JP2799338B2 - 機能的な第▲ｖ▼▲ｉ▼▲ｉ▼▲ｉ▼因子の製造方法 - Google Patents

機能的な第▲ｖ▼▲ｉ▼▲ｉ▼▲ｉ▼因子の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明はヒト第VIII因子、その新規な形態、それを含
有する組成物に関し、更に詳しくはヒト第VIII因子の機
能的な種（機能種）を製造するための手段および方法、
特に組換えDNA技術を利用して製造する手段および方法
に関するものである。 本発明は、一部にはヒト第VIII因子のDNA配列および
推定アミノ酸配列の発見に基き、また一方では第VIII因
子に随伴する成分が、機能的で生物学的に活性であると
いう事実の発見に基いている。この発見は、組換えDNA
技術を適用することによつて種々の形態の第VIII因子を
生産したことにより、そしてその結果、生物学的な試験
を行つてそれらの生物学的な機能を解明するのに、質的
にも量的にも充分な物質を生産することが可能となつた
ということにより実現された。この結果、遺伝子操作と
インビトロでのプロセツシングにより、第VIII因子の機
能的な種を随意に調製し、これまでなし得なかつた、商
業的に実用的な量の活性第VIII因子産物を効率良く生産
する、ということが可能となつた。本発明は、これらの
派生的な態様を、あらゆる観点において包含するもので
ある。 本発明の技術的背景を明らかにし、また、時にはその
実際面での詳細な事柄を補足するのに用いられる種々の
出版物その他の参考文献を、本明細書中に引用すると共
に、末尾に文献目録として収録した。 発明の技術的背景 血管系を完全な状態に維持するには、種々の細胞やタ
ンパク質の相互関係が不可欠である。例えば血管床の損
傷に際しては、血液の損失を防ぐために一連の反応が開
始される。まず最初の応答は血小板の活性化であり、こ
れが患部（損傷部位）に付着し、一連の反応が起こる。
これら一連の反応には、患部への他の血小板の誘引、多
数の有機化合物やタンパク質類の放出、並びに血液凝固
（凝血）カスケードの活性化のための、血栓性表面の形
成が含まれる。この連続的な反応の組合わせにより、血
小板栓塞が形成され、患部を封鎖する。この血小板栓塞
は該栓塞の周囲に繊維素糸（フイブリン・スレツド）を
形成することによつて安定化し、望ましくない血液損失
を阻止する。血小板塞栓とフイブリン・マトリツクス
は、傷の回復につれて徐々に溶解する。総説については
（１）を参照されたい。 出血を抑制する上で臨界的なフアクターは、初期の、
血小板栓塞の安定化に係る凝血カスケードの活性化であ
る。この系には、１ダース以上もの相互に作用し合う、
血漿中に存在するタンパク質、並びに放出および／また
は活性化された細胞内タンパク質類が含まれている（2,
3）。カスケード内の各段階には、プロテアーゼの、そ
の特定の不活性な形（酵素原）から触媒的に活性な形へ
の活性化が含まれる。国際的な同意の下（４）、カスケ
ード内のタンパク質は、それぞれにローマ数字を対応さ
せて命名される。それらの酵素原の形のものはローマ数
字で表されているが、活性形のものはローマ数字の後に
下付きの添字“a"を付して表される。カスケード内のあ
る段階で活性形をとるプロテアーゼが、該カスケード内
の次の段階に関与するプロテアーゼを触媒的に活性化す
る。この様にして、カスケードの開始期におけるタンパ
ク質の活性化を引き起こした小さな初期刺激が各段階毎
に触媒的に増幅され、終には大量のトロンビンが生産さ
れることとなり、このトロンビンによつて可溶性タンパ
ク質であるフイブリノーゲンの不溶性のフイブリンへの
触媒的変換が行われる。フイブリンは、糸（スレツド）
または繊維（フアイバー）の形に自己凝集（self−aggr
egating）する性質を有し、血小板栓塞を安定化し、容
易に移動しない様に機能する。 第１図に、今日血液凝固に関与することが知られてい
るタンパク質の相互作用を示した。このカスケードに含
まれるタンパク質のいずれかが欠乏または不足するとフ
イブリンの生産に係る初期刺激の伝播がそこで阻止され
ることになる。第１図のカスケードの中央部分には、第
IX a因子によつて第Ｘ因子が活性化されて第X a因子に
変換される段階が示されている。第VIII因子（同意語的
に第VIII c因子ともいう）はこの段階に、りん脂質およ
びカルシウムイオンの存在下、哺乳因子（コ・フアクタ
ー；それ自身は既知の機能を持たないが第IX a因子の活
性化に必要な因子）として作用するというのが通説であ
る。カスケード内で、この段階は重要である。何故なら
ば、２つの最も一般的な血友病は第VIII因子の機能低下
（Ａ型血友病または古典的血友病）、あるいは第IX a因
子の機能低下（Ｂ型血友病）により引き起こされること
が確認されているからである。血友病の約80％は第VIII
因子の欠損に起因する。これら両型の血友病の臨床的な
所見は同様であり、それは血小板栓塞の安定化に必要
な、充分量のフイブリンが形成されないので栓塞が容易
に移動してしまい、患部からの再出血を招くことで示さ
れる。凝固カスケードにおいて、第VIII因子と第IX因子
の欠損頻度が他の因子類と比較して相対的に高いのは、
これらがＸ−染色体と遺伝的に結合していることに基づ
くものである。第VIIIまたは第IX因子に関する遺伝子
の、１個の対立遺伝子に欠陥があれば、Ｘ染色体につい
て１個のコピーしか有していない男性の場合には血友病
が発現する。その他の凝固因子類は常染色体と結合して
おり、凝血異常（はるかに一般的でない）を引き起こす
には、通常、２つの対立遺伝子上の欠陥が必要である。
この様に、Ａ型およびＢ型血友病は、極めてありふれた
遺伝的血液凝固障害であり、殆んど例外なく男性に発症
する。 数十年前、血友病患部の平均死亡年令は20歳以下であ
つた。1950年の初めから1960年の後期に至る間に第VIII
因子の異常に関する研究がなされ、Ａ型血友病の治療に
まず全血漿、後に第VIII因子の濃縮物が用いられるよう
になつた。ヒト第VIII因子の供給源は、唯、ヒト血漿の
みであつた。そのために必要な経済上の１つのフアクタ
ーは、大量の使用可能な血漿を獲得するのに要する経費
である。そのために業者は、供給センター（献血センタ
ー）を建設し、供血者を補償し、得られた血漿を採血の
直後から処理プラントに出荷するまでの間、凍結状態に
して維持しなければならない。血漿試料は、1000人以上
の供給者からの分をロツトとしてプールし、処理され
る。第VIII因子の活性は不安定であり、濃縮物を得るの
に用いる極く少い回数の単純な精製手段にも大量の損失
を伴なう（活性の回収率は約15％）。得られた薬学的生
産物の純度は極めて低く、タンパク質1mgあたりの第VII
I因子の特異活性は0.5〜２単位である（第VIII因子活
性、１単位は、血漿1ml中に存在する活性に基いて定め
る）。第VIII因子濃縮物の純度は、第VIII因子タンパク
質の、約0.04重量％と見漬られる。この様に不純物含有
量が高いことから、タンパク質の沈降反応、肝炎、さら
に薬物の関与する獲得性免疫欠損症候群（AIDS）を引き
起こし得ること等を含む、種々の重大な副作用が随伴し
ている。この様な第VIII因子濃縮物の欠点は、血漿由来
の第VIII因子の不安定性、純度の低さ、および複数供給
者からのプールによつて誘導されたものであること、に
起因する。すなわち、1000人の供給者の内１名が例えば
肝炎患者であれば、そのロツト全体がウイルスに汚染さ
れる、ということを意味する。供給者はＢ型肝炎につい
て調査されるが、濃縮物中にはＡ型肝炎および、非−
Ａ、非−Ｂ型肝炎の両者が含まれていることがわかつて
いる。高純度の生産物を得る試みは、容認し難いく大量
の活性の損失、それによる経費の増大を招く結果とな
る。 第VIII因子の精製の歴史は、このタンパク質を取り扱
うことの困難さを証明している。この困難さは、大部
分、その不安定性と、全血中の第VIII因子含有量が微量
であることに起因する。1970年代の初期にはあるタンパ
ク質が、当時第VIII因子であると信じて同定された（5,
6,7）。このタンパク質は、糖タンパク質からなるサブ
ユニツトの凝集物であると確認された。このサブユニツ
トの分子量はSDSゲル電気泳動により、約240,000ダルト
ンと決定された。このサブユニツトは凝集して1,000,00
0〜20,000,000ダルトンの範囲内の、ヘテロジ−ニアス
（異種の）な高分子量の種（species）からなる集団を
構成している。このタンパク質は血友病患者の血漿中に
は存在しているが、フオン・ウイルブランド病（von wi
llebrand's disease、常染色体を介して継承される遺伝
性疾患であつて、出血時間の遅延と、第VIII因子のレベ
ル低下を特徴とする（８））患者の血漿中には認められ
なかつた。そこで、この高分子量タンパク質（フオン・
ウイルブランド因子（vWF）または第VIII因子関連抗原
（FV III RAg）と命令された）は、このタンパク質がフ
オン・ウイルブランド病においては存在せず、また古典
的血友病の場合にあつては幾らか非−機能的である
（９）ことを介して、これら両疾患の場合における凝固
欠損に関与している、という理論が提案された。しかし
ながら、その後、ある条件（顕著に高い塩濃度）下にお
いて、第VIII因子の活性に寄与していると信じられてい
たこのタンパク質から、因子VIII活性を分離し得るとい
うことが観察された（10−20）。この様な条件下での第
VIII因子の凝固活性を示すタンパク質の分子量は100,00
0〜300,000であつた。この時以来、第VIII因子の凝固活
性に関与するタンパク質（類）の同定および確認に多大
の努力が集中的に払われてきた。しかしながら、その様
なタンパク質は全血中から微量しか得られないことと、
不安定であることが相まつて上記の研究は妨げられてき
た。 ヒトおよび動物の両天然起源から種々の純度で第VIII
因子タンパク質（類）を単離したことが報告されている
（21−27、79）。しかし、上記の問題点があるので、誤
つた同定がなされ、その結果、所望の第VIII因子タンパ
ク質ではなく、第VIII因子調製物中の不純物タンパク質
がクローニングされ、発現しているおそれがある。この
可能性が現実のものであることは、上記のフオン・ウイ
ルブランド・タンパク質を第VIII因子凝固タンパク質で
あるとした、誤まつた同定からも強調できる。第VIII因
子様活性の同定における混乱も明らかに起こり得ること
である。第X a因子またはトロンビンは、第VIII因子が
欠損している血漿をも含む、種々の血漿の凝血時間の短
縮を惹起するので、適当なコントロールが行われなけれ
ば、外見上は第VIII因子様活性が現れることになる。ま
た、ある種の細胞が第VIII因子のそれと極めて似通つた
やり方で機能し得る活性物質を産生することも知られて
いる（28、29、30）。最後の文献（30）中で、この第VI
II因子様活性が実際は組織因子と称されるタンパク質の
ものであることが証明されている。これと同一または類
似の物質がヒト胎盤からも精製されている（31）。この
タンパク質は、血漿タンパク質の第VII因子と一緒にな
つて、第VIII因子および第IX a因子と同じ段階において
機能を表し、第Ｘ因子を活性化して第X a因子とする。 従つて、組換え第VIII因子の発現を証明する場合の障
害は、それが疑いもなく第VIII因子の活性の機能的な発
現である、ということの証明上の問題にある。たとえ第
VIII因子の全てまたは一部を暗号化している完全な、あ
るいは部分的なクローンを得たことを示す先行技術があ
るにしても、今日までに発現されたあらゆる組換えタン
パク質の４倍の大きさを有する組換えタンパク質を発現
させることには、通常の技術を持つ作業者にとつて、技
術上克服し難く、困難なことであることは、充分に認め
られていることである。 発明の要約 上記の、有効な人工産物およびそれに伴ない問題点
は、ヒト第VIII因子のクローニングおよび発現の成功に
関して主張された全てのクレームを綿密に精査すること
の必要性を示唆している。この点に関し、本発明が成功
を収めたことは、以下の点から証明される： １） クローン−誘導第VIII因子タンパク質に対して導
かれた抗体と、血漿−誘導第VIII因子タンパク質とが免
疫学的な交差反応を行うこと。 ２） ヒト血漿第VIII因子に対する中和モノクローナル
抗体と、本発明のクローンによつて暗号化されているタ
ンパク質とが交差反応を行うこと。 ３） 本発明に係る第VIII因子cDNAに対応するゲノムDN
Aが、第VIII因子の遺伝子を暗号化していることが知ら
れているＸ−染色体内に存在していること。 ４） 以下の点を示す機能的なタンパク質が発現される
こと、即ち： ａ） 第VIII因子欠損血漿に対し、これを修正する。 ｂ） 第IX a因子、カルシウムおよびりん脂質の存在下
で第Ｘ因子を活性化し第X a因子とする。 ｃ） 上記ａ）、ｂ）の活性が第VIII因子に対する特異
的抗体により失活する。 ｄ） その活性が第VIII因子に特異的な、固定化モノク
ローナル抗体のカラムに吸着（結合）する。 ｅ） 第VIII因子活性がトロンビンによつて賦活化され
る。 ｆ） その活性が、固定化されているフオン・ウイルブ
ランド因子に結合した後、溶離する。 即ち、本発明は、組換えDNA技術を利用することによ
り、機能的なヒト第VIII因子の生産に成功したこと、し
かも、その同定を行い、機能性を証明し、更には市場化
の準備に必要な、動物実験および臨床試験を開始し、行
うのに充分な量の物質を生産することに成功したことに
基いている。生産物であるヒト第VIII因子は、その機能
的である全ての形態において、第VIII因子に係る凝固活
性を欠損しているとの診断が下された患者に対し、予防
的または治療的に用いるのに適する。従つて本発明は、
（その重要な一側面であるが）第VIII因子を用いてヒト
における古典的血友病（Ａ型血友病）を診断および治療
する方法、並びにその使用にとつて適した医薬組成物を
提供することをも目的としている。 また、本発明は実質上純粋な、機能的ヒト第VIII因子
を提供するものである。本発明に係る、遺伝子操作を施
された適切な宿主系から産生された生産物は、治療上有
用な量および純度のヒト第VIII因子を提供する。その
上、本発明に係る第VIII因子には非−組換え細胞内の環
境中では常に伴なつて存在する汚染物質が随伴していな
い。 本発明はまた、DNA単離体、およびヒト第VIII因子を
発現可能な状態で暗号化している遺伝子配列を含有する
発現ビヒクル、並びにそれにより形質転換され、機能的
ヒト第VIII因子を発現し得る形質転換宿主細胞培養を提
供することを目的とするものである。更にまた、本発明
は、該DNA単離体、該DNA発現ビヒクル、該宿主細胞培養
およびその特殊な態様等を調製するのに有用な種々の方
法を提供することを目的とするものである。本発明はま
た、該細胞培養の発酵培養製品を調製することにも関す
るものである。 更に、本発明は、ヒト第VIII因子の機能的セグメント
に相当する新規なポリペプチド含有成分（類）を提供す
るものである。これらの新規なポリペプチド類は、天然
の第VIII因子の、生物学的活性および／または抗原決定
性セグメントである。例えば、その様なペプチド類はそ
のままで血友病患者の治療に用いることができ、特に、
第VIII因子に対する中和抗体を有する患者の治療に有用
である。後者の場合には、該当する患者に所望の抗原決
定基（類）を有するポリペプチドを与え、その様な抗体
と効果的に結合させておけば、ヒト第VIII因子の生物活
性成分含有ポリペプチドによる治療効果が増大する。 本発明方法に従つて得られる、ヒト第VIII因子の機能
的成分（類）を暗号化している、第VIII因子DNA単離体
は、遺伝子治療上の用途（例えばその様なDNAを造血性
幹細胞を介して第VIII因子欠損患者に挿入することによ
り該患者での第VIII因子活性を回復させる等）を有す
る。 特に好ましい態様 ヒト第VIII因子は、特に好適な宿主系において、機能
的な形で生産される。この系は本発明の発現ベクターに
よつてトランスフエクトされた新生児（乳児）期のハム
スターの腎細胞（BHK21（ｃ−13）、ATCC No.CCL10）か
らなり、ここに、この発現ベクターは、ヒト第VIII因子
を暗号化しているDNAであつて、その３′−および５′
−非翻訳領域のDNAを伴なうと共に、３′−非翻訳領域
に、例えばＢ型肝炎の表面抗原遺伝子に由来する、３′
−非翻訳終止DNA配列が結合したものである。この遺伝
子は、アデノウイルスのメジヤー・レイト・プロモータ
ー（major late promotor）であつて、その５′スプラ
イスリーダーを伴なつたものにより供給される転写およ
び翻訳コントロールエレメント、並びにSV40の複製起源
に係る領域であつて、転写促進配列およびプロモーター
配列を含んだ領域から導かれた転写および翻訳コントロ
ールエレメントにより発現される。更に、この発現ベク
ターは、SV40のアーリイ・プロモーター（遺伝子に増幅
能力を付与する）によつて作動するDHFR遺伝子、および
選択可能なマーカー（標識）遺伝子（例えばネオマイシ
ン耐性遺伝子）をも含有する。なお、後者は、ネオマイ
シン耐性に関する能力を有する別個のベクターを用いた
共形質転換法によつて供給してもよい。 図面についての記述 第１図．凝固カスケード（２）を図式的に示したダイヤ
グラムである。 第２図.DNAのTMAClおよび６×SSC内での融解（メルテイ
ング）点を示すグラフである。 A:各点の値は、λDNAの１部をとり、ニトロセルロース
・フイルターに２点づつ配して得た値である。これらフ
イルターをホルムアミドの不存在下に、実験方法の部分
に記載されている様にして37℃でハイブリダイズした。
１対のスポツトを、６×SSC（0.1％SDS）により
（□）、あるいは3.0MのTMACl、50mMのトリスHCl（pH8.
