DE3485818T2

DE3485818T2 - Herstellung des faktors viii und damit verwandte erzeugnisse.

Info

Publication number: DE3485818T2
Application number: DE8484904025T
Authority: DE
Inventors: J Toole
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1984-10-12
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2004-10-13
Also published as: DE3485818D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Desoxyribonukleinsäure (DNA), die für die zelluläre Produktion von menschlichem Faktor VIII:C codiert, und von DNA, die für Faktor VIII:C vom Schwein codiert. Sie betrifft Verfahren zum Erhalt von DNA-Molekülen, die für Faktor VIII:C codieren, und die Expression von Faktor VIII:C von Mensch und Schwein unter Verwendung solcher DNA sowie neuartige Verbindungen, einschließlich Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide, die verwendet wurden, um solche Klone zu erhalten und menschlichen Faktor VIII:C zu exprimieren. Die Erfindung betrifft ferner menschlichen AHF und seine Herstellung mittels Techniken der DNA-Rekombination.
Faktor VIII:C ist ein Blutplasmaprotein, das im Falle von Hämophilie A defekt oder nicht vorhanden ist. Hierbei handelt es sich um eine vererbbare Bluterkrankheit, von der angenähert einer von 20.000 Männern betroffen ist. Faktor VIII:C ist auch unter den Bezeichnungen Faktor VIII, Antihämophiliefaktor (AHF), Antihämophilieglobulin (AHG), Hämophiliefaktor A, Blutplättchen-Cofaktor, Thromboplasminogen und Thrombocytolysin bekannt. Die Bezeichnung "Faktor VIII:C" soll anzeigen, daß es sich um diejenige Verbindung handelt, die die Blutgerinnung (Clotting) bewirkt. Die Bezeichnungen "Faktor VIII:C" und "AHF" werden hier synonym verwendet.
Obgleich die Isolierung von AHF aus Blutplasma in der Literatur beschrieben wurde, war die genaue Struktur von AHF bislang nicht identifiziert worden. Ursache hierfür war zum Teil, daß ausreichende Mengen reinen Materials nicht erhältlich waren sowie die proteolytische Natur vieler Verunreinigungen und Reinigungsmittel. Obwohl unreines AHF in gewissen Mengen als konzentrierte Präparation aus frisch eingefrorenem menschlichen Plasma erhältlich ist, machen die äußerst niedrige Konzentration von AHF im Blutplasma und die hohen Kosten, die mit der Gewinnung und der Verarbeitung von menschlichem Plasma verbunden sind, den Preis dieses Materials für eine ausgedehnte Behandlung von Hämophilie unerschwinglich.
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, menschlichen AHF unter Verwendung der Techniken der DNA-Rekombination herzustellen.
AHF setzt sich wie andere Proteine aus ungefähr 20 verschiedenen Aminosäuren zusammen, die in einer spezifischen Reihenfolge angeordnet sind. Mit den Techniken der Genmanipulation wurde eine Methode entwickelt, die die Herstellung von AHF ermöglicht, indem man das Gen, das für das menschliche AHF-Protein codiert, identifiziert und cloniert, in einen rekombinanten DNA-Vektor einbaut, einen geeigneten Wirt mit dem Vektor, der das Gen enthält, transformiert, das menschliche AHF-Gen in einem solchen Wirt exprimiert und das hierbei erzeugte menschliche AHF gewinnt. Auf ähnliche Weise ermöglicht es die vorliegende Erfindung, mit den Techniken der DNA-Rekombination AHF vom Schwein herzustellen sowie Produkte und Verfahren bereitzustellen, die mit einer solchen Herstellung von Schweine-AHF in Zusammenhang stehen.
Neuerdings entwickelte Techniken haben es ermöglicht, für die Synthese kommerziell verwertbarer Proteine und Peptide, ungeachtet ihres natürlichen Ursprungs, Mikroorganismen einzusetzen, die zu schnellem und reichlichem Wachstum in der Lage sind. Diese Techniken ermöglichen es, einen geeigneten Mikroorganismus genetisch mit der Fähigkeit auszustatten, ein Protein oder Peptid zu synthetisieren, das normalerweise von einem anderen Organismus hergestellt wird. Die Technik nützt die grundlegende Beziehung, die in allen lebenden Organismen zwischen dem genetischen Material, gewöhnlich DNA, und den durch die Organismen synthetisierten Proteinen besteht. Diese Beziehung besteht darin, daß die Synthese der Aminosäuresequenz des Proteins durch eine Reihe von Trinukleotidsequenzen der DNA codiert wird. Ein oder mehrere Trinukleotidsequenzen (genannt Codons) codieren spezifisch für die Bildung einer jeden der zwanzig häufigsten Aminosäuren in Proteinen. Die spezifische Beziehung zwischen jedem gegebenen Trinukleotid und der entsprechenden Aminosäure, für es sie codiert, stellt den genetischen Code dar. Entsprechend dieser bekannten Beziehung spiegelt sich die Aminosäuresequenz eines jeden Proteins oder Peptids folglich in einer entsprechenden Nukleotidsequenz wider. Ferner kann diese Nucleotidsequenz im Prinzip durch jeden lebenden Organismus translatiert werden. Für eine Erörterung des genetischen Codes wird auf J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, (W.A. Benjamin, Inc., 1977) insbesondere S. 347-77; C.F. Norton, Microbiology (Addison, Wesley 1981), sowie die US-PS Nr. 4 363 877 verwiesen.
Die zwanzig Aminosäuren, aus denen die Proteine gebildet werden, sind Phenylalanin (im folgenden manchmal als "Phe" oder "F" bezeichnet), Leucin ("Leu", "L"), Isoleucin ("Ile", "I"), Methionin ("Met", "M"), Valin ("Val", "V"), Serin (Ser", "S"), Prolin ("Pro", "P"), Threonin ("Thr", "T"), Alanin ("Ala", "A"), Tyrosin ("Tyr", "Y"), Histidin ("His", "H"), Glutamin ("Gln", "Q"), Asparagin ("Asp", "N"), Glutaminsäure ("Glu", "E"), Cystein ("Cys", "C"), Tryptophan ("Trp", "W"), Arginin ("Arg", "R") und Glycin ("Gly", "G"). Die Aminosäuren sowie die sie codierenden verschiedenen Kombinationen von Trinukleotiden, die in einem gegebenen Codon enthalten sein können, sind der Tabelle 1 zu entnehmen: TABELLE 1 Der genetische Code Erste Position Zweite Position Dritte Position Stop* * Das "Stop"- oder Terminationscodon beendet die Expression des Proteins.
Die Kenntnis der Desoxyribonukleotid- oder DNA-Sequenz des Gens, das für ein bestimmtes Protein codiert, erlaubt die genaue Beschreibung der Aminosäuresequenz dieses Proteins. Umgekehrt trifft dies jedoch nicht zu; während Methionin nur durch ein Codon codiert wird, können die anderen Aminosäuren, wie aus Tabelle 1 ersichtlich, durch bis zu sechs Codons (z.B. Serin) codiert werden. Es besteht daher eine beträchtliche Ungewißheit bei der Vorhersage der Nukleotidsequenz aus der Aminosäuresequenz.
Insgesamt war vor der vorliegenden Erfindung sehr wenig über die Struktur von AHF bekannt, und trotz beträchtlicher Arbeit über viele Jahre war der Fachmann nicht in der Lage, die Struktur von AHF oder seines Gens zu bestimmen oder ein Verfahren bereitzustellen, durch das AHF in im wesentlichen reiner Form und in bedeutenden Mengen hätte hergestellt werden können.
Das hier beschriebene Verfahren, durch das das Gen für menschlichen AHF cloniert und exprimiert wird, beinhaltet die folgenden Schritte:
(1) Reinigung von Schweine-AHF;
(2) Bestimmung der Aminosäuresequenz von Schweine-AHF;
(3) Synthese von Oligonukleotid-Sonden und Verwendung dieser Sonden, um zumindest ein Fragment des Gens, das für Schweine-AHF codiert, zu identifizieren und/oder zu isolieren;
(4) Verwendung des Genfragments des Schweine-AHF, um menschliches genetisches Material, das für menschlichen AHF codiert, zu identifizieren und zu isolieren;
(5) Verwendung der oben beschriebenen DNA-Fragmente von AHF, um den Syntheseort von AHF unter den verschiedenen Säugetiergeweben zu bestimmen;
(6) Herstellung von cDNA-Segmenten, die für AHF von Mensch und Schwein codieren, mittels Messenger-RNA, die aus der Gewebeidentifizierung in Schritt (5) erhalten wurde;
(7) Konstruktion von cDNA-Klonen von Mensch und Schwein in voller Länge aus den cDNA-Segmenten nach Schritt (6), z.B. durch Ligation von cDNA- Segmenten, die durch dieselben Restriktionsenzyme gespalten wurden;
(8) Bildung von DNA-Expressionsvektoren, die die Synthese von AHF zu steuern vermögen;
(9) Transformation eines geeigneten Wirts mit den Expressionsvektoren, die die cDNA für AHF von Mensch oder Schwein in voller Länge tragen;
(10) Expression von AHF von Mensch oder Schwein im Wirt; und
(11) Gewinnung des exprimierten AHF.
Im Laufe dieser Arbeit wurde eine neue Technik entwickelt, eine genomische DNA-Bank zu testen (screenen), wobei Oligonukleotid-Sonden auf der Basis der Aminosäuresequenzen des AHF-Moleküls verwendet wurden.
Die Erfindung umfaßt die obigen Verfahren, zusammen mit den verschiedenen Nukleotiden, Vektoren und anderen Produkten, die in Verbindung damit hergestellt wurden.

