DK164876B

DK164876B - Fremgangsmaade til fremstilling af et human faktor viii,dna-sekvens, rekombinant udtrykkelsesvektor, dna-sekvensen, cellelinie og rekombinant organisme, anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et laegemiddel og farmaceutisk praeparat indeholdende saaledes fremstillet faktor viii polypeptid

Info

Publication number: DK164876B
Application number: DK176885A
Authority: DK
Inventors: Daniel Jeffrey Capon; Richard Mark Lawn; Gordon Allen Vehar; William Irwin Wood
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1984-04-20
Filing date: 1985-04-19
Publication date: 1992-08-31
Also published as: NL940016I2; HK8395A; LU88546I2; FI851497L; HUT37654A; FI86885C; NO851563L; IL74909A; KR850007275A; DE3581312D1; EP0385558A3; ES8607397A1; CA1341395C; ATE60087T1; JPS60243023A; JPH0640942A; GR850947B; MY102029A; FI851497A0; DK164876C

Description

i

DK 164876 B

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et human faktor VIII polypeptid eller et funktionelt derivat deraf samt en DNA-sekvens, som koder for polypeptidet, en rekombinant udtrykkelsesvektor, 5 som operabelt indeholder DNA-sekvensen, en cellelinie og en rekombinant organisme, som er transficeret med DNA-sekvensen. Endvidere angår opfindelsen anvendelsen af et ved fremgangsmåden fremstillet polypeptid til fremstilling af et lægemiddel og et farmaceutisk præparat 10 indeholdende et ved fremgangsmåden fremstillet faktor VIII polypeptid.

Opfindelsen er delvis baseret på opdagelsen af DNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens af human faktor VIII såvel som dermed forbundne portioner af faktor VIII 15 molekylet, som i vore hænder har vist sig at være funk tionelle bioaktive dele. Denne opdagelse blev muliggjort ved fremstillingen af faktor VIII i forskellige former ved anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi, hvilket på sin side muliggjorde fremstillingen af tilstrækkelig 20 kvalitet og mængde af materialer, hvormed der kunne udføres biologisk prøvning og bevises biologisk funktiona-litet. Efter at dette var bestemt, var det muligt at skræddersy funktionelle arter af faktor VIII via genetisk manipulation og in vitro forarbejdning, hvorved man 25 effektivt nåede frem til hidtil uopnåelige kommercielt praktiserbare mængder af aktive faktor-VIII-produkter.

Denne opfindelse er rettet mod disse forbundne udførelses-former i alle henseender.

De publikationer og andre materialer, som anvendes til 30 at belyse opfindelsens baggrund og i særlige tilfælde at give yderligere detaljer vedrørende dens udøvelse, betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning og er anført i slutningen af beskrivelsen i form af en bibliografi.

DK 164876 B

2

Opfindelsens baggrund

Opretholdelsen af et intakt vaskulært system kræver samvirke .af en række forskellige celler og proteiner.

Efter skade på det vaskulære leje startes en række reak-5 tioner for at forhindre væsketab. Den første reaktion er aktiveringen af blodplader, som hæfter til såret og undergår en række reaktioner. Disse reaktioner inkluderer tiltrækningen af andre blodplader til stedet, frigørelsen af et antal organiske forbindelser og pro-10 teiner, og dannelsen af en thrombogen overflade til aktivering af blodkoaguleringskaskaden. Via denne kombinerede række reaktioner dannes en blodpladeprop, som forsegler såret. Blodpladeproppen stabiliseres ved dannelsen af fibrintråde omkring proppen, hvilket forhindrer 15 uønsket væsketab. Blodpladeproppen og fibrinmatricen opløses derefter langsomt, efterhånden som såret repareres. Med henblik på en almen oversigt, se (1).

En kritisk faktor ved standsningen af blødning er aktiveringen af koaguleringskaskaden for at stabilisere den 20 først dannede blodpladeprop. Dette system består af over et dusin samvirkende proteiner, som er tilstede i plasma såvel som frigjorte og/eller aktiverede celle-proteiner (2, 3). Hvert trin i kaskaden involverer aktiveringen af en specifik inaktiv (zymogen) form af en 23 protease til den katalytisk aktive form. Ved international overenskomst (4) er hvert protein i kaskaden blevet tildelt en romertalsbetegnelse. Den zymogene form af hvert er repræsenteret ved romertallet, medens den aktiverede form er repræsenteret ved romertallet efterfulgt 30 af et "a". Den aktiverede form af proteasen i hvert trin i kaskaden aktiverer katalytisk den protease, som er involveret i det efterfølgende trin i kaskaden. På denne måde forstærkes en lille begyndelsesstimulus, som resulterer i aktiveringen af et protein ved kaskadens

DK 164876 B

3 begyndelse, katalytisk i hvert trin, således at det endelige resultat er dannelsen af et udbrud af thrombin med den resulterende thrombin-katalyserede omdannelse af det opløselige protein, fibrinogen, til dets uopløse-5 lige form, fibrin. Fibrin har den evne at selv-aggregere til tråde eller fibre, som har den funktion at stabilisere blodpladeproppen, således at proppen ikke let fjernes.

Figur 1 sammenfatter den nuværende forståelse af samvirket af proteiner, der er involveret i blodkoagulation. Manglen 10 eller deficiensen af ethvert af de i kaskaden involverede proteiner ville resultere i en blokering af udviklingen af den oprindelige stimulus til produktionen af fibrin.

I midten af kaskaden, som repræsenteret i figur 1, er et trin, hvori faktor IXa starter omdannelsen af faktor 15 X til den aktiverede form, faktor Xa. Faktor VIII (også synonymt betegnet som faktor VIIIC) antages for tiden at fungere i dette trin, i nærvær af phospholipid og calciumioner, som cofaktor, dvs. den har ingen kendt funktion i sig selv og er nødvendig for at forhøje aktivi-20 teten af faktor IX. Dette trin i kaskaden er kritisk, da de to mest almindelige hæmophilia-lidelser er blevet bestemt at forårsages af den nedsatte funktion af enten VIII (haemophilia A eller klassisk haemophilia) eller faktor IXa (hæmophilia B). Omkring 80 % af hæmophilia- 25 lidelserne skyldes mangel på faktor VIII. Den kliniske manifestation i begge typer lidelser er den samme: en mangel på tilstrækkelig fibrindannelse, som kræves til stabilisering af blodpladeproppen, hvilket resulterer i en prop, som let fjernes med ny blødning på stedet.

30 Den relativt høje frekvens af faktor VIII og faktor IX deficiens sammenlignet med andre faktorer i koagulerings-kaskaden skyldes deres genetiske tilknytning til X-kromo-somet. Et enkelt defekt allel af genet for faktor VIII eller faktor IX resulterer i hæmophilia hos mænd, som

DK 164876 B

4 kun har én kopi af X-kromosomet. De andre koaguleringsfaktorer er autosomalt forbundet og kræver almindeligvis tilstedeværelsen af to defekte alleler for at frembringe en blodkoaguleringslidelse - en meget mindre almindelig 5 begivenhed. Således er hæmophilia A og B langt de mest almindelige arvelige blodkoaguleringsforstyrrelser, og de forekommer næsten udelukkende hos mænd.

For flere årtier siden var gennemsnitsdødsalderen for blødere 20 år eller yngre. Fra begyndelsen af 1950'erne 10 til slutningen af 1960'erne førte forskningen inden for faktor VIII forstyrrelsen til behandling af hæmophilia A, først med helplasma og senere med koncentrater af faktor VIII. Den eneste kilde til human faktor VIII har været humant plasma. En faktor, som medvirker til 15 fordyrelsen, er omkostningen forbundet med fremskaffelse af store mængder anvendeligt plasma. Kommercielle firmaer må oprette aftapningscentre, godtgøre donorer og holde plasmaet i frossen tilstand umiddelbart efter tapningen og under forsendelsen til forarbejdningsvirksomheden.

20 Plasmaprøverne hældes sammen i mængder på over 1000 donorer og forarbejdes. På grund af faktor VIII aktivitetens ustabilitet er der store tab forbundet med de få simple rensningssprocedurer, som anvendes til at producere koncentraterne (med det resultat, at der kun udvindes 25 omkring 15 % aktivitet). De resulterende farmaceutiske produkter er stærkt urene med en specifik aktivitet på 0,5 - 2 faktor-VIII-enheder pr. mg protein (en enhed af faktor-VIII-aktivitet er pr. definition den aktivitet, som findes i 1 ml plasma). Den anslåede renhed af faktor-30 VIII-koncentrat er omkring 0,04 vægt-?o f aktor-V 111-protein. Dette høje urenhedsniveau er forbundet med en række forskellige alvorlige komplikationer, herunder udfældet protein, hepatitis og eventuelt det agens, som er ansvarligt for Erhvervet Immun-Defekt-Syndrom (AIDS). Disse 35 ulemper ved faktor-VIII-koncentraterne skyldes ustabili-

DK 164876 B

5 teten af den plasma-afledte faktor VIII, dens lave renhedsniveau og dens fremstilling ud fra en pulje af mange donorer. Dette betyder, at skulle et individ ud af de tusind donorer have f.eks. hepatitis, ville hele partiet 5 være besmittet med viruset. Donorer screenes for hepatitis B, men koncentraterne vides at indeholde både hepatitis A og hepatitis ikke-A ikke-B. Forsøg på at fremstille et produkt med højere renhed resulterer i uacceptabelt store tab i aktivitet, hvorved omkostningerne forøges.

10 Historien om rensning af faktor VIII belyser vanskelig heden ved at arbejde med dette protein. Denne vanskelighed skyldes for en stor del ustabiliteten og spormængderne af faktor VIII, som indeholdes i helblod. I de tidlige 1970'ere blev der karakteriseret et protein, som dengang 15 antoges at være faktor VIII (5, 6, 7). Dette protein blev bestemt at være et aggregat af en glycoprotein-under-enhed, hvilken underenhed udviste en molekylvægt på omkring 240 000 dalton bestemt ved SDS-gel-elektroforese. Denne underenhed aggregerede til en heterogen population 20 af arter med højere molekylvægt i området fra 1 million til 20 milioner dalton. Proteinet var tilstede i hæmo-philisk plasma, men manglende i plasma hos patienter med von Willebrand's sygdom, en autosomalt overført genetisk lidelse karakteriseret ved en forlænget blød-25 ningstid og lave niveauer af faktor VIII (8). Den dengang fremsatte teori var, at dette protein med høj molekylvægt, betegnet von Willebrand faktor (vWF) eller faktor-VIII-be-slægtet antigen (FVIIIRAg), var ansvarligt for koagulationsdefekten ved begge sygdomme, hvorved proteinet manglede 30 ved von Willebrand sygdom og på en eller anden måde var ikke-funktionelt ved klassiske hæmophilia-sygdomstil-stande (9). Imidlertid blev det senere iagttaget, at der under visse betingelser, især høje saltkoncentrationer, kunne udskilles faktor-V111-akt i vitet fra dette protein, 35 som antoges at være ansvarligt for aktiviteten af faktor

DK 164876 B

6

Ulli (10-20). Under disse betingelser udviste faktor-VIII-koaguleringsaktiviteten en molekylvægt på 100 000 -300 000. siden denne tid er der koncentreret store anstrengelser om at identificere og karakterisere det 5 eller de proteiner, som er ansvarlige for den koagulerende aktivitet af faktor VIII. Imidlertid har den omstændighed, at kun spormængder af proteinet er til rådighed i helblod, koblet med dets ustabilitet vanskeliggjort sådanne undersøgelser.

10 Der er blevet rapporteret forsøg på at isolere faktor- VIII-proteiner fra naturlig kilde, både human og animalsk, i varierende renhedstilstande (21-27, 79). På grund af de ovennævnte problemer foreligger muligheden for fejlagtig identifikation og efterfølgende kloning og 15 udtrykkelse af et forurenende protein i et faktor-VIII- præparat i stedet for det påtænkte faktor-VIII-protein.

At denne mulighed er reel, fremhæves af den tidligere nævnte fejlagtige identifikation af von Willebrandt protein som værende faktor-VIII-koaguleringsproteinet.

20 Forvirring med hensyn til identifikationen af faktor- VIII-lignende aktivitet er også en afgjort mulighed.

Enten faktor Xa eller thrombin ville frembringe en forkortelse af koaguleringstiden af forskellige plasmaer, herunder faktor-VIII-deficient plasma, således at de 25 ville synes at udøve faktor-VIII-lignende aktivitet, med mindre der udførtes de rigtige kontrolforanstaltninger. Visse celler vides også at producere aktiviteter, som kan fungere på en måde, der meget ligner den, der forventes af faktor VIII (28, 29, 30). Den sidstnævnte 30 reference (30) beviser, at denne faktor-VIII-lignende aktivitet faktisk er en vævsfaktor i proteinform. Det samme eller et lignende materiale er også blevet renset fra human placenta (31). Disse proteinfunktioner resulterer i forbindelse med plasmaproteinfaktoren VII, i 35 det samme trin som faktor VIII og faktor IXa, i aktiveringen af faktor X til faktor Xa.

DK 164876 B

7

Bevisbyrden for udtrykkeisen af en rekombinant faktor VIII ville derfor hvile på beviset for funktionel udtryk-kelse af, hvad der utvivlsomt er en faktor-VIII-aktivitet. Selv hvis forskere tidligere skulle have påvist, at 5 de opnåede en hel eller delvis klon, som kodede for hele eller en del af faktor VIII, kunne de tekniske problemer ved udtrykkeisen af et rekombinant protein, som er fire gange større end noget andet rekombinant protein udtrykt til dato, udmærket have vist sig uløselige 10 for almindelige fagfolk.

Den danske patentansøgning nr. 2923/85 (som svarer til den internationale patentansøgning offentliggørelse nr. W0 85/01961) er baseret på to prioritetsansøgninger dateret henholdsvis 28. oktober 1983 og 24. august 1984.

15 Af disse daterer kun den førstnævnte (US patentansøgning nr. 546 650) sig fra før prioritetsdatoen for den foreliggende ansøgning.

Undersøgelse af US patentansøgning nr. 546 650 viser, at den for størstedelen er af profetisk art, og at for-20 skerne stadig var langt fra at klone hele faktor VIII

DNA-sekvensen. Angivelsen på det tidspunkt var klart utilstrækkelig til at gøre dette til kendt teknik. Kloningen af faktor VIII var sandsynligvis den vanskeligste kloningsopgave, som nogen var gået i gang med på den 25 tid, og det kan ikke antages, at den var gjort til rutine på det tidspunkt, hvor kun en meget lille del af sekvensen var blevet klonet.

Sammenlignet med prioritetsansøgningen, US 546 650, er der flere afslørende modifikationer i den samme an-30 søgers senere indleverede ansøgning. I den senere an søgning gives for første gang en beskrivelse af et farmaceutisk præparat af AHF. Endvidere identificeres i den senere ansøgning for første gang aminosyresekvensen

DK 164876 B

8 af aminoterminus af faktor VIII. Disse tilføjelser rejser spørgsmål om, hvorvidt man i den førstindleverede ansøgning overhovedet var sikre på, at man havde et fragment af DNA, som kodede for en del af human faktor 5 VIII.

Man modificerede også den senere indleverede ansøgning til at afspejle en modifikation i screeningen af humant væv for mRNA, og man angav også en alternativ.procedure til ekstrahering af mRNA'en og isolering af en cDNA-10 klon. Denne alternative procedure fylder fire sider i den senere indleverede ansøgning. Det er tvivlsomt, om de fremgangsmåder, som blev antydet i US 546 650 til identifikation af faktor VIII mRNA og konstruktion af et cDNA-bibliotek, var beskrevet tilstrækkeligt til 15 at gøre opnåelsen heraf til kendt teknik.

Yderligere blev der, hvad angår udtrykkeisen af human faktor VIII, tilføjet hvad der igen betegnes som en alternativ procedure, som ikke var inkluderet i den første prioritetsansøgning. US patentansøgning nr.

20 546 650 henviser til deponeringer (side 38 og 39), som ikke er identificeret, og til figurer, som ikke findes i det indleverede prioritetsdokument, således at der er åbenlyse mangler i dets indhold foruden de utilstrækkeligheder, som fremgår af en mere detaljeret teknisk 25 overvejelse.

Krav 4 i US patentansøgning nr. 546 650 angiver en sekvens på 51 nucleotider af human faktor VIII. Det bør tages i betragtning, at faktor VIII genet omfatter 186 000 basepar af det humane X kromosom. Inden for de 186 000 30 basepar er der 26 exoner indeholdende de tilnærmelses vis 9 000 basepar kodesekvenser. De i kravet angivne 51 nucleotider omfatter 0,03 % af faktor VIII genet.

Det kan ikke for alvor accepteres, at denne ganske lil-

DK 164876 B

9 le fraktion af det totale gen er tilstrækkelig til at informere den læsende fagmand om, at han nu har adgang til isolering og udtrykkelse af det komplette faktor VIII gen.

5 Man kunne først stole på nøjagtigheden af sekvensen på 51 nucleotider, efter at fuld-længde-genet var blevet klonet, udtrykt, og det resulterende protein sammenlignet med faktor VIII oprenset fra plasma. Patentkrav på rekombinant faktor VIII, dens fremstilling og DNA, 10 som koder for den, kan kun med rette baseres på information, som bekræfter dette resultat og letter andres opnåelse af det. Det er derfor meningsløst at kræve et monopol på en opfindelse, som endnu ikke var gjort, baseret på den foreløbige angivelse af en ubetydelig 15 mængde information ud over den, som allerede fandtes inden for teknikken, og med hovedopgaven stadig liggende forude.

Den danske patentansøgning nr. 135/85 (som svarer til EP ansøgning offentliggørelse nr. 150 735 A2) er også 20 baseret på to prioritetsansøgninger, hvoraf kun den første (US patentansøgning nr. 570 062) daterer sig fra før prioritetsdatoen for den foreliggende ansøgning.

Denne prioritetsansøgning angiver også kun kloning og opklaring af en meget lille del af faktor VIII sekven-25 sen. Igen kan udtrykkeisen af denne faktor VIII under-enhed ikke siges at foregribe opnåelsen af udtrykkelse af det komplette funktionelle faktor VIII protein.

Denne prioritetsansøgning belyser vanskeligheden ved at forsøge at rette krav på faktor VIII baseret på en 30 delvis sekvens. Den sekvens, der er tilvejebragt i denne tidligere ansøgning, er blevet sammenlignet med fuldlængde-sekvensen i den foreliggende ansøgning.

DK 164876 B

10 I den tidligere ansøgning beskrives en udledt sekvens på 211 aminosyrer, som angives at kode for en del af faktor VIII. DNA'en er antageligvis en del af exon I i faktor VI-II genet. Faktisk er den DNA, som koder for 5 aminosyrerne 200 og videre, en del af en intron. Den DNA, som koder for aminosyre 199, er 22 000 basepar væk fra den næste exon og den DNA, som koder for aminosyre 200. På ansøgningstidspunktet for denne tidligere prioritetsansøgning var ansøgerne ude af stand til at 10 bedømme, om den opnåede sekvens faktisk var en del af en exon eller en intron. Aminosyrerne 1-58 er fulde af uoverensstemmelser med den autentiske faktor VIII sekvens. Fejlene stammer fra mange DNA-sekvensbestem-melsesfejl. Det var først efter opnåelse af fuld-læng-15 de-klonen, udtrykkelse af genet og sammenligning af det rekombinante protein med det isolerede oprensede protein, at man kunne være sikker på, at det klonede gen faktisk kodede for faktor VIII.

Således kan angivelserne i disse tidligere prioritets-20 ansøgninger ikke anses for at have gjort rekombinant faktor VIII og dens syntese til kendt teknik.

Sammenfatning af opfindelsen

De potentielle kunstprodukter og problemer, som er beskrevet ovenfor, viser i forening behovet for grundig 25 undersøgelse af alle påstande om heldig kloning og ud trykkelse af human faktor VIII. Den foreliggende opfindelses succes bevises af: 1) Immunologisk kryds-reaktivitet af antistoffer dannet over for klon-afledte faktor-VIII-proteiner med plasma- 30 afledte faktor-VIII-proteiner.

2) Kryds-reaktion af neutraliserende monoklonale anti-

DK 164876 B

11 stoffer dannet over for faktor VIII fra humant plasma med protein indkodet af klonen.

3) Identifikation af en genomisk DNA svarende til faktor-VII I-cDNA'en ifølge opfindelsen som værende lokaliseret 5 i X-kromosomet, hvor faktor-VIII-genet er kendt for at være indkodet.

4) Udtrykkelse af et funktionelt protein, som udøver: a) korrektion af faktor-VIII-deficient plasma.

b) Aktivering af faktor X til faktor Xa i nærvær 10 af faktor IXa, calcium og phospholipid.

c) Inaktivering af den under (a) og (b) iagttagne aktivitet med antistoffer specifikke for faktor VIII.

d) Binding af aktiviteten til en søjle med immobili- 15 seret monoklonalt antistof specifikt for faktor VIII.

e) Aktivering af faktor-VIII-aktiviteten med thrombin.

f) Binding af aktiviteten til og efterfølgende eluering fra immobiliseret von Willebrandt-faktor.

20 Således er den foreliggende opfindelse baseret på den heldige anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi til produktion af funktionel human faktor VIII, og det i mængder, som er tilstrækkelige til at bevise identifikation og funktionalitet og at starte og gennemføre dyreforsøg 25 og klinisk afprøvning som forudsætninger for markedets godkendelse. Produktet, human faktor VIII, er egnet til anvendelse, i alle dets funktionelle former, ved profylaktisk eller terapeutisk behandling af mennesker, som er diagnosticeret til at være deficiente med hensyn 30 til faktor-VI11-koaguleringsaktivitet. Det kan således anvendes ved fremgangsmåder til diagnosticering og behandling af klassisk hæmophilia (eller haemophilia A) hos mennesker.

DK 164876 B

12

Opfindelsen tilvejebringer en DNA-sekvens, som koder for et humant faktor VIII polypeptid med den i fig.

10 viste aminosyresekvens eller et derivat deraf med evnen til at korrigere human faktor VIII mangel.

5 Opfindelsen tilvejebringer også en rekombinant udtryk kelses vektor, som operabelt indeholder den ovennævnte DNA-sekvensj en cellelinie, som er blevet transficeret med udtrykkelsesvektoren og er i stand til at producere rekombinant funktionel human faktor VIII, fortrins-10 vis en cellelinie opnået ved transfektion af BHK-celler; og en rekombinant organisme transficeret med den ovennævnte DNA-sekvens, således at den er i stand til'at udtrykke den DNA.

Endvidere tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde, 15 som omfatter fremstilling af et polypeptid med den i fig. 10 viste aminosyresekvens eller et derivat deraf med evnen til at korrigere human faktor VIII mangel, hvilken fremgangsmåde omfatter anvendelsen af en organisme, herunder en cellelinie, som angivet ovenfor.

