TW202140025A - 軟骨發育異常症之治療 - Google Patents

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Abstract

一種用於治療軟骨發育異常症之醫藥組成物、及使用該醫藥組成物之治療方法，該醫藥組成物含有1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽。

Description

軟骨發育異常症之治療
[關聯申請案之相互參照] 本申請案主張基於已在2020年1月31日申請的日本專利申請案第2020-014260號說明書(其揭示內容整體係藉由參照而援用於本說明書中)之優先權。 本發明是有關於使用FGFR抑制劑之軟骨發育異常症(軟骨發育不全症、次軟骨發育不全症、致死性骨發育不全症)的治療。
纖維母細胞生長因子(FGF；fibroblast growth factor)係於廣泛組織中可觀察到表現且負責細胞增殖分化的生長因子之一者。FGF之生理學上的活性是經由作為專一性細胞表面受體的纖維母細胞生長因子受體(FGFR；fibroblast growth factor receptor)來進行媒介。FGFR是屬於受體型之蛋白質酪胺酸激酶家族，並由細胞外配體結合域、單跨膜域及細胞內酪胺酸激酶域所構成，至今已鑑定出4種FGFR(FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4)。FGFR是藉由FGF的結合而形成二聚物，並藉由磷酸化而被活化。受體的活化會誘導下游之特定訊息傳遞分子的動員及活化，而表現生理功能。
有報導指出FGF/FGFR訊息傳遞之異常與人類軟骨細胞分化異常相關疾病的關聯性。人類軟骨細胞分化異常的疾病中FGF/FGFR訊息之異常活化，被認為是起因於FGFR之基因突變(非專利文獻1、2)。
針對軟骨發育異常症，已報導FGFR3之G380R、N540K、K650E等點突變，並暗示此類基因突變可能為軟骨發育異常症的原因(非專利文獻3、4、5)。又，已報導作為FGFR抑制劑之NVP-BGJ398在激酶域外之活化突變FGFR3Y367C發病的軟骨發育不全症小鼠模式上具有治療效果(非專利文獻6)。又，已報導NVP-BGJ398對於FGFR3G380R突變在50nM下顯示激酶抑制效果。另一方面，並無報導指出在FGFR3G380R發病之軟骨發育不全症小鼠模式的治療效果。
已報導具有FGFR抑制效果的雙取代苯炔基化合物(專利文獻1)，亦已報導該等化合物對具有特定FGFR2突變之癌係有效的(專利文獻2)、在投予時程上間歇投予可能是有用的(專利文獻3)。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開WO2013/108809說明書 專利文獻2：國際公開WO2015/008844說明書 專利文獻3：國際公開WO2015/008839說明書 非專利文獻
非專利文獻1：Dev Dyn. 2017 Apr；246(4)：291-309。 非專利文獻2：Am J Hum Genet. 2000 Dec；67(6)：1411-21。 非專利文獻3：Nature. 1994 Sep 15；371(6494)：252-4。 非專利文獻4：Nat Genet. 1995 Jul；10(3)：357-9。 非專利文獻5：Am J Med Genet.1996 May 3；63(1)：148-54。 非專利文獻6：J Clin Invest. 2016 126(5)：1871-1884。
發明欲解決之課題 本發明之課題在於提供一種用以治療軟骨發育異常症之新穎醫藥品及使用有該醫藥組成物之治療方法。
用以解決課題之手段 本發明人等為解決前述課題而反覆進行了精闢研討，結果發現到1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮(Futibatinib)或其藥學上可接受之鹽會抑制具有突變之FGFR3的磷酸化，而對軟骨發育異常症具有優異之骨骼延長效果。
亦即，本發明包含下列[1]~[11]。
[1] 一種用於治療軟骨發育異常症之醫藥組成物，其含有1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽。
[2] 如[1]所記載之醫藥組成物，其中軟骨發育異常症為軟骨發育不全症、次軟骨發育不全症、或致死性骨發育不全症。