Kurze Zusammenfassung der Zeichnungen

Abbildung 1 ist eine Darstellung der Aminosäuresequenz (A), die für die aminoterminale Sequenz des in Beispiel 1 beschriebenen Thrombin-Spaltprodukts von 69.000 Dalton bestimmt wurde. Der erste Rest war nicht identifizierbar. Diese Sequenz wird mit der aus der Nukleotidsequenz des in Beispiel 3 beschriebenen Exons von Schweine-AHF abgeleiteten Sequenz (B) und mit der in Beispiel 4 beschriebenen Exon-Sequenz (C) des menschlichen AHF verglichen .
Abbildung 2 stellt die Aminosäuresequenz (im Ein-Buchstaben-Code) von Fragmenten eines Verdaus mit Rinderthrombin dar, nämlich (A) des Aminoterminus und (B) eines 40Kd Thrombin-Spaltprodukts des 166Kd AHF-Fragments vom Schwein, das von Fass et al., unten, isoliert wurde.
Abbildung 3 stellt den Aufbau einer Oligonukleotid-Sonde zur Identifizierung und Isolierung zumindest eines Teils des Schweinegens dar, das für AHF codiert.
Abbildung 4 stellt die DNA-Sequenz eines Sma I-DNA-Fragments (34-S1) dar, das ein AHF-Exon des Schweins enthält und sich aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Bakteriophagen PB34 ableitet.
Abbildung 5 ist eine Darstellung der DNA-Sequenz des Hae III-Inserts 34-H1, das, wie in Beispiel 3 beschrieben, das Exon für Schweine-AHF enthält. Diese Sequenz wird durch die in Abbildung 4 gezeigte längere Sequenz umfaßt und entspricht den Nukleotiden 250-615 der Sequenz in Abbildung 4.
Abbildung 6 ist eine Darstellung der DNA-Sequenz, die einen Teil des Exons des menschlichen AHF zeigt, wie es in Beispiel 4 beschrieben wurde.
Abbildung 7 zeigt die DNA-Nukleotidsequenz (nur als Einzelstrang), die die gesamte für menschlichen AHF codierende Sequenz enthält, zusammen mit der für menschlichen AHF abgeleiteten Aminosäuresequenz.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses dieser Materie gegeben. Soweit die Definitionen von Bedeutungen, wie sie innerhalb von Fachkreisen zu finden sind, abweichen, sollen die folgenden Definitionen maßgeblich sein.
Amplifikation bedeutet den Vorgang, bei dem Zellen Genwiederholungen innerhalb ihrer chromosomalen DNA erzeugen.
Co-Transformation bedeutet das Verfahren zur Transformation einer Zelle mit mehr als einem für die Zelle fremden exogenen Gen, von denen eines der Zelle einen selektierbaren Phänotyp vermittelt.
Stromabwärts bedeutet die Richtung zum 3'-Ende einer Nukleotidsequenz.
Ein Enhancer ist eine Nukleotidsequenz, die die Transkription von Genen unabhängig von der Identität des Gens, der Lage der Sequenz bezüglich des Gens oder der Orientierung der Sequenz ermöglicht.
Ein Gen ist eine Desoxyribonukleotid-Sequenz, die für ein gegebenes reifes Protein codiert. Für den vorliegenden Zweck soll ein Gen keine untranslatierten flankierenden Bereiche, wie RNA-Transkriptionsinitiationssignale, Polyadenylierungsstellen, Promotoren oder Enhancer, umfassen.
Ein Selektionsgen ist ein Gen, das Zellen, die das Gen als nachweisbares Protein exprimieren, einen Phänotyp verleiht.
Ein Selektionsmittel ist ein Zustand oder eine Substanz, die es ermöglicht, die Expression eines Selektionsgens nachzuweisen.
Phänotyp bedeutet die zu beobachtenden Eigenschaften einer Zelle, wie sie durch den zellulären Genotyp ausgeprägt werden.
Genotyp bedeutet die genetische Information, die in einer Zelle enthalten ist, im Gegensatz zu ihrer Ausprägung, die als Phänotyp zu beobachten ist.
Ligation ist das Verfahren zur Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen den 5'-und 3'-Enden zweier DNA-Stränge. Dies kann durch mehrere bekannte enzymatische Techniken, einschließlich der Ligation glatter Enden durch T4-Ligase, erfolgen.
Orientierung bezieht sich auf die Reihenfolge von Nukleotiden in einer DNA- Sequenz. Eine invertierte Orientierung einer DNA-Sequenz ist eine Orientierung, bei der sich die 5'-3'-Reihenfolge der Sequenz bezüglich einer anderen Sequenz im Vergleich zu einem Referenzpunkt in der DNA, aus der die Sequenz erhalten wurde, umkehrt. Solche Referenzpunkte können die Transkriptionsrichtung anderer spezifischer DNA-Sequenzen in der Ursprungs-DNA oder den Replikationsursprung replizierbarer Vektoren mit dieser Sequenz beinhalten.
Transkription bedeutet die Synthese von RNA von einer DNA-Matrize.
Transformation bedeutet die Veränderung des Genotyps einer Zelle durch zelluläre Aufnahme exogener DNA. Transformation kann in manchen Fällen durch eine Änderung im Phänotyp der Zelle nachgewiesen werden. Transformierte Zellen werden Transformanden genannt. Zellen im Stadium vor der Transformation werden als Parentalzellen bezeichnet.
Translation bedeutet die Synthese eines Polypeptids von Messenger-RNA (mRNA).
Die vorliegende Erfindung erlaubt zum erstenmal die Identifizierung und Isolierung des Gens für den Faktor VIII:C des Schweins mit Techniken der DNA- Rekombination. Mit diesen Techniken ermöglicht sie ebenso zum erstenmal die Isolierung und Identifizierung des Gens, das menschlichen Faktor VIII:C codiert, indem die Homologie zwischen der AHF-DNA des Schweins und menschlicher AHF-DNA ausgenutzt wird, um das menschliche Gen für AHF zu lokalisieren und zu isolieren. Dieser Weg zu cDNA-Klonen für die Herstellung von AHF über die Homologie mit dem AHF-Gen des Schweins vermeidet den lästigen Zeitaufwand und die kostspielige Notwendigkeit, menschlichen AHF, der überaus teuer und kaum erhältlich ist, zu reinigen.
AHF vom Schwein wird zuerst hoch gereinigt, besonders bevorzugt durch eine Reinigungstechnik mit monoklonalen Antikörpern, wie sie von David Fass et al., "Monoclonal Antibodies to Porcine AHF Coagulant and Their Use in the Isolation of Active Coagulant Protein", Blood 59:594-600 (1982) und von Knutsen et al., "Porcine Factor VIII:C prepared by affinity Interaction with Von Willebrand Factor and Heterologous Antibodies", Blood, 59:615-24 (1982) beschrieben wird. Polypeptide von Faktor VIII:C des Schweins werden an monoklonale Anti-VIII:C-Antikörper gebunden, die an einer geeigneten Affinitätschromatographiesäule immobilisiert sind. Zwei hochmolekulare Polypeptide mit Molekulargewichten von ungefähr 166 und 130Kd werden mit Ethylendiamintetraessigsäure eluiert. Ein anderes Proteinsegment mit einem Molekulargewicht von ungefähr 76Kd wird dann mit ungefähr 50%-igem Ethylenglykol von der Säule eluiert. Die partiellen Aminosäuresequenzen dieser Polypeptide und/oder von Fragmenten dieser Polypeptide, die in bekannter Weise, z.B. durch enzymatischen Verdau der Proteine mit Rinder-Thrombin oder durch andere zum Abbau von Proteinen geeignete Agentien, erhalten wurden, werden anschließend durch bekannte Analysemethoden bestimmt. Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz dieses Materials werden Oligonukleotid-Sonden synthetisiert, von denen zumindest einige mit DNA-Segmenten hybridisieren, die für das entsprechende Segment des AHF codieren. Diese Oligonukleotide werden dann verwendet, um auf Segmente des Gens zu screenen, die für Schweine-AHF codieren.
Sobald ein Teil des Gens für den AHF vom Schwein erhalten wurde, wird das rekombinante Material dazu verwendet, eine menschliche genomische DNA-Bank zu screenen und das Gen, das für menschlichen AHF codiert, zu lokalisieren und zu isolieren. Dieses Verfahren bestätigt, daß zwischen menschlichem AHF und AHF vom Schwein grundlegende Ähnlichkeiten existieren, und diese Ähnlichkeiten werden vorteilhaft genutzt, um das menschliche Faktor VIII:C-Gen oder Gensegmente davon zu isolieren und zu identifizieren.
Die Ähnlichkeiten in den Proteinen von Schwein und Mensch sind entsprechenden Ähnlichkeiten in den DNA-Sequenzen zuzuschreiben, die für die Aminosäuresequenzen codieren. Das genetische Material, das für die AHF-Proteine in Mensch und Schwein codiert, ist in einem hohen Prozentsatz der Positionen identisch und zeigt folglich Hybridisierung, beispielsweise in dem Verfahren nach Benton und Davis, "Screening gt Recombinant Clones by Hybridization to Single Plaques In Situ", Science, 196:180 (1977).
Die klonierten Segmente des Gens für menschlichen AHF werden dann verwendet, um eine Quelle für mRNA für AHF aus verschiedenen menschlichen Geweben zu identifizieren. Ähnlich verwendet man ein oder mehrere der klonierten Segmente des Schweine-AHF, um potentielle Gewebequellen auf Schweine-mRNA zu screenen. Dieser Schritt wird nach konventionellen Methoden durchgeführt, die die Extraktion von RNA, Gelelektrophorese, Übertragung auf Nitrocelluloseschichten und Hybridisierung mit radioaktiv markierter klonierter DNA beinhalten (s. beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbour Laboratory, 1982)). Sobald diese Gewebequelle einmal identifiziert ist, werden cDNA-Banken hergestellt (entweder in Plasmid- oder vorzugsweise Bakteriophage Lambda-Vektoren, die beide allgemein erhältlich sind), die wie unten beschrieben auf cDNA-Klone für AHF getestet werden. Dieses Screenen der cDNA-Bank wird wiederholt, bis man einen Satz von cDNA-Klonen erhält, der nachweislich der DNA-Sequenzdeterminierung das gesamte für AHF codierende DNA-Gen umfaßt.
Sobald man den cDNA-Klon für AHF von Mensch oder Schwein in voller Länge erhalten hat, werden bekannte und geeignete Mittel eingesetzt, um das AHF-Protein zu exprimieren, z.B. Insertion in einen geeigneten Vektor, Transfektion in einen geeigneten Wirt, Selektion transformierter Zellen (Transformanden) und Kultivierung dieser Transformanden zur Expression der AHF-Aktivität.
Die Wirt-Vektor-Systeme zur Expression von AHF können prokariontisch sein, wegen der Komplexität von AHF werden jedoch eukariontische Expressionssysteme bevorzugt, besonders (zumindest für biologisch aktives AHF mit Coagulationsaktivität) ein Säugetiersystem. Man erreicht dies leicht durch Eukarionten-Transformation (gewöhnlich Säuger- oder Wirbeltierzellen) mit einem geeigneten AHF- Vektor. Eukarionten-Transformation ist ein allgemein bekanntes Verfahren und kann mit verschiedenen Standardmethoden durchgeführt werden. Sie umfassen die An- bzw. Verwendung von Protoplastenfusion, DNA-Mikroinjektion, Chromosomentransfektion, von lytischen und nichtlytischen viralen Vektoren (z.B. Mulligan et al., Nature (London) 277:108-114; 1979), Zell-Zell-Fusion (Fournier et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 74:319-323; 1977), von Lipidstrukturen (US-PS 4 394 448) und von zellulärer Endocytose von DNA-Präzipitaten (Bachetti et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 74:1590- 1594; 1977). Andere eukariontische Zellen, wie Hefen oder Insektenzellen, können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden.
Die durch lytische virale Vektoren vermittelte Transformation ist zwar effizient, aus einer Reihe von Gründen aber nachteilhaft: Die maximale Größe der transfizierten DNA wird durch die Geometrie des viralen Capsids begrenzt, die exogenen Gene werden während der viralen Replikation häufig deletiert, man benötigt ein Helfervirus oder spezialisierte Wirte, die Wirtszellen müssen permissiv sein, und die Wirte werden im Verlauf der viralen Infektion getötet.
Nichtlytische Transformationen basieren auf der Transkription und Translation von Virusvektoren, die als stabiles Episom in eine Zellinie inkorporiert wurden. Diese Systeme erfordern im allgemeinen besondere Zellinien und weisen eine Reihe von Nachteilen auf (s. Trends in Biochemical Sciences, Juni 1983, S. 209-212).
Auf der anderen Seite sind andere Transformationsverfahren, in denen extrachromosomale DNA in die Chromosomen der Wirtszellen aufgenommen wird, durch niedrige Transformationsfrequenzen und mäßige Expressionsraten gekennzeichnet. Diese anfänglichen Schwierigkeiten wurden durch die Transformation mit Genen, die der kleinen tatsächlich transformierten Subpopulation von Zellen einen vererbbaren selektierbaren Phänotyp verleihen (Selektionsgene), verbessert. Die gesamte Population transformierter Zellen kann unter Bedingungen vermehrt werden, die die Zellen, die den Phänotyp erhalten haben, begünstigen, so daß es bequem möglich ist, transformierte Zellen aufzufinden. Anschließend können die Transformanden nach ihrer Fähigkeit gesichtet werden, den Phänotyp stärker zu exprimieren. Dies wird erreicht, indem man das Selektionsmittel so ändert, daß sich eine höhere Expression nachweisen läßt.
Selektionsgene lassen sich in drei Kategorien einteilen: nachweisbar amplifizierte Selektionsgene, dominante Selektionsgene und nachweisbar amplifizierte dominante Selektionsgene.
Bei nachweisbar amplifizierten Selektionsgenen kann die Amplifikation nachgewiesen werden, indem man die Wirtszellen Veränderungen des Selektionsmittels aussetzt. Nachweisbar amplifizierte Gene, die nicht dominant sind, erfordern allgemein eine Parentalzellinie, der das Selektionsgen genotypisch fehlt. Beispiele umfassen die Gene für Hydroxymethylglutamyl-CoA-Reduktase (Sinensky, Biochem. Biophys. Res. Commun. 78:863 (1977)), Ribonukleotid-Reduktase (Meuth et al., Cell 3:367 (1943)), Aspartat-Transcarbamylase (Kemp et al. Cell 9:541 (1976)), Adenylat- Deaminase (DeBatisse et al., Mol. and Cell Biol. 2(11):1346-1353 (1982)), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) der Maus und, mit einem defekten Promotor, Thymidin- Kinase (TK) von Mäusen.
Dominante Selektionsgene werden in Transformanden ungeachtet des Genotyps der Parentalzelle exprimiert. Die meisten dominanten Selektionsgene werden nicht nachweisbar amplifiziert, da der Phänotyp gegenüber dem Selektionsmittel so überaus wirksam ist, daß es schwierig ist, zwischen Zellinien zu unterscheiden, die das Gen amplifiziert oder nicht amplifiziert haben. Beispiele dominanter Selektionsgene dieses Typs umfassen die Gene für prokariontische Enzyme wie Xanthin-Guanin- Phosporibosyl-Transferase (Mulligan et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 78[4]:2072-2076 (1981)) und Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1-14 (1981)).
Einige dominante Selektionsgene werden auch nachweisbar amplifiziert. Geeignete Beispiele umfassen das mutierte DHFR-Gen, das von Haber et al., Somatic Cell Gent. 4:499-508 (1982), beschrieben wurde, Zelloberflächenmarker wie HLA- Antigene und Gene, die für Enzyme, wie spezifische Esterasen, codieren, die aus fluorogenen oder chromogenen Substraten, wie sie auf diesem Gebiet bekannt sind, fluoreszierende oder gefärbte Produkte erzeugen.
Die Verwendung nachweisbar amplifizierter dominanter Selektionsgene wird hier bevorzugt. Es versteht sich, daß ein dominantes Selektionsgen in manchen Fällen durch geeignete Mutationen im Gen in ein nachweisbar amplifiziertes Gen umgewandelt werden kann.
Selektionsgene waren zunächst von begrenzter kommerzieller Nützlichkeit. Wenn sie es auch ermöglichten, Transformanden zu selektieren, die zur Amplifikation aufgenommener DNA neigten, so lieferten die meisten Selektionsgene doch Produkte ohne kommerziellen Wert. Auf der anderen Seite vermittelten Gene für Produkte, die kommerziell wertvoll waren, ihren Transformanden im allgemeinen keinen leicht selektierbaren (oder auch nur nachweisbaren) Phänotyp. Dies ist beispielsweise der Fall bei Enzymen oder Hormonen, die den transformierten Zellen keine außergewöhnlichen Fähigkeiten im Nährstoff-Stoffwechsel oder zur Entgiftung verleihen. Die meisten Proteine von kommerziellem Interesse fallen in diese Gruppe, z.B. Hormone, Proteine, die an der Blutgerinnung beteiligt sind, und fibrinolytische Enzyme.
Nachfolgend wurde gefunden, daß eukariontische Zellen, die sich mit dem Selektionsgen transformieren lassen und dieses amplifizieren, dies auch im Fall des Produktgens tun. Bei der Verfolgung des Selektionsgens konnte eine Subpopulation transformierter Zellen identifiziert werden, die das Produktgen zusammen mit dem Selektionsgen coexprimieren und coamplifizieren. In der Praxis werden Transformanden in Anwesenheit des Selekstionsmittels kultiviert, und man folgert, daß Transformanden mit einer erhöhten Expression des Selektionsgens auch eine erhöhte Expression des Produktgens zeigen. Wie unten ausführlicher untersucht wird, ist dies nicht immer der Fall. Axel et al. (US-PS 4 399 216) verwenden den Ausdruck Co-Transformation, um die Transformation einer Zelle mit mehr als einem unterschiedlichen Gen zu beschreiben, sei es durch Vektorsysteme, die kovalent gekoppelte oder ungekoppelte Gene enthalten, sei es, in letzterem Fall, daß die Gene in die Wirtszellen nacheinander oder gleichzeitig eingeführt werden. Co- Transformation sollte "die Einführung und die stabile Integration eigentlich eines jeden definierten Gens in kultivierte Zellen erlauben" (Wigler et al., Cell. 16 :-777-785, 1975), und "unter Verwendung des Verfahrens der Co-Transformation ist es möglich, eukariontische Zellen zu erzeugen, die das gewünschte proteinische oder sonstige Material synthetisieren" (US-PS 4 399 216, Spalte 3, Zeilen 37-42).

