JP2024514204A - 再発寛解型多発性硬化症を治療するためのエリスロポエチン由来ペプチド - Google Patents

Abstract

エリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果をもたらすために、有効量のＥＰＯ由来ペプチドで多発性硬化症を治療する投与レジメン及び方法が本明細書に記載される。投与レジメン及び方法は、治療サイクル、続いて休止期を含み、ＥＰＯ由来ペプチドは、休止期中に投与されない。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１６日に出願された、米国仮特許出願第６３／１７５，７４２号の利益を主張する。この以前に出願された出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、退役軍人省により授与された助成金番号ＴＸ００１３０５の下で、及び国立衛生研究所により授与された助成金番号ＮＳ０７３５２６の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において、特定の権利を有する。

配列表の援用
本出願は、サイズが１２，２８８バイトであり、２０２２年３月２４日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ファイル名「３７７５９＿０３７８Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」を含む、本出願の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表を含む。

全分子エリスロポエチン（ＥＰＯ）の強力な有益な免疫調節及び抗炎症効果は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む様々な動物疾患モデルにおいて実証されているが、過剰な造血は、臨床用途におけるその使用を制限する。この動物モデルは、疾患病因を研究し、そのヒト対応物である多発性硬化症（ＭＳ）のための新しい療法を探求するために、多くの研究者によって広く使用されている。ＭＳは、原因不明の障害であり、特徴的な症状、徴候、及び進行によって臨床的に定義され、脳、視神経、及び脊髄白質に影響を及ぼす炎症及び脱髄の散在する領域によって病理学的に定義される。ＭＳの病因は、免疫媒介性炎症性脱髄プロセスを伴うと広く考えられている。ＭＳのための治療法は存在しないが、新たな疾患修飾療法が必要とされる。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、投与レジメンが本明細書に開示される。

再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、投与レジメンが本明細書に開示される。

再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

補体成分Ｃ３を減少させる方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

治療を必要とする対象において、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、組成物が、炎症成分又は自己免疫成分を有する少なくとも１つの疾患、障害、又は状態からの少なくとも１つの症状を改善するのに有効である、方法が本明細書に開示される。

患者における多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品の製造のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの使用であって、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなる、使用が本明細書に開示される。

患者における多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品の製造のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの使用であって、治療が、ＥＰＯ由来ペプチドの第１の治療サイクル、続いてＥＰＯ由来ペプチドの少なくとも１つの更なる治療サイクルを含み、各治療サイクルが、連続した日に適用される１～１４回の用量を含み、１日用量が、＞０及び≦１０ｍｇであり、各治療サイクルが、次の治療サイクルから少なくとも１～２４ヶ月離れている、使用が本明細書に開示される。

本発明の組成物及び方法の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面、及び特許請求の範囲に示されている。

ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ ＥＡＥマウスにおけるＧＦＡＰ ｍＲＮＡ及びルシフェラーゼの相対発現を示す。ｍＲＮＡを、免疫化後０、７、及び１４日目にＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウス脳から抽出し、リアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。ＧＦＡＰ ｍＲＮＡとルシフェラーゼとの間に強い相関が確認された。ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスは、７日目及び１４日目にＧＦＡＰ及びルシフェラーゼの増加した発現を示した（ｎ＝３、７日目に６～７倍増加、１４日目に２３～２５倍増加）。 ＪＭ－４治療単相性ＭＯＧ ＥＡＥマウスにおける臨床スコアを示す。ＭＯＧ免疫化ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７マウスは、免疫化の１１日後に有意な神経障害を発症した。９日目にＪＭ－４（５μｇ ＩＶ 毎日１２日間）での治療を開始した。ＪＭ－４治療ＭＯＧ動物におけるピーク臨床スコアは、シャム治療ＭＯＧ ＥＡＥマウスと比較して有意により低かった（ｎ＝８ ＪＭ－４治療、ｎ＝８ シャム治療、ｐ＜０．０５）。 ＪＭ４での顕著なポジティブな治療効果はまた、臨床スコアと相関するＧＦＡＰ－ｌｕｃ ＢＬＩ評価によって見られることを示す。図３Ａは、ＭＯＧ誘発性ＥＡＥにおけるＪＭ－４での治療後のインビボイメージングを示す。ＭＯＧ誘発性ＥＡＥ（下部パネル）を有するシャム治療ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７マウス（上部パネル）及びＪＭ－４治療マウスを、２１日にわたってＢＬＩを使用して監視した。９日目にＪＭ－４（５μｇ ＩＶ 毎日１２日間）での治療を開始した。このＪＭ－４治療動物は、治療後２日以内により低い脊髄ピーク強度、及び４日目までに脊髄シグナルの実質的な不在を示した（図３Ｂ、図３Ｃ）。ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスにおける前脳（図３Ｂ）及び脊髄（図３Ｃ）における生物発光の相対強度。 ＪＭ４での顕著なポジティブな治療効果はまた、臨床スコアと相関するＧＦＡＰ－ｌｕｃ ＢＬＩ評価によって見られることを示す。図３Ｂは、ピーク生物発光値が、前脳及び脊髄の両方において、ＪＭ－４治療ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ ＥＡＥマウスにおいて有意により低かったことを示す（脳ｎ＝８、ｐ＜０．０５、脊髄ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスを、９日目に開始してＪＭ－４（５μｇ ＩＶ毎日１２日間）で治療した。相対強度を、左耳値と比較した病変における光子強度の比として測定した。 ＪＭ４での顕著なポジティブな治療効果はまた、臨床スコアと相関するＧＦＡＰ－ｌｕｃ ＢＬＩ評価によって見られることを示す。図３Ｃは、ピーク生物発光値が、前脳及び脊髄の両方において、ＪＭ－４治療ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ ＥＡＥマウスにおいて有意により低かったことを示す（脳ｎ＝８、ｐ＜０．０５、脊髄ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスを、９日目に開始してＪＭ－４（５μｇ ＩＶ毎日１２日間）で治療した。相対強度を、左耳値と比較した病変における光子強度の比として測定した。 ２匹の未治療ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ再発寛解型ＥＡＥマウスにおけるＢＬＩ及び臨床スコアの縦断的評価を示す。黒色バーは、生物発光再燃を表す。図４Ａは、初期臨床症状（１４～２２日目）後、マウスが２８日目から７３日目まで無症状のままであったことを示す（上部パネル）。強いＢＬＩ増強にもかかわらず、臨床相関はなかった（５４～６４日目）。対照的に、ＢＬＩ増強の第３のエピソードは、重度麻痺を有する強い臨床再発に対応した（７８～８１日目）。 ２匹の未治療ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ再発寛解型ＥＡＥマウスにおけるＢＬＩ及び臨床スコアの縦断的評価を示す。黒色バーは、生物発光再燃を表す。図４Ｂは、第２の動物（下部パネル）において、ＢＬＩと臨床スコアリングとの間に相関が一貫して見られたことを示す。脳及び脊髄における増加したＢＬＩシグナルは、３つの異なるエピソード（１１～３０日目、４５～６０日目、９０～１００日目）における増加した臨床欠損と関連付けられた。 長期ＰＬＰ誘発性再発寛解型ＥＡＥにおける臨床スコアを示す。ＧＦＡＰ－ｌｕｃ／ＳＪＬマウスを、９日目に開始してＪＭ－４（５μｇ ＩＶ）で１２日間治療した。ＪＭ－４治療群における平均臨床スコアは、５ヶ月超にわたってシャム治療群と比較して顕著に低減したままであった（ｎ＝４ ＪＭ－４治療、ｎ＝５シャム治療、６０日目以降のｐ＜０．０５）。 ＪＭ－４（５μｇ ＩＶ毎日１２日間）で治療されたＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ再発寛解型ＥＡＥマウスにおける脊髄生物発光の再燃に対するポジティブな治療効果を示す。疾患経過中のバックグラウンドにかけての脊髄生物発光シグナルのエピソードを計算した。ＪＭ－４治療は、シャム治療群における再燃と比較して、イメージング再燃の数を有意に減少させた（ｎ＝８ ＪＭ－４治療、ｎ＝７ シャム治療、ｐ＜０．０５）。灰色バーは、標準誤差を表す（平均＋／－ＳＥＭシャム治療１０．２９＋／－２．４４７、ＪＭ－４治療４．０＋／－１．０１８）。 ＪＭ－４が、ＳＪＬ／Ｊ再発寛解型ＥＡＥマウスにおける脊髄脱髄及び軸索損傷に対して保護的であることを示す。図７Ａは、シャム治療ＥＡＥマウスにおけるミエリン（左側パネル）のルクソールファストブルー染色が、ＪＭ－４治療動物と比較して、脊髄の腹側白質において顕著な脱髄及び空胞化を示すことを示す。ＪＭ－４治療マウスにおけるＳＭＩ－３２染色軸索（右側パネル）は、シャム治療ＥＡＥ対照マウスと比較して、腹側脊髄の周辺部（白質）を縁取る損傷した軸索の数の大幅な低減を示す。 ＪＭ－４が、ＳＪＬ／Ｊ再発寛解型ＥＡＥマウスにおける脊髄脱髄及び軸索損傷に対して保護的であることを示す。図７Ｂは、ＪＭ４療法が血液脳関門の分解を減衰させることを示す。脊髄切片をマウスＩｇＧについて染色して、血清漏出が発生したかを判定した。正常なマウス脊髄切片では、ＩｇＧは検出されない。対照的に、生理食塩水治療ＥＡＥマウスは、脊髄の白質に最も顕著に見られる増加した免疫反応性を示した。ＪＭ４での治療は、ＥＡＥ髄におけるＩｇＧ免疫反応性の量を正常の近くまで大幅に低減した。 ＪＭ－４での治療がＥＡＥマウスの脊髄における有意に低減したＡ１アストロサイト活性化をもたらすことを示す。図８Ａは、正常マウスと比較したＥＡＥマウスにおける補体成分Ｃ３の有意な上昇調節、及びＥＡＥマウスにおけるＪＭ－４での治療後のＣ３免疫反応性の有意な減少を示す定量的分析を示す（データは平均＋／－ｓ．ｅ．ｍを表す）。 ＪＭ－４での治療がＥＡＥマウスの脊髄における有意に低減したＡ１アストロサイト活性化をもたらすことを示す。図８Ｂは、ＪＭ－４治療ＥＡＥマウスの脊髄におけるＧＦＡＰ（緑色）及びＣ３（赤色）の両方の免疫反応性の低減を示す免疫蛍光画像を示す。併合画像は、ほとんどのＣ３免疫反応性がＧＦＡＰ陽性アストロサイト（黄色）で見出されることを示した（群当たりｎ＝７、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、続いてＥＡＥマウスとＪＭ－４治療ＥＡＥマウスとの間のボンフェローニ比較）。

本明細書に記載される本開示の多くの修正及び他の実施形態は、前述の説明及び関連する図面に提示される教示の利益を有するこの開示が関連する当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本開示が開示される特定の実施形態に限定されず、修正及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。特定の用語が本明細書で採用されるが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定の目的では使用されない。

本発明の組成物及び方法を開示し、説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬（当然、変化し得るため）に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定することが意図されないことも理解されるべきである。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の実施又は試験において使用され得るが、方法及び材料の例が、これより記載される。

更に、特に明記されない限り、本明細書に示される任意の方法が、そのステップが特定の順序で実施されることを要求するものとして解釈されることは決して意図されないことが理解されるべきである。したがって、方法の請求項が、そのステップが従う順序を実際に列挙していないか、又は特許請求の範囲若しくは説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであると具体的に記述されない場合、いかなる点においても、順序が推論されることは決して意図されない。これは、ステップ又は操作フローの配置、文法的な構成若しくは句読点に由来する明白な意味、及び明細書に記載される態様の数若しくはタイプに関する論理事項を含む、解釈のための任意の可能な非明示的根拠について保持される。

本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連する方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなるものも、本開示が、先行開示のためにそのような公開に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、本明細書で提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認することができる。

定義
本明細書において及び特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の態様を含むことができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はまた、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することができるが、これに限定されない。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含み得る。したがって、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、化合物の混合物を含み、「薬学的担体（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及は、２つ以上のこのような担体の混合物を含むなど。本明細書で使用される「又は」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

