)를 갖는 사실상 선형 시약의 수단으로 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기의 올리고머로의 도입을 통해 기능화된다. 이러한 시약은 일차적으로 올리고머의 하이드록실기와 반응한다. 일부 실시예에서, 이러한 활성화된 올리고머는 올리고머의 5'-하이드록실기에 결합되는 기능화 시약을 가진다. 다른 실시예에서, 활성화된 올리고머는 3'-하이드록실기에 결합하는 기능화 시약을 가진다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본에 있는 하이드록실기에 결합되는 기능화 시약을 가진다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 통합되는 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 기능화 시약으로 기능화된다. 이러한 기능화 시약 및 모노머 또는 올리고머로의 통합의 합성 방법은 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재되어 있다.
일부 실시예에서, 고체상 결합(solid-phase bound) 올리고머의 5'-말단은, 비보호된 올리고머와 예를 들면, Diels-Alder Cycloaddition reaction을 통한 아미노산 또는 펩티드의 접합에 의한, 디에닐 포스포라미다이트(dienyl phosphoramidite) 유도체로 기능화된다.
다양한 실시예에서, 2'-카바메이트(carbamate) 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈리미도)-디옥시리보오스{2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-deoxyribose}당과 같은, 2'-당 변이체를 포함하는 모노머의 올리고머로의 통합은 올리고머의 당에 접합된 부분의 공유 접합을 촉진한다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 모노머의 2'-부분에 아미노를 포함하는 링커를 갖는 올리고머는, 예를 들면, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈리미딜아미노펜틸)-2'-디옥시아데노신-3'-N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미다이트{5'-dimethoxytrityl-2'-O-(e-phthalimidylaminopentyl)-2'-deoxyadenosine-3'--N,N-diisopropyl-cyanoethoxy phosphoramidite}와 같은, 시약을 이용하여 제조된다. 예를 들어, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171을 참조해라.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린(purine) 아미노기, 구아닌(guanine)의 엑소사이클릭 N2, 또는 시토신(cytosine)의 N4 또는 5 부분에 포함된, 뉴클레오염기에 아민(amine)을 포함하는 기능 부분을 가진다. 다양한 실시예에서, 이러한 기능화는 올리고머 합성에서 이미 기능화된 상업적인 시약을 이용하여 수득할 수 있다.
일부 기능적 부분은 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, 헤테로이중기능성 및 호모이중기능성 연결 부분은 Pierce Co.(Rockford, IⅡ)로부터 이용 가능하다. 다른 상업적으로 이용가능한 연결기는 5'-아미노-개질제(modifier) C6 및 3'-아미노-개질제 시약이고, 이들은 모두 Glen Research Corporation (Sterling, Va.)으로부터 이용가능하다. 5'-아미노-개질제 C6은 또한 Aminolink-2로서 ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)로부터 이용가능하고, 3'-아미노-개질제는 또한 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)로부터 이용가능하다.
조성물( Compositions )
본 발명의 올리고머는 약학적 제형 및 조성물에 사용된다. 적절하게, 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다. 적절한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물(pro-drug) 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고, 이는 또한 참조로서 본 발명에 통합된다. 제형 및 투여에 관한 기술에 대한 상세한 설명은 또한 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Maack Publishing Co, Easton Pa.)의 최신판에서 발견될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 세포 막을 통과하는 올리고머의 전달에 도움을 주기 위해 접합된 부분에 공유적으로 연결된 것이다. 세포 막을 통과하는 올리고머의 전달에 도움을 주는 접합된 부분의 예로는 콜레스테롤과 같은 친유성 부분(lipophilic moiety)이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 Invitrogen으로부터 상업적으로 이용가능한 Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX와 같은, 리포좀을 형성하는 지질 제형으로 제형화된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 하나 이상의 지질 유사 비-자연적으로 발생하는 작은 분자 ("리피도이드(lipidoid)")의 혼합물로 제형화된다. 리피도이드의 라이브러리는 기존의 합성 화학법에 의해 합성화될 수 있고 리피도이드의 다양한 양 및 조합은 선택된 투여 경로에 의해 표적 조직에 특정 크기의 올리고머의 효율적인 전달을 위한 담체를 개발하기 위해 분석될 수 있다. 적절한 리피도이드 라이브러리 및 조성물은, 예를 들면 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/abs/nbt1402.html에서 이용가능한 Akinc et al . (2008) Nature Biotechnol.에서 발견될 수 있으며, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명에서 나타낸 올리고머의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독성 효과의 허용가능한 수준을 보이는 염을 나타낸다. 이러한 염의 비-한정적인 예로는 아연(zinc), 칼슘(calcium), 비스무트(bismuth), 바륨(barium), 마그네슘(magnesium), 알루미늄(aluminum), 구리(copper), 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 카드뮴(cadmium), 나트륨(sodium), 칼륨(potassium) 등과 같은 금속 양이온으로 형성된 유기 아미노산 및 염기 추가 염으로; 암모니아, N,N'-디벤질에틸렌-디아민(N,N'-dibenzylethylene-diamine), D-글루코사민(D-glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에티렌디아민(ethylenediamine)으로부터 형성된 양이온으로; 또는 (a) 및 (b)의 (c) 조합; 예를 들면, 아연 타닌산염 또는 이와 같은 것으로부터 형성될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 전립선암, 신경교종, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식 질환의 치료에 유용한 활성제를 포함하는, 본 발명의 올리고머 또는 결합체에 추가로 다른 활성 성분을 포함한다.
일부 실시예에서, 추가적인 활성 성분은 파클리탁셀(paclitaxel)이다 (Narita et al., Clin. Cancer. Res. 2008 Sept 15:14(18): 5769).
일부 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및 추가적인 활성 성분 (예를 들면, 파클리탁셀)을 투여하는 단계를 포함하는 치료법이라는 특징이 있는 결합된 치료법을 제공하고, 이는 특정 실시예에서 본 발명의 약학적 조성물의 투여 이전, 투여 동안 또는 투여에 이어서 투여된다.
본 발명은 또한 첫 번째 부분이 본 발명에 따른 적어도 하나의 올리고머, 결합체 및/또는 약학적 조성물을 포함하고, 추가적인 부분이 전립선암, 신경교종, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 활성 성분 (예를 들면, 파클리탁셀)을 포함하는, 부분들의 키트를 제공한다. 그러므로, 본 발명에 나타낸 바와 같이, 부분들의 키트는 치료 방법에서 사용될 수 있는 것으로 고려되며, 여기서 방법은 첫 번째 부분 및 추가적인 부분 모두, 동시적으로 또는 순서대로 중 어느 하나로 투여되는 것을 포함한다.
적용( Application )
본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 기존의 질환 (예를 들면, 하기 본 발명에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애) 또는 질환의 방지, 즉, 예방을 나타낸다. 그러므로, 특정 실시예에서, "치료"는 예방을 포함하는 것으로 인식될 것이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들면, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 이런 올리고머는 세포 및 실험적 동물에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 단백질의 발현을 특이적으로 억제 (전형적으로 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 mRNA를 분해 또는 억제 함으로써 단백질 형성을 막음으로써)함으로써, 치료적 중재(therapeutic intervention)를 위한 표적으로서 표적의 기능적 분석 또는 그것의 유용성의 평가를 촉진한다.
특정 실시예에서, 올리고머는 진단에 있어서 노던 블랏팅(northern blotting), 인사이츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 또는 유사한 기술에 의해 세포 또는 조직에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 발현을 탐지 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다.
다양한 치료적 실시예에서, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 비-인간 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 유효한 양의 올리고머를 투여함으로써 치료될 수 있다. 또한 본 발명의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 투여함으로써 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 발현과 관련된, 질환 또는 상태를 가지거나 가지기 쉽다고 의심되는, 인간을 치료하는 것과 같은, 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 기재된 바와 같은 본 발명의 올리고머 또는 결합체의 용도, 또는 본 발명에 기재된 질환의 치료 방법을 제공한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 올리고머, 및/또는 본 발명에 따른 결합체, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이것이 필요한 동물 (이것이 필요한 환자와 같은)에 투여하는 것을 포함하는, 본 발명에 기재된 바와 같은 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
실시예에서 삽입된 바와 같이, 본 발명의 올리고머는 표적 핵산을 발현하는, 인간 세포와 같은, 포유류 세포와 같은, 세포에서 세포사멸을 유도하는 것으로 사용될 수 있다 - 이점과 관련하여, 또한 본 발명은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3을 발현하는 세포를 세포사멸을 유도하기에 충분한 양의 본 발명의 올리고머 또는 결합체 또는 약학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 세포내 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 세포사멸은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 유도될 수 있다. 적절하게 올리고머는 상기 세포에서 세포사멸을 유도하기에 유효한 양으로 첨가된다. 일부 실시예에서 상기 세포는 암 세포이다.
의학적 적응증( Medical Indications )
특정 치료학적 실시예에서, 치료되는 장애는 전립선암, 신경교종, 대장암, 유방암, 폐암, 흑색종 또는 간암과 같은, 과증식성 장애 (예를 들면 암)이다. 다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 이런 질환 또는 상태의 치료는 방사선요법, 화학요법 또는 면역치료요법과 같은, 하나 또는 그 이상의 다른 항암 치료와 조합될 수 있다.
다양한 실시예에서, 질환 또는 장애는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자 또는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3와 관련되거나 상호작용하는 단백질 산물의 유전자의 조절과 관련된다. 그러므로, 다양한 실시예에서, 표적 mRNA는, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 한점 돌염변이(single point mutations) 또는 3자암호반복(triplet repeat)을 포함하는, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 서열의 돌연변이된 형태이다.
다양한 실시예에서, 질환 또는 장애는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 비정상적인 수준과 관련된다.
본 발명에 사용된 용어 "비정상적인"은 세포에서 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자가 본 발명에서 언급된 질환, 장애 또는 상태를 가지지 않는 동물의 세포에서 발현 수준에 비해 과발현 (예를 들면, 업-레귤레이트)을 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 조성물은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 유전자의 과발현 (예를 들면, 업-레귤레이트)와 관련된 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 질환 또는 장애는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 돌연변이 형태의 비정상적인 수준과 관련된다.
본 발명에 사용된 용어 "돌연변이" 및 "돌연변이 형태"는 서열번호: 1로 나타내는 GLI2 핵산의 변이; 및/또는 서열번호: 2로 나타내는 GLI1 핵산의 변이; 및/또는 서열번호: 134로 나타내는 GLI3 핵산의 변이를 나타낸다. 상기 변이는 본 발명에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태와 관련될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에서 사용된 용어 "변이(variant)"는 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 치환 및/또는 결실에 의해 다른 염기 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 일부 실시예에서, 변이는 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 상동성 (동일성)을 가진다. 일부 또는 다른 실시예에서, 변이는 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134의 전체에서 15 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드와 같은; 30 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드와 같은; 60 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드를 가진다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 GLI2 표적 유전자, 즉 GLI2에 의해 조절되는 유전자의 유전자 산물의 발현을 조절하는 방법과 관련된다. GLI2 표적 유전자의 예로는 GLI1 및 PTCH1을 포함한다. 일부 실시예에서, GLI2 표적 유전자의 조절은 표적 유전자의 증가된 발현 또는 활성을 야기한다. 다른 실시예에서, GLI2 표적 유전자의 조절은 표적 유전자의 감소된 발현 또는 활성을 야기한다.
또한 본 발명은 본 발명에 기재된 특정 및 모든 상태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의, 하나 또는 그 이상의 LNA 모노머를 포함하는, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3 mRNA 또는 단백질의 비정상적인 수준과 관련된 상태로부터 고통받거나 이로 의심되는 포유류를 치료하는 방법을 제시한다.