Transformationsvektoren

Die bei der Co-Transformation von AHF verwendeten Vektoren enthalten ein Selektionsgen und das AHF-Gen. Zusätzlich liegen , wie unten beschrieben, in den Transformations- oder Co-Transformations-Vektoren gewöhnlich andere Elemente, wie Enhancer, Promotoren, Introns, begleitende DNA, Polyadenylierungsstellen und nicht- codierende 3'-Bereiche, vor.
Geeignete Selektionsgene werden oben beschrieben. Vorzugsweise verhindert das Selektionsmittel das Zellwachstum in Abwesenheit des Selektionsgens. Auf diese Weise überwachsen revertierte Zellen in Kulturen großen Maßstabs, die das Selektionsgen (und vermutlich ebenso das AHF-Gen) verlieren, nicht die Fermentation. Bei der kommerziellen Herstellung von AHF wäre es jedoch wünschenswert, die Verwendung von Zelltoxinen zu vermeiden und damit die Reinigungsschritte für das Produkt zu vereinfachen. Wünschenswert wäre daher ein Selektionsgen, das es den Transformanden ermöglicht, einen Nährstoff zu verwerten, der für das Wachstum kritisch ist, und den sie andernfalls nicht verwerten könnten. Ein Beispiel hierfür ist das oben beschriebene TK-Gen.
Zwei Klassen von Vektoren wurden bei der Co-Transformation verwendet. Die erste Klasse sind die ungekoppelten Vektoren. Hier sind Selektionsgen und AHF- Gen nicht kovalent verbunden. Diese Klasse von Vektoren wird bevorzugt, weil der Ligationsschritt oder eine sonstige Verknüpfung der beiden Gene nicht erforderlich ist. Dies vereinfacht das Transformationsverfahren, weil Selektions- und Produktgene gewöhnlich aus getrennten Quellen stammen und in ihrer Wildtyp- Umgebung nicht ligiert sind. Zusätzlich kann das während der Co-Transformation eingesetzte molare Verhältnis von AHF- und Selektionsgenen angepaßt werden, um die Effizienz der Co-Transformation zu erhöhen.
Die zweite Klasse von Co-Transformations-Vektoren sind gekoppelte Vektoren. Diese Vektoren unterscheiden sich von ungekoppelten Vektoren dadurch, daß Selektionsgen und AHF-Gen kovalent verbunden sind, vorzugsweise durch Ligation.
Die hier verwendeten Vektoren können auch Enhancer einschließen. Enhancer sind von Promotoren funktionell verschieden, scheinen aber mit Promotoren zusammenzuwirken. Ihre Funktion auf zellulärer Ebene wird nicht gut verstanden, ihr außergewöhnliches Charakteristikum ist jedoch die Fähigkeit, unabhängig von ihrer Lage oder Orientierung die Transkription zu aktivieren oder zu verstärken. Promotoren müssen stromaufwärts eines Gens liegen, während sich Enhancer stromaufwärts oder 5'- vom Promotor, als Intron innerhalb des Gens oder stromabwärts vom Gen zwischen dem Gen und einer Polyadenylierungsstelle oder 3'- von der Polyadenylierungsstelle befinden können. Invertierte Promotoren sind nicht funktionell, wohl aber invertierte Enhancer. Enhancer wirken in cis, d.h. sie haben nur Einfluß auf Promotoren, wenn sie sich auf demselben DNA-Strang befinden. Für eine allgemeine Erörterung von Enhancern siehe Khoury et al., Cell. 33:313- 314 (1983).
Bevorzugte Enhancer erhält man aus tierischen Viren wie Affenvirus 40 (SV 40), Polyoma-Virus, Rinder-Papillom-Virus, Retrovirus oder Adenovirus. Virale Enhancer sind leicht aus allgemein verfügbaren Viren erhältlich. Die Enhancer-Bereiche mehrerer Viren, z.B. Rous-Sarcoma-Virus und Affenvirus 40 sind gut bekannt, (s. Luciw et al., Cell. 33:705-716 1983).
Diese Bereiche können auf der Grundlage veröffentlichter Restriktionskarten für das fragliche Virus nach chemischen Standardmethoden ausgeschnitten und, falls nötig, modifiziert werden, um Spleißen des Enhancers in den Vektor wie gewünscht zu ermöglichen (s. beispielsweise Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159:601-621 (1982) und Mol. Cell Biol. 2(11):1304-1319 (1982)). Alternativ kann der Enhancer nach Sequenzdaten synthetisiert werden; die Größe der viralen Enhancer (im allgemeinen weniger als ungefähr 150bp) ist klein genug, um dies praktisch durchführen zu können.
Ein anderes Element, das in der Vektorzusammenstellung vorhanden sein sollte, ist eine Polyadenylierungsstelle. Hierbei handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die sich stromabwärts des translatierten Bereichs des Gens befindet und kurz hinter welcher die Transkription endet und Adenin-Ribonukleotide angefügt werden, die einen Polyadeninnukleotidschwanz am 3'-Ende der mRNA bilden. Polyadenylierung ist für die Stabilisierung der mRNA gegen den Abbau in der Zelle bedeutsam, ein Vorgang, der den Spiegel an mRNA und folglich an Produktprotein senkt.
Eukaryontische Polyadenylierungsstellen sind gut bekannt. Für eukaryontische Gene existiert eine Konsensus-Sequenz: 11 bis 30 Nukleotide von der Stelle, an der die Polyadenylierung beginnt, findet man das Hexanukleotid 5'-AAUAAA-3'. DNA- Sequenzen, die eine Polyadenylierungsstelle enthalten, sind entsprechend den Veröffentlichungen aus Viren erhältlich. Beispielhafte Polyadenylierungssequenzen können aus dem β-Globulin der Maus und den frühen oder späten Genen des Affenvirus 40 erhalten werden, virale Polyadenylierungsstellen werden jedoch bevorzugt. Da diese Sequenzen bekannt sind, können sie auf herkömmliche Weise in vitro synthetisiert und mit den Vektoren ligiert werden.
Der Polyadenylierungsbereich muß sich stromabwärts entweder vom AHF- oder vom Selektionsgen befinden, kann aber mit jedem der beiden Gene ligiert sein. Er kann allein mit dem Selektionsgen und nicht mit dem Produktgen ligiert sein, egal ob die Vektoren gekoppelt oder nicht gekoppelt sind. Bei der Sequenz, die die Polyadenylierungsstelle vom Translations-Stopcodon trennt, handelt es sich vorzugsweise um ein untranslatiertes DNA-Oligonukleotid, beispielsweise ein eukaryontisches Gen ohne Promotor. Da solche Oligonukleotide und Gene nicht mit einem Promotor ausgestattet sind, werden sie nicht exprimiert. Das Oligonukleotid sollte sich über eine beträchtliche Entfernung in der Größenordnung von bis zu 1000 Basen vom Stopcodon zur Polyadenylierungsstelle erstrecken. Dies untranslatierte Oligonukleotid am 3'-Ende führt im allgemeinen zu einer Erhöhung der Produktausbeuten. Der Vektor kann ungefähr 10 bis 30bp stromabwärts von der Konsensus-Sequenz enden, vorzugsweise werden jedoch die 3'-Sequenzen, die sich stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle befinden, in ihrer Wildtyp-Umgebung beibehalten. Diese Sequenzen erstrecken sich typischerweise über ungefähr 200 bis 600 Basenpaare stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle.
Die hier beschriebenen Vektoren können mit Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Komponenten der Vektoren, wie Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und ähnliches, sind aus natürlichen Quellen erhältlich oder können wie oben beschrieben synthetisiert werden. Wenn sich die Komponenten in einer DNA finden, die in großen Mengen zur Verfügung steht, z.B. Komponenten wie virale Funktionen, oder wenn sie synthetisiert werden können, z.B. Polyadenylierungsstellen, dann können grundsätzlich bei geeignetem Einsatz von Restriktionsenzymen große Vektormengen erhalten werden, indem man einfach den Ausgangsorganismus kultiviert, seine DNA mit einer geeigneten Endonuklease verdaut, die DNA-Fragmente trennt und die DNA, die das gewünschte Element enthält, identifiziert und gewinnt. Gewöhnlich wird ein Transformationsvektor in kleinen Mengen zusammengesetzt und dann mit einem geeigneten, autonom replizierenden Synthesevektor wie einem prokaryontischen Plasmid oder Phagen ligiert. In den meisten Fällen kann das Plasmid pBR322 verwendet werden (s. Kaufman et al., ibd.).
Die Synthesevektoren werden verwendet, um die ligierten Transformationsvektoren in bekannter Weise zu klonieren, beispielsweise durch Transfektion eines permissiven prokaryontischen Organismus, Replikation des Synthesevektors zu hoher Kopienzahl, Wiedergewinnung des Synthesevektors durch Zell-Lyse und Abtrennen des Synthesevektors von den Zelltrümmern.
Die resultierende Ausbeute an Synthesevektoren kann direkt in eukaryontische Zellen transfiziert werden oder der Transformationsvektor kann durch geeigneten Endonukleaseverdau und Trennung über das Molekulargewicht aus dem Synthesevektor zurückgewonnen werden. Die Wiedergewinnung des Transformationsvektors ist nicht notwendig, solange der Rest des Synthesevektors der eukaryontischen Genamplifikation, Transkription oder Translation nicht entgegenwirkt. Beispielsweise ist der hier bevorzugte Synthesevektor eine Mutante des Plasmids pBR322 von E. coli, in der Sequenzen, die für eukaryontische Zellen schädlich sind, entfernt worden (s. Kaufman et al., ibd.). Die Verwendung dieser Mutante beseitigt die Notwendigkeit, den Plasmidrest vor der Co-Transformation zu entfernen.

