CZ300959B6

CZ300959B6 - DNA kódující faktor VIII, proteinový produkt exprimovaný touto DNA a zpusob prípravy faktoru VIII

Info

Publication number: CZ300959B6
Application number: CZ20003282A
Authority: CZ
Inventors: S. Lollar@John
Original assignee: Emory University
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2009-09-23
Also published as: HUP0101317A2; US6180371B1; NZ506771A; NO20004497L; WO1999046274A1; JP2002506076A; PL342887A1; IL138281A; CN1224627C; CA2322508A1; CN1297452A; HUP0101317A3; EP1062224A4; EP1062224A1; KR20010082521A; IL138281A0; AU2995699A; CZ20003282A3; NO20004497D0; AU747644B2

Abstract

Aminokyseliny ve specifických místech lidského faktoru VIII vytvárejí interakce s inhibicními protilátkami u pacientu s hemofilií, u kterých se vytvorily tyto protilátky po lécení faktorem VIII. Vynález poskytuje modifikovaný faktor VIII, kde je provedena substituce aminokyseliny v jednom nebo nekolika specifických místech. Modifikovaný faktor VIII není inhibován inhibicními protilátkami namírenými proti epitopum domén A2 nebo C2. Modifikovaný faktor VIII je užitecný pro jedince trpící hemofilií, aby se zabránilo vzniku nebo pusobení inhibicních protilátek.

Description

DNA kódující faktor VIII, proteinový produkt exprímovaný touto DNA a způsob přípravy faktoru Vlil s Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká hybridního faktoru Vlil, který má aminokyselinovou sekvenci lidského a zvířecího faktoru Vlil, nebo má lidskou aminokyselinovou sekvenci faktoru Vlil a sekvenci jinou než sekvenci faktoru Vlil, a také se týká způsobu přípravy a použití tohoto io faktoru.

Dosavadní stav techniky

Koagulace (srážení) krve začíná tím, že se destičky prichycují na řez ve stěně poraněné krevní cévy v místě poškození. Pak jsou v kaskádě enzymaticky regulovaných reakcí rozpustné molekuly fibrinogenu přeměněny působením enzymu trombinu na nerozpustné řetězce fibrinu, které drží destičky pohromadě ve sraženině. V každém kroku této kaskády je proteinový prekurzor přeměněn na proteázu, která štěpí následující proteinový prekurzor v řadě. Ve většině kroků jsou nutné kofaktory.

Faktor Vlil cirkuluje jako inaktivní prekurzor v krvi, vázaný těsně a nekovalentním způsobem na von Willebrandův faktor. Faktor Vlil je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a aktivuje jeho prokoagulační funkce v kaskádě.

Ve své aktivní formě je proteinový faktor Vlila kofaktorem, který zvyšuje katalytickou účinnost faktoru lXa pro aktivaci faktoru X až o několik řádů.

Lidé s nedostatkem faktoru VIII nebo s protilátkami proti faktoru VIII, kteří nejsou léčeni faktorem Vlil, trpí nekontrolovatelným vnitřním krvácením, které způsobuje celou řadu vážných symptomů od zánětlivých reakcí v kloubech až po předčasná úmrtí. Lidé trpící silnou hemofilií (hemofilici), kterých je v USA asi 10 000, mohou být léčeni infuzemi lidského faktoru VIII, který obnoví normální koagulační schopnost krve, pokud je podáván v dostatečném množství a frekvenci. Klasická definice faktoru VIII je skutečně taková, že je to látka přítomná v normální krevní plazmě, která opraví defekty srážlivosti v plazmě pocházející z jedinců trpících hemofilií A.

Rozvoj protilátek (inhibičních protilátek neboli inhibitorů), které inhibují aktivitu faktoru Vlil, je vážnou komplikací při léčení pacientů trpících hemofilií. Autoprotilátky se vyvíjejí asi u 20 % pacientů s hemofilií A jako reakce na terapeutické infúze faktoru VIII. U dříve neléčených pacientů s hemofilií A, kteří tvoří inhibitory, se inhibitor vyvine přibližně za jeden rok léčení.

4o Navíc autoprotilátky, které inaktivují faktor Vili, se příležitostně vyvíjejí i u jedinců s předtím normální hladinou faktoru VIII. Když je titr inhibitoru dostatečně nízký, lze zvládat potíže zvyšujícími se dávkami faktoru VIU. Avšak často je titr inhibitoru tak vysoký, že ho nelze překonat dávkami faktoru VIII. Alternativní strategií je obejít potřebu faktoru VIII v průběhu normální hemostázy užitím komplexních přípravků faktoru IX (např. KONYNE®, Proplex®) nebo rekombinantním lidským faktorem Vlila. Navíc jelikož prasečí faktor VIII má obvykle podstatně nižší reaktivitu s inhibitory než lidský faktor VIII, užívá se přípravek obsahující částečně purifikovaný prasečí faktor Vílí ((HYATEC®). Mnoho pacientů, u kterých se vyvinuly inhibiční protilátky k lidskému faktoru Vili, bylo úspěšně léčeno prasečím faktorem VIII, a tolerovalo tuto léčbu po dlouhý čas. Avšak podávání prasečího faktoru VIII není úplné řešení, neboť i na prasečí faktor VIII se po jedné nebo několika infuzích mohou vyvinout inhibitory.

Několik přípravků faktoru VIII získaného z plazmy různé čistoty je komerčně dostupných pro léčení hemofilie A. Patří k nim částečně purifíkovaný faktor VIII získaný z plazmy sloučené z několika dárců, která je ošetřena tepelně a také detergentem proti virům, ale obsahuje značné množství antigenních proteinů, faktor VIII purifíkovaný pomocí monoklonálních protilátek, který obsahuje nízkou hladinu antigenních nečistot a virových kontaminací, a nakonec rekombinantní lidský faktor Vlil, který je nyní klinicky zkoušen. Naneštěstí je lidský faktor VIII za fyziologických koncentrací a pH nestabilní, je přítomen v krvi v mimořádně nízké koncentraci (0,2 pg/ml plazmy) a má velmi nízkou specifickou koagulační aktivitu.

Hemofilici vyžadují denní náhradu faktoru Vlil, aby se zabránilo krvácení a výsledné deformující artropatii hemofiliků. Avšak dodávky jsou nedostatečné a objevují se problémy při terapeutickém použití v důsledku obtíží při izolaci a purifikaci, imunigenicity, a také nutnosti odstranit riziko infekce AIDS a hepatitidy. Avšak ani použití rekombinantního lidského faktoru ιο VIII nebo částečně purifikovaného prasečího faktoru VIII neřeší zcela tyto problémy.

