HU219306B

HU219306B - T-cell-suppressive peptide fragments of human myelin basic protein (hmbp) and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU219306B
Application number: HU9402909A
Authority: HU
Inventors: Ahmad Al-Sabbagh; David A Hafler; Ariel Miller; Howard L Weiner
Original assignee: Autoimmune Inc
Priority date: 1992-04-09
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 2001-03-28
Also published as: ATE212358T1; WO1993021222A1; DE69331501D1; HU9402909D0; DE69320967D1; DE69331501T2; EP0863155A1; DE69320967T2; EP0650498A1; AU680824B2; KR100295606B1; JP3434510B2; NO317049B1; DK0863155T3; ATE170874T1; EP0863155B1; IL105347A0; NO943755L; EP0650498A4; AU4282493A

Abstract

A találmány tárgyát a humán mielin bázikus fehérje (hMBP) T-sejt-szuppresszió kiváltására alkalmas im- mundomináns peptidfragmensei ésazokkal analóg peptidek, valamint ilyen peptideket tartalmazógyógyászati készítmények képezik, melyek alkalmasak szklerózismultiplexben és más autoimmun betegségekben szenvedő betegekkezelésére. A találmány szerinti peptidek és készítmények alkalmasakarra, hogy különböző T-sejt-- közvetített vagy T-sejt-függő autoimmunválaszokat elnyomjanak (szuppresszáljanak). A találmány tárgyáhoztartozó készítmények az adagolás módjától (orális vagy parenterális),az adagok nagyságától és gyakoriságától függően a humán MBP-vel (hMBP-vel) reagáló emberi T-sejteket vagy anergizálják (azaz szaporodásukatmegállítják), vagy ezen sejtek aktív szuppresszióját váltják ki. Atalálmány szerinti készítmények orális vagy parenterális adagolásraalkalmasan formulázhatók és adagolásuk útján emberekben az MBP-velkapcsolatos autoimmun betegségek kialakulása gátolható, vagy a márkialakult betegség enyhíthető vagy teljesen gyógyítható. ŕ

Description

A találmány tárgyát a humán mielin bázikus fehérje (hMBP) T-sejt-szuppresszió kiváltására alkalmas immundomináns peptidffagmensei és azokkal analóg peptidek, valamint ilyen peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények képezik, amelyek alkalmasak szklerózis multiplexben és más autoimmun betegségekben szenvedő betegek kezelésére. A találmány szerinti peptidek és készítmények alkalmasak arra, hogy különböző T-sejtközvetített vagy T-sejt-függő autoimmun válaszokat elnyomjanak (szuppresszáljanak).

A találmány tárgyához tartozó készítmények az emberi MBP valamely peptidfragmensét vagy annak analóg vegyületét alkalmazva az MBP-re specifikus emberi T-sejteket anergizálják, azaz szaporodásukat megállítják, vagy ezen T-sejtek aktív szuppresszióját váltják ki.

A találmány tárgyát képezik továbbá az MBP olyan peptidfragmensei, amelyek immundomináns epitópokat tartalmaznak, és reagensként felhasználva alkalmasak az MBP-vei reagáló CD4+-sejtek azonosítására.

A technika állásának alábbi ismertetése nem szorítkozik kizárólag a találmány előzményeinek tárgyalására, ezért az ebben a részben tárgyalt eredmények közül a feltalálók új kutatási eredményei semmiképpen sem tekinthetők a technika állásához tartozónak.

A szklerózis multiplex (multiple sclerosis, MS) az ember központi idegrendszerében a fehérállomány krónikus gyulladásos megbetegedése, melynek általánosan elterjedt szakmai nézetek szerint autoimmun okai vannak. A betegség kóroktanától függetlenül az MS az idegszövet autoimmun károsításával jár. így például a betegség jellemzője az idegszövet T-sejtes és makrofágos infiltrációja (az agyban, a gerincvelőben, a környéki idegekben és hasonló szövetekben), a demielinizáció (az idegrostok burkának, a mielinnek a sérülése) és idegműködési zavarok fellépése. Másokkal együtt széles körben tanulmányoztuk a mielin bázikus fehérjének (MBP) a betegségben autoantigénként játszott szerepét, mivel az MBP az MS fő állatkísérletes modelljében, a kísérletes allergiás agyvelőgyulladásban (experimental allergic encephalomyelitis, EAE) betegségindukáló hatású, és az emberi vírusfertőzés utáni agyvelőgyulladásban is van szerepe. Emellett az MBP-t mint „bystander antigént” is tanulmányoztuk (lásd a 843,752 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést).

Az MS kóroktanára vonatkozó egyik elterjedt hipotézis szerint a központi idegrendszer fehérállományában lévő, MBP-vel reagáló T-sejtek indítják be a gyulladásos folyamatot. Egy másik hipotézis szerint a proteolipidfehérjével (proteolipid protien, PLP) reagáló Tsejtek indítják be a gyulladásos folyamatot. Annak kimutatása, hogy MBP-specifikus aktivált T-sejteket lehet elkülöníteni MS-betegekből [Allegretta, M. és munkatársai: Science, 247, 778 (1990)] tovább erősíti az MBP-vel reagáló T-sejtek szerepét a betegség kialakulásában. Saját kísérleteink is arra utalnak, hogy az MBPvel reagáló T-sejteknek szerepük van a betegség kortanában a gyulladásos folyamat megindulását követően. (Amint a következőben részletesen ismertetni fogjuk, kimutattuk, hogy egészséges egyénekben gyakran találhatók MBP-vel reagáló T-sejtek, de ellentétben az MSbetegek MBP-specifikus T-sejtjeivel, az egészségesek

MBP-specifikus T-sejtjei nem aktiváltak.)

Az MS jelenleg használatos kezelési módszerei kivétel nélkül palliatívak, azaz a tünetek enyhítésére, nem a betegség okainak felszámolására irányulnak, és többek között olyan gyógyszereket alkalmaznak, amelyek az immunválaszt nem specifikus módon nyomják el. Ilyenek többek között például a ciklofoszfamid, Imuran (azatioprin) és a ciklosporin A. Szteroid vegyületeket, mint a prednizon és a metil-prednizolon (nem specifikus immunszuppresszánsok) szintén használnak számos esetben. Mindezek a jelenleg alkalmazott gyógyszerek csak korlátozottan hatásosak az MS ellen. Az ilyen gyógyszerek használata korlátozott toxikus mellékhatásuk és amiatt, hogy idővel „globális” immunszuppressziót váltanak ki, azaz az ilyen gyógyszerekkel végzett huzamos kezelés csökkenti a normális védekező immunválaszt a kórokozókkal szemben, és a fertőzések esélyét növeli. Emellett a hosszan tartó általános immunszuppressziónak kitett betegekben bizonyos rosszindulatú elváltozások kockázata is nagyobb.

A kísérletes allergiás agyvelőgyulladásban (experimental allergic encephalomyelitis, EAE), az MS fő állatkísérletes modelljében fellépő immunológiai folyamatok részletesebben ismertek. Az EAE könnyen kiváltható kisemlósökben MBP-vel történő immunizálással vagy MBP-vel reagáló CD4+ T-sejtek adoptív transzferével [Alvord és munkatársai (szerkesztők): „Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Usefúl Model fór Multiple Sclerosis”, A. R. Liss, New York (1984); Makhtarian, D. E. és munkatársai: Natúré, 305, 356 (1984); Ben-Nun, A: és munkatársai: J. Immunoi., 129, 303,1982], Az egérben és patkányban EAE-t indukáló úgynevezett encephalitogén T-sejtek az MBP immundomináns régióit ismerik fel specifikusan. Ezeket a régiókat antigénprezentáló sejtek (antigén presenting cells, APC) a felszínükön egyedi MHC (major histocompatibility complex, fő szövet-összeférhetetlenségi komplex) II. osztályú antigénekhez kötve mutatják be (prezentálják) a T-sejteknek. Fontos hangsúlyozni, hogy az MBP immundomináns régiói, azaz a fehérje azon szakaszai, melyeket a CD4+ T-sejtek a leggyakrabban ismernek fel, az adott emlősfajtól (melyben a betegséget kiváltjuk) és az MBP-t adó emlősfajtól is függenek annak ellenére, hogy az MBP aminosavsorrendje nagyfokú hasonlóságot mutat ezen fajok között. így például felismertük, hogy az emberi eredetű MBP immundomináns epitópja emberben az emberi MBP 84-102. aminosavai között van. Egy másik immundomináns epitópot az emberi MBP 143-168. aminosavai között lehet találni. Ezt bizonyítja az MS-ben szenvedő egyénekből izolált T-sejtek specifitása (az egyesült államokbeli 502,559 számú szabadalmi bejelentés és az 1. példa). Az egérből származó MBP immundomináns epitópja egérben az 1-9. aminosavak között található [Zamvil és munkatársai: Natúré, 324, 258 (1986)], míg a patkányból származó MBP-é patkánynak adva a 68-88. aminosavak között van [Bums és munkatársai: J. Exp. Med., 169, 27 (1989)]. Másfelől a tengerimalac MBP

HU 219 306 Β immundomináns régiója patkányban a 75-84. aminosavak között található [Hashim, G.: „Myelin: Chemistry and Biology”, A. R. Liss, New York (1980)].

Az EAE-rendszeren végzett vizsgálatok alapján általában az autoimmun betegségek és különösen az MS kezelésére alternatív gyógyító eljárásokat dolgoznak ki. A 632,991 lajstromszámú ausztrál szabadalom (megadva: 1993. május 14.) és a WO 88/10120 számú nemzetközi közzétételi irat (1988. december 29.) feltárják, hogy teljes MBP vagy annak betegségokozó vagy nem betegségokozó ffagmensei és ezek analóg vegyületei hatásosak az akut monofázisos EAE elnyomására, valamint használhatóak az MS tüneteinek mérséklésére, ha szájon át vagy a bélrendszerbe adjuk őket.

Ebből a szempontból érdekes még a 642,693 lajstromszámú, 1994. február 22-én megadott ausztrál szabadalom, amely autoantigének, ezek betegségelnyomó fragmenseinek és ez utóbbiak analóg vegyületeinek aeroszol formájában, T-sejt-közvetített autoimmun betegségek (mint az MS) hatékony kezelése céljából történő beadását ismerteti.

A WO 91/12816 számú, 1991. szeptember 5-én kibocsátott, „Enhancement of Down Regulation of Autoimmune Diseases by Órai Administration of Autoantoigens” (Autoimmun betegségek elnyomásának fokozása autoantigének szájon át történő beadásával) című nemzetközi közzétételi irat olyan szinergistákat (hatáserősítőket) tár fel, melyeket autoantigének, ezek betegségelnyomó fragmenseinek és ez utóbbiak analóg vegyületeinek szájon át történő beadásakor lehet használni T-sejtközvetített autoimmun betegségek (mint az MS) hatékony kezelése céljából.

A WO 93/16724 számú nemzetközi közzétételi irat olyan eljárásokat és készítményeket ismertet, amelyek alkalmasak autoimmun betegségek szájon át vagy belélegeztetés útján való kezelésére, bystander antigének használatával. A bystander antigének olyan szövetspecifikus antigének, amelyek az autoimmun válasz által megtámadott szövetben jelen vannak, és amelyek szájon vagy a bélrendszeren át (vagy belélegzés útján) történő beadás esetén szuppresszor T-sejteket aktiválnak, melyek gátolják az autoimmun választ a károsodott szövetekben. Valamely bystander antigén nem szükségképpen autoantigén is egyúttal, és nem feltétlenül célpontja az autoimmun válasznak. [Valójában vannak bizonyítékok arra, hogy valamely autoantigén immunszuppresszív epitója(i) nem azonos(ak) ugyanazon autoantigén immundomináns epitópjaival, bár az immundomináns epitópok (melyek szájon át adva kiváltják a szuppressziót) szerepelhetnek bystander antigénként is, ha elnyomják az autoimmun választ ugyanazon antigén valamely más része vagy más antigének ellen.] A bystander antigének mindenképpen a) specifikusak az érintett szövetre és b) képesek szuppresszor Tsejteket indukálni, ha szájon át adják őket.

A T-sejt-receptorok két külön fehéijeláncból állnak. Egyes T-sejt-receptorokról (T cell receptor, TCR) - melyek V-béta- (VB) láncokból és V-alfa- (VA) láncokból állnak - ismeretes, hogy felismerik az MBP-t. SJL/PLegerekben ilyen receptorral rendelkező encephalitogén (betegségindukáló) T-sejtek az egér-MBP N-terminális részét (az 1-9. aminosavakat) ismerik fel, ha azt egy, az egér H-2 gén által kódolt MHC-molekula mutatja be (prezentálja) [Zamvil, S. S. és munkatársai: Natúré, 324, 258 (1986)]. Az ezen peptidet az MHC-vel kapcsolatban felismerő T-sejtek többségének receptorát az egér TCRgének közül a VB8.2 és a VA2 vagy a VA4 kódolja. Lewis-patkányokban az egér VB8.2-vel és VA2-vel homológ gének termékeit megtalálták olyan encephalitogén T-sejtekben, amelyek az MBP 68-88. aminosavait ismerik fel a patkány-MHC-vel kapcsolatban [Burns, F. R. és munkatársai: J. Exp. Med., 169, 27 (1989)]. VB8.2-specifikus monoklonális ellenanyag (azaz olyan ellenanyag, amelyik a VB8.2 gén termékét ismeri fel) egereknek adásával kimutatták, hogy egér-EAE kezelésében hatásos. A TCR VB8.2-termék aminosavsorrendjének megfelelő peptidekkel Lewis-patkányokat immunizálva az EAE-t kiküszöbölhetjük [Vanderbark, A. A. és munkatársai: Natúré, 341, 541-544 (1989); Howell, M. D. és munkatársai: Science, 246, 688 (1989)]. Azonban valamely autoantigén (mint az MBP) azon régiói, melyek immundomináns viselkedést mutatnak, faj specifikusak. Azt még nem tudjuk, hogy az emberben az MBP immundomináns régióit felismerő T-sejtek közös V-gént használnak-e, sőt ezen immundomináns régiókat még nem is határozták meg MS-betegek esetében.

Azt találtuk, hogy encephalitogén immundomináns epitópokat tartalmazó teljes antigéneket szájon át többszöri kis mennyiségekben adagolva kiváltja ezt a fajta aktív szuppressziót. Másfelől a teljes autoantigénnek (vagy annak egy, illetve több immundomináns epitópot tartalmazó ffagmensének) intravénás alkalmazása szintén indukál szuppressziót, de csak az autoantigén epitópjait felismerő T-sejtekét. Ezen utóbbi típusú szuppresszió, melynek mechanizmusa feltételezések szerint a klonális anergia, encephalitogén és különösen immundomináns epitópokat tartalmazó antigének egyszeri nagy adagjának szájon át történő beadásakor is fellép, különösen, ha az antigént proteázgátlókkal együtt adjuk.

A találmány szerinti megoldáshoz közeli technika állásához tartoznak még az alábbi közlemények:

The Faseb Journal, vol. 4, no. 7, 26 April, 1990, p. A1857, Abstract No. 955 cikk, amely ugyanazon MNB pepiidre specifikus citolitikus T-sejtnek restrikciós elemeként szolgáló négy különböző HLA-DR-molekulát ismertet.

The Faseb Journal, vol. 4, no. 7, 26 April, 1990, p. A1857, Abstract No. 956 cikk, amely sclerosis multiplexben immundomináns MBP peptiddel reaktív Tsejtekhez hasított TCP Vbeta gén alkalmazását ismerteti.

Science, vol. 248, 125, May 1990, p. 1016-1019. cikk, amely az MBP immundomináns régiójához alkalmazott humán T-sejt receptor Vbeta alkalmazását ismerteti.

Natúré, vol. 346., 12, July 1990., p 183-187. cikk, amely sclerosis multiplexben immundomináns MBP peptid epitóp T-sejt általi felismerését ismerteti.

Immunology Today, vol. 12, no. 8, 1991, p. 277-282. cikk, amely MBP peptid T-sejt általi felismerését ismerteti.

HU 219 306 Β

Journal of Immunology, vol. 145, no. 2, 15 July,

1990, p. 540-548, amely sclerosis multiplexben szenvedő és egészséges emberekből származó citotoxikus MBP specifikus T-sejt-vonal specifitását és HLA-restrikcióját ismerteti.

The Journal of Experimental Medicine, vol. 173,

1991, p. 19-24. cikk, amely MBP citotoxikus T-sejtek általi felismerését ismerteti négy HLA-DR típus vonatkozásában sclerosis multiplex esetén.

Journal of Immunology, vol. 148, no. 5, 01. March,

1992, p. 1359-1366. cikk, amely humán CD4+ citotoxikus T-sejt receptorokra immundomináns MBP 87-106. fehéijék alkalmazását és specifitását ismerteti.

WO 91/15225 számú irat (amely a P9203100 ügyiratszámú magyar szabadalmi bejelentésnek felel meg) olyan immundomináns epitópot ír le, mely kiváltja a sclerosis multiplexben szenvedő betegek megfelelő Tsejt-populációjának kielégítő stimulációját.

A felsorolt közlemények egyike sem ismerteti azonban az igényelt találmány szerinti immundomináns pepiidet, gyógyászati készítményeket vagy az ezek előállítására szolgáló eljárásokat, még utalások szintjén sem, és olyan műszaki megoldásokat sem ismertetnek, melyek alapján a találmány szerinti megoldás kidolgozása szakember számára kézenfekvő lenne.

Az emberi MBP esetén, amely fehérje a szakma véleménye szerint az MS egyik autoantigénje, az általunk végzett kiterjedt vizsgálatok a fehéije azon fragmenseinek azonosításához vezettek, melyeket az MS-betegekből izolált MBP-specifikus CD4+ T-sejtek nagy része felismer. Ezen fragmensek, melyek az immundomináns epitópokat hordozzák, minden valószínűség szerint alkalmasak arra, hogy MS-ben szenvedő betegeknek adják őket az autoimmun válasz, különösképpen az idegszövetet autoimmun módon támadó MBP-reaktív T-sejtek működésének visszaszorítása céljából. Ennek érdekében a találmány tárgyát képezi nemcsak az ilyen peptidfragmensek szájon át való alkalmazása, hanem azok parenterális (a bélrendszert elkerülő) adagolása is.

A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás hatóanyagként mielin bázikus fehérje immundomináns epitópját magában foglaló peptidet tartalmazó, szklerózis multiplexben vagy annak állatokat megbetegítő megfelelőjében szenvedő emlősben a mielin bázikus fehérjével reagáló CD4+ T-sejtek immunfünkciójának szuppresszálására szolgáló, intravénásán adható gyógyászati készítmény előállítása, mely eljárás szerint a mielin bázikus fehéije immundomináns epitóprégiójával vagy annak egy részével lényegében megegyező szekvenciájú peptidet - a T-sejteket a kezelt emlősben anergizálni képes mennyiségben - gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítünk.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként a felsorolt aminosav-szekvenciák egyikével megegyező szekvenciájú peptidet tartalmaz orálisan hatásos mennyiségben, gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy hígítóanyaggal elegyítve: a humán mielin bázikus protein (hMBP) 84-102. aminosavainak sorrendje; a hMBP 85-102. aminosavainak sorrendje; a hMBP 86-102. aminosavainak sorrendje; a hMBP 87-102. aminosavainak sorrendje; a hMBP 84-100. aminosavainak sorrendje; a hMBP 84-99. aminosavainak sorrendje; a hMBP 85-99. aminosavainak sorrendje; a hMBP 84-98. aminosavainak sorrendje; a hMBP 86-99. aminosavainak sorrendje; a hMBP 84-102. aminosavainak sorrendje azzal a különbséggel, hogy a 102. aminosav tirozinra van cserélve; a hMBP 143-168. aminosavainak sorrendje; a hMBP 148-162. aminosavainak sorrendje; az ENPVVHFFKNIVTPR aminosavsorrend; és a DENPWHFFKNIVTPRTPY aminosavsorrend.

A találmány tárgyát képezik továbbá vegyületek és készítmények, melyek az MBP-reaktív T-sejteket anergizálják vagy ezen T-sejtek aktív szuppresszióját okozzák; ez utóbbi például az MBP-reaktív T-sejtek szaporodásának gátlásában nyilvánul meg.

A találmány már ismertetett és egyéb megvalósítási módjai szakember számára világossá fognak válni a leírás, a csatolt ábrák és az igénypontok alapján.

Az 1. ábra egy oszlopdiagram, amely az MS-betegekből (A), illetve egészséges kontrollokból (B) izolált, az emberi MBP különféle peptidfragmenseivel reagáló T-sejtek gyakoriságát mutatja.

A 2A. és 2B. ábra azt illusztrálja, hogy MBP-specifikus encephalitogén T-sejtek intraperitoneális adásával indukált EAE elnyomható MBP-vel orálisan tolerizált állatokból származó lépsejtek átvitelével.

A 3. ábra azt illusztrálja, hogy az adoptív transzferrel átvitt EAE-t az MBP-vel etetett állatokból egyidejűleg átvitt CD4+-mentesített vagy CD8+-mentesített Tsejtek gátolják.

A 4. ábra egy oszlopdiagram, amelyik az EAE kiváltása elleni védelemmel kapcsolatos DTH-válaszok erősségét ábrázolja MBP-vel etetett állatokból származó CD4+ T-sejtek és különféle T-szubpopulációk együttes átvitelekor.

Az 5. ábrán egy oszlopdiagramot láthatunk, amely a kvantitatív szövettani vizsgálat eredményét a központi idegrendszerből (az agykéregből és a parenchimából) izolált gyulladásos gócok átlagos számával fejezi ki MBP-vel etetett egerekből származó különféle T-sejtszubpopulációkkal injekciózott egerek esetében.

A 6A. ábra az indukált EAE gátlását mutatja intravénásán alkalmazott MBP hatására; a 6B. ábra bemutatja az i.v. adott MBP hatását az adoptív transzferrel átvitt EAE-re; továbbá azt, hogy az i.v. tolerizált állatokból származó lépsejtek nem viszik át a gátlást, ha egy encephalitogén T-sejt-vonallal együtt adjuk őket egészséges állatoknak.

A 7. ábra egy oszlopdiagram, amelyik különféle MBP-peptidek orálisan (A) és vénásan (B) alkalmazott különféle MBP-peptidek EAE-gátló hatását mutatja.

