PT1286686E

PT1286686E - E-selectiva para o tratamento ou prevenção do acidente vascular cerebral

Info

Publication number: PT1286686E
Application number: PT01939279T
Authority: PT
Inventors: John M Hallenbeck; Hidetaka Takeda; Maria Spatz
Original assignee: Us Health
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2007-11-07
Also published as: JP4986361B2; EP1286686A2; WO2001089557A3; CA2410563A1; DE60129552D1; ATE367823T1; AU6481301A; EP1286686B1; DK1286686T3; US20040009125A1; WO2001089557A2; CA2410563C; US7261896B2; AU2001264813B2; DE60129552T2; EP2295067A1; US20070253975A1; JP2004503471A; ES2292594T3

Description

DESCRIÇÃO

"E-SELECTINA PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DO ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à utilização de E-selectina na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de acidentes vasculares cerebrais e para mitigar a lesão do tecido cerebral no seguimento de um acidente vascular cerebral. A presente utilização está especialmente adaptada para utilização em doentes com risco aumentado de acidente vascular cerebral ou que possam ficar em risco aumentado de acidente vascular cerebral. Adicionalmente, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de E-selectina, em que a composição farmacêutica é formulada para administração intranasal, aerossol ou inalável.

Antecedentes A E-selectina (também conhecida por ELAM-1, CD62 e CD62E) é uma molécula de adesão celular glicoproteica de superfície celular indutível por citocina que se encontra exclusivamente em células endoteliais. A E-selectina medeia a adesão de diversos leucócitos, incluindo neutrófilos, monócitos, eosinófilos, células assassinas naturais (NK), e um subconjunto de células T, ao endotélio activado (Bevilacqua, et al., "Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for 1 neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins," Science 243; 1160 (1989); Graber, et al., "T cells bind to cytokine-activated endothelial cells via a novel, inducible sialoglycoprotein and endothelial leukocyte adhesion molecule-1" J. Immunol. 145: 819 (1990); Carlos, et al., "Human monocytes bind to two cytokine-induced adhesive ligands on cultured human endothelial cells: endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1" Blood 77: 2266 (1991); Hakkert, et al., "Neutrophil and monocyte adherence to and migration across monolayers of cytokine-activated endothelial cells: the contribution of CD18, ELAM-1, and VLA-4" Blood 78: 2721 (1991); e Picker, et al., "ELAM-1 is an adhesion molecule for skin-homing T cells" Nature 349: 796 (1991)). A expressão de E-selectina é induzida no endotélio humano em resposta às citocinas IL-1 e TNF, bem como ao lipopolissacarideo bacteriano (LPS), através de regulação positiva transcricional (Montgomery, et al., "Activation of endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) gene transcription" Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 6523 (1991)). A E-selectina é expressa no tecido endotelial vascular onde as células foram activadas. Pober, J. S., et al., "Two distinct monokines, interleukin 1 and tumor necrosis factor, each independently induce biosynthesis and transient expression of the same antigen on the surface of cultured human vascular endothelial cells," J. Immunol. 136: 1680 (1986); Bevilacqua M.-P., et al., "Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule," Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 9238 (1987). Crê-se que a activação de células endoteliais vasculares, pelo menos em alguns casos, esteja envolvida na lesão tecidular vascular inflamatória conduzindo a trombose (Fareed, J. et al., "Molecular markers of hemostatic activation. Implications in the diagnosis of thrombosis, 2 vascular, and cardiovascular disorders," Clin. Lab. Med. 15: 39 (1995)). É facto estabelecido que a lesão do tecido vascular e a trombose estão envolvidas no desenvolvimento de acidentes vasculares cerebrais. 0 fornecimento reduzido de oxigénio e nutrientes do sangue às células do cérebro, em virtude de lesão do tecido vascular e trombose, conduz à morte das células cerebrais — as manifestações clinicas de um acidente vascular cerebral — e causa a formação de espaços detectáveis deixados por estas células, denominados enfartes. Os acidentes vasculares cerebrais são uma das principais causas de mortalidade no mundo e são responsáveis por dezenas de milhares de milhões de dólares de custos médicos, só nos Estados Unidos. Embora estejam disponíveis alguns tratamentos para a prevenção do acidente vascular cerebral, existe uma necessidade para tratamentos mais eficazes que sejam aplicáveis a uma fracção maior de doentes afectados.

Estruturalmente, a E-selectina pertence a uma família de moléculas de adesão designadas "selectinas" que inclui, igualmente, a P-selectina e a L-selectina (ver revisões em Lasky, "Selectins: interpreters of cell-specific carbohydrate Information during inflammation" Science 258: 964 (1992) e Bevilacqua e Nelson, "Selectins" J. Clin. Invest. 91: 379 (1993)) . Estas moléculas caracterizam-se por traços estruturais comuns tais como um domínio amino-terminal de tipo lectina, um domínio de factor de crescimento epidérmico (EGF) e um número discreto de módulos de repetição de complemento (aproximadamente 60 aminoácidos cada) semelhantes aos encontrados em determinadas proteínas de ligação do complemento. 3

Verificou-se, recentemente, que novos métodos e formulações farmacêuticas induzem tolerância, oralmente ou de mucosa (e. g., por administração intranasal, utilizando como agentes de tolerância autoantigénios, antigénios de proximidade ou fragmentos supressores de doença ou análogos de autoantigénios ou de antigénios de proximidade. Tais tratamentos são descritos em Wiener, H. et al., "Bystander suppression of autoimmune diseases," documento W09316724 (1993); Brigham & Womens Hospital (US), "Enhancement of the down-regulation of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens," documento W09112816 (1991); Weiner, H. et al., "Improved treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of auto antigens," documento W09108760 (1991); Weiner, H. et al., "Methods of treating or preventing autoimmune uveoretinitis in mammals," documento WO9101333 (1991); Weiner, H. et al., "Method of treating or preventing type 1 diabetes by oral administration of insulin," documento W09206704 (1992); Hafler, D. et al., "Bystander suppression of retroviral-associated neurological disease," documento WO940121 (1994); Weiner, H. et al., "Method of treating rheumatoid arthritis with type II collagen," documento W09407520 (1994); Weiner, H. et al., "Methods and compositions for suppressing allograft rejection in mammals," documento WO9207581 (1992); Wucherpfenning, K. et al., "Multiple sclerosis T-cell receptor," documento W09115225 (1991); Weiner, H. et al., "Suppression of proliferative response and induction of tolerance with polymorphic class II mhc allopeptides," documento WO9320842 (1993); Weiner, H. et al., "Suppression of T-cell proliferation using peptide fragments of myelin basic protein," documento W09321222 (1993); e Weiner, H. et al., "Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens," documento W09206708 (1992) . 4 administração intravenosa que