Problémy spojené s všeobecně užívanými komerčně dostupnými přípravky faktoru VIII získanými z plazmy stimulovaly významný zájem na vývoji lepšího přípravku faktoru VIII. Existuje potřeba účinnější molekuly faktoru Vlil, tak aby jedna molekula poskytla více koagulační aktivity, aby přitom tato molekula faktoru VIII byla stabilní při vybraném rozsahu pH a fyziologických koncentracích, aby dále měla sníženou schopnost indukovat tvorbu inhibičních protilátek a ještě navíc, aby tato molekula faktoru VIII unikla rozpoznání imunitním systémem pacienta, který již vyvinul protilátky proti lidskému faktoru VIII.

Předkládaný vynález proto poskytuje faktor VIII, který napravuje hemofilii u pacientů s deficitem faktoru VIII nebo s inhibitory faktoru VIII.

Předkládaný vynález se dále týká léčení hemofilie.

Vynález také poskytuje faktor VIII, který je stabilní při vybraném pH a fyziologické koncentraci.

Předkládaný vynález poskytuje faktor VIII, který má vyšší koagulační aktivitu než lidský faktor

VIII.

A dále vynález poskytuje faktor VIII, proti kterému se tvoří méně protilátek.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou purifikovanou hybridní molekulu faktoru VIII a její fragmenty s koagulační aktivitou, včetně hybridního faktoru VIII, který má aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII odvozenou z člověka a prasete nebo jiného savce odlišného od člověka (dále označovaného stručně jako „zvíře“). A také, ve druhém provedení vynálezu, včetně hybridního ekvivalentu faktoru VIII, který má aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII odvozenou z člověka nebo zvířete nebo obou a aminokyselinovou sekvenci, která nemá žádnou sekvenční identitu s faktorem VIII (aminokyselinová sekvence jiná než sekvence faktoru VIII), výhodně substituovanou v antigenním a/nebo imunogenním úseku faktoru VIII, Odborník sezná, že na základě předkládaného vynálezu je možno připravit četné konstrukty hybridního faktoru VIII, jako je např, (přičemž tento výčet není omezující) lidský/zvířecí faktor Vílí s vyšší koagulační aktivitou než má lidský faktor VIII („vyšší koagulační aktivita“), neimonogenní lidský/ekvivalentní faktor VIII, neantigenní lidský/ekvivalentní faktor VIII nebo lidský/zvířecí faktor Vlil, neimunogenní lidský/zvířecí nebo lidský/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu, neantigenní lidský/zvířecí nebo lidský/zvířecí/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu, neantigenní neimunogenní lidský/ekvivalentní a/nebo lidský/zvířecí/ekvivalentní faktor VIII, a neantigenní neimunogenní lidský/zvířecí/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu.

Molekula hybridního faktoru VIII je připravena izolací a rekombinaci podjednotek nebo domén lidského a zvířecího faktoru VIII, nebo metodami genového inženýrství z genů lidského a zvířecího faktoru VIII.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou metody genového inženýrství užity k náhradě elementů lidského faktoru Vílí příslušnými elementy zvířecího faktoru VIII, čímž vznikne hybridní molekula lidského/zvířecího faktoru Vlil. V druhém výhodném provedení vynálezu jsou metody genového inženýrství užity k nahrazení jedné nebo několika aminokyselin v lidském nebo zvířecím faktoru VIII nebo v hybridním lídském/zvířecím faktoru VIII aminokyselinami, které nemají známou sekvenční identitu s faktorem VIII, výhodně sekvencí amino5 kyselin, která má menší ímunoreaktivitu s přirozeně se vyskytujícími inhibičními protilátkami proti faktoru Vlil (neantigenní aminokyselinové sekvence) a/nebo je méně náchylná k vyvolání tvorby protilátek proti faktoru VIII (neimunogenní aminokyselinová sekvence) než sekvence lidského faktoru VIII. Příkladem aminokyselinové sekvence, která může být užita k nahrazení imunogenní nebo antigenni sekvence je sekvence alaninových zbytků.

Alternativně, jedna nebo několik domén nebo částečných domén faktoru VIII jsou izolovány a purifikovány z lidské nebo zvířecí plazmy a hybridní lidský/zvířecí faktor VIII se připraví smícháním domén nebo částečných domén z jednoho druhu s doménami nebo částečnými doménami druhého druhu. Hybridní molekuly se pak izolují iontovou výměnnou chromatografií.

Vynález popisuje způsoby přípravy vysoce purifikovaného faktoru VIII, které obsahují následující kroky:

a) izolace podjednotek lidského faktoru VIII získaného z plazmy a izolace podjednotek zvířecího faktoru VIII získaného z plazmy, po které následuje rekonstituce koagulační aktivity smícháním lidských a zvířecích podjednotek, a dále následuje izolace hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII iontovou výměnnou hromatografií,

b) izolace domén nebo částečných domén lidského faktoru VIII získaného z plazmy a domén nebo částečných domén zvířecího faktoru VIII získaného z plazmy, po které následuje rekonstituce koagulační aktivity smícháním lidských a zvířecích domén, a dále následuje izolace hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII iontovou výměnnou chromatografií,

c) konstrukce domén nebo částečných domén zvířecího faktoru VIII technologií rekombinantní DNA a rekombinantní výměna domén zvířecího a lidského faktoru VIII, aby vznikla hybridní molekula lidského/zvířecího faktoru VIII s koagulaění aktivitou,

d) vytvoření hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII nahrazením specifických amino30 kyselinových zbytků faktoru VIII jednoho druhu odpovídajícími jedinečnými aminokyselinovými zbytky faktoru VIII druhého druhu, nebo

e) vytvoření hybridního ekvivalentu molekuly faktoru VIII mající lidskou nebo zvířecí aminokyselinovou sekvenci nebo obě, kde specifické aminokyselinové zbytky faktoru VIII jsou nahrazeny aminokyselinovými zbytky, které nemají žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, metodou místně cílené mutageneze.

