KR20010082521A - 변형된 인자 ⅷ - Google Patents

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KR20010082521A
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Abstract

인간 인자 VIII의 특이성 아미노산 부위들은 인자 VIII로 처리된 후 저해 항원을 발생시키는 혈우병환자의 저해 항체와 작용한다. 아미노산 서열이 하나 이상의 특이 부위에서 치환체로 변경된 변형 인자 VIII가 제시된다. 변형 인자 VIII는 A2 또는 C2 도메인 에피토프에 대한 저해 항체에 의해 저해되지 않는다. 변형 인자 VIII는 혈우병 환자가 저해 항체의 작용을 피하게 하거나 예방하는 데 효과적이다.

Description

변형된 인자 Ⅷ{MODIFIED FACTOR Ⅷ}
혈액 응고는 혈소판이 상처 부위의 손상된 절개된 혈관벽에 부착되면서 개시된다. 다음에, 효소학적으로 조절되는 연속 반응들에 있어서, 가용성 피브리노겐 분자는 효소 트롬빈에 의해 병리혈전에서 함께 혈소판을 보유하고 있는 불용성 피브린 가닥으로 전환된다. 연속 반응의 각 단계에 있어서, 단백질 전구체는 그 다음 단백질 전구체를 절단하는 프로테아제로 순차적으로 전환된다. 보조인자는 대부분의 단계에서 요구된다.
인자 VIII은 폰 빌레브란트 인자에 단단하면서도 비공유적으로 결합되면서, 혈액내의 불활성 전구체로서 순환한다. 인자 VIII은 트롬빈 또는 인자 Xa에 의해 단백질 가수분해로 활성화되며 이때 트롬빈 또는 인자 Xa는 폰 빌레발렌트 인자로부터 인자 VIII를 해리시키고 응혈촉진제 기능을 순차적으로 활성화시킨다. 그 활성형태로서 단백질 인자 VIIIa는 인자 X 활성쪽으로 인자 IXa의 촉매학적 효능을 몇 차수의 크기로 증가시키는 보조인자이다.
인자 VIII이 결핍되어 있거나 인자 VIII에 대한 항체가 있는, 인자 VIII로 치료되지 않는 사람들은 관절에서의 염증 반응에서 초기 사망까지 망라하는 범위의 심각한 증상을 야기할 수 있는 조절되지 않는 내부 출혈을 당한다. 미국에서 약 10,000명에 달하는 심한 혈우병 환자들에게 충분한 횟수와 농도로 투여한다면 혈액의 정상적인 응고능을 회복시키는 인간 인자 VIII을 주입하여 치료할 수 있다. 실제 인자 VIII의 일반 정의에 의하면, 혈우병 A가 있는 환자로부터 유래된 혈장에서 응고 결함을 보정하는 정상 혈장에 존재하는 물질이다.
혈우병 환자의 치료에 있어 심각한 합병증으로서, 인자 VIII의 활성을 저해하는 항체("저해제" 또는 "저해성 항체")가 발생한다. 자기항체는 치료를 위한 인자 VIII의 주입에 반응하여 혈우병 A 환자의 약 20%에서 발생한다. 저해제가 발생하는, 미리 치료받지 않은 혈우병 A 환자에서, 저해제는 치료를 받은 지 1년 내에 통상 발생한다. 또한, 인자 VIII를 불활성화시키는 자기항체는 이전에 정상 인자 VIII 수준을 갖는 환자에서 가끔 발생한다. 저해제 적정농도가 충분히 낮으면, 환자는 인자 VIII의 투여량을 증가함으로써 치료받을 수 있다. 하지만, 종종 저해제역가가 높아져서 인자 VIII로 제압될 수 없게 된다. 다른 전략은 인자 IX 복합체 제제(예, KONYNER, ProplexR) 또는 재조합 인간 인자 VIIIa를 사용하여 정상적인 지혈동안의 인자 VIII에 대한 필요성을 우회하게 하는 것이다. 또한, 돼지 인자 VIII은 통상 인간 인자 VIII 보다 실질적으로 낮은 반응성을 갖기 때문에 부분 정제된 돼지 인자 VIII 제제(HYATE: CR)가 사용된다. 인간 인자 VIII에 대해 저해성 항체가 발생한 많은 환자들은 돼지 인자 VIII로 성공적으로 치료를 받고 장기간동안 그러한 치료를 계속 받았다. 그러나, 돼지 인자 VIII의 투여는 1회 이상의 주입후에 돼지 인자 VIII에 대해 저해제가 발생할 수 있기 때문에 완전한 해결책은 아니다.
혈우병 A의 치료를 위한 다양한 순도의 인간 혈장 유래 인자 VIII중 몇몇 제제는 시판되고 있다. 이것은 바이러스에 대해서 열처리 또는 약품 처리된, 많은 공급자들의 혈액 집합소로부터 유래된 부분 정제된 인자 VIII을 포함하나, 상당한 농도의 항원 단백질; 더 낮은 농도의 항원 불순물 및 바이러스 오염물질을 갖는 단일클론성 항체로 정제된 인자 VIII; 및 임상시험중인 재조합 인간 인자 VIII을 함유한다. 그러나, 인간 인자 VIII은 생리적 농도 및 pH에서 불안정하며 매우 낮은 농도(0.2 μg/ml 혈장)의 혈액에 존재하며 낮은 비 응혈활성을 갖는다.
혈우병 환자는 출혈 및 그로 인한 혈우병 관절증을 예방하기 위해 매일 인자 VIII을 교환해주어야 한다. 그러나 공급이 부적절하며 분리와 정제, 면역원성, 및 AIDS 및 간염 감염위험의 제거 필요성의 어려움으로 인해 치료적 사용에서의 문제가 발생한다. 재조합 인간 인자 VIII 또는 부분 정제된 돼지 인자 VIII이 모든 문제를 해결하지는 못한다.
통상 사용되는 시중 구입가능한 혈장 유래 인자 VIII과 관련된 문제는 보다 나은 인자 VIII 생성물의 개발에 상당한 관심을 불러일으켰다. 보다 효력있는 인자 VIII 분자가 요구되고 있어 보다 많은 응혈활성 단위가 분자; 선택 pH 및 생리적 농도에서 안정한 인자 VIII 분자; 저해성 항체 생성을 일으키는 경향이 적은 인자 VIII 분자; 및 인간 인자 VIII에 대한 항체가 이미 생성된 환자에서 면역 검출이 되지 않는 인자 VIII 분자에 전달할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 인자 VIII이 결핍되거나 인자 VIII에 대한 저해제가 있는 환자에서 혈우병을 고치는 인자 VIII을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈우병 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 선택 pH 및 생리적 농도에서 안정한 인자 VIII을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 인자 VIII보다 큰 응고제 활성을 갖는 인자 VIII을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인자 VIII에 대해 보다 적은 항체가 생성되는 인자 VIII을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은, 인간 및 돼지 또는 비인간 포유동물(본문에서 함께 "동물"로 지칭함)로부터 유래된 인자 VIII 아미노산 서열을 갖는 하이브리드 인자 VIII을 포함하거나; 다른 구체예로서, 인간 또는 동물 또는 둘 다로부터 유래된 인자 VIII 아미노산 서열 및 인자 VIII과 동일한 공지된 서열이 없는 아미노산 서열("비인자 VIII 아미노산 서열"), 바람직하게는 인자 VIII의 항원 및/또는 면역부위에서 치환된 서열을 갖는 하이브리드와 동등한 인자 VIII을 포함하며, 응고제 활성을 갖는 분리 정제된 하이브리드 인자 VIII 분자 및 그 단편을 제공한다. 본 기술분야의 숙련자는 수많은 하이브리드 인자 VIII 제조물들, 예를 들어 인간 인자 VIII보다 응고제 활성이 큰 인간/동물 인자 VIII("우수한 응고제 활성"); 비면역원성 인간/등가 인자 VIII; 비항원성 인간/등가 또는 인간/동물 인자 VIII; 응고제 활성이 우수한 비면역원성 인간/동물 또는 인간/등가 인자 VIII; 응고제 활성이 우수한 비항원성 인간/동물 또는 인간/동물/등가 인자 VIII; 비면역원성, 비항원성 인간/등가 또는 인간/등가/동물 인자 VIII; 및 응고제 활성이 우수한 비면역원성, 비항원성 인간/동물/등가 인자 VIII을 포함하는 수많은 하이브리드인자 VIII 제조물들이 제조될 수 있으며 또한 상기 본 발명의 제조물은 이에 제한되지 않는다는 것을 이해하게 될 것이다.
하이브리드 인자 VIII 분자는 인간 및 동물 인자 VIII 서브유닛 또는 도메인의 분리 및 재조합 또는 인간 및 동물 인자 VIII 유전자의 유전공학법에 의해 제조된다.
바람직한 구체예에서, 재조합 DNA 방법을 사용하여 인간 인자 VIII의 해당 요소를 동물 인자 VIII의 요소로 치환하고, 결과적으로 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 분자를 얻는다. 제2의 구체예에서, 재조합 DNA 방법을 사용하여, 상기 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 또는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 에서의 하나 이상의 아미노산을, 인자 VIII에 동일한 공지 서열을 가지지 않은 아미노산들, 바람직하게는 인간 인자 VIII보다 인자 VIII에 대한 자연발생적 저해 항체와 면역 반응성이 감소된 아미노산 서열 ("비항원성 아미노산 서열") 및/또는 인자 VIII에 대한 항체 생산을 덜 유도하는 아미노산 서열 ("비면역원성 아미노산 서열")로 교체한다. 면역원성 또는 항원성 서열을 치환하는데 사용될 수 있는 아미노산 서열의 예는 알라닌 잔기 서열이다.
다른 구체예에서, 인자 VIII의 서브유닛을 인간 또는 동물 혈장으로부터 분리 정제하고 하이브리드 인간/동물 인자 VIII은 동물 중쇄 서브유닛과 인간 경쇄 서브유닛의 혼합물 또는 인간 중질 사슬 서브유닛과 동물 경질 사슬 서브유닛의 혼합물로 제조되어 인간 경질 사슬/동물 중질 사슬 및 인간 중질 사슬/동물 경질 사슬 하이브리드 분자를 얻는다. 이들 하이브리드 분자는 이온교환 크로마토그래피로 분리한다.
대안으로, 인자 VIII의 하나 이상의 도메인 또는 부분 도메인을 인간 또는 동물 혈장으로부터 분리정제하고 하이브리드 인간/동물 인자 VIII은 한 종으로부터의 도메인 또는 부분 도메인과 다른 종의 도메인 또는 부분 도메인의 혼합물로 제조된다. 하이브리드 분자는 이온 교환 크로마토그래피로 분리될 수 있다.
고 정제된 하이브리드 인자 VIII의 제조방법은: (a) 혈장 유래의 인간 인자 VIII의 서브유닛 및 혈장 유래의 동물 인자 VIII를 분리한 다음에 인간 및 동물 서브유닛의 혼합물의 응고제 활성을 재구성하고 나서 이온교환 크로마토그래피로 하이브리드 인간/동물 인자 VIII을 분리하는 단계; (b) 혈장 유래의 인간 인자 VIII의 도메인 또는 일부 도메인 및 혈장 유래의 동물 인자 VIII의 도메인 또는 부분 도메인을 분리한 다음에 인간 및 동물 도메인의 혼합물의 응고제 활성을 재구성하고 나서 이온교환 크로마토그래피로 하이브리드 인간/동물 인자 VIII을 분리하는 단계; (c) 재조합 DNA 기술에 의해 동물 인자 VIII의 도메인 또는 부분 도메인을 구성하고 동물 및 인간 인자 VIII의 도메인을 재조합 교환하여 응고제 활성을 갖는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII을 생성하는 단계; (d) 한 종의 인자 VIII의 특정 아미노산 잔기를 다른 종의 인자 VIII중 해당하는 독특한 아미노산 잔기로 치환하여 하이브리드 인간/동물 인자 VIII을 생성하는 단계; 또는 (e) 인간 또는 동물 아미노산 서열 또는 둘 다를 갖는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자를 생성하는 단계로서, 인자 VIII의 특정 아미노산 잔기를 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 인자 VIII과 동일한 공지된 서열이 없는 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 가지는 것으로 설명될 것이다.
본 명세서에 기재된 돼지 인자 VIII을 코딩하는 전체 DNA 서열 결정함으로써, 먼저 적당한 숙주 세포에서 돼지 인자 VIII을 코딩하는 DNA를 발현시키는 것을 가능하게 하고 따라서 전체 길이의 돼지 인자 VIII를 합성할 수 있다. 따라서 정제된 재조합 돼지 인자 VIII은 본 발명의 양태이다. 돼지 인자 VIII의 각 도메인뿐만 아니라 어떤 특정 단편을 코딩하는 DNA는, 그 자체 또는 인간 인자 VIII을 코딩하는 DNA와 조합하여, 비슷하게 발현될 수 있어, 본 명세서에 기재된 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII을 제조할 수 있다. 더욱이, 결실된 B 도메인의 전부 또는 일부를 갖는 돼지 인자 VIII(B-도메인이 없는 돼지 인자 VIII)은 B 도메인의 하나 이상의 코돈이 결실된 돼지 인자 VIII을 코딩하는 DNA의 발현에 의해 본 발명의 일부로서 유용해진다.
하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII의 몇몇 구체예에서는 비 활성도가 인간 인자 VIII보다 크고 돼지 인자 VIII과 동일하거나 이보다 크다. 하이브리드 또는 하이브리드 동등 인자 VIII의 몇몇 구체예에서는 저해성 항체를 갖는 면역반응성이 인자 VIII과 동일하거나 이보다 적고 또는 면역원성이 인간 또는 돼지 인자 VIII과 비교하여 인간 또는 동물에서 적다.
하이브리드 또는 하이브리드 동등 인자 VIII을 투여하는 것으로 이루어지는 인자 VIII 결핍인 환자를 치료하는 방법 및 약학적 조성물도 제공된다.
관련 출원에 대한 전후 참조
본 출원은 1998년 3월 10일 출원된 미합중국 특허 출원 제 09/037,601의 우선권을 청구한다.
연방 연구보조에 관한 기록
상기 정부는 본 발명으로 이끈 연구에 부분적으로 투자된 국립보건원 지원 번호 HL40921, HL46215 및 HL36094로부터 기인한, 본 발명에 대한 권리를 가진다.
본 발명은 일반적으로 인간 및 동물 인자 VIII 아미노산 서열을 갖거나 인간 인자 VIII 및 비인자 VIII 아미노산 서열을 갖는 하이브리드 인자 VIII 및 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다.
도 1A-1H는 인간, 돼지 및 마우스 인자 VIII 산 서열들을 비교 배열한 도면이다.
특정하게 언급하거나 지시하지 않는다면, 본 명세서에 사용된 "인자 VIII"는 임의의 동물, 임의의 하이브리드 인자 VIII 또는 변형된 인자 VIII를 의미하며, "하이브리드 인자 VIII" 또는 "하이브리드 인자 VIII"는 인간, 돼지, 및/또는 비-인간, 비-돼지 포유동물 종으로부터 출처된 인자 VIII를 포함하는 임의의 기능 인자 VIII 단백질 분자 또는 이의 단편을 나타낸다. 그러한 조합들은, 비제한적인 하기 하이브리드 인자 VIII 분자류 또는 이의 단편을 포함한다: (1) 인간/돼지; (2) 인간/비-인간, 비-돼지, 예를 들어 인간/마우스; (3) 돼지/비-인간, 비-돼지 포유동물, 예를 들어 마우스/개. 이러한 조합들은 또한 하이브리드 인자 VIII 등가 분자 및 이의 단편들을 포함하는 바, 하기에서 더 설명되는 바와 같이, 하이브리드, 인간, 돼지 또는 비-인간, 비-돼지 포유동물에서 출처된, 인자 VIII에 동등한 공지 서열을 가지지 않는 아미노산 서열이 치환된 인자 VIII 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 하이브리드 조합체들은 또한 두 생물종 이상, 예를 들어, 인간/돼지/마우스에서 유래된 하이브리드 인자 VIII를 포함하는데, 여기서 인자 VIII에 동등한, 주지된 서열을 가지지 않는 아미노산 서열이 치환되어 있다. 별다른 언급이 없으면, "하이브리드 인자 VIII"는, 하기 예증적인 구체예에서 설명되는 바와 같이 연구 목적용 탐침자 또는 진단 시약용으로서 사용된 수 있는 하이브리드 인자 VIII의 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "포유동물 인자 VIII"는 별다른 언급이 없으면, 임의의 비-인간 동물로부터 유래된 아미노산 서열을 가지는 인자 VIII를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "동물"은 돼지 및 다른 비-인간 포유동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질" 또는 "융합 인자 VIII 또는 이의 단편"은 하이브리드 유전자의 산물로서 하나의 단백질에 대한 코딩 서열이, 예를 들어, 이의 일부를 다른 유전자의 제 2 단백질을 코딩하는 서열에 융합하여 상당히 변경되어서 상기 융합 단백질을 암호화하는 하이브리드 유전자가 생성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 융합 단백질은 본 출원서에서 설명된 하이브리드 인자 VIII 단백질의 조합체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상응" 핵산 또는 아미노산 또는 이들의 서열은 인자 VIII 또는 하이브리드 인자 VIII 분자 또는 이의 단편에서의 한 장소에 존재하는 것으로, 핵산 또는 아미노산 숫자가 동일 하지 않더라도, 다른 생물종의 인자 VIII 분자의 한 장소와 동일한 구조 및/기능을 가진다. 다른 인자 VIII 서열에 "상응하는" 서열은 실질적으로 그러한 서열에 상응하며 스트린젠트 조건하에서 지정된 서열 확인 번호(SEQ ID NO.)의 서열에 하이브리드하는 것이다. 다른 인자 VIII에 "상응하는" 서열은 또한 인자 VIII 또는 청구된 응혈 촉진제 하이브리드 인자 VIII 또는 이의 단편을 발현케하는 서열을 포함하고, 유전 코드의 중복만 없다면, 지정된 서열 확인 번호와 하이브리드 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "독특한" 아미노산 서열 잔기 또는 서열은 한 생물종의 인자 VIII 분자에서의 아미노산 서열 또는 잔기를 지칭하는 것으로, 이는 다른 생물종의 인자 VIII 분자에서의 상동 잔기 또는 서열과 다른 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비(specific) 활성"은 인간 인자 VIII 결핍 혈장의 응고 결함을 정정하는 활성을 지칭한다. 비 활성은 인간 인자 VIII 결핍 혈장의 응고 시간을 정상 인간 혈장의 것과 비교하는 표준 시험법으로 측정하여 전체 인자 VIII 단백질 밀리그람당 응혈활성 유닛트로 나타낸 것이다. 인자 VIII 활성의 일 유닛트는 정상 인간 혈장의 일 밀리리터에 존재하는 활성이다. 이러한 방법에 있어서, 응혈 형성 시간이 짧을수록, 인자 VIII의 활성이 더 크게 나타난다. 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII는 인간 인자 VIII 시험법에서 응혈활성을 가진다. 이러한 활성은, 다른 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자 또는 이의 단편의 활성과 함께 혈장-유도 또는 재조합 인간 인자 VIII의 활성보다 작거나, 같거나 또는 더 클 수 있다.
인간 인자 VIII cDNA 뉴클레오타이드 및 예상 아미노산 서열들이 SEQ ID NOs: 1 및 2에 각각 나타나 있다. 인자 VIII는 "도메인" 서열 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH를 결정짓는 내부 서열 유사체를 가지는 약 300 kDa 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 인자 VIII 분자에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "도메인"은 내부 아미노산 서열 정체 및 트롬빈의 단백질 분해 절단 위치에 의해 한정되는 아미노산들의 연속되는 사슬이다. 특정 언급이 없으면, 인자 VIII 도메인들은, 서열들이 인간 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)와 정렬된, 하기 아미노산 잔기를 포함한다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; B, 잔기 Ser741-Arg1648; A3, 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 남은 서열, 잔기 Glu1649-Arg1689, 는 인자 VIII 경질 사슬 활성 펩타이드로 지칭한다. 인자 VIII는 트롬빈 또는 인자 Xa에 의해 , 이를 폰 빌레브란트 인자로부터 분리시킴으로써 인자 VIIIa를 형성시킴으로써, 단백질 가수분해성으로 활성화된다. 인자 VIIIa 의 생물학적 기능은 X 활성쪽으로 인자 IXa의 촉매학적 효능을 몇 차수의 크기로 증가시키는 것이다. 트롬빈-활성 인자 VIIIa는 인자 IXa 및 인자 X와 함께 혈소판 또는 단핵구상에서 복합체를 형성하는 160 kDa A1/A2/A3-C1-C2 이형삼중체 (heterotrimer)이다. 사용된 바와 같이, "부분 도메인"은 한 도메인의 부분을 형성하는 아미노산들의 연속 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 인간 또는 동물 인자 VIII의 "서브 유닛트"는 단백질의 중질 및 경질 사슬들이다. 인자 VIII의 중질 사슬은 세 도메인 A1, A2 및 B를 포함한다. 인자 VIII의 경질 사슬은 또한 세 도메인 A3, C1 및 C2를 포함한다.
하이브리드 인자 VIII 또는 이의 단편은 (1) 분리된, 혈장-유도 동물 서브유니트 또는 인간 서브유니트 (중질 또는 경질 사슬)를 상응하는 인간 서브유니트 또는 동물 서브유니트 대신 치환; (2) 인간 도메인 또는 동물 도메인 (A1, A2, A3, B, C1 및 C2)을 상응하는 동물 도메인 또는 인간 도메인 대신 치환; (3) 인간 도메인 또는 동물 도메인 부분을 동물 도메인 또는 인간 도메인의 부분 대신 치환; (4) 하나 이상의 독특한 인간 또는 동물 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 MR이 서열을 상응하는 동물 또는 인간 아미노산 대신 치환; 또는 (5) 인자 VIII에 일치하는 주지된 서열을 가지지 않는 아미노산 서열을 인간, 동물 또는 하이브리드 인자 VIII 또는 이의 단편에서 하나 이상의 특이 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 서열 대신 치환하는 것에 의해 만들 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "B-도메인이 없는" 하이브리드 인자 VIII, 하이브리드 등가 인자 VIII, 또는 이들의 단편은 B 도메인이 결여된 하이브리드 인자 VIII 제조물들 중 임의의 것들 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "에피토프", "항원성 부위" 및 "항원 결정기(determinant)"는 유사하게 사용되며, 인간, 동물, 하이브리드 및 하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편의 일부분으로서, 항체에 의해 특이적으로 인식되는 부분을 지칭한다. 그것은 임의의 숫자의 아미노산 잔기로 구성되며, 단백질의 일차, 이차 또는 삼차 구조에 좌우된다. 본 발명에 따라서, 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 하이브리드 인자 VIII, 하이브리드 인자 VIII 등가물 또는 후술하는 진단 방법에서 시약으로 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 하이브리드, 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편은 모든 자연 발생 저해 인자 VIII 항체와 교차 반응하지 않거나 인간 또는 돼지 인자 VIII보다 덜 교차 반응한다.
용어 "면역원성 부위(immunogenic site)"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인간 또는 동물 인자 VIII, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII, 또는 이의 단편의 한 부위로서, 면역검정법과 같은 통상적인 방법, 즉, 본 명세서에서 설명되는 ELISA 또는 베데스타 (Bethesda) 검정으로 측정할 때, 인간 또는 동물에서 인자 VIII, 하이브리드, 하이브리드 등가물 또는 이의 단편에 대한 항체 생산을 특이적으로 유도하는 것이다. 그것은 임의의 수의 아미노산 잔기로 구성될 수 있고, 단백질의 일차, 이차 또는 삼차 구조에 좌우된다. 특정 구체예에서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편은 동물 또는 인체에서 비면역원성이거나 인간 또는 돼지 인자 VIII보다 덜 면역원성적이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하이브리드 인자 VIII 등가 분자 또는 이의 단편" 또는 "하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편"은, 인간, 동물 또는인자 VIII 또는 이의 단편에서의 하나 이상의 특이 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나 서열을 대신한 인간 또는 동물 인자 VIII에 동등하지 않은 공지되지 않은 동등물을 적어도 하나 포함하는 활성 인자 VIII 또는 하이브리드 인자 VIII 분자 또는 이의 단편이다. 인간 또는 동물 인자 VIII 서열과 일치하는 공지된 동등물 가지지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 서열은 또한 "비-인자 VIII 아미노산 서열"로 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 인자 VIII에 동등한 공지 서열을 가지지 않는 아미노산은 알라닌 잔기이다. 다른 바람직한 구체예에서, 인자 VIII 서열과 동등한 공지 서열을 가지지 않는 아미노산이 치환할 수 있는 특이 인자 VIII 서열은 자연 발생적인 인자 VIII 저해 항체와 면역 반응하는 항원성 부위를 포함하여, 결과된 하이브리드 인자 VIII 등가 분자물 또는 이의 단편이 인자 VIII 저해 항체와 덜 면역반응하거나 면역반응하지 않는다. 다른 바람직한 구체예에서, 인자 VIII에 동등한 주지된 서열을 가지지 않는 아미노산에 치환되는 특이 하이브리드 인자 VIII는 동물 또는 인체에서 인자 VIII 저해 항체의 형성을 유도하는 면역 부위를 포함하여, 결과된 하이브리드 인자 VIII 등가 분자물 또는 이의 단편이 덜 면역원성 활성을 보인다.
"인자 VIII 결핍"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 결함 인자 VIII의 생성에 의해, 인자 VIII의 부적절한 또는 무 생산에 의해 또는 저해체에 의한 인자 VIII의 부분 또는 전체 저해에 의해 야기된 응혈활성에서의 결핍을 포함한다. 혈우병 A는 인자 VIII 결핍의 한 형태로서, X-연결 유전자에서의 결함 및 그것이 암호화하고 있는 인자 VIII 단백질의 부재 또는 결핍에서 유래한다.
"진단 분석"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어떤 면에서 항원-항체 작용을 이용하여 시험 샘플에 있는 특정 항체의 양을 검출 및/또는 정량함으로써 의학적 치료방법의 결정을 돕는 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 많은 그러한 분석방법이 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그러나, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII DNA 또는 이의 단편 및 이로부터 발현된 단백질은, 전체 또는 부분적으로, 다른 공지된 분석법에서의 상응하는 시약을 대체할 수 있고, 이럼으로써 이 변형된 분석법은 인자 VIII에 대한 항체를 검출 및/또는 정량하는데 사용할 수 있다. 인간 또는 동물 인자 VIII에 대한 또는 인자 VIII 인간/동물 인자 VIII에 대한 항체의 검출을 위한 공지된 분석법을 변형할 수 있게 하는 것은 바로 상기 시약들, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII DNA 또는 이의 단편 또는 이로부터 발현된 단백질의 사용에 있다. 그러한 분석법은 ELISA, 면역확산 분석 및 면역블랏을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석들을 실행하는 데 적절한 방법은 당해 분야 기술자에 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질의 적어도 하나 에피토프를 포함하는 하이브리드 E는 하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편들을 진단 시약으로서 사용할 수 있다. 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 또는 이의 단편을 사용할 수 있는 다른 분석법의 예는 베데스다 분석법 및 항응고 분석법을 포함한다.
방법의 일반적 설명
미합중국 특허 출원 일련번호 07/864,006호는 응혈활성을 가지는 하이브리드인간/돼지 인자 VIII 분자를 발견한 것을 설명하고 있는 바, 여기서 인간 또는 돼지의 인자 VIII 분자의 요소가 다른 생물종의 인자 VIII 분자의 상응하는 요소를 치환하고 있다. 미합중국 특허 출원 일련번호 08/212,133 및 PCT/US94/13200은 응혈 촉진제 하이브리드 인간/동물 및 하이브리드 등가 인자 VIII 분자를 개시하고 있는 바, 여기서, 한 생물종의 인자 VIII 분자의 요소들이 다른 생물종의 인자 VIII 분자의 상응하는 요소를 치환하고 있다.
