JP2003512435A

JP2003512435A - 予防及び治療方法

Info

Publication number: JP2003512435A
Application number: JP2001532795A
Authority: JP
Inventors: ハリソン，レオナード，シー; ハニネン，アルノ; マルティネス，ナタン，アール; クレイマー，デイヴィッド
Original assignee: ザウォルターアンドイライザホールインスティチュートオブメディカルリサーチ
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2003-04-02
Also published as: EP1225912A1; EP1225912A4; WO2001030378A1; CA2387652A1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般的に、自己免疫疾患状態の予防及び治療方法並びにそのために有用な物質に関する。関連する一つの実施態様において、本発明は粘膜の抗原、及び／又は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される自己免疫疾患の起こり易さ若しくは危険を防止し若しくは少なくとも低減させるためＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止若しくは他の方法で遅延させることができる物質の使用を意図する。より具体的には、本発明は自己免疫病状と関連のある症状を保護し若しくは緩和するための粘膜により媒介される耐性を意図する。さらに具体的には本発明は、ＩＤＤＭ関連の自己抗原又はＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止する物質を粘膜表面にエーロゾル投与することにより臨床的インスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）を防止又は臨床的ＩＤＤＭの効果を防止若しくは低減若しくは緩和する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は一般的に自己免疫疾患状態の予防及び治療方法並びにそのために有用
な物質に関する。関連する一つの実施態様において、本発明は、細胞障害性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）により媒介される自己免疫疾患の起こり易さ若しくはその危険
を防止し又は少なくとも低減させるために、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止
又は他の方法で遅延させることができる粘膜抗原及び／又は物質の使用を意図す
る。より具体的には、本発明は自己免疫病理と関連する症状から護るため又は該
症状を緩和させるための粘膜により媒介される耐性を意図する。さらに一層具体
的には本発明は、ＩＤＤＭ関連の自己抗原を粘膜表面にエーロゾル投与により又
はＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止する物質により、臨床的インスリン依存性
真正糖尿病（ＩＤＤＭ）を防止する方法又は臨床的ＩＤＤＭの効果を防止若しく
は低減若しくは緩和する方法を提供する。

【０００２】発明の背景本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、この先行技術がオーストラリ
ア国又は他の国で一般常識の一部となっているとの認識又は如何なる意味での示
唆でもなく、そしてそう解釈すべきでもない。

【０００３】本明細書で数値により言及した刊行物の書誌的詳細は明細書の末尾に収録して
ある。

【０００４】免疫系一般そしてとりわけ細胞の免疫機構についての知識の増加により、治療
薬の設計及びその投与の代替的経路が大きく促進されつつある。研究の一つの重
要な領域は、自己免疫疾患状態における特定抗原により誘導される細胞免疫低応
答性を支配する機構である。

【０００５】自己抗原は、その投与が自己免疫疾患の通常の履歴を改変するときは病原性で
あると考えることができる。免疫耐性誘導のための自己抗原に特異的な戦術がゲ
ッ歯類における実験的自己免疫疾患の通常の履歴を有利に改変することが示され
た（１〜６）。古典的な経口投与による可溶性タンパク質抗原の粘膜表面への提
示は抗原特異的なＴ細胞により媒介される遅延型の過剰感作（ＤＴＨ）及びＩｇ
Ｅ応答の選択的抑制を結果として生ずる（１，７，８）。「経口耐性」はＴ細胞
（Ｔｈ１）応答から抗体（Ｔｈ２）応答までの免疫の分化と、調節Ｔ細胞の誘導
と、そして高抗原用量でＴ細胞アネルギー及びＴ細胞欠失の両方と関連させられ
てきた（１，９）。

【０００６】特に衰弱している自己免疫状態は、自己免疫炎症性「インスリン炎」病巣内の
、膵臓の島におけるインスリン生産性β細胞の選択的破壊から生ずるインスリン
依存性の真正糖尿病（ＩＤＤＭ）である（１０，１１）。β細胞破壊を媒介する
際の自己反応性Ｔ細胞の第一の役割は二つのＩＤＤＭの自然発生動物モデル、即
ちバイオ−ブリーディング（ＢＢ）ラット（１２）と非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マ
ウス（２）で直接示された。β細胞への免疫反応の引金となり又はそれを駆動す
る標的自己抗原は診断的適用を有するだけでなく特異的免疫治療のための薬物候
補でもある（３〜６）。病原性を持つと思われる幾つかの島／β細胞自己抗原が
、ゲッ歯類で還流する抗体又はＴ細胞との反応性により、そしてヒトで準臨床的
若しくは臨床的ＩＤＤＭ、とりわけインスリン、グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ（ＧＡＤ）及びＩＡ−２クラスのチロシンホスファターゼとの反応性により同
定されてきた（１３）。しかしながら、インスリン及びその前駆体であるプリ−
プロインスリンはβ細胞特異的な唯一のＩＤＤＭ自己抗原である。

【０００７】ヒトでは、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）は臨床的ＩＤＤＭの発症の危険マー
カーであり（１４）、そして糖尿病の母親の子孫における他の島抗原に対する自
己抗体の前に検出された（１５）。準臨床ＩＤＤＭ主体及び最近診断されたＩＤ
ＤＭ主体の半数までに、ヒトインスリンへの末梢血Ｔ細胞の増殖の増加が証明で
きる（１６）が、応答は比較的低い。これはおそらく優勢なヒトＴ細胞エピトー
プがプロインスリン中にあるからである。インスリンのＢ鎖とプロインスリン中
の連結（Ｃ）ぺプチドの間の天然の開裂部位にまたがるぺプチドがＩＤＤＭの危
険性のある親類の大部分でＴ細胞の増殖を誘導すると報告された（１７）。ＮＯ
Ｄマウスでは、ＩＡＡは糖尿病の発症の危険マーカーであると報告されており（
１８）、そしてインスリン炎病巣から生じたＴ細胞クローンの大部分はインスリ
ンＢ鎖、アミノ酸９〜２３と反応した（１９）。

【０００８】幾つかの研究がＮＯＤマウスモデルにおいて粘膜により媒介されるインスリン
への耐性を評価した。例えば、ザングら（２０）はブタインスリンの経口投与（
１ｍｇ週２回）が糖尿病の発症を遅延させそしてその発症率を低下させること、
そして糖尿病マウス由来の脾臓細胞により若い非糖尿病マウスへの糖尿病の移転
を部分的に阻止する脾臓Ｔ細胞と関連があることを見出した。続いてベルゲロッ
トら（２１）は経口インスリンによる誘導された調節細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であ
ったことを報告した。しかしながら、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のルイ
スラットモデルにおけるモルモットのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対
する経口耐性の初期の研究（１）では、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを
分泌し且つＣＤ４及びＣＤ８の両方を調節するＴ細胞が記述された。

【０００９】細胞により媒介される自己免疫状態の抑制を誘導するための抗原の送達のため
の有効な投与戦術を開発する必要がある。この投与戦術は免疫学的に効果的でな
ければならないだけでなく、便利で直接的で且つ安全でなければならない。本発
明に至る研究において、本発明者らは自然発生ＩＤＤＭの動物モデルである非肥
満糖尿病（ＮＯＤ）マウスで、インスリン及びその前駆体（プロインスリン）の
エーロゾル吸入及び鼻孔内投与を研究し、これが膵臓島病状及び糖尿病の発症率
を低減させるのに有効であることを明らかにした。さらに、エーロゾルインスリ
ンは糖尿病の防止に寄与する調節的ＣＤ８γδＴ細胞を誘導した。代わりの戦術
として、又は前述の方法と組み合わせて使用できる戦術として、本発明は、例え
ば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の間の相互作用を阻止すること
によりＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止若しくは他の方法で遅延させる方法を
さらに提供する。

【００１０】発明の概要本明細書を通じ、文脈が他の意を要求しない限り、「含む（comprise) 」とい
う用語、又は「含む（comprises)」又は「含む(comprising)」などのその変形は
、述べられた要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を含むことを意味する
が、如何なる他の要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を排除するもので
はないことを意味すると理解すべきである。

【００１１】本発明の一つの側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避
しながら、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）耐性を含む免疫耐性を誘導する方法
を意図する。この方法は該粘膜抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定
されたエピトープの機能を発揮できないように粘膜抗原を改変する工程、及び次
いで該粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減させるのに十分な時間及び条
件の下で該選択され又は改変された抗原を投与する工程を含む。

【００１２】本発明の別の一側面は、実質的に粘膜自己抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を
回避しながら細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法を意図する。こ
の方法は該自己抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトー
プの機能を発揮できないように粘膜自己抗原を改変する工程、及び次いで該自己
抗原に対する耐性を誘導するが該抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減するの
に十分な時間及び条件の下で該選択され又は改変された自己抗原を投与する工程
を含む。

【００１３】本発明のさらなる一側面は、主体における細胞により媒介される自己免疫疾患
を抑制する方法であって、自己免疫の病状を防止し、低減し若しくは他の方法で
緩和するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量
をエーロゾルとして投与する工程を含み、該抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相
互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を意図する。

【００１４】本発明のさらに別の一側面は、主体における自己免疫疾患状態を防止し、低減
し若しくは他の方法で緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫の
病状から護る免疫調節機構を誘導若しくは刺激するのに十分な時間及び条件の下
で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量を該主体にエーロゾルとして投与する
工程を含み、該抗原がＭＨＣクラスＩの相互作用領域を実質的に欠失しているも
のである方法を提供する。

【００１５】本発明のなお一層別の一側面は、主体におけるＩＤＤＭ、徐々に進行する（Ｓ
Ｐ）ＩＤＤＭ若しくは妊娠中のタイプＩ糖尿病を防止、低減若しくは他の方法で
緩和する方法であって、調節的Ｔ細胞を誘導するのに及び／又はＩＤＤＭと関連
する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するために十分な他の適切な機構を誘導す
るのに十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと関連する自己抗原の有効量を該主
体にエーロゾルとして若しくは他の機能的に同等な手段により投与する工程を含
み、該自己抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相互作用エピトープを実質的に欠失
しているものである方法を意図する。

【００１６】本発明のさらに別の一側面は、主体におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し若しく
は他の方法で緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止若しくは
低減し、且つ、他の方法でＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導するのに十分な時間
及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定された任意のエピトープの機能を発揮で
きないようにそのＣ末端で先端を切断されたプロインスリンぺプチド抗原を投与
する工程を含む方法を意図する。

【００１７】本発明のさらに別の一側面は、一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は
希釈剤を含むエーロゾル製剤中に自己免疫疾患と関連する抗原を含む組成物を提
供する。

【００１８】本発明の別の一側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避
しながらＣＴＬ耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫の誘導を阻止若しくは
低減するのに十分な時間及び条件の下で、機能性のＭＨＣクラスＩに限定された
エピトープを実質的に欠失している該粘膜抗原をコードする核酸分子若しくはそ
の類縁物質を主体に投与する工程を含む方法を意図する。

【００１９】本発明のさらなる側面はＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＩＤＤＭを防止又
は抑制する方法であって、ＩＤＤＭの効果を防止又は低減するのに十分な時間及
び条件の下で機能性のＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠失す
るＩＤＤＭ関連粘膜抗原をコードする核酸分子又はその類縁物質を主体に投与す
る工程を含む方法を意図する。

【００２０】本発明の別の一側面は、従って、該抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避し
ながら粘膜抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低
減するのに十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を
投与し、その前、同時若しくは後にＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴニス
トを投与する工程を含む方法を意図する。

【００２１】より具体的には、本発明は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しな
がら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減す
るのに十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与
し、その前、同時若しくは後にＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４相互作用のアンタゴニストを
投与する工程を含む方法を意図する。

【００２２】本発明のさらに別の一側面は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避し
ながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟
を阻止若しくは他の方法で遅延させるのに十分な時間及び条件の下である物質を
投与する工程を含む方法を提供する。

【００２３】より具体的には、本発明は粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しなが
ら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟を阻
止し若しくは他の方法で遅延させるのに十分な時間及び条件の下である物質を投
与する工程を含み、該物質がＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻止又は他の方法
で破壊するものである方法を提供する。

【００２４】本発明の別の一側面は、主体における疾患状態の治療又は予防のための医薬の
製造における、不活性なＭＨＣクラスＩエピトープを持つ粘膜抗原の使用を意図
する。

【００２５】本発明のさらに別の一側面は、疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造に
おける、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟を阻止できる物質の使用を意図する。

【００２６】本発明は、上に意図した方法のいずれかの組合せにおける使用をさらに提供す
る。

【００２７】好ましい実施態様の詳細な説明本発明はインスリン又はその前駆体が免疫耐性を誘導するために使用されうる
という驚くべき発見に基づいている。

【００２８】従って、本発明の一つの側面は、主体における粘膜抗原に対する応答としての
ＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら免疫耐性を誘導する方法であって、該粘膜抗
原を選択する工程又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの機能を発揮でき
ないように粘膜抗原を改変する工程、及び次いで該粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫
を阻止若しくは低減するのに十分な時間及び条件の下で該選択され又は改変され
た抗原を投与する工程を含む方法を意図する。

【００２９】一般に、粘膜抗原はＣＴＬにより媒介される糖尿病そして取り分けＩＤＤＭな
どの、これらに限定されるわけではないが、自己免疫疾患を防止するために用い
られる。

【００３０】従って、本発明の別の一側面は、粘膜自己抗原への応答として生ずるＣＴＬ免
疫を実質的に回避しながら細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法で
あって、自己抗原を選択する工程又はＭＨＣクラスＩに限定されるエピトープの
機能を発揮できないように該粘膜自己抗原を改変する工程、及び次に該選択され
又は改変された自己抗原を、該自己抗原に対する耐性を誘導するが該自己抗原に
対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、投与する
工程を含む方法を意図する。

【００３１】この自己抗原の投与はＤＮＡ又はポリペプチド／ぺプチドの送達によるもので
も、任意の適当な手段によるものでもよいが、好ましい投与経路は経口、経鼻、
経咽頭又は経気管支管を含む粘膜表面を経るものであり、そして鼻孔内エーロゾ
ルを含むエーロゾル経由である。