Stanovení celé DNA sekvence kódující prasečí faktor VIII, která je zde uvedena, poprvé umožnilo syntézu prasečího faktoru VIII plné délky expresí DNA kódující prasečí faktor VIII ve vhodné hostitelské buňce. Purifikovaný rekombinantní prasečí faktor VIII je proto jedním aspektem předkládaného vynálezu. DNA kódující každou z domén prasečího faktoru VIII stejně tak jako každý její specifický fragment mohou být podobně exprimovány, buďto samostatně, nebo v kombinaci s DNA kódující lidský faktor VIII, čímž se vytvoří hybridní lidský/zvířecí faktor VIII popsaný v předkládaném vynálezu. Kromě toho prasečí faktor VIII (fVIII) mající deletovanou (odstraněnou) celou nebo část B-domény (prasečí fVIII bez B domény) je dostupný jako další aspekt předkládaného vynálezu, a sice užitím exprese DNA kódující prasečí fVIII, která má deleci jednoho nebo několika kodonů v B-doméně.

Některá provedení hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII podle předkládaného vynálezu mají specifickou aktivitu vyšší než prasečí faktor VIII. Některá provedení hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII mají stejnou nebo nižší ímunoreaktivitu s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII a/nebo menší imunogenicitu pro člověka nebo zvíře, ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Ί

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro léčení pacientů trpících deficiencí faktoru Vlil, který obsahuje hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor Vlil.

Popis obrázků

Obrázky IA až IH společně poskytují porovnání sekvencí nukleových kyselin lidského, prasečího a myšího faktoru VIII.

Podrobný popis vynálezu

Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín „faktor VIII“ v předkládané přihlášce označuje jakoukoliv funkční proteinovou molekulu faktoru VIII z jakéhokoliv zvířete, jakýkoliv hybridní faktor VIII nebo modifikovaný faktor VIII, termíny „hybridní faktor VIII“ nebo „hybridní protein“ označují jakoukoliv funkční proteinovou molekulu faktoru VIII nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII člověka, prasete a/nebo jiného druhu savce kromě člověka nebo prasete. K takovým kombinacím patří (přičemž tento výčet není omezující) jakýkoliv z hybridních molekul faktorů VIII nebo jejich fragmentů: 1) lidská/prasečí, 2) lidská/savčí kromě lidské a prasečí, jako např. lidská/myší, 3) prasečí/savčí kromě lidské a prasečí, jako např. myší/psí. K takovým kombinacím patří také např. hybridní ekvivalentní molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty, jak budou definovány dále, obsahující aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII hybridního, lidského, prasečího, savčího jiného než lidského, savčího jiného než prasečího původu, kde byla provedena substituce sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII. K takovým hybridním kombinacím patří také aminokyselinová sekvence faktoru Vlil odvozená z více než dvou druhů, jako je např. lidská/prasečí/myší, nebo ze dvou a více druhů, kde byla provedena substituce sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII. Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín „hybridní faktor VIII“ zahrnuje i fragmenty hybridního faktoru VIII, které mohou být užity, jak bude popsáno dále v jednom provedení vynálezu, jako sondy pro výzkumné účely nebo jako diagnostická činidla.

Termín „savčí faktor VIH“ v tomto popisu zahrnuje faktor VIII s aminokyselinovou sekvencí odvozenou z kteréhokoliv savce kromě člověka. Termín „zvíře“ zde označuje prase a jakéhokoliv jiného savce kromě člověka.

Termín „fúzní protein“ nebo „fúzní faktor VIII nebo jeho fragment“ označují produkt hybridního genu, kde je kódující sekvence projeden protein extenzivně změněna, např. fúzí její části s kódující sekvencí druhého proteinu z jiného genu, aby vznikl hybridní gen, který kóduje fúzní protein.

Fúzní protein je tedy v tomto popisu podsoubor celého souboru hybridních proteinů faktoru VIII zde popisovaných.

„Odpovídající“ sekvence nukleové kyseliny, nebo aminokyselinová sekvence nebo obě, je sekvence přítomná v místě molekuly faktoru VIII nebo hybridního faktoru VIII nebo jeho frag40 mentu, které má stejnou strukturu a/nebo funkci jako místo molekuly faktoru VIII jiného druhu, ačkoliv počet nukleotidů nebo aminokyselin nemusí být nutně identický. Sekvence „odpovídající“ jiné sekvenci faktoru VIII v podstatě odpovídá takové sekvenci, a hybridizuje za stringentních podmínek s takovou sekvencí, která je uvedena v tomto popisu vynálezu. Sekvence „odpovídající“ jiné sekvenci faktoru VIII zahrnuje také sekvenci, která vede k expresi faktoru VIII nebo hybridního prokoagulačního faktoru podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragmentu a hybridizovala by se sekvencí podle vynálezu nebýt redundance v genetickém kódu.

„Jedinečná“ aminokyselina nebo aminokyselinový zbytek nebo aminokyselinová sekvence znamená aminokyselinovou sekvenci nebo zbytek v molekula faktoru VIII jednoho druhu, která so je odlišná od homologního zbytku nebo sekvence v molekule faktoru VIII jiného druhu.

„Specifická aktivita“ označuje aktivitu, která napraví koagulační defekt v plazmě s nedostatkem lidského faktoru VIII. Specifická aktivita je měřena v jednotkách srážlivosti krve na miligram celkového proteinu faktoru VIII ve standardním testu, kde se koagulační čas lidské plazmy deficitní na faktor VIII srovnává s koagulačním časem normální lidské plazmy. Jedna jednotka aktivity faktoru VIII je aktivita přítomná v jednom mililitru normální lidské plazmy. V testu čím je kratší čas vytvoření sraženiny tím větší je aktivita faktoru VIII, který je testován. Hybridní lidský/prasečí faktor VIII projevuje koagulační aktivitu v testu na lidský faktor Vlil. Tato aktivita, stejně jako aktivita ostatních molekul hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, je menší, shodná nebo i větší než aktivita faktoru VIII získaného z plazmy nebo rekombinantního faktoru VIII.