본 발명은 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 및 등가 인자 VIII 분자물과 이의 단편, 및 그러한 하이브리드물을 암호화하는 핵산 서열로서, 이들 중 몇몇은 인간 또는 돼지 인자 VIII보다 고도로-정제된 인간 인자 VIII와 비교할 때 기준 응고 분석법에서 더 높은 응혈활성을 가지며; 및/또는 인간 또는 돼지 인자 VIII에 대한 저해 항체에 덜 면역반응하며; 및/또는 인간 또는 돼지 인자 VIII보다 인체 또는 동물에서 덜 면역원성 활성을 보인다. 이러한 하이브리드 인자 VIII 분자는 하기와 같이 제조될 수 있다.
적어도 다섯 유형의 활성 하이브리드 인간/돼지 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자물 또는 이의 단편, 이들 하이브리드 인자 VIII 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 이들을 제조하는 방법이 개시된다: 이러한 것들은 (1) 인간 또는 돼지 서브유니트 (예를 들어, 중질 사슬 또는 경질 사슬)를 상응하는 돼지 또는 인간 서브유니트를 대신하여 치환함으로써; (2) 하나 이상의 인간 또는 돼지 도메인 (예를 들어, A1, A2, A3, B, C1 및 C2)을 상응하는 돼지 또는 인간 도메인을 대신하여 치환시킴으로써; (3) 하나 이상의 인간 또는 돼지 도메인의 연속되는 부분을 하나 이상의 돼지 또는 인간 도메인의 상응하는 부분을 대신하여 치환시킴으로써; (4) 인간 또는 돼지 인자 VIII에서의 하나 이상의 독특한 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 특이 서열을 상응하는 돼지 또는 인간 서열을 대신하여 치환시킴으로써; 및 (5) 인자 VIII에 동등한 공지된 서열을 가지지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 서열("비-인자 VIII 아미노산 서열")을 인간, 돼지 또는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII에서의 하나 이상의 아미노산의 적어도 하나의 특이 서열을 대신하여 치환시킴으로써 얻어진다.
적어도 다섯 유형의 활성 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자체 또는 이의 단편 및 이들을 암호화하는 핵산 서열을 또한 동일한 방법으로 제조할 수 있다: 이러한 것들은 (1) 인간 또는 비-인간, 비-돼지 포유동물 서브유니트 (예를 들어, 중질 사슬 또는 경질 사슬)를 상응하는 비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 인간 서브유니트를 대신하여 치환함으로써; (2) 하나 이상의 인간 또는 비-인간, 비-돼지 포유동물 도메인 (예를 들어, A1, A2, A3, B, C1 및 C2)을 상응하는 비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 인간 도메인을 대신하여 치환시킴으로써; (3) 하나 이상의 인간 또는 비-인간, 비-돼지 포유동물 도메인의 연속되는 부분을 하나 이상의 비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 인간 도메인의 상응하는 부분을 대신하여 치환시킴으로써; (4) 인간 또는 비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII에서의 하나 이상의 독특한 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 특이 서열을 상응하는 비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 인간 서열을 대신하여 치환시킴으로써; 및 (5) 인자 VIII에 동등한 공지된 서열을 가지지 않는 하나이상의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 서열("비-인자 VIII 아미노산 서열")을 인간, 비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII에서의 하나 이상의 아미노산의 적어도 하나의 특이 서열을 대신하여 치환시킴으로써 얻어진다.
또한 당해 분야의 숙련자는 동일한 방법으로 상기 두 문단에서의 유형 (1)-(5)에 상응하는, 돼지/마우스와 같은 적어도 둘 이상의 비-인간 포유동물의 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하고 및 비-인자 VIII 아미노산 서열을 더 포함하는 적어도 다섯 유형의 활성 하이브리드 인자 VIII 분자 및 이의 단편을 제조할 수 있다.
(1)-(3) 군으로 상기 서술된 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 및 등가 인자 VIII 단백질 또는 이의 단편들은 혈장 유도 인자 VIII의 도메인의 서브유닛트, 도메인 또는 연속되는 부분들을 분리한 후, 재구성 및 정제함으로써 만들어진다. (3)-(5)군으로 상기 서술된, 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 및 등가 인자 VIII 단백질 또는 이의 단편들은 재조합 DNA 방법으로 만들어진다. 인자 VIII 분자는 하기에서 더욱 상세히 서술되는 바와 같이, 다양한 부위의 출처에 따라서, 동물 서열보다 크거나 적은 백분율로 인간 서열을 포함할 수 있다.
현재 정보에 의하면, B 도메인은 아무런 저해 에피토프를 가지니 않고 인자 VIII 기능상에 알려진 효과가 없기 때문에, 특정 구체예에서는, 본 명세서에서 설명된 임의의 방법으로 제조된, 활성 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자 및 이의 단편에서 B 도메인을 제거한다 ("B(-)인자 VIII").
실시예 4에서, 돼지 중질 사슬 및 인간 경질 사슬을 포함하고 전술한 하이브리드의 제 1 유형에 상응하는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII는 지준 응고 분석법에 따르면 인간 인자 VIII에 비해서 더 큰 비 응혈활성을 가진다. 응혈활성을 가지는 하이브리드 인간/동물 또는 등가 인자 VIII는, 그 활성이 인간 /1의 것과 더 높거나, 같거나 또는 더 낮든지 간에, 저해체로 환자를 치료하는 데 유용한 데, 이는 이러한 저해체가 인간 또는 돼지 인자 VIII와 반응하는 것보다 하이브리드 인간/동물 또는 등가 인자 VIII와 덜 반응할 수 있기 때문이다.
분리된 인간 및 동물 인자 VIII 서브유닛트로부터 재구성에 의한 하이브리드 인자 VIII 분자의 제조
본 발명은 서브유닛트 치환체를 가지는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 분자 또는 이의 단편, 이들 하이브리드들을 암호화하는 핵산 서열, 이들을 제조하고 분리하는 방법, 및 이들의 응혈 촉진 활성의 특징을 결정하는 방법을 제공한다. 하나의 방법은 Fay, P. J (1990) J. Biol. Chem.265:6197; 및 Lollar, J. S 등 (1988) J. Biol. Chem.263:10451에서 보고된 방법들로부터 변형된 것으로 인간 및 동물 인자 VIII의 서브유닛트 (중질 및 경질 사슬)후, 인간 중질 사슬 및 동물 경질 사슬의 재구성 또는 인간 경질 사슬 및 동물 중질 사슬의 재구성을 포함한다.
인간 및 동물의 개별 서브유니트의 정제를 위해서는 경질 사슬/중질 사슬 이량체를 분리해야 한다. 이것은, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트 산 (EDTA)으로 칼슘을 킬레이트한 후, monoSTMHPLC (Pharmacia-LKB, 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 처리하여 수행될 수 있다. 인자 VIII 인간/동물 인자 VIII 분자들을 분리된 서브유니트로부터 칼슘 존재하에서 재구성한다. 하이브리드 인간 경질 사슬/동물 중질 사슬 또는 동물 경질사슬/인간 중질 사슬을 돼지 인자 VIII의 분리 방법, 예를 들어, Lollar, J.S. 등 (1988) Blood71:137-143에서 설명된 방법을, monoSTMHPLC를 사용하여 미반응 중질 사슬로부터 분리한다.
이러한 방법들, 한 구체예에서 활성 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제조하기 위해 사용되고, 하기 실시예에서 상세히 설명되는 방법들로 6배 이상의 인간 인자 VIII의 응혈 활성을 가지는 하이브리드 인간 경질 사슬/돼지 중질사슬 분자를 얻을 수 있다.
다른 인자 VIII 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII 분자들은 동일한 방법으로 제조, 분리 및 활성에 대해 특성 분석될 수 있다. 당해분야의 숙련자들은 이러한 방법들로 또한 돼지/마우스와 같이 경질 또는 중질 사슬을 포함하는 하이브리드 동물/동물 인자 VIII을 제조하고, 분리하고 및 활성에 대해 특성분석할 수 있거나 하나의 생물종을 다른 생물종의 종질 또는 경질 사슬과 조합할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
분리된 인간 및 동물 인자 VIII 도메인으로부터 재구성에 의한 하이브리드 인자 VIII 분자의 제조:
본 발명은 도메인 치환체를 가진 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 분자 또는 이의 단편, 이를 암호화하는 핵산 서열, 이들 제조하고 분리하는 방법, 이들의 응혈 촉진 활성을 특성화하는 방법을 제공한다. 한 방법은, 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII에 대해 Lollar, P. 등 (Nov. 25, 1992) J. Biol. Chem. 267(33): 23652-23657에서 설명된 바와 같이, 인간 인자 VIII의 하나 이상의 도메인 및 동물 인자 VIII의 하나 이상의 도메인을 분리한 후 인간 및 동물 도메인들을 재구성하여 응혈활성을 갖는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII을 형성하는 것을 포함한다.
특히 인간 A2 도메인을 돼지 A2 도메인으로 치환시킨 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제공하는 바, 이러한 구체예는 도메인-치환된 인자 VIII 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII가 제작될 수 있는 방법을 설명한다. 혈장-유도 비-인간, 비-돼지 포유동물 및 인간 A1/A3-C1-C2 이량체를 인자 VIIIa로부터 A2 도메인을 분리함으로써 얻을 수 있다. 이것은, 예를 들어 NaOH 존재하에서 시행되고, 이 후, 혼합물을 희석시키고 이량체를 monoSTMHPLC (Pharmacia-LKB, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 용출시킨다. 인자 VIIIa로부터 A2 도메인을 monoSTM에서 부차 성분으로서 분리한다. 한 생물종의 A2 도메인 및 다른 생물종의 A1/A3-C1-C2 이량체를 동량 혼합하여 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 분자들을 재구성한다.
monoSTM를 사용하여 미반응 이량체 및 A2로부터 하나 이상의 도메인 치환체를 가지는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 또는 이의 단편을 Lollar, J.S. 등 (1988)Blood71:137-143에서 설명된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 분리에 대한 방법으로 분리한다. 일반적인 방법을 사용하여 또한 한 생물종의 인자 VIII의 A1, A3, C1, C2 및 B를 제조 및 분리할 수 있고, 이들 중 임의의 하나 이상은 다른 생물조의 인자 VIII에서의 상응하는 도메인을 대신 할 수 있다. 당해 분야의 숙련자들은 이러한 방법을 사용하여 또한 돼지/마우스와 같은 도메인-치환된 하이브리드 동물/동물 인자 VIII를 제조, 분리 및 활성 특성화할 수 있다는 것을 즉시 이해할 것이다.
이러한 방법들로, 하기 실시예에서 더 상세히 설명될 것인바, 응혈 촉진 활성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자를 얻을 수 있다.
인간, 동물 및 하이브리드 인자 VIII 서브유니트, 도메인 또는 도메인 일부를 암호화하는 서열들의 재조합법을 사용한 하이브리드 인자 VIII 분자의 제조
서브유니트, 도메인 도메인의 연속 부분의 치환
본 발명은 서브유니트, 도메인 및 아미노산 서열 치환체를 가지는 활성, 재조합 하이브리드 인간/동물 및 하이브리드 등가 인자 VIII 분자체 및 이의 단편, 이들 하이브리드를 암호화하는 핵산 서열, 이들을 제조하고 분리하는 방법 및 이들의 응고, 면역 반응 및 면역원성 특성을 분석하는 방법을 제공한다.
Toole, J.J. 등 (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. 등 (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. 등 (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. 등 (1984) Nature 312:337-342(Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; 미합중국 특허 제 4,757,066호에 보고된 바와 같이 인간 인자 VIII 유전자를 분리하고 포유동물 세포에서 발현시키고, 및 아미노산 서열을 cDNA로부터 유추하였다. Capon 등의 미합중국 특허 제 4,965,199호는 포유동물 숙주 세포에서 인자 VIII를 생산하는 재조합 DNA 방법 및 인간 인자 VIII의 정제에 대하여 개시하고 있다. CHO (Chinese hamster ovary) 세포 및 BHKC (baby hamster kidney cells) 상에서 인간 인자 VIII을 발현시키는 것은 보고되어 있다. 인간 인자 VIII를 변형하여 B 도메인의 일부 또는 전부를 제거하였고 (미합중국 특허 제 4,868,112) 및 인간 인자 V b 도메인을 인간 인자 VIII B 도메인으로 치환하는 것이 시도되었다 (미합중국 특허 제 5,004,803). 인간 인자 VIII를 암호화하는 cDNA 서열 및 예측되는 아미노산 서열이 SEQ ID NOs: 1 및 2로 각각 나타나있다.
돼지 인자 VIII가 혈장으로부터 분리 및 정제되었다 [Fass, D.N. 등 (1982) Blood59:594]. 셀루로프라즈민 및 응고 인자 V와 상동성을 가지며 크게 부적절하게 위치한 N-말단 경질 사슬 서열의 일부분에 상응하는, 돼지 인자 VIII의 부분 아미노산 서열이 Church 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6934에 설명되어 있다. Toole, J. J. 등 (1984) Nature 312:342-347에는 돼지 인자 VIII의 네 개 아미노산 단편들의 N-말단 부분을 부분 서열화한 것을 설명하였지만, 인자 VIII 분자에서의 위치에 대한 단편들을 특성화하지는 않았다. 돼지 인자 VIII의 B 및 일부 A2 도메인의 아미노산 서열이 Toole, J.J 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83:5939-5942에 개시되어 있다. 돼지 인자 VIII의 완전한 A2 도메인을 암호화하는 cDNA 서열, 예상 아미노산 서열, 모든 도메인, 모든 서브유니트 및 특이 아미노산 서열의 치환체를 가지는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII가 "하이브리드 인간/돼지 인자 VIII"의 제목을 가지고, 1992년 4월 7일 출원되고 1994년 11월 15일에 미합중국 특허 제 5,364,771호로 발행된, Lollar 및 Marschall S. 미합중국 특허 출원 일련번호 07/864,004호에 및 WO 93/20093에 설명되어 있다. SEQ ID NO: 1에서 나타난 바와 같이, 성숙 인간 인자 VIII에서 잔기 373-740과 동일한 서열을 가지는 돼지 인자 VIII의 A2 도메인을 암호화하는 cDNA 서열 및 예상 아미노산 서열이 SEQ ID NOs: 3 및 4에 각각 나타나있다. 최근, 돼지 인자 VIII, 및 상응하는 인간 도메인을 치환한 돼지 A1 및/또는 A2 도메인을 가지는 키메라 인자 VIII의 A1 및 A2 도메인의 뉴클레오타이드 및 상응하는 아미노산 서열이 WO 94/11503호에 보고되어 있다.
혈장으로부터 두 돼지 및 인간 인자 VIII가 두 개 서브유니트 단백질로서 분리된다. 중질 사슬 및 경질 사슬로 알려진, 이 서브유니트들은 칼슘 또는 다른 이가 금속 이온을 요하는 비공유 경합으로 서로 묶여있다. 인자 VIII의 중질 사슬은 세 도메인 A1, A2 및 B를 포함하며 이들은 공유결합적으로 연결되어 있다. 인자 VIII의 경질 사슬은 또한 세 가지 도메인, A3, C1 및 C2로 지정된 도메인을 포함한다. 상기 B 도메인은 알려진 생물학적 기능을 가지고 있지 않고, 따라서 인자 VIII의 임의의 측정가능한 파라미터에서의 유의할만한 변경없이 단백질 가수분해하거나 재조합 DNA 기술 법으로 상기 분자로부터 분리될 수 있다. 인간 재조합 인자 VIII는, 비록 포유동물 세포에서 발현되지 않으면 글리코실화되지 않더라도, 혈장-유래 인자 VIII와 유사한 구조 및 기능을 가진다.
두 인간 및 돼지 활성화된 인자 VIII ("인자 VIIIa)는 A1 및 A2 도메인 간의 경질 사슬의 절단에 따라 세 가지 서브유니트를 가진다. 이러한 구조는 A1/A2/A3-C1-C2로 지정된다. 인간 인자 VIIIa는 돼지 인자 VIII를 안정화시키는 조건하에서 안정하지 않은 데, 이는 아마도 인간 인자 VIII의 A2 서브유니트가 더 약하게 결합되어 있기 때문일 것이다. 인간 및 돼지 인자 VIIIa의 A2 서브유니트의 분리는 인자 VIIIa 분자에서의 활성 손실과 연계되어 있다.
돼지 인자 VIII 분자의 일부 주지된 서열을 탐침자로서 사용하여, 오늘날까지 서열화되지 않은 돼지 인자 VIII 분자의 도메인을 표준, 확립된 클로닝 기술, 예를 들어, Weis, J. H., "Construction of recombinant DNA libraries"Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, eds. (1991); 및 Sambrook 등,Molecular Cloning, A Laboratory Manual에서 나타난 기술로 서열화되어 전체 길이의 하이브리드가 제작될 수 있다.
치환된 A2 도메인을 가지는 활성 재조합 인간/돼지 인자 VIII, 이를 암호화하는 핵산 서열, 및 이를 제조, 분리 및 활성 특성화 방법이 예증적 및 바람직한 구체예로서 특히 제공된다. 이러한 인자 VIII 제작물을 만드는 방법을 사용하여 서브유니트 치환체를 가지는 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 또는 이의 단편, 도메인의 연속 부분, 또는 A2외의 도메인을 제조할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 방법들이 또한 다른 재조합 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 동물/동물 하이브리드 인자 VIII 분자 또는 이의 단편들이 서브유니트, 도메인 또는 도메인의 연속 부분이 치환되도록 제조될 수 있는 방법을 설명한다는 것을 인지하게 될 것이다.
재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII의 제조는 관련 인자 VIII 서열을 암호화하는 인간 cDNA (Biogen, Inc.) 또는 인간 cDNA로 시작한다. 바람직한 구체예에서, cDNA에 의해 암호화된 인자 VIII는 전체 B 도메인이 결여되어 있고, Wood 등 (1984) Nature 312:330-337에 나타난 번호 부여 시스템에 따라 단일 사슬 인간 인자 VIII의 아미노산 잔기 1-740 및 1649-2332에 상응하는 (참조 SEQ ID NO:2), 도메인A1-A2-C1-C2를 포함한다.
돼지 또는 하이브리드 인자 VIII cDNA의 개별 서브유니트, 도메인 또는 도메인의 연속 부분은 확립된 돌연변이 기술에 의해 클론될 수 있고 상응하는 인간 또는 동물 서브유니트, 도메인 또는 도메인의 부분을 치환할 수 있다. 예를 들어, Lubin, I.M 등 (1994) J. Biol. Chem.269(12):8639-8641에는 일반적인 제한효소 부위를 이용하여 돼지 A2 도메인을 인간 도메인을 대신하여 치환하는 기술이 서술되어 있다. 한 생물종의 인자 VIII cDNA의 임의의 부위를 다른 생물종의 인자 VIII cDNA를 대신하여 치환하는 다른 방법은 Horton, R.M. 등 (1993) Meth. Enzymol217:270-279에 나타난 바와 같이, 중첩 확장에 의한 접합 (splicing)을 포함한다.
확립된 기술, Selden, R. F., "Introduction of DNA into mammalian cells" Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 등 편집 (1991)에 나타난 기술로, 서브유니트, 도메인 또는 도메인 일부를 암호화하는 하이브리드 인자 VIII cDNA 또는 전체 하이브리드 cDNA 분자를 발현 벡터에 클론하여 활성 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 단백질 분자를 배양된 세포에서 발현시킨다.
바람직한 구체예에서, 돼지 서열이 A2 도메인 또는 부분 도메인과 같이 도메인 또는 부분 도메인을 암호화하고 있는 하이브리드 인간/돼지 cDNA를 ReNeO와 같은 포유동물 발현 벡터에 삽입하여 하이브리드 인자 VIII 제조물을 형성하였다. 먼저, ReNeO 포유동물 발현 벡터로 하이브리드 cDNA를 삽입하고 하이브리드 단백질을 COS-7 세포에서 일시적으로 발현시킴으로써 하이브리드 인자 VIII의 특성화를 수행하였다. 다음, 활성 하이브리드 단백질이 발현되는 것인가를 결정하였다. 리포좀-매개 형질전환 (LipofectinTM, Life Technologies, Inc.)과 같은 당해 기술분야에 통상적인 방법을 사용하여 상기 발현 벡터 제조물을 BHKC와 같은 배양중인 세포에 안정하게 형질 전환하였다. 재조합 하이브리드 인자 VIII 단백질의 발현은, 예를 들어, 시퀀싱, 노던 및 웨스턴 블랏팅, 또는 중합효소 사슬 반응(PCR)로 확인될 수 있다. 단백질을 안정하게 발현시키는 형질전환된 세포가 유지되고 있는 배양액내의 하이브리드 인자 VIII 단백질을 침전시키고, 펠렛화시키고, 세척하고, 및 적당한 완충액에서 재현탁할 수 있고, 재조합 하이브리드 인자 VIII 단백질을 표준 기술, 예를 들어, 단일 클론성 anti-A2-SepharoseTM을 사용하는 면역친화성 크로마토그래피를 포함하는 기술로 정제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 서브유니트, 도메인 또는 아미노산 서열 치환체를 포함하는 하이브리드 인자 VIII가, 예를 들어, 안정성, 분비, 검출, 분리 등등을 향상시키는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 서열이 상기 인자 VIII 암호화 서열 근처의 장소에 삽입되어 있는 재조합 분자로부터 융합 단백질로서 발현된다. 융합 단백질의 제조에, 예를 들어, 촉진유전자 (promoter), 작동유전자 (operator) 및 조절유전자(regulator)를 포함하는, 동종 또는 이종 생물종 발현 조절 서열을 사용하는 데 사용되는 확립된 방법이 당해 분야에 공지되어 있고 통상적으로 사용되고 있다. 참조Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel, F.M. 등, 편집) Wiley Interscience, N.Y. 간행.
정제된 하이브리드 인자 VIII 또는 이의 단편을, 예를 들어, 정제된 재조합 인간 인자 VIII를 표준물로 사용하여 무혈장 인자 VIII 분석법, 일단계 응고 분석법, 및 효소-연계 면역흡수 분석법을 포함하는 표준 분석법으로 면역반응성 및 응혈활성에 대하여 분석할 수 있다.
숙련 실험자의 선호도 및 판단에 따라서, 플라즈미드 및 진핵 바이러스성 벡터 둘다를 포함하는 다른 벡터를 사용하여 재조합 유전자 제조물을 진핵세포에서 발현시킬 수 있다 (참조, 예를 들어, Sambrook 등, 16 장). 박테리아, 효모 및 곤충 세포 시스템을 포함하는 다른 벡터 및 발현 시스템을 사용할 수 있으나 글리코실화에서의 차이 또는 결여 때문에 바람직하지 않다.
배양 및 재조합 포유동물 단백질 발현용으로 통상 사용되는 다양한 세포에서 재조합 하이브리드 인자 VIII 단백질을 발현시킬 수 있다. 특히, 많은 설치류 세포라인이 많은 단백질의 발현 호스트로서 특히 유용하다는 것이 밝혀졌다. 바람직한 세포라인은 메릴랜드주 록크빌 소재의 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입가능하고, BHKC 및 CHO 세포를 포함하며 이들은 통상적인 절차 및 배양액을 사용하여 배양할 수 있다.
서브유니트, 도메인 또는 아미노산 서열 치환체를 가지는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제조하는데 사용되는 동일한 방법을 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 동물/동물과 같은, 다른 재조합 하이브리드 인자 VIII 단백질과 이의 단편 및 이들 하이브리드를 암호화하는 핵산 서열을 제조하는 데 사용할 수 있다. 공지된 인간 DNA 서열로부터 얻은 프라이머로 시작하여, 쥐과 및 인간 인자 VIII cDNA의 부분을 클론하였다. 하이브리드 인간/동물 또는 동물/동물 인자 VIII 분자를 제조하는 데 사용되는 다른 생물종의 인자 VIII 서열은 공지된 인간 및 돼지 DNA 서열을 출발점으로 하여 얻어질 수 있다. 사용될 수 있는 다른 기술은 동물 조직 DNA를 사용하는 PCR 증폭 방법, 및 동물로부터의 cDNA 라이브러리를 사용하여 인자 VIII 서열을 클론시키는 것 등을 포함한다.
예증적 구체예에서, 하이브리드 인간/마우스 인자 VIII 단백질을 하기와 같이 만들 수 있다. 인간 인자 VIII의 마우스 상동체에 상응하는 DNA 클론들을 분리 및 서열화하고, Elder, G. 등 (1993) Genomics16(2):374-379에서 설명된 바와 같이, 마우스 인자 VIII 단백질의 아미노산 서열을 예측하는 데, 이에는 마우스, 인간 및 돼지 인자 VIII 분자 일부의 예상 아미노산 서열과의 비교를 포함한다. 마우스 인자 VIII cDNA 서열 및 예상 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8에 각각 나타나 있다. 바람직한 구체예에서, Sarkar, G. 등 (1989) Science244:331-334에 설명된 전사체 시퀀싱을 이용한 RNA 증폭 방법 (RAWTS)을 사용할 수 있다. 간단하게 언급하며, (1) 올리고(dT) 또는 mRNA-특이 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 cDNA 합성; (2) 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드가 증폭될 부위에 보조적인 서열에 부착된 파지 촉진유전자를 포함하는 중합효소 사슬 반응 (PCR); (3) 파지 촉진유전자를 사용한 전사; 및 (4) 원 (내부) 올리고 뉴클레오타이드로 프라임되어 있는 전사체의 역전사중합효소-매게 디데옥시 서열화의 단계를 포함한다. 서열정보를 나타내는 것외에, 이러한 방법은 번역 개시 신호를 적절한 PCR 프라이머로 포함시킴으로써 시험관 번역 생성물을 얻게 하고; 다른 생물종으로부터 신규의 mRNA 서열 정보를 얻게 한다.
아미노산 치환
본 발명은 한 생물종의 하나 이상의 독특한 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열로서 다른 생물종의 상응하는 아미노산 서열이나 이의 단편을 치환하는 서열을 포함하는 재조합 하이브리드 인간/동물 및 동물/동물 인자 VIII 분자나 이의 단편, 이들 하이브리드를 암호화하는 핵산 서열, 이들을 제조 및 분리하는 방법, 및 이들의 응고, 면역원성 및 면역반응성을 특성화하는 방법을 제공한다.
A2 도메인은 인자 VIII 분자의 응혈촉진 활성에 필요하다. 연구 결과는 인간 인자 VIII 보다 돼지 인자 VIII가 여섯 배 더 큰 응혈촉진 작용을 가진다 (Lollar, P. 등 (1991) J. Biol. Chem.266:12481-12486)는 것과 인간 및 돼지 인자 VIII사이의 응혈활성에서의 차이가 인간 및 돼지 A2 도메인에서의 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 서열 차이에 기인한다 (Lollar, P. 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657)는 것을 알려준다. 또한 A2와 C2 도메인 및 가능하게는 인간 인자 VIII 분자내의 제 3 경질 사슬 부위가 에피토프를 보유하고 있는 것으로 여겨지며, Hoyer (1994) Semin. Hewatol.31:1-5에 따르면, 모두는 아니더라도 대부분의 저해 항체가 이에 반응한다.