20 Fremgangsmåden kan med fordel udøves med en eukaryotisk celle som værtsorganisme, især en kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-celle eller en babyhamsternyre-(BHK)-celle. Fremgangsmåden vil sædvanligvis yderligere omfatte et trin til udvinding af polypeptidproduktet og ofte anvendel-25 sen af polypeptidproduktet til fremstilling af et læge middel .

Endelig tilvejebringer opfindelsen et farmaceutisk præparat indeholdende et faktor VIII polypeptid alene fra en enkelt aminosyresekvens som vist i fig. 10 eller 30 et derivat deraf med evnen til at korrigere human faktor VIII mangel sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

Et sådan præparat vil normalt være i det væsentlige frit for protein eller andre materialer, som almindelig-

DK 164876 B

13 vis ledsager human faktor VIII, når den er isoleret fra dens native plasmaholdige miljø.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der ud over faktor VIII polypeptidet med den i fig. 10 viste amino-5 syresekvens også fremstilles derivater deraf, som er hidtil ukendte polypeptider omfattende en eller flere dele som svarer til funktionelle segmenter af human faktor VIII. Disse hidtil ukendte polypeptider kan repræsentere de bioaktive segmenter og/eller de antigeniske 10 determinant-segmenter af nativ faktor VIII. For eksempel er sådanne polypeptider nyttige til behandling af blødere som sådanne, og især dem, der har udviklet neutraliserende antistoffer over for faktor VIII. I det sidstnævnte tilfælde kunne behandling af sådanne patienter med po-15 lypeptider, som bærer de nødvendige antigen-determinanter, effektivt binde sådanne antistoffer, hvilket ville forøge effektiviteten af behandling med polypeptider, som bærer de bioaktive portioner af human faktor VIII.

De faktor VIII-DNA-sekvenser, som tilvejebringes ifølge 20 den foreliggende opfindelse, og som koder for én eller flere funktionelle dele af human faktor VIII, finder anvendelse inden for genterapi til genoprettelse af faktor-VIII-aktivitet hos deficiente individer ved inkorporering af sådan DNA, f.eks. via hæmatopoietiske 25 stamceller.

Særlig foretrukken udførelsesform

Human faktor VIII produceres i funktionel form i et særligt egnet værtcellesystem. Dette system omfatter babyhamster-nyreceller (BHK-21 (C — 13), ATCC nr. CCL 10), 30 som er blevet transficeret med en udtrykkelsesvektor omfattende DNA, der koder for human faktor VIII, inklusive 3'- og 5'-utranslateret DNA deraf og sammenføjet

DK 164876 B

14 i det 3'-utranslaterede område med 31-utranslateret terminator- DNA-sekvens, f.eks. en sådan fra hepatitis B overfladeantigen-gen. Udtrykkeisen af genet drives af transskriptions- og translations-styringselementer 5 leveret af den overvejende sene promotor fra adenovirus sammen med dens 5'-splejsede ledersekvens såvel som elementer afledt fra SV40- repliceringsorigin-området inklusive transskriptionsforstærker- og -promotorsekvenser. Desuden kan udtrykkelsesvektoren også indeholde 10 et DHFR-gen drevet af en SV40- tidlig-promotor, som tilfører genforstærkningsevne, og et selekterbart markørgen, f.eks. neomycinresistens (som kan tilføres vis cotransfektion med en separat vektor bærende neomycin-resistens-potentiale).

15 Figur forklaring

Figur 1. Skematisk repræsentation af koaguleringskaskaden (2).

Figur 2. Smeltning af DNA i TMAC1 og 6x SSC. A: for hvert punkt blev 10 duplikat-aliquoter af !X -DNA først 20 bundet til nitrocellulosefiltre. Disse filtre blev derpå hybridiseret uden formamid ved 37 °C som beskrevet i "Metoder". Par af pletter blev derpå vasket i 6sSSC, 0,1 % SDS (Π) eller 3,0 M TMAC1, 50 mM "Tris"-HCl, pH 8,0, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA (o) ved 2 °C temperatur-25 forøgelse fra 38 til 56 °C. Smeltningstemperaturen er det punkt, hvor 50 % af hybridiseringsintensiteten blev tilbage. B: et smeltnings forsøg som i koordinatsystem A blev gennemført ved binding af aliquoter af pBR322-DNA til nitrocellulosefiltre. Sonde fragmenter af varierende 30 længder blev dannet ved nedbrydning af pBR322 med Mspl, endemærkning af fragmenterne med P og isolering på polyacrylamidgeler. Sondefragmenterne fra 18 til 75 b blev hybridiseret uden formamid ved 37 °C og dem fra

DK 164876B

15 46 til 1374 b i 40 % formamid ved 37 °C som beskrevet i "Metoder". Filtrene blev vasket i 3,0 M tetramethyl-ammoniumchlorid (TMAC1), 50 mM "Tris"-HCl, pH 8,0, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA ved 3 °C temperatur forøgelser til bestemmel-5 se af smeltningstemperaturen. (o) smeltningstemperatur bestemt for p8R322-MspI-sondefragmenter, (A) smeltningstemperaturer i 3,0 M TMAC1 fra koordinatsystem a for 11 -17 b sonder.

Figur 3. Detektion af faktor-VIII-genet med sonde 8,3.

10 Tre billeder til venstre: Southern-afdupninger af 46,XY

(IX, mandlig) DNA og 49,XXXXY (4X) human DNA nedbrudt med EcoRI og BamHI blev hybridiseret i 6sSSC, 50 mM natriumphosphat (pH 6,8), 5x Denhardt's opløsning, 0,1 g/1 kogt, ultralydbehandlet laksesperm-DNA, 20 % formamid 15 ved 42 °C som beskrevet i "Metoder". De tre afdupninger blev vasket i lxSSC, 0,1 % SDS ved den angivne temperatur. Bane 1, EcoRI IX; bane 2, EcoRI 4X; bane 3, BamHI IX; og bane 4, BamHI 4X. Bane M, endemærkede \ Hindi11- og ^ørX174-Hae 111-nedbrudte markør fragmenter. Højre billede: 20 ét nitrocellulosefilter fra 3./4X-biblioteks-screeningen hybridiseret med sonde 8,3. Pile angiver to af de uafhængige faktor-VIII-positiver kloner. Hybridisering og vaskning for biblioteksscreeningen var som beskrevet ovenfor for Southern-afdupningerne med en vasketempera-25 tur på 37 °C.

Figur 4. Kort over det humane faktor-VIII-gen. Den øverste linie viser positionerne og de relative længder af de 26 proteinkodningsområder (Exons A - Z) i faktor-VIII-genet. Transskriptionsretningen er fra venstre 30 til højre. Den anden linie viser kortets målestok i kilobasepar (KB). Lokaliseringen af genkendelsessekvenserne for de 10 restriktionsenzymer, som blev anvendt til at kortlægge faktor-VIII-genet, er givet i den næste række linier. De ikke-udfyldte kasser repræsenterer

DK 164876 B

16 udstrækningen af human genomisk DNA indeholdt i hver af (1114, Λΐ20,λ482,3.599, ogl 605) og cosmid- (p541, p542, p543, p612, 613, p624) klonerne. Den nederste linie viser lokaliseringerne af sonder anvendt ved de 5 genomiske screeninger, hvortil der er henvist i teksten: 1) 0,9 kb EcoRI/BamHI-fragment fra p543; 2) 2,4 kb EcoRI/-BamHI-fragment fra-3.222; 3) 1,0 kb Ndel/BamHI triplet af fragmenter fra^.120; 4) oligonucleotid-sonde 8,3; 5) 2,5 kb StuI/EcoRI-fragment fra 1114; 6) 1,1 kb EcoRI/-10 BamHI-fragment fra λ 482; 7) 1,1 kb BamHI/EcoRI-fragment fra p542. Southern-afdupningsanalyse af 46,XY og 49,XXXXY genomisk DNA afslørede ingen skelnelige forskellige i organisationen af faktor-VIII-genet.

Figur 5. Cosmidvektor pGcos4. Det sammensmeltede Hincll-15 fragment på 403 b fralcll857S7 (Bethesda Research Lab.) indeholdende cos-centret blev klonet i pBR322 fra Aval til PvuII til dannelse af plasmidet pGcosl. Separat blev 1624 b PvuII- til -Nael-fragmentet af pFR400 (49n) indeholdende et SU40-origin og -promotor, et mutant 20 dihydrofolatreductase-gen og hepatitis B o verfladeantigen- afslutingssekvenser klonet ind i pBR322-AhaIII-stedet til dannelse af plasmidet mp33dhfr. En tre-parts ligering og kloning blev derpå gennemført med 1497 b Sphl- til -Ndel-fragmentet af pGcosl, 3163 b Ndel- til EcoRV-25 fragmentet af mp33dhfr og 376 b EcoRV- til - Sphl-frag- mentet af pKT19 til dannelse af cosmidvektoren pGcos3. pKT19 er et derivat af pBR322, hvori BamHI-centret i tetracyclinresistens-genet har den muterede nitroguanosin-behandling. pGcos4 blev dannet ved kloning af den synte-30 tiske 20mer, 51-AATTCGATCGGATCCGATCG, ind i EcoRI-centret af pGcos3.

Figur 6. Kort over pESVDA. 342 b PvuII-HindlH-fragmentet af SV40-virus spændende over SV40-repliceringsor.iginet og modificeret til at være afgrænset af EcoRI-steder

DK 164876 B

17 (73), polyadenyleringsstedet af hepatitis B virus (HBV) overfladeantigen (49n), indeholdt på et 580 b MabHI-Bglll-fragment, og pBR322-derivatet pML (75) er tidligere blevet beskrevet. Mellem EcoRI-stedet efter den tidlige 5 promotor fra SV40 og BamHi-stedet af HBV blev indsat

PvuII-HindlH-fragmentet (kort koordinat r 16.63 - 17.06) fra Adenovirus 2 indeholdende donorsplejsningsstedet af den første sene ledersekvens (position 16.65) umiddelbart efterfulgt af 840 b HindlH-SacI-fragmentet fra 10 Adenovirus 2 (position 7.67 - 9.97) (49j) indeholdende Elb-acceptor-splejsningsstedet ved kortposition 9.83.

Mellem donor- og acceptor-stederne ligger unikke Bg111 og Hindlll-steder til indsætning af genomiske DNA-frag-menter.

15 Figur 7. Analyse af RNA-transcripter fra pESVDA-vektorer.

Konfluente 10 cm plader af COS-7 celler (77) blev trans- ficeret med 2 ug plasmid-DNA under anvendelse af den modificerede DEAE-dextran-metode (84) som beskrevet i (73). RNA blev fremstillet 4 dage efter transfektionen 20 ud fra cytoplasmiske ekstrakter (49n) og underkastet elektroforese i denaturende formaldehyd-agarose-geler.

Efter overførsel til nitrocellulose blev filtrene hy- 32 bridiseret med den passende P-mærkede DNA som beskrevet i "Metoder". Filtrene blev vasket i 2X SSC, 0,2 % SDS 25 ved 42 °C og eksponeret på "Kodak XR5" film. Positionen af de ribosomale 28S- og 18S-RNA'er er angivet ved pile i hvert delbillede.

9.4 kb BamHI-fragmentet afA-114 indeholdende Exon A (se fig. 4) blev klonet ind i Bglll-stedet af pESVDA

30 (fig. 6). Plasmidet pESVDA111.6 indeholdt fragmentet indsat i den orientering, hvor den tidlige SV40-promotor ville transskribere det genomiske fragment i den rigtige (dvs. meningsfulde) retning. pESVDA111.7 indeholder 9.4 kb BamHI-fragmentet i den modsatte orientering.

DK 164876 B

18

Plasmidet pESVDA.5127 indeholder 12,7 kb Sacl-fragmentet afjill4 indsat (ved stump-ende-ligering) i Bglll-stedet af pESV/DA i den samme orientering som pESVDAlll.6.

A. Hybridisering af filtre indeholdende total cytoplas- 5 misk RNA fra celler transficeret med pESVDA, pESVDAlll.7 og pESVDAll.6. pESVD-RNA (bane 1), pESVDAlll.7 (bane 2), pSVDA111.6 (bane 3 - 5). Sonderet med faktor-VIH-exon-A-indeholdende fragment (bane 1-4) eller 1800 b StuI/Bam-fragment (bane 5). Svag kryds-hybridisering 10 ses til 18S-RNA.

B. Hybridisering af RNA med StuI/BamHI-sonde ("intron-sonde"). RNA fra: 1) pESVDA, polyA-; 2) pESVDA, poly A+; 3) pESVDAlll.7, polyA-; 4) pESVDAlll.7, polyA+; 5) pESVDAlll.6, polyA-; 6) pESVDAlll.6, 15 polyA+. De små mørke hybridiserede bånd, som ses i banerne A5, Bl, B3 og B5, repræsenterer sandsynligvis hybridisering til tRNA eller til Ala-gentagelses-sekvens, som findes i dette område.

C. Sammenligning af cytoplasmisk RNA fra pESVDAlll.6 20 (bane 1) og pESVDA.S127 (bane 2) sonderet med exon- A-indeholdende fragment. Bemærk den svage størrelses-forøgelse i bane 2, som repræsenterer yderligere exon-sekvenser indeholdt i det større genomiske fragment.

25 Figur 8. Sekvensen af pESVDA. S127-rcDNA-?klon S36. DNA-se-kvensen af den humane DNA-indsætning er vist for cDNA-klonen S36 opnået ud fra exon-udtrykkelsesplasmidet pESVDA.S127 (se nedenfor m.h.t. detaljer). Lodrette linier markerer exongrænser som bestemt ved analyse 30 af genomiske og cDNA-kloner af faktor VIII, og exons er betegnet ved bogstaver som i fig. 4. Udvalgte restrik-tionsendonucleasesteder er angivet.

DK 164876 B

19

Figur 9. cDNA-kloning. Faktor-VIII-mRNA er afbildet på den tredje linje, hvor den ikke-udfyldte blok repræsenterer området, som koder for det modne protein, det skraverede areal er signalpeptid-kodningsområdet, og 5 de tilsluttede linjer er de utranslaterede områder af mRNA'en. 5'-enden af mRNA'en er til venstre. Over denne linje er vist udstrækningen af exon B området af den genomiske klon på^222, og under mRNA-linjen er repræsenteret de seks cDNA-kloner, ud fra hvilke den fulde længde 10 af faktor-VIII-klonen blev samlet (se teksten m.h.t.

detaljer). cDNA-synteseprimere 1, 3, 4 og oligo (dT) er vist med pile, som viser den synteseretning, for hvilken de startede. Udvalgte restriktionsendonuclease-steder og en størrelsesskala i kilobaser er inkluderet.

15 Figur 10. Sekvens af human faktor-VIII-gen. Den komplette nucleotidsekvens af den sammensatte faktor-VIII-cDNA-klon er vist med nucleotiderne nummereret i den venstre ende af hver linje. Nummer 1 repræsenterer A i translations-startkodonen ATG. Negative tal refererer til 5'-utrans-20 lateret sekvens. (mRNA-kortlægningsforsøg antyder, at faktor-VIII-mRNA strækker sig omkring 60 nucleotider længere 5' end position -109 som vist her). Den forud-Sagte proteinsekvens er vist ovenover DNA'en. Tallene over aminosyrerne er SI - 19 for det forudsagte signal-25 peptid og 1 - 2332 for det forudsagte modne protein.

"OP" angiver den opale translationsstopkodon TAG. 3'-po-lyadenyleringssignalet AATAAA er understreget, og 8 rester af poly(A)-halen (som findes i klon3.cl0.3) er vist. Sekvensen, som er homolog med den syntetiske oli-30 gonucleotidsonde 8,3, er også blevet understreget (nucleotiderne 5557 - 5592). Udvalgte restriktionsendo-nuclease-spaltningssteder er vist over den pågældende sekvens. Nucleotiderne 2671 - 3217 repræsenterer sekvens afledt fra genomiske kloner, medens resten repræ-35 senterer cDNA-sekvens.

DK 164876 B

20

Den komplette DNA-sekvens af proteinkodningsområdet i human-faktor-VIIl-genet blev også bestemt ud fra de genomiske kloner, vi har beskrevet. Kun to nucleotider adskilte sig fra den i denne figur viste sekvens, som 5 er afledt fra cDNA-kloner (undtagen nucleotiderne 2671 - 3217). Nucleotid 3780 (understreget) er C i cDNA-klo..en til forskel fra G i den genomiske klon, hvorved den resulterende aminosyre 1241 bliver Asp i stedet for Glu. Nucleotid 8728 (understreget) i det 31-utranslaterede 10 område er A i den genomiske klon.

figur 11. Samling af fuld-længde rekombinant faktor-VIII-plasmid. Se teksten afsnit 8a med hensyn til detaljer om samlingen af plasmidet pSVEFVIII indeholdende den fulde længde af human-faktor-VIII-DNA. Nummereringen 15 af positionerne adskiller sig fra den i teksten og fig.

10 med 72 b.

Figur 12. Samling af faktor-VIII-udtrykkelsesplasmidet.

Se teksten afsnit 8b med hensyn til detaljer om samlingen af plasmidet pAML3p.8cl, som dirigerer udtryk-20 kelsen af funktionel human faktor VIII i BHK-celler.

Figur 13. Western-afdupningsanalyse af faktor VIII under anvendelse af fusionsprotein-antisera. Human faktor VIII blev adskilt på en 5 - 10 % polyacrylamid-gradient/ SD-gel ifølge proceduren fra (81). En bane af faktor 25 VIII blev farvet med sølv (80). De resterende baner af faktor VIII blev elektroforetisk overført til nitrocellulose med henblik på Western-afdupnings-analyse. Radioaktivt mærkede standarder blev påført i baner op til faktor VIII for at bedømme molekylvægten af de obser-30 verede bånd. Som angivet blev nitrocellulose-strimlerne inkuberet med de passende antisera, vasket og sonderet 125 med I-protein A. Nitrocellulosearkene blev underkastet autoradiografi.

DK 164876 B

21

Figur 14. Analyse af fusionsproteiner under anvendelse af C8-monoklonalt antistof. Fusionsproteinerne 1, 3 og 4 blev analyseret ved Western-afdupningsanalyse for reaktivitet med det faktor-UI11-specifikke monoklonale 3 antistof C8.

Figur 15. Elueringsprofil for højtryks-væske-kromatografi (HPLC) af faktor VIII på en Toya Soda TSK 4000 SU søjle. Søjlen blev ækvilibreret og udviklet ved stuetemperatur med 0,1 % SDS i 0,1 N natriumphosphat, pH 7,0.

10 Figur 16. Elueringsprofil for revers-fase-HPLC-separation af tryptiske faktor-VIII-peptider. Separationen blev gennemført på en Synchropak RP-P C-18 søjle (0,46 cm x 25 cm, lO^um) under anvendelse af en gradienteluering af acetonitril (1 % til 70 % i løbet af 200 minutter) 15 i 0,1 % trifluoreddikesyre. Pilen angiver toppen indeholdende peptidet med sekvensen AWAYFSDUDLEK.

Figur 17. Thrombin-aktivering af renset faktor-UI11-aktivitet. Cellesupernatanten blev chromatograferet på den C8-monoklonale harpiks og dialyseret for at fjer-20 ne elueringspuffer. Thrombin (25 ng) tilsattes ved ti den 0. Aliquoter blev fortyndet ved 1:3 ved de angivne tider og prøvet for koagulerende aktivitet. Enheder pr. ml blev udregnet fra en standardkurve af normalt humant plasma.

25 Detailbeskrivelse A. Definitioner I denne beskrivelse med krav betegner "human faktor Ulli" et funktionelt protein, som er i stand til in vivo eller in vitro at korrigere human-faktor-UIII-defi-30 denser karakteriseret f.eks. ved hæmophilia A. Pro-

DK 164876 B

22 teinet og de dermed forbundne aktiviteter betegnes også som faktor VIIIC (FVIIIC) og faktor-VIII-koaguleringsanti-gen (FVIIICAg)(31a). En sådan faktor VIII produceres af rekombinante cellekultursystemer i aktiv form svarende 5 til faktor-VIII-aktivitet nativ for humant plasma. (1 "enhed" af human-faktor-VIII-aktivitet er blevet defineret som den aktivitet, der findes i 1 ml normalt humant plasma.) Det her producerede faktor-VIII-protein defineres ved hjælp af det bestemte DNA-gen og aminosyresekvensbe-10 stemmelse, ved fysiske egenskaber og ved biologisk akti vitet .

Faktor VIII har flere nedbrydnings- eller forarbejdede former i den naturlige tilstand. Disse afledes proteolytisk fra et enkelt-kæde-forstadieprotein, som påvist i denne 15 beskrivelse. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et sådant enkelt-kæde-protein og angiver også fremstillingen, direkte eller via in vitro forarbejdning af et udgangsmolekyle, af disse forskellige nedbrydningsprodukter og indgivning af disse forskellige nedbryd-20 ningsprodukter, som er blevet påvist også at være aktive.

Sådanne produkter indeholder funktionelt aktive portioner svarende til nativt materiale.

Alleliske variationer eksisterer sandsynligvis. Disse variationer kan påvises ved én eller flere aminosyrefor-25 skelle i den samlede sekvens eller ved deletioner, ud skiftninger, indsætninger eller ombytninger af én eller flere aminosyrer i den samlede sekvens. Desuden kan lokaliseringen og graden af glycosylering afhænge af arten af det værtscellulære miljø. Ligeledes er der 30 ved anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi mulighed for fremstilling af forskellige human-faktor-VIII-deri-vater modificeret på forskellig måde ved resulterende enkelte eller flerdobbelte aminosyredeletioner, -substitutioner, -indsætninger eller -ombytninger, f.eks.

DK 164876 B

23 ved hjælp af stedsrettet mutagenese af den underliggende DNA. Desuden kan fragmenter af human faktor VIII, hvad enten de er fremstillet in vivo eller in vitro, have den krævede nyttige aktivitet, som omtalt ovenfor. Alle 5 sådanne alleliske variationer, glycosylerede versioner, modifikationer og fragmenter, som resulterer i derivater af faktor VIII, er omfattet af denne opfindelse, sålænge de indeholder det funktionelle segment af human faktor VIII og den nødvendige karakteristiske human-faktor-VIII-10 funktionelle aktivitet forbliver upåvirket i art. Sådanne fuktionelle varianter eller modificerede derivater betegnes "human-faktor-VIII-derivater" i denne beskrivelse med krav. De derivater af faktor VIII, som har den krævede funktionelle aktivitet, kan let identificeres ved de 15 heri beskrevne direkte in vitro prøvninger. Ud fra den heri angivne sekvens af human-faktor-VIII-DNA'en og aminosyresekvensen af human faktor VIII kan de fragmenter, som kan afledes via restriktionsenzymskæring af DNA'en eller proteolytisk eller anden nedbrydning af 20 human-faktor-VIU-protein, være nærliggende for fag folk.