[3] 如[1]或[2]所記載之醫藥組成物，其中軟骨發育異常症為軟骨發育不全症。
[4] 如[1]至[3]中任一項所記載之醫藥組成物，其中軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之軟骨發育異常症。
[5] 如[4]所記載之醫藥組成物，其中FGFR3突變為FGFR3第248位之精胺酸、第380位之甘胺酸、FGFR3第540位之天門冬醯胺酸、或第650位之離胺酸的突變。
[6] 如[4]所記載之醫藥組成物，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之軟骨發育不全症。
[7] 如[6]所記載之醫藥組成物，其中軟骨發育不全症為具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且該FGFR3突變係FGFR3第380位之甘胺酸突變成精胺酸。
[8] 如[4]所記載之醫藥組成物，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之次軟骨發育不全症。
[9] 如[8]所記載之醫藥組成物，其中次軟骨發育不全症為具有FGFR3突變的次軟骨發育不全症，且該FGFR3突變係FGFR3第540位之天門冬醯胺酸突變成離胺酸。
[10] 如[4]所記載之醫藥組成物，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之致死性骨發育不全症。
[11] 如[10]所記載之醫藥組成物，其中致死性骨發育不全症為具有FGFR3突變之致死性骨發育不全症，且該FGFR3突變為FGFR3第248位之精胺酸突變成半胱胺酸，或第650位之離胺酸突變成麩胺酸。
本發明亦有關於以下態樣。 ・一種軟骨發育異常症之治療劑，其包含如1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽。 ・一種用於治療軟骨發育異常症之用途的1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受的鹽。 ・一種1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽的用途，其係用於治療軟骨發育異常症。・一種1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽用於製造醫藥品之用途，該醫藥品係用於治療軟骨發育異常症。 ・一種軟骨發育異常症之治療方法，包含將1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽的有效量投予至軟骨發育異常症之患者的步驟。 ・一種商業套裝，同時包含作為活性成分之1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽、及其用途之指示書，該用途係用於治療受試者之軟骨發育異常症。
發明效果 根據本發明，能夠對軟骨發育異常症施以發揮優異骨骼延長效果的治療。
用以實施發明之形態 本發明有關於包含1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽的軟骨發育異常症之治療劑、以1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽作為有效成分之用於治療軟骨發育異常症的醫藥組成物，及使用該醫藥組成物之治療方法。
1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮(於本說明書中有時表示為「化合物1」)係具有下述結構之二取代苯炔基化合物，雖無特別限定，但例如可基於國際公開案WO2013/108809號所記載之製造方法來合成。
[化學式1]
Figure 02_image001
本發明中，化合物1可直接使用或以藥學上可接受之鹽的形態來使用。化合物1之藥學上可接受之鹽雖然沒有特別限定，但可舉例如：與鹽酸、硫酸等無機酸、醋酸、檸檬酸、酒石酸、馬來酸等有機酸的加成鹽；與鉀、鈉等鹼金屬之鹽；與鈣、鎂等鹼土類金屬之鹽；銨鹽、乙基胺鹽、精胺酸鹽等與有機鹼之鹽等。
本發明中「FGFR3」包含人類或非人類哺乳動物之FGFR3，且宜為人類FGFR3。人類FGFR3的NCBI Gene ID為2261。又，FGFR3蛋白質若包含為其剪接變體之同功型且來自人類，則可舉例如由NCBI參考序列：NP_000133所示胺基酸序列(序列編號1)構成的多肽。