본 발명의 흥미있는 측면은 상기 본 발명에 기재된 바와 같은 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 본 발명에 정의된 바와 같은 올리고머 (화합물) 또는 본 발명에 정의된 바와 같은 결합체의 용도를 제시한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 비-인간 동물 또는 인간에게, 치료학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머, 또는 이의 결합체를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 LNA 올리고머, 또는 이의 결합체는 연속적으로 보다는 짧은 기간 동안 투여된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 예를 들면, 상기 올리고머의 세포의 흡수를 증가시키기 위해, 올리고머 (화합물)는 접합된 부분에 연결된다. 한가지 실시예에서 접합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것을 포함하고, 선택적으로 추가적인 화학요법제를 투여하는 것을 추가적으로 포함하는, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 비정상적인 수준을 치료하는 방법을 제시한다. 일부 실시예에서, 화학요법제는 올리고머에 접합되거나, 약학적 조성물에 존재하거나, 또는 분리된 제형으로 투여된다.
또한, 본 발명은 약제로서 용도를 위한 본 발명에 정의된 올리고머, 조성물 또는 결합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 비정상적인 수준 또는 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 돌연변이 형태의 발현 (본 발명에 나타낸 질환 중 하나와 관련된 것들과 같은, 대립유전자 변이와 같은)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 올리고머, 조성물 또는 결합체의 용도에 관한 것이다.
게다가, 다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에 본 발명에서 정의된 바와 같은, 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암, 신경교종, 대장암, 유방암, 폐암, 흑색종 또는 간암과 같은, 암과 같은, 과증식성 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 상태로부터 고통받는 동물 (환자와 같은)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 비정상적인 수준에 의해 야기되는 질환에 대한 치료 또는 예방을 위해 적용된다.
일부 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 결합체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, GLI2 및/또는 GLI1 및/또는 GLI3의 비정상적인 수준을 치료하는 방법을 제시한다.
게다가, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 상태로부터 고통받는 동물 (환자와 같은)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
치료가 필요한 동물 (환자와 같은)은 질환 또는 장애로부터 고통받거나 고통받을 동물 (환자와 같은)이다.
적절한 동물은 인간 및 비-인간 동물을 포함한다.
일부 실시예에서, 동물은 포유류이다. 예로는 인간, 설치류 (랫트 및 마우스와 같은), 래빗, 영장류, 비-인간 영장류 (침팬지 및 원숭이와 같은), 말, 소, 양, 돼지, 개 및 고양이를 포함한다.
적절한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 제형, 다른 치료제와 조합, 전구 약물 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고 - 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 바와 같은 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 제공하고, 이것은 참조로서 본 발명에 통합된다.
실시예( EMBODIMENTS )
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 기재된 다른 실시예와 조합으로 사용될 수 있다.
1. 총 10 ~ 30 모노머 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10 ~ 30 모노머 사이의 길이의 올리고머로서, 여기서 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 GLI2 유전자 또는 mRNA의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 상동적인 올리고머.
2. 실시예 1에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3 - 90 중 어느 서열에 상응하는 부위에 적어도 80% 상동적인 올리고머.
3. 실시예 1 또는 2에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 상응하는 부위의 역상보와 미스매치가 없거나 오직 1개 또는 2개 이하의 미스매치를 포함하는 올리고머.
4. 실시예 1 - 3 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 인간 GLI1 (서열번호 1) 및 GLI2 (서열번호 2) mRNA 서열 모두의 역상보의 상응하는 부위에 미스매치가 없거나 1 또는 2 이하의 미스매치가 있는 것 중 어느 하나를 포함하는 올리고머.
5. 실시예 1 - 4 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 연속적인 뉴클레오티드 서열로 구성되는 올리고머.
6. 실시예 1 - 5 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 10 ~ 18 모노머 사이의 길이인 올리고머.
7. 실시예 1 - 5 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고머.
8. 실시예 7에 따른 올리고머로서, 여기서 뉴클레오티드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오티드(sugar modified nucleotide)와 같은, 당 변형된 뉴클레오티드인 올리고머.
9. 실시예 8에 따른 올리고머로서, 여기서 뉴클레오티드 유사체는 LNA인 올리고머.
10. 실시예 7 - 9 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 갭머(gapmer)인 올리고머.
11. 실시예 1 - 10 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, GLI2 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 GLI2 유전자 또는 mRNA의 발현을 억제하는 올리고머.
12. 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체(conjugate).
13. 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
14. 암과 같은, 과증식 질환의 치료를 위한 것과 같은 약제의 제조로서 사용되기 위한, 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체.
15. 암과 같은, 과증식 질환의 치료를 위한 것과 같은 약제의 제조를 위한, 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 정의된 결합체의 용도.
16. 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 또는 실시예 13에 따른 약학적 조성물을, 암과 같은, 과증식 질환으로부터 고통받거나, 또는 고통받을 것 같은 환자에게, 투여하는 것을 포함하는, 암과 같은, 과증식 질환의 치료 방법.
17. GLI2을 발현하는 세포에서 GLI2을 억제하기 위해, 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 또는 실시예 13에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, GLI2을 발현하는 세포에서 GLI2의 억제 방법.
18. 세포사멸을 유도하기에 충분한 양으로 GLI2을 발현하는 세포에 실시예 1 - 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 또는 실시예 13에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, GLI2을 발현하는 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법.
도면 1: 인간 GLI2 mRNA ( cDNA ) 서열 (서열번호 1). 유전자 등록번호(GenBank accession number) NM_005270.
도면 2: 인간 GLI1 mRNA ( cDNA ) 서열 (서열번호 2). 유전자 등록번호(GenBank accession number) NM_005269.
도면 3: 인간 GLI3 mRNA ( cDNA ) 서열 (서열번호 134). 유전자 등록번호(GenBank accession number) NM_000168.
도면 4: GLI2 올리고머로 형질전환한 후 DU -145 세포에서 GLI2 mRNA 발현. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 5. GLI2 올리고머로 형질전환한 24시간 후 DU -145 세포에서 GLI2 mRNA 발현. Gli2 올리고머로 형질전환 후 24 h에 DU-145 세포로부터 유래된 Q-PCR (정량적 PCR) 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 6. GLI2 올리고머로 형질전환한 24시간 후 518A2 세포에서 GLI2 mRNA 발현. Gli2 올리고머로 형질전환 후 24 h에 518A2 세포로부터 유래된 Q-PCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 7. GLI2 올리고머로 형질전환한 24시간 후 DU -145 세포에서 GLI1 mRNA 발현. Gli2 올리고머로 형질전환 후 24 h에 DU-145 세포로부터 유래된 Q-PCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 8. GLI2 올리고머로 형질전환한 24시간 후 518A2 세포에서 GLI1 mRNA 발현. Gli2 올리고머로 형질전환 후 24 h에 518A2 세포로부터 유래된 Q-PCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 9. GLI2 올리고머로 형질전환한 24시간 후 518A2 세포에서 GLI3 mRNA 발현. Gli2 올리고머로 형질전환 후 24 h에 518A2 세포로부터 유래된 Q-PCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도면 10. 마우스 혈장에서 LNA 올리고머의 안정성 결정. LNA 올리고머를 37℃에서 마우스 혈장으로 인큐베이션한 후 부분 표본을 0, 24, 48 및 120시간에 얻었다. 결과를 SDS-PAGE 겔을 이용하여 겔 전기영동에 의해 시각화된다. DNA 포스포티오에이트를 올리고머의 저하를 보여주는 양성 대조군 올리고머로서 사용되었다. 사용된 올리고머의 서열번호는 각 겔 하에 나타낸다.
도면 11. DU -145 세포에서 증식분석. MTS 분석은 4nM 및 20 nM 최종 올리고머 농도를 이용하여 DU-145 세포에서 수행되었다. 서열번호: 133로 기재되는 서열을 갖는 올리고머는 음성 대조군 (-ve)으로 사용되는 스크램블된 대조군이다. 양성 대조군 (+ve)은 시험관내 및 생체내 모두에서 독성이 있는 올리고머이다. 사용된 올리고머의 서열번호는 각 그래프의 머리 부분에 나타낸다.
도면 12 A 및 B - 혈청에서 ALT / AST 활성. GLI2를 표적화하는 서열번호: 120으로 기재되는 서열을 갖는 올리고머로 투여된 군에서 한 마우스는 6일째에 죽었음이 발견되었고, 이 군에서 나머지 동물은 6일째에 상태가 나빴으며 희생되었다. 서열번호: 120으로 기재되는 서열을 갖는 올리고머로 처리된 군에서 ALT 활성은 측정되기에 너무 높았다. 사용된 올리고머의 서열번호는 그래프의 각 막대 아래에 나타낸다.
도면 13. DU -145 세포에서 카스파아제 ( Caspase ) 3/7 분석. 카스파아제 3/7 분석은 4nM 및 20 nM 최종 올리고머 농도를 이용하여 DU-145 세포에서 수행되었다. 스크램블된 대조군은 음성 대조군으로 사용되었다. 목은 올리고머 대조군이 아닌 것을 나타낸다 - 즉, 목으로 형질전환 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군). 사용된 올리고머의 서열번호는 그래프의 막대 아래에 나타낸다.
도면 14. 518A2 세포에서 카스파아제 ( Caspase ) 3/7 분석. 카스파아제 3/7 분석은 4nM 및 20 nM 최종 올리고머 농도를 이용하여 518A2 세포에서 수행되었다. 스크램블된 대조군은 음성 대조군으로 사용되었다. 목은 올리고머 대조군이 아닌 것을 나타낸다. 독성 올리고머 (TC)는 시험관내 및 생체내 모두에서 독성을 보이는 올리고머이다. 사용된 올리고머의 서열번호는 각 그래프의 막대 아래에 나타낸다.
도면 15a 및 15b. PC3 전립선암 모델에서 서열번호: 3, 19 또는 75로 기재되는 서열을 갖는 올리고머의 항-종양 효과. 사용된 올리고머의 서열번호는 각 그래프의 막대 위에 나타낸다. 도면 범례에서, 관련있는 서열번호:는 상대적인 양 앞에 있다 (콤마로 분리된 것을 제외한). 따라서, 예를 들면 G2에 대한 "3,3 mg/kg"은 서열번호: 3의 3 mg/kg을 나타낸다.
도면 16. DU-145 전립선암 모델에서 서열번호: 19, 또는 서열번호: 75로 기재되는 서열을 갖는 올리고머의 종양 성장 억제 (TGI). 그래프에 대한 키(key)에서, "스크램블된 대조군"은 서바이빈(survivin)에 대한 스크램블된 대조군 올리고머를 나타내고, "19"는 서열번호 19를 나타낸다 (예를 들면, "19 30 mg/kg"은 서열번호 19의 30 mg/kg을 나타낸다).
도면 17. PC3 전립선암 모델에서 서열번호: 3, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 75로 기재되는 서열을 갖는 올리고머의 효험 연구 (종양 성장 억제). 그래프에 대한 키(key)에서, "3"은 서열번호 3을 나타내고 (예를 들면, "3 30 mg/kg"은 서열번호 3의 30 mg/kg을 나타낸다); "스크램블된 대조군"은 서바이빈(survivin)에 대한 스크램블된 대조군 올리고머를 나타내며; "19"는 서열번호 19를 나타내고 (예를 들면, "19 30 mg/kg"은 서열번호 19의 30 mg/kg을 나타낸다); 및 "75"는 서열번호 75를 나타낸다 (예를 들면, "75 10 mg/kg"은 서열번호 75의 10 mg/kg을 나타낸다).