A 8. ábra az emberi MBP immundomináns régiója (84-102. aminosavak) alapján szintetizált különféle peptideknek emberi MBP-reaktív T-sejt-klónok szaporodását serkentő képességét mutatja. A: egy vagy több Nterminális aminosav elhagyásának hatása; B: egy vagy több C-terminális aminosav elhagyásának hatása.

A 9. ábra egy 15 tagú peptidnek [az emberi MBP(85-99)-nek] négy különböző emberi T-sejt-klón

HU 219 306 Β szaporodását serkentő képességét hasonlítja össze az MBP(84-102)-és MBP(96-97)-peptidekével.

A 10. ábra az emberi MBP(85-99)- és MBP(88-104)-peptidek TCR/MCH-kapcsolódási szakaszait mutatja, valamint az ezen kapcsolódáshoz szükséges közös jellemzőket (motij).

All. ábra az emberi MBP-nek a találmány tárgyát képező 85-99. peptidjének T-sejt-klónok szaporodását kiváltó hatását hasonlítja össze a természetes MBP-fehérje ugyanezen kiónok szaporodását kiváltó hatásával.

A 12. ábra egy autoradiogram, amely 5 MS-betegből származó, az MBP(84-102)-peptiddel reagáló 18 Tsejt-vonalból vett cDNS PCR-amplifikációját mutatja.

A 13. ábra egy MS-betegből származó, MBP-reaktív T-sejt-vonalak TCR VB- és JB-génhasználatának Southem-blot-autoradiogramját mutatja.

A 14. ábra oszlopdiagramok sorozata, amely MSbetegekből és kontrollegyénekből izolált T-sejteknek az emberi MBP különböző régiói iránt mutatott reaktivitását mutajta a betegek bizonyos MCH-antigénjeivel összefüggésben.

15. ábra. Szabad peptidantigénnel előzetesen stimulált T-sejtek nem válaszolnak az antigénstimulációra. Az Ob.lA12.8 jelű T-sejt-klónt stimuláltuk vagy közvetlenül az MBP(84-102)-peptiddel vagy egy DR2+ Bsejt-vonallal (9010) vagy egy DR2-vel transzfektált Lsejttel, melyeket előzőleg 2 óra hosszat 37 °C-on kezeltünk az MBP(84- 102)-peptiddel; a T-sejt-klón szaporodását mértük. Az ábra jelzi az egy edényben (mérőhelyben) található peptidmennyiséget. Amint az az A részből látható, mindhárom stimulus azonos mértékű T-sejtszaporodást okozott. Hét nappal később a T-sejteket megmostuk és szaporodásukat ismét mértük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptid vagy 100 pg/ml MBP(84-102)peptiddel előkezelt B- vagy L-sejt jelenlétében. Amint azt a B rész mutatja, az eredetileg az MBP(84-102)peptid magas koncentrációival stimulált T-sejtek nem válaszoltak a második antigénstimulációra.

16. ábra. A T-sejtek válaszképtelensége nem előzhető meg B-sejtek hozzáadásával. Az Ob.lA12.8 nevű Tsejt-klónt 7 napig tenyésztettük magában vagy elsődleges stimulációként az MBP(84- 102)-peptidet és azonos (9010) vagy különböző (9009) II. osztályú MHC-antigént hordozó, besugárzott, feltüntetett számú B-sejttel. Ezután a T-sejteket megmostuk és szaporodásukat mértük MBP(84-102)-peptid (5 pg/ml) vagy rekombináns IL-2 (1000 egység/ml) jelenlétében. A peptid nélkül tenyésztett T-sejtek (körökkel jelölve) teljes szaporodási választ mutattak a másodlagos antigénstimulációra, míg a peptid jelenlétében tenyésztettek (négyzetekkel jelölve) válaszképtelenek voltak az antigénre a B-sejtek hozzáadásától függetlenül. Az IL-2 hatására bekövetkezett szaporodás mindegyik esetben azonos volt.

17. ábra. A T-sejt-anergia kinetikája. Az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klón sejtjeit 0-168 óráig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel, majd mostuk és az MBP(84-102)-re és IL-2-re adott szaporodási válaszukat mértük. Három párhuzamos tenyészet beütésszámainak (cpm) hibáját (S.E.) tüntettük fel. Az adatok azonos felépítésű, de különböző kísérletből származnak.

18. ábra. Az anergizált T-sejteken továbbra is van CD3. Az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klónt 4 napig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel, majd mostuk és sejtfelszíni antigénjeiket elemeztük, valamint szaporodási válaszukat mértük. A sejteket OKT3-FITC (Coulter) vagy kontrollként Mslg-FITC monoklonális ellenanyaggal jelöltük 30 percig 4 °C-on, kétszer mostuk, 1% formáimnál fixáltuk és áramlásos citometriával elemeztük. Az ugyanazon tenyészetből származó T-sejteknek az MBP(84-102)-peptiddel előkezelt, illetve nem előkezelt B-sejtek (9010), valamint rIL-2 hatására bekövetkező szaporodását mértük.

19. ábra. Anergizált T-sejtek aktiválása különféle stimulusokra. Az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klónt 7 napig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel vagy anélkül, majd mostuk és szaporodási válaszukat mértük antiCD3+PMA, Tll₂+Tlli, PMA+ionomicin és rIL-2 logaritmikus hígítási sorainak hatására. Az x tengelyeken feltüntettük az egyes reagensek végkoncentrációját vagy aszciteszhígítását. A PMA koncentrációit az anti-CD3 vagy az ionomicin koncentrációi alatt jelezzük.

20. ábra. Az anergizált T-sejtek antigén hatására bekövetkező Ca²⁺-felszabadítása gátolt. Az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klónt 7 napig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel vagy anélkül, majd mostuk, és a sejteket 2 pg/ml ionomicinnel megtöltöttük. Másodlagos stimulusként ionomicint (100 pg/ml), anti-CD3-at (1:30-ban hígított aszciteszfolyadék) vagy 100 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel előkezelt B-sejteket (9010) adtunk az áramlási citométerbe a nyilakkal jelzett időpontokban. Az antigénprezentáló sejtekkel való stimuláláshoz a sejteket kivettük az áramlási citométerből és 1 percig centrifugáltuk (sötét vonalakkal jelölve).

21. ábra. Anergizált T-sejtek citokintermelése. A. Az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klónt 2 napig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel vagy anélkül, majd mostuk, és 10 ng/ml PMA-val+1 pg/ml ionomicinnel vagy 5 pg/ml MBP(84-102)-peptiddel és 0 vagy 10 ng/ml PMA-val 4 óráig stimuláltuk 37 °C-on. A teljes RNS-t az RNAzol B-módszerrel nyertük ki. Az ábrán a nagy szögletes zárójelek azonos minták két különböző Northem-blotját jelölik, melyeket citokin- vagy βaktin-próbákkal hibridizáltunk. Az mRNS-csíkok közelítő nagyságát is megadtuk. B. Az Ob.lA12.8 nevű Tsejt-klónt 2 napig tenyésztettük 5 pg/ml MBP(84-102)peptiddel vagy anélkül, majd mostuk és MBP(84-102)peptiddel vagy rIL-2-vel mint pozitív kontrollal stimuláltuk. 20 óra elteltével a felülúszókat begyűjtöttük és ΗΤ-2-sejtek tenyészetén 1:3 arányban hígítottuk. A ΗΤ-2-sejtek szaporodása a T-sejtek felülúszójában jelen lévő IL-2 mennyiségével arányos; maximális választ az rIL-2-tartalmú pozitív kontroll adott.

A találmány tárgyát képezik immunszuppresszív hatóanyagok, melyek peptideket tartalmaznak, mely peptidek az emberi MBP ffagmensei. A találmány megvalósításai peptidek és ilyen peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások, melyek a fenti peptidek használatával az MBP és MBP-t tartalmazó szövetek ellen irányuló immunválaszt gátol5

HU 219 306 Β ják és/vagy elnyomják a T-sejteket, amelyek az emberi MBP valamely immundomináns epitópját ismerik fel. Ezen eljárások egy vagy több peptidnek orális és/vagy parenterális alkalmazását ölelik fel a találmány szerint és a fehérje, valamint az azt tartalmazó szövetek elleni immunválasz gátlását eredményezik.

A találmány tárgyát képezik továbbá az emberi MBP ffagmensei, melyek tartalmazzák a következő aminosavakat a következő sorrendben: ENPWHFFNKJVTPR.

Más vonatkozásban a találmány tárgyát képezik gyógyszerkészítmények, melyek az MBP egy vagy több, előzőkben jellemzett peptidjét tartalmazzák.

Megint más vonatkozásban a találmány tárgyát képezik eljárások, melyek az emberi MBP fragmenseinek felhasználásával az emberi T-sejtek működését gátolják, és a CD4+, MBP-reaktív emberi T-sejtek azonosítására alkalmasak.

Valamennyi itt idézett szabadalmi bejelentés, szabadalom és szakirodalmi közlemény teljes egészében a kitanítás részét képezi. Ellentmondások esetén a jelen leírás szövege és definíciói érvényesek.

A jelen találmány leírásának vonatkozásában szuppresszió (a szaporodás gátlása) alatt a T-sejtek szaporodásának bármely mérhető csökkenését értjük, amely olyan tényezők hatására következik be, mely tényezők általában serkentik ezen sejtek szaporodását. Mindazonáltal hangsúlyozni kell, hogy a jelen találmány leírása csak a károsító T-sejtek szaporodásának szuppressziójával foglalkozik, azaz olyan T-sejtek szaporodásának szuppressziójával, melyek autoimmun reakcióban vesznek részt (valamely saját antigénre, például az MBP-re specifikus CD4+ T-sejtek). A találmány fontos vonatkozása, hogy a szuppressziót korlátozott formában indukáljuk, mikor is a saját antigénre specifikus károsító Tsejtek szuppressziója az MBP fragmensének vagy fragmenseinek kiválasztásától és/vagy beadásuk módjától függ, amint azt alább tárgyaljuk.

A károsító T-sejtek szaporodásának szuppresszióját közvetetten is mérhetjük, mint például a betegség - az immunválaszban részt vevő T-sejtek szaporodásától közvetlenül vagy közvetve függő - tüneteinek enyhülésén keresztül; ilyenek például az MS-ben megfigyelt, az idegszövetet ért károsodás csökkenése, vagy az MSbetegekben tapasztalt rohamok számának és súlyosságának csökkenése. Az idegszövet károsodását megítélhetjük például mágneses rezonanciás képalkotással (MRI) és az ezzel látható léziók számának és súlyosságának mérésével. Az MS-betegekben tapasztalt rohamok számának és súlyosságának csökkenése megítélhető például a betegek klinikai kivizsgálásával. Az MRI és a klinikai kivizsgálás módszerei a szakmában jól ismertek.

Az autoantigén fogalmát itt úgy határozzuk meg, mint bármely anyag vagy annak része, mely normálisan előfordul valamely emlősben, és amelyet abnormális esetben az immunrendszer ellenanyagai és nyiroksejtjei idegenként, azaz nem a szervezethez tartozóként ismernek fel, és ezáltal az immunrendszer támadásának elsődleges célpontjává válik, mintha idegen anyag lenne. Másképpen az autoantigén olyan antigén, amely autoimmun válasz célpontjává vált. Pusztán az adott saját anyaggal reagáló ellenanyagok vagy T-sejtek (CD4+) jelenléte nem teszi azt autoantigénné. Az MS-ben például az

MBP- és a PLP-autoantigének.

Valamely autoantigén (mint az MBP) immundomináns epitópja olyan antigéndetermináns, amelyet valamely fogékony emlős jelentős számú T-sejtje (a Tsejtek nem feltétlenül abszolút többsége és nem feltétlenül többsége) felismer, és amely ellen immunválasz folyik a betegség által érintett emlősben. (Ebből világos, hogy a betegség iránt fogékony emlős nem feltétlenül a betegségtől érintett is egyben.)

Valamely autoantigén immundomináns régiói vagy immundomináns doménjei az adott autoantigén aminosavsorrendjének azon régiói, melyek valamely immundomináns epitópot tartalmaznak. Az MBP vagy más autoantigén immundomináns epitópjainak és régióinak szerkezete (és/vagy lokalizációja az MBP-n vagy más autoantigénmolekulán belül) függ a gazdaszervezettől, azaz gazdaspecifikus. Bizonyítékokkal szolgáltunk arra vonatkozóan, hogy az immundomináns epitópok gazdaspecifitásának oka, hogy egy bizonyos általános szerkezettel (motif) kell rendelkezniük (egy körülbelül 8-15 aminosav hosszú peptidfragmensen belül), amely a gazdaszervezet MHC-molekuláihoz kötődik. Ez a szerkezet (motif) a különböző fajoknál különböző (mint ahogyan az MHC is különböző), és ugyanazon faj tagjai között is mutathat polimorfizmust.

Az MBP fragmenseinek analóg vegyületei olyan vegyületek, amelyek szerkezete oly módon rokon az MBPfragmensével, hogy biológiai hatásuk azonos. A jelen definícióban említett biológiai hatás valamely MBP-fragmensnek a T-sejt-közvetített vagy T-sejt-függő, autoimmun választ gátló képességére vonatkozik, illetve az MBP valamely immundomináns epitópját felismerő Tsejtek általi felismerésre. Az MBP(84-102)-peptid analóg vegyülete például az MBP(84- 102tyr), amelyben a 102. aminosavat tirozinra cseréltük. Amint az a 8. ábrán látható, ez a csere semmilyen hatással nincs az MBPfragmens azon képességére, hogy az MBP-reaktív Tsejt-vonal szaporodását serkentse. Továbbá az aminosavcseréknek valószínűleg nincs hatásuk a fragmensek oldhatóságára vagy farmakokinetikájukra, a jelen fragmensek viszonylag kis mérete miatt. Megjegyzendő, hogy az analógnak nem feltétlenül kell az adott hatást ugyanazon mértékig mutatni, az analóg nem feltétlenül ugyanolyan erős szuppresszor, mint a természetes antigén eredeti fragmense.

Az emberi MBP releváns epitópjainak más analógjait azon képességeik alapján lehet összeállítani, ahogyan az MHC-hez kötődnek és a megfelelő T-sejt-receptor felismeri őket (ezeket a tulajdonságokat in vitro lehet tesztelni).

A jelen találmány vonatkozásában T-sejtek vagy Tlimfociták (T-nyiroksejtek) a hematopoetikus (vérképző) szövetekben található őssejtekből származó immunsejtek. A T-sejtek három nagy csoportját különböztetjük meg: helperek (segítők), szuppresszorok (gátlók) és citotoxikusak (sejtölők). A T-sejtek nagy többségének felszínén a CD4- vagy a CD8-antigén található (CD4+-, illetve CD8+-sejtek). A környéki (keringő)

HU 219 306 Β

T-sejteken a CD4, illetve CD8 jelenléte a sejtek működésével mutat összefüggést. A helperek többnyire CD4+-ak, az antigéneket a II. osztályú MHC-molekulákhoz kötve ismerik fel és segítő, szabályozó feladatokat látnak el. A citotoxikus és szuppresszor T-sejtek (melyek CD8+-ak) az antigént az I. osztályú MHCantigénekhez kötve ismerik fel és citotoxikus, illetve szuppresszív feladatokat végeznek.

Aktív szuppresszió alatt az immunológiai működések olyan szuppresszióját értjük, amely szuppresszió további immunsejtek, közelebbről szabályozó (szuppresszor) T-sejtek indukciójának a következménye.

Klonális anergia az immunológiai működések olyan szuppressziója, amely szuppresszió immunsejtek, közelebbről végrehajtó T-sejtek indukciójának következménye, mely T-sejtek a válaszképtelenség állapotában vannak, közelebbről válaszképtelenek azon prezentált antigénre, melyre normál esetben specifikusak, és amelyre válaszképpen normál esetben szaporodásnak indulnak [La Salle, J. és munkatársai: J. Exp. Med., 176, 177 (1992)]. Az anergizált T-sejtek minden tekintetben normálisnak tűnnek, attól eltekintve, hogy mintegy „ki vannak kapcsolva”. Nem aktiváltak és hozzáadott interleukin-2 (IL—2) nélkül nem szaporodnak az egyébként általuk felismert, prezentált antigénre.

A jelen találmányi leírásban kezelés alatt értjük mind az MS tüneteit mutató autoimmun megbetegedés (vagy annak klinikai és szubklinikai, azaz szövettani tüneteinek megjelenése) megelőzésére irányuló megelőző kezelést, mind a tünetek enyhítését vagy megszüntetését célzó, gyógyító jellegű kezelést az MS jelentkezése után.

Receptor eredetű peptidek (receptor derived peptides) azok a peptidek vagy analógjaik, melyek aminosavsorrendje megegyezik vagy bennfoglaltatik a T-sejtreceptor VB 17 és/vagy a VB 12 jelű fajtáival, továbbá más hatóanyagok (például csökkentett válaszképességű, VB17- vagy VB12-hordozó T-sejtek), amelyek valamely, az MS tüneteit mutató betegségben szenvedő emlősnek beadva elnyomják a betegség egy vagy több tünetét. (A jelen leírás szerint az aktív peptidek legalább körülbelül 20 aminosavból állnak. A hossz nincs maximálva, ameddig az aktivitás fennáll. így például teljes TCR-molekulák vagy éppen egész T-sejtek is használhatók.)

MHC vagy fő szövet-összeférhetőségi komplex (Major Histocompatibility Complex) az emlősök sejtjeinek, különösen aktivált T-sejtjeinek, makrofágjainak és más immunsejtjeinek felszínén jelen lévő fehérjék egy csoportja. Az MHC központi szerepet játszik az immunitás számos jelenségében, mind a hisztokompatibilitási (vagy átültetési, transzplantációs) antigének esetében, mind a hagyományos idegen antigének esetében. Az MHC-molekuláknak két fő fajtájuk ismeretes, az I. és II. osztályú antigének.

A11. osztályú MHC-antigének a sejthártyához kötött glikoproteinek, melyek az MHC részét képezik. II. osztályú MHC-antigéneket főleg az immunrendszer sejtjein, a B-sejteken, makrofágokon, az agyi asztrocitákon, a bőr Langerhans-sejtjein, a dendrikus sejteken, a timuszepitéliumon és a helper T-sejteken találni. AII. osztályú

MHC-antigének szabályozzák az immunválaszt többek közt az átültetett szövet kilökődésekor, ellenanyagképzéskor, graft-versus-host-reakciók (a beültetett csontvelő reakciója a befogadó szervezet ellen) alkalmával és a saját (autológ) antigének felismerésekor. A bejelentésben az MHC kifejezést és a 11. osztályú MHC-antigének kifejezést azonos értelemben használjuk. Az MHC fehérjéket kódoló géneket MHC-géneknek fogjuk nevezni. A T-sejtek immunválaszt indukálnak, ha antigénprezentáló sejtekkel (APC, antigén presenting cells) (például mononukleáris fagociták, monociták, Langerhans-sejtek vagy follikuláris dendrikus sejtek) találkoznak, melyek felveszik, megemésztik (processzálják) és felszínükön (az MHC-molekuláikhoz kötve) prezentálják valamely fehéije fragmenseit. A CD4+ T-sejtek kizárólag akkor ismerik fel az antigénmolekulákat, ha azok már processzálódtak, és fragmenseik valamely II. osztályú MHC-antigénnel bíró APC felszínén prezentálódnak.

T-sejt-receptor vagy TCR a T-sejtek felszínén található antigénfelismerő receptor. A TCR tehát az a receptor, amelyik megköti az immunrendszer által felismert és prezentált antigént (függetlenül attól, hogy a molekula idegen vagy autológ, mint az autoimmun betegségek esetében). A T-sejtek többsége egy diszulfidhidakkal összetartott kétláncú TCR-t hordoz, mely egy alfa- (A) és egy béta- (B) láncból áll; a T-sejtek kisebb részének receptora két másik láncból, a gammából és a deltából áll. Az A- és B-láncok egyaránt variábilis és konstans részből tevődnek össze [Tilinghast, J. P. és munkatársai: Science, 233, 879 (1986); Concannon, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6589 (1986); Kimura, N. és munkatársai: J. Exp. Med., 164, 739 (1986); Toyonaga, B. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8624 (1985)]. A variábilis régió „variábilis” (V), „diverzitás” (D) és ,joining” (összekötő , J) szegmensekből áll. Feltehetőleg a V, D és J szegmensek közötti kapcsolódási szakasz köti az antigént [Ηο, Η. Z. és munkatársai: Immunogenetics, 15, 509 (1982); Olerup, O. és munkatársai: Tissue Antigens, 30, 135 (1987); Opelz, G. és munkatársai: Tissue Antigens, 9, 54 (1977); Danska, J. S. és munkatársai: J. Exp. Med., 172, 27 (1990); Kempkis, B. és munkatársai: J. Immunoi., 147, 2467 (1991); Sellins, K. S. és munkatársai: J. Immunoi., 149, 2323 (1992)].

A T-sejtek antigénfelismerése három molekula: a T-sejt-receptor (TCR), az antigénprezentáló sejt (APC) MHC-molekulája és az APC által processzált peptid vagy peptidek kölcsönhatása eredményeképpen jön létre. A peptid a II. osztályú MHC-molekula zsebébe vagy mélyedésébe (cleft) kötődik be [Bjorkman, P. J. és munkatársai: Natúré, 329, 506 és 329, 512 (1987)]. A fehérjének az APC-k felszínén leggyakrabban megjelenő és a T-sejtek által leggyakrabban felismert ffagmense az immundomináns epitóp.

Az MS állatkísérletes modelljében, az EAE-ben az állati VB8.2-szekvencia egy részét tartalmazó T-sejtreceptorokat használtunk a betegség kezelésére, és kimutattuk, hogy azok a betegségindukáló T-sejtek kiküszöbölése útján hatnak. Közelebbről az állatkísérletes modellben a Thr-Leu-Cys-Ala-Ser-Ser vagy a Thr7

HU 219 306 Β

Leu-Cys-Ala-Ser-Arg aminosavakat tartalmazó peptidek [ezek a szekvenciák az egér Vb8.2 felszíni (elérhető) részének felelnek meg] egér- és patkánykísérletekben alkalmasnak bizonyultak a betegség elleni küzdelemre, a helper T-sejtek eltávolítása útján.