Verificou-se que a administração intravenosa de autoantiqénios (e seus fraqmentos contendo reqiões epitópicas imunodominantes) induz a supressão imunitária através de um mecanismo denominado anergia clonal. A anergia clonal causa a desactivação de apenas células T de ataque imune especificas de um antigénio especifico, sendo o resultado uma redução significativa na resposta imune a este antigénio. Deste modo, as células T promotoras de resposta autoimune especificas para um auto-antigénio, após anergização clonal, já não proliferam em resposta a esse antigénio. Esta redução na proliferação reduz igualmente as reacçóes imunes responsáveis pelos sintomas da doença autoimune (tais como lesão tecidular neural que se observa em MS) . Existem igualmente indícios de que a administração oral de autoantigénios (ou fragmentos imunodominantes) numa dose única e em quantidades substancialmente maiores do que aquelas que provocam a "supressão activa" podem igualmente induzir tolerância através de anergia clonal (ou deleção clonal).

Foi divulgado um método de tratamento que se processa por supressão activa. A supressão activa funciona por meio de um mecanismo diferente do da anergia clonal. Este método, discutido extensivamente em Weiner (1993), envolve a administração oral ou de mucosa de antigénios específicos para os tecidos debaixo de ataque autoimune. Estes denominados "antigénios de proximidade" fazem com que células T reguladoras (supressoras) sejam induzidas no tecido linfóide associado ao intestino (GALT) ou no tecido linfóide associado aos brônquios (BALT) ou, na maior parte dos casos, tecido linfóide associado à mucosa (MALT); MALT inclui tanto GALT como BALT. Estas células reguladoras são libertadas no sangue ou no tecido linfático e migram depois para 5 o órgão ou tecido afectado pela doença autoimune e suprimem o ataque autoimune do órgão ou tecido afectado.

As células T induzidas pelo antigénio de proximidade reconhecem, pelo menos, um determinante antigénico do antigénio de proximidade utilizado para as induzir e são direccionadas para o lócus do ataque autoimune, onde medeiam a libertação local de determinados factores imunomoduladores e citocinas, tais como o factor de crescimento transformador beta (TGF-β), interleucina 4 (IL-4) e/ou interleucina 10 (IL-10). Destes, o TGF-β é um factor imunossupressor inespecifico antigénico, na medida em que suprime o ataque imune independentemente do antigénio que provoca o ataque. (Contudo, em virtude da tolerização oral ou de mucosa com um antigénio de proximidade causar apenas a libertação de TGF-β na vizinhança do ataque autoimune, não se segue a imunossupressão sistémica.) As IL-4 e IL-10 são igualmente citocinas imunorreguladoras inespecificas antigénicas. A IL-4, em particular, melhora a resposta Th2 (i. e., actua sobre precursores de células T e faz com que estes se diferenciem, de um modo preferido, em células Th2, em detrimento de respostas Thl). A IL-4 inibe, igualmente, indirectamente a exacerbação Thl. A IL-10 é um inibidor directo de respostas Thl. Após a tolerização oral de mamíferos afectados por estados de doença autoimune com antigénios de proximidade, observam-se níveis aumentados de TGF-β, IL-4 e IL-10 no lócus do ataque autoimune (Chen, Y. et al., "Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune

encephalomyelitis," Science, 265: 1237-1240, (1994)). O mecanismo de supressão de proximidade foi confirmado por von Herrath et al., "Oral insulin treatment suppresses virus-induced antigen-specific destruction of beta cells and prevents 6 autoimmune diabetes in transgenic mice," J. Clin. Invest., 96:1324-1331, (1996). O documento WO 00/04928 refere-se a um método de optimização de tecido isquémico em revascularização, particularmente tecido isquémico do miocárdio. Divulga-se, especificamente, um meio para perfusão retrógrada de vectores de terapia génica angiogénica em tecido isquémico, em que o(s) polipeptideo (s) codificado (s) pelos vectores de terapia génica promove (m) a angiogénese e a revascularização e são seleccionados a partir do grupo consistindo em VEGF, ICAM-1, FGF, EGF, ácido nítrico sintase (NOS), E-selectina e suas combinações.

Para além disso, Michael P. Berilacqua et. al divulgam no artigo de investigação "Endothelial leukocyte Adhesion Molecule 1 : An Inducible Receptor for Neutrophils related to Complement Regulatory Proteins and Lectins" in Science, Vol. 243, páginas 1160-1164, 1989 que a adesão focal de leucócitos ao revestimento de vasos sanguíneos é uma etapa crucial na inflamação e em determinados processos de doença vascular. A molécula de adesão leucocitária endotelial 1 (ELAM-1), uma glicoproteína de superfície celular expressa por endotélio activado por citocinas, medeia a adesão de neutrófilos sanguíneos. Um ADN complementar (ADNc) de tamanho total para a ELAM-1 foi agora isolado por expressão transiente em células COS. As células transfectadas com o clone ELAM-1 expressam uma estrutura de superfície reconhecida por dois anticorpos monoclonais específicos de ELAM-1 (H4/18 e H18/7) e suportam a adesão de neutrófilos humanos isolados e a linha celular promielocítica HL-60. A expressão de transcritos de ELAM-1 em células endoteliais humanas cultivadas é induzida por citocinas, alcançando um máximo das 2 às 4 horas e decaindo às 24 horas; a expressão de superfície celular da proteína ELAM-1 iguala a do 7 ARNm. A sequência primária de ELAM-1 prevê um domínio amino-terminal de tipo lecitina, um domínio EGF e seis motivos repetitivos em série (cerca de 60 aminoácidos cada) aparentados aos encontrados em proteínas reguladoras do complemento. Verifica-se igualmente uma estrutura semelhante no receptor de superfície celular de orientação automática do linfócito MEL-14 e na proteína membranar granular 140, uma glicoproteína de membrana de grânulos secretores endoteliais e plaquetários que pode ser rapidamente mobilizada (< 5 minutos) para a superfície celular por intermédio de trombina e outros estímulos. Deste modo, a ELAM-1 pode ser um membro de uma família génica emergente de moléculas de superfície celular envolvidas na regulação de eventos inflamatórios e imunológicos na interface da parede do vaso e sangue.

Embora tivesse sido demonstrada a indução de tolerância e um efeito de proximidade para um certo número de antigénios, permanece uma necessidade de desenvolver métodos para a indução de tolerância à E-selectina e determinar se tal indução é possível. Além disso, permanece uma necessidade de determinar se a E-selectina pode ser utilizada como antigénio de proximidade para a indução de tolerância que proporcione supressão activa.