Således er human faktor VIII i funktionel form, dvs. "funktionel human faktor VIII", i stand til at katalysere omdannelsen af faktor X til Xa i nærvær af faktor IXa, 25 calcium og phosphorlipid såvel som at korrigere koagule ringsdefekten i plasma fra hæmophilia-A-påvirkede individer og klassificeres yderligere som "funktionel human faktor VIII" baseret på immunologiske egenskaber, som påviser identitét eller væsentlig identitet med faktor 30 VIII fra humant plasma.

"I hovedsagen ren form", anvendt til at beskrive tilstanden af "human faktor VIII" produceret ifølge opfindelsen, betyder i det væsentlige fri for protéin eller andre materialer, som almindeligvis er forbundet med

DK 164876 B

24 faktor VIII, når den er isoleret fra ikke-rekombinante kilder, dvs. fra dens "native" plasmaholdig miljø.

"DHFR-protein" henfører til et protein, som er i stand til at udøve den aktivitet, som forbindes med dihydrofolat-5 reductase (DHFR), og som derfor må kunne produceres af celler, som er i stand til at overleve på medium deficient m.h.t. hypoxanthin, glycin og thymidin (-HGT medium). I almindelighed er celler, som mangler DHFR-pro-tein, ude af stand til at vokse på dette medium, medens 10 celler, som indeholder DHFR-protein, gør det med held.

"Udtrykkelsesvektor" inkluderer vektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-sekvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er operabelt forbundet med andre sekvenser, som er i stand til at frembringe deres udtrykkelse.

15 Disse udtrykkelsesvektorer repliceres i værtcellen, enten v.h.a. et intakt operabelt repliceringsorigin eller ved funktionel integration i cellekromosomet.

Igen gives "udtrykkelsesvektor" en funktionel definition, og enhver DNA-sekvens, som er i stand til at frem-20 bringe udtrykkelse af en specificeret DNA-kode anbragt deri, er inkluderet i denne betegnelse, som den anvendes om den specificerede sekvens. I almindelighed er udtrykkelsesvektorer, som er nyttige ved rekombinant-DNA-teknik, ofte i form af "plasmider", som henfører til 25 cirkulære dobbeltstrengede DNA-løkker. Imidlertid skal opfindelsen inkludere sådanne andre former af udtrykkelsesvektorer, som har ækvivalente funktioner.

"DNA-isolat" betyder DNA-sekvensen omfattende den sekvens, der koder for human faktor VIII, enten i sig selv eller 30 inkorporeret i en kloningsvektor.

"Rekombinant værtscelle" henfører til én eller flere celler, som er blevet transformeret med vektorer kon-

DK 164876 B

25 strueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik.

Som defineret her produceres faktor VIII eller funktionelle segmenter deraf i de mængder, som kan opnås i kraft af denne transformation, fremfor i sådanne mindre 5 mængder og mindre enheder, som kunne produceres af en utransformeret naturlig værtskilde. Faktor VIII produceret af sådanne "rekombinante værtsceller" kan betegnes som "rekombinant human faktor VIII".

Størrelsesenheder for DNA og RNA forkortes ofte som 10 følger: b = base eller basepar; kb = kilobase (tusind baser) eller kilobasepar. For proteiner forkortes: D = dalton; dD = kilodalton.

B. Værtscellekulturer og -vektorer

Nyttig rekombinant human faktor VIII kan ifølge den 15 foreliggende opfindelse produceres i en række forskellige rekombinante værtsceller. Et særligt foretrukket system beskrives i det følgende.

I almindelighed foretrækkes prokaryoter til kloning af DNA-sekvenser ved konstruktion af de vektorer, som 20 anvendes ifølge opfindelsen. For eksempel er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig nyttig. Andre mikroorganismestammer, som kan anvendes, inkluderer E. coli stammer, såsom E. coli B, E. coli X1776 (ATCC nr. 31537), E. coli c600 og c600hfl og E. coli W3110 25 {V~, prototroph, ATCC nr. 27325), baciller, såsom

Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, og forskellige Pseudomonas-arter. Disse eksempler er selvfølgelig kun belysende og ikke begrænsende.

30 I almindelighed anvendes plasmidvektorer indeholdende replikon og styringssekvenser, som er afledt fra arter,

DK 164876 B

26 der er forenelige med værtscellen, i forbindelse med disse værter. Vektoren bærer almindeligvis et repli-ceringssted såvel som markeringssekvenser, som er i stand til at give fænotypisk selektion i transformerede 5 celler. F.eks. transformeres E. coli typisk under an vendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli art (32). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og tilvejebringer således lette midler til identificering og selektion af transformerede 10 celler. Plasmidet pBR322 eller et andet mikrobielt plasmid må også indeholde, eller være modificeret til at indeholde promotorer, som kan anvendes af mikroorganismen til udtrykkelse af dens egne proteiner. Disse promotorer, som mest almindeligt anvendes ved rekombinant-13 DNA-rekonstruktion, inkluderer (3-lactamase-(penicillinase)- og lactose-promotorsystemerne (33 - 35) og et tryptophan-(trp)-promotorsystem (36, 37). Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er der blevet opdaget og udnyttet andre mikrobielle promotorer, og detaljer vedrørende 20 deres nucleotidsekvenser er blevet publiceret, hvilket gør det muligt for en fagmand at ligere dem funktionelt ved plasmidvektorer (3B).

Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer. Saccharomyces cerevisiae 25 eller almindelig bagegær er den mest almindeligt anvendte blandt eukaryotiske mikroorganismer, selv om et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige. Til udtrykkelse i Saccharomyces anvendes f.eks. almindeligvis plasmidet YRp7 (39 - 41). Dette plasmid indeholder allerede trpl-30 genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, der mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (42). Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en karakteristisk egenskab ved gærværtscelle-genomet giver så et effektivt 35 miljø til detektering af transformation ved vækst i

DK 164876 B

27 fravær af tryptophan.

Egnede promoterende sekvenser i gærvektorer inkluderer promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase (43) eller andre glycolytiske enzymer (44, 45), såsom enolase, 3 glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatki-nase, triosephosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Ued konstruktion af egnede udtrykkelses-10 plasmider li geres de afslutningssekvenser, som er for bundet med disse gener, også ind i udtrykkelsesvektoren 3' for den sekvens, som ønskes udtrykt, for at tilvejebringe polyadenylering af mRNA'en og afslutning. Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at trans-13 skriptionen styres af vækstbetingelser, er promotor- områderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen og den førnævnte glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, samt enzymer, der er ansvarlige 20 for maltose- og galactoseudnyttelse. Enhver plasmidvektor indeholdende gærkompatible promotor-, repliceringsorigin-og afslutningssekvenser er egnet.

Anvendelse af kulturer af celler afledt fra flercellede organismer som celleværter foretrækkes, især til udtrykkel-25 se af underliggende DNA til fremstilling af den her omhandlede funktionelle humane faktor VIII, og der henvises især til den her beskrevne foretrukne udførelsesform.

I princippet er hvirveldyrceller af særlig interesse, såsom VERO- og HeLa-celler, kinesisk-hamster-ovarie-30 (CHO)-cellelinjer og W138-, BHK-, C0S-7- og MDCK-celle- linjer. Udtrykkelsesvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et eller flere replice-ringsoriginer, en promotor anbragt foran genet, som skal udtrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribo-

DK 164876 B

28 sombindingssteder, RNA-splejsningssteder, polyadenyle-ringssteder og transskriptionsterminatorsekvenser.

Til anvendelse i pattedyrceller kan styringsfunktionerne på udtrykkelsesvektorerne tilvejebringes af viralt ma-5 teriale. F.eks. afledes almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, abevirus 40 (SV40) og især Adenovirus 2.

Den tidlige og sene promotor fra SV40-virus er anvendelig ligesom den større sene promotor fra adenovirus som beskrevet ovenfor. Yderligere er det også muligt, og 10 ofte ønskeligt, at anvende promotor- eller styresekven ser, som normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat sådanne styresekvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

Et repliceringsorigin kan tilvejebringes enten ved kon-15 struktion af vektoren til at inkludere et exogent origin, som f.eks. afledt fra adenovirus eller anden viral (f.eks. polyoma, SV40, VSV, BPV osv.) kilde, eller kan tilvejebringes af værtscellens kromosomale repliceringsmekanisme, hvis vektoren integreres i værtscellekromosomet.

20 Ved valg af en foretrukken værtscelle til transfection med vektorerne ifølge opfindelsen, som omfatter DNA-se-kvenser, der koder for både faktor VIII og DHFR-protein, er det passende at vælge værten efter den anvendte type DHFR-protein. Hvis der anvendes vildtype-DHFR-protein, 25 foretrækkes det at vælge en værtscelle, som er deficient m.h.t. DHFR, hvilket muliggør anvendelsen af DHFR-kodese-kvensen som markør for heldig transfection i selektivt medium, som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin.

Hvis der på den anden side anvendes DHFR-protein med 30 lav bindingsaffinitet for MTX som styresekvensen, er det nødvendigt at anvende DHFR-resistente celler. Eftersom den mutante DHFR er resistent over for methotrexat,

DK 164876B

29 kan MTX-holdige medier anvendes som selektionsmiddel, forudsat at værtscellerne i sig selv er methotrexat-sensitive. De fleste eukaryotiske celler, som er i stand til at absorbere MTX, viser sig at være methotrexat-5 sensitive.

Alternativt kan et vildtype-DHFR-gen anvendes som forstærkningsmarkør i en værtscelle, som ikke er deficient m.h.t. DHFR, forudsat at der anvendes en anden lægemid-del-selekterbar markør, såsom neomycinresistens.

10 De efterfølgende eksempler beskriver anvendelsen af BHK-celler som værtsceller og udtrykkelsesvektorer, der inkluderer den større sene promotor fra adenovirus.

C. Almene metoder

Hvis der anvendes celler uden formidable cellevægbarrierer 15 som værtsceller, udføres transfection ved calciumphosphat- fældningsmetoden (46). Imidlertid kan der også anvendes andre metoder til indførelse af DNA i celler, såsom kerneinjektion eller protoplastfusion.

Hvis der anvendes prokaryotiske celler eller celler, 20 som indeholder væsentlige cellevægskonstruktioner, er den foretrukne transfeetionsmetode calciumbehandling under anvendelse af calciumchlorid (47).

Konstruktion af egnede vektorer indeholdende de ønskede kode- og styresekvenser sker ved anvendelse af standard-25 ligeringsteknik. Isolerede plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, tilpasses og religeres i den ønskede form til dannelse af de nødvendige plasmider.

Spaltning gennemføres ved behandling med et eller flere restriktionsenzymer i en egnet puffer. I almindelighed

DK 164876 B

30 anvendes omkring 1 ^ig plasmid eller DNA-fragmenter med omkring 1 enhed enzym i omkring 20 ^il pufferopløsning i en time. (Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret af produ-5 centen. Ligeledes angives standardbetingelser fo'r anven- delseaf T4-ligase, T4-polynucleotidkinase og bakteriel alkalisk phosphatase af producenten.) Efter inkubationer fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og nucleinsyren udvindes fra den vandige fraktion 10 ved udfældning med ethanol. Standard-laboratorieproce- durer er til rådighed (48).

Kohæsivt-endede (overhængende) restriktionsenzymfragmenter gøres stump-endede ved f.eks.:

Ifyldningsreparation: 2 - 15^-ug DNA blev incuberet 15 i 50 mM NaCl, 10 mM "Tris" (pH 7,5), 10 mM MgC^» 1 mM dithiothreitol med 250 ^uM af hvert af de fire deoxynu-cleosidtriphosphater og 8 enheder DNa-polymerase-Klenow-fragment ved 24 °C i 30 minutter. Reaktionen blev afsluttet med phenol- og chloroform-ekstraktion og ethanolfæld- 20 ning.

Eller Sl-nedbrydning: 2 - 15^ug DNAblev incuberet i 25 mM NaOAc (pH 4,5), 1 mM ZnCl2> 300 mM NaCl med 600 enheder S^-nuclease ved 37 °C i 30 minutter, efterfulgt af phenol- og chloroform-ekstraktion og ethanol-25 fældning.

Syntetiske DNA-fragmenter blev fremstillet ved kendte phosphotriester- (47a) eller phosphoramidit- (47b) procedurer. DNA'en underkastes elektroforese i agarose- eller polyacrylamid-gelplader ved standardprocedurer (48), 30 og fragmenter blev renset fra gelerne ved elektroeluering (48a). DNA-"Southernn-afdupnings-hybridisering fulgte efter (49a) proceduren.

RNA-"Northern"-afdupningshybridiseringer fulgte efter

DK 164876 B

31 elektroforese i agarose-gelplader indeholdende 6 % formaldehyd (48, 49 b). Radioaktivt mærkede hybridiserings- sonder fremstilles ved tilfældig kalvethymus-DNA-primet 32 syntese (49c) under anvendelse af P-mærkede nucleotid- 32 5 triphosphater med høj specifik aktivitet ( P: Amersham;

Klenow-DNA-polymerase: BRL, NEB eller Boehringer-Mannheim). Korte oligonucleotidsonder kan endemærkes med T4-poly-nucleotidkinase. "Standardsalt"-Southern-hybridiserings-betingelser var tilnærmelsesvis: hybridisering i 5 x SSc 10 (lx SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na^citrat), 50 mM Na-phos-phat pH 7,10 % dextransulfat, 5x Denhardt's opløsning (lx Denhardt's = 0,02 % ficoll, 0,02 % polyvinylpyrro-lidon, 0,02 % okseserumalbumin), 20 - lOO^ug/ml denatureret laksesperm-DNA, 0 - 50 % formamid ved temperaturer 15 i området fra 24 - 42 °C, efterfulgt af vaskninger i 0,2 - lx SSC plus 0,1 % SDS ved temperaturer i området fra 24 - 65 °C. Tørrede filtre blev eksponeret på "Kodak XAR" film under anvendelse af "DuPont Lightning-Plus" intensiveringsskærme ved -80 °C. Se alment (48).

20 Til Northern-afdupnings-screening af celle- og vævs- RNA'er foregik hybridiseringen i 5x SSC, 5x Denhardt's opløsning, 10 % dextransulfat, 50 % formamid, 0,1 %

SDS, 0,1 % natriumpyrophosphat, 0,1 mg/ml E. coli tRNA

32 ved 42 °C natten over med P-mærket sonde fremstillet 25 ud fra 189 b StuI/Hincl-fragmentet af 3- 120 indeholdende exon_A_sekvens. Vaskningsbetingelserne var 0,2x SSC, 0,1 % SDS ved 42 °C.

Human DNA blev fremstillet ud fra perifere blodlymfocyter (46,XY) eller lymfoblastceller (49,XXXXY, N.I.G.M.S.

30 Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.J., USA, nr. GM1202A) (48). E. coli plasmid-DNA blev fremstillet som i (48) og bakteriofag-X-DNA som i (48). Vævs-RNA blev fremstillet ved enten guanidinium thiocyanat-metoden (48, 49f) eller ved metoden fra (49b). Polyadenyleret

DK 164876 B

32 RNA blev isoleret på oligo(dT)-cellulose (49h).

DNA-sekvensanalyse blev gennemført ved metoden fra (49i).

Til 1\./4X-biblioteket blev frem 50 ug aliquoter af 49,XXXXY-DNA'en nedbrudt i et 1 ml volumen med Sau3AI-koncentra-5 tioner på 3,12, 1,56, 0,782, 0,39 og 0,159 enh./ml i 1 timeved 37 °C. Prøvningsnedbrydning og gelanalyse havde vist, at disse betingelser ved 0,782 enh./ml Sau3AI var DNA'ens vægtgennemsnitlige størrelse omkring 30 kb; således frembringer disse nedbrydninger en antals-10 gennemsnitlig fordeling centreret ved 15 kb. DNA fra fem nedbrydninger blev hældt sammen, phenol- og chlo-roform-ekstraheret, ethanolfældet og underkastet elek-troforese på en 6 g/1 horisontal agarosegel med lav geleringstemperatur (48) (Seaplaque agarose, FMC Corporation) 15 i to 5,6 x 0,6 x 0,15 cm strimler. Gelens 12 - 18 kb område blev udskåret, og DNA'en renset ved smeltning af gelskiven som beskrevet i (48).

Charon 30 arme blev fremstillet ved nedbrydning af 50yug af vektoren med BamHl og isolering af det sammensmeltede 20 31,9 armfragment fra en 6 g/1 agarosegel med lav gelerings temperatur som beskrevet ovenfor. Til konstruktion af 3/4X-biblioteket blev den optimale koncentration af Charon 30 BamHI-arme og 12 - 18 kb Sau3A-delvis-49,XXXXY-DNA bestemt som beskrevet i (48). Den ligerede DNA blev 25 indpakket med en in vitro ekstrakt, "packagene" (Promega

Biotec, Inc., Madison, WI, USA). Ved en typisk reaktion blev omkring l,3^ug Charon 30 BamHI-arme ligeret til 0,187yug 12 - 18 kb Sau3A-indsætnings-DNA i et lO^ul volumen. Indpakning af udpladningen af DNA'en gav omkring 30 1,3 x 106 fagplakker. Til frembringelse af /4X-biblioteket blev 1,7 x 10^ fager udpladet med 17000 fager pr. 150 cm plader. Disse plader blev dyrket natten over, skrabet ned i 10 mM "Tris"-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl£,

DK 164876 B

33 0,3 g/1 gelatine og centrifugeret kort for at forstærke fagen. Almindeligvis blev et egnet antal (0,3 - 2 x 10^) af disse fager udpladet og sigtet (48). I nogle tilfælde blev den ligerede og in vitro indpakkede fag screenet 3 direkte uden forstærkning.

Til isolering afA482 blev en klon indeholdende et 22 bp BclI-fragment af faktor-VIII-genomet, BamHI-armfrag-menterne af vektoren.^ 1059 (49) isoleret ved gelelektro-forese. Separat blev lOO^ug DNA fra 49,XXXXY-cellelinjen 10 nedbrudt med Bell, og 20-24 kb fraktionen isoleret ved gelelektroforese. Omkring 0,8yug af ^1059-arm-fragmenterne og 5 % af den isolerede BclI-DNA blev ligeret i et volumen på lO^ul (48) og til frembringelse af 712 000 plakker.

400 000 af disse blev screenet in duplo med 2,2 kb Sutl/- 15 EcoRI-sonde fra!^114.

Cosmid/4X-biblioteket blev frembragt ud fra den 49,XXXXY-DNA, som blev anvendt til at frembringe /4X-biblioteket, undtagen at der blev ofret stor omhu på DNA-isoleringen for at undgå forskydning eller andet brud. DNA'en blev 20 delvis spaltet med fem koncentrationer af Sau3AI, og den sammenhældte DNA størrelsesbestemt på en 100 - 400 g/1 saccharosegradient (49). Fraktionerne indeholdende 35 -45 kb DNA blev sammenhældt, dialyseret og ethanolfældet. Armfragmenter af cosmidvektoren pGcos4 blev fremstillet 25 ifølge de andetsteds beskrevne principper (50). I korthed blev 2 separate, lige store aliquoter af pGcos4 skåret med SstI (en isoschizomer af SacI) eller Sall og derpå behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Disse aliquoter blev derpå phenol- og chloroform-ekstraheret, 30 hældt sammen, ethanolfældet og skåret med BamHI. Fra denne nedbrydning blev 2 armfragmenter på 4394 og 4002 b isoleret fra en agarosegel med lav geleringstemperatur. Disse armfragmenter blev derpå ligeret til den isolerede, med Sau3AI delvis nedbrudte 40 kb DNA. Ved en typisk

DK 164876 B

34 reaktion blev 0,7 jjg pGcos4-armfragmenter ligeret til 1 pg 40 kb human 4X-DNA i et volumen på 10 pi (48).

Denne reaktionsblanding blev derpå indpakket in vitro og anvendt til at inficere E. coli HB101, en recA stam-5 me (48). Denne reaktion frembragte omkring 120 000 kolo nier, når den blev udpladet på tetracyclinholdige plader. Omkring 150 000 cosmider blev screenet på 20 150 mm plader in duplo som beskrevet, med forstærkning natten over på chloramphenicolholdige plader (48). Dobbelt-10 strenget cDNA blev fremstillet som tidligere beskrevet (36, 67) under anvendelse af enten oligo(dT)12-18 eller syntetiske deoxyoligonucleotid 16-mere som primere for førstestrengssyntese ved hjælp af revers transskriptase. Efter isolering ved hjælp af polyacrylamidgeler blev 15 cDNA af den passende størrelse (sædvanligvis 600 b eller større) enten påsat C-hale med terminal transferase, smeltet sammen med G-halet PstI-nedbrudt pBR322 og transformeret ind i E. coli stamme DH1 (76) eller ligeret med et 100 gange molært overskud af syntetiske EcoRI-adap-20 tor-DNA'er, genisoleret på en polyacrylamidgel, indsat ved ligering i EcoRI-nedbrudt "X GT10, indpakket i fagpartikler og formeret på E. coli stamme C600hfl (68). Som en modifikation af eksisterende procedurer blev en adaptor bestående af en komplementær syntetisk DNA 18-mer og 25 22-mer (5'-CCTTGACCGTAAGACATG og 5'AATTCATGTCTTACGGTCAAGG phosphoryleret ved den stumpe ende, men ikke ved den EcoRI-kohæsive ende for at muliggøre effektiv ligering af adaptoren til dobbeltstrenget cDNA uden udstrakt selvligering ved EcoRI-stedet. Dette var en effektiv 30 erstatning for den mere arbejdskrævende procedure med ligering af selvkomplementære EcoRI-linkere til EcoRI-methylase-behandlet dobbeltstrenget cDNA og efterfølgende fjernelse af overskud af linker-oligomere fra cDNA-ender-ne ved EcoRI-nedbrydning. For at forbedre effektiviteten 35 til opnåelse af cDNA-kloner > 3500 b strækkende sig fra poly(A)-sekvensen til de nærmeste eksisterende 3'-faktor-

DK 164876 B

35 VIII-sonde-sekvenser bragt til rådighed ved genomisk kloning (dvs. exon A), blev andenstrengs-cDNA-syntese specifikt primet ved inkludering i reaktionen af en syntetisk DNA 16-mer svarende til en sekvens i exon 5 B på mRNA-meningsstrengen.