【００３２】本発明のさらに別の一側面は主体の細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制
する方法であって、自己免疫病状を阻止し、低減し若しくは他の方法で緩和する
のに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量をエーロ
ゾルとして投与する工程を含み、該抗原が機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用領域を
実質的に欠失しているものである方法を意図する。

【００３３】より具体的には、本発明は主体の自己免疫疾患状態を阻止し、低減し若しくは
他の方法で緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫病状から護る
免疫調節機構を誘導し又は刺激するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾
患と関連する抗原の有効量を該主体にエーロゾルとして投与する工程を含み、該
抗原がＭＨＣクラスＩ相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を提
供する。

【００３４】本明細書で「免疫調節機構」というときは、細胞により媒介される免疫応答を
調節する全ての機構に対する言及であると理解されるべきであり、例えば、Ｔ細
胞の機能的活性の調節、一つ以上のサプレッサーＣＤ４Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２
又はγδＴ細胞（本明細書で「調節性Ｔ細胞」と呼ぶ）を含むＣＤ８Ｔ細胞によ
る調節、又はリンパ球、骨髄細胞又はストローマ細胞によるサイトカイン生産の
調節を経由するものなどであるが、これらに限定されない。

【００３５】本発明は、本発明者らによる一部の粘膜自己抗原がＭＨＣクラスＩに限定され
たＣＴＬに対するエピトープを含むという認識に一部基礎を置く。結果として、
これらの抗原の投与はＣＴＬ免疫及びＣＴＬ耐性を結果とし生じうる。従って、
本発明は、機能性のＭＨＣクラスＩで相互作用するエピトープを欠失している抗
原の選択又はこのエピトープを除去するように抗原を改変することを必要とする
。

【００３６】特に好ましい実施態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープはＭＨＣクラスＩ（Ｋ ^d ）に限定されるエピトープである。

【００３７】本発明は以降にＩＤＤＭ、成人における潜在性自己免疫糖尿病〔ＬＡＤＡ〕と
も呼ばれる徐々に進行するＩＤＤＭ（ＳＰＩＤＤＭ）及びＩＤＤＭが根底にある
ことによる妊娠中の糖尿病の防止、低減若しくは他の方法での緩和に関して記述
する。これは、しかしながら、本発明が細胞により媒介されるある範囲の自己免
疫状態に及ぶという理解の下でなされる。

【００３８】従って、本発明の別の一側面は、主体のＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ若しくは妊娠
糖尿病を防止し、低減し若しくは他の方法で緩和する方法であって、調節Ｔ細胞
の誘導、及び／又はＩＤＤＭと関連する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するの
に十分な他の適切な機構の誘導に十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと関連す
る自己抗原の有効量をエーロゾルとして若しくは他の機能的に同等な手段により
該主体に投与する工程を含み、該自己抗原が機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用エピ
トープを実質的に欠失しているものである方法を意図する。

【００３９】本明細書で以降における「ＩＤＤＭ」への言及には、ＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ
及び妊娠ＩＤＤＭが含まれる。

【００４０】誘導される調節Ｔ細胞は抗原の形及びその投与経路に依存する。例えば、分解
されていない、立体構造的に完全なポリペプチド若しくはタンパク質分子全体（
例えばインスリン）を投与するときは、ＣＤ８Ｔ細胞がそしてより具体的にはＣ
Ｄ８γδＴ細胞が誘導される。プロインスリンぺプチド（例えば、プロインスリ
ンぺプチド２４〜３６）などのより小さなぺプチドは一般的にＣＤ４Ｔ細胞、そ
してより具体的にはＣＤ４αβＴ細胞を誘導する。特に経口ルートで投与すると
きＣＤ４調節Ｔ細胞を優勢に形成するように、タンパク質全体を複数のぺプチド
に分解してもよい。

【００４１】機能性のＭＨＣクラスＩ相互作用エピトープの不存在には、このエピトープ領
域の全部若しくは一部を含む１個若しくは複数のアミノ酸の欠失が含まれる。ま
た、このエピトープは抗体又は他の分子と相互作用によるなどの他の手段により
阻止されうる。

【００４２】特に好ましい投与剤形はエーロゾルスプレー、液の滴下、又は蒸気を経る鼻孔
内投与である。

【００４３】鼻孔内投与又は他の投与経路のために用いられるＩＤＤＭと関連する好ましい
抗原は、インスリン及びプレプロインスリン若しくはプロインスリン、及びそれ
らの免疫応答刺激性誘導体、例えばプロインスリン、プレプロインスリン若しく
はインスリンのぺプチド断片であるが、これらに限定されない。ただし、これら
の抗原はＣＴＬ免疫の誘導に関与する機能性のＭＨＣクラスＩ関連領域を欠失し
ているか又は実質的に欠失していることが条件である。免疫応答刺激には、調節
性Ｔ細胞刺激が含まれることが好ましい。しかしながら、種々のイソ型（例えば
、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７）におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡ
Ｄ）若しくはその誘導体及びチロシンホスファターゼＩＡ−２若しくはその誘導
体など、これらに限定されないが、のいずれの島抗原も使用することができる。
これらの抗原はヒト由来のものであってもマウスなどの任意の非−ヒト種由来の
ものであってもよい。最も好ましい抗原は、アミノ酸２４〜３３により定義され
たＭＨＣクラスＩ相互作用領域を不活性化するように改変されたプロインスリン
ぺプチドである。この相互作用領域を改変して、重要なＭＨＣクラスＩアンカー
残基の一つ以上を欠失しているぺプチド又はＭＨＣクラスＩの結合が低減するよ
うに改変された残基を含むぺプチドを形成させてもよい。このプロインスリンぺ
プチドはＭＨＣクラスＩエピトープを不活性化するためにＣ末端の先端切断を受
けさせることが好ましい。その結果として、ＣＴＬ免疫の誘導はＣＴＬ耐性を含
む耐性の誘導から切り離される。

【００４４】従って、本明細書の別の一側面は、主体におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し、
若しくは他の方法により緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻
止若しくは低減させ、且つ、他の方法でＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導するの
に十分な時間及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定されたいかなるエピトープ
の機能をも発揮できないようにするためそのＣ末端抗原で先端切断したプロイン
スリンぺプチドを投与する工程を含む方法を意図する。

【００４５】さらに以下に論ずるように、本発明の方法は、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を
阻止するための戦術と組み合わせて用いてもよい。一つのアプローチでは、例え
ば、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の相互作用が阻止される。

【００４６】用語「誘導体」には、抗原の断片、一部、部分、化学的等価物、突然変異体、
同族体及び類縁物質が含まれる。類縁物質は天然起源のものでも、合成又は組換
え起源のものでもよく、融合タンパク質も含まれる。抗原の化学的等価物は抗原
の機能的類縁物質として作用できる。化学的等価物は必ずしも抗原から誘導され
る必要はなく、ある種の立体構造的類似性を共有すればよい。また、化学的等価
物は抗原のある種の物理化学的特性を模倣するように特異的に設計されてもよい
。化学的等価物は化学的に合成してもよく、例えば天然生産物のスクリーニング
の後に検出してもよい。

【００４７】本発明で意図される抗原の同族体は、ヒト由来の抗原又はマウスなどの任意の
非ヒト種由来の抗原を含むが、必ずしもこれらに限定される必要はない。

【００４８】誘導体には、一つ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれる。アミノ酸
の挿入誘導体は、１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入並びにアミノ末端及び／
又はカルボキシル末端の融合を含む。挿入アミノ酸配列変異型は一つ以上のアミ
ノ酸残基が該ぺプチド中の予め定められた部位に導入されるものである、もっと
も、得られる生産物の適切なスクリーニングを伴う無差別挿入も可能である。欠
失変異型は該配列から一つ以上のアミノ酸の除去が特徴である。置換アミノ酸変
異型は該配列中の少なくとも一つの残基が除去され異なる残基がその位置に挿入
されたものである。アミノ酸配列への付加には、他のぺプチド又はポリペプチド
との融合が含まれる。例えば、好ましい主体のぺプチドを他のぺプチド又は機能
性同族体若しくは類縁物質により置換することも可能である。ハイブリッドぺプ
チドはぺプチドの組合せを含みうる。

【００４９】用語「エーロゾル」はその最も一般的な意味て用いられ、鼻、咽喉、気管支又
は経口の経路を経て投与できるいかなる製剤をも含む。エーロゾルは一般に気体
又は蒸気中に懸濁された液体又は固体の粒子を含む。このエーロゾルは分散媒体
が気体である霧のようなコロイド系であるのが便利である。エーロゾル製剤を投
与する方法はいかなる手段でもよく、手動ポンプ、電動ポンプ、加圧ディスペン
サー、点鼻薬、若しくは他の便利な手段を用いて達成してもよい。さらに、液滴
の大きさは肺の浸透を決定しうる、そして液滴の大きさは投与の効率を最大にす
るように操作する必要がある。本発明の方法は鼻孔内表面に該製剤の直接適用に
まで及ぶことが理解されるべきである。

【００５０】特に好ましい実施態様では、エーロゾルは約１から約２０リットル／分の速度
、好ましくは約２から約１５リットル／分の速度で、そして液滴の大きさが約０
．１から約１０μｍ、より好ましくは約０．１から約６μｍで送達される。抗原
の貯蔵溶液は約０．５から約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、又はより好ましくは約１
．０から約１０ｍｇ／ｍｌの担体溶液で調製されるのが便利である。市販されて
いるインスリンは約４ｍｇ／ｍｌであるのが特に有用である。有用な用量は貯蔵
溶液から約５０μｌから１０００μｌであり、好ましくは１００μｌから５００
μｌである。

【００５１】抗原はアジュバントの中で又はアジュバントと共に単独で又は製剤により投与
されうる。このアジュバントは、コレラ毒素Ｂ、大腸菌の熱不安定毒素、サポニ
ン、クィルＡ抽出物及び他のサポニン誘導体、ＤＥＡＥ−デキストラン、硫酸デ
キストラン、アルミニウム塩、及び非イオン性ブロック・コポリマーを含む免疫
調節応答を増強するある範囲のアジュバントから選択される。アジュバントはサ
イトカイン（例えば、ＩＬ−４又はＩＬ−１３）、ムラミル−ジぺプチド及び誘
導体、及び細胞壁成分、例えば大腸菌などのグラム陰性細菌由来の細胞壁リポタ
ンパク質、ミコバクテリウム若しくはコリネバクテリウムの種由来の細胞壁成分
などの他の免疫調節因子を含んでもよい。アジュバント製剤はリストしたアジュ
バントの二つ以上の組合せを含んでもよい。これらのリストは網羅的と解すべき
ではない。アジュバントの選択は、標的とされる種に部分的に依存し、求められ
る免疫応答のレベル及び期間及び反応原性（即ち、組織適合性）の欠如に基づく
。活性成分及びアジュバントのレベルは必要なレベル及び免疫応答の期間を達成
するように選択される。

【００５２】抗原は治療的に有効な量で投与される。治療的に有効な量とは所望の効果を達
成するため、又は治療されるべき特定の状態の開始を遅延させるため、進行を阻
止するため、又は両者合わせて開始又は進行を遅延又は阻止するために少なくと
も部分的に必要な量を意味する。このような量は、勿論治療されるべき特定の状
態、その状態の重篤度、及び年齢、肉体状態、大きさ、体重及び同時に行なわれ
る治療を含む個々の患者のパラメータに基づくものである。これらの因子は当業
者には良く知られており、単なる機械的実験で取り組むことができる。最高用量
が使用されるのが一般に好ましい、即ち健全な医学的判断に従った最高の安全な
用量である。しかしながら、より低い用量又は耐用可能な用量が医学的な理由、
生理学的理由又は事実上の他の任意の理由のため投与されうることは当業者には
理解されることである。

【００５３】一般に、抗原の毎日の経口用量は約０．０１ｍｇ／用量／主体／日から１００
０ｍｇ／用量／主体／日である。初めに小用量（０．０１〜１ｍｇ）が投与され
、その後用量を約１０００ｍｇ／Ｋｇ／日まで増加させてもよい。このような投
与で主体の応答が不十分である場合は、より高い用量（又は異なる経路、より局
部的送達経路による効果的なより高い用量）さえも、患者の耐性が許す程度まで
用いてもよい。１個の用量が投与されてもよく、複数の用量が毎時、毎日、毎週
若しくは毎月の基準で投与されてもよい。抗原の効果的な量は個体により変わる
が、主体当たりの用量当たりで、約０．１μｇから約１００ｍｇまでの範囲であ
り、好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、より好ましくは約５μｇから２０
ｍｇの範囲である。特により低い用量はエーロゾル投与又は鼻孔内投与用に意図
されており、例えばｎｇ〜μｇ用量が最適である。

【００５４】本発明の関連する側面では、治療を受ける主体は治療又は予防の処置が必要な
いかなるヒト又は動物であってもよい。

【００５５】一般的に免疫状態そして特異的には調節Ｔ細胞及びサイトカインプロファイル
のレベルは当業者に知られた通常の方法を用いて任意の治療計画を通じて容易に
決定することができる。例えば、調節Ｔ細胞レベルはＴ細胞サブセットに特異的
な市販の抗体で標識化した後サイトメトリー分析によりモニターすることができ
る。主体の状態を決定する適切な方法の他の例としては、密度遠心分離により末
梢血の単核細胞の精製の後ＧＡＤ、ＩＡ−２ファミリー構成員、プレプロインス
リン、プロインスリン又はインスリン又はこれらの抗原由来のぺプチド配列など
の周知の抗原とインキュベートすることによる刺激が挙げられる。その結果得ら
れる増殖を³Ｈチミジンの取込みを検定することにより定量できる。サイトカイ
ンプロファイルは抗原で刺激した後約２４〜７２時間で測定できる。該サイトカ
インは、例えば、サイトカイン特異的抗体を用いて検出できる。抗原で刺激した
後約２４時間以内に、刺激した細胞を、例えば活性化マーカー発現のフローサイ
トメトリー分析により表現型として特徴付けることができる（例えば、ＣＤ６９
、ＣＤ４４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５）。活性化細胞の細胞表面標識化の後、該細
胞をさらに固定しサイトカインに特異的な蛍光色素標識化抗体と共にインキュベ
ートして細胞内のサイトカインレベルを測定する。特に、例えば、二重標識化検
定により細胞をさらに評価してもよい。この二重標識化細胞はフローサイトメト
リー分析又は蛍光顕微鏡法を用いて分析してもよい。