Esta invenção vai ao encontro destas necessidades proporcionando um meio para a indução de tolerância de E-selectina. Além disso, esta invenção proporciona um meio para o tratamento do acidente vascular cerebral pelo tratamento de E-selectina, presumivelmente através de um efeito de proximidade proporcionado por tolerância de E-selectina. Estas e outras vantagens, benefícios e utilizações da presente invenção serão evidentes para os especialistas na técnica após uma consideração da presente descrição. 8

Sumário da Invenção

Em geral, a presente invenção refere-se a meios para a prevenção de lesão do tecido cerebral resultante de obstruções de vasos sanguíneos por tratamento com E-selectina. A presente invenção refere-se igualmente a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de E-selectina, em que a composição farmacêutica é formulada para administração intranasal, aerossol ou inalável. De um modo mais particular, a presente invenção proporciona meios para a redução da lesão tecidular relacionada com o acidente vascular cerebral pelo tratamento de um mamifero com E-selectina. De um modo preferido, este tratamento induz tolerância de E-selectina no mamifero.

Esta invenção é especialmente útil no tratamento de doentes com um risco aumentado conhecido de acidente vascular cerebral. Tais doentes incluiriam, por exemplo, pessoas com tensão arterial elevada (especialmente tensão arterial elevada grave ou tensão arterial elevada não controlável com tratamento farmacológico convencional) , pessoas com uma história familiar de acidente vascular cerebral, pessoas com um ou mais acidentes vasculares cerebrais anteriores, diabetes, hipercolesterolemia e semelhantes. A presente utilização pode ser igualmente utilizada para o tratamento de doentes agendados para se submeterem tratamentos farmacológicos ou processos cirúrgicos que possam aumentar o risco de acidente vascular cerebral. A presente utilização pode, contudo, ser utilizada com indivíduos sem risco aumentado conhecido para acidente vascular cerebral. 9

Breve Descrição Dos Desenhos A FIG. 1 é um gráfico de áreas acumulativas de enfarte e hemorragia (em mm2) ao longo do tempo (dias). Losangos a sombreado, regime único de 5 pg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 pg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 pg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 pg de E-selectina com reforços. A FIG. 2 é um gráfico de número acumulativo de enfartes e hemorragias ao longo do tempo (dias). Losangos a sombreado, regime único de 5 pg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 pg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 pg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 pg de E-selectina com reforços. A FIG. 3 é um gráfico de área acumulativa de enfarte (em mm2) ao longo do tempo (dias). Losangos a sombreado, regime único de 5 pg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 pg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 pg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 pg de E-selectina com reforços. A FIG. 4 é um gráfico de número acumulativo de enfartes ao longo do tempo (dias). Losangos a sombreado, regime único de 5 pg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 pg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 pg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 pg de E-selectina com reforços. Os asteriscos indicam pontos de dados onde os valores dos grupos ES estão estatisticamente 10 diminuídos (p < 0,0001) utilizando um Modelo de Riscos Proporcionais de Cox em relação aos valores obtidos para grupos de controlo. A FIG. 5 é um gráfico de áreas acumulativas de hemorragia intraparenquimatosa (em mm2) ao longo do tempo (dias) . Losangos a sombreado, regime único de 5 yg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 yg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 yg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 yg de E-selectina com reforços. A FIG. 6 é um gráfico de número acumulativo de hemorragias intraparenquimatosas ao longo do tempo (dias). Losangos a sombreado, regime único de 5 yg de ovalbumina; losangos em branco, regime de 5 yg de ovalbumina com reforços; quadrados a sombreado, regime único de 5 yg de E-selectina; quadrados em branco, regime de 5 yg de E-selectina com reforços. A FIG. 7 é uma série de gráficos de barras mostrando o efeito do regime de tolerização de E-selectina da actual invenção em hipersensibilidade retardada. Para esta experiência os ratos receberam uma administração intranasal de E-selectina, em seguida foram imunizados com E-selectina na planta da pata antes de uma imunização de reforço na orelha. Os gráficos ilustram a alteração na espessura de orelha da orelha que recebeu a imunização de reforço de E-selectina comparativamente com a orelha que não recebeu uma administração de reforço. O painel A mostra o aumento em milímetros na orelha com o reforço e o painel B apresenta o aumento na orelha recebendo o reforço em termos de percentagem de alteração em espessura de orelha. Os gráficos 11 no lado esquerdo de cada painel mostram os dados para ratos recebendo administrações de PBS de controlo. Os gráficos no lado direito de cada painel mostram os dados dos que recebem um regime de tolerização de E-selectina de acordo com a actual invenção.

Descrição das Formas de Realização Preferidas

Meios para prevenção ou tratamento de acidentes vasculares cerebrais com E-selectina. Num aspecto, a invenção proporciona meios para a prevenção de acidentes vasculares cerebrais ou para a redução de lesão tecidular causada por um acidente vascular cerebral num doente, compreendendo a administração de E-selectina ao doente. De um modo preferido, a E-selectina é administrada de um modo que induz tolerância, de um modo muito preferido tolerância de efeito de proximidade. A E-selectina (também conhecida por ELAM-1, CD62 e CD62E) é uma molécula de adesão celular glicoproteica de superfície celular indutível por citocina que se encontra exclusivamente em células endoteliais. Estruturalmente, a E-selectina pertence a uma família de moléculas de adesão designadas "selectinas" que inclui igualmente a P-selectina e a L-selectina (ver revisões em Lasky, 1992 e Bevilacqua e Nelson, 1993) . Estas moléculas caracterizam-se por traços estruturais comuns, tais como um domínio amino-terminal de tipo lectina, um domínio de factor de crescimento epidérmico (EGF) e um número discreto de módulos de repetição de complemento (aproximadamente 60 aminoácidos cada) semelhantes aos encontrados em determinadas proteínas de ligação do complemento. 12

As fontes de E-selectina que podem ser utilizadas com a presente invenção incluem a E-selectina que foi substancialmente purificada a partir de fontes naturais, E-selectina recombinante produzida em células hospedeiras procarióticas ou, de um modo preferido, eucarióticas por intermédio de métodos bem conhecidos na técnica e fragmentos de E-selectina. Além disso, na actual invenção, a E-selectina pode ser substituída por uma pequena molécula orgânica ou é utilizado um pequeno peptídeo com uma estrutura que mimetiza a de uma parte de, de um modo preferido, uma parte imunorreactiva de E-selectina. Como aqui utilizado, "substancialmente puro" refere-se a uma pureza que permite a utilização eficaz de E-selectina para o tratamento do acidente vascular cerebral ou indução de tolerância.