Co-Transformation, Selektion und Nachweis der Amplifikation

Die Zellen, die transformiert werden sollen, können eukaryontische Zellen jeder Art, einschließlich Hefeprotoplasten, sein, gewöhnlich sind es aber keine Pilzzellen. Geeignet sind primäre Explantate (einschließlich relativ undif ferenzierter Zellen, wie Stammzellen) und unsterbliche und/oder transformierte Zelllinien. Zellen, die als Kandidaten in Frage kommen, brauchen genotypisch im Selektionsgen nicht defizient zu sein, solange das Selektionsgen dominant ist.
Die Zellen sind vorzugsweise, wie oben erörtert, stabile Säuger-Zellinien. Am besten sind Zellinien, von denen bekannt ist, daß sie Selektionsgene stabil in ihre chromosomale DNA einbauen, beispielsweise Eizellinien des Chinesischen Hamsters (CHO). Verwendbar sind auch HeLa-Zellen, COS-Affenzellen, Melanom- Zellinien, wie die Bowes Zellinie, Maus-L-Zellen, Maus-Fibroblastenzellen und Maus- NIH-3T3-Zellen.
Co-Transformation mit ungekoppelten Vektoren kann nacheinander oder gleichzeitig erfolgen (s. US-PS 4 399 216). Verfahren, die die zelluläre Aufnahme von DNA erleichtern, sind oben beschrieben. Die Mikroinjektion des Vektors in den Zellkern liefert die höchsten Transformationseffizienzen, am einfachsten ist es jedoch, wenn man die Parentalzellen der DNA in Form eines Calciumphosphat- Präzipitats aussetzt. Wesentlich bessere Co-Transformationseffizienzen ergeben sich bei der Co-Transformation mit einem molaren Überschuß von Produkt- zu Selektionsgen in der Größenordnung von 100:1.
Die Zellpopulation, die den Transformationsbedingungen unterworfen wurde, wird dann zur Identifizierung der Transformanden weiterverarbeitet. Nur eine kleine Subpopulation einer jeden Kultur, die für die Co-Transformation behandelt wurde, zeigt den Phänotyp des Selektionsgens. Die Zellen in der Kultur werden auf ihren Phänotyp untersucht. Dies kann erfolgen, indem man die Zellen einzeln mit einem Zellsortier-Gerät prüft, wobei der Phänotyp ein Signal erzeugt, beispielsweise eine Fluoreszenz nach Spaltung eines fluorogenen Substrats durch ein Enzym, das durch das Selektionsgen erzeugt wurde. Vorzugsweise befähigt der Phänotyp, wie weiter oben ausgeführt, jedoch nur den Transformanden, in speziellen Wachstumsmedien, zu wachsen oder zu überleben.
Die selektierten Transformanden werden dann auf Ligation des Produktgens in ihr Chromosom oder auf Expression des Produktes selbst geprüft. Ersteres kann mittels einer Southern Blot-Analyse, letzteres durch immunologische oder enzymatische Standardtests erfolgen.
Sobald die Transformanden identifiziert sind, wird die Expression des Produktgens durch weiteres Klonen in Anwesenheit eines Selektionsmittels wie MTX verstärkt (siehe US-PS 4 399 216).
Co-Transformanden, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, sind für in vivo Transfektionen höherer Organismen nach bekannten Methoden geeignet. Primäre Explantate oder stabile Zellinien eines potentiellen Wirtstieres werden co-transformiert und in den Wirt oder einen ansonsten im wesentlichen syngenen Wirt, der genotypisch im Produktprotein defizient ist, inkubiert.
Die Erfindung wird weiter erläutert unter Bezug auf die folgenden illustrativen Ausführungsformen, die rein beispielhaft sind und den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen wiedergegeben, nicht beschränken sollen.
Sofern nicht anders angegeben, werden die Restriktionsendonukleasen unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen verwendet. Ligationsreaktionen werden nach Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 245-246 (Cold Spring Harbor Laboratory 1982), durchgeführt, wobei der auf S. 246 beschriebene Puffer und eine DNA-Konzentration von 1 - 100 µg/ml bei einer Temperatur von 23ºC (DNA mit glatten Enden) bzw. bei 16ºC (DNA mit cohäsiven Enden) verwendet wird. "Phosphatasebehandlung", wie hier beschrieben, bedeutet die Dephosphorylierung von DNA und wird wie bei Maniatis et al., ibd., z.B. auf S. 133ff. durchgeführt. "Kinasebehandlung" bedeutet die Phosphorylierung von DNA. Elektrophorese erfolgt in 0,5 - 1,5% Agarose-Gelen mit 90 mM Tris-Borat und 10 mM EDTA. "Nick-Translation" nimmt Bezug auf das Verfahren zur Markierung von DNA mit ³²P nach Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237 (1977). Sämtliche radioaktiv markierte DNA ist ungeachtet der verwendeten Markierungstechnik mit ³²P markiert.
Mit "Schneller Präparation" ist eine schnelle Präparation von Bakteriophagen- oder Plasmid-DNA in kleinem Maßstab gemeint (beispielsweise nach Maniatis et al., ibd., S. 365-373).
Entsprechend einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine pharmazeutische Präparation von AHF bereitgestellt. Eine pharmazeutische Präparation von entsprechend dieser Erfindung erzeugtem menschlichen AHF zur parenteralen Verabreichung kann nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die pharmazeutische Präparation zur Verwendung am Menschen umfaßt sterilisierten AHF, der aus transformierten Zellen gewonnen wurde. Zusätzlich zu dem AHF- Polypeptid oder einem ausreichenden Bruchteil mit AHF-Aktivität können ein oder mehrere geeignete Trägerstoffe und wahlweise andere therapeutische Zutaten hinzugefügt werden. Der (die) Trägerstoff(e) muß "annehmbar" in dem Sinne sein, daß er mit anderen Zutaten der Präparation verträglich und für seinen Empfänger nicht schädlich ist. Die Präparation kann zweckmäßig in Form einer Dosierungseinheit dargeboten und nach irgendeinem der auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Methoden hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße, zur parenteralen Verabreichung geeignete pharmazeutische Präparation umfaßt zweckmäßig eine sterile lyophilisierte Präparation des AHF- Polypeptids, die durch Zugabe einer sterilisierten Lösung wiederaufbereitet werden kann, um Lösungen herzustellen, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des Empfängers sind. Die Präparation kann in Behältern für Einfach- oder Vielfachdosen dargeboten werden, z.B. in verschlossenen Ampullen oder Violen.
Es versteht sich, daß die erfindungsgemäße pharmazeutische Präparation zusätzlich zu dem sterilen AHF oder seiner Lösung ein oder mehrere zusätzliche Bestandteile wie Verdünnungsmittel, Puffer, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Schmiermittel, Konservierungsmittel (einschließlich Antioxidantien) und ähnliches enthalten kann. Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, fein zerkleinertes Silicagel, Kakaobutter, Talk, pflanzliche und tierische Fette und Öle, pflanzlicher Gummi und Polyalkylenglykol und andere für Pharmazeutika bekannte Trägerstoffe sind alle zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparationen geeignet. Präparationen zur parenteralen Verwendung umfassen eine Ampulle einer sterilen Lösung oder Suspension mit Wasser oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten Flüssigkeit als Trägerstoff, oder eine Ampulle mit sterilem festen AHF zur Verdünnung mit einer pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeit.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist bei der Behandlung von Hämophilie A von Nutzen. Derartige Präparationen liefern auch ein wichtiges Instrument sowohl bei in vivo- wie bei in vitro-Untersuchungen der Vorgänge, die bei der Gerinnung eine Rolle spielen, als auch bei der Untersuchung der immunologischen und biologischen Charakteristika des AHF-Moleküls.

BEISPIEL 1 Analyse der Proteinsequenz

Faktor VIII:C vom Schwein wurde von Dr. David Fass nach publizierten Verfahren gereinigt, Knutsen und Fass (1982); Fass et al. (1982), ibd. Die Analyse der Aminosäuresequenz erfolgt an einem mit Rinderthrombin erhaltenen Spaltprodukt des 76.000 Dalton-Proteins wie unten beschrieben.
Polypeptide des AHF vom Schwein, die an die Säule mit monoklonalem Anti- VIII:C-Antikörper gebunden sind, können hintereinander in zwei Schritten eluiert werden (Fass et al. 1982). Die zwei Spezies höheren Molekulargewichts, 166.000 und 130.000 Dalton, können mit EDTA eluiert werden. Das verbleibende Polypeptid, das ein Molekulargewicht von ungefähr 76.000 Dalton besitzt, kann dann mit 50%igem Ethylenglykol eluiert werden.
Das Protein von 76.000 Dalton wird nach ausgiebiger Dialyse in 50 mM Tris- HCl (pH 7,5), 0,15M NaCl, mit Thrombin verdaut. Verdaus mit Rinderthrombin werden bei Raumtemperatur für 60 Minuten mit 1 Einheit/ml Rinder-Thrombin durchgeführt, worauf die Zugabe einer weiteren Einheit/ml Thrombin und Inkubation für weitere 60 Minuten erfolgt. Die Verdaus mit Thrombin werden beendet, indem man 10 Minuten lang bei 90ºC in 0,01% SDS erhitzt. Das größere Thrombin-Verdauungsprodukt des 76.000 Dalton-Proteins ist ein Polypeptid von 69.000 Dalton (69Kd).
Weniger als 1 µg der oben beschriebenen 69Kd-Polypeptid-Spezies wird jodiert, um entsprechend dem Verfahren von U.K. Lämmli, Nature, 227:680 (1970) nach SDS- Gel-Elektrophorese als radioaktiver Marker zu dienen. Das in TAS-Puffer (50 mM Tris-Acetat (pH 7,8), 0,1% SDS) gelöste Polypeptid wird zu 100 µl desselben Puffers mit 5 mCi trägerfreiem ¹²&sup5;J hinzugefügt. 50 µl TAS-Puffer mit 2,5 mg/ml Chloramin T (Baker) werden hinzugefügt und die Lösung 1 Minute lang geschüttelt. Die Reaktionen werden beendet, indem man 50 µl TAS-Puffer mit 2,5 mg/ml Natriummetabisulfat, hinzufügt und anschließend 1 Minute lang schüttelt. Markiertes Protein wird von nicht-eingebautem ¹²&sup5;J unter Verwendung einer Sephadex G-25 M-Säule mit kleinem Volumen (PD-10, Pharmacia) chromatographisch abgetrennt. Die Säule wird mit mehreren Säulenvolumina TAS-Puffer mit 2,5 mg/ml Natriumjodid voräquilibriert. Das Porenvolumen wird gesammelt und die Integrität des Proteins durch SDS-Gelelektrophorese entsprechend dem Verfahren von Lämmli, (1970), ibd., analysiert.
Das radioaktiv markierte 69Kd-Protein wird zu seinem unmarkierten Gegenstück zur nachfolgenden Kontrolle hinzugefügt. Das Protein wird dann einzeln elektrophoretisch konzentriert. Die Proteinlösungen werden auf 0,1% SDS, 10 mM Dithiothreitol eingestellt und Coomassie Brillantblau (Serva) wird zur leicht blaßblauen Färbung der Lösung hinzugefügt.
Die Lösungen werden dann unter Verwendung von Spectrapore-Dialyseröhrchen (hergestellt von Spectrum Medical Industries, Inc., mit einem Ausschlußmolekulargewicht von ungefähr 14.000) kurz (1-2 Stunden) in TAS-Puffer dialysiert. Die dialysierten Proteinproben werden dann in einen elektrophoretischen Sammler nach dem von Hunkapiller et al., Meth. Enzymol., Enzyme Structures, Part I, 91:227 (1983) vorgeschlagenen Aufbau gegeben und 24 Stunden bei 50 Volt in TAS-Puffer elektrophoretisch konzentriert.
Das nach der obigen Methode konzentrierte 69Kd-AHF-Polypeptid wird entsprechend Lämmli, ibd., einer Elektrophorese durch ein SDS-Polyacrylamidgel unterworfen. Das gereinigte, durch Autoradiographie des radioaktiv markierten Indikatorpolypeptids identizifierte Protein wird aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und wie bei Hunkapiller et al., ibd., beschrieben konzentriert. Die konzentrierte Probe ist zur direkten Analyse der Aminosäuresequenz mit dem Gasphasensequenator nach Hewick et al., J. Biol. Chem., 256:7990 (1981) geeignet.
Die aminoterminale Sequenz von Rest 2 - 42 des 69.000-Dalton-Spaltprodukts mit Thrombin stellt sich wie in Abbildung 1 dar. Der erste Rest "X" war nicht identifizierbar. Die Aminosäuresequenzen (A) des Aminoterminus und (B) eines 40Kd- Verdauungsprodukts des 166Kd-AHF-Fragments mit Rinderthrombin, das von Fass et al., ibd., bemerkt wurde, sind in Abb. 2 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Aminoterminus des 76Kd-Polypeptids lautet: X-Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe.

BEISPIEL 2

Chemische Synthese von Oligonukleotid-Sonden für ein AHF-Gen vom Schwein

(a) Pool von Pentapeptid-Sonden

Die Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz eines Fragments von AHF vom Schwein erlaubt es, Oligonukleotid-Sonden für AHF vom Schwein zu entwerfen und zu synthetisieren. Durch den genetischen Code (Tabelle 1) ist es möglich, die Gensequenz, die für diese Aminosäuresequenz codiert, vorherzusagen. Da der genetische Code degeneriert ist, gibt es mehr als eine mögliche codierende DNA- Sequenz für jede Aminosäuresequenz. Um die korrekte DNA-Sequenz sicherzustellen, werden dementsprechend eine Vielzahl oder ein Pool komplementärer Oligonukleotid- Sonden für einen Bereich des AHF-Moleküls bereitgestellt, der lediglich eine überschaubare Anzahl an Oligonukleotiden erfordert. Solche Bereiche werden ausgewählt, indem man nach Folgen von 5 bis 8 benachbarten Aminosäuren sucht, die die niedrigste Degeneration aufweisen. Nachdem der Bereich ausgewählt wurde, wird ein Pool von Oligonukleotiden synthetisiert, der alle möglichen DNA-Sequenzen, die für die 5 bis 8 Aminosäuren in dem ausgewählten Bereich codieren können, beinhaltet.
In dem 69.000 Dalton-Spaltfragment des Schweine-AHF mit Thrombin gibt es eine Pentapeptidsequenz, die vom Aminoterminus gesehen von den Aminosäuren 18 bis 22 verläuft und die von bis zu 16 verschiedenen DNA-Sequenzen, jede mit 5 Codons entsprechend einer Länge von 15 Nukleotiden codiert werden könnte. Mögliche mRNA-Sequenzen
Die Sonden werden hergestellt, indem man eine begrenzte Anzahl von Oligonukleotid-Mischungen mit jeweils 2 bis 8 oder mehr Oligonukleotiden pro Mischung synthetisiert. Diese Mischungen werden als Pools bezeichnet. Es werden genügend Pools hergestellt, um alle möglichen codierenden Sequenzen zu umfassen.
Diese Oligonukleotide können manuell synthetisiert werden, z.B. nach der Phosphotriester-Methode, wie sie beispielsweise bei R L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98:3655 (1967), beschrieben wird. Andere Verfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe auch Matteucci und Caruthers, J. Am. chem. Soc. 103:3185 (1981)).
Vorzugsweise werden die synthetischen Oligonukleotid-Sonden für die gewünschten Polypeptidsequenzen jedoch auf chemisch identische Weise mit Hilfe einer vollautomatischen DNA-Synthesemaschine der Applied Biosystems, Modell 380A, wie oben angegeben, hergestellt.
Die auf diese Weise hergestellten Oligonukleotide können dann auf einer reversen HPLC-Säule, wie bei H. Fritz et al., Biochemistry, 17:1257 (1978), beschrieben, gereinigt werden. Nach Detritylierung mit 80% HOAc ist das resultierende Oligonukleotid normalerweise rein und kann direkt als Sonde verwendet werden. Sofern irgendwelche Verunreinigungen vorliegen, kann die synthetische DNA auf derselben HPLC-Säule weiter gereinigt werden, vorzugsweise unter Anwendung eines geringfügig unterschiedlichen Gradientensystems.
Die Oligonukleotide werden markiert, z.B. mit [-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase, und ihre Sequenz wird entweder durch zweidimensionale Homochromatographie nach Sanger et al., PNAS U.S.A., 70:1209 (1973) oder nach dem Verfahren von Maxam- Gilbert, Meth. Enzymology, 65:499 (1977), geprüft.