도면 18. PC3 전립선암 모델에서 서열번호: 19로 기재되는 서열을 갖는 올리고머의 효험 연구 (종양 성장 억제). 그래프에 대한 키(key)에서, "19"는 서열번호 19를 나타내고; "mpk"는 mg/kg을 나타내고, "IP"는 복강내 투여를 나타내며; "IV"는 정맥내 투여를 나타내며; "q1x10"는 매일 10번 투여를 나타내고; "q2x10"는 매 2일 10번 투여를 나타내며; "q3x10"는 매 3일 10번 투여를 나타내고; 예를 들면, "19;3mpk;IP;q1x10"는 복강내 투여로 서열번호 19의 3 mg/kg을 매일 10번 투여를 나타낸다.
도면 19. DLD-1 대장암 모델에서 서열번호: 19로 기재된 서열을 갖는 올리고머의 효험 연구 (종양 성장 억제). 그래프에 대한 키(key)에서, "19"는 서열번호 19를 나타내고; "mpk"는 mg/kg을 나타내고, "Q3x10"은 매 3일 10번 투여를 나타내며; 예를 들면, "19; 3mpk; Q3x4"는 서열번호 19의 3mg/kg을 매 3일 4번 투여를 나타낸다.
도면 20a, b 및 c. DU-145 전립선암 모델에서 서열번호: 19로 기재된 서열을 갖는 올리고머의 효험 연구 (종양 성장 억제). 그래프에 대한 키(key)에서, "3"은 서열번호 3을 나타내고, "19"는 서열번호 19를 나타내며; "75"는 서열번호 75를 나타내고; "IV"는 정맥내 투여를 나타내며; "q3x4"는 매 3일 4번 투여를 나타내고; 예를 들면, "3mg/kg;IV;q3x4"는 정맥내 투여로 서열번호 3의 3mg/kg을 매 3일 4번 투여를 나타낸다.
도면 21. PC3 전립선암 모델에서 서열번호: 3, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 75로 기재된 서열을 갖는 올리고머의 종양 성장 억제 (TGI). 그래프에 대한 키(key)에서, "3"은 서열번호 3을 나타내고, "19"는 서열번호 19를 나타내며; "75"는 서열번호 75를 나타내고; "IV"는 정맥내 투여를 나타내며; "75"는 서열번호 75를 나타내고; "iv"는 정맥내 투여를 나타내며; 예를 들면, "3, 3mg/kg,iv"는 정맥내 투여로 서열번호 3의 3mg/kg을 나타낸다.
실시예 1: 모노머 합성
LNA 모노머 구조 재료(building block) 및 유도체는 공개된 절차 및 이에 언급된 참조에 따라 제조되었다 - WO07/031081 및 이에 언급된 참조를 참조해라.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 (올리고머)는 WO07/031081에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 표 1은 안티센스 올리고뉴클레오티드 부분 및 본 발명의 실시예를 나타낸다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 고안
본 발명에 따른, 일련의 올리고뉴클레오티드 (올리고머)는 본 발명에서 서열번호: 1로 나타낸, 공개된 서열 GenBank accession number NM_005270를 이용한 인간 GLI2 mRNA의 다른 부분를 표적으로 하는 것으로 고안되었다(도 3). 일부 실시예에서는 또한 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1로 나타낸, 공개된 서열 GenBank accession number NM_005269를 이용한 GLI1 mRNA를 표적화하는 것 및/또는 서열번호: 134로 나타낸, 공개된 서열 GenBank accession number NM_000168를 이용한 GLI3 mRNA를 표적화하는 것으로 고안되었다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열. 서열번호: 3 - 84 및 서열번호: 85 - 90 (표 2에서 나타낸)은 인간 GLI2 mRNA 및 선택적으로 인간 GLI1 mRNA 및 선택적으로 인간 GLI3 mRNA를 표적으로 하는 것으로 고안된 올리고 부분 서열(올리고머)이다.
서열번호 서열 (5'-3') 길이
(염기) 		표적 부위
GLI2 		( Compl Gli1 )
서열번호: 3 ACCAGCATGTACTG 14 1647-1660 100(%)
서열번호: 4 ACCAGCATGTACT 13 100(%)
서열번호: 5 CCAGCATGTACTG 13 100(%)
서열번호: 6 ACCAGCATGTAC 12 100(%)
서열번호: 7 CCAGCATGTACT 12 100(%)
서열번호: 8 CAGCATGTACTG 12 100(%)
서열번호: 9 AACGTGCACTTGTG 14 1695-1708 100(%)
서열번호: 10 TTCTGGTGCTTGGC 14 1839-1852 100(%)
서열번호: 11 TTCTGGTGCTTGG 13 100(%)
서열번호: 12 TCTGGTGCTTGGC 13 100(%)
서열번호: 13 TTCTGGTGCTTG 12 100(%)
서열번호: 14 TCTGGTGCTTGG 12 100(%)
서열번호: 15 CTGGTGCTTGGC 12 100(%)
서열번호: 16 GTGAAGGCTGGGCTGA 16 1030-1045
서열번호: 17 TCTGCTTGTTCTGGTT 16 1242-1257
서열번호: 18 CCTGCTTACAGTCATC 16 1458-1473
서열번호: 19 CTCCTTGGTGCAGTCT 16 1514-1529
서열번호: 20 CTCCTTGGTGCAGTC 15
서열번호: 21 TCCTTGGTGCAGTCT 15
서열번호: 22 CTCCTTGGTGCAGT 14
서열번호: 23 TCCTTGGTGCAGTC 14
서열번호: 24 CCTTGGTGCAGTCT 14
서열번호: 25 CTCCTTGGTGCAG 13
서열번호: 26 TCCTTGGTGCAGT 13
서열번호: 27 CCTTGGTGCAGTC 13
서열번호: 28 CTTGGTGCAGTCT 13
서열번호: 29 CTCCTTGGTGCA 12
서열번호: 30 TCCTTGGTGCAG 12
서열번호: 31 CCTTGGTGCAGT 12
서열번호: 32 CTTGGTGCAGTC 12
서열번호: 33 TTGGTGCAGTCT 12
서열번호: 34 GTGTGTCTTCAGGTTC 16 1742-1757
서열번호: 35 CGCAGGTGTGTCTTCA 16 1747-1762
서열번호: 36 CGCAGGTGTGTCTTC 15
서열번호: 37 GCAGGTGTGTCTTCA 15
서열번호: 38 CGCAGGTGTGTCTT 14
서열번호: 39 GCAGGTGTGTCTTC 14
서열번호: 40 CAGGTGTGTCTTCA 14
서열번호: 41 CGCAGGTGTGTCT 13
서열번호: 42 GCAGGTGTGTCTT 13
서열번호: 43 CAGGTGTGTCTTC 13
서열번호: 44 AGGTGTGTCTTCA 13
서열번호: 45 CGCAGGTGTGTC 12
서열번호: 46 GCAGGTGTGTCT 12
서열번호: 47 CAGGTGTGTCTT 12
서열번호: 48 AGGTGTGTCTTC 12
서열번호: 49 GGTGTGTCTTCA 12
서열번호: 50 GCAGATGTAGGGTTTC 16 1871-1886
서열번호: 51 GCCACTGTCATTGTTG 16 2213-2228
서열번호: 52 CCAGGGCTGAGGTGTC 16 2301-2316
서열번호: 53 GAGGCAGCTTGGTGTT 16 2451-2466
서열번호: 54 TGCTGGTGGAGCTGTC 16 2607-2622
서열번호: 55 GTGAGGTTGAGCAGCC 16 2818-2833
서열번호: 56 GCCGCACAGGGTCGCT 16 3096-3111
서열번호: 57 ATGTAGTTTACCCTGG 16 3838-3853
서열번호: 58 CCATGAAGCCAGGCTG 16 4230-4245
서열번호: 59 TACATGTGGATCTGGC 16 4534-4549
서열번호: 60 TACATGTGGATCTGG 15
서열번호: 61 ACATGTGGATCTGGC 15
서열번호: 62 TACATGTGGATCTG 14
서열번호: 63 ACATGTGGATCTGG 14
서열번호: 64 CATGTGGATCTGGC 14
서열번호: 65 TACATGTGGATCT 13
서열번호: 66 ACATGTGGATCTG 13
서열번호: 67 CATGTGGATCTGG 13
서열번호: 68 ATGTGGATCTGGC 13
서열번호: 69 TACATGTGGATC 12
서열번호: 70 ACATGTGGATCT 12
서열번호: 71 CATGTGGATCTG 12
서열번호: 72 ATGTGGATCTGG 12
서열번호: 73 TGTGGATCTGGC 12
서열번호: 74 GCCATGTTGCTGATGC 16 4864-4879
서열번호: 75 TCAGATTCAAACCCA 15 5330-5344
서열번호: 76 TCAGATTCAAACCC 14
서열번호: 77 CAGATTCAAACCCA 14
서열번호: 78 TCAGATTCAAACC 13
서열번호: 79 CAGATTCAAACCC 13
서열번호: 80 AGATTCAAACCCA 13
서열번호: 81 TCAGATTCAAAC 12
서열번호: 82 CAGATTCAAACC 12
서열번호: 83 AGATTCAAACCC 12
서열번호: 84 GATTCAAACCCA 12
표 2는 본 발명의 올리고머가 고안될 수 있는 24머(mer) 서열 부분을 나타낸다 - 굵은 글씨체는 표 1에 나타낸 바와 같은 16머 서열 부분을 나타낸다.
상응하는 24머 서열 24머 서열 16머 서열
gcacc ACCAGCATGTACTG cgcct 서열번호: 85 서열번호: 3
TGCGA TTCTGGTGCTTGGC GCGGT 서열번호: 86 서열번호: 10
CGTA CTCCTTGGTGCAGTCT TCCC 서열번호: 87 서열번호: 19
GGAC CGCAGGTGTGTCTTCA GGTT 서열번호: 88 서열번호: 35
TTCG TACATGTGGATCTGGC CGTA 서열번호: 89 서열번호: 59
AGCAT TCAGATTCAAACCCA AATG 서열번호: 90 서열번호: 75
본 발명의 올리고뉴클레오티드 고안
서열 (5'-3')
ACCagca.tgtaCTG 서열번호: 91
AACgtgcacttGTG 서열번호: 92
TTCtggtgcttGGC 서열번호: 93
GTGaaggctgggcTGA 서열번호: 94
TCTgcttgttctgGTT 서열번호: 95
CCTgcttacagtcATC 서열번호: 96
CTCcttggtgcagTCT 서열번호: 97
GTGtgtcttcaggT ? TC 서열번호: 98
CGCaggtgtgtctTCA 서열번호: 99
GCAgatgtagggtTTC 서열번호: 100
GCCactgtcattgTTG 서열번호: 101
CCAgggctgaggtGTC 서열번호: 102
GAGgcagcttggtGTT 서열번호: 103
TGCtggtggagctGTC 서열번호: 104
GTGaggttgagcaGCC 서열번호: 105
GCCgcacagggtcGCT 서열번호: 106
ATGtagtttacccTGG 서열번호: 107
CCAtgaagccaggCTG 서열번호: 108
TACatgtggatctGGC 서열번호: 109
GCCatgttgctgaTGC 서열번호: 110
TCAgattcaaacCCA 서열번호: 111
서열번호: 91 - 111에서 대문자는 LNA 유닛과 같은, 본 발명에 기재된 것과 같은, 뉴클레오티드 (뉴클레오시드) 유사체 모노머를 나타낸다. 소문자는 뉴클레오티드 (DNA) 모노머를 나타낸다. 일부 실시예에서 뉴클레오티드 사이 인터뉴클레오티드 연결은 모두 포스포로티오에이트이다. 일부 실시예에서, LNA 모노머에서 모든 시토신 염기 (잔기)는 5-메틸 시토신이다.