재조합 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 또는 등가 인자 VIII 분자 또는 이의 단편은, 한 생물종의 인자 VIII의 A2, C2 및/또는 다른 도메인으로부터 얻은 하나 이상의 독특한 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 특이 서열을 다른 생물종의 상응하는 서열을 대신하여 치환함으로써 만들어 질 수 있는 데, 하기에서 상세히 설명되는 바와 같이, 상기 아미노산 서열은 두 생물종의 분자간에 다르다. 본 명세서에서 서술된 바람직한 예증적 구체예에서, 본 발명은 상응하는 인간 아미노산 서열을 치환한, 에피토프 함유 돼지 아미노산 서열을 함유하는 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제공하는 바, 상기 하이브리드 인자 VIII는 인자 VIII에 저해적 항원과의 면역반응성이 감소되었거나 전혀 없다. 다른 구체예에서, 제 3의 생물 종에서의 상응하는 서열을 치환하는, 하나 이상의 생물종으로부터 얻은 아미노산 서열을 포함하는 활성 재조합 하이브리드 인자 VIII 분자를 만들 수 있다. 하기에서 더 설명되는 바와 같이, 인자 VIII에 동일한 공지 서열을 가지지 않은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나 이상의 서열이 있는 인간, 동물 또는 하이브리드 인자 VIII를 함유하는 재조합 하이브리드 등가 분자를 만들 수 있다.
표준 방법으로 설명한 바와 같이 특이 아미노산 치환체를 가지는 임의의 하이브리드 인자 VIII 제조물을 응혈활성 및 인자 VIII에 대한 저해 항원과의 반응성에 대하여 분석하여 향상된 응혈활성 및/또는 낮아진 항원 면역반응성을 가지는 재조합 하이브리드 인자 VIII 분자를 확인할 수 있다. 인간 또는 돼지 인자 VIII에 비하여 감소된 응혈활성 및 낮아진 항체 반응성을 가지는 하이브리드 분자를 확인할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 인간 또는 돼지 인자 VIII에 비해, 더 적은, 동등한, 또는 더 큰 응혈활성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자나 이의 단편이 인자 VIII 결핍증을 가진 환자를 치료하는 데 유용하다는 것을 이해하게 될 것이다. 본 명세서에서 서술된, 특이 아미노산 치환체를 가지는 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제조하는 방법은 활성 재조합 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII 단백질, 하이브리드 동물-1/동물-2 인자 VIII, 및 하이브리드 등기 인자 VIII나 이의 단편을 제조하는 데 사용할 수 있다.
변형된 응혈 활성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자
본 발명은 부위지정 돌연변이 기술을 사용하여, 응혈촉진활성을 보유하는, 한 생물종의 인자 VIII에서의 하나 이상의 독특한 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 특이 서열로서, 다른 생물종의 인자 VIII의 상응하는 아미노산 서열을 치환하는, 특이서열을 포함하는 응혈촉진 재조합 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 또는 등가 인자 VIII 분자 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 치환에 사용될 특이 서열을 하기와 같이 선택하고 하이브리드 제조물을 제작하고 응혈활성에 대하여 분석한다. A2 도메인에서 아미노산 치환체를 포함하는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII가 바람직한 예증적 구체예로서 제공된다. 당해 기술분야의 사람은 이러한 방법을 사용하여 변형된 응혈활성, 바람직하게는 인간 인자 VIII에 비해서 증가된 응혈활성을 가지는, 다른 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 및 등가 인자 VIII 분자체나이의 단편을 제조할 수 있는 것을 이해할 것이다.
Lollar, P. 등 (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P. J. 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250에 따르면, 돼지 인자 VIII에서의 더 큰 응혈활성에 대한 기본은 돼지 인자 VIIIa보다 더 빨리 인간 인자 VIIIa의 A2 서브유니트가 동시에 분리하는 것으로 나타나고, 이는 활성 손실로 되는 것이다.
인간 및 돼지 인자 VIII A2 도메인들의 아미노산 서열(인간 인자 VIII의 전체 길이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2에 대하여 위치 373에서 잔기 번호가 시작)을 정렬 배열하여 비교한 것이 도 1C에 도시되어 있다. 변형된 응혈활성을 가지는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 분자를 제조하기 위해서, 돌연변이를 야기하기 위한 시초 타겟 후보들이 표 1에 나타나 있는 데, 이들은 인간 및 돼지 A2 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NOs: 2 및 6) 비교시 드러났다.
돌연변이 야기용 인간 아미노산 서열 타겟 후보 (SEQ ID NO:2)
서열 잔기 불일치 전하 변화
398-403 6 4 1
434-444 10 4 3
484-496 13 7 3
598-603 6 4 2
536-541 6 4 0
713-722 10 6 2
727-737 11 6 2
표 1 및 도 1A-1B의 굵은 글씨체는 인간 및 돼지 A2 도메인 아미노산 서열을 (각각 SEQ ID NOs:2 및 6)에서 7개 서열을 보여주는 데 이는 A2 도메인의 17 %밖에 구성하지 않지만 인간 및 돼지 A2 도메인 간의 서열 차이중 70%를 포함하고 있다.
인간 인자 VIII의 A2 도메인 (Ser373-Arg740)에서 아미노산 Ser373-Glu604가 상동 돼지 서열로 교체된 재조합 하이브리드 인간/돼지 제조물이 개시된다. 이러한 제조물은 A2 저해체와 반응하지 않고 인간 B(-) 인자 VIII와 동일한 응혈활성을 가진다. 인간 인자 VIII에 비하여 증가된 응혈활성을 가지는, 인간 인자 VIII에서의 완전한 돼지 A2 도메인 치환체를 포함하는 혈장-유래 하이브리드 분자가 개시된다. 이러한 제조물들을 비교함으로써, 잔기 Asp605 및 Arg740 사이의 부위가 인간 및 돼지 인자 VIII간의 활성 차이를 담당한다는 것을 알 수 있다. 이러한 부위는 Asp605 및 Arg740 사이의 부위에서의 돼지 치환체를 가지는 재조합 인자 VIII 인간/돼지 인자 VIII 분자를 체계적으로 만듦으로써 더욱 상세히 한정될 수 있는 데, 이를 위해, 확립된 부위-지정 돌연변이 기술, 예를 들어, A2의 NH2-말단 부위에서 돼지 치환체를 함유하는 하이브리드 인자 VIII 분자를 만드는데 사용된 "중첩 연장에 의한 접목" (SOE) 방법을 적용할 수 있다. 이러한 분자체들을 상술한 바와같이 COS-7 세포 및 BHKC에서 발현될 수 있다. 헤파린-세파로즈TM및 면역친화성 크로마토그래피와 같은 당해분야에 공지된 기술을 사용하여 상기 분자체들을 정제하여 균일한 분자체를 얻을 수 있다. 단백질 농도는 A280에서 자외선을 흡수하여 측정될 수 있고, 제조물의 비 활성은 응혈활성 (일단계 응고 분석으로 ml당 유니트로 측정된) A280으로 나눔으로써 결정될 수 있다. 인간 인자 VIII는 약 3000-4000 U/A280의 비 활성을 가지는 반면 돼지 인자 VIII은 약 20,000 U/A280의 비 활성을 가진다. 바람직한 구체예에서, 응혈촉진 재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII는 20,000 U/A280의 비 활성을 가지며 A2 도메인에서 최소량의 돼지 치환체를 함유한다.
본 명세서에서 서술되는 바와 같이, 부위-지정 돌연변이 기술을 사용하여 인간 인자 VIII에 비해 향상된, 동일한 또는 감소된 응혈활성, 그러나 바람직하게는 향상된 응혈활성을 가지는 하이브리드 단백질을 확인한다. 하이브리드 인간/돼지 구체예에서, Ho, S.N. 등 77 Gene 51-59 (1994) 및 실시예 7과 8에서 서술된 바와 같이 바람직하게는 SOE 방법을 사용하여, 특이 인간 서열을 돼지 서열로 치환한다. 인간 A2 도메인의 일부에 대한 아미노산 서열을 환상 제거하기 위해 실행된 것(참조 실시예 7)과 같이, 올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이 방법을 또한 사용할 수 있다. 상기 하이브리드체들의 기능 분석으로 응혈활성이 나타남에 따라, 상기 서열을 더분절하고 표준 포인트 돌연변이 분석 방법으로 응혈 촉진 서열에 대하여 더 지도화할 수 있다.
본 발명은 DNA 시퀀싱, 응혈활성 분석법, ELISA 및 280 nm에서의 UV 흡수에 의한 정제된 하이브리드 인자 VIII의 질량 분석법, 비 응혈 활성 (U/mg), 정제된 하이브리드 인자 VIII의 SDS-PAGE 등과 같은 확립되고 통상적인 방법으로 하이브리드 인자 VIII cDNA 및 단백질을 특성화하는 것에 관한 것이다. 임상적 효율성을 시험하는 다른 공지 방법을 사용하여 아미노산, 탄수화물, 황산염 또는 금속 이온 분석할 수 있다.
인간 인자 VIII에 비해 뛰어난 응혈활성을 가지는 재조합 하이브리드 인자 VIII는 그 제조에 있어 혈장-유래 인자 VIII보다 비싸지 않고 인자 VIII 결핍을 효과적으로 치료하는 데 필요한 인자 VIII의 양을 줄일수 있다.
감소된 면역반응성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자체
인자 VIII의 응혈활성을 저해하는 항체 ("저해체" 또는 "저해 항체")와 면역반응하는 에피토프는 인자 VIII에서 공지된 구조-기능 관계에 근거하여 특성화되었다. 아마도, 인자 VIII의 도메인 구조와 결부된 거대분자적 상호작용 중 어느 하나를 방해함으로써 또는 폰 빌레브란트 인자, 트롬빈, 인자 Xa, 인자 IXa 또는 인자 X와의 결합을 방해함으로써 저해체가 작용하는 것으로 여겨진다. 그러나, Fulcher 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; 및 Scandella 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156 에 설명된 바와 같이, 인간 인자 VIII대한 저해 항체중 90% 이상이 인자 VIII의 40 kDa A2 도메인 또는 20 kDa C2 도메인에 위치한 에피토프에 결합함으로써 작용하면서, 이들 도메인과 결부된 특이 기능을 방해한다. Scandll 등 (1993) Blood 82:1767-1775에 따르면, A2 및 C2 에피토프외에, 제 3의 에피토프가 인자 VIII의 경질 사슬의 A3 또는 C1 도메인에 있을 수 있다. 이러한 추정되는 제 3의 에피토프의 중요성은 알려지지 않았지만, 인자 VIII에서의 부차적인 에피토프 반응성을 설명해주는 것으로 보인다.
Lollar 등 (1994) J. Clin, Invest. 93:2497-2504에서 설명된 바와 같이, 항-A2 항원들이 인자 X 활성을 막는다. Ware 등 (1992) Blood Coagul. Fibribolysis 3:703-716에서 설명한 바와 같은 결손 돌연변이에 의한 이전의 맵핑 연구에 의하면, A2 에피토프는 40 kDa A2 도메인의 NH2-말단의 20 kDa 부위내에 존재한다. 경쟁 면역방사선측정 분석법 (competition immunoradiometric assay)에 따르면, Scandella 등 (1992) Throm. Haemostas 67:665-671에서 및 실시예 8에서 설명된 바와 같이, A2 저해체들은 공통 에피토프나 좁게 집단화된 에피토프를 인식하는 것으로 나타난다.
본 발명은 활성 재조합 하이브리드와 하이브리드 등가 인자 VIII 분자체나 이의 단편, 이들 하이브리드들을 암호화하는 핵산 서열, 이들을 제조하고 분리하는 방법, 빛 이들을 특성화시키는 방법을 제공한다. 이들 하이브리드는 인간/동물, 동물/동물 또는 등가 하이브리드 인자 VIII 분자체를 포함하는 바, 다른 생물종의 인자 VIII의 상응하는 아미노산 서열을 치환한, 한 생물종의 인자 VIII의 하나 이상의 독특한 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 특이 아미노산 서열을 더 포함하거나; 또는 , 인자 VIII에 동등한 알려진 서열을 가지지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열로서 인간, 동물 또는 하이브리드 인자 VIII에서 특이 아미노산 서열을 대체하는 서열을 포함한다. 결과된 하이브리드 인자 VIII는 저해 항체에 대한 면역 반응성이 인간 또는 돼지 인자 VIII에 비해서 감소되거나 결여되어 있다.
인자 VIII 분자에서 아미노산을 치환하기 위한 전술한 단락에서 설명한 접근 방법을 이용하여, 돌연변이성 분석으로, 하나의 생물종, 바람직하게는 돼지의 상응하는 인자 VIII 아미노산 서열로서 다른 생물종, 바람직하게는 사암의 인자 VIII에서 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열이나, A2, C2 또는 저해 항체에게 지향되는 다른 도메인에서의 하나 이상의 결정 주위를 포함하는 하이브리드 등가 인자 VIII의 아미노산 서열을 치환하는 것을 선택할 수 있다. 이 방법은 하기에서 더 상세히 설명된다. 결과된 응혈촉진 재조합 하이브리드 제조물은 표준 분석방법으로 측정할 때, 인간 인자 VIII에 비해서 저해 항체에 대한 면역반응성이 더 낮거나 결여되어 있다. 후술하는 바와 같이, 점차적으로 더 적게 아미노산 서열을 체계적으로 치환한 후, 하이브리드 제조물을 면역반응성에 대하여 분석함으로써, 인자 VIII 분자의 임의의 도메인 내의 에피토프가 맵핑 되고, 면역반응성이 적거나 없는 아미노산 서열에 의해 치환되고 및 하이브리드 인자 VIII이 제조된다.
당해분야의 숙련자는 에피토프 맵핑, 하이브리드 인자 VIII 분자의 제작 및 제작물의 돌연변이 분석을 조합한 이러한 접근법을 사용하여 A2, C2 및/또는 저해 항체가 지향하는 다른 도메인에서의 에피토프를 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열을 확인하고 치환할 수 있고 및 인간 또는 돼지 인자VIII에 비해 면역반응성이 감소되었거나 없는 응혈촉진 재조합 하이브리드 인간/동물, 동물/동물 또는 등가 인자 VIII 또는 이의 단편을 제작할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 방법은 실시예 8에서와 같이, 인간 A2 도메인에서 돼지 아미노산 치환체를 가지며 및 항-인자 VIII 항체에 항원성을 가지지 않는 재조합 응혈 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제조하는 데 사용된다.
통상, 돼지 인자 VIII는 인간 인자 VIII에 대한 저해 항체에 제한된 반응성 또는 무반응성을 가진다. 저해 항체에 감소된 또는 무 반응성을 가지는 재조합 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 분자들을 A2 도메인에서의 아미노산 치환에 근거하여, 다른 생물종의 인자 VIII 및 A2 외의 도메인에서의 치환체를 이용하여 하이브리드 인자 VIII가 제조될 수 있는 방법의 예로서 하기와 같이, 제조한다. 실시예 6, 7 및 8에서 및 상기에서 서술된 바와 같은 표준 클로닝 기술로 돼지 A2 도메인을 클로닝하고, 다음, cDNA를 절단하는 제한효소 자리를 사용하는 방법이나 SOE와 같은 통상적인 방법을 사용하여 A2 도메인 내로 절단 및 접합시킨다. 상술한 바와 같이, 결과된 돼지 아미노산 서열은 치환되어 인간 A2 도메인 내로 들어가서 하이브리드 인자 VIII 제작물을 만들고, 이는 포유동물 발현 벡터, 바람직하게는 ReNeo로 삽입되고, 배양된 세포, 바람직하게는 BHKC로 안정하게 형질전환되고 발현된다. 이 하이브리드 인자 VIII은, 예를 들어, 통상적인 베데스타 분석 또는 무혈장 색소원(chromogenic) 기질 분석법으로 항-A2 항체를 사용하여 면역반응성에 대하여 분석한다. 베데스타 유니트 (BU)는 저해체 역가를 측정하는 표준 방법이다. 베데스타 역가가 하이브리드에서 측정될 수 없다면(<0.7 BU/mg IgG), 인간 A2 에피토프를 치환된, 상응하는 인간 서열의 부위에서 제거한다. 이 에피토프는 점진적으로 좁혀들며, 특이 A2 에피토프가 따라서 결정되어 가능한 한 적은 인간 서열을 가지는 하이브리드 인간/인간 분자를 생산할 수 있다. 설명된 바와 같이, 저해 면역반응성에 결정적인 아미노산 Arg484-Ile508에 상응하는 25-잔기 서열을 확인하고 인간 A2 도메인에서 치환되었다. 이러한 서열내에서는 인간과 돼지 인자 VIII사이에 단지 9개 상이점이 있을 뿐이다. 이 부위를 더욱 분석하고 치환할 수 있다.
C1, C2 또는 다른 도메인에서 아미노산 서열 치환에 근거하여, A2 도메인에서는 치환되거나 치환되지 않은, 저해 항체에 대한 반응성이 감소되거나 없는 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 상동 스캐닝 접근법을 부위-지정 돌연변이법과 조합하여 상기 C2 에피토프를 맵핑할 수 있다. 더 상세히는, 이러한 절차들이, 예를 들어 RT-PCR을 사용하거나 돼지 간 cDNA 라이브러리를 인간 C2 또는 다른 도메인 DNA로써 탐침하여 돼지 C2 또는 다른 도메인을 클로닝하는 것; C2 또는 다른 도메인에서 에피토프를 맵핑하고 동시에 치환하는 제한효소 부위 기술 및/또는 연속 SOE; B(-) 인자 VIIIdom이 인간 C2 또는 다른 도메인을 대신한 치환; pBluescript와 같은 발현 벡터내로의 삽입; 배양된 세포에서의 발현; 및 면역반응성에 대한 통상적인 분석을 포함하는, A2 도메인에서의 아미노산 치환에 대해 설명된 것과 동일 또는 유사한 것일 수 있다. 이러한 분석법에 관해서는, C2 하이브리드 인자 VIII가 C2-특이 저해체, MR [Scandella 등 (1992) Thomb. Haemostasis 67:665-671 및 Lubin 등 (1994)], 및/또는 친화 크로마토그래피에 의해 제조된 다른 C2 특이 항체와의 반응성을 시행할 수 있다.
C2 도메인은 아미노산 잔기 2173-2332(SEQ ID NO:2)로 구성된다. 이러한 154개 아미노산 부위내에서, 저해체 활성은, Shima, M 등 (1993) Thromb. Haemostas 69:240-246에 따르면, 잔기 2248 및 2312 사이의 65 아미노산 부위로 지향되는 것으로 나타난다. 인자 VIII의 기능적으로 활성인 부위들의 다른 곳에서와 마찬가지로, 인간 및 돼지 인자 VIII의 C2 서열이 이 부위에서 85% 동일하다면, 인간 및 돼지 인자 VIII C2 아미노산 서열간에는 약 열 개의 차이가 있을 것이고, 이는 치환된 C2 서열로 하이브리드를 제작하는 데 처음 목표물로서 사용될 수 있다.
임상적으로 중요한 인자 VIII 에피토프들은 A2 및 C2 도메인에 한정되는 것 같다. 그러나, 인자 VIII의 다른 부위 (A1, A3, B 또는 C1 도메인)에 대한 항체가 확인된다면, 비항원성 하이브리드 인간/인간 인자 VIII 분자에 대해 본 명세서에서 설명된 접근법을 사용하여 에피토프들을 맵핑하고 제거할 수 있다.
더 상세하게는, 임의의 다른 동물 또는 인간 인자 VIII 도메인내의 추정되는 제 2 경질 사슬 에피토프 및/또는 임의의 다른 에피토프를 맵핑하는 것이 또한 수행될 수 있다. 먼저, A3 또는 C1 도메인내의 제 3 저해체 에피토프의 존재를 아래와 같이 확인한다. 인간("H") 및 돼지("P") 인자 VIII 아미노산 서열을 모델로 사용하여, A1P-A2P-A3P-C1H-C2P및 A1P-A2P-A3H-C1P-C2PB-도메인결여 하이브리드물들을 제작할 것이다. 돼지 인자 VIII에 대하여 낮거나 검출불가능한 역가를 가지는 약 20 여명의 환자 혈장 (미국 적십자사의 Dorothea Scandella 박사로부터 입수)에서 얻은 저해체 IgG를 상기 하이브리드물에 대하여 시험할 것이다. 제 3 에피토프가A3 도메인에 존재한다면, 저해 IgG는 A1P-A2P-A3H-C1P-C2P에 반응하나 A1P-A2P-A3P-C1H-C2P와는 하지 않을 것으로 예상된다. 역으로, 제 3 에피토프가 C1 도메인에 존재하면, 저해 IgG는 A1P-A2P-A3P-C1H-C2P와는 반응하나 A1P-A2P-A3H-C1P-C2P에는 반응하지 않을 것으로 예상된다. 제 3 에피토프가 확인되면, A2 및 C2 에피토프들에 대해 설명된 절차로 그것을 특성화할 수 있다.
예를 들어, A1P-A2P-A3P-C1H-C2P및 A1P-A2P-A3H-C1P-C2P하이브리드물을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 시행하고 재조합 인자 VIII C2-세파로즈TM을 통과시킴으로써 C2 특이성 항체를 제거함으로써, C1 또는 A3 도메인 에피토프에 특이적인 항체를 전체 환자 IgG로부터 분리할 수 있다. 추정되는 제 3 에피토프는 SOE 제작물에 의해 확인되는 데, 바람직한 구체예에서 인간 인자 VIII의 부분들이 돼지 서열로 체계적으로 치환된다.
감소된 면역원성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자
분자체가 인간 또는 동물에서 항체 형성을 유도할 수 있을 때 그 분자체는 면역원성이 있다고 할 수 있다. 본 발명은 다른 생물종의 인자 VIII의 면역원성 활성을 가지는 상응하는 아미노산 서열을 대신하여 치환하는, 한 생물종의 인자 VIII의 하나 이상의 독특한 아미노산을 포함하는 적어도 하나 이상의 특이 아미노산 서열; 또는 인간, 돼지 또는 하이브리드 인자의 아미노산 서열을 대신하여 치환하는,인자 VIII에 알려진 동등한 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 또는 돼지에서 야생형 인간 돼지 인자 VIII보다 덜 면역원성적인 응혈 재조합 하이브리드 인간/동물 또는 동물/동물 인자 VIII 분자, 하이브리드 인자 VIII 등가 분자 또는 이의 단편을 제공한다. 이러한 하이브리드를 사용하여 동물 또는 인간에서의 저해체 발생을 줄이고 인자 VIII 결핍을 치료할 수 있고, 및 이전에 치료되지 않은 혈우병 환자를 치료하는 데 바람직할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 하이브리드 인자 VIII는 인간 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하고, 또한 면역원성활성을 가지는 인간 아미노산 서열 대신 치환된 하나 이상의 알라닌 잔기를 포함하여, 인체 또는 동물에서 면역원성이 감소된 또는 없는 응혈 촉진 재조합 하이브리드 등가 분자 및 이의 단편을 수득할 수 있다.
하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 사용하여, 에피토프 맵핑, 및 인자 VIII 분자에서 비-항원성 아미노산 서열을 치환하는 것과 연계된 돌연변이 분석의 방법은 낮은 항원성을 가진 하이브리드 분자체들을 제조한다. 이러한 모델 및 연관 방법을 사용하여, 설명된 하이브리드 제작물 중 임의의 것을 부위-지정 돌연변이 기술로 변경하여 가능한 한 많이 임의의 기능적 에피토프를 제거함으로써, 면역 시스템이 하이브리드 인자 VIII를 인식하는 능력을 최소화시키게 되고, 이럼으로써 그것의 면역원성을 낮춘다.
항원성을 더 낮추고 덜 면역원성적인 하이브리드 인자 VIII를 제작하는 데 사용될 수 있는 한가지 방법은 Cunningham, B.C. 등 (1989) Science 244:1081-1085에서 설명한 바와 같이, 인간, 동물 또는 하이브리드 등가 인자 VIII에서 선택된특이 아미노산 서열의 알라닌 스캐닝 돌연변이 법이다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 법에서, 에피토프에 연루되었을 것이라고 추정되는 아미노산 측쇄는 부위-지정 돌연변이법을 사용하여 알라닌 잔기로 대체된다. 야생형 단백질과 알라닌 돌연변이와의 항체 결합능을 비교함으로써, 결합 작용에 대한 개별 측쇄의 상대적인 공헌을 결정할 수 있다. 알라닌 치환체들은, 항원 결합에 대한 측쇄 기여가 β-탄소를 넘어서 제거되지만, 그러나, 글라이신 치환과는 달리, 주사슬 형태가 보통 변하지 않기 때문에 특히 유용한 것 같다. 알라닌 치환은, 단백질-단백질작용을 지배하는 주요 입체구조적, 소수성 또는 정전기적 효과를 변경하지 않는다.
단백질 항원-항체 작용에 있어서, 약 15-20개의 항원 측쇄가 항체와 접촉한다. 주쇄 상호작용에 반대되는 것으로서, 측쇄 상호작용은 단백질-단백질상호 작용을 지배한다. 최근의 연구 결과에 따르면, 이러한 측쇄 상호작용의 몇몇(3 내지 5)만이 결합 에너지의 대부분을 관장하는 것으로 나타났다. 참조 Clackson, T. 등 (1995) Science 267:383-386. 몇몇 쥐과 단일클론 항체에 대한 성장 호르몬 에피토프의 연구 분석결과 결합 에너지에 대한 측쇄의 공헌도 등급이 하기와 같이 밝혀졌다: Arg>Pro>Glu-Asp-Phe-Ile, 여기서 Trp, Ala, Gly 및 Cys는 시험되지 않았다 [Jin, L 등 (1992) J. Mol. Biol. 226:851-865]. 484-508 A2 세그먼트내의 24 잔기중 12개가 이러한 측쇄를 포함하기 때문에 (표 1), 본 명세서에서 설명된 A2 에피토프를 사용한 결과도 이와 일치하고 있다.
일정한 아미노산 잔기가 특히 항체에 의해 잘 인식된다는 발견은 공지된 에피토프로부터 이러한 잔기를 제거하면 이러한 에피토프를 인식하는 면역 시스템의능력을 저하시킬 수 있는, 즉, 분자체를 덜 면역원성이되게 할 수 있다는 것을 의미한다. A2 에피토프의 경우, 면역원성 잔기는 인자 VIII 응혈활성 손실없이 치환될 수 있다. 예를 들어, HP9에서, Arg484는 Ser에 의해 치환되고, Pro485는 Ala에 의해, Arg489는 Gly에 의해, Pro492는 Leu에 의해 및 Phe501은 Met에 의해 치환된다. 더욱이, 실시예 8에서 설명되는 바와 같이, 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 제작물에서 면역원성을 시험하기 위해 사용된 환자 혈장으로부터의 결과는 상이한 환자로부터 얻은 항체들은 A2 도메인에서 동일한 또는 매우 유사한 구조적 부위를 인식한다는 것과 A2 저해체와 결합하는 데 참여하는, A2 도메인내의 잔기들이 변이를 거의 보이지 않는다는 것을 알려준다. 따라서, 인간 인자 VIII 잔기 484-508애에 포함된 A2 에피토프는, 그것이 인자 VIII의 다른 구조적 부위보다 인간 면역 시스템에 의해 더 잘 인식된다는 점에서, 면역우세(immunodominant) 에피토프이다. 전체 응혈활성을 유지하면서, 이러한 구조체를 다른 생물종으로부터의 비항원성 인자 VIII 서열 또는 비-인자 VIII 아미노산 서열에 의해 치환하는 것은 면역 시스템이 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII을 인식하는 것을 변경하는 것으로 예상된다.