本發明中，「FGFR3突變」只要是具有成為軟骨發育異常症原因之胺基酸突變的FGFR3蛋白質、或編碼該胺基酸之FGFR3基因便無特別限定，惟適宜的是，當序列編號1所示胺基酸序列中選自於第248號之精胺酸、第380號之甘胺酸、第540號之天門冬醯胺酸及第650號之離胺酸所構成群組中至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的情形時，其相當於序列編號1中上述位置之至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；較佳的是，當序列編號1所示胺基酸序列中選自於第248號之精胺酸、第380號之甘胺酸及第650號之離胺酸所構成群組中至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的情形時，其相當於序列編號1中上述位置之至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；較佳的是，當序列編號1所示胺基酸序列中選自於第248號之精胺酸及第380號之甘胺酸所構成群組中至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的情形時，其相當於序列編號1中上述位置之至少1個胺基酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；較佳的是，當序列編號1所示胺基酸序列中第380號之甘胺酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的情形時，其相當於序列編號1中第380號位置之甘胺酸已突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因。本說明書中，針對某FGFR3蛋白質，若僅以序列編號1中第X號胺基酸表示時，只要未明確記載並非如此，則當序列編號1所示胺基酸序列中第X號胺基酸及野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的情形時，其表示相當於序列編號1中第X號位置之胺基酸。再者，野生型胺基酸序列為與序列編號1相異之FGFR3蛋白質的某胺基酸是否為相當於序列編號1所示胺基酸之何處位置的胺基酸，係可例如利用BLAST的Multiple Alignment來確認。
第380號之甘胺酸或相當於序列編號1中第380號位置之甘胺酸已突變的FGFR3，宜為精胺酸已突變者。在本說明書中，有時將第380號之甘胺酸或相當於序列編號1中第380號位置之甘胺酸已突變的FGFR3表示為G380R。後述的R248C、N540K及K650E也相同。第248號之精胺酸或相當於序列編號1中第248號位置之精胺酸已突變的FGFR3，宜為半胱胺酸已突變之R248C。第540號之天門冬醯胺酸或相當於序列編號1中第540號位置之天門冬醯胺酸已突變的FGFR3，宜為離胺酸已突變之N540K。第650號之離胺酸或相當於序列編號1中第650號位置之離胺酸已突變的FGFR3，宜為麩胺酸已突變之K650E。
FGFR3突變宜為具有選自於由R248C、G380R、N540K及K650E所構成群組中至少1個胺基酸突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；較佳為具有選自於由R248C、G380R及K650E所構成群組中至少1個胺基酸突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；較佳為具有選自於由R248C及G380R所構成群組中至少1個胺基酸突變的胺基酸序列所構成之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因；且較佳為具有G380R突變之FGFR3蛋白質或編碼該胺基酸序列之FGFR3基因。
又，如前述，可了解到在某FGFR3同功型之突變中，即使在因胺基酸之缺失、插入等而突變位置係與序列編號1所示胺基酸位置不同時，亦與相當於序列編號1所示胺基酸位置的位置之突變相同。因此，舉例而言，序列編號1所示FGFR3中第380號之甘胺酸，在NCBI Reference Sequence：NP_ 001156685所示胺基酸序列(序列編號2)所構成的FGFR3中，係相當於第382號之甘胺酸。因此，在本發明中，只要未明示並非如此，則例如「G380R」不僅包含序列編號1所示FGFR3之第380號之甘胺酸突變為精胺酸的情形，還包含NCBI Reference Sequence：NP＿001156685所示胺基酸序列所構成之FGFR3中第382號之甘胺酸突變為精胺酸的情形。再者，某FGFR3同功型之某胺基酸是否為相當於序列編號1所示胺基酸之何處位置的胺基酸，係可例如利用BLAST的Multiple Alignment來確認。