De um modo preferido, a E-selectina para a presente invenção é da mesma espécie para a qual está a ser administrada. Contudo, como ilustrado nos Exemplos anexos, a E-selectina é eficaz em espécies, pelo menos em alguns casos, exceptuando aquelas a partir das quais tem origem. Por exemplo, a E-selectina humana é eficaz quando administrada a ratos em conformidade com os métodos da actual invenção. A E-selectina humana é composta por 589 aminoácidos e tem um peso molecular de 64 kDa. Os ácidos nucleicos codificando a E-selectina humana foram clonados e sequenciados. (Bevilacqua, Μ. P. 1989). Numa forma de realização, a fonte de E-selectina utilizada para a actual invenção é E-selectina humana recombinante. A tolerância de E-selectina induzida pelos antigénios de proximidade desta invenção é dose-dependente numa vasta gama de dosagens. Contudo, existem dosagens mínimas e máximas de eficácia que irão, certamente, variar dependendo do método de administração. Por outras palavras, a supressão activa das 13 alterações clínicas e histológicas acompanhando ou causando um acidente vascular cerebral dentro de uma gama específica de dosagem que, contudo, varia dependendo do organismo recebendo a dosagem, a via de administração, se a E-selectina é administrada em conjunto com outras moléculas co-estimuladoras e o regime especifico de administração de E-selectina. Por exemplo, para administração oral, a E-selectina é administrada geralmente em dosagens variando desde cerca de 0,005 a 500 mg/dia, de um modo mais preferido cerca de 0,05 a 50 mg/dia. As dosagens orais preferidas são desde 0,5 ug até 50 mg por administração.

Conhecem-se na técnica muitas vias de distribuição para a indução de tolerância de efeito de proximidade. Estas vias incluem vias inaláveis, aerossol e intranasal. Para a actual invenção a tolerância de E-selectina é induzida, de um modo preferido, por aplicação em gotas ou pulverização de E-selectina intranasalmente.

As formulações de E-selectina para utilização na presente invenção podem compreender constituintes inertes, incluindo veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, agentes de solubilização, agentes emulsionadores, sais e semelhantes, como é bem conhecido na técnica. São formulações preferidas de E-selectina as formulações intranasais incluindo soluções salinas normais, tais como, por exemplo, soluções salinas isotónicas e tamponadas fisiologicamente e soluções salinas tamponadas com fosfatos (PBS). O volume total das formulações intranasais é normalmente inferior a 1 mililitro, de um modo preferido, inferior a 100 pL. A E-selectina pode ser igualmente administrada numa forma de aerossol ou inalada. Exemplos de formulações para tolerizar 14 agentes administrados por inalação são proporcionados em Weiner, H. et al., "Improved treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of auto antigens," documento WO9108760 (1991). Os antigénios podem ser administrados como partículas secas de pó ou como uma solução aquosa atomizada suspensa num gás veiculo (e. g., ar, N2 e semelhantes).

Pode ser igualmente utilizado na prática da presente invenção aerossol seco na forma de partículas sólidas finamente divididas de E-selectina que não são dissolvidas ou suspensas num líquido. As formulações de E-selectina podem assumir a forma de pós de talco e compreender partículas finamente divididas tendo um tamanho de partícula médio entre cerca de 1 e 5 mícrones, de um modo preferido entre 2 e 3 mícrones. As partículas finamente divididas podem ser preparadas por pulverização e filtração de triagem utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. As partículas podem ser administradas por inalação de uma quantidade pré-determinada do material finamente dividido ou em pó. As formulações de E-selectina da presente invenção podem ser igualmente administradas na forma de um pulverizador de aerossol utilizando, por exemplo, um nebulizador tal como os descritos na Pat. U.S. N° 4624251 concedida a 25 de Nov. de 1986; Pat. U.S. N° 3703173 concedida a 21 de Nov. de 1972; Pat. U.S. N° 3561444 concedida a 9 de Fev. de 1971; e Pat. U.S. N° 4635627 concedida a 13 de Jan. de 1971. Outros sistemas de distribuição de aerossol, tais como o inalador de dose calibrada (MDI) pressurizado e o inalador de pó seco (ver, e. g., Newman, S. P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. e Davia, D. eds. pp. 197—224, Butterworths, Londres, Inglaterra, 1984) podem ser utilizados ao praticar a presente invenção. 15

Um modelo animal particularmente útil para a análise de formulações de E-selectina e sua eficácia no tratamento ou prevenção do acidente vascular cerebral é o rato propenso a acidente vascular cerebral e espontaneamente hipertenso SHR-SP (Okamoto, K. et al., "Establishment of the stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHR)," Circ. Res. (Supl.) 34, 35: 1 (1974)). Os ratos SHR-SP estão disponíveis mediante pedido ao professor Yukio Yamori, Graduate School of Human and Environmental Studies, Universidade de Quioto, Yoshida Nihonmatsu-cho, Sakyo-ku, Quioto, 606-8316, Japão. Os ratos SHR-SP morrem normalmente de doença cardiovascular de começo precoce, por vezes tão precoce como 14 semanas de idade, embora alguns ratos SHR-SP vivam até mais de 56 semanas de idade. Nestes ratos, frequentemente, a doença cardiovascular manifesta-se como um acidente vascular cerebral. A ocorrência de um acidente vascular cerebral nestes ratos é diagnosticada pela medição do estado comportamental que poderia ser dividido em 4 padrões: sem anormalidades (grau 1), irritável (grau 2), letárgico (grau 3), acinético (grau 4) (Yamori, U. et al., Japanese Criculation Journal 46: 274 (1982)).