Nukleotidová sekvence cDNA lidského faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence td. č. 1 a sekvence id. č. 2. Faktor Vlil je syntetizován jako jednořetězcový protein přibližné velikosti 300 kDa s vnitrní sekvenční homologií, která definuje sekvenci „domény“ NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. V molekule faktoru VIII termín „doména“ označuje souvislou sekvenci aminokyselin, která je definována vnitřní aminokyselino15 vou identitou a místy proteolytického štěpení trombinem. Pokud není uvedeno jinak, domény faktoru VIII zahrnují následující aminokyselinové zbytky, když je sekvence přiřazena aminokyselinové sekvenci lidského faktoru VIII (sekvence id. č. 2): Al, zbytky Alal-Arg372, A2, zbytky Ser373-Arg740, B, zbytky Ser741-Argl648, A3, zbytky Serl690-Ile2032, Cl, zbytky Arg2033-Asn2172, C2, zbytky Ser2173-Tyr2332. Sekvence A3-C1-C2 zahrnuje zbytky

Serl690-Tyr2332. Zbývající sekvence, zbytky Glu 1649-Arg 1689, je označována obvykle jako lehký řetězec aktivačního peptidu faktoru VIII. Faktor VIII je proteoíyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a vytváří faktor Vlila, který má prokoagulační funkci. Biologická funkce faktoru Vlila je zvyšovat katalytickou účinnost faktoru ÍXa pro aktivaci faktoru X o několik řádů. Trombinem aktivovaný faktor Vlila je hetero25 trimer A1/A2/A3-C1-C2 velikosti 160 kDa, který tvoří komplex s faktorem IXa a faktorem X na povrchu destiček nebo monocytů. Termín „částečná doména“ označuje v popisu předkládaného vynálezu souvislou sekvenci aminokyselin tvořící část domény.

„Podjednotky“ lidského a zvířecího faktoru VIII jsou těžké a lehké řetězce proteinu. Těžký řetězec proteinu obsahuje tři domény, Al, A2 a B. Lehký řetězec faktoru VIII obsahuje také tři domény, a sice A3, C1 a C2,

Hybridní faktor VIII nebojeho fragment může být připraven:

1) nahrazením lidských nebo zvířecích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími zvířecími nebo lidskými podjednotkami izolovaných z plazmy,

2) nahrazením lidských nebo zvířecích domén (Al, A2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími zvířecími nebo lidskými doménami,

3) nahrazením částí lidských nebo zvířecích domén částmi zvířecích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídajících lidských nebo zvířecích aminokyselin alespoň jednou specific40 kou sekvencí obsahující jednu nebo několik jedinečných zvířecích nebo lidských aminokyselin, nebo

5) nahrazením alespoň jedné sekvence zahrnující jednu nebo několik specifických aminokyselin v lidském, zvířecím nebo hybridním faktoru VIII nebo jeho fragmentu aminokyselinovou sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII.

„Hybridní faktor VIII bez B-domény“, „hybridní ekvivalentní faktor VIII“ nebo jejich fragmenty jsou jakékoliv faktory VIII popisované v této přihlášce postrádající B-doménu nebo jejich fragmenty.

Termíny „epitop“, „antigenní místo“ a „antigenní determinanta“ jsou užívány v tomto popisu jako synonyma a definují úsek lidského, zvířecího, hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII nebojeho fragmentu, který je specificky rozpoznáván protilátkou. Obsahuje jakýkoliv počet aminokyselin a je závislý na primární, sekundární i terciární struktuře proteinu. Ve

smyslu předkládaného vynálezu, hybridní faktor Vlil, ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jejich fragmenty, které obsahují alespoň jeden epitop, mohou být užity jako diagnostická činidla v testech, které budou popsány dále. V některých provedeních předkládaného vynálezu není hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jejich fragment křížově reaktivní neboje méně křížově reaktivní s přirozeně se vyskytujícími protilátkami inhibujícími faktor VIII ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem Vlil.

Termín „imunogenní místo“ je definován jako úsek lidského nebo zvířecího faktoru VIII, hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru Vílí nebo jejich fragmentu, které specificky vyvolá tvorbu protilátek proti lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII, hybridnímu nebo ekvivalentnímu hybridnímu faktoru Vlil nebo jejich fragmentu u člověka nebo zvířete, jak se dá zjistit rutinním testem, jako je např. radioimunotest, ELISA nebo test „Bethesda“ popsaný v předkládaném vynálezu. Obsahuje jakýkoliv počet aminokyselin a je závislý na primární, sekundární í terciární struktuře proteinu. V některých provedeních předkládaného vynálezu není hybridní nebo ekviva15 lentní hybridní faktor VIII nebo jejich fragment imunogenní nebo je méně imunogenní pro člověka nebo zvíře ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Termíny „molekula hybridního faktoru VIII nebo její fragment“ nebo „hybridní faktor VIII nebo jeho fragment“ a „ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment“ označují aktivní faktor

VIII nebo molekulu hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty, kde alespoň jedna sekvence obsahující jeden nebo několik specifických aminokyselinových zbytků lidského nebo zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmentu byla nahrazena alespoň jednou sekvenci obsahující jeden nebo několik aminokyselinových zbytků, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII. Sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII je označována také jak „aminokyselinová sekvence odlišná od faktoru VIII“. Ve výhodném provedení je aminokyselinová sekvence, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, sekvence slaninových zbytků. V jiném výhodném provedení vynálezu specifická sekvence faktoru VIII, která je nahrazena sekvencí bez známé sekvenční identity s faktorem VIII, obsahuje antigenní místo, které je imunoreaktivní s přirozeně se vyskytujícími inhibičními protilátkami proti faktoru VIII, takže výsledná ekvivalentní hybridní molekula faktoru VIII nebo její fragment jsou méně imunoreaktivní nebo vůbec nereagují s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII. Ještě v dalším výhodném provedení specifická sekvence faktoru VIII, která je nahrazena sekvencí bez známé sekvenční identity s faktorem VIII, obsahuje imunogenní místo, které vyvolává tvorbu inhibičních protilátek proti faktoru VIII u člověka nebo zvířete, takže výsledná molekula ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo její fragment jsou méně imunogenní.

„Deficience faktoru VIII“ nebo „nedostatek faktoru VIII“ označují nedostatečnou srážlivost způsobenou tvorbou defektního faktoru VIII, nedostatečnou či nulovou tvorbou faktoru VIII nebo částečnou Či Úplnou inhibici faktoru VIII inhibičními faktory. Hemofilie A je typ deficience faktoru VIII, který je důsledkem poruchy X-vázaného genu a nepřítomnosti nebo nedostatku proteinu faktoru VIII, který je tímto genem kódován.