本發明中，「軟骨發育異常症」意指例如軟骨發育不全症、次軟骨發育不全症、致死性骨發育不全症等生長軟骨功能低落所造成之疾病，並宜為軟骨發育不全症、次軟骨發育不全症或致死性骨發育不全症，較佳為軟骨發育不全症。
又，在本發明中，作為「具有FGFR3突變之軟骨發育異常症」，可舉：在序列編號1中第380號之甘胺酸或相當於序列編號1中第380號位置之甘胺酸、第540號之天門冬醯胺酸或相當於序列編號1中第540號位置之天門冬醯胺酸、或是第248號之精胺酸或相當於序列編號1中第248號位置之精胺酸、或者是第650號之離胺酸或相當於序列編號1中第650號位置之離胺酸的突變所造成的生長軟骨機能降低所致之疾病等； 宜可舉：具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且其為序列編號1中第380號之甘胺酸或相當於序列編號1第380號位置之甘胺酸突變成精胺酸；具有FGFR3突變之次軟骨發育不全症，且其為序列編號1中第540號之天門冬醯胺酸或者相當於序列編號1中第540號位置之天門冬醯胺酸突變成離胺酸；抑或是FGFR3突變之致死性骨發育不全症，且其為序列編號1所示FGFR3中第248號之精胺酸或相當於序列編號1中第248號位置之精胺酸突變成半胱胺酸的FGFR3突變、或者序列編號1所示FGFR3中第650號之離胺酸或相當於序列編號1中第650號位置之離胺酸突變成麩胺酸的FGFR3突變； 較佳可舉：具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且其為序列編號1所示FGFR3中第380號之甘胺酸或相當於序列編號1第380號位置之甘胺酸突變成精胺酸；或是FGFR3突變之致死性骨發育不全症，且其為具有序列編號1所示FGFR3中第248號之精胺酸或相當於序列編號1中第248號位置之精胺酸突變成半胱胺酸的FGFR3突變、或者序列編號1所示FGFR3中第650號之離胺酸或相當於序列編號1中第650號位置之離胺酸突變成麩胺酸的FGFR3突變； 更佳可舉：具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且其為序列編號1所示FGFR3中第380號之甘胺酸或相當於序列編號1第380號位置之甘胺酸突變成精胺酸；或是具有FGFR3突變之致死性骨發育不全症，且其為序列編號1所示FGFR3中第248號之精胺酸或相當於序列編號1中第248號位置之精胺酸突變成半胱胺酸；及 再更佳可舉：具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且其為序列編號1所示FGFR3中第380號之甘胺酸或相當於序列編號1第380號位置之甘胺酸突變成精胺酸。本說明書中，有時亦會將具有FGFR3突變之軟骨發育異常症簡單表示為FGFR3突變軟骨發育異常症。
在本發明中，FGFR3突變可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知的方法來檢測。例如，FGFR3基因突變的檢測方法可舉南方印漬術法、PCR法、DNA微陣列法、序列分析法等通常慣用的方法。又，作為FGFR3蛋白質突變的檢測方法，可舉使用了會與FGFR3突變專一性結合之抗體的手法(ELISA法、西方印漬術法、免疫染色法等)、質譜分析等通常慣用的方法。與FGFR3突變專一性結合的抗體可使用市售品，或可利用通常慣用的方法來製作。
在本發明中，「試料」不僅包括生體試料(例如細胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、尿)，亦包括自該等生體試料獲得之核酸萃取物(基因組DNA萃取物、mRNA萃取物、自mRNA萃取物所調製之cDNA調製物、cRNA調製物等)及蛋白質萃取物。又，前述試料亦可為實施福馬林固定處理、醇固定處理、冷凍處理或石蠟包埋處理者。作為前述生體試料可使用自生體採集者。又，生體試料的採集方法可因應生體試料的種類而適宜選擇。