【００５６】本発明の別の一側面は、一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤
を含むエーロゾル製剤に自己免疫疾患と関連する抗原を含む組成物を提供する。

【００５７】自己免疫疾患はＩＤＤＭであることが好ましい。

【００５８】この抗原はインスリン、又はプレプロインスリン、プロインスリンなどのその
前駆体の改変型又はそれらの誘導体（例えば、プロインスリンぺプチド２４〜３
６）又はＧＡＤ又はチロシンホスファターゼＩＡ−２若しくはその誘導体の改変
型などの島抗原であることが好ましく、該抗原はＭＨＣクラスＩエピトープの機
能を妨げるように改変されているものである。

【００５９】該抗原及び投与経路は、インスリンＣＤ８Ｔ細胞などの分子全体に関しては調
節Ｔ細胞そして最も好ましくはＣＤ８γδＴ細胞、又はプロインスリンぺプチド
２４〜３６などのより小さな分子に関してはＣＤ４Ｔ細胞そして最も好ましくは
ＣＤ４αβＴ細胞を誘導するものであることが好ましい。

【００６０】代替的実施態様では、ＩＤＤＭ関連自己抗原をコードする核酸分子が投与され
る。一般に、この実施態様によれば、プロインスリン又はその改変型をコードす
るＤＮＡなどの核酸分子の鼻孔内若しくは他の適切な投与が糖尿病の発症を抑制
するＣＤ４Ｔ細胞の集団を誘導する。

【００６１】該核酸分子は機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用分子を欠失しているぺプチドをコ
ードすることが好ましい。

【００６２】該核酸分子は好ましくはｃＤＮＡなどのＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであり、ＤＮ
Ａ：ＲＮＡハイブリッドである。該核酸分子はプラスミド又はベクターの形であ
ることがとりわけ好ましい。該核酸分子は安定性を増強するためにヌクレオチド
塩基の付加又は置換類似体を含んでもよい。

【００６３】従って、本発明の別の一側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質
的に回避しながらＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導する方法であって、機能性Ｍ
ＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠失している粘膜抗原をコード
する核酸分子又はその類縁物質を、ＣＴＬ免疫の誘導を阻止又は低減するのに十
分な時間及び条件の下で、主体に投与する工程を含む方法を意図する。

【００６４】より具体的には、本発明はＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＩＤＤＭを防止
又は抑制する方法であって、機能性ＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実
質的に欠いているＩＤＤＭ関連自己抗原をコードする核酸分子又はその類縁物質
を、ＩＤＤＭの効果を防止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、主体に
投与する工程を含む方法を意図する。

【００６５】本発明のさらに別の一側面はＣＴＬ耐性からＣＴＬ免疫を切り離すための他の
方法を意図する。特に、ＣＴＬのエフェクターである「キラー」細胞への成熟は
樹状細胞などの抗原提示細胞によるプライミングを要求する。この樹状細胞は該
抗原ぺプチド（即ち、エピトープ）をＭＨＣクラスＩ分子との複合体としてＣＤ
８ＣＴＬのＴ細胞受容体に提示する。樹状細胞それ自体は、Ｔ細胞上のＣＤ４０
リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と樹状細胞上のＣＤ４０の間の相互作用を通じて「ヘル
パー」ＣＤ４Ｔ細胞との先立つ相互作用によりこの機能を発揮するようにプライ
ムされる（図１１参照）。ＣＤ８Ｔ細胞自体もＣＤ４０Ｌを発現することが示さ
れた。従って、別の実施態様では、粘膜抗原の投与と連結してＣＤ４０Ｌ−ＣＤ
４０相互作用のアンタゴニストを投与することが提唱される。このようなアンタ
ゴニストの１例はモノクローナル抗体などのＣＤ４０Ｌ抗体である。ＣＤ４０Ｌ
−ＣＤ４０相互作用のアンタゴニストは粘膜抗原の投与の前、同時又はその後に
投与されうる。逐次投与には、数秒以内、数分以内、数時間以内、数日以内又は
数週間以内が含まれる。同時には実質的な同時が含まれる。この余分の処理は粘
膜抗原又は粘膜抗原をコードする核酸分子の投与と一緒でもよい。

【００６６】本発明の別の一側面は、従って、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避
しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低
減するのに十分な時間及び条件の下で、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴ
ニストの投与の前、同時若しくは後に、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を
投与する工程を含む方法を意図する。

【００６７】より具体的には、本発明は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しな
がら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減す
るのに十分な時間及び条件の下で、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用のアンタゴニ
ストの投与の前、同時若しくは後に、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投
与する工程を含む方法を意図する。

【００６８】本発明のさらに別の一側面は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避し
ながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成
熟を阻止若しくは他の方法で遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物
質を投与する工程を含む方法を提供する。

【００６９】より具体的には、本発明は粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しなが
ら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を
阻止若しくは他の方法で遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質を
投与する工程を含み、該物質がＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻止若しくは他
の方法で妨害するものである方法を提供する。

【００７０】本発明の一層別の一側面は、ある疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造
におけるＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止できる物質の使用を意図する。

【００７１】本発明は下記の非限定的な実施例によりさらに説明する。

【００７２】実施例１エーロゾル治療と糖尿病評価８匹の雌ＮＯＤマウスを入れた準密封箱のそれぞれを、標準的な患者用電動ポ
ンプ（メイメッド・エーロゾルＭＫＶ，アネステティック・サプライズ，シドニ
ー，オーストラリア）及びアエロフロ・ネブライザー（ウエイト・アンド・コウ
．，シドニー）に連結することによりエーロゾル化した。４ｍｇ／ｍｌの組換え
ヒトインスリン（ヒュームリンＲ，イーライ・リリー）又は対照オボアルブミン
タンパク質を、２４〜３２マウスの群に、流速１２リットル／分、定格液滴サイ
ズ＜５．８μｍで１０分間以上送達した。すべての処置は０９００及び１１００
時間の間に行なわれた。治療計画とマウスの世話は、インスティチューショナル
・アニマル・エチック・コミティーにより承認され監督された。１００日齢から
少なくとも２８日毎に後眼窩の静脈血を採取し、マウスは反復テストにより確認
されたその血中グルコースが１１ｍＭより多いときは糖尿病であると判断された
。グルコースは、麻酔をかけていないマウスの後眼窩の静脈叢からガラス毛細管
を介して吸引した血液滴について、ＢＭ−ＴｅｓｔＧｌｙｃｅｍｉｅ（登録商
標）ストリップ及びＲｅｆｌｏｌｕｘ（登録商標）IIメーター（ベーリンガー−
マンハイム）を用いて測定した。

【００７３】実施例２組織学マウスをＣＯ₂吸入により殺し、膵臓及び唾液腺を直ちにブインの定着液中に
摘出し、パラフィン中に包埋した。島浸潤の重篤度の尺度であるインスリン炎評
点は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した一連の６μｍの膵臓切片中の最小で
も１５の別々の島の等級付けとその平均をとることにより二人の独立の研究者に
よりブラインドで決定された。等級付けのスケールは、０，浸潤なし，島は無傷
、１，島周辺に１０未満のリンパ細胞，島は無傷、２．島周辺及び島内に１０〜
２０個のリンパ細胞，島は無傷、３，島周辺及び島内に２０より多くのリンパ細
胞，島の５０％未満が置換又は破壊、４，大量のリンパ細胞浸潤，５０％以上の
島が置換又は破壊、である。唾液腺の浸潤はクラスターにおけるリンパ細胞の数
により等級付けされた。０，細胞なし、１，細胞が１０未満、２，細胞が１０〜
５０、３，細胞が５０より大。

【００７４】実施例３免疫応答個々の正常血糖マウス由来の脾臓細胞を赤血球溶解緩衝液で処理し、示された
濃度の抗原を含む丸底ウェル中の４連の５０μモルの２−メルカプトエタノール
を含む２×１０⁵／２００μｌの無血清ＨＬ−１培地（ハイコール，アーヴィン
，ＣＡ）に再懸濁し、インキュベートした。５％ｖ／ｖＣＯ₂／空気中、３７℃
で３日間の後、それぞれのレプリカ上清から１００μｌの部分標本をとり、サイ
トカイン検定のため−７０℃で貯蔵した。次いで、細胞に３Ｈ−チミジンを加え
、１６時間後に収穫し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（商標）ミクロ−シンチレーション・
カウンター（パッカード，メリデン，ＣＴ）で計数した。インスリンは、エーロ
ゾル治療に用いたと同様の組換え体ヒト（ヒュームリンＲ，イーライ・リリー）
であった。マウスインスリンIIのアミノ酸９〜２３に対応するインスリンＢ鎖ぺ
プチド（ぺプチド・エクスプレス，フォート・コリンズ，ＣＯ）はＨＰＬＣ分析
により９０％を越える純度であった。ＧＡＤ６５はバキュロウイルス系でＣ末端
ヘキサヒスチジンを持って発現された組換え体ヒトであり、Ｎｉ^{2 +}キレーショ
ンアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥで
１本のバンドとして分離され、定量的リムルス・ライゼート検定（バイオ・ホイ
タッカー，ウォーカースヴィル，ＭＤ）により、内毒素フリーであった。

【００７５】ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γはモノクローナル抗体の対（
ファーミンゲン）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。検出の最低限界はそれぞ
れ、６２、１６、１６及び５５ｐｇ／ｍｌであった。ＴＧＦ−β１はＥＬＩＳＡ
キット（プロメガ）を用いて最低検出限界１６ｐｇ／ｍｌで測定した。

【００７６】インスリン抗体を検出するため、¹²⁵Ｉ標識化ヒトインスリン（約１００，０
００ｃｐｍ，比活性１２０μＣｉ／μｇ）を、プロテアーゼ阻害剤と逐次対数希
釈したマウス血清の混合物を含むリン酸塩緩衝化食塩水中で、過剰の無標識イン
スリン（１０μｇ／ｍｌ）を含め又は含めずに、４℃で５日間インキュベートし
た。次いで、複合体をウサギ抗マウスグロブリン抗血清を用いて沈殿させ、洗浄
し、ガンマカウンターで計数した。ポジティブの対照の血清（モルモットの抗ブ
タインスリン血清、ヒトのＩＤＤＭ血清）は、総放射活性のうちの３７〜５４％
が最大沈殿した。過剰の非標識化インスリンの存在下での非特異的結合は３％以
下であった。

【００７７】実施例４糖尿病の養子免疫細胞移入６〜９週齢の雄ＮＯＤマウス（１６／群）にコバルト線源から照射し（８００
Ｒ）、次いで３〜６時間後に最近糖尿病を発症した１４〜１９週齢の雌ＮＯＤマ
ウス由来の脾臓細胞プールの２×１０⁷及びエーロゾルのインスリンかオブアル
ブミンで処理されたマウス由来の脾臓細胞の２×１０⁷（又はこの数から分画さ
れた細胞）を２００μｌ中に一緒に懸濁させ、尾の静脈経由で与えた。次いで、
移入後２週間に血中グルコースの測定を開始することにより、糖尿病の発症を追
跡監視した。

【００７８】実施例５脾臓細胞集団の分画脾臓細胞は赤血球溶解緩衝液で処理し、マウス等張リン酸塩緩衝化食塩水中に
再懸濁した。全てのＴ細胞をナイロンウールへの非吸着により精製した。ＣＤ４
細胞及びＣＤ８細胞は製造者の説明書に従ってＭＡＣＳ・ミクロビーズ（ミルテ
ニ・ビオテク，ＧｍｂＨ，ドイツ）に直接結合したモノクローナル抗体で磁気的
にポジティブに選択／除去し、生存細胞（トリパン・ブルー染色が負）として計
数した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ４細胞又はＣＤ８細胞の９５％除去
が明らかになり、それぞれの回収率は約８０％及び約５０％であった。

【００７９】 γδＴ細胞は、エーロゾル処理マウス由来のＴ細胞を、まずビオチン化ＧＬ３
−１Ａ抗体（ファルマシア，サンジエゴ，ＣＡ）と、次いでストレプトアビジン
−ＭＡＣＳミクロビーズとインキュベートし、その後磁気分離することにより、
ポジティブに選択／除去した。フローサイトメトリーにより、γδ細胞は１〜２
％のＮＯＤ脾臓細胞を含み、ＧＬ３−１Ａ抗体でその全てを除去した。ＣＤ８γ
δＴ細胞を精製するために、ＣＤ８Ｔ細胞をまず抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抱合体及び
抗ＦＩＴＣミクロビーズを持つ全てのＴ細胞から磁気的に選択した。このミクロ
ビーズを次にミルテニル・バイオテク・プロトコルに従って放出し、ついでＣＤ
８細胞をγδ陽性画分とγδ欠如画分とに磁気的に分離した。二重染色及びＦＡ
ＣＳ分析により、γδ細胞の完全な欠如とＣＤ８集団を表す高及び低ＧＬ３−１
Ａとしてのその回収が示された。

【００８０】実施例６糖尿病とインスリンエーロゾル・ヒトインスリン又はエーロゾル・オブアルブミンを２８日齢の雌
ＮＯＤマウスに異なる計画で投与し、インスリン炎がマウス集団で検出可能とな
る最も早い時、及び糖尿病の発症率及びインスリン炎の重篤度を続いて測定する
。

