JP2777043B2 - 機能的な第ｖｉｉｉ因子の製造方法 - Google Patents

機能的な第ｖｉｉｉ因子の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の利用分野】本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子、その
新規な形態、それを含有する組成物に関し、更に詳しく
はヒト第ＶＩＩＩ因子の機能的な種(機能種)を製造する
ための手段および方法、特に組換えＤＮＡ技術を利用し
て製造する手段および方法に関するものである。
【０００２】本発明は、一部にはヒト第ＶＩＩＩ因子の
ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列の発見に基き、また
一方では第ＶＩＩＩ因子に随伴する成分が、機能的で生
物学的に活性であるという事実の発見に基いている。こ
の発見は、組換えＤＮＡ技術を適用することによって種
々の形態の第ＶＩＩＩ因子を生産したことにより、そし
てその結果、生物学的な試験を行ってそれらの生物学的
な機能を解明するのに、質的にも量的にも充分な物質を
生産することが可能となったということにより実現され
た。この結果、遺伝子操作とインビトロでのプロセッシ
ングにより、第ＶＩＩＩ因子の機能的な種を随意に調製
し、これまでなし得なかった、商業的に実用的な量の活
性第ＶＩＩＩ因子産物を効率良く生産する、ということ
が可能となった。本発明は、これらの派生的な態様を、
あらゆる観点において包含するものである。
【０００３】本発明の技術的背景を明らかにし、また、
時にはその実際面での詳細な事柄を補足するのに用いら
れる種々の出版物その他の参考文献を、本明細書中に引
用すると共に、末尾に文献目録として収録した。
【０００４】
【発明の技術的背景】血管系を完全な状態に維持するに
は、種々の細胞やタンパク質の相互関係が不可欠であ
る。例えば血管床の損傷に際しては、血液の損失を防ぐ
ために一連の反応が開始される。まず最初の応答は血小
板の活性化であり、これが患部(損傷部位)に付着し、一
連の反応が起こる。これら一連の反応には、患部への他
の血小板の誘引、多数の有機化合物やタンパク質類の放
出、並びに血液凝固(凝血)カスケードの活性化のため
の、血栓性表面の形成が含まれる。この連続的な反応の
組合わせにより、血小板栓塞が形成され、患部を封鎖す
る。この血小板栓塞は該栓塞の周囲に繊維素糸(フイブ
リン・スレッド)を形成することによって安定化し、望
ましくない血液損失を阻止する。血小板塞栓とフイブリ
ン・マトリックスは、傷の回復につれて徐々に溶解す
る。総説については(１)を参照されたい。
【０００５】出血を抑制する上で臨界的なファクター
は、初期の、血小板栓塞の安定化に係る凝血カスケード
の活性化である。この系には、１ダース以上もの相互に
作用し合う、血漿中に存在するタンパク質、並びに放出
および／または活性化された細胞内タンパク質類が含ま
れている(２,３)。カスケード内の各段階には、プロテ
アーゼの、その特定の不活性な形(酵素原)から触媒的に
活性な形への活性化が含まれる。国際的な同意の下
(４)、カスケード内のタンパク質は、それぞれにローマ
数字を対応させて命名される。それらの酵素原の形のも
のはローマ数字で表されているが、活性形のものはロー
マ数字の後に下付きの添字“a"を付して表される。カス
ケード内のある段階で活性形をとるプロテアーゼが、該
カスケード内の次の段階に関与するプロテアーゼを触媒
的に活性化する。この様にして、カスケードの開始期に
おけるタンパク質の活性化を引き起こした小さな初期刺
激が各段階毎に触媒的に増幅され、終には大量のトロン
ビンが生産されることとなり、このトロンビンによって
可溶性タンパク質であるフイブリノーゲンの不溶性のフ
イブリンへの触媒的変換が行われる。フイブリンは、糸
(スレッド)または繊維(ファイバー)の形に自己凝集(sel
f−aggregating)する性質を有し、血小板栓塞を安定化
し、容易に移動しない様に機能する。
【０００６】Ｆｉｇ.１に、今日血液凝固に関与するこ
とが知られているタンパク質の相互作用を示した。この
カスケードに含まれるタンパク質のいずれかが欠乏また
は不足するとフイブリンの生産に係る初期刺激の伝播が
そこで阻止されることになる。Ｆｉｇ.１のカスケード
の中央部分には、第ＩＸa因子によって第Ｘ因子が活性
化されて第Ｘa因子に変換される段階が示されている。
第ＶＩＩＩ因子(同意語的に第ＶＩＩＩc因子ともいう)
はこの段階に、りん脂質およびカルシウムイオンの存在
下、補助因子(コ・ファクター;それ自身は既知の機能を
持たないが第ＩＸa因子の活性化に必要な因子)として作
用するというのが通説である。カスケード内で、この段
階は重要である。何故ならば、２つの最も一般的な血友
病は第ＶＩＩＩ因子の機能低下(Ａ型血友病または古典
的血友病)、あるいは第ＩＸa因子の機能低下(Ｂ型血友
病)により引き起こされることが確認されているからで
ある。血友病の約８０％は第ＶＩＩＩ因子の欠損に起因
する。これら両型の血友病の臨床的な所見は同様であ
り、それは血小板栓塞の安定化に必要な、充分量のフイ
ブリンが形成されないので栓塞が容易に移動してしま
い、患部からの再出血を招くことで示される。凝固カス
ケードにおいて、第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子の欠損頻
度が他の因子類と比較して相対的に高いのは、これらが
Ｘ−染色体と遺伝的に結合していることに基づくもので
ある。第ＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子に関する遺伝子の、
１個の対立遺伝子に欠陥があれば、Ｘ染色体について１
個のコピーしか有していない男性の場合には血友病が発
現する。その他の凝固因子類は常染色体と結合してお
り、凝血異常(はるかに一般的でない)を引き起こすに
は、通常、２つの対立遺伝子上の欠陥が必要である。こ
の様に、Ａ型およびＢ型血友病は、極めてありふれた遺
伝的血液凝固障害であり、殆んど例外なく男性に発症す
る。
【０００７】数十年前、血友病患者の平均死亡年令は２
０歳以下であった。１９５０年の初めから１９６０年の
後期に至る間に第ＶＩＩＩ因子の異常に関する研究がな
され、Ａ型血友病の治療にまず全血漿、後に第ＶＩＩＩ
因子の濃縮物が用いられるようになった。ヒト第ＶＩＩ
Ｉ因子の供給源は、唯、ヒト血漿のみであった。そのた
めに必要な経済上の１つのファクターは、大量の使用可
能な血漿を獲得するのに要する経費である。そのために
業者は、供給センター(献血センター)を建設し、供血者
を補償し、得られた血漿を採血の直後から処理プラント
に出荷するまでの間、凍結状態にして維持しなければな
らない。血漿試料は、１０００人以上の供給者からの分
をロットとしてプールし、処理される。第ＶＩＩＩ因子
の活性は不安定であり、濃縮物を得るのに用いる極く少
い回数の単純な精製手段にも大量の損失を伴なう(活性
の回収率は約１５％)。得られた薬学的生産物の純度は
極めて低く、タンパク質１mgあたりの第ＶＩＩＩ因子の
特異活性は０．５〜２単位である(第ＶＩＩＩ因子活
性、１単位は、血漿１ml中に存在する活性に基いて定め
る)。第ＶＩＩＩ因子濃縮物の純度は、第ＶＩＩＩ因子
タンパク質の、約０．０４重量％と見積られる。この様
に不純物含有量が高いことから、タンパク質の沈降反
応、肝炎、さらには薬物の関与する獲得性免疫欠損症候
群(ＡＩＤＳ)を引き起こし得ること等を含む、種々の重
大な副作用が随伴している。この様な第ＶＩＩＩ因子濃
縮物の欠点は、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子の不安定性、
純度の低さ、および複数供給者からのプールによって誘
導されたものであること、に起因する。すなわち、１０
００人の供給者の内１名が例えば肝炎患者であれば、そ
のロット全体がウィルスに汚染される、ということを意
味する。供給者はＢ型肝炎について調査されるが、濃縮
物中にはＡ型肝炎および、非−Ａ、非−Ｂ型肝炎の両者
が含まれていることがわかっている。高純度の生産物を
得る試みは、容認し難く大量の活性の損失、それによる
経費の増大を招く結果となる。
【０００８】第ＶＩＩＩ因子の精製の歴史は、このタン
パク質を取り扱うことの困難さを証明している。この困
難さは、大部分、その不安定性と、全血中の第ＶＩＩＩ
因子含有量が微量であることに起因する。１９７０年代
の初期にはあるタンパク質が、当時第ＶＩＩＩ因子であ
ると信じて同定された(５,６,７)。このタンパク質は、
糖タンパク質からなるサブユニットの凝集物であると確
認された。このサブユニットの分子量はＳＤＳゲル電気
泳動により、約２４０,０００ダルトンと決定された。
このサブユニットは凝集して１,０００,０００〜２０,
０００,０００ダルトンの範囲内の、ヘテロジーニアス
(異種の)な高分子量の種(species)からなる集団を構成
している。このタンパク質は血友病患者の血漿中には存
在しているが、フォン・ウイルブランド病(von willeb
rand's disease、常染色体を介して継承される遺伝性
疾患であって、出血時間の遅延と、第ＶＩＩＩ因子のレ
ベル低下を特徴とする(８))患者の血漿中には認められ
なかった。そこで、この高分子量タンパク質(フォン・
ウイルブランド因子(vＷＦ)または第ＶＩＩＩ因子関連
抗原(ＦＶＩＩＩＲＡg)と命名された)は、このタンパク
質がフォン・ウイルブランド病においては存在せず、ま
た古典的血友病の場合にあっては幾らか非−機能的であ
る(９)ことを介して、これら両疾患の場合における凝固
欠損に関与している、という理論が提案された。しかし
ながら、その後、ある条件(顕著に高い塩濃度)下におい
て、第ＶＩＩＩ因子の活性に寄与していると信じられて
いたこのタンパク質から、因子ＶＩＩＩ活性を分離し得
るということが観察された(１０−２０)。この様な条件
下での第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を示すタンパク質の分
子量は１００,０００〜３００,０００であった。この時
以来、第ＶＩＩＩ因子の凝固活性に関与するタンパク質
(類)の同定および確認に多大の努力が集中的に払われて
きた。しかしながら、その様なタンパク質は全血中から
微量しか得られないことと、不安定であることが相まっ
て上記の研究は妨げられてきた。
【０００９】ヒトおよび動物の両天然起源から種々の純
度で第ＶＩＩＩ因子タンパク質(類)を単離したことが報
告されている(２１−２７、７９)。しかし、上記の問題
点があるので、誤った同定がなされ、その結果、所望の
第ＶＩＩＩ因子タンパク質ではなく、第ＶＩＩＩ因子調
製物中の不純物タンパク質がクローニングされ、発現し
ているおそれがある。この可能性が現実のものであるこ
とは、上記のフォン・ウイルブランド・タンパク質を第
ＶＩＩＩ因子凝固タンパク質であるとした、誤まった同
定からも強調できる。第ＶＩＩＩ因子様活性の同定にお
ける混乱も明らかに起こり得ることである。第Ｘa因子
またはトロンビンは、第ＶＩＩＩ因子が欠損している血
漿をも含む、種々の血漿の凝血時間の短縮を惹起するの
で、適当なコントロールが行われなければ、外見上は第
ＶＩＩＩ因子様活性が現れることになる。また、ある種
の細胞が第ＶＩＩＩ因子のそれと極めて似通ったやり方
で機能し得る活性物質を産生することも知られている
(２８、２９、３０)。最後の文献(３０)中で、この第Ｖ
ＩＩＩ因子様活性が実際は組織因子と称されるタンパク
質のものであることが証明されている。これと同一また
は類似の物質がヒト胎盤からも精製されている(３１)。
このタンパク質は、血漿タンパク質の第ＶＩＩＩ因子と
一緒になって、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸa因子と同
じ段階において機能を表し、第Ｘ因子を活性化して第Ｘ
a因子とする。
【００１０】従って、組換え第ＶＩＩＩ因子の発現を証
明する場合の障害は、それが疑いもなく第ＶＩＩＩ因子
の活性の機能的な発現である、ということの証明上の問
題にある。たとえ第ＶＩＩＩ因子の全てまたは一部を暗
号化している完全な、あるいは部分的なクローンを得た
ことを示す先行技術があるにしても、今日までに発現さ
れたあらゆる組換えタンパク質の４倍の大きさを有する
組換えタンパク質を発現させることには、通常の技術を
持つ作業者にとって、技術上克服し難く、困難なことで
あることは、充分に認められていることである。
【００１１】
【発明の要約】上記の、有効な人工産物およびそれに伴
なう問題点は、ヒト第ＶＩＩＩ因子のクローニングおよ
び発現の成功に関して主張された全てのクレームを綿密
に精査することの必要性を示唆している。この点に関
し、本発明が成功を収めたことは、以下の点から証明さ
れる:
【００１２】１) クローン−誘導第ＶＩＩＩ因子タン
パク質に対して導かれた抗体と、血漿−誘導第ＶＩＩＩ
因子タンパク質とが免疫学的な交差反応を行うこと。 ２) ヒト血漿第ＶＩＩＩ因子に対する中和モノクロー
ナル抗体と、本発明のクローンによって暗号化されてい
るタンパク質とが交差反応を行うこと。 ３) 本発明に係る第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡに対応するゲ
ノムＤＮＡが、第ＶＩＩＩ因子の遺伝子を暗号化してい
ることが知られているＸ−染色体内に存在しているこ
と。
【００１３】４) 以下の点を示す機能的なタンパク質
が発現されること、即ち: a) 第ＶＩＩＩ因子欠損血漿に対し、これを修正する。 b) 第ＩＸa因子、カルシウムおよびりん脂質の存在下
で第Ｘ因子を活性化し第Ｘa因子とする。 c) 上記a)、b)の活性が第ＶＩＩＩ因子に対する特異的
抗体により失活する。 d) その活性が第ＶＩＩＩ因子に特異的な、固定化モノ
クローナル抗体のカラムに吸着(結合)する。 e) 第ＶＩＩＩ因子活性がトロンビンによって賦活化さ
れる。 f) その活性が、固定化されているフォン・ウイルブラ
ンド因子に結合した後、溶離する。 即ち、本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用することによ
り、機能的なヒト第ＶＩＩＩ因子の生産に成功したこ
と、しかも、その同定を行い、機能性を証明し、更には
市場化の準備に必要な、動物実験および臨床試験を開始
し、行うのに充分な量の物質を生産することに成功した
ことに基いている。生産物であるヒト第ＶＩＩＩ因子
は、その機能的である全ての形態において、第ＶＩＩＩ
因子に係る凝固活性を欠損しているとの診断が下された
患者に対し、予防的または治療的に用いるのに適する。
従って本発明は、(その重要な一側面であるが)第ＶＩＩ
Ｉ因子を用いてヒトにおける古典的血友病(Ａ型血友病)
を診断および治療する方法、並びにその使用にとって適
した医薬組成物を提供することをも目的としている。
【００１４】また、本発明は実質上純粋な、機能的ヒト
第ＶＩＩＩ因子を提供するものである。本発明に係る、
遺伝子操作を施された適切な宿主系から産生された生産
物は、治療上有用な量および純度のヒト第ＶＩＩＩ因子
を提供する。その上、本発明に係る第ＶＩＩＩ因子には
非−組換え細胞内の環境中では常に伴なって存在する汚
染物質が随伴していない。
【００１５】本発明はまた、ＤＮＡ単離体、およびヒト
第ＶＩＩＩ因子を発現可能な状態で暗号化している遺伝
子配列を含有する発現ビヒクル、並びにそれにより形質
転換され、機能的ヒト第ＶＩＩＩ因子を発現し得る形質
転換宿主細胞培養を提供することを目的とするものであ
る。更にまた、本発明は、該ＤＮＡ単離体、該ＤＮＡ発
現ビヒクル、該宿主細胞培養およびその特殊な態様等を
調製するのに有用な種々の方法を提供することを目的と
するものである。本発明はまた、該細胞培養の発酵培養
製品を調製することにも関するものである。
【００１６】更に、本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の機
能的セグメントに相当する新規なポリペプチド含有成分
(類)を提供するものである。これらの新規なポリペプチ
ド類は、天然の第ＶＩＩＩ因子の、生物学的活性および
／または抗原決定性セグメントである。例えば、その様
なペプチド類はそのままで血友病患者の治療に用いるこ
とができ、特に、第ＶＩＩＩ因子に対する中和抗体を有
する患者の治療に有用である。後者の場合には、該当す
る患者に所望の抗原決定基(類)を有するポリペプチドを
与え、その様な抗体と効果的に結合させておけば、ヒト
第ＶＩＩＩ因子の生物活性成分含有ポリペプチドによる
治療効果が増大する。
【００１７】本発明方法に従って得られる、ヒト第ＶＩ
ＩＩ因子の機能的成分(類)を暗号化している、第ＶＩＩ
Ｉ因子ＤＮＡ単離体は、遺伝子治療上の用途(例えばそ
の様なＤＮＡを造血性幹細胞を介して第ＶＩＩＩ因子欠
損患者に挿入することにより該患者での第ＶＩＩＩ因子
活性を回復させる等)を有する。
【００１８】
【特に好ましい態様】ヒト第ＶＩＩＩ因子は、特に好適
な宿主系において、機能的な形で生産される。この系は
本発明の発現ベクターによってトランスフェクトされた
新生児(乳児)期のハムスターの腎細胞(ＢＨＫ２１(c−
１３)、ＡＴＣＣ Ｎo．ＣＣＬ１０)からなり、ここ
に、この発現ベクターは、ヒト第ＶＩＩＩ因子を暗号化
しているＤＮＡであって、その３'−および５'−非翻訳
領域のＤＮＡを伴なうと共に、３’−非翻訳領域に、例
えばＢ型肝炎の表面抗原遺伝子に由来する、３’−非翻
訳終止ＤＮＡ配列が結合したものである。この遺伝子
は、アデノウィルスのメジャー・レイト・プロモーター
(major late promotor)であって、その５'スプライス
リーダーを伴なったものにより供給される転写および翻
訳コントロールエレメント、並びにＳＶ４０の複製起源
に係る領域であって、転写促進配列およびプロモーター
配列を含んだ領域から導かれた転写および翻訳コントロ
ールエレメントにより発現される。更に、この発現ベク
ターは、ＳＶ４０のアーリイ・プロモーター(遺伝子に
増幅能力を付与する)によって作動するＤＨＦＲ遺伝
子、および選択可能なマーカー(標識)遺伝子(例えばネ
オマイシン耐性遺伝子)をも含有する。なお、後者は、
ネオマイシン耐性に関する能力を有する別個のベクター
を用いた共形質転換法によって供給してもよい。
【００１９】
【図面についての記述】
Ｆｉｇ.１：凝固カスケード(２)を図式的に示したダイ
ヤグラムである。 Ｆｉｇ.２：ＤＮＡのＴＭＡＣlおよび６×ＳＳＣ内での
融解(メルテイング)点を示すグラフである。Ａ:各点の
値は、λＤＮＡの１部をとり、ニトロセルロース・フィ
ルターに２点づつ配して得た値である。これらフィルタ
ーをホルムアミドの不存在下に、実験方法の部分に記載
されている様にして３７℃でハイブリダイズした。１対
のスポットを、６×ＳＳＣ(０．１％ＳＤＳ)により
(□)、あるいは３．０ＭのＴＭＡＣl、５０mＭのトリス
ＨＣl(pＨ８．０)、０．１％ＳＤＳおよび２mＭのＥＤ
ＴＡからなる混合物により(○)、３８℃から５６℃の間
で２℃づつ増加させた温度の下で洗浄した。ハイブリダ
イゼーションの強度が５０％残存している温度を融解点
(温度)とした。Ｂ:pＢＲ３２２ ＤＮＡの一部をニトロ
セルロース・フィルターに結合させ、２Ａの場合と同様
に融解実験を行った。pＢＲ３２２のＭspＩ消化で生成
した種々の長さのプローブ・フラグメントを、32Ｐで末
端−標識し、ポリアクリルアミドゲル上で単離した。実
験方法に関する記載に従って、１８〜７５bのプローブ
・フラグメントをホルムアミドの非存在下、３７℃でハ
イブリダイズし、４６〜１３７４bのプローブ・フラグ
メントを４０％ホルムアミドの存在下、３７℃でハイブ
リダイズした。このフィルターを、３．０Ｍテトラメチ
ルアンモニウム・クロライド(ＴＭＡＣl)、５０mＭトリ
ス・ＨＣl(pＨ８．０)、０．１％ＳＤＳおよび２mＭの
ＥＤＴＡを含む混合物中、３℃づつ増加する温度下にお
いて洗浄し、融解点を求めた。図中、(○)はpＢＲ３２
２ＭspＩプローブ・フラグメントに関する融解点であ
り、(△)は１１〜１７bプローブについて、２Ａからの
３．０Ｍ ＴＭＡＣl中で求めた融解点である。
【００２０】Ｆｉｇ.３:プローブ８．３．を用いた第Ｖ
ＩＩＩ因子の検出に際する写真の模写図である。左側の
３枚の図は以下のものを表す:ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
で消化した、４６,ＸＹ(１Ｘ:男)ＤＮＡおよび４９,Ｘ
ＸＸＸＹ(４Ｘ)ヒトＤＮＡを、６×ＳＳＣ、５０mＭり
ん酸ナトリウム(pＨ６．８)、５×デンハート(Ｄenhard
t's)溶液、０．１g／lの、煮沸し超音波処理した鮭精子
ＤＮＡおよび２０％ホルムアミド中、４２℃において、
実験方法の箇所に記載した如くにしてハイブリダイズし
て得たサザーン・ブロッドを示す。３つのブロットを１
×ＳＳＣ(０．１％ＳＤＳ)中で、指示された温度下に洗
浄した。第１列、ＥcoＲＩ、１Ｘ,第２列、ＥcoＲＩ、
４Ｘ;第３列、ＢamＨＩ、１Ｘ;第４列、ＢamＨＩ、４
Ｘ。Ｍ列は、末端標識した、λＨindＩＩＩおよびφＸ
１７４ＨaeＩＩＩ消化マーカー・フラグメントである。
右側の図は次のものを示す:λ／４Ｘのライブラリー・
スクリーンから得たニトロセルロース・フィルターとプ
ローブ８．３とのハイブリダイズの結果を示している。
矢印は、２個の独立した、第ＶＩＩＩ因子陽性クローン
を指示している。このライブラリー・スクリーンのハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄法は、上記のサザーン・
ブロット法について記載した通りである(洗浄温度３７
℃)。
【００２１】Ｆｉｇ.４:ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の遺
伝子地図。最上列の一列は第ＶＩＩＩ因子遺伝子の、２
６個所のタンパク質暗号領域(エクソンＡ〜Ｚ)の位置、
および相対的な長さを示している。転写の方向は左から