에피토프를 지배하는 크고 및/또는 하전된 잔기를 작고, 중성 측쇄 (예를 들어, 알라닌)로 치환하는 부위-지정 돌연변이법은 면역원성이 감소된 부위를 나타낼 것이라고 예상된다. 중대한 저해체 에피토프 각각에서 이러한 치환체 몇몇을 함유하는 분자체는 면역 시스템이 이를 항원-항체 상호작용의 전형인 열쇠- 및-키 기작으로 맞추기가 어려울 것이다. 이것의 낮은 항원성 때문에, 그러한 하이브리드 분자체는 저해체로써 인자 VIII 결핍 환자를 치료하는 데 유용하게 될 것이고, 그리고, 낮은 면역원성 때문에, 이전에 치료되지 않은 혈우병 A 환자를 치료하는데 유용할 수 있다.
일반적인 결과는 소개의 주요 잔기중에서 하나의 돌연변이만으로도 특정 단백질-단백질 상호작용에 대한 결합상수를 수 차수 크기로 줄인다는 것이다. 따라서, 모든 인자 VIII 에피토프는 저해체 발생에 결정적인 아미노산들을 제한된 숫자로 가지고 있다. 인자 VIII내의 각 에피토프에 대해서, 면역원성 활성을 가지는 하나 이상의 특이 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열에 대신에 알라닌으로 치환하면, 야생형 인자 VIII보다 덜 면역원성적인 활성 분자를 생성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 하이브리드 인자 VIII는 B 도메인이 없는 것이다.
면역원성 활성을 가지는, 인자 VIII 내의 아미노산 서열대신에 면역원성 활성의 거의 없거나 전혀 없는 아미노산을 치환하는 활성 재조합 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII을 제조하는 방법에서, A2 도메인에서 아미노산 치환체를 가진 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 사용하는 것이 예증적 구체예로서 하기에 서술된다. 인간 인자 VIII 부위 484-508에는 25 잔기가 있다. 부위-지정 돌연변이법을 사용하여 이러한 잔기중 임의의 것이 다른 19 개 아미노산중 임의의 것으로 치환된 단일 돌연변이체들을 총 475개 만들 수 있다. 더욱이, 하나 보다 많은 돌연변이를 가지는 하이브리드 분자체들을 제작할 수 있다.
하이브리드 제작물은, Friguet, B 등 (1985) J. Immunol. Methods 77:305-319 (1985)에 설명된 바와 같이, 저해체 항체에 대한 결합상수를 측정함으로써, 항원성에 대하여 분석할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합상수는 적어도 삼 차수의 크기로 감소되며, 이것은 베데스타 역가를 임상적으로 중요하지 않는 수준으로 낮추게 한다. 예를 들어, A2 항체에 의한 저해의 IC50(결합 상수의 대략 측정치)은 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 제작물 HP2, HP4, HP5, HP7 및 HP9에서 감소되었고, 이것은 베데스타 역가가 측정할 수 없는 수준까지 감소된 것과 연관이 있었다. 예를 들어, 인간 인자 VIII의 이중 또는 삼중 알라닌 변이체 (예들 들어, 인간 인자 VIII Arg484->Ala, Arg489->Ala, Phe501->Ala 삼중 변이체)는 치료용도에 충분히 낮은 항원성을 가진 분자를 생성할 것이다. 유사 변이들이 C2 에피토프 및 추정되는 제 3 에피토프내에 만들어 질 수 있다. 바람직한 구체예는 둘 또는 세 개 인자 VIII 에피토프들내로 둘 또는 세 개 알라닌 치환을 포함한다. 이러한 부위로의 다른 치환들 또한 수행될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 인체 및 동물내에서 인간 또는 돼지 인자 VIII보다 덜 항원성 및/또는 면역원성적인 하이브리드 등가 인자 VIII 분자체가 확인될 것이다. 그러한 하이브리드 등가 제작물을 감소된 항원성 및/또는 면역원성에 대하여 동물에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 대조군 및 인자 VIII 결핍 토끼, 돼지, 개, 마우스, 영장류 및 다른 포유동물을 동물 모델로서 사용할 수 있다. 한 실험 방법에서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 동물에게 육개월 내지 일년에 걸쳐 바람직하게는 정맥내 주입으로 그리고 5 내지 50 유니트/kg 체중의 양으로, 바람직하게는 10-50 유니트/kg, 및 가장 바람직하게는 40 유니트/kg의 양으로 체계적으로투여할 수 있다. 주입후 시험 기간 동안에 걸쳐 정해진 간격으로 혈장 샘플을 취하여 항체를 , 면역검정 및 베데스타 분석법을 포함하는 통상적인 방법으로 측정할 수 있다. 응혈활성 또한 일단계 응집 분석법을 포함하는 통상적인 방법으로 샘플내에서 측정할 수 있다.
하이브리드 등가 인자 VIII 분자체를 감소된 항원성 및/또는 면역원성에 대하여 인체내에서 적어도 두 가지 유형의 임상적 시도로 시험할 수 있다. 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII가 저해 항원과 면역반응성이 있느냐를 결정하기 위해 설계된, 한 가지 시도에서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 바람직하게는 정맥 주입으로, 치료적 인간 또는 돼지 인자 VIII의 응집 활성을 저해하는, 인자 VIII에 대한 항체를 가지는 인자 VIII 결핍 환자 25명에게 투여한다. 인간 또는 인간 등가 인자 VIII의 투여량은 5 내지 50 유니트/kg 체중, 바람직하게는 10-50 유니트/kg, 가장 바람직하게는 40 유니트/kg 체중이다. 각각 투여한 다음 약 1 시간 후에, 혈액 샘플로부터 인자 VIII의 회복을 일단계 응집 분석법으로 측정한다. 다시 주입 5 시간 후에 샘플을 취하여 회복 정도를 측정한다. 샘플로부터 인자 VIII의 회복 및 소멸 속도는 항체 역가 및 저해 활성의 지표가 된다. 항체 역가가 높다면, 인자 VIII 회복은 보통 측정될 수 있다. 혈장-유래 인간 인자 VIII, 재조합 인간 인자 VIII, 돼지 인자 VIII, 및 인자 VIII 또는 인자 VIII 대체물의 통상적으로 사용되는 다른 형태로 처리된 환자에서, 회복 결과를 회복 결과의 회복과 비교한다.
하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII이 면역원성인가, 즉 환자가 저해 항체를 발생할 것인가를 결정하는 것으로 설계된 두 번째 유형의 임상 시도에서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 전술 문단에서 설명한 바와 같이, 인자 VIII에 대한 항체를 발생시키지 않은 100 명의 이전에 치료되지 않았던 혈우병 환자에게 투여한다. 매 2 주마다 육개월 내지 일년에 걸쳐서 치료한다. 이기간 동안 1 내지 3 개월 주기로, 혈액 샘플을 취하고 베데스타 분석법 또는 다른 항체 분석법을 실시하여 저해 항체의 존재를 결정한다. 회복 분석 또한, 상술한바와 같이, 각 주입 후에 실시할 수 있다. 결과를, 혈장-유래 인간 인자 VIII, 재조합 인간 인자 VIII, 돼지 인자 VIII 또는 인자 VIII나 인자 VIII 대체물의 통상적으로 사용되는 다른 형태를 받은 혈우병 환자와 비교하였다.
인간 및 비-돼지, 비-인간 포유동물 인자 VIII 아미노산 서열을 이용한 하이브리드 인자 VIII 분자체의 제조
특이 아미노산의 치환체를 가진 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제조하는데 사용된 방법을 사용하여, 인간 또는 돼지 인자 VIII에 비하여, 변형된 또는 동일한 응혈활성 및/또는 동일하거나 감소된 면역반응성 및/또는 면역원성을 가지는 재조합 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 동물/동물 인자 VIII 단백질을, A2, C2 및/또는 다른 도메인에서의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것에 근거하여, 제조할 수 있다.
인간 및 /비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 동물/동물 인자VIII 단백질간의 아미노산 정체를 비교하여 응혈활성, 항-A2 및 항-C2 면역반응성 및/또는 면역원성, 또는 다른 도메인에서의 면역반응성 및/또는 면역원성이 있는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 다음, 유사한 방법을 사용하여 하이브리드 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII 분자를 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이, 각 하이브리드의 기능 분석으로, 저해 항체에 감소된 활성, 및/또는 감소된 면역원성, 및/또는 증가된 응혈활성을 가지는 것들을 밝히고 그 서열을 점 변이 분석으로 세분할 수 있다.
예를 들어, 하이브리드 인간/마우스 인자 VIII 분자체일 상술한 바와 같이 제조할 수 있다. 인간의 A2 도메인 (SEQ ID NO:2) 및 마우스의 A2 도메인 (SEQ ID NO:6)의 배열된 아미노산 서열이 도 1C에 나타나 있다. Elder 등에 의해 보고된 바와 같이, 마우스 cDNA에 의해 암호화된 인자 VIII 단백질 (SEQ ID NO:5)는 2319개의 아미노산을 가지며 인간 서열 (SEQ ID NO:2)에 대해 전체적으로 74% 서열 동일성을 가지고 (B 도메인을 비교에서 제외시킬 때는 87% 동일성), 그리고 인간 인자 VIII보다 32 아미노산 더 짧다. 마우스 A 및 C 도메인 (SEQ ID NO:6)에서의 아미노산 서열은 매우 높게 보존되어 있어 인간 서열 (SEQ ID NO:2)와 84-93% 서열 동일성을 유지하고 있고 b 및 두 개 짧은 산성 도메인은 42-70% 서열 동일성을 가진다. 상세하게는, A1, A2 및 A3 마우스 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6)는 상응하는 인간 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)와 85, 85 및 90% 동일하다. C1 및 C2 마우스 아미노산 서열은 상응하는 인간 아미노산 서열과 93 및 84% 동일하다. 예상되는 마우스 인자 VIII 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6)에서, A1, A2 및 A3 도메인들은 인간 인자 VIII 아미노산 1-372, 373-740, 및 1690-2032에 각각 상동적이다.
트롬빈/인자 Xa 및 하나를 제외한 전체 활성화된 단백질 C 절단 부위가 마우스 인자 VIII에서 보존되어 있다. 폰 빌레브란트 인자 결합용 타이로신 잔기 또한 보존되어 있다.
Elder 등에 따르면, 마우스 인자 VIII의 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:5)는 7519 염기를 포함하며 인간 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:1)와 전체적으로 67% 동일성을 가진다. 쥐를 코딩하는 6957 쌍의 서열은 인간 인자 VIII에서 7053 염기쌍의 서열과 82% 서열 동일성을 가진다. B 도메인을 비교에 포함시키지 않을 경우, 88% 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있다.
Elder 등은 인간과 마우스 인자 VIII 분자체는 전체적으로 74% 동일하고, 변형될 때 혈우병을 유발하는 인간 잔기중에서 95%는 마우스와 동일하다고 보고하고 있다. 이러한 데이터는 돼지 인자 VIII 분자에서 응혈활성 및/또는 항체에 대한 면역반응성을 가지는 아미노산 서열을 확인하는 데 사용한 동일한 기술을 마우스 또는 다른 동물 인자 VIII에 적용하여 유사한 아미노산 서열을 확인하고 하이브리드 분자체를 제조하는 것을 뒷받침한다.
인간 및 비-인간, 비-돼지 포유동물 인자 VIII 아미노산 서열 및 비-인자 VIII 아미노산 서열을 사용한 감소된 교차 반응성을 가지는 하이브리드 인자 VIII 분자체의 제조
돼지 인자 VIII를 임상적으로 사용하여 인간 인자 VIII에 대한 저해 항체를 가지는 인자 VIII 결핍 환자를 치료한다. 인간 혈장이 돼지 인자 VIII와 반응하는교차 반응성은 하이브리드 돼지/비-인간, 비-돼지 포유동물 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 제조하여 감소시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인간 A2, C2 또는 다른 도메인-특이 저해체가 비-인간, 비-돼지 포유동물 ("다른 포유동물") 인자 VIII와 반응하느냐의 결정을, 통상적인 베데스다 분석법 및 표준물로서 특정한 다른 포유동물 혈장을 사용함으로써, 내릴 수 있다. 저해체 역가는 통상 혈장에서 측정되어서, 정제된 다른 포유동물 인자 VIII가 필요치 않다. 저해체가 서열이 공지된 다른 포유동물 인자 VIII, 예를 들어, 쥐과 인자 VIII와 반응하지 않는다면, 상응하는 다른 포유동물 서열을 돼지 에피토프 부위 내로 치환시켜 인간/돼지 하이브리드를 사용하여 확인할 수 있다. 일단 동물 서열이 알려지면, 부위-지정 돌연변이 기술, 예를 들어, Kunkel, T.A. 등 (1991) Meth. Enzymol 204:125-139에서 설명된 올리고뉴클레오타이드-매개 돌연변이를 사용하여 하이브리드 돼지/동물 인자 VIII 분자체를 제조할 수 있다. 다른 동물 혈장이 쥐 또는 돼지 인자 VIII보다 A2, C2 또는 다른 인자 VIII 저해체와 덜 반응한다면, 돼지 에피토프에 상응하는 동물 서열은 RT-PCR과 같은 통상적인 방법으로 결정될 수 있고, 및 하이브리드 인간/동물 또는 돼지/동물 인자 VIII를 부위-지정 돌연변이법으로 제작할 수 있다. 또한, 인간 혈장과의 교차 반응성이 돼지 인자 VIII에 비해 감소된 하이브리드 인간/동물 또는 돼지/비-돼지 포유동물 인자 VIII은 하나 이상의 다른 동물로부터 출처된 상응하는 아미노산 서열 치환을 가지도록 제조할 수 있다. 다른 구체예에서, 인자 VIII 아미노산 서열에 공지된 동일체를 가지지 않는 아미노산 서열, 바람직하게는 알라닌 잔기들을 알라닌 스캐닝 돌연변이 기술을 사용하여 돼지 에피토프 서열을대신하여 치환시킴으로써 교차 반응성을 감소시킬 수 있다.
임상학적으로 중요한 에피토프들을 확인 후, 광범위한 저해체 혈장에 대하여 시험관에서 시험하였을 때 돼지 인자 VIII에 비하여 더 작거나 동일한 교차 반응성을 가지는 재조합 인자 VIII 분자체를 발현시킬 것이다. 바람직하게는 이러한 분자체들은 이러한 도메인에서의 면역 반응성 아미노산 서열이 다른 포유동물 서열로 교체된, 조합 A2/C2 하이브리드물이다. 이러한 부위에서 추가로 돌연변이화하여 교차반응성을 감소시킬 수 있다. 감소된 교차반응성이 비록 바람직하지만, 오염된 돼지 단백질 때문에 부작용을 나타내며, 돼지 인자 VIII 서열의 면역원성으로 인하여 곤란한 효과를 낼 수 있는 기존의 돼지 인자 VIII 농축 물에 비해서 장점이 많은 생성물을 제조하는 데는 필요치 않다. 하이브리드 인간/다른 포유동물 또는 돼지/따른 포유동물 인자 VIII 분자체는 이질의 돼지 단백질을 포함하지 않는다. 또한, 돼지 A2 도메인에서 수행된 광대한 에피토프 맵핑의 결과, 치료효율적인 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII의 95% 이상이 인간과 동일하다는 것이 밝혀졌다.
하이브리드 인자 VIII 등가물의 제조
상기 및 실시예에서 설명한 인자 VIII 분자에서의 아미노산 치환 방법을 사용하여 인간, 동물 또는 하이브리드 인자 VIII에서 항원성 및/또는 면역원성 부위를 포함하는 적어도 하나의 특이 아미노산 서열을 대신하여 치환한, 인자 VIII에 동일한 공지된 아미노산 서열을 가지지 않은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 아미노산 서열 ("비-인자 VIII 서열")을 포함하는 응혈촉진 재조합 하이브리드 인자 VIII 등가 분자체 또는 이의 단편을 제조할 수 있다. 결과된 활성 하이브리드 인자 VIII 등가 분자체는 비치환된 인간, 동물 또는 하이브리드 인자 VIII보다 인자 VIII 저해 항체와의 반응성이 같거나 더 적고 및/또는 인체 및 동물에서 면역원성이 더 적다.
인간 또는 동물 인자 VIII 또는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII에서 응혈 및/또는 항원 및/또는 면역원성 활성에 중요한 아미노산의 그러한 서열을 대체하여 하이브리드 등가 인자 VIII 분자체를 제조할 수 있는 적당한 아미노산 잔기는 응혈, 항원 또는 면역원성 활성을 가지는 동물 또는 인간 인자 VIII 아미노산 서열에 동일한 공지 서열을 가지지 않는 임의의 아미노산을 포함한다. 한 구체예에서, 치환될 수 있는 아미노산은 알라닌 잔기를 포함하며, 알라닌 스캐닝 돌연변이 기술을 사용한다.
설명된 하이브리드 인자 VIII 등가 분자체는 동물 인자 VIII 서열에 동일성이 없는 아미노산 잔기가 응혈, 항원 또는 면역 활성에 중요하지 않은 아미노산 잔기를 대신하여 치환한 그러한 분자들을 포함한다.
전술한 바와 같이, 하이브리드 인자 VIII 등가 분자체의 한 구체예에서, 상기 분자는 저해체 혈장과의 교차반응성이 감소되어 있다. 교차 반응성 인자 VIII에서 하나 이상의 에피토프가 상술한 바와 같이 확인된 후, 비-인자 VIII 아미노산 서열, 바람직하게는 알라닌 잔기에 의해, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 방법으로 치환된다.
바람직한 한 구체예에서, 에피토프를 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열을 대신하여, 및/또는 바람직하게는 인간 인자 VIII 내의 면역원성 부위를 포함하는 하나이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 서열을 대신하여 치환하고, 인자 VIII에 동일한 공지 서열을 가지지 않는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 알라닌을 포함하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 응혈촉진 재조합 하이브리드 인자 VIII 등가 분자체가 제조된다. 결과된 하이브리드 등가 인자 VIII 분자 또는 이의 단편은 인체 또는 동물에서 인자 VIII에 대한 저해 항체와의 면역반응성이 감소되었거나 또는 없고 및/또는 면역원성이 감소되거나 없다. 비항원성 돼지 특이 아미노산 서열에 의해 치환되는, 인간 인자 VIII의 A2 도메인에서의 특이 항원성 아미노산 서열을 확인하는 방법이 실시예 7 및 8에 설명되어 있고 인간 및 동물 인자 VIII의 A2 및 다른 도메인에서의 항원성 서열을 확인하고 알라닌 스캐닝 돌연변이법과 같은 부위-지정 돌연변이 방법을 k용하여 비-인자 VIII 아미노산 서열을 치환하는 것을 예시한다.
실시예 8에서 설명된 바와 같이, 인간 A2 에피토프가 25 또는 더 적은 아미노산으로 좁아졌기 때문에, 알라닌 스캐닝 돌연변이법을 인간 아미노산 서열을 가지는 제한된 수의 하이브리드 인자 VIII 제작물상에서 시행하여 어는 것이 A2 아미노산 치환체에 근거한, 응혈촉진, 비-면역반응성 및/또는 비면역원성 하이브리드 인자 VIII인가를 결정할 수 있다. A2 도메인에 있어서, 알라닌 치환으로 하이브리드 제작물의 항원성 및 면역원성 둘다를 가장 감소시킬 것 같은 후보들은 Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501 및 Ile508이다. 이러한 돌연변이 각각을 포함하는 하이브리드 제작물의 mAb413 및 A2 특이 환자 IgGs의 패널에 대한 친화 결합은 ELISA로써 결정될 것이다. 활성적이고 A2 저해체에 대한 친화성 결합이 2 차수의 크기로 감소된 임의의 변이체는 A2 치환 인자 VIII 분자에 대한 후보이다. 에피토프가 더 많이 변형될수록 덜 면역원성이 될 것이라는 가정에 근거하여 하나이상의 변이를 가지는 제작물을 선택할 것이다. Arg484-Ile508 사이의 부위에 다른 후보 잔기가 있을 가능성이 있는 데, 이는 인간 및 돼지 인자 VIII둘 다에 공통적인 에피토프에 대한 주요 잔기가 있을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 하전된 잔기들은 빈번하게 단백질-단백질 상호작용에 연루된다. 사실, Arg490 대체용 알라닌은 인간 인자 VIII의 저해체에 0.2% 반응성만을 가지는 응혈촉진된 인자 VIII을 생성한다 (표 VI). 유사하게, Lys493을 알라닌으로 대체하는 것도 가능성 있는 후보이다.
이러한 방법은 C2 에피토프 및 A3에 존재할 것이라고 추정되는 제 3 에피토프는 물론 인자 VIII에서의 확인된 임의의 다른 에피토프에서 수행하여 하이브리드 등가 인자 VIII 제작물을 제조한다.
진단 분석
하이브리드 인간/동물, 동물/동물 또는 등가 인자 VIII cDNA 및/또는 이들로부터 발현된 단백질, 전체 또는 부분을, 기질, 예를 들어, 인자 VIII 결핍 환자의 혈청 및 체액 샘플을 포함하는 기질 내에서, 인간 또는 동물 인자 VIII 또는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII 또는 등가물에 대한 저해 항체를 검출하는 분석용 진단시약으로 사용될 수 있다. 이러한 항체 분석법은 ELISA 분석, 면역블랏, 방사선면역분석 (radioimmunoassays), 면역확산 분석 및 인자 VIII 생물학적 활성 분석 (예를 들어, 응고 분석에 의해)과 같은 분석법을 포함한다. 이러한 시약을 제조하는 기술 및 이에 사용되는 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 환자 혈청 샘플에서의 저해 항체를 검출하기 위한 면역분석법은 시험 샘플을 적어도 하나의 항원부위를 가지는 충분한 양의 하이브리드 인간/동물 인자 VIII와 반응시키는 것을 포함하는 바, 그 양은 샘플에서 저해 항체와 검출할 수 있는 착체를 형성할 만큼 충분한 것이다.
핵산 및 아미노 산 탐침자는 하이브리드 인간/돼지, 인간/비-인간, 비-돼지 포유동물, 동물/동물, 또는 등가 인자 VIII cDNA 또는 단백질 분자 또는 이의 단편들의 서열에 근거하여 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 것들은 색소 또는 시판되는 효소성, 형광성, 화학발광성 또는 방사성 표지로 표지될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 탐침자를 사용하여 인간, 동물 또는 하이브리드 인간/동물 인자 VIII에 대한 저해체의 존재가 의심되는 혈청 또는 다른 체액을 거를 수 있다. 환자에서의 저해체 농도를 정량화하고 건강한 대조군과 비교하고, 인자 VIII 결핍증 환자가 하이브리드 인간/동물 또는 하이브리드 등가 인자 VIII로 치료할 수 있는 지를 결정하는 데 사용할 수 있다. cDNA 탐침자를, 예를 들어, DNA 라이브러리를 탐색하는 연구 목적으로 사용할 수 있다.
약학 조성물
하이브리드 인간/동물, 돼지/비-인간, 비-돼지 포유동물, 동물-1/동물-2 또는 등가 인자 VIII을 단독 또는 적절한 약학적 안정화 화합물, 전달자, 및/또는 운반자와 조합으로 포함하는 약학 조성물을 E. W. Martin의 Remington's Pharmaceutical Sciences에서 설명된 바와 같은 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 바람직한 정맥 주입용 운반자 또는 전달자는 생리적 염수 또는 인산염 완충 염수이다.
다른 바람직한 구체예에서, 적절한 안정화 화합물, 전달자 및 운반자는 알부민과 같은 인간 또는 동물 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
인지질 소포체 또는 리포좀 현탁액 또한 약학적 허용 담체 또는 운반자로서 바람직하다. 이러한 것들은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 예를 들어, 포스파티딜세린/-포스파티딜콜린 또는 표면에 음전하를 부여할 수 있는 인지질 또는 세척제의 다른 조성물을 포함하는 데, 이는 인자 VIII가 음전하로 하전된 인지질 막에 결합되기 때문이다. 적절한 지질(류) (스테이로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파디딜 콜린 및 콜레스테롤과 같은)을 무기 용매에 용해시키고 다음 무기 용매를 증발시켜 용기의 표면상에 건조된 지질 막을 뒤에 남김으로써 리포좀을 제조할 수 있다. 다음, 하이브리드 인자 VIII의 수용액을 용기내로 도입한다. 다음, 용기를 손으로 휘돌려서 용기 면으로부터 지질물질을 벗겨내고 지질 응집체를 분산시키고, 이럼으로써 리포좀 현탁액을 형성한다.
하이브리드 인자 또는 하이브리드 등가 인자 VIII는 비타민 K 의존성 응고인자, 조직 인자, 및 인자 VIII 결합 부위를 포함하는 폰 빌레브란트 인자 (vWf)나 vWf의 단편을 포함하는, 다른 적절한 안정화 화합물, 운반자, 및/또는 전달자 그리고 수크로즈와 같은 다당류와 조합될 수 있다.
역전사바이러스 벡터와 같은 운반 수단을 사용하여, 인간 인자 VIII가 전달될 수 있는 방법으로 유전자 치료에 의해 하이브리드나 하이브리드 등가 인자 VIII를 전달할 수 있다. 이러한 방법은 인자 VIII cDNA를 인간 세포로 병합시키고 이를 인자 VIII 결핍 환자에게 직접 이식하거나 또는 인자 VIII 분자에 투과성이지만 세포에는 불투과성인, 이식성 장치에 둔 다음에 이식한다. 바람직한 방법은 역전사 바이러스-매개 유전자 전달법이다. 이러한 방법에서, 외인성 유전자 (예를 들어, 인자 VIII cDNA)를 변형된 역전사 바이러스의 게놈으로 클론한다. 바이러스성 기구를 통해, 유전자를 발현될 숙주 세포의 게놈에 삽입시킨다. 역전사바이러스 벡터를 바이러스가 생성되지 않게 변형하여 숙주세포의 바이러스 감염을 예방한다. 이러한 형태의 치료에 대한 일반적인 원칙은 당해 분야의 숙련자에게는 공지되어 있고 문헌에 나타나 있다[예를 들어, Kohn, D.B 등 (1989) Transufusion 29:812-820].
하이브리드 인자 VIII를 vWf에 결합시킨 상태로 보관하여 하이브리드 분자체의 반감기 및 수명을 증가시킬 수 있다. 또한, 인자 VIII를 냉동건조하여 vWf 존재하에서 활성 물질의 수율을 높일 수 있다. 제품 공급자에 의해 사용되는 인간 및 동물 인자 VIII 저장 방법을 하이브리드 인자 VIII의 저장에 사용할 수 있다. 이러한 방법은: (1) 부분적으로 정제된 상태에서 인자 VIII의 냉동건조 (더 이상의 정제 없이 부어넣은 인자 VIII "농축물"로서); (2) 인자 VIII을 안정화시키는 알부민의 `존재하에서 짐머만 (Zimmerman) 방법 및 냉동건조에 의한 인자 VIII의 면역친화-정제; (3) 알부민의 존재하에서 재조합의 냉동건조를 포함한다.
또한, 하이브리드 인자 VIII는 4 ℃의 0.6M NaCl, 20 mM MES 및 5 mM CaCl2pH 6.0 내에서 무기한으로 안정하며 이러한 완충액에서 얼려진 상태로 보관하고 해동하여 최소 활성 손실만을 나타내게 할 수 있다.
치료 방법
하이브리드 또는 2 등가 인자 VIII를 사용하여 저해 항체를 가지거나 가지지 않는 혈우병 환자에서의 및 저해 항체의 발생으로 인자 VIII 결핍을 획득한 환자에서의 인자 VIII 결핍으로 인한 조절되지 않는 출혈 (예를 들어, 관절내, 두개골내, 또는 위장내 출혈)을 치료한다. 상기 활성물질을 바람직하게는 정맥내로 투여한다.