本明細書で使用される場合、「任意選択的な」又は「任意選択的に」という用語は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよく、又は生じなくてもよいことを意味し、この説明には、当該事象又は状況が生じる場合、及び生じない場合が含まれることを意味する。

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本明細書に記載されるようにアッセイされる、対象からの組織又は臓器；細胞（対象内、対象から直接的に採取される、又は培養物中で維持される細胞、又は培養された細胞株からのもののいずれか）；細胞溶解物（若しくは溶解物画分）又は細胞抽出物；又は細胞又は細胞材料（例えば、ポリペプチド又は核酸）から誘導される１つ以上の分子を含有する溶液を意味する。試料はまた、細胞又は細胞成分を含有する任意の体液又は排泄物（例えば、限定されないが、血液、尿、糞便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。よって、開示される方法の対象は、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。「対象」という用語には、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含まれる。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、成人、子供、青年期及び新生児の対象、並びに雌雄を問わない胎児が包含されることが意図される。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患又は障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。開示される方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与ステップの前などに、多発性硬化症の治療の必要があると診断されている。

本明細書では、範囲は、「約」又は「およそ」ある特定の値から、及び／又は「約」又は「およそ」別の特定の値までのように表現され得る。そのような範囲が表される場合、更なる態様は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」又は「およそ」の使用により近似値として表される場合、特定の値が更なる態様を形成することを理解されたい。更に、範囲の各終点は、他の終点と関連して、及び他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解されたい。例えば、１０～１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

「阻害する」、「阻害すること」、及び「阻害」は、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータを低減又は減少させることを意味する。これには、限定されないが、活性、応答、状態、又は疾患の完全な除去が含まれ得る。これには、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患の１０％の阻害又は低減も含まれ得る。よって、いくつかの態様では、阻害又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はその間の任意の量の低減であり得る。いくつかの態様では、阻害又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００％である。いくつかの態様では、阻害又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００％である。

本明細書で使用される「調節する」、「調節すること」、及び「調節」は、活性又は機能又は数の変化を意味する。変化は、活性、機能、又は数の増加又は減少、増強、又は阻害であってもよい。

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態を部分的又は完全に軽減するか、緩和するか、和らげるか、その発症を遅らせるか、その進行を阻害するか、若しくは遅延させるか、その重症度を低減するか、及び／又はその１つ以上の症状又は特徴の発生を低減することを指す。治療は、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病的状態を発症するリスクを減少させる目的のために、疾患、障害、及び／若しくは状態の徴候を示さない対象、及び／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の初期徴候のみを示す対象に投与され得る。治療はまた、疾患、障害、及び／又は状態の症状の１つ以上の徴候を緩和するために、対象に投与することができる。例えば、疾患、障害、及び／又は状態は、多発性硬化症に関連し得る。

本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、製剤、薬物、又は免疫剤の特徴、有効性、又は効力を改善する任意の成分を指す。

本明細書で使用される「投与する」という用語は、分配すること、供給すること、適用すること、与えること、割り当てること、又は寄与することを指す。「投与すること」又は「投与」という用語は、交換可能に使用され、インビボ投与、及びエクスビボでの直接的な組織への投与を含む。一般に、組成物は、経口、頬側、非経口、局所、吸入若しくは吸引によって（すなわち、口を通して若しくは鼻を通して）、又は直腸のいずれかで、所望に応じて従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含有する投与単位製剤中で全身投与され得るか、又はこれらに限定されないが、注射、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、局所適用、若しくは非経口などの手段によって局所投与され得る。本明細書で使用される「非経口」という用語は、例えば、皮下（すなわち、皮膚の下への注射）、筋肉内（すなわち、筋肉への注射）、静脈内（すなわち、静脈への注射）、髄腔内（すなわち、脊髄の周りの空間又は脳のくも膜の下への注射）、胸骨内注射又は注入技法を含む、注射（すなわち、注射による投与）による体内への導入を指す。非経口投与される組成物は、針、例えば、外科用針を使用して送達される。本明細書で使用される「外科用針」という用語は、流体（すなわち、流れることができる）組成物の選択された解剖学的構造への送達に適合された任意の針を指す。注射用調製物、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。

追加の投与は、例えば、静脈内、心膜内、経口、インプラントを介して、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、リンパ管内、腫瘍内、又は硬膜外で実施され得る。投与は、例えば、１回、複数回、及び／又は１つ以上の長期間かけて実施することができる。

本明細書で使用される「担体」という用語は、天然又は合成の、有機又は無機成分を指し、活性成分を組み合わせて、生物に著しい刺激を引き起こさず、記載される発明の組成物の生物学的活性及び特性を無効化しない用途を促進する。担体は、治療される対象への投与に適したものにするために、十分に高い純度及び十分に低い毒性を有していなければならない。担体は、不活性であり得るか、又は薬学的利益、美容上の利益、若しくは両方を有し得る。

本明細書で使用される「接触させる」という用語は、接触している、又は直接的若しくは局所的近接性の状態（ｓｔａｔｅ）又は状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を指す。本明細書で使用される「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、接触させること（ｂｒｉｎｇｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ又はｐｕｔｔｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ）を指す。組成物を、これらに限定されないが、臓器、組織、細胞、又は腫瘍などの、標的目標に接触させることは、当業者に知られる任意の投与手段によって生じ得る。

「ＥＰＯ由来オリゴペプチド」、「エリスロポエチン（ＥＰＯ）由来オリゴペプチド」、「ＥＰＯ ＡＢループペプチド」、及び「短ＥＰＯペプチド」という用語は、哺乳動物エリスロポエチン（ＥＰＯ）の断片をコードする単離又は合成ペプチドを指すために交換可能に使用される。本明細書で使用される「オリゴペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接続された少数（例えば、２～約３０）のアミノ酸残基を含有する任意の分子を指す。本明細書で使用される「ＥＰＯ由来オリゴペプチド」という用語は、通常はペプチドの一部ではない、追加の化学部分を含有する、哺乳動物エリスロポエチン（ＥＰＯ）の断片をコードする単離又は合成ペプチドも含む。

本明細書で使用される「投与レジメン」は、少なくとも１つの治療サイクル、続いて少なくとも１つの休止期を指す。投与レジメンは、２つ以上の治療サイクル及び２つ以上の休止期を含むことができる。例えば、投与レジメンは、１週間の治療サイクル、続いて５ヶ月の休止期であり得る。別の例は、２週間の治療サイクル、続いて１年の休止期、次いで１週間の治療サイクル、続いて１年の休止期であり得る。

本明細書で使用される場合、「治療サイクル」という用語は、確立された期間にわたるＥＰＯ由来ペプチドの投与を指す。治療サイクルは、ＥＰＯ由来ペプチドの幅広い投与量及びＥＰＯ由来ペプチドを投与するための異なる時間の長さを含む。例えば、治療サイクルは、３ヶ月の期間であり得、ＥＰＯ由来ペプチドは、３ヶ月の期間にわたって１週間に２回投与することができる。

本明細書で使用される「用量」又は「投与量」は、特定の時間に服用される、ＥＰＯ由来ペプチドなどの、治療剤の特定の量を指す。

本明細書で使用される場合、「有効量」は、所望の効果を提供するのに十分な量の組成物又はＥＰＯ由来ペプチドを意味することを意味する。例えば、有効量のＥＰＯ由来ペプチドは、治療効果を提供し、治療の離脱後に持続的な治療効果を提供する量であり得る。有効量のＥＰＯ由来ペプチドは、再発寛解型多発性硬化症を減少させること、脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減すること、補体成分Ｃ３を減少させること、及び／又は炎症成分若しくは自己免疫成分を有する少なくとも１つの疾患、障害、若しくは状態からの少なくとも１つの症状を改善することによって例示される利益を引き起こすことができる量、並びにＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にする量である。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態、治療されている疾患（又は根底にある遺伝的欠陥）の重症度、使用される特定の化合物、その投与様式などに応じて、対象毎に変動するであろう。よって、正確な「有効量」を指定することは不可能である。しかしながら、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者によって判定され得る。

本明細書で使用される場合、「持続的な治療効果」は、治療薬が離脱された後に持続する治療効果である。

本明細書で使用される「休止期」は、ＥＰＯ由来ペプチドが投与されない期間を指す。

本明細書で使用される「ペプチド」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を指す。ペプチドは、連続したアミノ酸からなる。「ペプチド」という用語は、天然に存在する又は合成分子を包含する。

本明細書で使用される場合、「治療する」とは、疾患若しくは状態の悪化を防止又は遅延させるため、又は疾患の効果を部分的若しくは完全に逆転させるために、多発性硬化症を有する、ヒト又は他の哺乳動物（例えば、動物モデル）などの、対象に、開示される組成物のうちの１つを投与することを意味する。

本明細書で使用される場合、「予防する」は、多発性硬化症を発症するために増加した感受性を有する対象が多発性硬化症を発症する可能性を最小限に抑えることを意味する。

本明細書に述べられる全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたときと同じ程度に、本明細書において参照により組み込まれる。

前述の発明は、理解の明確化の目的のために説明及び例によっていくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び修正を実施することができる。

投与レジメン
有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンが本明細書に開示される。投与レジメンの休止期は、ＥＰＯ由来ペプチドが投与されない期間であり得る。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、投与レジメンが本明細書に開示される。有効量のＥＰＯ由来ペプチドは、持続的な治療効果をもたらすだけでなく、急性の有益な効果をもたらすのに十分な量でもある。よって、ＥＰＯ由来ペプチドの効果は、治療サイクル中、治療サイクルの終了時、及び休止期中に測定及び観察することができる。持続的な治療効果は、薬物効果が消失した後でも見られる治療効果である。いくつかの態様では、治療サイクルは、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、毎日投与することを含むことができる。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを７～１４日間、毎日投与することを含む、投与レジメンが本明細書に開示される。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを１０～１２日間、毎日投与することを含む、投与レジメンが本明細書に開示される。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、治療サイクルが、休止期後に第２の治療サイクルを更に含む、投与レジメンが本明細書に開示される。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、投与レジメンが本明細書に開示される。いくつかの態様では、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）は、アミノ末端を保護するアセチル基及びカルボキシル末端を保護するアミド基で末端保護される。

投与レジメンは、休止期後に第２の治療サイクルを更に含むことができる。第２の休止期は、第２の治療サイクル後に行われ得る。いくつかの態様では、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の治療サイクルを投与することができ、各治療サイクルに休止期が続く。いくつかの態様では、投与レジメンは、無限の治療サイクルを含み、各々に休止期が続く。例えば、対象は、その寿命にわたる連続した治療サイクル、続いて休止期を伴う投与レジメンを処方され得る。

いくつかの態様では、第２の投与レジメンは、多発性硬化症又は他の神経学的欠損の１つ以上の症状の再発に基づいて処方することができる。第２の投与レジメンは、初期投与レジメンが投与された１、２、３、４、５ヶ月、又は５ヶ月超後に投与することができる。第２の投与レジメンは、初期投与レジメンと同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、初期投与レジメンは、１週間の治療サイクル、続いて５ヶ月の休止期であり得る。５ヶ月の休止期の後、対象を試験することができ、１つ以上の症状又は１つ以上の神経学的欠損が進行しているか、又は重症度若しくは持続時間において悪化している場合、更なる１週間の治療サイクル、続いて休止期、又は２週間の治療サイクル、続いて休止期からなる第２の投与レジメンを処方することができる。ＥＰＯ由来ペプチドの用量は、初期投与レジメンと任意の追加で処方された投与レジメンとの間で変動し得る。いくつかの態様では、多発性硬化症の１つ以上の症状は、視力喪失、疼痛、疲労、及び協調運動障害であり得る。いくつかの態様では、改善は、多発性硬化症の１つ以上の症状において、例えば、多発性硬化症の１つ以上の症状の重症度又は持続期間において観察され得る。

少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを１週間にわたって毎日投与することを含むか、又は治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドの２週間にわたる毎日の投与を含む、投与レジメンが本明細書に開示される。

治療サイクル
治療サイクルは、異なる投与量のＥＰＯ由来ペプチドの投与、及び異なる時点での投与を含むことができる。ＥＰＯ由来ペプチドは、最大１ヶ月にわたって変動する量で投与することができる。いくつかの事例では、投与は、毎日最大１週間、２週間、３週間、又は４週間にわたって行われ得る。例えば、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日にわたって投与することができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎日１又は２週間にわたって投与することができる。