右へ向かっている。第２列目はキロ塩基対(kb)を基準と
する該地図のスケールを示している。その下方の数列
は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のマッピングに用いた１０個
の制限酵素の認識部位の位置を示している。長方形(□
)は、λファージ(λ１１４、λ１２０、λ２２２、
λ４８２、λ５９９およびλ６０５)並びにコスミッド
(ρ５４１、ρ５４２、ρ５４３、ρ６１２、ρ６１３
およびρ６２４)クローンのそれぞれに含有されている
ヒト・ゲノムＤＮＡの量(程度)を示している。最も下の
一列は、ゲノム・スクリーンに用いたプローブの位置を
示す:１)ρ５４３からの、０．９kbＥcoＲＩ／ＢamＨＩ
フラグメント;２)λ２２２からの２．４kb ＥcoＲＩ／
ＢamＨＩフラグメント:３)λ１２０のフラグメントから
得た１．０kb ＮdeＩ／ＢamＨＩフラグメントのトリプ
レット:４)オリゴヌクレオチドプローブ８．３;５)λ１
１４からの２．５kb ＳtuＩ／ＥcoＲＩフラグメント:
６)λ４８２からの１．１kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラ
グメント:７)ρ５４２からの１．１kb ＢamＨＩ／Ｅco
ＲＩフラグメント。４６,ＸＹおよび４９,ＸＸＸＸＹゲ
ノムＤＮＡのサザーン・ブロット分析では、第ＶＩＩＩ
因子遺伝子組織には何ら識別し得る差異を認めなかっ
た。
【００２２】Ｆｉｇ.５:コスミッド・ベクターpＧcos４
の制限サイト地図である。λc１８５７Ｓ７(ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリー(Ｂethesda Ｒesearch Ｌa
b．))のcos部位を含有する、アニールした、４０３b
ＨincＩＩフラグメントを、pＢＲ３２２の、ＡvaＩ〜Ｐ
vuＩＩ部分にクローンし、プラスミドpＧcos１を得た。
また、別個に、pＦＲ４００(４９n)の、ＳＶ４０起源お
よびプロモータ、突然変異ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、並びにＢ型肝炎表面抗原の末端配列を含有するＰvu
ＩＩからＮaeＩまでの(ＰvuＩＩ−ＮaeＩ)１６２４bフ
ラグメントをpＢＲ３２２のＡhaＩＩＩ部位にクローン
してプラスミドmp３３dhfrを得た。次いでpＧcos１のＳ
phＩ−ＮdeＩ１４９７bフラグメント、mp３３dhfrのＮd
eＩ−ＥcoＲＶ３１６３bフラグメント、およびpＫＴ１
９のＥcoＲＶ−ＳphＩ３７６bフラグメントを用いて３
成分ライゲーションを行ってクローニングし、pＧcos３
を得た。pＫＴ１９はpＢＲ３２２の誘導体であり、テト
ラサイクリン耐性遺伝子内のＢamＨＩ部位がニトログア
ノシン処理によって突然変異を起こしている。合成２０
マー(量体)の５'ＡＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡ
ＴＣＧをpＧcos３のＥcoＲＩ部位にクローニングするこ
とにより、pＧcos４が生成する。
【００２３】Ｆｉｇ.６:pＥＳＶＤＡの制限サイト地図
である。ＳＶ４０ウイルスの３４２bＰvuＩＩ−ＨindＩ
ＩＩフラグメントはＳＶ４０の複製起源を包含すると共
に、ＥcoＲＩ部位と結合し得る様に修飾されており(７
３)、またＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)の表面抗原(４９n)
のポリアデニル化部位は、５８０bp ＢamＨＩ−ＢglＩ
Ｉフラグメントに含まれており、そして、pＢＲ３２２
から誘導されたpＭＬについては既に述べた通りであ
る。ＳＶ４０のアーリイ(初期)プロモーターに続くＥco
ＲＩ部位とＨＢＶのＢamＨＩ部位との間に、第１番目の
レイト(後期)リーダー配列のスプライス供与部位(１
６．６５の位置)を含有するＰvuＩＩ−ＨindＩＩＩフラ
グメント(地図上の座標:アデノウイルス２の１６．６３
−１７．０６の位置)、およびその直後に、地図上９．
８３の位置にＥlbスプライス受容部位を含有するアデノ
ウイルス２の８４０bp ＨindＩＩＩ−ＳacＩフラグメ
ント(７．６７−９．９７の位置)(４９j)が挿入されて
いる。これら供与部位と受容部位との間には、ゲノムＤ
ＮＡフラグメントを挿入するための、ＢglＩＩおよびＨ
indＩＩＩ部位がそれぞれ１個づつ、存在する。
【００２４】Ｆｉｇ.７:pＥＳＶＤＡベクターからのＲ
ＮＡ転写物に関する分析の結果を示す。融合用の１０cm
の培養皿内でＣＯＳ−７細胞(７７)を、改良ＤＥＡＥ−
デキストラン法(８４)により、文献記録(７３)の如くに
して２μgのプラスミドＤＮＡでトランスフエクトし
た。ＲＮＡはトランスフエクション後４日目に細胞質抽
出物(エキス)(４９n)から調製し、変性ホルムアルデヒ
ド−アガロースゲル内での電気泳動にかけた。ニトロセ
ルロースフィルター上に移した後、方法について示す如
くこのフィルターを適当な32Ｐ−標識ＤＮＡとハイブリ
ダイズした。フィルターを２×ＳＳＣ(０．２％ＳＤＳ)
中、４２℃において洗浄し、コダック(kodak)のＸＲ５
フイルムに露出させた。各像の２８Ｓおよび１８Ｓリボ
ソームＲＮＡの位置を矢印で示した。
【００２５】エクソンＡを含むλ１１４の９．４kb Ｂ
amＨＩフラグメント(Ｆｉｇ.４参照)をpＥＳＶＤＡのＢ
glＩＩ部位(Ｆｉｇ.６参照)にクローンした。プラスミ
ドpＥＳＶＤＡ１１１．６はこのフラグメントを、ＳＶ
４０のアーリー(早期)プロモーターがゲノムフラグメン
トを適切な(即ちセンスのある)向きに転写させる様な方
向で挿入させ、含有している。また、pＥＳＶＤＡ１１
１．７は反対の方向性で９．４kb ＢamＨＩフラグメン
トを含有している。プラスミドpＥＳＶＤＡ Ｓ１２７
は、pＥＳＶＤＡのＢglＩＩ部位にpＥＳＶＤＡ１１１．
６と同じ方向性で挿入されている、(平滑末端ライゲー
ションによる)λ１１４の１２．７kb ＳacＩフラグメ
ントを含有している。
【００２６】Ａ:pＥＳＶＤＡ、pＥＳＶＤＡ１１１．７
およびpＥＳＶＤＡ１１１．６でトランスフエクトされ
た細胞から得た全細胞質ＲＮＡを含有するフィルターの
ハイブリダイゼーションに基く。各列は、それぞれpＥ
ＳＶＤＲＮＡ(第１列)、pＥＳＶＤＡ１１１．７(第２
列)、pＥＳＶＤＡ１１１．６(第３−５列)を表わす。ま
た、これらをプローブするためには、第ＶＩＩＩ因子エ
クソンＡ含有フラグメント(第１−４列)または１８００
b ＳtuＩ／ＢamＨＩフラグメント(第５列)を用いた。
１８ＳＲＮＡには僅かな交叉ハイブリダイゼーションが
認められる。
【００２７】Ｂ:ＲＮＡとＳtｕＩ／ＢamＨＩプローブ
(“イントロンプローブ")とのハイブリダイゼーション
に基く。各列のＲＮＡの起源は以下の通りである:１)p
ＥＳＶＤＡ,polyＡ-:２)pＥＳＶＤＡ,polyＡ+;３)pＥＳ
ＶＤＡ１１１．７、polyＡ-;４)pＥＳＶＤＡ１１１．
７、polyＡ+;５)pＥＳＶＤＡ１１１．６、polyＡ-;６)p
ＥＳＶＤＡ１１１．６、polyＡ+。Ａ５、Ｂ１、Ｂ３お
よびＢ５の各列にみられる小さい暗色のハイブリダイゼ
ーション帯は、おそらく、この領域に存在するtＲＮＡ
またはＡluリピート配列とのハイブリダイゼーションを
示すものであろう。
【００２８】Ｃ:エクソンＡ含有フラグメントでプロー
ブした、pＥＳＶＤＡ１１１．６からのＲＮＡ(第１列)
およびpＥＳＶＤＡ．Ｓ１２７からのＲＮＡ(第２列)を
対比させたものである。第２列では、より大きいゲノム
フラグメント中に含まれている付加的なエクソン配列を
示すサイズのわずかな増加が注目される。
【００２９】Ｆｉｇ.８:pＥＳＶＤＡ．Ｓ１２７ cＤＮ
ＡクローンＳ３６の配列を示す模式図である。ヒトＤＮ
Ａ挿入物のＤＮＡ配列は、エクソン発現プラスミドpＥ
ＳＶＤＡ．Ｓ１２７から得られたcＤＮＡクローンＳ３
６として表わされる(詳しくは後述する)。垂直な線は、
第ＶＩＩＩ因子のゲノムおよびcＤＮＡクローンの分析
によって決定されたエクソンの境界であり、エクソンは
Ｆｉｇ.４の如く分類されている。選択された制限エン
ドヌクレアーゼの制限部位を指示した。
【００３０】Ｆｉｇ.９:cＤＮＡのクローニングを示す
模式図である。第ＶＩＩＩ因子mＲＮＡは第３列目に記
されており、ここに、長方形の枠は成熟タンパク質の暗
号領域、斜線の部分は信号ペプチドの暗号領域、更に、
隣接している線はメッセージの非翻訳領域をそれぞれ表
す。このmＲＮＡの５'末端は左側である。この図の上方
にはゲノム・クローンλ２２２のエクソンＢ領域の範囲
が示されており、また、該mＲＮＡを示す図の下方には
６個のcＤＮＡクローン(それらが一緒になって完全な長
さの第ＶＩＩＩ因子のクローンを構成する。詳細な本文
を参照されたい)が示されている。cＤＮＡの合成プライ
マー類、１、３、４およびオリゴ(dＴ)を、それらがプ
ライマーとなって開始された合成反応の向きを矢印で表
して記載した。選択された制限エンドヌクレアーゼの制
限部位、並びにキロベース(kb)に基くスケールをも示し
た。
【００３１】Ｆｉｇ.１０:ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の
配列を示す模式図である。合成(組立てられた)第ＶＩＩ
Ｉ因子cＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列が示
されており、各列の左端にヌクレオチドの番号が記され
ている。番号１のＡは翻訳開始コドンＡＴＧのＡを表
す。負の数は５'非翻訳配列の部分を表す。mＲＮＡマッ
ピング実験によると、第ＶＩＩＩ因子のmＲＮＡは、こ
の図に示されている−１０９に加えて５'側に、さらに
約６０個のヌクレオチド配列を有することが示唆されて
いる。推定のタンパク質配列をＤＮＡ配列の上側に示し
た。アミノ酸配列の上に付した番号、Ｓ１−１９の部分
は推定の信号ペプチド配列であることを示し、番号１−
２３３２は推定の成熟タンパク質の配列であることを示
す。“ＯＰ"は、オパール、即ち翻訳終止コドンＴＡＧ
を意味する。３'ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡには
下線を引いて指摘すると共に、ポリ(Ａ)末端の８個の残
基(クローンλc１０．３内に発見されている)も示し
た。合成オリゴヌクレオチド・プローブ８．３とホモロ
ーガスな(相同の)配列部分を、下線を引いて指摘した
(ヌクレオチド５５５７−５５９２)。選択された制限エ
ンドヌクレアーゼの開裂部位を適当な配列の上方に示し
た。ヌクレオチド２６７１−３２１７はゲノム・クロー
ンから導かれた配列を表し、その他はcＤＮＡ配列を表
している。
【００３２】ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子のタンパク質暗
号領域の完全なＤＮＡ配列を、既述のゲノム・クローン
から求めた。それは、cＤＮＡクローンから導かれた、
Ｆｉｇ.１０の配列と、唯２個のヌクレオチドに関して
異るだけであった(ただし、ヌクレオチド２６７１−３
２１７は除く)、即ち、cＤＮＡクローンにおけるヌクレ
オチド３７８０(下線で示した)はＧであり、アミノ酸コ
ドン１２４１はaspからgluに変化している。また、３'
非翻訳領域内のヌクレオチド８７２８(下線で示した)
は、ゲノム・クローンではＡに変っている。
【００３３】Ｆｉｇ.１１:完全な長さを有する組換え第
ＶＩＩＩ因子プラスミドの組立て模式図である。完全な
長さのヒト第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡを含有するプラスミ
ドpＳＶＥＦＶＩＩＩの組立てに関する詳細な部分は、
明細書中の項目８aを参照されたい。位置を表す数字
は、本文中の数字、およびＦｉｇ.１０の数字と７２bp
づつズレている。
【００３４】Ｆｉｇ.１２:第ＶＩＩＩ因子発現プラスミ
ドの組立て模式図である。ＢＨＫ細胞内で、機能的なヒ
ト第ＶＩＩＩ因子の発現を指令するプラスミドpＡＭＬ
３p．８c１の詳細な組立て方法は、本文８bに記載され
ている。
【００３５】Ｆｉｇ.１３:融合タンパク質抗血清を用い
た、ウエスタン・ブロッティング法による第ＶＩＩＩ因
子の解析像である。ヒト第ＶＩＩＩ因子を、文献(８１)
記載の方法に従って５−１０％のポリアクリルアミド・
グラデイエントＳＤＳゲルで分離した。第ＶＩＩＩ因子
の列の内、１つを銀によって染色した(８０)。残る第Ｖ
ＩＩＩ因子の列をそのまま電気泳動的にニトロセルロー
ス・フィルター上に移し、ウエスタン・ブロッティング
法で解析した。放射性同位元素で標識した標準試料を列
中、第ＶＩＩＩ因子の横に適用し、観察される帯に対応
する分子量を算定した。指示に従って、このニトロセル
ロース切片を適当な抗血清と共にインキュベートし、洗
浄した後、125ＩプロティンＡでプローブした。このニ
トロセルロース片(シート)をオートラジオグラフィーに
適用した。
【００３６】Ｆｉｇ.１４:Ｃ８モノクローナル抗体を用
いた融合タンパク質の解析像である。融合タンパク質
１,３および４の第ＶＩＩＩ因子の特異的モノクローナ
ル抗体Ｃ８との反応性をウエスタン・ブロッティング法
で解析した。
【００３７】Ｆｉｇ.１５:第ＶＩＩＩ因子のトーヤ・ソ
ーダ(Ｔoya Ｓoda)・ＴＳＫ４０００ＳＷカラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)における溶離
曲線(像)である。このカラムを平衡にし、０．１Ｍりん
酸ナトリウム(pＨ７．０)中ＳＤＳ０．１％溶液で室温
で展開した。
【００３８】Ｆｉｇ.１６:第ＶＩＩＩ因子トリプチック
ペプチド類を逆相ＨＰＬＣで分離した場合の溶離曲線で
ある。この分離は、シンクロパック(Ｓynchropak)ＲＰ
−ＰＣ−１８カラム(０．４６cm×２５cm、１０μ)を使
用し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルに
よる傾斜溶出(アセトニトリル濃度を２０分間で１％か
ら７０％に変化)に基いて行った。矢印は配列:ＡＷＡＹ
ＦＳＤＶＤＬＥＫのペプチドを含むピークの位置を指示
している。
【００３９】Ｆｉｇ.１７:トロンビンの、精製(純化)第
ＶＩＩＩ因子活性成分に対する活性化作用を表すグラフ
である。細胞上澄みをＣ８モノクローナル樹脂上、クロ
マトグラフにかけ、透析して溶離緩衝液を除いた。トロ
ンビン(２５ng)を加え、この時を０時とする。指示され
た時間毎に一部をとって１:３に希釈し、凝固活性を分
析した。正常ヒト血漿から得た標準曲線に基いて１mlあ
たりの単位数(u／ｍｌ）を算出した。
【００４０】詳細な記述 Ａ．定義 本明細書中、“ヒト第ＶＩＩＩ因子”という語句は、イ
ンビボまたはインビトロにおいて、例えばＡ型血友病等
で特徴づけられるヒトにおける第ＶＩＩＩ因子欠損症を
修正することのできる機能的なポリペプチドを意味す
る。このタンパク質、およびそれに伴う活性はまた、第
ＶＩＩＩＣ因子(ＦＶＩＩＩＣ)および第ＶＩＩＩ因子凝
固抗原(ＦＶＩＩＩＣＡg)とも称される(３１a)。その様
な第ＶＩＩＩ因子は、組換え細胞培養により、天然のヒ
ト血漿の第ＶＩＩＩ因子活性に対応する、活性な形で生
産される。(ヒト第ＶＩＩＩ因子の活性は、正常ヒト血
漿１ml中に存在する活性を１単位として定義されてい
る。)本発明に係る第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、確認
されたそのＤＮＡ遺伝子およびアミノ酸の配列決定を通
じ、またその物性並びに生物学的活性に基いて明確なも
のとなった。
【００４１】天然の状態において、第ＶＩＩＩ因子は多
数の分解または処理形態を示す。これらの形態は、本明
細書に示す様に、前駆体である、一本鎖タンパク質から
導かれる。本発明はその様な一本鎖(single chain)タ
ンパク質を提供するものであり、さらに、そのまま、ま
たは親分子のインビトロでのプロセッシングを介してそ
れら種々の分解産物を提供すると共に、これもまた活性
であることが示されたその様な種々の分解産物を投与す
る方法をも提供するものである。その様な産物は、天然
物質に対応する機能的に活性な部分(１またはそれ以上)
を含有している。
【００４２】様々な対立性の(アレリック)変異体が存在
する。これらの変異体は、全配列中で１またはそれ以上
のアミノ酸が異るか、あるいは、全配列中、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転換される
ことによって示される。加えて、宿主細胞内環境の性質
によってグリコシル化の位置および程度が左右される。
また、組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、基となるＤ
ＮＡの部位指向性変異誘発性により、単一または複数の
アミノ酸の欠失、置換、挿入または転換によって様々に
修飾された、種々のヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体が生産さ
れる可能性がある。しかも、インビボまたはインビトロ
で生産されたヒト第ＶＩＩＩ因子のフラグメントも、前
述の如く所望の活性を有する可能性がある。これらアレ
リック変異体の全て、グリコシル化された変異種、修飾
物またはフラグメント等、第ＶＩＩＩ因子の誘導体とさ
れるものは、それらがヒト第ＶＩＩＩ因子の機能的セグ
メントを含有し、さらに根本的で特徴的なヒト第ＶＩＩ
Ｉ因子の機能的な活性(ただし、本質に変化を来すこと
なく維持されているもの)を含有する限りにおいて、本
発明の範囲に含まれるものである。本明細書中では、そ
の様な機能的な変異体または修飾された誘導体を、“ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子誘導体"と称する。これら第ＶＩＩＩ
因子誘導体が所望の機能的な活性を有することは、本明
細書中に述べる簡単なインビトロ実験により容易に同定
することができる。本明細書で開示したヒト第ＶＩＩＩ
因子ＤＮＡの配列およびヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸
配列から、このＤＮＡを制限酵素的に切断することによ
り、あるいはヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質にタンパク
分解その他の分解法を適用することにより、これらフラ
グメント類を得ることができるということは、当業者に
とって自明である。
【００４３】従って、機能的な形のヒト第ＶＩＩＩ因
子、即ち、“機能的ヒト第ＶＩＩＩ因子"は、第ＩＸa因
子、カルシウムおよびりん脂質の存在下、第Ｘ因子のＸ
aへの変換を触媒し得ると同時に、Ａ型血友病患者から
得られた血漿中の凝固性欠損を修正し得ること、更には
ヒト血漿中第ＶＩＩＩ因子と同一または実質上同一であ
るとみられる免疫学的な特性を有することによっても
“機能的ヒト第ＶＩＩＩ因子"と分類することができ
る。
【００４４】本発明方法に従って得られた“ヒト第ＶＩ
ＩＩ因子"の状態について“実質上純粋な形"なる記述
は、それが、非−組換え供給源(即ち、それが“天然"に
含有されている血漿内環境)から単離された第ＶＩＩＩ
因子に通常随伴しているタンパク質その他の物質を、実
質的に含まないことを意味する。
【００４５】“ＤＨＦＲタンパク質"という語句はジヒ
ドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)に伴う活性を表し得るタン
パク質を意味しており、従ってそのものは、ヒポキサン
チン、グリシンおよびチミジンを欠く培地(−ＨＧＴ培
地)で生存し得る細胞により、生産されるはずである。
一般に、ＤＨＦＲタンパク質を欠く細胞はこの様な培地
で増殖することができない。
【００４６】“発現ベクター"という語句は本発明に係
るＤＮＡ配列であって、該配列の発現を有効なものとす
る様、作用する他の配列と機能的に結合している配列を
含有し、それを発現させることができるベクターを指
す。これらの発現ベクターは、自身の持つ機能的な複製
起源の働きで、または細胞内の染色体への機能的な組込
みにより、宿主細胞内で複製する。“発現ベクター"と
いう語句も機能的に定義されるものであり、それは、そ
のものの配列中に含まれている特定のＤＮＡコード(暗
号)を、それに関して用いられた場合に、有効に発現さ
せ得る様なＤＮＡ配列のすべてを指す。一般に、組換え
ＤＮＡ技術においては、しばしば、環状二重鎖ＤＮＡル
ープである、“プラスミド"の形の発現ベクターが利用
される。しかしながら、本発明においては、上記の如く
同等の機能を果す他の形の発現ベクターをも包含するも
のとする。
【００４７】“ＤＮＡ単離体"とは、ヒト第ＶＩＩＩ因
子の暗号配列を含有するＤＮＡ配列を意味し、それ自身
またはクローニングベクター中に取り込まれたものを含
む。
【００４８】“組換え宿主細胞"とは、組換えＤＮＡ技
術で組立てられたベクターによって形質転換された細胞
中の１つの細胞(cell／cells)を指す。ここに示した如
く、この形質転換によって、形質転換されていない天然
の宿主源で生産される様な少量で低純度のものと異り、
大量に第ＶＩＩＩ因子またはその機能的セグメントを生
産することができる。その様な“組換え宿主細胞"によ
って生産される第ＶＩＩＩ因子を“組換えヒト第ＶＩＩ
Ｉ因子"と称することができる。
【００４９】ＤＮＡおよびＲＮＡの大きさを示す単位
は、本明細書中、しばしば以下の略号で表示される:b＝
塩基または塩基対;kb＝キロ(１０００)塩基またはキロ
塩基対。タンパク質に関する略号は以下の通りである:
Ｄ＝ダルトン;kＤ＝キロダルトン。温度は全て摂氏であ
る。 Ｂ．宿主細胞培養およびベクター 本発明方法によれば、種々の組換え宿主細胞内で、有用
な組換えヒト第ＶＩＩＩ因子を生産することができる。
以下に、特に好ましい系を示す。一般に、本発明にとっ
て有用なベクターを組立てるためのＤＮＡ配列のクロー
ニングには原核生物が好ましい。例えば、Ｅ．coli Ｋ