실시예 4: 시험관 내( in vitro ) 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 표적 핵산이 측정가능한 수준으로 존재한다면 임의의 다양한 세포 형태에서 시험될 수 있다. 표적은 내생적으로 또는 상기 표적 핵산을 암호화하는 핵산의 일시적 또는 안정적인 형질전환에 의해 발현될 수 있다. 표적 핵산의 발현 수준은 일반적으로 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 실시간 PCR(Real-Time PCR), 리보뉴클레아제 보호(Ribonuclease pretection) 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 하기 세포 형태는 실례의 목적을 위해 제공되나, 표적이 선택된 세포 형태에서 발현된다면, 다른 세포 형태도 일반적으로 사용될 수 있다. 세포는 하기 기재된 바와 같은 적절한 배지에서 배양되었고 37℃에서 95 ~ 98% 습도 및 5% CO2에서 유지되었다. 세포는 일반적으로 매주에 2 ~ 3회 계대배양하였다.
DU -145: 인간 전립선암 세포주 DU-145는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Biochrom 19357-5010) 및 25 ㎍/ml 겐타마이신(gentamicin) (Sigma # G1397)을 포함하는 글루타맥스 I(Glutamax I) (Gibco # 61870-010)를 갖는 RPMI 1640 배지에서 배양되었다.
518A2: 인간 흑색종 암 세포주 518A2는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Biochrom 19357-5010), 2 mM 글루타맥스 I(Glutamax I) (Gibco #35050-038) 및 25 ㎍/ml 겐타마이신(gentamicin) (Sigma # G1397)을 포함하는, Dulbecco`s MEM (Sigma #　D5671)에서 배양되었다.
실시예 5: 시험관 내( in vitro ) 모델: 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리
세포를 형질전환 운반체로서 양이온성 리포솜 제형 LipofectAMINE 2000 (Gibco)을 사용하여 올리고머로 처리하였다. 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트 (NUNC)에 분주하여 75 ~ 90% 밀도가 되었을 때 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 최종 농도 0.8 nM 내지 20 nM 범위로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 제형은 혈청이 없는 OptiMEM (Gibco) 및 5 ㎍/㎖의 최종 지질 농도의 LipofectAMINE 2000을 사용하여 제조사가 지시한 방법에 따라 실시하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였고 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배양 배지를 제거함으로써 처리를 중지시켰다. 세포를 세척하여 혈청을 함유하는 배지를 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후, 세포는 RNA 분석을 위해 수득하기 전에 20시간 동안 회복시켜다.
실시예 6: 시험관 내( in vitro ) 모델: RNA 추출 및 cDNA 합성
세포주로부터 RNA를 분리하기 위해, 제조사에 의해 제공한 프로토콜에 따라 RNeasy mini kit(Qiagen cat. no. 74104)를 사용하였다. 첫 번째 가닥 합성은 제조사의 지시에 따라 Ambion으로부터 입수한 역전사효소(Reverse Transcriptase) 시약을 사용하여 수행하였다.
각 시료를 위해, 0.5 ㎍의 총 RNA를 RNase가 없는 H2O로 조절하였고(10.8 ㎕) 2 ㎕의 랜덤 데카머(random decamers)(50 μM) 및 4 ㎕의 dNTP mix(각 dNTP는 2.5 mM)를 혼합하여 70℃에서 3분간 가열한 후, 각 시료를 즉시 얼음에서 냉각하였다. 시료를 얼음에서 냉각한 후, 2 ㎕ 10×완충용액 RT, 1 ㎕ MMLV 역전사효소(100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해제(inhibitor)(10 U/㎕)를 각 시료에 첨가하여 42℃에서 60분 동안 배양하였고, 95℃에서 10분 동안 효소를 열 비활성화하였고, 그런 다음 시료를 4℃에서 냉각하였다.
실시예 7: 시험관 내( in vitro ): 실시간 PCR ( Real - time PCR )에 의한 GLI2 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 분석
GLI2 mRNA 발현의 안티센스 조절은 당업계에 공지된 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, GLI2 mRNA 수준은 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive polymerase chain reactin, PCR), 또는 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 정량할 수 있다. 실시간 정량적 PCR이 바람직하다. RNA 분석은 총 세포의 RNA 또는 mRNA에서 수행될 수 있다. RNA 분리 및 노던 블랏 분석과 같은 RNA 분석의 방법은 당업계에서 일반적이고 예를 들면, Molecular biology, John Wiley 및 Sons에 현행하는 프로토콜에서 알 수 있다. 실시간 정량적 PCR은 Applied Biosystem으로부터 이용가능한, 상업적으로 이용가능한 Multi-Color Real time PCR Detection System을 이용하여 편리하게 수행될 수 있다.
GLI2 mRNA 수준의 실시간 정량적 PCR 분석
인간 GLI2 mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 GLI2 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. Hs00257977_m1)를 사용하여 정량하였다.
인간 GLI1 (또한 본 발명에 Gil1로 나타낸) mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 GLI1 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. Hs00171790_m1)를 사용하여 정량하였다.
글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 정량은 시료 제조에서 어떠한 편차를 표준화하기 위한 내생적 대조군으로서 사용하였다.
인간 GAPDH mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat no. 4310884E)를 사용하여 정량하였다.
실시간 정량적 PCR은 당업계에 공지된 기술이고 예를 들면 Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994에서 알 수 있다.
실시간 PCR
실시예 6에 기재된 바와 같이 수행된 첫 번째 가닥 합성으로부터 유래된 cDNA를 2 - 20배 희석하였고, Applied Biosystems의 Taqman 7500 FAST를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 통해 분석하였다. 프라이머 및 탐침은 2×Taqman Fast Universal PCR master mix (2×) (Applied Biosystems Cat.# 4364103)로 혼합하였고 최종 부피 10 ml에 4 ml의 cDNA를 첨가하였다. 각 시료는 3회 분석하였다. cDNA의 2배 희석의 분석은 분석을 위해 제작된 표준곡선(standard curve)의 RNA를 발현하는 세포주로부터 정제된 물질로 제조되었다. 멸균 H20는 주형(template)이 없는 대조군을 위해 cDNA 대신에 사용하였다. PCR 프로그램은: 30초 동안 95℃, 그런 다음 95℃에서 3초, 60℃에서 30초가 40 사이클이었다. 표적 mRNA 서열의 상대적인 정량은 Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21.을 사용하여 산출된 임계 사이클(Thresold cycle)로부터 측정하였다.
실시예 8: 시험관 내( in vitro ): 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 GLI2 발현의 안티센스 억제
올리고뉴클레오티드는 DU-145 세포 및 518A2 세포에서 0.8, 4 및 20 nM의 농도에서 GLI2 mRNA 녹다운(knockdown)에 대한 가능성을 위해 측정되었다 (도 4, 5 및 6 참조). 데이타는 4 nM에서 모의(mock) 형질전환된 세포에 대해 상대적으로 GLI2 mRNA의 다운-레귤레이트 퍼센트로서 표 4에 나타냈다. 모의(mock) 형질전환된 세포는 올리고 없이 지질로 형질전환된 것이다 (음성 대조군). 상기 스크램블된 대조군은 서열을 표적화하기 위해 상보성이 없는, 서열번호: 133으로 기재되는 서열을 갖는 올리고머와 같은, 올리고머이다.
소문자는 DNA 유닛을 나타내고, 굵은 대문자는 β-D-옥시-LNA(β-D-oxy-LNA) 유닛을 나타낸다. LNA 모노머에서 모든 시토신 염기는 5'-메틸시토신이다. 아래에 기입한 "s"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
시험 물질 서열 (5'-3') GLI2 mRNA
(% inhib .)
서열번호: 112 A s C s C s asgscsas .tsgstsas C s T s G 72.8
서열번호: 113 A s A s C s gstsgscsascststs G s T s G 55.2
서열번호: 114 T s T s C s tsgsgstsgscststs G s G s C 79.6
서열번호: 115 G s T s G s asasgsgscstsgsgsgscs T s G s A 82.3
서열번호: 116 T s C s T s gscststsgststscstsgs G s T s T 71.9
서열번호: 117 C s C s T s gscststsascsasgstscs A s T s C 62.2
서열번호: 118 C s T s C s cststsgsgstsgscsasgs T s C s T 79.9
서열번호: 119 G s T s G s tsgstscststscsasgsgs T s ? T s C 68.4
서열번호: 120 C s G s C s asgsgstsgstsgstscsts T s C s A 71.4
서열번호: 121 G s C s A s gsastsgstsasgsgsgsts T s T s C 74.9
서열번호: 122 G s C s C s ascstsgstscsaststsgs T s T s G 63.7
서열번호: 123 C s C s A s gsgsgscstsgsasgsgsts G s T s C 66.8
서열번호: 124 G s A s G s gscsasgscststsgsgsts G s T s T 37.6
서열번호: 125 T s G s C s tsgsgstsgsgsasgscsts G s T s C 31.6
서열번호: 126 G s T s G s asgsgststsgsasgscsas G s C s C 70.3
서열번호: 127 G s C s C s gscsascsasgsgsgstscs G s C s T 42.8
서열번호: 128 A s T s G s tsasgstststsascscscs T s G s G 71.4
서열번호: 129 C s C s A s tsgsasasgscscsasgsgs C s T s G 73.7
서열번호: 130 T s A s C s astsgstsgsgsastscsts G s G s C 69.2
서열번호: 131 G s C s C s astsgststsgscstsgsas T s G s C 62.4
서열번호: 132 T s C s A s gsaststscsasasascs C s C s A 79.7
서열번호: 133 C s G s T s csasgstsastsgscsgs A s A s T s c control oligo
표 4에 나타낸 바와 같이, GLI2 mRNA 발현을 표적화하는 모든 시험된 올리고뉴클레오티드는 4 nM의 낮은 투여량에서 적어도 30%의 억제를 제공하였다. 서열번호: 113, 117, 119, 122, 123, 130 및 131 모두는 4 nM의 투여량에서 적어도 50%의 억제를 제공하고, 서열번호 112, 114, 115, 116, 118, 120, 121, 126, 128, 129 및 132 모두는 4 nM의 투여량에서 적어도 70%의 억제를 제공한다.
서열번호 117, 119, 122, 123, 130, 131, 112, 114, 115, 116, 118, 120, 121, 126, 128, 129 및 132로 나타낸 서열을 갖는 올리고머 (또한 본 발명에서 올리고스로 나타낸) 모두는 4 nM의 투여량에서 적어도 60%의 억제를 제공하고, 그러므로, 일부 실시예에서 바람직하게는, 예를 들면 길이 (더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 조성 (예를 들면, 유사체 유닛의 형태 및/또는 비율)을 변화시키는, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 기초한 올리고뉴클레오티드이고, 이는 또한 GLI2 mRNA 발현의 효과적인 억제를 제공한다.
실시예 9: 시험관내 ( In vitro ) 분석: 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 GLI1 발현 및 인간 GLI3 발현의 안티센스 억제
올리고뉴클레오티드는 DU-145 세포 및 518A2 세포에서 0.8, 4 및 20 nM의 농도에서 GLI1 mRNA를 녹다운하기 위한 이들의 잠재력을 평가하였다 (도면 7 및 8 참조).