0）、0.1％SDSおよび2mMのEDTAからなる混合物により
（○）、38℃から56℃の間で２℃づつ増加させた温度の
下で洗浄した。ハイブリダイゼーシヨンの強度が50％残
存している温度を融解点（温度）とした。B:pBR322 DNA
の一部をニトロセルロース・フイルターに結合させ、2A
の場合と同様に融解実験を行つた。pBR322のMsp I消化
で生成した種々の長さのプローブ・フラグメントを、32
Pで末端−標識し、ポリアクリルアミドゲル上で単離し
た。実験方法に関する記載に従つて、18〜75bのプロー
ブ・フラグメントをホルムアミドの非存在下、37℃でハ
イブリダイズし、46〜1374bのプローブ・フラグメント
を40％ホルムアミドの存在下、37℃でハイブリダイズし
た。このフイルターを、3.0Mテトラメチルアンモニウム
・クロライド（TMACl）、50mMトリス・HCl（pH8.0）、
0.1％SDSおよび2mMのEDTAを含む混合物中、３℃づつ増
加する温度下において洗浄し、融解点を求めた。図中、
（○）はpBR322Msp Iプローブ・フラグメントに関する
融解点であり、（△）は11〜17bプローブについて、2A
からの3.0M TMACl中で求めた融解点である。 第３図：プローブ8.3.を用いた第VIII因子の検出に際す
る写真の模写図である。左側の３枚の図は以下のものを
表す:EcoR IおよびBamH Iで消化した、46,XY（1X:男）D
NAおよび49,XXXXY（4X）ヒトDNAを、６×SSC、50mMりん
酸ナトリウム（pH6.8）、５×デンハート（Denhardt'
s）溶液、0.1g/の、煮沸し超音波処理した鮭精子DNA
および20％ホルムアミド中、42℃において、実験方法の
箇所に記載した如くにしてハイブリダイズして得たサザ
ーン・ブロツドを示す。３つのブロツトを１×SSC（0.1
％SDS）中で、指示された温度下に洗浄した。第１列、E
coR I、1X,第２列、EcoR I、4X;3列、BamH I、1X;第４
列、BamH I、4X。Ｍ列は、末端標識した、λHind IIIお
よびφX174Hae III消化マーカー・フラグメントであ
る。右側の図は次のものを示す：λ/4Xのライブラリー
・スクリーンから得たニトロセルロース・フイルターと
プローブ8.3とのハイブリダイズの結果を示している。
矢印は、２個の独立した、第VIII因子陽性クローンを指
示している。このライブラリー・スクリーンのハイブリ
ダイゼーシヨンおよび洗浄法は、上記のサザーン・ブロ
ツト法について記載した通りである（洗浄温度37℃）。 第４図：ヒト第VIII因子遺伝子の遺伝子地図。最上列の
一列は第VIII因子遺伝子の、26個所のタンパク質暗号領
域（エクソンＡ〜Ｚ）の位置、および相対的な長さを示
している。転写の方向は左から右へ向かつている。第２
列目はキロ塩基対（kb）を基準とする該地図のスケール
を示している。その下方の数列は、第VIII因子遺伝子の
マツピングに用いた10個の制限酵素の認識部位の位置を
示している。 λフアージ（λ114、λ120、λ222、λ482、λ599およ
びλ605）並びにコスミツド（ρ541、ρ542、ρ543、ρ
612、ρ613およびρ624）クローンのそれぞれに含有さ
れているヒト・ゲノムDNAの量（程度）を示している。
最も下の一列は、ゲノム・スクリーンに用いたプローブ
の位置を示す:1）ρ543からの、0.9kb EcoR I/BamH Iフ
ラグメント;2）λ222からの2.4kb EcoR I/BamH Iフラグ
メント;3）λ120のフラグメントから得た1.0kb Nde I/B
amH Iフラグメントのトリプレツト;4）オリゴヌクレオ
チドプローブ8.3;5）λ114からの2.5kb Stu I/EcoR Iフ
ラグメント;6）λ482からの1.1kb EcoR I/BamH Iフラグ
メント;7）ρ542からの1.1kb BamH I/EcoR Iフラグメン
ト。46,XYおよび49,XXXXYゲノムDNAのサザーン・ブロツ
ト分析では、第VIII因子遺伝子組織には何ら識別し得る
差異を認めなかつた。 第５図：コスミツド・ベクターpGcos4の制限サイト地図
である。λc1857S7（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ー（Bethesda Research Lab.））のcos部位を含有す
る、アニールした、403b Hinc IIフラグメントを、pBR3
22の、Ava I〜Pvu II部分にクローンし、プラスミドpGc
os1を得た。また、別個に、pFR400（49n）の、SV40起源
およびプロモータ、突然変異ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、並びにＢ型肝炎表面抗原の末端配列を含有するPvu
IIからNae Iまでの（Pvu II−Nae I）1624bフラグメン
トをpBR322のAha III部位にクローンしてプラスミドmp3
3dhfrを得た。次いでpGcos1のSph I−Nde I1497bフラグ
メント、mp33dhfrのNde I−EcoR V3163bフラグメント、
およびpKT19のEcoR V−Sph I376bフラグメントを用いて
３成分ライゲーシヨンを行つてクローニングし、pGcos3
を得た。pKT19はpBR322の誘導体であり、テトラサイク
リン耐性遺伝子内のBamH I部位がニトログアノシン処理
によつて突然変異を起こしている。合成20マー（量体）
の５′AATTCGATCGGATCCGATCGをpGcos3のEcoR I部位にク
ローニングすることにより、pGcos4が生成する。 第６図:pESVDAの制限サイト地図である。SV40ウイルス
の342b Pvu II−Hind IIIフラグメントはSV40の複製起
源を包含すると共に、EcoR I部位と結合し得る様に修飾
されており（73）、またＢ型肝炎ウイルス（HBV）の表
面抗原（49n）のポリアデニル化部位は、580bp BamH I
−Bgl IIフラグメントに含まれており、そして、pBR322
から誘導されたpMLについては既に述べた通りである。S
V40のアーリイ（初期）プロモーターに続くEcoR I部位
とHBVのBamH I部位との間に、第１番目のレイト（後
期）リーダー配列のスプライス供与部位（16.65の位
置）を含有するPvu II−Hind IIIフラグメント（地図上
の座標：アデノウイルス２の16.63−17.06の位置）、お
よびその直後に、地図上9.83の位置にElbスプライス受
容部位を含有するアデノウイルス２の840bp Hind III−
Sac Iフラグメント（7.67−9.97の位置）（49j）が挿入
されている。これら供与部位と受容部位との間には、ゲ
ノムDNAフラグメントを挿入するための、Bgl IIおよびH
ind III部位がそれぞれ１個づつ、存在する。 第７図:pESVDAベクターからのRNA転写物に関する分析の
結果を示す。融合用の10cmの培養皿内でCOS−７細胞（7
7）を、改良DEAE−デキストラン法（84）により、文献
記載（73）の如くにして２μｇのプラスミドDNAでトラ
ンスフエクトした。RNAはトランスフエクシヨン後４日
目に細胞質抽出物（エキス）（49n）から調製し、変性
ホルムアルデヒド−アガロースゲル内での電気泳動にか
けた。ニトロセルロースフイルター上に移した後、方法
について示す如くこのフイルターを適当な32P−標識DNA
とハイブリダイズした。フイルターを２×SSC（0.2％SD
S）中、42℃において洗浄し、コダツク（kodak）のXR5
フイルムに露出させた。各像の28Sおよび18Sリボソーム
RNAの位置を矢印で示した。 エクソンＡを含むλ114の9.4kb BamH Iフラグメント
（第４図参照）をpESVDAのBgl II部位（第６図参照）に
クローンした。プラスミドpESVDA111.6はこのフラグメ
ントを、SV40のアーリー（早期）プロモーターがゲノム
フラグメントを適切な（即ちセンスのある）向きに転写
させる様な方向で挿入させ、含有している。また、pESV
DA111.7は反対の方向性で9.4kb BamH Iフラグメントを
含有している。プラスミドpESVDA S127は、pESVDAのBgl
II部位にpESVDA111.6と同じ方向性で挿入されている、
（平滑末端ライゲーシヨンによる）λ114の12.7kb Sac
Iフラグメントを含有している。 A:pESVDA、pESVDA111.7およびpESVDA111.6でトランスフ
エクトされた細胞から得た全細胞質RNAを含有するフイ
ルターのハイブリダイゼーシヨンに基く。各列は、それ
ぞれpESVDRNA（第１列）、pESVDA111.7（第２列）、pES
VDA111.6（第３−５列）を表わす。また、これらをプロ
ーブするためには、第VIII因子エクソンＡ含有フラグメ
ント（第１−４列）または1800b Stu I/Bamフラグメン
ト（第５列）を用いた。18SRNAには僅かな交叉ハイブリ
ダイゼーシヨンが認められる。 B:RNAとStu I/BamH Iプローブ（“イントロンプロー
ブ”）とのハイブリダイゼーシヨンに基く。各列のRNA
の起源は以下の通りである:1）pESVDA,polyA-;2）pESVD
A,polyA+;3）、pESVDA111.7、polyA-;4）pESVDA111.7、
polyA+;5）pESVDA111.6、polyA-;6）pESVDA111.6、poly
A+。A5、B1、B3およびB5の各列にみられる小さな暗色の
ハイブリダイゼーシヨン帯は、おそらく、この領域に存
在するtRNAまたはAluリピート配列とのハイブリダイゼ
ーシヨンを示すものであろう。 C:エクソンＡ含有フラグメントでプローブした、pESVDA
111.6からのRNA（第１列）およびpESVDA.S127からのRNA
（第２列）を対比させたものである。第２列では、より
大きいゲノムフラグメント中に含まれている付加的なエ
クソン配列を示すサイズのわずかな増加が注目される。 第８図:pESVDA.S127 cDNAクローンS36の配列を示す模式
図である。ヒトDNA挿入物のDNA配列は、エクソン発現プ
ラスミドpESVDA.S127から得られたcDNAクローンS36とし
て表わされる（詳しくは後述する）。垂直な線は、第VI
II因子のゲノムおよびcDNAクローンの分析によつて決定
されたエクソンの境界であり、エクソンは第４図の如く
分類されている。選択された制限エンドヌクレアーゼの
制限部位を指示した。 第９図:cDNAのクローニングを示す模式図である。第VII
I因子mRNAは第３列目に記されており、ここに、長方形
の枠は成熟タンパク質の暗号領域、斜線の部分は信号ペ
プチドの暗号領域、更に、隣接している線はメツセージ
の非翻訳領域をそれぞれ表す。このmRNAの５′末端は左
側である。この図の上方にはゲノム・クローンλ222の
エクソンＢ領域の範囲が示されており、また、該mRNAを
示す図の下方には６個のcDNAクローン（それらが一緒に
なつて完全な長さの第VIII因子のクローンを構成する。
詳細は本文を参照されたい）が示されている。cDNAの合
成プライマー類、１、３、４およびオリゴ（dT）を、そ
れらがプライマーとなつて開始された合成反応の向きを
矢印で表して記載した。選択された制限エンドヌクレア
ーゼの制限部位、並びにキロベース（kb）に基くスケー
ルをも示した。 第10図：ヒト第VIII因子遺伝子の配列を示す模式図であ
る。合成（組立てらてた）第VIII因子cDNAクローンの完
全なヌクレオチド配列が示されており、各列の左端にヌ
クレオチドの番号が記されている。番号１のＡは翻訳開
始コドンATGのＡを表す。負の数は５′非翻訳配列の部
分を表す。mRNAマツピング実験によると、第VIII因子の
mRNAは、この図に示されている−109に加えて５′側
に、さらに約60個のヌクレオチド配列を有することが示
唆されてる。推定のタンパク質配列をDNA配列の上側に
示した。アミノ酸配列の上に付した番号、S1−19の部分
は推定の信号ペプチド配列であることを示し、番号１−
2332は推定の成熟タンパク質の配列であることを示す。
“OP"は、オパール、即ち翻訳終止コドンTAGを意味す
る。３′ポリアデニル化信号AATAAAには下線を引いて指
摘すると共に、ポリ（Ａ）末端の８個の残基（クローン
λc10.3内に発見されている）も示した。合成オリゴヌ
クレオチド・プローブ8.3とホモローガスな（相同の）
配列部分を、下線を引いて指摘した（ヌクレオチド5557
−5592）。選択された制限エンドヌクレアーゼの開裂部
位を適当な配列の上方に示した。ヌクレオチド2671−32
17はゲノム・クローンから導かれた配列を表し、その他
はcDNA配列を表している。 ヒト第VIII因子遺伝子のタンパク質暗号領域の完全な
DNA配列を、既述のゲノム・クローンから求めた。それ
は、cDNAクローンから導かれた、第10図の配列と、唯２
個のヌクレオチドに関して異るだけであつた（ただし、
ヌクレオチド2671−3217は除く）。即ち、cDNAクローン
におけるヌクレオチド3780（下線で示した）はＧであ
り、アミノ酸コドン1241はaspからgluに変化している。
また、３′非翻訳領域内のヌクレオチド8728（下線で示
した）は、ゲノム・クローンではＡに変つている。 第11図：完全な長さを有する組換え第VIII因子プラスミ
ドの組立て模式図である。完全な長さのヒト第VIII因子
cDNAを含有するプラスミドpSVEF VIIIの組立てに関する
詳細な部分は、明細書中の項目8aを参照されたい。位置
を表す数字は、本文中の数字、および第10図の数字と72
bpづつズレている。 第12図：第VIII因子発現プラスミドの組立て模式図であ
る。BHK細胞内で、機能的なヒト第VIII因子の発現を指
令するプラスミドpAML3p.8c1の詳細な組立て方法は、本
文8bに記載されている。 第13図：融合タンパク質抗血清を用いた、ウエスタン・
ブロツテイング法による第VIII因子の解析像である。ヒ
ト第VIII因子を、文献（81）記載の方法に従つて５−10
％のポリアクリルアミド・グラデイエントSDSゲルで分
離した。第VIII因子の列の内、１つを銀によつて染色し
た（80）。残る第VIII因子の列をそのまま電気泳動的に
ニトロセルロース・フイルター上に移し、ウエスタン・
ブロツテイング法で解析した。放射性同位元素で標識し
た標準試料を列中、第VIII因子の横に適用し、観察され
る帯に対応する分子量を算定した。指示に従つて、この
ニトロセルロース切片を適当な抗血清と共にインキユベ
ートし、洗浄した後、125IプロテインＡでプローブし
た。このニトロセルロース片（シート）をオートラジオ
グラフイーに適用した。 第14図:C8モノクローナル抗体を用いた融合タンパク質
の解析像である。融合タンパク質1,3および４の第VIII
因子の特異的モノクローナル抗体CRとの反応性をウエス
タン・ブロツテイング法で解析した。 第15図：第VIII因子のトーヤ・ソーダー（Toya Soda）
・TSK4000SWカラムを用いた高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）における溶離曲線（像）である。このカラム
を平衡にし、0.1Mりん酸ナトリウム（pH7.0）中SDS0.1
％溶液で室温で展開した。 第16図：第VIII因子トリプチツクペプチド類を逆相HPLC
で分離した場合の溶離曲線である。この分離は、シンク
ロパツク（Synchropak）RP−PC−18カラム（0.46cm×25
cm、10μ）を使用し、0.1％トリフルオロ酢酸中、アセ
トニトリルによる傾斜溶出（アセトニトリル濃度を20分
間で１％から70％に変化）に基いて行った。矢印は配
列:AWAYFSDVDLEKのペプチドを含むピークの位置を指示
している。 第17図：トロンビンの、精製（純化）第VIII因子活性成
分に対する活性化作用を表すグラフである。細胞上澄み
をC8モノクローナル樹脂上、クロマトグラフにかけ、透
析して溶離緩衝液を除いた。トロンビン（25ng）を加
え、この時を０時とする。指示された時間毎に一部をと
つて1:3に希釈し、凝固活性を分析した。正常ヒト血漿
から得た標準曲線に基いて1mlあたりの単位数（u/ml）
を算出した。 詳細な記述 A.定義 本明細書中、“ヒト第VIII因子”という語句は、イン
ビボまたはインビトロにおいて、例えばＡ型血友病等で
特徴づけられるヒトにおける第VIII因子欠損症を修正す
ることのできる機能的なポリペプチドを意味する。この
タンパク質、およびそれに伴う活性はまた、第VIII C因
子（F VIII C）および第VIII因子凝固抗原（F VIII CA
g）とも称される（31a）。その様な第VIII因子は、組換
え細胞培養により、天然のヒト血漿の第VIII因子活性に
対応する、活性な形で生産される。（ヒト第VIII因子の
活性は、正常ヒト血漿1ml中に存在する活性を１単位と
して定義されている。）本発明に係る第VIII因子タンパ
ク質は、確認されたそのDNA遺伝子およびアミノ酸の配
列決定を通じ、またその物性並びに生物学的活性に基い
て明確なものとなつた。 天然の状態において、第VIII因子は多数の分解または
処理形態を示す。これらの形態は、本明細書に示す様
に、前駆体である、一本鎖タンパク質から導かれる。本
発明はその様な一本鎖（single chain）タンパク質を提
供するものでありさらに、そのまま、または親分子のイ
ンビトロでのプロセツシングを介してそれら種々の分解
産物を提供すると共に、これもまた活性であることが示
されたその様な種々の分解産物を投与する方法をも提供
するものである。その様な産物は、天然物質に対応する
機能的に活性な部分（１またはそれ以上）を含有してい
る。 様々な対立性の（アレリツク）変異体が存在する。こ
れらの変異体は、全配列中で１またはそれ以上のアミノ
酸が異るか、あるいは、全配列中、１またはそれ以上の
アミノ酸が欠失、置換、挿入または転換されることによ
つて示される。加えて、宿主細胞内環境の性質によつて
グリコシル化の位置および程度が左右される。また、組
換えDNA技術を用いる場合には、基となるDNAの部位指向
性変異誘発性により、単一または複数のアミノ酸の欠
失、置換、挿入または転換によつて様々に修飾された、
種々のヒト第VIII因子誘導体が生産される可能性があ
る。しかも、インビボまたはインビトロで生産されたヒ
ト第VIII因子のフラグメントも、前述の如く所望の活性
を有する可能性がある。これらアレリツク変異体の全
て、グリコシル化された変異種、修飾物またはフラグメ
ント等、第VIII因子の誘導体とされるものは、それらが
ヒト第VIII因子の機能的セグメントを含有し、さらに根
本的で特徴的なヒト第VIII因子の機能的な活性（ただ
し、本質に変化を来すことなく維持されているもの）を
含有する限りにおいて、本発明の範囲に含まれるもので
ある。本明細書中では、その様な機能的な変異体または
修飾された誘導体を、“ヒト第VIII因子誘導体”と称す
る。これら第VIII因子誘導体が所望の機能的な活性を有
することは、本明細書中に述べる簡単なインビトロ実験
により容易に同定することができる。本明細書で開示し
たヒト第VIII因子DNAの配列およびヒト第VIII因子のア
ミノ酸配列から、このDNAを制限酵素的に切断すること
により、あるいはヒト第VIII因子タンパク質にタンパク
分解その他の分解法を適用することにより、これらフラ
グメント類を得ることができるということは、当業者に
よつて自明である。 従つて、機能的な形のヒト第VIII因子、即ち、“機能
的ヒト第VIII因子”は、第IX a因子、カルシウムおよび
りん脂質の存在下、第Ｘ因子のX aへの変換を触媒し得
ると同時に、Ａ型血友病患者から得られた血漿中の凝固
欠損を修正し得ること、更にはヒト血漿中第VIII因子と
同一または実質上同一であるとみられる免疫学的な特性
を有することによつても“機能的ヒト第VIII因子”と分
類することができる。 本発明方法に従つて得られた“ヒト第VIII因子”の状
態について“実質上純粋の形”なる技術は、それが、非
−組換え供給源（即ち、それが“天然”に含有されてい
る血漿内環境）から単離された第VIII因子に通常随伴し
ているタンパク質その他の物質を、実質的に含まないこ
とを意味する。 “DHFRタンパク質”という語句はジヒドロ葉酸還元酵
素（DHFR）に伴う活性を表し得るタンパク質を意味して
おり、従つてそのものは、ヒポキサンチン、グリシンお
よびチミジンを欠く培地（−HGT培地）で生存し得る細
胞により、生産されるはずである。一般に、DHFRタンパ
ク質を欠く細胞はこの様な培地で増殖することができ
ず、DHFRタンパク質を含有する細胞は増殖することがで
きる。 “発現ベクター”という語句は本発明に係るDNA配列
であつて、該配列の発現を有効なものとする様、作用す
る他の配列と機能的に結合している配列を含有し、それ
を発現させることができるベクターを指す。これらの発
現ベクターは、自身の持つ機能的な複製起源の働きで、
または細胞内の染色体への機能的な組込みにより、宿主
細胞内で複製する。“発現ベクター”という語句も機能
的に定義されるものであり、それは、そのものの配列中
に含まれている特定のDNAコード（暗号）を、それに関
して用いられた場合に、有効に発現させ得る様なDNA配
列のすべてを指す。一般に、組換えDNA技術において
は、しばしば、環状二重鎖DNAループである、“プラス
ミド”の形の発現ベクターが利用される。しかしなが
ら、本発明においては、上記の如く同等の機能を果す他
の形の発現ベクターをも包含するものとする。 “DNA単離体”とは、ヒト第VIII因子の暗号配列を含
有するDNA配列を意味し、それ自身またはクローニング
ベクター中に取り込まれたものを含む。 “組換え宿主細胞”とは、組換えDNA技術で組立てら
れたベクターによつて形質転換された細胞中の１つの細
胞（cell/cells）を指す。ここに示した如く、この形質
転換によつて、形質転換されていない天然の宿主源で生
産される様な少量で低純度のものと異り、大量に第VIII
因子またはその機能的セグメントを生産することができ
る。その様な“組換え宿主細胞”によつて生産される第
VIII因子を“組換えヒト第VIII因子”と称することがで
きる。 DNAおよびRNAの大きさを示す単位は、本明細書中、し
ばしば以下の略号で表示される:b＝塩基または塩基対;k
b＝キロ（1000）塩基またはキロ塩基対。タンパク質に
関する略号は以下の通りである:D＝ダルトン;kD＝キロ
ダルトン。温度尾は全て摂氏である。 B. 宿主細胞培養およびベクター 本発明方法によれば、種々の組換え宿主細胞内で、有
効な組換えヒト第VIII因子を生産することができる。以
下に、特に好ましい系を示す。 一般に、本発明にとつて有用なベクターを組立てるた
めのDNA配列のクローニングには原核生物が好ましい。
例えば、E.coli K12株294（ATCC No.31446）が特に好ま
しい。その他の使用し得る微生物の菌株には、E.coli