Na altura da morte, os cérebros de ratos SHR-SP contêm, normalmente, numerosos enfartes e áreas de hemorragia intraparenquimatosa que podem ser contados e medidos através de análise microscópica de secções cerebrais. A eficácia de uma formulação de E-selectina pode ser determinada pela comparação do número e área de enfarte e hemorragia intraparenquimatosa de ratos SHR-SP que foram tratados com uma formulação de teste de E-selectina, administrada num regime de reforço, com aqueles que foram tratados com formulações de controlo, consistindo apenas em componentes de transporte, antigénios inespecíficos (e. g., ovalbumina) ou E-selectina numa única tolerização em vez de um 16 programa de reforço. Um exemplo desta estratégia é divulgado na secção de Exemplos desta descrição. A dosagem óptima de E-selectina é uma que produza o máximo efeito benéfico sobre a lesão tecidular cerebral causada por trombose avaliada como descrito anteriormente. Uma dose eficaz causa, pelo menos, uma atenuação estatisticamente ou clinicamente significativa de, pelo menos, um marcador, sintoma ou indício histológico característico de acidente vascular cerebral, tais como aqueles descritos anteriormente. A estabilização de sintomas ou lesão tecidular, nas condições em que os doentes ou animais de controlo sofrem um agravamento dos sintomas ou lesão tecidular, é um indicador de eficácia de um tratamento supressor. A verificação da gama de dosagem eficaz, bem como da quantidade óptima de E-selectina, é determinada utilizando métodos convencionais e os ensinamentos do presente pedido. Poe exemplo, as dosagens para mamíferos e dosagens humanas podem ser determinadas começando com uma dose relativamente baixa (e. g., 1 micrograma) e aumentando-a progressivamente medindo, simultaneamente, respostas apropriadas (e. g., número de células que segregam TGF-beta, IL-4 e/ou IL-10; número e activação de células T de ataque imune no sangue (e. g., por análise de diluição limitante e capacidade para proliferar); e/ou gravidade de doença). A dosagem óptima produz a quantidade máxima de prevenção de acidentes vasculares cerebrais ou a máxima protecção de lesão tecidular no cérebro causada por trombose minimizando, simultaneamente, efeitos secundários indesejáveis. Potenciais efeitos secundários incluem a produção de auto-anticorpos patogénicos (Hu, W. et al., "Experimental mucosal induction of uveitis with the 60-kDa heat shock protein- 17 derived peptide 336-351," Eur. J. Immunol. 28: 244.4 (1998); Genain C. P., et ai., "Late complications of immune deviation therapy in a nonhuman primate," Science 274: 2054 (1996)) ou uma resposta citotóxica de linfócitos T que induz auto-imunidade (Blanas E., et al., "Induction of autoimmune diabetes by oral administration of autoantigen," Science 274: 1707 (1996)).

Uma dose eficaz causa, pelo menos, uma atenuação estatisticamente ou clinicamente significativa de, pelo menos, uma manifestação de trombose na cavidade craniana tal como, por exemplo, o número ou área de enfartes cerebrais, o número ou área de hemorragia intraparenquimatosa cerebral, a taxa de ocorrência ou tempo até ao começo de acidente vascular cerebral e semelhantes. A dosagem máxima eficaz de um antigénio de proximidade em humanos pode ser verificada pelo teste de dosagens progressivamente maiores em ensaios clínicos, começando com uma dosagem relativamente baixa, por exemplo, 0,5 yg por administração.

As dosagens preferidas para instilações intranasais são desde 0,5 a 50 mg por administração, de um modo preferido para humanos aproximadamente desde 5 yg a 5 mg por administração. Para ratos, uma dosagem preferida é 5 yg por administração. As formulações farmacêuticas de aerossol preferidas podem compreender, por exemplo, uma solução salina tamponada fisiologicamente aceitável, contendo entre cerca de 1 mg e cerca de 300 mg de E-selectina. A verificação do regime óptimo para a administração de E-selectina é determinada à luz da informação aqui divulgada e informação bem conhecida respeitante à administração de antigénios de proximidade e autoantigénios. A variação de rotina 18 de dosagens, combinações e duração de tratamento é realizada nas circunstâncias em que os efeitos de tais variações no organismo possam ser medidas. A E-selectina é utilizada, de um modo preferido, na prática desta invenção utilizando uma série de administrações. Normalmente, estas administrações são espaçadas durante um período de 1 a 2 semanas. Por exemplo e conforme adicionalmente pormenorizado nos Exemplos, a E-selectina pode ser administrada em cinco administrações intranasais durante um período de duas semanas. De um modo preferido, este protocolo envolve a administração de E-selectina de dois em dois dias durante dez dias. De um modo preferido, o regime de administração é repetido em administrações de reforço que são geralmente administradas separadas por várias semanas. Numa forma de realização preferida, as administrações de reforço são proporcionadas de três em três semanas. As administrações de reforço podem incluir uma série de administrações, como descrito anteriormente para as administrações iniciais.

Agentes sinérgicos citocínicos e não citocínicos podem ser utilizados em conjunto com E-selectina na presente invenção para melhorar a eficácia de tolerização de E-selectina. A administração "em conjunto com" abrange a administração simultânea e sequencial, bem como administração em forma combinada ou separadamente. A utilização oral e parentérica de agentes sinérgicos citocínicos (interferões de Tipo I) foi descrita em Hafler, D. A. et al., "Treatment of autoimmune disease using oral tolerization and/or type 1 interferon," documento W09527499 (1995). A administração de citocinas estimuladoras de Th2 é descrita em Weiner H. L., et al., "Treatment of autoimmune disease using oral tolerization and/or 19

Th2-enhancing cytokines," documento WO9527500 (1995). Por exemplo, a IL-4 e IL-10 podem ser administradas da forma descrita em Weiner et al. Id.

Exemplos não limitantes de agentes sinérgicos não citocinicos para utilização na presente invenção incluem lipopolissacarídeos bacterianos de uma ampla variedade de bactérias Gram-negativas, tais como vários subtipos de E. coli e Salmonella (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.; Difco, Detroit, Mich.; BIOMOL Res. Labs., Plymouth, Pa.), Lípido A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.; ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio; Polysciences, Inc., Warrington, Pa.); lipoproteinas imunorreguladoras, tais como peptideos ligados covalentemente a tripalmitoil-S-glicarilcisteinil-seril-serina (P.sub.3 C55) que podem ser obtidos como divulgado em Deres, K. et al. (Nature, 342: 561-564, "In vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopeptide vaccine," 1989) ou lipoproteina "de Braun" de E. coli que pode ser obtida como divulgado em Braun, V., Biochim. Biophys. Acta 435: 335-337, 1976; e a cadeia β da toxina da cólera (CTB) cuja capacidade sinérgica foi descrita (embora não com respeito ao enfraquecimento de reacção autoimune) por Sun, J-B et al., "Cholera toxin B subunit: an efficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheral immunological tolerance," Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91: 10795 (1994). A gama de dosagem eficaz para agentes sinérgicos não citocinicos para mamíferos é de cerca desde 15 ng a cerca de 15 mg por kg de peso e, de um modo preferido, 300 ng — 12 mg por kg de peso. A gama de dosagem eficaz para o interferão de Tipo I oral para mamíferos é desde 1000-150000 unidades sem ter sido discernida a dosagem máxima eficaz. Outro composto activo que pode ser útil em conjunto com E-selectina é o metotrexato que é conhecido por causar um 20 acentuado desvio imunitário de Th2 com secreção de IL-4 grandemente aumentada quando proporcionado num regime cadenciado (Weiner et al., "Treatment of Autoimmune Disease Using Tolerization in Combination with Methotrexate," Pat. U.S. N.° 5935577 (1999). A verificação do regime óptimo para a administração de E-selectina e/ou da molécula co-estimuladora é determinada à luz da informação aqui divulgada e informação bem conhecida respeitante à administração de antigénios de proximidade e autoantigénios. A variação de rotina de dosagens, combinações e duração de tratamento é realizada nas circunstâncias em que os efeitos de tais variações no organismo possam ser medidas. 0 agente co-estimulador é administrado, de um modo preferido, no espaço de 24 horas da administração de E-selectina. De um modo mais preferido, é administrado ao mesmo tempo que a E-selectina. De um modo muito preferido, ambos são administrados numa formulação oral combinada.