Az emberi MBP-n két olyan régiót azonosítottunk, amelyek az emberi MBP-nek emberben immundomináns epitópjait tartalmazzák. Ez a két régió az emberi MBP két, egymástól az aminosavsorrendben távol eső részén található (a 82-102. és a 143-168. aminosavak között). Amint azt az 1. példa bemutatja, az emberi MBP 84-102. aminosavait azonosítottuk mint immundomináns epitópot, amelyet az MS-ben szenvedő betegekből izolált környéki (perifériás) T-sejtek többsége felismer. További kísérletek megmutatták, hogy ezen doménen belül az immundomináns epitóp a 85-99. aminosavak között helyezkedik el. Ezeket az adatokat a 3. példa ismerteti. (A 3. példában ismertetett adatokból következik, hogy legalábbis egyes emberi T-sejt-klónok számára az immundomináns epitóp a 87-98. aminosavak között lehet. A 84-102-vel reagáló T-sejt-klónok mindegyike felismeri a 85-99. fragmenst). Az MBP(143-168)-fragmenssel végzett hasonló kísérletek ez utóbbi immundomináns epitópnak a pontos helyét is feltárhatják.

Az MS állatkísérletes modelljével, az EAE-vel kapcsolatos kísérletek azt mutatták, hogy a tengerimalacMBP és a marha-MBP immundomináns epitópjait tartalmazó fehérjefragmensek, ha a betegségben szenvedő patkányoknak szájon át adjuk őket, hatékonyak a betegség tüneteinek visszaszorításában (a 07/596,936 számú kapcsolódó szabadalmi bejelentés és a 2. példa szerint), bár egyes nem betegségindukáló ífagmensek hatásosabbak, mint a betegségindukáló fragmensek. Továbbá azt is kimutattuk, hogy ezen orálisan kiváltott szuppresszió CD8+ szuppresszorsejtek indukciójának tulajdonítható [Lider és munkatársai: J. Immunoi., 142, 748 (1989)]. Más szerzők szintén végeztek állatkísérleteket az MBP encephalitogén ffagmenseivel [lásd például Swierkosz, J. E. és munkatársai: J. Immunoi., 119, 1501 (1977); Su, X-M. és munkatársai: J. Neuroimmunol., 34, 181 (1991) (egérben encephalitogénnek talált MBP-fragmensek lépsejtekhez kötve az egérben adoptív transzferrel átvitt EAE megszüntetésére); Avrilionis, K. és munkatársai: J. Neuroimmunol., 35, 201 (1991) (emberi MBP tengerimalacban encephalitogén fragmensét liposzómához kötve, intraperitoneálisan és bőr alá adva használták az ugyanezen ffagmens által indukált EAE megszüntetésére)].

A találmány tárgyát képező peptideket, melyek a károsító T-sejtek szaporodásának szuppressziójára alkalmasak, előnyösen lehet használni ezen peptideket tartalmazó immunszuppresszív készítmények összeállítására. Például olyan peptideket lehet konstruálni erre a célra, melyek az emberi MBP olyan ffagmenseit tartalmazzák, amelyek emberi MBP-specifikus CD4+ T-sejtek anergiáját váltják ki, vagy a demielinizációra specifikus szuppresszorsejteket indukálnak. Lásd például az 1. és 2. példát. A 2. példában ismertetett eredmények arra utalnak, hogy a tolerizáló hatóanyag beadásának módja befolyásolja a mechanizmust, amelyik az autoimmun reakció szuppressziójához vezet. így az emberi MBP valamely immundomináns epitópját tartalmazó peptidfragmensek in vitro hatásosak az MBP-reaktív CD4+ T-sejtek szaporodásának gátlására, és várhatóan ugyanezen mechanizmus révén hatásosak lesznek, ha embereknek intravénásán adják őket. Ugyanezen epitóp peptidek várhatóan elnyomják az emberi idegszövet elleni autoimmun reakciót, ha embereknek szájon át adják őket. Adatokkal rendelkezünk arra vonatkozóan, hogy a teljes MBP (melyben a fent ismertetett mindkét immundomináns epitóp megtalálható) szuppresszor T-sejtek indukálása útján képes szuppressziót előidézni, ha az MBP-t szájon át, többszöri kis adagokban adjuk. Ugyanezen antigén szintén szájon át, de egyszeri nagy adagban adva anergia kiváltásával okoz szuppressziót. Végül bizonyítékok vannak arra, hogy egyidejűleg mindkét mechanizmust ki lehet váltani az MBP szájon át való alkalmazásával, az adagolási sémának az előbbi két határeset közötti beállításaival.

Anélkül, hogy elméleti megfontolásokkal korlátozni akarnánk magunkat, azt gondoljuk, hogy az MBP immundomináns fragmenseinek orális vagy enterális alkalmazása szuppresszor T-sejtek megjelenését okozhatja, melyek elnyomják az idegszövet (az agy, a gerincvelő, a környéki idegek és hasonló sejttípusok) elleni autoimmun válaszban részt vevő T-sejteket. Az MS-ben szenvedő betegeknél tapasztalt patológiás idegszövetkárosodást ezen autoimmun válasz egyenes következményeként szokták felfogni. Minthogy ezen tolerizáló mechanizmus a megtámadott szövet közelében lévő sejtek immunreaktivitását elnyomó szabályozó (szuppresszor) T-sejtek indukcióján alapul, az aktív szuppresszió példájának tekinthető.

Nagy mennyiségű kísérleti bizonyítékot gyűjtöttünk össze arra, hogy az aktív szuppresszió a tolerizáló antigénre specifikus szuppresszor T-sejtek indukciója útján működik, mely T-sejtek a test azon részeire vándorolnak, ahol a megfelelő antigénjük található. A test ezen részein találhatók az autoimmun reakciónak kitett szövetek is. Mihelyt a szuppresszor T-sejtek találkoznak az antigénjükkel, nem specifikus szuppresszív citokineket bocsátanak ki, mint a β-TGF és az IL-4 (interleukin-4), melyek elnyomják az autoimmun választ (lásd a 843,752 számú szabadalmi bejelentést).

Ezzel szemben az MBP immundomináns epitópjait tartalmazó fragmensek intravénás (vagy szubkután vagy intraperitoneális) alkalmazása valószínűleg más mechanizmus, a klonális anergia útján okoz szuppressziót. A klonális anergia vagy T-sejt-válaszképtelenség okaként a megfelelő, úgynevezett kostimuláló faktorok hiányában történő antigénprezentációt szokták megjelölni [Jenkins, Μ. K.: PNAS, 84, 5409 (1987)]. A kérdéses faktorok pontos identitása nem ismeretes, de szolubilis citokinek (például B-7, EDCI és a megfelelő sejten belüli kalciumkoncentráció) szerepét tételezik fel. Újabb adatok alapján azonban úgy tűnik, hogy úgynevezett „negatív szignálok” felelősek az anergiáért, nem pedig kostimuláló faktorok hiánya. Ezen szignálokat sem azonosították még azonban [LaSalle, J. M. és munkatársai: J. Exp. Med., 176, 177 (1992)]. Ahelyett, hogy szaporodás8

HU 219 306 Β ra ösztönözné a T-sejt-klónokat, a kostimuláló faktorok hiányában vagy negatív szignálfaktorok jelenlétében történő antigénprezentáció a T-sejteket további antigéningerre válaszképtelenné teszi, míg IL-2-re a T-sejtek válaszképesek maradnak; ezt nevezik anergiának [Jenkins és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 5409 (1987); Mueller és munkatársai: Ann. Rév. Immunok, 7, 455 (1989); Schwartz és munkatársai: Science, 248, 1349 (1990)]. így valamely autoimmun válaszban részt vevő, valamely autoantigénre (mint az MBP) specifikus kiónok nem fognak tovább szaporodni ezen antigénre, ezért az autoimmun betegség tüneteiért, például az MS esetében az idegszövet károsodásáért felelős autoimmun szövetkárosítás csökken.

A klonális anergia útján ható szuppressziót meg lehet különböztetni (és az alábbi kísérletekben ténylegesen meg is különböztettük) az aktív szuppressziótól adoptív transzferkísérletekben, amelyek valamely tolerizált állatból egy nem tolerizált állatba átvitt szuppresszor T-sejtek azon képességét vagy ennek hiányát méri, hogy azok az utóbbi állatban az immunműködések szuppresszióját okozzák-e. Ha a szuppresszió aktív, azaz szuppresszor T-sejtek közreműködésével zajlik, a T-sejt-transzfer szuppressziót okoz; ha a szuppresszió passzív, azaz klonális anergiáról van szó, a T-sejttranszfer nem vezet szuppresszióhoz. A 2. példában ismertetett eredmények olyan eseteket illusztrálnak, amikor egyik vagy másik mechanizmus játszik szerepet, és megmutatják, hogy a szuppresszió mechanizmusa az alábbi tényezők közül egynek vagy többnek a függvénye: (i) a tolerancia kiváltása céljából beadott anyag (például az MBP immundomináns epitópjait tartalmazó fragmensek szájon át adva aktív szuppressziót, parenterálisan adva anergiát váltanak ki); (ii) a tolerizáló antigén beadásának módja (például csak az autoimmun válaszban részt vevő T-sejtek által felismert epitópok váltanak ki anergiát i.v. beadva); (iii) a beadás gyakorisága és az egyszeri dózis (például a szájon át adott MBP aktív szuppressziót vált ki, ha többszöri kis adagban adjuk, de passzív szuppressziót vált ki akkor, ha egyszeri nagy adagot adunk belőle).

Az adatok azt mutatják, hogy az MBP-nek mind az encephalitogén, mind a nem encephalitogén fragmensei aktív szuppressziót váltanak ki, ha szájon át adjuk őket. A nem encephalitogén fragmensek közül azok, amelyek immunszuppresszív epitópot tartalmaznak, kizárólag aktív szuppresszión keresztül hatnak és csak szájon át alkalmazva. Az encephalitogén fragmensek (melyek immundomináns epitópot tartalmaznak) emellett anergiát is kiválthatnak, ha egyszeri nagy mennyiségben adjuk őket.

Ezek az eredmények nagy jelentőségűek az MBP-t mint tolerizáló anyagot alkalmazó tolerizáló készítmények és eljárások tervezése szempontjából. így attól függően, hogy milyen típusú immunszuppresszió a kívánatos, adott beadási módok és adott fragmensek használhatók. így például kívánatos lehet egy vagy több betegségkiváltó epitópot hordozó peptid alkalmazása i.v., i.p. vagy s.c. és (akár egyidejűleg) egy vagy több immunszuppresszív peptid adása szájon át.

Szintén várható, hogy a beadási módok és/vagy adagolási sémák és/vagy autoantigénfragmensek kombinációit alkalmazó tolerizáló módszerek lesznek a leghatékonyabbak. Amint az a szakember számára érthető, a találmány tárgyát képező fragmensek vagy fragmenskombinációk (avagy egy fragmens és a teljes antigén kombinációja) hatékonysága és az adott MBP-fragmensek beadási módjának (vagy különböző beadási módok kombinációjának) hatékonysága függ a kezelt személy korától, nemétől, testtömegétől és fizikai állapotától, a betegség stádiumától, valamint más fragmensek vagy más kezelések egyidejű alkalmazásától vagy nem alkalmazásától. Következésképpen a használandó fragmenseket, dózisokat és kezelési sémákat jelentős részben ezen tényezők alapján kell megállapítani, és adott esetben kísérletekkel meghatározni. Ez a fajta kísérleti meghatározás azonban pusztán rutinkísérleteket igényel, az itt leírt példáknak és útmutatásnak megfelelően.

Az emberi MBP aminosavsorrendjén alapuló peptideket a találmány céljaira az 1. példa szerint jól ismert, szilárd fázisú peptidszintetizáló módszerekkel lehet előállítani [Memfield, R. B.: Fed. Proc. Soc. Exp. Bioi., 21, 412 (1962) és J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); Mitchell, R. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 98, 7357 (1976); Tam, J. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)], előnyösen kereskedelmi forgalomban lévő peptidszintetizátorral (például Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a gyártó utasításait követve. Más módszer szerint ilyen peptideket rekombináns DNS-technológiával is elő lehet állítani, amint az a szakmában jól ismert [Maniatis és munkatársai: „Mólecular cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratories, NY (1982), különösen az 51-54. és 412-430. oldalak]. Például az ilyen peptideket DNSexpressziós termékként lehet kinyerni, miután az MBP kívánt fragmensét kódoló, az adott fajból izolált DNS-t expressziós vektorokba bevittük, és a vektort megfelelő eukarióta vagy prokarióta gazdaszervezetbe vittük, mely gazdaszervezet a kívánt peptidet önmagában vagy valamely fúziós peptid vagy fehéije részeként expresszálja; ez utóbbi esetben a peptidet a fúziós fehérjéből jól ismert módszerekkel lehet kinyerni.

Peptidanalógokat az emberi MBP ismert és alább is közölt aminosavsorrendje alapján lehet tervezni, a fent ismertetettekhez hasonló szintetikus vagy rekombináns módszerek használatával, és például az Eyler, Β. B. in Advances in Experimental Medicine and Biology, 21, 259-281 (1978) közleményben leírt módszerekkel. Például valamely peptidet, mely az MBP kiválasztott fragmensének szekvenciáján alapul, de azzal nem teljesen azonos, a fent leírt módszerekkel lehet szintetizálni. Egy ilyen pepiidnek azután MBP-reaktív CD4+ Tsejtekre gyakorolt hatását lehet tesztelni, az 1. példában az emberi MBP immundomináns epitópjának az MBP(84- 102)-peptiden belüli elhelyezkedésének meghatározására leírt eljárások alapján, vagy a T-sejt-receptorhoz és az MHC-hez való kötődését lehet tesztelni a 4. példában leírtaknak megfelelően. Valamely MBPalapú peptid emberi orális alkalmazáskor várható hatását in vitro úgy lehet tesztelni, hogy betegekből MBP9

HU 219 306 Β specifikus környéki szuppresszor T-sejteket izolálunk, és a peptid jelenlétében mutatott szaporodásukat mérjük. Emellett vagy e helyett azt is meghatározhatjuk, hogy ezen szuppresszor T-sejtek bocsátanak-e ki szuppresszív citokineket, például TGF-et és/vagy IL-4-et a peptid jelenlétében. [Lásd például a transwell-rendszer használatát a 843,752 számú szabadalmi bejelentésben (mely a PCT US 92/01705 számú bejelentés ekvivalense), azzal a különbséggel, hogy a lépsejtek használata felesleges, az MBP-peptid önmagában is használható a β-TGF felszabadulásának kiváltására.] MBP-specifikus szuppresszor T-sejteket MBP hatására történő szaporítás és anti-CD8 ellenanyaggal végzett kötődési kísérletek segítségével lehet izolálni.

A találmány tárgyát képezik gyógyszerkészítmények és orális vagy parenterális használatra szánt formulák, melyek alkalmasak emberben, elsősorban MS-ben szenvedő betegekben az autoimmun T-sejt-aktivitás csökkentésére. Általánosságban az ilyen készítmények a találmány szerinti peptidekből, melyek az emberi MBP fragmensei vagy azok analógjai, egyet vagy többet tartalmaznak az autoimmun válaszban részt vevő sejtek szaporodásának csökkentésére alkalmas mennyiségben. Valamely működés elnyomása, mely in vitro az immunválaszban részt vevő sejtek szuppressziójához vezet, és/vagy valamely MS-ben szenvedő, a találmány szerinti készítményekkel kezelt betegben az MS egy vagy több tünetének enyhülését okozza, szintén a találmány tárgyát képezi. Lásd a fenti definíciókat arra vonatkozóan, hogy mi számít szuppressziónak és a tünetek enyhülésének.

A találmány tárgyát képező T-sejt-szuppresszív peptidek az MBP-eredetű szekvenciák előtt vagy után tartalmazhatnak egyéb, nem MBP-eredetű szekvenciákat is, ha ezen szekvenciák nem gátolják a peptidek szuppresszív aktivitását. Az ilyen konstrukciókat könnyen lehet tesztelni immunszuppresszív aktivitás szempontjából az itt leírt módszerekkel.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények szükség szerint tartalmazhatnak a gyógyszerkészítmények előállításánál szokásos hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokat, oldószereket, oldatba vivő és emulzifikálószereket, valamint sókat, amint az a szakmában közismert. Ilyenek többek között a 0,5 N sóoldat desztillált vízben parenterális alkalmazás céljára és a laktóz orális alkalmazás céljára.

Az emberi MBP ffagmenseit szájon át vagy belélegeztetés útján szinergistákkal együtt is lehet adni, melyek az immunszuppresszió hatékonyságát növelik. Többek között ilyen szinergisták a Gram-negatív baktériumok széles skálájából például az E. coli és a Salmonella különféle altípusai által termelt lipopoliszacharidok (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA; Difco, Detroit, USA; BIOMOL Rés. Labs., Plymouth, PA), lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA; ICN Biochemicals, Cleveland, OH, USA; Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) és immunológiai szabályozó lipoproteinek, mint például a tripalmitoil-S-glicaril-ciszteinil-szeril-szerinhez (P3 C55) kovalensen kötött peptidek, melyeket a Deres, K. és munkatársai által a

Natúré, 342, 561 (1989)-ben leírtak szerint nyerhetünk; vagy az E. coli „Brauns” lipoproteidje, amelyet a Braun, V.: Biochim. Biophys. Acta, 435, 335 (1976) közleményben leírtak szerint nyerhetünk. Előnyösen LPS-t, különösen előnyösen Lipid A-t használunk. A Lipid A különösen előnyös a találmány szempontjából, mert kevésbé toxikus, mint az LPS. Az LPS-t a találmány céljaira Gram-negatív baktériumokból nyerhetjük ki, és a Galanes és munkatársai: Eur. J. Biochem., 9, 245 (1969), valamint a Skelly, R. R. és munkatársai: Infect. Immun., 23, 287 (1979) által leírt módszerekkel tisztíthatjuk.

Az MBP-ffagmensekkel együtt adott szinergisták, például az LPS vagy a Lipid A hatásos mennyiségei széles határok között változhatnak, az adott emlős testtömeg-kilogrammjára vonatkoztatva naponta 0,15 és 15 mg között, előnyösen 0,3 és 12 mg/kg testtömeg/nap között.

A találmány szerinti szuppresszív készítmények beadásának módja lehet orális vagy parenterális vagy ezek kombinációja. Az orális alkalmazás magában foglalja az orális (szájon át), enterális (bélrendszerbe) és intragasztrális (közvetlenül a gyomorba történő) adagolást, melyek közül az orális a legelőnyösebb. A parenterális alkalmazás magában foglalja az intraperitoneális (hashártyán belülre), szubkután (bőr alá), intradermális (bőrbe) és előnyösen az intravénás alkalmazásokat.

Általában az MBP-peptidet vagy -analógot egy embernek szájon át mintegy 10 pg és 20 mg közötti dózisban lehet adni alkalmanként, előnyösen 100 pg és 250 pg között. Ezt a mennyiséget lökésszerűen egy adagban vagy több adagra elosztva lehet beadni. A teljes MBP esetében az aktív szuppresszió kiváltására alkalmas adag például naponta négyszer 1 mg. Anergia kiváltására például parenterálisan adott 10-20 mg alkalmas. Az egyszeri dózis és az adagolás gyakorisága optimalizálása érdekében előnyös a beteget monitorizálni. A pontos dózis és az alkalmazás gyakorisága függ a betegség stádiumától, jelentkezésének gyakoriságától és súlyosságától, a kezelt személy fizikai állapotától, amint az a szakmában közismert. Következésképpen az ilyen optimalizálást esetenként kell elvégezni. Az immunszuppresszióhoz szükséges dozírozás optimalizálása azonban nem jelent az elvárhatót meghaladó mértékű kísérletezést, az itt leírt útmutatás alapján végezve.

A találmány egy másik előnyös megvalósítása szerint a gyógyszerkészítmény beadható belélegeztetés (inhalálás) útján is, előnyösen aeroszol formájában. Előnyösen a szervezetbe való bejuttatás nem az orrjáratokon, hanem a görgők és a tüdő felszínén történik. A találmány szerinti MBP-ffagmensek és hasonló anyagok embernek beadhatók szilárd porrészecskék formájában vagy valamely hordozógázban (például levegő vagy nitrogén) eloszlatott vizes oldatként. Előnyös aeroszolos gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak például valamely élettanilag elfogadható pufferolt sóoldatot.

A találmány tárgyát képező aeroszolos gyógyszerkészítmény példának okáért olyan aeroszolos spray (per10

HU 219 306 Β met) formájában kerülhet beadásra, amelyet az amerikai egyesület államokbeli, 1986. november 25-én megadott, 4,624,251 számú, továbbá az 1972. november 21én megadott 3,703,173 számú, valamint az 1971. február 9-én megadott, 3,561,444 számú és az 1971. január 13-án megadott, 4,635,627 számú szabadalmakban leírt ködképző szerkezetek valamelyikével állítottak elő. Az aeroszolt a kezelt személy vagy állat belélegzi.

A találmány megvalósításakor használhatók még más aeroszolos adagolórendszerek is, mint például a nyomás alatt működő adagoló inhalálókészülék (pressurized metered dose inhaler, MDI) vagy a száraz port belélegeztető készülék, amelyek leírása a következő könyvfejezetben található: Newmann, S. P.: in „Aerosols and the Lung”, szerkesztette Clarké, S. W. és Davia, D., 197-224. oldal, Butterworths, London, England (1984).

Ilyen típusú aeroszoladagoló rendszereket kereskedelmi forgalomban is lehet kapni, például a Fisons Corporation (Bedford, MA, USA), a Schering Corp. (Kenilworth, NJ) és az American Pharmoseal Co. (Valencia, CA) cégektől.