【００８１】糖尿病の発症率は２８日齢での１回のエーロゾルインスリン処理では僅かしか
影響されず、エーロゾル・オブアルブミン投与後の８８％に比べ２４０日齢まで
で７５％である。しかしながら、３又は１０連続日の間の処理及びその後毎週１
回の処理により、糖尿病の発症は有意に遅延しそしてその発症率は有意に低下し
た。５回の別々の実験で、１５６日齢における糖尿病の発症率は、オブアルブミ
ン処理マウスにおける４７％の中央値からインスリン処理マウスにおける２３％
まで低下し、糖尿病の累積発症率が最高に達する２４０日齢で、その値はそれぞ
れ７９％及び４９％であった（ｐ＝０．００５、カプラン−マイアー生存統計）
。最初の処理が３又は１０日間であったときは相違はなかった。処理が１０連続
日次いで毎週１回なされたがインスリン炎が十分に確立された４９日齢まで処理
が開始されなかった別の実験では、エーロゾルインスリンは１５６日での糖尿病
発症率を、５８％から２５％までなお有意に低下させた（ｐ＝０．００１）。イ
ンスリン処理は、「インスリン炎評点」により判断すると、島病巣の重篤度の有
意の低下と関連した。これは糖尿病発症率の減少と平行した（表１）。ＮＯＤマ
ウスでも起こった唾液腺のリンパ細胞による浸潤（シアリティス，sialitis）は
エーロゾルインスリンにより影響を受けなかった。

【００８２】吸収促進物質の不存在下で、ヒトの鼻咽喉粘膜からのインスリンの全身取込み
は微々たるものであった（２２）。ＮＯＤマウスでは、血中グルコースはエーロ
ゾルインスリンにより短期間では変わらなかった。１０％エバンス・ブルー色素
で標識したインスリン溶液は鼻咽喉、気管、及び主要気管支部分並びに食道に沈
着することが観察された。可溶性タンパク質のエーロゾル送達又は鼻孔内送達の
後に一部の胃腸管への接触を避けることは、不可能ではないにしても、困難であ
るが、鼻咽喉のみへの送達で耐性を誘導するのに十分である（７、２３、２４）
。

【００８３】

【表１】

【００８４】マウス（３２／群）に２８日齢から１０連続日の間エーロゾル・インスリンか
又はエーロゾル・オブアルブミンを投与し、ついで毎週１回投与した。１０５日
齢の時に、各群からの５匹の非糖尿病マウスを殺して膵臓の組織検討を行なった
。インスリン炎評点は平均値±ＳＤとして表す。¹ インスリン処理マウスのインスリン炎評点は有意に低下した（ｐ＜０．０１
、マン−ホイットニーＵテスト）。² インスリン処理マウスの糖尿病発症率は有意に低下した（ｐ＝０．０４、フ
ィッシャーのエグザクトテスト）。

【００８５】実施例７免疫応答

【００８６】本発明者らは、エーロゾル・インスリン処理がインスリンに対する免疫応答を
変えるか否かを研究した。プライムしていないＴ細胞の、インスリンを含む島抗
原に対する増殖性の応答がＮＯＤマウスで報告された（２５）が、必ずしも再現
性がなかった（２６）。インスリンか又はオブアルブミンで処理された５６〜１
０５日齢のマウス由来の脾臓細胞（０．５〜２．５×１０⁶／ｍｌ）のヒトイン
スリン又はヒトオブアルブミン（０．２、２．０、２０及び４０μｇ／ｍｌ）に
対する異なる血清補充培地若しくは無血清培地における増殖性応答は、基礎レベ
ルの２倍未満まで変化し、通常はインスリンの最高濃度での基礎レベル未満に抑
制された。高濃度のインスリンはＴ細胞の応答を阻害すると報告された（２７）
。対照的に、オブアルブミン処理の対照マウスでは、インスリンＢ鎖ぺプチドａ
９〜２３、即ちＮＯＤマウス島由来のＴ鎖クローン（１９）に対する優勢エピト
ープに対する応答は有意であった（表２）が、インスリン処理マウスではそうで
なかった。さらに、オブアルブミンマウスはＮＯＤマウスで脾臓Ｔ鎖を刺激する
と先に報告された（２５）ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６
５）に対しインスリンマウスよりも有意に高い応答を示した。両処理群からのマ
ウスで、コンカナバリンＡ又はＴ細胞受容体ＣＤ３モノクローナル抗体である１
４５−２Ｃ１１による非抗原特異的刺激への増殖性応答は同様であり（表２）、
そして無処理マウスとの相違もなかった。このことはエーロゾル処理が一般的免
疫抑制を惹起したのではなかったことを示す。インスリンＢ鎖９〜２３への応答
としてのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＧＦ−β１の分泌はインスリン処理マウス
とオブアルブミン処理マウスの間で有意差はなかった。しかしながら、ＩＬ−４
そしてとりわけＩＬ−１０のレベルはインスリン処理マウスの細胞の場合、より
高かった（表３）。

【００８７】

【表２】

【００８８】群当たり３匹のマウスからの脾臓細胞を４連でＨＬ−１無血清培地中で検定し
た。統計学的比較（マン−ホイットニーＵテスト）は各群について１２回の結果
の間で行なった。

【００８９】

【表３】

【００９０】複製培養ウェルから得た上清（表２）を３日培養した後に試料とし、サイトカ
インについて検定した。

【００９１】インスリン抗体は、インスリン処理及びオブアルブミン処理の７０〜１０５日
齢のマウス（ｎ＝１２／群）から得た血清について標準的免疫沈降検定法により
測定した。インスリン処理マウスから得た血清中の抗体による¹²⁵Ｉ−インスリ
ン放射活性の沈降（１２．７±３．６％、沈降したｃｐｍの平均値±ＳＤ）はオ
ブアルブミン処理マウス（６．９±２．５％）よりも有意に高かった（ｐ＜０．
０１、マン−ホイットニーＵテスト）。エーロゾルインスリン後のＴ細胞増殖の
抑制及びインスリンＢ鎖ぺプチドへのＩＬ−４及びＩＬ−１０の応答の増加と共
にインスリン抗体の「レベル」の増加は、ルイスラットにおける経口ＭＢＰ（１
）及びＮＯＤマウスにおける鼻孔内ＧＡＤぺプチド（２８）の後に記述されたよ
うな、免疫偏向の現象と一致する。ＩＤＤＭのＤＴＨ病巣内でのβ細胞の崩壊は
Ｔｈ１により媒介されるプロセスの１例であり（１０，１１）、エーロゾルイン
スリンによるその阻害は、重要な島抗原に対する応答としてＴｈ１／Ｔｈ２のバ
ランスをＴｈ２へとシフトさせると予想されるかも知れない。欠陥のあるサプレ
ッサーＴ細胞の機能はＩＤＤＭにおいてこのバランスをＴｈ１へシフトすること
だと仮定された（１１）。Ｔ細胞のＧＡＤに対する増殖性応答の減少はインスリ
ンエーロゾルにより誘導された調節性細胞によるＴｈ２サイトカインであるＩＬ
−４及びＩＬ−１０（１）の分泌の結果の「傍観者」抑制を反映するものであろ
うとは思われない。何故なら、ＧＡＤを含む培養物中にインスリンを添加しなか
ったことを除いては、コンＡ及び抗ＣＤ−３への応答は損なわれなかったからで
ある。直接的説明は、ＧＡＤへの応答の減少はインスリン炎及びβ細胞破壊に及
ぼすエーロゾルインスリンの保護効果を反映するというものである。このことは
少なくとも一部のＧＡＤ免疫が二次的であり、（プロ）インスリンに対する免疫
がβ細胞破壊においてより近接した役割を持ちうることを意味する。ヒトＧＡＤ
６５に対するＮＯＤマウスのＴ細胞の応答はより強力であり、天然のヒトインス
リンに対する応答よりもより早いように見えると報告されてきた（２５）が、Ｎ
ＯＤマウスの抗原提示細胞におけるマウスプロインスリンIIのトランスジェニッ
ク発現はインスリン炎及び糖尿病を完全に阻止することが見出された（２９）。

【００９２】実施例８調節性ＣＤ８γδＴ細胞本発明者らは、エーロゾルインスリンが病原性のエフェクターＴ細胞による糖
尿病の養子免疫細胞移入を阻害できるであろう調節性細胞を誘導したか否かを研
究した。古典的な養子免疫細胞移入モデル（３０）（図６参照）においては、若
齢の放射線照射された非糖尿病の同系の雄又は雌のレシピエントへ静脈注射され
た糖尿病のＮＯＤ雌マウス由来の脾臓細胞は、４週間以内に大部分に臨床的糖尿
病を惹起する。老齢の糖尿病マウス由来の２×１０⁷個の脾臓細胞をエーロゾル
オブアルブミンマウス由来の同数の脾臓細胞と共に共注射すると、若齢のレシピ
エントの大部分が４〜５週間以内に糖尿病を発症した、対照的に、エーロゾルイ
ンスリンマウス由来の脾臓細胞との共注射後には、少数しか糖尿病を発症しなか
った（図４Ａ）。糖尿病の発症率は、エーロゾルインスリンマウス由来の脾臓細
胞か又はナイロンウール非吸着性脾臓細胞（Ｔ細胞が濃縮）のいずれかを用いた
六つの独立実験において７５％以上抑制された。

【００９３】次に、脾臓細胞を、分画し、糖尿病移入の抑制の原因となる該調節性細胞を同
定した。ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の涸渇選択並びにポジティブ選択は、ＣＤ８
細胞が専ら移入の抑制の原因であることを明白に示した（図４Ｂ）。ＣＤ４細胞
の涸渇は、エーロゾルインスリンマウス由来の残りの脾臓細胞の移入抑制能力を
変えなかった（図４Ｂ）、そしてポジティブ選択されたＣＤ４細胞は移入を抑制
しなかった（図４Ｃ）。他方で、エーロゾルインスリンマウス由来のＣＤ８の涸
渇した脾臓細胞による抑制は存在しなかった（図４Ｄ）のに対して、ポジティブ
選択されたＣＤ８細胞は移入を抑制した（図４Ｅ）。ポジティブ選択されたＣＤ
８細胞による部分抑制は、これらの涸渇後の糖尿病の急速な進行と対比して、多
分ＣＤ８細胞の非効率的な回収によるものである。この実験では、７ｘ１０⁵個
の精製されたＣＤ８細胞が糖尿病マウス由来の２ｘ１０⁷個の脾臓細胞とともに
各レシピエント内に共注射されたのである。

【００９４】 γδ受容体をもつＴ細胞は免疫調節の役割を果たすことが示されてきた（３１
〜３６）。興味深いことに、全末梢血のγδ細胞は準臨床的ＩＤＤＭのヒトにお
けるβ細胞機能の喪失と同時に減少することが報告されている（３７）。観察さ
れた糖尿病移入の抑制がγδＴ細胞によるものであったか否かを決定するために
、本発明者らは抗γδＴ細胞モノクローナル抗体であるＧＬ３−１Ａを用いて脾
臓細胞を分画した（３８）。ＣＤ８細胞の涸渇と同様に、γδＴ細胞の涸渇によ
り、インスリンエーロゾル処理されたマウスに由来するナイロンウール非吸着性
脾臓細胞は糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制する能力を完全に失った（図５Ａ）
。逆に、インスリンエーロゾル処理されたマウスに由来する比較的少数のγδＴ
細胞は移入を抑制できた。移入後の糖尿病の発症率は、１．４ｘ１０⁵γδＴ細
胞が糖尿病マウス由来の２ｘ１０⁷個の脾臓細胞と共に注射されると、少なくと
も７０日間で５０％まで低下した（図５Ａ）。糖尿病移入を抑制した脾臓のＣＤ
８及びγδＴ細胞は、同一物であり、二つの相互依存集団ではなかった。従って
、それらがまずγδＴ細胞を涸渇させた場合、インスリンエーロゾル処理された
マウスに由来するＣＤ８細胞の移入を抑制する能力は喪失したが、一方、該ＣＤ
８細胞から精製された少数のγδ細胞は移入を防止した（図５Ｂ）。１１の異な
る共移入実験から得られた結果の概要は図６に提示する。

【００９５】ＦＡＣＳ分析は、ＧＬ３抗体と反応するγδ細胞が１２〜１６週齢の雌ＮＯＤ
マウスの脾臓における全細胞の１．６〜２．４％及びＣＤ８⁺細胞の約１％を構
成することを明らかにした。これらの値はインスリン又はオブアルブミンのエー
ロゾルで処理されたマウス群間で差異は無かった。しかしながら、それらの低い
産出量のため、抗原に特異的なＣＤ８γδＴ細胞の異なる亜集団はこの方法で識
別するのは難しいであろう。分画された細胞、例えば逐次精製されたＣＤ８γδ
細胞を用いたより高い保護（図６）は、定量的であり未分画細胞のそれと比較し
てより高い絶対数を反映している。

【００９６】実施例９インスリンのエーロゾル化粘膜へのインスリン送達の様式としてのエーロゾル吸入は、ＮＯＤマウスの糖
尿病の発症率を減少させる際に経口インスリン（２２、２３）と同じく効果的で
あった。これがインスリン炎の発症後の治療であったという事実は、循環する島
の抗原に反応する抗体及びＴ細胞の存在が潜在的なインスリン炎を反映すると解
釈される、準臨床的疾患の危険性のあるヒトのＩＤＤＭの予防に特に重要である
。実際、最近診断されたＩＤＤＭのヒトと比較して、ＮＯＤマウスはより重いイ
ンスリン炎を患い、雌の大部分が糖尿病に進行する（１０、１１、２４）。エー
ロゾルインスリンは明白な代謝効果を有しなかったが、調節性ＣＤ８γδＴ細胞
の集団を誘導し、その少数は、病原性のエフェクターＴ細胞の糖尿病を養子免疫
細胞移入する能力を抑制した。細胞に媒介された自己免疫病状から防御するこれ
らの抗原に誘導された「サプレッサー」Ｔ細胞はこれまでに記載されたことはな
かった。

【００９７】経口耐性は、細胞性の抗原特異的免疫の低減並びに時折体液性の抗原特異的免
疫の増大と関連させられ、ＴＧＦ−β又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β
１をそれぞれ分泌するＣＤ８Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞のいずれかと関連させられ
てきた（８）。しかしながら、これらの調節性細胞はγδ受容体を担うものとし
て同定されてこなかった。ＮＯＤマウスでは、インスリンに対する経口耐性は調
節性ＣＤ４Ｔ細胞に帰せられた（２１）。本発明によれば、ＣＤ８γδＴ細胞が
エーロゾルインスリンにより誘導される該調節性細胞である。