B、E.coli X1776（ATCC No.31437）、E.coli c600およ
びc600hf1並びにE.coli W3110（F-,λ-,プロトトロフイ
ツク,ATCC No.27325）等のE.coli菌株；バチラス・サブ
チラス（Bacillus subtilus）の如きバチラス属の菌
株；その他、サルモネラ・チフイムリウム（Salmonella
typhimurium）またはセラチア・マーセサンス（Serrat
ia marcesans）等の腸内菌や様々なシユードモーナス
（Pseudomonas）種の菌株が含まれる。これらの例が、
制限的なものでなく、例示にすぎないことは言うまでも
ない。 一般に、宿主細胞に適合し得る種から誘導されたレプ
リコンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクタ
ーを、これらの宿主と一緒に用いる。普通、ベクター
は、複製部位、並びに形質転換細胞内で表現型に基づく
選択性を付与し得る標識配列を有する。例えば、E.coli
は一般にE.coli種から導かれたプラスミドであるpBR322
を用いて形質転換される（32）。pBR322はアンピシリン
およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有しているの
で、形質転換細胞を容易に同定および選択できる手段を
提供するものである。このpBR322プラスミド、あるいは
他の微生物プラスミドはまた、微生物がそれ自身のタン
パク質を発現させるために利用し得るプロモーターを含
有し、または含有する様に修飾されていなければならな
い。組換えDNAの組立てに最も普通に用いられるプロモ
ーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およ
びラクトースプロモーター系（33−35）並びにトリプト
フアン（trp）プロモーター系（36、37）が含まれる。
これらが最も普通に用いられるものであるが、その他の
微生物プロモーターも発見されて使用されており、それ
らの詳細なヌクレオチド配列も公開され、当業者はそれ
らをプラスミドベクターと機能的にライゲートすること
ができる（38）。 原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物も用
いられる。真核性微生物の内、サツカロミケス・セレビ
シエ（Saccharomyces cereviciae）または通常のパン酵
母が最も一般的に用いられるが、その他多数の菌株も普
通に用い得る。サツカロミケス内で発現させるために
は、例えばプラスミドYRp7（39−41）が通常用いられ
る。このプラスミドは既にtrp1遺伝子を含有しているの
で、トリプトフアン中で増殖する能力を持たない、酵母
の突然変異株（例えばATCC No.44076またはPEP4−１（4
2））に選択マーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムの
特徴としてtrp1障害があるということは、形質転換体を
トリプトフアン不在で増殖させることによつて形質転換
体を検出する際に有効な状況が与えられることになる。 酵母用ベクターの好適なプロモーテイング配列には、
以下のものに対するプロモーターが含まれる:3−ホスホ
グリセレート・キナーゼ（43）、またはエノラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフエート・デヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
エート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムタ
ーゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフエート・
イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グル
コキナーゼ等の他の解糖酵素類（44、45）。適当な発現
プラスミドを組立てるためには、これらの遺伝子を伴な
つた終止配列を、発現ベクター中に、発現させるべき所
望の配列の３′とライゲートさせて入れ、mRNAのポリア
デニル化部位および末端配列を提供する。その他、増殖
条件によつて転写がコントロールされるという利点をさ
らに有するプロモーターとして、アルコール・デヒドロ
ゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスフアターゼ、
窒素代謝に関連する減成酵素、前記グリセルアルデヒド
−３−ホスフエート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルト
ースおよびラクトースの利用に与える酵素類等に関する
プロモーター領域が含まれる。酵母と適合し得るプロモ
ーター、複製起源および終止配列を含有するプラスミド
ベクターの全てが適する。 多核微生物からの細胞培養を宿主細胞として用いるこ
とも好ましく、殊に、本発明並びに参考文献にみられる
機能的なヒト第VIII因子を生産するために、不明瞭なDN
Aを発現させるには好ましい態様であるに相違ない。原
則として、脊椎動物の細胞により大きい関心が寄せられ
ており、例えば、VEROおよびHeLa細胞、チヤイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞系、並びにW138、BHK、COS−
７およびMDCK細胞系等が含まれる。その様な細胞のため
の発現ベクターには、通常（必要ならば）複製起源
（類）および発現されるべき遺伝子の前方に位置してい
るプロモーターが、所望のリボゾーム結合部位、RNAス
プライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列
と共に含有されている。 哺乳類細胞内で使用するための発現ベクター用のコン
トロール機能は、しばしばウイルス性物質によつて供給
される。例えば、普通用いられているプロモーターはポ
リオーマ、シミアンウイルス40（SV40）および最も頻繁
にはアデノウイルス２から導かれる。前記アデノウイル
ス２のメジヤー・レート（主後期）プロモーターと同様
に、SV40ウイルスの初期および後期のプロモーターは、
いずれも有用である。さらに、正常な状態で所望の遺伝
子配列を伴つているプロモーターまたはコントロール配
列を用いることもでき、またしばしば好ましいといえ
る。ただし、その様なコントロール配列が宿主細胞系に
適合性を有することを条件とする。 複製起源は、外来性の起源、アデノウイルスその他の
ウイルス性起源（例えばポリオーマ、SV40、VSV、BPV
等）を含む様にベクターを組立てるか、あるいはベクタ
ーが宿主細胞染色体に組込まれるならば、宿主細胞の染
色体性複製機構によつて与える。 第VIII因子とDHFRの両者をそれぞれ暗号化しているDN
A配列を含む本発明のベクターでトランスフエクトする
のに好適な哺乳類宿主細胞を選択するに際しては、用い
るDHFRタンパク質のタイプに従つて宿主を選択するのが
適当である。野生型DHFRタンパク質を用いる場合には、
DHFR欠損宿主細胞を選択するのが好ましく、そうするこ
とにより、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く選択用培地内で、満足のいくトランスフエクシヨン
を選択するためのマーカーとしてDHFR暗号配列を用いる
ことができる。 他方、MTXに対する結合の親和性の低い、DHFRタンパ
ク質をコントロール配列に用いる場合には、DHFR耐性細
胞を用いる必要はない。何故ならば突然変異DHFRはメト
トレキセート耐性であるので、宿主細胞自身がMTX感受
性であることを条件として、MTX含有培地を選択の手段
として用いることができるからである。MTXを吸着する
ことのできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート感
受性であると思われる。 別法として、第２の選択マーカー（例えばネオマイシ
ン耐性）を使用する場合には、DHFR−非欠損型の細胞内
での増幅用マーカーとしてDHFR遺伝子を用いることもで
きる。 以下に実施例を挙げ、宿主細胞としてのBHK細胞の使
用例、およびアデノウイルスのメジヤー・レート・プロ
モーターを含有する発現ベクターについて詳しく説明す
る。 C. 一般的手法 強固な細胞壁障害を有していない細胞を宿主細胞とし
て用いる時には、りん酸カルシウム沈降法によつてトラ
ンスフエクシヨンを行う（46）。しかしながら、DNAを
細胞内に導入するための他の方法、例えば核内注入また
はプロトプラスト融合等、も用いることができる。 原核細胞または実質的な細胞壁構造を有する細胞を用
いる場合の好ましいトランスフエクシヨン法は塩化カル
シウムを用いたカルシウム処理である（47）。 所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適
当なベクターの組立てには、標準的なライゲーシヨン技
術を用いる。単離したプラスミドまたはDNAフラグメン
トを開裂、修復し、所望のプラスミドにとつて望ましい
形に再ライゲートする。 開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素（類）を用いて行
う。一般に、約１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメ
ントを、約20μの緩衝液中で約１単位の酵素により、
１時間処理する（特定の制限酵素にとつて適当な緩衝液
および基質の量は製造業者によつて明らかにされてい
る。即ち、T4リガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼお
よび細菌性アルカリ性ホスフアターゼに関する使用上の
標準的な条件、の如くである）。インキユベーシヨンの
後、フエノールおよびクロロホルムによる抽出でタンパ
ク質を除き、水性画分をエタノール沈殿に付し、核酸を
回収する。標準的な実験手法を用いることができる（4
8）。 粘着末端（突出部、オーバーハンギング）を有する制
限酵素切断フラグメントを平滑末端化するには、以下の
方法の内、いずれかを採用する： うめ込み修復法（フイル・イン・リペアー）:2−15μ
ｇのDNAを、50mM NaCl、10mMトリス（pH7.5）、10mM Mg
Cl2および1mMジチオトレイトール中で、各250μＭの４
種類のデオキシヌクレオシツド・トリホスフエート並び
にDNAポリメラーゼ・クレノー（klenow）フラグメント
８単位と共に24℃で30分間インキユベートする。フエノ
ールおよびクロロホルム抽出、並びにエタノール沈殿に
付して反応を終了させる；あるいは S1消化法:2−15μｇのDNAを、25mM NaOAc（pH4.5）、1m
M ZnCl2、300mM NaCl中でS1ヌクレアーゼ600単位と共に
37℃で30分間インキユベートし、フエノール、クロロホ
ルム処理、およびエタノール沈殿によつて反応を終了さ
せる。 合成DNAフラグメントは、周知のホスホトリエステル
法（47a）またはホスホアミダイト法（りん酸アミド化
法）（47b）によつて調製することができる。DNAを、常
法通り、アガロースゲル、またはポリアクリルアミドス
ラブゲルにかけ、電気溶離法（48a）によつてこのゲル
からフラグメントを精製する。DNAの“サザーン”ブロ
ツト・ハイブリダイゼーシヨンは、（49a）の方法に従
つて行つた。 RNAの“ノーザン”ブロツト・ハイブリダイゼーシヨ
ンは、６％ホルムアルデヒド含有アガロース・スラブ・
ゲル電気泳動に続いて行つた（48、49b）。放射性標識
−ハイブリダイゼーシヨンプローブは、高度の特異活性
を有する32P−標識ヌクレオチド・トリスホスフエート
を使用し、ウシ胸腺DNAのランダム（無作為）なプライ
ム合成（primed synthesis）法（49）によつて調製した
（32P:アマーシヤム（Amersham）；クレノールDNAポリ
メラーゼ:BRL、NEBまたはベーリンガー−マンハイム（B
oehringer−Mannheim））。短いオリゴヌクレオチド・
プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼによつて末端
−標識化することができる。“スタンダード・ソルト
（Standard salt）”サザーン・ハイブリダイゼーシヨ
ンの条件は以下の範囲内に含まれる:5×SSC（１×SSC＝
0.15M NaCl0.015Mクレン酸ナトリウム）、50mMりん酸ナ
トリウム（pH7）、10％硫酸デキストラン、５×デンハ
ート溶液（１×デンハート＝0.02％フイコル、0.02％ポ
リビニルピロリドン、0.02％ウシ血清アルブミン）、20
−100μg/mlの変性鮭精子DNAおよび０−50％のホルムア
ミドからなる混合物中で24℃〜42℃においてハイブリダ
イゼーシヨンし、次いで0.2〜１×SSCと0.1％SDSとの混
合物により、24℃−65℃において洗浄する。フイルター
を乾燥し、デユポン、ライテイング−プラス（Dupont L
ighting−plus）強化スクリーンを使用し、−80℃にお
いてコダツク（Kodak）XARフイルムに感光させた。総説
（48）参照。 細胞及び組織RNA類のノーザン・ブロツト・スクリー
ニングにおいては、５×SSC、５×デンハート溶液、10
％硫酸デキストラン、50％ホルムアミド、0.1％SDS、0.
1％ピロリン酸ナトリウムおよび0.1mg/mlE.coli tRNAを
λ120エクソンＡ含有配列の180bp Stu I/Hinc Iフラグ
メントから調製した32P−標識プローブと共に42℃で一
夜ハイブリダイゼーシヨンした。洗浄条件は0.2×SSC、
0.1％SDS（42℃）であつた。 ヒトDNAは抹消血中リンパ球（46,XY）またはリンパ芽
球細胞（49,XXXXY,N.I.G.M.S.ヒユーマン・ジエネテク
・ミユータント・セル・レポジツトリー（Human Geneti
c Mutant Cell Repository），カムデン,N.J.（Camden,
N.J.）,No.GM1202A）（48）から調製した。大腸菌（E.c
oli）プラスミドDNAおよびバクテリオフアージλDNAは
文献（48）記載の如くにして調製した。組織RNAはグア
ニジウム・チオシアネート法（48、49f）または（49b）
記載の方法で調製した。ポリアデニル化RNAはオリゴ（d
T）セルロース上（49h）で調製した。 DNA配列決定は（49i）の方法で行つた。 λ/4×ライブラリーを得るために、各50μｇの５部の
49,XXXXY DNAを濃度3.12、1.56、0.782、0.39および0.1
95u/mlのSau3A I 1ml中で、37℃において１時間消化し
た。試験的な消化およびゲル分析の結果、Sau3A I濃度
0.782u/mlのこれら条件下におけるDNAの平均的な大きさ
（重量）は約30kbであつた。このことは、これらの消化
法によつて、平均値が15kbを中心に分布している物が生
成することを示している。これら５組の消化物から得た
DNAをプールし、フエノールおよびクロロホルム抽出し
た後、エタノール沈殿に付し、6g/の低ゲル化温度の
水平アガロースゲル（48）（シープラーク・アガロース
（Seaplaque agarose）、FMCコーポレーシヨン（FMC co
rporation））上、２個のスロツト（5.6×0.6×0.156c
m）中に入れて電気泳動にかけた。このゲルの12−18kb
領域を切り取り、このゲル切片を融解法に付し、DNAを
精製した（48）。 シヤロン30アーム（arms）は、ベクター50μｇをHamH
Iで消化し、上記の如く6g/の低ゲル化温度アガロー
スゲルからアニールした31.9kbアーム・フラグメントを
単離することにより、調製した。λ/4Xライブラリーを
組立てるために、（48）に記載の如く、シヤロン30BamH
Iアームおよび12−18kbの部分的Sau3A処理49,XXXXY DN
Aの至適濃度を決定した。ライゲートしたDNAをインビト
ロの抽出物“パツカゲル（packagene）”（プロメガ・
バイオテク，インコーポレーテツド（Promega Biotec,I
nc.），マジソン（Madison）,WI）に包み込んだ。代表
的な反応においては、シヤロン30BamH Iアーム約1.3μ
ｇを容量10μで12−18kb Sau3A DNA挿入物0.187μｇ
にライゲートした。このDNAの平板培養物（plating）を
包み込み、約1.3×106のフアージ・プラークを得た。λ
4Xライブラリーを得るために、1.7×106のフアージを、
平板150cm当りに17,000の割合でフアージをおき、平板
培養した。このフアージを増幅させるために、これらの
平板で１夜増殖させ、10mMトリスHCl（pH7.5）、0.1M N
aCl、10mM MgCl2および0.5g/ゼラチン中にかき落し、
短時間遠心した。通常、適当数（0.5−２×106）のこれ
らフアージを平板から取り、スクリーンした（48）。数
例では、ライゲートし、インビトロで包み込んだフアー
ジを、増幅させずに直接スクリーンした。 λ482を単離するために、第VIII因子ゲノムの22kb Bc
l Iフラグメント含有クローンと、ベクターλ1059（4
9）のBamH Iアーム・フラグメントをゲル電気泳動法で
単離した。他方、49,XXXXY細胞系列のDNA100μｇをBcl
I消化し、電気泳動にかけて20−24kb画分を単離した。
λ1059アーム・フラグメント約0.8μｇと５％の単離Bcl
I DNAを容量10μでライゲートし（48）、712,000個
のプラークを得た。その400,000個を、λ114の2.2kb St
u I/EcoR Iプローブで２回、スクリーンした。 コスミツド/4Xライブラリーは、シエアリング（剪
断）その他の切断が生じない様、大きな注意を払つてDN
Aを単離する外は、λ/4Xライブラリーの生成に用いた4
9,XXXXY DNAから得ることができる。このDNAを５種類の
濃度のSau3A Iによつて部分消化し、プールされたDNAを
100−400g/のシユクロース・グラデイエント（49）上
でサイズ分けした。35−45kbのDNAを含有する分画をプ
ールし、透析した後、エタノール沈殿に付した。コスミ
ツド・ベクターpGcos4のアーム・フラグメントを文献
（50）記載の原則に従つて調製した。簡単に述べると、
等量のpGcos4を夫々別個に、Sat I（Sac Iのイソスキゾ
マー（isoschizomer））またはSal Iで切断した後、細
菌性アルカリ性ホスフアターゼで処理する方法である。
次いで各混合物をフエノールおよびクロロホルムで抽出
し、プールしてエタノール沈殿に付し、BamH Iで切断し
た。この消化物から、低ゲル化温度−アガロースゲルに
より２つのアーム・フラグメント、4394bおよび4002bが
得られた。次いで、これらのアーム・フラグメントを、
単離した40kbのSau3A I部分消化DNAにライゲートした。
一般的な反応では、0.7μｇのpGcos4アーム・フラグメ
ントを容量10μで、１μｇの40kbヒト4X DNAにライゲ
ートした（48）。次いて、この反応物をインビトロで包
み込んでE.coli HB101のrecA-菌株を感染させるのに用
いた（48）。この反応物をテトラサイクリン含有平板上
で平板培養すると、約120,000のコロニーが生成した。
約150,000のコスミツドをクロラムフエニコール含有平
板上で一夜増幅させ、既述の如く、20個の150mm平板に
よつて２回、スクリーンした（48）。 二重鎖cDNAは、逆転写による一次鎖（first−stran
d）合成におけるプライマーとしてオリゴ（dT）12−18
または、合成デオキシオリゴヌクレオチド16マーを使用
し、既知（36,67）の方法で調製した。ポリアクリルア
ミドゲルで単離した後、適当なサイズ（通常、600μｐ
以上）のcDNAを次のいずれかの方法で処理した。ターミ
ナル・トランスフエラーゼによつてＣ末端化し、これを
Ｇ末端化したPst I消化pBR322とアニールしてE.coli菌
株DH1（76）に導入（トランスフオーム）するか、ある
いは100倍モル過剰量の合成DNA EcoR Iアダプターとラ
イゲートさせ、ポリアクリルアミドゲル上で再度単離し
た後、EcoR I消化λGT10にライゲーシヨンを介して挿入
し、フアージ粒子に包み込み、E.coli菌株C600hf1（6
8）を感染させる。既存の方法の改良法として、相補的
な合成18マーまたは22マー（５′−CCTTGACCGTAAGACATG
および５′AATTCATGTCTTACGGTCAAGG）からなるアダプタ
ーを、EcoR I粘着末端でなく平滑末端でりん酸化するこ
とにより、該アダプターがそのEcoR I部位で過剰な自己
ライゲーシヨンを起こすことなく二重鎖cDNAと効果的に
ライゲーシヨンし得るようにした。この方法は、自己相
補適なEcoR IリンカーをEcoR Iメチラーゼ処理した二重
鎖cDNAにライゲートし、続いてEcoR I消化を行つてcDNA
の末端から過剰のリンカー・オリゴマーを除去するとい
う、より骨の折れる方法の代替法として有効である。ゲ
ノムクローニングによつて入手し得るポリ（Ａ）から最
寄りの存在する３′フアクターVIIIプローブ配列まで
の、＞3500bpのcDNAクローン（即ちエクソンＡ）を効率
よく得るために、mRNAのセンス鎖上にあるエクソンＢ内
の配列に対応する合成DNA16マーを反応系に含ませるこ
とにより２番目の鎖のcDNA合成を特異的にプライムし
た。 D. アデノウイルスのサブクローニング アデノウイルス2DNAは、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Bethesda Researoh Laboratories（BRL））
から購入した。このウイルス性DNAをHind III開裂し、
５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけた
（TBE緩衝液）。Hind III Bフラグメント（49j）を含有
するゲル領域を切り取り、該ゲルからDNAを電気溶離し
た。フエノール−クロロホルム抽出の後、エタノール沈
殿によつてDNAを濃縮し、これをHind III−開裂pUC13
（49k）にクローンすることにより、プラスミドpAd Hin
d Bを得た。このHind IIIサブクローンをHind IIIおよ
びSal Iで消化し、アデノウイルスの17.1−25.9に及
ぶ、コ・オーデイネーツ（配位物）を単離した。このフ
ラグメントをHind III、Sal I開裂pUC13にクローンし、
プラスミドpUCHSを得た。pAd Hind BからSal I〜Xho I
フラグメント、即ち25.9−26.5コオーデイネーツを単離
し、pUCHSの単一のSal I部位にクローンし、pUCHSXを生