Várhatóan aeroszolos alkalmazás esetén az MBPfragmensek kisebb mennyisége is elegendő lesz az autoimmun betegség kezelésére, amint azt a kísérletes autoimmun agyvelőgyulladás (EAE) mielin bázikus fehérjével (MBP) és az adjuváns arthritis kollagénnel történő kezelésénél találtuk, a 642,693 lajstromszámú (korábban már említett) ausztrál szabadalmunkban leírtak szerint. Továbbá úgy tűnik, hogy az MBP-fragmensek belélegzése esetén kiváltott immunszuppresszió aktív szuppressziós mechanizmuson keresztül hat [Weiner, H. L. és munkatársai: FASEB, 4, 2102 (1990)]. A találmány tárgyát képező MBP-peptidek aeroszol formájában a szervezetbe juttatható mennyisége körülbelül 0,015 és körülbelül 1,5 mg/kg testtömeg/nap között lehet, és tetszés szerint magában foglalhat valamely szinergistát körülbelül 0,05 és körülbelül 15 mg/kg testtömeg/nap közötti mennyiségben, egyszeri vagy többszöri adagban. A pontos beadandó adag függ a betegség súlyosságától és a beteg fizikai állapotától.

Parenterális alkalmazás esetén a kiszerelés általában mintegy 1 és mintegy 200 mg találmány szerinti peptidet tartalmazhat személyenként és naponta. A fenti ismertetés, mely a hordozó- és segédanyagokra, valamint a mennyiségek és az adagolás finom beszabályozására vonatkozott orális alkalmazás esetén, a parenterális alkalmazásra is vonatkoztatható.

Nyilvánvaló, hogy valamely orális vagy parenterális készítmény egységnyi adagja nem szükségszerűen tartalmazza a hatóanyag(ok)nak az MS kezelésére hatásos mennyiségét, minthogy a szükséges hatásos dózist az egységnyi adag többszöri beadásával is biztosítani lehet.

Az 1-3. példákban ismertetett módszerek használhatóak a találmány szerinti eljárások hatékonyságának monitorozására és a találmány szerinti betegségelnyomó készítmények adagolási sémáinak, valamint a ffagmensek és beadási módok optimalizálására.

T-sejteket valamely beteg véréből vagy cerebrospinális folyadékából lehet izolálni, felnöveszteni és klónozni, amint azt az 1-3. példák ismertetik (a találmány szerinti kezelés előtt és/vagy után). A találmány tárgyát képező MBP-peptidek ellen poliklonális vagy monoklonális ellenanyagokat lehet termeltetni a szakmában széleskörűen ismert és használt módszerekkel, majd ezek segítségével meg lehet határozni az MBP-reaktív sejtek arányát valamely beteg vérében, közelebbről az MBP-reaktív, aktivált CD4+ T-sejtek arányát, a találmány szerinti kezelés előtt és/vagy után. A találmány tárgyát képező MBP-peptidek szintén felhasználhatók azon egyének azonosítására, akik MBP-reaktív T-sejtekkel rendelkeznek, az 1. példában ismertetett módszerek segítségével.

Az alábbiakban bemutatott példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk tovább szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1. példa

Az emberi MBP fő immundomináns régiójának azonosítása

MBP-t emberi agyszövetből vonunk ki, és egy CM-52 oszlopon (Wattman Biosystems Ltd., Maidstone, Kent, U. K.) tisztítjuk a legnagyobb molekulatömegű csúcsot használva [Chou, F. C.-H. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 251, 2671 (1976)]. MBP-peptideket valamely szilárd fázisú módszerrel szintetizálunk, vagy egy kereskedelmi laboratóriumtól szerzünk be (Bioresearch Láb Inc., San Raphael, CA, USA) és nagynyomású folyadékkromatográfiával (high pressure liquid chromatography, HPLC) tisztítjuk a következőképpen: Minden egyes peptidkészítményt 1 mg/ml-re hígítunk 0,1% trifluor-ecetsavban (TCA). Ezután egy HPLC-oszlopra (Rainin Reverse Phase C4 vagy C18) visszük fel a mintát, majd egy 0,1% TCA-t tartalmazó 0-70% acetonitrilgradienssel mossuk le. A csúcsokat 214 nm-en detektáljuk. A használandó MBP-ffagmenseket az 1. táblázat tartalmazza. Az emberi MBP aminosavsorrendje publikált, tehát a peptidek elkészítéséhez csak az aminosavszámok szükségesek.

HU 219 306 Β

Emberi

MBP- Aminosav-sorrend aminosavak

1. táblázat

Emberi

MBP- Aminosav-sorrend aminosavak

- 20: ASQKRPSQRHGSKYLATAST

- 40: KDHARBGFLPRHRDTGILDS

- 60: IGRFFGGDRGAPKRGSGKDS

- Θ2: HHPARTAHYGSLPQKSEGRT

- 102: DENPWHFFKNIVTPRTPP

113 - 132: LSRFSWGAEGQRPGFGYGGR 143 - 168: FKGVDAQGTLSKIFKLGGRD

11 -	30:	GS KYLATASTMDKARKGFLP
31 -	50:	RHRDTGILDSIGRFFGGDRG
51 -	70:	APKRGSGKDSHEPARTA3YG
71 -	92:	SLPQKSEGRTQDENPWHFF
93 -	112 :	KNIVTPRTPPPSQGKGRGLS
124 -	142 :	RPGFGYGGRASDYKSAHKG

Egy gyors T-sejt-klónozó módszert használunk annak vizsgálatára, hogy vannak-e immundomináns epitópok az MBP-n, melyek a II. osztályú MHC-fenotípusokkal reagálnak, és ezen reaktivitás gyakoriságának mérésére. Esetünkben 15 824 rövid élettartamú T-sejt- 30 vonalat generáltunk 51 vizsgálati személyből. Perifériás mononukleáris vérsejteket tenyésztünk tisztított MBP-vei (0,1 mg). A harmadik napon, majd később 3-4 naponként interleukin-2-t (IL-2, ABT, Columbia, MD, USA) és 2 egység rekombináns interleu- 35 kin-4-et (IL-4, Genzyme, Boston, MA, USA) adunk a tenyészetekhez. A tenyésztés 13. napján minden egyes vonalból vett mintákat teszteljük MBP-reaktivitásra a következő szaporodási tesztben: a T-sejteket három párhuzamosban (10⁵ sejt/mérőhely) 96 gömbölyű aljú 40 mérőhellyel rendelkező tálcára (Costar) teszünk, és megfelelő stimulálóanyagok (0,1 mg teljes MBP vagy 5% IL-2) jelenlétében tenyésztjük 72 óráig 37 °C-on,

90% páratartalom és 5% CO₂ jelenlétében. A sejtekhez 2 pCi [³H]TdR-t (2 Ci/mmol, New England Nuclear, 45 Boston, MA, USA) adunk legalább 18 óra időtartamra. APC-ként (antigénprezentáló sejt) Epstein-Barr-vírustranszformált emberi B-sejteket (a vírus kereskedelmi forgalomban kapható az ATCC-től) vagy L-sejteket [emberi DR₂-vel transzfektált egérsejtek; L-sejteket az 50 ATCC-től lehet rendelni az ATCC-CCL1 katalógusszám alatt, és Wilkinson, D. és munkatársai: J. Exp. Med., 167, 1442 (1988) szerint lehet őket transzfektálni a DR₂-t kódoló DNS-sel Wu, S: és munkatársai: J. Immunoi., 138, 2953 (1987) szerint] használunk. Ezekből mérőhelyenként 1 χ 10⁶-ot teljes tápfolyadékban 40 pmol/liter MBP-vel vagy PLP-vel (foszfolipid-protein) vagy ezek nélkül 2 óráig 37 °C-on tartunk, kétszer mossuk Hanks-féle sóoldatban (Whittaker), majd 4 °Con 5000 raddal besugározzuk őket. 10⁵ T-sejtre 10⁴APC-t használunk. A T-sejteket APC nélkül is stimuláljuk úgy, hogy 2 pmol/liter MBP-t, PLP-t vagy a megfelelő fragmenst adjuk közvetlenül a T-sejtekhez 48 órára, majd timidinnel jelöljük és learatjuk.

Azokat a T-sejt-vonalakat, melyek a fentiek szerint MBP-vel vagy PLP-vel reaktívnak mutatkoznak, a továbbiakban a fenti módszerekkel az emberi MBP aminosavsorrendjét lefedő, átfedő 20 tagú peptidekkel teszteljük a 2. táblázat szerint. Az MBP- és PLP-reaktív sejtek arányát határozott, relapszáló-remittáló MS-ben szenvedő betegekből (akiket MRI-vel, azaz mágneses rezonancia-képalkotással és klinikai vizsgálatokkal diagnosztizáltak), más neurológiai betegségekben szenvedőkből és egészséges egyénekből származó sejtvonalakkal végezzük. Az esetünkben kapott tipikus eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

HU 219 306 Β

2. táblázat

	KOR	NEM (F/N)	Reaktív vonalak MBP	/összes száma PLP	Reaktív átlagos MBP	vonalak gyakorisága PLP
MS* n=23	34,2±1,4	35/65	554/7746	20/432	7,18±2,3 ( o	3,34±1,56
Más N**	38,7±3,2	43/57	118/2880	3/384	o 4,10±l,0	0,90±0,62
n=10					4
Egészséges	3O,3±l,5	50/50	73/1742		4,70±l,5
n=6					8

* MS = szklerózis multiplex ** N = neurológiai

Az MS-betegek esetünkben fehérek voltak és jól jellemezett relapszáló-remittáló betegségben szenvedtek legalább két exacerbációval az előző 24 hónapban, valamint MRI-vel látható pozitív léziókkal a vérvétel időpontjában. Az egyéb neurológiai betegségekben szenvedőknél a jelen esetben a vérvétel előtt 1-3 héttel a következő diagnózisokat állapították meg: cerebrovaszkuláris esemény (n=4), vérzéses agysérülés (n=4) vagy áttételes agytumor (n=2). Az egyes betegcsoportokból generált T-sejt-vonalak számát és az ezekből MBPvagy PLP-reaktívak számát a 2. táblázat mutatja. Emellett minden egyes egyénre kiszámítjuk az MBP-reaktív, illetve PLP-reaktív sejtvonalak arányát úgy, hogy az MBP/PLP-reaktív sejtvonalak számát elosztjuk az adott személyből nyert összes sejtvonal számával, és megadjuk az átlagokat, valamint az átlag hibáját (standard error of the mean, SEM).

Míg az MBP összes fragmensével reagáló vonalak gyakorisága valamivel magasabb az MS-ben szenvedő egyéneknél, mint a többieknél, a különbség esetünkben nem szignifikáns. Ezzel szemben, amint azt lejjebb tárgyaljuk, az MS-betegekből nyert reaktív sejtvonalak nagyobb arányban reagálnak az MBP 84-102. és 143-168. aminosavait tartalmazó peptidekkel, ami azt jelenti, hogy ezek a peptidek hordozzák az immundomináns epitópokat, amelyek az MS kifejlődésében szerepet játszanak.

Az MS-betegekből nyert, esetünkben összesen 302 sejtvonal közül, amelyeket sikerült kinöveszteni és ismételten MBP-reaktívnak bizonyultak, 140 (46,4%) reagált az MBP(84-102)-peptiddel; körülbelül 70-80% reagált az MBP(84-102)-és az MBP(143-168)-peptidek valamelyikével. A kontrollcsoportokban az összesen 100 MBP-reaktív vonalból ezen konkrét esetben 11 (11%) ismerte fel az MBP(84-102)-peptidet és körülbelül 34% reagált az MBP(84-102)- és az MBP(143-168)-peptidek valamelyikével. Minden egyes egyénre kiszámítottuk az MBP-reaktív, illetve PLP-reaktív sejtek arányát; ezek átlagát a 2. táblázat jobb oldali legszélső oszlopa mutatja. A PLP megfelelő immundomináns epitópjait az MBP-re az imént leírtak szerint lehet azonosítani.

Az MBP-specifikus sejtvonalak gyakorisága az egészségesek és az egyéb neurológiai betegségekben szenvedők esetében gyakorlatilag azonos, ezért elemzés céljára az adatokat összevonhatjuk. Az MS-ben szenvedőkből származó T-sejt-vonalak között az MBP(84-102)-peptiddel szelektíven reagálók aránya magasabb, mint a kontrollcsoportok esetében (1. ábra). Az MBP 61-82. és 124-142. peptidekkel szembeni reaktivitás esetében szintén szignifikáns, de kevésbé szembeszökő eltérés figyelhető meg. Az MBP(143-168)-peptiddel reagáló T-sejtvonalak aránya mind az MS-betegek, mind a kontrollok esetében magas. Az aktivált T-sejtek kiválasztására IL-2-t használunk. IL-2-vel történt elsődleges stimuláció után az így aktivált sejtvonalak felismerték az MBPpeptideket.

Mindezen eredményeket MS-betegek nagyobb csoportján megismételve, a fenti módszereket alkalmazva az adott esetben még 132 T-sejt-vonalat nyertünk (63at MS-betegektől és 88-at egészségesektől). A tipikus eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. Összefoglalva ezen eredmények alátámasztják azt a következtetést, hogy az MBP 84-102. és 143-168. aminosavait tartalmazó peptidek hordozzák az MBP immundomináns epitópjait.

HU 219 306 Β

3. táblázat

Egyén	Stimulus	MBP-reaktív nalak száma
MS-HY	MBP	17
	IL-2	4
MS-SW	MBP	8
	IL-2	3
MS-CY	MBP	14
	IL-2	4
MS-HK	MBP	7
	IL-2	6
MS-JA	MBP	10
	IL-2	4
MS-MI	MBP	5
	IL-2	2
MS-AN	MBP	2
	IL-2	2

vo- Peptid-reaktivitás (MBP reaktív vonalak aránya) 84-102 (17/17)

84-102 (14/4)

84-102 (2/8)

143-158 (5/8) egyéb (1/8)

143-168 (2/3) egyéb (1/3)

143-168 (9/14) egyéb (5/14)

143-168 (3/4) egyéb (1/4)

143-168 (6/7) egyéb (1/7)

143-168 (5/5) egyéb (1/6)

84-102 (1/10)

143-168 (8/10)

143-168 (4/4)

84-102 (3/5)

143-168 (1/5) egyéb (1/5)

84-102 (1/2)

143-168(1/2)

143-168 (2/2)

HU 219 306 Β

3. táblázat (folytatás)

Egyén	Stimulus	MBP-reaktív nalak száma
MS-ST	MBP	ND
	IL-2	18
NS-kw	MBP	8
	IL-2	1
NS-jl	MBP	12
	IL-2	12
NS-aa	MBP	2
	IL-2	2
NS-dd	MBP	12
	IL-2	2
NS-nb	MBP	37
	IL-2	2

ND = nem történt vizsgálat vo- Peptid-reaktivitás (MBP reaktív vonalak aránya)

ND

84-102 (6/18)

143-168 (6/18)

93-142 (3/18) egyéb (3/18)

84-102 (2/8)

143-168 (5/8) egyéb (1/8)

84-102 (1/1)

84-102(10/12) egyéb (2/12)

84-102(7/12)

143-168 (5/12)

84-102 (2/2)

84-102(2/2)

84-102(4/12)

143-168 (6/12) egyéb (2/12)

84-102 (1/2)

143-168 (1/2)

84-102 (37/37)

84-102 (2/2)

HU 219 306 Β

4. táblázat

vizsg. szeaely _sej_t	CSF , /nnT -	IL-Z-^re válaszképes .T-seitek χ 10*	TL-2-re válaszképes • T-seitek x 10*
CSF	FBMC	CSF	F8MC
MS-betegek		(A>	(B)	(C,	(D)
MS-l	12.2	16.003.1-25.7)·	4.7(21-61)	160.6-61)	N.D.*
MS-2	1.5	10.4(4.(-(4.)	6.7(41-11.1,	51(4.3-92,	N.D.
M5-3	12	7.7 (42-12.1)	4.7(19-6.1,	3.1(12-72)	N.D
MS-1	11	14.4(1(.5-23.7)	13.3(9.9-19.7)	9.1 (6.9-14.6,	N.D.
MS-5	n	17.5(13.1-241)	111(7.6-171,	61 (51-14.5)	N.D.
MS-6	10	231 (14.9-32.4)	6.7(6.4.131)	201(14.6-261)	N.D.
MS-7	2.4	25.0(11.7-33.1)	7.7(41-12.4)	6.4(6.0-13.5)	1.6(1.4-32)
MS-1	LI	7.7(4.3-11.9)	21(1.7-5.6)	6.7(42-111)	1.9(12-4.4,
MS-9	$.0	111 (14-17.1)	111 (6.6-17.4)	1.7(12-41)	N.D.
MS-10	4.1	241(171-321)	14 (6.4-131,	3.4(21-7.4,	N.D.
MS-ll	5.7	23.1(16.1-321)	31(21-71,	4 9(19-61)	N.D.
MS-12	4.6	4.1 (31-1 l.l)	17(1.6-51)	NJ>.	N.D.
MS-13	12	(71(131-241)	10.0 (7.6.15.4,	N.D.	N.D.
MS-14	3.4	25.0(11.7-33.5)	161(111-23.5)	14(1.7-6.9)	N.D.
MS-15	3.1	(11 ((3.4-24.1)	11 (5.6-11.4)	6.6(52-10.1)	N.D.
MS-16	4,5	41(4.3-(1.1)	42(2.4-71)	6.4(52-10.7)	ΝΛ.
MS-17	11	115(6.6-112)	62 (4.6-10.6)	1.4(11-4.5)	NJ>.
MS-ll	* 11	7.7(41-13.1)	4.3(2.7-91)	NJ>.	ΝΌ.
MS-19	4.Í	1 l.l (7.6-17.0)	10(1.4-51)	161(1).5-24.1,	17(1.6-52!
MS-20	3.1	234(16.9-32.0)	61 (6.0-121)	N.D	N.D.
átlag	)M	15.7	7.1	5.4	012
teámat wídi		(E)	(F)	IC)	(H,
OND
OND-i	5.0	10.4 (71-16.4)	9.6(7.3-14.6)	N.D	N.D.
OND-2	10	7.2 (5.1-10.6,	11(5.1-114)	N.D	N.D
OND-3	14	4.6 (11-9.0,	7.1 (4.2.14.5)	N.D.	N.D.
ΟΝΟ-»	5.0	5.1(4.6-10.1)	5.4 (4.2-9.9)	N.D.	N.D.
ONO-5	5.0	4.1 (2.3-6 5)’	6.7(6.4-13.4,	N.D.	N.D.
OND-6	J.4	4.6 (2.9-9.21	6.6 (5.2-10.2,	N.D.	N.D.
ONO-7	11	31(2.0-7 9)	4.2 (2.4-6.91	N.D.	N.D.
ONIM	1.»	2.1 (1.5-5 0)	J.«(i μ n	N.D	NI).
átlag	S. G	• >	6.0	-	-
jszlopok kó-	(ΛΗΙΟ	IC'MI»	(l;)tl^;)	(AMD)	ΙΙΙΙ-ίΙ^:)«.Ί-<0)
iötti p-érték	Ü M0I	ÍÍIUMH	1» 16?	0001	Ü?7Jt 0WMH

X-os konfidencia-limit b= a használt sejtkoncentrációban nem észlelhető ^c= t-teszttel számítva

HU 219 306 Β

A 4. táblázatban látható adatok azt mutatják, hogy az MBP-specifikus T-sejtek IL-2-vel történő elsődleges stimulációja esetén az MS-betegekből (a kontrollcsoportokhoz képest) lényegesen nagyobb számú MBP-specifikus MBP-reaktív T-sejt-klónt lehet azonosítani. Ez arra utal, hogy az MBP-reaktív T-sejt-klónokat az IL-2 reaktiválhatja (feltehetően deanergizálja), és azok ezután az MBP-peptidekre reaktívakká válnak.

2. példa

Az orális tolerancia indukciójának mechanizmusa

Az ebben a példában szereplő kísérletek célja az MBP különböző fragmenseivel történő EAE-gátlás hatékonyságának összehasonlítása, az adott fragmens orális és intravénás beadásának összehasonlítása és a betegség kezelhetőségének megállapítása attól függően, hogy az indukált vagy adoptív transzferrel átvitt állapot. Az EAE indukciójáról beszélünk, ha az MBP-vel immunizáljuk a gazdaállatot úgy, hogy az MBP-t izomba adjuk valamely adjuvánssal együtt. Az adoptív transzfer esetében egy MBP-reaktív sejtvonalat aktiválunk, majd az állatba injektáljuk. Ebben a példában a következő anyagokat és módszereket használjuk.

Állatok. 6-8 hetes nőstény Lewis-patkányokat a Harlan-Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN, USA) cégtől veszünk, majd szokásos, korlátlan mennyiségű laboratóriumi takarmányon és vizen tartjuk őket. Az állatokat a „Committee on Care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council” ajánlásai szerint tartjuk (DHEW:NIH, 85-23,1985-ös kiadás).

Antigének. Tengerimalac mielin bázikus fehérjét agyszövetből tisztítunk Deibler és munkatársai: Prep. Biochem., 2, 139 (1972) módszere szerint. A fehérjetartalmat és a tisztaságot gélelektroforézissel és aminosav-elemzéssel ellenőrizzük. Concanavalin A-t és hisztont a Sigmától (St. Louis, MO, USA) szerzünk be. Peptideket szintetizálunk és HPLC-n tisztítunk. A szintetizált peptidek aminosavsorrendje a következő :

21-40: MDHARHGFLPRHRDTGILDS (patkányoknak szájon át adva immunszuppresszív régió);

71-90: SLPQKSQRSQDENPVVHF (patkányokban immundomináns encephalitogén régió);

151-170: GTLSKIFKLGGRDSRS.

Tolerancia kiváltása. Patkányokat 1 ml PBS-ben feloldott lmg MBP-vel vagy csak PBS-sel etetünk közvetlenül a gyomorba, 18-as rozsdamentes állatetető tű segítségével (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA). Az állatokat 2-3 naponként összesen öt alkalommal etetjük, az utolsó etetés az immunizálás előtt két nappal történik. Intravénás tolerancia vagy klonális anergia kiváltása céljából a patkányokat 0,1 mg PBSben oldott MBP-vel, MBP-peptiddel vagy hisztonnal, avagy csak PBS-sel injekciózunk a szemvénába naponta ötször 2-3 napig; az utolsó injekciót az immunizálás előtt két nappal kapják.