더욱이, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII는 하이브리드를 생성하도록 유전공학적으로 조작된 세포의 이식체에 의해 또는 상술한 바와 같이, 그러한 세포를 포함하는 장치의 이식에 의해 투여될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 단독 또는 안정화제, 전달자 및/또는 운반자와 조합한 약학 조성물을 인간 또는 동물 인자 VIII의 주입에 사용된 것과 동일한 방법에 따라서 정맥내로 환자에 주입한다.
그러한 치료가 필요할 때 환자에 투여하여야만 되는, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 조성물의 치료량은 인자 VIII 결핍 정도에 따라 변한다. 일반적으로 투여량 수준은 각 환자의 출혈의 정도 및 기간에 맞추어 빈도, 지속기간 및 유니트로 조절된다. 따라서, 표준 응고 분석법으로 측정할 때 출혈을 멈추게하는 치료적으로 유효한 양으로 환자에게 하이브리드를 전달하기에 충분한 양으로 인자 VIII를 약학적으로 허용가능한 담체, 전달자 또는 안정화제에 포함시킨다.
인자 VIII는 일반적으로 혈우병 A를 가진 개인으로부터 얻어진 혈장에서 응고 결함을 보정하는 정상 혈장에 존재하는 물질로서 정의된다. 인자 VIII의 정제된 및 부분 정제된 형태의 시험관내 응혈활성은 인간 환자로 주입하는 인자 VIII의 투여량을 계산하는 데 사용되며 환자 혈장으로부터 회복된 활성의 신뢰성있는 지표이며 생체내 출혈 결함의 보정에 대한 신뢰성있는 지표이다. Lusher, J.M 등 328 New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman, D.D. 등 (1992) Blood 79:389-397; 및 Brinkhous 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755에 따르면, 신규의 인자 VIII의 시험관 표준 분석과 개 주입 모델 또는 인간 환자에서의 양태간의 불일치가 발표된 것은 없다.
통상, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII의 투여를 통해 환자에게 달성하려는 소망의 혈장 인자 VIII 농도는 정상치의 30-100% 범위이다. 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII의 바람직한 투여 방식에 있어서, 상기 조성물은 약 5 내지 50 유니트/kg 체중 범위의 투여량, 더욱 바람직하게는 10-50 유니트/kg 체중 범위의 투여량, 및 가장 바람직하게는 20-40 유니트/kg 체중의 투여량으로 정맥내 투여된다; 투여 주기는 약 8 내지 24 시간 범위이다 (심하게 앓고 있는 혈우병 환자에서); 및 치료기간 날수는 1 내지 10일 또는 출혈사건이 해결될 때까지이다. 참조, 예를 들어, Roberts, H.R., 및 M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V and Factors VII to XII)", ch. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Willians, W. J. 등 편집 (1990). 인간 인자 VIII보다 더 높은 비 활성 또는 감소된 항체 반응성 또는 면역원성 때문에, 저해체를 가진 환자는 더 많은 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 요하거나 환자는 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 덜 요할 수 있다. 인간 또는 돼지 인자 VIII로 치료한 것에서와 같이, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII의 주입량은 일단계 인자 VIII 응혈 분석에 의해 결정되고 및 특정의 경우, 주입후 환자의 혈장에서 인자 VIII를 측정함으로써 생체 내 회복을 정한다. 임의의 특정 문제에서, 특이 투여 요법은 개인의 필요 및 상기 조성물의 투여를 집행하거나 관장하는 사람의 전문가적인 판단에 따라서, 시간에 걸쳐 조절되어야 하며 여기서 설정된 농도범위는 오로지 예증적인 것이고 청구된 조성물의 범위 또는 실행을 제한할 의도가 아님이 이해될 것이다.
치료는 조성물을 단일 정맥 투여의 형태 또는 바람직하게는, 일정 기간에 걸쳐 주기적 또는 연속적 투여형태를 취한다. 선택저그로 하이브리드 또는 등가 하이브리드 인자 VIII를 다양한 주기로 하나 또는 수 개의 복용 단위로 리포좀을 사용하여 피하 또는 경구적으로 투여할 수 있다.
하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII를 사용하여 인간 인자 VIII에 항체를 발생시키는 혈우병환자에서의 인자 VIII 결핍으로 인한 조절되지 않는 출혈을 치료할 수 있다. 이 경우, 인간 또는 동물 인자 VIII 단독의 것보다 우수한 응혈활성은 필요치 않다. 인간 인자 VIII의 것보다 열악한 응혈활성 (예를 들어, 3000 units/mg 미만)이, 환자의 혈장에서 항체에 의해 그 활성이 중화되지 않는다면, 유용하다.
하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 VIII 분자 및 이를 분리, 특성화, 제조 및 이용하는 방법들은 일반적으로 상기에서 설명되었고 하기 비제한적 실시예를 참조하면 더욱 이해가 될 것이다.
실시예 1: 돼지 인자 VIII 및 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII의 분석
돼지 인자 VIII는, 비(specific) 활성에 근거할 때, 인간 인자 VIII보다 더 큰 응혈활성을 가진다. 이러한 결과들이 실시예 3의 표 III에 나타나 있다. 이러한 결론은 인간 돼지 인자 VIII가 잘 비교되는 적절한 표준 커브의 사용에 근거한다. 응혈분석은 인자 VIII가 혈우병 A 환자의 혈장의 응고시간을 단축하는 능력에 근거한다. 두 가지 유형의 분석법을 사용하였다: 일 단계 및 이 단계 분석법...
일단계 분석법에서, 0.1 ml 혈우병 A 혈장 (George King Biomedical Inc.)을 0.1 ml 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시약 (APTT) (Organon Teknika) 및 희석되고, 구연산 처리된 정상 인간 혈장으로 구성되는 0.01 ml 샘플 또는 표준물과 함께 물중탕에서 37 ℃에서 5 분간 항온처리하였다. 다음, 0.1 ml 20 mM CaCl2를 첨가하였고 피브린 응혈물 발생 시간은 시각적으로 검사하여 결정하였다.
인자 VIII의 일 유니트는 구연산 처리된 정상 인간 혈장 1 ml에 존재하는 양으로서 결정된다. 표준물로서 인간 혈장과, 돼지 및 인간 인자 VIII 활성을 직접 비교하였다. 혈장 표준물 또는 정제된 단백질을 0.15 M NaCl, 0.02 M HEPES, pH 7.4에서 희석하였다. 가장 높은 희석을 1/50으로 하면서 3 또는 4 번의 혈장 희석에 근거하고 및 log10응고 시간을 log10혈장 농도에 대하여 그리는 것에 근거하여 표준 곡선을 만들었다. 이는 직선이었다. 미지의 샘플에서의 인자 VIII 유니트는 상기 표준 곡선으로부터 내삽법으로 결정하였다.
일단계 분석법은 혈우병 A 혈장에 형성된 활성인자에 의한 인자 VIII의 내인성 활성화에 근거하는 반면, 이단계 분석법은 예비활성화된 인자 VIII의 응혈촉진 활성을 측정한다. 이단계 분석에서, 트롬빈과 반응한 인자 VIII 함유 샘플을 37℃에서 5 분간 예비 항온처리한, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 및 인간 혈우병 A 혈장의 혼합물에 첨가하였다. 상술한 인간 표준 곡선에 근거하여, 결과된 응혈시간을 units/ml로 전환하였다. 이단계 분석에서 상대적인 활성은 인자 VIII가 예비활성화되었기 때문에 일단계 분석에서보다 더 높았다.
실시예 2: 인간 및 돼지 인자 VIII간의 기능적 차이의 특성화
돼지 및 인간 혈장-유래 인자 VIII 및 인간 재조합 인자 VIII의 분리는 Fulcher C.A. 등 (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole 등 (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. 등 (1984)Nature 312:326-330 (Genentech); Wood 등 (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. 등 (1984) Nature 312:337-342 (Genentech); Fass 등 (1982) Blood 59:594; Toole 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942에 설명되어 있다. 이것은 몇 가지 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 제조물 모두는, 인간 및 돼지 인자 VIII 사이에 안정성에서 기능적 차이가 있긴 하지만, 서브유니트 조성에 있어서 유사하다.
인간 재조합 및 돼지 인자 VIII를 비교하기 위해서, 고도로 정제된 인간 재조합 인자 VIII (Cutter Laboratories, 캘리포니아주 버클리 소재) 및 돼지 인자 VIII[Fass 등 91982) Blood 59:594에서 설명된 바와 같이 면역정제된]의 제제들을 Mono QTM(Pharmacia-LKB, 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 음이온-교환 컬럼 (Pharmacia Inc.) 상에서 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 처리하였다. Mono QTMHPLC 단계의 목적은 인간 및 돼지 인자 VIII를 비교 목적상 공통 완충액으로 교환한 것에서 부차적인 불순물을 제거하는 것이다. 인자 VIII의 1000-2000 유니트를 포함하는 시험 용기에 5 ml H2O를 첨가하였다. Hepes (2 M pH 7.4)를 최종 농도 0.02 M로 첨가하였다. 인자 VIII를 0.15 M NaCl, 0.02 M Hepes, 5 mM CaCl2pH 7.4 (완충액 A에 0.15 M NaCl 첨가)로 평형화된 Mono QTMHR 5/5 컬럼에 적용하고; 10 ml 완충액 A 융합 0.15 M NaCl로 세척하고, 0.15 M에서 0.90 M NaCl의 선형구배를 가지는 20 ml 완충액 A를 1 ml/분의 유동속도로 용출시켰다.
인간 혈장-유래 인자 VIII (Mono QTMHPLC로 정제된) 및 돼지 인자 VIII을 비교하기 위해, 면역친화-정제된, 혈장-유래 돼지 인자 VIII를 0.04 M Hepes, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80 pH 7.4로 1:4 희석시키고 인간 인자 VIII에 대하여 전술 문단에서 설명된 동일 조건하에서 Mono QTMHPLC로 처리하였다. 인간 및 돼지 인자 VIII의 분리를 위한 이러한 방법들은 당해 분야의 기술자들에게는 기본적인 것이다.
컬럼 분획물을, 일단계 응혈분석에 의해, 인자 VIII 활성에 대하여 분석하였다. 물질의 A280당 활성의 유니트로 표현되는, 분석의 평균 결과는 표 II에 나타나 있고, 돼지 인자 VIII는 일단계 분석법을 사용할 때, 인간 인자 VIII보다 적어도 여섯배 더 큰 활성을 가진다는 것을 보여주고 있다.
인간 및 돼지 인자 VIII 응혈활성 비교
활성 (U/A280)
돼지 21,000
인간 혈장-유래 3,600
인간 재조합 2,400
실시예 3: 인간 및 돼지 인자 VIII의 안정성 비교
인자 VIII에 대한 일단계 분석의 결과는 샘플에서 인자 VIII가 인자 VIIIa로 활성화 된 것 및 형성된 인자 VIIIa 활성의 손실 가능성을 반영한다. 인간 및 돼지 인자 VIII의 안정성을 직접 비교하였다. Mono QTMHPLC (Pharmacia, Inc., 뉴저지피스카타웨이 소재)로부터의 샘플을 동일 농도 및 완충액 조성으로 희석시키고 트롬빈과 반응하였다. 다양한 시간대에서, 샘플을 회수하여 이단계 응혈 분석하였다. 일반적으로, 절정의 활성(2 분경)은 돼지가 인간 인자 VIIIa보다 10배 더 크고 돼지 및 인간 인자 VIII 둘다 이후로 활성이 감소하는 데 인간 인자 VIIIa 활성이 더 빨리 감소하였다.
일반적으로, 안정한 인간 인자 VIIIa를 분리하는 시도는 안정한 돼지 인자 VIIIa를 생성하는 조건을 사용할 때조차도 성공적이지 않다. 이를 증명하기 위해, Mono QTMHPLC-정제 인간 인자 VIII을 트롬빈으로 활성화시키고, Lollar 등 (1989) Biochemistry 28:666에서 설명된 바와 같이, 안정한 돼지 인자 VIIIa를 생성하는 조건하에서 Mono STM양이온-교환 (Pharmacia, Inc.) HPLC 처리하였다.
인간 인자 VIII 43 μg/ml (0.2 μM)을 함유한 총 10 ml의 0.2 M NaCl, 0.01 M Hepes, 2.5 mM CaCl2pH 7.4 완충액을 트롬빈 (0.036 μM)과 10분간 반응시키고, 이 때, FPR-CH2Cl D-페닐-프롤릴-아르기닐-클로로메틸 케톤을 0.2 μM의 농도로 첨가하여 트롬빈을 불가역적으로 불활성시켰다. 다음, 혼합물을 40 mM 2-(N-모르폴리노)에탄 설폰 산 (MES0, 5 mM CaCl2pH 6.0과 1:1 희석시키고, 5 mM MES, 5 mM CaCl2pH 6.0 (완충액 B)에 0.1 M NaCl을 더한 것으로 평형화된 Mono STMHR 5/5 HPLC 컬럼 (Pharmacia, Inc.) 상에 2 ml/min으로 적재하였다. 인자 VIIIa를 컬럼세척 없이 0.1 M NaCl에서 0.9 M NaCl까지 구배의 완충액 B 20 ml로 1 ml/min으로 용출하였다.
상기 이단계 분석에서 응혈활성을 가진 분획물을 이러한 조건하에서 단일 피크로 용출하였다. 상기 피크 분획물의 비 활성은 약 7,500 U/A280이었다. Mono STM인자 VIII 피크의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)를 실시한 후에 단백질을 실버 염색하여 인자 VIII의 이형이량체적 (A3-C1-C2/A1) 유도체에 상응하는 두 개 밴드를 나타내었다. 비록 A2 단편이 낮은 농도 때문에 이러한 조건하에서 실버 염색으로 확인되지 않지만,125I-표지에 의하여 미량의 구성체로서 확인되었다.
인간 인자 VIII을 사용한 결과와는 달리, 동일한 조건하에서 Mono STMHPLC에 의해 분리된 돼지 인자 VIIIa는 1.6x106U/A280의 비 활성을 가졌다. SDS-PAGE에 의한 돼지 인자 VIIIa의 분석에 의하면, A1, A2 및 A3-C1-C2 서브유니트에 상응하는 3 단편들이 나타났고, 이는 돼지 인자 VIIIa가 세 개 서브유니트를 보유한다는 것을 알려주는 것이다.
인간 트롬빈-활성화 인자 VIII 제제의 pH 6에서의 Mono STM결과는 안정한 돼지 인자 VIIIa를 산출하는 조건하에서 인간 인자 VIIIa가 취약하다는 것을 나타낸다. 그러나, 미량의 A2 단편이 상기 피크 분획물에서 확인되었지만, 응혈활성이 소량의 이형삼량체적 인자 VIIIa 또는 낮은 비 활성을 가지는 이형이량체적 인자VIIIa로부터 유래하는 것인지를 결정하는 것은 이러한 방법 단독으로는 가능하지 않다.
인간 인자 VIIIa가 A2 서브유니트를 손실하기 전에 그것을 분리하는 것이 이러한 문제를 해결하는 데 바람직하다. 이를 위해, 분리를 Mono STM완충액의 pH를 pH 5로 저하하는 것을 포함하는 방법으로 수행하였다. Mono QTM-정제 인간 인자 VIII (0.5 mg)을 H2O로 희석하여 0.25 M NaCl, 0.01 M Hepes, 2.5 mM CaCl2, 0.005% Tween-80 pH 7.4 (총 부피 7.0 ml)에 함유된 최종조성 인자 VIII 0.25 mg/ml (1 μm)을 나타낸다. 트롬빈을 최종 농도 0.072 μm로 첨가하고 3 분간 반응시켰다. 다음, 트롬빈을 FPR-CH2Cl (0.2 μm)로 불활성화시켰다. 다음, 이 혼합물을 40 mM 소듐 아세테이트, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 5.0과 1:1 희석시키고 0.01 M 소듐 아세테이트, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80 pH 8.0에 0.1 M NaCl를 더한 것으로 평형화된 Mono STMHR 5/5 HPLC 컬럼상에 2 ml/min 속도로 적재하였다. 인자 VIIIa를 컬럼세척 없이 0.1M NaCl에서 1.0 NaCl까지의 구배를 가지는 동일 완충액 20 ml로 1 ml/min의 속도로 용출시켰다. 이것은 SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 나타나는 바와 같이, 검출할 수 있는 양의 A2 단편을 함유한 피크로 응혈활성이 나타난다는 것을 발견하게 한다. 상기 피크 분획물의 비 활성은 pH 6.0에서 회복한 것보다 10배 더 크다 (75,000 U/A280, 7,500 U/A280). 그러나, pH 6.0에서 분리된, 4 ℃에서 무한정으로 안정한, 돼지 인자 VIIIa와는 다르게, 인간 인자 VIIIa 활성은 Mono STM으로부터의 용출이후 수시간에 걸쳐 꾸준히 감소하였다. 또한, pH 5.0에서 정제되고 즉시 분석된 인자 VIIIa의 비 활성은 돼지 인자 VIIIa의 5%로서, 분석 전에 상당한 분리가 일어났다는 것을 의미한다.
이러한 결과들은 두 인간 및 돼지 인자 VIII가 세 개의 서브유니트 (A1, A2 및 A3-C1-C2)들로 구성되어 있다는 것을 보여준다. A2 서브유니트의 분리는 생리적 이온 강도, pH 및 농도와 같은 특정 조건하에서 두 인간 및 돼지 인자 VIIIa의 활성 손실에 책임이 있다. 특정 조건하에서 돼지 인자 VIIIa의 상대적인 안정성은 A2 서브유니트의 더 강한 결합에 기인한다.
실시예 4: 서브유니트들의 재구성에 의한 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII의 제조
돼지 인자 VIII 경질 사슬 및 인자 VIII 중질사슬을 하기와 같이 분리하였다. pH 7.4, 0.5 M EDTA 용액을 Mono-QTM-정제 돼지 인자 VIII에 최종농도 0.05 M이 되게 첨가하였고 실온에서 18-24 시간 방치하였다. 10 mM 히스티딘-Cl, 10 mM EDTA, 0.2% v/v Tween 80으로 구성된, pH 6.0의 완충액 (완충액 B)를 동량 부피 첨가하고 결과된 용액을 완충액 A에 0.25 M NaCl을 더한 것으로 미리 평형화시킨 Mono-STMHR 5/5 컬럼에 1 ml/min을 적용하였다. SDS-PAGE로 측정결과, 인자 VIII 중질 사슬들은 상기 수지에 결합하지 않았다. 인자 VIII 경질 사슬을 0.1-0.7 M NaCl 선형 구배를 가진 20 ml 완충액 A로 1 ml/min의 속도로 용출하고 SDS-PAGE에의해 동질화되었다. 인자 VIII 중질 사슬을 하기와 같이 Mono-QTM(Pharmacia, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 분리하였다. 인자 VIII 경질사슬은 인자 VIII 경질사슬을 정제하는 동안 Mono-STM에 흡수되지 않는다. 인자 VIII 중질 사슬을 함유하는 실패한 재료들은 pH 7.4 0.5 M Hepes 완충액을 첨가하여 pH 7.2로 조정하고, 이를 0.1 M NaCl, 0.02 M Hepes, 0.01 % Tween-80 pH 7.4로 평형화시킨 Mono-QTMHR 5/5 HPLC 컬럼 (Pharmacia Inc)에 적용하였다. 이 컬럼을 동일 완충액 10 ml로 세척하고 인자 VIII 중질 사슬을 0.1-1.0 M NaCl 구배를 가지는 동일 완충액 20 ml로 용출하였다. 인간 경질사슬 및 중질사슬을 동일한 방식으로 분리하였다.
인간 및 돼지 경질 및 중질 사슬을 하기 단계에 따라서 재구성하였다. 100 μg/ml 농도인 인간 또는 돼지 인자 VIII 경질사슬 포함하는 1 M NaCl, 0.02 M Hepes, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 7.4 10 μl를: (1) 이종의 중질사슬을 60 μg/ml로 함유하는 동일 완충액 25 μl; (2) 0.02 M hepes, 0.01% Tween-80, pH 7.4 10 μl; (3) 0.6 M CaCl25 μl와 14시간 실온에서 혼합하였다. 혼합물을 0.02 M MES, 0.01% Tween-80, 5 mM CaCl2, pH 6를 사용하여 1/4로 희석하고 0.1 M NaCl, 0.02 M MES, 0.01% Tween-80, 5 mM CaCl2, pH 6.0에서 평형화된 Mono-STMHr5/5로 적용하였다. 동일 완충액에서 0.1-1.0 M NaCl의 농도 구배액 20 ml을 1 ml/min 속도로 전개하고 0.5 ml 분획물들을 수집하였다. 280 nm에서 분획물의 흡광도를 판독하고, 분획물들을 흡광도로써 인자 VIII 활성에 대하여 일단계 응고 분석법으로 분석하였다. 중질 사슬은 과다하게 존재하였는 데 이는 유리 경질사슬 (중질사슬과 결합되어 있지 않은)이 또한 Mono-STM과 결합되어 있기 때문이다; 잉여 중질사슬은 유리 경질 사슬이 제조물의 부분이 아니라는 것을 확인하는 것이다. Mono-STMHPLC 정제 후에 재구성 실험을 사슬의 네 가지 가능한 조합으로 수행하였다: 인간 경질사슬/인간 중질사슬, 인간 경질사슬/돼지 중질사슬, 돼지 경질사슬/돼지 경질사슬, 돼지 경질사슬/인간 중질 사슬. 표 III은 인간 경질사슬/돼지 중질사슬 인자 VIII가 자연적인 돼지 인자 VIII(표 II)와 비견할만한 활성을 가지는 것으로 나타내고 있고, 이는 돼지 중질사슬에서의 구조적 요소가 인간 인자 VIII에 비하여 돼지 인자 VIII의 증가된 응혈활성에 관여한다는 것을 의미한다.
하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 응혈활성과 인간 및 돼지 인자 VIII와의 비교
활성 (U/A280)
돼지 경질사슬/ 돼지 중질사슬 30,600
인간 경질사슬/돼지 중질사슬 44,100
돼지 경질사슬/인간 중질사슬 1,100
인간 경질사슬/인간 중질사슬 1,000
실시예 5: 도메인 재구성에 의한 활성 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 제조
돼지 또는 인간 혈액으로부터, 돼지 A1/A3-C1-C2 이량체, 돼지 A2 도메인, 인간 A1/A3-C1-C2 이량체, 및 인간 A2 도메인을 Lollar 등 (1992) J. Biol. Chem.267(33):23652-23657에 설명된 방법에 따라서 각각 분리하였다. 예를 들어, 돼지 A1/A3-C1-C2 이량체를 분리하기 위해, pH 6.0의 돼지 인자 VIIIa (140 μg)에 5 N NaOH를 첨가하여 30 분간 pH 8.0으로 올려 A2 도메인을 분리하고 응고 분석으로 측정될 때 95% 불활성화시켰다. 완충액 B (20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 7.4)를 사용하여 이 혼합물을 1:8로 희석시키고 완충액 B에서 평형화된 MonoS 컬럼에 적용하였다. 0.1-1.0 M NaCl 구배를 가지는 완충액 B를 사용하여 약 0.4 M NaCl에서 예리한 단일 피크로서 A1/A3-C1-C2 이량체를 용출하였다. 돼지 A2 도메인을 분리하기 위해서, Lollar 등 (1989) Biochem 28:666-674의 방법에 따라서, 돼지 인자 VIIIa를 인자 VIII 0.64 mg으로 시작하여 만들었다. 유리된 돼지 A2 도메인을 Mono-STM크로마토그래피로 0.3 M NaCl에서 부차 성분 (50 μg)으로서 분리하였다.
하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 분자를 하기와 같이 이량체 및 도메인으로부터 재구성하였다. 정제된 성분에 대한 농도 및 완충액 조건은 다음과 같다:돼지 A2, 0.63 μM, 완충액 A (5 mM MES; 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 6.0)에 0.3 M NaCl 첨가한 것;돼지 A1/A3-C1-C2, 0.27 μM, 완충액 B에 0.4 M NaCl 첨가한 것, pH 7.4;인간 A2, 1 μM, 0.3 M NaCl, 10 mM 히스티딘-HCl, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-20, pH 6.0;인간 A1/A3-C1-C3, 0.18 μM, 0.5 M NaCl, 10 mM 히스티딘-C1, 2.5 mM CaCl2, 0.1% Tween-20, pH 6.0. 동량의 A2 도메인 및 A1/A3-C1-C2 이량체를 혼합함으로써 재구성 실험을 실시하였다. 인간 A1/A3-C1-C2 이량체를 사용한 혼합실험에서, 0.5 M MES, pH 6.0을 70 mM까지 첨가하여 pH를 6.0으로 낮췄다.
네 가지 모든 가능한 하이브리드 인자 VIIIa 분자체-[pA2/(hA1/A3-C1-C2)], [hA2/(pA1/A3-C1-C2)], [pA2/(pA1/pA3-C1-C2)] 및 [hA2/(hA1/A3-C1-C2)]-을 다양한 시간대에서 이단계 응고 분석으로 얻었다.
A2 도메인들과 A1/A3-C1-C2 이량체를 혼합한 후 활성 한 시간 안에 거의 완전하게 발생하였고 37℃에서 적어도 24 시간동안 안정하였다. 표 IV는 1 시간 내에서 분석한, 재구성된 하이브리드 인자 VIIIa 분자의 활성을 나타낸다. 인자 VIIIa 분자의 비 활성이 얻어지는 이단계 분석은 일단계 분석과 다르며, 그 값은 일단계 분석에서 얻어진 인자 VIII 분자체의 활성값과 비교할 수 없다.
도메인-치환된 하이브리드 인간/돼지 인자 VIIIa의 응혈활성 비교
하이브리드 fVIIIa 비 활성 (U/mg)
돼지 A2 융합 인간 A1/A3-C1-C2 140,000
돼지 A2 융합 돼지 A1/A3-C1-C2 70,000
인간 A2 융합 돼지 A1/A3-C1-C2 40,000
인간 A2융합 인간 A1/A3-C1-C2 40,000
표 IV에서 보는 바와 같이, 최대 활성은 돼지 A2 도메인/인간 A1/A3-C1-C2 이량체에 의해 나타나고, 그 다음 돼지 A2 도메인/돼지 A1/A3-C1-C2 이량체이다.
따라서, 돼지 인자 VIIIa의 A2 도메인을 인간 인자 VIIIa의 A1/A3-C1-C2 이량체와 혼합했을 때, 응혈활성이 얻어졌다. 더욱이, 인간 인자 VIIIa의 A2 도메인을 돼지 인자 VIIIa의 A1/A3-C1-C2 이량체와 혼합하였을 때, 응혈활성이 얻어졌다. A2, A1 및 A3-C1-C2 부위 스스로는 응혈활성을 가지지 않는다.
실시예 6: 돼지 인자 VIII의 A2 도메인의 분리 및 시퀀싱
B 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 돼지 인자 VIII의 A2 도메인 일부만이 서열화되어 있었다 [Toole 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942]. 전체 돼지 인자 VIII A2 도메인에 대한 cDNA 및 예상 아미노산 서열 (각각, SEQ ID NOs: 3 및 4)이 본 발명에서 개시된다.
돼지 비장 전체 RNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 돼지 인자 VIII A2 도메인을 클론하였다: 공지된 인간 인자 VIII cDNA 서열에 기초한 축퇴된 프라이머 및 돼지 인자 VIII 서열 일부에 기초한 정확한 돼지 프라이머를 사용하였다. 1 kb PCR 산물을 분리하고 BluescriptTM(Stratagene) 파지미드 벡터로 삽입하여 증폭하였다.
돼지 A2 도메인을 디데옥시 시퀀싱으로 완전히 서열화하였다. cDNA 및 예상 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 3 및 4로 각각 기재하였다.