Esta invenção, que não deverá ser limitada pela teoria, é baseada na hipótese que a activação da superfície lumenal do endotélio num segmento vascular por citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral alfa e a interleucina-l-beta, é um pré-requisito para o desenvolvimento de trombose ou para a evolução de lesão inflamatória do vaso nesse segmento. A abordagem geral envolve a exposição de linfócitos em tecido linfóide associado aos brônquios (BALT) e, talvez, tecido linfóide associado ao intestino (GALT) a uma molécula antigénica de adesão para produzir linfócitos tolerizados. 0 antigénio é instilado intranasalmente. Os linfócitos tolerizados sofrem "desvio imunitário" sintetizando e libertando, desse modo, o factor de crescimento transformador 21 beta (TGFp; uma citocina que causa a "supressão de proximidade" parácrina da produção de citocina pró-inflamatória) quando o mesmo antigénio é de novo encontrado. 0 antigénio é a E-selectina, uma molécula de adesão que é apenas expressa na superfície endotelial em segmentos vasculares que se tornaram activos. A essência desta abordagem é, por conseguinte, programar linfócitos autólogos para se tornarem monitores móveis que proporcionam vigilância contínua dos vasos. Quando estes encontram a E-selectina num segmento activado, ligam-se a esse segmento e ficam estimulados a produzir TGFp. 0 TGFp suprime depois a produção de citocinas pró-inflamatórias, reduz a trombogenicidade endotelial e minimiza a lesão do vaso. Após uma única exposição antigénica, a tolerância de linfócitos subsiste por um período de semanas e a manutenção de longo prazo do estado tolerante requer repetidas exposições de reforço ao antigénio.

Além disso, a presente invenção proporciona meios de redução da possibilidade de um acidente vascular cerebral por intermédio de um mecanismo que pode incluir a redução específica de hemorragia intracraniana. Embora não desejando que seja limitada pela teoria, esta conclusão é baseada nas considerações seguintes relacionadas com a hemorragia intracraniana e polimorfismos génicos de endoglina. As mutações do gene da endoglina foram associadas à hemorragia intracraniana em doentes (Alberts, M.J. et al., "Endoglin gene polymorphism as a risk factor for sporadic intracerebral hemorrhage," Ann. Neurol., 41: 683 (1997)). Parece que a endoglina se liga a TGF-β e desempenha subsequentemente um papel na manutenção e desenvolvimento vascular. Uma deficiência da função da endoglina parece diminuir a resposta do endotélio em relação a TGF-β resultando numa tendência aumentada para a hemorragia. A tolerização de 22 E-selectina parece igualmente aumentar o número de linfócitos positivos para TGF-β e pode aumentar a libertação de TGF-β em segmentos de vasos que estejam a ficar activados, como descrito anteriormente. Poderia prever-se que tal reduziria a possibilidade de hemorragia na presença de endoglina. 0 que é potencialmente relevante para a eliminação observada de hemorragia intracraniana no grupo que recebeu tolerização de E-selectina e tolerização de reforço, como descrito na secção de Exemplos a seguir.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona meios para a mitigação da lesão tecidular cerebral no seguimento de um acidente vascular cerebral por administração de E-selectina a um doente imediatamente após ou, de um modo preferido, antes da ocorrência do acidente vascular cerebral. De um modo preferido, a E-selectina é administrada de um modo que induz tolerância, como descrito a seguir, de um modo muito preferido tolerância de efeito de proximidade. As considerações com respeito a fontes de E-selectina, doses, vias de distribuição, formulações e semelhantes, são descritas acima para métodos de prevenção de um acidente vascular cerebral. Como demonstrado nos Exemplos anexos, não só a administração de E-selectina reduz significativamente o número de enfartes formados num modelo de rato propenso a acidente vascular cerebral, como os enfartes que se formam são significativamente menores em tamanho do que os enfartes de controlo. Por conseguinte, a tolerância à E-selectina parece minimizar a lesão tecidular cerebral em animais que têm um acidente vascular cerebral enquanto estão num estado de tolerância de E-selectina. Método para Indução de Tolerância de E-Selectina. Um aspecto da presente invenção é um método para a indução de tolerância de 23 E-selectina num hospedeiro. 0 método compreende a administração intranasal de E-selectina. Numa forma de realização preferida, o protocolo consiste em administrações intranasais de reforço de E-selectina.

Numa forma de realização, a tolerância de E-selectina é induzida por um protocolo de administração de cinco em duas de cinco administrações intranasais de E-selectina por um período de duas semanas. Numa forma de realização muito preferida, esta administração de cinco em duas é repetida, pelo menos, uma vez. De um modo muito preferido, este regime de reforço é repetido de três em três semanas para toda a vida do organismo.