各治療サイクルの時間の長さは、投与量当たり投与されるＥＰＯ由来ペプチドの量に応じて変動し得る。治療サイクルは、ＥＰＯ由来ペプチドの１日１回、２回、又は３回の投与を含むことができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎週投与することができる。いくつかの態様では、アポＥ模倣物は、２日毎に１回又は更には１週間に１回投与することができる。いくつかの例では、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間投与することができる。例えば、治療サイクルは、ＥＰＯ由来ペプチドを１日１回１週間にわたって又は毎日２週間にわたって投与することを含むことができる。よって、各治療サイクルは、投与についての確立された時間の長さ、及びその時間枠中の確立された投与スケジュールを含む。

いくつかの態様では、治療サイクル中に２つ以上のＥＰＯ由来ペプチドを投与することができる。２つ以上のＥＰＯ由来ペプチドは、一緒に又は別々の組成物に製剤化することができる。いくつかの事例では、１つ以上のＥＰＯ由来ペプチドは、１つ以上の他の治療剤、例えば、これらに限定されないが、クラドリビン、フマル酸ジメチル、フマル酸ジロキシメル、フィンゴリモド、フマル酸モノメチル、オザニモド、シポニモド、テリフルノミド、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ペグインターフェロンベータ－１ａ、アレムツズマブ、ミトキサントロン塩酸塩、ナタリズマブ、オファツムマブ、ポネシモド、及びオセレリズマブを含む、疾患修飾剤、抗炎症剤、抗けいれん剤、免疫修飾療法、又はステロイドと組み合わせて投与される。

休止期
開示される投与レジメンは、少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む。休止期は、ＥＰＯ由来ペプチドが投与されない期間であり得、期間の長さは、変動し得る。休止期の長さは、治療サイクル中に投与されるＥＰＯ由来ペプチドの持続的な治療効果がどのくらい持続するかに依存する。いくつかの態様では、休止期は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月であり得る。いくつかの態様では、休止期は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０年であり得る。例えば、休止期は、少なくとも１週間、２週間、３週間、又は４週間（１ヶ月）であり得る。

どれくらい休止期が持続するべきかを判定する１つの方法は、対象を試験又は評価して、対象における神経学的欠損の進行を判定することである。神経学的欠損が対象の障害を増加させるレベルまで進行した場合、対象は、第２の投与レジメンが処方され得る。神経学的欠損が安定しているか又は改善していた場合、休止期は、延長することができる。対象は、定期的に試験することができる。例えば、対象は、１、２、３、４、５、６、７日毎、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２週間毎、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２４、３０、若しくは３６ヶ月毎に試験することができる。

いくつかの態様では、休止期は、投与されるＥＰＯ由来ペプチドの用量及び治療サイクル中に達成される神経学的欠損の低減に応じて短縮又は延長することができる。例えば、休止期は、治療サイクル中のＥＰＯ由来ペプチドの用量が増加し、神経学的欠損が実質的に低減し、かつ／又は臨床的スコアリングシステムが実質的に改善される場合、延長することができる。休止期の長さはまた、治療サイクルの長さに基づいて変動することができる。例えば、対象が特定の用量のＥＰＯ由来ペプチドを１週間にわたって毎日受ける場合、休止期は、同じ用量のＥＰＯ由来ペプチドを２週間にわたって週１回受ける対象よりも短い場合がある。表２は、神経学的欠損を定量化するための臨床スコアリングシステムを提供する。いくつかの態様では、対象は、神経学的検査、総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）を使用して、イメージング、及び時限２５フィート歩行を介して評価することができる。例えば、神経学的欠損は、神経学的検査を使用して判定することができ、所見は、正常から逸脱する。

いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、休止期中に投与されないが、ＥＰＯ由来ペプチド以外の多発性硬化症治療薬は、休止期中に投与することができる。

いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドの有益な効果は、治療サイクルが完了した後でも、依然として対象に存在し得る。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、治療サイクルが完了した後、対象においてもはや検出不能である。よって、長期治療効果は、残留ＥＰＯ由来ペプチドからのものではない。

用量
ＥＰＯ由来ペプチドの用量又は投与量は、これらに限定されないが、投与の経路、製剤、患者の状態／疾患の重症度、以前の治療、患者のサイズ、体重、表面積、年齢、及び性別、投与されている他の薬物、並びに他の疾患、障害、若しくは疾病の存在若しくは不在を含む患者の全体的な全般的な健康状態、治療サイクルの長さ、又は他の薬物がレジメンに含まれるかなどの、多くの因子に依存して変動し得、当業者によって判定され得る。患者に投与される薬学的組成物の特定の投与量は、様々な考慮事項（例えば、疾患、障害、又は状態の症状の重症度）、対象の年齢及び身体的特徴、並びに当業者に既知の他の考慮事項に依存するであろう。必要とされる投与量の変動が予想され得る。投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験的経路を使用して調整することができる。投与量は、当業者に既知の臨床的アプローチを使用して確立することができる。本明細書に記載の組成物の投与は、単回又は複数回（例えば、２回、又は３回、４回、６回、８回、１０回、２０回、５０回、１００回、１５０回、又はそれより多く）であり得る。

有効投与量は、経験的に判定することができ、そのような判定を行うことは、当該技術の範囲内である。組成物の投与についての投与量範囲は、疾患が治療される所望の効果をもたらすのに十分な大きさのものである。例えば、投与量は、治療効果を提供し、治療（すなわち、ＥＰＯ由来ペプチド）が離脱された後でさえ、持続的な治療効果を提供する又は可能にするのに有効な量であり得る。治療効果は、これらに限定されないが、脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減すること、補体成分Ｃ３を減少させること、上昇した単核細胞数を低減すること及び／又は正常に戻すこと、樹状細胞の数を減少させること、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＮＦ－ガンマ）を減少させること、Ｔｒｅｇ細胞を増殖させること、並びにＴヘルパーＴｈ１７陽性細胞の数の低減することであり得る。治療効果は、神経炎症のマーカーによって測定することができる。治療効果は、放射線イメージング（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ（造影剤あり又はなし））、総合障害度評価尺度、生物発光イメージング、血清バイオマーカー、例えば、非リン酸化ニューロフィラメントタンパク質、神経学的検査、又は他の既知の方法によって測定することができる。

投与量は、有害な副作用、例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほどに大きいものであってはならない。投与量は、いずれかの禁忌の事象では、個々の医師によって調整することができる。投与量は、異なってもよく、１日又は数日間、１日１回以上の用量投与で投与することができる。ガイダンスは、所与のクラスの医薬品の適切な投与量についての文献に見出すことができる。

好適な投与量には、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの量が含まれるが、これらに限定されない。例えば、開示されるＥＰＯ由来ペプチドのうちの１つ以上を対象に投与することを伴う方法であって、ＥＰＯ由来ペプチドが、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、約５、６、７、８、９、若しくは１０ｍｇの量、又はその間の任意の量で毎日投与することができる。

ＥＰＯ由来ペプチド用量は、ボーラス注射として、又は１時間以上にわたる注入として投与することができる。

ＥＰＯ由来ペプチド
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞の増殖、生存、及び末端分化に関与する多面発現性サイトカインである（Ｂｕｎｎ Ｆ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ２０１３；３：ａ０１１６１９、及びＭａｒｔｉｎｅｚ Ｆ ａｎｄ Ｐａｌｌｅｔ Ｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２０１４；９：１８８７－１８８９）。全分子ＥＰＯは、ベータ－アミロイド分解を防止することによって動物モデルにおいて虚血性毒性に対する神経保護を提供し、脳損傷を改善し、記憶を改善する（Ｌｅｅ ＳＴ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２；１２０：１１５－１２４、Ｓｈａｎｇ ＹＣ，ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ ２０１２；４：１８７－２０１、Ｌｉ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１７；１９４：１５－２５、及びＷｅｉ Ｓ，Ｌｕｏ Ｃ，Ｙｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７；３６１：３４２－３５２）。神経炎症性障害のための新しい治療アプローチの開発におけるＥＰＯの潜在的な治癒役割を考慮すると、そのメカニズム及びその下流効果をより明確に定義するための研究努力が進行中のままである（Ｍａｉｅｓｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｎｅｗ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ ２０１２；１３：１１１０２－１１１２９）。

ＥＰＯ由来ペプチドの例を表１に提供する。

「エリスロポエチン」（ＥＰＯ）という用語は、赤血球分化の調節及び循環赤血球量の生理学的レベルの維持に関与する主要なホルモンを指す。ＥＰＯ分子は、成熟形態へと更に加工されるアミノ酸配列（配列番号１０）ＭＧＶＨＥＣＰＡＷＬＷＬＬＬＳＬＬＳＬＰＬＧＬＰＶＬＧＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫＥＡＥ ＮＩＴＴＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩ ＴＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡ ＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＷＥＰＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳＰＰＤ ＡＡＳＡＡＰＬＲＴＩ ＴＡＤＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲを有する１９３アミノ酸ペプチドである。

ＥＰＯ分子は、１）アミノ酸配列（配列番号１１）ＭＧＶＨＥＣＰＡＷＬＷＬＬＬＳＬＬＳＬＰＬＧＬＰＶＬＧを有する単一ペプチド（１～２７位）と、２）アミノ酸配列（配列番号１２）ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫＥＡＥＮＩ ＴＴＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳ ＥＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳ ＳＱＰＷＥＰＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲＡＬＧＡＱＫＥＡＩ ＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲを有する鎖（２８～１９３位）と、３）アミノ酸配列ＴＧＤＲ（配列番号１３）を有するプロペプチド（１９０～１９３位）と、４）プロペプチド（１９３位）（Ｒ）と、を含む。

「全ＥＰＯ」及び「全ＥＰＯ分子」という用語は、アミノ酸配列（配列番号１４）ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫＥＡＥＮＩ ＴＴＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＮＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳ ＥＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳ ＳＱＰＷＥＰＬＱＬＨＶＤＬＡＶＳ ＧＬＲＥＬＴＴＬＬＲＡＬＧＡＱＬＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＡＴＩＴＡＮＴＥＲＫＬＥＲＶＹＳＮＡＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＱＥＡＣＲＴＧＤとの実質的な同一性を有する、組換えＥＰＯタンパク質の１６５アミノ酸ペプチドバックボーン（鎖）を指すために、本明細書で交換可能に使用される。このバックボーンは、Ａｓｐ２４、Ａｓｐ３８、及びＡｓｐ８３に結合した３つのＮ結合炭水化物、並びにＳｅｒ１２６に結合した１つのＯ結合炭水化物を含有する。（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：６９３－７０２，１９８６を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

治療方法
本明細書に開示される組成物、投与レジメン、及び方法は、多発性硬化症を有する対象の治療に有用であり得る。例えば、少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期について、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与することによって、多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症を治療する方法、脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減する方法、補体成分Ｃ３を減少させる方法、及び／又は炎症成分若しくは自己免疫成分を有する疾患、障害、若しくは状態を治療する方法が本明細書に開示される。よって、開示される方法は、開示される投与レジメンのうちの１つ以上を使用してＥＰＯ由来ペプチドを投与することを含むことができる。よって、開示される治療サイクル又は休止期のいずれかは、開示される方法で使用することができる。本明細書に開示される方法は、治療薬の不在下であっても、長期治療効果を可能にすることができる。開示される方法は、有効量のＥＰＯ由来ペプチドの投与を含むことができる。ＥＰＯ由来ペプチドの有効量は、ＥＰＯ由来ペプチドが離脱された後に持続的な治療効果を可能にする量であり得る。

いくつかの態様では、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態は、認知症、急性脳血管損傷、急性脊髄損傷、急性外傷性脳損傷及び反復性軽度外傷性脳損傷、急性心血管損傷、関節炎、自己免疫疾患、脱髄疾患、脳卒中、多発性硬化症、神経損傷、並びに免疫媒介性炎症であり得る。

多発性硬化症を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなる。

再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなる。

再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

補体成分Ｃ３を減少させる方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されない、方法が本明細書に開示される。