１２株２９４(ＡＴＣＣＮo．３１４４６)が特に好まし
い。その他の使用し得る微生物の菌株には、Ｅ．coli
Ｂ、Ｅ．coliＸ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎo．３１５３
７)、Ｅ．coli c６００およびc６００hf１並びにＥ．c
oliＷ３１１０(Ｆ-,λ-,プロトトロフイック,ＡＴＣＣ
Ｎo．２７３２５)等のＥ．coli菌株;バチラス・サブチ
ラス(Ｂacillus subtilus)の如きバチラス属の菌株;そ
の他、サルモネラ・チフイムリウム(Ｓalmonella typh
imurium)またはセラチア・マーセサンス(Ｓerratia ma
rcesans)等の腸内菌や様々なシュードモーナス(Ｐseudo
monas)種の菌株が含まれる。これらの例が、制限的なも
のでなく、例示にすぎないことは言うまでもない。
【００５０】一般に、宿主細胞に適合し得る種から誘導
されたレプリコンおよびコントロール配列を含むプラス
ミドベクターを、これらの宿主と一緒に用いる。普通、
ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞内で表現型
に基づく選択性を付与し得る標識配列を有する。例え
ば、Ｅ．coliは一般にＥ．coli種から導かれたプラスミ
ドであるpＢＲ３２２を用いて形質転換される(３２)。p
ＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含有しているので、形質転換細胞を容易に同定
および選択できる手段を提供するものである。このpＢ
Ｒ３２２プラスミド、あるいは他の微生物プラスミドは
また、微生物がそれ自身のタンパク質を発現させるため
に利用し得るプロモーターを含有し、または含有する様
に修飾されていなければならない。組換えＤＮＡの組立
てに最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラク
タマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモータ
ー系(３３−３５)並びにトリプトフアン(trp)プロモー
ター系(３６、３７)が含まれる。これらが最も普通に用
いられるものであるが、その他の微生物プロモーターも
発見されて使用されており、それらの詳細なヌクレオチ
ド配列も公開され、当業者はそれらをプラスミドベクタ
ーと機能的にライゲートすることができる(３８)。
【００５１】原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性
微生物も用いられる。真核性微生物の内、サッカロミケ
ス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cereviciae)または通
常のパン酵母が最も一般的に用いられるが、その他多数
の菌株も普通に用い得る。サッカロミケス内で発現させ
るためには、例えばプラスミドＹＲp７(３９−４１)が
通常用いられる。このプラスミドは既にtrp１遺伝子を
含有しているので、トリプトフアン中で増殖する能力を
持たない、酵母の突然変異株(例えばＡＴＣＣＮo．４４
０７６またはＰＥＰ４−１(４２))に選択マーカーを与
える。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp１障害があ
るということは、形質転換体をトリプトフアン不在で増
殖させることによって形質転換体を検出する際に有効な
状況が与えられることになる。
【００５２】酵母用ベクターの好適なプロモーテイング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:３−ホスホグリセレート・キナーゼ(４３)、または
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフエート・
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース
−６−ホスフエート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセ
レート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホ
スフエート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメ
ラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類(４４、４
５)。適当な発現プラスミドを組立てるためには、これ
らの遺伝子を伴なった終止配列を、発現ベクター中に、
発現させるべき所望の配列の３'とライゲートさせて入
れ、mＲＮＡのポリアデニル化部位および末端配列を提
供する。その他、増殖条件によって転写がコントロール
されるという利点をさらに有するプロモーターとして、
アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、
前記グリセルアルデヒド−３−ホスフエート・デヒドロ
ゲナーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利用に
与える酵素類等に関するプロモーター領域が含まれる。
酵母と適合し得るプロモーター、複製起源および終止配
列を含有するプラスミドベクターの全てが適する。
【００５３】多核微生物からの細胞培養を宿主細胞とし
て用いることも好ましく、殊に、本発明並びに参考文献
にみられる機能的なヒト第ＶＩＩＩ因子を生産するため
に、不明瞭なＤＮＡを発現させるには好ましい態様であ
るに相違ない。原則として、脊椎動物の細胞により大き
い関心が寄せられており、例えば、ＶＥＲＯおよびＨe
Ｌa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞
系、並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣ
Ｋ細胞系等が含まれる。その様な細胞のための発現ベク
ターには、通常(必要ならば)複製起源(類)および発現さ
れるべき遺伝子の前方に位置しているプロモーターが、
所望のリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアデニル化部位および転写終止配列と共に含有されて
いる。
【００５４】哺乳類細胞内で使用するための発現ベクタ
ー用のコントロール機能は、しばしばウイルス性物質に
よって供給される。例えば、普通用いられているプロモ
ーターはポリオーマ、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)
および最も頻繁にはアデノウイルス２から導かれる。前
記アデノウイルス２のメジヤー・レート(主後期)プロモ
ーターと同様に、ＳＶ４０ウイルスの初期および後期の
プロモーターは、いずれも有用である。さらに、正常な
状態で所望の遺伝子配列を伴っているプロモーターまた
はコントロール配列を用いることもでき、またしばしば
好ましいといえる。ただし、その様なコントロール配列
が宿主細胞系に適合性を有することを条件とする。
【００５５】複製起源は、外来性の起源、アデノウイル
スその他のウイルス性起源(例えばポリオーマ、ＳＶ４
０、ＶＳＶ、ＢＰＶ等)を含む様にベクターを組立てる
か、あるいはベクターが宿主細胞染色体に組込まれるな
らば、宿主細胞の染色体性複製機構によって与える。
【００５６】第ＶＩＩＩ因子とＤＨＦＲの両者をそれぞ
れ暗号化しているＤＮＡ配列を含む本発明のベクターで
トランスフエクトするのに好適な哺乳類宿主細胞を選択
するに際しては、用いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに
従って宿主を選択するのが適当である。野性型ＤＨＦＲ
タンパク質を用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を
選択するのが好ましく、そうすることにより、ヒポキサ
ンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択用培地内
で、満足のいくトランスフエクションを選択するための
マーカーとしてＤＨＦＲ暗号配列を用いることができ
る。
【００５７】他方、ＭＴＸに対する結合の親和性の低
い、ＤＨＦＲタンパク質をコントロール配列に用いる場
合には、ＤＨＦＲ耐性細胞を用いる必要はない。何故な
らば突然変異ＤＨＦＲはメトトレキセート耐性であるの
で、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であることを条件とし
て、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることがで
きるからである。ＭＴＸを吸着することのできる真核細
胞の大多数は、メトトレキセート感受性であると思われ
る。
【００５８】別法として、第２の選択マーカー(例えば
ネオマイシン耐性)を使用する場合には、ＤＨＦＲ−非
欠損型の細胞内での増幅用マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝
子を用いることもできる。以下に実施例を挙げ、宿主細
胞としてのＢＨＫ細胞の使用例、およびアデノウイルス
のメジャー・レート・プロモーターを含有する発現ベク
ターについて詳しく説明する。
【００５９】Ｃ．一般的手法 強固な細胞壁障害を有していない細胞を宿主細胞として
用いる時には、りん酸カルシウム沈降法によってトラン
スフエクションを行う(４６)。しかしながら、ＤＮＡを
細胞内に導入するための他の方法、例えば核内注入また
はプロトプラスト融合等、も用いることができる。
【００６０】原核細胞または実質的な細胞壁構造を有す
る細胞を用いる場合の好ましいトランスフエクション法
は塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である(４
７)。
【００６１】所望な暗号配列およびコントロール配列を
含有する適当なベクターの組立てには、標準的なライゲ
ーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮ
Ａフラグメントを開裂、修復し、所望のプラスミドにと
って望ましい形に再ライゲートする。
【００６２】開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素(類)を
用いて行う。一般に、約１μgのプラスミドまたはＤＮ
Ａフラグメントを、約２０μlの緩衝液中で約１単位の
酵素により、１時間処理する(特定の制限酵素にとって
適当な緩衝液および基質の量は製造業者によって明らか
にされている。即ち、Ｔ４リガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼおよび細菌性アルカリ性ホスフアターゼに
関する使用上の標準的な条件、の如くである)。インキ
ュベーションの後、フエノールおよびクロロホルムによ
る抽出でタンパク質を除き、水性画分をエタノール沈澱
に付し、核酸を回収する。標準的な実験手法を用いるこ
とができる(４８)。
【００６３】粘着末端(突出部、オーバーハンギング)を
有する制限酵素切断フラグメントを平滑末端化するに
は、以下の方法の内、いずれかを採用する:
【００６４】うめ込み修復法(フイル・イン・リペア
ー):２−１５μgのＤＮＡを、５０mＭＮaＣl、１０mＭ
トリス(pＨ７．５)、１０mＭ ＭgＣl2および１mＭジチ
オトレイトール中で、各２５０μＭの４種類のデオキシ
ヌクレオシツド・トリホスフエート並びにＤＮＡポリメ
ラーゼ・クレノー(klenow)フラグメント８単位と共に２
４℃で３０分間インキュベートする。フエノールおよび
クロロホルム抽出、並びにエタノール沈澱に付して反応
を終了させる;あるいは
【００６５】Ｓ１消化法:２−１５μgのＤＮＡを、２５
mＭ ＮaＯＡc(pＨ４．５)、１mＭＺnＣl2、３００mＭ
ＮaＣl中でＳ１ヌクレアーゼ６００単位と共に３７℃
で３０分間インキュベートし、フエノール、クロロホル
ム処理、およびエタノール沈澱によって反応を終了させ
る。
【００６６】合成ＤＮＡフラグメントは、周知のホスホ
トリエステル法(４７a)またはホスホアミダイト法(りん
酸アミド化法)(４７b)によって調製することができる。
ＤＮＡを、常法通り、アガロースゲル、またはポリアク
リルアミドスラブゲルにかけ、電気溶離法(４８a)によ
ってこのゲルからフラグメントを精製する。ＤＮＡの
“サザーン"ブロット・ハイブリダイゼーションは、(４
９a)の方法に従って行った。
【００６７】ＲＮＡの“ノーザン"ブロット・ハイブリ
ダイゼーションは、６％ホルムアルデヒド含有アガロー
ス・スラブ・ゲル電気泳動に続いて行った(４８、４９
b)。放射性標識−ハイブリダイゼーションプローブは、
高度の特異活性を有する32Ｐ−標識ヌクレオチド・トリ
ホスフエートを使用し、ウシ胸腺ＤＮＡのランダム(無
作為)なプライム合成(primed synthesis)法(４９)によ
って調製した(32Ｐ:アマーシャム(Ａmersham);クレノー
ＤＮＡポリメラーゼ:ＢＲＬ、ＮＥＢまたはベーリンガ
ー−マンハイム(Ｂoehringer−Ｍannheim))。短いオリ
ゴヌクレオチド・プローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによって末端−標識化することができる。“スタ
ンダード・ソルト(Ｓtandard salt)"サザーン・ハイブ
リダイゼーションの条件は以下の範囲内に含まれる:５
×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮaＣl ０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム)、５０mＭりん酸ナトリウム(pＨ
７)、１０％硫酸デキストラン、５×デンハート溶液(１
×デンハート＝０．０２％フイコル、０．０２％ポリビ
ニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン)、２
０−１００μg／mlの変性鮭精子ＤＮＡおよび０−５０
％のホルムアミドからなる混合物中で２４℃〜４２℃に
おいてハイブリダイゼーションし、次いで０．２〜１×
ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとの混合物により、２４℃−６
５℃において洗浄する。フィルターを乾燥し、デュポ
ン、ライテイング−プラス(Ｄupont Ｌighting−plus)
強化スクリーンを使用し、−８０℃においてコダック(k
odak)ＸＡＲフイルムに感光させた。総説(４８)参照。
【００６８】細胞及び組織ＲＮＡ類のノーザン・ブロッ
ト・スクリーニングにおいては、５×ＳＳＣ、５×デン
ハート溶液、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムア
ミド、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム
および０．１mg／ml Ｅ．coli tＲＮＡを、λ１２０
エクソンＡ含有配列の１８９bp Ｓtu Ｉ／Ｈinc Ｉ
フラグメントから調製した32Ｐ−標識プローブと共に４
２℃で一夜ハイブリダイゼーションした。洗浄条件は
０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ(４２℃)であった。
【００６９】ヒトＤＮＡは末梢血中リンパ球(４６,Ｘ
Ｙ)またはリンパ芽球細胞(４９,ＸＸＸＸＹ,Ｎ.Ｉ．
Ｇ．Ｍ．Ｓ．ヒューマン・ジエネテク・ミュータント・
セル・レポジットリー(Ｈuman Ｇenetic Ｍutant Ｃ
ell Ｒepository),カムデン,Ｎ.Ｊ．(Ｃamden,Ｎ.
Ｊ．),Ｎo．ＧＭ１２０２Ａ)(４８)から調製した。大腸
菌(Ｅ．coli)プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファー
ジλＤＮＡは文献(４８)記載の如くにして調製した。組
織ＲＮＡはグアニジニウム・チオシアネート法(４８、
４９f)または(４９b)記載の方法で調製した。ポリアデ
ニル化ＲＮＡはオリゴ(dＴ)セルロース上(４９h)で調製
した。
【００７０】ＤＮＡ配列決定は(４９i)の方法で行っ
た。λ／４×ライブラリーを得るために、各５０μgの
５部の４９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡを濃度３．１２、１．
５６、０．７８２、０．３９および０．１９５u／mlの
Ｓau３ＡＩ１ml中で、３７℃において１時間消化した。
試験的な消化およびゲル分析の結果、Ｓau３ＡＩ濃度
０．７８２u／mlのこれら条件下におけるＤＮＡの平均
的な大きさ(重量)は約３０kbであった。このことは、こ
れらの消化法によって、平均値が１５kbを中心に分布し
ている物が生成することを示している。これら５組の消
化物から得たＤＮＡをプールし、フエノールおよびクロ
ロホルム抽出した後、エタノール沈澱に付し、６g／lの
低ゲル化温度の水平アガロースゲル(４８)(シープラー
ク・アガロース(Ｓeaplaque agarose)、ＦＭＣコーポ
レーション(ＦＭＣ corporation))上、２個のスロット
(５．６×０．６×０．１５cm)中に入れて電気泳動にか
けた。このゲルの１２−１８kb領域を切り取り、このゲ
ル切片を融解法に付し、ＤＮＡを精製した(４８)。
【００７１】シャロン３０アーム(arms)は、ベクター５
０μgをＢamＨＩで消化し、上記の如く６g／lの低ゲル
化温度アガロースゲルからアニールした３１．９kbアー
ム・フラグメントを単離することにより、調製した。λ
／４Ｘライブラリーを組立てるために、(４８)に記載の
如く、シャロン３０ＢamＨＩアームおよび１２−１８kb
の部分的Ｓau３Ａ処理４９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡの至適
濃度を決定した。ライゲートしたＤＮＡをインビトロの
抽出物“パッカゲン(packagene)"(プロメガ・バイオテ
ク,インコーポレーテッド(Ｐromega Ｂiotec,Ｉnc．),
マジソン(Ｍadison),Ｗ１)に包み込んだ。代表的な反応
においては、シャロン３０ＢamＨＩアーム約１．３μg
を容量１０μlで１２−１８kb Ｓau３Ａ ＤＮＡ挿入
物０．１８７μgにライゲートした。このＤＮＡの平板
培養物(plating)を包み込み、約１．３×１０6のファー
ジ・プラークを得た。λ４Ｘライブラリーを得るため
に、１．７×１０6のファージを、平板１５０cm当りに
１７,０００の割合でファージをおき、平板培養した。
このファージを増幅させるために、これらの平板で１夜
増殖させ、１０mＭトリスＨＣl(pＨ７．５)、０．１Ｍ
ＮaＣl、１０mＭＭgＣl2および０．５g／lゼラチン中に
かき落し、短時間遠心した。通常、適当数(０．５−２
×１０6)のこれらファージを平板から取り、スクリーン
した(４８)。数例では、ライゲートし、インビトロで包
み込んだファージを、増幅させずに直接スクリーンし
た。
【００７２】λ４８２を単離するために、第ＶＩＩＩ因
子ゲノムの２２kb ＢclＩフラグメント含有クローン
と、ベクターλ１０５９(４９)のＢamＨＩアーム・フラ
グメントをゲル電気泳動法で単離した。他方、４９,Ｘ
ＸＸＸＹ細胞系列のＤＮＡ１００μgをＢclＩ消化し、
電気泳動にかけて２０−２４kb画分を単離した。λ１０
５９アーム・フラグメント約０．８μgと５％の単離Ｂc
lＩＤＮＡを容量１０μlでライゲートし(４８)、７１
２,０００個のプラークを得た。その４００,０００個
を、λ１１４の２．２kb ＳtuＩ／ＥcoＲＩプローブで
２回、スクリーンした。
【００７３】コスミッド／４Ｘライブラリーは、シエア
リング(剪断)その他の切断が生じない様、大きな注意を
払ってＤＮＡを単離する外は、λ／４Ｘライブラリーの
生成に用いた４９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡから得ることが
できる。このＤＮＡを５種類の濃度のＳau３ＡＩによっ
て部分消化し、プールされたＤＮＡを１００−４００g
／lのシュクロース・グラデイエント(４９)上でサイズ
分けした。３５−４５kbのＤＮＡを含有する分画をプー
ルし、透析した後、エタノール沈澱に付した。コスミッ
ド・ベクターpＧcos４のアーム・フラグメントを文献
(５０)記載の原則に従って調製した。簡単に述べると、
等量のpＧcos４を夫々別個に、ＳstＩ(ＳacＩのイソス
キゾマー(isoschizomer))またはＳalＩで切断した後、
細菌性アルカリ性ホスフアターゼで処理する方法であ
る。次いで各混合物をフエノールおよびクロロホルムで
抽出し、プールしてエタノール沈澱に付し、ＢamＨＩで
切断した。この消化物から、低ゲル化温度−アガロース
ゲルにより２つのアーム・フラグメント、４３９４bお
よび４００２bが得られた。次いで、これらのアーム・
フラグメントを、単離した４０kbのＳau３ＡＩ部分消化
ＤＮＡにライゲートした。一般的な反応では、０．７μ
gのpＧcos４アーム・フラグメントを容量１０μlで、１
μgの４０kbヒト４Ｘ ＤＮＡにライゲートした(４
８)。次いで、この反応物をインビトロで包み込んで
Ｅ．coliＨＢ１０１のrecＡ-菌株を感染させるのに用い
た(４８)。この反応物をテトラサイクリン含有平板上で
平板培養すると、約１２０,０００のコロニーが生成し
た。約１５０,０００のコスミッドをクロラムフエニコ
ール含有平板上で一夜増幅させ、既述の如く、２０個の
１５０mm平板によって２回、スクリーンした(４８)。
【００７４】二重鎖cＤＮＡは、逆転写による一次鎖(fi
rststrand)合成におけるプライマーとしてオリゴ(dＴ)
１２−１８または、合成デオキシオリゴヌクレオチド１
６マーを使用し、既知(３６,６７)の方法で調製した。