D. Adenovirus-subkloninq

Adenovirus-2-DNA blev fremskaffet fra Bethesda Research Laboratories (BRL). Den virale DNA blev spaltet med HindiII og underkastet elektroforese igennem en 5 % 10 polyacrylamidgel (TBE-puffer). Området af gelen indeholdende HindilI-B-fragmentet (49j) blev udskåret, og DNA'en elektroelueret fra gelen. Efter phenol-chloroform-ekstrak-tion blev DNA'en koncentreret ved ethanol fældning og klonet ind i HindiII-spaltet pUC13 (49k) til dannelse 15 af plasmidet pAdHindB. Denne HindiII-subklon blev nedbrudt med Hindlll og Sall, og der blev isoleret et fragment spændende over de adenovirale koordinater 17.1 - 25.9 (49j). Dette fragment blev klonet ind i HindiII,Sall-spal-tet pUC13 til dannelse af plasmidet pUCHS. Fra pAdHindB 20 blev isoleret fragmentet Sall til Xhol, koordinaterne 25.9 - 26.5, og klonet ind i pUCHS ved det unikke Sall-sted til dannelse af pUCHSX. Dette plasmid rekonstruerer de adenovirale sekvenser fra position 17.1 i den første sene leder-mellem-sekvens til Xhol stedet ved position 25 26.5 i det tredje sene leder-exon.

Den overvejende sene adenoviruspromotor blev klonet ved udskæring af Hindlll C-, D- og E-fragmenterne, (som vandrer sammen) fra acrylamidgelen, kloning af dem ind i pUC13 ved Hind 111-stedet og screening for rekombinanter 30 indeholdende Hindlll C-fragmentet ved restriktionsanalyse. Denne subklon blev nedbrudt med SacI, som spaltede ved position 15.4, 5' for den overvejende sene promotor (49j) såvel som i polylinkeren af pUC13. DNA'en blev

DK 164876 B

36 recirkulariseret til dannelse af pMLP2 indeholdende fragmentet SacI til Hindlll (positionerne 13.4 - 17.1) klonet i SacI- og HindiII-stederne i pUC13.

E. Konstruktion af Neomycinresistens-vektor 5 Neomycinresistensmarkøren indeholdt i E. coli transposon 5 blev isoleret fra et Tn5-holdigt plasmid (491). Sekvensen af neomycinresistensgenet er tidligere blevet publiceret (49m). Neo-fragmentet blev nedbrudt med Bglll, som spalter ved et punkt 36 b 5' for translationsstartkodonen af 10 neomycinphosphotransferase-genet, og behandlet med exonu- clease Bal31. Phosphotransferase-genet blev udskåret med BamHI, som spalter DNA'en 342 b efter translationsafslutningskodonen, og indsat i pBR32 mellem et udfyldt Hindlll-sted og BamHI-stedet. En klon, pNeoBal6, havde 15 translationsstartkodonen anbragt 3 b 3' for det udfyldte

HindiII-sted (TCATCGATAAGCTCGCATG...). Dette plasmid blev nedbrudt med Clal og BamHI, hvorpå 1145 b fragmentet spændende over phosphotransferase-genet blev isoleret og indsat i pattedyrudtrykkelsesvektoren pCVSVEHBS (se 20 nedenfor). Det resulterende plasmid, pSVENeoBal6, anbringer neomycinphosphotransferase-genet 3' for den tidlige SU40-promotor og 5' for polyadenyleringsstedet af HBV-overfladeantigen-genet (49n). Når det indføres i pattedyr-vævskulturceller, er dette plasmid i stand til at udtrykke 25 phosphotransferase-genet og overføre resistens over for aminoglucosidet G418 (49o).

F. Transfektion af vævskulturceller BHK-21-cellerne (ATCC) er hvirveldyrceller dyrket i vævskultur. Disse celler kan, som kendt inden for faget, 30 opretholdes som permanente cellelinjer præpareret ved successive overførsler fra isolerede normale celler.

Disse cellelinjer opretholdes enten på en fast bærer

DK 164876 B

37 i flydende medium eller ved vækst i suspensioner indeholdende bærernæringsstoffer.

Cellerne transficeres med 5 pg ønsket vektor (4 ug pAML3P.8cl og lyug pSVEneoBal6) som fremstillet ovenfor 5 under anvendelse af fremgangsmåden fra (49p).

Fremgangsmåden sikrer samvirket af en samling af plasmider med en bestemt værtscelle, hvorved man forøger sandsynligheden for, at hvis ét plasmid absorberes af en celle, vil yderligere plasmider også absorberes (49q). I over-10 ensstemmelse hermed er det praktisk gennemførligt at indføre både de primære og sekundære kodesekvenser under anvendelse af separate vektorer for hver såvel som under anvendelse af en enkelt vektor indeholdende begge sekvenser .

15 G. Vækst af transficerede celler og udtrykkelse af peptider BHK-cellerne, som blev underkastet transfektion som angivet ovenfor blev først dyrket i to dage i ikke-selektivt medium, og derpå blev cellerne overført til medium indeholdende G418 (400yug/ml), hvorved der blev selekteret 20 for celler, som er i stand til at udtrykke plasmid-phospho-transferase. Efter 7-10 dage i nærvær af G418 blev kolonier synlige for det blotte øje. Trypsinisering af de 400 kolonier og genudpladning muliggjorde hurtig vækst af en konfluent 10 cm plade af G418-resistente 25 celler.

Denne cellepopulation består af celler repræsenterende én række forskellige startintegranter. For at opnå celler, som indeholdt det største antal kopier af FVIII-udtrykkel-sesplasmidet, blev cellerne dernæst inkuberet med en 30 inhibitor for DHFR-proteinet.

DK 164876 B

38 H. Behandling med methotrexat

De G418-resistente celler inhiberes af-methotrexat (MTX), en specifik inhibitor for DHFR i koncentrationer på over 50 nM. I overensstemmelse med tidligere undérsø-5 gelser af virkningerne af MTX på vævskulturceller se lekteres for celler, som er resistente for MTX p.g.a. udtrykkelse af de flere kopier DHFR-genet indeholdt i FVIII-udtrykkelsesvektoren, og der kan iagttages en ledsagende forøgelse i udtrykkeisen af sekvenserne, 10 der koder for FVIII. Ved trinvis forøgelse af mængden af MTX fremkaldes forstærkning af plasmidet pAM13P.8cl, hvorved kopitallet forøges. Den øvre grænse for forstærkningen afhænger af mange faktorer, men på denne måde kan der selekteres celler, som er resistente for 15 millimolære koncentrationer af MTX, idet de indeholder hundreder eller tusinder af kopier af DHFR-udtrykkelses-(og således FVIII-udtrykkelses-) plasmidet.

Til faktor-VIII-udtrykkelse blev G418-resistente BHK-celler, som opstod efter transfection med pAML3P.8cl og pSVENeoBal6, 20 inkuberet med medier indeholdende 100 nM og 250 nM MTX som beskrevet (49r). Efter 7-10 dage blev celler, som var resistente for 250 nM MTX, prøvet for faktor-VIII-udtrykkelse ved aktivitets-, radioimmunoprøvnings-og mRNA-Northern-analyse.

25 I. Faktor-VIII-antistoffer

En række forskellige polyklonale og monoklonale antistoffer for faktor VIII blev anvendt under dette arbejde. CC er et polyklonalt antistof afledt fra plasmaet af en alvorligt påvirket bløder (49s). C8 er et neutraliserende 30 monoklonalt antistof, som bindes til 210 kD portionen af faktor VIII (49t). CIO er et monoklonalt antistof med egenskaber, der minder om C8, og som blev isoleret

DK 164876 B

39 i hovedsagen som beskrevet i (49t). Et kommercielt neutraliserende monoklonalt antistof, som bindes til 80 kD portionen af faktor VIII blev fremskaffet fra Synbiotic Corp., San Diego, CA., USA Produkt No. 10004. C7F7 er 3 et neutraliserende monoklonalt antistof, som bindes til 80 kD portionen af faktor VIII. C7F7 blev induceret og renset som følger: 6 uger gamle BALB/c hunmus blev flergangs-indpodet med omkring 10yug renset faktor VIII, og splenocyter sammensmeltet med X63-Ag8.653 musemyoloma-10 celler (49u) tre dage efter den sidste indpodning. Hybridi- seringsproceduren og isoleringen af hybridceller foregik ved kloningsmetoder ifølge tidligere beskrevne forskrifter (49r). Specifikke antistofproducerende kloner blev detekte-ret ved fast-fase-RIA-procedurer (49w). Positive kloner 13 blev derefter prøvet for koaguleringsforlængelseskapaci tet ved den ovenfor beskrevne APTT-prøvning. Monoklonalt C7F7 blev ekspanderet ved vækst i syngeniske dyr; antistof /S\ blev renset fra ascites-væsker ved protein A/"Sepharose'iy CL-4B"-chromatografi (49x).

20 J. Radioimmunprøvninqer for faktor VIII

To radioimmunprøvninger (RIA) blev udviklet til prøvning for faktor VIII produceret ud fra BHK- og andre cellelinjer. Begge er to-trins prøvninger, hvorved CC-antistoffet bundet til en fast bærer anvendes til at binde faktor 25 VIII (49t). Dette immunkomplex detekteres derpå med 125I-mærket C10-antistof (210 kD specifikt) eller 125I-mærket C7F7~antistof (80 kD specifikt).

Kort fortalt gennemføres to-trins RIA'erne som følger: de 96 huller i en mikrotiterplade overtrækkes natten 30 over med 100yul 50 mM NaHCO^-puffer, pH 9,6 indeholdende 2,5 mg/1 CC-antistof, som er blevet renset ved protein A/"Sepharose"®-chromatografi (49x). Hullerne vaskes tre gange med 200yul PBS indeholdende 0,05 % "Tween® 20"

DK 164876 B

40 og blokeres med 200 pi PBS indeholdende 0,1 % gelatine og 0,01 % merthiolat i 1-2 timer. Hullerne vaskes som før, og der tilsættes 100 pil prøve og inkuberes natten 125 over. Hullerne vaskes, og der tilsættes 100 pil I-mær-5 ket (82) CIO- eller C7F7-antistof (1000 tællinger pr.

min/ yul) og inkuberes i 6 - 8 timer. Hullerne vaskes igen og tælles. Standardkurven afledes fra prøver af normalt plasma fortyndet 1:10 til 1:320.

K. Sø.jle med monoklonalt faktor-VIII-antistof 10 En søjle med monoklonalt antistof over for humant faktor VIII blev fremstillet ved inkubation af 1,0 mg C8-anti-stof (i 0,1 M NaHC03, pH 8,5) med 1,0 ml "Affi-Gel 10" (Bio-Rad laboratories, Richmond, CA, USA) i fire timer ved 4 °C. Mere end 95 % af antistoffet blev koblet til 15 gelen, bestemt ved "Bio-Rad" proteinprøvningen (Bio-Rad

Laboratories). Gelen blev vasket med 50 volumener vand og 10 voluméner 0,05 N imidazol, pH 6,9, indeholdende 0,15 M NaCl.

L. Chromatoqrafi af medier på monoklonal søjle 20 Medier blev påført den monoklonale antistofsøjle (1 ml harpiks) og vasket med 0,05 M imidazolpuffer, pH 6,4, indeholdende 0,15 M NaCl, ind til materiale absorberende ved 280 nm var vasket af. Søjlen blev elueret med 0,05 M imidazol, pH 6,4, indeholdende 1,0 M Kl og 25 20 % ethylenglycol. Prøver blev fortyndet til prøvning og dialyseret til efterfølgende analyse.

M. Fremstilling af faktor-VIII-fusionsproteiner og fusions-protein-antisera E. coli indeholdende plasmiderne konstrueret til fusions-proteinudtrykkelse blev dyrket i M-9 medier ved 37 °C.

DK 164876 B

41

Fusionsproteinudtrykkelse blev induceret ved tilsætning af indolacrylsyre til en slutkoncentration på 50 yl/ml i et tidsrum på 2,5 - 4 timer. Cellerne blev høstet ved centrifugering og frosset indtil brugen.

5 Cellepillerne for fusion 3 blev suspenderet i 100 ml 20 mM natriumphosphat, pH 7,2, indeholdende 10 ^ug/ml lysozym og l^ug/ml hver af RNase og DNase. Suspensionen blev omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur for fuldstændigt at dispergere cellepillen. Suspensionen blev derpå 10 ultralysbehandlet i 4 minutter (pulseret ved 60 % styrke).

Opløsningen blev centrifugeret ved 8000 omdr./min i en Sorvall RC-2B centrifuge i en GSA rotor. Pillen blev resuspenderet i 100 ml 0,02 M natriumphosphat, pH 7,2. Suspensionen blev overlejret over 300 ml 60 % glycerol.

15 Prøven blev centrifugeret ved 4000 omdr./min i 20 minutter i en RC-3B centrifuge. Der opstod to lag i glycerolet.

Både pille- og bund-glycerollaget viste et enkelt protein-bånd med den forventede molekylvægt på 25 000 dalton når det blev analyseret på SDS-polyacrylamid-geler.

20 Pillen blev opløst i 0,02 M natriumphosphatpuffer indeholdende 0,1 % SDS. Den resuspenderede pille og det nedre glycerollag blev dialyseret over for 0,02 M ammoniumhydro-gencarbonat, pH 8,0, for at fjerne glycerol. Opløsningen blev lyophiliseret og genopløst i 0,01 M natriumphosphat-25 puffer indeholdende 0,1 SDS og frosset indtil brugen.

Cellepillerne for fusionsproteinerne 1 og 4 blev suspenderet i 0,05 M "Tris", pH 7,2, indeholdende 0,3 M natrium-chlorid og 5 mM EDTA. Der tilsattes lysozym til en koncentration på 10yug/ml. Prøver blev inkuberet i 5 minutter 30 ved stuetemperatur. Der tilsattes NP-40 til 0,2 %, og suspensionen blev inkuberet i is i 30 minutter. Der tilsattes natriumchlorid til en slutkoncentration på 3 M og DNase (l^ug/ml). Suspensionen blev inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur. Prøven blev centrifugeret,

DK 164876 B

42 og supernatanten smidt væk. Pillen blev resuspenderet i et volumen vand og recentrifugeret. Cellepillerne blev opløst i opløsninger indeholdende 0,1 % til 1 % SDS og renset ved enten præparativ SDS-polyacrylamid-gel-5 elektroforese efterfulgt af elektroeluering af fusionspro teinbåndet eller ved HPLC på en TSK 3000 søjle ækvili-breret med 0,1 M natriumphosphat indeholdende 0,1 % SDS.

Kaninantisera blev fremstillet ved injektion af vilde 10 New Zealand kaniner med en prøve af fusionsprotein suspenderet i Freund's complete adjuvant (første injektion) efterfulgt af forstærkninger med to ugers intervaller under anvendelse af prøven suspenderet i Freund's incomplete adjuvant. Efter seks uger blev der opnået sera, som 15 blev analyseret ved Western-afdupnings-analyse for reakti vitet med faktor-VIIl-proteiner afledt fra humant plasma.

N. Prøvninger til detektion af udtrykkelse af faktor-VUl-aktivitet

Korrektion af haemophilia A plasma 20 Teori: Faktor-VIII-aktivitet defineres som den aktivitet, der vil korrigere koaguleringsdefekten hos faktor-VIII-de-ficient plasma. En enhed af faktor-VIII-aktivitet er blevet defineret som den aktivitet, der er til stede i 1 ml normalt humant plasma. Prøvningen er baseret 25 på iagttagelse af den tid, der kræves til dannelse af en synlig fibrinklump i plasma afledt fra en patient, der er diagnostiseret som lidende af hæmophilia A (klassisk hæmophilia). Jo kortere den tid er, som kræves til klumpdannelse ved denne prøvning, jo større er faktor-VIII-akti-30 viten i den undersøgte prøve. Denne type prøvning betegnes som aktiveret-delvis-thromboplastin-tid (APTT). Kommercielle reagenser er til rådighed for sådanne bestemmelser

DK 164876 B

43 (f.eks. General Diagnostics Platelin Plus Activator; produkt nr. 35503).

Procedure; Alle koaguleringsprøvninger blev gennemført i 10 x 75 mm borsilicat-reagensglas. Siliconering blev 5 gennemført under anvendelse af "SurfaSil" (produkt fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA), som var blevet fortyndet 1:10 med petroleumsether. Reagensglassene blev fyldt med denne opløsning, inkuberet i 15 sekunder, og opløsningen fjernet. Glassene blev vasket 10 tre gange med vandværksvand og tre gange med destilleret vand.

"Platelin Plus Activator" (General Diagnostics, Morris Plains, NJ, USA) blev opløst i 2,5 ml destilleret vand ifølge anvisningerne på pakningen. Til præparation af 15 prøven til koaguleringsprøvninger blev "Platelin Plus

Activator"-opløsningen inkuberet ved 37 °C i 10 minutter og opbevaret på is indtil brugen. Til et siliconeret reagensglas sattes 50^ul "Platelin Plus Activator" og 50yul faktor- VIII-deficent plasma (George King Biomedical 20 Inc, Overland Park, KA, USA). Denne opløsning blev inkuberet ved 37 °C i ialt 9 minutter. Lige før afslutningen af 9 minutters inkubering af den ovenstående opløsning blev prøven, som skulle afprøves, fortyndet i 0,05 M "Tris"-HCl, pH 7,3, indeholdende 0,02 % okseserumalbumin.

25 Til plasma/ aktivator-suspensionen sattes 50^υ1 af den fortyndede prøve, og nøjagtigt 9 minutter inde i inkubationen af suspensionen blev koaguleringskaskaden startet ved tilsætning af 50^ul calciumchlorid (0,033 M). Reaktionsblandingen blev hurtigt blandet, og under forsigtig 30 omrøring af reagensglasset blev den tid, som kræves til dannelse af en synlig fibrinklump, kontrolleret.

En standardkurve for faktor-VIII-aktivitet kan opnås ved fortynding af normalt plasma (George King Biomedical, Inc., Overland Park, KA, USA) 1:10, 1:20, 1:50, 1:100

DK 164876 B

44 og 1:200. Koaguleringstiden afsættes over for plasmafortyndingen på semilog kurvepapir. Dette kan derpå anvendes til at omsætte en koaguleringstid til enheder af faktor-VIII- aktivitet.

5 0. Chromoqen peptidbestemmelse

Teori: Faktor VIII fungerer ved aktiveringen af faktor X til faktor Xa i nærvær af faktor IXa, phosphorlipid og calciumioner. Der er blevet udformet en højspecifik prøvning, hvorved faktor IXa, faktor X, phospholipid 10 og calciumioner tilføres. Frembringelsen af faktor Xa ved denne prøvning afhænger derfor af tilsætningen af en kilde for faktor VIII-aktivitet. Jo mere faktor VIII der sættes til prøvningen, jo mere faktor Xa frembringes. Efter at faktor Xa har fået lov at dannes, sættes et 15 chromogent peptidsubstrat til reaktionsblandingen. Dette peptid spaltes specifikt af faktor Xa, påvirkes ikke af faktor X og spaltes kun langsomt af andre proteaser. Spaltning af peptidsubstratet frigør en para-nitroanilid-gruppe, som har absorbans ved 405 nm, medens det uspaltede 20 peptidsubstrat kun har ringe eller ingen absorbans ved denne bølgelængde. Frembringelsen af absorbans p.g.a. spaltningen af det chromogene substrat afhænger af mængden af faktor Xa i prøveblandingen efter inkubationsperioden, hvilken mængde igen afhænger af mængden af funktionel 25 faktor VIII i prøven, som er sat til reaktionsblandingen.

Denne prøvning er yderst specifik for faktor-VIII-aktivitet og skulle være mindre udsat for potientielle falske positiver sammenlignet med faktor-VIII-deficient-plasma-prøvningen.

30 Procedure: Faktor VIII til samtidig prøvning blev fremskaf fet fra Helena Laboratories, Beaumont, TX, USA (Cat.

No. 5293). Den grundlæggende procedure, som blev anvendt, var i hovedsagen den, som er angivet af producenten

DK 164876B

45 for "endepunktmetoden" for prøver indeholdende mindre end 5 % faktor VIII. Hvor det er anført, blev inkubationstiderne forlænget for at gøre prøvningen mere sensitiv.

Til visse prøvninger blev de af producenten anbefalede 5 reagensvolumener ændret. Denne ændring i forskriften berører ikke de samlede resultater af prøvningen.

Det chromogene substrat (S-2222 + 1-2581) for faktor Xa blev opløst i 10 ml vand, hvilket resulterede i en substratkoncentration på 2,7 millimol pr. liter. Denne 10 substratopløsning blev aliquoteret og opbevaret frosset ved -20 °C. FIXa + FX reagenset indeholdt faktor IXa og faktor X og blev opløst i 10 ml vand. Opløsningen blev aliquoteret og opbevaret frosset ved -70 °C indtil brugen. Med sættet blev også leveret de følgende opløsning-15 er: 0,025 molær calciumchlorid; phospholipid (svine- hjerne); og puffer-lageropløsning (fortyndes 1 del lager-opløsning til 9 dele vand til prøvningen, vil dette resultere i en slutkoncentration på 0,05 M "Tris"-HCl, pH 7,3, indeholdende 0,02 % oksealbumin). Disse opløs-20 ninger blev opbevaret ved 4 °C indtil brugen.

Phospholipid + FIXa + FX reagenset fremstilles ved blanding af et volumen phospholipid med fem volumener FIXa + FX reagens.

Der anvendtes følgende procedurer: 25 _Reagens_ Prøveglas Blindprøve

Phospholipid + FIXa + FX 200yUl 200^ul

Prøve 100

Puffer-arbejdsopløsning -- 100

Blandes godt og inkuberes ved 37 °C i 4 minutter 30 Calciumchlorid 100 100

DK 164876 B

46

Blandes godt og inkuberes ved 37 °C i nøjagtigt 10 minutter S-2222 + 1-2581 200 200

Blandes godt og inkuberes ved 37 °C i nøjagtigt 10 minutter Eddikesyre (50 %) 100 100 5 Blandes godt

Prøvens absorbans ved 405 nm blev bestemt over for blindprøven i et spektrofotometer inden for 30 minutter.

Absorbansen ved 405 nm blev sat i forhold til faktor-VIII-enheder ved kalibrering af prøven under anvendelse 10 af normal human plasmastandard (George King Biomedical, Overland Park, KS, USA).

Eksempel på foretrukken udførelsesform 1. Almen strategi til opnåelse af faktor-VIII-qenet

Den mest almindelige fremgangsmåde til opnåelse af et 15 rekombinant-DNA-gen-produkt er at screene biblioteker af cDNA-kloner opnået ud fra mRNA fra det pågældende væv eller celletype. Flere faktorer medvirkede til anvendelse også af en alternativ fremgangsmåde til screening af genomisk DNA for faktor-VIII-genet. For det første 20 var stedet for syntese af faktor VIII ukendt. Selv om leveren ofte anses for den mest sandsynlige syntesekilde, er påvisningen deraf tvivlsom. Syntese i lever og eventuelt milt er blevet antydet ved organfusions- og transplantations-undersøgelser (56). Imidlertid forøges faktor-VIII-aktivi-25 teten ofte hos patienter med alvorligt leversvigt (56a). Nylige modstridende undersøgelser under anvendelse af monoklonal-antistof-binding til celler detekterer de højeste niveauer af proteinet i sinusoidale leverendothelial-celler (51), hepatocytceller (52) eller lymfeknudeceller

DK 164876 B

47 (efterfulgt i mængde af lunge, lever og milt) (53).