治療を必要とする対象において、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、治療サイクルに休止期が続き、ＥＰＯ由来ペプチドが、休止期中に投与されず、組成物が、炎症成分又は自己免疫成分を有する少なくとも１つの疾患、障害、又は状態からの少なくとも１つの症状を改善するのに有効である、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態は、認知症、急性脳血管損傷、急性脊髄損傷、急性外傷性脳損傷及び反復性軽度外傷性脳損傷、急性心血管損傷、関節炎、自己免疫疾患、脱髄疾患、脳卒中、多発性硬化症、神経損傷、並びに免疫媒介性炎症であり得る。

開示されるＥＰＯ由来ペプチドのうちのいずれかは、開示される方法で使用することができる。例えば、ＥＰＯ由来ペプチドは、ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１、ＪＭ－４）であり得、具体的には、ＥＰＯ由来ペプチドは、アミノ末端にアセチル基及びカルボキシル末端にアミド基を有するＪＭ－４ペプチドであり得る。

ＥＰＯ由来ペプチドを使用する方法も本明細書に開示される。例えば、患者における多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品の製造のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの使用が本明細書に開示される。いくつかの態様では、治療は、ＥＰＯ由来ペプチドの第１の治療サイクル、続いてＥＰＯ由来ペプチドの少なくとも１つの更なる治療サイクルを含むことができ、各治療サイクルは、連続した日に適用される１～１４回の用量を含み、１日用量は、＞０及び≦１０ｍｇであり、各治療サイクルは、次の治療サイクルから少なくとも１～２４ヶ月離れている。いくつかの態様では、少なくとも１つの更なる治療サイクルは、第１の治療サイクル後少なくとも５ヶ月で投与することができる。いくつかの態様では、少なくとも１つの更なる治療サイクルは、第１の治療サイクルよりも短い期間にわたって同じ１日用量であり得る。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドの第１の治療サイクルは、５日間５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ／日の用量であり得る。いくつかの態様では、患者は、第１の治療サイクル後１２ヶ月で、５日間６、７、８、９、又は１０ｍｇ／日の用量でのＥＰＯ由来ペプチドの更なる治療サイクルで再治療することができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドの２つの初期治療サイクルに、再生されたＭＳ活性の証拠に対してのみ、ＥＰＯ由来ペプチドの第３以降の治療サイクルが続き得る。いくつかの態様では、第３以降の治療サイクルは、１週間５～１０ｍｇ／日の用量であり得る。いくつかの態様では、再生されたＭＳ活性の証拠は、臨床的手段によって診断することができる。いくつかの態様では、臨床的手段は、神経障害の再発又は進行からなる群から選択することができる。いくつかの態様では、再生されたＭＳ活性の証拠は、脳又は脊髄の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって診断することができる。いくつかの態様では、ＭＲＩによって検出されるＭＳ活性は、Ｔ１若しくはＴ２強調画像上での新しい脳若しくは脊髄病変の発生によって、又はそのような病変の病変ガドリニウム取り込み若しくは体積の増加によって示される。いくつかの態様では、繰り返しＭＲＩは、ＥＰＯ由来ペプチドの第３以降の治療サイクルが必要であるかを判定するために、ＥＰＯ由来ペプチドの第２の治療サイクル後に固定間隔で実施される。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドの第３以降の治療サイクルは、疾患が臨床的に再出現する前に実施することができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、静脈内投与することができる。いくつかの態様では、ＭＳは、再発型ＭＳであり得る。いくつかの態様では、患者は、ＭＳのための事前の療法を受けていた。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなる。

開示される治療方法は、対象に応じて異なる時間で行われ得る。具体的には、治療は、ＭＳ又は再発寛解型多発性硬化症に起因する高い障害又はその高い後遺障害リスクを有すると考えられる対象において行われ得る。いくつかの態様では、治療は、急性ＭＳ発作後に対象が安定した後に開始することができる。急性ＭＳ発作は、１つ以上の新しい症状又は古い症状の悪化をもたらすＭＳの増悪を含むことができる。いくつかの態様では、治療は、急性ＭＳ発作の直後、あるいは急性ＭＳ発作の２、４、６、８、１０、１２週間後、又は２、４、６、８、１０、若しくは１２ヶ月後に開始することができる。治療は、血液検査、腰椎穿刺、又はＭＲＩ後に開始することができる。いくつかの態様では、ＭＲＩは、１つ以上の（新しい）脳又は脊髄病変を明らかにし得る。ＭＳのリスクが高いと考えられる対象は、中枢神経系における炎症及び損傷、周囲毒素への曝露、低ビタミンＤレベル、喫煙、肥満、エプスタイン－バーウイルスでの以前の感染、遺伝的因子、及び女性であることをもたらし得る身体の免疫系による異常な応答を有する個体であり得る。高リスク対象では、治療を延長することができる。

いくつかの態様では、方法は、多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、又は炎症成分若しくは自己免疫成分を有する疾患、障害、若しくは状態を有する対象（例えば、ヒト患者）を特定し、次いで対象に、本明細書に開示されるＥＰＯ由来ペプチドのうちの１つ以上を含む組成物を提供するステップを更に含むことができる。いくつかの態様では、対象は、多発性硬化症を有する。いくつかの態様では、対象は、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態を有し、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態は、認知症、急性脳血管損傷、急性脊髄損傷、急性外傷性脳損傷及び反復性軽度外傷性脳損傷、急性心血管損傷、関節炎、自己免疫疾患、脱髄疾患、脳卒中、多発性硬化症、神経損傷、並びに免疫媒介性炎症である。

治療サイクル。投与レジメンに関して本明細書に記載されるような、治療サイクルは、時間の長さにおいて変動することができる。いくつかの態様では、治療サイクルは、少なくとも１又は２週間であり得るが、最大１ヶ月持続し得る。いくつかの態様では、開示される方法は、有効量のＥＰＯ由来ペプチドの毎日１、２、３、又は４週間の投与を含む治療サイクルを有する。治療サイクルは、ＥＰＯ由来ペプチドの毎日１週間又は毎日２週間の投与を含むことができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎日又は１日に複数回投与することができる。いくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、２週間毎に１回又は更には１ヶ月に１回投与することができる。いくつかの例では、ＥＰＯ由来ペプチドは、毎日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間投与することができる。各治療サイクルは、投与についての確立された時間の長さ、及びその時間枠中の確立された投与スケジュールを含むことができる。

方法は、休止期後に第２の治療サイクルを更に含むことができる。いくつかの態様では、第２の治療サイクルは、４週間の休止期後に投与することができる。いくつかの態様では、第２の治療サイクルは、初期治療サイクルの開始から少なくとも１年で投与することができる。

休止期。いくつかの態様では、投与レジメンに関して本明細書において以前に記載されるような、休止期は、少なくとも１週間であり得るが、数年にわたって持続し得る。ＥＰＯ由来ペプチドは、休止期中に投与されない。

休止期の長さは、治療サイクル中に投与されるＥＰＯ由来ペプチドの持続的な治療効果がどのくらい持続するかに依存する。いくつかの態様では、休止期は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月であり得る。いくつかの態様では、休止期は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０年であり得る。例えば、休止期は、少なくとも１週間、２週間、３週間、又は４週間（１ヶ月）であり得る。

いくつかの態様では、休止期は、治療サイクル中に投与されるＥＰＯ由来ペプチドの用量に応じて減少又は延長することができる。例えば、治療サイクル中のＥＰＯ由来ペプチドの用量が増加した場合、休止期を延長することができる。休止期の長さはまた、治療サイクルの長さに基づいて変動することができる。例えば、対象が特定の用量のＥＰＯ由来ペプチドを１週間にわたって毎日受ける場合、休止期は、同じ用量のＥＰＯ由来ペプチドを２週間にわたって６ヶ月にわたって毎日受ける対象よりも短い場合がある。

ＥＰＯ由来ペプチドは、休止期中に投与されないが、ＥＰＯ由来ペプチド以外の多発性硬化症治療薬は、休止期中に投与することができる。ＥＰＯ由来ペプチド以外の多発性硬化症治療薬は、多発性硬化症における使用について承認された任意の疾患修飾療法であり得る。

ＥＡＥ動物モデル及び多発性硬化症
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、脳及び脊髄白質への急性損傷を伴う中枢神経系炎症性脱髄疾患である。この動物モデルは、疾患病因を研究し、そのヒト対応物である多発性硬化症（ＭＳ）のための新しい療法を探求するために、多くの研究者によって広く使用されている。ＭＳ及びＥＡＥの両方の病因は、（１）ミエリン反応性Ｔ細胞の活性化、（２）ケモカイン及び接着分子の上方調節された発現、（３）ＣＮＳ白質への限局性Ｔ細胞及びマクロファージ浸潤、並びに（４）脱髄及び軸索損傷及び神経機能の喪失を伴うと考えられる（Ｔｒａｐｐ．，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，９８：４９－５６（１９９９））。ＥＡＥ及びＭＳの両方において、ミエリンに存在する自己抗原に特異的な活性化Ｔリンパ球は、ＣＮＳ炎症に、並びに末梢血白血球及び血漿タンパク質への血液脳関門の分解に関連しており、これは主に、ＣＮＳのミエリン豊富な白質領域に制限されている（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９７：１０７３－８１（２００３）、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３（１１）：４２２２－３１（２００４）、Ａｂｄｕｌ－Ｍａｊ ｉｄ，Ｋ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１４１：１０－１９（２００３）、Ｂａｔｔｉｓｔｉｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：４７７５－８２（２００３））。

ＥＡＥは、完全フロイントアジュバント中で乳化された、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などの、ミエリンタンパク質からの免疫優性ペプチドでの免疫化、続いて特定のマウス株のための追加のアジュバントとしての百日咳毒素の注射によって、マウスなどの遺伝的に感受性のある動物において実験的に誘発することができる（Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５６：７６７－７７（２００４））。疾患発症は、株毎に異なる。例えば、ＳＪＬ／Ｊマウスでは、ＰＬＰ又はＭＢＰは、再発寛解型進行を誘発するが、ＭＯＧで免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、多くの場合、慢性形態の疾患を発症する。

多発性硬化症には、再発寛解型ＭＳ、二次進行性ＭＳ、原発性進行性ＭＳ、及び原発性再発型ＭＳが含まれ得る。

送達
ＥＰＯ由来ペプチド、及びＥＰＯ由来ペプチドを含む組成物が本明細書に開示される。治療有効量は、状態若しくは疾患の症状の完全な解消、状態若しくは疾患の症状の重症度の低減、又は状態若しくは疾患の症状の進行の遅延をもたらす、対象に投与される組成物の量であってもよい。本明細書に記載の方法はまた、投与を最適化するための監視ステップを含み得る。本明細書に記載の組成物は、予防的治療として、又は変性変化の進行を遅らせるか、若しくは遅延させるために、投与することができる。

本明細書に記載される組成物は、臨床疾患の発症を遅延、低減、又は好ましくは予防するのに十分な量で対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。したがって、いくつかの態様では、患者は、ヒト患者であり得る。治療用途において、組成物は、多発性硬化症、認知症、急性脳血管損傷、急性脊髄損傷、急性外傷性脳損傷及び反復性軽度外傷性脳損傷、急性心血管損傷、関節炎、自己免疫疾患、脱髄疾患、脳卒中、多発性硬化症、又は神経学的損傷及び免疫媒介性炎症を既に有するか、又はそれらと診断された対象（例えば、ヒト患者）に、徴候若しくは症状を少なくとも部分的に改善するか、又は状態の症状、その合併症、及び結果の進行を阻害する（好ましくは停止する）のに十分な量で投与することができる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。治療有効量の組成物（例えば、薬学的組成物）は、治癒を達成する量であり得るが、その結果は、達成することができるいくつかの中の１つのみである。記述されるように、治療有効量は、疾患、障害、若しくは状態の発症若しくは進行が遅延、妨害、若しくは予防されるか、あるいは疾患、障害、若しくは状態、又は疾患、障害、若しくは状態の症状が改善される治療を提供する量を含む。症状のうちの１つ以上は、あまり重度ではない場合がある。治療された個体において回復を加速させることができる。