【００９８】実施例１０鼻腔内のインスリン（図１）、プロインスリン（図２）又はプロインスリンペプチド２４〜３６（図３）インスリン担体溶液又はマウス等張リン酸塩緩衝化食塩水のいずれかに溶解し
た４ｍｇ／ｍｌの市販のインスリン、又は同液に溶解した１〜４ｍｇ／ｍｌのプ
ロインスリン若しくはプロインスリンペプチド２４〜３６を、２８日齢又は５６
日齢のいずれかの麻酔をかけずに拘束したＮＯＤ雌マウスの鼻孔に１０〜２０μ
ｌの容量で適用した。５６日齢までに全マウスは潜在的な島の炎症（インスリン
炎）を呈することに留意せよ。

【００９９】２８日齢又は５６日齢のいずれかでのインスリン、プロインスリン又はプロイン
スリンペプチド２４〜３６の１回投与はそれぞれ、対照タンパク質のオブアルブ
ミン又は鶏卵リゾチームと比較して、ＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病の発症を有
意に遅延させた。比較用量のベースで、プロインスリン及びプロインスリンペプ
チド２４〜３６はインスリンより効果があった。これらの効果は該タンパク質又
はペプチドの反復用量を用いるとより大きくなる。プロインスリン２４〜３６の
１回鼻孔内投与（４０μｇ）で前処理された雌のマウスにおいて、全脾臓細胞、
及びＣＤ８Ｔ細胞を涸渇させたがＣＤ４Ｔ細胞は涸渇していない全脾臓細胞は、
糖尿病マウス由来の脾臓細胞による糖尿病の養子免疫細胞移入を有意に抑制した
（図７）。雌のマウスを２８日齢で処理した後、屠殺し、それらの脾臓細胞を５
６日齢で養子免疫細胞共移入のために採取した。

【０１００】実施例１１危険性のある個体における鼻孔内インスリンの臨床試行この鼻孔内インスリン試行（ＩＮＩＴ）は、島の自己抗原と反応する循環する
抗体及びＴ細胞を含むＩＤＤＭの免疫マーカーと共に、危険性があるが他方で健
康な一親等の親類への鼻孔内インスリンの投与を含む。本発明者らの主体は、イ
ンスリン、ＧＡＤ又はチロシンホスファターゼＩＡ−２に対する少なくとも二つ
の抗体を有し、末梢血のＴ細胞はインスリン、プロインスリンペプチド２４〜３
６に応答し、時々ＧＡＤ及びＩＡ−２ペプチドに応答する。この実験の理由は、
インスリンに対する粘膜媒介性免疫耐性を誘導することであり、ＮＯＤマウスの
本アプローチの成功に基づいて、安全性を証明することである。市販のヒトの組
換えインスリンを使用する。これは通常ＩＤＤＭの人達への皮下注射又は静脈注
射により日常的に投与される。この試行に参加した４〜３０歳（平均１１．４歳
）の３８人の危険性の高い主体において、有意な副作用は観察されなかった。粘
膜刺激の可能性は存在するが、これはごく稀であり、その上大したことでなく一
過性であった。エーロゾル又は鼻孔内のインスリンで処理されたＮＯＤマウスは
臨床的合併症又は生検でも異常を示さなかった。

【０１０１】このＩＮＩＴ試行はＩＤＤＭの代用免疫マーカーへの鼻孔内インスリンの影響
を調べる。この計画は、無作為化された、二重盲検及びプラシーボ対照であり、
６カ月で交差させた。プラシーボはインスリン用に通常使用される担体溶液であ
る。本目的はインスリン及び他のベータ細胞の抗原に対する抗体及びＴ細胞のレ
ベルに及ぼす有意な効果を証明することである。更に、グルコースの静脈注射へ
の応答としての第一段階のインスリン放出（ＦＰＩＲ）、即ちベータ細胞の機能
の測定は、開始時、６ヶ月及び１２ヶ月に監視される。該交差の設計は、治療の
機会を全主体に与え（危険性のある親類にとって重要な問題）、何らかの治療効
果があれば測定は維持され、群内及び群間の分析を可能にする。治療は最初に１
０日連続で毎日、次いで一週間に二日連続で投与される。６ヶ月後、治療は交差
される（インスリンからプラシーボへ、又は逆に）。

【０１０２】鼻孔を通じたインスリンの投与用量は市販の４ｍｇ／ｍｌ溶液を約２００μＬ
（８００μｇ）である。該プラシーボはインスリンが通常溶かされる担体溶液で
ある。

【０１０３】結果鼻孔内インスリンは、インスリン抗体全長の有意な増加（ｐ＝０．０１）、並
びに変性したヒトのインスリンに対する末梢血の単核（Ｔ細胞）増殖の相伴う減
少と関連しており、インスリン抗体のレベル及び変性したインスリンに対するＴ
細胞の増殖性応答は第一期（ｐ＝０．０５）及び第二期（ｐ＝０．０１）で反比
例の関係にあった。これらの結果はＮＯＤマウスで見られたものと一致している
。ＦＰＩＲが初期に第一のパーセンタイルより上で測定可能であったどの主体に
もＦＰＩＲに変化は無かった。免疫パラメータの変化はＦＰＩＲの変化と関連し
ておらず、例えば、インスリンについてのインスリン抗体の増加は、第一のパー
センタイルよりＦＰＩＲが大きな主体でのベータ細胞機能の低下と関連していな
かった。鼻孔内インスリンの副作用は明白でなかった。この結果は、長期ＦＰＩ
Ｒ及び糖尿病の発症率に対する鼻孔内インスリンの効果を決定するために更なる
試行を勇気づける。

【０１０４】実施例１２機能性ＭＨＣクラスＩに相互作用するエピトープを除去するためのプロインスリンペプチド２４〜３６の改変プロインスリンペプチド２４〜３６の投与後、糖尿病の養子免疫細胞移入をほ
とんど完全に阻止したＣＤ４調節性Ｔ細胞が誘導されたが（単離され、エフェク
ター「糖尿病誘発性」Ｔ細胞を用いて若齢の放射線照射されたＮＯＤマウス中に
トランスフェクトされた場合）、自然発生糖尿病の発症は遅延されたが防止され
ることはなかった。本発明者らは、該プロインスリンペプチドがＭＨＣクラスＩ
（Ｈ２−Ｋ^d）に限定されたＣＴＬ、即ちアミノ酸２６〜３４及びアミノ酸２５
〜３４の推定エピトープを有することを観察した。従って、プロインスリンペプ
チド２４〜３６の投与により、ＣＴＬ免疫及びＣＴＬ耐性の同時誘導が結果とし
て生ずるであろう。まず、この投与は、２６〜３４及び特に２５〜３４がＫ^dに
結合でき（図８）そしてＮＯＤマウスにＣＴＬを誘発できることを示した（図９
にアミノ酸２６〜３４を示す）。次に、これらは、該プロインスリンアミノ酸２
４〜３６ペプチドの一連のＣ末端の先端切断の効果を証明した（図１０）。位置
９のアンカー残基（アミノ酸３４）の欠失によるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの
不活性化は、中核のＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｇ７）結合配列が鼻腔内投与後に
糖尿病を防止する能力を有意に増強した。位置（ｐ）９のＣ末端アミノ酸は、Ｍ
ＨＣクラスＩ分子への結合に必要とされる重要な「アンカー」残基である。

【０１０５】実施例１３ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０シグナル発信を標的化することによる経口耐性からの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫の切り離し材料及び方法マウスマウスはザ・ウォルター・アンド・イライザ・ホール・インスティチュート・
オブ・メディカル・リサーチで飼育し維持した。経口耐性及びＣＴＬ活性は、６
から８週齢の雌のＣ５７Ｂ１／６マウスで決定した。ＭＨＣクラスＩに限定され
たＯＶＡ_257-264ペプチドに対するトランスジェニックＣＤ８Ｔ細胞受容体（Ｔ
ＣＲ）を保持するトランスジェニックＯＴ−１／ラッグ（Ｒａｇ）^-/ ^-マウス
及びＭＨＣクラスIIに限定されたＯＶＡ_323-339ペプチドに対するトランスジェ
ニックＣＤ４ＴＣＲを保持するＯＴ−IIマウスは、Ｌｙ５．１／ＣＤ４５．２同
系Ｃ５７Ｂ１／６マウス（ＯＴ−Ｉ細胞）内及びＲＩＰ−ＯＶＡトランスジェニ
ックマウス（ＯＴ−Ｉ細胞及びＯＴII細胞）中への養子免疫細胞移入用にＯＶＡ
に反応するＴ細胞のドナーとして６から１２週間の間使用した。

【０１０６】耐性の誘導経口耐性は、報告された高用量及び低用量のＯＶＡに対応する二つのプロトコ
ルを用いて誘導された。

【０１０７】ＯＶＡ（Ｖ等級、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）は、弱いメトキシフ
ルラン（Penthrane （商標））麻酔の下で胃内挿管を介して２０ｍｇを１日おき
に３日間（高用量）又は０．５ｍｇを１日おきに５日間（低用量）のいずれかで
雌のＣ５７Ｂ１／６マウスに投与した。リムルス・ライゼート検定（バイオ・ホ
イタッカー、ウォーカースヴィル、メリーランド州）で測定されたＯＶＡ溶液（
１０ｍｇ／ｍｌ）の内毒素濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以下であった。ＣＤ４０Ｌの
シグナル発信はハムスターＩｇＧ１抗マウスＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ−１（ＡＴＣ
Ｃ、ロックビル、メリーランド州）の投与により阻止され、その対照はヒトＢｃ
ｌ−２に特異的なハムスターｍＡｂ６Ｃ８であった。両ｍＡｂを、Ｇタンパク質
−セファロース（ファルマシア社、ウップサラ、スウェーデン）上でアフィニテ
ィークロマトグラフィーによりハイブリドーマ細胞培養液から精製し、記載した
ように２５０μｇの用量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。

【０１０８】細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）検定ＣＴＬは下記のように検定した。

【０１０９】マウスは、２０ｘ１０⁶個のＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋ^bm-1脾臓細胞（ＣＤ４Ｔ細胞
の援助に依存している）を用いて静脈注射でプライムされ、又は２００μｇのＯ
ＶＡペプチド２５７〜２６４のＣＦＡ１００μｌ（ＣＤ４Ｔ細胞の援助に依存し
ない）を用いて尾の基部に皮下注射（ｓ．ｃ．）でプライムされた。実験に応じ
て、マウスはｍＡｂ及び経口ＯＶＡを受容した２週間後又は３週間後にプライム
された。マウスはプライミングの７日後に屠殺され、その脾臓細胞は⁵¹Ｃｒ放出
検定でエフェクターとして使用する前に更に６日間インビトロで刺激された。溶
血ユニットは、各脾臓から生成したエフェクターの総数を３０％のＯＶＡに特異
的な溶解に必要なエフェクターの総数で割ることにより算出した。

【０１１０】ＣＴＬ前駆体の経口ＯＶＡ±抗ＣＤ４０Ｌ処理の効果経口ＯＶＡに対するＯＶＡに特異的なＣＴＬ前駆体の応答並びにＣＤ４０Ｌ阻
害の効果を決定するために、３×１０⁶個のＯＴ−Ｉ細胞をＬｙ５．１同系雌マ
ウス内に移入した後、該マウスに０日目及び３日目にＭＲ−１又は対照の６Ｃ８
ｍＡｂのいずれかを与えた。経口ＯＶＡ２０ｍｇは１〜３日目に毎日与えた。マ
ウスは１４日目に屠殺され、脾臓ＯＴ−Ｉ細胞の数並びにそれらのＣＤ４４及び
ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン活性マーカー）の発現を Lysys２（商標）ソフトウ
ェア（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてＦＡ
ＣＳｃａｎにより分析した。細胞は、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４４及び抗Ｌ−セレク
チンｍＡｂ（ファーミンゲン社、サンノゼ、カリフォルニア州）とともにビオチ
ン化抗Ｌｙ５．２ｍＡｂ（ファーミンゲン社）及びＰＥ結合抗ＣＤ８ｍＡｂ（シ
グマ社）とインキュベートした後、ストレプトアビジン結合ＰｅｒＣｐ（ファー
ミンゲン社）と第二段階のインキュベーションを行いＬｙ５．２を検出した。

【０１１１】ＲＩＰ−ＯＶＡ^loマウスの糖尿病誘導に及ぼす経口ＯＶＡ±抗ＣＤ４０Ｌ処理の効果ＣＴＬの経口ＯＶＡのインビボ活性化へのＣＤ４０Ｌ阻害の効果が経口ＯＶＡ
であることを調べるために、膵臓のβ細胞上でＯＶＡを発現するＲＩＰ−ＯＶＡ
マウスに、０．３ｘ１０６個のＯＴ−１細胞及び０．２ｘ１０⁶個のＯＴ−１細
胞を養子免疫細胞移入し、移入日（０日目）にＭＲ−１及び対照の６Ｃ８ｍＡｂ
を与えた。次に、マウスに一日目から始めて０．５ｍｇを１日おきに５日間の経
口ＯＶＡで処理した。血中グルコースは、１４日目及び２１日目に後眼窩の静脈
血滴についてグルコメーターを用いて測定し、１４ｍｍｏｌ／ｌを上回る値は糖
尿病の徴候とみなした。