成させた。このプラスミドは、アデノウイルス配列の、
第一番目の後期（late）リーダー介在配列内の17.1の位
置から、第三番目の後期リーダーエクソン内の26.5位の
Xho I部位に至る範囲を回復している。 アデノウイルスのメジヤー・レート・プロモーター
は、アクリルアミドゲルからHind III C、ＤおよびＥフ
ラグメント（これらは一緒に泳動する）を切除し、これ
らをpUC13のHind III部位にクローニングし、Hind III
Cフラグメントを含有する組換え体を制限分析法によつ
てスクリーニングすることにより、クローンした。この
サブクローンをSac I消化し、同じくpUC13のポリリンカ
ー内にあるメジヤー・レート・プロモーター（49j）の
５′側、15.4位で切断した。このDNAを再び閉環させてp
MLP2を得た。これは、pUC13のSac IおよびHind III部位
にクローンされているSac I〜Hind IIIフラグメント
（位置、15.4−17.1）を含有している。 E. ネオマイシン耐性ベクターの組立て E.coliトランスポゾン５内に含まれているネオマイシ
ン耐性マーカーをTn5含有プラスミドから単離した（49
l）。ネオマイシン耐性遺伝子の配列は既に公表されて
いる（49m）。このネオフラグメントをBgl II消化に体
し、ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子の翻
訳開始コドンの５′側36bp位で開裂させ、これをエキソ
ヌクレアーゼBal31で処理した。このホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子をBamH Iで切断し、翻訳終止コドンに続
く342bpでDNAを開裂し、pBR322のうめ込み処理したHind
III部位とBamH I部位との間に挿入した。その１つのク
ローンであるpNec Bal6は、うめ込み処理されたHind II
I部位の３′側、3bpの位置に翻訳開始コドンを有してい
た（TCATCGATAAGCTCGCATG…）。このプラスミドをCla I
とBamH Iで消化し、ホスホトランスフエラーゼ遺伝子を
含む1145bpフラグメントを単離し、これを哺乳類発現ベ
クター、pCVSVEHBS（下記参照）に挿入した。得られた
プラスミドpSVENeo Bal6は、ネオマイシンホスホトラン
スフエラーゼ遺伝子をSV40初期プロモーターの３′側
で、HBV表面抗原遺伝子（49n）の５′側に位置して含有
している。このプラスミドは、哺乳類の組織培養細胞に
導入した時、ホスホトランスフエラーゼ遺伝子を発現さ
せると共に、アミノグルコシツドG418（29o）に対する
耐性を付与することができる。 F.組織培養細胞のトランスフエクシヨン BHK21細胞（ATCC）は組織培養で増殖させた脊椎動物
の細胞である。これらの細胞は、当業者周知の如く、正
常細胞から単離され、継次連続転移（successive seria
l transfer）によつて調製された永久細胞系列（統）と
して保持することができる。この細胞系列は、液体媒質
中の固体支持体上に保持されているか、または支持栄養
素を含有する懸濁液中で増殖させることにより、保持さ
れている。 この細胞を（49p）の方法を用いて上記の如く調製し
た所望のベクター５μｇ（４μg pAML3P、8c1および１
μｇのpSVE neo Bal6）でトランスフエクトした。 この操作においては、特定の宿主細胞に対して、集団
のプラスミドが相互に作用する、ということが保証され
ているので、あるプラスミドが細胞内に吸収されたなら
ば、他のプラスミドも同様に吸収されたとみなし得る
（49q）。従つて、第一の暗号配列と第二の暗号配列と
を別々のベクターを用いて導くこと、およびこれらの両
配列を含有する単一のベクターを用いて導くことができ
る。 G. トランスフエクトされた細胞の増殖、およびペプチ
ドの発現 上記の如くトランスフエクシヨンに供した細胞を、ま
ず、非選択培地で２日間増殖させ、次いで該細胞をG418
（400μg/ml）含有培地に導き、プラスミド・ホスホト
ランスフエラーゼを発現し得る細胞を選択した。G418の
存在下で７〜10日後には、コロニーが肉眼で観察できる
様になつた。数百のコロニーをトリプシ処理し、再度平
板培養してG418耐性細胞を径10cmの皿状に、急速に全面
増殖させた。 この細胞集団は、種々の初期成分を表す細胞で構成さ
れていた。次に、F VIII発現プラスミドのコピーを最も
数多く有する細胞を得るために、これらの細胞をDHFRタ
ンパク質阻害物質と一緒にインキユベートした。 H. メトトレキセート処理 G418耐性細胞は、50nM以上の濃度において特異的なDH
FR阻害剤であるメトトレキセート（MTX）によつて阻害
される。組織培養細胞に対するMTXの作用に関する従来
の研究と同様に、F VIII発現ベクターに含有されている
DHFR遺伝子のコピーを多数発現することによつてMTXに
抵抗し得る細胞を選択し、それに付随してF VIII暗号配
列の発現の増加を観察した。MTXの量を段階的に増加す
ることによりプラスミドpAML3P.8c1の増幅に影響を及ぼ
し、コピー数を増加させた。増幅程度の上限は多くの因
子によつて左右されるが、この方法により、ミリモル単
位の濃度のMTXに耐性である、数百または数千のDHFR発
現（即ち、F VIII発現）プラスミドを有する細胞を選択
することができる。 第VIII因子を発現させるために、pAML3P.8c1およびpS
VE Neo Bal6でトランスフエクトして得たG418−耐性BHK
細胞を既述の如く100nMおよび250nMのMTXを含有する培
地内でインキユベートした（49r）。７−10日後、250nM
のMTXに耐性を有する細胞の第VIII因子発現を、活性、
ラジオイムノアツセイおよびmRNAのノーザン分析法によ
つて調べた。 I. 第VIII因子抗体 この研究においては、第VIII因子に対する様々なポリ
クローナル抗体および単クローナル抗体を用いた。CCは
重篤な血友病患者の血漿から導かれた抗体である（49
s）。C8は第VIII因子の210kDタンパク質部分と結合する
中和モノクローナル抗体である（49t）。C10はC8と同じ
特性を有するモノクローナル抗体であつて、（49t）記
載の方法と実質上同様にして単離された。第VIII因子の
80kD部分と結合する市販の中和モノクローナル抗体は、
シンバイオテイツク・コーポレーテツド、サン・テイエ
ゴ、CA.（Synbiotic Corp.,San Diego,CA.）から、Prod
uct No.10004の下、入手した。C7F7は第VIII因子の80kD
部分と結合する中和モノクローナル抗体である。C7F7の
誘導および精製法は次の通りである:6週令の雌BALB/cマ
ウスに約10μｇの精製第VIII因子を反復接種し、最後の
接種から３日後に、脾細胞とX63−Ag8.653マウス骨髄腫
細胞（49u）と融合させた。先に述べたプロトコールに
従つてハイブリダイゼーシヨン、並びにクローニング法
による雑種細胞の単離を行つた（49r）。クローンを生
成している特異抗体を固相RIA法で検出した（49w）。次
に、陽性クローンの凝固遅延効果を、上の文献に記載さ
れているAPTT分析法で調べた。モノクローナルC7F7をシ
ンジネイツクな動物内で増殖させることにより増加させ
た；抗体を、プロテインＡ−セフアロースCL−4Bクロマ
トグラフイーにより、腹水症患者の腹水から精製した
（49x）。 J. 第VIII因子に関するラジオイムノアツセイ BHKその他の細胞系列から生産された第VIII因子を分
析するために、２種類のラジオイムノアツセイ（RIA）
を開発した。２方法はいずれも固体支持体に結合したCC
抗体に第VIII因子を結合させることを含む、２段階分析
法である（49t）。この免疫複合体を、次いでI125標識C
10（抗体（210kD特異抗体）またはI125標識C7F7（80特
異抗体）で検出した。 ２段階RIAを以下に簡単に説明する：微量力価検定皿
（マイクロタイター・デイツシユ）の16個のくぼみを、
予めプロテインＡ−セフアロース・クロマトグラフイー
（49x）で精製したCC抗体2.5mg/を含有する50mM NaHC
O3緩衝液（pH9.6）100μで一夜覆つておく。くぼみを
トウイーン20（Tween20）0.05％を含有するPBS200μ
で３回洗浄し、ゼラチン0.5％とメチオレート0.01％と
を含有するPBS200μにより、１〜２時間、ブロツク
（遮断）処理した。これらのくぼみを前回と同様に洗浄
し、試料100μを加えて一夜インキユベートした。く
ぼみを洗浄し、I125で標識した（82）C10またはC7F7抗
体を加え（1000cpm/μ）、６〜８時間インキユベート
した。再度くぼみを洗浄し、計数した。1:10〜1:30の割
合で希釈した正常血漿試料により、標準曲線を作成し
た。 K. 第VIII因子モノクローナル抗体カラム ヒト第VIII因子モノクローナル抗体カラムを、1.0mg
のC8抗体（0.1M NaHCO3（pH8.5）中）と、1.0mlのAffi
−Gel10（バイオ−ラツド・ラボラトリーズ、リツチモ
ンド、カルフオルニア（Bio−Rad Laboratories,Richmo
nd,CA））とを４℃で４時間インキユベーシヨンするこ
とにより、調製した。バイオ−ラツド・プロテイン・ア
ツセイ（Bio−Rad Protein Assay）（バイオ−ラツド・
ラボラトリーズ）により、95％以上の抗体がゲルと結合
していることが確認された。このゲルを、50倍容量の水
と10倍容の0.15M NaClを含有する0.05Mイミダゾール（p
H6.9）で洗浄した。 L. 培地のモノクローナルカラムによるクロマトグラフ
イー 培地をモノクローナル抗体カラム（樹脂1ml）に適用
し、0.15M NaClを含有する0.05Mイミダゾール緩衝液（p
H6.4）で、280nmにおける吸収を示す物質が洗い流され
てしまうまで洗浄した。このカラムを1.0M KIおよび20
％エチレングリコールを含有する0.05Mイミダゾール（p
H6.4）で溶離した。試料を測定のために希釈し、以後の
分析に備えて透析した。 M. 第VIII因子融合タンパク質および融合タンパク質抗
血清の調製 融合タンパク質を発現させるために組立てたプラスミ
ドを含有するE.coliを37℃においてＭ−９培地内で増殖
させた。2.5時間から４時間の間にインドール酢酸を最
終濃度が50μg/mlとなる様に加えて融合タンパク質の発
現を誘導した。細胞を遠心して集め、使用するまで凍結
しておいた。 融合物３用の細胞ペレツトを、リゾチーム10μg/ml並
びに、RNaseおよびDNase各１μg/mlを含有する20mMりん
酸ナトリウム（pH7.2）100ml中に懸濁した。この懸濁液
を、細胞ペレツトが完全に分散されるまで、室温で30分
間撹拌した。次いで、この懸濁液を４分間超音波処理し
た（出力60％のパルス）。この溶液をSorvall RC−2B遠
心機により、GSAローター内で、8000rpmにおいて遠心し
た。得られたペレツトを0.02Mりん酸ナトリウム（pH7.
2）100mlに再懸濁した。この懸濁液に60％グリセリン30
0mlを積層した。この試料をRC−3B遠心機により、4000r
pmで20分間遠心した。グリセリン層が２層に分離した。
SDSアクリルアミドゲル上で分析したところ、ペレツト
と底部のグリセリン層はいずれも予測された分子量25,0
00ダルトンのタンパク質のシングルバンドを示した。こ
のペレツトを0.1％SDSを含有する0.02Mりん酸ナトリウ
ム緩衝液に溶かした。再懸濁したペレツトと下方のグリ
セリン層とを0.02M重炭酸アンモニウム（pH8.0）に対し
て透析し、グリセリンを除去した。この溶液を凍結乾燥
し、0.1％SDS含有0.01Mりん酸ナトリウム緩衝液に再び
溶かした後、使用するまで凍結しておいた。 融合タンパク質１および４を得るために、この細胞ペ
レツトを0.3M塩化ナトリウムと5mM EDTAを含有する0.05
Mトリス（pH7.2）に懸濁した。リゾチームを濃度10μg/
mlになる様に加えた。試料を室温で５分間インキユベー
トした。NP−40を濃度0.2％になる様に加え、この懸濁
液を氷浴中で30分間インキユベートした。塩化ナトリウ
ムを、最終濃度が3Mになる様に加え、DNaseを加えた
（１μg/ml）。この懸濁液を室温で５分間インキユベー
トした。試料を遠心し、上澄液を捨てた。ペレツトを少
量の水に再懸濁し、再び遠心した。得られた細胞ペレツ
トを0.1％〜１％のSDSを含有する溶液に溶かし、これ
を、プレパラテイブSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、次いで融合タンパク質のバンドを電気溶離す
るか、あるいは、0.1％SDS含有0.1Mりん酸ナトリウムで
平衡させたTSK3000カラムを用いてHPLCにかけ、精製し
た。 ウサギ抗血清は、ニユージーランド白ウサギに、フロ
インド完全アジユバントに懸濁した融合タンパク質試料
を注射し（一次接種）、２週間の間隔をあけてフロイン
ド不完全アジユバントに懸濁した試料を接種し、促進し
た。６週間後、血清をとり、ウエスタン・ブロツト法に
よりヒト血漿由来の第VIII因子タンパク質との反応性を
調べた。 N.第VIII因子活性の発現を検出するための分析法 Ａ型血友病血漿の修正−理論：第VIII因子の活性を、第
VIII因子を欠く血漿における凝固欠損を修正することの
活性として定義する。第VIII因子活性の単位は、正常な
ヒト血漿1ml中に存在する活性を１単位として定めた。
測定方法は、Ａ型血友病（古典的血友病）の診断が下さ
れた患者から得た血漿中にフイブリン・クロツト（繊維
素の凝塊）が形成されるまでに要する時間の測定に基
く。この測定においては、凝塊の形成に要する時間が短
かい程、被検試料中の第VIII因子の活性が大きいといえ
る。この形式の測定により得た値を、賦活化−部分的ト
ロンボプラスチン時間（APTT）と表す。この様な測定法
に用い得る試薬は市販品から入手可能である（例えば、
ジエネラル・ダイアグノステイツクス・プラテリン・プ
ラス活性化剤、製品番号35503（General Diagostics Pl
atelin Plus Activator;Product number35503））。 方法：全ての凝固アツセイ（測定）はホウケイ酸ガラス
製の試験管（10×75mm）を用いて行つた。サーフアシル
（Surfasil、ピアス・ケミカル・カンパニー、ロツクフ
オード、イリノイス（Pierce Chemical Company,Rockfo
rd,Il.）製）を石油エーテルにより、1:10の割合で希釈
したものを用いてシリコーン処理（siliconization）を
施した。即ち、試験管にこの溶液を入れ、15秒間インキ
ユベートした後、該溶液を除去した。試験管を水道水で
３回、次いで蒸留水で３回洗浄した。 プラテリン・プラス活性化剤（Platelin Plus Activa
tor）（ジエネラル・ダイアグノステイツクス，モーリ
スプレーンス，ニユージヤージー（General Diagnostic
s,Morris Plains,NJ））を、包装紙に記載されている指
示通り、蒸留水2.5mlに溶かした。凝固アツセイ用の試
料を調製するために、プラテリン・プラス・アクテイベ
ーター溶液を37℃で10分間インキユベートし、使用する
まで氷浴上で保存した。シリコーン処理した試験管にプ
ラテリン・プラス活性化剤50μと第VIII因子欠損血漿
（ジヨージ・キング・バイオメデイカル・インコーポレ
ーテツド、オーバーランドパーク・カンサス（George K
ing Biomedical Inc.,Overland Park,KA））50μとを
加えた。この溶液を37℃で合計９分間インキユペートし
た。上記溶液に対する９分間のインキユベーシヨン処理
が終了する直前に被検試料を0.02％のウシ血清アルブミ
ンを含有する0.05Mトリス−HCl（pH7.3）で希釈した。
血漿／活性化剤懸濁液に希釈した試料50μを加え、正
確に９分経過した時点でこの懸濁液のインキユベーシヨ
ン物内に50μの塩化カルシウム（0.033M）を加えて凝
固カスケードを開始させた。この反応混合物を素早く混
合し、フイブリン・クロツトの形成が認められるまでの
間、この試験管を監視下、静かに撹拌した。第VIII因子
活性の標準曲線は、正常血漿（ジヨージ・キング・バイ
オメデイカル，インコーポレーテツド，オーバーランド
パーク，カンサス）を1:10、1:20、1:50、1:100および
1:200の割合で希釈することにより、得られる。片対数
グラフ用紙を使用し、このクロツテイング時間を血漿の
希釈率に対してプロツトする。次いで、この図を用いて
クロツテイング時間を、第VIII因子活性（単位）に変換
することができる。 O. 色素原ペプチドの測定 理論：第VIII因子は、第IX a因子、りん脂質、およびカ
ルシウムイオンの存在下における第Ｘ因子の第X aの因
子への活性化において機能的である。第IX a因子、第Ｘ
因子、りん脂質およびカルシウムイオンが供給された場
合における高度に特異的な測定法を企画した。即ち、こ
の測定法における第X a因子の形成は、第VIII因子活性
の供給源の添加に依存している。この測定系に第VIII因
子を多く加えれば、それだけ多くの第X a活性が生成す
る。第X a因子を生成させてから、反応混合物中に色素
源ペプチド基質を加える。このペプチドは第X a因子に
よつて開裂されるが第Ｘ因子によつては影響されず、ま
た他のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）によつては
徐々にしか開裂されない。この基質は開裂されて405nm
に吸収を示すパラ−ニトロ−アニリド基を放出するが、
開裂されていないペプチド基質はこの波長において殆ん
ど、または全く吸収を示さない。色素源基質の開裂によ
る吸収の生成は、インキユベーシヨン時間経過後の被検
混合物中の第X a因子の量に依存しており、この量はま
た反応混合物に加えた被検試料中に含まれている機能的
な第VIII因子の量に依存している。この測定法は第VIII
因子活性に極めて特異的なので、第VIII因子欠損血漿分
析法の如く、間違つて陽性を示すおそれは殆んどない。 方法：第VIII因子コアテスト（Coatest factor VIII）
を、ヘレナ・ラボラトリーズ、ビユーモント、テキサス
（Helena Laboratories,Beaumont,TX）（Cat.No.5293）
から購入した。使用した基本的な手法は製造業者が第VI
II因子の含有量が５％以下である試料に関して指示して
いる“エンド・ポイント法”に実質上従うものである。
指示されている様に、測定の感度をより高くするために
インキユベーシヨン時間を延長した。また、ある測定に
際しては業者指定の試薬量を変更した。このプロトコー
ルにおける変更は全体的な測定結果を妨害することはな
い。 第X a因子のために用いる色素原基質（Ｓ−2222＋Ｉ
−2581）を10mlの水に溶かし、基質濃度2.7ミリモル／
の液を得る。この基質溶液を分け、−20℃で冷凍保存
した。第IX a因子および第Ｘ因子を含有しているF IX a
＋F X試薬を水10mlに溶かした。この溶液を分け、使用
するまで−70℃で冷凍保存した。更に、次の一連の溶液
をも用意した:0.025M塩化カルシウム；りん脂質（ブタ
の脳）；バツフアー・ストツク溶液（Buffer Stock Sol
ution;測定用に、ストツク溶液（１部）を水（９部）で
希釈した溶液であり、最終濃度は0.05Mトリス−HCl（pH
7.3）（ウシアルブミンを0.02％含有）である）。これ
らの溶液は使用するまで４℃で保存した。 りん脂質＋F IX a＋F X試薬は、りん脂質１容量とF I
X a＋F X試薬５容量とを混合することにより調製した。 方法は以下の通りである。 ブランク試薬に対する試料の405nmにおける吸光度を
分光光度計により、30分以内に測定した。 405nmにおける吸光度は、正常人のヒト血漿標品（ジ
ヨージ・キング・バイオメデイカル、オーバーランド・
パーク、カンサスシテイ）を用いて測定値から外挿して
得た第VIII因子の単位数と相関々係にあつた。 以下に好ましい実施態様を挙げ、本発明を詳しく説明
する。 実施例 1. 第VIII因子遺伝子を得るための一般的な手法 組換えDNA遺伝子産物を得るための、最も一般的な方
法は、適当な組織または細胞型のmRNAから得たcDNAクロ
ーンで構成されるライブラリーをスクリーンする方法で
ある。第VIII因子遺伝子のためのゲノムDNAのスクリー
ニングに通常とは別の方法をも用いる理由としていくつ
かの因子を挙げることができる。第１は、第VIII因子の
合成部位が不明である、ということである。しばしば、
最も可能性の高い合成部位として肝臓が考えられていた
が、その証拠はあいまいである。肝臓および多分脾臓で
合成されているであろうということが、器官潅流および
器官移植研究において示唆されていた（56）。しかしな
がら、第VIII因子活性は、しばしば重篤な肝障害を有す
る患者で増加している（56a）。最近の、モノクローナ
ル抗体と細胞との結合を利用して行われた相矛盾する研
究結果によると、このタンパク質が最も高レベルに検出
されたのは、肝ジヌノイド内皮細胞（51）、肝細胞また
はリンパ節細胞（量は肺、肝臓および脾臓の順に続く；
（53））のいずれかであつた。それと対照的に、第VIII
因子に関する抗原（フオン・ウイルブランド・フアクタ
ー（von Willebrand Factor））が内皮細胞で作られて
いることは、ほぼ確実である（54）。供給源である組織
が不確かであるばかりか、血漿中の第VIII因子の濃度は
極端に低い。例えば、その循環濃度約100−200ng/ml（5
5）という値は、血清アルブミンのモル濃度の約1/2,00
0,000に相当する。従つて、ある特定の組織のmRNAから
得られたcDNAライブラリーが第VIII因子のクローンを与
え得るか否かは不明である。 これらの点を考慮し、まず、バクテリオフアージ・ラ
ムダ中のヒトゲノムの組換えライブラリー（以下、ゲノ
ムライブラリー（genomic libraries）と症する）をス
クリーンすることを決定した。ゲノムライブラリーは第
VIII因子遺伝子を含有しているはずであるが、存在する
と思われるイントロンが組換えタンパク質の完全な発現
を妨げるおそれがある。一般的な手順は次の通りであ
る： 1. ヒト第VIII因子タンパク質の配列が決定された部分
に対するゲノム・クローンの同定を行う。 2. mRNAの全暗号領域を包含している重なり合つたゲノ
ムクローンを得るために“ゲノム・ウオーク（genomic
walk）”を行う。 3. ゲノムクローンのフラグメントを用いて第VIII因子
のmRNAの供給源である組織または細胞のRNAにブロツテ
イング法でバイブリダイゼーシヨンさせ、その様なRNA
を含む細胞を同定し、これらの細胞からcRNAクローンを
得る。 4. No.3と平行して、ゲノムクローンの一部をSV40組換