本明細書に記載される方法では、ＥＰＯ由来ペプチドの投与又は送達は、様々なメカニズムを介することができる。上に定義されるように、多発性硬化症を治療するための投与レジメン及びそれらの投与レジメンを使用する方法が本明細書に開示される。投与レジメン及び方法は、薬学的に許容される担体などの担体も含むことができる、本明細書に記載されるＥＰＯ由来ペプチドのうちのいずれか１つ以上を含有する組成物を含む。本明細書に開示されるＥＰＯ由来ペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物もまた本明細書に開示される。

いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、修飾された治療用細胞の直接送達のために使用することができる。

開示されるＥＰＯ由来ペプチドは、溶液中又は懸濁液中にあり（例えば、微粒子、リポソーム、又は細胞に組み込まれ）得る。

任意の好適な投与経路は、開示される組成物に使用することができる。好適な投与経路は、例えば、局所、経腸、局所、全身、又は非経口を含むことができる。例えば、投与は、皮表、吸入、浣腸、結膜、点眼剤、点耳剤、肺胞、鼻腔、鼻腔内、経腸、経口、口腔、口腔内、経口腔、腸、直腸、直腸内、経直腸、注射、注入、静脈内、動脈内、筋肉内、脳内、脳室内、側脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、嚢内、海綿体内、髄内、眼内、頭蓋内、経皮、経粘膜、経鼻、吸入、大槽内、硬膜外、硬膜周囲、硝子体内、などであり得る。開示される組成物は、任意の他の療法において、及び任意の他の療法とともに使用することができる。

本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される」とは、当業者には周知の通り、活性成分のあらゆる分解を最小限に抑え、対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限に抑えるように選択されるであろう材料又は担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水、又は多胞リポソームが挙げられる。例えば、本発明では、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチド又はＰＣ：ペプチドを担体として使用することができる。他の好適な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９^th ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載される。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩は、製剤を等張性にするために製剤に使用される。薬学的に許容される担体の他の例としては、生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５～約８、又は約７～約７．５であり得る。更なる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、ステント（血管形成手順中に血管に埋め込まれる）、リポソーム、又は微粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましくてもよいことは、当業者には明らかであろう。これらは、最も典型的には、生理的ｐＨの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体である。

薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図された活性が損なわれない限り、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤なども含み得る。薬学的組成物は、（本発明の組成物に加えて）１つ以上の活性成分、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などを含み得る。薬学的組成物は、局所治療又は全身治療が所望されるかどうか、及び治療される領域に応じて、ある数の方式で投与され得る。

非経口投与の調製物には、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在し得る。

経口投与のための組成物には、粉剤又は顆粒剤、水又は非水媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、並びにモノ、ジ、トリアルキル、及びアリールアミン、及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として潜在的に投与され得る。

典型的なペプチド製剤とは異なり、Ｄ型アミノ酸を含む本発明のペプチドは、胃酸などによるタンパク質分解に対する保護なしに、経口でも、投与することができる。それにもかかわらず、いくつかの態様では、ペプチド送達は、保護賦形剤の使用によって増強することができる。これは、典型的には、ポリペプチドを組成物と複合体化して、酸性及び酵素的加水分解に耐性にすることによって、又はポリペプチドをリポソームなどの適切に耐性のある担体にパッケージングすることによってのいずれかで達成される。経口送達のためのポリペプチドを保護する手段は、当該技術分野で周知である（例えば、治療剤の経口送達のための脂質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい）。

上昇した血清半減期は、徐放性タンパク質「パッケージング」システムの使用によって維持することができる。そのような徐放性システムは、当業者に周知である。いくつかの態様では、タンパク質及びペプチドのためのＰｒｏＬｅａｓｅ生分解性ミクロスフェア送達システム（Ｔｒａｃｙ（１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１４：１０８、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：７９５、Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１５，３５７）他の薬剤あり又はなしで乾燥製剤として配合することができるポリマーマトリックス中に活性剤を含有する生分解性ポリマーミクロスフェアからなる乾燥粉末。

ＰｒｏＬｅａｓｅマイクロスフィア製造プロセスは、活性剤の完全性を維持しながら、高いカプセル化効率を達成するように特別に設計された。プロセスは、（ｉ）安定化賦形剤で薬物溶液を噴霧凍結乾燥させることによるバルクから凍結乾燥薬物粒子の調製、（ｉｉ）薬物－ポリマー懸濁液の調製、続いて薬物粒子サイズを低減するための超音波処理又は均質化、（ｉｉｉ）液体窒素への噴霧化による凍結薬物－ポリマーミクロスフェアの製造、（ｉｖ）エタノールでのポリマー溶媒の抽出、並びに（ｖ）最終的な乾燥粉末製品を製造するための濾過及び真空乾燥からなる。得られた粉末は、多孔質ポリマー粒子内に均一かつ厳密に分散される、活性剤の固体形態を含有する。プロセスで最も一般的に使用されるポリマー、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）は、生体適合性及び生分解性の両方である。

カプセル化は、低温（例えば、－４０℃）で達成することができる。カプセル化中、タンパク質は、水の不在下で固体状態に維持され、よってタンパク質の水誘発性立体構造の移動性を最小限に抑え、反応物として水を含むタンパク質分解反応を防止し、タンパク質が変性を受け得る有機水性界面を回避する。好ましいプロセスは、ほとんどのタンパク質が不溶性である溶媒を使用し、よって高いカプセル化効率（例えば、９５％超）をもたらす。

いくつかの態様では、溶液の１つ以上の成分は、「濃縮物」として、例えば、希釈のために準備された保存容器（例えば、予め測定された体積）中、又はある体積の水への添加のために準備された可溶性カプセル中で提供することができる。

前述の製剤及び投与方法は、例示的なものであり、限定的なものではないことが意図される。本明細書に提供される教示を使用して、他の好適な製剤及び投与様式を容易に考案することができることが理解されるであろう。

併用療法
開示される方法のいくつかの態様では、ＥＰＯ由来ペプチドは、単独で、又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。追加の治療剤は、治療される疾患又は症状に基づいて選択される。様々なクラスの好適な薬理学的薬剤及び薬物の説明は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（１１ｔｈ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（２００５）において見られ得る。例えば、ＥＰＯ由来ペプチドを含有する薬学的組成物は、多発性硬化症を治療するための１つ以上の既知の治療剤と組み合わせて投与することができる。多発性硬化症を治療するための治療剤としては、これらに限定されないが、抗炎症剤、抗けいれん剤、免疫調節療法、ステロイド、及び疾患修飾薬物が挙げられる。疾患修飾薬物の例としては、これらに限定されないが、クラドリビン、フマル酸ジメチル、フマル酸ジロキシメル、フィンゴリモド、フマル酸モノメチル、オザニモド、シポニモド、テリフルノミド、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ペグインターフェロンベータ－１ａ、アレムツズマブ、ミトキサントロン塩酸塩、ナタリズマブ、オファツムマブ、ポネシモド、及びオセレリズマブが挙げられる。

併用療法は、投与レジメンの治療サイクル中にＥＰＯ由来ペプチド及び追加の治療剤を投与することを含むことができる。併用療法はまた、治療サイクル中にＥＰＯ由来ペプチド、及び休止期中に追加の治療剤を投与することを含むことができる。

薬学的組成物
本明細書に開示される組成物を含む、薬学的組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＥＰＯ由来ペプチドのうちのいずれかを含むことができる。例えば、表１に列挙されるＥＰＯ由来ペプチドのうちの１つ以上を含む薬学的組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される物質のための媒体として使用され得る溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤を指す。薬学的に許容される担体は、脂質系又はポリマー系のコロイドであり得る。コロイドの例としては、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、及びミセルが挙げられる。組成物は、様々な投与経路のいずれかによる投与のために製剤化することができ、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよく、これは投与経路に応じて様々であってもよい。本明細書に記載されるＥＰＯ由来ペプチド又は他の薬物のうちのいずれかは、薬学的組成物の形態で投与することができる。

本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、「担体」又は「希釈剤」とも称され得るものを含む、任意の化合物又は物質を意味する。薬理学的及び生理学的に許容される組成物を調製することは、当該技術分野では日常的であると考えられ、したがって、当業者は、必要に応じて、多数の当局に指導を求めることができる。組成物はまた、追加の薬剤（例えば、防腐剤）を含み得る。

本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与のために調製され得る。非経口投与のために調製される薬学的組成物としては、静脈内（又は動脈内）、筋肉内、皮下、髄腔内投与、経粘膜（例えば、鼻腔内）直接若しくは局所注射、経皮（例えば、局所）、又は腹腔内投与のために調製されるものが挙げられる。エアロゾル吸入も使用することができる。非経口投与は、単回ボーラス用量の形態であり得るか、又は例えば、連続ポンプによるものであり得る。いくつかの態様では、局所又は直接注射は、対流増強送達を介し得る。いくつかの態様では、組成物は、これらに限定されないが、水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などを含む、許容される担体中で、本明細書に開示されるＭＳＵＴ２阻害剤のうちのいずれかを溶解又は懸濁することを含む、非経口投与のために調製することができる。含まれる賦形剤のうちの１つ以上は、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、張力調整剤、湿潤剤、洗剤などの生理学的状態に近似させるのを助けることができる。組成物が、固体成分（経口投与のためのものであり得る）を含む場合、賦形剤のうちの１つ以上は、結合剤又は充填剤として機能することができる（例えば、錠剤、カプセルなどの製剤化のために）。組成物が、皮膚又は粘膜表面への適用のために製剤化される場合、賦形剤のうちの１つ以上は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒又は乳化剤であり得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、経口、筋肉内、静脈内、皮下、髄腔内、直接若しくは局所注射、鼻腔内、又は腹腔内投与のために製剤化される。

薬学的組成物は、滅菌されてもよく、従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、又は滅菌濾過されてもよい。水溶液は、そのまま使用するために包装されてもよく、又は本開示によって包含される凍結乾燥された凍結乾燥調製剤を、投与前に滅菌水性担体と合わせてもよい。薬学的組成物のｐＨは、典型的には、３～１１（例えば、約５～９）、又は６～８（例えば、約７～８）であろう。固体形態で得られた組成物は、複数の単回投与単位で包装されてもよく、各々が所定量の上述の１つ以上の薬剤を含む（例えば、錠剤又はカプセルの密封された包装）。固体形態の組成物はまた、局所的に適用可能なクリーム又は軟膏のために設計された圧縮可能なチューブなど、柔軟な量のための容器で包装されてもよい。組成物はまた、粉末、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、坐剤、滅菌注射用溶液及び滅菌包装された粉末として製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、意図されるように（すなわち、適切なように）対象に投与される場合に、有害な反応（すなわち、有害反応、負の反応、又はアレルギー反応）を生じないか、又は引き起こさない分子及び組成物を意味する。

本明細書に開示される組成物は、対象に直接投与することができる。一般に、組成物は、それらの送達を促進するために、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水又は緩衝食塩水溶液）中に懸濁させることができる。好適な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子又は移植可能なデバイス）中の組成物のカプセル化は、送達の効率を向上させ得る。いくつかの態様では、投与経路は、限定されないが、脳への直接注射を含む。このような投与は、手術なしで、又は手術とともに行うことができる。

キット
本明細書に記載されるキットは、上述の組成物（例えば、ＥＰＯ由来ペプチドのうちの１つ以上）と、好適な説明書（例えば、オーディオ資料、ビジュアル資料、又はオーディオビジュアル資料として記載及び／又は提供されたもの）との任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、キットは、本明細書に開示されるいずれか１つの組成物を含む所定量の組成物を含む。キットは、説明書、滅菌流体、シリンジ、滅菌容器、送達デバイス、及び緩衝液、又は他の対照試薬のうちの１つ以上を更に含み得る。

実施例１：慢性再発型ＥＡＥに対する短期エリスロポエチンペプチドＪＭ４療法の長期有益効果
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の臨床症状に密接に類似する進行性麻痺をもたらす実験動物における中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼすＴ細胞媒介性自己免疫疾患である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；１２２：１７３－８９）。ＭＳとの臨床的及び免疫病理学的類似性のために、ＥＡＥは、ＭＳのための療法の開発において広く使用される動物モデルである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；１２２：１７３－８９）。パルス免疫再構築療法として知られる２つの新たに認識されたＦＤＡ承認ＭＳ療法、アレムツズマブ及びクラドリビンは、何年も持続し得る持続的な臨床及び放射線有益効果を誘発する短期治療コースに従う（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｐ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｂｊｅｒｇ Ｆ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２０１９；１２：１－１６）。