Dosagens preferidas, fontes de E-selectina, formulações, volumes de dosagem, regimes e métodos de análise de resultados, com vista à optimização destas considerações para instilações intranasais para a indução de tolerância de E-selectina, são semelhantes às descritas anteriormente para a utilização da administração de E-selectina na prevenção do acidente vascular cerebral. Por exemplo, as dosagens preferidas variam desde 0,5 yg a 50 mg por administração, de um modo preferido para humanos aproximadamente desde 5 yg a 5 mg por administração. A optimização da dosagem necessária para a supressão imunitária envolve não mais do que experimentação de rotina, dadas as directrizes aqui divulgadas. O aspecto actual da invenção para a indução de tolerância de E-selectina tem muitas utilidades. Por exemplo, pode ser utilizado na prevenção e tratamento de acidentes vasculares cerebrais e outras formas de doença vascular, tais como doença arterial coronária. Adicionalmente, pode ser utilizado no tratamento de distúrbios em que se tenha determinado, ou se 24 possa determinar, que a E-selectina desempenha um papel, tal como, por exemplo, lesão pulmonar, psoríase, dermatite de contacto, doença inflamatória intestinal, artrite e semelhantes. (Ver, e. g., Washington R., et al., "Expression of immunologically relevant endothelial cell activation antigens on isolated central nervous system microvessels from patients with multiple sclerosis," Ann. Neurol. 35: 89 (1994); Bevilacqua (1989); Bevilacqua e Nelson, "Selectins," J. Clin. Invest. 91: 379 (1993); Koch, et al., "Immunolocalization of endothelial and leukocyte adhesion molecules in human rheumatoid and osteoarthritic synovial tissues," Lab Invest. 64: 313 (1991); Mulligan, et al., "Role of endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-l) in neutrophil-mediated lung injury in rats," J. Clin. Invest. 88: 1396 (1991); e Mulligan, et al., "Protective effects of oligosaccharides in P-selectin-dependent lung injury," Nature 364: 149 (1993)). A avaliação do efeito de formulações de E-selectina numa resposta imune à E-selectina pode realizar-se, por exemplo, pela determinação da diminuição em certos marcadores de inflamação, tais como o número de clones de células T activados dirigidos contra tecido vascular activado. A tolerância imunológica pode ser medida através de um conjunto de métodos que são bem conhecidos na técnica. Numa forma de realização preferida, a resposta de hipersensibilidade retardada (DTH) pode ser medida em animais pela injecção de E-selectina, por exemplo, na planta da pata de um organismo a analisar e, em seguida, administrar uma injecção de reforço, por exemplo na planta de uma pata ou numa orelha, numa altura posterior, normalmente mais de uma semana mais tarde, de um modo muito preferido 2 semanas mais tarde. As reacções DTH podem ser medidas após a injecção de indução como o aumento do inchaço no local de re-estimulação com 25 antigénio. 0 inchaço da planta do pé ou orelha pode ser medido às, por exemplo, 0, 24 e 48 horas após a provocação.

Os métodos para analisar os efeitos da tolerância de E-selectina na ocorrência de acidente vascular cerebral ou lesão relacionada com acidente vascular cerebral, utilizando ratos propensos a acidente vascular cerebral, é discutido acima e na secção de Exemplos. Este método é útil como medida indirecta da eficácia de uma determinada dosagem, formulação e protocolo na indução de tolerância de E-selectina através de administração intranasal de E-selectina.

Os exemplos seguintes descrevem e ilustram as utilizações e composições da invenção. Pretende-se que estes exemplos sejam meramente ilustrativos da presente invenção e não que a limitem em qualquer âmbito. Os especialistas na técnica perceberão facilmente que podem ser utilizadas variações dos materiais utilizados nos - e nas condições e processos dos - procedimentos descritos nestes exemplos. EXEMPLO 1: Redução de enfartes cerebrais por administração de E-selectina. Foram analisados os efeitos de administração de E-selectina em enfartes dos cérebros de ratos propensos a acidente vascular cerebral. Ratos macho e fêmea propensos a acidente vascular cerebral e espontaneamente hipertensos (SHR-SP) de 8-10 semanas de idade foram obtidos da colónia de NIH. (Okamoto (1974)). Às 11 semanas de idade, E-selectina — (E- selectina humana solúvel: lectina de E-selectina humana, dominios EGF, CRI, CR2, cauda peptidica myc) ovalbumina ou veiculo (PBS) foram administrados intranasalmente. A E-selectina 26 humana purificada foi obtida da Protein Design Laboratories (Fremont, CA) .

As preparações de E-selectina e de controlo foram administradas da seguinte forma: os ratos SHR-SP foram divididos em três grupos: (1) um grupo de controlo de solução salina (PBS), (2) um grupo de administração de E-selectina (grupo ES) e (3) um grupo com ovalbumina (OVA) administrada (grupo OVA). Adicionalmente, os grupos ES e OVA foram divididos em grupos de administração simples (não reforço) e repetitiva (reforço). Para o grupo de controlo, 20 pL de solução salina tamponada com fosfatos (PBS) foram administrados em cada narina de dois em dois dias durante 10 dias para um total de 5 administrações. Para o grupo ES de não reforço, 2,5 pg de E-selectina em 20 pL de PBS foram administrados em cada narina de dois em dois dias durante 10 dias para um total de 5 administrações. Para o grupo ES de reforço, 2,5 pg iniciais de E-selectina em 20 pL de PBS foram administrados como anteriormente para o grupo de não reforço; adicionalmente, 2,5 pg de E-selectina em 20 pL de PBS foram administrados intranasalmente em cada narina de dois em dois dias durante 10 dias (3 semanas após o primeiro processo de E-selectina) e repetida de três em três semanas até ao sacrifício dos animais. Para o grupo OVA de não reforço, 2,5 pg de ovalbumina em 20 pL de PBS foram administrados em cada narina de dois em dois dias durante 10 dias para um total de 5 administrações. Para o grupo OVA de reforço, 2,5 pg iniciais de ovalbumina em 20 pL de PBS foram administrados em cada narina como anteriormente para o grupo de não reforço; adicionalmente, 2,5 pg de ovalbumina em 20 pL de PBS foram administrados intranasalmente em cada narina de dois em dois dias durante 10 dias (3 semanas após o primeiro processo de ovalbumina) e repetida de três em três semanas até ao sacrifício dos animais. 27

Os ratos foram avaliados quanto a sinais físicos e neurológicos de acidente vascular cerebral. Estas avaliações incluíram uma estimativa da excitação (i. e., erecção pilosa, hiperquinesia), hiperirritabilidade (i. e., saltos, tentando a evasão), depressão comportamental e psicológica (i. e., hipoquinesia, hipostenia, hipotonia, hiporreação), perturbação do movimento (i. e., episódio transiente de levantamento repetitivo das patas, ataxia, paresia, paralisia), e sintomas tardios observados perto do momento da morte (í. e., apatia, coma, incontinência urinária). Os ratos foram igualmente monitorizados pela medição da tensão arterial, peso corporal, peso do coração e gasometria arterial utilizando métodos conhecidos na técnica.

Os enfartes foram avaliados da seguinte forma. Quando os animais mostravam sinais de insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou acidente vascular cerebral, eram perfundidos e os seus cérebros removidos para processamento histológico e imagiológico. As secções de 8 níveis estereostáticos pré-determinados foram cortadas de cada cérebro (total de 240 secções). O número e área de enfartes ou hemorragias foram determinados para cada secção de cada animal. A significância estatística de administrações de E-selectina foi determinada pela comparação de grupos de E-selectina com grupos de controlo através de um Modelo de Riscos Proporcionais de Cox.