【０１１２】経口耐性の評価全身プライミングに対するＣＴＬ耐性を評価するため、経口ＯＶＡの最終投与
の１４日後又は２１日後に、マウスに２０ｘ１０⁶個のＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋ^bm-1 脾臓細胞を用いて静脈注射し又はＣＦＡ中０．１ｍｇのＯＶＡタンパク質を用い
て皮下注射した。続いて、これらの脾臓ＣＴＬ活性を上記のように測定した。粘
膜耐性の通常のインデックスを評価するため、経口ＯＶＡの最終投与の７日後に
、マウスにＣＦＡ中のＯＶＡ（０．１ｍｇ）を尾の基部に皮下注射により免疫化
した。１０日後、マウスに麻酔をかけ、後眼窩の静脈叢からガラスの毛細管を用
いて給餌し、ＣＯ₂窒息により屠殺し、これらの脾臓及び鼠蹊リンパ節を摘出し
た。血清を回収しＯＶＡ抗体の検定用に−２０℃で保存した。細胞懸濁液を、ス
テンレス鋼網を用いて機械的破壊により脾臓及び節から調製し、洗浄し、計数し
、そしてＯＶＡに対する増殖応答及びサイトカイン応答の検定用に２ｍＭのグル
タミン、５ｘ１０^-5の２−メルカプトエタノール及び５％v/vの胎児牛血清を含
有するＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。

【０１１３】ＯＶＡに対するＩｇＧサブクラス抗体は、前述したようにペルオキシダーゼ結
合抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３抗体（サザン・バイ
オテクノロジー・アソシエイツ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。

【０１１４】２００μＬの培地中での脾臓細胞（１ｘ１０⁶）又は鼠蹊リンパ節細胞（５ｘ
１０⁵）のＯＶＡに対する増殖応答は、５％ＣＯ₂／大気中３７℃で９６時間０
．１ｍｇ／ｍｌのＯＶＡの存在下又は非存在下でインキュベーションした後、９
６穴リンブロプレート（フローラブズ社、マックリーン、バージニア州）の丸底
ウェルで８回反復して測定した。³Ｈ−チミジン（１μＣｉ）を細胞回収前１０
〜１６時間に各ウェルに添加し、該細胞を回収し、洗浄し、トップカウントシン
チレーションカウンターで計数した。ＯＶＡに対する脾臓細胞又は鼠蹊リンパ節
細胞のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の応答はＥＬＩＳＰＯＴ検定により測定した。細
胞（５ｘ１０⁵／２００μｌ）は、５μｇ／ｍｌＰＢＳのモノクローナルラット
抗マウスＩＦＮγ（クローンＲ４−６Ａ２）又はＩＬ−４（クローン１１Ｂ１１
）抗体で一晩予め被覆したマルチスクリーン・インモビロン−Ｐ膜９６穴プレー
ト（ＭＡＩＰＳ４５１０；ミリポア社、ノースライド、オーストラリア）の穴に
添加した。細胞は、５％ＣＯ２／大気中３７℃で２４時間０．１ｍｇのＯＶＡの
存在下又は非存在下でインキュベーションした後、洗浄して得た。膜に結合した
サイトカインは、４μｇ／ｍｌのビオチン複合モノクローナルラット抗マウスＩ
ＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２）又はＩＬ−４（クローンＢＶＤ６−２４Ｇ２
）と４℃で一晩反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、
次いで３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ；ダコ社、カルピンテリア
、カリフォルニア州）を用いて発色させた。全てのモノクローナル抗体はファー
ミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア州から購入した。

【０１１５】統計治療群間の差異はフィッシャーの正確検定又はマン−ホイットニー試験により
分析した。

【０１１６】結果ＣＤ４０Ｌの阻害は経口ＯＶＡによるＣＴＬ誘導を損なうＣＤ４Ｔ細胞の援助に依存する経路（図１２Ａ）によるＣＴＬプライミングを
阻害するＭＲ−１ｍＡｂの用量（２５０μｇ、腹腔内注射）を決定した後、同様
の用量の対照のｍＡｂ６Ｃ８又はＭＲ−１ｍＡｂのいずれかをＣ５７Ｂ１／６マ
ウスに与えた後、１日おきに３日間該マウスに２０ｍｇのＯＶＡを給餌した。経
口ＯＶＡは、６Ｃ８で処理したマウスでは７５％（９／１２）にＣＴＬ応答を誘
導したが、ＭＲ−１で処理したマウスでは２５％（３／１２）しか誘導しなかっ
た（図１２Ｂ）。

【０１１７】経口ＯＶＡによるＣＴＬの活性化及び増加はＣＤ４０Ｌを必要とする経口ＯＶＡによるＣＴＬ誘導がＣＴＬ前駆体の活性化及び増加と関連したこと
を証明するため、養子免疫細胞移入されたＯＶＡに特異的なトランスジェニック
ＣＴＬ（ＯＴ−Ｉ細胞）を実験未使用のＬｙ５．１同系レシピエント内に移入し
、ＯＶＡを給餌した。経口ＯＶＡに対するＯＴ−Ｉ細胞の応答におけるＣＤ４０
Ｌの役割は、対照のｍＡｂ６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１のいずれかでレ
シピエントマウスを前処理することにより調べた。最終結果を分析する前に活性
化、増殖、再循環そしておそらくは細胞死を生じさせるために、本発明者らは経
口ＯＶＡの最終投与の１４日後に該脾臓から得たＯＴ−Ｉ細胞を調べた。この部
位及び時間は、例えばＯＶＡに誘導されたＣＴＬを測定するために用いた他のプ
ロトコルに相当するものであった。経口ＯＶＡ及び６Ｃ８に応答して、脾臓のＯ
Ｔ−Ｉ細胞が非常に増加し（図１３Ｂ）ＣＤ４４の発現を増大させ（図１３Ａ、
１３Ｃ）並びにＣＤ６２Ｌの発現を減少させた（図１３Ａ、１３Ｄ）。このこと
は多数が活性化／記憶表現型を獲得したことを示している。しかしながら、ＭＲ
１の存在下で、ＯＴ−Ｉ細胞の増加（図１３Ｂ）及び活性化（図１３Ａ、１３Ｃ
、１３Ｄ）を誘導する経口ＯＶＡの能力は著しく損なわれた。

【０１１８】抗ＣＤ４０Ｌ処理はＲＩＰ−ＯＶＡ^loマウスにおける経口ＯＶＡによる糖尿病の誘導を防止する予備実験で、本発明者らは、０．３ｘ１０⁶個のＯＴ−ＩＩ細胞及び０．２ｘ
１０⁶個のＯＴ−Ｉ細胞の最少量の移入がＯＶＡ被覆脾臓細胞でレシピエントの
ＲＩＰ−ＯＶＡ^loマウスを全身プライミングした後の糖尿病の発症に必要である
ことを見出した。従って、これらの数のＯＴ−ＩＩ細胞及びＯＴ−Ｉ細胞をＲＩ
Ｐ−ＯＶＡ^loマウスに移入し、その翌日に該マウスに対照のｍＡｂ６Ｃ８又は抗
ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１を与え、次いで１日おきに５日間０．５ｍｇのＯＶＡを
給餌した。経口ＯＶＡの後、６Ｃ８を与えられたマウスの６０％（９／１５）が
糖尿病を発症したのに対し、ＭＲ１を与えられたマウスではわずか１４％（２／
１４）しか発症しなかった（ｐ＝０．０２）（図１４）。

【０１１９】抗ＣＤ４０Ｌ処理は経口耐性の誘導を防止しないＣＤ４０Ｌ遺伝子を標的とするマウスの実験は、ＣＤ４０Ｌシグナル発信が経
口耐性の誘導に必要であることを示した（３９）。しかしながら、この突然変異
はパイアー斑（３９）の発症及び胚中心（４０）の発達に影響する。従って、抗
ＣＤ４０ＬｍＡｂで短期処理され且つ遺伝子操作されていないマウスにおいて経
口耐性が誘導できるか否かを決定することが重要であった。以前、ＣＴＬ免疫を
誘導しながら、経口ＯＶＡが全身ＯＶＡによる強力なＣＴＬ免疫の更なるプライ
ミングを逆に抑制することが示された（４１）。抗ＣＤ４０Ｌ処理がＣＴＬへの
経口ＯＶＡのこの耐性原効果に影響するか否かを決定するために、Ｃ５７Ｂ１／
６マウスに２５０μｇの対照ｍＡｂ６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１を腹腔
内投与し、次いでＰＢＳ又はＰＢＳ中のＯＶＡを給餌した。１４日後又は２１日
後、これらを、ＣＤ４Ｔ細胞に依存する様式で、ＯＶＡ被覆脾臓細胞を静脈注射
で（図１５Ａ）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中１００μｇのＯＶ
Ａを皮下注射で（図１５Ｂ）プライムした。後者の方法はＣＤ４Ｔ細胞の援助と
関わりなく直接的にＣＴＬをプライムする。これらの実験は、ＭＲ１による抗Ｃ
Ｄ４０Ｌ処理がいずれかの方法によるＣＴＬの全身プライミングへの経口ＯＶＡ
の該耐性原効果を改変しないことを証明した。これは、マウスが高用量（２０ｍ
ｇを１日おきに３日間）又は低用量（０．５ｍｇを１日おきに５日間）の経口Ｏ
ＶＡの１４日後又は２１日後にチャレンジされたかどうかを問わず、全実験で一
致した（図１５Ｃ、１５Ｄ）。

【０１２０】次に、抗ＣＤ４０Ｌ処理が経口耐性の通常パラメータに影響するか否かを決定
するための実験を行った。経口ＯＶＡ（２０ｍｇを１日おきに３日間）の最初の
投与前におけるＭＲ１の１回注射は、全身ＯＶＡでプライムしたＴ細胞増殖又は
ＩＦＮ−γ生産（図１６Ａ及び図１６Ｂに脾臓細胞をそれぞれ示す）又は血清抗
ＯＶＡ抗体（図１６Ｃ）の抑制を限定しなかった。増殖の平均刺激インデックス
は、６Ｃ８投与後３．５０（経口ＰＢＳ）から１．９６（経口ＯＶＡ）に低減し
（ｐ＜０．０５）、ＭＲ１投与後３．２１から２．０４に低減した（ｐ＜０．０
５）（図１６Ａ）。経口ＯＶＡ後のプライムされたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応
答の抑制は、より劇的で抗ＣＤ４０Ｌ処理により影響されなかった（図１６Ｂ）
。いずれの条件下でもＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴＳ（４／穴以下）はほとんど検出
されなかった。

【０１２１】抗原の粘膜投与は、自己抗原の場合、該抗原に対する次の免疫応答に耐性とな
ることができ、自己免疫抗原の場合には、自己免疫疾患の発症を抑制できる。し
かしながら、該モデルタンパク質抗原のオブアルブミン（ＯＶＡ）の粘膜投与も
細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫を誘導し、これは疾患を惹起しうる。本発明者
らは、経口ＯＶＡに誘導された耐性とＣＴＬ免疫が、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の間
の相互作用を標的化することにより切り離すことができることを示す。ＣＤ４０
Ｌのモノクローナル抗体阻害はＣＴＬの同時誘導を妨げることにより耐性を強化
した。これは、経口ＯＶＡへの応答としての養子免疫細胞移入されたＯＶＡに特
異的なＣＴＬ（ＯＴ−１−ＣＤ８細胞）の活性化及び増大の阻害により反映され
た。更に、膵臓β細胞上でＯＶＡをトランスジェニック発現するマウスにおいて
、ＣＤ４０Ｌの阻害は、ＯＶＡの経口投与に続くＣＴＬ（ＯＴ−１細胞）媒介性
自己免疫糖尿病の発症を有意に阻害した。これらの結果は、ＣＴＬに対する粘膜
耐性がＣＴＬプライミングのためのＣＤ４０Ｌシグナル発信の要件とは無関係に
誘導されることを示している。従って、ＣＤ４０Ｌシグナル発信の阻害はＣＴＬ
媒介性自己免疫疾患を予防するための粘膜抗原の有効性（及び安全性）を改良で
きるであろう。これを証明するために、８週齢の雌ＮＯＤマウスに、１日目、３
日目、１０日目、２４日目及び３８日目にエーロゾルインスリン（４ｍｇ／ｍｌ
、１０分間）又は希釈対照の投与直前に抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体である
ＭＲ−１又は対照抗体の６Ｃ８を用いて処理された（３００μｇ、腹腔内注射）
。エーロゾルインスリンによる抗ＣＤ４０Ｌ抗体の処理は、希釈剤又は対照抗体
並びにエーロゾルインスリン又は希釈剤のいずれかによる抗ＣＤ４０Ｌ抗体処理
と比較して糖尿病の発症率を著しく低減した（図１７）。

【０１２２】実施例１４鼻腔内プロインスリンＤＮＡは糖尿病を予防するＣＤ４Ｔ細胞を誘導する材料及び方法ＤＮＡマウスのプロインスリンIIｃＤＮＡ又はオブアルブミンゲノムＤＮＡを、ＣＭ
Ｖ初期プロモーターの制御下で哺乳動物発現ベクターのｐＣＩに由来するプラス
ミドベクター内にサブクローニングした。該ベクターを改変し、ＣＩＧＨと名付
ける。プラスミドを、大腸菌から調製し、ＰＥＧ沈降及びトリトンＸ１１４相分
配により精製し、１ｍｌのＰＢＳに２ｍｇのＤＮＡを希釈し、−２０℃で凍結し
た。

【０１２３】マウス及び処理マウスはザ・ウォルター・アンド・イライザ・ホール・インスティチュート・
オブ・メディカル・リサーチで飼育し維持した。３週齢及び５週齢で、５０μｇ
のＤＮＡを含む２５μｌのＰＢＳを麻酔をかけていない雌マウスに５μｌずつ繰
り返し鼻腔内投与した。他の実験においては、マウスを開始時３週齢で４週間連
続して２５μｇのＤＮＡを鼻腔内投与した。

【０１２４】糖尿病の決定血中グルコースは、後眼窩の静脈叢から微細なガラスの毛細管を介して得られ
た血液滴についてアドバンテージモニター（ベーリンガーマンハイム社）を用い
て測定した。これらの血中グルコースが連続した日で１１ｍＭを上回る場合、マ
ウスは糖尿病とみなされた。養子免疫細胞移入研究で用いた糖尿病のドナーマウ
スは１週間未満で高い血中グルコースを示した。