え“エクソン発現”プラスミド内で発現させるために使
用する。これらのプラスミドを組織培養（cos）細胞に
トランスフエクトして転写されたRNAは、インビボで切
断されるはずであり、これもまた組換え第VIII因子タン
パク質の発現に好適なcDNAクローンの供給源として利用
し得る。 これらの試みに関する実際の工程には、cDNAクロー
ン、数種のタイプのゲノムクローン、およびSV40“エク
ソン発現”クローン（これらについてはそれぞれ必要に
応じて別個に記述する）からの情報を相互に関連させ、
同時に発現させることが含まれる。 2. ゲノム・ライブラリー・スクリーニング法 第VIII因子遺伝子はヒトＸ染色体上に存在することが
知られている（56）。陽性クローンを増加させるため
に、4X染色体を含む個体から得たDNAでゲノムライブラ
リーを組立てた（リンパ芽球細胞系列はXXXXYの核型を
有する；本明細書では、このDNAから組立てられたライ
ブラリーを“4Xライブラリー”と表す）。49,XXXXY DNA
をSau3A I部分消化に付し、適当なサイズの画分をλフ
アージまたはコスミツドベクターにライゲートした。こ
れらλ/4Xおよびコスミツド/4Xライブラリーの組立ての
詳細に関しては後述する。λ/4Xライブラリー中に第VII
I遺伝子が含まれる予想頻度はおよそ110,000クローン当
り１個であり、同じくコスミツドライブラリーに関して
はおよそ40,000当り１個の割合である。 これらのライブラリーを、第VIII因子タンパク質の配
列の一部に基く合成オリゴヌクレオチドを用いてスクリ
ーンした。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、コ
ドン選択利用分析（codon choiceusage analysis）に基
いて30〜100個のヌクレオチドからなる一本鎖配列であ
るとされたもの（ロング・プローブ）と、選択された各
コドンに関して可能な全ての縮重の組合せで特定され
た、14〜20個のヌクレオチド長さを有するプローブ（シ
ヨート・プローブ）との２つの型に分けられる。 ロング・プローブの主な利点は、それらをタンパク質
の任意の10−30アミノ酸配列に基いて合成することがで
きる、という点にある。これはコドンの重復度の低い特
定の領域を見出すことを要しない。もう１つの利点は、
遺伝子配列との正確な合致が必要でないために（唯、相
補的な10−14ヌクレオチドの伸長部位が必要である）、
イントロンの存在による、あるいは遺伝子の多形性また
はタンパク質の配列上のエラーによつて引き起こされた
相補性の中断が必ずしもハイブリダイゼーシヨンの有用
性を妨げない、という点にある。ロング・プローブの欠
点は、各アミノ酸について唯一個のコドンしか選択され
ない、という点である。我々は、コドンを選択するに際
して哺乳類に関するコドン頻度表（57）により、これに
よつては好適なものが明らかでない場合には、第IX因子
遺伝子（58）のコドンの利用方法に基いて行つた。ロン
グ・プローブの推定配列の適合性の如何が不明であるの
で、ハイブリダイゼーシヨン・ストリンジエンシイは、
各プローブ毎に、経験的に定めなければならない。この
ことは、ゲノムDNAブロツトとハイブリダイゼーシヨン
させ、様々なストリンジエンシーで洗浄することによつ
て調べる。 シヨート・プローブの利点は、可能なコドンの各々を
オリゴヌクレオチドのプールとして合成することができ
る、という点にある。従つて、アミノ酸配列が正しけれ
ば、そのシヨート・プローブは常に懸案の遺伝子とハイ
ブリダイズするに相違ない。主な制約は、合成される配
列のプールが複雑である、という点にある。操作上、ゲ
ノムライブラリーとのハイブリダイゼーシヨンの制限が
示されるプールの最大のサイズは、その中に32個の異る
配列が含まれているものである。このことは、コドンの
重複度の低い領域のタンパク質配列のみを使用できるこ
とを意味する。代表的なプローブは、タンパク質配列中
の６−アミノ酸フラグメントについて可能な全配列を特
定している1617マーのプールである。 ロングプローブと同様に、シヨートプローブに関して
も使用されるハイブリダイゼーシヨン・ストリンジエン
シイは経験的に求められた。その理由は、日常的に用い
られるハイブリダイゼーシヨン条件（６×SSC）の下で
は、ハイブリツドの安定性は２つの因子（即ち、長さと
Ｇ−Ｃ含量）に依存するので、Ｇ−Ｃ含量の低いプロー
ブのストリンジエント条件は、Ｇ−Ｃ含量の高いそれの
ストリンジエントとは全く同じでないことにある。1617
マーの典型的なプールはＧ−Ｃを41−65％の範囲内で含
有しており、これらのプローブは10℃以上の温度領域
（48゜〜58℃）で６×SSC中に融解すると思われる。16
プール内の正確な配列は予めわかつていないので、丁度
48℃より低いハイブリダイゼーシヨン・ストリンジエン
シイを利用し、Ｇ−Ｃ含量が最も低い配列をハイブリダ
イゼーシヨンさせる。しかしながら、多くのクローンを
スクリーニングすると、この方法では、多数のより短
く、またはより高いＧ−Ｃ含量のものが偽の陽性を示し
得る。１塩基対についての融解温度の変化は１〜２℃で
あるので、17の内、12−13の短い配列のプローブも、そ
れらのＧ−Ｃ含量が高ければ結合するであろう。16 17
マーのプールしたプローブは、ヒトゲノム中において無
作為に、17塩基配列と同じく13塩基配列と1200回ハイブ
リダイズする。 シヨート・プローブを用いるハイブリダイゼーシヨン
において、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ塩基対の安定性を同等に
すると共に、高度に複雑なDNA配列のライブラリーをス
クリーンする場合のシヨートプローブの有用性を著しく
促進し得る様な、シヨートプローブのハイブリダイゼー
シヨン技術を開発した。 図2Aは、通常（６×SSC）および3.0M TMACl条件下で
の４つのシヨートプローブの融点をプロツトしたグラフ
である。3.0M TMACl中では、プローブはその長さと略直
線関係の融点を示しているのに対し、６×SSC中では、
融点はＧ−Ｃの含量によつて大きく左右されている。６
×SSC中において13マーの示している高い融点は、明き
らかにＧ−Ｃ含量が65％であるとの結論を証明してい
る。図2Bは、3.0M TMACl中における11〜数千の塩基長さ
を有するプローブの機能を表す融点を示すグラフであ
る。この図から、所望の長さに正確に合致する長さを有
するプローブのためのハイブリダイゼーシヨン条件を素
早く選択することができる。 このTMAClハイブリダイゼーシヨン法は、ある、既知
の長さのものと正確に合致（適合）する配列を必要とす
る場合に極めて有用である。この方法には、例えば下記
の方法が含まれる:1. 16 17マーのプールを用いてヒト
ゲノムライブラリーをスクリーニングする。我々は50℃
において3.0M TMACl洗浄を行い、17,16、並びに極く僅
かな15塩基配列をハイブリダイゼーシヨンさせた。かく
して、数多くの、よりホモロジーの低い、Ｇ−Ｃ含量の
高いプローブを除去した。2. シヨートプローブによる
スクリーンで、配列決定の容易な陽性配列が余りにも多
く得られたならばTMACl融解法によつて、最も可能性の
高いものを見つけ出すことができる。陽性配列のレプリ
カをハイブリダイズし、２℃の温度間隔で（17マーの場
合（融解温度54℃）は、46,48,50,52,54および56℃を採
用することができる）洗浄する。最も高温で融解する陽
性配列がプローブと最も緊密に適合している。既知の配
列を標準に用いることにより、17マーに関しては、その
ホモロジーを±１塩基またはそれ以上の確率で予測する
ことができる。3. 同様に、ロングプローブによるスク
リーンであまりにも多くの陽性の配列が得られたなら
ば、同じタンパク質配列に基く、シヨートプローブのプ
ールを得ることができる。このプールの中の１つが完全
に適合するかもしれないので、TMAClによる融解実験に
より、最も有望な陽性配列の選択をより精密に行うこと
ができるであろう。4. 部位指向性（sitedirected）突
然変異誘発においては、通常、中心部に１またはそれ以
上の変化を含む20ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチ
ドが合成される。20マーの中央に１塩基の不適合がある
だけでも、TMACl洗浄法により、親配列と、突然変異誘
導体とを容易に識別することができる。このことは、所
望の突然変異が正確にプローブと適合することに起因す
る。洗浄の条件は図2Bから単純に求めることができる。
5. 緊密に関連している遺伝子系列（フアミリー）の中
から特定の１遺伝子を選び出す。上記と同様の融解実験
により、100の極めて似通つた配列の集りの中から１つ
の特定の遺伝子が選び出された。 3. 第VIII因子ゲノムクローンの最初の単離 第VIII因子に富む標品は、多電解質クロマトグラフイ
ーおよび免疫吸着法により、ヒト−クリオプレシピテー
ト（寒冷沈降物）から既述の如く調製した（79）。この
物質を0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と１％重炭
酸アンモニウムに対して透析して凍結乾燥し、使用まで
−20℃において保存した。 第VIII因子標品は他の血漿タンパク質で汚染されてい
るので、第VIII因子を精製すると共に、第VIII因子から
導かれることが確かである様々なポリペプチド鎖を分離
するために、更に分画する必要がある。このことは、ト
ーヤ・ソーダ（Toya Soda）TSK4000SWカラムを用いてSD
Sの存在下、高速液体クロマトグラフイーに付すことに
より、達成された。この様なクロマトグラフイー法では
タンパク質を分子量に応じて分離できる。 凍結乾燥タンパク質を再び蒸留水に入れ、これを１％
SDSおよび0.1Mりん酸ナトリウム（pH7.5）に調節した。
TSKカラム（0.75×50cm;オールテツク、デイアーフイー
ルド（Alltech,Deerfield）IL）を室温で0.1Mりん酸ナ
トリウム（pH7.0）中0.1％SDS溶液により、平衡させ
た。試料約0.15〜0.25mlを注入し、カラムを流速0.5ml/
分でイソクラテイクに展開させた。280nmにおける吸収
を監視し、その分画0.2mlを得た。代表的な溶離像を第1
5図に示す。一部をとり、ポリアクリルアミドの濃度勾
配が５〜10％である。ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド・勾配ゲル電気泳動にかけ、銀染色法で解析
した（80）。25分後に溶離した物質は80,000および78,0
00Dの二本鎖（doublet）タンパク質であつた。これらの
タンパク質を含む画分を、第15図の棒（バー）で示した
様に、プレパラテイブTSKに、別々に、３回付してプー
ルし、使用に供するまで−20℃で保存した。 TSK分画から精製した80,000ダルトンのタンパク質
（0.8ナノモル）を窒素雰囲気下、8M尿素、0.36Mトリス
−HCl（pH8.6）および3.3mMエチレンジアミン−四酢酸
に対し、一夜透析した。上記の透析用緩衝液中に10mMジ
チオトレイトールを加えることによりジスルフイド結合
を還元した。最終的な容易は1.5mlであつた。システイ
ンを5Mヨード酢酸（1M NaOHに溶かした溶液）15μで
アルキル化した。このアルキル化反応は暗所において室
温で35分間行い、ジチオトレイトールを最終濃度が100m
Mになる様に加えて止めた。このタンパク質溶液を0.1M
重炭酸アンモニウム中、8M尿素液に対して４時間透析し
た。この透析液の尿素濃度を24時間の間に徐々に希釈
し、変化させた（8M、4M、2M、1Mおよび最終尿素濃度0.
5M）。還元し、アルキル化した80,000ダルトンのタンパ
ク質にTPCK−処理トリプシン（Sigma Chem.Co.）を、第
VIII因子タンパク質30部：トリプシン１部の重量比で加
えてトリプシン消化を行つた。この消化を37℃で12時間
継続して行つた。この反応混合物を使用するまで凍結し
ておいた。トリプシン処理ペプチドの高速液体クロマト
グラフイーによる分離を、高速分割Synchropak RP−PC
−18カラム（0.46×25cm、10μ）上で、室温でSpectra
−Physics8000クロマトグラフを用いて行つた。試料約
0.8mlを注入し、カラムを、0.1％トリフルオロ酢酸中、
アセトニトリル勾配溶液（１％〜70％/20分）で展開し
た。210nmおよび280nmの吸収を監視した（１％〜７％）
（第16図）。各ピークに相当する画分を集め、Beckman
スピニング・キヤツプ・シーケンサー中で、オン−ライ
ンPTHアミノ酸同定法による配列決定に付すまで４℃で
保存した。第16図において、矢印の位置はアセトニトリ
ル約23％で溶離した部分であり、配列:AWAYFSDVDLEKを
有するペプチドを含有するピークである。この配列は、
ヒトゲノム・ライブラリーのスクリーニングのためのオ
リゴヌクレオチドプローブ8.3を生成せしめるために用
いたものである。 これまでに論じた事に基いてロングおよびシヨートプ
ローブが合成された。使用した第２のロングプローブ
は、第VIII因子のトリプシン処理−フラグメントである
12個のアミノ酸から成る配列:AWAYFSDVDLEKに基いてい
る。このプローブのために合成するよう選択されたDNA
配列は、５′−CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC
であつた。このプロープ（8.3と称する）を、まずゲノ
ム・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨンで試験した。図
3Aは、標識した8.3プローブとゲノム・サザーン・ブロ
ツト法でハイブリダイズした正常な雄（IX）および49,X
XXXY（4X）DNAを種々のストリンジエンシイーで洗浄し
て得た像である。最高のストリンジエンシイー（IX SS
C、46℃）においてさえ、3.8kb（EcoR I）および9.4kb
（BamH I）のシングルバンドがみられたにすぎない。こ
のバンドのIXレーン（列）と4Xレーン中の強度比は、Ｘ
−結合第VIII因子遺伝子のそれについて予測された如
く、約1:4であつた。対照実験においては、既知のＸ−
結合遺伝子プローブ（第IX因子）のハイブリダイゼーシ
ヨン比は、常染色体性遺伝子（アルブミン）のそれが1:
1であるのに対して、予測された比率1:4を示すことが証
明された。 これらのゲノム・ブロツト法の結果に基き、8.3プロ
ーブをλ/4Xライブラリーをスクリーンするのに用い
た。500,000個のフアージを50個の150mm平板上で増殖さ
せ、ニトロセルロースフイルターを２回、32P−標識8.3
プローブとハイブリダイズ（洗浄のストリンジエンシ
イ:IX SSC、37℃）した（第３図）。再試験によつて、1
5の強くハイブリダイズしたクローンと15のそれより弱
くハイブリダイズしたクローンとを得た。これらの単離
したプラークからDNAを調製し、制限エンドヌクレアー
ゼで開裂し、プローブ8.3によるブロツト・ハイブリダ
イズに付した。強くハイブリダイズしたクローンの多く
が、ゲノム・ブロツトにより検出したものと同じ大きさ
の、ハイブリダイズした3.8kbのEcoR Iフラグメントを
与えた。さらに、強くハイブリダイズしたクローンの全
てが、8.3kbプローブとのハイブリダイゼーシヨンに際
して262塩基対のSau3A Iフラグメントと同じ挙動を示し
た。Sau3A Iフラグメントを一本鎖フアージベクターM13
mP8（86）にクローンし、ハイブリダイゼーシヨンによ
つてスクリーンし、ジデオキシ法に従つて配列決定を行
つた。この262bpフラグメントのDNA配列は8.3プローブ
とかなりのホモロジー（相同性）を示した。このホモロ
ジーは、全体の84％がホモロジーであると共に、14およ
び10bpの連続的に合致する領域がある、ということを含
む。このペプチドフラグメントの最初の10残基は、組換
えクローンのDNA配列から推定されるそれと一致してお
り、しかも、トリプシン処理による生産物から予測され
る様に、リジンコドンによつて先行されていた。最後の
２つの予測残基はDNA配列と合致していなかつた。しか
しながら連結部（juncture）のDNAは、RNAのスプライス
部位供与配列（60,61）と良好な一致を示し、すぐ後
に、３つの可能な解読フレーム中の終止コドンが続いて
いた。このことは、この位置から始まるイントロンが存
在していることを暗示している（この暗示は下記のcDNA
クローンによつて確認された）。ホモロジー領域の５′
側に約400bのオープン・リーデイング・フレームが延び
ていた。この領域内に、数個のコンセンサスなスプライ
ス受容配列が確認された。この領域の、DNAに基く推定
のタンパク質配列を点検した結果、これらの配列は、更
に幾つかの第VIII因子のトリプシ処理ポリペプチドのタ
ンパク質配列と合致することがわかつた。このことは、
ヒト第VIII因子のためのゲノムクローンのエクソンが得
られた、ということを証明するものである。 4. ゲノム・クローンの拡張：λライブラリーンのゲノ
ム・ウオーキング 当初、λ/4Xライブラリーから８個の独立した第VIII
因子ゲノム・クローンが得られた。これらは約28kbに及
びヒトゲノムの重複（over−lapping）セグメントを含
有していた。第VIII因子タンパク質の概算されたサイズ
に基き、完全な遺伝子は、イントロンの大きさに応じて
100〜200kbであろうと推測される。従つて、重複クロー
ンのコレクシヨン（収集）を、ゲノム・ウオーキングに
よつてさらに拡張させた。 この方法における第Ｉ段階は、既存のゲノム・クロー
ンの制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をマツピングする
ことである。クローンから得たDNAを制限酵素単独また
は組合わせによつて消化し、ゲル電気泳動法により、確
認した（ある場合においては、次いでサザーン・ブロツ
ト・ハイブリダイゼーシヨンを行つた）。EcoR Iおよび
BamH I消化で生じたDNAフラグメントを、便宜上、pUCプ
ラスミドベクター（59）にサブクローンした。制限マツ
ピング法、DNA配列決定および8.3プローブとのブロツト
ハイブリダイゼーシヨンによつて遺伝子の方向性を決定
した。 次いで、28kb領域の末端付近の一本鎖の（シングル）
コピーフラグメントを“ウオーク”プローブとして同定
した。クローンしたDNAの消化物を32P−標識全ヒト−DN
Aとブロツトハイブリダイズさせた。この方法によつ
て、ゲノム中に約50以上、繰返されている配列を含有す
るフラグメントだけがハイブリダイズすることになるで
あろう（87,88）。ハイブリダイズしなかつた候補−ウ
オーク・プローブ・フラグメントを、その配列上の繰返
しについて、λ/4Xライブラリーからの50,000フアージ
とのハイブリダイゼーシヨンにより、再度調べた。 Nde IおよびBamH Iで消化したλ120DNAの５′側に1kb
フラグメントのトリプレツトが単離された（図４参
照）。このプローブを用いて100万個のλ/4Xバクテリオ
フアージをスクリーンした。得られたクローン、λ122
は、λ120から５′側に約13kb延びていることがわかつ
た（図４参照）。 ３′側には、λ114の2.5kb Stu I/EcoR I制限フラグ
メントが、一本鎖のコピーウオーク・プローブとして同
定された。λ/4X、次いで他のλ／ヒトゲノムライブラ
リーの徹底的なスクリーニングによつては、伸張するク
ローンを得ることができなかつた。λライブラリー中の
ゲノム領域について示した代表例は既に観察されている
（62）。所望の配列を得るためにゲノムDNAを特異的に
豊富化し、それから制限的なバクテリオフアージライブ
ラリーを得ることを決定した。 ヒトゲノムDNAと2.5kb Stu I/EcoR Iプローブとのサ
ザーン・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨンによつて22
kbの、ハイブリダイズし得るBcl I制限フラグメントが
示された。制限マツピング法によつて、このフラグメン
トのクローニングおよび回収により、ゲノムクローンの
３′側に長い伸長部分が得られることがわかつた。ヒト
49,XXXXY DNAをBcl Iで消化し、約22kbのサイズのフラ
クシヨンをゲル電気泳動で精製した。このDNAをバクテ
リオフアージベクターλ1059のBamH I部位にライゲート
し、１つのライブラリーを調製した（先に用いたベクタ
ーであるシヤロン30は、その様に大きい挿入には適応し
得ない）。この豊富化されたライブラリーをスクリーン
して得た400,000個のフアージから、６個のハイブリダ
イズするクローンが得られた。所望のクローン（λ482
と命名）は、本来の、１セツトのゲノムクローンから
３′側に、更に17kb延びていた（第４図）。 5. ゲノムウオーキング：コスミツドクローン コスミツドベクターを用いて新しいゲノムライブラリ
ーを組立てた。コスミツド（63）はプラスミドとバクテ
リオフアージとのハイブリツドであり、約45kbというλ
/4X DNAライブラリーの平均挿入サイズを約３倍上回る
大きさの挿入物に適応し得る。新規な組立てコスミツド
ベクターpGcos4は以下の理由で望ましいものである:1）
BamH I部位を有していないpBR322のテトラサイクリン耐
性遺伝子誘導体を用いた。このことにより、プラスミド
中、任意の位置にBamH I部位を設けることができ、それ
をクローニング部位として使用できる。テトラサイクリ
ン耐性は、より一般的なアンピシリン耐性よりも、耐薬
剤性が大きいことから幾分取り扱い易いといえる。２）
cos部位を含む、λの403b Hinc IIフラグメントをpBR32
2の641b Ava I/Pvu IIフラグメントで置き換えることに
よりプラスミドのコピー数を増加させると共に、真核細
胞の形質転換を妨げる様なpBR322の内の配列（75）を除
去した。３）デヒドロ葉酸還元酵素とSV40の複製起源お
よびプロモーターとの突然変異生成物がpGcos4ベクター
に含有されている。こうすることにより、このベクター
内にクローンされたフラグメントはすべて、広範な真核
細胞内に伝播されることになる。このことから、固有の
プロモーター類を伴なつたゲノムDNAの大きいフラグメ
ントを発現させるのに有用であろうと予測される。４）
クローニングの部位として、pBR322起源のEcoR I部位
に、EcoR I、Pvu I、BamH I、Pvu IおよびEcoR Iがクロ
ーンされた。唯一のBamH I部位はゲノムDNAの35−45b S
au3A1フラグメントのクローンに利用される。両端のEco
R I部位は挿入物のEcoR Iフラグメントのサブクローニ
ングに用いることができる。また、Pvu I部位は、多く
の場合、全挿入物を切り取るのに使用される。真核性DN
A中にはPvu I部位が極めて稀れにしか存在せず、ヒトDN