올리고뉴클레오티드는 518A2 세포에서 0.8, 4 및 20 nM의 농도에서 GLI3 mRNA를 녹다운하기 위한 이들의 잠재력을 평가하였다 (도면 9 참조).
실시예 10: LNA 올리고뉴클레오티드에 의한 세포사멸 유도
518A2 세포를 1.5 x 105 cells/well의 농도에서 형질전환하기 하루 전날 6-웰 배양 플레이트(NUNC)에서 접종하고 DU-145 세포는 2.8 x 105 cells/well의 농도에서 형질전환하기 하루 전날 6-웰 배양 플레이트(NUNC)에서 접종하였다. 상기 세포를 75 - 90% 융합할 때 형질전환 담체로서 양이온성 리포좀 형성 LipofectAMINE 2000 (Gibco)를 이용하여 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 사용된 상기 올리고머 농도는 4 nM 및 20 nM였다 (웰에서 최종 농도). 올리고머-지질 복합체의 형성은 무혈청 OptiMEM (Gibco) 및 5 ug/ml의 최종 지질 농도를 이용하여 제조사에 의한 설명되는 바와 같이 근본적으로 수행하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였고 처리는 올리고머를 포함하는 배양 배지의 제거에 의해 중지시켰다. Optimem으로 세척한 후, 300 ul의 트립신(Trypsin)은 세포가 웰로부터 분리될 때까지 각 웰에 첨가하였다. 트립신은 상기 웰에 3 ml HUH7 배양 배지를 첨가함으로써 비활성화시켰고 단일 세포 현탁액은 세포 현탁액 상하를 부드럽게 피펫팅(pipetting)함에 의해 만들었다. 스크램블된 올리고 (올리고머) 서열번호: 33은 대조군으로 사용하였다.
이런 다음, 100 ul의 세포 현탁액은 Nunc (cat #136101)로부터 흰 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (다른 시간 점에서 측정하기 위해, 4개의 플레이트를 준비하였다). 그런 다음, 플레이트는 분석을 수행할 때까지, 37℃, 95% 습도 및 5% CO2에서 배양하였다.
캐스파아제 분석( Caspase assay ): 세포사멸 특이적 캐스파아제 3 및 6의 활성은 루미노제닉 캐스파아제(luminogenic Caspase)-Glo 3/7-기질 분석 (Promega 유래 Cat#G8091)를 이용하여 측정하였다. 분석되는 플레이트는 15분 동안 실온에 평형화시켰다. 캐스파아제-글로(Caspase-Glo) ® 3/7 완충용액은 실온에 대해 평형화되는 캐스파아제-글로 ® 작용액에 캐스파아제-글로 ® 3/7 기질로 혼합하였다. 그런 다음, 100 ul의 캐스파아제-글로 ® 작용액은 96-웰 플레이트의 각 웰에 배제에 주의깊게 첨가하였다 (거품 및 웰 사이 오염을 피하는 것이 중요하다). 플레이트는 1분 동안 주의 깊게 흔든 후, 빛으로부터 보호된 상태로 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 캐스파아제 활성은 Luminoscan Ascent instrument (Thermo Labsystems)에서 초당 상대적인 라이트 유닛(Relative Light Units per second; RLU/s)으로 측정하였다. 데이타는 1로 기재되는 목(mock) 샘플의 평균 체적에 대해 상대적인 것과 관련되고 나타내었다. 도면 14 및 14 참조.
실시예 11: 시험관내에서 LNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 증식의 억제
518A2 세포를 형질전환하고 실시예 10에 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로 채취하였다 (세포사멸 유도). 서열번호: 133은 스크램블된 대조군으로 제공하였다. 이런 다음, 100 ul의 세포 현탁액을 MTS 분석을 위해 96-웰 플레이트 ("Orange Scientific")의 각 웰에 첨가하였다 (다른 시간 점에서 측정하기 위해, 4개의 플레이트를 준비하였다). 그런 다음, 플레이트는 분석을 수행할 때까지, 37℃, 95% 습도 및 5% CO2에서 배양하였다.
증식하는 생존가능한 세포의 측정( MTS 분석)
증식 분석을 위해, 10 ul의 CellTiter 96 ® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, G3582)를 96-웰 플레이트의 각 웰의 배지에 첨가하고, 각 웰을 주의 깊게 흔든 다음, 측정 전에 1시간 동안 37℃, 95% 습도 및 5% CO2에서 배양하였다. 흡광도를 분광광도계(spectrophotometer)에서 490 nm에서 측정하였고 분석의 배경(background)은 단지 배지를 포함하는 웰로부터 제거하였다. 490 nm에서 흡광도는 생존가능한 세포의 수에 비례하고 목 형질전환된 세포 및 올리고머로 형질전환된 세포를 위한 초과 시간을 나타내었다. 도면 11 참조.
실시예 12: 서열번호: 112, 114, 118, 120, 130 및 132 및 폴리에틸렌글리콜( polyethylene glycol)의 결합체의 제조
올리고머는 5' 말단에 일반적인 포스포라미다이트 케미스트리(phosphoramidite chemistry)를 이용한 올리고머의 5' 인산기에 대한 Fmoc와 같은 보호기(blocking group)로 보호된 헥산-1(hexan-1) 아민과 같은, 아미노알킬기(aminoalkyl group)의 접합에 의해 기능화되고, 화학식 (1)을 가지는 기능화된 올리고머 (활성화된 올리고머)를 수득하기 위해 결과 화합물의 산화, 그것을 탈보호 및 정제한다:
Figure pct00007
(I)
화학식 (I) 또는 (III)에서 용어 올리고머는 서열번호: 112, 114, 118, 120, 130 alc 132로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고머와 같은, 본 발명의 올리고머를 나타낸다.
화학식 (II)에 나타낸 바와 같은, 활성화된 PEG 용액:
Figure pct00008
(II)
여기서 PEG 부분은 12,000의 평균 분자량을 가지고, PBS 완충용액에 있는 화학식 (I)의 화합물은 12시간 동안 실온에서 혼합하였다. 반응 용액을 메틸렌클로라이드(methylene chloride)로 3회 추출하였고 결합된 유기물층을 마그네슘설페이트(magnesium sulphate)로 건조시켜 여과하였고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이차 증류수에 녹인 후 음이온 교환 컬럼에 통과시켰다. 반응하지 않은 PEG 링커(linker)를 물로 녹여 분리하였고 산물은 NH4HCO3 용액으로 녹여 분리하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획을 모아 화학식 (III)의 결합체를 생산하기 위해 친지질화하였다:
Figure pct00009
(III)
여기서 올리고머 (예를 들면, 서열번호: 112, 114, 118, 120, 130 및 132)는 방출가능한 링커를 통해 12,000의 평균 분자량을 가지는 PEG 폴리머에 접합된다.
실시예 13: Gli1 , Gli2 및 Gli3 mRNA 발현과 관련된 DU -145 및 518A2 세포에서 IC50 결정
실험적 세부사항에 대해 실시예 4 - 9 참조하라.
GLI2 mRNA 발현과 관련된 다양한 GLI2 올리고머들에 대한 IC50 값을 DU-145 세포들 및 518A2 세포들에서 결정하였다. 상기 세포들을 0.04 nM 내지 20 nM 최종 농도의 범위의 농도에서 올리고머들로 형질감염(트랜스펙트)시켰다. GLI2 (또는 본 발명에서 Gli2로 나타내는) mRNA 발현은 qPCR (정량적 PCR)로 형질감염시킨 후 24시간 후에 결정하였다. 상기 결과를 도면 4, 5 및 6에 나타내었다. 모든 올리고머들은 형질감염 24시간 후 GLI2 mRNA의 강한 다운레귤레이션을 나타내었으며, IC50: 모든 세포주에서 4 nM 이하였다.
GLI1 mRNA 발현과 관련된 다양한 GLI2 올리고머들에 대한 IC50 값을 DU-145 세포들 및 518A2 세포들에서 결정하였다. 상기 세포들을 0.04 nM 내지 20 nM 최종 농도의 범위의 농도에서 올리고머들로 형질감염시켰다. GLI1 mRNA 발현은 qPCR로 형질감염시킨 후 24시간 후에 결정하였다. 상기 결과를 도면 7 및 8에 나타내었다. 이중-특이적 GLI2 올리고머들인, 서열번호 112 및 114를 형질감염시킨 후 24시간 후에 분석할 때, DU-145 및 518A2 세포들 모두에서 IC50: 모든 세포주에서 4 nM 이하로 GLI1의 강한 다운레귤레이션을 나타내었다. 게다가, 서열번호 120은 세포주 모두에서 GLI1의 녹다운 (Gli1 mRNA의 감소된 발현)을 나타내었으며, DU-145 세포주에서 가장 강한 녹다운이 발견되었다. 서열번호 120은 GLI1에 단지 1개 미스매치를 가진 것으로, 이는 관찰된 이런 올리고머로 GLI1의 녹다운에 대한 이유가 될 것이다. 대조적으로, 서열번호 130은 DU-145 및 518A2 세포들 모두에서 농도 10 nM 및 20 nM에서 GLI1 발현을 유도하는 것처럼 보였다.
GLI3의 발현 (또는 본 발명에서 Gli3로 나타내는)을 GLI2 올리고머로 형질감염시킨 후 518A2 세포들에서 조사하였다. 상기 발현을 DU-145 세포들에서는 분석하지 않았으며, 이는 이런 세포들에서 GLI3 mRNA의 발현이 매우 낮게 발현하기 때문이다 (qPCR에 대한 검출 한계 이하). 모든 올리고머들은 GLI3에 적어도 2개 미스매치한 것으로 고안하였으며, 이는 상기 올리고머로 GLI3의 표적화를 피하는 것을 요구하기 때문이었다. 상기 결과는 도면 9에 나타내었다. 상기 결과는 서열번호 114가 GLI3 mRNA 발현의 강한 녹다운을 나타내었으며, IC50이 4 nM 이하인 것을 보여주었다. 서열번호 118 및 서열번호 120는 IC50: 20 nM (118) 이상 또는 10 - 20 nM (120) 사이로, GLI3의 다운레귤레이션을 나타낸 반면에, 나머지 올리고머들은 가장 높은 농도에서 GLI3 mRNA 발현에 대한 효과가 없거나 단지 약간의 효과를 가졌다.
실시예 14: GLI2 올리고머의 혈장 안정성
마우스 혈장 (BomTac:NMRI 마우스들로부터 유래된 리튬 헤파린 혈장, 14-09-05 채취된, Taconic Europe)는 해동시킨 후 45 ul 혈장/튜브를 갖는 튜브로 부분 표본화하였다. 그런 다음, 5 ul 올리고머 (200 uM)을 20 uM의 최종 농도를 위해 45 ul 혈장에 첨가하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 샘플을 0 - 120시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다양한 시간점(0h, 24h, 48h 및 120h)에서 샘플을 채취한 후 상기 반응을 액체질소에서 샘플을 스냅냉동(snap freezing)함으로써 정지시켰다. 분석을 위해, 샘플을 적재 완충용액에 첨가한 후 변성 조건 하에서 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동-정렬 겔(PAGE-sequencing gel)에서 전기영동함으로써 분석하였다.