ポリアクリルアミドゲルで単離した後、適当なサイズ
(通常、６００μp以上)のcＤＮＡを次のいずれかの方法
で処理した。ターミナル・トランスフエラーゼによって
Ｃ末端化し、これをＧ末端化したＰstＩ消化pＢＲ３２
２とアニールしてＥ．coli菌株ＤＨ１(７６)に導入(ト
ランスフオーム)するか、あるいは１００倍モル過剰量
の合成ＤＮＡＥcoＲＩアダプターとライゲートさせ、ポ
リアクリルアミドゲル上で再度単離した後、ＥcoＲＩ消
化λＧＴ１０にライゲーションを介して挿入し、ファー
ジ粒子に包み込み、Ｅ．coli菌株Ｃ６００hf１(６８)を
感染させる。既存の方法の改良法として、相補的な合成
１８マーまたは２２マー(５'−ＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴＡ
ＡＧＡＣＡＴＧおよび５'ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＧＧＴＣＡＡＧＧ)からなるアダプターを、ＥcoＲＩ
粘着末端でなく平滑末端でりん酸化することにより、該
アダプターがそのＥcoＲＩ部位で過剰な自己ライゲーシ
ョンを起こすことなく二重鎖cＤＮＡと効果的にライゲ
ーションし得るようにした。この方法は、自己相補的な
ＥcoＲＩリンカーをＥcoＲＩメチラーゼ処理した二重鎖
cＤＮＡにライゲートし、続いてＥcoＲＩ消化を行ってc
ＤＮＡの末端から過剰のリンカー・オリゴマーを除去す
るという、より骨の折れる方法の代替法として有効であ
る。ゲノムクローニングによって入手し得るポリ(Ａ)か
ら最寄りの存在する３'ファクターＶＩＩＩプローブ配
列までの、＞３５００bpのcＤＮＡクローン(即ちエクソ
ンＡ)を効率よく得るために、mＲＮＡのセンス鎖上にあ
るエクソンＢ内の配列に対応する合成ＤＮＡ１６マーを
反応系に含ませることにより２番目の鎖のcＤＮＡ合成
を特異的にプライムした。
【００７５】Ｄ．アデノウイルスのサブクローニング アデノウイルス２ＤＮＡは、ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ(ＢethesdaＲesearch Ｌaboratories(ＢＲ
Ｌ))から購入した。このウイルス性ＤＮＡをＨindＩＩ
Ｉ開裂し、５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
にかけた(ＴＢＥ緩衝液)。ＨindＩＩＩＢフラグメント
(４９j)を含有するゲル領域を切り取り、該ゲルからＤ
ＮＡを電気溶離した。フエノール−クロロホルム抽出の
後、エタノール沈澱によってＤＮＡを濃縮し、これをＨ
indＩＩＩ−開裂pＵＣ１３(４９k)にクローンすること
により、プラスミドpＡdＨindＢを得た。このＨindＩＩ
ＩサブクーロンをＨindＩＩＩおよびＳalＩで消化し、
アデノウイルスの１７．１−２５．９に及ぶ、コ・オー
デイネーツ(配位物)を単離した。このフラグメントをＨ
indＩＩＩ、ＳalＩ開裂pＵＣ１３にクローンし、プラス
ミドpＵＣＨＳを得た。pＡdＨindＢからＳalＩ〜ＸhoＩ
フラグメント、即ち２５．９−２６．５コオーデイネー
ツを単離し、pＵＣＨＳを単一のＳalＩ部位にクローン
し、pＵＣＨＳＸを生成させた。このプラスミドは、ア
デノウイルス配列の、第一番目の後期(late)リーダー介
在配列内の１７．１の位置から、第三番目の後期リーダ
ーエクソン内の２６．５位のＸhoＩ部位に至る範囲を回
復している。
【００７６】アデノウイルスのメジャー・レート・プロ
モーターは、アクリルアミドゲルからＨindＩＩＩＣ、
ＤおよびＥフラグメント(これらは一緒に泳動する)を切
除し、これらをpＵＣ１３のＨindＩＩＩ部位にクローニ
ングし、ＨindＩＩＩＣフラグメントを含有する組換え
体を制限分析法によってスクリーニングすることによ
り、クローンした。このサブクーロンをＳalＩ消化し、
同じくpＵＣ１３のポリリンカー内にあるメジャー・レ
ート・プロモーター(４９j)の５'側、１５．４位で切断
した。このＤＮＡを再び閉環させてpＭＬＰ２を得た。
これは、pＵＣ１３のＳaｃＩおよびＨindＩＩＩ部位に
クローンされているＳaｃＩ〜ＨindＩＩＩフラグメント
(位置、１５．４−１７．１)を含有している。
【００７７】Ｅ．ネオマイシン耐性ベクターの組立て Ｅ．coliトランスポゾン５内に含まれているネオマイシ
ン耐性マーカーをＴn５含有プラスミドから単離した(４
９l)。ネオマイシン耐性遺伝子の配列は既に公表されて
いる(４９m)。このネオフラグメントをＢglＩＩ消化に
付し、ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子の
翻訳開始コドンの５'側３６bp位で開裂させ、これをエ
キソヌクレアーゼＢal３１で処理した。このホスホトラ
ンスフエラーゼ遺伝子をＢamＨＩで切断し、翻訳終止コ
ドンに続く３４２bpでＤＮＡを開裂し、pＢＲ３２２の
うめ込み処理したＨindＩＩＩ部位とＢamＨＩ部位との
間に挿入した。その１つのクローンであるpＮeoＢal６
は、うめ込み処理されたＨindＩＩＩ部位の３'側、３bp
の位置に翻訳開始コドンを有していた(ＴＣＡＴＣＧＡ
ＴＡＡＧＣＴＣＧＣＡＴＧ…)。このプラスミドをＣla
ＩとＢamＨＩで消化し、ホスホトランスフエラーゼ遺伝
子を含む１１４５bpフラグメントを単離し、これを哺乳
類発現ベクター、pＣＶＳＶＥＨＢＳ(下記参照)に挿入
した。得られたプラスミドpＳＶＥＮeoＢal６は、ネオ
マイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子をＳＶ４０初
期プロモーターの３'側で、ＨＢＶ表面抗原遺伝子(４９
n)の５'側に位置して含有している。このプラスミド
は、哺乳類の組織培養細胞に導入した時、ホスホトラン
スフエラーゼ遺伝子を発現させると共に、アミノグルコ
シツドＧ４１８(４９o)に対する耐性を付与することが
できる。
【００７８】Ｆ．組織培養細胞のトランスフエクション ＢＨＫ２１細胞(ＡＴＣＣ)は組織培養で増殖させた脊椎
動物の細胞である。これらの細胞は、当業者周知の如
く、正常細胞から単離され、継次連続転移(successive
serial transfer)によって調製された永久細胞系列
(統)として保持することができる。この細胞系列は、液
体媒質中の固体支持体上に保持されているか、または支
持栄養素を含有する懸濁液中で増殖させることにより、
保持されている。
【００７９】この細胞を(４９p)の方法を用いて上記の
如く調製した所望のベクター５μg(４μg pＡＭＬ３
Ｐ．８c１および１μgのpＳＶＥneoＢal６)でトランス
フエクトした。この操作においては、特定の宿主細胞に
対して、集団のプラスミドが相互に作用する、というこ
とが保証されているので、あるプラスミドが細胞内に吸
収されたならば、他のプラスミドも同様に吸収されたと
みなし得る(４９q)。従って、第一の暗号配列と第二の
暗号配列とを別々のベクターを用いて導くこと、および
これらの両配列を含有する単一のベクターを用いて導く
ことができる。
【００８０】Ｇ．トランスフエクトされた細胞の増殖、
およびペプチドの発現 上記の如くトランフエクションに供した細胞を、まず、
非選択培地で２日間増殖させ、次いで該細胞をＧ４１８
(４００μg／ml)含有培地に導き、プラスミド・ホスホ
トランスフエラーゼを発現し得る細胞を選択した。Ｇ４
１８の存在下で７〜１０日後には、コロニーが肉眼で観
察できる様になった。数百のコロニーをトリプシ処理
し、再度平板培養してＧ４１８耐性細胞を径１０cmの皿
状に、急速に全面増殖させた。
【００８１】この細胞集団は、種々の初期成分を表す細
胞で構成されていた。次に、ＦＶＩＩＩ発現プラスミド
のコピーを最も数多く有する細胞を得るために、これら
の細胞をＤＨＦＲタンパク質阻害物質と一緒にインキュ
ベートした。
【００８２】Ｈ．メトトレキセート処理 Ｇ４１８耐性細胞は、５０nＭ以上の濃度において特異
的なＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキセート(ＭＴＸ)に
よって阻害される。組織培養細胞に対するＭＴＸの作用
に関する従来の研究と同様に、ＦＶＩＩＩ発現ベクター
内に含有されているＤＨＦＲ遺伝子のコピーを多数発現
することによってＭＴＸに抵抗し得る細胞を選択し、そ
れに付随してＦＶＩＩＩ暗号配列の発現の増加を観察し
た。ＭＴＸの量を段階的に増加することによりプラスミ
ドpＡＭＬ３Ｐ．８c１の増幅に影響を及ぼし、コピー数
を増加させた。増幅程度の上限は多くの因子によって左
右されるが、この方法により、ミリモル単位の濃度のＭ
ＴＸに耐性である、数百または数千のＤＨＦＲ発現(即
ち、ＦＶＩＩＩ発現)プラスミドを有する細胞を選択す
ることができる。
【００８３】第ＶＩＩＩ因子を発現させるために、pＡ
ＭＬ３Ｐ．８c１およびpＳＶＥ ＮeoＢal６でトランス
フエクトして得たＧ４１８−耐性ＢＨＫ細胞を既述の如
く１００nＭおよび２５０nＭのＭＴＸを含有する培地内
でインキュベートした(４９r)。７−１０日後、２５０n
ＭのＭＴＸに耐性を有する細胞の第ＶＩＩＩ因子発現
を、活性、ラジオイムノアッセイおよびmＲＮＡのノー
ザン分析法によって調べた。
【００８４】Ｉ．第ＶＩＩＩ因子抗体 この研究においては、第ＶＩＩＩ因子に対する様々なポ
リクローナル抗体および単クローナル抗体を用いた。Ｃ
Ｃは重篤な血友病患者の血漿から導かれた抗体である
(４９s)。Ｃ８は第ＶＩＩＩ因子の２１０kＤタンパク質
部分と結合する中和モノクローナル抗体である(４９
t)。Ｃ１０はＣ８と同じ特性を有するモノクローナル抗
体であって、(４９t)記載の方法と実質上同様にして単
離された。第ＶＩＩＩ因子の８０kＤ部分と結合する市
販の中和モノクローナル抗体は、シンバイオテイック・
コーポレーテッド、サン・ディエゴ、ＣＡ．(Ｓynbioti
c Ｃorp．,Ｓan Ｄiego,ＣＡ．)から、Ｐroduct Ｎ
o．１０００４の下、入手した。Ｃ７Ｆ７は第ＶＩＩＩ
因子の８０kＤ部分と結合する中和モノクローナル抗体
である。Ｃ７Ｆ７の誘導および精製法は次の通りであ
る:６週令の雌ＢＡＬＢ／cマウスに約１０μgの精製第
ＶＩＩＩ因子を反復接種し、最後の接種から３日後に、
脾細胞とＸ６３−Ａg８．６５３マウス骨髄腫細胞(４９
u)と融合させた。先に述べたプロトコールに従ってハイ
ブリダイゼーション、並びにクローニング法による雑種
細胞の単離を行った(４９r)。クローンを生成している
特異抗体を固相ＲＩＡ法で検出した(４９w)。次に、陽
性クローンの凝固遅延効果を、上の文献に記載されてい
るＡＰＴＴ分析法で調べた。モノクローナルＣ７Ｆ７を
シンジエネイックな動物内で増殖させることにより増加
させた;抗体を、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４
Ｂクロマトグラフィーにより、腹水症患者の腹水から精
製した(４９x)。
【００８５】Ｊ．第ＶＩＩＩ因子に関するラジオイムノ
アッセイ ＢＨＫその他の細胞系列から生産された第ＶＩＩＩ因子
を分析するために、２種類のラジオイムノアッセイ(Ｒ
ＩＡ)を開発した。２方法はいずれも固体支持体に結合
したＣＣ抗体に第ＶＩＩＩ因子を結合させることを含
む、２段階分析法である(４９t)。この免疫複合体を、
次いでＩ125標識Ｃ１０抗体(２１０kＤ特異抗体)または
Ｉ125標識Ｃ７Ｆ７(８０kＤ特異抗体)で検出した。２段
階ＲＩＡを以下に簡単に説明する:微量力価検定皿(マイ
クロタイター・デイッシュ)の１６個のくぼみを、予め
プロテインＡ−セファロース・クロマトグラフィー(４
９x)で精製したＣＣ抗体２．５mg／lを含有する５０mＭ
ＮaＨＣＯ3緩衝液(pＨ９．６)１００μlで一夜覆って
おく。くぼみをトウイーン２０(Ｔween２０)０．０５％
を含有するＰＢＳ２００μlで３回洗浄し、ゼラチン
０．１％とマーチオレート(merthiolate)０．０１％と
を含有するＰＢＳ２００μlにより、１〜２時間、ブロ
ック(遮断)処理した。これらのくぼみを前回と同様に洗
浄し、試料１００μlを加えて一夜インキュベートし
た。くぼみを洗浄し、Ｉ125で標識した(８２)Ｃ１０ま
たはＣ７Ｆ７抗体を加え(１０００cpm／μl)、６〜８時
間インキュベートした。再度くぼみを洗浄し、計数し
た。１:１０〜１:３０の割合で希釈した正常血漿試料に
より、標準曲線を作成した。
【００８６】Ｋ．第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体カ
ラム ヒト第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体カラムを、１．
０mgのＣ８抗体(０．１ＭＮaＨＣＯ3(pＨ８．５)中)
と、１．０mlのＡffi−Ｇel１０(バイオーラッド・ラボ
ラトリーズ、リッチモンド、カルフォルニア(Ｂio−Ｒa
d Ｌaboratories,Ｒichmond,ＣＡ))とを４℃で４時間
インキュベーションすることにより、調製した。バイオ
ーラッド・プロテイン・アッセイ(Ｂio−Ｒad Ｐrotei
n Ａssay)(バイオーラッド・ラボラトリーズ)により、
９５％以上の抗体がゲルと結合していることが確認され
た。このゲルを、５０倍容量の水と１０倍容の０．１５
ＭＮaＣlを含有する０．０５Ｍイミダゾール(pＨ６．
９)で洗浄した。
【００８７】Ｌ．培地のモノクローナルカラムによるク
ロマトグラフィー 培地をモノクローナル抗体カラム(樹脂１ml)に適用し、
０．１５ＭＮaＣlを含有する０．０５Ｍイミダゾール緩
衝液(pＨ６．４)で、２８０nmにおける吸収を示す物質
が洗い流されてしまうまで洗浄した。このカラムを１．
０ＭＫＩおよび２０％エチレングリコールを含有する
０．０５Ｍイミダゾール(pＨ６．４)で溶離した。試料
を測定のために希釈し、以後の分析に備えて透析した。
【００８８】Ｍ．第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質および
融合タンパク質抗血清の調製 融合タンパク質を発現させるために組立てたプラスミド
を含有するＥ．coliを３７℃においてＭ−９培地内で増
殖させた。２．５時間から４時間の間にインドール酢酸
を最終濃度が５０μg／mlとなる様に加えて融合タンパ
ク質の発現を誘導した。細胞を遠心して集め、使用する
まで凍結しておいた。
【００８９】融合物３用の細胞ペレットを、リゾチーム
１０μg／ml並びに、ＲＮaseおよびＤＮase各１μg／ml
を含有する２０mＭりん酸ナトリウム(pＨ７．２)１００
ml中に懸濁した。この懸濁液を、細胞ペレットが完全に
分散されるまで、室温で３０分間撹拌した。次いで、こ
の懸濁液を４分間超音波処理した(出力６０％のパル
ス)。この溶液をＳorvall ＲＣ−２Ｂ遠心機により、
ＧＳＡローター内で、８０００rpmにおいて遠心した。
得られたペレットを０．０２Ｍりん酸ナトリウム(pＨ
７．２)１００mlに再懸濁した。この懸濁液に６０％グ
リセリン３００mlを積層した。この試料をＲＣ−３Ｂ遠
心機により、４０００rpmで２０分間遠心した。グリセ
リン層が２層に分離した。ＳＤＳアクリルアミドゲル上
で分析したところ、ペレットと底部のグリセリン層はい
ずれも予測された分子量２５．０００ダルトンのタンパ
ク質のシングルバンドを示した。このペレットを０．１
％ＳＤＳを含有する０．０２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
に溶かした。再懸濁したペレットと下方のグリセリン層
とを０．０２Ｍ重炭酸アンモニウム(pＨ８．０)に対し
て透析し、グリセリンを除去した。この溶液を凍結乾燥
し、０．１％ＳＤＳ含有０．０１Ｍりん酸ナトリウム緩
衝液に再び溶かした後、使用するまで凍結しておいた。
【００９０】融合タンパク質１および４を得るために、
この細胞ペレットを０．３Ｍ塩化ナトリウムと５mＭＥ
ＤＴＡを含有する０．０５Ｍトリス(pＨ７．２)に懸濁
した。リゾチームを濃度１０μg／mlになる様に加え
た。試料を室温で５分間インキュベートした。ＮＰ−４
０を濃度０．２％になる様に加え、この懸濁液を氷浴中
で３０分間インキュベートした。塩化ナトリウムを、最
終濃度が３Ｍになる様に加え、ＤＮaseを加えた(１μg
／ml)。この懸濁液を室温で５分間インキュベートし
た。試料を遠心し、上澄液を捨てた。ペレットを少量の
水に再懸濁し、再び遠心した。得られた細胞ペレットを
０．１％〜１％のＳＤＳを含有する溶液に溶かし、これ
を、プレパラティブＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、次いで融合タンパク質のバンドを電気溶離
するか、あるいは、０．１％ＳＤＳ含有０．１Ｍりん酸
ナトリウムで平衡させたＴＳＫ３０００カラムを用いて
ＨＰＬＣにかけ、精製した。
【００９１】ウサギ抗血清は、ニュージーランド白ウサ
ギに、フロインド完全アジュバントに懸濁した融合タン
パク質試料を注射し(一次接種)、２週間の間隔をあけて
フロインド不完全アジュバントに懸濁した試料を接種
し、促進した。６週間後、血清をとり、ウエスタン・ブ
ロット法によりヒト血漿由来の第ＶＩＩＩ因子タンパク
質との反応性を調べた。
【００９２】Ｎ．第ＶＩＩＩ因子活性の発現を検出する
ための分析法 Ａ型血友病血漿の修正−理論 :第ＶＩＩＩ因子の活性
を、第ＶＩＩＩ因子を欠く血漿における凝固欠損を修正
することの活性として定義する。第ＶＩＩＩ因子活性の
単位は、正常なヒト血漿１ml中に存在する活性を１単位
して定めた。測定方法は、Ａ型血友病(古典的血友病)の
診断が下された患者から得た血漿中にフイブリン・クロ
ット(繊維素の凝塊)が形成されるまでに要する時間の測
定に基く。この測定においては、凝塊の形成に要する時
間が短い程、被検試料中の第ＶＩＩＩ因子の活性が大き
いといえる。この形式の測定により得た値を、賦活化−
部分的トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)と表す。この
様な測定法に用い得る試薬は市販品から入手可能である
(例えば、ジエネラル・ダイアグノステイックス・プラ
テリン・プラス活性化剤、製品番号３５５０３(Ｇenera
l Ｄiagostics Ｐlatelin Ｐlus Ａctivator;produ
ct number３５５０３))。
【００９３】方法:全ての凝固アッセイ(測定)はホウケ
イ酸ガラス製の試験管(１０×７５mm)を用いて行った。
サーファシル(Ｓurfasil、ピアス・ケミカル・カンパニ
ー、ロックフオード、イリノイス(Ｐierce Ｃhemical
Ｃompany,Ｒockford,Ｉ１．)製)を石油エーテルによ
り、１:１０の割合で希釈したものを用いてシリコーン
処理(siliconization)を施した。即ち、試験管にこの溶
液を入れ、１５秒間インキュベートした後、該溶液を除
去した。試験管を水道水で３回、次いで蒸留水で３回洗
浄した。
【００９４】プラテリン・プラス活性化剤(Ｐlatelin
Ｐlus Ａctivator)(ジェネラル・ダイアグノステイッ
クス,モーリスプレーンス,ニュージャージー(Ｇeneral
Ｄiagnostics,Ｍorris Ｐlains,ＮＪ))を、包装紙に
記載されている指示通り、蒸留水２．５mlに溶かした。
凝固アッセイ用の試料を調製するために、プラテリン・
プラス・アクティベーター溶液を３７℃で１０分間イン
キュベートし、使用するまで氷浴上で保存した。シリコ
ーン処理した試験管にプラテリン・プラス活性化剤５０
μlと第ＶＩＩＩ因子欠損血漿(ジョージ・キング・バイ
オメディカル・インコーポレーテッド、オーバーランド
パーク・カンサス(Ｇeorge Ｋing Ｂiomedical Ｉn
c．,Ｏverland Ｐark,ＫＡ))５０μlとを加えた。この
溶液を３７℃で合計９分間インキュベートした。上記溶
液に対する９分間のインキュベーション処理が終了する
直前に被検試料を０．０２％のウシ血清アルブミンを含
有する０．０５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ７．３)で希釈し
た。血漿／活性化剤懸濁液に希釈した試料５０μlを加
え、正確に９分経過した時点でこの懸濁液のインキュベ
ーション物内に５０μlの塩化カルシウム(０．０３３
Ｍ)を加えて凝固カスケードを開始させた。この反応混
合物を素早く混合し、フイブリン・クロットの形成が認
められるまでの間、この試験管を監視下、静かに撹拌し
た。第ＶＩＩＩ因子活性の標準曲線は、正常血漿(ジョ
ージ・キング・バイオメディカル・インコーポレーテッ
ド、オーバーランドパーク・カンサス)を１:１０、１:
２０、１:５０、１:１００および１:２００の割合で希
釈することにより、得られる。片対数グラフ用紙を使用
し、このクロッティング時間を血漿の希釈率に対してプ
ロットする。次いで、この図を用いてクロッティング時
間を、第ＶＩＩＩ因子活性(単位)に変換することができ
る。
【００９５】Ｏ．色素原ペプチドの測定 理論 :第ＶＩＩＩ因子は、第ＩＸa因子、りん脂質、およ
びカルシウムイオンの存在下における第Ｘ因子の第Ｘa
の因子への活性化において機能的である。第ＩＸa因
子、第Ｘ因子、りん脂質およびカルシウムイオンが供給
された場合における高度に特異的な測定法を企画した。
即ち、この測定法における第Ｘa因子の形成は、第ＶＩ
ＩＩ因子活性の供給源の添加に依存している。この測定
系に第ＶＩＩＩ因子を多く加えれば、それだけ多くの第
Ｘa活性が生成する。第Ｘa因子を生成させてから、反応
混合物中に色素源ペプチド基質を加える。このペプチド
は第Ｘa因子によって開裂されるが第Ｘ因子によっては
影響されず、また他のプロテアーゼ(タンパク質分解酵
素)によっては徐々にしか開裂されない。この基質は開
裂されて４０５nmに吸収を示すパラ−ニトロ−アニリド
基を放出するが、開裂されていないペプチド基質はこの
波長において殆んど、または全く吸収を示さない。色素
源基質の開裂による吸収の生成は、インキュベーション
時間経過後の被検混合物中の第Ｘa因子の量に依存して