EAE kiváltása. EAE-betegség aktív indukciója céljából Lewis-patkányokat immunizálunk 25 pg MBP-t adva a bal talpba. Az MBP-oldat 50 pl-jét előzetesen pl Freund-féle teljes adjuvánssal, mely 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis-t tartalmaz (Difco), emulzióvá keveijük. Adoptív transzferrel átvitt EAE előidézésére MBP+CFA-val immunizált patkányból T-sejtvonalat növesztünk ki és tartunk fenn [Ben-Nun és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 11, 195 (1982)]. Az encephalitogén sejteket Concanavalin A-val (Con A, 2 pg/ml) és immunizált állatokból származó besugárzott timocitákkal (mint APC) együtt tenyésztve aktiváljuk, Ficoll-Hipaque (1077, Sigma) grandiensen izoláljuk és kétszer PBS-ben megmossuk. 5xl0⁶ encephalitogén sejtet injektálunk intraperitoneálisan 0,1 ml PBS-ben a besugárzott (750 rád, 24 órával előbb) recipiens patkányoknak. A modulátor és encephalitogén sejtek életképességét tripánkék kizárási teszttel állapítjuk meg, általában 90% fölött van. Minden egyes kísérletben 5 állatot használunk kísérleti csoportonként.

T-sejt-alcsoportok tisztítása orális tolerizálást követő protektív adoptív transzfer céljából. Nyiroksejtalcsoportok szelektív eltávolítását Cruikshank módosított módszerével végezzük [J. Immunok, 138, 3817 (1987)] mágneses részecskék segítségével. A lépsejteket egérben termelt anti-patkány-CD8 vagy CD4-specifikus monoklonális ellenanyagokkal (1:10 hígítás, OX/8 és W3/25 jelű kiónok, kereskedelmi forgalomba hozza a Serotec/Bioproducts, Indianapolis, IN, USA) inkubáljuk 30 percig jégfurdőben, kétszer mossuk, majd előre mosott mágneses részecskékhez adjuk, amelyek átlagos átmérője 4,5 pm (M-450), és amelyekhez előzőleg kecske anti-egér-IgG-t kötöttek (Dynal Inc., Fort Lee, NJ). A használt mágneses részecskemennyiséget úgy adjuk meg, hogy az eltávolítani kívánt sejtek mindegyikére körülbelül 10 mágneses részecske jusson. A sejteket a mágneses részecskékkel 0,5 ml 10% totális borjúsavót tartalmazó RPMI 1640-ben inkubáljuk egy 10 ml-es gömbölyű aljú csőben (Nunc), 30 percig jégen, 5 percenként gyengéden megrázva a csövet. Inkubáció után a sejtmágneses részecskeszuszpenziót 5 ml tápfolyadékkal mossuk, és a sejtrészecskekomplexeket a szabad sejtektől erős mágneses térben, mágneses részecskekoncentrátorral (Dynal-MPC-1) 2 perc alatt elválasztjuk. A felülúszót eltávolítjuk, és az eljárást kétszer megismételjük. Az adott ellenanyaggal mentesített T-sejt-készítmény 95%-nál több CD4+CD8- vagy CD4-CD8+-sejtet tartalmaz, áramlásos citometriával mérve. MBP-vel etetett és kontrollállatok lépsejtjeit (5xl0⁶ sejt/ml tápfolyadék) 2 pg/ml Con A jelenlétében tartjuk. Az adott sejtektől mentesített sejtkeverékeket 2,5 χ 10⁶/ml töménységben tartjuk. Az így nyert T-sejt-szubpopulációkat modulátorsejtként használjuk.

Klinikai értékelés. Az állatokat minden nap vizsgáljuk az EAE tüneteinek meglétére anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. Az EAE klinikai súlyosságát a következőképpen értékeljük: 0 nincs betegség, 1 petyhüdt farok, 2 egyik hátsó comb bénulása, 3 mindkét hátsó comb bénulása, 4 mind a négy végtag bénulása, 5 halál. A betegség időtartamát a betegség első jelentkezésétől (általá17

HU 219 306 Β bán az immunizálás után 10-11 nap) az állat haláláig vagy teljes gyógyulásáig adjuk meg.

Késői típusú túlérzékenység (delayed type hypersensitivity, DTH) tesztelése. A DTH tesztelésére 25 pg PBS-ben oldott MBP-t injektálunk a fülbe. Ez előtt és 48 órával később mikrométer-tolómérővel (Mitutoyo, Japán) mérjük a fül vastagságát anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. A változást kezelési csoportonként, mint átlagokat, és az átlagok hibáját adjuk meg.

Szövettan. Az adoptív transzferrel EAE-ben megbetegített patkányoknál a kóros elváltozásokat szövettani értékelésnek vetjük alá. Az adoptív transzfer után 15 nappal a gerincvelőt eltávolítjuk és 10% semlegesre pufferolt formáimnál rögzítjük. Paraffinos metszeteket készítünk, és azokat Luxol gyors kék-hematoxilinexozin-festéssel kezeljük általánosan használt módszerek szerint [Sobel és munkatársai: J. Immunoi., 132, 2393 (1984)]. A gerincvelőszövetből minden állatnál azonos módon veszünk mintákat, és metszetenként a gyulladásos gócok (húsznál több aggregált gyulladásos sejt) számát adjuk meg a parenchimában és a hártyában úgy, hogy a vizsgálatot végző személy ne tudja, milyen kezelést kapott az állat (Sobel és munkatársai, lásd fent).

Statisztikai elemzés. A klinikai pontszámokat kétoldali Wilcoxon rangkorrelációval elemezzük. Chi-négyzet-módszert használunk a betegség előfordulási gyakoriságának összehasonlítására a különböző csoportok közt, míg az átlagokat a Student-féle t-teszttel hasonlítjuk össze.

Eredmények

Adoptív transzferrel átvitt EAE gátlása MBP-vel végzett orális tolerizálással. Hogy az MBP előzetes orális adagolásának az adoptív transzferrel átvitt EAE-re gyakorolt hatását tisztázzuk, MBP-vel etetett és kontrollpatkányokat intraperitoneálisan inokulálunk 5 χ 10⁶MBP-specifikus, Con A-stimulált encephalitogén Tsejttel. Az MBP-reaktív sejteket két nappal az utolsó etetés után visszük be. A 2A. ábra feltünteti az MBPvel orálisan tolerizált, majd MBP-specifikus sejtekkel inokulált állatok klinikai pontértékeit (fekete körök) és hasonlóképpen inokulált, előzőleg nem kezelt állatok klinikai pontértékeihez (üres körök) hasonlítja ezeket egy tipikus kísérlet esetében. Amint az látható, az MBP orális alkalmazása nincs hatással az adoptív transzferrel átvitt EAE-re. Véleményünk szerint ennek oka az, hogy az átvitt encephalitogén sejtek aktiváltak, a célszervhez gyorsan eljutnak, ahol azután immunválaszt kezdeményeznek, mielőtt kellő számú szuppresszor T-sejt vándorolna a nyirokcsomókba és a célszervbe (agy). Ennek alapján a regulator:encephalitogén sejtek aránya a célszervben és megjelenésük időzítése kritikusnak tűnik.

Ezzel szemben az adoptív transzferrel átvitt EAE gátlás alá kerül, ha orálisan tolerizált állatokból kivett lépsejteket viszünk át az encephalitogén sejtekkel együtt az előkezeletlen recipiensekbe (2B. ábra). Ez arra utal, hogy a lépsejtek között lévő, már aktivált szuppresszor T-sejtek sikeresen megelőzik a betegség kifejlődését, ha a végrehajtósejtekkel együtt adjuk őket.

A 2B. ábra a klinikai pontértékek alakulását mutatja olyan állatok esetében, amelyekbe MBP-vel orálisan tolerizált más állatokból származó 1,5xlO⁶ lépsejtet viszünk át 5xl0⁶ encephalitogén sejttel együtt. Az orálisan tolerizált állatokból származó lépsejteket összekeveijük az encephalitogén sejtekkel, majd beinjektáljuk (fekete körök). Amint azt szintén a 2B. ábra mutatja, a betegség elleni védelem akkor is érvényesül, ha az encephalitogén és a moderátorsejteket külön injektáljuk a jobb és a bal lágyékba (üres körök), ami arra utal, hogy a védőhatás nem a szuppresszor T-sejtek és az immunválaszért felelős T-sejtek kölcsönhatásának következménye. A pozitív kontrollállatok klinikai pontértékeit a 2B. ábrán fekete négyzetek jelölik.

Az adoptív transzferrel átvitt EAE gátlása az orálisan tolerizált állatokból származó CD8 + T-sejtektől függ. Annak megállapítására, hogy az adoptív transzferrel átvitt EAE gátlása valamely T-sejt-szubpopulációtól függ-e, az MBP-vel etetett állatok lépsejtjeit mentesítjük a CD8 + , illetve CD4+ T-sejtektől, mielőtt az adoptív transzferben modulátorsejtként használnánk őket. Amint azt a 3. ábra mutatja, a védelem adoptív transzferé megszűnik, ha CD8+-mentesített lépsejteket viszünk át, míg CD4+-mentesített lépsejtek átvitelekor nem szűnik meg (átlagos legnagyobb klinikai pontérték: 2,3±0,2, szemben a 0,7±0,2-vel p<0,01). Üres négyzetek: teljes lépsejt-populáció; fekete körök: CD4+-mentesített lépsejtek; üres körök: CD8+-mentesített lépsejtek.

Az adoptív transzferrel átvitt EAE-hez kapcsolódó késői típusú hiperszenzitivitási reakciók (DTH). Korábban összefüggést találtunk a DTH és az aktívan indukált EAE orális toleranciát követő szuppressziója között [Miller és munkatársai: J. Exp. Med., 174, 791 (1991); Miller és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 421 (1992)]. Annak megállapítására, hogy hasonló összefüggés áll-e fenn az adoptív transzferrel átvitt EAE esetében, a DTH-válaszokat mérjük. Amint azt a 4. ábra mutatja, jelentős DTH-reakciók fejlődnek ki az adoptív transzferrel EAE-ben megbetegített állatokban, és ezen DTH-reakciókat az MBP-vel orálisan tolerizált állatokból átvitt lépsejtek gátolják. A DTH-válaszok gátlása megszűnik, ha CD8+-mentesített lépsejteket használunk, de fennmarad, ha CD4+-mentesített lépsejteket adunk a betegségátvivő sejtekkel együtt (esetünkben a fülduzzadás mértéke CD4+-mentesített lépsejtek esetében: 0,6 ±0,1; szemben a CD8+-mentesített lépsejtekkel: l,8±0,2; p<0,01).

MBP-vel orálisan tolerizált állatokból származó lépsejtek hatása a központi idegrendszer szövettanára adoptív transzferrel előidézett EAE-ben. Az MBP orális adása gátolja a központi idegrendszer gyulladását aktívan indukált EAE-ben [Higgins és munkatársai: J. Immunoi., 140, 440 (1988)]. Mindazonáltal nem minden, a klinikai tüneteket enyhítő kezelés befolyásolja a központi idegrendszer gyulladását [Offner és munkatársai: Science, 251, 430 (1991)]. Amint azt az 5. ábra mu18

HU 219 306 Β tatja, mind a parenchimában, mind az agyhártyában csökken a gyulladás, ha MBP-vel etetett állatokból származó sejteket viszünk át. Ez a csökkenés akkor is megfigyelhető, ha CD4+-mentesített sejteket használunk, de megszűnik, ha CD8+-mentesített modulátor lépsejteket viszünk át az orálisan tolerizált állatokból. A gyulladásos gócok száma (parenchima+hártya) tipikusan a következő kísérleti csoportok szerint. Kontroll: 76±8,2; MBP-vel etetett: 3,8±1,8; CD4+-mentesített: 2,8±l,0; CD8+-mentesített: 65±4 (p<0,01; az MBPvel etetett és a CD4+-mentesített csoportok szemben a CD8+-mentesített csoporttal).

Az aktívan indukált és adoptív transzferrel átvitt EAE gátlása MBP i.v. beadását követően. Amint azt a 6A. ábra mutatja, az MBP intravénás (i.v.) injektálása jelentősen gátolja az MBP/CFA-immunizálással aktívan indukált EAE-t (tipikusan az átlagos legnagyobb klinikai pontérték 0,5±0,2; hisztonnal injekciózott kontrolioknál: 3,0±0,3; p<0,01), az MBP-vel végzett orális tolerizálással analóg módon. Szemben az orális tolerizálással, amelyik nem véd az adoptív transzferrel átvitt EAE-től, az MBP i.v. injekciója az adoptív transzferrel átvitt EAE-től is megvéd (tipikusan az átlagos legnagyobb klinikai pontérték 0,4±0,2; szemben a kontrollal: 3,2±0,2; p<0,01) (6B. ábra). Azonban ellentétben az orális tolerizálással, az i.v.-tolerizált állatokból a betegség elleni védelem nem vihető át lépsejtek adoptív transzferével, ha ez utóbbiakat egy MBPspecifikus encephalitogén sejtvonallal együtt adjuk más állatoknak (tipikusan az átlagos legnagyobb klinikai pontérték 2,8±0,2; a kontroliokkal szemben nem szignifikáns).

Az EAE gátlása MBP-peptidek orális vagy i.v. beadását követően. Az orális és i.v. tolerancia mechanizmusának további vizsgálata céljából az MBP encephalitogén és nem encephalitogén régióit képviselő peptideket adunk orálisan és intravénásán a betegség aktívan indukcióját szolgáló immunizálás előtt. A tengerimalac-MBP 71-90. peptidje encephalitogén Lewispatkányokban [Swanborg és munkatársai: J. Immunoi., 114, 191 (1975)]. Amint azt a 7. ábra mutatja, az EAE-t i.v. tolerizálás útján csak a teljes MBP-vel és az MBP 71-90. peptidjével tudjuk gátolni, de a tengerimalac-MBP 21-40. peptidjével nem. A 21-40. peptiddel végzett orális tolerizálás ezzel szemben hatásos az EAE gátlásában. A tengerimalac-MBP 21-40. peptidjét azért választottuk, mert korábban kimutattuk, hogy MBP-vel orálisan tolerizált patkányok lépsejtjeiből β-TGF felszabadulását okozza [Miller, A. és munkatársai: FASEB, 6, 1686 (1992)]. A kontrollként használt tengerimalac-MBP 131-150. nem gátolja az EAE-t, akár orálisan, akár i.v. adjuk. Megjegyzendő, hogy az i.v.-gátlás mellett a 71-90. peptid orálisan is gátolja az EAE kialakulását. Ez arra utal, hogy egy adott MBP-ből származó, egy adott gazdaszervezetben immundomináns domént hordozó peptidek elnyomhatják a T-sejtek működését, ha szájon át vagy intravénásán adjuk őket, de különböző mechanizmusok révén, a beadás útjától és az adagolástól függően.

Ezen kísérletek eredményei azt mutatják, hogy alapvető különbségek vannak az orálisan és parenterálisan (például intravénásán) adott MBP szuppresszáló mechanizmusai között. Az eredmények arra utalnak, hogy a szájon át adott antigének elsősorban aktív szuppresszió kiváltásával hatnak, míg a parenterálisan adott antigének klonális anergia útján. Ezt a következtetést különösen jól alátámasztja, hogy az i.v.-tolerizált állatok lépsejtjei nem gátolják az adoptív transzferrel kiváltott EAE-t. Ezeket az eredményeket jól fel lehet használni az antigénkiváltott tolerancián alapuló immunszuppresszív eljárások kidolgozásakor, a találmány szerinti eljárásoknál is.

3. példa

Az emberi MBP immundomináns epitópjainak pontos azonosítása átfedő peptidek MBP-specifikus Tsejt-klónokat stimuláló hatásának mérésével Az 1. példában ismertetett sejtszaporodás-mérési módszerrel meg lehet határozni az emberi MBP immundomináns doménjének (84-102. aminosavak) megfelelő peptid T-sejt-szaporodást serkentő képességét, és azt össze lehet hasonlítani olyan peptidekkel, amelyekben az immundomináns dómén N- és C-terminális végéről egy vagy több aminosavat elhagyunk. Amint azt a 8. ábra (és az 5. táblázat) mutatja, a T-sejtvonalak szaporodnak azon N-terminális felől rövidített peptidek hatására, amelyek még tartalmazzák a 85. aminosavat; ha ezt is eltávolítjuk, a fragmens szaporodásserkentő képessége élesen csökken. A C-terminális felől eltávolítva az aminosavakat a 99. aminosavig nem változik lényegesen az epitópfunkció, azután gyorsan csökken. Ha a C-terminálisról nem hagyunk el aminosavakat, a 85. és 86. aminosavak eltávolítása sem okoz szaporodáscsökkenést a használt klón esetében, amint azt a 8. ábra mutatja. A 9. ábra szerint 4 különböző T-sejt-klónnak adunk MBP(84-102)-peptidet, valamint 85-99. és 86-97. peptideket annak tesztelésére, hogy különböző kiónok különbözőképpen reagálnak-e a különböző peptidekre. Bár az egyes kiónok epitóp peptid hatására mutatott szaporodási sebessége különböző, az adott peptid szaporodást serkentő képessége minőségileg azonos kiónról kiónra. Ezekből a kísérletekből kitetszik, hogy az emberi MBP 85-99. aminosavai alkotják a legkisebb immundomináns fragmenst, amelyik valamennyi T-sejt-klón T-sejt-aktivitását serkenti.

Az 5. táblázat összefoglalja az emberi MBP-re (84-102. peptidjére) specifikus T-sejt-klónok szaporodási készségét az MBP(84-102)-peptid és annak rövidített, illetve módosított verziói hatására. A táblázat számadatai azon peptidkoncentrációknak felelnek meg (mikromol/literben), melyek az adott klón maximális stimulációjának 50%-át eredményezik. A maximális stimuláció meghatározására a T-sejt-klónokhoz az eredeti, nem rövidített MBP(84-102)-peptidet adjuk. A félkövér számok („50” és „>50”) ötszörös vagy ennél nagyobb stimulatív kapacitásveszteséget jelölnek az eredeti MBP(84-102)-peptidhez képest.

HU 219 306 Β

5. táblázat

Rövidített peptidek relatív hatékonysága MBP(84-102)-sspecifikus T-sejt-klónok stimulációjában

	Ob.lH8	OB.l-	Ob.2G9	Ob.lC3	Ob.l-	Ob.2F3	Ob.3Dl	Hy.2-
		E10			A12			Ell
84-102	3,1	4,0	3,8	2,9	1,6	2,1	2,0	0,26
84-	2,0	3,1	3,2	2,9	1,6	1,5	2,0	0,26
102tyr
85-102	12	1,8	3,6	4,0	0,4	1,5	2,0	0,31
86-102	>50*	>50	>50	50	4,8	17	2,0	0,45
87-102				>50	>50	>50	4,2	0,80
88-102							>50	50
89-102								>50
84-100	2,2	1,8	1,2	2,2	0,65	1,9	2,5	0,08
84-99	3,1	4,0	2,1	2,3	1,6	2,1	2,2	0,26
84-97	>50	>50	>50	>50	22	22	11	25
84-96					>50	>50	50	>50

84-95 >50

50%-os stimulációt [100%: MBP(84-102)] eredményező peptidkoncentrációk (\mmol/liter). * Több mint ötszörös aktivitásvesztés az MBP(84- 102)-peptidhez képest.

4. példa

MBP(85-99)-reaktív klánok szaporodása a peptid alaninanalógjának hatására

All. ábra mutatja az egyes peptidek kötődését az

MHC-hez (bal oldali oszlop) és egy T-sejt-klónhoz (jobb oldali grafikus táblázat). A DRBl*1501 jelű transzfektált L-sejtek prezentálják az immundomináns MBP(84-102)-peptidet autoreaktív T-sejteknek. Az antigénprezentáló sejteket előzőleg az MBP(84-102)-peptiddel (0,1 mg/ml B-sejtvonalak esetében, 0,05 mg/ml a DR-transzfektánsok esetében) kezeljük, 5000 raddal besugározzuk és 3 napig tenyésztjük együtt a T-sejtekkel, majd timidinnel jelöljük. Az értékeket (³H-timidin-felvétel az eredeti pepiidhez képest) az ábrán megadott mintákkal jelöljük. Az eredmények szerint a 89. helyen lévő Val és a 92. helyen lévő Phe lényeges az MHCkötés szempontjából. A peptidrövidítési adatok arra utalnak, hogy a 95. helyen található izoleucin szintén fontos az MHC-kötéshez. A T-sejt-receptorhoz a His90, Phe91 és Lys93 aminosavak kötődnek.

A Hy.2Ell jelű T-sejt-klón akkor is szaporodik a peptid hatására, ha a 93-as Lys-t Arg-ra cseréljük, az Ob jelű T-sejt-klón nem. A DRBl*1501 és DRB5*0101 jelű sejtvonalak esetében a kötési adatokból általánosítható kötőhelyszerkezet (motif) a 10. ábrán látható. A felfelé mutató nyilak a receptorhoz való kötődést, a lefelé mutató nyilak az antigénprezentáló sejtek MHC-jéhez való kötődést mutatják.

A 88-95. pozíciókban konzervatív és nem konzervatív helyettesítéseket tartalmazó peptideket szintetizálunk. így például a negatív aszparaginsavat egy másik negatív töltésű aminosavra (glutaminsavra) lehet cserélni vagy egy olyanra, amelynek nincs töltése, de a térfogata hasonló (aszparagin), avagy ellenkező töltésűre (lizin), végül valamely kis térfogatú aminosavra, például alaninra. Körülbelül 60 pepiidet kell megszintetizálni.

Előzetes adatok szerint az MBP(143-168)-peptid legkisebb domináns epitópja a 148-162. aminosavakat tartalmazó szakasz. Ha ezen peptid magját is meghatároztuk a 2. és 3. példa szerint, a 4. példához hasonló elemzést végezhetünk.

Analóg peptidek DR26- (DRBl*1501), DR2a(DRB5*0101), DR4-, DR7- és DQ1.1-hez való kötődését vizsgáljuk. Ezek a kísérletek a továbbiakban tisztázzák, hogy mely aminosavak játszanak szerepet az MHC-hez való kötődésben. A T-sejt-receptorhoz való kötődés vizsgálatára olyan peptideket használunk, melyek az eredeti peptid kötőképességének legalább 10%-ával rendelkeznek.