혈장 안정성 분석으로부터 유래된 결과는 상기 올리고머가 매우 안정성이 있는 것을 보여주었다. 모든 올리고머들은 시험관내(in - vitro) 안정성을 보였으며, 그것에 의하여 활성 화합물의 90% 이상이 37℃에서 마우스 혈장으로 인큐베이션할 때 24시간 후 남았다. 3'-말단에 A-잔기를 가지는, 서열번호: 120 및 서열번호: 132를 나타내는 서열을 갖는 올리고머들에 대하여, 약한 N-1 밴드가 24시간 인큐베이션 후에 개시되는 것으로 검출될 수 있는 반면에, 분해는 나머지 올리고머들 중 어떤 것들에 대해 검출될 수 있었다. 우리는 이전에 3'-말단에 A-잔기를 가지는 올리고머들이 혈장에서 인큐베이션한 후 약한 N-1 밴드가 나타나는 것을 관찰하였으며, 이는 아마도 탈푸린화 때문인 것이다. 상기 결과는 도면 10에 나타내었다.
실시예 15: GLI2 올리고머의 T m 결정
LNA 올리고머/RNA 듀플렉스의 녹는 온도는 UV-광도계(UV-spectrometry system)와 상응하는 소프트웨어 (Perkin Elmer, Fremont, USA)를 이용하여 결정하였다. LNA 올리고머 및 이의 상보적인 RNA는 Tm-완충용액 (200 nM NaCl, 0.2 nM EDTA, 20 mM NaP, pH 7.0)에 대해 최종 농도 1.5 uM으로 첨가하였다. 듀플렉스 형성은 시료를 3분 동안 95℃에 가열한 후, 30분 동안 실온에서 냉각함으로써 제조되었다.
녹는 온도 (Tm)값은 Lambda 25 UV/VIS 분광계 (Perkin Elmer)에서 측정하였고 데이타는 TempLab 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 이용하여 수집 및 분석하였다. 장비는 20 - 95℃로부터 올리고머 듀플렉스 시료를 가열한 후 25℃까지 냉각하는 것으로 프로그램화하였다. 이런 과정 동안 260 nm에서 흡광도를 기록하였다. 녹는 곡선은 Tm값을 산출하는데 사용하였다. RNA에 대한 올리고머의 Tm값을 결정하였다 (표 5).
UV -광도계에 의해 측정된 상보적인 RNA 에 대한 LNA 올리고머의 Tm
서열번호 Tm
112 63.8 ℃
114 72.2 ℃
118 72.9 ℃
120 70.5 ℃
130 65.0 ℃
132 60.7 ℃
모든 GLI2 올리고머들은 그들의 상보적인 RNA에 대하여 60 ℃ 이상의 Tm을 가졌다.
실시예 16: DU -145 및 518A2 세포에서 증식 분석
MTS 분석: 증식 분석을 위해, 10 ul CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, G3582)을 96-웰 플레이트의 각 웰의 배제에 첨가하였고, 상기 플레이트를 주의깊게 흔든 다음, 측정 전 1시간 동안 37℃, 95% 습도 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 흡광도는 분광광도계(spectrophotometer)에서 490 nm로 측정하였고, 분석을 위한 배경은 단지 배지를 포함하으로 웰로부터 감하였다.
GLI2 올리고머들로 형질감염 후 증식은 MTS 분석을 이용하여 DU-145 및 518A2 세포들에서 조사하였다. 증식은 형질감염 후 5h, 24h, 48h 및 72h에서 분석하였다. 상기 결과는 U-145 및 518A2 세포들에서 서열번호: 130으로 나타내는 서열을 갖는 올리고머를 제외한 모든 GLI2 올리고머들이 강하고 투여량-의존적인 증식 억제를 나타낸 반면에, 음성 대조군은 세포 증식에 대한 효과를 가지지 않았다. 증식을 억제하는 가장 강한 올리고머들은 서열번호: 114, 118 및 120으로 나타내는 서열을 가지는 올리고머였다. 2개의 독립적인 스크린을 수행하였고, 다양한 올리고머의 평균 활성의 최적의 대표적인 것이 되는 스크린으로부터 유래한 데이타를 나타내었다 (도면 11).
실시예 17: 생체내 ( In vivo ) 분석: Gli 올리고뉴클레오티드의 생체내 ( in vivo , i.v. ) 투여 후 마우스 간에서 ALT 및 AST 결정.
암컷 NMRI 마우스에 10 mg/kg의 투여량으로 0, 3, 6 및 9일에 서열번호: 112, 114, 118, 120 및 132의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 정맥(i.v.) 주사를 놓았다. 동물을 투여 24시간 후에 희생시켰다. ALT 및 AST 수준을 희생의 시점에 마우스로부터 획득된, 적혈구를 제거한, 혈청에서 결정하였다. 마우스 혈청에서 알라닌-아미노트랜스퍼라제(alanine-aminotransferase, ALT) 및 아스팔테이트-아미노트랜스퍼라제(aspartate-aminotransferase, AST)의 활성은 96-웰 포맷에 적합한 것을 제외하고 제조사의 지시에 따라 효소적 ALT 분석 (ABX Pentra A11A01627 (ALT) or A11A01629 (AST), Horiba ABX Diagnostics, France)을 이용하여 결정하였다. 요컨대, 혈청 샘플은 H2O로 2.5배 희석한 후 2번 분석하였다. 각 웰에 50 ul 희석된 샘플 또는 표준 (ABX Pentra 유래 멀티칼(multical), A11A01652)의 첨가 후, 200 ul의 37℃ ALT 시약 혼합물을 각 웰에 첨가하였다. 상호작용 분석(Kinetic Measurement)은 30초 간격으로 5분 동안 340 nm 및 37℃에서 수행하였다. 데이타는 2배 희석된 표준 곡선으로 연관시켰으며, 결과는 U/L에서 ALT 활성으로 나타내었다.
상기 결과를 도면 12 A 및 B에 나타내었다.
실시예 18: 동물 모델에서 항- GLI 올리고뉴클레오티드의 항-종양 효과
모든 이종이식 연구에 대해, 마우스를 피하로 종양을 이식하였다. 종양이 약 100 - 200 mm3 (또는 지정된 크기)에 도달할 때, 마우스를 지정된 투여량 및 스케줄에 LNA-올리고뉴클레오티드로 주사하였다.
PC3 종양을 지니는 마우스 (전립선 암 모델)를 3, 30, 및 100 mg/kg의 서열번호: 3, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 75로 기재되는 서열을 갖는 LNA 올리고머로 처리하였다 (정맥 주사(IV); 매 3일 4번 투여 (q3d x 4)). 연구의 말미에, 종양을 채취한 후, 인간 및 마우스 GLI mRNA 및 PTCH1 mRNA 수준을 인간 또는 마우스 mRNA 중 어느 하나에 대해 특이적인 프로브를 이용하여 분석하였다. 양성 대조군 (GLI2 안티센스 올리고뉴클레오티드- 서열번호: 10으로 형질감염된 세포로부터 유래된)을 상기 연구에서 인큐베이트하였고, 이는 예측된 바와 같이 다운 레귤레이션 결과를 나타내었다. 서열번호: 19, 서열번호: 75 또는 서열번호: 3으로 기재된 서열을 갖는 올리고머로 처리하는 것은 인간 GLI1, GLI3 또는 Ptch1 mRNA의 녹다운을 야기하지 않았다 (데이타는 보이지 않는다). 그러나, 도면 15a에서 보는 바와 같이, 종양 상피 세포에서 GLI2 mRNA의 다운 조절의 정도는 투여량-반응 관계가 확립될 수 없었음에도 불구하고, 서열번호: 19 또는 서열번호: 75을 가지는 올리고머로 처리한 것에 대해 관찰하였다.
흥미롭게도, 마우스 GLI1, GLI3 또는 Ptch1의 mRNA는 투여량-반응 관계가 확립될 수 없었음에도 불구하고, 모든 3개의 올리고머에 의해 유의적으로 하향 조절되었다 (도면 15b 참조 - PC3 종양 기질). GLI1(GLI2의 조절 하에)이 헤지호그 경로(hedgehog pathway)와 직접 관련된 전사 인자이기 때문에, 상기 결과는 기저 세포가 GLI mRNA에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 처리에 의해 영향을 받는 것을 제시하였다. GLI2는 GLI1 및 Ptch1의 수준을 조절하였다. 그러므로, GLI2의 억제는 GLI1 및 Ptch1의 다운-레귤레이션을 야기할 것이다.
도면 15에 있어서, G1은 식염수를 나타낸다; G2는 3 mg/kg의 서열번호 3을 나타낸다; G3는 30 mg/kg의 서열번호 3을 나타낸다; G4는 3 mg/kg의 서열번호 19를 나타낸다; G5는 30 mg/kg의 서열번호 19를 나타낸다; G6는 100 mg/kg의 서열번호 19를 나타낸다; G7은 3 mg/kg의 서열번호 75; G8은 30 mg/kg의 서열번호 75를 나타낸다; G9는 100 mg/kg의 서열번호 75를 나타낸다; C는 시험관내 대조군 518A - 흑색종 세포주; T는 시험관내 대조군 10 nM의 4478 (Gli2 안티센스 (서열번호 10))를 나타내었다. 용어 RQ%는 상대적인 양을 퍼센티지로 나타낸다; 용어 KD는 녹다운(knock down)을 나타낸다; 용어 AN09017는 실험자에 의해 사용된 연구 번호를 나타낸다; 용어 "mpk"는 mg/kg를 나태난다.
이전의 소형 독성학(mini-toxicology, minitox) 연구는 종양 성장 억제의 증거를 보여주었다 (tumor growth inhibition, TGI) (도면 16). 이번 연구에서, 서열번호: 3 (데이타를 보이지 않음), 서열번호: 19 (도면 16 참조), 또는 서열번호: 75 (도면 16 참조)로 기재된 서열을 가지는 올리고머의 효능을 DU-145 전립선암 모델에서 다중 투여 (0.3-30 mg/kg; 매 3일 10번 투여 (q3d x10))로 테스트하였다. 상기 화합물들은 활발한 TGI를 보이지 않았다. 적어도 서열번호: 19 및 서열번호: 75로 기재되는 서열을 가지는 올리고머에 대해, 3 mg/kg 투여량에 대한 동향이 다른 투여량 수준 보다 나은 것으로 수행되었다.
PC3 이종이식 전립선암 모델에서 효능 연구를 수행하였다. 서열번호: 3, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 75로 나타내는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 3 - 30 mg/kg에서 q3d x10 (매 3일 10번 투여)로 주었다. 28일자로 (대부분의 군에서 거의 100% 생존하는 최종일), 어떤 처리의 가장 큰 TGI는 서열번호: 19로 기재되는 서열을 가지는 올리고머로 처리한 것 (54%) 및 서열번호: 3으로 기재되는 서열을 가지는 올리고머로 처리한 것 (34%)으로 나타났으며, 이들 둘 모두 3 mg/kg (도면 17 참조)였다. 반응에서 큰 변화는 어떤 특정 군에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 서열번호: 19로 기재되는 서열을 가지는 올리고머를 3 mg/kg로 처리하면 최고의 TGI를 야기하였다.
이번 연구에서, 서열번호: 19로 기재되는 서열을 가지는 올리고머를 PC3 이종이식 (전립선암 모델)에 대한 완전한 효능 연구에서 투여되었다 (3 mg/kg, IV). 또한, 상기 연구는 ip (복강내 주사) 및 iv (정맥 주사) 투여 루트를 비교하였다. q1d (매일 투여) 스케줄에 대한 최고의 반응을 가지는 적당한 TGI를 관찰하였다 (도면 18 참조). 복강내 주사 또는 정맥 주사 루트를 통한 올리고머의 투여 (q3d 스케줄에 대한 - 매 3일 투여하는)는 유사한 효능을 야기하였다. 이런 연구는 GLI 안티센스 올리고머가 전립선암에 효과적일 수 있음을 나타낸다. 도면 18에서 용어 "mpk"는 "mg/kg"을 의미한다.