„Diagnostický test“ označuje testy, které nějakým způsobem využívají interakce antigen-proti45 látka pro detekci a/nebo kvantifikaci množství konkrétní protilátky, která je přítomna v testovaném vzorku jako pomocný prostředek k výběru vhodné terapie. DNA hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru Vlil nebo její fragment, nebo příslužný protein z ní exprimovaný mohou být použity k nahrazení odpovídajících reakčních činidel v dosud známých testech, přičemž modifikovaný test se užije k detekci a kvantifikaci protilátek proto faktoru VIII. Je to právě užití těchto činidel, a sice DNA hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejího fragmentu, nebo příslužného proteinu z ní exprimovaného, které dovolují modifikovat dosud známé testy pro detekci protilátek proti lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII nebo hybridnímu lidskému/zvířecímu faktoru VIII. K takovým testům patří, aniž by výčet byt limitující, ELISA test, imunodifúzní test a imunopřenos („imunoblot“). Metody vhodné k provádění těchto testů jsou odborníkům dostatečně známy. Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment, který obsahuje alespoň jeden epitop proteinu, může být užit jako diagnostické činidlo. Příklady testů, kde se užívá hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment jsou test „Bethesda“ a antikoagulační test,

Obecný popis použitých postupů

Patent US 5 364 771 popisuje novou molekulu hybridního lidského/prasečího faktoru Vlil s koagulační aktivitou, ve které byly určité prvky molekuly lidského nebo zvířecího faktoru Vlil nahrazeny odpovídajícími prvky molekuly faktoru VIII jiného druhu. Patent US 5 663 060 a io přihláška WO 95/24427 popisují prokoagulační hybridní lidský/zvířecí ekvivalentní faktor VIII, kde byly určité prvky molekuly faktoru VIII jednoho druhu nahrazeny odpovídajícími prvky molekuly faktoru VIII jiného druhu.

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířectho, zvířecího/zvířecího a ekvivalentního faktoru Vlil a jejich fragmenty, a dále nukleovou kyselinu kódující takové hybridní molekuly, z nichž některé mají větší koagulační aktivitu ve standardních koagulaČních testech než vysoce purifikovaný lidský faktor VIII a/nebo jsou méně imunoreaktivní s inhibičními protilátkami proti lidskému nebo prasečímu faktoru VIII než lidský nebo prasečí faktor VIII a/nebo jsou méně imunogenní pro Člověka nebo zvíře než lidský nebo prasečí faktor VIII. Tyto hybridní molekuly faktoru VIII lze zkonstruovat užitím následujících postupů.

Předkládaný vynález popisuje přinejmenším pět typů aktivních molekul hybridního lidského/prasečího nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty a sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto hybridní faktory VIII a také způsoby jejich přípravy:

1) nahrazením lidských nebo prasečích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími prasečími nebo lidskými podjednotkami,

2) nahrazením jedné nebo několika lidských nebo prasečích domén (Al, A2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími prasečími nebo lidskými doménami,

3) nahrazením souvislé části jedné nebo několika lidských nebo prasečích domén odpovídají30 čími částmi prasečích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídajících lidských nebo prasečích sekvencí alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jeden nebo několik jedinečných aminokyselinových zbytků lidského nebo prasečího faktoru VIII, nebo

5) nahrazením alespoň jedné specifické sekvence obsahujících jednu nebo několik amino kyselin v lidském, prasečím nebo hybridním lidském/prasečím faktoru VIII alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo několik aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII (tj. aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru Vlil).

Stejnými postupy lze připravit přinejmenším pět typů aktivních molekul hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty a sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto hybridní faktory Vlil a také způsoby jejich přípravy:

1) nahrazením lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími savčími jinými než lidskými a prasečími nebo lidskými podjednotkami,

2) nahrazením jedné nebo několika lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích domén (Al, A.2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími prasečími nebo lidskými doménami,

3) nahrazením souvislé části jedné nebo několika lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích domén odpovídajícími částmi savčích jiných než lidských a prasečích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídajících lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích sekvencí alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jeden nebo několik jedinečných aminokyselinových zbytků lidského nebo savčího jiného než lidského a prasečího faktoru Vlil, nebo

5) nahrazením alespoň jedné specifické sekvence obsahující jednu nebo několik aminokyselin v lidském, savčím jiném než lidském a prasečím nebo hybridním lidském/savčím jiném než lidském faktoru Vlil alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo několik aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem Vlil (tj. aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru VIII).

io

Dále je odborníkovi ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě alespoň pěti typů aktivních molekul hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, které odpovídají typům uvedeným v bodech 1 až 5 ve dvou předcházejících odstavcích, kdy hybridní faktor VIII obsahuje aminokyselinové sekvence faktoru VIII ze dvou nebo více savců vyjma člověka, např. hybridní prasečí/myší faktor VIII, a dále obsahuje aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII.

Hybridní lidské/zvířecí, zvířecí/zvířecí a ekvivalentní molekuly faktoru Vlil nebo jejich fragmenty uvedené pod body 1 až 3 se připravují izolací podjednotek, domén nebo souvislých Částí domén z faktoru VIII získaného z plazmy, po které následuje rekonstituce a purifikace. Hybridní lidské/zvířecí, zvířecí/zvířecí a ekvivalentní molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty uvedené pod body 3 až 5 se připravují technikami rekombinantní DNA (tj, genového inženýrství). Hybridní molekuly mohou obsahovat menší či větší procento lidské sekvence ve srovnání se zvířecí sekvencí, v závislosti na původu jednotlivých úseků, jak bude popsáno ještě podrobněji dále.

Jelikož současné údaje ukazují, že B doména nemá žádný inhibiční epitop a nemá žádný známý vliv na funkci faktoru Vlil, v některých provedeních předkládaného vynálezu je B doména odstraněna z aktivního hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jeho fragmentu (faktor VIII je pak označován jako „B (-) faktor VIII“) připraveného způsoby podle vynálezu.

V příkladu 4 je ukázáno, že hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující prasečí těžký řetězec a lidský lehký řetězec, který odpovídá prvnímu typu hybridů uvedených výše, má větší specifickou koagulační aktivitu ve standardním koagulačním testu než lidský faktor VIII. Hybridní íidský/zvířecí nebo ekvivalentní faktor VIII, ať již má vyšší, stejnou nebo nižší aktivitu než lidský faktor VIII, je užitečný pro léčení pacientů s tvorbou inhibitorů, neboť tyto inhibitory reagují méně s hybridním nebo ekvivalentním faktorem VIII než s původním lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Příprava molekuly hybridního faktoru VIII rekonstitucí izolovaných podjednotek lidského a zvířecího faktoru VIII

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmenty, sekvence nukleových kyselin kódující tyto hybridní molekuly a způsoby jejich přípravy a izolace a dále metody pro charakterizaci jejich koagulační aktivity. Jedna z metod, která je modifikovaným postupem publikovaným Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 265: 6197, 1990 a Lollar, J.S. et al., J. Biol. Chem. 263; 10451, 1988, obsahuje izolaci podjednotek (tj, těžký řetězec a lehký řetězec) lidského a zvířecího faktoru VIII, po které následuje rekombinace lidského těžkého řetězce a zvířecího lehkého řetězce nebo lidského lehkého řetězce a zvířecího těžkého řetězce.