I modsætning hertil syntetiseres det faktor-VIII-beslæg-tede antigen (von Willebrand faktor) næsten sikkert af endothelialceller (54). Ikke blot er vævskilden usik-5 ker, mængden af faktor VIII i plasma er også yderst lav. Den cirkulerende koncentration på omkring 100 -200 ng/ml (55) er f.eks. omkring 1/2 000 000 af den molære koncentration af serumalbumin. Således var det ikke klart, at cDNA-biblioteker fremstillet ud fra RNA 10 fra et givet væv ville give faktor-VIII-kloner.

Baseret på disse overvejelser blev det besluttet først at screene rekombinante biblioteker af det humane genom i bakteriofag ^ (i det følgende betegnet som genomiske biblioteker). Selv om genomiske biblioteker skulle indeholde 15 faktor-V111-genet, kunne den sandsynlige tilstedeværelse af introns frembyde forhindringer for den endelige udtryk-kelse af det rekombinante protein. Den almindelige strategi var: 1. at identificere en genomisk klon svarende til 20 en sekvensbestemt portion af det humane faktor-VIII-protein; 2. at gennemføre en "genomisk vandring" for at opnå overlappende genomiske kloner, som ville inkludere hele mRNA-kodeområdet; 3. at anvende fragmenter af de genomiske kloner til 25 ved hybridisering til RNA-afdupninger at identificere vævs- eller cellekilder for faktor-VIII-mRNA og derpå gå videre til opnåelse af cDNA-kloner fra sådanne celler; 4. parallelt med nr. 3 at udtrykke portioner af genomiske kloner i rekombinante SV40-"exonudtrykkelses"- 30 plasmider (RNA transskriberet fra disse plasmider efter transfection af vævskultur-(cos)-celler skulle splejses in vivo og ville være en alternativ kilde til cDNA-kloner, som er egnede til udtrykkelse af rekombinant faktor-VIII-protein) .

DK 164876 B

48

Den faktiske fremadskriden af denne procedure involverede et samspil af information afledt fra cDNA-kloner, geno-miske kloner af flere typer og rekombinante SV40-"exon-udtrykkelses"-kloner, som nødvendigvis er beskrevet 5 separat nedenfor.

2. Procedure for screening af qenomisk bibliotek

Faktor-VIII-genet vides at ligge på det humane X-kromosom (56). For at forøge mængden af positive kloner blev der konstrueret genomiske biblioteker ud fra DNA opnået 10 fra et individ indeholdende 4X-kromosomer. (Lymfoblastcel- lelinjen er karyotypebestemt 49,XXXXY; biblioteker konstrueret ud fra denne DNA betegnes heri som ”4X-biblio-teker"). 49,XXXXY-DNA blev delvis nedbrudt med Sau3AI og passende størrelsesfraktioner blev ligeret ind i 15 ^fag- eller cosmidvektorer. Detaljer m.h.t. konstruktionen af disse^/4X- og cosmid/4X-biblioteker er anført nedenfor. Den forventede frekvens af faktor-VIII-genet i P./4X-biblio-teket er omkring én blandt 110 000 kloner og i cosmid-biblioteket omkring én blandt 40 000.

20 Disse biblioteker blev screenet for faktor-VIII-genet med syntetiske oligonucleotidsonder baseret på portioner af faktor-VIII-proteinsekvensen. Disse oligonucleotidsonder falder i to typer, en enkelt sekvens på 30 - 100 nucleotid-er baseret på codonvalgsanalyse (lange sonder) og en 25 pulje af sonder med en længde på 14 - 20 nucleotider, som specificerer alle mulige degenerationskombinationer for hvert codonvalg (korte sonder).

Hovedfordelen ved lange sonder er, at de kan syntetiseres på basis af enhver 10 - 30 aminosyresekvens i proteinet.

30 Der behøver ikke at findes specielle områder med lav codonredundans. En anden fordel er, at eftersom en nøjagtig pasning med gensekvensen ikke er nødvendig (der kræves

DK 164876 B

49 kun strækninger af komplementaritet på 10 - 14 nucleoti-der), ville afbrydelse af komplementaritet p.g.a. tilste-værelsen af en intron eller forårsaget af genpolymorfi eller proteinsekvensbestemmelsesfejl ikke nødvendigvis 5 forhindre nyttig hybridisering. Ulempen ved lange sonder er, at der kun er valgt én codon for hver aminosyre.

Vi har baseret vort valg af codoner på en tabel over pattedyrcodonfrekvens (57), og når denne ikke gav noget klart fortrin, på codonanvendeisen i faktor-IX-genet 10 (58). Eftersom den forventede sekvensoverensstemmelse af de lange sonder er ukendt, må hybridiseringsstringensen bestemmes empirisk for hver sonde. Dette blev gennemført ved hybridisering til genomisk-DNA-afdupninger og udvaskninger ved forskellige stringenser.

15 Fordelen ved korte sonder er, at hver mulig codon syntetiseres som en pulje af oligonucleotider. Hvis således aminosyresekvensen er korrekt, skulle en kort sonde altid hybridisere til det interessante gen. Hovedbegrænsningen er kompleksiteten af den pulje af sekvenser, 20 som kan syntetiseres. Operationelt kan en pulje på 32 forskellige sekvenser betragtes som en maksimal puljestørrelse ud fra signal/støj-begrænsningerne for hybridisering til genomiske biblioteker. Dette betyder, at kun proteinsekvenser i områder med lav codonredundans 25 kan anvendes. En typisk sonde ville være en pulje på 16 17-mere, som specificerer alle mulige sekvenser over et 6-aminosyre-fragment af proteinsekvensen.

Som med lange sonder måtte den anvendte hybridiseringsstrin-gens for korte sonder bestemmes empirisk. Dette skyldes 30 at hybridernes stabilitet under almindeligt anvendte hybridiseringsbetingelser (6xSSC) afhænger af de to faktorer: længden og G-C-indholdet; stringente betingelser for sonderne med lavt G-C-indhold er slet ikke stringente for dem med højt G-C-indhold. En typisk pulje på 16 17-mere kunne have et område på 41 - 65 % G-C, og disse

DK 164876 B

50 sonder vil smelte i 6xSSC over et 10 °C temperaturområde (fra 48 til 58 °C). Da den korrekte sekvens inden for puljen på 16 ikke er kendt på forhånd, anvender man en hybrid-iseringsstringens lige under 48 °C for at tillade 5 hybridisering af sekvensen med lavest G-C-indhold. Imid lertid vil dette, når man screener et stort antal kloner, give mange falske positive med kortere længde og højere G-C-indhold. Da ændringen i smeltetemperatur er 1 - 2 °C pr. baseparpasning, vil sondesekvenser så korte som 10 12 eller 13 af de 17 også binde, hvis de har et højt G-C-indhold. Tilfældigt i det humane genom vil en sondepulje på 16 17-mere hybridisere med 1200 gange så mange 13-base-sekvenser som 17-base-sekvenser.

Der blev udviklet en hybridiseringsteknik for korte 15 sonder, som udligner stabiliteten af G-C- og A-T-basepar og i stort omfang forhøjer anvendeligheden af korte sonder til at screene biblioteker med høj DNA-sekvens-kom-pleksitet.

I fig. 2A er afsat smeltetemperaturen for 4 korte sonder 20 under almindelige (6xSSC) og 3,0 M TMACl-udvasknings- betingelser. I 3,0 M TMAC1 smelter sonderne som en næsten lineær funktion af længden, medens smeltningen i 6xSSC i høj grad influeres af G-C-indholdet. Den høje smeltetemperatur i 6xSSC af den 13-mere, som har 65 % G-C-indhold, viser dette klart. Fig. 2B viser smeltetemperaturen 25 i 3,0 M TMAC1 som en funktion af· længden for 11 til tusinder af baser. Denne figur muliggør et hurtigt valg af hybridiseringsbetingelser for en sonde med en nøjagtig overensstemmelse af enhver ønsket længde.

TMACl-hybridiseringsproceduren har stor anvendelighed 30 når som helst der ønskes en nøjagtig sekvenspasning af en eller anden kendt længde. Eksempler på denne teknik

DK 164876 B

51 inkluderer: 1. Screening af et humant genomisk bibliotek med en pulje af 16 17-mere. Vi har anvendt en 3,0 M TMACl-vaskning ved 50 °C, som tillader hybridisering af kun 17-, 16- og nogle 15-base-sekvenser. Det store 5 antal sonder med højt G-C-indhold og lavere homologi udelukkes således. 2. Hvis en screening med kort sonde giver for mange positive til at sekvensbestemmes let, kan de mest sandsynlige kandidater findes ved en TMAC1-smeltningsprocedure. Replica af de positive hybridiseres 10 og vaskes ved 2 °C intervaller (for 17-mere, som smelter ved 54 °C, ville man anvende 46, 48, 50, 52, 54 og 56 °C).

De positive, som smelter ved den højeste temperatur, vil passe nærmest med sonden. Med en standard af kendt sekvens kan homologien forudsiges - 1 base eller bedre 15 for en 17-mer. 3. På lignende måde kan der, hvis en screening med lang sonde giver for mange positive, syntetiseres en pulje af korte sonder baseret på den samme proteinsekvens. Da et medlem af denne pulje ville indeholde en perfekt pasning, kunne TMACl-smeltningsforsøg forfine 20 valget af den bedste kandidat blandt de positive. 4.

Ved stedsdirigeret mutagenese syntetiseres et oligonucleo-tid med en længde på typisk 20 baser med en eller flere ændringer i centret. TMACl-vaskningsproceduren kan let skelne udgangs- og mutantderivaterne, selv for en fejl-25 pas.ning på 1 base i midten af en 20-mer. Dette skyldes, at den ønskede mutation passer nøjagtigt til sonden. Udvaskningsbetingelserne kan simpelthen bestemmes ud fra fig. 2B. 5. Valg af et bestemt gen ud af en familie af nært beslægtede gener. Et smeltningsforsøg af samme 30 slags som det, der er beskrevet ovenfor, er blevet anvendt til at vælge et bestemt gen ud af en samling på 100 meget ens sekvenser.

3. Første isolering af den qenomiske faktor-V111-kIon Faktor-VIII-berigede præparater blev fremstillet ud DK 164876 B ' ,1 52 humant kryopræcipitat ved polyelektrolyt-chromatografi og immunoadsorption som tidligere beskrevet (79). Dette materiale blev dialyseret i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) og 1 λ ammoniumhydrogencarbonat, lyophiliseret 5 og opbevaret ved -20 °C indtil brugen.

På grund af forurening af faktor-VIII-præparaterne med andre plasmaproteiner krævedes yderligere fraktionering for at rense faktor VIII såvel som adskille de forskellige polypeptidksder, som antages at opstå af faktor VIII.

10 Dette blev gennemført ved chromatografi af proteinet på "Toya Soda TSK 4000 SI?J"-sø jler under anvendelse af højtryks-væske-chromatografi i nærvær af SDS. En sådan chromatografi adskiller proteinerne efter molekylstørrelse.

Det lyophiliserede protein blev rekonstitueret i destille-15 ret vand og gjort 1 % SDS og 0,1 M natriumphosphat, pH 7,5. TSK-søjlen (0,75 x 50 cm; Alltech, Deerfield, IL, USA) blev ækvilibreret ved stuetemperatur med 0,1 % SDS i 0,1 M natriumphosphat, pH 7,0. Prøver på omkring 0,15 - 0,2 ml blev injiceret, og søjlen udviklet isokratisk 20 ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min. Absorbansen blev kontrolleret ved 280 nm, og der blev opsamlet fraktioner på 0,2 ml. En repræsentativ elueringsprofil er vist i fig. 15. Aliquoter blev analyseret ved SDS-gel-elektro-forese på gradientgeler af 5 % til 10 % polyacrylamid 25 og analyseret ved sølvfarvning (80). Materialet, som elueredes efter 25 minutter svarede til en duplet af proteiner ved 80 000 og 78 000 D. Fraktionerne indeholdende disse proteiner blev hældt sammen som angivet ved pinden i fig. 15, fra tre separate præparative TSK-forløb, 30 og opbevaret ved -20 °C indtil brugen.

Det rensede 80 000 D protein fra TSK-fraktioneringen (0,8 nmol) blev dialyseret natten over over for 8 M

DK 164876 B

53 urinstof, 0,36 M "Tris"-HCl, pH 8,6, og 3,3 mM ethylendia-mintetraeddikesyre under en nitrogenatroosfære. Disulfid-bindinger blev reduceret ved inkludering af 10 mM dithio-threitol i den ovenstående dialysepuffer. Det endelige 5 volumen var 1,5 ml. Cysteinresterne blev alkyleret med 15^ul 5 M iodeddikesyre (opløst i 1 M NaoH). Reaktionen fik lov at foregå i 35 minutter ved stuetemperatur i mørke, og alkyleringsreaktionen blev udslukt ved tilsætning af ditriothreitol til en slutkoncentriation på 100 mM.

10 Proteinopløsningen blev dialyseret over for 8 M urinstof i 0,1 M ammoniumhydrogencarbonat i 4 timer. Dialyseopløsningen blev ændret til gradvist at fortynde urinstofkoncentrationen (8 M, 4 M, 2 Μ, 1 M og endelig 0,5 M urinstof) i løbet af 24 timer. Tryptisk nedbrydning blev gennemført 15 på det reducerede alkylerede 80 000 dalton protein ved tilsætning af TPCK-behandlet trypsin (Sigma Chem. Co.) ved et vægtforhold på 1 del trypsin til 30 dele faktor-VIII-protein. Nedbrydningen fik lov at fortsætte i 12 timer ved 37 °C. Reaktionsblandingen blev frosset indtil brugen.

20 HPLC-separation af de tryptiske peptider blev gennemført på en højopløsnings "Synchropak RP-P C-18"-søjle (0,46 x 25 cm, lOyum) ved stuetemperatur med en Spektra-Physics 8000 chromatograf. Der blev injiceret prøver på omkring 0,8 ml, og søjlen blev udviklet med en gradient af acetoni-25 tril (1 % til 70 % i løbet af 200 minutter) i 0,1 % tri fluoreddikesyre. Absorbansen blev kontrolleret ved 210 nm og 280 nm (figur 16). Hver top blev opsamlet og opbevaret ved 4 °C, indtil den blev underkastet sekvensanalyse i en "Beckman spinning cup sequencer" med 30 on-line PTH-aminosyre-identifikation. Pilen i fig. 16, eluerende ved omkring 23 % acetonitril, viser toppen indeholdende peptidet med sekvensen AWAYFSDVDLEK. Denne sekvens blev anvendt til at skabe oligonucleotidsonden 8.3 til screening af humant genomisk bibliotek.

Lange og korte sonder blev syntetiseret på basis af

DK 164876 B

54 de netop anførte overvejelser. Den anden anvendte lange sonde var baseret på sekvensen af et tryptisk faktor-VIII-fragment på de 12 aminosyrer, AWAYFSDVDLEK. DNA-sekvensen, som blev valgt til syntese af sonden, var 5 5'-CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC. Denne sonde (kaldt 8.3) blev først prøvet ved genomiske afdupnings-hybridiseringer. Figur 3A viser genomiske Southern-af-dupninger af normal mandlig (IX) og 49,XXXXY (4X) DNA hybridiseret med mærket 8.3 sonde og vasket med forskel-10 lige stringenser. Selv ved den højeste stringens (lxSSC, 46 °C) blev der iagttaget et enkelt bånd på 3,8 kb (EcoRI) og 9,4 kb (BamHI). Intensiteten af dette bånd havde et forhold på omkring 1:4 i IX- og 4X-banerne, som det ville forventes for det X-tilknyttede faktor-VIII-gen.

13 Kontrolforsøg har vist, at en kendt X-tilknyttet gensonde (faktor IX) gav det forventede 1:4 hybridiseringsforhold, medens et autosomalt gen (albumin) gav et 1:1 forhold.

Baseret på disse genomiske afdupningsresultater blev 8.3-sonden anvendt til at screene 3-/4X-biblioteket.

20 500 000 fager blev dyrket på halvtreds 150 mm plader, og dobbelte sæt nitrocellulosefiltre blev hybridiseret 32 med P-mærket 8.3-sonde ved en udvaskningsstringens på lxSSC, 37 °C (figur 3). Ved gentagen prøvning blev der opnået 15 stærkt hybridiserende og 15 svagere hybri-25 diserende kloner. DNA blev fremstillet ud fra disse isolerede plakker, spaltet med restriktionsendonucleaser og afdupnings- hybridiseret med sonde 8.3. Mange af de stærkt hybridiserende kloner gav et hybridiserende EcoRI-fragment på 3,8 kb, den samme størrelse, som blev 30 detekteret ved den genomiske afdupning. Desuden udviste alle stærkt hybridiserende kloner et identisk 262 b Sau3AI-fragment efter hybridisering med 8.3-sonden.

Sau3AI-fragmenterne blev klonet ind i den enkeltstrengede fag-vektor M13mp8 (86), screenet ved hybridisering og 35 sekvensbestemt ved dideoxy-proceduren. DNA-sekvensen

DK 164876 B

55 af 262 b fragmentet viste betydelig homologi med 8.3-sonden. Homologien inkluderede områder af kontinuerte pasninger på 14 og 10 b med en samlet homologi på 83 %. De første 10 rester af peptidfragmentet stemte overens 5 med det, der blev udledt fra DNA-sekvensen af de rekom-binante kloner, og foran dem var en lysincodon som forventet for produktet af en tryptisk nedbrydning. De sidste to forudsagte rester passede ikke med DNA-se-kvensen. Imidlertid indeholdt DNA'en ved denne forbindelse 10 en god konsensus-RNA-splejsnings-donorsekvens (60, 61) efterfulgt kort efter af stopcodoner i alle tre mulige læserammer. Dette tydede på tilstedeværelsen af en intron begyndende ved denne position. (Denne antydning blev bekræftet med de nedenfor beskrevne cDNA-kloner.) En 15 åben læseramme strakte sig næsten 400 b 5' for homolo- gi-området. I dette område blev der identificeret flere konsensus-splejsnings-akceptorsekvenser. Undersøgelse af den DNA-forudsagte proteinsekvens for dette område afslørede pasninger med proteinsekvens af flere yderligere 20 tryptiske peptidfragmenter af faktor VIII. Dette viste, at der var blevet opnået en exon af en genomisk klon for human faktor VIII.

4. Udvidelse af qenomiske kloner: Λ-Biblioteks-qenom-vandrinq 25 Først blev der opnået 8 uafhængige genomiske faktor-VIII- klone.r ud fra A/4X-biblioteket. Disse indeholdt overlappende sekvenser af det humane genom spændende over omkring 28 kb. Ud fra den anslåede størrelse af faktor-VIII-protein-et blev det antaget, at det komplette gen ville omfatte 30 100 - 200 kb, afhængigt af længden af introns. Derfor blev samlingen af overlappende kloner udvidet ved "genomvandring".

Det første trin i denne fremgangsmåde var kortlægningen af restrikstionsendonuclease-spaltningssteder i de eksiste-35 rende genomiske kloner (figur 4). DNA fra disse kloner

DK 164876 B

56 blev nedbrudt med restriktionsenzymer enkeltvis eller i kombinationer og karakteriseret ved gelelektroforese (i nogle tilfælde efterfulgt af Southern-afdupnings-hy-bridisering). DNA-fragmenter frembragt ved EcoRI- og 5 BamHI-nedbrydning blev subklonet i pUC-plasmid-vektorer (59) af nemhedsgrunde. Restriktionskortlægning, DNA-se-kvensanalyse og afdupnings-hybridiseringer med 8.3-sonden bestemte genorienteringen.

Dernæst blev enkelt-kopi-fragmenter nær ved enderne 10 af 28 kb området identificeret som "vandre"-sonder.

Nedbrydninger af klonet DNA blev afdupningshybridiseret 32 med total P-mærket human DNA. Med denne teknik vil kun fragmenter indeholdende sekvenser gentaget mere end ca. 50 gange i genomet hybridisere (87, 88). Ikke-hybri-15 serende vandre-sonde-kandidat-fragmenter blev prøvet igen for gentagne sekvenser ved hybridisering til 50 000 fager fra 3/4X-biblioteket.

1 5'-retningen blev en triplet af 1 kb sondefragmenter isoleret fra 3l20-DNA nedbrudt med Ndel og Bamhl (se 20 figur 4). En million 3/4X-bakteriofager blev sigtet med denne sonde. En resulterende klon, 3.222, blev vist at strække sig omkring 13 kb 5' for 3.120 (se figur 4).

I 3'-retningen blev et 2,5 kb Stul/EcoRI-restriktions-fragment af 3.114 identificeret som en enkelt-kopi-vandre-25 sonde. Omfattende screening af 3/4X-biblioteket og derefter andre 3/human-genomiske biblioteker gav ingen udstrækkende kloner. Underrepræsentation af genomiske områder i 3 -biblioteker er blevet iagttaget tidligere (62). Det blev besluttet specifikt af berige genomisk DNA med 30 hensyn til de ønskede sekvenser og konstruere et begrænset bakteriofag-bibliotek ud fra det.

DK 164876 B

57

Southern-afdupnings-hybridisering af human genomisk DNA med 2,5 kb 5tuI/EcoRI-sonden viste et 22 kb hybri-diserende BclI-restriktionsfragment. Restriktionskortlægning viste, at kloning og udvinding af dette fragment 5 ville resultere i en stor ^'-udvidelse af genomiske kloner. Human 49,XXXXY- DNA blev nedbrudt med Bell, og en størrelsesfraktion på omkring 22 kb blev renset ved gelelektroforese. Denne DNA blev ligeret ind i BamHI-centret af bakteriofagvektoren ^1059, og et bibliotek 10 blev fremstillet. (Den tidligere anvendte vektor, Charon 30, kunne ikke rumme en så stor indsætning.) Seks hy-bridiserende kloner blev opnået ud fra 400 000 fager screenet fra dette berigede bibliotek. Den ønskede klon, betegnet-^ 442, strakte sig 17 kb yderligere 3' end vort 15 oprindelige sæt af overlappende genomiske kloner (figur 4).