おり、この量はまた反応混合物に加えた被検試料中に含
まれている機能的な第ＶＩＩＩ因子の量に依存してい
る。この測定法は第ＶＩＩＩ因子活性に極めて特異的な
ので、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿分析法の如く、間違って
陽性を示すおそれは殆んどない。
【００９６】方法:第ＶＩＩＩ因子コアテスト(Ｃoatest
factorＶＩＩＩ)を、ヘレナ・ラボラトリーズ、ビュ
ーモント、テキサス(Ｈelena Ｌaboratories,Ｂeaumon
t,ＴＸ)(Ｃat．Ｎo．５２９３)から購入した。使用した
基本的な手法は製造業者が第ＶＩＩＩ因子の含有量が５
％以下である試料に関して指示している“エンド・ポイ
ント法"に実質上従うものである。指示されている様
に、測定の感度をより高くするためにインキュベーショ
ン時間を延長した。また、ある測定に際しては業者指定
の試薬量を変更した。このプロトコールにおける変更は
全体的な測定結果を妨害することはない。
【００９７】第Ｘa因子のために用いる色素原基質(Ｓ−
２２２２＋Ｉ−２５８１)を１０mlの水に溶かし、基質
濃度２．７ミリモル／lの液を得る。この基質溶液を分
け、−２０℃で冷凍保存した。第ＩＸa因子および第Ｘ
因子を含有しているＦＩＸa＋ＦＸ試薬を水１０mlに溶
かした。この溶液を分け、使用するまで−７０℃で冷凍
保存した。更に、次の一連の溶液をも用意した:０．０
２５Ｍ塩化カルシウム;りん脂質(ブタの脳);バッファー
・ストック溶液(Ｂuffer Ｓtock Ｓolution;測定用
に、ストック溶液(１部)を水(９部)で希釈した溶液であ
り、最終濃度は０．０５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ７．３)
(ウシアルブミンを０．０２％含有)である)。これらの
溶液は使用するまで４℃で保存した。りん脂質＋ＦＩＸ
a＋ＦＸ試薬は、りん脂質１容量とＦＩＸa＋ＦＸ試薬５
容量とを混合することにより調製した。方法は以下の通
りである。
【００９８】 空試験 用試薬 試 薬 試験管 (ブランク) りん脂質＋ＦＩＸa＋ＦＸ ２００μl ２００μl 被検試料 １００ … 緩衝作用をする溶液 … １００ 良く混合し、３７℃で４分間インキュベート する 塩化カルシウム １００ １００ 良く混合し、３７℃で正確に１０分間イン キュベートする Ｓ−２２２２＋Ｉ−２５８１ ２００ ２００ 良く混合し、３７℃で正確に１０分間イン キュベートする 酢酸(５０％) １００ １００ 良く混合する
【００９９】ブランク試薬に対する試料の４０５nmにお
ける吸光度を分光光度計により、３０分以内に測定し
た。
【０１００】４０５nmにおける吸光度は、正常人のヒト
血漿標品(ジョージ・キング・バイオメディカル、オー
バーランド・パーク・カンサスシティ)を用いて測定値
から外挿して得た第ＶＩＩＩ因子の単位数と相関関係に
あった。以下に好ましい実施態様を挙げ、本発明を詳し
く説明する。
【０１０１】
【実施例】
１．第ＶＩＩＩ因子遺伝子を得るための一般的な手法 組換えＤＮＡ遺伝子産物を得るための、最も一般的な方
法は、適当な組織または細胞型のmＲＮＡから得たcＤＮ
Ａクローンで構成されるライブラリーをスクリーンする
方法である。第ＶＩＩＩ因子遺伝子のためのゲノムＤＮ
Ａのスクリーニングに通常とは別の方法をも用いる理由
としてはいくつかの因子を挙げることができる。第１
は、第ＶＩＩＩ因子の合成部位が不明である、というこ
とである。しばしば、最も可能性の高い合成部位として
肝臓が考えられていたが、その証拠はあいまいである。
肝臓および多分脾臓で合成されているであろうというこ
とが、器官灌流および器官移植研究において示唆されて
いた(５６)。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子活性は、し
ばしば重篤な肝障害を有する患者で増加している(５６
a)。最近の、モノクローナル抗体と細胞との結合を利用
して行われた相矛盾する研究結果によると、このタンパ
ク質が最も高レベルに検出されたのは、肝ジヌソイド内
皮細胞(５１)、肝細胞またはリンパ節細胞(量は肺、肝
臓および脾臓の順に続く;(５３))のいずれかであった。
それと対照的に、第ＶＩＩＩ因子に関する抗原(フォン
・ウィルブランド・ファクター(von Ｗillebrand Ｆa
ctor))が内皮細胞で作られていることは、ほぼ確実であ
る(５４)。供給源である組織が不確かであるばかりか、
血漿中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は極端に低い。例えば、
その循環濃度約１００−２００ng／ml(５５)という値
は、血清アルブミンのモル濃度の約１／２,０００,００
０に相当する。従って、ある特定の組織のmＲＮＡから
得られたcＤＮＡライブラリーが第ＶＩＩＩ因子のクロ
ーンを与え得るか否かは不明である。
【０１０２】これらの点を考慮し、まず、バクテリオフ
ァージ・ラムダ中のヒトゲノムの組換えライブラリー
(以下、ゲノムライブラリー(genomic libraries)と称
する)をスクリーンすることを決定した。ゲノムライブ
ラリーは第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含有しているはずであ
るが、存在すると思われるイントロンが組換えタンパク
質の完全な発現を妨げるおそれがある。一般的な手順は
次の通りである:
【０１０３】１．ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の配列
が決定された部分に対するゲノム・クローンの同定を行
う。 ２．mＲＮＡの全暗号領域を包含している重なり合った
ゲノムクローンを得るために“ゲノム・ウオーク(genom
ic walk)"を行う。 ３．ゲノムクローンのフラグメントを用いて第ＶＩＩＩ
因子のmＲＮＡの供給源である組織または細胞のＲＮＡ
にブロッテイング法でハイブリダイゼーションさせ、そ
の様なＲＮＡを含む細胞を同定し、これらの細胞からc
ＤＮＡクローンを得る。 ４．Ｎo．３と平行して、ゲノムクローンの一部をＳＶ
４０組換え“エクソン発現"プラスミド内で発現させる
ために使用する。これらのプラスミドを組織培養(cos)
細胞にトランスフエクトして転写されたＲＮＡは、イン
ビボで切断されるはずであり、これもまた組換え第ＶＩ
ＩＩ因子タンパク質の発現に好適なcＤＮＡクローンの
供給源として利用し得る。
【０１０４】これらの試みに関する実際の工程には、c
ＤＮＡクローン、数種のタイプのゲノムクローン、およ
びＳＶ４０“エクソン発現"クローン(これらについては
それぞれ必要に応じて別個に記述する)からの情報を相
互に関連させ、同時に発現させることが含まれる。
【０１０５】２．ゲノム・ライブラリー・スクリーニン
グ法 第ＶＩＩＩ因子遺伝子はヒトＸ染色体上に存在すること
が知られている(５６)。陽性クローンを増加させるため
に、４Ｘ染色体を含む固体から得たＤＮＡでゲノムライ
ブラリーを組立てた(リンパ芽球細胞系列はＸＸＸＸＹ
の核型を有する;本明細書では、このＤＮＡから組立て
られたライブラリーを“４Ｘライブラリー"と表す)。４
９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡをＳau３ＡＩ部分消化に付し、
適当なサイズの画分をλファージまたはコスミッドベク
ターにライゲートした。これらλ／４Ｘおよびコスミッ
ド／４Ｘライブラリーの組立ての詳細に関しては後述す
る。λ／４Ｘライブラリー中に第ＶＩＩＩ遺伝子が含ま
れる予想頻度はおよそ１１０,０００クローン当り１個
であり、同じくコスミッドライブラリーに関してはおよ
そ４０,０００当り１個の割合である。
【０１０６】これらのライブラリーを、第ＶＩＩＩ因子
タンパク質の配列の一部に基く合成オリゴヌクレオチド
を用いてスクリーンした。これらのオリゴヌクレオチド
プローブは、コドン選択利用分析(codon choice usag
e analysis)に基いて３０〜１００個のヌクレオチドか
らなる一本鎖配列であるとされたもの(ロング・プロー
ブ)と、選択された各コドンに関して可能な全ての縮重
の組合せで特定された、１４〜２０個のヌクレオチド長
さを有するプローブ(ショート・プローブ)との２つの型
に分けられる。
【０１０７】ロング・プローブの主な利点は、それらを
タンパク質の任意の１０−３０アミノ酸配列に基いて合
成することができる、という点にある。これはコドンの
重複度の低い特定の領域を見出すことを要しない。もう
１つの利点は、遺伝子配列との正確な合致が必要でない
ために(唯、相補的な１０−１４ヌクレオチドの伸長部
位が必要である)、イントロンの存在による、あるいは
遺伝子の多形性またはタンパク質の配列上のエラーによ
って引き起こされた相補性の中断が必ずしもハイブリダ
イゼーションの有用性を妨げない、という点にある。ロ
ング・プローブの欠点は、各アミノ酸について唯一個の
コドンしか選択されない、という点である。我々は、コ
ドンを選択するに際して哺乳類に関するコドン頻度表
(５７)により、これによっては好適なものが明らかでな
い場合には、第ＩＸ因子遺伝子(５８)のコドンの利用方
法に基いて行った。ロング・プローブの推定配列の適合
性の如何が不明であるので、ハイブリダイゼーション・
ストリンジエンシイは、各プローブ毎に、経験的に定め
なければならない。このことは、ゲノムＤＮＡブロット
とハイブリダイゼーションさせ、様々なストリンジエン
シーで洗浄することによって調べる。
【０１０８】ショート・プローブの利点は、可能なコド
ンの各々をオリゴヌクレオチドのプールとして合成する
ことができる、という点にある。従って、アミノ酸配列
が正しければ、そのショート・プローブは常に懸案の遺
伝子とハイブリダイズするに相違ない。主な制約は、合
成される配列のプールが複雑である、という点にある。
操作上、ゲノムライブラリーとのハイブリダイゼーショ
ンの制限が示されるプールの最大のサイズは、その中に
３２個の異る配列が含まれているものである。このこと
は、コドンの重複度の低い領域のタンパク質配列のみを
使用できることを意味する。代表的なプローブは、タン
パク質配列中の６−アミノ酸フラグメントについて可能
な全配列を特定している１６１７マーのプールである。
【０１０９】ロングプローブと同様に、ショートプロー
ブに関しても使用されるハイブリダイゼーション・スト
リンジエンシイは経験的に求められた。その理由は、日
常的に用いられるハイブリダイゼーション条件(６×Ｓ
ＳＣ)の下では、ハイブリッドの安定性は２つの因子(即
ち、長さとＧ−Ｃ含量)に依存するので、Ｇ−Ｃ含量の
低いプローブのストリンジエント条件は、Ｇ−Ｃ含量の
高いそれのストリンジエントとは全く同じでないことに
ある。１６１７マーの典型的なプールはＧ−Ｃを４１−
６５％の範囲内で含有しており、これらのプローブは１
０℃以上の温度領域(４８°〜５８℃)で６×ＳＳＣ中に
融解すると思われる。１６プール内の正確な配列は予め
わかっていないので、丁度４８℃より低いハイブリダイ
ゼーション・ストリンジエンシイを利用し、Ｇ−Ｃ含量
が最も低い配列をハイブリダイゼーションさせる。しか
しながら、多くのクローンをスクリーニングすると、こ
の方法では、多数のより短く、またより高いＧ−Ｃ含量
のものが偽の陽性を示し得る。１塩基対についての融解
温度の変化は１〜２℃であるので、１７の内、１２−１
３の短い配列のプローブも、それらのＧ−Ｃ含量が高け
れば結合するであろう。１６１７マーのプールしたプロ
ーブは、ヒトゲノム中において無作為に、１７塩基配列
と同じく１３塩基配列と１２００回ハイブリダイズす
る。
【０１１０】ショート・プローブを用いるハイブリダイ
ゼーションにおいて、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ塩基対の安定
性を同等にすると共に、高度に複雑なＤＮＡ配列のライ
ブラリーをスクリーンする場合のショートプローブの有
用性を著しく促進し得る様な、ショートプローブのハイ
ブリダイゼーション技術を開発した。
【０１１１】Ｆｉｇ.２Ａは、通常(６×ＳＳＣ)および
３．０Ｍ ＴＭＡＣl条件下での４つのショートプロー
ブの融点をプロットしたグラフである。３．０Ｍ ＴＭ
ＡＣl中では、プローブはその長さと略直線関係の融点
を示しているのに対し、６×ＳＳＣ中では、融点はＧ−
Ｃの含量によって大きく左右されている。６×ＳＳＣ中
において１３マーの示している高い融点は、明らかにＧ
−Ｃ含量が６５％であるとの結論を証明している。Ｆｉ
ｇ.２Ｂは、３．０Ｍ ＴＭＡＣl中における１１〜数千
の塩基長さを有するプローブの機能を表す融点を示すグ
ラフである。この図から、所望の長さに正確に合致する
長さを有するプローブのためのハイブリダイゼーション
条件を素早く選択することができる。
【０１１２】このＴＭＡＣlハイブリダイゼーション法
は、ある、既知の長さのものと正確に合致(適合)する配
列を必要とする場合に極めて有用である。この方法に
は、例えば下記の方法が含まれる: １．１６，１７マ
ーのプールを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリー
ニングする。我々は５０℃において３．０Ｍ ＴＭＡＣ
l洗浄を行い、１７,１６、並びに極く僅かな１５塩基配
列をハイブリダイゼーションさせた。かくして、数多く
の、よりホモロジーの低い、Ｇ−Ｃ含量の高いプローブ
を除去した。２．ショートプローブによるスクリーン
で、配列決定の容易な陽性配列が余りにも多く得られた
ならば、ＴＭＡＣl融解法によって、最も可能性の高い
ものを見つけ出すことができる。陽性配列のレプリカを
ハイブリダイズし、２℃の温度間隔で(１７マーの場合
(融解温度５４℃)は４６,４８,５０,５２,５４および５
６℃を採用することができる)洗浄する。最も高温で融
解する陽性配列がプローブと最も緊密に適合している。
既知の配列を標準に用いることにより、１７マーに関し
ては、そのホモロジーを±１塩基またはそれ以上の確率
で予測することができる。３．同様に、ロングプローブ
によるスクリーンであまりにも多くの陽性の配列が得ら
れたならば、同じタンパク質配列に基く、ショートプロ
ーブのプールを得ることができる。このプールの中の１
つが完全に適合するかもしれないので、ＴＭＡＣlによ
る融解実験により、最も有望な陽性配列の選択をより精
密に行うことができるであろう。４．部位指向性(sited
irected)突然変異誘発においては、通常、中心部に１ま
たはそれ以上の変化を含む２０ヌクレオチド長さのオリ
ゴヌクレオチドが合成される。２０マーの中央に１塩基
の不適合があるだけでも、ＴＭＡＣl洗浄法により、親
配列と、突然変異誘導体とを容易に識別することができ
る。このことは、所望の突然変異が正確にプローブと適
合することに起因する。洗浄の条件はＦｉｇ.２Ｂから
単純に求めることができる。５．緊密に関連している遺
伝子系列(ファミリー)の中から特定の１遺伝子を選び出
す。上記と同様の融解実験により、１００の極めて似通
った配列の集りの中から１つの特定の遺伝子が選び出さ
れた。
【０１１３】３．第ＶＩＩＩ因子ゲノムクローンの最初
の単離 第ＶＩＩＩ因子に富む標品は、多電解質クロマトグラフ
ィおよび免疫吸着法により、ヒト−クリオプレシピテー
ト(寒冷沈降物)から既述の如く調製した(７９)。この物
質を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)と１％重
炭酸アンモニウムに対して透析して凍結乾燥し、使用ま
で−２０℃において保存した。
【０１１４】第ＶＩＩＩ因子標品は他の血漿タンパク質
で汚染されているので、第ＶＩＩＩ因子を精製すると共
に、この第ＶＩＩＩ因子から導かれることが確かである
様々なポリペプチド鎖を分離するために、更に分画する
必要がある。このことは、トーヤ・ソーダ(Ｔoya Ｓod
a)ＴＳＫ４０００ＳＷカラムを用いてＳＤＳの存在下、
高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、達成さ
れた。この様なクロマトグラフィー法ではタンパク質を
分子量に応じて分離できる。
【０１１５】凍結乾燥タンパク質を再び蒸留水に入れ、
これを１％ＳＤＳおよび０．１Ｍりん酸ナトリウム(pＨ
７．５)に調節した。ＴＳＫカラム(０．７５×５０cm;
オールテック、デイアーフィールド(Ａlltech,Ｄeerfie
ld)ＩＬ)を室温で０．１Ｍりん酸ナトリウム(pＨ７．
０)中０．１％ＳＤＳ溶液により、平衡させた。試料約
０．１５〜０．２５mlを注入し、カラムを流速０．５ml
／分でイソクラテイクに展開させた。２８０nmにおける
吸収を監視し、その分画０．２mlを得た。代表的な溶離
像をＦｉｇ.１５に示す。一部をとり、ポリアクリルア
ミドの濃度勾配が５〜１０％である、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミド・勾配ゲル電気泳動にかけ、
銀染色法で解析した(８０)。２５分後に溶離した物質は
８０,０００および７８,０００Ｄの二本鎖(doublet)タ
ンパク質であった。これらのタンパク質を含む画分を、
Ｆｉｇ.１５の棒(バー)で示した様に、プレパラティブ
ＴＳＫに、別々に、３回付してプールし、使用に供する
まで−２０℃で保存した。
【０１１６】ＴＳＫ分画から精製した８０,０００ダル
トンのタンパク質(０．８ナノモル)を窒素雰囲気下、８
Ｍ尿素、０．３６Ｍトリス−ＨＣl(pＨ８．６)および
３．３mＭエチレンジアミン−四酢酸に対し、一夜透析
した。上記の透析用緩衝液中に１０mＭジチオトレイト
ールを加えることによりジスルフイド結合を還元した。
最終的な容量は１．５mlであった。システインを５Ｍヨ
ード酢酸(１ＭＮaＯＨに溶かした溶液)１５μlでアルキ
ル化した。このアルキル化反応は暗所において室温で３
５分間行い、ジチオトレイトールを最終濃度が１００m
Ｍになる様に加えて止めた。このタンパク質溶液を０．
１Ｍ重炭酸アンモニウム中、８Ｍ尿素液に対して４時間
透析した。この透析液の尿素濃度を２４時間の間に徐々
に希釈し、変化させた(８Ｍ、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび
最終尿素濃度０．５Ｍ)。還元し、アルキル化した８０,
０００ダルトンのタンパク質にＴＰＣＫ−処理トリプシ
ン(Ｓigma Ｃhem．Ｃo．)を、第ＶＩＩＩ因子タンパク
質３０部:トリプシン１部の重量比で加えてトリプシン
消化を行った。この消化を３７℃で１２時間継続して行
った。この反応混合物を使用するまで凍結しておいた。
トリプシン処理ペプチドの高速液体クロマトグラフィー
による分離を、高速分割Ｓynchropak ＲＰ−ＰＣ−１
８カラム(０．４６×２５cm、１０μ)上、室温でＳpect
ra−Ｐhysics ８０００クロマトグラフを用いて行っ
た。試料約０．８mlを注入し、カラムを、０．１％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリル勾配溶液(１％〜７０
％／２０分)で展開した。２１０nmおよび２８０nmの吸
収を監視した(１％〜７０％)(Ｆｉｇ.１６)。各ピーク
に相当する画分を集め、Ｂeckmanスピニング・キャップ
・シーケンサー中で、オン−ラインＰＴＨアミノ酸同定
法による配列決定に付すまで４℃で保存した。Ｆｉｇ.
１６において、矢印の位置はアセトニトリル約２３％で
溶離した部分であり、配列:ＡＷＡＹＦＳＤＶＤＬＥＫ
を有するペプチドを含有するピークである。この配列
は、ヒトゲノム・ライブラリーのスクリーニングのため
のオリゴヌクレオチドプローブ８．３を生成せしめるた
めに用いたものである。
【０１１７】これまでに論じた事に基いてロングおよび
ショートプローブが合成された。使用した第２のロング
プローブは、第ＶＩＩＩ因子のトリプシン処理−フラグ
メントである１２個のアミノ酸から成る配列:ＡＷＡＹ
ＦＳＤＶＤＬＥＫに基いている。プローブのために合成
するよう選択されたＤＮＡ配列は、５'−ＣＴＴＴＴＣ
ＣＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＣＣ
ＣＡＡＧＣであった。このプローブ(８．３と称する)
を、まずゲノム・ブロット・ハイブリダイゼーションで
試験した。Ｆｉｇ.３Ａは、標識した８．３プローブと
ゲノム・サザーン・ブロット法でハイブリダイズした正
常な雄(ＩＸ)および４９,ＸＸＸＸＹ(４Ｘ)ＤＮＡを種
々のストリンジエンシイーで洗浄して得た像である。最
高のストリンジエンシイー(ＩＸ ＳＳＣ、４６℃)にお
いてさえ、３．８kb(ＥcoＲＩ)および９．４kb(ＢamＨ
Ｉ)のシングルバンドがみられたにすぎない。このバン
ドのＩＸレーン(列)と４Ｘレーン中の強度比は、Ｘ−結
合第ＶＩＩＩ因子遺伝子のそれについて予測された如
く、約１:４であった。対照実験においては、既知のＸ
−結合遺伝子プローブ(第ＩＸ因子)のハイブリダイゼー
ション比は、常染色体遺伝子(アルブミン)のそれが１:
１であるのに対して、予測された比率１:４を示すこと
が証明された。これらのゲノム・ブロット法の結果に基
き、８．３プローブをλ／４Ｘライブラリーをスクリー
ンするのに用いた。５００,０００個のファージを５０
個の１５０mm平板上で増殖させ、ニトロセルロースフィ
ルターを２回、32Ｐ−標識８．３プローブとハイブリダ
イズ(洗浄のストリンジエンシイ:ＩＸ ＳＳＣ、３７
℃)した(Ｆｉｇ.３)。再試験によって、１５の強くハイ
ブリダイズしたクローンと１５のそれより弱くハイブリ
ダイズしたクローンとを得た。これらの単離したプラー
クからＤＮＡを調製し、制限エンドヌクレアーゼで開裂
し、プローブ８．３によるブロット・ハイブリダイズに
付した。強くハイブリダイズしたクローンの多くが、ゲ
ノム・ブロットにより検出したものと同じ大きさの、ハ
イブリダイズした３．８kbのＥcoＲＩフラグメントを与
えた。さらに、強くハイブリダイズしたクローンの全て
が、８．３kbプローブとのハイブリダイゼーションに際