Izolace jak lidských, tak í zvířecích jednotlivých podjednotek zahrnuje disociaci dimeru těžký řetězec/lehký řetězec. To lze provést např. chelatací vápníku pomocí kyseliny etylendiamnitetraoctové (EDTA) následované monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ), Hybridní

CZ 300959 Bó molekuly lidského/zvířecího faktoru VHI se pak rekonstituují z izolovaných podjednotek v přítomnosti vápníku. Hybridní faktory VIII lidský lehký řetězec/zvířecí těžký řetězec nebo zvířecí těžký řetězec/lidský lehký řetězec jsou izolovány od nezreagovaných těžkých řetězců pomocí postupu monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) pro izolaci prasečího faktoru VIII, jak byl popsán v Lollar, J.S. etal., Blood 71: 137-143,1988.

Tyto metody, které byly použity v jednom provedení předkládaného vynálezu k přípravě aktivního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII (což je popsáno v následujících příkladech) poskytly aktivní hybridní molekulu faktoru VIII lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, která io vykazovala více než šestkrát vyšší prokoagulaění aktivitu než lidský faktor VIII.

Jiné hybridní molekuly faktoru VIII, např. lidské/savčí jiné než lidské a prasečí, lze připravit, izolovat a charakterizovat stejným způsobem. Dále je odborníkovi ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě, izolaci a charakterizaci aktivity hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, jako je např. hybridní prasečí/myší faktor VIII, který obsahuje lehký řetězec nebo těžký řetězec jednoho biologického druhu kombinovaný s těžkým řetězcem nebo lehkým řetězcem jiného druhu.

Příprava molekuly hybridního faktoru VIII rekonstitucí izolovaných domén lidského a zvířecího faktoru VIII

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII se substitucemi domén nebo jejich fragmenty, sekvence nukleových kyselin kódující tyto hybridní molekuly a způsoby jejich přípravy a izolace a dále metody pro charakterizaci jejich koagulační aktivity.

Jedna z metod obsahuje izolaci jedné nebo několika domén lidského a jedné nebo několika domén zvířecího faktoru VIII, po které následuje rekombinace lidských a zvířecích domén, takže vznikne hybridní lidský/zvířecí faktor VIII s koagulační aktivitou, jak to popsali Lollar, P. et al„ J, Biol. Chem. 267(33); 23652-23657 (25. listopadu 1992) pro hybridní lidský/prasečí faktor VIII.

Předkládaný vynález specificky poskytuje hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde lidská doména A2 je nahrazena prasečí doménou A2, což ilustruje příklad, jak se může konstruovat doménově substituovaný hybridní lidský/savcí jiný než lidský a prasečí faktor VIII. Savčí, jiné než lidské a prasečí dimery a lidské dimery A1/A3-C1-C2 získané z plazmy jsou izolovány disociací domény A2 z faktoru Vlila. To ,se provádí např. v přítomnosti NaOH a poté zředěním směsi a elucí dimerů pomocí monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). Doména A2 je izolována od faktoru Vlila jako menšinová složka v monoS™ HPLC. Hybridní molekuly lidského/zvířecího faktoru VIII jsou pak rekonstituovány smícháním stejného objemu domény A2 jednoho biologického druhu a dimerů A1/A3-C1-C2 jiného druhu.

Hybridní lidské/zvířecí faktory VIII nebo jejich fragmenty s jednou nebo více substitucemi domén jsou izolovány ze směsi nezreagovaných dimerů a domén A2 pomocí postupu monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) pro izolaci prasečího faktoru VIII, jak byl popsán v Lollar, J.S. et al., Blood 71: 137-143, 1988. Rutinní postupy lze také užít k izolaci domén AI, A3, Cl, C2 a B faktoru VIII jednoho biologického druhu, z nichž pak jedna nebo několik mohou nahradit odpovídající doménu faktoru VIII jiného druhu. Odborníkovi je ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě, izolaci a charakterizaci aktivity hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, jako je např. hybridní prasečí/myší faktor VIII.

Tyto postupy, popsané ještě podrobněji v následujících příkladech, poskytly molekuly hybridního faktoru VIII s prokoagulaění aktivitou.

Příprava molekul hybridního faktoru VIII metodami genové inženýrství rekombinací sekvencí kódujících podjednotky, domény nebo části domén lidského, zvířecího a hybridního faktoru VIII

Λ

Nahrazování podjednotek, domén nebo souvislých části domén

Předkládaný vynález poskytuje aktivní rekombinantní hybridní lidský/zvířecí a hybridní ekvivalentní faktor VIII a jeho fragmenty, kde byly nahrazeny podjednotky, domény nebo amino5 kyseliny, sekvence nukleových kyselin kódujících tyto hybridní molekuly, způsoby jejich přípravy a izolace a dále způsoby charakterizace jejich koagulačních, imunoreaktivních a imunogenních vlastností.

Lidský gen faktoru Vlil byl izolován a exprimován v savčích buňkách, jak popsali Toole, J.J. et io al., Nátuře 312: 342-347, 1984 (Genetics Institute), 1984, Gitschier, J. et al., Nátuře 312:

326-330, 1984 (genetech), Wood, W.I. et al., Nátuře 312: 330-337, 1984 (Genetech), Vehar, G.A. et al., Nátuře 312:337-342, 1984 (Genentech), a dále v patentových přihláškách WO 87/04187, WO 88/08035, WO 88/03558 a v patentu US 4 757 006, a na základě známé cDNA byla dedukována aminokyselinová sekvence. Patent US 4 965 199 udělený Caponovi et al, popisuje rekombinantní metodu přípravy savčího faktoru VIII v savčích hostitelských buňkách a purifikaci lidského faktoru VIII. Byla popsána exprese lidského faktoru VIII v CHO buňkách (buňky ovarií čínského křečka) a BHKC (fetální ledvinné křeččí buňky). Lidský faktor Vlil byl modifikován tak, že byla odstraněna celá nebo část B-domény (patent US 4 868 112) a byl učiněn pokus nahradit tuto doménu B faktoru VIII B doménou lidského faktoru V (patent

US 5 004 803). Sekvence cDNA kódující lidský faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 1 a 2.