短期ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ＥＡＥマウスモデルにおける前臨床研究の結果は、炎症を起こしたＣＮＳ内でのグリア細胞主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ発現の弱さ、低減した単核細胞浸潤、及び下方調節における顕著な改善を実証することによって、ＥＰＯの強力な免疫調節効果を明らかにした（Ｙｕａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２００８；４：３）。全分子ＥＰＯは、ＥＡＥモデルにおいて治療上の有望性を示すが、赤血球量の上昇、心血管合併症、脳卒中、及び高血圧を含む毒性は、ヒト臨床診療でのその使用における関心を制限する（Ｄｉｃａｔｏ Ｍ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００８；３：１１－１５、Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：ｅ６４７－ｅ６５６、及びＣｏｒｗｉｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００７；３５７：９６５－７６）。全分子ＥＰＯによって誘発される副作用を回避するために、小さな副作用フリーＥＰＯ由来ペプチド、ＪＭ４が生成され、過剰な赤血球形成の原因となる活性なしに、症候性ＥＡＥマウスにおいて堅牢なＥＰＯ様組織保護特性を有することが見出された（Ｙｕａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１５；１２：８５０－８６１、及びＷａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１６；２：４１８－４２７）。

全分子ＥＰＯ及びＪＭ４の両方でのＥＡＥマウスの治療は、上昇した単核細胞数を正常まで低減し、樹状細胞を１０倍減少させ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＮＦ－ガンマを含む炎症誘発性サイトカインを減少させることが見出された（Ｙｕａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１５；１２：８５０－８６１）。加えて、ＪＭ４ペプチドは、ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスにおいてＴｒｅｇ細胞を増殖させ、ＴヘルパーＴｈ１７陽性細胞を低減することが見出された（Ｙｕａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１５；１２：８５０－８６１）。これらの所見は、ミクログリア、アストロサイト、及びＴ細胞を伴う、先天性及び後天性免疫の両方に対する重大な効果を通した全分子ＥＰＯのそれに密接に類似する神経保護におけるＪＭ４活性のメカニズムを示す。

生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、神経炎症を非侵襲的に監視し、疾患発症を予測し、疾患再燃を追跡するためにＥＡＥにおいて利用され得る感度の高い定量的イメージングモダリティである（Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２００８；５：６）。ＢＬＩは、アルツハイマー病マウスモデルにおけるアミロイドベータ蓄積の進行を追跡するため、及びプリオン感染性を測定するための広範な臨床適用性を示している（Ｗａｔｔｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１１；１０８：２５２８－２５３３、及びＴａｍｇｕｎｅｙ Ｇ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００９；１０６：１５００２－１５００６）。以前の研究は、ＢＬＩを使用して、アストロサイト活性のための既知のマーカーであるグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現を連続的に定量化し、トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＮＳ神経炎症を追跡し、それによって炎症性疾患プロセスを監視するためのパラダイムとして機能していた（Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２００８；５：６、Ｈｏｃｈｇｒａｅｆｅ Ｋ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ ＥＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３；４７：８６８－８８２、及びＺｈｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４；３６７：２１０－２１２）。アストロサイト活性化は、ＥＡＥ誘発のためのプロセスを反映する実用的なバイオマーカーであり、臨床症状の発症前に観察される（Ｂｒａｍｂｉｌｌａ Ｒ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１９；１３７：７５７－７８３）。上昇したＧＦＡＰ発現は、再発寛解型ＥＡＥマウスにおける臨床症状の発症前に見られ、アストロサイト反応性は同様に、ＭＳ病変形成の初期段階で発生し、慢性的に持続する（Ｂｒａｍｂｉｌｌａ Ｒ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１９；１３７：７５７－７８３、及びＡｌｖａｒｅｚ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｉａ ２０１３；６１：１９３９－５８）。近年、Ａ１及びＡ２と称される２つの異なるタイプの反応性アストロサイトが同定されている（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；５４１：４８１－４８７、及びＳｍｉｔｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８３；２６４：２４１－５３）。Ａ１アストロサイトは、ＧＦＡＰを過剰発現し、補体成分Ｃ３の上方調節された発現を提示し、ＭＳ及び神経変性障害において上方調節され（Ｌｉ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４；５６：７６７－７７、及びＳｍｉｔｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８３；２６４：２４１－５３）、それらはオリゴデンドロサイト及びニューロンの死をもたらす。対照的に、Ａ２アストロサイトは、神経保護性であると考えられる（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；５４１：４８１－４８７）。

本明細書に記載される結果は、ＪＭ４治療が、急性ＭＯＧ単相性疾患において及び慢性再発寛解型プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）誘発性ＥＡＥマウスにおいて長期的に炎症効果を実質的に低減すること、並びにＢＬＩが、ＥＡＥの臨床経過を追跡するための良好な方法論であることを示す。結果はまた、ＥＡＥマウスのＣＮＳにおける増加したＣ３発現を実証し、ＪＭ４治療動物におけるＣ３発現の顕著な低減を示す。ＪＭ４での短期治療のこれらの持続的かつ長期的な臨床的利益は、新たに認識された免疫再構築多発性硬化症薬物、アレムツズマブ及びクラドリビンのそれに類似する。

方法。動物。雄ＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（ＧＦＡＰ－ｌｕｃ＋／－）マウス（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入されたアルビノＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｙｒｃ－２ｊ又はＳＪＬ／Ｊマウスのいずれかと交配した。Ｆ１子孫を、製造業者のプロトコルに従ってＰＣＲによって遺伝子型決定した。ＧＦＡＰ発現について陽性である８～１０週齢の雌マウス（ＧＦＡＰ－ｌｕｃ／Ｃ５７又はＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ）を使用した。

ペプチド。ミエリン由来抗原タンパク質タンパク質ペプチドＰＬＰ１３９－１５１（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ、配列番号１５）又はＭＯＧ３５－５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ、配列番号１１）を、それぞれ、ＥＡＥの再発寛解型慢性及び単相性形態の誘発に使用した。非造血（ＥＰＯ）由来短ペプチド断片、ＪＭ４（ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ、配列番号１）を療法に使用した。ペプチドは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、ＷＡから購入した。

ＥＡＥの誘発及び動物の臨床評価。活性ＥＡＥを標準的なプロトコルに従って誘発した（Ｓｍｉｔｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８３；２６４：２４１－５３）。マウスを、０日目に、４ｍｇ／ｍＬの殺滅Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）で補足された、等体積のフロイントアジュバント中のＰＬＰ１３９－１５１又はＭＯＧ３５－５５ペプチドのいずれかで構成される１００μＬのエマルジョンでの尾基部の両側での皮下注射によって免疫化した。抗原の初期用量は、ＳＪＬ／Ｊマウスにおける再発型ＥＡＥを誘発するための１００μｇのＰＬＰペプチド、又は急性単相性ＥＡＥの誘発のためのＣ５７ＢＬ／６マウス当たり２００μｇのＭＯＧペプチドであった。ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ／Ｊマウスは、７日目に第２のＰＬＰ抗原免疫化を受けた。これらの免疫化の直後、マウスは、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）に希釈された２００ｎｇのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の静脈内（ＩＶ）注射を受けた。ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／Ｃ５７ＢＬマウスは、接種後２日目に、２００ｎｇのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の追加ＩＶ注射を受けた。動物は、疾病の急性期中は２人の盲検の独立した観察者によってＥＡＥの臨床徴候について毎日計量及び評価され、その後の慢性期中は１週間に３回追跡された。単相性ＥＡＥ ＭＯＧ Ｃ５７ＢＬ６モデルを２８～３０日間監視し、ＰＬＰ ＳＪＬ／Ｊ再発モデルを免疫化後６ヶ月近くにわたって追跡した。ＥＡＥマウスモデルにおける行動神経学的欠損を定量化するために使用される臨床スコアリングシステム（表２）は、以前に記載された（Ａｑｕｉｎｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０；５４：１３９８－４０４）。

生物発光イメージング（ＢＬＩ）。生物発光シグナルを、暗箱に取り付けられた冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを有するインビボイメージングシステム１００（ＩＶＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて定量化した。３匹の動物を同時に撮像した。マウスは、イメージングの２～３分前に１ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）のＩＶ注射を受け、イメージングのために気化イソフルランで直ちに麻酔した。イメージングシグナルは、ＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１（Ｘｅｎｏｇｅｎ）ソフトウェアを使用してステラジアン当たり平方センチメートル当たり秒当たりの光子（光子／ｓ・ｃｍ２／ｓｒ）の単位で定量化し、２分かけて統合した。シグナル定量化のために、光子を、隣接する前脳の２．１８ｃｍ２及び脊髄領域の５．２７ｃｍ２に及ぶ「関心領域」（ＲＯＩ）から得た。生物発光は、内因性対照として使用される、中枢神経系ＲＯＩからの総光子値対左耳上の等しいサイズの領域から得られた光子値の比として表された。急性ＥＡＥモデルでは、測定を典型的には１～２日毎に行い、連続した２日の測定値の平均を使用した。生物発光イメージングを、疾患発症後１日おきに、及び疾病のその後の慢性期中に毎週２回実施した。

ＪＭ４治療。ＪＭ４ペプチドを、２ｍｇ／ｍｌまで蒸留水にまず溶解し、－８０℃で保存した。使用直前に、ペプチド溶液を、ＰＢＳで５μｇ／２００μｌまで更に希釈した。治療は、脳又は脊髄のいずれかの生物発光シグナルがバックグラウンドよりも有意に高くなったとき（通常、免疫化の８～９日後及ぶ臨床徴候の発症前）に開始した。ＥＡＥマウスを、ＪＭ４治療及びシャム治療群に無作為に分けた。ＪＭ４治療ＥＡＥ動物（群当たり４～１０匹）を、１０～１２日間２５０μｇ／ｋｇのＰＢＳ中のペプチドのＩＶ ＪＭ４で毎日治療した。対照ＥＡＥ動物を、同じ期間にわたってＩＶ生理食塩水でシャム治療した。治療効果を評価するために、マウスは、ＢＬＩ検査並びに臨床及び組織病理学的評価を受けた。

リアルタイムＰＣＲ。ＧＦＡＰメッセージレベルとルシフェラーゼ発現との間の相関を検証するために、ＥＡＥマウス脳由来の総ＲＮＡを免疫化後の異なる時点で抽出した。２段階リアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用したＡＢＩ ７７００配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。ｃＤＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出されたトータルＲＮＡの２μｇでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＲＴ－ＰＣＲ（製造業者のプロトコル）を介して合成した。２μＬの２０倍希釈ＲＴ－ＰＣＲ反応溶液を、リアルタイムＰＣＲ反応において試験した。ＧＦＡＰ転写物を増幅するために使用されるプライマーペアは、フォワード５’－ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号１６）及びリバース５’－ＣＡＣＧＡＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＡＧＡＧＣ－３’（配列番号１７）、並びにルシフェラーゼ転写物についてフォワード：５’－ＧＣＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡ－３’（配列番号１８）及びリバース５’－ＣＡＴＴＣＣＧＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＴＴＴ－３’（配列番号１９）であった。リアルタイムＰＣＲを、２５秒間９４℃、２５秒間６０℃、及び４５秒間７２℃での４０サイクルにわたって実行した。定量化は、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００についてＵｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２に記載される相対標準曲線方法を使用して行った。ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）転写物の産物を、内因性対照として使用した。標準曲線を、６段階希釈を使用して生成し、＞０．９９の相関スコアを各実行について観察した。試料を３通りに実行し、平均Ｃｔ値を分析に使用した。融解温度を解離曲線で研究し、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中での電気泳動によって検証した。