HU 219 306 Β

5. példa

Módszerek

MBP-t emberi agyszövetből vonunk ki és egy CM-52 oszlopon tisztítjuk, a legnagyobb molekulatömegű csúcsot használva [Chou, F. C.-H. és munkatár- 5 sai: J. Bioi. Chem., 251, 2671 (1976)]. MBP-peptideket valamely szilárd fázisú módszerrel szintetizálunk vagy egy kereskedelmi laboratóriumtól szerzünk be (Bioresearch Láb Inc., San Raphael, CA, USA) és nagynyomású folyadékkromatográfiával (high pressure liquid chromatography, HPLC) tisztítjuk. A használandó MBP-fragmenseket a 6. táblázat tartalmazza.

6. táblázat

Emberi

MBP- Aminosav-sorrend aminosavak

Emberi

MBP- Aminosav-sorrend aminosavak

1-20:	ASQKRPSQRHGSKYLATAST.»
21-40:	MDHARHGFLPRHRDTGILDS'
41-60:	IGRFFGGDRGAPKRGSGKDS
61-82:	HHPARTAHYGS LPQKS HGRT
84-102;	DENPWHFFKNIVTPRTPP
113-132:	LSRFSWGAEGQRPGFGYGGR :
143-168:	FKGVDAQGTLSKIFKLGGRD

11-30: GSKYLATASTMDHARHGFLP 31-50: RHRDTGILDSIGRFFGGDRG 51-70: APKRGSGKDSHHPARTAHYG 71 - 92 : SLPQKSHGRTQDENPWHFF 93-112: KNIVTPRTPPPSQGKGRGLS 4-142: RPGFGYGGRASDYKSAHKG

A T-sejtek TCR VB-gén-használatát polimeráz láncreakcióval (polymerase chain reaction, PCR) határozzuk meg, egy TCR VB primerkészlet segítségével, majd Southern blottal. A T-sejt-vonalakat perifériás mononukleáris sejtekből növesztjük ki kétszeri MBPstimulációval, majd egy immundomináns emberi MBP-peptiddel (84-102.) történő stimulációval. A peptid immundomináns voltát előzőleg szaporodási tesztekben állapítjuk meg (amint azt az 1. vagy 7. példában lenjük), a 6. táblázatban közölt 13 átfedő MBP-peptid segítségével. A specifikus MBP-peptiddel történő harmadik stimuláció után az MBP-reaktív T-sejtekből (20 000-50 000 db) RNS-t vonunk ki guanidiumizotiocianát/fenol-kloroformmal és izopropanolos lecsapással, hordozó (carrier) tRNS jelenlétében. Egyláncú DNS-t oligo-dT és AMV reverz-transzkriptáz használatával szintetizálunk (mindkettő kapható kereskedelmi forgalomban a Bethesda Research Laboratoriestől, Gaithersburg, MD, USA). PCR-t (polymerase chain reaction, az amerikai egyesült államokbeli, 1989. január 24-én megadott, 4,800,159 számú, az 1987. július 28-án megadott 4,683,195 számú és az 1987. július 28-án megadott 4,683,202 számú szabadalmak szerint) végzünk egy 19 oligonukleotidból álló készlettel (melyek a publikált TCR VB-családokra specifikus 1-20-ig; lásd a 7. táblázatot), melyek a TCR-B-lánc CDR2 régiójának és egy CB-nek (B-lánc konstans régió) felelnek meg (7. táblázat) [amint azt a következő közleményekben megtaláljuk: Tlinghast, J. P. és munkatársai: Science, 233, 879 (1986); Concannon, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 6598 (1986); Kimura, N. és munkatársai: J. Exp. Med., 164, 739 (1986); Toyonaga, B. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 8624 (1985); Kimura, N. és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 17, 375 (1987)]. A reakciót 30 ciklusban végezzük (94 °C 1 perc, 55 °C 2 perc, 72 °C 3 perc), 50 mikroliter térfogatban, minden egyes primerből 1 mikrogramm felhasználásával. Az amplifikált termékeket 1% agarózgélen választjuk el, átvisszük nitrocellulózra és egy belső oligonukleotid TCR-CB próbával hibridizáljuk (7. táblázat). A próbákat előzőén a végükön jelöljük ³²P-gamma-ATP-vel és T4 polinukleotid-kinázzal (Bethesda Research Labs) 10⁸ cpm/pg aktivitásig és 6xSSC, 5xDenhardt-oldat, 0,05% pirofoszfát, 100 pg/ml denaturált DNS és 0,5% SDS elegyében hibridizáljuk 18 órán át 37 °C-on. A biotokat 6xSSC/70 °C stringency-körülmények között mossuk és 2-18 óra hosszat autoradiografáljuk. Azokat a T-sejt-vonalakat, amelyek több mint két VGszegmensre pozitívak, úgy tekintjük, mint amelyek nem egyetlen MBP-reaktív T-sejből származnak és a további elemzésből kizárjuk.

Szekvenálás céljára a cDNS-t egy VB17-primerrel (7. táblázat) amplifikáljuk, amely egy belső PstI restrikciós helyet tartalmazó leading szegmensre specifikus. Az amplifikált DNS-t proteináz K-val kezeljük, fenol/kloroformmal kirázzuk, etanollal lecsapjuk és BglII, valamint PstI restrikciós endonukleázokkal kezeljük (melyeket kereskedelmi forgalomban, például a fent említett Bethesda Research Lábtól szerezhetünk be). A gélen tisztított DNS-t M13 mpl8-ba ligáljuk, és az egyszálú DNS-t dideoximódszerrel szekvenáljuk [Sanger, F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)]. Negatív kontrollokat is beiktatunk a tel21

HU 219 306 Β jes eljárás alatt, hogy az RNS-minták és a cDNS-készítéshez, valamint az amplifikációhoz használt reagensek esetleges szennyeződését ellenőrizzük. A használandó VB-, CB- és JB2.1-primer szekvenciákat a 7. táblázat tartalmazza.

Az amplifikált és nem amplifikált mintákat külön kezeljük, a reagenseket szétosztjuk és amplifikált anyag jelenlétére teszteljük, továbbá negatív kontrollokat iktatunk a minták közé a különböző kísérleti lépésekben (RNS-izolálás, cDNS-szintézis, PCR-amplifikáció).

7. táblázat

VB 1 5' AAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAAC3'

VB2 5' GCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCG3'

VB 3 5'AAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAG3'

VB4 5 ' CTGAGGCCACATATGAGAGTGGATTTGTCA3'

VB 5 5 ' CAGAGAAACAAAGGAAACTTCCCTGGTCGA3'

VB 6 5 ’ GGGTGCGGCAGATGACTCAGGGCIGCCCAA3'

VB 7 5' ATAAATGAAAGTGTGCCAAGTCGCTTCTCA3 ’

VB 8 5' AACGTTCCGATAGA7GATTCAGGGA7GCCC3'

VB9 5' CATTATAAATGAAACAGTTCCAAATCGCTT3*'

VB10 5' CTTATTCAGAAAGCAGAAATAATCAATGAG3'

VB 11 5' TCCACAG AGAAGGG AGATCTTTCCTCTGAG3'

VB12 5 · GATACTGACAAAGGAGAAGTCTCAGATGGC3 ·

VB14 5' GTGACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGG3'

VB 15 5' GATATAAACAAAGGAG AGATCTCTGA7GGA3'

VB16 5' CATGATAATCTTTATCGACGTGTTATGGGA3'

VB17 5' TTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTAC3'

VB18 5' GATGAGTCAGGAATGCCAAAGGAACGATTT3'

VB19 5 ' CAAGAAACGGAGATGCACAAGAAGCGATTC3'

VB 2 0 5' ACCGACAGGCTGCAGGCAGGGGCCTCCAGC3 '

CB 5 * GGCAGACAGGACCCTTGCTGGTAGGACAC3'

C - probe 5 * TTCTGATGGCTCAAACACAGCGACCTCGGG3' VB17 - Leader 5' AGCAACCAGGTGCTCTGCAGTG7GGTCCIT3 · JB2.1 S'CCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATTGTAGGAX’

6. példa

MS-ben szenvedő betegekből kinyert T-sejtek

VB-gén-használatának azonosítása A fent leírt megközelítés helyességének ellenőrzésére két kísérletsorozatot kell elvégeznünk. Először is kimutatjuk, hogy a 7. táblázatban felsorolt primerek a VB20 kivételével képesek perifériás T-sejtek cDNSének amplifikációjára (12. ábra). Másodsorban a PCRamplifikáció specificitását vizsgáljuk nagyobb számú (esetünkben 69), független, mitogénnel (például fitohaemagglutinin, PHA és interleukin-2) kinövesztett, majd egysejtes állapotig klónozott T-sejt-klón VG-gén-használatának elemzésével. Az ezen módszerrel elérhető magas klónozási aránynak köszönhetően az ilyen kiónok hűen reprezentálják a perifériás T-sejtek VBgén-használatát. Tipikusan például a 69 klónból 65-nél (94,2%) sikerül meghatározni a TCR VG-gén-használatot, ami arra utal, hogy az alkalmazott VB-primerek a TCR VB-készlet nagy részét lefedik. Míg adott esetben ezen kiónokból 58 (84%) pozitív egyetlen VBre, 7 klón (10,1%) kettős pozitív, alighanem két átrendezett és expresszált TCR VB-gén jelenléte miatt.

A TCR VB-gén-használatot ezután például öt, klinikailag definiált, relapszáló-remittáló MS-betegből származó, adott esetben például hatvanöt MB-specifikus klón esetében elemezzük. Reprezentatív Southem-blotokat a 12. ábra mutat, az összes sejtvonal VB-gén-használatának elemzését a 8. táblázat tartalmazza.

HU 219 306 Β

8. táblázat

Az MBP (84-102)-peptiddel reagáló T-sejt-vonalak Szklerózis multiplex

Sej.tvonal	TCR VB	Sejtvonal ^CR VB	„ . - TCR VB Sejtvonal
Patient 1	(DR2.DR7)	HY.2C12 VB17,VB1	Cy.2C2 VB12
HY.1B12	VB 17	Hy.2E2 VB17.VB1	Cy.3F6 VB12
Hy.lG9	VB17	Hy.2Ell VB17,VB2	Cy.4Cl VB12
Hy.lH7	VB17	Hy.3All VB17,VB2
Patient 3	(DR2.DR4)
Hy.2C9	VB 17	Hy.2C8 VB17.VB11	NS.2A5 VB1
Hy.2E4	VB17	Hy.3B7 VB4	NS.2C10
VB3,VB14		a
Hy.2E6	VB17	Hy.3C3 VB4	NS.2D11
VB5,VB7		•
Hy.2F10	VB17	Hy.3C6 VB4	Na.lGll
VB12,VB17
Hy.2G5	VB 17	Hy.2Fll VB7	NS.2E2
VB12.VB17
Hy.2Gll	VB17	Hy.3Bl2 VB7
Patient 4	(DR2.DR71
Hy.3A8	VB 17	Hy.lH3 VB14	Fn.lM7 VB 4
Hy.3A10	VB 17	Hy.2B2 VB14	Fn.3E17
VB3,VB5
Hy.3B9	VB 17	Hy.2H9 VB14	Fn.lE6
VB6,VB8
Hy.3C7	VB17		Fn.lGő VB17
Hy.3G10	VB17	Patient 2 (DR2.DRwll)
Patient 5	(DR3.DR4)
Hy.3F6	VB17	Cy.2Hll VB1,VB7	Tw.lBll VB12
Hy.3F7	VB17	Cy.3D2 VB1,VB7	TW.2F3
VB12,VB17
Hy.3F10	VB 17	Cy.2C6 VB2	Tw.ElO VB17
Hy.lAB	VB17	Cy.2G5 VB17	TW.2E2 VB14

Kontrollok

Sej tvonal	TCR VB	Sejtvonal	TCfc Sejtvonal *	rCR VB
Control 1	(DR2.DR4)	Control 2	(DR2) Control 4	(DR7,
DRwll)
Rt.lA9	VB17	Hr.lB7	VB12 AQ.3B1
VB1,VB8
Rt.3Cl	VB17	Hr.lC9	VBS ΑΠ.3Η3	VB8
Rt.3Gll	VB 17	Control 3	JU2B2I An.3C12	VB2
Rt.3A3	VB17, VB14	Md.2A4	VB6,VB8 Control 5
(DR1.DR9)

HU 219 306 Β

8. táblázat (folytatás)

Az MBP( 143-168 )-peptiddel reagáló T-sejt-vonalak

Szklerózis multiplex

Sejtvonal	TCR VB	Sejtvonal	TCR VB
Pacient 2	(DR2. DRwll)	Pacient 3	(DR2. DR4)
Cy.lEő	VB14	NS.2D6	VB 3
Cy.2B12	VB14	Pacient .4	(DR2. DR.7)
Cy.2E2	VB 14	Fn.lH5	VB4
Cy.3G10	VB14	Fn.2A10	VB4
Cy.3H10	VB14,VB8	Fn.2A5	VB2
Cy.4C10	VB14,VB17	Patient 5	(DR3. DR4)
Cy.lC12	VB12	Tw.2C9	VB12
Cy.lE9	VB7
Cy.3F9	VB1

Kontrollok

, TCR VB bejtvonal	Sej tvonal	TCR VB
Control 3 (DR2)	Control 6	(DR1, DR71
ΗΓ.2Ε10 VB3, VB5	Bn.2Gl	VB12
Hr.3E9 VB7	Bn.3D6	VB12
	Bn.3C10	VB5,VB8

Tipikusan 51 sejtvonal reagál az MBP 84-102-vel, míg 14 T-sejt-vonal reagál az MBP(143-168)-peptiddel. A Hy jelű betegből (a 8. táblázatban az 1. beteg) származó, MBP(84-102)-peptiddel reagáló 31 sejtvonalat elemezve azok 74%-a használja a VB17-génsza- 40 kaszt, míg más nyolc sejtvonal a VB2-, VB7- vagy a VB14-génszakaszokat használja. Ennek alapján a VB17-et fő felismerőelemnek tartjuk az ezen MS-betegből nyert, az MBP(84-102)-peptidjével reagáló Tsejt-vonalak esetében. Másik négy betegből (a 8. táblá- 45 zatban 2-5. betegek) származó 20 T-sejt-vonalból jellemzően 6 használja a VB17-et. Az ezen négy betegből származó MBP-reaktív T-sejt-klónok által használt második TCR VB a VB12, amelyet jelen esetben a húszból 7-nél találunk meg. 50

A Hy jelű betegből származó 4 T-sejt-klónban található VB-szekvencia 100%-ban homológ a publikált VB17-szekvenciával [Kimura, N. és munkatársai:

Eur. J. Immunoi., 17, 375 (1987)]. Ennek alapján állítható, hogy valóban specifikus VB-szakaszokat amplifi- 55 kálunk. A VDJ-szekvencia (diversy-junctional, diverzitáskapcsolódó szakasz) elemzése megmutatja, hogy mind a négy T-sejt-klón ugyanazon JB2.1-szakaszt használja, és háromnegyedük ugyanazon VDJ-szekvenciát használja (7. táblázat). Annak megállapítására, 60 hogy a VB17+ T-sejtek milyen gyakran használják a JB2.1 szakaszt, példának okáért a Hy jelű betegből nyert 20, MBP-specifikus T-sejt-klónból származó DNS-t amplifikáljuk a VB17-primerkészlettel és egy CB- vagy JB2.1-primerrel (13. ábra). Mindezen sejtvonalak pozitívak a VB 17-re és a JB2.1-re is, míg a negatív kontrollok (az összes sejtvonalból kivett, cDNS-sé nem konvertált RNS, és a cDNS-szintézishez, nemkülönben az amplifikációhoz használt reagensek) negatívak PCR és Southem-blot alapján. Ezek az adatok a Hy jelű betegből származó, MBP(84-102)-reaktív Tsejt-vonalakban fellépő erős szelekciót mutatnak, mely a VB17-JB2.1-szekvenciák használatát eredményezi.

Más betegekből, jelen esetben az Fn és Ns jelűekből származó két további MBP(84-102)-specifikus, PCR alapján VB17-et használó T-sejt-vonal cDNS-ét szekvenáljuk és hasonlítjuk a Hy jelű beteg adataihoz (8. táblázat). Bár a VB17-szekvenciák azonosak az MBP(84-102)-reaktív T-sejtek esetében, különböző JB-szekvenciákat találunk. Ezen eredmények szerint egy adott immundomináns epitópot felismerő T-sejtek ugyanazon VB-gént használják az egyéntől függetlenül. Ezzel szemben a JB-gén használata az egy adott egyéntől származó T-sejtek esetében azonos, de külön24

HU 219 306 Β böző egyének T-sejtjei különböző JB-szakaszokat használnak.

Tipikusan öt beteg közül négy pozitív a betegséggel összefüggést mutató DR2-allélre, esetünkben az ötödik (Tw) HLA-DR3, DR4. Ennek ellenére az ezen betegből származó 4 sejtvonalból három a VB12/VB17-gént használja (8. táblázat), ami arra utal, hogy nem szükséges ugyanazon II. osztályú MHC-antigének jelenléte az azonos TCR VB-használathoz az MBP(84-102)-peptid felismerése vonatkozásában.

7. példa

Az emberi MBP fő immundomináns régiójának azonosítása

Egy gyors T-sejt-klónozó módszert használunk an- 15 nak vizsgálatára, hogy vannak-e immundomináns epitópok az MBP-n, melyek a II. osztályú MHC-fenotípusokkal reagálnak, és ezen reaktivitás gyakoriságának mérésére. Esetünkben 15 824 rövid élettartamú T-sejtvonalat generáltunk 51 vizsgálati személyből. Perifériás mononukleáris vérsejteket tenyésztünk tisztított MBP-vel (0,1 mg, a tisztítást lásd az 1. példában).

A harmadik napon, majd később 3-4 naponként interleukín-2-t (IL-2, ABT, Columbia, MD, USA) és 2 egység rekombináns interleukin-4-et (IL-4, Genzyme, Boston, MA, USA) adunk a tenyészetekhez. A tenyésztés 13. napján minden egyes vonalból vett 5 mintákat teszteljük MBP-reaktivitásra az emberi MBP aminosavsorrendjét lefedő, átfedő 20 tagú peptidekkel teszteljük az előbbi 6. táblázat szerint. MHC-korlátozási kísérletek céljából valamely MBP-peptiddel reagáló vonalakat két további ciklusban stimulálunk, elő10 szőr MBP-vel, majd a vonal által felismert specifikus MBP-ffagmenssel. A betegek egy részében a proteolipid proteint (PLP, egy másik fontos központi idegrendszeri antigén) felismerő T-sejtek gyakoriságát is meghatározzuk.

Az MBP- és PLP-reaktív sejtek arányát határozott, relapszáló-remittáló MS-ben szenvedő betegekből (akiket MRI-vel, azaz mágneses rezonancia-képalkotással és klinikai vizsgálatokkal diagnosztizáltak), más neurológiai betegségekben szenvedőkből és egészséges egyénekből (akik az MS-betegekéhez hasonló kor és nem szerinti eloszlást mutatnak) származó sejtvonalakkal végezzük. Az esetünkben kapott tipikus eredményeket az alábbi, 8A. táblázat tartalmazza.

8A. táblázat

MSn=23	KOR 34,211,4	NEM (F/N)	MHC DR 4 26,1	% DR wll 13,0	DQ wll 78.2	Reaktív vonalak MBP 554/7746	/összes száma PLP 20/432	Reaktív átlagos MBP 7,1812,38	vonalak gyakorisága PLP I 3,3411.56
35/65	DR 2 60,9
Mis neurológiai	38,713,2	43/57	14,3	0,0	42,9	85,7	118/2880	3/384	4,1011,04	0,9010,62
betegség n= 10
Egészséges	30,3±1.5	50/50	16,7	0,0	50,0	66,6	73/1742		4,7011,58
n=6
DR2+ kontrollok	32,012,9	50/50	100	16,7	0,0	100	53/1728		3,0812,06

Az MS-betegek esetünkben fehérek voltak és jól jellemzett relapszáló-remittáló betegségben szenvedtek 50 legalább két exacerbációval az előző 24 hónapban, valamint MRI-vel látható pozitív léziókkal a vérvétel időpontjában. Az egyéb neurológiai betegségekben szenvedőknél a jelen esetben a vérvétel előtt 1-3 héttel a következő diagnózisokat állapították meg: cerebrovasz- 55 kuláris esemény (n=4), vérzéses agysérülés (n=4) vagy áttételes agytumor (n=2). Az egyes betegcsoportokból generált T-sejt-vonalak számát és az ezekből MBP- vagy PLP-reaktívak számát a 2. táblázat mutatja. Emellett minden egyes egyénre kiszámítjuk az MBP- 60 reaktív, illetve PLP-reaktív sejtvonalak arányát úgy, hogy az MBP/PLP-reaktív sejtvonalak számát elosztjuk az adott személyből nyert összes sejtvonal számával, és megadjuk az átlagokat, valamint az átlag hibáját (standard error of the mean, SEM).

Míg az MBP összes fragmensével reagáló vonalak gyakorisága valamivel magasabb az MS-ben szenvedő egyéneknél, mint a többieknél, a különbség esetünkben nem szignifikáns. Az MS-betegek esetében több PLPreaktív sejtvonalat nyerünk, mint az egyéb betegek esetében, de ez a különbség sem szignifikáns statisztikailag.

HU 219 306 Β

Az MS-betegekből nyert, esetünkben összesen 302 sejtvonal közül, amelyeket sikerült kinöveszteni és ismételten MBP-reaktívnak bizonyulnak, 140 (46,4%) reagál az MBP(84-102)-peptiddel; körülbelül 70-80% reagál az MBP(84-102)- és az MBP(143-168)-pepti- 5 dek valamelyikével. A kontrollcsoportokban az összesen 100 MBP-reaktív vonalból ezen konkrét esetben 11 (11%) ismeri fel az MBP(84-102)-peptidet. Minden egyes egyénre kiszámítjuk az MBP-reaktív, illetve PLP-reaktív sejtek arányát; ezek átlagát a 8A. táblázat 10 jobbról második oszlopa mutatja.