本發明中，可使用化合物1或其藥學上可接受之鹽本身作為軟骨發育異常症之治療劑，亦可使用組合有化合物1或其藥學上可接受之鹽與藥學載劑的醫藥組成物。因此，在一實施形態中，本發明提供一種含有化合物1或其藥學上可接受之鹽的醫藥組成物。
在使製劑中含有化合物1或其藥學上可接受之鹽以作為有效成分時，係任擇地與藥學載劑摻合，且可因應預防或治療目的來採用各種投予形態。投予形態可舉例如：口服劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、貼片劑等，較佳為口服劑。口服劑可做成錠劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、糖漿劑等形態，並沒有特別限定。該等投予形態分別可利用對習於此藝者而言公知慣用的製造方法來製造。製劑或醫藥組成物可根據投予形態且任擇地添加適當的賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩散劑等載劑。
上述各投予單位形態中應摻合之化合物1或其藥學上可接受之鹽的量，依擬適用其之患者的症狀或依其劑型等而非一定，但一般而言，宜每投予單位形態於口服劑中設為0.05~1000mg，於注射劑中設為0.01~500mg，於栓劑中設為1~1000mg。
又，化合物1或其藥學上可接受之鹽的每1日投予量，係依患者之症狀、體重、年齡、性別等而異，無法一概而論，但通常成人(體重60kg)以化合物1或其藥學上可接受之鹽而言為每1日約1~1000mg，且宜為每1日約10~500mg，較佳為每1日約10~300mg。
再者，當連日投予化合物1或其藥學上可接受之鹽的每1日投予量時，該投予量例如以化合物1或其藥學上可接受之鹽而言為每1日約1~200mg，宜為每1日2~100mg，較佳為每1日4~50mg，更佳為每1日10~40mg。
再者，當間歇投予化合物1或其藥學上可接受之鹽的每1日投予量時，該投予量例如以化合物1或其藥學上可接受之鹽而言為每1日約2~1000mg，宜為每1日10~500mg，較佳為每1日20~200mg，更佳為每1日50~160mg。
又，化合物1或其藥學上可接受之鹽的投予時程可舉連日投予或間歇投予。
本說明書中，所謂的「連日投予」可舉例如以21日連續投予之時程作為1循環的投予時程，亦可在每1循環結束時設定停藥期間。
本說明書中所謂的「間歇投予」只要是滿足1週內2次以上且空出1日以上投予間隔(一投予日與下次投予日之間隔日數)的條件即無特別限定。
可舉例如：以1週為1循環之投予時程，且該投予時程係每1循環隔1~3日(一投予日與下次投予日之間隔為1~3日)投予2次以上化合物1或其藥學上可接受之鹽，且該循環重複實施1次或2次以上； 以14日為1循環之投予時程，且該投予時程係投予日與下次投予日之間隔空出1~3日並於每1循環投予4~7次化合物1或其藥學上可接受之鹽，且該循環係重複實施1次或2次以上； 以14日為1循環之投予時程，且該投予時程係於1循環所含14日內，於第1日、第4日、第8日及第11日投予化合物1或其藥學上可接受的鹽； 以14日為1循環之投予時程，且該投予時程係於1循環所含14日內，於第1日、第3日、第5日、第7日、第9日、第11日及第13日投予化合物1或其藥學上可接受之鹽； 以14日為1循環之投予時程，且該投予時程係於1循環所含14日內，於第1日、第3日、第5日、第8日、第10日及第12日投予化合物1或其藥學上可接受的鹽等。在本發明中，所謂「將投予日與下次投予日之間隔空出X日」，意指已於第n日投予時，將下次投予日設為第n+(1+X)日。例如，將投予日與下次投予日之間隔空出1日即意指當已於第1日投予時，下次的投予日設為第3日。
本發明還提供一種軟骨發育異常症的治療方法，其包含對軟骨發育異常症患者投予有效量之化合物1或其藥學上可接受之鹽的步驟。化合物1或其藥學上可接受之鹽及其投予方法等係如前述。患者可舉人類、非人類之哺乳動物等。非人類哺乳動物可舉例如猴子、狗、貓、兔子、小鼠、大鼠、豚鼠等。又如前述，軟骨發育異常症可舉FGFR3突變軟骨發育異常症等。
因此，在一實施形態中，本發明還提供一種FGFR3突變軟骨發育異常症之治療方法，其包含以下(1)及(2)之步驟： (1)從來自患者的試料中，檢測FGFR3蛋白質或FGFR3基因突變的步驟； (2)對上述(1)之步驟中檢測出FGFR3蛋白質或FGFR3基因突變的患者，投予有效量之化合物1或其藥學上可接受之鹽的步驟。