組織病理学。免疫化後の異なる時点でのＣＮＳ炎症及び脱髄を評価するために、ＪＭ４ペプチド治療群及びシャム治療群におけるＥＡＥマウスを麻酔し、氷冷ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドで左心室へと灌流した。脊髄及び脳を取り出した。次いで、組織をパラフィンに埋め込み、切片化し、ルクソールファストブルー／ＰＡＳで染色して、脱髄の程度を判定した。脊髄の高頸部、胸部、及び低腰仙部領域からの５ミクロンのパラフィン切片を、同じスライド上に配置した。各スライドは、ＪＭ４治療ＥＡＥ動物由来の対照正常脊髄切片、シャム治療ＥＡＥ髄、及び脊髄切片を含有した。組織病理学的検査を盲検で行った。加えて、急性軸索損傷を評価するために、ＳＭＩ－３２抗神経フィラメントＨ免疫組織化学染色を完了した（Ａｑｕｉｎｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０；５４：１３９８－４０４）。簡潔には、５μｍの切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化溶液で処理し、非特異的結合を最小限に抑えるために正常ウマ血清でブロックした。切片をまず、ＰＢＳ中で１：５，０００に希釈されたマウスＳＭＩ－３２抗体（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と４℃で一晩インキュベートした。２回の５分ＰＢＳ洗浄後、切片を、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－アビジン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）によって各３０分間インキュベートした。切片をジアミノベンジジン四塩酸塩（Ｓｔａｂｌｅ ＤＡＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１～３分間反応させることによって、免疫染色を可視化した。余分なＤＡＢを蒸留水で洗浄することによって除去し、スライドを光学顕微鏡を使用して評価した。

脊髄（頸部から仙骨部まで６～７等分に切断）を凍結し、８μｍ厚断面で連続的に切断し、スライド上に収集し、次いで－２０℃で１０分間アセトン中で後固定した。切片を、９０℃で１０分間Ｔａｒｇｅｔ Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ（Ｐａｎ Ｐａｔｈ）でまず処理し、２％正常ウマ血清中で１０分間ブロックした。切片を、１：５０のモノクローナルラット抗マウスＣ３補体（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１１８６２）又は１：５００のポリクローナルウサギ抗マウスＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ Ｚ０３３４ＧＦＡＰ）のいずれかと４℃で一晩インキュベートした。翌日、切片をＰＢＳ中で各１０分間３回洗浄し、１：１２０の作業希釈でｃｙ３又はｃｙ２コンジュゲートヤギ抗マウス／ラット／ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎＲｅｓｅａｒｃｈ）と１時間インキュベートした。切片を、ｄＨ２Ｏ中で各１０分間３回洗浄し、続いて蛍光顕微鏡イメージングを行った。

４倍又は１０倍対物レンズを使用したＰｒｏｇＲｅｓ ＭＦクールデジタルカメラを装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１蛍光顕微鏡（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して、免疫組織化学画像を得た。異なる脊髄レベルからの各切片の半分を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ４．０画像分析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して、標識が一定の閾値を超えた構造における面積パーセントを測定することによって定量化した。

統計分析。データを、平均±ＳＥＭとして表す。ＢＬＩ及び臨床スコアに対するＪＭ４効果を比較するために、両側ｔ検定を使用した。ＪＭ４の長期効果を、６０日目以降の各対象の平均臨床スコアを使用することによって、再発型ＥＡＥモデルにおいて研究した。生物発光は、脊髄における発光強度が左耳と比較して０．５の閾値を超えた日数によって測定した。両側ログランク検定を使用して生存データを調査した。ｐ＜０．０５の値は、有意とみなされた。

結果。ＧＦＡＰとルシフェラーゼ発現との間の相関の検証。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ ＥＡＥマウスモデルにおけるＧＦＡＰ発現とルシフェラーゼ発現との間の相関を検証した。免疫化後０、７、及び１４日でＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウス脳からＲＮＡを抽出し、２段階リアルタイムＰＣＲを行った。ＧＦＡＰ及びルシフェラーゼの増加した発現は、７日目及び１４日目に見られた（図１）。ＧＦＡＰとルシフェラーゼ転写との間に強い相関（＞９８％）が確認された（ｒ平方＝０．９９５８）。

単相性及び再発寛解型ＥＡＥモデルにおける生物発光に対するＪＭ４治療の効果。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２００８；５：６）は、ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ Ｃ５７ＢＬ／６ｊ－Ｔｙｒｃ－２ｊアルビノマウスを使用して、ＭＯＧ誘発性急性ＥＡＥを研究し、ＧＦＡＰ生物発光と臨床スコアとの間の密接な相関が使用されることを見出した。ＭＯＧ誘発性単相性ＥＡＥに対するＪＭ４の治療効果を調査するために、本明細書ではＧＦＡＰ－Ｌｕｃモデルを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６ｊ－Ｔｙｒｃ－２ｊと交配されたＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（ＧＦＡＰ－ｌｕｃ＋／－）の雌Ｆ１子孫を、２００μｇのＭＯＧで免疫化した。これらのマウスはその後、免疫後９日目に開始して１２日間、ＪＭ４ ２５０μｇ／ｋｇ ＩＶ又は０．９％生理食塩水ＩＶでのシャム治療のいずれかを受けた。疾患発症及び重症度は、臨床神経学的スコアリングによって、及びＧＦＡＰ－ｌｕｃ ＢＬＩによって評価された。単相性臨床経過は、シャム治療ＥＡＥ群においてＬｕｏ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１６；２：４１８－４２７）によって記載されるように観察された。マウスは、１０±０．７日目に臨床徴候をまず発症し、１４日目に最大平均臨床スコア３．７±０．４に達し、約２週間の疾患持続時間を有した。対照的に、ＪＭ４で治療されたＥＡＥ動物は、疾患経過の残り全体を通して１２日目から臨床スコアの有意な低減を示し（図２）、最大平均臨床スコアは、２．２５±０．３（ｐ＜０．０５）まで低減した。

ＪＭ４での顕著なポジティブな治療効果はまた、臨床スコアと相関するＧＦＡＰ－ｌｕｃ ＢＬＩ評価によって見られた（図３）。ＭＯＧ誘発性ＥＡＥモデルでは、最も早期に検出可能な生物発光シグナル（ＲＯＩ／耳比≧０．４）が、免疫化後７日という早期に前脳にかけて確認された。有意なシグナルが９日までに動物の９０％において検出され、最大値が１１日目～１６日目、典型的には臨床欠損の発症に２～３日先行して観察された。９日目に類似の生物発光スコアを有する動物を、ＪＭ４治療又はシャム治療ＥＡＥ群にペアリングし、ＪＭ４治療を開始した。ＪＭ４治療ＭＯＧ ＥＡＥ群における疾患経過にわたる脳及び脊髄領域内のピーク生物発光測定値は、シャム治療群のものよりも有意に低いままであった（図３）。１１～１２日目のピーク疾患スコアからの３～４倍低減（１１～１７日目）が、シャム動物と比較してＪＭ４治療で見られた。加えて、ＧＦＡＰ－ｌｕｃシグナルは、シャム治療群と比較される場合、ＪＭ４治療動物において３～４日より早期にベースラインに戻った。

ＰＬＰ誘発性再発寛解型ＥＡＥモデルに対するＪＭ４治療の持続的効果。急性単相性ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスモデルにおけるＪＭ４ペプチドの短期有益効果を定量化した後、慢性再発寛解型ＰＬＰ抗原誘発性ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスに対する長期ＪＭ４治療効果を調査した。生物発光イメージングでＧＦＡＰ－ｌｕｃ発現を監視することが、臨床検査よりもＣＮＳ神経炎症状態を判定するためのより感度が高く包括的な指標であり得るかを試験した。このため、ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ（－／＋）／ＦＶＢＮ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）マウスをＳＪＬ／Ｊマウスと交配することによって、新たな発光ＧＦＡＰ－Ｌｕｃ／ＳＪＬ／１ ＥＡＥモデルを作製した。

Ｆ１子孫ＳＪＬ／Ｊ雌マウスを１００μｇのＰＬＰ１３９－１５１で初期免疫化し、ブースター免疫化を７日目に投与した。マウスを、最大６ヶ月にわたって臨床検査及びＢＬＩイメージングによって評価した。ＰＬＰ免疫化されたマウスの８０パーセントは、ＥＡＥを発症し、５～６ヶ月の実験コース中に臨床スコアリングによって評価されるように少なくとも１つの再発を示した。第１の臨床徴候は免疫化の１１±１．５日後に現れ、臨床スコアは１４±２．４日でピークに達し、平均して急性ピークは７．５±３．８日継続した。バックグラウンドレベルを上回る生物発光シグナルは、動物の８０％において９日で検出された。増加したシグナルは、まず前脳で見られ、その後、典型的には臨床症状の発症の１～２日前にピークに達する脊髄シグナルを伴い１～３日で脊髄に拡大した。脊髄における光子測定値の強度は、臨床スコアと強く相関した。ＰＬＰ免疫化マウスの２０パーセントでは、脳において臨床症状がないか又は増加した生物発光シグナルが見られず、これらのマウスを研究から取り除いた。明確な臨床再発の前に、動物は、その後、数日の経過にかけてバックグラウンドレベルに後退した、脊髄における生物発光シグナルの実質的な増加を示した。吻側前脳における生物発光強度増加に、疾患の臨床証拠が常に続くとは限らない（図４）。

９日目に新しい発光ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスモデルを特徴分析した後、マウス（各実験において４～６匹の動物）を２つの群に分け、一方をＩＶ ＪＭ４ペプチド（５μｇ／日）の１２日コースで治療し、他方をシャム治療した（０．９％生理食塩水ＩＶ）。臨床欠損を毎日スコア付けし、画像を急性期中に毎週２～３回撮影し、続いて７～１０日毎に最大５ヶ月にわたって撮像した。ＪＭ４治療された再発寛解型マウスの長期臨床スコアは、５ヶ月超にわたってシャム治療されたＥＡＥマウスよりも有意に低いままであった（図５）。ＪＭ４治療動物における臨床欠損は、疾患の急性期中にシャム治療動物よりも７日早く急速に改善した。ＪＭ４治療マウスについての平均臨床スコアは、１３０日にわたって１未満のままであったが、シャム治療群スコアは、同じ期間にわたって２を中心とした。ＪＭ４治療再発寛解型ＥＡＥマウスでは、脳又は脊髄のいずれかにおけるＧＦＡＰ－ｌｕｃ発現及び疾患再燃の総数の両方は、シャム治療動物と比較して有意に減少した（図６）。ＪＭ４で治療されたＳＪＬ／Ｊ再発寛解型ＥＡＥマウスは、シャム治療された対照マウスと比較して、腹側脊髄を縁取る損傷した軸索の数の大幅な低減を示した（図７）。ＪＭ４での治療は、カプラン－マイヤープロットによって分析されるように、１００日で再発寛解型ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて１００％の生存をもたらし、シャム治療動物の５０％が生存した。

ＭＯＧ誘発性単相性ＥＡＥマウスにおけるＣ３発現によって表されるＡ１アストロサイト活性化は、ＪＭ－４治療によって減衰された。ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスは、免疫後９日目に開始して１２日間、ＪＭ４ ２５０μｇ／ｋｇ ＩＶ又は０．９％生理食塩水ＩＶでのシャム治療のいずれかを受けた。ＥＡＥマウスのＣＮＳにおけるＡ１アストロサイト活性化を示すために、Ａ１アストロサイトのマーカーである補体成分Ｃ３についての免疫組織化学を行った。ＧＦＡＰと共局在化するＣ３発現は、シャム治療された対照マウスと比較して免疫化２４日後のＣ５７ＢＬ ＭＯＧ ＥＡＥマウスの脊髄において上方調節された。重要なことに、ＪＭ４での治療は、Ｃ３発現の有意な低減をもたらした（群当たりｎ＝７、ＥＡＥ １７．５＋／－３．７対ＪＭ４治療８．３＋／－１．９、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ比較）。これらの結果は、ＪＭ－４治療がＥＡＥマウスにおいてＡ１アストロサイト活性化を５０％を超えて減衰させたことを示す。例えば、図８を参照されたい。

考察．ＢＬＩ／臨床研究は、急性ＭＯＧ及び再発寛解型ＰＬＰ ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスモデルの両方において、小ＥＰＯ由来ペプチド、ＪＭ４の重大な免疫調節利益を実証する。両方のモデルにおいて、ＪＭ－４のポジティブな臨床及びイメージング治療効果は、全分子ＥＰＯに関連するネガティブな造血副作用なしに維持された。