【０１２５】結果初期の実験では、１０週齢の鼻腔内ＤＮＡ処理されたマウスから得られた脾臓
細胞を、ナイロンウールを経る経路によりＴ細胞（以下の本明細書で脾臓Ｔ細胞
と呼ぶ）について濃縮し、次いで、糖尿病になったばかりのＮＯＤマウスからの
脾臓細胞と共に放射線照射した６週齢の雄ＮＯＤマウスに静脈注射で共移入する
か又はシクロホスファミド処理したＮＯＤ雌内に静脈注射で移入した。シクロホ
スファミド処理はＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を早めた。両実験モデルに
おいて、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞を受容したレシピエ
ントマウスに糖尿病発症率の有意な低下が観察された。５ｘ１０⁶個の脾臓Ｔ細
胞が２ｘ１０⁷個の「糖尿病」脾臓細胞とともに共移入された３つの実験におい
て、移入４週間後のレシピエントにおける糖尿病の合計発症率は、オブアルブミ
ンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントの６４％と比較してプロイ
ンスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントでは１４％であった
（ｐ＝０．００３）（表４）。平行して、５ｘ１０⁶個の脾臓Ｔ細胞を、３００
ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射で受容した２日後の８〜１０週齢
の雌ＮＯＤマウス内に移入した。シクロホスファミドの１７日後に観察された糖
尿病の最大発症率は、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシ
ピエントの１２．５％と比較してオブアルブミンＤＮＡ処理されたドナーからの
細胞のレシピエントでは５６％であった（ｐ＝０．０２）（表５）。プロインス
リンＤＮＡの筋内注射を二回受けたマウスから得た５ｘ１０⁶個の脾臓Ｔ細胞を
シクロホスファミド処理されたレシピエント内に注射した場合、防御は観察され
なかった（表５）。

【０１２６】鼻腔内プロインスリンIIＤＮＡを投与されたＮＯＤマウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞は
糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制する

【０１２７】

【表４】

【０１２８】＊ｐ＝０．００３、＊＊ｐ＝０．０２は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較して
のもの、フィッシャーの正確検定

【０１２９】鼻腔内プロインスリンIIＤＮＡを投与されたＮＯＤマウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞は
シクロホスファミド誘導性糖尿病を抑制する

【０１３０】

【表５】

【０１３１】＊ｐ＝０．００２、＊＊ｐ＝０．０４は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較して
のもの、フィッシャーの正確検定

【０１３２】本発明者らは、次に、分画した脾臓Ｔ細胞集団を移入することにより防御の原
因となるＴ細胞の表現型を同定することに努めた。脾臓Ｔ細胞を、磁気ＭＡＣＳ
マイクロビーズと結合させた抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体又は抗マウスＣ
Ｄ８モノクローナル抗体のいずれかとインキュベートし、ポジティブ選択カラム
（ミルテニー社）上で精製した。ＦＡＣＳ分析によるＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ
細胞の純度はそれぞれ＞９５％及び＞８５％であった。次に、４ｘ１０⁶個のＣ
Ｄ４Ｔ細胞又は１ｘ１０⁶個のＣＤ８Ｔ細胞のいずれかを２ｘ１０⁷個の糖尿病
脾臓細胞と共に６週齢の放射線照射された雄内に共移入された。移入４週間後の
糖尿病の発症率は、オブアルブミンＤＮＡ処理された対照からのＣＤ４Ｔ細胞の
レシピエントの７１％と比較してプロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの
ＣＤ４Ｔ細胞のレシピエントでは３６％であった（ｐ＝０．０２）（表４）。対
照的に、プロインスリンＤＮＡ又はオブアルブミンＤＮＡのいずれかで処理され
たマウスからのＣＤ８細胞を共移入されたレシピエントでは糖尿病の発症率（９
４％対８３％）に差異はなかった（表４）。４ｘ１０⁶個のＣＤ４Ｔ細胞又は２
．５ｘ１０⁶個のＣＤ４涸渇（ＣＤ８Ｔ細胞が濃縮された）脾臓Ｔ細胞を、シク
ロホスファミド処理された１０週齢の雌マウス内に注射した場合に同様の結果が
得られた。従って、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからのＣＤ４Ｔ細胞
を受容したマウスの糖尿病発症率（１７％）は、オブアルブミンＤＮＡ処理され
たドナーからＣＤ４Ｔ細胞を受容したマウス（５６％）と比較して有意に低下し
（ｐ＝０．０４）、一方、プロインスリンＤＮＡ又はオブアルブミンＤＮＡで処
理されたドナーからのＣＤ４涸渇脾臓Ｔ細胞を受容したマウスでは糖尿病発症率
の差異はなかった（表５及び表６）。

【０１３３】

【表６】

【０１３４】＊ｐ＝０．００７、＊＊ｐ＝０．４は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較しての
もの、フィッシャーの正確検定

【０１３５】ヒト及びＮＯＤマウスの両方で、高血糖症の発症は「インスリン炎」の後に起
き、「インスリン炎」は、該島の血管の極又は境界でのリンパ球の島周囲の蓄積
からβ細胞破壊に関連した該島内への重度の浸潤まで及ぶ。次に、本発明者らは
、ＮＯＤマウスの島を調べ、インスリン炎の程度が７０日齢及び１００日齢の両
方でオブアルブミンＤＮＡ処理されたマウスと比べてプロインスリンＤＮＡ処理
されたマウスで有意に低いことを見出した（０．８９±０．０８対１．６±０．
１２、ｐ＜０．０１、マンーホイットニー試験）。

【０１３６】当業者は本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外の変形及
び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあ
らゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明
細書中で言及し又は示した段階、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集
合的に包含し、並びに任意の二つ以上の該段階若しくは特徴の任意の組合わせ又
は全ての組合わせも包含する。

【０１３７】引用文献１．ヴァイナー,エイチ．エル．ら、Annu. Rev. Immunol. 12: 809-837, 1994
。２．キクタニら、Adv. Immunol. 51: 285-322, 1992 。３．アドリーニら、Springer Semin. Immunopathol. 14: 187-199, 1992 。４．ムイルら、Diabet./Metab. Rev. 9: 279-287, 1993。５．ティッシュら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 437-438, 1994。

【０１３８】６．ハリソン, エル. シー.、Mol. Med. 1: 722-727，1995。７．ホルトら、Immunol. Today 8: 14-15, 1987 。８．ウェル,Ｈ．Ｇ．、J. Infect. Dis. 9: 147-151, 1911。９．チェンら、Science 265: 1237-1239, 1994。１０．ハニーマンら、Springer Semin. Immunopathol. 14: 253-274, 1993 。

【０１３９】１１．バッハ,Ｊ．Ｆ．、1994。Endocrine Rev. 15: 516-542, 1994。１２．モーデスら、Diab. Metab. Rev. 3: 725-750, 1987。１３．ハリソン,Ｌ．Ｃ．、Immunol. Today. 13: 348-352, 1992 。１４．ディーンら、Diabetologia 29: 339-342, 1986。１５．チーグラーら、Diabetologia 36: 402-408, 1993。

【０１４０】１６．ハリソンら、J.Clin. Invest. 89: 1161-1165, 1992 。１７．ルディら、Mol. Med. 1: 625-633, 1995。１８．チーグラーら、Diabetes 38: 358-363, 1989。１９．ダニエルら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 956-958, 1986。２０．チャングら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10252-10256, 1991。

【０１４１】２１．ベルゲロットら、J. Autoimmunity 7: 655-663, 1994。２２．モーゼスら、Diabetes 32: 1040-1047, 1983。２３．メッツラーら、Inter. Immunol. 5: 1159-1165, 1993。２４．ヴァルドら、Clin. Immunol. Immunopathol. 3: 30-34, 1994 。２５．カウフマン，ディー．エル．、Nature 366: 69-72, 1993 。

【０１４２】２６．ハーテンバックら、J. Autoimmunity 2: 151-161, 1989。２７．フントら、J. Immunol. 136: 3994-3996, 1986。２８．チアンら、J. Exp. Med. 183: 1561-1567, 1996 。２９．フレンチら、Diabetes 46: 34-39, 1997。３０．ウィッカーら、Diabetes 35: 855-60, 1986 。

【０１４３】３１．カベリッツ,D.、Crit. Rev. Immunol. 11: 281-303, 1992 。３２．カウフマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9620-9624, 1993。３３．カルディロら、Eur. J. Immunol. 23: 2597-2605, 1993。３４．ゴルクジンスキー,Ｒ.Ｍ.、Immunology 81: 27-35, 1994．３５．セオら、Cancer Immunol. Immunother. 40: 358-366, 1995 。

【０１４４】３６．ナカタら、Immunol Immunopathol 3: 217-222, 1995 。３７．ラングら、J. Autoimmunity 6: 107-119, 1993。３８．グードマンら、J. Exp. Med. 170: 1569-1581, 1989 。３９．キュオンら、J. Immunol. 162: 1904-1909, 1999。４０．シューら、Immunity 1: 423-431, 1994 。

【０１４５】４１．ブラナスら、Science 274: 1707-1709, 1996。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、日齢５６日におけるヒトインスリン（８０μｇ）の経鼻投与が雌ＮＯ
Ｄマウスにおける糖尿病発症開始を遅延させることを示すグラフ表示である。

【図２】図２は、日齢５６日におけるヒトプロインスリン（４０μｇ）の経鼻投与が糖
尿病開始を遅延させることを示すグラフ表示である。

【図３】図３は、ヒトプロインスリンアミノ酸２４〜３６の経鼻投与（日齢５６日に４
０μｇ）が糖尿病開始を遅延させることを示すグラフ表示である。

【図４】図４は、エーロゾルインスリンが糖尿病の移入を抑制するＣＤ８Ｔ細胞を誘導
することを示すグラフ表示である。週齢６〜９週のＮＯＤ雄マウス（ｎ＝１６／
群）に、エーロゾルインスリン処理又はオバルブミン処理したＮＯＤ雌マウス由
来の分画していない（Ａ）又は分画した（Ｂ〜Ｅ）脾臓細胞と共に、最近糖尿病
にかかった１４〜１９週齢の雌マウス由来のプールした脾臓細胞を注射し、それ
らの糖尿病発症率をその後追跡監視した。示した実験では、エーロゾル供与マウ
スは１０連続日の間次いで４９日齢からは毎週１回処理されたが、１５６日齢で
犠牲にしたときは正常血糖値であった。

【図５】図５は、エーロゾルインスリンが糖尿病移入を抑制するＣＤ８γδＴ細胞を誘
導することを示すグラフ表示である。若い雄ＮＯＤマウスに「糖尿病」脾臓細胞
（２×１０⁷）と図４の説明のようにエーロゾル処理されたマウス由来の総又は
分画した脾臓Ｔ細胞とを同時注射した。注射した分画細胞の数は、Ａ）で、エー
ロゾルインスリンマウス由来であり、約１０⁷総Ｔ細胞であり、約１０⁷のγδ
欠失Ｔ細胞又は１．４×１０⁵γδＴ細胞であり、Ｂ）では、エーロゾルインス
リンマウス由来であり、約１０⁷総Ｔ細胞、２×１０⁶ＣＤ８Ｔ細胞、２×１０ ⁶ γδ欠失ＣＤ８Ｔ細胞又は１．５×１０⁵ＣＤ８γδ陽性Ｔ細胞であった。

【図６】図６は、糖尿病の養子免疫細胞移入はエーロゾルインスリンにより誘導された
ＣＤ８γδＴ細胞により抑制されることを示す図式的表示である。１１の実験の
要約である。

【図７】図７は、ヒトプロインスリンアミノ酸２４〜３６（日齢５６日に４０μｇ）の
経鼻投与がＮＯＤマウスにおいて糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制するＣＤ４Ｔ
細胞を誘導することを示すグラフ表示である。

【図８】図８は、マウスのプロインスリンアミノ酸２６〜３４及びある程度までマウス
プロインスリンアミノ酸２５〜３４がＭＨＣクラスＩ分子Ｋ^dに結合することを
示すグラフ表示である。この検定では、ＲＭＡ−Ｓ細胞の表面でのＫ^dの発現が
フローサイトメーター中での蛍光により検出されるモノクローナル抗Ｋ^d抗体の
結合によって監視される。該細胞へのＫ^d結合ぺプチドの付加はＫ^dを安定化し
、シグナル応答における右側シフトにより示されるように細胞表面でのその発現
を増加させる。イソ型対照＝対照のモノクローナル抗体、ぺプチドなし＝構成的
Ｋ^d発現、ＨＡＰ及びＬＬＯ＝Ｋ^dに結合することが知られており、陽性対照と
して用いられたフル・ヘマグルチニン及びリステリア由来のぺプチド。

【図９】図９は、マウスプロインスリンアミノ酸２５〜３４がＮＯＤマウスにおいてＫ ^d に限定された細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することを示すグラフ表
示である。６週齢の雌マウスを、完全フロイントアジュバント中のぺプチド５０
μｇで皮下に免疫化した。１４日後にその脾臓を摘出し、脾臓細胞をイン・ビト
ロで１０μｇ／ｍｌのぺプチドで６日間、再刺激した。脾臓細胞を次に⁵¹Ｃｒ及
びぺプチド負荷ＲＭＡ−Ｓ標的細胞に対するＣＴＬ活性についてテストした。

【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、Ｃ−末端切断が経鼻投与のプロインスリンＢ−Ｃぺ
プチドの糖尿病抑制効果を増強することを示す図式的表示である。

【図１１】図１１は、ＣＤ８Ｔ細胞を活性化してＣＴＬとするＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互
作用の役割を含む、Ｉ型糖尿病におけるβ細胞破壊の仮定された機構を示す図式
的表示である。

【図１２】図１２は、ＣＴＬの全身プライミング（Ａ）及び経口プライミング（Ｂ）がＣ
Ｄ４０Ｌのシグナル発信を要求することを示すグラフ表示である。（Ａ）対照ｍ
Ａｂである６Ｃ８（白抜き四角）又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１（白丸）
の２５０μｇを、ＣＴＬをプライムするためにＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋ^bm-1脾臓細胞
の２０×１０⁶個を静脈注射でチャレンジする１日前にＣ５７Ｂ１／６マウスに
１回腹腔内注射した。１４日後にマウスを殺し、その脾臓細胞をＣＴＬ活性につ
いてテストし、代表的個々のマウスについてＯＶＡ特異的溶解として表した。（
Ｂ）６Ｃ８又はＭＲ１の同じ用量をマウスに給餌し、次いで１日おきに３日間２
０ｍｇのＯＶＡを給餌した。１４日後にさらにプライミングすることなく、マウ
スを殺し、その脾臓細胞をＣＴＬ活性についてテストし、今度は個々のマウスの
脾臓当たりの溶解ユニットとして表した（ｎ＝１２／群）。