5 . Genomvandrinq: Cosmidkloner

Et nyt genomisk bibliotek blev konstrueret med cosmidvek-torer. Cosmider (63), en plasmid- og bakteriofag-hybrid, 20 kan rumme omkring 45 kb indsætning, omkring en tredobling af den gennemsnitlige indsætningsstørrelse i -^/4X-DNA-bib-lioteket. En nykonstrueret cosmidvektor, pGcos4, har de følgende ønskelige egenskaber: 1

Der blev anvendt et derivat af tetracyclinresistens-genet 25 i pBR322 som ikke indeholdt et BamHI-sted. Dette gjorde det muligt at anbringe et BamHI-sted andetsteds i plas-midet og anvende det som kloningsstedet. Tetracyclinre-sistens er noget lettere at arbejde med end den mere almindeligt anvendte ampicillinresistens p.g.a. lægemidlets 30 større stabilitet. 2. 403 b HincII-fragmentet af A- indeholdende cos-stedet blev anvendt i stedet for 641 b Aval/-PvulIfragmentet af pBR322, således at plasmidets kopital ville forøges og for at fjerne pBR322-sekvenser, som 58

DK 164876 B I

i skader transformationen af eukaryotiske celler (75).

3. Et mutant dihydrofolatreductase-gen med et SV40-repli- ceringsorigin og -promotor blev inkluderet i pGcos4-vek- toren. På denne måde kunne alle fragmenter, som klones ! 5 i denne vektor, formeres i et bredt område af eukaryotiske celler. Det blev forventet, at dette kunne vise sig nyttigt ved udtrykkelse af store fragmenter af genomisk DNAmed deres naturlige promotorer. 4. Med henblik på kloningsstedet blev en syntetisk 20-mer med restriktions-10 stederne EcoRI, Pvul, BamHI, Pvul og EcoRI klonet ind i EcoRI-stedet fra pBR322. Det unikke BamHI-sted anvendes til at klone 35 - 45 b Sau3AI-fragmenter af genomisk DNA. De flankerende EcoRI-steder kan anvendes til sub-kloning af EcoRI-fragmenter af indsætningen. Pvul-ste-15 derne kan anvendes til udskære hele indsætningen i de fleste tilfælde. Pvul-stederne er yderst sjældne i euka-ryotisk DNA og forventes kun at forekomme én gang for hver 134 000 basepar baseret på dinucleotidfrekvens-er hos human DNA.

20 Figur 5 giver skemaet for konstruktionen af cosmidvektoren, pGcos4. 35 - 45 kb Sau3AI-fragmenter af 49,XXXXY-DNA blev klonet i denne vektor. Omkring 150 000 rekombinanter blev screenet in duplo med et 2,4' kb 5'-EcoRI/BamHI-frag-ment af^-222 og et 1 kb 31-EcoRI/BamHI-fragment af 25 482, som var enkelt-kopi-sonder identificeret nær ved enderne af det eksisterende genomiske område. Fire positive cosmidkloner blev isoleret .og kortlagt. Fig. 4 inkluderer cosmiderne p541, p542 og p543. Ud fra denne screening udvidede disse cosmidkloner det genomiske 30 faktor-VIII-område til ialt 114 kb. Efterfølgende son dering med cDNA- kloner identificerede talrige exons i det eksisterende sæt af overlappende genomiske kloner, men viste, at den genomiske vandring endnu ikke var fuldført. Yderligere skridt blev taget i hver retning.

DK 164876 B

59

En 3'-vandre-sonde blev fremstillet ud fra et 1,1 kb BamHI/EcoRI-fragment af p542 (fig.4). Denne sonde detekterede den overlappende cosmidklon p613, som strakte sig omkring 35 kb yderligere 3’. På et senere tidspunkt 5 blev den fulde faktor-VIII-budskabssekvens opnået ved cDNA-kloning (se nedenfor). Når et 1,9 kb EcoRI-cDNA-fragment indeholdende den 3'-terminale portion af cDNA'en blev hybridiseret til Southern-afdupninger af human genomisk og cosmidklonet DNA, identificerede den et 10 enkelt 4,9 kb EcoRI-bånd og 5,7 kb, 3,2 kb og 0,2 kb BamHI-bånd i både ikke-klonet (genomisk) og p613-DNA.

Dette implicerede, at 3'-enden af genet nu var nået, som vi senere fik bekræftet ved DNA-sekvens-analyse.

En 5'-vandre-sonde blev fremstillet ud fra et 0,9 kb 15 EcoRI/BamHI-fragment af p543. Den detekterede en overlappende cosmidklon p612, som udvidede det overlappende område ganske lidt. De mest 5' genomiske kloner blev endelig opnået ved screening af cosmid/4X- og ^./4X-biblio-teker med cDNA-afledte sonder. Som vist i fig. 4 fuldender 20 ^599,3.605 og p624 sættet af rekombinante kloner, som spænder over faktor-VIII-genet. (Disse kloner overlapper hinanden og indeholder al DNA'en i dette område af det humane genom med undtagelse af en 8,4 kb åbning mellem p624 og X 599 bestående udelukkende af intron-DNA.) 25 Tilsammen spænder genet over 200 kb af det humane X-kromo-som. Dette er langt det største gen, som hidtil er rapporteret. Groft taget 95 % af genet udgøres af introns, som må forarbejdes rigtigt for at frembringe mRNA-skabe-lon til syntesen af faktor-VIII-proteinet.

30 Isoleringen af faktor-UIII-gen-området i rekombinante X- og cosmid-kloner er ikke tilstrækkelig til at producere et nyttigt produkt, faktor-VIII-proteinet. Der fulgte flere forsøg på at identificere og karakterisere proteinkodningsportionerne (exon) af genet for til sidst at

DK 164876 B

60 konstruere et rekombinant udtrykkelsesplasmid, som er i stand til at dirigere syntesen af aktivt faktor-VIII-pro-tein i transficerede mikroorganismer eller vævskulturceller. To strategier gav ikke væsentligt nyttige resultater: 5 yderligere screening af genomiske kloner med nye oli- gonucleotidsonder baseret på proteinsekvensbestemmelse, og anvendelsen af udvalgte fragmenter af genomiske kloner som sonder ved RNA-afdupnings-hybridiseringer. Imidlertid blev kodeområder for faktor-VIII-proteinet isoleret 10 ved anvendelse af SV40-"exonudtrykkkelses"-vektorer og, til sidst, ved cDNA-kloning.

6. SV40-exonudtrykkelses-vektorer

Det er højst usandsynligt, at et genomisk område på flere hundrede kb kunne karakteriseres fuldstændigt 15 ved DNA-sekvens-analyse eller direkte anvendes til at syntetisere nyttige mængder af faktor-VIII-protein.

Groft taget 95 % af det human faktor-VIII-gen består af introns (mellemliggende sekvenser), som må fjernes kunstigt eller ved hjælp af eukaryotisk RNA-splejsnings-20 maskineri, før proteinet vil kunne udtrykkes. Der blev skabt en procedure til fjernelse af introns fra ufuldstændigt karakteriserede restriktionsfragmenter af genomiske kloner under anvendelse af, hvad vi kalder SV40-udtrykkel-ses-vektorer. Den almene ide går ud på at indsætte frag-25 menter af genomisk DNA i plasmider indeholdende en SV40- promotor og producere væsentlige mængder af rekombinant RNA, som ville blive forarbejdet i de transficerede abe-cos-celler. Den resulterende splejsede RNA kan analyseres direkte eller udgøre materiale til cDNA-kloning.

30 I det mindste i teorien, kunne denne teknik anvendes til at samle en hel splejset version af faktor-V/III-genet.

Vore første exonudtrykkelseskonstruktioner anvendte eksiste-

DK 164876 B

61 rende SV40-cDNA-vektorer, som udtrykte hepatitis-over-fladeantigen-genet (73). Imidlertid gav de genomiske faktor-VIII-fragmenter, som blev klonet ind i disse vektorer, ingen iagttagelig faktor-VIII-RNA, når den 3 blev analyseret ved afdupningshybridisering. Det blev antaget, at vanskeligheden kunne være, at exonområderne af cDNA-vektorerne under forløbet af disse konstruktioner var blevet sammenføjet med intron-områder af faktor-VIII-genet. For at komme uden om disse vanskeligheder blev 10 exonudtrykkelsesvektoren pESVDA konstrueret som vist i fig. 6. Denne vektor indeholder den tidlige SV40-promotor, det overvejende sene første splejsningsdonorsted fra Adenovirus 2, intronsekvenser, hvori de genomiske faktor-VIII-fragmenter kunne klones, efterfulgt af Elb-splejs-15 ningsacceptorstedet fra Adenovirus 2 og 3'-utranslaterede og polyadenyleringssekvenser fra hepatitis B overfladeantigenet (49j).

Først blev 9,4 kb BamHI-fragmentet og 12,7 kb Sstl-frag-mentet aflll4 klonet ind i intron-området af pESVDA 20 (se fig. 6). Northern-afdupnings-analyse af RNA'en synte tiseret af disse to konstruktioner efter transfektion af cos-celler er vist i fig. 7. Med 9,4 kb BamHI-konstruk-tionen findes et hybridiserende RNA-bånd på omkring 1,8 kb med sonder for exon A samt 31-utranslateret hepati-25 tissekvens. For at undersøge RNA'en for eventuelle nye faktor-VIII-exons blev et 2,0 kb StuI-BamHI-fragment af3_114 3' for exon A hybridiseret i en parallel bane.

Denne sonde viste også et RNA-bånd på 1,8 kb, som viser tilstedeværelsen af yderligere nye faktor-VIII-exons 30 i dette område. Hver af disse tre sonder hybridiserede også til et RNA-bånd fra en konstruktion indeholdende det genomiske 12,7 kb SstI-fragment. Dette RNA-bånd var omkring 2,1 kb. Denne iagttagelse tydede på, at yderligere 200 - 300 b af exonsekvenser var indeholdt 35 i denne konstruktion 3' for BamHI-stedet, som afgrænser

DK 164876 B

62 9,4 kb BamHI-fragmentet.

Kontrolforsøg viste, at dette system er i stand til at splejse kendte exonområder korrekt. Et 3,2 kb genomisk HindiIl-fragment af muse-dhfr spændende over exons III 5 og IV blev klonet i pESVDA. Et RNA-bånd på 1 kb blev fundet med en muse-dhfr-sonde. Dette er den forventede størrelse, hvis exonerne er splejset korrekt. Konstruktioner med det genomiske 9,4 kb BamHI-faktor-VIlI-fragment eller 3,2 kb dhfr-fragment i den modsatte orientering 10 gav ingen iagttagelige RNA-bånd med nogen af sonderne (fig. 7).

En cDNA-kopi af RNA'en fra 12,7 kb Sstl-konstruktionen blev klonet i pBR322 og screenet. Der blev fundet én næsten fuld-længde (1700 b) cDNA-klon (S36). Sekvensen 15 af 950 bp Sstl-fragmentet indeholdende hele faktor-VIII- indsætningen og en del af pESVDA-vektoren på hver side er vist i fig. 8. Sekvensen begynder og ender med ade-novirus-splejsningsdonor- og -acceptor-sekvenserne som forventet. Derimellem er der 888 b faktor-VIII-sekvens 20 inkluderende exon A. De 154 b før og de 568 b efter exon A indeholder flere faktor-VIII-80K-tryptiske fragmenter, hvilket bekræfter, at disse er nyidentificerede exons. Sekvenser af det genomiske område svarende til disse exons viste, at de 154 b 5' for exon A er indeholdt 25 i en exon, C, og at områderne 3' for exon A er sammensat af 3 exons, D, E og I på henholdsvis 229, 183 og 156 b.

Hver af disse exons er afgrænset af et rimeligt splejsningsdonor- og -acceptor-sted (60, 61).

Efterfølgende sammenligning af S36-exonudtrykkelses-cDNA'en 30 med cellelinje-faktor-VIII-cDNA-klonerne viste, at hele

den splejsede faktor-VIII-sekvens i S36 er fra faktor-VIII-exons. Denne inkluderede som forventet exons C, A, D, E

DK 164876 B

63 og I. Imidlertid manglede 47 b af exons A ved C, A-sam-lingen, og exons F, G og H var fuldstændigt udeladt.

De skift i læseramme, som opstod ved en sådan afvigende RNA-forarbejdning, viste, at den ikke kunne svare nøjag-5 tigt til faktor-VIII-sekvensen. Ved C, A-samlingen var anvendt et splejsningssted med god konsensus frem for det autentiske. Den forskellige splejsning af S36- klonen sammenlignet med den autentiske faktor-VIII-transskript kan skyldes, at kun en del af den primære RNA-trans-10 skript blev udtrykt i cos-celle-konstruktionen. Alternativt kan celletype- eller arts -variabilitet være skyld i denne forskel.

7. cDNA-kloning

a. Identifikation af en cellelinje, som producerer 15 faktor-VIII-mRNA

For at identificere en RNA-kilde til isolering af faktor-VIII-cDNA-kloner blev polyadenyleret RNA isoleret fra talrige humane cellelinjer og væv og screenet ved Northern-afdupnings-hybridisering med 189 bp Stul/Hindll-20 fragmentet fra exon A området af'2.120. Poly(A)+-RNA

fra det humane T-celle-hybridom CH-2 udviste en hybri-diserende RNA-art. Størrelsen af den hybridiserende RNA blev bedømt til at være omkring 10 kb. Dette er den størrelse mRNA, som forventes at kode for et protein 25 på omkring 300 kD. Ved sammenligning med kontrol-DNA- prikafdupnings- hybridiseringer (66) blev mængden af denne RNA bestemt til at være 0,0001 - 0,001 % af den totale cellulære poly(A)+-RNA i CH-2 cellelinjen. Dette resultat viser, at isolering af faktor-VI11-cDNA-sekvenser 30 fra denne kilde ville kræve yderligere berigelse med specifikke sekvenser eller også indebære screening af yderst store antal cDNA-kloner.

64 DK 164876 B ! b. cDNA-kloner syntetiseret ud fra specifikke primere DNA-sekvensanalysen af genomiske faktor-VIII-kloner muliggjorde syntesen af syntetiske 16 b oligonucleotider til specifikt at prime første-strengs-syntese af cDNA. ' 5 Normalt anvendes oligo(dT) til at starte cDNA-syntese ved mRNA'ens poly(A)-haler. Anvendelsen af specifikke primere har to fordele frem for oligo(dT). For det første tjener den til at berige cDNA-klon-populationen med hensyn til faktor VIII. For det andet anbringer den 10 cDNA-klonerne i områder af genet, for hvilke vi har hybridiseringssonder. Dette er særlig vigtigt ved kloning af et så stort gen. Da cDNA-kloner sjældent er længere end 1000 - 2000 basepar ville oligo(dT)-primede kloner sædvanligvis være udetekterbare med en sonde fremstillet 15 ud fra de fleste områder af faktor-VIII-genet. Den an vendte strategi var at anvende DNA-fragmenter og sekvensinformation fra det først opnåede exon A område til at opnå specifikke primere for syntese af cDNA-kloner. Vi gik frem på den måde, at vi opnåede et sæt 20 overlappende cDNA-kloner i 5'-retningen baseret på karakteriseringen af den tidligere generation af cDNA-kloner.

For at aflede cDNA-området mere i 3' retningen anvendte vi cDNA- og genomiske klonfragmenter fra 3'-exons til at detektere oligo(dT)-primede cDNA-kloner. Flere typer 25 af cDNA-kloningsprocedurer blev anvendt under dette arbejde og vil blive beskrevet nedenfor.

Den første specifikke cDNA-primer, 5'-CAGGTCAACATCAGAG ("primer 1"); se fig. 9) blev syntetiseret som den reverse komplement af de 16 3'-terminale rester af exon A sekvensen.

30 C-halet cDNA blev syntetiseret ud fra 5^-ug CH-2-celle-poly (A)+-RNA med "primer 1" og smeltet ind i G-halet pBR322 som beskrevet alment i (67). Omkring 100 000 resulterende E. coli transformanter blev udpladet på 100 150 mm skåle 65 og screenet ved hybridisering (48) med 189 bp Stul/Hindll-fragmentet fra exon A området af den genomiske klon ^120 (fig. 4.). Der blev udvundet én hybridiserende klon ("pi.11") (se fig. 9). DNA-sekvensanalyse af pi.11 5 påviste identitet med vore genomiske faktor-VIII-kloner.

447 b cDNA-indsætningen i pi.11 indeholdt de første 104 b af genomisk exon A (anden-strengs-syntese strakte sig øjensynligt ikke tilbage til primeren) og fortsatte yderligere i, hvad vi senere kunne påvise at være exons 10 B og C. 5'-punktet af divergens med exon A sekvens var afgrænset af et typisk RNA-splejsningsacceptor-sted (61).

Selv om gennemførligheden af at opnå faktor-VIII-cDNA-kloner ud fra CH-2-cellelinjen nu var blevet påvist, blev der 15 foretaget yderligere raffinementer. Anstrengelser af forskellige typer blev gjort på yderligere at berige CH-2-RNA på faktor-VIII-budskab. En heldig strategi var at kombinere første-strengs-cDNA-syntese ud fra specifikke primere med hybrid-selektion af den resul-20 terende enkeltstrengede cDNA. "Primer 1" anvendtes med 200yUg poly(A )+-CH-2-RNA til at syntetisere enkeltstrenget cDNA. 1 stedet for at anvende DNA-polymerase til umiddelbart at omdanne denne til dobbeltstrenget DNA, blev den enkeltstrengede DNA hybridiseret til 2y-ug af 189 b 25 StuI/HincII-fragmentet af genomisk DNA, som var blevet immobiliseret på aktiveret diazobenzyloxymethy1 (DBM)-cellulosepapir (Schleicher and Schuell "Transa-Bind"); se (48). Selv om det normalt er RNA, som udsættes for hybrid-selektion, blev proceduren anvendt efter cDNA-30 syntese for at undgå yderligere manipulation af de sjæld ne, store og relativt labile faktor-UIII- RNA-molekyler. Efter eluering blev materialet omdannet til dobbeltstrenget cDNA, størrelsesadskilt, og 0,5 ng udvundet DNA blev forsynet med C-hale og klonet ind i pBR322 35 som før. Der blev opnået omkring 12000 rekombinante

DK 164876B

66 kloner, som blev screenet ved hybridisering med et 364 b Sau3A/5tuI-fragment afledt fra den tidligere cDNA-klon pi.11. Sondefragmentet blev med vilje valgt til ikke at overlappe med den DNA, som anvendtes til hybrid-se-5 lektion. Således undgik man identifikationen af falske rekombinanter indeholdende noget af StuI/HincII-DNA-fragmentet, som uundgåeligt frigøres fra DBM-cellulo-sen. Der blev opnået 29 hybridiserende kolonier. Dette repræsenterer groft taget en 250 ganges berigelse af 10 de ønskede kloner i forhold til den tidligere procedure.

Hver af de 29 nye rekombinanter blev karakteriseret ved restriktionskortlægning, og de to længste (p3.12 og p3.48; fig. 9) blev sekvensbestemt. Disse cDNA-kloner strakte sig omkring 1500 b yderligere 5' end pi.11.

15 Sideløbende kortlægning og sekvensanalyse af cDNA- og genomiske kloner afslørede tilstedeværelsen af en usædvanlig stor exon (B, fig. 4), som omfattede p3.12 og p3.48. På basis af denne iagttagelse blev DNA-sekvensana-lysen af den genomiske klon 3.222 udstrakt til at definere 20 udstrækningen af denne exon. Exon B området indeholdt en åben læseramme på omkring 3 kb. 16-mere primere ("primer 2" og "primer 3") blev syntetiseret til at passe i sekvens inden for denne store exon i håbet om at opnå en betydelig udstrækning i cDNA-kloning.

25 Ved dette punkt blev det påvist, at et bakteriofag-ba- seret cDNA-kloningssystem kunne anvendes, hvilket muliggjorde produktion og screening af store antal af cDNA-kloner uden forudgående berigelser ved hybrid-selektion.

3.GT10 (68) er et fag 3 derivat med et enkelt EcoRI-re-30 striktionssted i dets repressorgen. Hvis dobbeltstrengede cDNA- fragmenter er flankeret af EcoRI-steder, kan de ligeres ind i dette unikke sted. Indsætning af fremmed DNA i dette sted gør fag-repressoren minus, således at der dannes en klar plak.3GT10 uden indsætning danner

DK 164876B

GI

uklare plakker, som således kan skelnes fra rekombi-nanter. Foruden den store trans formationseffektivitet, som ligger i fag-indpakningen, er 3.-cDNA-plakker mere hensigtsmæssige at screene ved høj tæthed end bakterie-5 kolonier.

Dobbeltstrenget cDNA blev fremstillet som før under anvendelse af "primer 3", 5'-AACTCTGTTGCTGCAG (lokaliseret omkring 530 b nedad fra den postulerede 5'-ende af exon B). EcoRI-"adaptorer" blev ligeret til den stumpendede 10 cDNA. Adaptorerne bestod af komplementære syntetiske 18-mere og 22-mere med sekvensen 5'-CCTTGACCGTAAGACATG og 5'-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG. 5'-enden af 18-meren var phosphoryleret, medens 5'-enden af 22-meren bevarede 5'-OH-gruppen, hvormed den var syntetiseret. Når de 15 sammensmeltes og ligeres med cDNA’en, danner adaptorerne således overhængende EcoRI-steder, som ikke kan selv-ligere. Dette gør det muligt at undgå EcoRI-methylering af cDNA og efterfølgende EcoRI-nedbrydning, som følger på linker-ligering ved andre publicerede procedurer (83). Efter 20 gelisolering til størrelsesseparation af cDNA'en og fjernelse af ureagerede adaptorer blev en ækvimolær mængde af denne cDNA ligeret ind i EcoRI-skåret3.GT10, indpakket og udpladet på E. coli c600hfl. Omkring 3 000 000 kloner fra l^ug poly(A)+-RNA blev udpladet 25 på 50 150 mm petriskåle og hybridiseringsscreenet med et 300 bp HinfI-fragment fra 5'-enden af exon B. 46 dobbelte positive blev identificeret og analyseret ved EcoRI-nedbrydning. Flere cDNA-indsætninger viste sig at strække sig omkring 2500 b 5' for "primer 3". Disse 30 lange kloner blev analyseret ved DNA-sekvensbestemmelse.