Három párhuzamos tenyészetben egyenként 50 000 T-sejtet tenyésztünk 50 000 besugárzott APCvel (MNC, mononukleáris sejtek) [Hafler, D. A. és munkatársai: J. Exp. Med., 167,1313 (1988)] 72 óráig göm- 15 bölyű aljú, 96 mérőhelyes mikrotitertálcán, majd ³Htimidinnel jelöljük legalább 18 óráig. Az MNC-APCsejteket magukban vagy 100 mikrogramm/ml szintetikus MBP(84-102)-peptiddel (ez az optimális szaporodásserkentő koncentráció) vagy 100 mikrogramm/ml 20 teljes MBP-vel tartjuk. A három párhuzamos tenyészet átlagos cpm-értékeit a 9. táblázat tartalmazza, csakúgy, mint a DR és DQw haplotípusokat. A legfelső sorban található, DR2+, DR7+, DQwl+, DQw3+ beteggel azonos haplotípusokat aláhúzás jelöli. 25

Különböző mononukleáris sejtek (MNC) és antigénprezentáló sejtek (APC) használatával nyert T-sejtszaporodási értékeket mutatunk be. A Hy jelű betegből származó, az MBP 84-102-vel reagáló 5 T-sejt-vonalat tovább szaporítunk analóg, besugárzott, szintetikus 30 MBP 84-102-vel előkezelt MNC-vel történő ismételt stimulálásokkal, majd az MBP ezen régiójára vonatkozó felismerőképességüket elemezzük.

Ehhez az MBP 84-102-vel reagáló 5 T-sejt-vonalat autológ MNC-APC-vel tálcán tenyésztjük a fentiek 35 szerint, különböző II. osztályú MHC-géntermékeket (antigéneket) felismerő monoklonális ellenanyagok 1:100-as véghígításának jelenlétében. (Az ellenanyagok nevezéktana a 10. Nemzetközi Hisztokompatibilitási „Workshoptól” származik; az ellenanyagok spéci- 40 ficitását szintén megadjuk.) Az eredményeket a 10. táblázat mutatja.

I

			Peptid 84-102	1 24,411 \|	KO CM	VT Os	¹⁰⁰ 1	f 31,121	ko CT	2,744 \|
										tT
		01V	cu Cfl 2	3	oo	Os		R	Os	ομ_λ ί—Ή
				CM		CT	CM,
						c-
			u	Os		KO	CT	CM	CT	C-
			<	cr	CM	o	CM	Tf	CT	κο
					CT				Os
			>tid 102	τη			CT
						Γ-
						Os
				c	oo	CT	i—l	KO	OS	C-
			cu ’d-		VT	KO			00	Os
			00		KO	CM			CM
		Os	cu	Sj
		X cm	CQ s	c4	C~-	OO	CM		©	OO
			CM	VT	©	VT	O	VT
					cr	CM	tT
			υ	σ\	KO	KO	Os	os
			O-	so	cr	CM	kO	rf	ko	VT
			<		ko	CM	c-		CM
* § o			’eptid 4-102	i	9,399		Os	CM	\|	CT
		00			OO	CT	Tt		CT
>
•w					Os
'JP		—’	cu		CT
Vi 1		2E1	CQ Σ	□	2,9		OO	OO		VT
				VT	s©	Os	V)	vt\|	CM
Ό N

C3
“Λ			u	00	Γ	Γ*-	r-H	KO	00	Tt
		Cl.		—H	cr	©	CT	r-	CT
N Vi			<		CM



SÍI			•e O
<1>			Os
			o. T		CM	CM	©	©	CT	OS
			cu			xt		00	Tj-	VT
‘3			oo		rH		1—t			CM
O
··—s
				ci
K		Os	cu
<		U CM	CO 2		OO c-	VT VT	44	VT CM	Os CT	24
										P*
			υ	cr	CM	VT	CT	00	CT	r-
			<	oo	00	Tj*	tT	VT		VT
			3 ©	c~ ’st				31
			o. 7	r-
				c	CM	cn	CM	Os	r-	Tt·
			** oc		CT	VT	VT			VT
			cu	a				q
		<	CQ					N
			2	-4	K©	k©	CM		©	Os
					VT	CM	CT		’d*	CT
			ü	CM	CT	CM	KO	VT	00
			<	cr	OO	CT	TT	CT	CT	-4-
		υ	s	cr		CT		CM	CM	r-
		o, <	& o		i—1	cm	CM		i—l	cm

	jx
	o
	c
	£							©
	ö		oi						Γ-;	£
	X		Q	CM	CM	TT	CT	C)	CM
	2

xxx=az antigénprezentáló sejtek MHC-fenotípusa.

HU 219 306 Β

I •ο

β) irt β

C

Ο >

ι

Φ

0)

I

Ε-ι

Ό

Ν «

ε '«β

Ν

W ιο bD

Φ

XJ

Φ :3 irt φ

•ι—)

I <

«0 <

Ο rt «

«*» σι

Β d

Μ d

σι

U d

σι rt rt	24,411	27,363
o	σι	10
in	tn	in
	10	rt
	*	w
	β	β
σι	m	rt
rt	d	rt
	rt	rt
	•	*
	rt
rt	rt	d
©	σι	d
	σι	rt
	*	*
	*	in
	rt	rt
d	t*	m
rt	*	c·
	P*	rt
	*	*
	©	rM
	rt	H
		CQ
		<
	irt	ε
APC	nélkü	troli
csak	mAB	kon

ΟΟ <Μ

ΟΗ» ιη «-< ιο (Μ d d d 10 d Μ Ο\ rlNtf <η d <

φ <B Ο tn « rt <N σι in σι «-t

Ο Ρ· rl

CD

J

Λ rt rt V · d σ· •A ►3in \o r+ W> σι m

'<a

XJ

M-i •rt

Ü

Φ

CX ra t

CQ

0£ a

XJ c

(0 <*« o «-· * σι r·· < © » « » in rt rt rt β * 10 t* «9· 10 10 « * » in f- i* d rt tn o t* m rt O d « » * d rt d μ· d * « * na ♦ σι » · » rt rt v rt öl β tn ® n CO rH d

Cl o

rt

Φ

J

Cl * m o ci

XJ c

<e σι <s

P- rt rt d

σι *

in r* rt σι o

P* rt d

rt

P*

CQ

CX

Q

I •rt

XJ c

flj tn rt

CX

O ♦

0i

Q

I •rt

XJ

C

AJ

HU 219 306 Β

Az MBP-specifíkus sejtvonalak gyakorisága az egészségesek és az egyéb neurológiai betegségekben szenvedők esetében gyakorlatilag azonos, ezért elemzés céljára az adatokat összevonhatjuk. Az MS-ben szenvedőkből származó T-sejt-vonalak között az MBP(84-102)-pep- 5 tiddel szelektíven reagálók aránya magasabb, mint a kontrollcsoportok esetében (1. ábra). Az MBP 61-82- és 124-142-peptidekkel szembeni reaktivitás esetében szintén szignifikáns, de kevésbé szembeszökő eltérés figyelhető meg. Az MBP(143-168)-peptiddel reagáló T-sejt- 10 vonalak aránya mind az MS-betegek, mind a kontrollok esetében magas. A DR2 DQwl haplotípus nagyon ritka a kontrolokban, de gyakoribb az MS-betegekben (9. táblázat). A DR2 fenotípus és az MBP 84- 102-vel reagáló Tsejtek aránya és gyakorisága között összefüggés figyelhe- 15 tő meg (14. ábra).

Annak megállapítására, hogy az MBP(84-102)-re vonatkozó T-sejt-reaktivitás kötődik-e a DR2,DQwlexpresszióhoz a nem MS-es egyénekben, további például 6 egészséges egyén DR2,DQwl fenotípusát vizs- 20 gáljuk. A jellemző eredményeket a 14. ábra szemlélteti.

Az MBP 84-102-vel reagáló T-sejtek aránya és a DR2 közötti asszociációt a kontroliokban is megfigyelhetjük (DR2+ kontrollok: 31,0± 10,8%; DR2—ak: 10,0±0,4%), bár az ezen régióval reagáló T-sejt-vonalak aránya kisebb ebben a csoportban, mint az MSbetegeknél (14. ábra). Bár a DQwl „linkage dissociation”-ben van a DR2-vel, valamint a DRl-gyel és a DRwlO-zel is, a peptidreaktivitás elemzése nem vezet a DQwl fenotípussal való asszociáció kimutatásához.

A DRwl 1 fenotípus gyakoribb a kontrollokban, mint az MS-betegekben (8A. táblázat). A DRwll pozitívan asszociált az MBP 142-168. peptidjével reagáló T-sejtvonalak gyakoriságával, de nem az MBP(84-102)-peptidjével reagáló T-sejt-vonalak gyakoriságával (13. ábra). Az MBP 31-50. peptidjével szemben mutatott reaktivitás, melyet elsősorban a kontrollszemélyeknél figyelhetünk meg, a DRwl 1-gyel asszociációt mutat. Más MHCasszociációt nem figyeltünk meg.

Az MHC és az egyes T-sejt-vonalak specifitása közötti összefüggést is tanulmányozzuk. Közelebbről meghatározzuk, hogy az egyes MHC-haplotípusok alkalmasak-e az antigénprezentációra az MBP immundomináns epitópjaival reagáló T-sejt-vonalak esetében. Az eredményeket az alábbi, 11. táblázat tartalmazza.

11. táblázat

Beteg

DR2

DQwl £1

DR4

DRw53

DQw3

P2

DR2

DQwl

SÍ

DR4

DRw53

DQw3

S2

DR4

DRw53

DQw3

S3

DR2

DQwl

DRwll

DRw52

DQwl

DRwll

DRw52

DQwl

DRw6

DRw52

DQwl

DRw6

DRw52

DQwl

DRw6

DRw52

DQwl

DRw4

DRw53

DQw3

MBP

84-102

143-168

A DR2+, DRwll+ beteg mindkét MBP-peptidre (84-102 és 143-168) reagáló T-sejtek magas gyakoriságát mutatja. A beteg DRwll+ szülőjének (Pl) T- 50 sejtjei elsősorban az MBP(143-168)-peptidet ismerik fel, míg a DR2+ szülő (P2) T-sejtjei elsősorban az MBP(84-102)-peptiddel reagálnak. A reaktív T-sejtvonalak gyakorisága azonban alacsonyabb, mint a betegnél. A beteg egyik testvére DR2+, T-sejtjei elsősor- 55 bán az MBP(84-102)-peptiddel reagálnak. A két HLA-azonos (DR4, DQw3/DRw6, DQwl) testvér közül az egyik T-sejtjei felismerik az MBP(84-102)-peptidet, a másiké nem. Bár a DQwl korlátozhatja az MBP(84-102)-peptid felismerését, egyéb tényezők, 60 mint például az örökletes TCR-polimorfizmus befolyásolhatják az egyik DR4,DQw3/DRw6,DQwl fenotípusú testvér MBP-autoantigénnel szembeni reaktivitását. Ennek a családi linkage-analízisnek az eredményei arra utalnak, hogy az immundomináns MBP-epitópok optimális felismeréséhez specifikus II. osztályú MHCallélek szükségesek mind az MS-betegekben, mind a kontrollokban. Összefoglalva ezek a kísérletek arra utalnak, hogy bár a DR2+ kontrollegyének T-sejtjei elsősorban ugyanazon MBP-determinánsokat ismerik fel, mint a DR2+ MS-betegek, az MBP-epitópokkal reagáló T-sejtek gyakorisága vérükben kisebb, mint a betegekében.

HU 219 306 Β

7A. példa

A VB 17 TCR szekvenálása

Hat klónozott, az MBP(84-102)-peptiddel reagáló, a Hy, Fr és Ns jelű betegekből származó T-sejt-vonal TCR VB 17 PCR-termékeit megszekvenciáljuk a dideoximódszerrel, amint azt az 5. példa ismerteti.

A DNS-mintákat a VB17-leaderszekvenciára és a TCR CB-régióra specifikus primerekkel amplifikáljuk az 5. példa szerint. Az amplifikált DNS-t Ml3-ba klónozzuk, és a jól ismert dideoximódszerrel szekvenáljuk (3 M13-plakkot T-sejt-vonalanként). Az eredményeket az alábbi, 12. táblázat ismerteti.

12. táblázat

	VB	DB	JB
Hy.lAS	T yrLeuCysAlaSerSer TATCTCTCTRCCCACTACT	ThrAspTrpSer ACTGACTGGAGC	SerTyrAsnGtuGlnPhe TCCTACAATGAGCAGTTC	VB17-JB2.1
Hy.2C9	TyrLeuCysAlaSarSer TATCTCTGTGCCAGTAGT	ThrAspTrpSer ACTGACTGGAGC	SerTyrAsnGluGtnPha TCCTACAATGAGCAGTTC	VB17-JB2.1
Hy.3AlO	TyrleuCysAlaSerSer TATCTCTGTGCCAGTAGT	ThrAspTrpSer ACTGACTGGAGC	SerTyrAspGluGlnPhe TCCTACAATGAGCAGTTC	VB17-JB2.1
Hy.2C8	TyrLtuCysAleSerArg TATCTCTGTGCCAGTAGG	ThrSarGly ACTAGCCGGC	SerTyrAsnGluGtnPha TCCTACAACGAGCAGTTC	VB17-JB2.1
Fn.1G6	TyrleuCysAlaSarSer TATCTCTGTGCCAGTAGT	IleProPro ATCCCTCCA	SerTyrGluGtnTyrPhe TCCTACGAGCAGTACTTC	VB17-JB2.7
MS.1C11	TyrlauCysA l aSarSar TATCTETGTGCCAGTAGT	AlsAspArg GEGGACAGG	AspGtnProGlnHisPhe GATCAGCCCCAGCATTTT	VB17-JB1.5

Megjegyzendő, hogy a Hy jelű betegből származó mind a 4 T-sejt-klónban található VB17-szekvencia 100%-ban homológ a publikált VB17-szekvenciával.

Az alábbiakban ismertetjük az aminosavak hárombetűs és egybetűs jelöléseinek megfeleléseit a táblázatok könnyebb használata céljából.

Aszparaginsav (Asp, D)

Glutaminsav (Glu, E)

Lizin (Lys, K)

Arginin (Arg, R)

Hisztidin (His, H)

Tirozin (Tyr, Y)

Cisztein (Cys, C)

Aszparagin (Asn, N)

Glutamin (Gin, Q)

Szerin (Ser, S)

Treonin (Thr, T)

Glicin (Gly, G)

Alanin (Alá, A)

Valin (Val, V)

Leucin (Leu, L)

Izoleucin (He, I)

Metionin (Met, M)

Prolin (Pro, P)

Fenil-alanin (Phe, F)

Triptofán (Trp, W)

8. példa

Az alábbi példában a következő anyagokat és módszereket használjuk:

MBP-reaktív T-sejt-klónok előállítása. Mielin bázi60 kus fehérje (MBP)-reaktív T-sejt-vonalakat és -kló29

HU 219 306 Β nokat korábban közölt módszerek szerint állítunk elő [5]. MBP(84-102)-reaktív T-sejt-vonalakból ki ónokat limitált hígítással készítünk (0,3 sejt/mérőhely) 96 mérőhelyes, V aljú mikrotitertálcákon (Costar, Cambridge, MA, USA), pg/ml PHA.P (Wellcome Diagnostics, Beckenham, UK) és 10⁵ besugárzott allogén PBMC jelenlétében, sejttenyésztő közegként RPMI 1640-t (Walkersville, MD, USA) használva, amihez 10% összeöntött emberi AB-savót (pooled humán serum, PHS), 4 mmol/liter glutamint (GIBCO, Grand Island, NY, USA), 10 mmol/liter HEPES-puffert (Whittaker), 100 pg/ml penicillint és streptomicint (GIBCO), 5% IL-2-t (Humán T stim, Collaborative, Research, Bedford, MA, USA) és 1 pg/ml rIL-4-et (Genetics Institute, Cambridge, MA, USA) adunk. A kiónokat 8-12 naponként restimuláljuk 10⁴/mérőhely töménységben, 96 mérőhelyes, gömbölyű aljú mikrotiter-tálcákon (Costar), váltakozva 40 pmol/liter 84-102-vel előkezelt, besugárzott autológ PBMC-vel és PHA/allogén PBMC-vel (peripheral blood mononuclear cells, perifériás vér mononukleáris sejtek). Az itt tárgyalandó kísérletekhez a T-sejt-klónokat mindig ugyanazon fagyasztásból felvéve stimuláljuk, hogy a hosszú ideig tenyésztett klón esetleges változásait (drift) elkerüljük. A T-sejteket 90% FCS/10% DMSOban fagyasztjuk folyékony nitrogénben.

Az MBP(84-102)-peptid. Az MBP(84-102)-peptidet, melynek szekvenciája DENPVVHFFKNIVTPRTPP, szilárd fázisú szintessel állítjuk elő (például Bioresearch Láb., Inc., San Raphael, CA) és korábban közölt módszer [5] szerint HPLC-vel tisztítjuk.

Sejtvonalak. A korábban kifejlesztett EBV-transzformált sejtvonalakat [esetünkben 9010 (DR2w2,DQl) és 9009 (DR2w21,DQl)] 10% FCS-t tartalmazó teljes tápfolyadékban tartjuk, majd a fent leírtak szerint fagyasztjuk és csak közvetlenül az antigénkezelés előtt olvasztjuk fel. A DR2a-val transzfektált egér L-sejt-vonalat (R. Sekaly ajándéka) DMEM (Whittaker) tápfolyadékban tartjuk a következő kiegészítőkkel: 10% FCS (Whittaker), 1,6 mmol/liter xantin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 110 pmol/liter hipoxantin (Sigma), 18 pmol/liter mikofenolsav (GIBCO); a fentiek szerint fagyasztjuk és csak közvetlenül az antigénkezelés előtt olvasztjuk fel. A HT-2 nevű egér IL-2-fuggő sejtvonalat (ATCC) 10% FCS-t tartalmazó komplett tápfolyadékban tartjuk 5% IL-2-vel, és az utolsó etetést követően két nappal használjuk az IL-2 mérésére.

Monoklonális ellenanyagok (MoAb). Az itt felhasznált monoklonális ellenanyagok a következők: CD3specifikus: OKT3 és 2AD2; CD2-specifikus: Tll₂ és Tll₃; HLA-DR-specifikus: L243; HLA-DQ-specifikus: S3/4; HLA-DP-specifikus: B7/21; CD28-specifikus: 9,3 (J. Ledbetter ajándéka); CD45RA-specifíkus: 2H4; CD45RO-specifikus: UCHL-1 (Dakopatts, Glostrup, Denmark); LFA-3 és LFA-1; és CD25specifikus: Tac.

Szaporodási teszt. A T-sejt-klónokat három párhuzamosban (10⁵ sejt/mérőhely) 96 gömölyű aljú mérőhellyel rendelkező tálcára (Costar) tesszük, és az ábraaláírásoknak megfelelő stimulálóanyagok jelenlétében tenyésztjük 72 óráig 37 °C-on, 90% páratartalom és 5% CO₂ jelenlétében. A sejtekhez 2 pCi [³H]TdR-t (2 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA) adunk legalább 18 óra időtartamra. APC-ként (antigénprezentáló sejt) Epstein-Barr-virustranszformált emberi B-sejteket vagy L-sejteket használunk úgy, hogy 1 χ 10⁶/ml-t teljes tápfolyadékban 40 pmol/liter MBP 84-102-vel 2 óráig 37 °C-on tartunk, kétszer mossuk Hanks-féle sóoldatban (Whittaker), majd 4 °C-on 5000 raddal besugározzuk őket. A T-sejteket APC nélkül is stimuláljuk úgy, hogy 2 pmol/liter MBP-peptidet vagy 10³ p/ml rIL-2-t (Hoffman LaRoche, Nutley, NJ) adunk közvetlenül a T-sejtekhez a tenyésztés időtartamára.

A T-sejtek áramlási citometriás vizsgálata. A megfelelő monoklonális ellenanyagból (aszcitesz) 1:100-as hígítást készítünk PBS/2% PHS-ben, és ezzel jelöljük a T-sejteket 10⁶/ml koncentrációban 30 percig 4 °C-on. A sejteket kétszer mossuk 4 °C-os festőközeggel, majd FITC-jelzett, kecskében termelt anti-egér-Ig (Tago, Burlinganie, CA, USA) 1/60-as hígításával festjük 30 percig 4 °C-on. A sejteket a fentiek szerint kétszer mossuk, majd 1% formaldehiddel (J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ, USA) rögzítjük. Az áramlási citométer-vizsgálatokat egy Epics C áramlási citométerrel végezzük (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA).

B7-transzfekció. 50 pg, KpnI-gyel linearizált B7-pCDM8-konstrukciót transzfektálunk együtt 5 pg, Pvul-linearizált POP.F-fel L-tk—sejtekbe vagy DR2+ L-tk—sejtekbe (amelyeket előzőén transzfektálunk DR2-vel) elektroporézis használatával, BRL-elektroporátorral 250 V és 1600 mF beállítások mellett. A POP.F-plazmidban herpes simplex-vírus timidinkináz-génje van az SV40-promoter kontrollja alatt [23]. A DR2-B7⁺-transzfektánsokat hipoxantin-aminopterin-timidin-tartalmú tápközegben (Sigma) történő tenyésztéssel szelektáljuk, majd klónozzuk. A DR2+B7+transzfektánsokat hipoxantin-aminopterin-timidintartalmú, 150 pg/ml G418-szulfátot (GIBCO) is tartalmazó tápközegben történő tenyésztéssel szelektáljuk, majd klónozzuk. A felszínükön B7-et expresszáló kiónokat (amint azt anti-B7 monoklonális ellenanyaggal végzett indirekt immunfluoreszcenciával megállapítjuk) újraklónozzuk.

A sejten belüli Ca²⁺-koncentráció, [Ca²*], mérése. Amint azt előzőleg leírtuk [22], a T-sejt-klónokat (0,2-l,0xl0⁷ sejt/ml) 2 pg/ml Indo-l-gyel (Sigma) töltjük meg tápfolyadékban, 37 °C-on, 45 percig. Az Indo-val töltött sejteket tápfolyadékkal 1/10 arányban meghígítjuk, majd 4 °C-on tartjuk a FACS-analízisig. A stimulátor-APC-ket előkezeljük vagy nem 40 pmol/liter 84-102-vel, kétszer mossuk és tápfolyadékban reszuszpendáljuk. A még nem stimulált, Indoval töltött T-sejtek fluoreszcenciáját 30 másodpercig mérjük a stimulus hozzáadása előtt. Sejtes stimuláláshoz a stimuláló APC-ket és az Indo-val töltött válaszoló sejteket 30 percig mérjük, majd kivesszük az áramlási citométerből és 1 percig centrifugáljuk, hogy a sejtsejt kapcsolatok létrejöhessenek. Az Indo-1 töltés po30

HU 219 306 Β zitív kontrolljaként ionomicint (Sigma) használunk 100 pg/ml koncentrációban.