Aのジヌクレオチド頻度に関しては、134,000bの間に唯
１回しか生成しない、と予想される。 コスミツドベクターの組立て模式図を第５図に示す。
49,XXXX Y DNAの35−45kb Sau3A1フラグメントをこのベ
クターにクローンした。約150,000個の組換え体を、
５′側：λ222の2.4kb EcoR I/BamH Iフラグメントと
３′側：λ482の1kb EcoR I/BamH Iフラグメント（これ
らはいずれも、このゲノム領域の末端付近に同定された
一本鎖のコピー・プローブである）により、２回スクリ
ーンした。４個の陽性なコスミツドクローンを単離し、
マツピングした。第４図にはコスミツドp541、p542およ
びp543が示されている。このスクリーンから、これらの
コスミツドクローンは第VIII因子ゲノム領域内で、計11
4kbpの長さに達していることがわかる。引き続いて行つ
たcDNAクローンによるプロービングでは、既存の１組の
重復ゲノムクローン類の中に存在する多くのエクソンが
確認されたが、このゲノムウオークが未だ完了していな
いことが示唆された。そこで、いずれかの方向に向けて
更に作業を行つた。 ３′側のウオークプローブをp542の1.1kb BamH I/Eco
R Iフラグメントから調製した（第４図）。このプロー
ブにより、更に３′側へ約35kb伸長する重復コスミツド
クローンp613を検出した。続いて、cDNAクローニングに
より、第VIII因子の全メツセージ配列を得た（以下参
照）。cDNAの３′−末端部分を含む1.9kb EcoR I cDNA
フラグメントを、ヒト−ゲノムおよびコスミツドクロー
ンDNAのサザーンブロツトにハイブリダイズさせたとこ
ろ、非クローン（ゲノム）およびp613DNAの両者の中に
単１の4.9kb EcoR Iバンドと、5.7、3.2および0.2kbのB
amH Iバンドが確認された。このことは、既に遺伝子の
３′末端に到達していることを暗示するものであり、後
に、DNA配列決定でそのことを確認した。 また、５′側のウオークプローブは、p543の0.9kb Ec
oR I/BamH Iフラグメントから調製された。これによつ
て重復領域から僅かにはみ出して延びる重復コスミツド
クローンp612を検出した。大部分の５′−ゲノムクロー
ンは、最終的にはコスミツド/4Xおよびλ/4Xライブラリ
ーをcDNA誘導プローブでスクリーニングすることによ
り、得られた。第４図に示されている如く、λ599、λ6
05およびλ624が得られて、第VIII因子の全長にわたる
１組の組換えクローンが完全に揃う（これらのクローン
は、唯１個のイントロンDNAである、p624とλ599との間
の8.4kbのギヤツプを除いて、全て重復し合い、ヒトゲ
ノムのこの領域に含まれるDNA全てを含有している）。
これらは一緒になつて、ヒトＸ染色体の200kbに及ぶ遺
伝子を構成する。この遺伝子は報告されたものの内、最
も大きい遺伝子である。この遺伝子の約95％はイントロ
ンであり、第VIII因子タンパク質の合成に用いる鋳型の
mRNAを生産するためには適切に処理されねばならない。 λおよびコスミツド組換えクローン中からの第VIII因
子遺伝子領域の単離は、有用な生産物である第VIII因子
タンパク質の生産にとつて充分とはいえない。トランス
フエクトされた微生物または組織培養細胞内での活性な
第VIII因子タンパク質の合成を指令することのできる、
組換え発現プラスミドを完全に組立てるために遺伝子の
タンパク質暗号部分（エクソン）を同定し、特徴づける
ための様々な試みが引き続いて行われた。２つの試みは
実質上有用な結果を得ることができなかつた：ゲノムク
ローンを、新しいオリゴヌクレオチドプローブでタンパ
ク質配列に基いて更にスクリーニングすること、および
RNAブロツト・ハイブリダイゼーシヨンのプローブとし
て、ゲノムクローンで選択したフラグメントを用いる試
みである。しかしながら、本発明では、第VIII因子タン
パク質の暗号領域をSV40の“エクソン発現”ベクターを
用いて単離し、また完全な形のものは、cDNAクローニン
グで得た。 6. SV40エクソン発現ベクター 数百kbものゲノム領域をDNA配列決定で完全に特徴づ
けたり、有用な量の第VIII因子タンパク質を合成するの
に直接用いることは殆んどあり得ないことである。ヒト
第VIII因子遺伝子の略95％はイントロン（介在配列）か
ら成り、これらはタンパク質の発現に先立ち、人工的
に、または真核性RNAスプライシングで機械的に、除去
されねばならない。SV40発現ベクターと命名したベクタ
ーを使用して、完全な特徴づけがなされていないゲノム
クローンの制限フラグメントから、イントロンを除去す
る方法を考案した。一般的な概念は、ゲノムDNAのフラ
グメントをSV40プロモーターを含有するプラスミドに挿
入し、有意な量の組換えRNAを生成せしめ、それでトラ
ンスフエクトしたサルcos細胞内でプロセス（処理）さ
せることからなる。得られた、スプライス後のRNAは、
直接分析にかけてもよく、またはcDNAクローニングのた
めの物質として使用できる。少くとも理論上、この方法
を用いて第VIII因子遺伝子の全てについてスプライスし
たものを組立てることができる。 エクソン発現組立て物に最初用いたのは肝炎表面抗原
遺伝子（73）を発現する既存のSV40cDNAベクターであつ
た。しかしながら、これらのベクターにクローンしたゲ
ノム第VIII因子フラグメントは、ブロツトハイブリダイ
ゼーシヨン法で分析したところ、なんら観察し得る第VI
II因子RNAを与えなかつた。このことは、この様な組立
て方法では、その工程中にcDNAのエクソン領域が第VIII
遺伝子のイントロン領域と結合してしまうことにあると
推測された。これらの問題点を克服するために、エクソ
ン発現ベクターpESVDAを第６図に示す如く、組立てた。
このベクターは、SV40のアーリー（初期）プロモータ
ー、アデノウイルスIIメジヤー・レート、第Ｉスプライ
ス供与部位、ゲノム第VIII因子フラグメントのクローン
のためのイントロン配列、次いでアデノウイルスII E1b
スプライス受容部位、並びに肝炎Ｂ表面抗原の３′非翻
訳およびポリアデニル化配列（49j）を含有している。 初めに、λ114の9.4kb BamH Iフラグメントおよび12.
7kb Sst IフラグメントをpESVDAのイントロン領域にク
ローンした（第６図参照）。これらの２つの組立てによ
り合成されたRNAをcos細胞にトランスフエクトした後、
ノーザン・ブロツト法で分析した結果を第７図に示す。
9.4kb BamH I組立て物に関しては、エクソンＡおよび肝
炎遺伝子の３′非翻訳領域のための各プローブで約1.8k
bのハイブリダイズしたRNAのバンドが見出された。新し
い第VIII因子エクソンのRNAを調べるために、λ114の2.
0kbp Stu I/BamH Iフラグメント（エクソンＡの３′
側）を並べてハイブリダイズさせた。このプローブで1.
8kbにRNAバンドが示され、この領域に新しい第VIII因子
エクソンが存在することが証明された。これらの３個の
プローブをまた、それぞれ、12.7kb Sst Iゲノムフラグ
メントを含有する組立物からのRNAバンドとハイブリダ
イズさせた。このRNAバンドは約2.1kbであつた。この観
察結果は、この組立て物が、9.4kb BamH Iフラグメント
の１側であるBamH I部位の３′側に、約200−300bpのエ
クソンを含有していることを示唆するものである。 対照実験によつて、この系で既知のエクソン領域を正
確にスプライシングし得ることがわかつた。ネズミのdh
frスパニング（全長にわたる）エクソンIIIおよびIVの
3.2kbゲノムHind IIIフラグメントをpESVDAにクローン
した。ネズミdhfrプローブにより、1kbのRNAバンドを見
出した。このサイズは、エクソンが正しくスプライスさ
れるならば、予測通りの大きさである。9.4kb BamH I第
VIII因子または3.2kb dhfrゲノムフラグメントにより、
反対方向の組立てを行つたところ、どのプローブによつ
てもなんら観察し得るRNAバンドはみられなかつた（第
７図）。 12.7kb Sst I組立て物からのRNAのcDNAコピーをpBR32
2にクローンし、スクリーンした。１個の、略完全な長
さ（1700bp）のcDNAクローン（S36）が見出された。第V
III因子挿入物の全てと、そのいずれかの側にpESVDAベ
クターの一部を含んでいる950bpのSst Iフラグメントの
配列を第８図に示す。この配列は予想通り、アデノウイ
ルスのスプライス供与配列および受容配列が始まり、終
つている。その間に、エクソンＡを含む、888bpの第VII
I因子の配列がある。エクソンＡの前方154bpおよび後方
568bpには、数個の第VIII因子80Kトリプシン処理フラグ
メントが含まれており、これらが新らたにエクソンとし
て同定、確認された。これらのエクソンに相当するゲノ
ム領域の配列決定により、エクソンＡの５′側154bpに
は１個のエクソン、エクソンＣが、また３′側には、そ
れぞれ229、183および156bpに３個のエクソン、エクソ
ンＤ、ＥおよびＩが含まれていることがわかつた。これ
ら各エクソンは、妥当な供与および受容部位によつて結
合されていた（60、61）。 引き続いて行つたS36エクソン発現cDNAと第VIII因子
細胞系列cDNAクローンとの比較により、S36内のスプラ
イスされた第VIII因子配列は全て第VIII因子エクソンか
らのものであることが示された。これには予測されるエ
クソンとしてＣ、Ａ、Ｄ、ＥおよびＩが含まれる。しか
しながら、エクソンＡはＣ、Ａ連結部分の47bpが失われ
ており、またエクソンＦ、ＧおよびＨは完全に脱落して
いた。その様な正常でないRNAのプロセツシングに起因
する解読フレームのシフトは、それが第VIII因子の配列
と正確に対応していないかもしれない、ということを示
している。Ｃ、Ａ連結部には、標準的なものでなく、よ
く一致するスプライス部位を用いた。標準的な第VIII因
子転写物と比較して、S36クローンのスプライシングが
異つている原因は、RNAの一次転写物の一部分しかcos細
胞の組立て物中で発現しないことにあるかもしれない。
あるいは、細胞型または種間の変化が、その様な相違に
係つているのかもしれない。 7. cDNAクローニング a.第VIII因子mRNAを生産する細胞系列の同定 第VIII因子cDNAクローンの単離に用いるRNA供給源を
同定するために、多くのヒト細胞系列および組織からポ
リアデニル化RNAを単離し、これをλ120のエクソンＡ領
域から得た189bp Stu I−Hinc IIフラグメントを用いた
ノーザン・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨンにより、
スクリーンした。CH−２、ヒトＴ−細胞ハイブリドーマ
からのポリ（Ａ）+RNAにハイブリダイズするRNAの種が
あることが示された。ハイブリダイズするRNAの大きさ
は約10kbと算定される。この大きさは約300kDのタンパ
ク質を暗号化するmRNAについて予測される大きさであ
る。ドツト−ブロツト・ハイブリダイゼーシヨン（66）
での対照DNAとの比較により、このRNAの量はCH−２細胞
系列中に存在する全細胞性ポリ（Ａ）+RNAの0.0001〜0.
001％であると決定された。この結果は、該供給源から
第VIII因子cDNA配列を単離するには、特異配列をさらに
豊富化するか、さもなくば非常に多数のcDNAクローンの
スクリーニングを行う必要があることを示唆するもので
ある。 b.特異的にプライムされたcDNAクローン 第VIII因子ゲノムクローンのDNA配列決定に基き、cDN
Aの一次鎖合成を特異的にプライム（prime）する16塩基
のオリゴヌクレオチドが合成された。cDNAの合成を開始
する場合、通常は、mRNAのポリ（Ａ）末端（テール）に
オリゴ（dT）を作用させる。本発明の特異的プラスミド
はオリゴ（dT）に比べて２つの利点を有する。第１に、
それは第VIII因子のためのcDNAクローン集団を豊富化す
るよう働く、第２に、それは、cDNAクローンを、本発明
者らの有するハイブリダイゼーシヨンのためのプローブ
が該当する、遺伝子領域に位置せしめる様作用する。こ
のことは、その様な大きい遺伝子のクローニングには特
に重要な点である。cDNAクローンが1000〜2000塩基対よ
りも長いことは稀れであるために、オリゴ（dT）でプラ
イムされたクローンは、第VIII因子の大多数の領域から
調製されたプローブによつては、通常検出され得ない。
そこで、最初のエクソンＡ領域からのDNAフラグメント
と配列に関する情報を用いて特異的にプライムされたcD
NAクローンを得るための努力が払われた。より早期に生
成されたcDNAクローンを確認することで、１組の５′方
向へ向う重復cDNAクローンを得た。更にcDNAの３′側領
域を導くために、cDNAと３′エクソンからのゲノムクロ
ーンフラグメントを用いてオリゴ（dT）でプライムされ
たcDNAクローンを検索した。この試みのための工程には
下記の如く、数種類のcDNAクローニング法を採用した。 最初の特異的cDNAプライマー５′−CAGGTCAACATCAGAG
（“プライマー”第９図参照）は、エクソンＡ配列の
３′末端の16残基の逆相補性の配列として合成された。
CH−２細胞ポリ（Ａ）+RNA5μｇとプライマー１からＣ
−末端化cDNAを合成し、（67）に一般的に記載されてい
る様に、Ｇ−末端化pBR322アニールした。得られた約10
0,000のE.coli（大腸菌）形質転換体を100の150mm皿に
のせ、ゲノムクローンλ120（第４図）のエクソンＡ領
域から得た180bp Stu I/Himc IIフラグメントとハイブ
リダイゼーシヨンすることにより、スクリーンした（4
8）。１個の、真にハイブリダイズするクローン（“p1.
11"）を回収した（第９図）。p1.11のDNA配列決定によ
り、これは本発明に係る第VIII因子ゲノムクローンと同
一であることが証明された。p1.11内の447bp cDNA挿入
物は、ゲノムエクソンＡの最初の104b（二次鎖合成がプ
ライマー後方に向けて伸長しないことは明らかである）
を含有し、後にエクソンＢおよびＣの存在が示された部
分に連続していた。エクソンＡ配列の５′側分岐点は、
典型的なRNAスプライス受容部位で画されていた（6
1）。 この様にCH−２細胞系列から容易に第VIII因子を得る
ことができる、ということが証明されたので、更に細か
い工夫がなされた。第VIII因子のメツセージのために、
CH−2RNAを更に豊富化する様、様々な努力が払われた。
そして、特異的にプライムされた一次鎖cDNAの合成と、
得られた一本鎖cDNAをハイブリツド法で選択することを
組合わせるのに成功した。一本鎖cDNAの合成には、プラ
イマー１と200μｇのポリ（Ａ）+CH−2RNAを用いた。こ
のものを直ちに二重鎖DNAに転換するに際し、DNAポリメ
ラーゼを用いる代りに、該一本鎖DNAを、活性化されたA
BMセルロースペーパー（SchleicherおよびSchull.“ト
ランサ・バインド（Transa−Bind））上に固定化された
189bpのStu I/Hinc IIゲノムフラグメントDNA2μｇにハ
イブリダイズした（48）。通常、RNAはハイブリツド選
択法に委ねられるが、本発明においては、第VIII因子の
RNA分子が稀れで大きく、比較的不安定な故に、余分な
操作を避けるため、その工程をcDNA合成の後で行つた。
溶離した後、得た物質を二重鎖cDNAに変換し、サイズに
よつて選別して回収したDNA0.5ngをＣ−末端化し、前記
の如くpBR322にクローンした。約12,000の組換えクロー
ンが得られ、これを前述のcDNAクローンp1.11から導か
れた364bp Sau3A/Stu Iフラグメントのハイブリダイゼ
ーシヨンによつてスクリーンした。このプローブフラグ
メントをハイブリツド選択に用いたDNAと重復しないよ
うに選び出した。この様にして、DBMセルロースから常
に放出されるStu I/Hinc II DNAフラグメントを幾らか
含む偽の組換え体を誤つて同定することが回避される。
29のハイブリダイズしたコロニーが得られた。このこと
は、従来の方法に比べて所望のクローンが約250倍豊富
化されていることを示している。 新しい29の組立て物の各々を制限マツピング法で特徴
づけし、２個の最も長い配列（p3.12およびp3.48、第９
図）の配列決定を行つた。これらのcDNAはp1.11から
５′側へ、更に約1500bp伸長していた。cDNAとゲノムク
ローンの同時マツピングおよび配列決定により、p3.12
およびp3.48を囲む異常に長いエクソン（エクソンＢ、
第４図）が存在していることが判明した。この観察に基
き、該エクソンの程度を明らかにするため、ゲノムクロ
ーンλ222のDNA配列決定を行つた。エクソンＢ領域は約
3kbのオプン・リーデイング・フレームを含んでいた。c
DNAクローニングにおいて相当な長さの伸長部分が得ら
れることを期して、この長いエクソン内の配列と合致す
る様、16マーのプライマー２および３を合成した。 この時点で、バクテリオフアージを基とするcDNAクロ
ーニング系を用いることができ、そうすることにより、
事前にハイブリツド選択を行つて豊富化することなしに
多数のcDNAクローニングを生産し、スクリーニングする
ことができる、ということが証明された。λGT10（68）
は、そのリプレツサー遺伝子中に単１のEcoR I制限部位
を有するフアージ入誘導体である。もしも二重鎖cDNAフ
ラグメントの両端がEcoR I部位であれば、これらを該単
１部位に挿入することができる。この部位に外来のDNA
を挿入することにより、フアージ・リプレツサーを消失
させ、澄明なプラークを生成させる。挿入されていない
λGT10は濁つたプラークを形成するので、組換体から容
易に識別し得る。フアージ・パツケーシングが本来有す
る形質転換効率の大きさ、に加えて高濃度のλcDNAプラ
ークのスクリーンが細菌性コロニーのそれよりも容易で
ある。 プライマー３（５′−AACTCTGTTGCTGCAG）を用いて前
記の如く二重鎖cDNAを製造した（プライマー３はエクソ
ンＢの仮定の５′末端から約550bp下流に位置する）。
アダプターは相補的な合成18マー（５′−CCTTGACCGTAA
GACATG）および22マー（５′−AATTCATGTCTTACGGTCAAG
G）で構成されている。18マーの５′末端はりん酸化さ
れているが22マーの５′末端はそれの合成に用いられた
５′−OHを保持している。従つて、これらのアダプター
をアニールし、cDNAとライゲートすると、自己ライゲー
トし得ない、突出した（粘着性の）EcoR I部位を形成す
ることになる。このことにより、cDNA Iメチル化が回避
され、引き続いてEcoR I消化を行い、他の公表された方
法によりリンカーライゲーシヨンに付すことができる
（83）。cDNAのサイズ選択と未反応アダプターの除去の
ためにゲル単離を行つた後、等モル量の該cDNAをEcoR I
切断λGT10にライゲートしてパツケージした後、EcoR I
c600hf1に接触させた。１μｇのポリ（Ａ）+RNAから得
た約3,000,000のクローンを50個の150mmペトリ皿にの
せ、エクソンＢの５′末端からの300bp Hinf Iフラグメ
ントとハイブリダイゼーシヨンし、スクリーンした。46
の１対の陽性が認められ、これらをEcoR I消化で分析し
た。数個のcDNA挿入物はプライマー３の５′側へ約2500
bp伸長している様に思われた。これらの長いクローンを
DNA配列決定で分析した。λ13.2およびλ13.27の５′末
端の配列を第10図に示す。これらは本発明者らが既に得
た第VIII因子の暗号領域における５′末端を指示する様
な点を幾つか有していた。最初の109bpは、可能な解読
フレームの全てに終止コドンを有していた。次に、ATG
トリプレツトが現れ、続いてλ13.2内にあるcDNA挿入物
の2724bpの残余部分に対するオープンリーデイングフレ
ームが存在する。開始信号（イニシエーター）ATGに続
く配列の翻訳によつて、分泌タンパク質“リーダー”ま
たは“プレ”配列（69）の典型的な19のアミノ酸配列が
与えられる。その特徴は２個の電荷を有する基が10個の
アミノ酸の疎水性部分（芯）の境界にある、ということ
である。この推定のリーダー配列の次には、第VIII因子
の210kDおよび95kDトロンビン消化物に対するタンパク
質配列決定によつて得られたアミノ末端残基に対応する
領域が続く。 c. オリゴ（dT）でプライムされたcDNAクローン 数千以上の第VIII因子mRNAの３′側の塩基がcDNAに変
換されないままになつている。そこで、オリゴ（dT）に
より逆転写をプライム（開始し）、mRNAの３′ポリ
（Ａ）＋テールを含むcDNAクローンを探すことにした。
しかしながら、クローンを豊富化し、二次鎖DNA合成の
効率を増大する様、工夫する内に、確立されていた方法
に代えて二次鎖cDNA合成に特異的なプライマーを用いる
ことが決定された。エクソンＡ（第９図）の３′末端か
ら約400bp上流のPst I部位にあるメツセージ・センス配
列を表すために16マーのプライマー４（５′−TATTGCTG
CAGTGGAG）を合成した。オリゴ（dT）をプライマーとし
てmRNAを逆転写し、二次鎖合成のためにプライマー４と
DNAポリメラーゼを加え、次いで前記の如くEcoR Iに適
応させたcDNAをλGT10にライゲートした。3,000,000個
のプラークを、p3.12上に含まれ、プライマー４から下
流側に存在する419bpのPst I/Hinc IIフラグメントでス
クリーンした。回収した４個のクローンからDNAを調製
した。これを消化してマツピングし、上記のSV40エクソ
ン発現プラスミドを用いてエクソンであることが同定さ
れたばかりの、更に下流のゲノムフラグメントと、ブロ
ツト・ハイブリダイズさせた。４個の組換え体の内３個
がハイブリダイズした。最長のλ10.44は約1,800塩基対
であつた。λ10.44の配列は、二次鎖合成が、正にプラ
イマー４から始まつていることを示していた。これはSV
40エクソン発現クローンS36に含まれる全てのエクソン
配列、およびその他を含有していた。しかしながら、λ
10.44のオープン・リーデイング・フレームはcDNAの末
端に連続していた。また、３′非翻訳領域、あるいはポ
リ（Ａ）テールのいずれも見出されなかつた。多分、二
次鎖合成は完全に行われなかつたのであろう。 完全な３′末端を含有するクローンを見出すために、
同じフイルターを標識されたλ10.44からのDNAを用いて
再度スクリーンした。さらに24個のクローンを回収し、
マツピングして２個の最も長いクローン（λ10.3および
λ10.92）の配列決定を行つた。これらは実質上同じ配
列であつてλ10.44と重復し、３′側に更に約1900塩基
対が付加された配列を有していた。このDNA配列のλ10.