在一實施形態中，本發明復亦提供以下方法： 一種FGFR3突變軟骨發育異常症的治療方法，其包含對具有FGFR3蛋白質或FGFR3基因突變的患者投予有效量之化合物1或其藥學上可接受之鹽的步驟， 且該方法係從來自該患者之試料中檢測FGFR3蛋白質或FGFR3基因突變。
在上述治療方法中，經檢測出FGFR3蛋白質或FGFR3基因突變的患者係被預測投予有效量之化合物1或其藥學上可接受之鹽的化學療法會展現充分的治療效果。在此，「治療效果」可藉由骨骼延長效果等進行評估。又，可藉由FGFR3功能抑制之活性(例如以FGFR3磷酸化為指標之抑制活性)的程度來推定治療效果。
[實施例] 以下雖舉實施例來進一步具體地說明本發明，但本發明當不因其等而受到任何限定。本發明雖藉由實施例充分說明，惟習於此藝者當可理解各種變更及修飾皆可行。因此，只要如此之變更及修飾並未逸脫本發明之範圍，則其等皆囊括於本發明中。
實施例1：試管內由化合物1對FGFR3突變體之抑制活性的評估
1-1 FGFR3突變體表現載體的建構 FGFR3係使用由ORIGENE公司購入之FGFR3(NM_000142)Human Tagged ORF Clone(FGFR3野生型(WT)表現載體)，各突變體(G380R、N540K及K650E)之表現用載體係以前述載體為模板而進行建構。
1-2 以FGFR3磷酸化為指標之FGFR3抑制活性測定 以包含10%胎牛血清之DMEM培養基培養人類胎兒腎細胞HEK293T並透過常規方法回收細胞後，懸浮於包含10%胎牛血清之DMEM培養基中，並使用運用了Lipofectamine 3000 Reagent(Thermo Fisher SCIENTIFIC)的脂質體轉染法將上述所示FGFR3野生型或突變體表現載體分別導入細胞，並在96孔盤以每1孔1.5×104 個/100µL來播種。
作為藥液，準備Vehicle(DMSO)組、各稀釋系列(以3000nM為最大終濃度，1000、300、100、30、10、3、1、0.3nM為止之9個濃度的稀釋系列)之化合物1。將已播種的細胞以37℃、5%CO2 進行24小時培育後，添加包含藥液之培養基11µL，並進一步培育1小時。
FGFR3對自磷酸化能力之功能抑制是使用Human Phospho-FGF R3 DuoSet IC ELISA(R&D SYSTEMS)來測定及評估。具體而言，對套組隨附之細胞溶解液添加蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor(Roche))及磷酸酶抑制劑(Phosphatase inhibitor(Roche))，使用其等將細胞溶解並依照套組的步驟準則實施實驗，對各孔以讀盤儀(SpectraMAX384，Molecular Devices)進行比值色彩定量。藥劑添加孔之相對FGFR3的磷酸化率係作為以控制組為100%時之比率依下式算出。此外，實驗以連2(每1處理組2孔)來進行，並將2孔之各資料的平均值使用於解析。
相對的FGFR3磷酸化率(%)=(藥劑添加孔之訊號量)/(控制組之訊號量)×100
IC50值(50%抑制濃度)係作為相對於控制組達到50%抑制時的濃度而算出。
就使FGFR3野生型(WT)、或突變體(G380R、N540K或K650E)表現的293T細胞株而言，化合物1展現如下述般的抑制活性(表1)。
[表1]
Figure 02_image003
實施例2：使用了軟骨發育不全症模式小鼠之化合物1的骨骼延長效果
使用FGFR3ACH小鼠(Naski，M.C. et al. Development 1998，125(24)：4977-88，以下簡單表示為ACH小鼠)。大量作出已對FVB系統ACH小鼠作人工受精的F1 hybrid小鼠，萃取基因組DNA，藉由PCR法來進行基因型分型。化合物1係溶解於0.5%HPMC作成各濃度溶液，按照投予日之各別體重以令化合物1投予用量為0.1mg/kg、1mg/kg或3mg/kg的方式以10mL/kg投予化合物1。以化合物1投予組與對照組(vehicle=投予0.5%HPMC)分組(WT及vehicle投予組：n=5；化合物1投予組：n=6)並自日齡21至42為止以1日1次腹腔內注射的方式進行一周5日投藥(5投2停)。於日齡43實施安樂死，進行體重測定以及利用X射線攝影之骨長測定(大腿骨、脛骨、尺骨)。X射線攝影是使用faxitron X-ray DX-50(AcroBio股份公司)來進行，以ImageJ進行計測。使用鄧奈特多重比較檢定(Dunnett’s multiple comparisons test)來進行顯著性差異檢定，圖1~圖5中的*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。