Sekvensen af 5'-enderne af 3.13.2 og .3.13.27 er vist i fig. 10. De havde flere træk, som viste, at vi har nået 5'-enden af kodeområdet for faktor-VIII. De første 109 b indeholdt stopcodoner i alle mulige læserammer. Derpå

DK 164876 B

68 viste der sig en ATG-triplet efterfulgt af en åben læseramme for resten af de 2724 b af cDNA-indsætningen i.2-13.2. Translation af sekvensen efter start-ATG-codonen giver en sekvens på 19 aminosyrer, som er typisk for 5 en "leder"- eller "præ"-sekvens hos et secerneret protein (69). Dens fremtrædende træk er 2 ladede rester på hver side af en hydrofob kerne på 10 aminosyrer. Efter denne formodede ledersekvens er et område svarende til ami-noterminale rester opnået ved proteinsekvensanalyse 10 af 210 kD og 95 kD thrombin-nedbrydnings-fragmenter af faktor VIII.

c. cDNA-kloner syntetiseret ud fra oligo(dT)-primere

Adskillige tusind flere 3'-baser af faktor-VIII-mRNA var endnu tilbage at omdanne til cDNA. Valget var at 15 starte revers transskription med oligo(dT) og søge efter cDNA-kloner indeholdende 31-poly(A)+-halerne af mRNA. Imidlertid forsøgte vi at berige klonerne og forøge effektiviteten af anden-strengs-DNA-syntesen ved at erstatte etablerede procedurer med anvendelse af en 20 specifik primer for anden-strengs-cDNA-syntese. Den 16-mere primer ("primer 4"), 5'-TATTGCTGCAGTGGAG, blev syntetiseret til at repræsentere mRNA-meningssekven-sen ved et Pstl-sted omkring 400 b opad fra 3'-enden af exon A (fig. 9). mRNA blev reversstransskriberet 25 med oligo(dT)-primer, "primer 4" tilsattes med DNA-poly-merase til anden-strengs-syntese, og EcoR.I-tilpasset cDNA blev derpå ligeret ind i'^GTlO som før. 3 000 000 plakker blev screenet med et 419 b Pstl/HinclI-fragment indeholdt på p3.12 liggende nedenfor "primer 4". DNA 30 blev præpareret ud fra de fire udvundne kloner. Disse blev nedbrudt, kortlagt og afdupnings-hybridiseret med yderligere nedenfor beliggende genomiske fragmenter, som netop var blevet identificeret som exons under anvendelse af de ovenfor beskrevne SV40-exonudtrykkelses-plasmider.

DK 164876 B

69

Tre af de fire rekombinanter hybridiserede. Den længste, Λ10.44 uar på omkring 1800 basepar. DNA-sekuensen af ,3.10.44 uiste, at anden-strengs-syntesen faktisk begyndte ued "primer 4". Den indeholdt alle exonsse uenser fundet 5 i SV40-exonsudtrykkelses-klonen 536 og flere til. Imidler tid fortsatte den åbne læseramme af 3.10.44 til enden af cDNA'en. Der fandtes intet 3'-utranslat^ret område og ..eller ingen poly(A)-hale. Antageligvis uar anden-strengssyntesen ikke ført helt igennem.

10 For at finde kloner indeholdende den komplette 3'-ende screenede ui igen de samme filtre med mærket DNA fra XlO.44. 24 yderligere kloner bleu udvundet og kortlagt, og de to længste (5.10.3 og3.lo.92) blev sekvensbestemt.

De indeholdt hovedsageligt identiske sekvenser, som 15 overlappede X10.44 og tilføjede omkring 1900 b mere

i 3'-retningen. 51 b forbi enden af 3.10.44 uiste DNA-se-kvensen en TGA-translationsstopcodon efterfulgt af et tilsyneladende 3'-utranslateret område på 1805 basepar. Diagnostiske træk ved dette område er stopcodoner spredt 20 i alle tre læserammer og en poly(A)-signalsekvens, AATAAA

(89), efterfulgt af 15 baser nedad med en poly(A)-strækning ved enden af cDNA'en (klon5.10.3 indeholder 8 A'er efterfulgt af EcoRI-adaptoren ved dette punkt, medensX10.9.2 indeholder over 100 A'er ved dens 3'-ende).

25 d. Komplet cDNA-sekvens

Den komplette sekvens af overlappende kloner præsenteres i figur 10. Den består af en kontinuert åben læseramme, som koder for 2351 aminosyrer. Hvis man antager et formodet terminalt signalpeptid på 19 aminosyrer, vil det "modne" 30 protein derfor have 2332 aminosyrer. Den udregnede molekyl vægt for dette protein er omkring 267 000 dalton. Når man tager eventuel glycosylering i betragtning, ligger dette meget nær på molekylvægten af det native protein som bestemt ved SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese.

DK 164876 B

70

Den "komplette" cDNA-længde på omkring 9000 basepar (afhængigt af længden af 3'-poly(A)) stemmer overens med den antagne længde af mRNA'en bestemt ved Northern-af- ^ 5 dupnings-hybridisering. 5'-området (det aminoterminale kodeområde) indeholder væsentlig korrespondance med peptidsekvensen af 210 kD materiale afledt fra faktor VIII, og 3'-området (det carboxyterminale kodeområde) indeholder væsentlig korrespondance med peptidsekvensen 10 af 80 kD proteinet.

8. Udtrykkelse af rekombinant faktor VIII

a. Samling af fuld-lænqde-klon

For at udtrykke rekombinant faktor VIII blev det fuldstændige 7 kb proteinkodeområde samlet fra flere separate 15 cDNA- og genomiske kloner. Nedenfor og i fig. 11 beskrives konstruktionen af tre mellemplasmider indeholdende 5'-områ-det, midterområdet og 3'-området af genet. Mellemprodukterne kombineres i et udtrykkelsesplasmid anbragt efter en tidlig SV40-promotor. Dette plasmid tjener på sin 20 side som udgangspunkt for forskellige konstruktioner med modificerede terminale sekvenser og forskellige promotorer og selekterbare markører til transformation af et antal pattedyrcelletyper.

5'-kodeområdet blev samlet i et pBR322-derivat på en 25 sådan måde, at Clal-restriktionsstedet blev placeret før ATG-startcodonen af faktor-VIII-signalsekvensen.

Eftersom der ikke findes noget andet Clal-sted i genet, bliver det et hensigtsmæssigt sted til finpudsninger af udtrykkelsesplasmidet.

71

Det hensigtsmæssige Clal- og Sacl-holdige plasmid pT24-10 (67a) blev spaltet med HindHI, fyldt ud med DNA-polyme-rase og skåret med Sacl. Et 77 b AluI/SacI-fragment blev udvundet fra 5'-området af faktor-VlII-cDNA-klonen 5 3.13.2 og ligeret ind i denne vektor til dannelse af mellemproduktet kaldt pF8Cla-Sac. (Alul-centret er lokaliseret i det 5'-utranslaterede område af faktor VIII, og Sacl-centret 10 b uden for ATG-startcodonen ved nucleo-tidposition 10 i fig. 10; nucleotidpositionen af alle 10 restriktionssteder omtalt i det følgende vil blive numme reret som i fig. 10 begyndende med A i startcodonen ATG.) Et 85 b Clal/SacI-fragment indeholdende 11 b adap-torsekvens (adaptorsekvensen 5' ATCGATAAGCT er helt afledt fra pBR322) blev isoleret fra pF8Cla-Sac og li-15 geret sammen med et 1801 b SacI/KpnI-(nucleotid 1811) fragment fraXl3.2 ind i en Clal/KnpI-vektor fremstillet ud fra en pBR322-subklon indeholdende et Hindi Il-fragment (nuo. 1019-2277) af faktor VIII. Dette mellemprodukt, kaldt pF8Cla-Kpn, indeholdt de første 2277 kodenucleo-20 tider af faktor VIII med 65 5'-utranslaterede basepar og Clal-adaptorsekvensen på 11 basepar foran. pF8Cla-Kpn blev åbnet med Kpnl og Sphl (i pBR322-delen) for at tjene som vektor fragmentet ved ligering med 466 b Kpnl/ Hindlll-fragment afledt fra en EcoRI-subklon af 3-13.2 25 og et 1654 b Hindi II/Sphl-(nuc. 4003) fragment afledt fra den exon-B-holdige subklon p222.8. Dette gav pF8Cla-Sph indeholdende de første 3931 b af faktor-VIII-kode-sekvensen.

Den midterste del af kodeområdet blev afledt fra en 30 tre-parts-ligering til kombination af fragmenter af tre pBR322/cDNA-kloner eller -subkloner. p3.48 blev åbnet med BamHI (nuc. 4743) og Sall (i pBR322 tet området) for at tjene som vektor. Ind i disse steder blev ligeret et 778 b BamHI/Ndel-(nuc. 5520) fragment fra p3.12 og 35 et 2106 b NdeI/SalI-(i pBR322) fragment fra subklonen

DK 164876 B

72 pXL0.44R1.9. Rigtig ligering resulterede i et tetracyc-linresistent plasmid pF8Sca-RI.

Den yderste 3'-portion af faktor-VIII-cDNA blev klonet direkte ind i en SV40-udtrykkelsesvektor. Plasmidet 5 pCVSVEHBV indeholder en tidlig SV40-promotor efterfulgt af en polylinker og genet for Hepatitis B overfladeantigenet .

[pCVSVEHBV, også betegnet som pCVSVEHBS, er en ganske lidt afvigende variant af p342E (73). Nærmere bestemt 10 opnås pCVSVEHBV som følger: 340 b HindIII/HindIII-frag-mentet, som omfatter SV40-repliceringsoriginet (74) blev ligeret ind i plasmid pML (75) mellem EcoRI-stedet og HindiII-stedet. Plasmid-EcoRI-stedet og SV40-HindIII-stedet blev gjort stumpe ved tilsætning af Klenow-DNA-15 polymerase I i nærvær af de 4 dNTP’er før nedbrydningen med Hindlll. Det resulterende plasmid, pESV, blev nedbrudt med Hindlll og BamHI, og 2900 b vektorfragmentet isole ret. Til dette fragment blev ligeret et Hindlll/Bglll-fragment på 2025 b fra HBV modificeret til at indeholde 20 en polylinker (DNA-fragment indeholdende flere restrik tionssteder) ved EcoRI-stedet. HBV-fragmentet omfatter overfladeantigen-genet og afledes ved EcoRI/Bglll-ned-brydning af klonet HBV-DNA (74). Det dobbeltstrengede linker-DNA-fragment (5·dAAGCTTATCGATTCTAGAATTC3' . ..) 25 blev nedbrudt med Hindlll og EcoRI og sat_til HBV-fragmen tet, hvorved EcoRI/Bglll-fragmentet blev omdannet til et Hindlll/BgIII-fragment. Selv om dette kunne gøres som en tre-parts-ligering omfattende linker, HBV-frag-ment og vektor, er det mere hensigtsmæssigt, og blev ] 30 gennemført på den måde, først at sætte Hindlll/EcoRI- linkeren til den klonede HBV-DNA og derpå udskære Hindlll/ Bglll-fragmentet ved samtidig nedbrydning af plasmidet med de to enzymer. Det resulterende plasmid, pCVSVEHBV, indeholder et bakterielt repliceringsorigin fra det

DK 164876 B

73 pBR322-afledte pML, en ampicillinresistens-markør, også fra pML, et SV40-fragment orienteret således, at den tidlige promotor vil dirigere transkriptionen af det indsatte HBV-fragment, og overfladeantigen-genet fra 5 HBV. HBV-fragmentet tilvejebringer også et polyadenyle- ringssignal til produktionen af polyadenylerede mRNA'er, som de normalt dannes i pattedyrcellers cytoplasma.]

Plasmidet pCVSVEHBV indeholdt et nyttigt Clal-sted umiddelbart 5' for et Xbal-sted i polylinkeren. Dette plasmid 10 blev åbnet med Xbal og BamHI (i det 3'-utranslaterede område af hepatitis antigen-genet), og enderne udfyldt med DNA-polymerase. Dette fjernede hepatitis-overfla-deantigen-kodeområdet, men bevarede dets 3'-polyade-nylerings-signalområde såvel som SV40-promotoren. Ind 15 i denne vektor blev ligeret et 1883 b EcoRI-fragment (med udfyldte ender) fra cDNA-klonen (λ.10.3 . Dette indeholdt de sidste 77 kodebasepar af faktor VIII, det 3'-utranslaterede område på 1803 b, 8 adenosinrester og den udfyldte EcoRI-adaptor. På grund af sammenføjeisen 20 af de udfyldte restriktionssteder blev EcoRI-enden genskabt ved 5'-enden (ud fra udfyldt Xbal sammenføjet med udfyldt EcoRI), men ødelagt ved 3'-enden (udfyldt EcoRI sammenføjet med udfyldt BamHI). Dette plasmid blev kaldt pCVSVE/10.3.

25 Det komplette faktor-VIII-cDNA-område blev sammenføjet ved en tre-parts-ligering. pCVSVE/10.3 blev åbnet med Clal og EcoRI og tjente som vektor for indsætningen af 3870 b Clal/Scal-fragmentet fra pF8Cla-Sca og 3182 b Scal/EcoRI-fragmentet fra pF8Sca-RI. Dette udtrykkelses-30 plasmid blev kaldt pSVEFVIII.

DK 164876B

74 b. Konstruktion til udtrykkelse af faktor VIII i uævs-kulturceller_

En variant vektor baseret på pSVEFVIII, indeholdende den overvejende sene promotor fra adenovirus, tre-parts-5 ledersekvens og et forkortet faktor VIII 3'-utransla-teret område, producerede aktiv faktor VIII, når den blev stabilt transficeret ind i BHK-celler.

Fig. 12 viser konstruktionen af pAML3P.8cl, udtrykkelses-plasmidet, som producerer aktiv faktor VIII. For at 10 gennemføre denne konstruktion blev Sstll-stedet i pDFll (49r) og Clal-stedet i pEHED22 (49y) først fjernet med Klenow-DNA-polymerase I. Disse steder ligger i de 3'-og 3'-utranslaterede områder af DHFR-genet på disse plasmider. Derpå gennemførtes en tre-parts-ligering 15 af fragmenter indeholdende de deleterede steder og hepati tis B overfladeantigen-genet fra pCVSVEHBS (ovenfor) til dannelse af vektoren pCVSVEHED22 CS, som kun har ét Clal-sted og ét SstH-sted. Plasmidet pSVEFVIII indeholdende det samlede faktor-VIII-gen (fig. 11) blev 20 spaltet med Clal og Hpal for at udskære hele kodeområdet og omkring 380 b af det 3'-utranslaterede område. Dette blev indsat i Clal, Sstll-deletionsvektoren ved dens unikke Clal- og Hpal-steder til erstatning for overfladeantigen-genet til dannelse af udtrykkelsesplasmidet 25 pSVE.8clD.

Separat blev den overvejende sene adenovirus-promotor med dens tre-parts 5'-leder samlet fra to subkloner af portioner af adenovirus-genomet sammen med et DHFR-ud-trykkelses-plasmid, pEHD22 (49y). Konstruktionen af 30 de to adenovirus-subkloner, pUCHSX og pMLP2, er beskrevet under "Metoder". pMLP2 indeholder SstI-til-HindIII-frag-mentet fra adenoviruskoordinaterne 15.4 til 17.1 klonet i SstI-til-HindIII-stedet i pUC13 (59). pUCHSX indehol-

DK 164876 B

75 der Hindi II-til-XhoI-fragmentet med koordinaterne 17.1 til 26.5 klonet i HindIII-til-SalI-stedet i p(JC13. Når de samles ved Hindi II-stedet, indeholder disse to adenovirus-fragmenter den overvejende sene promotor fra 5 adenovirus, alle de første to exons og introns og en del af den tredje exon op til Xhol-stedet i det 5'-translaterede område.

En tre-parts-ligering samlede adenovirus-promotoren foran DHFR-genet i plasmidet pAML3P.D22. Dette anbragte 10 et Clal-sted kort efter det tidligere Xhol-sted i den tredje exon af adenovirus-tre-parts-5'-lederen. Endelig blev den tidlige SV40-promotor i faktor-VIII-udtrykkel-sesplasmidet, pSVE.8clD, fjernet med Clal og Sall og erstattet med en tidlig SV40/adenovirus-tandempromotor 15 (se fig. 12) til dannelse af det endelige udtrykkelses- plasmid, pAML3P.8cl. Dette plasmid indeholder adenovi-rus-tre-parts-lederen splejset i den tredje exon til det 51-utranslaterede område af faktor-VIII. Dette efterfølges af den fulde længde af faktor-VIII-struktur-20 genet inklusive dets signalsekvens. Det 31-utranslaterede område af faktor-l/III-genet splejses ved Hpa I-stedet til det 31-utranslaterede område af hepatitis B overfladeantigen-genet. Dette efterfølges af DHFR-genet, som har en tidlig SV40-promotor og et 3'-utranslateret hepa-25 titis-område, som tilfører et funktionelt polyadenyle- ringssignal.

Faktor-V111-udtrykkelses-plasmidet, pAML3P.8cl, blev transficeret ind i BHK-celler sammen med neomycinresi-stens-vektoren pSVEneoBal6 (ATCC nr. CRL 8544, depone-30 ret den 20. april 1984). Disse celler blev først selekteret med G418 efterfulgt af en selektion med methotre-xat.

En indledende karakterisering af faktor-VI II-RNA1 en

DK 164876 B

76 produceret af BHK-cellelinien blev gennemført ved Northern- analyse af poly(A)+-cytoplasmisk RNA ved hybridisering 32 til en P-mærket faktor-VIII-DNA-sonde. Denne analyse viser et bånd med en længde på omkring 9 kb. Baseret 5 på hybridiseringsintensiteter er dette bånd omkring 100 - 200 gange beriget, sammenlignet med det 9 kb bånd, som findes i CH-2-cellelinien.

9. Identifikation af rekombinant faktor VIII

a. Radioimmunprøvninq 10 Radioimmunprøvninger blev gennemført som beskrevet under "metoder" på supernatanter og lyserede celler fra den faktor-VIII-producerende BHK-cellelinie. Tabel 1 viser, at supernatanterne (som indeholder faktor-VIII-aktivitet) (se 96) også indeholder tilnærmelsesvis lige store mæng-13 der af 210 kD (CIO) og 80 kD (C7F7) portionerne af faktor VIII bedømt ved disse radioimmunprøvninger. Faktor VIII kan også detekteres i cellelysaterne ved begge radioimmunprøvninger. Kontrolcellelinier, der ikke udtrykker faktor VIII frembragte RIA-værdier på mindre end 0,001 20 enheder pr. ml.

TABEL 1

Faktor-VIII-RIA af BHK-cellelinie transficeret med pAML3P.8cl CIO C7F7 23 Cellesupernatant

Forsøg 1 0,14 enh./ml 0,077 enh./ml.

Forsøg 2 0,022 " 0,021 "

Cellelysat

Forsøg 1 0,42 " 0,016 125

DK 164876B

77 Tæl1inger/min af bundet I blev omsat til enh./ml med en standardkurve baseret på fortyndinger af normalt plasma. Alle værdier er signifikant over baggrunden.

Grænserne for detektion var 0,005 enh./ml for ClO-prøv-5 ningen og 0,01 enh./ml for C7F7-prøvningen.

b. Chromoqenprøvning på BHK-cellemedier

Som vist i tabel 2 frembragte medier fra disse celler en absorbans ved 405 nm, når de blev prøvet ved Coatest-prøvningen. Som beskrevet ovenfor, er denne prøvning 10 specifik for faktor-VIII-aktivitet til aktivering af faktor X. Tilsætning af monoklonale antistoffer, som er specifikke for faktor VIII, sænkede den frembragte mængde af faktor Xa som påvist ved faldet i absorbans fra 0,155 for medierne til 0,03 for medierne plus anti-15 stoffer (efter fratrækning af blindværdien). Derfor producerer cellerne en aktivitet, som fungerer ved en prøvning, der er specifik for faktor-VIII-aktivitet, og denne aktivitet neutraliseres af antistoffer, som er specifikke for faktor VIII.

20 Inkubation af mediet i reaktionsblandingen uden tilsætning af faktor IXa, faktor X og phospholipid resulterede ikke i en forøgelse i absorbansen ved 405 nm i forhold til blindværdien. Den iagttagne aktivitet skyldes derfor ikke tilstedeværelsen af en ikke-specifik protease, 25 som spalter substratet, og desuden neutraliseres den af antistoffer, som er specifikke for faktor VIII.

DK 164876 B

78 TABEL 2

Faktor-VIII-aktivitet af BHK-cellelinie bestemt ved chromogenprøvning .

Absorbans 5 ved 405 nm

Absorbans (efter fra- ved trækning af

Prøve 405 nm kontrolværdi)

Medium 0,193 0,155 10 Puffer-kontrol^ 0,038 (0,0)

Medium + faktor-VIII-antistof^ 0,064 0,030

Puffer-kontrol^ + faktor-VIII- antistof_ 0,034 (0,0) 1 Reaktioner modificeret som følger: 50 ^ul hver af 15 IXa/X/phospholipid, CaC^ og 1:100 fortyndet prøve blev inkuberet 10 minutter ved 37 °C. Der tilsattes S2222 (50 ^ul), og reaktionen blev afsluttet med 100 yul 50 % eddikesyre efter 60 minutter ved 37 °C.

2 Pufferen, som anvendtes i stedet for prøven, var 20 0,05 M "Tris"-HCl, pH 7,3, indeholdende 0,2 % oksese- rumalbumin.

3 Antistoffet var en blanding af C8 og C7F7 (10 ^ug hver). Mediet blev forinkuberet i 5 minutter før prøvningens start.

25 c. Chromatoqrafi af medium på monoklonal harpiks

Serum indeholdende medium indeholdende faktor-VIII-akti-vitet blev chromatograferet på søjlen af monoklonalt antistof C8 (ATCC nr. 40115, deponeret d. 20. april 1984) som beskrevet (ovenfor). De eluerede fraktioner 30 blev fortyndet 1:100 og prøvet for aktivitet. Til 50 yul af den fortyndede topfraktion sattes forskellige monoklonale antistoffer, som vides at være neutraliserende for plasma-faktor-VIII-aktivitet. De i tabel 3 angivne resultater viser, at den fra søjlen eluerede 79 faktor-VIII-aktivitet (nu meget mere koncentreret end mediet) også blev neutraliseret af disse faktor-VIII-antistoffer.

TABEL 3 5 Chromogenprøvning·*· af topfraktion af eluat fra monoklo- nalt antistof

Absorbans ^

Prøve ved 405 nM

Topfraktion^ 0,186

Topfraktion plus faktor-VIII-antistof^ 0,060 10 Puffer-kontrol 0,000

Puffer-kontrol plus faktor-VIII-antistof 0,045 1 Prøvningen gennemførtes som følger: 50 ^ul fortyndet prøve blev inkuberet 5 minutter med 50 ^ul IXa/X/phos-pholipid-opløsning ved 37 °C. Reaktionsblandingen 15 blev inkuberet med 50 ^ul CaC^ og fik lov at reagere i 10 minutter ved 37 °C. Det chromogene substrat (50 ^-ul) tilsattes, og reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 100 ^,ul 50 % eddikesyre efter 10 minutter.

20 2 Topfraktionen blev fortyndet 1:100 i 0,05 M "Tris", pH 7,2, indeholdende 0,15 M NaCl til prøvninger.