して２６２塩基対のＳau３ＡＩフラグメントと同じ挙動
を示した。Ｓau３ＡＩフラグメントを一本鎖ファージベ
クターＭ１３mp８(８６)にクローンし、ハイブリダイゼ
ーションによってスクリーンし、ジデオキシ法に従って
配列決定を行った。この２６２bpフラグメントのＤＮＡ
配列は８．３プローブとかなりのホモロジー(相同性)を
示した。このホモロジーは、全体の８４％がホモロジー
であると共に、１４および１０bpの連続的に合致する領
域がある、ということを含む。このペプチドフラグメン
トの最初の１０残基は、組換えクロンのＤＮＡ配列から
推定されるそれと一致しており、しかも、トリプシン処
理による生産物から予測される様に、リジンコドンによ
って先行されていた。最後の２つの予測残基はＤＮＡ配
列と合致していなかった。しかしながら連結部(junctur
e)のＤＮＡは、ＲＮＡのスプライス部位供与配列(６０,
６１)と良好な一致を示し、すぐ後に、３つの可能な解
読フレーム中の終止コドンが続いていた。このことは、
この位置から始まるイントロンが存在していることを暗
示している(この暗示は下記のcＤＮＡクローンによって
確認された)。ホモロジー領域の５'側に約４００bのオ
ープン・リーデイング・フレームが延びていた。この領
域内に、数個のコンセンサスなスプライス受容配列が確
認された。この領域の、ＤＮＡに基く推定のタンパク質
配列を点検した結果、これらの配列は、更に幾つかの第
ＶＩＩＩ因子のトリプシ処理ポリペプチドのタンパク質
配列と合致することがわかった。このことは、ヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子のためのゲノムクローンのエクソンが得られ
た、ということを証明するものである。
【０１１８】４．ゲノム・クローンの拡張:λライブラ
リーのゲノム・ウオーキング 当初、λ／４Ｘライブラリーから８個の独立した第ＶＩ
ＩＩ因子ゲノム・クローンが得られた。これらは約２８
kbに及ぶヒトゲノムの重複(overlapping)セグメントを
含有していた。第ＶＩＩＩ因子タンパク質の概算された
サイズに基き、完全な遺伝子は、イントロンの大きさに
応じて１００〜２００kbであろうと推測される。従っ
て、重複クローンのコレクション(収集)を、ゲノム・ウ
オーキングによってさらに拡張させた。
【０１１９】この方法における第Ｉ段階は、既存のゲノ
ム・クローンの制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をマッ
ピングすることである。クローンから得たＤＮＡを制限
酵素単独または組合わせによって消化し、ゲル電気泳動
法により、確認した(ある場合においては、次いでサザ
ーン・ブロット・ハイブリダイゼーションを行った)。
ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ消化で生じたＤＮＡフラグメン
トを、便宜上、pＵＣプラスミドベクター(５９)にサブ
クローンした。制限マッピング法、ＤＮＡ配列決定およ
び８．３プローブとのブロットハイブリダイゼーション
によって遺伝子の方向性を決定した。
【０１２０】次いで、２８kb領域の末端付近の一本鎖の
(シングル)コピーフラグメントを“ウオーク"プローブ
として同定した。クローンしたＤＮＡの消化物を32Ｐ−
標識全ヒト−ＤＮＡとブロットハイブリダイズさせた。
この方法によって、ゲノム中に約５０以上、繰返されて
いる配列を含有するフラグメントだけがハイブリダイズ
することになるであろう(８７,８８)。ハイブリダイズ
しなかった候補−ウオーク・プローブ・フラグメント
を、その配列上の繰返しについて、λ／４Ｘライブラリ
ーからの５０,０００ファージとのハイブリダイゼーシ
ョンにより、再度調べた。
【０１２１】ＮdeＩおよびＢamＨＩで消化したλ１２０
ＤＮＡの５'側に１kbフラグメントのトリプレットが単
離された(Ｆｉｇ.４参照)。このプローブを用いて１０
０万個のλ／４Ｘバクテリオファージをスクリーンし
た。得られたクローン、λ１２２は、λ１２０から５'
側に約１３kb延びていることがわかった(Ｆｉｇ.４参
照)。
【０１２２】３'側には、λ１１４の２．５kb ＳtuＩ
／ＥcoＲＩ制限フラグメントが、一本鎖のコピーウオー
ク・プローブとして同定された。λ／４Ｘ、次いで他の
λ／ヒトゲノムライブラリーの徹底的なスクリーニング
によっては、伸張するクローンを得ることができなかっ
た。λライブラリー中のゲノム領域について示した代表
例は既に観察されている(６２)。所望の配列を得るため
にゲノムＤＮＡを特異的に豊富化し、それから制限的な
バクテリオファージライブラリーを得ることを決定し
た。
【０１２３】ヒトゲノムＤＮＡと２．５kb ＳtuＩ／Ｅ
coＲＩプローブとのサザーン・ブロット・ハイブリダイ
ゼーションによって２２kbの、ハイブリダイズし得るＢ
clＩ制限フラグメントが示された。制限マッピング法に
よって、このフラグメントのクローニングおよび回収に
より、ゲノムクローンの３'側に長い伸長部分が得られ
ることがわかった。ヒト４９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡをＢc
lＩで消化し、約２２kbのサイズのフラクションをゲル
電気泳動で精製した。このＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターλ１０５９のＢamＨＩ部位にライゲートし、１
つのライブラリーを調製した(先に用いたベクターであ
るシャロン３０は、その様に大きい挿入には適応し得な
い)。この豊富化されたライブラリーをスクリーンして
得た４００,０００個のファージから、６個のハイブリ
ダイズするクローンが得られた。所望のクローン(λ４
８２と命名)は、本来の、１セットのゲノムクローンか
ら３'側に、更に１７kb延びていた(Ｆｉｇ.４)。
【０１２４】５．ゲノムウオーキング:コスミッドクロ
ーン コスミッドベクターを用いて新しいゲノムライブラリー
を組立てた。コスミッド(６３)はプラスミドとバクテリ
オファージとのハイブリッドであり、約４５kbというλ
／４ＸＤＮＡライブラリーの平均挿入サイズを約３倍上
回る大きさの挿入物に適応し得る。新規な組立てコスミ
ッドベクターpＧcos４は以下の理由で望ましいものであ
る:１)ＢamＨＩ部位を有していないpＢＲ３２２のテト
ラサイクリン耐性遺伝子誘導体を用いた。このことによ
り、プラスミド中、任意の位置にＢamＨＩ部位を設ける
ことができ、それをクローニング部位として使用でき
る。テトラサイクリン耐性は、より一般的なアンピシリ
ン耐性よりも、耐薬剤性が大きいことから幾分取り扱い
易いといえる。２)cos部位を含む、λの４０３bＨｉｎ
ｃＩＩフラグメントをｐＢＲ３２２の６４１bＡvaＩ／
ＰvuＩＩフラグメントで置き換えることによりプラスミ
ドのコピー数を増加させると共に、真核細胞の形質転換
を妨げる様なpＢＲ３２２の内の配列(７５)を除去し
た。３)デヒドロ葉酸還元酵素とＳＶ４０の複製起源お
よびプロモーターとの突然変異生成物がpＧcos４ベクタ
ーに含有されている。こうすることにより、このベクタ
ー内にクローンされたフラグメントはすべて、広範な真
核細胞内に伝播されることになる。このことから、固有
のプロモーター類を伴なったゲノムＤＮＡの大きいフラ
グメントを発現させるのに有用であろうと予測される。
４)クローニングの部位として、pＢＲ３２２起源のＥco
ＲＩ部位に、ＥcoＲＩ、ＰvuＩ、ＢamＨＩ、ＰvuＩおよ
びＥcoＲＩがクローンされた。唯一のＢamＨＩ部位はゲ
ノムＤＮＡの３５−４５bＳau３Ａ１フラグメントのク
ローンに利用される。両端のＥcoＲＩ部位は挿入物のＥ
coＲＩフラグメントのサブクローニングに用いることが
できる。また、ＰＶuＩ部位は、多くの場合、全挿入物
を切り取るのに使用される。真核性ＤＮＡ中にはＰvuＩ
部位が極めて稀にしか存在せず、ヒトＤＮＡのジヌクレ
オチド頻度に関しては、１３４,０００bの間に唯１回し
か生成しない、と予想される。
【０１２５】コスミッドベクターの組立て模式図をＦｉ
ｇ.５に示す。４９,ＸＸＸＸＹ ＤＮＡの３５−４５kb
Ｓau３Ａ１フラグメントをこのベクターにクローンし
た。約１５０,０００個の組換え体を、５'側:λ２２２
の２．４kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントと３'側:
λ４８２の１kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメント(こ
れらはいずれも、このゲノム領域の末端付近に同定され
た一本鎖のコピー・プローブである)により、２回スク
リーンした。４個の陽性なコスミッドクローンを単離
し、マッピングした。Ｆｉｇ.４にはコスミッドp５４
１、p５４２およびp５４３が示されている。このスクリ
ーンから、これらのコスミッドクローンは第ＶＩＩＩ因
子ゲノム領域内で、計１１４kbpの長さに達しているこ
とがわかる。引き続いて行ったcＤＮＡクローンによる
プロービングでは、既存の１組の重複ゲノムクローン類
の中に存在する多くのエクソンが確認されたが、このゲ
ノムウオークが未だ完了していないことが示唆された。
そこで、いずれかの方向に向けて更に作業を行った。
【０１２６】３'側のウオークプローブをp５４２の１．
１kbＢamＨＩ／ＥcoＲＩフラグメントから調製した(Ｆ
ｉｇ.４)。このプローブにより、更に３'側へ約３５kb
伸長する重複コスミッドクローンp６１３を検出した。
続いて、cＤＮＡクローニングにより、第ＶＩＩＩ因子
の全メッセージ配列を得た(以下参照)。cＤＮＡの３'−
末端部分を含む１．９kb ＥcoＲＩ cＤＮＡフラグメ
ントを、ヒト−ゲノムおよびコスミッドクローンＤＮＡ
のサザーンブロットにハイブリダイズさせたところ、非
クローン(ゲノム)およびp６１３ＤＮＡの両者の中に単
１の４．９kb ＥcoＲＩバンドと、５．７、３．２およ
び０．２kbのＢamＨＩバンドが確認された。このこと
は、既に遺伝子の３'末端に到達していることを暗示す
るものであり、後に、ＤＮＡ配列決定でそのことを確認
した。
【０１２７】また、５'側のウオークプローブは、p５４
３の０．９kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントから調
製された。これによって重複領域から僅かにはみ出して
延びる重複コスミッドクローンp６１２を検出した。大
部分の５'−ゲノムクローンは、最終的にはコスミッド
／４Ｘおよびλ／４ＸライブラリーをcＤＮＡ誘導プロ
ーブでスクリーニングすることにより、得られた。Ｆｉ
ｇ.４に示されている如く、λ５９９、λ６０５および
λ６２４が得られて、第ＶＩＩＩ因子の全長にわたる１
組の組換えクローンが完全に揃う(これらのクローン
は、唯１個のイントロンＤＮＡである、p６２４とλ５
９９との間の８．４kbのギャップを除いて、全て重複し
合い、ヒトゲノムのこの領域に含まれるＤＮＡ全てを含
有している)。これらは一緒になって、ヒトＸ染色体の
２００kbに及ぶ遺伝子を構成する。この遺伝子は報告さ
れたものの内、最も大きい遺伝子である。この遺伝子の
約９５％はイントロンであり、第ＶＩＩＩ因子タンパク
質の合成に用いる鋳型のmＲＮＡを生産するためには適
切に処理されねばならない。
【０１２８】λおよびコスミッド組換えクローン中から
の第ＶＩＩＩ因子遺伝子領域の単離は、有用な生産物で
ある第ＶＩＩＩ因子タンパク質の生産にとって充分とは
いえない。トランスフエクトされた微生物または組織培
養細胞内での活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質の合成を
指令することのできる、組換え発現プラスミドを完全に
組立てるために遺伝子のタンパク質暗号部分(エクソン)
を同定し、特徴づけるための様々な試みが引き続いて行
われた。２つの試みは実質上有用な結果を得ることがで
きなかった:ゲノムクローンを、新しいオマゴヌクレオ
チドプローブでタンパク質配列に基いて更にスクリーニ
ングすること、およびＲＮＡブロット・ハイブリダイゼ
ーションのプローブとして、ゲノムクローンで選択した
フラグメントを用いる試みである。しかしながら、本発
明では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の暗号領域をＳＶ４
０の“エクソン発現"ベクターを用いて単離し、また完
全な形のものは、cＤＮＡクローニングで得た。
【０１２９】６．ＳＶ４０エクソン発現ベクター 数百kbものゲノム領域をＤＮＡ配列決定で完全に特徴づ
けたり、有用な量の第ＶＩＩＩ因子タンパク質を合成す
るのに直接用いることは殆んどあり得ないことである。
ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の略９５％はイントロン(介
在配列)から成り、これらはタンパク質の発現に先立
ち、人工的に、または真核性ＲＮＡスプライシングで機
械的に、除去されねば成らない。ＳＶ４０発現ベクター
と命名したベクターを使用して、完全な特徴づけがなさ
れていないゲノムクローンの制限フラグメントから、イ
ントロンを除去する方法を考案した。一般的な概念は、
ゲノムＤＮＡのフラグメントをＳＶ４０プロモーターを
含有するプラスミドに挿入し、有意な量の組換えＲＮＡ
を生成せしめ、それでトランスフエクトしたサルcos細
胞内でプロセス(処理)させることからなる。得られた、
スプライス後のＲＮＡは、直接分析にかけてもよく、ま
たはcＤＮＡクローニングのための物質として使用でき
る。少くとも理論上、この方法を用いて第ＶＩＩＩ因子
遺伝子の全てについてスプライスしたものを組立てるこ
とができる。
【０１３０】エクソン発現組立て物に最初用いたのは肝
炎表面抗原遺伝子(７３)を発現する既存のＳＶ４０cＤ
ＮＡベクターであった。しかしながら、これらのベクタ
ーにクローンしたゲノム第ＶＩＩＩ因子フラグメント
は、ブロットハイブリダイゼーション法で分析したとこ
ろ、なんら観察し得る第ＶＩＩＩ因子ＲＮＡを与えなか
った。このことは、この様な組立て方法では、その工程
中にcＤＮＡのエクソン領域が第ＶＩＩＩ遺伝子のイン
トロン領域と結合してしまうことにあると推測された。
これらの問題点を克服するために、エクソン発現ベクタ
ーpＥＳＶＤＡをＦｉｇ.６に示す如く、組立てた。この
ベクターは、ＳＶ４０のアーリー(初期)プロモーター、
アデノウイルスＩＩメジャー・レート、第Ｉスプライス
供与部位、ゲノム第ＶＩＩＩ因子フラグメントのクロー
ンのためのイントロン配列、次いでアデノウイルスＩＩ
Ｅ１bスプライス受容部位、並びに肝炎Ｂ表面抗原の３'
非翻訳およびポリアデニル化配列(４９j)を含有してい
る。
【０１３１】初めに、λ１１４の９．４kbＢamＨＩフラ
グメントおよび１２．７kbＳstＩフラグメントをpＥＳ
ＶＤＡのイントロン領域にクローンした(Ｆｉｇ.６参
照)。これらの２つの組立てにより合成されたＲＮＡをc
os細胞にトランスフエクトした後、ノーザン・ブロット
法で分析した結果をＦｉｇ.７に示す。９．４kbＢamＨ
Ｉ組立て物に関しては、エクソンＡおよび肝炎遺伝子の
３'非翻訳領域のための各プローブで約１．８kbのハイ
ブリダイズしたＲＮＡのバンドが見出された。新しい第
ＶＩＩＩ因子エクソンのＲＮＡを調べるために、λ１１
４の２．０kbpＳtuＩ／ＢamＨＩフラグメント(エクソン
Ａの３'側)を並べてハイブリダイズさせた。このプロー
ブで１．８kbにＲＮＡバンドが示され、この領域に新し
い第ＶＩＩＩ因子エクソンが存在することが証明され
た。これらの３個のプローブをまた、それぞれ、１２．
７kbＳstＩゲノムフラグメントを含有する組立物からの
ＲＮＡバンドとハイブリダイズさせた。このＲＮＡバン
ドは約２．１kbであった。この観察結果は、この組立て
物が、９．４kbＢamＨＩフラグメントの１側であるＢam
ＨＩ部位の３'側に、約２００−３００bpのエクソンを
含有していることを示唆するものである。
【０１３２】対照実験によって、この系で既知のエクソ
ン領域を正確にスプライシングし得ることがわかった。
ネズミのdhfrスパニング(全長にわたる)エクソンＩＩＩ
およびＩＶの３．２kbゲノムＨindＩＩＩフラグメント
をpＥＳＶＤＡにクローンした。ネズミdhfrプローブに
より、１kbのＲＮＡバンドを見出した。このサイズは、
エクソンが正しくスプライスされるならば、予測通りの
大きさである。９．４kbＢamＨＩ第ＶＩＩＩ因子または
３．２kb dhfrゲノムフラグメントにより、反対方向の
組立てを行ったところ、どのプローブによってもなんら
観察し得るＲＮＡバンドはみられなかった(Ｆｉｇ.
７)。
【０１３３】１２．７kb ＳstＩ組立て物からのＲＮＡ
のcＤＮＡコピーをpＢＲ３２２にクローンし、スクリー
ンした。１個の、略完全な長さ(１７００bp)のcＤＮＡ
クローン(Ｓ３６)が見出された。第ＶＩＩＩ因子挿入物
の全てと、そのいずれかの側にpＥＳＶＤＡベクターの
一部を含んでいる９５０bpのＳstＩフラグメントの配列
をＦｉｇ.８に示す。この配列は予測通り、アデノウイ
ルスのスプライス供与配列および受容配列で始まり、終
っている。その間に、エクソンＡを含む、８８８bpの第
ＶＩＩＩ因子の配列がある。エクソンＡの前方１５４bp
および後方５６８bpには、数個の第ＶＩＩＩ因子８０Ｋ
トリプシン処理フラグメントが含まれており、これらが
新たにエクソンとして同定、確認された。これらのエク
ソンに相当するゲノム領域の配列決定により、エクソン
Ａの５'側１５４bpには１個のエクソン、エクソンＣ
が、また３'側には、それぞれ２２９、１８３および１
５６bpに３個のエクソン、エクソンＤ、ＥおよびＩが含
まれていることがわかった。これら各エクソンは、妥当
な供与および受容部位によって結合されていた(６０、
６１)。
【０１３４】引き続いて行ったＳ３６エクソン発現cＤ
ＮＡと第ＶＩＩＩ因子細胞系列cＤＮＡクローンとの比
較により、Ｓ３６内のスプライスされた第ＶＩＩＩ因子
配列は全て第ＶＩＩＩ因子エクソンからのものであるこ
とが示された。これには予測されるエクソンとしてＣ、
Ａ、Ｄ、ＥおよびＩが含まれる。しかしながら、エクソ
ンＡはＣ、Ａ連結部分の４７bpが失われており、またエ
クソンＦ、ＧおよびＨは完全に脱落していた。その様な
正常でないＲＮＡのプロセッシングに起因する解読フレ
ームのシフトは、それが第ＶＩＩＩ因子の配列と正確に
対応していないかもしれない、ということを示してい
る。Ｃ、Ａ連結部には、標準的なものでなく、よく一致
するスプライス部位を用いた。標準的な第ＶＩＩＩ因子
転写物と比較して、Ｓ３６クローンのスプライシングが
異っている原因は、ＲＮＡの一次転写物の一部分しかco
s細胞の組立て物中で発現しないことにあるのかもしれ
ない。あるいは、細胞型または種間の変化が、その様な
相違に係っているのかも知れない。
【０１３５】７．cＤＮＡクローニング a．第ＶＩＩＩ因子mＲＮＡを生産する細胞系列の同定 第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡクローンの単離に用いるＲＮＡ
供給源を同定するために、多くのヒト細胞系列および組
織からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、これをλ１２０
のエクソンＡ領域から得た１８９bpＳtuＩ−ＨincＩＩ
フラグメントを用いたノーザン・ブロット・ハイブリダ
イゼーションにより、スクリーンした。ＣＨ−２、ヒト
Ｔ−細胞ハイブリドーマからのポリ(Ａ)+ＲＮＡにハイ
ブリダイズするＲＮＡの種があることが示された。ハイ
ブリダイズするＲＮＡの大きさは約１０kbと算定され
る。この大きさは約３００kＤのタンパク質を暗号化す
るmＲＮＡについて予測される大きさである。ドット−
ブロット・ハイブリダイゼーション(６６)での対照ＤＮ
Ａとの比較により、このＲＮＡの量はＣＨ−２細胞系列
中に存在する全細胞性ポリ(Ａ)+ＲＮＡの０．０００１
〜０．００１％であると決定された。この結果は、該供
給源から第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡ配列を単離するには、
特異配列をさらに豊富化するか、さもなくば非常に多数
のcＤＮＡクローンのスクリーニングを行う必要がある
ことを示唆するものである。
【０１３６】b．特異的にプライムされたcＤＮＡクロー
ン 第ＶＩＩＩ因子ゲノムクローンのＤＮＡ配列決定に基
き、cＤＮＡの一次鎖合成を特異的にプライム(prime)す
る１６塩基のオリゴヌクレオチドが合成された。cＤＮ
Ａの合成を開始する場合、通常は、mＲＮＡのポリ(Ａ)
末端(テール)にオリゴ(dＴ)を作用させる。本発明の特
異的プライミングはオリゴ(dＴ)に比べて２つの利点を
有する。第１に、それは第ＶＩＩＩ因子のためのcＤＮ
Ａクローン集団を豊富化するよう働く。第２に、それ
は、cＤＮＡクローンを、本発明者らの有するハイブリ
ダイゼーションのためのプローブが該当する、遺伝子領
域に位置せしめる様作用する。このことは、その様な大
きい遺伝子のクローニングには特に重要な点である。c
ＤＮＡクローンが１０００〜２０００塩基対よりも長い
ことは稀れであるために、オリゴ(dＴ)でプライムされ
たクローンは、第ＶＩＩＩ因子の大多数の領域から調製
されたプローブによっては、通常検出され得ない。そこ
で、最初のエクソンＡ領域からのＤＮＡフラグメントと
配列に関する情報を用いて特異的にプライムされたcＤ
ＮＡクローンを得るための努力が払われた。より早期に
生成されたcＤＮＡクローンを確認することで、１組の
５'方向へ向う重複cＤＮＡクローンを得た。更にcＤＮ
Ａの３'側領域を導くために、cＤＮＡと３'エクソンか
らのゲノムクローンフラグメントを用いてオリゴ(dＴ)
でプライムされたcＤＮＡクローンを検索した。この試
みのための工程には下記の如く、数種類のcＤＮＡクロ
ーニング法を採用した。
【０１３７】最初の特異的cＤＮＡプライマ−５'−ＣＡ
ＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧ(“プライマー"Ｆｉｇ.