【図１３】図１３は、経口ＯＶＡによるＯＶＡ特異的ＣＴＬの活性化及び拡大がＣＤ４０
Ｌを要求することを示すグラフ表示である。Ｌｙ５．１に対して類遺伝子的なレ
シピエントマウスＣ５７Ｂ１／６を、３×１０⁶トランスジェニックＯＴ−Ｉ細
胞（Ｌｙ５．２）で養子免疫細胞移入し、次いで対照ｍＡｂである６Ｃ８又は抗
ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１の２５０μｇを腹腔内投与した。各処理群からの
マウスを次に二つの群に分け、ＰＢＳか又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡのいずれ
かを１日おきに３日間に給餌した。ｍＡｂ処理は第３回目の給餌の前に繰り返し
た。給餌開始から１４日目にマウスを殺し、それらの脾臓中のＯＴ−Ｉ細胞の数
及び表現型をフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）個々のマウスのドッ
ト−プロットは、ＯＴ−Ｉ細胞上でのＣＤ４４発現（左）及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ−
セレクチン）発現（右）を示す。高レベルのＣＤ４４又は低レベルのＣＤ６２Ｌ
を発現する細胞の百分率は対応する四半分に示してある。６Ｃ８又はＭＲ１で処
理され次いでＰＢＳ又はＯＶＡを給餌された個々のレシピエントマウスにおける
脾臓当たりのＯＴ−Ｉ細胞の数（Ｂ）、ＣＤ４４の発現（Ｃ）及びＣＤ６２Ｌ^lo （Ｄ）ＯＴ−Ｉ細胞の％は１回の実験について示されるが、類似の結果が３回の
実験で得られた。

【図１４】図１４は、抗ＣＤ４０Ｌ処理がＲＩＰ−ＯＶＡ^loマウスの経口ＯＶＡによる糖
尿病の誘導を防止することを示すグラフ表示である。ＯＴ−Ｉ細胞及びＯＴ−II
細胞を保持するＲＩＰ−ＯＶＡ^loマウスに、対照ｍＡｂである６Ｃ８又は抗ＣＤ
４０ＬｍＡｂであるＭＲ１を２５０μｇ腹腔内注射した。低用量経口耐性計画を
模倣するため、次に１日おきに５日間０．５ｍｇのＯＶＡをマウスに給餌した。
給餌の開始後１２日目に血中グルコースを測定し、１３ミリモル／ｌを越える価
を糖尿病の診断と考えた。データは２回の実験からプールする。

【図１５】図１は、抗ＣＤ４０Ｌ処理がＣＴＬの全身プライミングに対する経口耐性を制
限しないことを示すグラフ表示である。ＯＶＡ被覆脾臓細胞での静脈内プライミ
ング（Ａ）又はＣＦＡにおけるＯＶＡでの皮下プライミング（Ｂ）への応答とし
てのＣＴＬ活性は、対照ｍＡｂである６Ｃ８及び抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ
１で処理されたマウスにおける経口ＯＶＡによって同じ様に減弱されない。マウ
スを６Ｃ８又はＭＲ１の２５０μｇで腹腔内注射し、次いで１日おきに３日間Ｐ
ＢＳ（黒四角）又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡ（白丸）のいずれかを給餌した。
１４日又は２１日（示していない）の後に、マウスを全身的にプライムし、７日
後に殺し、それらの脾臓細胞を、ＣＴＬ活性の標準的なイン・ビトロ⁵¹Ｃｒ放出
検定のために回収した。エフェクター（Ｅ）としてプライムした脾臓細胞を、標
的（Ｔ）としての⁵¹Ｃｒ負荷細胞に対してテストした。それぞれのプロットは個
々のマウスを表す。個々のマウスに対するＣＴＬ活性プロットを、（Ａ）におけ
るようにプライミング後の４回の実験（Ｃ）からそして（Ｂ）におけるようなプ
ライミング後の２回の実験（Ｄ）からの溶解性ユニットに変換した。これらの実
験では、マウスはＰＢＳか又は２０ｍｇの経口ＯＶＡのいずれかを１日おきに３
日（Ｃ）又はＰＢＳか０．５ｍｇの経口ＯＶＡのいずれかを１日おきに５日間（
Ｄ）投与された。

【図１６】図１６は、抗ＣＤ４０Ｌ処理が、Ｔ細胞増殖応答（Ａ）及びＩＦＮ−γ応答（
Ｂ）、又は抗体生産（Ｃ）の全身プライミングに対する経口耐性を制限しないこ
とを示すグラフ表示である。マウス（ｎ＝３／群）に、対照ｍＡｂである６Ｃ８
又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１の２５０μｇを腹腔内注射した。次いでそ
れらにＰＢＳか又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡのいずれかを１日おきに３日間給
餌した。７日後に、尾の基部にＣＦＡ中のＯＶＡ（０．１ｍｇ）を皮下注射して
マウスを免疫化した。１０日後に脾臓及び鼠蹊部のリンパ節及び血清を採取して
、０．１ｍｇ／ｍｌのＯＶＡ（平均値及び標準偏差は脾臓に対するもの）及び抗
ＯＶＡ抗体の非存在下（黒線）又は存在下（縞模様）におけるＴ細胞増殖及びサ
イトカイン生産の測定を、方法の部で記載したように行なった。

【図１７】図１７は、エーロゾルインスリンを投与されたＮＯＤマウスにおける糖尿病発
症率に及ぼす抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（ＭＲ−１）による処理の効果を
示すグラフ表示である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図９】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１０Ａ】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１３Ｂ】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３Ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１３Ｃ】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３Ｄ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１３Ｄ】

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１６Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１６Ａ】

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１６Ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１６Ｃ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 37/02 37/02 37/06 37/06 (31)優先権主張番号ＰＱ７６２１ (32)優先日平成12年５月19日(2000．5．19) (33)優先権主張国オーストラリア（ＡＵ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ハニネン，アルノフィンランド国、トゥルクＦＩＮ− 20520，ティキストカツ６番地、ユニバーシティオブトゥルク、メディシティ内 (72)発明者マルティネス，ナタン，アールオーストラリア国、ビクトリア州 3057、イーストブルンズイック、ロードストリート 20Ａ番地 (72)発明者クレイマー，デイヴィッドオーストラリア国、ビクトリア州 3031、フレミントン，エジンバラストリート 80番地Ｆターム(参考） 4C076 AA24 BB03 BB21 BB22 BB25 BB27 CC07 CC17 CC21 CC30 4C084 AA13 AA17 MA56 MA59 NA13 ZB081 ZC351 4C085 AA03 BB31 CC03 CC22 DD86 EE03 EE06 FF02 FF13 FF14 FF18 FF19 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】主体において粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質
的に回避しながら、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）耐性を誘導する方法であっ
て、該粘膜抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの
機能を発揮できないように粘膜抗原を改変する工程、及び次いで該粘膜抗原に対
するＣＴＬ免疫を阻止若しくは低減させるのに十分な時間及び条件の下で該選択
され若しくは改変された抗原を投与する工程を含む方法。
【請求項２】該粘膜抗原が粘膜自己抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３】該粘膜抗原がペプチド又はポリペプチドとして投与される
ものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】該粘膜抗原が該粘膜抗原をコードするＤＮＡとして投与さ
れるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】該粘膜抗原又は該粘膜抗原をコードするＤＮＡが粘膜表面
に投与されるものである、請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】投与が口、鼻、咽頭及び／又は気管支管の経路の一つ以上
を経るものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】投与がエーロゾル投与を経るものである、請求項６記載の
方法。
【請求項８】主体における自己免疫疾患の状態を防止し、低減し若しく
は他の方法で緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫の病状から
護る免疫調節機構を誘導若しくは刺激するのに十分な時間及び条件の下で該自己
免疫疾患と関連する抗原の有効量を該主体にエーロゾル投与する工程を含み、該
抗原がＭＨＣクラスＩの相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法。
【請求項９】該主体がヒトである、請求項１又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】該ＭＨＣクラスＩエピトープがＭＨＣクラスＩ（Ｋ^d)
に限定されるエピトープである、請求項１又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】該抗原がインスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）、徐
々に進行するＩＤＤＭ（ＳＰＩＤＤＭ）及び／又は妊娠中の糖尿病に関連するも
のである、請求項１又は請求項８又は請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止若しくは他の方法で
遅延させる工程と組合わせた、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１３】主体におけるＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ又は妊娠中の糖尿
病を防止、低減若しくは他の方法で緩和する方法であって、調節性Ｔ細胞を誘導
するのに及び／又はＩＤＤＭと関連する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するの
に十分な他の適切な機構を誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと
関連する自己抗原の有効量を該主体にエーロゾルとして若しくは他の機能的に同
等な手段により投与する工程を含み、該自己抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相
互作用エピトープを実質的に欠失しているものである方法。
【請求項１４】該主体がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】該ＭＨＣクラスＩエピトープがＭＨＣクラスＩ（Ｋ^d）
に限定されるエピトープである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】該調節性Ｔ細胞がＣＤ８Ｔ細胞である、請求項１３記載
の方法。
【請求項１７】該ＣＤ８Ｔ細胞がＣＤ８γδＴ細胞である、請求項１６
記載の方法。
【請求項１８】該調節性Ｔ細胞がＣＤ４Ｔ細胞である、請求項１５記載
の方法。
【請求項１９】該ＣＤ４Ｔ細胞がＣＤ４αβＴ細胞である、請求項１８
記載の方法。
【請求項２０】該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経
るものである、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】該抗原がプレプロインスリン又はプロインスリン又はそ
れらの断片である、請求項１３〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】該抗原がインスリン又はその断片である、請求項１３〜
請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】該抗原がプロインスリンペプチド２４〜３６である、請
求項２１記載の方法。
【請求項２４】ＣＴＬの誘導及び／若しくは成熟を阻止する工程若しく
は他の方法で遅延させる工程と組合わせた、請求項１３〜請求項２０のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項２５】主体におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し若しくは他の方
法で緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ耐性を防止、低減又は他の方
法で誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定された任意
のエピトープの機能を発揮できないようにそのＣ末端で抗原の先端を切断された
プロインスリンぺプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項２６】該主体がヒトである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】該プロインスリンペプチドがヒト、ネズミ又はブタ起源
のものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】該プロインスリンペプチドがヒト起源のものである、請
求項２７記載の方法。
【請求項２９】該プロインスリンがエーロゾルを経て投与されるもので
ある、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経
るものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】該プロインスリンが約１〜約２０リットル／分の速度で
投与されるものである、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】該プロインスリンがアジュバント内で投与されるもので
ある、請求項２９又は請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】該アジュバントがコレラ毒素１３、大腸菌の熱不安定毒
素、サポニカ若しくはその誘導体、クィルＡ抽出物、ＤＥＡＥ−デキストラン、
硫酸デキストラン及びアルミニウム塩から選択されるものである、請求項３２記
載の方法。
【請求項３４】アジュバントがサイトカイン、ムラミル−ジぺプチド又
は細胞壁成分である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】ＣＴＬの誘導及び／若しくは成熟を阻止若しくは他の方
法で遅延させる工程と組合わせた、請求項２５〜請求項３４のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項３６】粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該
抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を防止又は低減するのに
十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与する工
程を含み、それと同時若しくはその後にＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴ
ニストを投与する工程を含む方法。
【請求項３７】該アンタゴニストがＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌの相互作用
のアンタゴニストである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】該アンタゴニストが抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項３
７記載の方法。
【請求項３９】該主体がヒトである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】該プロインスリンペプチドがヒト、ネズミ又はブタ起源
のものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】該プロインスリンペプチドがヒト起源のものである、請
求項３６記載の方法。
【請求項４２】該プロインスリンがエーロゾルを経て投与されるもので
ある、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経
るものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４４】粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該
抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止
若しくは他の方法で遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質を投与
する工程を含む方法。
【請求項４５】該物質がＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用のアンタゴニ
ストである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】該アンタゴニストが抗ＣＤ４０抗体である、請求項４５
記載の方法。
【請求項４７】主体における疾患状態の治療又は予防のための医薬の製
造における、不活性なＭＨＣクラスＩエピトープを持つ粘膜抗原の使用。
【請求項４８】該主体がヒトである、請求項４７記載の使用。
【請求項４９】該疾患状態がＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ又は妊娠中の糖尿
病である、請求項４７又は請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】該抗原が自己抗原である、請求項４９記載の使用。
【請求項５１】該自己抗原がプロインスリンである、請求項４９記載の
使用。
【請求項５２】疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造におけるＣ
ＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止できる物質の使用。
【請求項５３】該物質がＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻害するも
のである、請求項５２記載の使用。
【請求項５４】該物質が抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項５３記載の使
用。
【請求項５５】自己免疫疾患の治療又は予防のための物質であって、該
自己免疫疾患を引き起こす自己抗原を含み、且つ該自己抗原が機能性のＭＨＣク
ラスＩに限定されたエピトープを欠失するよう改変されている物質。
【請求項５６】該自己免疫疾患がＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ又は妊娠中の
ＩＤＤＭである、請求項５４記載の物質。
【請求項５７】該自己抗原がプロインスリン又はインスリンである、請
求項５６記載の物質。
【請求項５８】ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻害する物質を更に含む
、請求項５５〜請求項５７のいずれか１項に記載の物質。
【請求項５９】ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻害する、請求項５
８記載の物質。
【請求項６０】抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項５９記載の物質。
【請求項６１】自己免疫状態の治療及び／又は予防のために使用する物
質であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴニストを含む物質。
【請求項６２】ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻害する、請求項６
１記載の物質。
【請求項６３】抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項６２記載の物質。