44の末端を越えて51塩基対の位置にはTGA翻訳終止コド
ンがあり、これに続いて1805塩基対の明らかに３′非翻
訳領域が存在していた。この領域を識別する上で特徴と
されるのは、３個のリーデイングフレームの全てに分散
して存在する停止コドン、およびポリ（Ａ）信号AATAAA
（89）であつて、その15塩基下流にcDNAの末端から延び
るポリ（Ａ）を伴なうもの、を有することにある（クロ
ーンλ10.3はこの位置に８個のＡと、それに続いてEcoR
Iアダプターを有し、他方λ10.9.2はその３′末端に10
0以上のＡを有する）。 d. cDNAの完全な配列 重複クローンの完全な配列を第10図に示す。これは23
51のアミノ酸を暗号化した連続的なオープン・リーデイ
ング・フレームで構成されている。19個のアミノ酸から
成る推定の末端信号ペプチドを考慮すると、“成熟”タ
ンパク質は2332個のアミノ酸から成るといえる。このタ
ンパク質の分子量（計算値）は約267.000ダルトンであ
る。グリコシル化の可能性を考慮すれば、この値はSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で求めた天然のタン
パク質の分子量と近似した値である。 “完全な"cDNAの長さを約9000塩基対とすること
（３′ポリ（Ａ）の長さに基く）は、ノーザン・ブロツ
ト・ハイブリダイゼーシヨンによつて求めたmRNAの長さ
と一致している。５′（アミノ末端暗号）領域に含有さ
れている配列は、210kDの第VIII因子誘導物質のペプチ
ド配列と実質上対応しており、また、３′（カルボキシ
末端暗号）領域に含有されているペプチド配列は80kDの
タンパク質のペプチド配列と実質上対応している。 8. 組換え第VIII因子の発現 a. 全長に及ぶクローンの組立て、 組換え第VIII因子の発現のために、幾つかの別々のcD
NAおよびゲノムクローンを合わせて7kbの全タンパク質
暗号領域を組立てた。以下、並びに第11図に、遺伝子の
５′、中間および３′領域を含有する３種類の中間体プ
ラスミドの組立てについて記載した。これら中間体を、
発現プラスミド中でSV40アーリープロモーターに続けて
一緒にした。このプラスミドは、その末端配列を変更
し、異つたプロモーターおよび選択マーカーを含有さ
せ、多数の哺乳類細胞型の形質転換のための種々の組立
てにおける出発点として作用する。 ５′暗号領域は、Cla I制限部位が第VIII因子信号配
列のATG開始コドンの前に位置する様に、pBR322誘導体
内に結合される。この遺伝子内には、これ以外のCla I
部位が見られないので、この部位は発現プラスミドの精
製にとつて重宝な部位となる。便利なCla IおよびSac I
部位を含有するプラスミドpT24−10（67a）をHind III
で開裂し、DNAポリメラーゼでうめ、Sac Iで切断した。
第VIII因子cDNAクローンλ13.2の５′領域から１個の77
b Alu I/Sac Iを回収し、このベクターにライゲートし
てpF8 Cla−Sacと称する中間体を得た（Alu I部位は第V
III因子の５′非翻訳領域中にあり、Sac I部位は開始コ
ドンATGを10b越えた、第10図におけるヌクレオチド10の
位置にある；以下、全ての制限部位を指すヌクレオチド
位置は、第10図に示す如く開始コドンATGのＡから始ま
るものとする）。11bpのアダプター配列（アダプター配
列５′ATCGATAAGCTはその全てをpBR322から得た）を含
有する85b Cla I/Sac IフラグメントをpF8 Cla−Sacか
ら単離し、λ13.2から得た1801b Sac I/Kpn I（nuc.、
ヌクレオチド番号1811）フラグメントと共に、第VIII因
子のHind IIIフラグメント（nuc.1019−2277）を含有す
るpBR322サブクローンから調製したCla I/Kpn Iベクタ
ーにライゲートした。pF8Cla−Kpnと称するこの中間体
は、65の５′非翻訳塩基対と11塩基対のCla Iアダプタ
ー配列によつて先行される、第VIII因子の暗号ヌクレオ
チド配列中最初の2277ヌクレオチド配列中最初の2277ヌ
クレオチドを含有している。pF8 Cla−KpnをKpn Iおよ
びSph Iで開裂する（pBR322部分に含まれる）ことによ
り、λ13.2のEcoR Iサブクローンから導かれる466b Kpn
I/Hind IIIフラグメントと、エクソンＢ含有サブクロ
ーンp222.8から導かれる1654b Hind III/Sph I（nuc.40
03）とのライゲーシヨンに用いるためのベクターフラグ
メントが得られる。このことにより、第VIII因子暗号配
列の最初の3931bを含有するpF8 Cla−Sphが生産され
る。 暗号領域の中間部分は、３種のpBR322/cDNAクローン
またはサブクローンのフラグメントを結合させることか
らなる３成分（three−piece）ライゲーシヨンによつて
導かれた。p3.48をBamH I（nuc.4743）およびSal I（pB
R322のtet領域中にある）で開裂し、ベクターとして用
いた。これらの部位に、p3.12からの778b BamH I/Nde I
（nuc.5520）とサブクローンｐλ10.44R1.9からの2106b
Nde I/Sal I（pBR322中）とをライゲートした。適切に
ライゲートされることにより、テトラサイクリン耐性プ
ラスミドであるpF8 Sca−R Iが得られた。 第VIII因子cDNAの大多数の３′部分をSV40発現ベクタ
ー中に直接クローンした。得られたプラスミドpCVSVEHB
VはSV40アーリープロモーターを含有しており、この後
方に、ポリリンカー並びに肝炎Ｂ表面抗原に関する遺伝
子が存在する。 〔pCVSVEHBV（あるいはpCVSVEHBSとも表す）は、p342
E（73）が僅かに変化したものである。本発明では、pCV
SVEHBVを、特に、下記の如くにして調製した:SV40複製
起源（74）を囲む540bpのHind III−Hind IIIフラグメ
ントをプラスミドpML（75）のEcoR I部位とHind III部
位との間にライゲートした。プラスミドEcoR I部位とSV
40Hind III部位とを、Hind III消化に先立ち、４個のdN
TPの存在下クレノーポリメラーゼＩを加えることによ
り、平滑末端処理した。得られたプラスミドpESVをHind
IIIおよびBamH I消化に付し、2900bのベクターフラグ
メントを単離した。このフラグメントに、EcoR I部位に
ポリリンカー（複数の制限部位を含むDNAフラグメン
ト）を含有すべく修飾されたHBVから得た2025bのHind I
II−Bgl IIフラグメントをライゲートした。このHBVフ
ラグメントは表面抗原遺伝子を包含しており、クローン
されたHBVDNA（74）からEcoR I−Bgl II消化を介して得
られる。二本鎖のリンカーDNAフラグメント（５′dAAGC
TTATCGATTCTAGAATTC3′…）をHind IIIとEcoR Iで消化
し、HBVフラグメントに加えることにより、EcoR I−Bgl
IIフラグメントをHing III−Bgl IIフラグメントに変
換した。このことは、リンカー、HBVフラグメントおよ
びベクターから成る３成分ライゲーシヨンによつても行
うこともできるが、最初にHind III−EcoR Iリンカーを
クローンされたHBV DNAに加え、次のこのプラスミドを
該当する酵素と共に共消化することにより、Hind III−
Bgl IIフラグメントを生成させる方法が好都合であり、
この様にして実施した。得られたプラスミドpCVSVEHBV
は、pMLから導かれたpBR322の細菌性複製起源、同じくp
MLから導かれたアンピシリン耐性マーカー、アーリープ
ロモーターが挿入されたHBVフラグメントの転写を指令
する様な方向性をとつているSV40フラグメント、並びに
HBVからの表面抗原遺伝子を含有している。HBVフラグメ
ンとは、哺乳類細胞の細胞質内で通常生成されている様
な、ポリアデニル化mRNAを生産するための、ポリアデニ
ル化信号を与えるものでもある。〕 プラスミドpCVSVEHBVはポリリンカー内のXba I部位の
５′側に隣接して有用なCla I部位を含有している。こ
のプラスミドをXba IおよびBamH I（肝炎Agの３′非翻
訳領域にある）で開裂し、両末端をDNAポリメラーゼで
埋めた。このことによつて肝炎表面抗原暗号領域は除去
されたが、その３′ポリアデニル化信号領域、並びにSV
40プロモーターは保持されている。このベクターに、cD
NAクローンの10.3から得た1883b EcoR Iフラグメント
（両末端を埋めたもの）をライゲートした。このものは
第VIII因子の最後の77の暗号塩基対、1805bの３′非翻
訳領域、８個のアデノイン残基、および埋め込み処理さ
れたEcoR Iアダプターを含有している。埋め込まれた
（filled in）制限部位の結合により、５′末端のEcoR
I末端は回復した（埋め込まれたXba Iが同様のEcoR Iに
結合）が、３′末端は破壊された（うめ込まれたEcoR I
が同様のBamH Iに結合）。このプラスミドをpCVSVE/10.
3と称した。 完成した第VIII因子のcDNA領域を33成分ライゲーシヨ
ンで結合させた。pCVSVE/10.3をCla IおよびEcoR Iで開
裂し、pF8Cla−Scaからの3870b Cla I/Sca Iフラグメン
トおよびpF8 Sca−R Iからの3182b Sca I/EcoR Iフラグ
メントを挿入するためのベクターとして用いた。この発
現プラスミドをpSVEF VIIIと称する。 b.組織培養細胞内で第VIII因子を発現させるための組立
て PSVEFV IIIの変種ベクターは、アデノウイルス・メジ
ヤー・レート・プロモーター、三部から成るリーダー配
列および短縮された第VIII因子の３′非翻訳領域を含有
しており、それは、安定にBHK細胞にトランスフエクト
された場合、活性な第VIII因子を生産する。 活性な第VIII因子を生産する発現プラスミドpAM3p.8c
lの組立て模式図を第12図に示す。この組立てに際して
は、まず、pFD11（49r）内のSst II部位およびpEHED22
（49y）内のCla I部位をクレノーDNAポリメラーゼＩで
除去した。これらの部位は、これらプラスミドのDHFR遺
伝子の３′および５′非翻訳領域にある。ついで、これ
らの欠失部位を有するフラグメント、およびpCVSVEHBS
（上記）からのＢ型肝炎表面抗原遺伝子からなる３部分
ライゲーシヨンを行なうことにより、唯１個のCla Iお
よび１個のSst II部位をするベクターpCVSVEHED22△CS
が生成された。組立てられた第VIII因子遺伝子（第11
図）を含有するプラスミドpSVEF VIIIをCla IおよびHpa
Iで開裂し、全暗号領域と約380bの３′非翻訳領域とを
得た。これをCla I、Sst I欠失ベクターの単１のCla I
およびHpa I部位に挿入して表面抗原遺伝子と置き換え
ることにより、発現プラスミドpSVE.8c1Dを得た。 別個に、三部からなる５′リーダー配列を伴なうアデ
ノウイルス・メジヤー・レート・プロモーターを、アデ
ノウイルスゲノム一部分である２つのサブクローンか
ら、DHFR発現プラスミドpEDH22（49y）と一緒に組立て
た。２つのアデノウイルス・サブクローンpuCHSXおよび
pMLP2の組立て方法は、実験方法の項に記載されてい
る。pMLP2は、pUC13（59）のSst I〜Hind III部位にク
ローンされた、アデノウイルス・コ・オーデイネーツ1
5.4〜17.1のSst I〜Hind IIIフラグメントを含有してい
る。また、pUCHSXは、puc13のHind III〜Sal I部位にク
ローンされた、コ・オーデイネーツ17.1〜26.5のHind I
II〜Xho Iフラグメントを含有している。これらの２つ
のアデノウイルスフラグメントは、それらをHind III部
位で結合することにより、アデノウイルスのメジヤー・
レート・プロモーター、最初の２つのエクソンおよびイ
ントロンの全て、並びに第３番目のエクソンの内、５′
非翻訳領域内のXho I部位までの部分を含有することに
なる。 ３部分ライゲーシヨンによつてアデノウイルスプロモ
ーターはプラスミドpAML3P.D22内のDHFR遺伝子の先端に
結合される。また、このことで、アデノウイルスの三部
からなる５′リーダー配列の第３番目のエクソン内にあ
る前記Xho I部位から少し後方にCla I部位が配されるこ
とになる。最後に、第VIII因子発現プラスミドpSVE.8c1
DのSV40アーリー・プロモーターをCla IおよびSal Iで
除去し、SV40アーリー／アデノウイルス・タンデムプロ
モーター（第12図参照）で置き換えることにより最終的
な発現プラスミドpAML3P.8c1を生成させた。このプラス
ミドは、第VIII因子の５′非翻訳領域に向う第３番目の
エクソン内でスプライス（切断）されている。アデノウ
イルスの三部からなるリーダー配列を含有している。こ
の後方には、第VIII因子の全長についての構造遺伝子の
配列がその信号配列と共に含有されている。第VIII因子
遺伝子の３′非翻訳領域は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の
３′非翻訳領域に向うHpa I部位でスプライスされてい
る。この後方には、SV40のアーリープロモーターと機能
的なポリアデニル化信号とを付与する肝炎３′非翻訳領
域を有するDHFR遺伝子が続く。 第VIII因子発現プラスミドpAML3p.8c1を、ネオマイシ
ン耐性ベクターpSVE neo Ba16（ATCC No.CRL8544、198
4.4月20日、ブタペスト条約に基き寄託）と共にBHK細胞
にコ・トランスフエクトした。これらの細胞をまずG418
で選択し、次いでメトトレキセートで選択した。 BHK細胞系列から生産された第VIII因子RNAの最初の特
徴づけは、ポリ（Ａ）＋細胞質RNAと、32P標識第VIII因
子DNAプローブとのハイブリダイゼーシヨンによる、ノ
ーザン分析法によつて行われた。この分析において長さ
約9kbに相当するバンドが認められた。ハイブリダイゼ
ーシヨンの強さに基くと、このバンドはCH−２細胞系列
内に認められる9kbのバンドに比べて約100〜200倍、豊
富化されていた。 9. 組換え第VIII因子の同定 a. ラジオイムノアツセイ ラジオイムノアツセイは文献記載の如く、BHK第VIII
因子産生性細胞から得た上澄みと溶解細胞とを用いて行
つた。表Ｉは、この上澄液（これは第VIII因子活性を含
有している）（96参照）が、これらRIAによる判定に基
き、略等量の、第VIII因子の210kD（C10）および80kD
（C7F7）部分をも含有していることを示すものである。
第VIII因子は、細胞溶解物に対する両RIA法によつても
検出された。第VIII因子を発現しない対照細胞系列は0.
001単位/ml以下のRIA値を産生するにすぎない。 表Ｉ pAML3p.8clでトランスフエクトしたBHK細胞系列
の第VIII因子ラジオイムノアツセイ C10 C7F7 細胞上澄液 実験１ 0.14U/ml 0.077 実験２ 0.022 0.021 細胞溶解物 実験１ 0.42 0.016 I125cpmバンドを正常血漿の希釈度に基く標準曲線を
用いて単位/mlに変換した。これらの値は全てバツク・
グラウンドを著しく上向つていた。検出限界は、C10分
析に関して0.005U/ml、C7F7分析に関して0.01U/mlであ
つた。 b. BHK細胞培地の比色分析（Chromogenic assay） 表２に示す如く、これらの細胞が生じた培地をコアテ
スト分析（Coatest assay）で検査すると、405nmに吸収
を示した。上記の如く、この分析法は第Ｘ因子の活性化
における第VIII因子の活性に特異的である。第VIII因子
に対する特異的モノクローナル抗体を加えることにより
第X a因子の生産量が減少されることは、培地の吸収
が、抗体を加えることによつて0.155から0.03（ブラン
ク値を差し引いた値）に減少することで証明できる。従
つて、この細胞は、第VIII因子活性に特異的な分析法に
おいて機能的な活性であつて、第VIII因子の特異抗体に
よつて中和される活性を生産する。 この培地を第I Xa因子、第Ｘ因子、およびりん脂質を
含有しない反応混合物中でインキユベートしたところ、
ブランク値を越える程の、405nmにおける吸収の増加を
示さなかつた。従つて、観察された活性はプロテアーゼ
による基質の非特異的開裂、および、第VIII因子に対す
る特異抗体による中和によるものでないことが明らかで
ある。 1.反応は次の様に修飾して行つた:50μｇずつのI Xa/X/
りん脂質、CaCl2および１−100倍希釈した試料を37℃で
10分間イキユベートした。S2222（50μ）を加え、37
℃で60分間経過した後、50％酢酸100μで反応を終了
させた。 2. 試料の代りに緩衝液（0.05Mトリス−HCl（pH7.