９参照)は、エクソンＡ配列の３'末端の１６残基の逆相
補性の配列として合成された。ＣＨ−２細胞ポリ(Ａ)+
ＲＮＡ５μgとプライマー１からＣ−末端化cＤＮＡを合
成し、(６７)に一般的に記載されている様に、Ｇ−末端
化pＢＲ３２２アニールした。得られた約１００,０００
のＥ．coli(大腸菌)形質転換体を１００の１５０mm皿に
のせ、ゲノムクローンλ１２０(Ｆｉｇ.４)のエクソン
Ａ領域から得た１８９bpＳtuＩ／ＨimcＩＩフラグメン
トとハイブリダイゼーションすることにより、スクリー
ンした(４８)。１個の、真にハイブリダイズするクロー
ン(“p１．１１")を回収した(Ｆｉｇ.９)。p１．１１の
ＤＮＡ配列決定により、これは本発明に係る第ＶＩＩＩ
因子ゲノムクローンと同一であることが証明された。p
１．１１内の４４７bpcＤＮＡ挿入物は、ゲノムエクソ
ンＡの最初の１０４b(二次鎖合成がプライマー後方に向
けて伸長しないことは明らかである)を含有し、後にエ
クソンＢおよびＣの存在が示された部分に連続してい
た。エクソンＡ配列の５'側分岐点は、典型的なＲＮＡ
スプライス受容部位で画されていた(６１)。
【０１３８】この様にＣＨ−２細胞系列から容易に第Ｖ
ＩＩＩ因子を得ることができる、ということが証明され
たので、更に細かい工夫がなされた。第ＶＩＩＩ因子の
メッセージのために、ＣＨ−２ＲＮＡを更に豊富化する
様、様々な努力が払われた。そして、特異的にプライム
された一次鎖cＤＮＡの合成と、得られた一本鎖cＤＮＡ
をハイブリッド法で選択することを組合わせるのに成功
した。一本鎖cＤＮＡの合成には、プライマー１と２０
０μgのポリ(Ａ)+ＣＨ−２ＲＮＡを用いた。このものを
直ちに二重鎖ＤＮＡに転換するに際し、ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる代りに、該一本鎖ＤＮＡを、活性化された
ＡＢＭセルロースペーパー(ＳchleicherおよびＳchul
l．“トランサ・バインド(Ｔransa−Ｂind))上に固定化
された１８９bpのＳtuＩ／ＨincＩＩゲノムフラグメン
トＤＮＡ２μgにハイブリダイズした(４８)。通常、Ｒ
ＮＡはハイブリッド選択法に委ねられるが、本発明にお
いては、第ＶＩＩＩ因子のＲＮＡ分子が稀れで大きく、
比較的不安定な故に、余分な操作を避けるため、その工
程をcＤＮＡ合成の後で行った。溶離した後、得た物質
を二重鎖cＤＮＡに変換し、サイズによって選別して回
収したＤＮＡ０．５ngをＣ−末端化し、前記の如くpＢ
Ｒ３２２にクローンした。約１２,０００の組換えクロ
ーンが得られ、これを前述のcＤＮＡクローンp１．１１
から導かれた３６４bpＳau３Ａ／ＳtuＩフラグメントの
ハイブリダイゼーションによってスクリーンした。この
プローブフラグメントをハイブリッド選択に用いたＤＮ
Ａと重複しないように選び出した。この様にして、ＤＢ
Ｍセルロースから常に放出されるＳtuＩ／ＨincＩＩＤ
ＮＡフラグメントを幾らか含む偽の組換え体を誤って同
定することが回避される。２９のハイブリダイズしたコ
ロニーが得られた。このことは、従来の方法に比べて所
望のクローンが約２５０倍豊富化されていることを示し
ている。
【０１３９】新しい２９の組立て物の各々を制限マッピ
ング法で特徴づけし、２個の最も長い配列(p３．１２お
よびp３．４８、Ｆｉｇ.９)の配列決定を行った。これ
らのcＤＮＡはp１．１１から５'側へ、更に約１５００b
p伸長していた。cＤＮＡとゲノムクローンの同時マッピ
ングおよび配列決定により、p３．１２およびp３．４８
を囲む異常に長いエクソン(エクソンＢ、Ｆｉｇ.４)が
存在していることが判明した。この観察に基き、該エク
ソンの程度を明らかにするため、ゲノムクローンλ２２
２のＤＮＡ配列決定を行った。エクソンＢ領域は約３kb
のオプン・リーティング・フレームを含んでいた。cＤ
ＮＡクローニングにおいて相当な長さの伸長部分が得ら
れることを期して、この長いエクソン内の配列と合致す
る様、１６マーのプライマー２および３を合成した。
【０１４０】この時点で、バクテリオファージを基とす
るcＤＮＡクローニング系を用いることができ、そうす
ることにより、事前にハイブリッド選択を行って豊富化
することなしに多数のcＤＮＡクローンを生産し、スク
リーニングすることができる、ということが証明され
た。λＧＴ１０(６８)は、そのリプレッサー遺伝子中に
単１のＥcoＲＩ制限部位を有するファージ入誘導体であ
る。もしも二重鎖cＤＮＡフラグメントの両端がＥcoＲ
Ｉ部位であれば、これらを該単１部位に挿入することが
できる。この部位に外来のＤＮＡを挿入することによ
り、ファージ・リプレッサーを消失させ、澄明なプラー
クを生成させる。挿入されていないλＧＴ１０は濁った
プラークを形成するので、組換体から容易に識別し得
る。ファージ・パッケージングが本来有する形質転換効
率の大きさ、に加えて高濃度のλcＤＮＡプラークのス
クリーンが細菌性コロニーのそれよりも容易である。
【０１４１】プライマー３(５'−ＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧ
ＣＴＧＣＡＧ)を用いて前記の如く二重鎖cＤＮＡを製造
した(プライマー３はエクソンＢの仮定の５'末端から約
５５０bp下流に位置する)。アダプターは相補的な合成
１８マー(５'−ＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴＡＡＧＡＣＡＴ
Ｇ)および２２マー(５'−ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＧＧＴＣＡＡＧＧ)で構成されている。１８マーの５'
末端はりん酸化されているが２２マーの５'末端はそれ
の合成に用いられた５'−ＯＨを保持している。従っ
て、これらのアダプターをアニールし、cＤＮＡとライ
ゲートすると、自己ライゲートし得ない、突出した(粘
着性の)ＥcoＲＩ部位を形成することになる。このこと
により、cＤＮＡＩメチル化が回避され、引き続いてＥc
oＲＩ消化を行い、他の公表された方法によるリンカー
ライゲーションに付すことができる(８３)。cＤＮＡの
サイズ選択と未反応アダプターの除去のためにゲル単離
を行った後、等モル量の該cＤＮＡをＥcoＲＩ切断λＧ
Ｔ１０にライゲートしてパッケージした後、ＥcoＲＩc
６００hf１に接触させた。１μgのポリ(Ａ)+ＲＮＡから
得た約３,０００,０００のクローンを５０個の１５０mm
ペトリ皿にのせ、エクソンＢの５'末端からの３００bp
ＨinfＩフラグメントとハイブリダイゼーションし、ス
クリーンした。４６の１対の陽性が認められ、これらを
ＥcoＲＩ消化で分析した。数個のcＤＮＡ挿入物はプラ
イマー３の５'側へ約２５００bp伸長している様に思わ
れた。これらの長いクローンをＤＮＡ配列決定で分析し
た。λ１３．２およびλ１３．２７の５'末端の配列を
Ｆｉｇ.１０に示す。これらは本発明者らが既に得た第
ＶＩＩＩ因子の暗号領域における５'末端を指示する様
な点を幾つか有していた。最初の１０９bpは、可能な解
読フレームの全てに終止コドンを有していた。次に、Ａ
ＴＧトリプレットが現れ、続いてλ１３．２内にあるc
ＤＮＡ挿入物の２７２４bpの残余部分に対するオープン
リーデイングフレームが存在する。開始信号(イニシエ
ーター)ＡＴＧに続く配列の翻訳によって、分泌タンパ
ク質“リーダー"または“プレ"配列(６９)の典型的な１
９のアミノ酸配列が与えられる。その特徴は２個の電荷
を有する基が１０個のアミノ酸の疎水性部分(芯)の境界
にある、ということである。この推定のリーダー配列の
次には、第ＶＩＩＩ因子の２１０kＤおよび９５kＤトロ
ンビン消化物に対するタンパク質配列決定によって得ら
れたアミノ末端残基に対応する領域が続く。
【０１４２】c．オリゴ(dＴ)でプライムされたcＤＮＡ
クローン 数千以上の第ＶＩＩＩ因子mＲＮＡの３'側の塩基がcＤ
ＮＡに変換されないままになっている。そこで、オリゴ
(dＴ)により逆転写をプライム(開始)し、mＲＮＡの３'
ポリ(Ａ)+テールを含むcＤＮＡクローンを探すことにし
た。しかしながら、クローンを豊富化し、二次鎖ＤＮＡ
合成の効率を増大する様、工夫する内に、確立されてい
た方法に代えて二次鎖cＤＮＡ合成に特異的なプライマ
ーを用いることが決定された。エクソンＡ(Ｆｉｇ.９)
の３'末端から約４００bp上流のＰstＩ部位にあるメッ
セージ・センス配列を表すために１６マーのプライマー
４(５'−ＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧ)を合成し
た。オリゴ(dＴ)をプライマーとしてmＲＮＡを逆転写
し、二次鎖合成のためにプライマー４とＤＮＡポリメラ
ーゼを加え、次いで前記の如くＥcoＲＩに適応させたc
ＤＮＡをλＧＴ１０にライゲートした。３,０００,００
０個のプラークを、p３．１２上に含まれ、プライマー
４から下流側に存在する４１９bpのＰstＩ／ＨincＩＩ
フラグメントでスクリーンした。回収した４個のクロー
ンからＤＮＡを調製した。これを消化してマッピング
し、上記のＳＶ４０エクソン発現プラスミドを用いてエ
クソンであることが同定されたばかりの、更に下流のゲ
ノムフラグメントと、ブロット・ハイブリダイズさせ
た。４個の組換え体の内３個がハイブリダイズした。最
長のλ１０．４４は約１,８００塩基対であった。λ１
０．４４の配列は、二次鎖合成が、正にプライマー４か
ら始まっていることを示していた。これはＳＶ４０エク
ソン発現クローンＳ３６に含まれる全てのエクソン配
列、およびその他を含有していた。しかしながら、λ１
０．４４のオープン・リーデイング・フレームはcＤＮ
Ａの末端に連続していた。また、３'非翻訳領域、ある
いはポリ(Ａ)テールのいずれも見出されなかった。多
分、二次鎖合成は完全に行われなかったのであろう。
【０１４３】完全な３'末端を含有するクローンを見出
すために、同じフイルターを標識されたλ１０．４４か
らのＤＮＡを用いて再度スクリーンした。さらに２４個
のクローンを回収し、マッピングして２個の最も長いク
ローン(λ１０．３およびλ１０．９２)の配列決定を行
った。これらは実質上同じ配列であってλ１０．４４と
重複し、３'側に更に約１９００塩基対が付加された配
列を有していた。このＤＮＡ配列のλ１０．４４の末端
を越えて５１塩基対の位置にはＴＧＡ翻訳終止コドンが
あり、これに続いて１８０５塩基対の明らかに３'非翻
訳領域が存在していた。この領域を識別する上で特徴と
されるのは、３個のリーデイングフレームの全てに分散
して存在する停止コドン、およびポリ(Ａ)信号ＡＡＴＡ
ＡＡ(８９)であって、その１５塩基下流にcＤＮＡの末
端から延びるポリ(Ａ)を伴なうもの、を有することにあ
る(クローンλ１０．３はこの位置に８個のＡと、それ
に続いてＥcoＲＩアダプターを有し、他方λ１０．９．
２はその３'末端に１００以上のＡを有する)。
【０１４４】d．cＤＮＡの完全な配列 重複クローンの完全な配列をＦｉｇ.１０に示す。これ
は２３５１のアミノ酸を暗号化した連続的なオープン・
リーデイング・フレームで構成されている。１９個のア
ミノ酸から成る推定の末端信号ペプチドを考慮すると、
“成熟"タンパク質は２３３２個のアミノ酸から成ると
いえる。このタンパク質の分子量(計算値)は約２６７,
０００ダルトンである。グリコシル化の可能性を考慮す
れば、この値はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で求めた天然のタンパク質の分子量と近似した値であ
る。
【０１４５】“完全な"cＤＮＡの長さを約９０００塩基
対とすること(３'ポリ(Ａ)の長さに基く)は、ノーザン
・ブロット・ハイブリダイゼーションによって求めたm
ＲＮＡの長さと一致している。５'(アミノ末端暗号)領
域に含有されている配列は、２１０kＤの第ＶＩＩＩ因
子誘導物質のペプチド配列と実質上対応しており、ま
た、３'(カルボキシ末端暗号)領域に含有されているペ
プチド配列は８０kＤのタンパク質のペプチド配列と実
質上対応している。
【０１４６】８．組換え第ＶＩＩＩ因子の発現 a．全長に及ぶクローンの組立て 組換え第ＶＩＩＩ因子の発現のために、幾つかの別々の
cＤＮＡおよびゲノムクローンを合わせて７kbの全タン
パク質暗号領域を組立てた。以下、並びにＦｉｇ.１１
に、遺伝子の５'、中間および３'領域を含有する３種類
の中間体プラスミドの組立てについて記載した。これら
中間体を、発現プラスミド内でＳＶ４０アーリープロモ
ーターに続けて一緒にした。このプラスミドは、その末
端配列を変更し、異ったプロモーターおよび選択マーカ
ーを含有させ、多数の哺乳類細胞型の形質転換のための
種々の組立てにおける出発点として作用する。
【０１４７】５'暗号領域は、ＣlaＩ制限部位が第ＶＩ
ＩＩ因子信号配列のＡＴＧ開始コドンの前に位置する様
に、pＢＲ３２２誘導体内に結合される。この遺伝子内
には、これ以外のＣlaＩ部位が見られないので、この部
位は発現プラスミドの精製にとって重宝な部位となる。
便利なＣlaＩおよびＳacＩ部位を含有するプラスミドp
Ｔ２４−１０(６７a)をＨindＩＩＩで開裂し、ＤＮＡポ
リメラーゼでうめ、ＳacＩで切断した。第ＶＩＩＩ因子
cＤＮＡクローンλ１３．２の５'領域から１個の７７b
ＡluＩ／ＳacＩを回収し、このベクターにライゲートし
てpＦ８Ｃla−Ｓacと称する中間体を得た(ＡluＩ部位は
第ＶＩＩＩ因子の５'非翻訳領域中にあり、ＳacＩ部位
は開始コドンＡＴＧを１０b越えた、Ｆｉｇ.１０におけ
るヌクレオチド１０の位置にある;以下、全ての制限部
位を指すヌクレオチド位置は、Ｆｉｇ.１０に示す如く
開始コドンＡＴＧのＡから始まるものとする)。１１bp
のアダプター配列(アダプター配列５'ＡＴＣＧＡＴＡＡ
ＧＣＴはその全てをpＢＲ３２２から得た)を含有する８
５bＣlaＩ／ＳacＩフラグメントをpＦ８Ｃla−Ｓacから
単離し、λ１３．２から得た１８０１b ＳacＩ／Ｋpn
Ｉ(nuc．、ヌクレオチド番号１８１１)フラグメントと共
に、第ＶＩＩＩ因子のＨindＩＩＩフラグメント(nuc．
１０１９−２２７７)を含有するpＢＲ３２２サブクロー
ンから調製したＣlaＩ／ＫpnＩベクターにライゲートし
た。pＦ８Ｃla−Ｋpnと称するこの中間体は、６５の５'
非翻訳塩基対と１１塩基対のＣlaＩアダプター配列によ
って先行される、第ＶＩＩＩ因子の暗号ヌクレオチド配
列中最初の２２７７ヌクレオチド配列中最初の２２７７
ヌクレオチドを含有している。pＦ８Ｃla−ＫpnをＫpn
ＩおよびＳphＩで開裂する(pＢＲ３２２部分に含まれ
る)ことにより、λ１３．２のＥcoＲＩサブクローンか
ら導かれる４６６b ＫpnＩ／ＨindＩＩＩフラグメント
と、エクソンＢ含有サブクローンp２２２．８から導か
れる１６５４bＨindＩＩＩ／ＳphＩ(nuc．４００３)と
のライゲーションに用いるためのベクターフラグメント
が得られる。このことにより、第ＶＩＩＩ因子暗号配列
の最初の３９３１bを含有するpＦ８Ｃla−Ｓphが生産さ
れる。
【０１４８】暗号領域の中間部分は、３種のpＢＲ３２
２／cＤＮＡクローンまたはサブクローンのフラグメン
トを結合させることからなる３成分(three−piece)ライ
ゲーションによって導かれた。p３．４８をＢamＨＩ(nu
c．４７４３)およびＳalＩ(pＢＲ３２２のtet領域中に
ある)で開裂し、ベクターとして用いた。これらの部位
に、p３．１２からの７７８bＢamＨＩ／ＮdeＩ(nuc．５
５２０)とサブクローンpλ１０．４４Ｒ１．９からの２
１０６bＮdeＩ／ＳalＩ(pＢＲ３２２中)とをライゲート
した。適切にライゲートされることにより、テトラサイ
クリン耐性プラスミドであるpＦ８Ｓca−ＲＩが得られ
た。
【０１４９】第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡの大多数の３'部分
をＳＶ４０発現ベクター内に直接クローンした。得られ
たプラスミドpＣＶＳＶＥＨＢＶはＳＶ４０アーリープ
ロモーターを含有しており、この後方に、ポリリンカー
並びに肝炎Ｂ表面抗原に関する遺伝子が存在する。
【０１５０】[pＣＶＳＶＥＨＢＶ(あるいはpＣＶＳＶＥ
ＨＢＳとも表す)は、p３４２Ｅ(７３)が僅かに変化した
ものである。本発明では、pＣＶＳＶＥＨＢＶを、特
に、下記の如くにして調製した:ＳＶ４０複製起源(７
４)を囲む５４０bpのＨindＩＩＩ−ＨindＩＩＩフラグ
メントをプラスミドpＭＬ(７５)のＥcoＲＩ部位とＨind
ＩＩＩ部位との間にライゲートした。プラスミドＥcoＲ
Ｉ部位とＳＶ４０ＨindＩＩＩ部位とを、ＨindＩＩＩ消
化に先立ち、４個のdＮＴＰの存在下クレノーポリメラ
ーゼＩを加えることにより、平滑末端処理した。得られ
たプラスミドpＥＳＶをＨindＩＩＩおよびＢamＨＩ消化
に付し、２９００bのベクターフラグメントを単離し
た。このフラグメントに、ＥcoＲＩ部位にポリリンカー
(複数の制限部位を含むＤＮＡフラグメント)を含有すべ
く修飾されたＨＢＶから得た２０２５bのＨindＩＩＩ−
ＢglＩＩフラグメントをライゲートした。このＨＢＶフ
ラグメントは表面抗原遺伝子を包含しており、クローン
されたＨＢＶＤＮＡ(７４)からＥcoＲＩ−ＢglＩＩ消化
を介して得られる。二本鎖のリンカーＤＮＡフラグメン
ト(５'dＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴ
Ｃ３'…)をＨindＩＩＩとＥcoＲＩで消化し、ＨＢＶフ
ラグメントに加えることにより、ＥcoＲＩ−ＢglＩＩフ
ラグメントをＨindＩＩＩ−ＢglＩＩフラグメントに変
換した。このことは、リンカー、ＨＢＶフラグメントお
よびベクターから成る３成分ライゲーションによっても
行うことができるが、最初にＨindＩＩＩ−ＥcoＲＩリ
ンカーをクローンされたＨＢＶＤＮＡに加え、次にこの
プラスミドを該当する酵素と共に共消化することによ
り、ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩフラグメントを生成させる
方法が好都合であり、この様にして実施した。得られた
プラスミドpＣＶＳＶＥＨＢＶは、pＭＬから導かれたp
ＢＲ３２２の細菌性複製起源、同じくpＭＬから導かれ
たアンピシリン耐性マーカー、アーリープロモーターが
挿入されたＨＢＶフラグメントの転写を指令する様な方
向性をとっているＳＶ４０フラグメント、並びにＨＢＶ
からの表面抗原遺伝子を含有している。ＨＢＶフラグメ
ントは、哺乳類細胞の細胞質内で通常生成されている様
な、ポリアデニル化mＲＮＡを生産するための、ポリア
デニル化信号を与えるものでもある。]
【０１５１】プラスミドpＣＶＳＶＥＨＢＶはポリリン
カー内のＸbaＩ部位の５'側に隣接して有用なＣlaＩ部
位を含有している。このプラスミドをＸbaＩおよびＢam
ＨＩ(肝炎Ａgの３'非翻訳領域にある)で開裂し、両末端
をＤＮＡポリメラーゼで埋めた。このことによって肝炎
表面抗原暗号領域は除去されたが、その３'ポリアデニ
ル化信号領域、並びにＳＶ４０プロモーターは保持され
ている。このベクターに、cＤＮＡクローンの１０．３
から得た１８８３bＥcoＲＩフラグメント(両末端を埋め
たもの)をライゲートした。このものは第ＶＩＩＩ因子
の最後の７７の暗号塩基対、１８０５bの３'非翻訳領
域、８個のアデノシン残基、および埋め込み処理された
ＥcoＲＩアダプターを含有している。埋め込まれた(fil
led in)制限部位の結合により、５'末端のＥcoＲＩ末
端は回復した(埋め込まれたＸbaＩが同様のＥcoＲＩに
結合)が、３'末端は破壊された(うめ込まれたＥcoＲＩ
が同様のＢamＨＩに結合)。このプラスミドをpＣＶＳＶ
Ｅ／１０．３と称した。
【０１５２】完成した第ＶＩＩＩ因子のcＤＮＡ領域を
３成分ライゲーションで結合させた。pＣＶＳＶＥ／１
０．３をＣlaＩおよびＥcoＲＩで開裂し、pＦ８Ｃla−
Ｓcaからの３８７０bＣlaＩ／ＳcaＩフラグメントおよ
びpＦ８Ｓca−ＲＩからの３１８２bＳcaＩ／ＥcoＲＩフ
ラグメントを挿入するためのベクターとして用いた。こ
の発現プラスミドをpＳＶＥＦＶＩＩＩと称する。
【０１５３】b．組織培養細胞内で第ＶＩＩＩ因子を発
現させるための組立て ＰＳＶＥＦＶＩＩＩの変種ベクターは、アデノウイルス
・メジャー・レート・プロモーター、三部から成るリー
ダー配列および短縮された第ＶＩＩＩ因子の３'非翻訳
領域を含有しており、それは、安定にＢＨＫ細胞にトラ
ンスフエクトされた場合、活性な第ＶＩＩＩ因子を生産
する。
【０１５４】活性な第ＶＩＩＩ因子を生産する発現プラ
スミドpＡＭ３p・８clの組立て模式図をＦｉｇ.１２に
示す。この組立てに際しては、まず、pＦＤ１１(４９r)
内のＳstＩＩ部位およびpＥＨＥＤ２２(４９y)内のＣla
Ｉ部位をクレノーＤＮＡポリメラーゼＩで除去した。こ
れらの部位は、これらプラスミドのＤＨＦＲ遺伝子の
３'および５'非翻訳領域にある。ついで、これらの欠失
部位を有するフラグメント、およびpＣＶＳＶＥＨＢＳ
(上記)からのＢ型肝炎表面抗原遺伝子からなる３部分ラ
イゲーションを行なうことにより、唯１個のＣlaＩおよ
び１個のＳstＩＩ部位をするベクターpＣＶＳＶＥＨＥ
Ｄ２２△ＣＳが生成された。組立てられた第ＶＩＩＩ因
子遺伝子(Ｆｉｇ.１１)を含有するプラスミドpＳＶＥＦ
ＶＩＩＩをＣlaＩおよびＨpaＩで開裂し、全暗号領域と
約３８０bの３'非翻訳領域とを得た。これをＣlaＩ、Ｓ
stＩ欠失ベクターの単１のＣlaＩおよびＨpaＩ部位に挿
入して表面抗原遺伝子と置き換えることにより、発現プ
ラスミドpＳＶＥ．８clＤを得た。
【０１５５】別個に、三部からなる５'リーダー配列を
伴なうアデノウイルス・メジャー・レート・プロモータ
ーを、アデノウイルスゲノム一部分である２つのサブク
ローンから、ＤＨＦＲ発現プラスミドpＥＨＤ２２(４９
y)と一緒に組立てた。２つのアデノウイルス・サブクロ
ーンpuＣＨＳＸおよびpＭＬＰ２の組立て方法は、実験
方法の項に記載されている。pＭＬＰ２は、pＵＣ１３
(５９)のＳstＩ〜ＨindＩＩＩ部位にクローンされた、
アデノウイルス・コ・オーデイネーツ１５．４〜１７．
１のＳstＩ〜ＨindＩＩＩフラグメントを含有してい
る。また、pＵＣＨＳＸは、pＵＣ１３のＨindＩＩＩ〜
ＳalＩ部位にクローンされた、コ・オーデイネーツ１
７．１〜２６．５のＨindＩＩＩ〜ＸhoＩフラグメント
を含有している。これらの２つのアデノウイルスフラグ
メントは、それらをＨindＩＩＩ部位で結合することに
より、アデノウイルスのメジャー・レート・プロモータ
ー、最初の２つのエクソンおよびイントロンの全て、並
びに第３番目のエクソンの内、５’非翻訳領域内のＸｈ
ｏＩ部位までの部分を含有することになる。
【０１５６】３部分ライゲーションによってアデノウイ
ルスプロモーターはプラスミドpＡＭＬ３Ｐ．Ｄ２２内
のＤＨＦＲ遺伝子の先端に結合される。また、このこと
で、アデノウイルスの三部からなる５'リーダー配列の
第３番目のエクソン内にある前記ＸhoＩ部位から少し後
方にＣlaＩ部位が配されることになる。最後に、第ＶＩ
ＩＩ因子発現プラスミドpＳＶＥ．８c１ＤのＳＶ４０ア
ーリー・プロモーターをＣlaＩおよびＳalＩで除去し、
ＳＶ４０アーリー／アデノウイルス・タンデムプロモー
ター(Ｆｉｇ.１２参照)で置き換えることにより最終的
な発現プラスミドpＡＭＬ３Ｐ．８clを生成させた。こ
のプラスミドは、第ＶＩＩＩ因子の５'非翻訳領域に向
う第３番目のエクソン内でスプライス(切断)されてい
る。アデノウイルスの三部からなるリーダー配列を含有
している。この後方には、第ＶＩＩＩ因子の全長につい
ての構造遺伝子の配列がその信号配列と共に含有されて
いる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の３'非翻訳領域は、Ｂ型
肝炎表面抗原遺伝子の３'非翻訳領域に向うＨpaＩ部位
でスプライスされている。この後方には、ＳＶ４０のア
ーリープロモーターと機能的なポリアデニル化信号とを
付与する肝炎３'非翻訳領域を有するＤＨＦＲ遺伝子が
続く。
【０１５７】第ＶＩＩＩ因子発現プラスミドpＡＭＬ３
p．８c１を、ネオマイシン耐性ベクターpＳＶＥneoＢa
１６(ＡＴＣＣ Ｎo．ＣＲＬ８５４４、１９８４．４月
２０日ブダベスト条約に基き寄託)と共にＢＨＫ細胞に
コ・トランスフエクトした。これらの細胞をまずＧ４１
８で選択し、次いでメトトレキセーキで選択した。
【０１５８】ＢＨＫ細胞系列から生産された第ＶＩＩＩ
因子ＲＮＡの最初の特徴づけは、ポリ(Ａ)+細胞質ＲＮ
Ａと、32Ｐ標識第ＶＩＩＩ因子ＤＮＡプローブとのハイ
ブリダイゼーションによる、ノーザン分析法によって行
われた。この分析において長さ約９kbに相当するバンド
が認められた。ハイブリダイゼーションの強さに基く
と、このバンドはＣＨ−２細胞系列内に認められる９kb
のバンドに比べて約１００〜２００倍、豊富化されてい
た。
【０１５９】９．組換え第ＶＩＩＩ因子の同定 a．ラジオイムノアッセイ ラジオイムノアッセイは文献記載の如く、ＢＨＫ第ＶＩ
ＩＩ因子産生性細胞から得た上澄みと溶解細胞とを用い
て行った。表１は、この上澄液(これは第ＶＩＩＩ因子