실시예 7: 재조합 하이브리드 인간/동물 인자 VIII의 제조
인간 인자 VIII의 뉴클레오타이드 및 예상 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NOs: 1 및 2)이 문헌 [Toole 등 (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier 등 (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood 등 (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar 등 (1984) Nature 312:337-342 (Genentech)]상에설명되어 있다.
재조합 하이브리드 인간/동물 인자 VIII를 만드는 것은 인간 인자 VIII cDNA (Biogen Corp.)의 일부분이 제거되어야 하며 서열 동등체를 가지는 동물 cDNA 서열이 삽입되어야 한다는 것을 요한다. 다음, 하이브리드 cDNA를 적절한 발현 시스템에서 발현한다. 예를 들어, 돼지 A2 도메인이 상응하는 A2 서열 대신하고 있는 하이브리드 인자 VIII cDNA들을 클론하였다. 먼저, 인간 인자 VIII의 A2 도메인에 상응하는 전체 cDNA 서열을 다음에는 A2 도메인의 더 작은 부분을 당해 분야에공지된 기술인, 올리고뉴클레오타이드-매개 돌연변이법 (참조, 예를 들어, Sambrook, J., E.F. Fritsch 및 T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Chapter 125, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989)으로 환상 제거한다. 각 단계는 하기와 같다.
재료
메톡시카르보닐-D-시클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐라이드 (SpectrozymeTNXa) 및 항-인자 VIII 단일클론 항체들 ESH4 및 ESH8을 American Diagnostica (코넷티컷주 그린위치 소재)로부터 구입하였다. 단일막 포스파티딜콜린/포스파티딜세린 (75/25, w/w) 소포체를 Barenholtz, Y. 등 16 Biochemistry 2806-2810 (1997)에 따라서 제조하였다. 재조합 데설파토히루딘을 Ciba-Geigy Pharmaceuticals (캘리포니아주 세리토스 소재)의 R. B. Wallis 박사로부터 얻었다. 돼지 인자들 IXa, X, Xa 및 트롬빈을 Lollar 등 (1984) Blood 63:1303-1306 및Duffy, E.J. 등 (1992) J. Biol Chem. 207:7621-7827의 방법에 따라서 분리하였다. 무알부민 순수 재조합 인간 인자 VIII를 Baxter-Biotech (일리노이주 디어필드 소재)로부터 얻었다.
돼지 인자 VIII A2 도메인의 클로닝
Chomczyneki 등 (1987) Anal. Biochem. 162:156-159에서 설명한 바와 같이 분리한 역전사된 인간 비장 mRNA를 PCR함으로써 돼지 A2 도메인을 암호화하는 cDNA를 얻었다. 프라이머로서 랜덤 헥사머를 사용하여 제 1-사슬 cDNA 합성 키트 (Pharmacia, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로써 cDNA를 제조하였다. 공지된 한정된 돼지 A2 아미노산 서열에 기초한, 5'-말단 축퇴 프라이머 5' AARCAYCCNAARACNTGGG 3' (SEQ ID NO:11), 및 돼지 A2 도메인의 3' 직후의 공지된 돼지 DNA 서열에 기초한, 3'-말단 확정 프라이머, 5' GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (SEQ ID NO:12)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이러한 올리고뉴클레오타이드들은 인간 서열 (SEQ ID NO:1)에서 뉴클레오타이드 1186-1203 및 2289-2313에 해당한다. Taq DNA 중합효소 (Promega Corp., 윌밍톤주 매디슨 소재)를 사용하여 35 사이클 (1 분 94℃, 2 분 50℃, 2분 50℃)로 증폭하였다. 1.1-킬로베이스 크기의 증폭된 단편을, Murchuck, D 등 (1991) Nucl. Acids Res. 19:1154에서 설명된 바와 같이, T-벡터 방법을 사용하여 EcoRV 위치에 pBluescript II KS-(Stratagene)으로 삽입하였다. 이체리키아 콜라이 XL1-Blue-감응(Escherichia coli XL1-Blue-competent) 세포들을 형질잔환시키고 플라즈미드 DNA를 분리하였다. SequenaseTMversion 2.0 (U.S. Biochemical Corp., Amersham LifeScience Inc.의 사업부, 일리노이주 알링톤 에이치티에스. 소재)를 사용하여 시퀀싱을 양방향으로 실시하였다. 이러한 서열은 동일한 돼지로부터 얻은 비장 RNA (CircumVentTMNew England Biolabs, 매사츄세스 비벌리 소재)의 독립적인 역전사 PCR 산물을 직접 시퀀싱함으로써 얻어진 동일한 서열로 확인하였다. 자기항체 RC에 대한 에피토프를 포함하는 부위는 인간 인자 VIII (SEQ ID NO:2)에서 373-536으로서 확인되었다.
하이브리드 인간/돼지 인자 VIII cDNA의 제작 및 발현
아미노산 잔기 741-1648 (SEQ ID NO:2)를 암호화하는 서열이 없는, B-도메인 결여 인간 인자 VIII (HB-, 매사추세스 캠브리지 소재 Biogen Inc.로부터 구입)을 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII를 제작하는 출발물질로 사용하였다. HB-를 발현벡터 ReNeo로 클론하였다. 조작을 용이하게 하기 위해, 인자 VIII용 cDNA를 ReNeo로부터 XhoI/HpaI 단편으로서 분리하고 Xho1/EcoRV 절단 pBlueScript II KS로 클로닝하였다. Kunkel, T. A. 등 (1991) Meth. Enzymol 204:125-139에서 설명된 바와 같이, 우라실-함유 파지 DNA를 사용하는 부위-지정 돌연변이 반응에 올리고뉴클레오타이드, 5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3' (SEQ ID NO:7)를 사용하여 인간 A2 서열 (SEQ ID NO:1에서의 뉴클레오타이드 1169-2304)을 루프-아웃시키고 동시에 SnaBI 제한효소를 도입한다. A2-도메인결여 인간 인자 VIII 함유 플라즈미드를 SnaBI으로 절단한 후, ClaI 링커를 첨가하였다. 다음, 돼지 A2 도메인을 인산화된 5' 프라이머 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEQ ID NO:8) 및 3' 프라이머 5' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEQ ID NO:9)를 각각 사용하여, PCR로 증폭시켰다. ClaI 링커를 PCR 산물에 첨가한 후 인간 인자 VIII-함유 벡터에 결찰하였다. 각각 5'- 및 3'-말단 접합부를 교정하기 위한 SEQ ID NO:8에서 나타난 올리고뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 1-22 (SEQ ID NO:9에서의 5' GAA...TTC)을 사용하여, 부위지정 돌연변이법으로, A1/A2 및 A2/A3 접합을 교정하여 정확한 트롬빈 절단 및 플랭킹 서열을 회복하였다. HP1로 명명된 결과된 제작물에서, 인간 A2 도메인을 정확하게 돼지 A2 도메인에 의해 치환되었다. 예비 산물은 돼지 A2 도메인의 PCR 증폭 결과로서 A1-A2 접합부에서 불필요한 티민을 포함하였다. 이러한 단일 염기는 변이성 올리고뉴클레오타이드 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3' (SEQ ID NO:10)를 사용하여 루프 아웃시켰다. 결과된 하이브리드 뉴클레오타이드 서열은 인간 A1, 돼지 A2 및 인간 A3, C1 및 C2 도메인을 가지는 활성 인자 VIII를 암호화하고 있다.
인간 인자 VIII 및 인간/돼지 A2 인자 VIII cDNA를 함유하는 pBluescript 플라즈미드를 간에 SpeI/BamHI 단편들을 교환시킴으로써, 인간 NH2-말단 A2 도메인의 63%를 함유하며, 추정되는 A2 에피토프를 포함하는 부위로 B 도메인 결여 cDNA의 동족 인간 서열을 대체하였다. 이 서열은 A2 도메인 및 접합 부위를 서열화함으로써 확인하였다. 최종적으로, 전체 A2 서열을 함유하는 SpeI/ApaI 단편을 HB-내의 상응하는 서열대신 치환됨으로써, HP2 제작물을 만들었다.
Seldon, R. F., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. 등 편집) pp. 9.21-9.26 Wiely Intersciene N.Y.에서 설명된 바와 같이, DEAE-덱스트란-중개 DNA 형질전환 후, COS-7 세포에서의 HB-및 HP2 예비 발현을 시험하였다. 활성 인자 VIII 발현을 확인하고, 예비 항체 저해에 대해 연구한 후, HB-및 HP2 DNA를 리포좀-중재 형질전환법 (Lipofectin Life Technologies, Inc., 메사추세스주 게티스버그 소재)을 이용하여 BHKC (baby hamster kidney cells)로 안정하게 형질전환시켰다. 플라즈미드-함유 클론들을, 400 μg/ml G418을 함유하는 듈베코 변형 이글 배지-F12/10% 태아 송아지 혈청 (DMEM-F12/10 fetal calf serum)에서 G418 내성을 지닌 것들을 선택한 후 100 μg/ml G418을 함유하는 DMEM-F12/10% 태아 송아지 혈청에서 유지시켰다. 링 클로닝으로 HB-및 HP2 인자 VIII 활성을 최대로 발현하는 콜로니들을 선택하고 확대하여 더 특성화시켰다.
정제된 재조합 인간 인자 VIII를 표준물로서 사용하여, 무혈장 인자 VIII 분석법, 일단계 응고 분석법, 및 요소-연계 면역 흡수 분석법으로 HB-및 HP2 인자 VIII 발현을 비교하였다. HB-및 HP2에 대해서 2600 및 2580 units/mg의 비 응혈활성을 각각 얻었다. HB-및 HP2 1.2 및 1.4 units/ml/48시간/107세포를 각각 생성하였다. 이것은 야생형 제작물 (2,600±200 units/mg)와 동일한 것이다. HB-및 HP2의 비 활성은 무혈장 인자 VIII 분석법으로는 구별할 수 없었다.
A1, A2, A3, C1, 및/또는 C2 도메인 치환물을 가지는 재조합 하이브리드 인간/동물 및 등가 인자 VIII의 생물학적 활성은 COS-세포 포유동물 일시적 발현 시스템을 사용하여 우선 평가할 수 있다. 하이브리드 인간/동물 및 등가 cDNA를 COS 세포로 형질전환 시키고 상술한바와 같이 일단계 및 이단계 응혈 분석법을 사용하여 상등액을 인자 VIII 활성에 대하여 분석할 수 있다. 또한, 더 민감하고 많은 샘플을 분석할 수 있는 염색원 기질 분석법 (chromagenic substrate assay)를 사용하여 인자 VIII 활성을 측정할 수 있다. 인자 VIII 활성 분석에 유사한 분석법들이 표준적으로 사용될 수 있다 [Wood 등 (1984) Nature 312:330-337; Toole 등 (1984) Nature 312:342-347]. COS 세포에서의 재조합 인자 VIII의 발현은 또한 표준 절차로 행하여진다 [Toole 등 (1984) Nature 312:342-347; Pittman 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2429-2433].
본 명세서에서 설명된 재조합 분자물을 위한 출발물질로서 사용된 인간 인자 VIII cDNA를 COS 세포에서 발현시켜 생물학적 활성을 가지는 생성물을 산출하였다. 상술한 바와 같이, 이러한 물질들은 하이브리드 인간/동물 인자 VIII분자들을 비교하는 표준물로서 사용될 수 있다. 이 분석에서의 활성을 비 활성으로 전환하여 하이브리드 분자들의 적절히 비교한다. 이를 위해, 세포에 의해 생성된 인자 VIII의 양을 측정하는 것이 필요하고 인간 및/또는 동물 인자 VIII를 표준물로서 사용하여 면역분석함으로써 수행될 수 있다. 인자 VIII에 대한 면역분석은 당해 분야의 기술자에게는 통상적인 것이다 [참조, 예를 들어, Lollar 등 (1988) Blood 71:137-143].
실시예 8 하이브리드 인간/동물 및 등가 인자 VIII에서의 저해 활성 결정
에피토프로서 연루될 것 같은 인간 및 동물 인자 VIII의 서열 (예를 들어, 인자 VIII와 반응하는 저해 항체에 대한 인지 부위)는 하기에서 나타난 바와 같이, 통상적인 방법, 예를 들어, 인자 VIII에 대한 항체를 사용하는 분석을 중첩 연장 방법에 의한 접합 (splicing by overlap extension methods, SOE)과 같은 부위-지정 돌연변이법과 연계하여 사용함으로써 결정될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법에 따라서, 상응하는 항원성 인간 서열에 비해 항원적이지 않는 동물 인자 VIII의 서열을 확인하고 치환물을 사용하여 동물 서열에 삽입하거나 인간 서열을 결실시킬 수 있다. 인자 VIII에 동일한 공지된 서열을 가지지 않는 알라닌 잔기와 같은 아미노산의 서열을 또한 표준 재조합 DNA 방법 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이법으로 치환시킬 수 있다. 돼지 인자 VIII는 인간 인자 VIII보다 특정 저해 항체와 덜 반응한다; 이것은 저해체를 가진 환자에 대한 현재의 치료법의 근거가 된다. 재조합 하이브리드들이 만들어진 후, 통상적인 분석방법, 베데스다 저해 분석법을 포함하는 방법으로 반응성에 대하여 시험관내에서 분석할 수 있다. 자연적 인간 인자 VIII 및 자연적 동물 인자 VIII보다 덜 반응적인 그러한 제작물이 대체요법용 후보이다.
전부는 아니지만, 인간 인자 VIII와 반응하는 대부분의 저해 항체가 지향하는 에피토프는 2332 아미노산 인간 인자 VIII 분자내의 두 부위, A2 도메인 (아미노산 잔기 373-740) 및 C2 도메인 (아미노산 잔기 2173-2332, 둘다 SEQ ID NO:2에 나타나 있다)에 위치하는 것으로 여겨진다. 인간 A2 도메인의 일부가 이의 아미노산 서열과 동일한 서열을 가지는 돼지 서열에 의해 대체된 재조합 하이브리드 인간-돼지 인자 VIII 분자를 만듦으로써 A2 에피토프를 제거하였다. 이것은, 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 표준 분자 생물학 기술에 의한 돼지 A2 도메인을 클로닝하고 다음 제한 부위를 사용하여 A2 도메인 내에서 절단하고 접합시킴으로써 수행되었다. HP2로 명명된, 결과된 제작물에서, 돼지 인자 VIII의 잔기 373-604 (SEQ ID NO:4)를 인간 A2 도메인 내로 치환하였다. 하기 방법으로 항-인간 인자 VIII 항체를 사용하여 HP2를 면역반응성에 대하여 분석하였다.
인자 VIII 효소-연결 면역흡수 분석
인간 인자 VIII 경질 사슬 항체인 6 μg/ml 농도의 ESH4 0.15 ml을 마이크로타이터 플레이트 웰에 코팅시키고 밤새 항온처리하였다. 이 플레이트를 물로 3번 세척한 후, 웰을 1시간동안 0.15 M NaCl, 10 mM 소듐 포스페이트, 0.05% Tween-20, 0.05% 탈지 분유, 0.05% 소듐 아지드 pH 7.4로 차단시켰다. 감수성을 높이기 위해, 인자 VIII을 함유하는 샘플을 30 nM 트롬빈으로 15분간 활성화시켰다. 플레이트를 다시 세척하고 샘플 또는 순수 재조합 인간 인자 VIII (10-600 ng/ml) 0.1 ml을 표준물로서 사용하여 첨가하였다. 2 시간의 항온처리후, 상기 플리에피토프를 세척하고 비오티닐화된 ESH8, 즉, 다른 인자 VIII 경질 사슬 항체를 각 웰에 첨가하엿다. 피어스(Pierce)사의 설포석신이미딜-6-(비오틴아미드)헥사노에이트 비오티닐화 키트를 사용하여 ESH8을 비오티닐화 시켰다. 1 시간 항온처리후, 플레이트를 세척하고 스트레파비딘 알카라인 포스파타제 0.1 ml을 각 웰에 첨가하였다. 바이오-라드(Bio-Rad)사의 알카라인 포스파타제 기질 시약 키트를 사용하여 플레이트를 더 전개하였고, Vmax 마이크로타이터 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Inc., 캘리포니아주 선빌 소재)를 사용하여 각 웰의 405 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 미지 인자 VIII 농도를 인자 VIII 기준 곡선의 직선 부분으로부터 결정하였다.
인자 VIII 분석법
HB-및 HP2 인자 VIII를 상술한 바와 같이 일단계 응고 분석법 [Bowie, E.J.W. 및 C.A. Owen Disorders of Hemostasis (Ratnoff 및 Forbes, 편집) pp. 43-72, Grunn & Stratton Inc., Orlando, FL (1984)] 또는 하기와 같은 무혈장 분석법으로 측정하였다. 0.15 M NaCl, 20 nM HEPES, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 7.4 용액에서, 10 nM 인자 IXa, 425 nM 인자 X 및 50 μM 단일막 포스파티딜세린/포스파티딜콜린 925/75, w/w) 소포체의 존재하에서 40 nM 트롬빈으로 HB-또는 HP2 인자 VIII를 활성화시켰다. 5 분후, 0.05 M EDTA 및 100 nM 재조합 데설파토히루딘으로 반응을 종결시키고, 결과된 인자 Xa를 Hill-Eubanks 등 (1990) j. Biol. Chem.265:17854-17858의 방법에 따른 염색원 기질 분석법으로 측정하였다. 이러한 조건하에서, 형성된 인자 Xa의 양은, 정제된 재조합 인자 VIII(Baxter Biotech, 일리노이주 디어필드 소재)를 표준물로서 사용하여 판단했을 때, 출발 인자 VIII에 선형적으로 비례하였다.
응고 분석에 앞서, 헤파린-세파로즈TM크로마토그래피를 사용하여, 48시간 처리된 배지로부터 HB-또는 HP2 인자 VIII를 10-15 units/ml로 농축시켰다. HB-또는 HP2 인자 VIII를 혈우병 혈장 (Geroge King Biomedical)에 최종농도 1 unit/ml로 첨가하였다. RC 또는 MR 혈장 또는 mAb 413 IgG (4 μM)의 저장액에서의 저해체 역가를 Kasper, C.K. 등 (1975) Thromb. Diath. Haemorrh 34:869-872에서 설명된 바와 같은 베데스다 분석법으로 측정하였다. 저해체 IgG는 Leyte, A. 등 (1991) J. Biol. Chem. 266:740-746에서 설명된 것과 같이 제조하였다.
HP2는 항-A2 항체와 반응하지 않는다. 그러므로, 잔기 373-603은 항-A2 항체에 대한 에피토프를 포함한다.
중첩 확대 접목 (Splicing by overlap extension (SOE))에 의한 하이브리드 인간-돼지 인자 VIII의 제조 및 분석
인간 A2 부위에서 돼지 아미노산 치환체를 가지는 몇 가지 응혈촉진 재조합하이브리드 인간/돼지 인자 VIIIB-도메인 결여 분자체를 제조하여 A2 에피토프를 더 좁혔다. 제한부위법외에, H 등 (1989) Gene 77:51-59에 설명된 바와 같은 "중첩확대에 의한 접목" (SOE)를 사용하여 돼지 인자 VIII cDNA의 임의의 부위를 치환하였다. SOE에서, 접목 부위는 PCR에 의해 증폭되어 원하는 cDNA를 생성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 중첩함으로써 한정된다. HP4에서 HP13으로 명명된, 열 개 cDNA 제작물을 만들었다. 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 이들을 ReNeo 발현 벡터로 삽입하고, 안정하게 BHKC로 형질전환시키고 및 높은 농도[0.5-1 μg (약 3-6 units)/107세포/24 시간]로 발현시켰다. A2 도메인에 특이적인 모델 쥐과 단일클론성 저해 항체, mAb413 존재 및 무존재하에서 인자 VIII 응혈활성을 결정하였다. 저해체가 없을 때, 모든 제작물은 B(-) 인간 인자 VIII과 구별할 수 없는 비 응혈활성을 가졌다.
베데스타 분석법 [Kasper 등 (1975) Thromb. Diath. Haemor고. 34:869-872]을 사용하여 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 제작물을 항-A2 저해체 mAb413과의 반응성에 대해 분석하였다. 베데스다 우니트 (BU)는 저해체 역가를 측정하는 표준 방법이다. 결과가 표 V에 나타나 있고, 재조합 인간 인자 VIII와 비교되어 있다.
아미노산-치환된 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII의 면역반응성 비교
제작물 돼지 치환 저해 mAb413 (BU/mg IgG
인간 B(-) fVIII 없음 1470
HP4 373-540 <0.7
HP5 373-508 <0.7
HP6 373-444 1450
HP7 445-508 <0.7
HP8 373-483 1250
HP9 484-508 <0.7
HP10 373-403 1170
HP11 404-508 <0.7
HP12 489-508 <0.7
HP13 484-488 <0.7
돼지 치환물의 경계는 삽입물의 NH2-말단 및 C-말단부에서 인간 및 돼지 인자 VIII사이에 상이한 첫 번째 아미노산들에 의해 한정된다. 표 V에서 나타난 바와 같이, 베데스다 역가가 측정될 수 없다면 (<0.7 BU/mg IgG), A2 에피토프는 치환된 돼지 서열의 부위 내에 있는 것이다. 이 에피토프는, mAb413이 HP9와 반응성이 없는 것을 예증되는 바와 같이, 오직 25 잔기로 구성된, 잔기 484-509 (SEQ ID NO:2)로 점진적으로 한정되었다. HP4에서 HP11까지의 제작물중, HP9가 저해체와 반응하지 않는 가장 "인간화"된 제작물이다. 이것은 A2 에피토프의 결정 부위가 서열 Arg484-Ile508내에 존재한다는 것을 의미한다.
이러한 결정적인 부위에서의 아미노산 서열의 인간 및 돼지 인자 VIII간의 비교에 근거하여, 두 개 제작물 HP12 및 HP13을 더 만들었고, 여기서 상응하는 아미노산 서열이 인간 아미노산 489-508 및 484-488을 대신하여 각각 치환하고 있다. 어느 것도 mAb413과 반응하지 않는다. 이것은 Arg488-Ser489 결합을 구성하는 각 잔기가 A2 저해체와의 반응에 중요하다는 것을 의미한다. HP12에서는 단지 5 잔기만이 비-인간 출처이며, HP13에서는 단지 4 잔기만이 비-인간 출처이다. 484-508, 484-488 및 489-508 돼지치환 하이브리드물은 네 명의 환자 혈장으로부터의 A2 저해체에 의한 저해가 감소된 것을 나타내며, 이는 저해체 개체군 반응에 따라서, A2 에피토프의 구조에 있어서 변화가 거의 없다는 나타낸다.
저해체 혈장으로부터 제조된 두 개의 항-A2 IgG5에 대해서, 가장 인간화된 제작물, HP9, HP12, 및 HP13의 반응성을 결정하였다. mAb413과 같이, 이러한 항체들은 HP9, HP12 및 HP13과 반응하지 않았으나, 대조군 제작물 HP(-) 및 HP8과는 반응하였다.
동일한 방법으로, 484-508간의 부위를 결정 A2 에피토프의 최종 확인을 위해 더 분석할 수 있다.
실시예 7 및 8에서 설명된 방법을 사용하여 인간 A2 또는 다른 도메인에서 아미노산 치환체를 가지는 다른 하이브리드 인간/비-돼지 포유동물 인자 VIII, 임의의 도메인에서 아미노산 치환체를 가지는 하이브리드 인간/동물 또는 동물/동물 ~, 또는 하이브리드 인자 VIII 등가 분자 또는 이들 중 임의의 단편을 제조할 수 있고, 그러한 하이브리드 인자 VIII는 항-인자 VIII 항체와 면역반응성이 감소되었거나 없다.
실시예 9 부위-지정 돌연변이에 의한 인간 인자 VIII A2 저해체 반응성의 제거
실시예 8은 잔기 484 및 508에 의해 인간 인자 VIII A2 도메인으로 결합된 돼지 서열의 치환이 A2-특이성 인자 VIII 저해체 군과의 반응성을 크게 감소시킨 분자를 산출하는 것을 나타낸다 [참조, Healey 등 (1995) J. Biol. Chem. 270:14505-14509]. 이 부위에서, 3 및 돼지 인자 VIII사이에는 9개 다른 아미노산이 있다. 인간 B-도메인 결여 인자 VIII에서 이러한 9 개 잔기, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501 및 I508 (단문자 아미노 코드를 사용)는, 부위-지정 돌연변이를 사용하여, 개별적으로 알라닌으로 전환되었다. 또한, Mlu1 및 Sac2를,A2 에피토프에 비하여 5' 및 3' 부위의 인자 VIII cDNA내에 두면서 이러한 부위에 상응하는 아미노산을 변경하지 않게 하여 클로닝을 용이하게 한다. 9개 변이체를 BHKC내로 안정하게 형질전환시키고 고도로 발현시켰다. 9개 모두는 생물학적으로 활성인 인자 VIII를 생성하였다. Healey 등에 의해 기술된 바와 같은 헤파린-세파로즈 크로마토그래피로 이들을 부분적으로 정제하고 농축하였다.
실시예 7에서와 같이, 쥐(murine) 단일클론성 저해체 mAb413과의 반응성에 의해 상기 변이체를 특성화하였다. 이러한 저해체는 오늘날 연구된 모든 인간 저해체와 동일한 또는 매우 유사한, A2 도메인 내의 집단화된 에피토프를 인식한다. 베데스다 분석법을 사용하여 저해체 반응성을 측정하였다. 간략하게는 말해서, 저해체의 베데스다 역가는 표준 일단계 인자 VIII 응고 분석법에서 50%로 인자 VIII를 저해하는 저해체의 희석농도이다. 예를 들어, 항체 용액이 1/420로 희석되고 이것이 재조합 인자 VIII 시험 샘플을 50%로 저해한다면, 베데스다 역가는 420 U이다. MAb413과 같이 순수한 단일클론성일 경우, 항체의 질량은 공지되어 있고 따라서 결과물들은 MAb413 mg당 베데스다 유니트(BU)로 표현된다. 50% 저해점을 발견하기 위해서는 일정한 범위의 MAb413 희석농도를 만들고 곡선 맞추기 방법으로 50% 저해점을 찾는다. 결과는 하기와 같다.
변이 반응성* MAb413 역가 (BU/mg) %
야생형, B(-)fVIII 9400 --
484->A 160 1.7
P485->A 4000 42
Y487->A 50 0.53
R488->A 3500 37
R489->A 1.6 0.015
R490->A <--> <0.2>
P492->A 630 6.7
V495->A 10700 113
F501->A 11900 126
I508->A 5620 60
*야생형 대비.
이러한 결과들은 484, 487, 489 및 492 위치에서 알라닌 치환을 시행함으로써 모델 A2 저해체 쪽으로의 인자 VIII 항원성을 10 인수보다 더 크게 줄일 수 있다는 것을 의미한다. R489->A의 반응성은 겨의 4차수의 크기로 감소된다. 이러한 알라닌 치환체는 인자 VIII의 항원성 및 면역원성을 낮추는 데 치료학적으로 유용하다.
상기 결과는 알라닌-스캐닝 돌연변이법의 효용성을 확인하며 또한 아미노산 서열이 저해 항원에 반응성이 있는 에피토프내에서 변형되었더라도 생물학적 활성이 유지된다는 것을 증명하고 있다. 인간 및 돼지 서열이 다른 아홉 개 부위 중 다섯 개는 또한 인간과 쥐 서열이 다른 부위이다. 이러한 위치에서 알라닌 치환체를 가지는 인자 VIII들은 따라서 현재 임의의 공지된 포유동물 인자 VIII와 동일한 서열을 가지지 않는 서열을 가지는 하이브리드 인자 VIII 등가 분자의 예이다.