Prasečí faktor VIII byl izolován a purifikován z plazmy (Fass, D.N. et al., Blood 59: 594, 1982). Částečná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII odpovídající úseku N-konce lehkého řetězce mající homologii s ceruloplazminem a koagu lačním faktorem V a zcela nesprávně umístěný byl popsán Church et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6934, 1984. Toole J.J. et al., Nátuře 312: 342-347, 1984 popsal částečné sekvencování fragmentů ze čtyřech aminokyselin zN-koncového úseku prasečího faktoru VIII, ale nijak necharakterizoval polohu těchto fragmentů v molekule faktoru VIII, Aminokyselinová sekvence domén B a části domény A2 byly publikovány v Toole, JJ. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5939-5942, 1986. cDNA kódující úplnou doménu A2 prasečího faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence a také hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde jsou substituovány všechny domény, všechny podjednotky a specifické sekvence aminokyselin byly popsány v přihlášce vynálezu US 07/864 004 nazvané „Hybridní lidský/prasečí faktor VIII“ podané 7. dubna 1992 původci John S. Lollar a

Marshall S. Runge, na jejímž základě byl udělen 15. listopadu 1994 patent US 5 364 771 a dále také WO 93/20093. Sekvence cDNA kódující doménu A2 prasečího faktoru VIII mající sekvenční identitu se zbytky 373-740 zralého lidského faktoru VIII uvedeného jako sekvence id. č. 1, je zde uvedena jako sekvence id. č. 3 a predikovaná aminokyselinová sekvence jako sekvence id. ě. 4. Nedávno byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 94/11503 nukleotidové a odpovídající aminokyselinové sekvence domén Al a A2 prasečího faktoru VIII a chimérický faktor VIII, kde prasečí Al a/nebo A2 doména nahrazuje odpovídající lidskou doménu.

Jak prasečí, tak i lidský faktor VIII jsou izolovány z plazmy jako protein složený ze dvou podjednotek. Podjednotky, známé jako lehký a těžký řetězec, jsou navzájem spojeny nekovalentními vazbami, které vyžadují přítomnost vápníku nebo jiného divalentního iontu kovu. Těžký řetězec faktoru Vili obsahuje tři domény Al, A2 a B, které jsou spojeny kovalentně. Lehký řetězec obsahuje také tri domény, označované A3, Cl a C2. B doména nemá žádnou známou biologickou funkci a lze ji z molekuly odstranit buďto proteolyticky, nebo metodami rekombinantní DNA, aniž by se měřitelně změnily vlastnosti faktoru Vili. Lidský rekombinantní faktor VIII má obdobnou strukturu a funkci jako lidský faktor VIII izolovaný z plazmy, i když není glykosylován, pokud není exprimován v savčích buňkách.

Lidský a prasečí aktivovaný faktor VIII (tj. faktor Vlila) mají tři podjednotky díky štěpení těžkého řetězce mezi doménami Al a A2. Tato struktura se označuje A1/A2/A3-C1-C2. Lidský faktor Vlila není stabilní v podmínkách, které stabilizují prasečí faktor Vlila, pravděpodobně díky slabší asociaci podjednotky A2 lidského faktoru Vlila. Disociace podjednotky A2 lidského i prasečího faktoru Vlila je spojena se ztrátou aktivity molekuly faktoru VIII.

Použitím sond pro dosud známé sekvence částí molekuly prasečího faktoru VIII je možné standardními postupy sekvencovat ty části prasečího faktoru VIII, které ještě nebyly sekvencovány. Tyto standardní postupy jsou popsány např. v publikacích Weis, J.H., Construction of Recombinant DNA Libraries, Ausubel et ak, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, lne., 1991, a Sambrook et ak, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, jejichž pomocí lze konstruovat io hybridy plné délky.

Předkládaný vynález specificky poskytuje jako příklad výhodného provedení aktivní rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII se substituovanou doménou A2, sekvenci nukleové kyseliny kódující tento hybridní faktor VIII a způsoby jeho přípravy, izolace a charakterizace jeho aktivity. Postupy, kterými byly připraveny tyto hybridní molekuly lze užít také k přípravě rekombinantního hybridního lidského/praseěího faktoru VIII nebo jeho fragmentů, který má nahrazeny podjednotky, souvislé části domén nebo domény jiné než A2. Odborníkovi je také zřejmé, že tyto postupy ukazují, jak je možné připravit i jiné další molekuly rekombinantního hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího nebo rekombinantního hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, kde jsou nahrazeny podjednotky, domény nebo souvislé části domén.

Rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII byl připraven z lidské cDNA (Biogen, ínc.) a prasečí cDNA popsané v předkládaném vynálezu, které kóduji relevantní sekvence faktoru VIII. Ve výhodném provedení vynálezu faktor VIII kódovaný cDNA obsahuje domény A1-A2-A325 C1-C2, postrádá celou doménu B a odpovídá tak aminokyselinovým zbytkům 1-740 a 16492332 jednořetězcového lidského faktoru VIII (viz sekvence id. č, 2) podle číslování dle Wood et ak, Nátuře 312:330-337, 1984.

Jednotlivé podjednotky, domény nebo souvislé části domén lidského nebo prasečího faktoru VIII

3o lze nahradit odpovídajícími prasečími nebo lidskými podjednotkami, doménami nebo souvislými částmi domén, které byly klonovány a byly k takové substituci použity pomocí odborníkovi známých technik mutageneze. Např. Lubin, I.M. et ak, J. Biol. Chem. 269 (12):8639-8641, 1994 popisují, metody substituce lidské domény A2 prasečí doménou s využitím vhodných restrikčních míst. Další metody pro substituci jakéhokoliv zvoleného úseku cDNA faktoru VIII jednoho biologického druhu úsekem cDNA faktoru VIII jiného druhu jsou např. metoda „splicing by overlap extension“ (SOE), kterou popsali Horton et al., Meth. Enzymoh 217: 270-279, 1993.

cDNA kódující podjednotky, domény nebo části domén faktoru VIII nebo celé hybridní cDNA byly klonovány do vektorů pro dočasnou expresi aktivní proteinové molekuly hybridního lidského/prasečího faktoru Vlil v buněčných kulturách, a sice v oboru známými metodami, které jsou popsány např. v Selden, R.F., Introduction of DNA into mammalian cells, v Ausubel et ak, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1991.