活性を含有している)(９６参照)が、これらＲＩＡによ
る判定に基き、略等量の、第ＶＩＩＩ因子の２１０kＤ
(Ｃ１０)および８０kＤ(Ｃ７Ｆ７)部分をも含有してい
ることを示すものである。第ＶＩＩＩ因子は、細胞溶解
物に対する両ＲＩＡ法によっても検出された。第ＶＩＩ
Ｉ因子を発現しない対照細胞系列は０．００１単位／ml
以下のＲＩＡ値を産生するにすぎない。
【０１６０】
【表１】 pＡＭＬ３Ｐ．８clでトランスフエクトしたＢＨＫ細胞系列の第ＶＩＩＩ因子 ラジオイムノアッセイ Ｃ１０ Ｃ７Ｆ７ 細胞上澄液 実験１ ０．１４Ｕ／ml ０．０７７ 実験２ ０．０２２ ０．０２１ 細胞溶解物 実験１ ０．４２ ０．０１６ Ｉ125cpmバンドを正常血漿の希釈度に基く標準曲線を用
いて単位／mlに変換した。これらの値は全てバック・グ
ラウンドを著しく上向っていた。検出限界は、Ｃ１０分
析に関して０．００５Ｕ／ml、Ｃ７Ｆ７分析に関して
０．０１Ｕ／mlであった。
【０１６１】b．ＢＨＫ細胞培地の比色分析(Ｃhromogen
ic assay) 表２に示す如く、これらの細胞が生じた培地をコアテス
ト分析(Ｃoatest assay)で検査すると、４０５nmに吸
収を示した。上記の如く、この分析法は第Ｘ因子の活性
化における第ＶＩＩＩ因子の活性に特異的である。第Ｖ
ＩＩＩ因子に対する特異的モノクローナル抗体を加える
ことにより第Ｘa因子の生産量が減少されることは、培
地の吸収が、抗体を加えることによって０．１５５から
０．０３(ブランク値を差し引いた値)に減少することで
証明できる。従って、この細胞は、第ＶＩＩＩ因子活性
に特異的な分析法において機能的な活性であって、第Ｖ
ＩＩＩ因子の特異抗体によって中和される活性を生産す
る。
【０１６２】この培地を第ＩＸa因子、第Ｘ因子、およ
びりん脂質を含有しない反応混合物中でインキュベート
したところ、ブランク値を越える程の、４０５nmにおけ
る吸収の増加を示さなかった。従って、観察された活性
はプロテアーゼによる基質の非特異的開裂、および、第
ＶＩＩＩ因子に対する特異抗体による中和によるもので
ないことが明らかである。
【０１６３】
【表２】 比色分析法１によるＢＨＫ細胞系列の第ＶＩＩＩ因子活性の測定 吸収(４０５nm) 試 料 吸収(４０５nm) 対照値を補正 培地 ０．１９３ ０．１５５ 緩衝液対照2 ０．０３８ (０．０) 培地＋第ＶＩＩＩ因子抗体3 ０．０６４ ０．０３０ 緩衝液対照2＋第ＶＩＩＩ因子抗体 ０．０３４ (０．０) １．反応は次の様に修飾して行った:５０μgずつの１Ｘ
a／Ｘ／りん脂質、ＣaＣl2および１−１００倍希釈した
試料を３７℃で１０分間インキュベートした。Ｓ２２２
２(５０μl)を加え、３７℃で６０分間経過した後、５
０％酢酸１００μlで反応を終了させた。 ２．試料の代りに緩衝液(０．０５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ
７．３)、ウシ血清アルブミン０．２％含有)を用いた。 ３．抗体はＣ８とＣ７(１０μgづつ)の混合物である。
分析に先立ち、培地を５分間プレインキュベートした。
【０１６４】c．モノクローナル樹脂上、培地のクロマ
トグラフィー 第ＶＩＩＩ因子活性含有培地を含む血清を既述(上記)の
如くＣ８モノクローナル抗体(ＡＴＣＣ Ｎo．４０１１
５、１９８４年４月２０日寄託前記ＣＲＬ８５４４と同
条件で入手可能)カラムでクロマトグラフした。溶離し
たフラクションを１:１００に希釈し、活性を分析し
た。ピークを示す希釈フラクション５０μlに血漿中の
第ＶＩＩＩ因子活性を中和する、既知の様々なモノクロ
ーナル抗体を加えた。その結果を表３に示す。この表
は、カラムから溶離した第ＶＩＩＩ因子活性(培地内の
それよりもはるかに濃縮されている)もまたこれらの第
ＶＩＩＩ因子抗体によって中和されることを示してい
る。
【０１６５】
【表３】 モノクローナル抗体溶出液のピーク・フラクションの比色分析1 試 料 吸収(４０５nm1) ピーク・フラクション2 ０．１８６ ピーク・フラクション＋第ＶＩＩＩ因子抗体3 ０．０６０ 緩衝液対照 ０．０００ 緩衝液対照＋第ＶＩＩＩ因子抗体 ０．０４５ １．分析は以下の如くにして行った:希釈した試料５０
μlをＩＸa／Ｘ／りん脂質溶液５０μlと３７℃で５分
間インキュベートした。この反応混合物をＣaＣl2５０
μlとインキュベートし、３７℃で１０分間進行させ
た。次いで発色性基質(５０μl)を加え、１０分後に５
０％酢酸１００μlを加えて反応を終了させた。 ２．ピーク・フラクションを、分析のために０．１５Ｎ
aＣlを含有する０．０５Ｍトリス(pＨ７．２)で１:１０
０に希釈した。 ３．抗体として、１０μlのシムバイオテイック抗体(Ｓ
ym biotic antibody)を、希釈した試料に加え、室温
で５分間インキュベートした。
【０１６６】d．精製第ＶＩＩＩ因子の凝固活性 細胞培地中に検出した活性を、Ｃ８モノクローナル樹脂
(上記)を通すことによって精製し、濃縮した。ピーク・
フラクションを、０．１５ＭＮaＣl、０．０２Ｍグリシ
ン・エチルエステル、０．０１ＭＣaＣl2および１０％
グリセリンを含有する０．０５Ｍイミダゾール(pＨ６．
９)に対して透析し、溶離緩衝液を除去した。活性なピ
ーク・フラクションをとり、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿内
での凝固分析により、分析した(表４)。フイブリン・ク
ロット(凝固)は８４秒後に認められた。無添加の場合に
は、血友病血漿は１０４．０秒後にクロットを形成し
た。従って、この溶離フラクションは血友病血漿におけ
る凝固欠損を修正するといえる。正常なヒト血漿を希釈
し、同様にして分析した。この血漿から求めた標準曲線
から、溶離フラクションは約０．０１単位／mlの第ＶＩ
ＩＩ因子凝固活性を示すことが示唆された。
【０１６７】
【表４】 モノクローナル抗体精製第ＶＩＩＩ因子の凝固活性 クロッテイング時間 試 料 (秒) 組換え第ＶＩＩＩ因子1a ８６．５ 組換え第ＶＩＩＩ因子1a＋Ｃ７Ｆ７抗体 １０１．３ 対照2 １０１．３ 組換え第ＶＩＩＩ因子1b ８２．４ 組換え第ＶＩＩＩ因子1b＋１０λ シンバイオテイック抗体 １１０．６ 対照2 ９５．５ １．第ＶＩＩＩ因子はＣ８モノクローナル樹脂から溶離
したピークフラクションを１時間半(１a)または２時間
(１b)透析し、溶離緩衝液を除くことにより、得られ
た。 ２．対照緩衝液は０．０５Ｍトリス(pＨ７．３)に０．
２％ウシ血清アルブミンを含有せしめたものである。
【０１６８】e．精製第ＶＩＩＩ因子のトロンビン活性
化作用 凝固活性がトロンビンによって賦活化されることは、第
ＶＩＩＩ因子の性質として良く知られている。モノクロ
ーナルカラムから溶離したフラクションについて、この
性質を調べた。溶離緩衝液(上記)を除くために試料を透
析した後、溶出液を０．１５ＭＮaＣl、０．０２Ｍグリ
シン・エチルエステル、０．０１ＭＣaＣl2および１０
％グリセリンを含有する０．０５Ｍイミダゾール(pＨ
７．６)１００μlで希釈した。この希釈液を更に希釈し
ていかなる溶離緩衝液(これはトロンビンの機能を妨害
するかもしれない)も残存させないようにすると共に、
反応混合物のpＨを高めた。この溶液にトロンビン(２５
ng)を加え、室温で反応を行った。様々な時点で２５μl
づつをとり、１:３に希釈して凝固活性を調べた。結果
をＦｉｇ.１７に示す。第ＶＩＩＩ因子活性は、該活性
について予測される通り、時間の経過と共に増加し、次
いで減少している。添加量のトロンビンがこの分析の観
察期間中、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿を凝固させないこ
と、さらに、認められた凝固時間のトロンビン依存性の
増加、その後の減少、に基く観察時間は、この実験でモ
ニターしている活性そのものが実際に、トロンビンによ
る第ＶＩＩＩ因子の賦活性によるものであることを証明
している。トロンビンによる活性化の観察結果(約２０
倍)は、血漿第ＶＩＩＩ因子に関する観察結果と一致し
ている。
【０１６９】f．組換え第ＶＩＩＩ因子の固定化フオン
・ウイルブランド・セファロースへの結合 第ＶＩＩＩ因子は血漿中でフオン・ウイルブランド因子
(vＷＦ)と可逆的なコンプレックスを形成して循環して
いることが知られている(１０−２０)。従って、有用な
形の組換え第ＶＩＩＩ因子は、それが第ＶＩＩＩ因子で
あることを確認するために、その様なコンプレックスを
形成する能力を有していなければならない。加えて、そ
の様なコンプレックスを形成する能力を有することは、
組換え第ＶＩＩＩ因子が、血友病患者に注入投与された
時、天然の活性な循環形である第ＶＩＩＩ因子／vＷＦ
コンプレックスを形成することができることを証明する
ものである。組換え第ＶＩＩＩ因子の、vＷＦと相互作
用する能力を試験するために、以下に示す如くvＷＦを
精製し、樹脂に固定化した:
【０１７０】ヒトフオン・ウイルブランド因子は、０．
１５ＭＮaＣlを含有する０．０５Ｍトリス(pＨ７．３)
で平衡させたセファロースＣＬ４Ｂ樹脂を用いたクロマ
トグラフィーにヒト第ＶＩＩＩ因子濃縮物(例えば、カ
ッター・ラボラトリーズ(Ｃutter Ｌaboratories)から
購入できる)をかけることにより、調製された。フオン
・ウイルブランド因子はカラムの空容量の溶出量で溶離
する。この範囲をプールし、飽和濃度の４０％の硫酸ア
ンモニウムで沈澱させて濃縮し、これを、フオン・ウイ
ルブランド因子に由来する、第ＶＩＩＩ因子の凝固活性
を分離するために、０．２５ＭＣaＣl2を含有する上記
の緩衝液の存在下、カラムクロマトグラフィーに付し
た。再び空(カラムの)容量のフラクションをプールして
硫酸アンモニウムを用いて濃縮し、０．１Ｍ重炭酸ナト
リウムに対して透析した。得られた製品を業者指示の如
く臭化シアンで活性化したセファロース(ファルアシア
(Ｐharmacia)から購入)に共有結合的に結合させた。こ
のカラムを０．０５ＭＮaＣlおよび０．２５ＭＣaＣl2
を含有する０．０２Ｍトリス(pＨ７．３)で洗浄して非
結合タンパク質を除いた。組換え第ＶＩＩＩ因子を血清
不含媒質中で調製し、室温で、vＷＦ樹脂１．０mlのカ
ラムに適用した。
【０１７１】このカラムを洗浄して非結合タンパク質を
除き、０．０５ＭＮaＣlおよび０．２５ＭＣaＣl2を含
有する０．０２Ｍトリス(pＨ７．３)で溶離した。１．
０mlのフラクションを集めて１:１０に希釈し、分析し
た。結果を表５に示す。第ＶＩＩＩ因子活性は培地から
カラムに吸収されている。次いでこの活性は、ヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子について予測される様に、高い塩濃度で溶離
された(表５)。従って、ＢＨＫ細胞によって生産された
第ＶＩＩＩ因子はフオン・ウイルブランド因子と特異的
な相互作用をする能力を有するものである。
【０１７２】
【表５】 試 料 吸収(４０５nm1) 細 胞 培 地 ０．１４３ 洗 浄 液 ０．０１５ 溶離フラクション１ ０．０００ 〃 ２ ０．４１０ 〃 ３ ０．０９３ 〃 ４ ０．０１７ 〃 ５ ０．０００ 〃 ６ ０．０００ １)分析法は、全てのものを１／２の容量に減じた外は
業者の指示通りである。
【０１７３】10．融合タンパク質の分析 ここに述べる一連の実験は、クローンによって血漿中の
ポリペプチドと一緒に暗号化されているタンパク質を免
疫学的に同定することにある。この目的は、遺伝子の一
部を大腸菌内で融合タンパク質として発現させることに
より、達成された。クローンされた遺伝子の暗号配列の
内、全てまたは一部を、抗体を生成させるのに適当な物
質が与えられる様、所望の形に発現させることができ
る。これら、クローンされたタンパク質の所望の領域に
特異的な抗体を、タンパク質の分析および精製に用いる
ことができる。この目的の下、一連の大腸菌／第ＶＩＩ
Ｉ因子“融合タンパク質"が調製された。第ＶＩＩＩ因
子クローンのフラグメントを、その第ＶＩＩＩ因子の暗
号配列が適当な解読枠内で、Ｅ．colitrpＬＥ融合タン
パク質(４８、７０、７１)の最初の１２アミノ酸と結合
する様、プラスミドpＮＣＶ(７０)のＢglＩＩ部位にラ
イゲートした。この強力なtrpプロモーター系の下で
は、通常、実質的な量の組換えタンパク質産物が生産さ
れる。
【０１７４】第ＶＩＩＩ因子の１８９bpＳtuＩ／Ｈinc
ＩＩフラグメント(アミノ酸１７９９−１８６０を暗号
化している)を単離し、これをpＵＣ１３(４９k)のＳma
Ｉ部位にライゲートしてpfus１を組立てた。この中間体
プラスミドをＢamＨＩおよびＥcoＲＩ消化して２００bp
フラグメントをpＮＣＶ(７０)(これから５２６bpのＢｇ
ｌＩＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントが回収された)に挿入
した。プラスミドpfus１はtrpプロモーターのコントロ
ール下で、１６trpＬＥと、リンカーにより暗号化され
ているアミノ酸、次いで６１個の第ＶＩＩＩ因子残基、
最後の９個の、リンカー暗号化残基およびtrpＥカルボ
キシ末端残基とで構成される１０kＤの融合タンパク質
を産生する。
【０１７５】pfus３は、第ＶＩＩＩ因子の２９０bpＡva
ＩＩフラグメント(アミノ酸１０００〜１０９６)を除去
し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントを用い
て突出したヌクレオチドを埋め、この平滑末端化された
ＤＮＡフラグメントを既にＢglＩＩで切断されているp
ＮＣＶにライゲートし、同様にして埋めることにより、
組立てられた。適切な方向性でフラグメントが充填され
た(制限的消化とＤＮＡ配列決定に基く)このプラスミド
は、１９２アミノ酸のtrpＬＥタンパク質に囲まれた９
７個の第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸を含有する、約４０k
Ｄの融合タンパク質の合成を指令する。
【０１７６】第ＶＩＩＩ因子サブクローンλ２２２．８
をＢanＩで切断し、突出部をヌクレアーゼＳ1で逆向き
に消化した後、ＰstＩ消化して得られた５２５bpの平滑
末端／ＰstＩフラグメント(アミノ酸７１０−８８５)を
単離することにより、pfus４を得た。これをＢglＩＩで
消化したpＮＣＶにライゲートし、ＰstＩ消化して得ら
れたベクターフラグメントを単離した。pfus４は第ＶＩ
ＩＩ因子の１７５アミノ酸と、それに続くtrpＬＥの最
初の１２アミノ酸を含有する２２kＤの融合タンパク質
の合成を指令する。
【０１７７】この融合タンパク質を精製し、上記の如く
抗体を生成させるためにウサギに注射した。これらの抗
体の血漿融導第ＶＩＩＩ因子との結合性をウエスタンブ
ロット法で試験した。
【０１７８】それらウエスタン・トランスフアーの結果
をＦｉｇ.１３に示す。各融合タンパク質は血漿第ＶＩ
ＩＩ因子と反応した。融合物１は８０,０００ダルトン
のポリペプチドを暗号化している遺伝子の領域から生成
された。融合タンパク質１の抗血清は８０,０００ダル
トンのバンドとのみ結合し、より大きい分子量のタンパ
ク質とは反応しないことがわかる。融合タンパク質３お
よび４の抗血清は８０,０００ダルトン以上のタンパク
質と交差反応するが８０,０００ダルトンのバンドとは
結合しないことが示されている。モノクローナル抗体Ｃ
８は第ＶＩＩＩ因子に対向する中和モノクローナル抗体
であって、２１０,０００ダルトンのタンパク質と反応
することが知られている。Ｆｉｇ.１４は、融合タンパ
ク質４がこのモノクローナル抗体と結合することを示し
ており、従って、Ｃ８で確認し得るアミノ酸配列が融合
ポリペプチド４によって暗号化されていることを証明し
ている。このことは更に、融合タンパク質４が２１０,
０００ダルトンのタンパク質を暗号化しているタンパク
質配列を含有するという同定を支持するものである。上
記の研究結果は、この遺伝子が２１０,０００および８
０,０００ダルトンの両タンパク質に対するアミノ酸配
列を暗号化していることを証明するものである。
【０１７９】11．医薬組成物 本発明の化合物群は薬学的に有用な組成物についての既
知の製造方法に従い、本発明の方法で得た第ＶＩＩＩ因
子産物を薬学的に許容し得る担体ビヒクルと混合するこ
とにより、製剤化することができる。適当なビヒクル、
およびその他のヒトタンパク質(例えばアルブミン)を含
む製剤は例えばレミントンのフアーマシューティカルサ
イエンス(Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences)
(Ｅ．Ｗ．Ｍartin)に記載されている。その様な組成物
は、宿主に効果的に投与するのに適した薬学的に許容し
得る組成物を調製するために、有効量の本発明のタンパ
ク質と適当量のビヒクルとを含有している。本発明のヒ
ト第ＶＩＩＩ因子を、例えば血友病に罹患している患者
に非経口投与することができる。
【０１８０】通常、血友病治療時の平均投与量は出血病
状の重篤度によって変動する。静脈内投与における平均
投与量は次の通りである:術前の指示量、４０単位／Ｋ
g;少量の出血、１５〜２０単位／Ｋg;維持量、８時間に
２０〜４０単位／Ｋg。
【０１８１】以下に本明細書中に引用した参考文献を示
す。文献目録 １．ヘモスタシスおよびトロンボシス(Ｈemostasis an
d Ｔhrombosis),ＢloomおよびＴhomas,編Ｃhurchill,
Ｌivingstone,ＮＹ(１９８１)． ２．Ｄavie,らアニュアル・レビューズ・オブ・バイオ
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(１９７６)．
【図面の簡単な説明】
【図１】 血液凝固の表面−媒介活性化を示す、凝固カ
スケード(２)(内在系)のダイアグラムの前半である。
【図２】 血液凝固の表面−媒介活性化を示す、凝固カ
スケード(２)(内在系)のダイアグラムの後半である。
【図３】 ＴＭＡＣlまたは６×ＳＳＣ内でのλＤＮＡ
の融解点を示すグラフである。
【図４】 ＴＭＡＣlまたは６×ＳＳＣ内でのｐＢＲ３
２２ ＤＮＡの融解点を示すグラフである。
【図５】 プローブ８．３を用いた第ＶＩＩＩ因子の検
出状況の写真の模写図である。
【図６】 ヒト第ＶＩＩＩ因子の遺伝子地図である。
【図７】 コスミッドベクターpＧcos４の制限サイト地
図である。
【図８】 pＥＳＶＤＡの制限サイト地図である。
【図９】 pＥＳＶＤＡベクターからのＲＮＡ転写物に
関する解析像を示す写真の模写図である。
【図１０】 pＥＳＶＤＡ．Ｓ１２７cＤＮＡクローンＳ
３６の配列式の模式図である。
【図１１】 cＤＮＡのクローニングに関する模式図で
ある。
【図１２】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その１)。
【図１３】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その２)。
【図１４】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その３)。
【図１５】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その４)。
【図１６】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その５）。
【図１７】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である（その６)。
【図１８】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その７)。
【図１９】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その８)。
【図２０】 ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の配列を示す模
式図である(その９)。
【図２１】 完全な長さのヒト第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡ
を含有する組換えプラスミドpＳＶＥＦＶＩＩＩの組立
て模式図である(その１)。
【図２２】 完全な長さのヒト第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡ
を含有する組換えプラスミドpＳＶＥＦＶＩＩＩの組立
て模式図である(その２)。
【図２３】 完全な長さのヒト第ＶＩＩＩ因子cＤＮＡ
を含有する組換えプラスミドpＳＶＥＦＶＩＩＩの組立
て模式図である(その３)。
【図２４】 第ＶＩＩＩ因子発現プラスミドpＡＭＬ３
p．８c1の組立て模式図である(その１)。
【図２５】 第ＶＩＩＩ因子発現プラスミドpＡＭＬ３
p．８c1の組立て模式図である(その２)。
【図２６】 第ＶＩＩＩ因子発現プラスミドpＡＭＬ３
p．８c1の組立て模式図である(その３)。
【図２７】 融合タンパク質抗血清を用いたウエスタン
ブロッテイング法による第ＶＩＩＩ因子解析像の模写図
である。
【図２８】 融合タンパク質の解析像の模写図である。
【図２９】 第ＶＩＩＩ因子の高速液体クロマトグラフ
ィーにおける溶離曲線の模写図である。
【図３０】 第ＶＩＩＩ因子のトリプシン処理ペプチド
の逆相ＨＰＬＣによる溶離曲線の模写図である。
【図３１】 トロンビンによる組換えヒト第ＶＩＩＩ因
子活性化作用を表す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ゴードン・アレン・ビーハー アメリカ合衆国カリフォルニア94070、 サン・カーロス、メイプル・ウェイ14番 (72)発明者 ウィリアム・アーウィン・ウッド アメリカ合衆国カリフォルニア94402、 サン・マテオ、タリータウン・ストリー ト1400番 (56)参考文献 特開 昭61−500646（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−185723（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ 〜79！ （1989） Ｐ. 1648−1652

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記のアミノ酸配列またはそのアミノ酸の置換、欠
    失、挿入または転換により誘導されるアミノ酸配列を有
    する、ヒト以外の哺乳動物細胞によって生産された組換
    えヒト第VIIIポリペプチドであって、ヒト第VIII因子欠
    損症を修正する能力を有し、ヒト細胞内でのグリコシル
    化パターンと異なるグリコシル化パターンを有する組換
    えヒト第VIII因子ポリペプチド。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 ２．下記のアミノ酸配列またはそのアミノ酸の置換、欠
    失、挿入または転換により誘導されるアミノ酸配列をコ
    ードするＤＮＡを、該ＤＮＡでトランスフェクトされた
    哺乳動物細胞中で発現させることからなる、ヒト第VIII
    因子欠損症を修正する能力を有すると共にヒト細胞内で
    のグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターン
    を有する機能的な組換えヒト第VIII因子ポリペプチドの
    製造方法。 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 ３．ａ）下記のアミノ酸配列： 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【化２１】 【化２２】 【化２３】 【化２４】 もしくは下記のアミノ酸配列： 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 を有するヒト第VIII因子ポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ、ＤＨＦＲ増幅可能遺伝子にかかる第２のＤＮＡ、お
    よび選択可能標識遺伝子にかかる第３のＤＮＡで哺乳類
    動物細胞を同時トランスフェクトし、 ｂ）トランスフェクトされた細胞を非選択培地で生育さ
    せ、 ｃ）トランスフェクトされた細胞を選択培地に移し、上
    記の選択可能標識耐性細胞について選択し、 ｄ）段階ｃ）で選択した細胞を、選択剤を増量した培地
    中で培養することによって該ＤＨＦＲ増幅可能遺伝子を
    増幅させることからなる請求項２の方法。 ４．該選択可能標識遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子で
    ある請求項３の方法。 ５．ネオマイシン耐性を付与する該選択可能標識遺伝子
    がネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である
    請求項４の方法。
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