如圖1~圖5所示，在測定時(日齡43)，與vehicle投予組相較，化合物1之投予組觀察到濃度相依之骨骼延長效果。 接著，從投藥後之小鼠分離大腿骨，並將軟骨生長板進行番紅O染色，計測其長度。茲將結果示於圖4。可確認到ACH小鼠之生長板平均寬度為148.3，對ACH小鼠投藥化合物1之組為206.4，且與vehicle投予組相較確有延長。
實施例3：使用了軟骨發育不全症模式小鼠之化合物1的骨骼延長效果
由與實施例2相同之方法，變更化合物1之投予用量(雄性小鼠：1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg，雌性小鼠：1mg/kg、3mg/kg或6mg/kg)，使用雄性及雌性兩種小鼠(n=10)進行骨骼延長效果之評估。使用Dunnett’s multiple comparisons test來進行顯著性差異檢定，圖6~圖11中的*表示p＜0.05、**表示p＜0.01、***表示p＜0.001、****表示p＜0.0001。
如圖6~圖11所示，在測定時(日齡43)，與vehicle投予組相較，化合物1之投予組觀察到濃度相依之骨骼延長效果。
實施例4：在疾病iPS細胞模式下之藥效評估
從致死性骨發育不全症I型(TD1，R248C)與軟骨發育不全症(ACH，G380A)患者之皮膚纖維母細胞、及健全者之皮膚纖維母細胞建立iPS細胞株，並朝軟骨細胞分化誘導。從健全iPS細胞有形成軟骨組織，相對於此，從TD1-iPS細胞與ACH-iPS細胞誘導成之組織中軟骨成分減少(Yamashita et al.，Nature，2014，513(7519)：507-11)。
在此分化誘導系統中，分化誘導開始後第3日起於培養基交換時(培養基更換為2-7天1次)添加1nM化合物1，於分化誘導第10週進行分析。使用瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)作為陽性控制。評估項目是將組織切片染色(番紅(Safranin)染色)，並以COL2A1及Aggrecan(ACAN)之mRNA表現作為指標。使用Unpaired test(非配對檢驗)來進行顯著性差異檢定，圖13中之*表示p＜0.05。
如圖12所示，藉由化合物1的添加，可確認到番紅染色陽性之染色像，其係將作為軟骨細胞外基質之構成成分的醣胺聚醣染色。 又，如圖13所示，就添加有化合物1之細胞而言，其COL2A1及ACAN之mRNA之表現與未添加的細胞相比表現增加。
圖1顯示大腿骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle(載劑)投予組， ACH 0.1mg/kg：ACH小鼠0.1mg/kg投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組。 圖2顯示脛骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 0.1mg/kg：ACH小鼠0.1mg/kg投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組。 圖3顯示尺骨長的測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 0.1mg/kg：ACH小鼠0.1mg/kg投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組。 圖4顯示大腿骨之生長軟骨板厚的測定結果。縱軸表示生長軟骨板厚(µm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 0.1mg/kg：ACH小鼠0.1mg/kg投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組。 圖5顯示脛骨之生長軟骨板厚的測定結果。縱軸表示生長軟骨板厚(µm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 0.1mg/kg：ACH小鼠0.1mg/kg投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組。 