(b) Sonden mit 45 Nukleotiden

Die Verwendung von Oligonukleotid-Sonden zum Screenen einer genomischen DNA- Bank nach dem AHF-Gen oder Fragmenten davon war ein besonderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung. Während Oligonukleotide bereits zum Screenen von cDNA- Banken verwendet wurden (siehe z.B. M. Jaye et al., Nucleic Acids Research 11:2325 (1982)), wurden genomische Banken bisher nur mit cDNA-Sonden erfolgreich gescreent, d.h. mit Sonden, die erst hergestellt worden waren, nachdem die Gewebequelle für die mRNA für ein beschriebenes Protein identifiziert und zur Herstellung eines cDNA-Klons genutzt worden war, der genau zu der DNA-Sequenz des genomisch gesuchten Gens paßte.
Im vorliegenden Fall wurde gezeigt, daß es möglich ist, Oligonukleotide zu verwenden, um Gensegmente in einer genomischen DNA-Bank zu identifizieren, die für die Aminosäuresequenz des interessierenden Proteins codieren. Die Identifizierung solcher Gensegmente führt zu einer genauen Sonde, die bei Screening-Techniken von mRNA, cDNA oder anderen genomischen Screening-Techniken Anwendung finden kann.
Vorzugsweise werden wie hier Oligonukleotide verwendet, die wenigstens zwei Segmenten der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins entsprechen. Vorzugsweise wird wenigstens eine dieser Oligonukleotid-Sonden in Form eines oder mehrerer Oligonukleotid-Pools verwendet, die im ganzen genommen jede mögliche DNA-Sequenz enthalten, die für die ausgewählte Aminosäuresequenzen codieren könnte. Vorzugsweise wird eine relativ kurze Probe, z.B. 11 bis 25 Nukleotide, vorzugsweise 15 bis 20 Nukleotide, in Verbindung mit einer relativ langen Probe, z.B. 30 bis 200 Nukleotide, vorzugsweise 40 bis 50 Nukleotide, verwendet. Die zweite Sonde kann zur Bestätigung verwendet werden und ist nicht immer zur Identifizierung des DNA- Segments notwendig. Vorzugsweise wird wenigstens eine der Sonden, besonders bevorzugt die längere der Sonden, entsprechend den unten beschriebenen Regeln 1 bis 4 konzipiert.

Regel 1. Codon-Präferenz

Sofern nicht andere Erwägungen eine Rolle spielten, wurde diejenige Nukleotidsequenz gewählt, die zu vorherrschenden oder ähnlichen Sequenzen in ähnlichen Säugergenen paßte (siehe Mechanisms of Ageing Dev., 18: (1982)).

Regel 2. Vorteilhafte GT-Paarung

Das Nukleotid G kann, zusätzlich zur Bindung an sein Komplement C, auch schwache Bindungen mit dem Nukleotid T bilden (siehe K.L. Agarwal et al., J. Biol. Chem. 256:1023 (1981)). Sofern man vor der Wahl von G oder A für die dritte Position eines zweifelhaften Codons steht, wird man folglich vorzugsweise G wählen, da die resultierende Hybridisierung, selbst wenn es sich bei dem tatsächlichen Nukleotid an dieser Position um ein T anstatt ein C handelt, immer noch stabil wäre. Wäre fälschlich ein A gewählt worden, könnte die entsprechende A:C- Inkompatibilität genügen, um die Fähigkeit der Sonde, mit der genomischen DNA zu hybridisieren, zu zerstören.

Regel 3. Vermeidung von 5'-CG-Sequenzen

Bei der Auswahl unter möglichen mehrdeutigen Sequenzen sind jene Nukleotide zu wählen, die keine 5'-CpG-Sequenz enthalten, sei es innerhalb eines Codons oder zwischen zwei Codons.

Regel 4. Position fehlender Übereinstimmung (Mismatch-Position)

Bei der Wahl der zu verwendenden Codonsequenzen wurde das Postulat berücksichtigt, daß eine fehlende Übereinstimmung nahe den Enden des Moleküls die Stabilität der Hybridisierung nicht so nachteilig beeinflußt wie eine fehlende Übereinstimmung am Zentrum des Moleküls. Folglich bestand beispielsweise bei ernsthaften Zweifeln hinsichtlich der Sequenz eines besonderen Codons, das sich nahe dem Zentrum der Sonde befand, die Tendenz, einen Pool möglicher Nukleotidsequenzen für dieses Codon zu testen, wogegen Codonpositionen nahe den Enden der Sonde in höherem Maße auf der Basis der Codon-Präferenz bestimmt wurden.
Die für die 45-mer-Sonden gewählten Sequenzen sind, ebenso wie die Aminosäuresequenzen, die möglichen DNA-Sequenzen und die "wirkliche Sondensequenz", d.h. das Komplement zum eigentlichen codierenden Strang, der für das AHF-Exon bestimmt wurde, in Abb. 3 gezeigt.
Von den Nukleotidpositionen, die Wahlmöglichkeiten beinhalten, wurden somit drei abgedeckt, indem Pools verwendet wurden, die beide möglichen Nukleotid- Alternativen enthielten, fünf wurden korrekt vorhergesagt, eine wurde derart vorhergesagt, daß sie sich, obwohl inkorrekt, neutral verhielt, und vier weitere waren falsch.
Trotz ungefähr 11% Positionen mit fehlender Übereinstimmung (5/45) reicht der Pool von 45 mer-Oligonukleotiden aus, um wie unten beschrieben ein Genfragment des Schweine-AHF sicher zu identifizieren.

BEISPIEL 3

Screenen einer genomischen DNA-Bank vom Schwein

Eine genomische DNA-Bank vom Schwein wird unter Verwendung des Bakteriophagen- Vektors Lambda J1 konstruiert. Lambda J1 leitet sich von L47.1 (Loenen et al., Gene 20:249 (1980)) durch Ersatz der 1,37kb und 2,83kb Eco RI-Bam HI-Fragmente mit einem 95bp Eco RI-Hind III-Xba I-Bgl II-Bam HI-Polylinker ab. Das 6,6kb Bam HI- Fragment liegt dann als eine direkte Wiederholung in umgekehrter Orientierung relativ zu L47.1 vor. Die Klonierungskapazität für Bam HI-Fragmente beträgt 8,6 - 23,8kb. Mit Bam HI gespaltene Schweine-DNA (hergestellt wie bei Piccini et al., Cell, 30:205 (1982)) wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und durch Zentrifugation in einer Mikrofuge konzentriert. 0,67 µg von mit Bam HI geschnittener Schweine-DNA werden mit 2 µg Lambda J1 Bam-HI-"Armen", die wie bei Maniatis et al., ibd., S. 275-279, beschrieben, präpariert wurden, in einem Volumen von 10 µl Ligationspuffer mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ligiert (Maniatis et al., ibd., S. 474). Die ligierte DNA wird wie bei Maniatis et al., ibd., S. 291, verpackt und ausplattiert.
Ungefähr 4 x 10&sup5; pfu werden auf E. coli C600 auf Petrischalen aus Plastik mit einem Durchmesser von 15 cm mit NZCYM Agarose zu 8.000 pfu/Platte ausplattiert. Diese rekombinanten Phagen werden nach dem Verfahren von Woo (1979) unter Verwendung der oben beschriebenen 45mer-Sonde, die wie oben beschrieben mit ³²P radioaktiv markiert war, gescreent. Die Filter werden dann in 5x SSC, 5x Denhardt's, 0,1% SDS und 5 x 10&sup6; cpm/ml Sonde bei 45ºC 16 Stunden lang hybridisiert, in 5x SSC, 0,1% SDS bei 50ºC gewaschen und mit Verstärkerfolien (DuPont Lightning-Plus) einer Autoradiographie unterworfen. Die Autoradiographie zeigt zahlreiche Phagen, die in unterschiedlichem Ausmaß mit dem 45mer hybridisierten. Die Filter werden dann in 0,5 M NaOH denaturiert, in 1,0 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl neutralisiert und mit dem 15mer wie für das 45mer beschrieben hybridisiert, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungs- und Waschtemperatur 37ºC beträgt. Ein Phage, der an beide Sonden hybridisierte, wurde von der Originalplatte gepickt. 100 pfu wurden ausplattiert und die Plaques wie oben beschrieben unter Verwendung des 15mers als Sonde getestet.
Ein positiver Phage, bezeichnet als PB34, wurde als Pfropfen ausgestochen und zur Herstellung eines Plattenlysats verwendet (Maniatis et al., ibd., S. 65-66). Eine Isolierung von PB34-DNA in kleinem Maßstab erfolgt entsprechend dem Verfahren nach Maniatis et al., ibd., S. 371-372. 10 µl dieser DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Hae III geschnitten und dann mit alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim) behandelt. Nach einer Phenolextraktion werden 20 ng von mit Sma I geschnittener M13mp8-DNA zugefügt, die Lösung auf 0,2 M NaCl gebracht und die Nukleinsäure durch Zugabe von 2 Volumenteilen (Vol.) Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wird durch Zentrifugation pelletiert und in 2 µl Ligationsmischung wieder aufgelöst. Die DNA wird 30 Minuten lang bei 23ºC ligiert, auf 50 µl mit Ligasepuffer verdünnt und 3 weitere Stunden ligiert. 5 µl dieser Reaktion werden zur Transformation von E. coli JM101/TG1 verwendet.
Die Zellen werden für die Transformation kompetent gemacht, indem man sie bei 37ºC in 50 ml SOBM-Medium zu einer O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 wachsen läßt (SOBM ist 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1 M NaCl, 0,11 g pro Liter KOH, 20 mM MgSO&sub4;). Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 2500 Upm 10 Minuten lang bei 4ºC pelletiert. Die Zellen werden resuspendiert in 3,5 ml 100 mM RbCl, 45 mM MnCl&sub2;, 50 mM CaCl&sub2;, 10 mM Kalium-MES pH 6,4 (MES = Methylethansulfonsäure). 200 µl kompetenter Zellen werden mit der in 5 µl Ligationsreaktion enthaltenen DNA bei 0ºC 30 Minuten lang transformiert. Die Zellen erhalten dann bei 42ºC einen Hitzeschock von 90 Sekunden; anschließend fügt man 4 ml 0,8% Agarose/SOBM mit 100 µl stationären JM101/TG1- Zellen hinzu und plattiert auf 10 cm Petrischalen mit SOBM-Agar aus.
Ein Subklon, der ein Hae III-Fragment von PB34 enthält, und mit dem 15mer hybridisiert, wird durch Screenen nach dem Verfahren von Benton und Davis, ibd., identifiziert. Dieser Klon wird isoliert und zur Verwendung als Matrize präpariert. Die DNA-Sequenz des Hae III-Fragments, das sich in diesem als 34-H1 bezeichneten Klon befindet, ist in Abb. 5 gezeigt. Eine DNA-Matrize von M13 wird hergestellt, indem man 1,5 ml infizierter Zellen 5 Stunden bei 37ºC wachsen läßt. Die Zellen werden durch 10-minütige Zentrifugation in einer Beckman-Mikrofuge pelletiert. 1,0 ml des (das Virus enthaltenden) Überstandes wird entfernt und 200 µl 20% Polyethylenglykol, 2,5 M NaCl werden hinzugefügt. Diese Probe wird dann bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation in einer Beckman-Mikrofuge. Der Niederschlag wird in 100 µl TE gelöst, 7,5 µl 4 M NaCH&sub3;COO, pH 4,5, werden hinzugefügt und die Probe wird zweimal mit einer 1:1-Mischung von Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert. Die einzelsträngige Phagen-DNA wird dann durch Zugabe von 2 Vol. Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wird durch Zentrifugation in einer Beckman-Mikrofuge pelletiert und in 30 µl 1 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, gelöst. Die DNA-Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy-Kettenabbruchsmethode (siehe z.B. Sanger et al., PNAS U.S.A., 74:5463 (1977)), wobei das 15mer als Primer verwendet wird. Die ermittelte Sequenz, die in den in den Abb. 4 und 5 dargestellten Sequenzen beinhaltet ist, bestätigte, daß der Subklon ein Exon des Schweine-AHF enthielt, da es die identischen 14 Aminosäuren besitzt, die durch den Bereich Phenylalanin&sub2; bis Glutamin&sub1;&sub5; in der aminoterminalen Sequenz des in Abb. 1 dargestellten 69Kd-Fragments umfaßt werden. Eine weitere Bestätigung ergab sich aus der Sequenzierung vom 5'-Ende des Hae III- Inserts in den 34-H1-Vektor, unterstützt durch den "Universal-Primer" (Bethesda Research Labs) neben dem Polylinker in diesem Vektor. Ebenso wurde das Insert dieses als 34-H1 bezeichneten Klons in M13mp9 umkloniert, indem die DNA mit Eco RI und Hind III geschnitten und nach Behandlung mit alkalischer Kälber-Phosphatase mit M13mp9-DNA, die mit Eco RI und Hind III gespalten worden war, ligiert wurde. Dieser Klon, der bezüglich des Universal-Primers eine Inversion des Hae III- Segments aufweist, wurde ebenfalls wie oben beschrieben sequenziert. Die resultierenden Sequenzdaten für das gesamte Insert 34-H1 sind in Abb. 5 gezeigt. Diese Sequenz bestätigt, daß dieser Subklon ein Exon des AHF-Gens des Schweins enthält, das von Nukleotid 169 bis 267 mindestens die 30 Aminosäuren von Phenylalanin&sub2; bis Arginin&sub3;&sub1; des 69Kd-Fragments codieren könnte (Fig. 1).
Es erscheint wahrscheinlich, daß Arginin&sub3;&sub1; an ein Intron grenzt, da stromabwärts von Nukleotid 267 (Abb. 5) in allen drei Leserahmen Terminations- Codons zu finden sind, und man in dem Bereich zwischen den Nukleotiden 266 - 267 auch eine Sequenz findet, die der Konsensus-Sequenz für die 5'-Splice-Stelle ähnlich ist. Außerdem unterscheidet sich die Aminosäuresequenz, die von der DNA stromabwärts codiert würde, vollständig von derjenigen, die in dem 69Kd-Fragment des Schweine-AHF beobachtet wurde.
DNA von PB34 wurde mit Bam HI gespalten und einer Elektrophorese durch ein Agarose-Gel unterworfen. Die Banden wurden nach Anfärben des Gels in 5 µg/ml Ethidiumbromid durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht. 3 Inserts von angenähert 6,6kb, 6,0kb und 1,8kb wurden beobachtet. Die DNA im Gel wurde wie in Maniatis et al., ibd., S. 383 - 386, beschrieben, auf Nitrocellulose übertragen. Die Hybridisierung des Filters mit dem 15mer und die Autoradiographie erfolgten wie oben beschrieben. Die Autoradiographie ergab, daß die Bande von 6,0kb ein Genfragment des AHF enthielt, das an die 15 mer-Sonde hybridisierte.
Somit war zum ersten Mal ein Abschnitt des Gens, das für AHF vom Schwein codiert, isoliert und identifiziert worden. Der rekombinante Klon PB34 des Bakteriophagen Lambda ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 40087 hinterlegt.