DLD-1 대장암 모델은 사이클로파민(cyclopamine)-저항성 대장암 모델이다 (Yauch et al Nature 2008, 455: 406-410). Smo 유전자의 엑손 11에서 돌연변이는 이런 암 세포주에서 나타난다. 그럼에도 불구하고, 헤지호그(hedgehog) 경로는 여전히 활성화된다. 상기 모델은 시험관내 또는 생체내에서 Smo 억제제 (예를 들면, 사이클로파민)에 대해 반응하지 않는다. 게다가, DLD-1은 헤지호그(hedgehog) 리간드를 분비하지 않는 것을 나타내었다. 리간드 및/또는 Smo 돌연변이의 결핍 때문에, 상기 모델은 사이클로파민 또는 그의 유사체에 반응하지 않을 것이며, 따라서 GLI2 안티센스 치료법과 같은, 대체적인 치료법을 테스트하기 위한 좋은 모델이다. 성장 억제는 이전에 MOE 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 입증한 바 있다 (Kim et al, 2007 Cancer Res. 67(8) 3583 -3593.).
서열번호: 19로 기재되는 서열을 가지는 올리고머의 효과는 DLD-1 대장암 모델에서 두 투여량 수준 (3 및 30 mg/kg, 매 3일 6번 정맥 주사(q3dx6(iv)))에서 테스트하였다. 결과 (도면 19의 상부면)는 이주마다 3 mg/kg 주사로 동물의 처리가 23%의 TGI를 야기하는 것을 입증하였다. 30 mg/kg 투여량 수준에서는 어떠한 효과도 나타나지 않았다. 상기 연구는 TGI 결과를 확인하기 위해 반복하였다. 이런 예비적 결과에 의해 뒷받침되기 위해, 효능 연구가 3 mg/kg, 매 3일 10번 투여 (q3dx10), iv로 투여되는 양으로 동일 모델에서 수행하였다. 4th 투여 후, 집단을 희생시킨 후 종양 및 간 샘플을 GLI1/GLI2 mRNA 녹다운 분석을 위해 수집하였다. 나머지 동물들은 TGI을 위해 모니터링하였다. 이런 연구에서, 어떠한 TGI도 관찰되지 않았다 (도면 19의 하부면). 추가적인 효능 연구가 요구되었다.
DU-145 종양 이종이식 (전립선암 모델)을 지정된 바와 같이 다양한 투여량으로 서열번호: 19, 서열번호: 75, 또는 서열번호: 3으로 기재된 서열을 갖는 올리고머로 처리하였다. 좋은 항종양 성장 억제 (DU145 모델)은 모든 3개의 화합물에 대해 관찰되었다 (도면 20 a - c). 그러나, 투여량 반응의 결핍이 있었다. 서열번호: 19 및 서열번호: 75의 가장 효과적인 투여량은 3 mg/kg (매 3일 3번 투여 (q3d x 3))였다. 도면 20은 q3d x 4 (매 3일 4번 투여)를 나타낸다.
종양 성장 억제 연구는 PC3 전립선암 모델에서 서열번호: 3, 서열번호: 19, 및 서열번호: 75로 기재되는 올리고머로 수행하였다 (매 3일 10번 투여 (q3d x10)) (n.b. n=3). 상기 화합물의 한정된 양 때문에, 각 군은 3마리의 마우스를 포함시켰다. 좋거나 탁월한 항종양 효과는, 종양 극복이 서열번호: 3 및 서열번호: 75으로 기재되는 서열을 갖는 화합물로 검출됨에도 불구하고, 모든 3개의 화합물로 관찰되었다 (도면 21 참조). 이런 화합물의 일부의 높은 투여량은 첫번째 실험에서 종양 성장에 대한 억제 효과를 나타나지 않았기 때문에, 종양을 지닌 동물을 상기 효과가 재생될 수 있는지 결정하기 위해 30 mg/kg의 서열번호: 19, 서열번호: 3, 또는 서열번호: 75로 기재되는 서열을 가지는 안티센스 올리고머로 41일에 재처리하였다. 서열번호: 19 및 서열번호: 75는 종양 정체를 나타내었다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개는 참조로서 본 발명에 통합된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 떨어지지 않은 당업자에게 자명할 수 있다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시예와 관련되는 것으로 기재되어 있음에도 불구하고, 청구된 본 발명은 이런 구체적인 실시예로 지나치게 한정되지 않는 것이 이해될 것이다. 정말로, 생화학 및 분자 생물학 또는 관련 분야의 기술자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 모델의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
<110> Enzon Pharmaceuticals, Inc. Santaris Pharma A/S <120> RNA ANTAGONISTS TARGETING GLI2 <130> 10fpi-12-10 <150> PCT/IB2009/006407 <151> 2009-07-15 <150> EP08104754 <151> 2008-07-15 <150> US61/081135 <151> 2008-07-16 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6780 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gattgccacc caggacgatg agcggctgag atggagacgt ctgcctcagc cactgcctcc 60 gagaagcaag aagccaaaag tgggatcctg gaggccgctg gcttccccga cccgggtaaa 120 aaggcctctc ctttggtggt ggctgcagcg gcagcagcag cggtagctgc ccaaggagtg 180 ccgcagcatc tcttgccacc attccatgcg cccctaccga ttgacatgcg acaccaggaa 240 ggaaggtacc attacgagcc tcattctgtc cacggtgtgc acgggccccc tgccctcagc 300 ggcagccctg tcatctctga catctccttg atccggcttt ccccgcaccc ggctggccct 360 ggggagtccc ccttcaacgc cccccacccg tacgtgaacc cccacatgga gcactacctc 420 cgttctgtgc acagcagccc cacgctctcc atgatctctg cagccagggg cctcagcccc 480 gctgatgtgg cccaggagca ccttaaggag aggggactgt ttggccttcc tgctccaggc 540 accaccccct cagactatta ccaccagatg accctcgtgg caggccaccc cgcgccctac 600 ggggacctgc tgatgcagag 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Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 5 ccagcatgta ctg 13 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 6 accagcatgt ac 12 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 7 ccagcatgta ct 12 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 8 cagcatgtac tg 12 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 9 aacgtgcact tgtg 14 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 10 ttctggtgct tggc 14 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) 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Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 63 acatgtggat ctgg 14 <210> 64 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 64 catgtggatc tggc 14 <210> 65 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 65 tacatgtgga tct 13 <210> 66 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 66 acatgtggat ctg 13 <210> 67 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 67 catgtggatc tgg 13 <210> 68 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 68 atgtggatct ggc 13 <210> 69 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 69 tacatgtgga tc 12 <210> 70 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 70 acatgtggat ct 12 <210> 71 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 71 catgtggatc tg 12 <210> 72 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 72 atgtggatct gg 12 <210> 73 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 73 tgtggatctg gc 12 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 74 gccatgttgc tgatgc 16 <210> 75 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 75 tcagattcaa accca 15 <210> 76 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 76 tcagattcaa accc 14 <210> 77 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 77 cagattcaaa ccca 14 <210> 78 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 78 tcagattcaa acc 13 <210> 79 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 79 cagattcaaa ccc 13 <210> 80 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 80 agattcaaac cca 13 <210> 81 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 81 tcagattcaa ac 12 <210> 82 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 82 cagattcaaa cc 12 <210> 83 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 83 agattcaaac cc 12 <210> 84 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 84 gattcaaacc ca 12 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 85 gcaccaccag catgtactgc gcct 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 86 tgcgattctg gtgcttggcg cggt 24 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 87 cgtactcctt ggtgcagtct tccc 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 88 ggaccgcagg tgtgtcttca ggtt 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 89 ttcgtacatg tggatctggc cgta 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 90 agcattcaga ttcaaaccca aatg 24 <210> 91 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 91 accagcatgt actg 14 <210> 92 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 92 aacgtgcact tgtg 14 <210> 93 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 93 ttctggtgct tggc 14 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 94 gtgaaggctg ggctga 16 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 95 tctgcttgtt ctggtt 16 <210> 96 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 96 cctgcttaca gtcatc 16 <210> 97 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 97 ctccttggtg cagtct 16 <210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 98 gtgtgtcttc aggttc 16 <210> 99 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 99 cgcaggtgtg tcttca 16 <210> 100 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 100 gcagatgtag ggtttc 16 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <400> 101 gccactgtca ttgttg 16 <210> 102 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 102 ccagggctga ggtgtc 16 <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 103 gaggcagctt ggtgtt 16 <210> 104 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 104 tgctggtgga gctgtc 16 <210> 105 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 105 gtgaggttga gcagcc 16 <210> 106 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 106 gccgcacagg gtcgct 16 <210> 107 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 107 atgtagttta ccctgg 16 <210> 108 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 108 ccatgaagcc aggctg 16 <210> 109 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 109 tacatgtgga tctggc 16 <210> 110 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 110 gccatgttgc tgatgc 16 <210> 111 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 111 tcagattcaa accca 15 <210> 112 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 112 accagcatgt actg 14 <210> 113 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 113 aacgtgcact tgtg 14 <210> 114 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 114 ttctggtgct tggc 14 <210> 115 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 115 gtgaaggctg ggctga 16 <210> 116 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 116 tctgcttgtt ctggtt 16 <210> 117 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 117 cctgcttaca gtcatc 16 <210> 118 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 118 ctccttggtg cagtct 16 <210> 119 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 119 gtgtgtcttc aggttc 16 <210> 120 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 120 cgcaggtgtg tcttca 16 <210> 121 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 121 gcagatgtag ggtttc 16 <210> 122 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 122 gccactgtca ttgttg 16 <210> 123 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 123 ccagggctga ggtgtc 16 <210> 124 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 124 gaggcagctt ggtgtt 16 <210> 125 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 125 tgctggtgga gctgtc 16 <210> 126 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 126 gtgaggttga gcagcc 16 <210> 127 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 127 gccgcacagg gtcgct 16 <210> 128 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 