Os animais viveram durante períodos variáveis desde 14 semanas até ao termo da experiência às 56 semanas. As mortes foram causadas por insuficiência cardíaca e insuficiência renal, secundárias em relação a hipertensão grave (tensão arterial sistólica média de 215 mm Hg), bem como por acidentes vasculares 28 cerebrais. A idade média na altura da morte e a tensão arterial sistólica média não diferiram entre grupos experimentais. 0 grupo experimental de animais que recebeu E-selectina mantido com administrações de reforço teve uma redução estatisticamente significativa na frequência e área de enfartes comparativamente com os grupos de controlo (p < 0,0001) (FIGS 1-7) . A área média de enfartes diminuiu de entre cerca de 6, 873 mm2 até cerca de 27,718 mm2 nos grupos de controlo e de administração única de E-selectina para cerca de 0,002 mm2 no grupo de E-selectina de reforço (i. e., uma redução superior a 99%; ver Tabelas I—IV, FIGS 1 e 3) . O número médio de enfartes diminuiu de cerca de 3,0 para cerca de 7,3 para os grupos de controlo e de administração única de E-selectina para cerca de 0,3 nos grupos de E-selectina de reforço (i. e., uma redução superior a 91%; ver Tabelas I—IV, FIGS 2 e 4) . As hemorragias intraparenquimatosas estiveram ausentes do grupo de E-selectina de reforço, porém estiveram presentes num número médio de desde cerca de 3,2 a cerca de 2,3 por secção cerebral analisada nos grupos de controlo e de administração única de E-selectina (ver Tabelas I-IV e FIGS 1, 2, 5 e 6). 29

Tabela I: Dados do Grupo OVA

Amostra (sexo) Enfartes Hemorragia Intraparenquimatosa Número Área (mm2) Número Área (mm2) 1 (fêmea) 13 6, 966 2 0,439 2 (fêmea) 0 0 0 0 3 (fêmea) 1 0,062 15 0,390 4 (fêmea) 19 133,850 4 0, 950 5 (macho) 15 70,559 1 0,021 6 (macho) 10 10,308 0 0 7 (fêmea) 0 0 0 0 8 (fêmea) 0 0 0 0 Média 7,3 27,718 2,8 0,225

Tabela II: Dados do Grupo OVÂb

Amostra (sexo) Enfartes Hemorragia Intraparenquimatosa Número Área (mm2) Número Área (mm2) 1 (fêmea) 0 0 0 0 2 (macho) 3 0, 734 1 4,784 3 (fêmea) 21 40,502 17 1,372 4 (fêmea) 0 0 0 0 5 (fêmea) 0 0 1 0,063 6 (fêmea) 0 0 0 0 Média 4,0 6,873 3,2 1,037 30

Tabela III: Dados do Grupo ES

Amostra (sexo) Enfartes Hemorragia Intraparenquimatosa Número Área (mm2) Número Área (mm2) 1 (fêmea) 0 0 0 0 2 (macho) 0 0 0 0 3 (fêmea) 9 13,488 5 0,177 4 (fêmea) 14 77,909 13 7,553 5 (fêmea) 0 0 0 0 6 (fêmea) 1 0,012 0 0 7 (macho) 0 0 0 0 8 (macho) 0 0 0 0 Média 3,0 11,426 2,3 0,966

Tabela IV: Dados do Grupo ESb

Amostra Enfartes Hemorragia (sexo) Intraparenquimatosa Número Área (mm2) Número Área (mm2) 1 (macho) 0 0 0 0 2 (fêmea) 0 0 0 0 3 (fêmea) 0 0 0 0 4 (fêmea) 0 0 0 0 5 (macho) 1 0,003 0 0 6 (fêmea) 0 0 0 0 7 (fêmea) 1 0,011 0 0 8 (macho) 0 0 0 0 Média 0,3 0,002 0 0 31 EXEMPLO 2: Indução de tolerância à E-selectina. Foi realizada uma análise a fim de determinar se a tolerância à E-selectina foi induzida pelo protocolo de administração intranasal de E-selectina descrito anteriormente, que resultou na diminuição de lesão tecidular relacionada com acidente vascular cerebral. Para esta análise, preparações de E-selectina ou de controlo em PBS foram administradas a ratos como descrito no Exemplo 1 para os grupos de não reforço. Foi analisada a hipersensibilidade retardada (DTH) pela injecção de 5 pg de E-selectina em 50 pL de PBS e 50 pL adjuvante completo de Freund nas plantas das patas (s.q.) 14 dias após administração intranasal. Catorze dias mais tarde, os ratos foram re-provocados por injecção de 5 pg de E-selectina em 50 pL de PBS na orelha e a espessura de orelha foi medida com microcompassos de espessura (Mitsutoyo) 48 horas mais tarde.

Os resultados do ensaio de hipersensibilidade retardada demonstraram que a instilação intranasal de E-selectina humana induziu tolerância. A administração de E-selectina intranasalmente antes de injecção na planta da pata e de injecção na orelha de indução, resultou numa supressão significativa de inchaço de orelha comparativamente com os grupos de controlo (FIG. 7), conforme medido com microcompassos de espessura da Mitsutoyo. Estes dados demonstram que o protocolo de administração de E-selectina utilizado induziu tolerância à E-selectina.

Lisboa, 23 de Outubro de 2007 32

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de E-selectina, em que a composição farmacêutica é formulada para administração intranasal, aerossol ou inalável.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a E-selectina é E-selectina humana.
3. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a E-selectina é para ser administrada intranasalmente.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a E-selectina é, em primeiro lugar, para ser administrada intranasalmente durante um periodo de duas semanas.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que uma administração de reforço de E-selectina é realizada após uma primeira administração intranasal.
6. Utilização de E-selectina para a preparação de um medicamento para a prevenção e o tratamento de acidente vascular cerebral num mamífero e para mitigar a lesão do tecido cerebral no seguimento de um acidente vascular cerebral. 1
7. Utilização de E-selectina de acordo com a reivindicação 6, em que a tolerância à E-selectina num mamífero e tolerância por efeito de proximidade à E-selectina são induzidas.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 em que a E-selectina é E-selectina humana.
9. Utilização de acordo com as reivindicações 6 a 8, em que o medicamento é formulado para administração via mucosa.
10. Utilização de acordo com as reivindicações 6 a 9, em que a E-selectina é para ser administrada intranasalmente.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a E-selectina é, em primeiro luqar, para ser administrada intranasalmente durante um período de duas semanas.
12. Utilização de acordo com as reivindicações 9 a 11, em que uma administração de reforço de E-selectina é realizada após uma primeira administração intranasal. Lisboa, 23 de Outubro de 2007 2