예를 들어, 두 개 알라닌 치환체를 조합하여 더 변형하면, 더 광대한 범위의 환자에게 크게 감소된 항원성이 제공될 수 있는 데, 환자마다 상이한 이는 폴리클론성 가변 항체들이 인자 VIII A2 에피토프의 가변체와 반응할 수 있기 때문이다. 또한, 면역원성 (항원 유도 능력)은 하나 이상의 아미노산 치환체를 포함함으로써 더 감소될 수 있다. 그러한 치환체들은 알라닌, 돼지-특이성 아미노산 둘다, 또는 낮은 면역원성 능력을 가지는 것으로 알려진 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 490, 495 및 501 위치에서의 치환체들이 면역원성을 낮추는 데 효과적이다. 또한, 이러한 치환체들은 특정 환자 항체에 대한 반응성을 낮추는 것 같다.
항원-항체 결합에너지로의 주요 공헌자로서 또는 크거나 하전된 측쇄를 가지는 것으로 이미 언급된 것을 피하려고 주의하면, 알라닌 외, 다른 효과적인 항원성-감소 아미노산 치환체를 만들 수 있다. 본 명세서에서, 에피토프내에서 치환되면 항원적 반응성을 감소시키는 그러한 아미노산을 "면역반응성-감소" 아미노산으로 칭한다. 알라닌외 다른 면역반응성 감소 아미노산은 메티오닌, 루이신, 세린 및 글라이신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 주어진 아미노산이 나타낼 수 있는 면역반응성의 감소는 이를 치환함으로써 단백질 형태, 에피토프 접근성과 같은 것에 나타나는 효과에 달려있다는 것이 이해될 것이다.
실시예 10
클레나우 단편, 인산화된 ClaI 링커, NotI 링커, T4 리가제, 및 Taq DNA 중합효소를 Promega (위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구입하였다. 폴리뉴클레오타이드 키나제를 매릴랜드주 게이서스버그 소재 Life Technologies, Inc. 로부터 구입하였다. γ32P-ATP (Redivue, >5000Ci/mmol)을 Amersham으로부터 구입하였다. pBluescript II KS- 및 E. coli Epicurean XL1-Blue 세포를 Stratagene (캘리포니아주 라 졸라 소재)로부터 구입하였다. 합성 올리고뉴클레오타이드를 Fife Technologies, Inc 또는 Cruachem, Inc.로부터 구입하였다. 클로닝 목적으로 사용하기 위한 PCR 산물을 제조할 때 5'-인산화 프라이머를 사용하였다. 돼지 fVIII cDNA 또는 염색체 DNA의 중합효소 사슬 반응 (PCR)용 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 (nt) 번호매김은 인간 fVIII cDNA를 참조물로 이용한다 (Wood 등 (1984) 상기 참조).
돼지 비장 전체 RNA를 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법 [Chomczynski 등 (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]로 분리하였다. 전체 비장 RNA로부터의 돼지 cDNA 제조는, 별다른 언급이 없으면, 몰로니 무린 (Moloney murine) 백혈병 바이러스 역전사 중합효소 (RT) 및 반응을 채비하는 랜덤 헥사머 (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech)를 사용하였다. RT 반응물은 45 mM Tris-Cl, pH 8.3, 68 mM KCl, 15 mM DTT, 9 mM MgCl2, 0.08 mg/ml 소 혈청 알부민 및 1.8 mM 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTP)를 함유하였다. 돼지 염색체 DNA를 비장으로부터 표준 방법을 사용하여 분리하였다 (Strauss, W.M. (1995) In Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausublel 등 편집자, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3). Geneclean II (Bio 101) Ehss Quiex II Gel 추출 키트 (Qiagen)을 사용하여 아가로즈로부터 DNA를 분리하였다.
Hybaid OminGene 열순환기 (thermocycler)를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. Taq DNA 중합효소를 사용하는 PCR 반응용으로서, 반응물은 0.6 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.5 μM 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 50 U/ml 중합효소 및 0.1 부피의 첫째 사슬 cDNA 반응 혼합물을 포함하였다. 특별히 언급한 곳을 제외하고, PCR 산물을 젤 정제하고, 클레나우 단편으로 블런트 말단처리하고, 에탄올로 침전시키고, 및 T4 리가제를 사용하여 탈인산화된 pBluescript II KS-의 EcoRV 부위로 결찰시키거나 인산화된 ClaI 링커와 결찰시키고, ClaI으로 절단하고, Sephacryl S400 크로마토그래피에 의해 정제되고, 및 ClaI-절단된, 탈인산화된 pBluescript II KS-으로 결찰시킨다. 특별히 언급하지 않으면 결찰은 T4 DNA 리가제 (rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim)를 사용하여 수행한다. 삽입물-함유 pBluescript II KS- 플라즈미드를 사용하여 E. coli Epicurean XL1-Blue 세포를 형질전환시켰다.
플라즈미드 DNA의 시퀀싱은 Applied Biosystems의 373a 자동화 DNA 시퀀서 및 PRISM 색소 종결 키트를 사용하거나 또는 수동으로 Sequenase v. 2.0 시퀀싱 키트 (Amersham Corporation)을 사용하여 수행되었다. 올리고뉴클레오타이드의32P-말단 표지화를 포함하는 PCR 산물들의 직접 시퀀싱은 사이클 시퀀싱 방법 (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies)을 사용하여 행하여 졌다.
5' UTR 서열, 신호 펩타이드, 및 A1 도메인 코돈을 포함하는 돼지 fVIIIcDNA 클론의 분리
cDNA 말단의 5' 쾌속 증폭 (5'-RACE) 방법 (Marathon cDNA Amplification, Clontech 사, Version PR55453)을 사용하여, 암컷 돼지 비장 총 RNA을 네스티드 (nested) RT-PCR함으로써, 돼지 fVIII cDNA 5'에서 A2 도메인까지를 증폭하였다. 이것은 록-도킹 올리고(dT) 프라이머 [Borson, N.D. 등 (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148]을 사용하는 제 1 사슬 cDNA 합성, E. coli DNA 중합효소 I을 사용하는 제 2 사슬 cDNA 합성, 및 5' 연장된 이본쇄 어댑터 SEQ ID:13 5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3' 3'-H2N-CCCGTCCA-PO4-5'와의 결찰을 포함하는 것으로, 상기 작은 사슬은 비특이성 PCR 프라임처리를 감소시키는 아미노 기로써 3' 말단에서 차단되고 이들은 3' 말단에서 8 개 뉴클레오타이드에 상보적이다 (Siebert, P. D. 등 (1995) Nucleic. Acids. Res. 23:1087-1088). 어댑터-특이성 올리고뉴클레오타이드 SEQ ID NO: 14 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (AP1로 명명)를 센스 프라이머로서, 및 돼지 fVIII A2 도메인 특이성 올리고뉴클레오타이드 SEQ ID NO:15 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104)를 안티센스 프라이머로서, 및 모아진 (nested), 돼지 A2 도메인-특이성 올리고뉴클레오타이드 SEQ ID NO:17 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520)을 안티센스 프라이머로서 사용하여 PCR의 첫 번 회차를 실시하였다. 항체-중개 핫 스타트 방법 [Kellogg, D.E. 등 (1994) BioTechniques 16:1134-1137]을 이용한 상업적인 키트 (Advantage cDNA PCR core kit)를 사용하여 PCR을수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 60 초간 변성한 후, 튜브 온도 조절을 이용하여, 94℃에서 30 초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 및 68℃에서 4 분간 연장하는 30회 (첫번째 PCR) 또는 25회 (두번째 PCR)을 하는 것이다. 이러한 과정은 현저한 약 1.6 kb 산물을 생산하며 이는 5' UTR로 약 150 bp연장된 단편의 증폭과 일치한다. 이 PCR 산물을 ClaI 링커를 사용하여 pBluescript로 클론하였다. 네 개 클론의 삽입물을 양방향으로 서열화하였다.
이러한 클론들의 서열은 5' UTR이 137 bp, 신호 펩타이드, A1 도메인 및 일부 A2 도메인에 상응하는 부위를 포함한다. 4 부위중 적어도 3 개에서 완전일치가 이루어졌다. 그러나, 클론들은 평균 4 개 분명한 PCR-발생 변이를 포함하는 데, 이는 아마도 클론성 산물을 발생시키는 데 필요한 PCR의 복수회차에 기인한다. 그러므로, 우리는 신호 펩타이드 부위로부터 얻은 서열을 사용하여, RENEOPIGSP로 명명된, 센스 사슬 인산화된 PCR 프라이머, SEQ ID NO:18 5'-CCTCTC GAGCCA CCA TGT CGA GCC ACCATGCAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3'를 서열을 확인하는 다른 PCR 산물 합성용으로 및 발현벡터로의 클로닝용으로 설계하였다. 굵은 활자체의 서열은 개시 코돈을 나타낸다. 5'에서 여기까지의 서열은 fVIII의 발현에 사용된 포유동물 발현 벡터 ReNeo로의 5' 삽입 부위와 동일한 서열을 나타낸다 (Lubin 등 (1994) 상기 참조). 이러한 부위는 XhoI 절단 부위 (밑줄)를 포함한다. RENEOPIGSP 및 nt 1497-1520 올리고뉴클레오타이드는 돼지 암컷 비장 cDNA를 주형으로서 사용하여 Taq DNA 중합효소-중재 PCR 반응을 채비(prime)하는 데 사용되었다. 몇몇 다른 제조업자로부터의 DNA 중합효소는 감지할만한 산물을 산출하는 데 실패하였다. PCR 조건은 94℃에서 4분간 변성후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 2분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 연장하는 35 사이클을 실시하고 최종적으로 72℃에서 5분간 연장하는 단계가 포함된다. PCR 산물을 ClaI 링커를 사용하여 pBluescript로 클론시켰다. 이러한 클론들중 두 개의 삽입물을 양방향으로 서열화하고 합치되는 서열을 일치시켰다.
A3, C1, 및 5' 쪽의 C2 도메인 코돈들을 포함하는 돼지 fVIII cDNA 클론의 분리
먼저, B-A3 도메인 단편 (nt 4519-5571) 및 C1-C2 도메인 단편 (nt 6405-6990)에 상응하는 두 돼지 비장 RT-PCR 산물을 클론하였다. C2 도메인의 3' 말단을 fVIII에서 말단 엑손인 엑손 26 부위까지 연장하였다. B-A3 산물을 돼지-특이성 B 도메인 프라이머, SEQ ID NO:19 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T3'을 사용하여 만들었고, 상기 서열에서 밑줄된 부위는 인간 fVIII의 nt 4519-4530과 같이 배열된 돼지 fVIII의 부위와 상응한다. 올리고뉴클레오타이드의 5' 부위는 원래 클로닝 목적을 위해 의도된 NotI 부위를 포함한다. B-A3 산물을 생성하는 데 사용된 안티센스 프라이머, SEQ ID NO:20 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3'는 인간 fVIII cDNA 서열 nt 5545-5571과 역 상보성에 바탕을 둔 것이다. PCR 반응물은 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 9.0, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 2.5 mM dNTPs, 20 μM 프라이머, 25 units/ml Taq DNA 중합효소 및 1/20 부피의 RT 반응 혼합물을 포함하였다. PCR 조건은, 94℃에서 3 분간 변성 후, 94℃에서 1분간변성, 50℃에서 2분간 어닐링 및 72℃에서 1분간 연장하는 30 사이클을 포함한다. PCR 산물을 T4 DNA 키나제를 이용 인산화시키고 NotI 링커를 덧붙였다. NotI으로 절단 후, PCR 단편을 BlueScript II KS-의 NotI 부위로 클론시키고 XL1-Blue 세포로 형질전환시켰다.
각각 SEQ ID NO:21 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) 및 SEQ ID NO:22 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (nt 6966-6990의 역상보성)인 센스 및 안티센스 프라이머를 합성하는, 알려진 돼지 cDNA 서열을 사용하여 C1-C2 산물을 만들었다. PCR 조건은 B-A2 산물을 생성할 때 사용되었던 것과 동일하였다. 결과된 단편을 Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3 Prime Inc., 콜로라도주 볼더 소재)를 사용하여 pNOT 클로닝 벡터로 결찰하고 JM109 세포에서 성장시켰다.
B-A3 및 C1-C2 플라즈미드를 부분적으로 서열화하여 각각 SEQ ID NO:23 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) 및 SEQ ID NO:24 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564)인 돼지-특이성 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 만들었다. 이러한 올리고뉴클레오타이드들을 프라이머로서 사용하고 Clontech Advantage cDNA PCR 키트를 이용하여 2013 bp RT-PCR 산물을 생성하였다. 인간 nt 4551-6564에 상응하는 이러한 산물은 경질 사슬 활성 펩타이드 (nt 5002-5124), A3 도메인 (nt 5125-5114) 및 대부분의 C1 도메인 (nt 6115-6573)에 상응하는 부위를 포함한다. C1-C2 클론의 서열은 인간 및 돼지 cDNA nt 6565에서 C1 도메인의 3' 말단까지가 동일하다는 것을 확립시켜주었다. PCR 산물을pBluescript II KS-의 EcoRV 부위로 클론하였다. 4 개 클론들을 양방향으로 완전히 서열화하였다. 4 부위중 적어도 3개에서 완전일치가 이루어졌다.
C2 도메인 코돈들의 3' 편을 포함하는 돼지 fVIII 클론들의 분리
인간 fVIII (뉴클레오타이드 6574-7053)의 C2 도메인은 엑손 24-26 내에 포함되어 있다 [Gitschier J. 등 (1984) Nature 312:326-330]. 인간 엑손 26은 뉴클레오타이드 6901-8858로서 1958 bp를 포함한다. 이것은 1478bp의 3' 비번역 서열을 포함한다. 상기 C2 도메인의 3' 말단 및 3' UTR에 상응하는 엑손 26 cDNA를 클론하기 위해 3' RACE [Siebert 등 (1995) 상기 참조], 역 PCR [Ochman, H. 등 (1990) Biotechnology (N.Y). 8:759-760], 제한부위 PCR [Sarkar, G. 등 (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], "예측할수없이 프라임되는 (unpredictably primed)" PCR [Dominguez, O. 등 (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248]을 사용하여 그리고 돼지 간 cDNA 라이브러리를 탐색함으로써 시도하였지만 실패하였다. 돼지 fVIII의 5' 말단을 클론하는 데 성공적으로 사용되었던 동일한 어댑터-결찰된 이중사슬 cDNA 라이브러리를 사용하여 3' RACE를 시도하였다. 따라서 이러한 방법의 실패는 엑손 26에 상응하는 cDNA의 부재 때문이 아니었다.
목적된 유전자 워킹 PCR 방법 [Parker, J.D. 등 (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060]을 사용하여 C2 도메인의 3' 편을 클론하였다. 돼지-특이성 센스 프라이머, SEQ ID NO:25 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 4904-6924)를 처음 C2 도메인 서열에 기초하여 합성하였고 실험식에서 이용가능한 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된 비특이성 "워킹(walking)" 프라이머와 함께 PCR 반응에 사용하였다. PCR 산물을,32P-말단 표지된 돼지-특이성 내부 프라이머, SEQ ID NO:26 5'-CCGTGGTGAACGCGCTGGACC-3' (nt 6932-6952)를 사용하여 프라이머 연장 분석 [Parker 등 (1991) BioTechniques 10:94-101]의 목표로 사용하였다. 흥미롭게는, 시험된 40개의 비특이성 프라이머들 중에서, 단지 2개만이 프라이머 연장 분석시 긍정적인 산물을 생성하였고 이러한 두 프라이머는 C2 도메인의 3' 말단에서 정확한 및 축퇴된 인간 서열 SEQ ID NO:27 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) 및 SEQ ID NO:28 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (7027-7053)에 상응하였다. 이러한 프라이머들은 애초에 통상적인 RT-PCR에 의해 산물을 생성하는 것으로 설계되었으나, 에티디움 브로마이드 염색 결합에 의해 시각화될 수 있는 충분한 산물을 생성하는데 실패하였다. 그러나, 더 민감한 프라이머 연장 방법에 의해 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 이러한 산물을 젤 정체하고 직접적으로 서열화하였다. 이것은 돼지 fVIII의 서열 3'에서 nt 7026까지를 연장시켰다.
이전에서 설명된 5'-RACE에서 사용된 어댑터-결찰 이중-사슬 cDNA 라이브러리를 사용하여 생성된 네스티드 PCR 산물의 프라이머 연장 분석으로 추가적인 서열을 얻었다. 제 1 회 반응은 돼지 적확 프라이머 SEQ ID NO:29 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541-6564) 및 AP1 프라이머를 사용하였다. 제 2 회 반응은 SEQ ID NO:30 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) 및 AP2 프라이머를 사용하였다. 직접 PCR 시퀀싱으로 3'에서 C2 도메인의 말단까지의 서열(nt 7053)을 연장하였다. 이 C2 도메인 서열은 C2 도메인의 3' 말단 근처 nt 7045에서 제외하고는 단일한 것이다. 반복된 PCR 반응을 분석한 결과 이 부위에서, A, G 또는 A/G의 이중 판독이 나타났다.
두 개 프라이머 SEQ ID NO:31 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) 및 SEQ ID NO:32 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031)을 사용하여 시퀀싱을 3'UTR로 연장하였다. 몇몇 부위에서 확실하지 않더라도, 약 15 bp의 3'UTR 서열을 얻었다. 다음, 이 3' 비번역 서열의 최상 추정치에 근거하여 몇 개의 안티센스 프라이머를 합성하였다. 이러한 프라이머들은 3' 말단에 TGA 종결 코돈의 역 상보서열을 포함하였다. 특이 센스 프라이머 SEQ ID NO:33 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) 및 3' UTR 안티센스 프라이머 SEQ ID NO:34 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'를 사용하여 돼지 비장 게놈 DNA 및 돼지 비장 cDNA로부터 PCR 산물을 얻고 이를 아가로즈 젤 전기영동 및 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 클로닝할 목적으로 충분한 양의 물질을 얻기 위해, 네스티드 센스 프라이머 SEQ ID NO:35 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' 및 동일한 안티센스 프라이머를 사용하여 2회차 PCR을 실시하였다. 141 bp PCR 산물을 EcoRV-절단 pBluescipt II KS-로 클론시켰다. 게놈 DNA로부터 유도된 세 개 클론 및 cDNA로부터 유도된 세 개 글론의 서열을 양방향으로 얻었다. 이 서열은 게놈 DNA에서는 언제나 A이고 cDNA에서는 언제나 G인 nt 7045에서만을 제외하고는 불명확하지 않았다.
인간, 돼지 및 마우스 fVIII의 다중 DNA 서열 배열체 (도 1A-1H)
신호 펩타이드, A1, A2, A3, C1 및 C2 부위의 배열을 CLUSTALW 프로그램 [Thompson, J.D. 등 (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680]을 사용하여 실시하였다. 갭(gap) 오픈 및 갭 연장 페널티들은 각각 10 및 0.05 이었다. 인간, 마우스 및 돼지 B 도메인이 배열물들은 이전에 설명되어 있다 [Elder 등 (1993) 상기 참조]. 인간 A2 서열은 SEQ ID NO:2에서 아미노산 373-740에 상응한다. 돼지 A2 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4에 주어져 있고 마우스 A2 도메인 아미노산 서열이 SEQ ID NO:6 내 아미노산 392-759로 주어져 있다.
실시예 11. 활성, 재조합 B-도메인 결여 돼지 인자 VIII (PB-)의 발현
재료
구연산 처리된 혈우병 A 및 정상 인간 혈장을 George King Biomedical Inc.로부터 구입하였다. 태아 송아지 혈청, 제네티신, 페니실린, 스트렙토마이신, DMEM/F12 배지 및 AIV-V 배지를 Life Technologies Inc.로부터 구입하였다. Taq DNA 중합효소는 Promega로부터 구입하였다. Vent DNA 중합효소는 New England Biolabs.로부터 구입하였다. pfu DNA 중합효소 및 파지미드 pBluescript II KS-를 Stratagene으로부터 구입하였다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 Life Technologies 또는 Cruachem. Inc.로부터 구입하였다. 제한효소는 New England Biolabs 또는 Promega로부터 구입하였다. 클로닝 목적으로 PCR 산물을 생성할 때, 5'-인산화 프라이머들을 사용하였다. 돼지 fVIII cDNA 또는 게놈 DNA의 PCR 증폭용 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드(nt) 번호매김은 인간 fVIII cDNA를 참조물로 사용한다 [Wood 등 (1984) Nature 312:330-337]. HB-/ReNeo는 내 암피실린 및 제네티신 유전자 및 트롬빈에 의해 생성된 Ser741-Arg1648 절단 단편으로서 정의된 전체 B 도메인이 결여된 인간 fVIII을 포함한다. ReNeo내의 fVIII 삽입물의 3' 말단에 있는 fVIII C2 도메인 cDNA의 돌연변이를 단순화시키기 위해서, NotI 부위를 SOE 돌연변이법 [Horton, R.M. 등 (1993) Methods Enzymol. 217:270-279]을 이용하여 HB-/ReNeo의 종결코돈에서 3'쪽으로 2 개 염기 앞에 도입하였다. 이러한 제작물을 HB-ReNeo/NotI으로 명명하였다.
산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법 [Chomczynski, P. 등 (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]으로 전체 RNA를 분리하였다. 몰로니 무린 백혈병 역전사효소 (RT) 및 랜덤 헥사머를 제작자의 지시에 따라 (First-Strand cDNA 합성 키트, Pharmacia Biotech) 사용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. Qiagen Plasmid Maxi 키트 (Qiagen, Inc.)를 사용하여 플라즈미드 DNA를 정제하였다. Taq, Vent 또는 Pfu DNA 중합효소를 사용하여 Hybaid OmniGene 열순환기에서 PCR 반응을 실시하였다. PCR 산물을 젤 정제하고, 에탄올로 침전시키고 및 T4 DNA 리가제 (쾌속 DNA 결찰 키트, Boehringer Mannheim)를 사용하여 플라즈미드 DNA내로 결찰하였다. 삽입물을 함유하는 플라즈미드를 사용하여 E. coli Epicurean XL1-Blue 세포를 형질전환시켰다. PCR로 생성된 모든 신규 fVIII DNA 서열은 Applied Biosystems373a 자동 DNA 시퀀서 및 PRISM 색소 종결 키트를 사용하여 디데옥시 시퀀싱으로 확인하였다.
돼지 C2 도메인을 가지는 하이브리드 fVIII 발현 벡터 HP20의 제작
C1 도메인의 3' 말단 및 모든 C2 도메인에 상응하는 돼지 fVIII cDNA를 공지된 돼지 fVIII cDNA 서열 [Healy, J. F. 등 (1996) Blood 88:4209-4214]에 기초한 프라이머를 사용하는 RT-PCR로 비장 총 RNA로부터 pBluescript로 클론하였다. 이러한 제작물 및 HB-/ReNeo를 주형으로 사용하여 SOE 돌연변이법으로 인간 C1-돼지 C2 융합 생성물을 pBluescript에서 제작하였다. 이러한 플라즈미드에서 C1-C2 단편을 ApaI 및 NotI으로 제거하고 ApaI/NoTI-절단 HB-/ReNeo/NotI으로 결찰하여 HP20/ReNeo/NotI을 생성하였다.
돼지 경질 사슬 (HP18)-를 함유하는 B-도메인 결실 하이브리드 인간/돼지 fVIII의 제작
인간 fVIII 경질 사슬은 아미노산 잔기 Asp1649-Tyr2332로 구성된다. 돼지 fVIII cDNA내의 상응하는 잔기로 HB-의 이러한 부위를 대신하여 HP18로 명명된 하이브리드 인간/돼지 fVIII 분자를 생성한다. 이는 돼지 A2 부위, A3 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인 일부에 해당하는 PCR 산물을 Hp20에서 상응하는 부위를 대신하여 치환함으로써 실행되었다. 제작을 용이하게 하기 위해, 동의의 AvrII 부위를HP22의 A2 및 A3 도메인의 접합에 있는 nt 2273으로 SOE 돌연변이법으로 도입하였다. pBlueScript 내의 돼지 신호 펩타이드-A1-부분 A2 단편 [Healy 등 (1996) 상기 참조]을, HP1으로 지정된, 돼지 A2 도메인을 함유한 하이브리드 인간/돼지 fVIII [Lubin 등 (1994) 상기 참조]와 융합시킴으로써 HP22를 제작하였다.
돼지 B 도메인 결여 fVIII-(PB - )의 제작
HP18/BS (융합 AvrII)의 SpeI/NotI 단편을 AvrII/NotI을 사용하여 절단하고 AvrII/NotI-절단 HP22/BS (융합 AvrII)로 결찰시켜, 전체 B 도메인이 결여된 돼지 fVIII로 구성된 PB-/BS (융합 AvrII) 제작물을 생성하였다. PB-/BS (융합 AvrII)의 Xba/NotI 단편을 HP22/ReNeo/NotI (융합 AvrII)으로 결찰시킴으로써 PB-를 ReNeo내로 클론시켰다.
재조합 fVIII 분자의 발현
PB-/ReNeo/NotI (융합 AvrII) 및 HP22/ReNeo/NotI (융합AvrII)을 일시적으로 COS 세포내로 형질전환시키고 전술한 바와 같이 발현시켰다 [Lubin, I. M. 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641]. HB-/ReNeo/NotI를 그리고 DNA 없는 것(모의)을 대조군으로서 트랜스펙션시켰다.
PB-, HP22 및 HB-의 fVIII 활성을 크로모제닉 분석에 의해 하기와 같이 측정하였다. COS 세포 배양 상청액내의 fVIII의 샘플을 0.15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM cAC12, 0.01% Tween-80, pH 7.4 내에서 10 nM 인자 IXa, 425 nM 인자 X 및 50 μM 단일막 포스파티딜세린-[포스파티딜콜린(25/75 w/w) 소포체 존재하에서 40 nM 트롬빈으로 활성화시켰다. 5 분후, 반응을 0.05 M EDTA 및 100 nM 재조합 데설파토히루딘을 사용하여 종결시키고 결과된 인자 Xa를 염색성 기질 분석법으로 측정하였다.
독립적으로 형질전환된 이중 세포배양 상등액의 결과 (분당 405 nm에서 흡광도)
HB-: 13.9
PB-: 139
HP22: 100
모의(mock): <0.2
이러한 결과들은 돼지 B-도메인결여 fVIII 및 돼지 A1 및 A2 서브유니트로 구성되는 B-도메인 결여 fVIII가 활성적이라는 것을 나타내며 이것들은 인간 B-도메인결여 fVIII보다 뛰어난 활성을 가진다는 것을 제시하고 있다.
헤파린-세파로즈 크로마토그래피를 사용하여 성장배지로부터 PB-를 정제하고 농축하였다. 헤파린-세파로즈 (10 ml)는 0.075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2.5 mM CaCl2, 0.005% Tween-80, 0.02% 소듐 아지드 pH 7.40으로 평형화하였다. 발현세포로부터의배지 (100-200 ml)를 헤파린-세파로즈에 적용하고, 이를 소듐 아지드 없이 평형화 완충액 30 ml로 세척하였다. PB-를 0.65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 7.40으로 용출시키고 -80℃에서 저장하였다. fVIII 응혈활성의 수율은 일반적으로 50-75% 수준이었다.