BEISPIEL 4

Lokalisierung des menschlichen AHF-Gens

Die bei Maniatis et al., Cell, 15:687 (1978) beschriebene menschliche genomische DNA-Bank wird auf das menschliche AHF-Gen getestet, indem man E. coli LE392 (öffentlich zugänglich) mit 6 x 10&sup5; pfu infiziert und auf 15 cm-Platten mit NZCYM Agar mit einer Dichte von 20.000 pfu/Platte ausplattiert. Diese Phagen werden nach dem Verfahren von Benton und Davis, ibd., mit dem 6,0kb AHF-Fragment vom Schwein, das in Beispiel 3 beschrieben wurde und das über Nick-Translation mit ³²P markiert wurde, als Sonde gescreent. Ein Phage, der ein starkes Hybridisierungssignal zeigt, wird gepickt, mit ungefähr 100 pfu/10 cm-Platte ausplattiert und wie oben beschrieben unter Verwendung des radioaktiv markierten 45mers als der einen Sonde und dem 6,0kb Bam HI-Fragment von PB34 als der anderen wie oben beschrieben zweifach getestet. Ein Phage, bezeichnet als HH25, der an beide Sonden hybridisiert, wird identifiziert, ein Platten-Vorratsstamm wird hergestellt und DNA wird wie oben beschrieben nach dem schnellen Verfahren präpariert. Die Phagen-DNA wird mit Sau3AI geschnitten, mit alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt, mit Phenol extrahiert und mit 20 ng M13mp8-DNA, die mit Bam HI geschnitten wurde, copräzipitiert. Die gefällte DNA wird durch Zentrifugation pelletiert und in 2 µl Ligasepuffer, der die T4-DNA-Ligase enthält, wieder gelöst. Die Ligation erfolgt 2 Minuten lang bei 16ºC, dann wird auf 50 µl mit Ligase-Puffer, der T4-DNA-Ligase enthält, verdünnt und weitere 3 Stunden bei 16ºC inkubiert. 5 µl dieser Reaktionsmischung werden wie oben in Beispiel 3 beschrieben zur Transformation von E. coli JM101/TG1 verwendet.
Die Plaques werden nach dem Verfahren von Benton und Davis unter Verwendung des radioaktiv markierten 15mers als Sonde getestet. Ein Phagen-Plaque, bezeichnet als 25-S1, der Hybridisierung zeigt, wird isoliert und einzelsträngige Phagen- DNA als Matrize für die DNA-Sequenzierung wird wie oben beschrieben präpariert. Die Sequenzierung erfolgt nach der von Sanger et al., ibd., beschriebenen Dideoxy- Kettenabbruchsmethode unter Verwendung des 15mers als Primer und ergibt die DNA- Sequenz des codierenden Strangs, die in Abb. 6 gezeigt ist. 84 auf diese Weise sequenzierte Nukleotide zeigten eine 85%ige Homologie mit dem homologen Bereich des AHF vom Schwein. Es existiert auch nur in einer Aminosäure ein Unterschied zwischen dem Bereich 2 bis 16 des 69Kd-Fragments des AHF vom Schwein, wie er in Abb. 1 gezeigt ist, und dem entsprechenden Bereich, der aus der menschlichen Nukleotidsequenz der Abb. 6 abgeleitet wurde. Dieser hohe Grad an Homologie zeigt, daß die DNA des rekombinanten Phagen HH-25 vom AHF-Gen stammt.
Somit wurde zum ersten Mal ein Exon für das menschliche AHF-Gen isoliert und identifiziert. Die Rekombinante HH-25 des Bakteriophagen Lambda ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 40086 hinterlegt.

BEISPIEL 5

Identifizierung von Zellen, die AHF aktiv transkribieren

Die oben beschriebenen AHF-Exons von Schwein und Mensch sind in den verschiedensten Funktionen nützlich; in einer Funktion dienen sie als Test-Agens für die Identifizierung von Gewebe, das in vivo Syntheseort von AHF ist. Es stehen eine Reihe von Testverfahren zur Verfügung, die auf der Verwendung des Exons als genauem Komplement zur mRNA basieren, die bei der natürlichen Expression von AHF gebildet wird. In den Testverfahren wird Gewebe von verschiedenen Teilen des Körpers behandelt, um die darin enthaltenen mRNA freizusetzen; diese wird dann mit dem DNA- Segment, das das Exon für AHF enthält, hybridisiert, und wenn ein Molekül mRNA mit diesem Exon hybridisiert, so ist das Gewebe, das die Quelle dieser mRNA ist, auch die Quelle von AHF.

1. Screening-Verfahren

Gewebe von Schwein oder Mensch aus verschiedenen Organen, einschließlich Nieren, Leber, Pankreas, Milz, Knochenmark, Lymphknoten etc., wird durch Extraktion mit Guanidin-Hydrochlorid nach der Methode von Cox, Methods Enzymol., 12B:120 (1968), mit einigen Änderungen präpariert. Im einzelnen wird das Gewebe in 8 M Guanidin-Hydrochlorid (oder 4 M Guanidin-Isothiocyanat, wie vorgeschlagen von Chirgwin et al.) Biochemistry 18:5294 (1979), siehe auch Maniatis et al., ibd., S. 189ff) 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM EDTA explantiert und in einem Omnimixer (Sorvall) bei Höchstgeschwindigkeit 1 Minute lang homogenisiert. Das Homogenat wird 5 Minuten bei 5000 Upm in einem Sorvall-Rotor HB-4 geklärt, und die RNA wird durch Zugabe von 0,5 Vol. Ethanol gefällt. Die RNA wird gelöst und noch dreimal aus 6 M Guanidin- Hydrochlorid gefällt bevor sie in H&sub2;O gelöst wird.
Die mRNA aus diesem Pool wird durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose (Collaborative Research) angereichert.
Diese mRNA wird dann einer Elektrophorese durch ein Agarose-Gel mit Formaldehyd unterworfen (Maniatis et al., ibd, S. 202-3). Die mRNA in dem Gel wird dann auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (Maniatis et al., ibd., S. 203-4).
Die auf diese Weise erhaltene mRNA wird mit der radioaktiv markierten Exon-DNA von Schwein oder Mensch, die wie oben beschrieben erhalten wurde, hybridisiert, und die Existenz von Hybriden wird durch Autoradiographie nachgewiesen. Ein radioaktives Signal zeigt an, daß die Gewebequelle für die mRNA eine Quelle der AHF-Synthese im Körper ist.
Alternativ kann die mRNA getestet werden, indem man die Testmethode der S&sub1;- Protektion anwendet.
Nuklease S&sub1; ist ein Enzym, das einzelsträngige DNA, aber keine basengepaarten Nukleotide, wie beispielsweise hybridisierte mRNA/DNA, hydrolysiert. Folglich zeigt die Existenz einer radioaktiven Bande nach Acrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie, daß die einzelsträngige DNA, die dem AHF-Exon enspricht, durch die komplementäre mRNA, d.h. die mRNA für AHF, geschützt wurde. Folglich ist das Gewebe, das die Quelle dieser mRNA war, in vivo ein Syntheseort für AHF. Dies Gewebe kann als Quelle für mRNA für AHF verwendet werden. Dies Screening-Verfahren kann sich als etwas empfindlicher erweisen als das oben beschriebene Testverfahren.
Eine Sonde, die aus einer einzelsträngigen, radioaktiv markierten und zur mRNA komplementären DNA besteht, wird, unterstützt durch den Universal-Primer von M13, an dem vom Schwein stammenden genomischen Subklon 34-H1 synthetisiert. Die Reaktion erfolgt in 100 µl Lösung 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 40 µM dGTP, dTTP, dCTP, 60 µCi ³²P-dATP (400 Ci/mMol), mit 10 ng Universal-Primer, 200-400 ng 34-H1 Matrizen-DNA und dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I (E. coli). Die Reaktionsmischung wird 60 Minuten bei 23ºC und 10 Minuten bei 70ºC inkubiert, dann werden 50 Einheiten Pst I hinzugefügt und für weitere 60 Minuten inkubiert.
Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol/Chloroform beendet, man fügt NaCl zu einer Konzentration von 0,2 M hinzu und fällt dann mit 2 Vol. 100% Ethanol. Die gefällte DNA wird durch Zentrifugation pelletiert, in 20% Sucrose, 50 mM NAOH, 0,1% Kresolgrün aufgelöst und dann einer Elektrophorese in 2% Agarose in 50 mM NaOH, 10 mM EDTA unterworfen. Das resultierende einzelsträngige Fragment wird durch Autoradiographie lokalisiert, die Bande ausgeschnitten und die DNA durch Elektroelution in einem Dialyseröhrchen isoliert.
Die mRNA-Probe wird aus Gewebe von Leber, Milz usw. nach der oben beschriebenen Methode mit Guanidin-Hydrochlorid präpariert.
Die Sonde wird dann mit der mRNA-Probe (erhalten aus dem Anreicherungsschritt der Oligo(dT)-Chromatographie) in 50% Formamid, 0,4 M NaCl, 40 mM PIPES [Piperazin- N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)], pH 6,5, 1 mM EDTA, 5-50 µg mRNA, 2 ug markierte DNA in einem Volumen von 15 µl hybridisiert. Die Hybridisierung wird durch die Zugabe von 200 µl kaltem S&sub1;-Nukleasepuffer (0,25 M NaCl, 0,3 M NaCH&sub3;COO (pH 4,5), 1 mM ZnSO&sub4;, 5% Glycerin) und 1000 Einheiten S&sub1;-Nuklease beendet. Die Reaktionsmischung wird 30 Minuten bei 45ºC inkubiert. Die Proben werden mit Phenol extrahiert, mit 10µg Hefe-tRNA als Träger mit Ethanol gefällt und einer elektrophoretischen Analyse in einem 5% Polyacrylamid-Sequenzierungsgel unterworfen (Maxam-Gilbert, PNAS USA, 74:560 (1977)).

BEISPIEL 6

Verwendung von Exon-DNA von AHF zur Gewinnung von mRNA für AHF aus Gewebe

Sobald ein Gewebe als Quelle für mRNA identifiziert ist, wird mRNA von AHF aus diesem Gewebe extrahiert und zur Konstruktion einer cDNA-Bank verwendet. Die cDNA- Bank wird dann benutzt, um wie unten beschrieben einen cDNA-Klon voller Länge zu identifizieren und zu konstruieren, der für die Aminosäuresequenz von AHF codiert und keine Introns des genomischen Klons enthält. Danach wird die cDNA, die für das AHF-Protein codiert, zur Expression von AHF in einem geeigneten Wirt in einen passenden Expressionsvektor eingebaut.
Da zur Behandlung von Hämophilie und für andere Verwendungszwecke eine starke Nachfrage an menschlichem AHF besteht, wird die Präparation von cDNA für menschlichen AHF beschrieben.

1. Gewinnung von mRNA für menschlichen AHF

mRNA aus menschlichem Gewebe, das für die AHF-Synthese verantwortlich ist, wird nach der Extraktionsmethode mit Guanidin-Hydrochlorid gemäß Cox mit den Modifikationen nach Chirgwin et al. wie oben präpariert.
Eine weitere Fraktionierung der durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose erhaltenen mRNA wird durch Sedimentation in 5-20% Sucrosegradienten mit 10 mM Tris- HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA und 0,2% SDS durch Zentrifugation für 24 Stunden bei 22.000 Upm in einem SW28-Rotor von Beckman erreicht. Fraktionen von 1,0 ml werden gesammelt, mit Natriumacetat bis zu einer Konzentration von 0,2M versetzt, zweimal mit Ethanol gefällt und dann in Wasser gelöst. Die Größenverteilung der fraktionierten RNA wird durch Elektrophorese durch 1,4% Agarose-Gele mit 2,2 M Formaldehyd bestimmt.
mRNA, die mit einem S(Svedberg)-Wert von größer als 28 sedimentiert, wird zur Synthese doppelsträngiger cDNA vereinigt. 10 µg dieser RNA wird bei Raumtemperatur in 10 µl 10 mM Methylquecksilberhydroxid denaturiert. Zur Inaktivierung des Methylquecksilberhydroxids werden 140 mM 2-Mercaptoethanol hinzugefügt. Die RNA wird dann auf 50 µl 140 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 42ºC), 1 mM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats, 200 µg/ml Oligo(dT)12-18, 10 mM MgCl&sub2;, und 0,1 µCi ³²P-dCTP/ml verdünnt. Die Reaktionen erfolgen nach Zugabe von 3 µl von 17 Einheiten/µl AMV reverse Transcriptase (Life Sciences) für 1 Stunde bei 42ºC. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 0,25 M EDTA (pH 8,0) auf 20 mM beendet. Die resultierende Mischung wird einmal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, gefolgt von einer Chloroformextraktion. Die Probe wird dann an einer 5ml Sepharose CL-4B-Säule (Pharmacia), die mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, äquilibriert wurde, chromatographiert. Das Porenvolumen wird gesammelt und die Nukleinsäuren (einschließlich aller RNA/cDNA-Hybride) werden durch Zugabe von 2,5 Vol. Ethanol gefällt.
Vorzugsweise wird in Verbindung mit dem obigen Verfahren auch ein Oligonukleotidsegment des AHF-Exons anstelle von Oligo(dT) verwendet, um die reverse Transkription zu starten (Ullrich et al., Nature, 303:821 (1983)).
Die RNA/cDNA-Hybride werden in 35 µl deionisiertem H&sub2;O gelöst, auf 100 mM Kaliumcacodylat (pH 6,8), 100 µM dCTP, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Kobaltchlorid eingestellt und durch Zugabe von 10 Einheiten Terminale Deoxynukleotidyltransferase (pH Biochemicals) und Inkubation für 30 Sekunden bei 37ºC enzymatisch mit Schwänzen versehen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,25 M EDTA zu einer Konzentration von 10 mM beendet. Tris-HCl (pH 8,0) wird auf 300 mM hinzugefügt und die Probe wird einmal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) und dann mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die Nukleinsäuren werden aus diesem Produkt durch Zugabe von 2,5 Vol. Ethanol gefällt.
Die mit dC-Schwänzen versehenen Hybridmoleküle werden dann mit 170 µg/ml Oligo(dG)14-18 Cellulose in 10 mM KCl, 1 mM EDTA 10 Minuten bei 43ºC und dann weitere 10 Minuten bei 23ºC reassoziieren gelassen. Das Reaktionsprodukt wird dann auf 100 µl 100 mM Ammoniumsulfat, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mM MgCl&sub2;, 100 µg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, Cohn-Fraktion V) und 100 µM Nikotinamid-Adenin- Dinukleotid verdünnt. Die cDNA-Synthese des zweiten Strangs wird durch Zugabe von 1 Einheit RNase H (P-L Biochemicals), 1 Einheit E. coli DNA-Ligase, und 10 Einheiten DNA-Polymerase I initiiert, und man inkubiert 12 Stunden bei 16ºC.
Die Probe wird dann wie oben beschrieben über Sepharose CL-4B chromatographiert. Doppelsträngige DNA wird mit Ethanol gefällt und wie für die RNA/cDNA- Hybride beschrieben mit dC-Schwänzen versehen.