3 Antistoffet var 10 ^ul symbiotisk antistof tilsat den fortyndede prøve og inkuberet 5 minutter ved stuetemperatur.

25 d. Koagulerende aktivitet af renset faktor VIII

Den i cellemediet detekterede aktivitet blev renset og koncentreret ved passage over en monoklonal C8-har-piks (ovenfor). Topfraktionen blev dialyseret over for 0,05 M imidazol, pH 6,9, indeholdende 0,15 M NaCl, 0,02 30 M glycin-ethylester, 0,01 M CaCl^ og 10 glycerol for

DK 164876 B

80 at fjerne elueringspufferen. Aktivitetstop fraktionen blev prøvet ved koagulationsanalyse i faktor-VIII-defi-cient plasma (tabel 4). En fibrinklump blev iagttaget efter 84 sekunder. Uden nogen tilsætning dannede haemo-5 philiaplasmaet en klump i løbet af 104,0 sekunder. Derfor korrigerede den eluerede fraktion koaguleringsdefekten hos haemophilia-plasma. Normalt humant plasma blev fortyndet og prøvet på samme måde. En standardkurve fremstillet ud fra dette plasma viste, at den eluerede frak-10 tion havde en koagulerende faktor-VIII-aktivitet på tilnærmelsesvis 0,01 enh./ml.

TABEL 4

Koagulerende aktivitet af med monoklonalt antistof renset faktor VIII

15 Prøve Koaguleringstid (s)

Rekombinant faktor VIII ^3 86,5

Rekombinant faktor VIII ^3 og C7F7- antistof 101,3

Kontrol2 101,3 20 Rekombinant faktor VIII 82,4

Rekombinant faktor VIII ^ og 10X symbiotisk antistof 110,6

Kontrol2_ 95,5 1 Faktor VIII var topfraktionen elueret fra den monoklo- 25 nåle C8-harpiks og dialyseret i 1 1/2 (la) eller 2 (lb) timer for at fjerne elueringspufferen.

2 Kontrolpufferen var 0,05 M "Tris", pH 7,3, indeholdende 0,2 % okseserumalbumin.

e. Thrombinaktiverinq af renset faktor VIII

30 Aktivering af koagulerende aktivitet ved hjælp af throm-

DK 164876 B

81 bin er en velkendt egenskab ved faktor VIII. Den eluerede fraktion fra den monoklonale søjle blev analyseret for denne egenskab. Efter dialyse af prøven for at fjerne elueringspufferen (ovenfor) blev 100 ^ul af eluatet 5 fortyndet med 100 ^,ul 0,05 M imidazol, pH 7,6, indehol dende 0,15 M NaCl, 0,02 M glycin-ethylester, 0,01 M CaCl2 og 10 % glycerol. Denne fortynding gennemførtes for yderligere at fortynde eventuel resterende elue-ringspuffer (som eventuelt kunne skade thrombinfunktio-10 nen) såvel som at forøge reaktionsblandingens pH-værdi.

Der sattes thrombin (25 ng) til opløsningen, og reaktionen gennemførtes ved stuetemperatur. Aliquoter på 25 ^ul blev udtaget til forskellige tidspunkter, fortyndet 1:3 og prøvet for koaguleringsaktivitet. Resultaterne 15 er vist i fig. 17. Faktor-VIII-aktiviteten steg med tiden og faldt derefter, som forventet for en faktor-VIII-aktivitet. Den tilsatte mængde thrombin koagulerede ikke faktor-VIII-deficient plasma i tidsrum, som blev iagttaget for disse prøvninger, og den observerede tids-20 afhængige forøgelse og efterfølgende formindskelse i observeret koagulationstid beviste, at den kontrollerede aktivitet faktisk skyldtes thrombinaktivering af faktor VIII. Den iagttagne tilnærmelsesvis 20 ganges aktivering ved hjælp af thombin er i overensstemmelse med den, 25 der observeres for plasma-faktor-VI11.

f. Binding af rekombinant faktor VIII til immobiliseret /S) von Willebrand-"SepharoselAt^_.___

Faktor VIII vides at cirkulere i plasma i et reversibelt kompleks med von Willebrand-faktor (vWF) (10-20). En 30 nyttig form for rekombinant faktor VIII bør derfor også have denne evne til at danne et sådant kompleks for at bekræfte identitet som faktor VIII. Desuden ville evnen til at danne et sådant kompleks bevise evnen hos en rekombinant faktor VIII til at danne den naturlige

DK 164876B

82 cirkulerende form af aktivitet som faktor VIII/vWF-kom-plekset efter infusion til blødere. For at prøve den rekombinante faktor VIII's evne til at samvirke med vWF blev vWF renset og immobiliseret på en harpiks som 5 følger:

Human von Willebrand-faktor blev fremstillet ved chromato-grafi af humane faktor-VIII-koncentrater (skaffet fra f.eks. Cutter Laboratories) på en "Sepharose® CL4B"-har-piks ækvilibreret med 0,5 M "Tris", pH 7,3, indeholdende 10 0,15 M NaCl. von Willebrand-faktoren elueres i det tomme volumen af søjlen. Dette område blev hældt sammen, koncentreret ved udfældning med ammoniumsulfat ved 40 % mætning og rechromatograferet på søjlen i nærvær af den ovennævnte puffer indeholdende 0,25 M CaC^ for 15 at adskille den koagulerende faktor-VIII-aktivitet fra von Willebrand-faktoren. Fraktionerne i det tomme volumen blev igen hældt sammen, koncentreret under anvendelse af ammoniumsulfat og dialyseret over for 0,1 M natrium-hydrogencarbonat. Det resulterende præparat blev kovalent 20 knyttet til cyanbromid-aktiveret "Sepharose'*-'' (købt fra Pharmacia) som anbefalet af producenten. Søjlen blev vasket med 0,02 M "Tris", pH 7,3, indeholdende 0,05 M NaCl og 0,25 M CaC^ for at fjerne ubundne proteiner. Den rekombinante faktor VIII blev fremstillet 25 i serumfrit medium og påført en 1,0 ml søjle af vWF-har-piksen ved stuetemperatur.

Søjlen blev vasket for at fjerne ubundet protein og elueret med 0,02 M "Tris", pH 7,3, indeholdende 0,05 M NaCl og 0,25 M CaC^. Fraktioner på 1,0 ml blev opsam-30 let, fortyndet 1:10 og prøvet. Resultaterne er vist i tabel 5. Faktor-VIII-aktiviteten absorberes fra mediet på søjlen. Aktiviteten kan derefter elueres fra søjlen under anvendelse af høj saltkoncentration (tabel 5) som forventet for den humane faktor VIII. Derfor har

DK 164876 B

83 den af BHK-cellerne producerede faktor VIII evnen til specifik samvirken med von Willebrand-faktorproteinet.

TABEL 3

Absorbans ^ 5 Prøve ved 405 ntn

Cellemedier 0,143

Vaskning 0,015

Eluerede fraktioner 1 0,000 10 2 °’410 3 0,093 4 0,017 5 0,000 _6_ 0,000 1 Prøvningsprocedurerne var dem, som er anbefalet af producenten, undtagen at alle volumener blev formindsket med halvdelen.

10. Analyse af fusionsproteiner 2Q Formålet med dette sæt af forsøg var at bevise immuno logisk identitet af det protein, som kodes for af klonen, med polypeptiderne i plasma. Dette blev gennemført ved at udtrykke portioner af genet som fusionsproteiner i E. coli. Alle eller en del af kodesekvenserne i det 2^. klonede gen kan udtrykkes i former udformet til at give materiale, der er egnet til at fremkalde antistoffer.

Disse antistoffer, som er specifikke for ønskede områder af det klonede protein, kan være til nytte ved analyse og rensning af proteiner. En række E. coli/faktor-VIII-"fusionsproteiner" blev fremstillet til dette formål. Fragmenter af faktor-VIII-kloner blev ligeret ind i Bglll-stedet i plasmidet pNCV (70) på en sådan måde, at faktor-VIII-kodesekvenserne blev sammenføjet i rigtig

DK 164876 B

84 læseramme med de første 12 aminosyrer af det sammensmeltede E. coli trp LE-protein (48, 70, 71). Sædvanligvis produceres væsentlige mængder af rekombinant proteinprodukt ud fra dette stærke trp-promotor-system.

5 pfusl blev konstrueret ved isolering af et 189 b Stul/

HindI-fragment af faktor-VIII-genet (koder for aminosy-rerne 1799-1860) og ligering af dette ind i Smal-stedet i pUD13 (49k). Dette mellemproduktplasmid blev nedbrudt med BamHI og EcoRI, og 200 b fragmentet indsat i pNCV 10 (70), hvorfra 526 b Bglll-til-EcoRI-fragmentet var ble vet fjernet. Dette plasmid, pfusl, producerer under trp-promotor-styring et 10 kD fusionsprotein bestående af 16 trpLE- og linker-kodede aminosyrer, efterfulgt af 61 rester af faktor Ulli og til sidst 9 linker-kodede 15 og trpE-carboxyterminale rester.

pfus3 blev konstrueret ved fjernelse af et 290 b Avall-fragment af faktor-VIII-genet (koder for aminosyrer-ne 1000-1096), udfyldning i de overhængende nucleotider under anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase 20 og ligering af dette, nu stumpendede, DNA-fragment ind i pNCV, som var blevet skåret med BglH og udfyldt på lignende måde. Dette plasmid, med det udfyldte fragment i denne rette orientering (bestemt ved restriktions-nedbrydninger og DNA-sekvens-analyse) dirigerer syntesen 25 af et ca. 40 kD fusionsprotein indeholdende 97 amino syrer af faktor VIII indlejret i trpLE-proteinets 192 aminosyrer.

pfus4 blev fremstillet ved skæring af faktor-VIII-sub-klonen, A.222.8, med BanI, nedspisning af overhænget 30 med nuclease S^, efterfulgt af Pstl-nedbrydning og isole ring af det resulterende 525 b stump-Pstl-fragment (koder for aminosyrerne 710-885). Dette blev ligeret ind i pNCV, som var blevet nedbrudt med Bglll, og derpå behand- 85 let med S^, nedbrudt med PstI, og vektorfragmentet isole ret. pfus4 dirigerer syntesen af et 22 kD fusionsprotein indeholdende 175 aminosyrer af faktor VIII efterfulgt af de oprindelige 12 aminosyrer af trpLE.

5 Fusionsproteinerne blev renset og injiceret i kaniner for at frembringe antistoffer som beskrevet ovenfor.

Disse antistoffer blev prøvet for binding til plasma-afledt faktor VIII ved Western-afdupning-analyse.

Resultaterne af en sådan Western-overførsel er vist 10 i fig. 13. Hvert af fusionsproteinerne reagerer med plasma-faktor VIII. Fusion 1 blev dannet ud fra det område af genet, som koder for et 80 000 dalton polypep-tid. Det kan ses, at fusion 1 antisera kun reagerer med 80 000 dalton-båndet og ikke reagerer med proteiner-15 ne med højere molekylvægt. Fusion 3 og 4 antisera viser krydsreaktivitet med proteinerne på mere end 80 000 dalton og reagerer ikke med 80 000 dalton-båndet. Det monoklonale antistof C8 er et aktivitetsneutraliserende monoklonalt antistof rettet mod faktor VIII og vides 20 at reagere med 210 000 dalton-proteinet. Fig. 14 påviser, at fusion 4 protein vil reagere med dette monoklonale antistof, hvilket viser, at den af C8 genkendte amino-syresekvens indgår i fusion 4 polypeptidet. Dette understøtter yderligere identiteten af fusion 4 protein som 25 indeholdende proteinsekvenser, der omfatter 210 000 daltonproteinet. De ovenstående undersøgelser beviser afgørende, at genet har indkodet aminosyresekvensen for både 210 000 og 80 000 dalton-proteinerne.

11. Farmaceutiske præparater 30 Forbindelserne ifølge opfindelsen kan sammensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved det her omhandlede humane faktor-VIII-

DK 164876 B

86 produkt kombineres i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bæremedium. Egnede medier og deres sammensætning, inklusive andre humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceuti-5 cal Sciences by E.W. Martin, der betragtes som inkorpo reret i denne beskrivelse ved denne henvisning. Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det her omhandlede protein sammen med en egnet mængde medium til fremstilling af farmaceutisk acceptable præparater, 10 som er egnede til effektiv indgivning til værten. F.eks.

kan den her omhandlede humane faktor VIII indgives paren-teralt til individer, som lider af f.eks. haemophilia A.

Den gennemsnitlige løbende dosering til behandling af 15 en bløder varierer med alvoren af blødningsepisoden.

De gennemsnitlige doser indgivet intravenøst er i området 40 enh./kg for præoperative indikationer, 15 - 20 enh./kg for mindre blødning og 20 - 40 enh./kg indgivet over en 8 timers periode med henblik på en opretholdelses-20 dosis.

Bibliografi

DK 164876 B

87 1. Hemostasis and Thrombosis. Bloom and Thomas, Eds., Churchill, Livingstone, NY (1981).

2. Davie, et al_., Ann. Rev. Biochem. 44. 799 (1975).

3. Jackson, et al_., Ann. Rev. Biochem. 49, 767 (1980).

4. Wright, J. Am. Med. Assoc. 170, 325 (1959).

5. Schmer, et al_., J. Biol. Chem. 247, 2512 (1972).

6. Legaz, et al_., J. Biol. Chem. 247, 3946 (1973).

7. Shapiro, et al_., J. Cl in. Invest. 52, 2198 (1973).

8. Nilsson, et aT_., Acta. Hed Scan!. 159, 179 (1957).

9. McKee, Ann. NY Acad. Sci. 240, 8 (1975).

10. Thelin, et al_., Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 (1961).

11. Griggs, et al_., Proc. Natl. Acad. Sci, 70, 2814 (1973).

12. Donati, et al_., Thromb. Res. 2, 97 (1973).

13. Weiss, et al_., Br. J. Haematol 18, 89 (1970).

14. Weiss, et al_., Thromb. Diath. Haemorrh 27, 212 (1972).

15. Weiss, et al_., Science 182, 1149 (1973).

16. Rick, et al_., Blood 42, 737 (1973).

17. Rick, et al., Thromb. Res. 7, 909 (1975).

18. Thelin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 (1961).

19. Owen, et jH., Thromb. Diath. Haemorrh. 27, 502 (1972).

20. Cooper, et al_., Proc. Natl. Acad. Sci. 70, 2326 (1973).

21. Vehar, et al_., Biochemistry 19, 401 (1980).

22. Fulcher, et a]_., Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 1648 (1982).

23. Fulcher, et al_., Blood 61, 807 (1983).

24. Fulcher, et al_., Blood 63, 486 (1984).

DK 164876B

88 25. Fass, et al_., Blood 59, 594 (1982).

26. Knutson, et £L, Biood 59, 615 (1982).

27. Fay, et al_., Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 7200 (1982).

28. Gordon, et al., Thrombosis Res. 6, 127 (1975).

29. Sacharski, et al_., Mayo Clinic Proc. 44, 784 (1969).

30. Green, et al_., Biood 37, 47 (1971).

31. Schwinn, et al_., U.S. Patent 4067964.

31a. Zimmerman, et al_., Haemostasis and Thrombosis, Bloom and Thomas, Eds., Churchill, Livingstone, NY, p.lll (1981).

32. Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977).

33. Chang, et al_., Nature 275, 615 (1978).

34. Itakura, _et al_., Science 198, 1056 (1977).

35. Goeddel, et al_., Nature 281, 544 (1979).

36. Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).

37. European Patent Appln. Publ. No. 0036776.

38. Siebenlist, et al·, Cel! 20, 269 (1980).

39. Stinchcomb, et al., Nature 282, 39 (1979).

40. Kingsman, et al_., Gene 7, 141 (1979).

41. Tschemper, et al., Gene 10, 157 (1980).

42. Jones, Genetics 85, 12 (1977).

43. Hitzeman, et aK, J. Biol. Chem, 255, 2073 (1980).

44. Hess, et al_., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968).

45. Holland, et jQ_., Biochemistry 17, 4900 (1978).

46. Graham, et al_., Virology 52, 546 (1978).

47. Cohen, et al_., PNAS (USA) 69, 2110 (1972).

DK 164876B

89 47a. Crea, et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) 47b. Beaucage, et όΠ_., Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981) 48. Mani atis, et a]_., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982).

48a. Lawn, et al_., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

49. Karn, et ajL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172 (1930).

49a. Southern, J. Molec, Biol. 98, 503 (1975).

49b. Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5794 (1980).

49c. Taylor, et a}_., Biochem. biophys. Acta 442, 324 (1975).

49f. Ullrich, et al_., Science 196, 1313 (1977).

49g. Berger, et al_., Biochemistry 18, 5143 (1979).

49h. Aviv, et a]L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).

491. Sanger, aj_.> Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).

49j. Gingeras, et al_., J. Biol. Chem. 257 13475 (1982).

49k. horrander, et al_., Gene 26, 101 (1983).

491. Picken, et al_., Inf, and Immun. 42, 269 (1983).

49m. Beck, et al_., Gene 19, 327 (1982).

49n. Simonson, et_al_.t Mol. Cell Biol. 3, 2250 (1983).

49o. Southern, et al_., J. Mol, and Applied Gen. 1, 327 (1982).

49p. Graham, et al_., Virology 52, 456 (1978).

49q. Wigler, et al_., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 77,'3567 (1980).

49r. Simonson, et al_., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495 (1983).

49s. Rotblat, et aj_., Thromb. Res. 21, 431 (1981).

49t. Rotblat, et _al_., J. Lab. Clin. Med. 101, 735 (1983).

49u. Kearney, et al_., J. Immun. 123, 1548 (1979).

DK 164876B

90 49v. Kohier ,et al_.f Nature 256, 495 (1975).

49w. Benton, et al·» Virol. 117, 490 (1982).

49x. Ghalon, et al-, J. Immun. 9, 359 (1979).

49y. U.S.S.N. 459152, filed 19 Jan. 83.

50. Ish-Horowitz, et al·, Nuel. Acids Res. 9, 2989 (1981).

51. Stel, et al·, Nature 303, 530 (1983).

52. Kelly, et al., Brit. J. Haem. (1984).

53. Exmer, et al·, Thrombosis Res. 32, 427 (1983).

54. Oaffe, et a\_., J. Cl in. Invest. 53, 36a (1974).

55. Fay, et al·, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 79, 7200 (1982).

56. Zimmerman, et al., Haemostasis and Thrombosis Bloom, A.L. and Duncan, P.T. (Churchill Livinstone, New York) pp. 111-123 (1981).

56a. Meili, et il·> Thromb. Diathes. Haemorrh. 24, 161 (1970).

57. Grantham, et aL·, Nuclei Arts Res. 8, r49 (1980).

58. Kurachi, et aK, Proc. natl. Acad. Sci. USA 79, 6461 (1982).

59. Viera, et aK, Gene 19, 259 (1982).

60. Breathnach, et al·, Ann. Rev. Biochem 50, 349 (1981).

61. Sharp, Cell 23, 643 (1981).

62. Fritsch, et å\_., Cel! 19, 959 (1980).

63. Collins, et al·, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4242 (1978).

66. Kafatos, et aK, Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

67. Capon, _et aL·, Nature 304, 507 (1983).

67a. Capon, et al., Nature 301, 33 (1983).

DK 164876 B

91 68. Huynh, et Practical Approaches in Biochemistry (IRL Press Ltd., Oxford, England) (1984).

69. Perlman, et al_., J. Mol. Biol. 167, 391 (1983).

70. Kleid, et «Π.» Science 214, 1125 (1981).

71. Goeddel, et al_., Nature 287, 411 (1980).

73. Crowley, et al_., Nol. Cel! Biol. 3, 44 (1983).

74. Liu, et a£., DMA I» 213 (1982).

75. Lusky, et al_., Nature 293, 79 (1981).

76. Hanahan, J, Hol. Biol. 166, 557 (1983).

77. Gluzraan Cel! 23, 175 (1981).

78. Grunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975).

79. Tuddenham, et al., Symposium cn Factors VIII/von Willebrand Factor, October 7-9, 1982, p.l.

80. Morrissey, Anal. Bioclem 117, 307 (1981).

81. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

82. Greenwood, ££., Biochem. J. 89, 114 (1963).

83. Maniatis, et al., Cel! 15, 687 (1963).

84. Sompayrac. et a£., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7575 (1981).

86. Messing, et al_., Nucl. Acids Res. 9, 304 (1981).

87. Wood, et al_., 0. Biol. Chem. 256, 1502 (1981).

88. Shen, et al_., Cel! 19, 379 (1981).

89. Proudfoot, et al_., Nature 252, 359 (1976).

Claims

92 DK 164876 B | l

1. DNA-sekvens, som koder for human faktor VIII poly-peptid med den i fig. 10 viste aminosyresekvens eller et derivat deraf, som har evnen til at korrigere human faktor VIII mangel.

2. Rekombinant udtrykkelsesvektor, som operabelt inde holder DNA-sekvensen ifølge krav 1.

3. Vektor ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er vektoren pAML3P.8cl, der er anvendt til at transficere BHK-cellelinien ATCC nr. CRL8544.

4. Cellelinie, som er i stand til at producere rekom binant funktionel human faktor VIII, hvilke celler er blevet transficeret med udtrykkelsesvektoren ifølge krav 3.

5. Cellelinie ifølge krav 4, som er opnået ved trans- 15 fektion af BHK-celler.

6. Cellelinie ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den er ATCC nr. CRL8544.

7. Rekombinant organisme transficeret med DNA-sekvensen ifølge krav 1, således at den er i stand til at udtryk- 20 ke den DNA.

8. Fremgangsmåde, som omfatter fremstillingen af et polypeptid med den i fig. 10 viste aminosyresekvens eller et derivat deraf, som har evnen til at korrigere human faktor VIII mangel, hvilken fremgangsmåde omfat- 25 ter anvendelse af organismen ifølge krav 7.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvorved værtsorganismen DK 164876 B 93 er en eukaryotisk celle.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved den eukaryo-tiske celle er en kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-cellelinie .

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved den eukaryo- tiske cellelinie er en babyhamsternyre-(BHK)-cellelinie.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 8-11, som yderligere omfatter trinnet til udvinding af polypep-tidproduktet.

13. Anvendelse af polypeptidet fremstillet ved frem gangsmåden ifølge ethvert af kravene 8-12, til fremstilling af et lægemiddel.

14. Farmaceutisk præparat indeholdende et faktor VIII polypeptid udelukkende fra en enkelt aminosyresekvens 15 som vist i fig. 10 eller et derivat deraf med evnen til at korrigere human faktor VIII mangel, fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 8-12, sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

15. Farmaceutisk præparat ifølge krav 14, som er i det 20 væsentlige frit for andre proteiner eller andre mate rialer, der almindeligvis ledsager human faktor VIII, når den er isoleret fra dens native plasmaholdige miljø.