圖6顯示大腿骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 10mg/kg：ACH小鼠10mg/kg投予組。 圖7顯示脛骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 10mg/kg：ACH小鼠10mg/kg投予組。 圖8顯示尺骨長的測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 10mg/kg：ACH小鼠10mg/kg投予組。 圖9顯示大腿骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 6mg/kg：ACH小鼠6mg/kg投予組。 圖10顯示脛骨長之測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 6mg/kg：ACH小鼠6mg/kg投予組。 圖11顯示尺骨長的測定結果。縱軸表示骨長(mm)。橫軸如下列。 WT：野生型小鼠， ACH  vehicle：ACH小鼠vehicle投予組， ACH 1mg/kg：ACH小鼠1mg/kg投予組， ACH 3mg/kg：ACH小鼠3mg/kg投予組， ACH 6mg/kg：ACH小鼠6mg/kg投予組。 圖12顯示使用來自致死性骨發育不全症I型(TD1)及軟骨發育不全症(ACH)患者的iPS細胞，並以葡萄糖胺聚醣作為指標的藥效評估結果(番紅染色圖)。 vehicle：vehicle(=0.1% DMSO)投予組， 化合物1 1nM：1nM化合物1投予組。 圖13顯示使用來自致死性骨發育不全症I型(TD1)及軟骨發育不全症(ACH)患者的iPS細胞，並以COL2A及ACAN mRNA之表現作為指標的藥效評估結果。使用StepOnePlus™即時PCR系統(Applied Biosystems)進行測定。縱軸顯示使用GAPDH基因作為內部標準的ΔCt值。橫軸如下列。 vehicle：vehicle(=0.1% DMSO)投予組， 化合物1：1nM化合物1投予組。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
(無)

Claims (11)

  1. 一種1-[(3S)-3-[4-胺基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-吡咯啶基]-2-丙烯-1-酮或其藥學上可接受之鹽用於製造醫藥品之用途，該醫藥品係用於治療軟骨發育異常症。
  2. 如請求項1之用途，其中軟骨發育異常症為軟骨發育不全症(achondroplasia)、次軟骨發育不全症(hypochondroplasia)、或致死性骨發育不全症(thanatophoric dysplasia)。
  3. 如請求項1或2之用途，其中軟骨發育異常症為軟骨發育不全症。
  4. 如請求項1或2之用途，其中軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之軟骨發育異常症。
  5. 如請求項4之用途，其中FGFR3突變為FGFR3第248位之精胺酸、第380位之甘胺酸、FGFR3第540位之天門冬醯胺酸、或第650位之離胺酸的突變。
  6. 如請求項4之用途，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之軟骨發育不全症。
  7. 如請求項6之用途，其中軟骨發育不全症為具有FGFR3突變之軟骨發育不全症，且該FGFR3突變係FGFR3第380位之甘胺酸突變成精胺酸。
  8. 如請求項4之用途，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之次軟骨發育不全症。
  9. 如請求項8之用途，其中次軟骨發育不全症為具有FGFR3突變的次軟骨發育不全症，且該FGFR3突變係FGFR3第540位之天門冬醯胺酸突變成離胺酸。
  10. 如請求項4之用途，其中具有FGFR3突變之軟骨發育異常症為具有FGFR3突變之致死性骨發育不全症。
  11. 如請求項10之用途，其中致死性骨發育不全症為具有FGFR3突變之致死性骨發育不全症，且該FGFR3突變為FGFR3第248位之精胺酸突變成半胱胺酸，或第650位之離胺酸突變成麩胺酸。
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