Citokin-mRNS észlelése Northern-módszerrel. Az Ob.lA12,8 jelű T-sejt-klón sejtjeit 10⁵/mérőhely koncentrációban, 96 gömbölyű aljú mérőhellyel rendelkező mikrotitertálcán IL-2/IL-4-gyel kiegészített tápfolyadékban tenyésztjük 2 pmol/liter MBP(84-102)peptiddel vagy anélkül, 48 óráig. A sejteket mossuk és teljes tápfolyadékban reszuszpendáljuk 2xl0⁶/ml koncentrációban 10 ng/ml PMA és 1 pg/ml ionomicin vagy 2 pmol/liter MBP(84-102)-peptid vagy 2 pmol/liter MBP(84-102)-peptid +10 ng/ml PMA jelenlétében vagy ezek távollétében, 4 óráig, 37 °C-on. A teljes sejt-RNS-t az RNAzol B-módszerrel nyerjük ki (TM Cinna Scientific, Friendswood, TX, USA). 10 pg teljes sejt-RNS-t frakcionálunk formaldehid-gélelektroforézissel, 1,2% SeaKem-agarózban (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA), 2,2 mol/liter formaldehiddel. Frakcionálás után az RNS-t Nytran-membránokra (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) blottoljuk át lOxSSC-ben, éjszakán át, kapilláristranszferrel. A membránokat vákuumban sütjük 80 °C-on 2 óráig. A citokinpróbák hibridizálása céljából a membránokat előmossuk 0,5xSSC-ben és 5% SDSben 65 °C-on 2 óráig, majd előhibridizáljuk 50% formaldehid, 5xSSC, 0,5% SDS, lxDenhardt-oldat, 10% dextrán-szulfát és 0,1% mg/ml lazacsperma-DNS (Sigma) keverékében 42 °C-on 1-2 óráig. Az előzőleg a [24]-ben leírt IL-2-, IL-4- és γ-IFN-próbákat random primer jelölési módszerrel (Boehringer Mannheim, Mannheim, Németország) > 10⁸ cpm/pg specifikus aktivitásig jelöljük és frissen adjuk a hibridizációs pufferhez. A hibridizálást 42 °C-on 20 óráig végezzük. A membránokat 0,2xSSC/l,0% SDS-ben kétszer 10 percig mossuk 24 °C-on, majd kétszer 30 percig 50 °C-on. Az autoradiográfiát -70 °C-on 1-5 napig végezzük.

Eredmények

Peptidantigénnel előzetesen stimulált T-sejtek válaszképtelenek az antigénre. Korábban kimutattuk, hogy MBP-reaktív T-sejt-klónok peptidantigénre szaporodnak hagyományos APC távollétében is, ha a peptidantigént saját II. osztályú MHC-antigénjeiken prezentálják az autológ T-sejt-klónok számára [22]. Most azt vizsgáljuk, hogy az antigénnek a T-sejtek által történő prezentálása a válaszoló T-sejt-klónban más szignálmechanizmusokat indít-e be, mint a hagyományos APC-k. Amint azt a 15. ábra mutatja, az Ob.lA12.8 jelű T-sejt-klón ugyanolyan jól válaszol a szaporodási tesztben a tenyészethez közvetlenül adott MBP(84-102)-peptidre, mint az előkezelt DR2+ Bsejt-vonalhoz vagy DR2-transzfektált L-sejtekhez kötött pepiidre (15A. ábra). Viszont az eredetileg szabad MBP(84-102)-peptiddel stimulált T-sejtek egy héttel később tesztelve nem válaszolnak az antigénstimuláció egyik formájára sem (15B. ábra, üres körök), míg az elsődlegesen előkezelt DR2+ B-sejt-vonalhoz vagy DR2-transzfektált L-sejtekhez kötött pepiiddel stimulált T-sejtek a másodlagos stimulusra normális választ adnak (15B. ábra, kitöltött jelek). A második stimulációkor tapasztalt válaszképtelenség fordítottan arányos az elsődleges stimulációban alkalmazott antigénkoncentrációval és az akkor indukált szaporodási ütemmel.

Két különböző egyéntől származó, például öt különböző T-sejt-klón esetében kimutatható, hogy ha a kiónok két különböző pepiidre specifikusak, csak a specifikus peptid okoz válaszképtelenséget (az adatokat nem mutatjuk be).

Kostimulátorsejtek hozzáadása nem szünteti meg a válaszképtelenséget. Feltehető, hogy az anergia kiváltása inkább valamely negatív szignálnak, mint az APC-k valamely kostimuláló szignálja hiányának tulajdonítható, hiszen az L-sejtek (melyek feltehetően nem hordoznak emberi eredetű kostimulátormolekulákat) nem okoznak anergiát. Azonban nemrégiben az L-sejteken is találtunk egér-B7-et (G. Freeman, a kézirat előkészítés alatt), és az egér B7-ről kimutattuk, hogy az stimulálja az emberi T-sejteket [25]. Annak érdekében, hogy az L-sejteknek a válaszképtelenség kiváltására gyakorolt hatását közvetlenül teszteljük, DR2-transzfektált L-sejteket adunk a T-sejtek tenyészetéhez, mely szabad petpidantigént tartalmaz. Az emberi B7-nek mint kostimulátomak a szerepét úgy teszteljük, hogy az emberi B7 gént DR2⁺ és DR2- L-sejtekbe transzfektáljuk. Amint azt a 13. táblázat mutatja, az egy hétig szabad MBP(84-102)-peptid jelenlétében tenyésztett Tsejtek nem válaszolnak a másodlagos antigénstimulációra akkor sem, ha emberi B7-et vagy B7-et és DR2-t hordozó L-sejteket adunk a tenyészethez.

Annak eldöntésére, hogy a peptidantigén által kiváltott válaszképtelenséget egyéb kostimulátor-molekulák (a B7-en kívül) megszüntetik-e, besugárzott B7⁺ Bsejteket, melyek a megfelelő (9010) vagy nem megfelelő (9009) HLA-DR-antigént hordozzák, adunk a Tsejt-klón tenyészetéhez az MBP(84-102)-peptiddel együtt. A 16. ábra demonstrálja, hogy egyik B-sejtvonal sem képes a szabad peptid által okozott T-sejtanergiát megszüntetni. Ellenben, amint azt a 15. ábra mutatja, ha az MHC-egyeztetett B-sejt-vonalat (9010) előkezeljük a peptidantigénnel, majd tenyésztés előtt megmossuk, nem tapasztaljuk a T-sejt-klón válaszképtelenségét. Bár a T-sejt-klón elveszti a válaszképességét szabad peptidantigén hatására, IL-2-re adott válasza nem változik annak jeléül, hogy a válaszképtelenség nem sejtpusztulás következménye.

A T-sejt-anergia kinetikája. A T-sejt-anergia kinetikájának meghatározására az MBP(84-102)-peptidre és IL-2-re adott másodlagos T-sejt-választ mérjük a pepiiddel végzett elsődleges stimuláció után 0-168 óra múlva. Az MBP(84-102)-peptiddel való tenyésztés során 24 órán belül az antigénre adott válasz több mint tízszeres csökkenését tapasztaljuk; ez időre a háttérszaporodás (peptid nélkül) visszatér a nyugvó sejtek szintjére. A válaszképtelenség tovább nő, több mint százszoros értékre négy nap alatt, és a kísérlet teljes időtartama, 7 nap alatt végig megmarad (17. ábra).

Az anergizált T-sejteken továbbra is van CDi. A pepiiddel anergizált T-sejt-klónok válaszképtelensége másodlagos is lehetne, a CD3/TCR sejtfelszíni

HU 219 306 Β komplex expressziójának elvesztésével. Valójában nem ez a helyzet, minthogy a peptiddel válaszképtelenné tett T-sejt-klónok ugyanolyan CD3-expressziót mutatnak, mint a nem anergizált T-sejt-klónok (18. ábra).

19. ábra. Anergizált T-sejtek válasza különféle nem antigénstimulusokra. Hogy pontosabban meghatározhassuk, mely aktivációs utak nem működnek az anergizált T-sejt-klónoknál, peptiddel válaszképtelenné tett T-sejt-klónokat olyan reagensekkel kezelünk, amelyek utánozzák vagy éppen megkerülik a sejtfelszíni antigénstimuláció mechanizmusait (19. ábra). Az anergizált Tsejtek nem szaporodnak anti-CD3+PMA, valamint a mitogén CD2 ellenanyag-kombináció (Tl^+TllO hatására. Ezzel szemben az anergizált T-sejtek is normálisan válaszolnak PMA+ionomicin (ez a kombináció megkerüli a transzmembrán szignáltranszdukciót [26]) és rIL-2 (amely egy más úton serkenti a szaporodást [27] ) hatására (20. ábra).

Az anergizált T-sejtek antigén hatására bekövetkező Ca²⁺-felszabadító-képessége sérült. Korábban kimutattuk, hogy az MBP-reaktív T-sejt-klónok sejten belül Ca²⁺-ionokat szabadítanak fel antigénnel előkezelt T- vagy B-sejtek által prezentált peptid hatására [22], Most a peptidanergizált T-sejtek válaszképességét teszteljük ezzel a módszerrel. Az anergizált T-sejtek sejten belüli Ca-ion-koncentrációja sokkal kevésbé nő akár a TCR/anti-CD3-mal végzett keresztkötésére, akár B-sejtek által prezentált peptidantigénre (20. ábra). Ezzel szemben az anergizált T-sejt-klónok válaszképessége ionomicinre azonos a nem anergizált T-sejt-klónokéval.

Anergizált T-sejtek nem termelnek citokineket antigén hatására. MBP(84-102)-peptiddel anergizált vagy anélkül tenyésztett T-sejt-klónokat az elsődleges tenyészet 48 órája után stimulálunk peptiddel, peptiddel + PMA-val vagy PMA-val+ionomicinnel. 4 óra után az mRNS-t kinyeijük, és az IL-2, IL-4 és γ-IFN relatív mennyiségét Northern-blottal meghatározzuk. Az anergia indukciója előtt az Ob.lA12.8 nevű T-sejt-klón IL-2-t, IL-4-et és γ-IFN-t termel az MBP(84-102)peptid vagy ionomicin és PMA vagy a peptid és PMA hatására. Ezzel szemben az anergizált T-sejt-klón nem szintetizált IL-2-, IL-4-, γ-IFN-mRNS-t az MBP(84-102)peptid vagy a peptid és PMA hatására; ionomicin és PMA kombinációjára viszont jelentős citokin-mRNStermeléssel válaszol (21A. ábra). Az IL-2-mRNS-re vonatkozó Northem-blot-eredményeket ΗΤ-2-sejteket használó IL-2-bioassay-vel is megerősítjük (21B. ábra). A másodikra peptidantigénnel stimulált, előzőleg anergizált T-sejtek nem bocsátanak ki IL-2-t, míg a nem anergizáltak igen, amint azt a ΗΤ-2-sejtek szaporodása mutatja.

A hagyományos APC-k, mint a makrofágok, Bsejtek és dendrikus sejtek állandóan hordoznak II. osztályú MHC-molekulákat és képesek az antigéneket processzálni, valamint a CD4+ T-sejteknek prezentálni [28] . Emberi T-sejtek, amelyek aktivációt követően szintén kifejezik a II. osztályú MHC-molekulákat, szintén képesek peptideket vagy degradált antigéneket prezentálni, de teljes antigéneket nem processzálnak, azaz „nem hagyományos” APC-ként funkcionálnak [22, 29-31], Bár az MBP 84-102-vel történő stimuláció sejtszaporodáshoz (proliferáció) vezet, kimutattuk, hogy a peptiddel stimulált T-sejtek válaszképtelenek antigénnel vagy TCR/CD3 keresztkötéssel történő másodlagos stimulációra, de nem IL-2-re. Továbbá hosszan tartó válaszképtelenséget indukálhatunk szabad peptiddel, de nem peptiddel előkezelt B-sejtekkel vagy DR2+ L-sejt-transzfektánsokkal, ami arra utal, hogy a válaszképtelenség nem pusztán valamely reffakter, válaszképtelen állapot rövid fennállásának következménye, mint azt a nagy dózisú antigénre fellépő válaszképtelenség esetén gondolják [9]. Ezt a fajta válaszképtelenséget „energiának” nevezzük, mert a T-sejtek válaszképtelenek az antigénstimulációra, de IL-2-re válaszképesek maradnak, ami ezen elnevezés eredeti kritériuma [8].

In vitro T-sejt-toleranciát kémiailag fixált APC-kel vagy szilárd felszínhez kötött anti-CD3 monoklonális ellenanyagokkal lehet kiváltani, másodlagos kostimuláló szignál hiányában [6-8], Kimutatták, hogy a Tsejteken található CD28-molekula, amely a B-sejteken és aktivált makrofágokon található B7-molekulához kötődik, a T-sejt-aktivációhoz szükséges kostimuláló út (pathway) része; feltételezik, hogy a B7-kostimuláció hiánya anergiához vezet [14-16], Azonban az MBPpeptid saját T-sejt-prezentációja által indukált anergia, úgy tűnik, ezen fajta kostimuláció mellett jön létre, hiszen akár B7-transzfektánsok, akár EBV-transzformált B-sejtek (melyek sok B7-et hordoznak) hozzáadása nem akadályozza meg a válaszképtelenség kialakulását. Továbbá olyan B-sejtek, melyek a megfelelő MHC-t hordozzák, szabad antigén jelenlétében nem tolerogén APC-ként szerepelnek és alighanem versengenek a T-sejtekkel az antigénért a tenyésztés folyamán, szintén nem képesek a válaszképtelenség kialakulását megakadályozni. Az eredmények arra utalnak, hogy a szabad peptid T-sejt-prezentációja által okozott anergia valamely negatív szignál következménye, nem pedig valamely pozitív szignál hiánya okozza. Ezen eredményeknek gyakorlati következményei vannak az antigénspecifikus T-sejt-vonalak és -kiónok fenntartásával kapcsolatban, melyeket szabad peptid távollétében kell restimulálni, hogy az antigénnel kapcsolatos válaszképesség elvesztését elkerüljük.

Az autoantigén T-sejt-prezentációja által kiváltott anergia mechanizmusát vizsgálva megállapíthatjuk, hogy az anergizált T-sejtek intracelluláris Ca-mobilizáló képessége csökken akár APC-k, akár anti-CD3 ellenanyag hatására. PMA és ionomicin kombinációja teljesen helyreállítja a citokintermelést és az anergizált Tsejtek szaporodását, ami annak a jele, hogy a PKC(protein kináz C) aktiválódást és az intracelluláris Cafelszabadulást követő események nem károsodtak. Ennek megfelelően az anergia állapota, definíció szerint a szignáltranszdukció megváltozása, esetünkben különbözik a Jenkins és Schwartz által leírt in vitro klonális anergiától, ahol a membrán közelében lejátszódó szignálesemények nem károsodtak [32, 33]. Az antigén Tsejt-prezentációja által kiváltott anergia mechanizmusa

HU 219 306 Β a transzgénikus egerekben tapasztaltakhoz hasonlatos, amikor is a perifériára kerülő autoreaktív T-sejtek nem képesek az intracelluláris Ca-szint növelésére TCRszignál hatására, de PMA és ionomicin kombinációjára szaporodnak [21]. Ennek megfelelően a funkcionálisan definiált anergiának legalább két típusa van. Hasonlóképpen a sejtek rosszindulatú transzformációjához, amelyik a sejt szignálközvetítő útjait szabályozó számos különböző molekula egyikének megváltozására vezethető vissza, a T-sejt-anergia jelensége is számos különféle mechanizmus útján érhető el, melyek a T-sejtaktiválódás különböző stádiumait érintik.

O’Hehir és munkatársai kimutatták, hogy a peptid vagy szuperantigén által kiváltott T-sejt-válaszképtelenség a CD3 sejtfelszíni expressziójának csökkenésével és a CD25 növekedésével jellemezhető a peptidantigén hozzáadása után 16 órával [34,35]. Esetünkben is megfigyelhető a CD3/TCR-expresszió némi csökkenése és a CD25-expresszió növekedése ebben a korai időpontban, feltehetően a T-sejt-aktiváció következményeképpen (az adatokat nem mutatjuk be). Mindazonáltal azt találjuk, hogy 4 nap után az energizált sejteken ugyanannyi CD3 van, mint a nem anergizáltakon (18. ábra). Ezek szerint az anergiát nem lehet egyszerűen a sejtfelszíni CD3/TCR csökkenésével magyarázni.

Amint azt a perifériás vérből származó emberi Tsejt-klónok többségénél láttuk [24], az Ob.lA12.8 jelű T-sejt-klón is T_HO fenotípusúnak tűnik, amennyiben mind a T_H1, mind a T_H2 altípusokra jellemző citokineket termeli mitogén-stimuláció hatására [36], Az anergizált T-sejtek nem képesek IL-2-, IL-4- és γIFN-mRNS-t szintetizálni vagy mérhető mennyiségű IL-2-t kibocsátani antigénstimulációra PMA jelenlétében vagy távollétében, míg az ionomicin és PMA keveréke beindítja a citokintermelést. Ezek az eredmények összhangban vannak a proliferációs és Ca-szint-növekedési adatokkal, ami azt jelenti, hogy a T-sejt-szignál a Ca-mobilizációt megelőzően szenved gátlást. A Tsejtek által a pepiidre válaszképpen generált negatív szignál még azonosításra vár, csakúgy, mint a konkrét biokémiai szignálesemény, amelyik ezekben az anergizált T-sejtekben megváltozik.

Az immunológia egyik fő kérdése, hogy az aktivált autoantigénreaktív T-sejtek milyen szabályozásnak vannak alávetve a gyulladásos válasz folyamán. Korábban kimutattuk, hogy a T-sejtek képesek peptidantigént és részlegesen degradált natív MBP-t prezentálni, bár nem képesek a tiszta MBP-t processzálni és prezentálni [22], Ennek alapján úgy gondoltuk, hogy a gyulladás helyén (például az agyban, egy demielinizációs plakkban) lévő aktivált T-sejtek képesek lehetnek MBP-fragmenseket prezentálni más, jelen lévő T-sejteknek. Annak kimutatása, hogy a peptidantigén Tsejt-prezentálása klonális válaszképtelenséghez vezet, arra utal, hogy a tolerancia eme mechanizmusa talán azért alakulhatott ki a törzsfejlődés során, hogy az autoreaktív T-sejteket ne engedje egy gyulladásos gócban a károsodott saját szövetre válaszképpen klonálisan szaporodni. A saját antigénből degradált fehérje jellemzően magas sejten kívüli koncentrációban található, míg az idegen antigén az elsődleges in situ immunválasz után már csak kisebb koncentrációban van jelen, és a hagyományos APC-k intemalizálják, majd processzálják és prezentálják. Ily módon a T-sejtek (melyek nem processzálják, csak prezentálják az antigént) helytelen antigénprezentációja a megfelelő T-sejt-klón aktiválódása helyett annak anergiáját okozza valamely gyulladás helyén, ahol degradált saját antigén található.

Összefoglalva bizonyítékokat mutattunk be Lamb és Feldman [10, 11] eredeti megfigyelésének magyarázatára, miszerint T-sejt-klónok előkezelése peptidantigénnel az antigénre adott válaszképtelenséghez vezet. Az anergia az emberi T-sejtek II. osztályú MHC-molekula-expressziójával kapcsolatos, mely T-sejtek képesek más autológ T-sejteknek prezentálni a peptidantigént. Bár ez a kölcsönhatás eleinte a T-sejtek aktiválódásához vezet, a peptiddel való találkozást követően 24 órával már a T-sejtek válaszképtelenek a további stimulusra. Az anergizált T-sejtek szignálmechanizmusának károsodása a membrán közelében történik, mivel a peptiddel kezelt T-sejtek Ca-szint-növekedésükben, citokintermelésükben és antigénstimulusra történő szaporodásukban gátoltak, de PMA és ionomicin hatására normális válaszokat mutatnak.

HU 219 306 Β

13. táblázat

Elsődleges stimulus Másodlagos stimulus

L-sejt-expresszió

DR2a no	B2 L-cell	84:.102	84-102 +	CPM + SEM 192 ± 16 32.471 ± 1.264
+ +		+	303 ± 81 344 ± 199
+	-	-		-	347 ± 202
		-		+	14.143 ± 1.456
		+		-	399 ± 89
		+		+	291 ± 74
-	+	-		-	308 ± 133
		-		+	16.354 ± 3,331
		+		-	365 ± 76
		+		+	268 ± 71
+	+	-		-	278 ± 99
		-		+	18.221 ± 7.684

+ 332 ± 247 + + 224 ± 89

13. táblázat. Az anergia B7+ járulékos sejtek jelenlétében is fellép. Az Ob.2F3. T-sejt-vonalat hét napig tenyésztjük 5 pg/ml 84-102 jelenlétében vagy anélkül, 45 KF/mérőhely 5000 rad-dal besugárzott L-sejttel vagy anélkül, mely L-sejtek DR2-t és/vagy B7-et expresszálnak. DR2-t expresszáló vagy nem expresszáló

L-sejteket transzfektálunk B7-tel. Az átlagos fluoreszcenciaintenzitás tipikusan 77,2 (egér-Ig-PE) és 215,6 (B7-PE) a DR2+B7+ vonal esetében és 56,8 (egérIg-PE) és 158,6 (B7-PE) a DR2-B7+ vonal esetében. Az elsődleges tenyészetet követően a T-sejteket mossuk és 84- 102-re adott proliferációjukat mérjük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként DENPVVHFFKNIVTPRTPP szekvenciájú peptidet vagy fragmensét tartalmazó, szklerózis multiplex kezelésére alkalmazható orális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a peptidet vagy fragmensét gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.
2. Eljárás hatóanyagként a PVVHFFK szekvenciát magában foglaló, legfeljebb 19 aminosavból álló peptidet tartalmazó, szklerózis multiplex kezelésére alkalmazható orális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a peptidet gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.