経口及び注射可能疾患修飾療法を含む、ＲＲＭＳのための従来の治療は、通常、療法の持続時間に限定される有益な効果を実証している。免疫再構築療法と呼ばれるＭＳの治療の新たに出現したクラスは、短い治療コースをはるかに超えて持続する顕著に延長された臨床的利益を示す。２つの免疫再構築化合物：アレムツズマブ及びクラドリビンが認識されており、これらの化合物は、ＭＳ患者における脳磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で見られるように、リンパ球、クラススイッチされた及びスイッチされていないメモリーＢ細胞を枯渇させ、再発率及びガドリニウム増強病変の低減をもたらす。両方の医薬品で、療法の長期臨床的利益は、多くの場合、積極的治療の時間後に数ヶ月～数年間保持される（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｐ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｂｊｅｒｇ Ｆ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２０１９；１２：１－１６）。ＪＭ－４での短期療法が、ＢＬＩによって少なくとも５ヶ月間監視されるように、持続的な臨床的利益及びアストロサイト活性化の下方調節をもたらすというこれらの所見は、ＪＭ－４を、免疫再構築療法に類似した長く持続する利益を達成するための療法として提示する。

本明細書に記載される実験では、相対ＧＦＡＰ－ｌｕｃ発現は、ＥＡＥトランスジェニックマウスモデルにおいて経時的に増加することが確認され、神経炎症の有用なバイオマーカーとして、古典的なアストロサイトマーカーであるＧＦＡＰの以前に認識された概念を強化した（Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２００８；５：６）。これらの結果は、臨床症状及び炎症と同時に起こる増加したＧＦＡＰ ｍＲＮＡレベルを示す以前に研究された急性ＥＡＥモデルと類似していた（Ｓｍｉｔｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８３；２６４：２４１－５３、Ａｑｕｉｎｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０；５４：１３９８－４０４、及びＡｑｕｉｎｎｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８；５１：１０８５－１０９６）。再発寛解型ＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥマウスモデルでは、増強された生体発光異常が臨床欠損よりも頻繁に観察され、治療の効果を臨床症状の出現前に複数の時点で及びより高精度で非侵襲的に監視することをもたらした。これらの所見は、ＢＬＩが、多くの場合、マウスにおける臨床評価よりも感度が高いことを示す。同様に、ＢＬＩを使用した先行研究は、臨床神経学的障害の発症の５～７日前のＥＡＥ病変の早期検出を報告した（Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２００８；５：６）。

ＥＡＥマウスモデルにおける治療応答を監視するためのＢＬＩの使用に類似して、ＭＲＩは、診断目的で及びＭＳ患者における療法に対する疾患応答を監視するために利用されてきた。この現在の研究の所見と同様に、ＭＲＩで見られる急性ＭＳ病変は、多くの場合、臨床徴候及び症状に先行し得る（Ｂａｒｋｈｏｆ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ １９９７；１２０：２０５９－６９、及びＬｉｎｃｏｌｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００９；６６：４１２－４）。興味深いことに、本明細書に記載される結果は、吻側脳における生物発光強度増加に、疾患の臨床証拠が常に続くとは限らないことを示した。これらの所見は、ＭＳにおいてよく認識された臨床放射線学的パラドックスを連想させ、ＭＲＩで見られる放射線病変負荷は、多くの場合、臨床障害の程度と相関しない（Ｂａｒｋｈｏｆ Ｆ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００２；１５：２３９－２４５、及びＷｕｅｒｆｅｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００７；２６：１９０－１９８）。

予想されるように、ＢＬＩは、慢性寛解再発型ＥＡＥモデルにおける疾患状態の評価においてより大きな有用性を有するように見えた。生物発光シグナルの平均１日強度は、ＪＭ４群とシャム治療群との間で有意差はなかったが、ＧＦＡＰ発現がバックグラウンドを上回るＪＭ－４治療動物における再燃の数は、シャム治療動物で見られたものよりも常に実質的に少なかった（図６）。このデータは、ＪＭ－４での１０～１２日の治療コースが、急性期での重度ＥＡＥの発症を停止し、慢性ＥＡＥ動物における炎症再発の数を５ヶ月超にわたって顕著に低減することを示す。臨床スコアリングによって、ＪＭ４治療されたＳＪＬ／Ｊ動物の５０％が５ヶ月の実験全体を通して無再発のままであり、シャム治療されたマウスの２０％が無再発のままであった。特に、１２日間のＪＭ－４療法はＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥ動物の１００％の生存をもたらし、シャム治療されたＳＪＬ／Ｊ ＥＡＥ動物の半数は死亡した。

毒性Ａ１アストロサイト表現型の存在は、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト上のＣ３タンパク質の強い上方調節によって明らかにされるように、ＥＡＥマウスの脊髄において検出された。この結果は、ＭＳ及び他の神経変性障害において報告されたＡ１反応性アストロサイトの存在と一致している（Ｐｏｎａｔｈ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８；９：１－１２、Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｅ ａｎｄ Ｆａｒｉｎａ Ｃ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；３７：６０８－６２０、及びＬｉｄｄｅｌｏｗ Ｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｓ Ｂ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１７；４６：９５７－９６６）。最も重要なことに、ＥＡＥマウスのＪＭ－４治療は、免疫組織化学によって検出されるようなＣ３陽性Ａ１アストロサイトの大幅な低減及びＢＬＩによって検出されるＧＦＡＰ－ｌｕｃ発現の低減をもたらす。これらの結果は、我々が以前に報告したように、Ｔ細胞及び炎症性サイトカインのサブセットの変化を含む末梢免疫系に対するその効果に加えて、ＪＭ－４治療によるＣＮＳにおける免疫系に対する重大な効果を示す（Ｙｕａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１５；１２：８５０－８６１）。ＥＡＥマウスモデルの脳におけるアストロサイト型の更なる特徴分析は、ＥＡＥを治療するための有効な薬物の将来の開発のために必要である。

本明細書に記載されるように、７～１４日持続するＪＭ－４での短期治療パルスは、慢性再発型ＥＡＥマウスにおいて少なくとも５ヶ月持続する持続的かつ長期の臨床的利益をもたらすことが示された。よって、これらのデータは、ＪＭ－４の短いコースが、ＭＳ患者の治療において副作用なしに長期臨床的利益につながるであろうことを示す。

Claims (35)

1. 少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、前記治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、投与レジメン。
2. 前記治療サイクルが、有効量の前記ＥＰＯ由来ペプチドを７～１４日間、毎日投与することを含む、請求項１に記載の投与レジメン。
3. 前記治療サイクルが、前記休止期後に第２の治療サイクルを更に含む、請求項１に記載の投与レジメン。
4. 再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、前記方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、前記治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記治療サイクルに休止期が続き、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、方法。
5. 前記休止期が、少なくとも５ヶ月である、請求項４に記載の方法。
6. 前記休止期後に第２の治療サイクルを更に含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記第２の治療サイクルが、前記休止期後に投与される、請求項６に記載の方法。
8. 前記第２の治療サイクルが、初期治療サイクルの開始から１年で投与される、請求項６に記載の方法。
9. 前記休止期中に、前記ＥＰＯ由来ペプチド以外の治療剤を投与することを更に含む、請求項４に記載の方法。
10. 前記ＥＰＯ由来ペプチドが、ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ末端を保護するアセチル基及びカルボキシル末端を保護するアミド基で末端保護される、請求項１０に記載の投与レジメン。
12. 少なくとも１つの治療サイクル、続いて休止期を含む、投与レジメンであって、前記治療サイクルが、有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、投与レジメン。
13. 前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記アミノ末端を保護するアセチル基及び前記カルボキシル末端を保護するアミド基で末端保護される、請求項１２に記載の投与レジメン。
14. 再発寛解型多発性硬化症を治療する方法であって、前記方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、前記治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、前記治療サイクルに休止期が続き、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、方法。
15. 脊髄におけるＡ１アストロサイト活性化を低減する方法であって、前記方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、前記治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、前記治療サイクルに休止期が続き、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、方法。
16. 補体成分Ｃ３を減少させる方法であって、前記方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、前記治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、前記治療サイクルに休止期が続き、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されない、方法。
17. 治療を必要とする対象において、炎症成分又は自己免疫成分を有する疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、前記方法が、対象に有効量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドを、少なくとも１つの治療サイクルにわたって投与することを含み、前記治療サイクルが、有効量のＥＰＯ由来ペプチドを投与して、前記ＥＰＯ由来ペプチドの離脱後に持続的な治療効果を可能にすることを含み、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなり、前記治療サイクルに休止期が続き、前記ＥＰＯ由来ペプチドが、前記休止期中に投与されず、組成物が、炎症成分又は自己免疫成分を有する少なくとも１つの疾患、障害、又は状態からの少なくとも１つの症状を改善するのに有効である、方法。
18. 炎症成分又は自己免疫成分を有する前記疾患、障害、又は状態が、認知症、急性脳血管損傷、急性脊髄損傷、急性外傷性脳損傷及び反復性軽度外傷性脳損傷、急性心血管損傷、関節炎、自己免疫疾患、脱髄疾患、脳卒中、多発性硬化症、神経損傷、並びに免疫媒介性炎症である、請求項１７に記載の方法。
19. 患者における多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品の製造のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）由来ペプチドの使用であって、前記治療が、前記ＥＰＯ由来ペプチドの第１の治療サイクル、続いて前記ＥＰＯ由来ペプチドの少なくとも１つの更なる治療サイクルを含み、各治療サイクルが、連続した日に適用される１～１４回の用量を含み、１日用量が、＞０及び≦１０ｍｇであり、各治療サイクルが、次の治療サイクルから少なくとも１～２４ヶ月離れている、使用。
20. 前記少なくとも１つの更なる治療サイクルが、前記第１の治療サイクルの少なくとも５ヶ月後に投与される、請求項１９に記載の使用。
21. 前記少なくとも１つの更なる治療サイクルが、前記第１の治療サイクルよりも短い期間にわたって同じ１日用量である、請求項１９又は２０に記載の使用。
22. 前記ＥＰＯ由来ペプチドの前記第１の治療サイクルが、５日間、５～１０ｍｇ／日の用量である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用。
23. 前記患者が、前記第１の治療サイクル後１２ヶ月で、１週間、５μｇ／日の用量での前記ＥＰＯ由来ペプチドの更なる治療サイクルで再治療される、請求項２２に記載の使用。
24. 前記ＥＰＯ由来ペプチドの２つの初期治療サイクルに、再生されたＭＳ活性の証拠に対してのみ、前記ＥＰＯ由来ペプチドの第３以降の治療サイクルが続く、先行請求項のいずれか一項に記載の使用。
25. 前記第３以降の治療サイクルが、１週間５～１０ｍｇ／日の用量である、請求項２４に記載の使用。
26. 再生されたＭＳ活性の証拠が、臨床的手段によって診断される、請求項２４又は２５に記載の使用。
27. 前記臨床的手段が、神経障害の再発又は進行からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。
28. 再生されたＭＳ活性の証拠が、脳又は脊髄の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって診断される、請求項２４又は２５に記載の使用。
29. ＭＲＩによって検出されるＭＳ活性が、Ｔ１若しくはＴ２強調画像上での新しい脳若しくは脊髄病変の発生によって、又はそのような病変の体積の増加によって示される、請求項２９に記載の使用。
30. 繰り返しＭＲＩが、前記ＥＰＯ由来ペプチドの第３以降の治療サイクルが必要であるかを判定するために、前記ＥＰＯ由来ペプチドの前記第２の治療サイクル後に固定間隔で実施される、請求項２９又は３１に記載の使用。
31. 前記ＥＰＯ由来ペプチドの前記第３以降の治療サイクルが、前記疾患が臨床的に再出現する前に実施される、請求項３０に記載の使用。
32. 前記ＥＰＯ由来ペプチドが、静脈内に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の使用。
33. 前記ＭＳが、再発型ＭＳである、先行請求項のいずれか一項に記載の使用。
34. 前記患者が、ＭＳのための事前の療法を受けていた、先行請求項のいずれか一項に記載の使用。
35. 前記ＥＰＯ由来ペプチドが、アミノ酸配列ＧＣＡＥＨＣＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶ（配列番号１）からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の使用。

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