3）、ウシ血清アルブミン0.2％含有）を用いた。 3. 抗体はC8とC7（10μｇづつ）の混合物である。分析
に先立ち、培地を５分間プレインキユベートした。 c. モノクローナル樹脂上、培地のクロマトグラフイー 第VIII因子活性含有培地を含む血清を既述（上記）の
如くC8モノクローナル抗体（ATCC No.40115、1984年４
月20日寄託、前記CRL8544と同条件で入手可能）カラム
でクロマトグラフした。溶離したフラクシヨンを1:100
に希釈し、活性を分析した。ピークを示す希釈フラクシ
ヨン50μに血漿中の第VIIII因子活性を中和する、既
知の様々なモノクローナル抗体を加えた。その結果を表
３に示す。この表は、カラムから溶離した第VIII因子活
性（培地内のそれよりもはるかに濃縮されている）もま
たこれらの第VIII因子抗体によつて中和されることを示
している。 表３ モノクローナル抗体溶出液のピーク・フラクシヨ
ンの比色分析１ 試 料 吸収（405nm1） ピーク・フラクシヨン２ 0.186 ピーク・フラクシヨン＋第VIII因子抗体３ 0.060 緩衝液対照 0.000 緩衝液対照＋第VIII因子抗体 0.045 1.分析は以下の如くにして行つた：希釈した試料50μ
をI Xa/X/りん脂質溶液50μと37℃で５分間インキユ
ベートした。この反応混合物をCaCl250μとインキユ
ベートし、37℃で10分間進行させた。次いで発色性基質
（50μ）を加え、10分後に50％酢酸100μを加えて
反応を終了させた。 2.ピーク・フラクシヨンを、分析のために0.15NaClを含
有する0.05Mトリス（pH7.2）で1:100に希釈した。 3.抗体として、10μのシムバイオテイツク抗体（Sym
biotic antibody）を、希釈した試料に加え、室温で５
分間インキユベートした。 d. 精製第VIII因子の凝固活性 細胞培地中に検出した活性を、C8モノクローナル樹脂
（上記）を通すことによつて精製し、濃縮した。ピーク
・フラクシヨンを、0.15M NaCl、0.02Mグリシン・エチ
ルエステル、0.01M CaCl2および10％グリセリンを含有
する0.05Mイミダゾール（pH6.9）に対して透析し、溶離
緩衝液を除去した。活性なピーク・フラクシヨンをと
り、第VIII因子欠損血漿内での凝固分析により、分析し
た（表４）。フイブリン・クロツト（凝固）は84秒後に
認められた。無添加の場合には、血友病血漿は104.0秒
後にクロツトを形成した。従つて、この溶離フラクシヨ
ンは血友病血漿における凝固欠損を修正するといえる。
正常なヒト血漿を希釈し、同様にして分析した。この血
漿から求めた標準曲線から、溶離フラクシヨンは約0.01
単位/mlの第VIII因子凝固活性を示すことが示唆され
た。 1. 第VIII因子はC8モノクローナル樹脂から溶離したピ
ークフラクシヨンを１時間半（1a）または２時間（1b）
透析し、溶離緩衝液を除くことにより、得られた。 2. 対照緩衝液は0.05Mトリス（pH7.3）に0.2％ウシ血
清アルブミンを含有せしめたものである。 e. 精製第VIII因子のトロンビン活性化作用 凝固活性がトロンビンによつて賦活化されることは、
第VIII因子の性質として良く知られている。モノクロー
ナルカラムから溶離したフラクシヨンについて、この性
質を調べた。溶離緩衝液（上記）を除くために試料を透
析した後、溶出液を0.15M NaCl、0.02Mグリシン・エチ
ルエステル、0.01M CaCl2および10％グリセリンを含有
する0.05Mイミダゾール（pH7.6）100μで希釈した。
この希釈液を更に希釈していかなる溶離緩衝液（これは
トロンビンの機能を妨害するかもしれない）も残存させ
ないようにすると共に、反応混合物のpHを高めた。この
溶液にトロンビン（25ng）を加え、室温で反応を行つ
た。様々な時点で25μづつをとり、1:3に希釈して凝
固活性を調べた。結果を第17図に示す。第VIII因子活性
は、該活性について予測される通り、時間の経過と共に
増加し、次いで減少している。添加量のトロンビンがこ
の分析の観察期間中、第VIII因子欠損血漿を凝固させな
いこと、さらに、認められた凝固時間のトロンビン依存
性の増加、その後の減少、に基く観察時間は、この実験
でモニターしている活性そのものが実際に、トロンビン
による第VIII因子の賦活性によるものであることを証明
している。トロンビンによる活性化の観察結果（約20
倍）は、血漿第VIII因子に関する観察結果と一致してい
る。 f. 組換え第VIII因子の固定化フオン・ウイルブランド
・セフアロースへの結合 第VIII因子は血漿中でフオン・ウイルブランド因子
（vWF）と可逆的なコンプレツクスを形成して循還して
いることが知られている（10−20）。従つて、有用な形
の組換え第VIII因子は、それが第VIII因子であることを
確認するために、その様なコンプレツクスを形成する能
力を有していなければならない。加えて、その様なコン
プレツクスを形成する能力を有することは、組換え第VI
II因子が、血友病患者に注入投与された時、天然の活性
な循還形である第VIII因子/vWFコンプレツクスを形成す
ることができることを証明するものである。組換え第VI
II因子の、vWFと相互作用する能力を試験するために、
以下に示す如くvWFを精製し、樹脂に固定化した： ヒトフオン・ウイルブランド因子は、0.15M NaClを含
有する0.05Mトリス（pH7.3）で平衡させたセフアロース
CL4B樹脂を用いたクロマトグラフイーにヒト第VIII因子
濃縮物（例えば、カツター・ラバラトリーズ（Cutter L
aboratories）から購入できる）をかけることにより、
調製された。フオン・ウイルブランド因子はカラムの空
容量の溶出量で溶離する。この範囲をプールし、飽和濃
度の40％の硫酸アンモニウムで沈殿させて濃縮し、これ
を、フオン・ウイルブランド因子に由来する、第VIII因
子の凝固活性を分離するために、0.25M CaCl2を含有す
る上記の緩衝液の存在下、カラムクロマトグラフイーに
付した。再び空（カラムの）容量のフラクシヨンをプー
ルして硫酸アンモニウムを用いて濃縮し、0.1M重炭酸ナ
トリウムに対して透析した。得られた製品を業者指示の
如く臭化シアンで活性化したセフアロース（フアルアシ
ア（Pharmacia）から購入）に共有結合的に結合させ
た。このカラムを0.05M NaClおよび0.25M CaCl2を含有
する0.02Mトリス（pH7.3）で洗浄して非結合タンパク質
を除いた。組換え第VIII因子を血清不含媒質中で調製
し、室温で、vWF樹脂1.0mlのカラムに適用した。 このカラムを洗浄して非結合タンパク質を除き、0.05
M NaClおよび0.25M CaCl2を含有する0.02Mトリス（pH7.
3）で溶離した。1.0mlのフラクシヨンを集めて1:10に希
釈し、分析した。結果を表５に示す。第VIII因子活性は
培地からカラムに吸収されている。次いでこの活性は、
ヒト第VIII因子について予測される様に、高い塩濃度で
溶離された（表５）。従つて、BHK細胞によつて生産さ
れた第VIII因子はフオン・ウイルブランド因子と特異的
な相互作用をする能力を有するものである。 表 ５ 試 料 吸収（405nm1） 細胞培地 0.143 洗浄液 0.015 溶離フラクシヨン１ 0.000 溶離フラクション２ 0.410 溶離フラクシヨン３ 0.093 溶離フラクシヨン４ 0.017 溶離フラクシヨン５ 0.000 溶離フラクシヨン６ 0.000 １）分析法は、全てのものを1/2の容量に減じた外は業
者の指示通りである。 10.融合タンパク質の分析 ここに述べる一連の実験は、クローンによつて血漿中
のポリペプチドと一緒に暗号化されているタンパク質を
免疫学的に同定することにある。この目的は、遺伝子の
一部を大腸菌内で融合タンパク質として発現させること
により、達成された。クローンされた遺伝子の暗号配列
の内、全てまたは一部を、抗体を生成させるのに適当な
物質が与えられる様、所望の形に発現させることができ
る。これら、クローンされたタンパク質の所望の領域に
特異的な抗体を、タンパク質の分析および精製に用いる
ことができる。この目的の下、一連の大腸菌／第VIII因
子“融合タンパク質”が調製された。第VIII因子クロー
ンのフラグメントを、その第VIII因子の暗号配列が適当
な解読枠内で、E.colitrp LE融合タンパク質（48、70、
71）の最初の12アミノ酸と結合する様、プラスミドpNCV
（70）のBgl II部位にライゲートした。この強力なtrp
プロモーター系の下では、通常、実質的な量の組換えタ
ンパク質産物が生産される。 第VIII因子の189bp Stu I/Hinc IIフラグメント（ア
ミノ酸1799−1860を暗号化している）を単離し、これを
pUC13（49k）のSma I部位にライゲートしてpfus1を組立
てた。この中間体プスミドをBamH IおよびEcoR I消化し
て200bpフラグメントをpNCV（70）（これから526bpのBg
l II〜EcoR Iフラグメントが回収された）に挿入した。
プラスミドpfus1はtrpプロモーターのコントロール下
で、16trpLEと、リンカーにより暗号化されているアミ
ノ酸、次いで61個の第VIII因子残基、最後の９個の、リ
ンカー暗号化残基およびtrpEカルボキシ末端残基とで構
成される10kDの融合タンパク質を産生する。 pfus3は、第VIII因子の290bp Ava IIフラグメント
（アミノ酸1000〜1096）を除去し、DNAポリメラーゼの
クレノーフラグメントを用いて突出したヌクレオチドを
埋め、この平滑末端化されたDNAフラグメントを既にBgl
IIで切断されているpNCVにライゲートし、同様にして
埋めることにより、組立てられた、適切な方向性でフラ
グメントが充填された（制限的消化とDNA配列決定に基
く）このプラスミドは、192アミノ酸のtrpLEタンパク質
に囲まれた97個の第VIII因子のアミノ酸を含有する、約
40kDの融合タンパク質の合成を指令する。 第VIII因子サブクローンλ222.8を、Ban Iで切断し、
突出部をヌクレアーゼS1で逆向きに消化した後、Pst I
消化して得られた525bpの平滑末端/Pst Iフラグメント
（アミノ酸710−885）を単離することにより、pfus4を
得た。これをBgl IIで消化したpNCVにライゲートし、Ps
t I消化して得られたベクターフラグメントを単離し
た。pfus4は第VIII因子の175アミノ酸と、それに続くtr
pLEの最初の12アミノ酸を含有する22kDの融合タンパク
質の合成を指令する。 この融合タンパク質を精製し、上記の如く抗体を生成
させるためにウサギに注射した。これらの抗体の血漿誘
導第VIII因子との結合性をウエスタンブロツト法で試験
した。 それウエスタン・トランスフアーの結果を第13図に示
す。各融合タンパク質は血漿第VIII因子と反応した。融
合物１は80,000ダルトンのポリペプチドを暗号化してい
る遺伝子の領域から生成された。融合タンパク質１の抗
血清は80,000ダルトンのバンドとのみ結合し、より大き
い分子量のタンパク質とは反応しないことがわかる。融
合タンパク質３および４の抗血清は80,000ダルトン以上
のタンパク質と交差反応するが80,000ダルトンのバンド
とは結合しないことが示されている。モノクローナル抗
体C8は第VIII因子に対向する中和モノクローナル抗体で
あつて、210,000ダルトンのタンパク質と反応すること
が知られている。第14図は、融合タンパク質４がこのモ
ノクロナール抗体と結合することを示しており、従つ
て、C8で確認し得るアミノ酸配列が融合ポリペプチド４
によつて暗号化されていることを証明している。このこ
とは更に、融合タンパク質４が210,000ダルトンのタン
パク質を暗号化しているタンパク質配列を含有するとい
う同定を支持するものである。上記の研究結果は、この
遺伝子が210,000および80,000ダルトンの両タンパク質
に対するアミノ酸配列を暗号化していることを証明する
ものである。 11.医薬組成物 本発明の化合物群は薬学的に有用な組成物についての
既知の製造方法に従い、本発明の方法で得た第VIII因子
産物を薬学的に許容し得る担体ビヒクルと混合すること
により、製剤化することができる。適当なビヒクル、お
よびその他のヒトタンパク質（例えばアルブミン）を含
む製剤は例えばレミントンのフアーマシユーテイカルサ
イエンス（Remington's Pharmaceutical Sciences）
（E.W.Martin）に記載されている。その様な組成物は、
宿主に効果的に投与するのに適した薬学的に許容し得る
組成物を調製するために、有効量の本発明のタンパク質
と適当量のビヒクルとを含有している。本発明のヒト第
VIII因子を、例えば血友病に罹患している患者に非経口
投与することができる。 通常、血友病治療時の平均投与量は出血病状の重篤度
によつて変動する。静脈内投与における平均投与量は次
の通りである：術前の指示量、40単位/Kg;少量の出血、
15〜20単位/Kg;維持量、８時間に20〜40単位/Kg。 以下に本明細書中に引用した参考文献を示す。 文献目録 1. ヘモスタシスおよびトロンボシス（Hemostasis and
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【図面の簡単な説明】 第１図は血液凝固の表面−媒介活性化を示す、凝固カス
ケード（２）（内在系）のダイアグラムである。第２図
はTMAClまたは６×SSC内でのDMAの融解点を示すグラフ
である。第３図はプローブ8.3を用いた第VIII因子の検
出状況の写真の模写図である。第４図はヒト第VIII因子
の遺伝子地図である。第５図はコスミツドベクターpGco
s4の制限サイト地図である。第６図はpESVDAの制限サイ
ト地図である。第７図はpESVDAベクターからのRNA転写
物に関する解析像を示す写真の模写図である。第８図は
pESVDA.S127cDNAクローンS36の配列式の模式図である。
第９図はcDNAのクローニングに関する模式図である。第
10図はヒト第VIII因子遺伝子の配列を示す模式図であ
る。第11図は完全な長さのヒト第VIII因子cDNAを含有す
る組換えプラスミドpSVEF VIIIの組立て模式図である。
第12図は第VIII因子発現プラスミドpAML3p.8c1の組立て
模式図である。第13図は融合タンパク質抗血清を用いた
ウエスタンブロツテイング法による第VIII因子解析像の
模写図である。第14図は融合タンパク質の解析像の模写
図である。第15図は第VIII因子の高速液体クロマトグラ
フイーにおける溶離曲線の模写図である。第16図は第VI
II因子のトリプシン処理ペプチドの逆相HPLCによる溶離
曲線の模写図である。第17図はトロンビンによる組換え
ヒト第VIII因子活性化作用を表す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ゴードン・アレン・ビーハー アメリカ合衆国カリフオルニア94070、 サン・カーロス、メイプル・ウエイ14番 (72)発明者 ウイリアム・アーウイン・ウツド アメリカ合衆国カリフオルニア94402、 サン・マテオ、タリータウン・ストリー ト1400番 (56)参考文献 特開 昭60−185723（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−500646（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ［79］1982，Ｐ．1648−1652

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記アミノ酸配列を有するヒト第VIII因子ポリペプ
    チド、もしくはヒト第VIII因子欠損症を修正する能力を
    有する該配列のアミノ酸改変変種またはそれらの断片を
    コードするDNA単離体もしくはそのアレリック変異体。 ２．該アミノ酸改変変種のアミノ酸1241がグルタミン酸
    残基である特許請求の範囲第１項記載のDNA単離体もし
    くはそのアレリック変異体。 ３．アミノ酸1241をコードする塩基配列がGACである
    か、もしくはGAGである特許請求の範囲第１項記載のDNA
    単離体もしくはそのアレリック変異体。 ４．該断片が200kD、95kDまたは80kDのポリペプチド断
    片である特許請求の範囲第１項記載のDNA単離体もしく
    はそのアレリック変異体。 ５．ヌクレオチド配列:GCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCT
    GGAAAAAを有する部分的ヒト第VIII因子コード配列であ
    る特許請求の範囲第１項記載のDNA単離体。 ６．下記ヌクレオチド配列を有する部分的ヒト第VIII因
    子コード配列である特許請求の範囲第１項記載のDNA単
    離体。 ７．下記ヌクレオチド配列を有する部分的ヒト第VIII因
    子コード配列である特許請求の範囲第１項記載のDNA単
    離体。８．選択可能な標識、複製起点、下記アミノ酸配列を有
    するヒト第VIII因子ポリペプチド、もしくはヒト第VIII
    因子欠損症を修正する能力を有する該配列のアミノ酸改
    変変種またはそれらの断片をコードするDNA配列もしく
    はそのアレリック変異体、上記DNA配列もしくはそのア
    レリック変異体に機能的に連結したプロモーター、およ
    びポリアデニル化部位を含有することを特徴とする複製
    可能な発現ベクター。 ９．該アミノ酸改変変種のアミノ酸1241がグルタミン酸
    残基である特許請求の範囲第８項記載のベクター。 １０．アミノ酸1241をコードする該DNA配列もしくは該
    アレリック変異体の塩基配列がGACであるか、もしくはG
    AGである特許請求の範囲第８項記載のベクター。 １１．該断片が200kD、95kDまたは80kDのポリペプチド
    断片である特許請求の範囲第８項記載のベクター。 １２．下記構造を有するpAML3P.8c1である請求の範囲第
    ８項記載のベクター。［ここに“E"はSV40初期プロモーターを表し、“AML"は
    アデノウイルス主後期プロモーターを表し、“DHFR"は
    ジヒドロ葉酸還元酵素をコード化する遺伝子を表し、
    “FVIII"は下記アミノ酸配列をコード化するDNA配列を
    表す。 １３．SV40初期プロモーター、スプライス供与部位、イ
    ントロン、スプライス受容部位、Ｂ型肝炎表面抗原の
    ３′非翻訳およびポリアデニル化部位を、５′から３′
    の方向に含有し、下記アミノ酸配列を有するヒト第VIII
    因子をコード化するゲノムDNAの断片が該イントロン内
    に含まれており、該断片が第VIII因子配列のエクソン領
    域をその５′および３′末端の両方に有する組換えDNA
    エクソン発現ベクターであって、トランスフェクトされ
    た哺乳類細胞中で転写された時に、イントロンを含まな
    い、該挿入されたDNA断片に対応するRNAセグメントを与
    えることができるDNAエクソン発現ベクター。 １４．スプライス供与部位がアデノウイルスII主後期第
    １スプライス供与部位であり、スプライス受容部位がア
    デノウイルスII E1bスプライス受容部位である特許請求
    の範囲第13項記載のベクター。 １５．ゲノムクローンから得られる部分的ヒト第VIII因
    子配列をコードするプラスミドpESVDA111.6、pESVDA11
    1.7、またはpESVDA.S127である特許請求の範囲第13項記
    載のベクターであって、pESVDA111.6に挿入されている
    ヒト第VIII因子DNA断片は、SV40初期プロモーターがそ
    のゲノム断片をセンス方向に転写するような方向性でpE
    SVDAのBgl II部位中にクローン化されたヌクレオチド配
    列： であり、pESVDA111.7は上記第VIII因子ゲノム断片を逆
    の方向性で含有する点以外はpESVDA111.6と同一であ
    り、pESVDA.S127に挿入されているヒト第VIII因子DNA断
    片は、pESVDA111.6と同じ方向性を持ち、pESVDAのBgl I
    I部位中に平滑末端連結によって挿入されている下記ヌ
    クレオチド配列：であるベクター（ただし、該pESVDAはトランスフェクト
    された哺乳類細胞中で転写された時に、イントロンを含
    まない、挿入されたヒト第VIII因子DNA断片に対応するR
    NAセグメントを与え得るベクターであって、下記構造を
    有することを特徴とする。［ここに“SV40ori"はSV40複製起点をまたぐSV40ウイル
    スの342bp断片を表し、“E"はSV40初期プロモーターを
    表し、“DONOR"はアデノウイルスII主第一後期リーダー
    スプライス供与部位を表し、“ACCEPTOR"はアデノウイ
    ルスII E1bスプライス受容部位を表し、“HBsAg"はポリ
    アデニル化部位を含むＢ型肝炎表面抗原コード化遺伝子
    の580bp断片を表す］）。 １６．選択可能な標識、複製起点、下記アミノ酸配列を
    有するヒト第VIII因子ポリペプチド、もしくはヒト第VI
    II因子欠損症を修正する能力を有する該配列のアミノ酸
    改変変種またはそれらの断片をコードするDNA配列もし
    くはそのアレリック変異体、上記DNA配列もしくはその
    アレリック変異体に機能的に連結したプロモーター、お
    よびポリアデニル化部位を含有することを特徴とする複
    製可能な発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動
    物細胞。 １７．該アミノ酸改変変種のアミノ酸1241がグルタミン
    酸残基である特許請求の範囲第16項記載の哺乳動物細
    胞。 １８．アミノ酸1241をコードする該DNA配列もしくは該
    アレリック変異体の塩基配列がGACであるか、もしくはG
    AGである特許請求の範囲第16項記載の哺乳動物細胞。 １９．該断片が200kD、95kDまたは80kDのポリペプチド
    断片である特許請求の範囲第16項記載の哺乳動物細胞。 ２０．BHK細胞である特許請求の範囲第16項記載の細
    胞。 ２１．SV40初期プロモーター、スプライス供与部位、イ
    ントロン、スプライス受容部位、Ｂ型肝炎表面抗原の
    ３′非翻訳およびポリアデニル化部位を、５′から３′
    の方向に含有し、下記アミノ酸配列を有するヒト第VIII
    因子をコード化するゲノムDNAの断片が該イントロン内
    に含まれており、該断片が第VIII因子配列のエクソン領
    域をその５′および３′末端の両方に有する組換えDNA
    エクソン発現ベクターであって、トランスフェクトされ
    た哺乳類細胞中で転写された時に、イントロンを含まな
    い、該挿入されたDNA断片に対応するRNAセグメントを与
    えることができるDNAエクソン発現ベクターでトランス
    フェクトされた哺乳動物細胞。 ２２．下記アミノ酸配列： もしくは下記アミノ酸配列： をコードするDNA配列、DHFR増幅可能遺伝子をコードす
    る第２のDNA配列、および選択可能な標識遺伝子をコー
    ドする第３のDNA配列でトランスフェクトされた哺乳動
    物細胞。 ２３．BHK ATCC番号CRL8544である特許請求の範囲第22
    項に記載の哺乳動物細胞。
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