2. Screenen auf menschliche AHF-DNA

Die wie oben beschrieben erhaltene, mit dC-Schwänzen versehene doppelsträngige cDNA wird mit einer äquimolaren Menge pBR322 mit dG-Schwänzen (New England Nuclear) in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl 2 Stunden bei 37º reassoziieren gelassen. Die verknüpften chimären Moleküle werden dann bei -20ºC bis zur bakteriellen Transformation eingefroren.
Die bakterielle Transformation erfolgt mit E. coli MC1061. Die Zellen (50 ml) werden bis zu einer optischen Dichte von 0,25 bei 600 nm wachsen gelassen. Die Zellen werden durch 12-minütige Zentrifugation bei 2.500 Upm konzentriert, in 10 ml sterilem 100 mM CaCl&sub2; gewaschen und wieder wie oben durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen werden in 2 ml sterilem 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und 12 Stunden bei 4ºC gehalten. Die verknüpften chimären Moleküle werden bei einem Verhältnis von 5 ng doppelsträngiger cDNA pro 200 µl kompetenten Zellen bei 4ºC 30 Minuten inkubiert. Die Bakterien werden dann einem zweiminütigen Hitzeschock von 42ºC unterworfen. Dann wird 1 ml L-Medium hinzugefügt und die Zellen 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Zellen werden dann auf LB-Agar-Platten mit 5 µg/ml Tetracyclin ausplattiert.
Menschliche AHF-Klone werden nach dem Verfahren der Koloniehybridisierung nach Grunstein und Hogness, PNAS U.S.A. 72:3961 (1975) identifiziert. Die cDNA- Bank wird dann auf ein Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell) ausplattiert, das auf LB-Agar-Platten mit 5 µg/ml Tetracyclin liegt. Die Kolonien werden über Nacht bei 37ºC wachsen gelassen, und dann wird das Filter auf steriles Whatman 3 M-Papier gelegt. Ein vorbefeuchtetes Nitrocellulosefilter wird dann gegen das Originalfilter gepresst und die Filter mit einer 18er-Nadel fest verbunden. Das Replica-Filter wird dann auf LB-Tetracyclinplatten bei 37ºC wachsen gelassen, bis die Kolonien einen Durchmesser von 1 bis 2 mm erreicht haben. Die Filter werden dann auf LB-Platten mit 150 µg/ml Chloramphenicol übertragen und 16-24 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Die Filter werden dann entfernt und 5 Minuten bei Raumtemperatur auf ein mit 0,5 M NAOH gesättigtes Whatman 3 M-Papier gelegt. Anschließend werden die Filter neutralisiert, indem sie auf mit 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl gesättigtes Whatman 3 M-Papier und dann auf mit 2x Standard-Salz-Citrat (SSC) gesättigtes Whatman 3 M-Papier gelegt werden. SSC (1x) besteht aus 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat.
Die Filter werden luftgetrocknet und im Vakuum 2 Stunden bei 80ºC gebacken. Die Vorhybridisierung der Filter erfolgt 30 Minuten bei 65ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1% SDS gefolgt von 30 Minuten in 7x SSC, 5x Denhardt's (1x Denhardt's ist 0,02% Polyvinylpyrrolidin, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinderserumalbumin), 100 µg/ml denaturierter DNA von Lachsspermien und 0,1% SDS. Mit ³²P markierte menschliche Exon-DNA, die wie oben beschrieben präpariert wurde, wird zu 10&sup6; cpm/ml hinzugefügt und die Hybridisierung 12-16 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die Filter werden dann unter mehrfachem Wechsel in 7x SSC, 0,1 SDS 1-2 Stunden bei 37ºC gewaschen. Die Filter werden dann luftgetrocknet und einer Autoradiographie mit Kodak XAR-Film und Verstärkerfolie (Dupont Lightning-Plus) unterworfen.
Diejenigen Kolonien, die ein Hybridisierungssignal über dem Hintergrund zeigten, werden in L-Medium mit 50µg/ml Tetracyclin zur schnellen Reinigung von Plasmid-DNA wachsen gelassen. Die Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes et al., Anal. Biochem., 114:193 (1981) gereinigt. Ein Aliquot dieser DNA wird mit der Restriktionsendonuklease Pst I gespalten, und die Fragmente werden durch Elektrophorese in 1% Agarose/TBE-Gelen aufgetrennt und entsprechend dem Verfahren von E. Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975), Methods Enymol, 69:152 (1980) geblottet. Die Nitrocellulosefilter werden mit radioaktiv markierter Exon-DNA von menschlichem AHF wie für die Koloniehybridisierung beschrieben hybridisiert. Diejenigen Plasmide, die Pst I-Inserts enthielten, die mit der Exon-DNA von AHF hybridisieren, wurden zur Sequenzanalyse der DNA verwendet.
Zur Sequenzierung wurde Plasmid-DNA (gereinigt aus 0,75 ml Kultur nach dem Verfahren von Holmes et al., ibd.) vollständig mit der Restriktionsendonuklease Sau3A I verdaut. Das resultierende als 34-S1 identifizierte DNA-Segment hat die in Abbildung 4 dargestellte DNA-Sequenz. Die DNA wird nach Extraktion mit Phenol/Chloroform mit Ethanol gefällt und in 10 µl TE (10 µM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) wieder aufgelöst. 5 µl der DNA-Lösung werden mit 20 ng von mit Bam HI gespaltener DNA der replikativen Form von M13mp9 in 100 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und einem Überschuß an T4-DNA- Ligase ligiert. Die Ligationen werden 2-4 Stunden bei 15ºC durchgeführt.
5 µl der Ligationsreaktionen werden wie oben beschrieben zur Transformation von 200 µl E. coli JM101/TG1 verwendet. Rekombinanten sind als weiße Plaques zu identifizieren, wenn man sie auf LB-Agar-Platten mit X-gal als Indikator für β- Galactosidase-Aktivität wie bei Davies et al., J. Mol. Biol. 36:413 (1968) beschrieben, wachsen läßt.
Rekombinante Phagen, die Sequenzen tragen, die mit dem menschlichen Exon hybridisieren, werden nach dem Verfahren von Benton et al., Science 196:180 (1977) unter Verwendung eines radioaktiv markierten menschlichen AHF-Exons als Sonde identifiziert. Plaques, die ein Hybridisierungssignal zeigen, werden gepickt und mit L-Medium in 1,5 ml-Kulturen wachsen gelassen. Einzelsträngige Phagen-DNA, die aus diesen Kulturen präpariert wurde, dient als Matrize bei der mit Oligonukleotid- Primern unterstützten DNA-Synthese. Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxymethode (s. z.B. Sanger et al., PNAS U.S.A. 74:5463 (1977)).
Rekombinanten von menschlichem AHF werden identifiziert, indem man ihre Nukleotidsequenz mit derjenigen vergleicht, die aus der Exon-Sequenz des menschlichen AHF bekannt ist.

3. mRNA für AHF vom Schwein

Rekombinanten von menschlichem AHF werden verwendet, um eine Gen-Bank aus Schweinegewebe zu testen, die ebenso wie die cDNA-Bank aus menschlichem Gewebe hergestellt wurde. Voraussichtliche rekombinante DNA-Klone von Schweine-AHF werden nach dem Verfahren von Grunstein und Hogness unter Verwendung des mit ³²P markierten Exon-Fragments vom Schwein als Sonde wie oben identifiziert. Die Sonde ist das vom Schwein stammende AHF-Exon, das durch Nick-Translation mit ³²P nach Rigby et al., J. Mol. Biol., 113:237 (1977) markiert wurde.
Kolonien, die ein Hybridisierungssignal zeigen, werden zur schnellen Plasmidreinigung wie oben beschrieben wachsen gelassen. Die Plasmid-DNA wird mit der Restriktionsendonuklease Pst I gespalten, durch 1% Agarose/TBE-Gele elektrophoretisch aufgetrennt und nach dem Verfahren von E. Southern (1975) geblottet. Die Blots werden mit Rekombinanten vom Schweine-AHF, die durch Nick-Translation mit ³²P markiert wurden, hybridisiert.
Klone voller Länge können in bekannter Weise konstruiert werden, beispielsweise durch Ligation von DNA-Fragmenten aus überlappenden Klonen an Restriktionsstellen, die beiden Klonen gemeinsam sind, eine Technik, die als "Wandern auf dem Chromosom" ("gene walking") bekannt ist.

4. Identifizierung von Klonen voller Länge aus den Schritten 2 oder 3

Der Abstand zwischen den 5'-Ende eines Klons und dem 5'-Ende der mRNA kann durch Primer-Extension nach dem Verfahren von Agarwal et al., J.B.C. 256(2):1023- 1028 (1981) unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers analysiert werden, dessen Sequenz aus dem (aminoterminalen) 5'-Bereich des vorliegenden AHF-Klons stammt. Wenn Gele, die nach diesem Verfahren entwickelt wurden, mehr als ein Transkript zeigen, sollte die stärkste Bande als das Transkript betrachtet werden, das die volle mRNA darstellt.
Es gibt jedoch viele mRNAs, die einen langen Bereich einer untranslatierten 5'-Sequenz enthalten. Folglich hängt die Expression menschlicher AHF-DNA nicht allein vom Erhalt eines vollständigen cDNA-Klons ab. Beispielsweise kann ein Klon erhalten werden, der nach der DNA-Sequenzanalyse ein Methionin-Codon zeigt, dem eine Sequenz folgt, die analog oder identisch mit einem bekannten Sekretionssignal eukaryontischer Proteine ist und die mit den übrigen Codons in einem Leseraster liegt. Transformation und Expression sollten für einen Klon erfolgen, der die Met- Sekretionssignal-Sequenz enthält, von der erwarteten Größe ist und einen Poly(T)- 3'-Terminus besitzt.