128 atgtagttta ccctgg 16 <210> 129 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 129 ccatgaagcc aggctg 16 <210> 130 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 130 tacatgtgga tctggc 16 <210> 131 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 131 gccatgttgc tgatgc 16 <210> 132 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 132 tcagattcaa accca 15 <210> 133 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines are 5-methylcytosine <400> 133 cgtcagtatg cgaatc 16 <210> 134 <211> 8281 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gcgcacaccc gccgctccca ctcacccgcg ccgctctccc gccttccccg cgcgccccgc 60 ggccgcccgc gggtctatgg gaagttcggg gacttgacag ccgctgccgc cgcagggcat 120 ttttggtcga agagagctga agtaatgaga agacatcatg gaggcccagt cccacagctc 180 cacgaccact gaaaagaaaa aagttgagaa ttccatagtg aagtgctcca ctcgaacaga 240 tgtgagcgag aaagccgttg cctccagcac cacttctaat gaggatgaaa gtcctggaca 300 gacttatcac agagagagaa gaaacgcaat cactatgcag ccacagaatg tccaggggct 360 cagcaaagtc agtgaggaac cttcaacatc gagtgacgag agggcctcat tgatcaagaa 420 agagatccat gggtccctgc cacacgtggc ggagccctct gtgccgtacc gcgggacggt 480 gtttgccatg gaccccagga atggttacat ggagccccac taccaccctc ctcatctttt 540 ccctgccttc catcctcctg taccaattga tgccagacat catgagggcc gttaccatta 600 cgatccatct ccgattcctc cattgcatat gacttccgcc ttatctagta gccctacgta 660 tccggacctg cccttcatta ggatctcccc acaccggaac cccactgctg cttccgagtc 720 tcccttcagc cctccacatc cctacattaa tccctacatg gactatatcc gctccttgca 780 cagcagccca tcgctctcca tgatctcagc aacccgtggg ctgagcccta cagatgcgcc 840 ccatgcagga gtcagcccag cagaatacta tcatcagatg gccctgctaa ctggccagcg 900 cagcccctat gcagacatta ttccctcagc tgccaccgcc ggcacggggg ccatccacat 960 ggaatatctt catgctatgg atagcaccag attctccagc cccaggctgt cagccaggcc 1020 gagccgaaaa cgtacactgt ccatatcacc actctccgat catagctttg accttcagac 1080 catgataagg acgtctccca actccttggt cacgattctc aataattccc gtagcagctc 1140 ttcagcaagt ggctcctatg gtcacttatc tgcaagtgca atcagccctg ccttgagctt 1200 cacctactct tccgcgcccg tctctctcca catgcatcag cagatcctaa gccgacaaca 1260 gagcttaggt tcagcctttg gacacagccc tccactcatc caccctgccc caacttttcc 1320 aacacagagg cctattccag ggatccctac ggttctgaac cccgtccagg tcagctccgg 1380 cccttctgag tcctcacaga acaagcccac gagtgagtct gcagtgagca gcactggtga 1440 cccgatgcac aacaagaggt ccaagatcaa acccgatgaa gacctcccca gcccaggggc 1500 tcgggggcag caggaacagc ccgaaggaac aacccttgtc aaggaggaag gggacaaaga 1560 tgaaagcaaa caggagcctg aagtcatcta tgagacaaac tgccactggg aaggctgcgc 1620 gagggagttc gacacccaag agcagcttgt gcaccatata aataacgacc atattcatgg 1680 agagaagaag gagttcgtgt gcaggtggct ggactgctca agagagcaga aacccttcaa 1740 agcccagtat atgttggtag tgcatatgag aagacacacg ggcgagaagc ctcacaaatg 1800 cacttttgaa ggttgcacaa aggcctactc gagactagaa aacttgaaaa cacacttgag 1860 atctcacact ggagagaaac catacgtctg tgagcacgaa ggttgcaaca aggctttctc 1920 aaatgcctct gatcgcgcca aacaccaaaa cagaacgcat tccaatgaga aaccatatgt 1980 gtgcaaaatc ccaggctgca ctaagcgtta cacagaccca agctccctcc ggaaacatgt 2040 gaagacagtg catggcccag aggctcatgt caccaagaag cagcgagggg acatccatcc 2100 tcggccgcca cccccgagag attccggcag ccattcacag tccaggtcgc ctggccgacc 2160 gactcaggga gcccttggtg agcagcagga cctcagcaac actacctcaa agcgggaaga 2220 atgcctccag gtgaaaaccg tcaaggcaga gaagccaatg acatctcagc caagccctgg 2280 tggtcagtct tcatgcagca gccaacagtc ccccatcagc aactattcca acagtgggct 2340 cgagcttcct ctgaccgatg gaggtagtat aggagacctc agtgccatcg atgaaacccc 2400 aatcatggac tcaaccattt ccactgcaac cacagccctt gctttgcaag ccaggagaaa 2460 cccggcaggg accaaatgga tggagcacgt aaaactagaa aggctaaaac aagtgaatgg 2520 aatgtttccg cgactgaacc ccattctacc ccctaaagcc cctgcggtct ctcctctcat 2580 aggaaatggc acacagtcca acaacacctg cagcttgggt gggcccatga cgcttctccc 2640 gggcagaagc gacctctctg gggtggacgt cactatgctg aacatgctca acagaaggga 2700 cagcagcgcc agcaccatca gctcggccta cctgagcagc cgccgctcct cagggatctc 2760 gccctgcttc tccagccgcc gctccagcga ggcgtcacag gccgagggcc ggccgcagaa 2820 cgtgagcgtg gccgactcct acgaccccat ctccaccgac gcctcgcgcc gctccagcga 2880 agccagccag agcgacggcc tgcccagcct gctcagcctc acgcccgccc agcagtaccg 2940 cctcaaggcc aagtacgcgg ctgccacagg agggccgccg ccgacgcccc tgcccaacat 3000 ggagaggatg agcctgaaga cgcgcctggc gctgctcggg gatgccctcg agcctggcgt 3060 ggccctgcct ccagttcatg ccccgaggag gtgcagcgac gggggagccc acggctacgg 3120 gcggcgccac ctgcagccgc acgatgcgcc gggccacggc gtgaggaggg ccagcgaccc 3180 ggtgcggaca ggctccgagg gcctggccct gcctcgtgtg ccgcgcttca gcagcctcag 3240 cagctgcaac cccccggcga tggccacgtc cgcggagaag cgcagtctcg tgcttcagaa 3300 ttacacgcgg cccgagggcg gccagtcccg aaacttccac tcgtccccct gtcctcccag 3360 catcaccgag aacgtcaccc tggagtccct gaccatggac gctgatgcca acctgaacga 3420 tgaggatttc ctgccggacg acgtggtgca gtatttaaat tcccagaacc aagcagggta 3480 cgagcagcac ttccccagcg ccctcccgga cgacagcaaa gtgccccacg ggcccggtga 3540 ctttgacgcg cccgggctgc cagacagcca cgctggccag cagttccatg ccctcgagca 3600 gccctgcccc gagggcagca aaaccgacct gcccattcag tggaacgaag tcagctccgg 3660 aagcgccgac ctgtcctcct ccaagctcaa gtgtgggccg cggcccgctg tgccgcagac 3720 tcgcgccttt gggttctgca acggcatggt cgtccacccg cagaacccct tgaggagcgg 3780 gcctgctggg ggctatcaga ccctcgggga gaacagcaac ccctacggtg gcccagagca 3840 cttgatgctc cacaacagcc ccggaagtgg caccagtgga aacgccttcc atgaacagcc 3900 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tcagaacctt tcccatagct cctcccgcct caccacgcct cgggcgtccc tcccattccc 4800 agcgctgtcc atgagcacca ccaacatggc tatcggggac atgagttctt tgctgacctc 4860 cctagcggaa gaaagcaaat tccttgcagt tatgcaatag gctttaggaa aaaaagactg 4920 caaccaacgg aaatcaatag gagttgaaga gattaaactg actttgtttt ggctgttttt 4980 ttagttctgt atgtatttta gcaatctcat ctcacctaac tgagatgtgt ttcaattata 5040 ttccttttat ggaaaaggac tctgaaaaac cctaaagtat tctagggaga aactgtcttc 5100 catttcagtt ttgaatcagt attgttacac tcaaaccacc ctctttttaa aaaaaaaaaa 5160 aaaaactgta agccccgccc cctttttagt aaaccgatgt aaatttgtga tgtgcatatt 5220 cttctttctt ttagaagagc agtcaaatta aaggatttga catgttttgc tgttgctcaa 5280 aggaaatagg agttggtgtg cttgtgacca aggggttaca cttccagctt ttaaaattct 5340 cctttacatg tgctcagtgt tttgttttgt gttttggttt ctgtttttta ttttaattcc 5400 cacattgggc acaagaatca gaatatggat agctagttta agaaactttt gtgggtgcac 5460 tgtagcatag atgacagaat attgatgttc cccccatctc caattcagtt cagggcattc 5520 cacagttaaa cagaaatggg aacgtggggc tcttataaat gaaatgggcg ctcacagttt 5580 tggttttcag ctcttcatgt ctgtaagtgt gctttggggg aggctatgtc tgtatggtcg 5640 attctcagtt atcacatttg cctctcctcc cactaccttc atgaacattc agtgctgttt 5700 cgcactgcag ttagagagaa gggacggaca gttggtgaca ctcagccaca ttgctacttt 5760 tatctgttct ggtaagaagt tagatagatg gtagattgaa gcaattgggt agaattagtt 5820 gggggaatat ttatgagttg ctgtgtttgt tgattagttc catctctttc ccattttaac 5880 tgagaattga ttatatatag ctctaagtat ataggtattt aaacaacccc acaagcggct 5940 gtatcagtaa catttattaa ttccactata gtgagggagg atttccattc taaatacctt 6000 attttgaggg atttataaaa cttagttgta aaagagaaag cccacatagt gggaataaat 6060 tgcttcagcc atttttagta tttgagagca ctagggaaga tgtttagtag ctgtgtggat 6120 gccttttttc acaccctgtc tattgaatgc tgcatccatt cacgaagtta aatgttacat 6180 gcagttagtc cttaatgtgg actggatctg tacttttgtt ttggattaaa acatttaaag 6240 atttttgaag tgcagctact ccccacgtgc atttgataca cataaaagtc atactgtgtg 6300 tgcacaaaga gtacatggat tttccagcat attgctttaa aaaattatat aaactgttaa 6360 aatattaaca cctcaggcta cctgctgtat tctgtcccat tgacccctgg aattggattt 6420 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Claims (15)

  1. 총 10 ~ 30 모노머 사이의 연속된 서열의 첫번째 부위를 포함하는 10 ~ 30 모노머 사이의 길이이고, 상기 연속된 서열은 서열번호 1 및/또는 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 134로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 GLI2 유전자 또는 mRNA와 같은, 포유류 GLI2 유전자 또는 포유류 GLI2를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 상동적인, 올리고머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 연속된 서열은 서열번호 19, 3 - 18 및 20 - 90 중 어느 서열에 상응하는 부위에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90% 상동적인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 연속된 서열은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 134에 상응하는 부위의 역상보와 미스매치가 없거나 1개 또는 2개 이하의 미스매치를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 서열은 9 - 18 뉴클레오티드 사이의 길이인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 서열은 뉴클레오시드 유사체(analogues)를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오시드; 바람직하게 상기 뉴클레오시드 유사체는 LNA와 같은, 당 변형된 뉴클레오시드인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 갭머(gapmer)인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, GLI2 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 GLI2 유전자 또는 mRNA의 발현을 억제하고; 바람직하게 상기 올리고머는 서열번호: 112, 114, 118, 120, 130 및 132로 구성된 군으로부터 선택되며; 더욱 바람직하게 상기 올리고머는 서열번호 118 또는 132인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체(conjugate).
  10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 9항의 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 암과 같은, 과증식 질환의 치료를 위한 것과 같은, 약제로서 사용을 위한, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 9항의 결합체.
  12. 암과 같은, 과증식 질환의 치료를 위한 것과 같은, 약제의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 제 9항에서 정의된 결합체의 용도.
  13. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 9항의 결합체, 또는 제 10항의 약학적 조성물을 암과 같은, 과증식 질환으로부터 고통받거나, 또는 고통받을 것 같은 동물에게, 투여하는 단계를 포함하는, 암과 같은, 과증식 질환의 치료 방법.
  14. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 9항의 결합체를 GLI2를 발현하는 세포에서 GLI2를 억제하기 위하여 상기 세포로 투여하는 단계를 포함하는, GLI2를 발현하는 세포에서 GLI2의 억제 방법.
  15. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 9항의 결합체, 또는 제 10항의 약학적 조성물을 세포사멸을 유도하기에 충분한 양으로 GLI2를 발현하는 세포에 투여하는 단계를 포함하는, GLI2를 발현하는 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법.
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