돼지 B-도메인결여 fVIII (PB - )의 안정 발현
형질전환된 세포 라인을 10% 태아 송아지 혈청, 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-F12에서 유지하였다. 태아 송아지 혈청을 사용 전에 50℃에서 한시간 동안 가열 불활성화시켰다. HB-/ReNeo 및 PB-ReNeo/NotI (융합AvrII)를 BHK 세포로 안정하게 형질전환시키고, 발현세포를 600 μg/ml 제네티신을 함유하는 성장 배지에서 유지하는 것을 제외하고 이미 설명된 일반적인 방법 [Lubin 등 (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641]을 사용하여 제네티신에 저항성이 있는 것을 선택하였다. Corning T-75 플라스크에서 집합적으로 성장된 세포를 넌크(Nunc)사 삼중 플라스크 내의 600 μg/ml 제네티신을 함유한 배지로 옮기고 집합적으로 성장시켰다. 배지를 제거하고 제네티신이 없는 무혈청, AIM-V 배지 (Life Technologies, Inc.)로 대체하였다. 인자 VIII 발현을 일단계 인자 VIII 응혈작용 (상기 참조)으로 감시하고 배지 100-150 ml을 날마다 한번 4 내지 5일 동안 모았다. 배지 내에서 HB-및 PB-에 대한 최대 발현 수준은 각각 ml 당 1-2 유니트 및10-12 유니트의 인자 VIII 응혈 활성이었다.
PB - 의 정제
60% 포화 황산 암모늄을 사용하여 배양 상등액으로부터 PB-를 침전시킨 후, 혈장-유도 돼지 인자 VIII의 정제에 대해 이전에 설명된 바와 같은 W3-3 면역친화성 크로마토그래피 및 모노 Q 고압 액체 크로마토그래피로 정제하였다. PB-의 비 응혈활성을 일단계 응혈 분석법 [Lollar 등 (1993) 상기 참조]으로 측정하였고 이는 플라즈마-유래 돼지 인자 VIII와 유사하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정되었을 때, PB-제조물은 분자 질량 160 kDa, 82 kDa 및 76 kDa의 세 밴드가 나타났다. 82 kDa 및 76 kDa 밴드는 A1-A2 및 ap-A3-C1-C2 도메인 (ap는 활성화 펩타이드를 의미)을 함유하는 이형이량체로서 이미 설명되어 있다 [Toole 등 (1984) Nature 312:342-347]. 160 kDa 밴드를 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 전달하고 NH2-말단 시퀀싱하여 Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (여기서 Xx는 미확정)을 얻었고 이는 단일 사슬 인자 VIII의 NH2-말단 서열이다 [Toole 등 (1984) 상기 참조]. 따라서, PB-는 A2 및 A3 도메인사이에서 절단되어 두 개의 형태, 즉 단일 사슬 A1-A2-ap-A3-C1-C2 단백질 및 A1-A2/ap-A3-C1-C2 이형이량체로 구성되도록 부분적으로 가공된다. 재조합 HB-의 유사 처리가 보고되어있다 [Lind 등 (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-27].
돼지 인자 VIII의 특성화
137 bp의 5' UTR에 상응하는 돼지 fVIII의 cDNA 서열, 신호 펩타이드 암호화 부위 (57 bp) 및 A1 (1119 bp), A3 (990 bp), C1 (456 bp) 및 C2 (483 bp) 도메인을 결정하였다. B 도메인 및 경질 사슬 활성 펩타이드 부위 [Toole 등 (1986) 상기 참조] 및 A2 도메인 [Lubin 등 (1994) 상기 참조]에 대해 이미 보고된 서열과 함께, 본 명세서에서 보고된 서열로 번역된 산물에 상응하는 돼지 fVIII cDNA의 결정을 완전하게 된다. 5' UTR 부위, 신호 펩타이드, 및 A1 도메인 cDNA를 포함한 단편을 5'-RACE RT-PCR 방법을 사용하여 클론하였다. 인간 C2 서열에 기초한 프라이머는 RT-PCR 산물을 제조하는 데 성공적으로 사용되었고 이 산물은 A3, C1 및 C2 도메인의 5' 편을 클로닝하는 데 사용되었다. C2 도메인의 3' 편에 상응하는 cDNA 및 3' UTR cDNA를 클론하는 것이 어렵다는 것이 밝혀져 있다. C2 도메인의 나머지는 목표 유전자 워킹 PCR 방법으로 궁극적으로 클론하였다 [Parker 등 (1991) 상기 참조].
본 명세서에 보고된 서열 SEQ ID NO:36은 C2 도메인의 3' 말단 근처의 nt 7045에서를 제외하고는 명백한데, 상기 위치는 상술한 바와 같이 A 또는 G이다. 상응하는 코돈은 GAC (Asp) 또는 AAC (Asn)이다. 인간 및 마우스 코돈들은 각각 GAC 및 CAG (Gln)이다. 이러한 것이 다형현상 또는 재생성 PCR 인공물을 표시하는 것인지는 알려지지 않는다. GAC 및 AAC 코돈 양쪽에 상응하는 돼지 C2 도메인 치환체들을 포함하는 재조합 하이브리드 인간/돼지 B-도메인결여 fVIII cDNA를 응혈활성에서 감지될만한 차이점 없이 안정하게 발현되었다. 이것은 이러한 두 C2 도메인 변체간에 기능적 차이가 없음을 의미한다.
전체 길이 돼지 fVIII의 예상 아미노산 서열 SEQ ID NO:37을 보고된 인간[Wood 등 (1984) 상기 참조] 및 쥐서열 [Elder 등 (1993) 상기 참조]과 함께 배열한 것을 도 1A-1H에서, 번역후 변경, 단백질가수분해 절단, 및 다른 고분자에 의한 인식 부위와 함께 나타낸다. 배열된 서열의 일치 정도는 표 VI에 나타나 있다. 전술한 바대로, 이러한 생물종들의 B 도메인들은 A 또는 C 도메인보다 더 다양하다. 이것은 B 도메인이 그의 큰 크기에도 불구하고 기능이 알려져 있지 않다는 관찰과 일치한다 [Elder 등 (1993) 상기 참조; Toole 등 (1986) 상기 참조]. 본 발명의 결과는 B 도메인 또는 돼지 fVIII가 활성에 불필요하다는 것을 확인한다. 본 명세서에 제시된 서열 데이터에 기초하여, 결실된 B 도메인 전부 또는 부분을 가지는 돼지 fVIII는 결실된 돼지 B 도메인의 코돈 전부 또는 일부를 가지는 돼지 fVIII 암호화 DNA를 발현시킴으로써 합성될 수 있다. A1 도메인 APC/인자 IXa 절단 펩타이드 (잔기 337-372) 및 경질 사슬 활성 펩타이드에 상응하는, 더 다양한 서열 (표 VII)이 있다. 337-372 펩타이드를 생성하는 위치 336에서의 트롬빈 절단 부위는 확실히 마우스에서 결여되어 있는 데 이러한 잔기는 아르기닌 대신에 글루타민이기 때문이다 [Elder 등 (1993) 상기 참조]. 트롬빈 절단 펩타이드 (또는 마우스 fVIII에서 가능성있는 흔적성 337-372 활성 펩타이드)의 상대적으로 빠른 분기성은 이미 피브리노펩타이드에 대해서 이미 언급되어 있다[Creighton, T. E. (1993) InProteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, pp. 105-138]. 일단 절단되면, 이러한 펩타이드의 생물적 기능이 손실되는 데 이는 빠른 분기성에 대한 가능한 이유로서 언급되어 왔다. 인간 fVIII내의 Arg562는 fVIII 및 fVIIIa의 불활성화 동안 활성화된 단백질 C에 대한 더 중요한 절단 부위라는 것으로 제시되었다 [Fay, P.J. 등 (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145]. 이러한 부위는 인간, 돼지 및 마우스 fVIII에서 보존되어 있다.
도 1A-1H에서 잠재적 N-연결 글리코실화 부위가 굵은 글씨체로 표시되어 있다. 8 개의 보존된 N-연결 글리코실화 부위가 있다: A1 도메인에 하나, A2 도메인에 하나, B 도메인에 네 개, A3 도메인에 하나 및 C1 도메인에 하나가 있다. 19 개의 A 및 C 도메인 시스테인이 보존되어 있는 반면 B 도메인 시스테인은 분기되어 있다. fVIII내의 일곱 디설파이드 결합들 중에서 여섯 개가 인자 V 및 세룰로플라즈민내의 동형 부위에서 발견되며, C 도메인 디설파이드 결합 둘다 인자 V내에서 발견된다 [McMullen, B. A. 등 (1995) Protein Sci. 4:740-746]. 인간 fVIII는 위치 346, 718, 723, 1664 및 1680에서 황산화된 타이로신을 포함한다 [Pittman, D.D. 등 (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102]. 이러한 잔기들은, 비록 CLUSTALW 프로그램이 인간 fVIII에서 Tyr346에 상응하는 마우스 타이로신을 배열하는 것을 실패하였지만. 마우스 fVIII 및 돼지 fVIII에서 보존되어 있다.
마우스 및 돼지 혈장은 인간 혈우병 A 혈장에서의 응고 결함을 교정할 수 있고, 이는 이러한 생물종의 A 및 C 도메인에서의 잔기 보존 수준과 일치한다. 돼지fVIII의 응혈촉진 활성은 인간 fVIII의 것보다 우수하다 [Lollar, P. 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657]. 본 명세서에서 설명되는 바와 같이 발현되고 정제된 재조합 돼지 인자 VIII (B 도메인 결실)는 또한 인간 fVIII보다 더 큰 비 응혈활성을 보이며, 혈장-유래 돼지 fVIII와 비견할 수 있다. 이것은 활성 A1/A2/A3-C1-C2 fVIIIa 이형이량체로부터 A2 서브유니트의 자연적 분리속도가 저하된 것에 기인한 것일 수 있다. 응혈촉진 활성에서의 이러한 차이가 생물종 적응의 예로서 기능에서의 진화적 변화 [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-244)를 반영하는 것이지는 알려져있지 않다. 번역된 산물에 해당하는 돼지 fVIII cDNA 서열이 완성된 지금, 동족체 스캐닝 돌연변이법 [Cunningham, B. C. 등 (1989) Science 243:1330-1336]로써, 인간 및 돼지 fVIII 간의 구조적 차이 즉 후자의 더 우수한 활성을 나타내게하는 요인을 확인할 수 있다.
돼지 fVIII는 fVIII가 주입된 혈우병 환자에서 나타나는 또는 일반적인 개체에서 자기항체로서 나타나는 저해 항체와 덜 반응한다. 이것은 저해 항체로 환자를 관리하는데 돼지 fVIII 농축물을 사용하는 근거가 된다 [Hay 및 Lozier (1995) 상기 문헌 참조]. 대부분 저해체들은 A2 도메인 또는 C2 도메인내에 위치한 에피토프로 지향된다 [Fulcher, C. A. 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156; Scandella, D 등 (1989) Blood 74:1618-1626]. 또한, 알려지지 않은 중요한 에피토프가 A3 또는 C1 도메인에 있다는 것이 확인되었다 [Scandella 등 (1989) 상기 참조; Scandella, D. 등 (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. 등 (1994) Blood84:224a]. 동족체 스캐닝 돌연변이법 [Healey 등 (1995) 상기 참조)]으로, 상기 A2 에피토프를 잔기 484-508로 맵핑하였다. 이러한 25 잔기 분체에서는, 상대적으로 적은 비율의 동일 서열 (16/25 또는 64%)이 있다. 이에 대한 항체들이 저해성이라는 사실에 비추어서 기능적으로 중요하게 보이는 이러한 부위가 명백히 상대적으로 더 빠른 유전적 방임경향에 있다는 것은 흥미롭다. 돼지 A2 도메인 및 A3 도메인의 배열은 상기 A2 에피토프가 A3 도메인내의 상응하는 부위와 감지할만한 상동성을 공유하지 않고 있다는 것을 보여준다.
인간 fVIII의 C2 저해체 에피토프는 결실 맵핑에 의해 잔기 2248-2312 내에 위치한다는 것이 제시되어 있다 [Scandella, D. 등 (1995) Blood 86:1811-1819]. 인간 및 돼지 fVIII는 이러한 65 잔기 분체에서 83% 동일하다. 그러나, C2 에피토프를 특성화하기 위해 이러한 부위를 상동체 스캐닝 돌연변이법으로 분석한 결과 C2 에피토프의 주 결정자는 놀랍게도 인간 아미노산 2181-2243 (SEQ ID NO:2 및 도 1h)에 상응하는 부위내에 위치한다는 것을 밝혔다.
인간 인자 VIII의 C2 도메인의 다양한 부분들이 돼지 인자 VIII의 상응하는 부위에 의해 치환된 인간-돼지 하이브리드 인자 VIII 단백질을 본 명세서에서 설명된 전략 (실시예 8)을 사용하여 만들었다. SEQ ID NO:37에 주어진 돼지 C2 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 하이브리드 암호화 DNA를 제작함으로써, 다양한 C2-하이브리드 인자 VIII를 합성하였다. 각 하이브리드 DNA가 형질전환된 세포에서 발현되어 하이브리드 인자 VIII가 성장 배지로부터 부분적으로 정제될 수 있었다. 임의의 저해체 부재하에서의 활성은 일단계 응고 분석에 의해 측정되었다.
한벌의 다섯 개 인간 저해체를 사용하여 각 하이브리드 인자 VIII를 시험하였다. 항 인자 VIII 항체를 함유하는 저해체 혈장은, 저해를 중화시킬 수 있는 재조합 인간 C2 도메인의 능력에 근거하여, 인간 C2 도메인에 대하여 지향되는 것으로 나타났다. 모든 시험 혈장에 있어서, 저해체 역가는 C2 도메인 또는 경질 사슬에 의해 79% 보다 더 크게 중화되었으나, 재조합 인간 A2 도메인에 의해서는 10% 미만으로 중화되었다. 또한, C2-하이브리드 인자 VIII를, C2 도메인과 결합하는 무린(murine) 단일클론성 항체에 대해 시험하였고, 인간 C2 저해체 항체와 같이, 그것은 인자 VIII가 인지질 및 폰 빌레브란트 인자로의 인자 VIII 결합하는 것을 저해하였다.
C2-하이브리드 인자 VIII들에 대한 항체 저해체 역가들을 비교함으로써, 인간 C2 저해체 에피토프의 주 결정자는 잔기 2181-2243 (SEQ ID NO:2, 도 1H 참조)의 부위라는 것으로 나타났다. COOH 말단에서 잔기 2253 까지의 부위로 지향된 항-C2 항체는 다섯 명의 환자 혈청중 네 명에서 확인되지 않았다. 인간 아미노산 잔기 2181-2199 및 2207-2243에 상응하는 돼지 서열을 가지는 하이브리드를 비교하는 데 있어서, 두 부위가 항체 결합에 기여한다는 것이 명백하였다. 인간 잔기 2181-2243에 상응하는 돼지 아미노산 서열이 SEQ ID NO:37내에서 1982-2044로 번호가 매겨져 있다. 1982-2044로 번호가 매겨진 돼지 아미노산을 암호화하고 있는 돼지 DNA 서열은 SEQ ID NO:35에서 5944-6132로 번호가 매겨진 뉴클레오타이드이다.
도 1H를 참조하면, 부위 2181-2243에서, 인간 및 돼지 서열사이에는 16개의다른 아미노산이 있다. 이러한 차이는 잔기 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238, 및 2243에서 발견된다. 이렇게 번호매김된 잔기 하나 이상에서의 아미노산을 치환하여 인간 항-C2 저해 항체에 반응성이 없는 변형된 인간 인자 VIII를 만들 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이법은 전술한 바와 같이, 자연 발생적 잔기에 대한 알라닌 치환을 이룰 수 있는 유용한 방법이다. 본 명세서에서 기술한 바와 같이, 알라닌외의 다른 아미노산이 또한 치환될 수 있다. 개별 아미노산, 특히 인간/돼지 또는 인간/마우스 사이에 동일하지 않은 또는 항체 결합에 기여할 것 같은 것들에 대하여 알라닌 치환하면 저해 항체에 대한 반응성이 감소된 변형된 인자 VIII를 산출할 수 있다.
또한, 면역원성이 되는 것이 더 적은 능력을 가진 아미노산을 잔기 2181-2243의 한정된 부위내에 삽입시키는 전력은 감소된 면역원성을 가지는 변형된 인자 VIII들을 생성한다. 감소된 면역원성 인자 VIII는 혈우병 A 환자를 치료하는데 인자 VIII 보조물로서 자연적-서열 인자 VIII보다 오히려 더 유용하다. 감소된 면역원성 인자 VIII로 치료된 환자는 저해 항체를 덜 발생시키며 따라서 그들의 수명기간동안 치료 효용성이 덜 감소된다.
도 1A-1H는 함께 인간, 돼지 및 마우스 인자 VIII 아미노산 서열의 배열된 서열 비교를 나타낸다. 도 1A는 신호 펩타이드 부위들(인간, SEQ ID NO:40; 돼지, SEQ ID NO: 37, 아미노산 1-19; 무린 (murine), SEQ ID NO:6, 아미노산 1-19)을 비교한다. 도 1A-1H의 아미노산들은 성숙된 단백질의 첫 번 알라닌에서 번호 1로 번호가 매겨지며 신호 펩타이드의 아미노산들은 음수로 할당되어 있다. SEQ ID NO:2내의 인간 fVIII 서열은 또한 성숙된 단백질의 첫 번 알라닌이 아미노산 번호 1로서 매겨져 있는 것으로 시작한다. 마우스 fVIII (SEQ ID NO:6) 및 돼지 fVIII (SEQ ID NO:37)의 아미노산 서열에서, 성숙된 서열의 첫 번 아미노산 (알라닌)은 아미노산 번호 20이다. 도 1A-1H는 인간, 마우스 및 돼지 fVIII의 상응하는 서열을, 가장 큰 아미노산 동일성이 있는 부위가 나란히 세워지도록, 배열한 것을 보여준다. 도 1A-1H에서의 아미노산 번호는 인간 fVIII에만 적용된다. 도 1B는 인간 (SEQ ID NO:2, 아미노산 1-372), 돼지 (SEQ ID NO:37, 아미노산 20-391), 및 쥐 (SEQ ID NO:6, 아미노산 20-391)의 A1 도메인에 대한 아미노산 서열을 보여준다. 도 1C는 인간(SEQ ID NO:6, 아미노산 373-740), 돼지 (SEQ ID NO:37, 아미노산 392-759), 및 마우스 (SEQ ID NO:6, 아미노산 392-759)로부터의 인자 VIII A2 도메인에 대한 아미노산 서열을 보여준다. 도 1D는 인간 인자 VIII (SEQ ID NO:2, 아미노산 741-1648), 돼지 (SEQ ID NO:37, 아미노산 760-1449) 및 마우스 (SEQ ID NO:6, 아미노산 760-1640)의 B 도메인의 아미노산 서열을 제공한다. 도 1E는 인간, 돼지 및 마우스의 인자 VIII 경질 사슬 활성 펩타이드의 아미노산 서열 (각각, SEQ ID NO:2, 아미노산 1649-1689; SEQ ID NO:37, 아미노산 1450-1490; 및 SEQ ID NO:6, 아미노산 1641-1678)을 비교하고 있다. 도 1F는 인간. 돼지 및 마우스 인자 VIII A3 도메인에 대한 서열을 비교하고 있다 (각각, SEQ ID NO:2, 아미노산 1690-2019; SEQ ID NO:37, 아미노산 1491-1820; 및 SEQ ID NO:6, 아미노산 1679-2006). 도 1G는 인간, 돼지 및 마우스의 인자 VIII C1 도메인의 아미노산 서열을 제공한다 (각각, SEQ ID NO:2, 아미노산 2020-2172; SEQ ID NO:37, 아미노산 1821-1973; 및 SEQ ID NO:6,아미노산 2007-2159). 도 1H는 인간, 돼지 및 마우스의 인자 VIII C2 도메인의 서열데이터 (각각 SEQ ID NO:2, 아미노산 2173-2332; SEQ ID NO:37, 아미노산 1974-2133; 및 SEQ ID NO:6, 아미노산 2160-2319)를 제공한다.
다이아몬드는 타이로신 황산화 부위를 나타내며, 잠재적 글리코실화 부위는 굵은 글씨체로 나타나 있고, 인자 IXa, 인지질 및 단백질 C에 대한 제시된 결합 부위는 이중 밑줄되어 있고, 항-A2 및 항-C2 저해 항체를 결합하는 데 결부된 부위는 이탤릭체로 되어 있다. 별표는 보존된 아미노산 서열을 강조하는 것이다. 참조 SEQ ID NO:36 (돼지 인자 VIII cDNA) 및 SEQ ID NO:37 (돼지 인자 VIII의 추론된 아미노산 서열) 참조. 상기 인간 번호매김 시스템을 참조물로 사용한다 [Wood 등 (1984) 상기 문헌 참조]. 상기 A1, A2 및 B 도메인들은 372 및 740 위치에서의 트롬빈 절단 부위 및 1648 에서의 미지의 단백질 절단부위에 의한 잔기 1-372, 373-740 및 741-1648 로서 각각 정의된다 [Eaton, D. L. 등 (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. A3, C1 및 C2 도메인은 각각 잔기 1690-2019, 2020-2172 및 2173-2332로서 정의된다 [Vehar 등 (1984) 상기 문헌 참조]. 트롬빈 (인자 IIa), 인자 IXa, 인자 Xa 및 APC에 대한 절단 부위 [Fay 등 (1991) 상기문헌 참조; Eaton, D. 등 (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. 등 (1992) Blood 80:3120-3128]는 반응성 아르기닌 위에 효소 이름을 표기함으로써 나타나 있다. 산성 펩타이드는 위치 1689에서 트롬빈 또는 인자 Xa에 의해 fVIII 경질 사슬로부터 절단된다. 인자 IXa [Fay, P.J. 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P. J. 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), 인지질 (Foster, P.A. 등 (1990)Blood 75:1999-2004) 및 단백질 C (Walker, F.J. 등 (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489)]에 대한 결합부위는 이중적으로 밑줄이 그어져 있다. 항-A2과 결합하는데 관계된 부위 [Lubin 등 (1994) 상기 문헌 참조; Healey 등 (1995) 상기 문헌 참조] 및 이미 제시되었던 항-C2 저해 항체에 대한 부위가 이탤릭체로 되어 있다. 본 발명에서 설명된 바와 같이 확인된 C2 저해체 (인간 아미노산 2181-2243)은 도 1H에서 단일 밑줄로 그어져 있다. 타이로신 황산화 부위 [Pittman 등 (1992) 상기 참조; Michnick 등 (1994) 상기 참조]는 ◆로 표시되어 있다. 잠재 N-결합 글리코실화 인식 서열 (NXS/T 여기서 X는 프롤린이 아님)이 굵은 글씨체로 나타나 있다.
B 도메인이 결여된 인자 VIII 단백질을 암호화하고 있는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:38로 주어지며 상응하는 추정 아미노산 서열이 SEQ ID NO:39로 제공되어 있다.

Claims (36)

  1. SEQ ID NO:37에 설정된 돼지 인자 VIII의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:36에 설정된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  3. SEQ ID NO:37에 설정된 돼지 인자 VIII의 A1 도메인 아미노산 20-391을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 분리 및 정제된 DNA.
  4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:36에 설정된 위치 58-1173의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  5. SEQ ID NO:37에 설정된 돼지 인자 VIII의 A3 도메인 아미노산 1491-1820을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA.
  6. 제 5 항에 있어서, SEQ ID NO:36에 설정된 위치 4471-5460의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  7. SEQ ID NO:37에 설정된 돼지 인자 VIII의 C1 도메인 아미노산 1821-1973을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA.
  8. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO:36에 설정된 위치 5461-5919의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  9. SEQ ID NO:37에 설정된 돼지 인자 VIII의 C2 도메인 아미노산 1974-2133을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA.
  10. 제 9 항에 있어서, SEQ ID NO:36에 설정된 위치 5920-6399의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:39에 설정된 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  12. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:38에 설정된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  13. 돼지 인자 VIII 암호화 DNA의 치환체를 포함하는 인간/돼지 하이브리드 인자 VIII를 암호화하는 DNA에서, 아미노산 번호 2181-2243를 암호화하고 있는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:37의 아미노산 1982-2044를 암호화하는 뉴클레오타이드에 의해 치환되어 있는 DNA.
  14. 제 13 항에 있어서, 인간 인자 VIII 암호화 DNA는 SEQ ID NO:36의 뉴클레오타이드 5944-6132인 것을 특징으로 하는 DNA.
  15. SEQ ID NO:37의 아미노산 20-2133을 암호화하는 코돈들을 포함하는, 돼지 인자 VIII를 암호화하는 DNA.
  16. 제 15 항에 있어서, SEQ ID NO:36의 뉴클레오타이드 58-6399의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA.
  17. SEQ ID NO:39의 아미노산 20-1443을 암호화하는 코돈을 포함하는, B-도메인 결여 돼지 인자 VIII를 암호화하는 DNA.
  18. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO:38의 뉴클레오타이드 60-4331의 서열을 가지는 DNA.
  19. 제 17 항의 DNA의 분리 및 정제된 단백질 발현 산물.
  20. 제 18 항의 DNA의 분리 및 정제된 단백질 발현 산물
  21. SEQ ID NO:2에 따른 위치 2181-2243 중 하나 이상에서 아미노산 치환체를 포함하는 바, 치환체는 자연 발생적인 아미노산대신 면역반응성을 감소시키는 아미노산의 삽입물인, 응혈촉진성을 가지는 변형 인간 인자 VIII.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 치환체는 SEQ ID NO:2에 따른 위치 2181, 2182, 2195, 2196, 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224, 2225, 2226, 2227, 2228, 2234, 2238, 또는 2243 중 하나 이상에서 만들어진 것을 특징으로 하는 변형 인자 VIII.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 치환체는 위치 2181, 2195, 2196, 2207, 2226, 2227, 2228, 및 2234 중 하나 이상에서 만들어진 것을 특징으로 하는 변형 인자 VIII.
  24. SEQ ID NO:2에 따른 아미노 산 번호 2181-2243내의 적어도 하나의 위치에서 자연 발생 아미노산 대신에 면역반응성-저하 아미노산을 치환하는 것을 포함하는, 저해 항체에 대한 반응성을 감소시키고 응혈촉진 활성은 유지되게 하는 인자 VIII을 변형시키는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 아미노산 번호 2181-2243 내에 아미노산 치환체를암호화하도록 변형된 적어도 하나의 코돈을 가지는, 변형 인자 VIII를 암호화하는 DNA를 발현시킴으로써, SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 번호 2181-2243 내에 아미노산이 치환되는, 인자 VIII을 변형시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 면역반응성-감소 아미노산은 알라닌, 메티오닌, 루이신, 세린 또는 글리신인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 면역반응성 감소 아미노산은 알라닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 면역반응성 감소 아미노산의 치환이 SEQ ID NO:2에 따른 위치 번호 2181, 2182, 2195, 2196, 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224, 2225, 2226, 2227, 2228, 2234, 2238, 또는 2243 중 적어도 하나에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. SEQ ID NO:37에 설정된, 적어도 아미노산 20-2133을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 배양 배지내의 적절한 포유동물 숙주 세포에 발현시키고 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 인자 VIII 단백질을 정제하는 것을 포함하는 돼지 인자 VIII를 제조하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 DNA는 적어도 뉴클레오타이드 58-6399를 포함하는, 본질적으로 SEQ ID NO:36에 설정된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO:37에 설정된 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO:36에 설정된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. SEQ ID NO:39에 설정된, 적어도 아미노산 20-1443을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 배양 배지내의 적절한 포유동물 숙주 세포에 발현시키고 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 인자 VIII 단백질을 정제하는 것을 포함하는 B-도메인 결여 돼지 인자 VIII를 제조하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 DNA는 적어도 뉴클레오타이드 60-4331를 포함하는, 본질적으로 SEQ ID NO:38에 설정된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO:39에 설정된 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO:38에 설정된, 뉴클레오타이드 번호 3에서 뉴클레오타이드 번호 4331까지의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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