5. Alternatives Verfahren

Alternativ zu den in den Abschnitten 1-3 beschriebenen Verfahren werden die cDNA-Klone für AHF von Schwein oder Mensch bevorzugt unter Verwendung eines Bakteriophagen-Vectors in folgender Weise identifiziert.
mRNA aus fötalem menschlichem Lebergewebe, das für die AHF-Synthese verantwortlich ist, wurde mit Guanidin-Hydrochlorid nach der Methode von Cox und mit den Modifikationen nach Chirgwin et al. wie oben in Beispiel 5, Abschnitt 1, präpariert. Die cDNA des ersten Stranges wurde ausgehend von 10 ug PolyA&spplus;-RNA aus fötaler Leber nach dem in Beispiel 6, Abschnitt 1, ibd. beschriebenen Verfahren synthetisiert. Im einzelnen wurden 10 µg dieser RNA bei Raumtemperatur in 10 µl 10 mM Methylquecksilberhydroxid denaturiert. 140 mM 2-Mercaptoethanol wurde hinzugefügt, um das Methylquecksilberhydroxid zu inaktivieren. Die RNA wurde dann auf 50 µl 140 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 42ºC) 1 mM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats, 200 µg/ml Oligo(dT)12-18, 10 mM MgCl&sub2; und 0,1 µCi ³²P-dCTP/ml verdünnt. Diese Reaktionen wurden nach Zugabe von 3 µl von 17 Einheiten/µl AMV reverse Transkiptase (Life sciences) eine Stunde bei 42ºC durchgeführt.
Zur Synthese des ersten Stranges einer Gen-Bank mittels Primer-Extension wurden 200 pMol eines speziellen komplementären 38mers in den Denaturierungsschritt mit CH&sub3;HgOH eingebracht, und nach 10 Minuten bei 23ºC wurde die Reaktion auf 140 mM β-Mercaptoethanol, 0,7 M KCl, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 42ºC) und 1 Einheit/µl RNasin: (Biotec) eingestellt und 2 Minuten bei 50ºC und 2 Minuten bei 42ºC inkubiert. Dann wurde auf 50 µl 140 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 42ºC), 1 mM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats, 10 mM MgCl&sub2; und 0,1 µCi ³²P- dCTP/µl verdünnt. Die Reaktion wurde nach Zugabe von 3 µl von 17 Einheiten/µl AMV reverse Transkriptase 1 Stunde bei 42ºC inkubiert.
Nach der Synthese des ersten Stranges wurden die Reaktionen auf 150 µl enthaltend 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 7,5 mM NH&sub4;SO&sub4; und 250 µM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats verdünnt, und die Synthese des zweiten Stranges wurde durch Zugabe von 1 Einheit RNase H (E. coli) und 45 Einheiten DNA-Polymerase I initiiert. Die Reaktionen wurden 8 Stunden bei 16ºC inkubiert durch Zugabe von EDTA auf eine Konzentration von 20 mM beendet und mit H&sub2;O auf ein Endvolumen von 200 µl gebracht. EcoRI-Methylierung erfolgte dann durch Zugabe von S-Adenosylmethionin zu einer Konzentration von 50 µM und von 40 Einheiten EcoRI-Methylase. Diese Reaktionen wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, durch Phenol/Chloroform terminiert und unter Verwendung von Sephadex G50, das mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 0,1 M NaCl äquilibriert worden war, chromatogaphiert. Das Porenvolumen wurde gesammelt und durch Zugabe von Ethanol gefällt.
Die cDNA-Moleküle wurden in 200 µl mit 50 mM Tris, pH 8,3, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 50 µM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats, 100 µg/ml Ovalbumin und 5 Einheiten T4-Polymerase mit glatten Enden versehen. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann durch Extraktion mit Phenol/Chloroform beendet. Die Nukleinsäuren wurden dann durch Zugabe von Ethanol gefällt.
An die cDNA-Moleküle mit glatten Enden wurden dann unter Standardbedingungen (Maniatis et al., ibd., S. 243) in einem Gesamtvolumen von 45 µl EcoRI-Linker (Collaborative Research) ligiert. Die Reaktionen wurden dann durch Zugabe von EDTA auf 15 mM beendet und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die Nukleinsäuren wurden mit Ethanol gefällt und durch Zentrifugation pelletiert. Die mit Linkern versehene cDNA wurde in 200 µl 100 µM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl aufgelöst mit 300 Einheiten EcoRI 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die Reaktion wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und über Sepharose CL-4B, äquilibriert mit 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, chromatographiert. Die cDNA in dem Porenvolumen wurde gesammelt, mit Ethanol gefällt und durch Zentrifugation pelletiert.
Die cDNA wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA wieder gelöst und mit EcoRI-gespaltener, mit Phosphatase behandelter Lambda Charon 21A-DNA bei verschiedenen Verhältnissen von cDNA zu Vector-DNA unter Standardligationsbedingungen ligiert. Die ligierte DNA wurde verpackt und nach üblichen Verfahren titriert (Maniatis et al., ibd., S. 64, 256). Die Gen-Bank wurde ausplattiert und unter Verwendung von ³²P-markierter menschlicher Exon-DNA unter den Bedingungen von Benton and Davis, ibd., getestet. Man erhielt überlappende Klone, die ungefähr 10.000 Basenpaare umfaßten, von denen ein wesentlicher Teil sequenziert wurde, wobei sich ein langer offener Leserahmen ergab, der für menschlichen AHF codierte. Die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA, die für menschlichen AHF codiert, ist in Abb. 7 zusammen mit der für menschlichen AHF abgeleiteten Aminosäuresequenz gezeigt. Die überlappenden Klone wurden in dem Vector pSP64 (Promega Biotec) nach üblichen Methoden zusammengesetzt, z.B. durch Ligation von DNA-Fragmenten aus überlappenden Klonen an Restriktionsstellen, die beiden Klonen gemeinsam sind. Ein rekombinanter Klon von pSP64 mit der in Abb. 7 dargestellten Nukleotidsequenz, bezeichnet als pSP64-VIII, ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 39812 hinterlegt.

BEISPIEL 7

Expression von AHF von Mensch oder Schwein

Dieses Beispiel behandelt die Expression von AHF in einem Co-Transformations- System unter Verwendung des Klons mit voller Länge, wie er nach dem Verfahren in Beispiel 6 erhalten wurde.

1. Präparation des Transformationsvektors

Eine direkte Methode, um den AHF-Transformationsvektor zu erhalten, wird unten beschrieben. Das Plasmid pCVSVL wird teilweise mit Pst I verdaut und der Verdau durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Nach Sichtbarmachung wird die Bande des linearen DNA-Fragments, das dem Plasmid mit der vollen Länge entspricht, als pCVSVL-B1 isoliert.
Die cDNA für AHF wird aus den Klonierungsvektoren von Beispiel 6 durch partiellen Verdau mit Pst I wieder erhalten. Der partielle Verdau wird durch Gelelektrophorese aufgetrennt und die Bande, die dem Molekulargewicht der cDNA in voller Länge entspricht, wird isoliert. pCVSVL-B1 wird mit diesem DNA-Fragment verknüpft, mit T4-Ligase bei 15ºC ligiert, in E. coli HB101 transfiziert, und Transformanden werden nach ihrer Tetracyclinresistenz selektiert. Die selektierten E. coli-Transformanden werden mit Tetracyclin wachsen gelassen. Plasmid pCVSVL- B1a wird auf übliche Weise wiedererhalten. Die richtige Orientierung der cDNA in dem Plamid kann auf übliche Weise mit (einer) geeigneten Endonuklease(n) bestimmt werden.

2. Co-Transformation: Selektion und Amplifikation

Plasmid pCVSVL-A1a oder pCVSVL-B1a und pAdD26SVpA#3 (Kaufman et al., ibd.) werden zusammengemischt (50 µg HP und 0,5 µg pAdD26SVpA #3) und durch Zugabe von NaOAc pH 4,5 auf 0,3 M und von 2,5 Vol. Ethanol gefällt. Die gefällte DNA wird an der Luft trocknen gelassen, in 2x HEBSS (0,5 ml) resuspendiert und wie beschrieben kräftig mit 0,25 M CaCl&sub2; (0,5 ml) gemischt (Kaufman et al., ibd.). Man läßt das Calciumphosphat-DNA-Präzipitat 30 Minuten bei Raumtemperatur absetzen und verwendet es dann für CHO DUKX-B1-Zellen (Chasin und Urlaub, 1980, erhältlich von der Columbia University). Vermehrung und Pflege dieser Zellen wurden beschrieben (Kaufman et al., ibd., Chasin und Urlaub, 1980).
Die DUKX-B1 Zellen werden vor der Transfektion zu 5x10&sup5;/10cm-Schale 24 Stunden subkultiviert. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden 5 ml Medium mit 10% fötalem Kälberserum hinzugefügt und die Zellen 4,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Medium wird dann von der Monoschicht entfernt, und 2 ml Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 10 µg/ml Thymidin, Adenosin und Desoxyadenosin und Penicillin und Streptomycin hinzugefügt. 2 Tage später werden die Zellen im Verhältnis 1:15 in einem Medium mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum und Penicillin und Streptomycin aber ohne Nukleoside subkultiviert. Die Zellen werden dann nach 4 bis 5 Tagen mit demselben Medium wieder gefüttert.
Kolonien erscheinen 10 bis 12 Tage nach der Subkultivierung im Selektivmedium. Methotrexat (MTX)-Selektion, Nachweis des AHF-Gens und Amplifikation des Selektionsgens erfolgen entsprechend Axel et al., US-P 4 399 216, oder Kaufman et al., ibd.
Die Ausbeuten an AHF können durch Co-Transformation der permanenten Zellinie EA.hy 926 (Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:3734-3737 (1983) anstelle von DUKX-B1 Zellen verbessert werden. In diesem Fall sollte das co-transformierende Selektionsgen das dominante DHFR-Gen sein (Haber et al., Somatic Cell Genetics 4:499-508 (1982)). Ansonsten entsprechen Co-Transformation und Kultivierung im wesentlichen den obigen Ausführungen.

3. Produktion von AHF

Die in Abschnitt 2 selektierten, AHF produzierenden CHO-Transformanden werden in Impfkultur nach Standardmethoden gehalten. Die Kultur wird durch Zellkultivierung in üblichen Medien auf 10 l gebracht. Das Medium muß kein MTX enthalten und enthält keine Nukleoside, um Revertanten des Selektionsgens auszuschließen.
Der Überstand der Kultur wird nach den Standardtests bei Blutplasmaproben auf Gerinnungsaktivität kontrolliert (Verringerung der Gerinnungszeit bei an Faktor VIII defizientem Plasma). Der Überstand kann nach üblichen Verfahren, wie Fällung mit Polyethylenglykol und Glycin (wie für die Reinigung von AHF aus Blutplasma bekannt), gereinigt werden, um die Empfindlichkeit der Tests auf Faktor VIII zu erhöhen.
Wenn die Faktor VIII-Aktivität eine Spitze erreicht hat, werden die Zellen aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation abgetrennt. Faktor VIII wird dann durch Fällungen mit Polyethylenglykol und Glycin wiedergewonnen und gereinigt. Die Gerinnungsaktivität wird an Plasma gezeigt, dem Faktor VIII fehlt.

4. Alternatives Verfahren zur Produktion von AHF

Eine cDNA voller Länge, die den gesamten für AHF codierenden Bereich enthält, wurde aus dem oben beschriebenen Exon in HH-25, zwei cDNA-Klonen, die die äußeren 5'- und 3'-Bereiche des Exons überlappten, und einem dritten Klon konstruiert, der den 3'-cDNA-Klon überlappte und bis über das Terminationscodon hinausreichte. Die Konstruktion erfolgte so, daß synthetische Sal I-Stellen gerade in 5'-Position vor das Initiator-Methionin und in 3'-Position zum Translations-Stopsignal am Ende der für AHF codierenden Sequenzen gesetzt wurden. Dies erlaubte den Einbau in die und das Ausschneiden aus der Sal I-Stelle des Polylinkers von pSP64. Das Sal I- Fragment aus diesem Klon (pSP64-VIII) wurde gereinigt und mit pCVSVL2 ligiert. pCVSVL2 ist ein Plasmid, das mit dem Expressionsvektor pCVSVL (Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 2:1304 (1982) identisch ist, außer daß darin die 3'- zur SV40- Polyadenylierungssequenz befindliche Pst I-Stelle deletiert wurde, was nach üblichen Verfahren geschehen kann, und daß es eine Duplikation des SV40-Ava II- "D"-Fragments stromaufwärts vom größeren späten Promotor (MLP) von Adenovirus enthält. pCVSVL2 wurde ausgehend von pAdD26SVpA(1) (s. Kaufman et al., ibd.) konstruiert, indem man an jedes Ende der beiden Ava II-"D"-Fragmente von SV40 Xho I-Linker anfügte und die Fragmente in die Xho I-Stelle in PAdD26SVpA(1) einsetzte. Die Ava II-"D"-Fragmente werden beide in einer Weise eingebaut, daß sich der späte Promotor von SV40 in derselben Orientierung wie der größere späte Promotor von Ad2 befindet. Zu den Plasmiden pCVSVL und pAdD26SVpA(3) siehe Kaufman et al., ibd. Um das Sal I-Fragment von pSP64-VIII in pCVSVL2 einzubauen, wurde die einzige Pst I- Stelle in pCVSVL2 in eine Sal I-Stelle umgewandelt (Rothstein et al., Methods Enzym., 69:98 (1980). Das aus pSP64-VIII ausgeschnittene Sal I-Fragment lieferte nach dem Einbau pCVSVL2-VIII. pCVSVL2-VIII enthält die korrekte 5'- 3'-Orientierung, die eine Transkription der für AHF codierenden Sequenz vom Adenovirus-MLP des Vektors erlaubt. pCVSVL2-VIII ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. 39813 hinterlegt.
pCVSVL2-VIII wurde in COS-7-Zellen von Affen (Mellon et al., Cell 27:279 (1981) entsprechend der Vorschrift über die DEAE Dextran-Transfektion (Sampayrac und Danna, PNAS U.S.A. 78:7575 (1981) eingeschleust. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium kultiviert, das 3 Tage nach der Transfektion auf AHF-Aktivität getestet wurde.
Die Faktor VIII:C-Aktivität wurde durch Test mit einem chromogenen Substrat bestimmt (Didisheim, Science 129:389 (1959)), der bestätigte, daß eine Expression von menschlichem Faktor VIII:C in Höhe von ungefähr 0,05 Einheiten/ml erreicht worden war.

Claims

1. Isolierter rekombinanter Vektor, enthaltend DNA, die für menschlichen Faktor VIII:C codiert, der ein Polydesoxyribonukleotid mit der Sequenz umfaßt:

2. Die DNA des rekombinanten Vektors nach Anspruch 1, worin die DNA menschliche genomische DNA ist.

3. Vektor nach Anspruch 1, worin die für menschlichen Faktor VIII:C codierende DNA mittelbar oder indirekt mit DNA nicht-menschlichen Ursprungs gekoppelt ist.

4. Nicht-menschlicher rekombinanter Expressionsvektor für menschlichen Faktor VIII:C, der ein DNA-Segment mit der Sequenz:

umfaßt, das operativ mit einer heterologen regulatorischen Kontrollsequenz gekoppelt ist.

5. Transformierte nicht-menschliche Säugerzellinie, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 4.

6. Testmittel zur Identifikation von Desoxyribonukleotidsequenzen und Ribonukleotidsequenzen, die mindestens für einen Teil des menschlichen Gens für Faktor VIII:C codieren, das im wesentlichen aus einem Desoxyribonukleotid mit der folgenden Sequenz oder ihrem inversen Komplement besteht:

7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Gerinnungsaktivität des menschlichen Faktors VIII:C, das die Schritte umfaßt:

(1) Kultivierung einer isolierten, mit doppelsträngiger DNA transformierten Zelle, worin die DNA

(a) operativ mit einer heterologen regulatorischen Kontrollsequenz gekoppelt wurde,

(b) unter strikten Bedingungen an die folgende Nukleotidsequenz hybridisiert:

und

(c) für ein Protein codiert, das nach Expression Gerinnungsaktivität des menschlichen Faktors VIII:C zeigt, und

(2) Gewinnung des Proteins aus der Kultur.

8. Transformierte nicht-menschliche Säugerzelle, die ein für menschlichen Faktor VIII:C codierendes Gen enthält, das ein Polydesoxyribonukleotid mit der Sequenz:

in operabler Verbindung mit einer heterologen regulatorischen Kontrollsequenz in einem Expressionsvektor hierfür umfaßt.