Ve výhodném provedení cDNA kódující hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde prasečí sekven45 ce kóduje doménu nebo Část domény, např. doménu A2 nebo její část, byla vložena do savčího expresního vektoru jako je např. ReNeo, a byl tak vytvořen konstrukt hybridního faktoru Vlil. Předběžná charakterizace hybridního faktoru VIII byla provedena tak, že hybridní cDNA byla vložena do savčího expresního vektoru ReNeo a hybridní protein byl přechodně exprimován v buňkách COS-7. Pak bylo možno stanovit, zda je exprimován aktivní hybridní protein.

Expresní vektorový konstrukt se pak dále užil k trvalé transfekci buněk v buněčné kultuře, např.

buněk fetálních křečcích ledvin, a sice metodami v oboru známými, jako je např. liposomy zprostředkovaná transfekce (Lipofectin™, Life Technologies, lne.). Exprese proteinu rekombinantního hybridního faktoru VIII se ověří např. pomocí sekvencování, northemového a westernového přenosu (northem biot, western biot) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Protein hybridního faktoru Vlil se z kultivačního média, ve kterém se kultivují transfekované buňky trvale exprimující protein, precipituje, pak se poletuje, opláchne a resuspenduje ve vhodném pufru, a pak se rekombinantní hybridní faktor VIII purifíkuje standardním způsobem, např. imunoafinitní chromatografií pomocí např. Sepharose^rM s monoklonální protilátkou anti-A2,

V dalším výhodném provedení je hybridní faktor Vlil obsahující substituované podjednotky, domény nebo části domén, exprimován jako fúzní protein z rekombinantní molekuly, kde je na místo sousedící se sekvencí kódující faktor VIII vložena sekvence kódující protein, který např. zvyšuje stabilitu, sekreci nebo zlepšuje detekci, izolaci apod. Odborníkům jsou známé postupy io pro použití homologních nebo heterologních sekvencí řídících expresi, jako jsou např. promotory, operátory a regulátory při přípravě fůzních proteinů a jsou v oboru rutinně využívány (viz např.

Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, lne., 1991).

Purifíkovaný hybridní faktor VIII nebo jeho fragment se testuje na imunoreaktivitu a koagulační aktivitu standardními testy, ke kterým patří např, test s plazmou bez faktoru Vlil, jednostupňový koagulační test, nebo ELISA test s purifi kovaným rekombinantním faktorem VIII jako standardem.

I jiné vektory, včetně plazmidů a eukaryotických virových vektorů, lze užít k expresi rekombinantních genových konstruktů v savčích buňkách v závislosti na požadavcích a úsudku odborníka (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kapitola 16). Lze také užít jiné expresní systémy, např. bakterie nebo hmyzí buňky, ale není to výhodné, neboť existují rozdíly v glykosylaci nebo ke glykosylaci vůbec nedochází,

Protein hybridního faktoru VIII může být exprimován v celé řadě buněk rutinně užívaných pro expresi rekombinantních savčích proteinů, Zejména řada buněčných linií hlodavců je vhodná pro expresi velkých proteinů. K výhodným buňkám, které jsou dostupné v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, MD) patří buňky fetálních křečcích ledvin a buňky ovarií čínského křečka (CHO), které lze kultivovat užitím rutinních postupů a kultivačních médií.

Stejné metody, které byly užity k přípravě hybridního lidského/praseěího faktoru VIII se substituovanou podjednotkou, doménou nebo aminokyselinovou sekvencí, lze užít také k přípravě dalších rekombinantních hybridních faktorů VIII nebo jejich fragmentů a sekvencí nukleových kyselin kódujících tyto hybridy, a sice např. hybridní lidský/savěí jiný než lidský a prasečí nebo zvířecí/zvírecí faktor VIII. Pomocí primerů ke známých sekvencím lidské DNA byla klonována celá myší cDNA a část prasečí cDNA faktoru VIII. Sekvence faktoru VIII dalších biologických druhů pro přípravu hybridního lidského/zvířecího nebo zvířecí ho/zvířecího faktoru VIII lze získat pomocí známých lidských a prasečích sekvencí jako výchozího materiálu. Jiným způsobem je využití amplifikace PCR s DNA ze zvířecí tkáně a použití cDNA knihovny ze zvířete ke klonování sekvence faktoru VIII.

Jako příklad výhodného provedení lze uvést následující přípravu proteinu - hybridního lidského/myšího faktoru VIII. DNA klony odpovídající myšímu homologu genu lidského faktoru Vili byly izolovány a sekvencovány a byla predikovaná aminokyselinová sekvence proteinu faktoru VIII, jak popsali Elder G. et al., Genomics 16 (2):374-379,1993, přičemž v této publikaci bylo také provedeno srovnání predikované aminokyselinové sekvence myši a člověka a pouze části sekvence molekuly faktoru Vílí prasete. Myší cDNA sekvence kódující faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 5 a 8. Ve výhodném provedení byla užita metoda amplifikace RNA se sekvencováním transkriptu (RAWTS), jak ji popsali Sarkar G. et al., Science 244: 331-334, 1989. Stručně shrnuto, jednotlivé kroky této metody jsou: 1) syntéza cDNA pomocí oligo(dT) primerů nebo oligonukleotidového primerů specifického k mRNA, 2) polymerázová řetězová reakce, PCR, kde jeden nebo oligonukleotidové primery obsahují fágový promotor připojený k sekvenci komplementární k úseku, který má být amplifikován, 3) transkripce s fágovým promotorem a 4) sekvencování transkriptu pomocí dideoxynukleotidů zprostředkované reverzní transkriptázou, která žívá jako primer vnitřní („nested“) oligonukleotid. Tato metoda, kromě toho, že poskytne informaci o sekvenci, vede také ke vzniku translačního produktu in vitro tím, že iniciační translační signál je inkorporován do vhodného PCR primerů. Metodu lze také užít k získání informací o sekvenci nové mRNA z jiných biologických druhů.

Substituce aminokyselin

Předkládaný vynález poskytuje aktivní hybridní molekuly lidského/zvírecího a zvířecího/zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmenty, kde aminokyselinová sekvence jednoho biologického io druhu je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo několik jedinečných aminokyselin jiného druhu, sekvence nukleové kyseliny kódující tyto hybridní molekuly, způsoby jejich přípravy a izolace a dále způsoby pro charakterizace jejich koagulačních, imunogenních a imunoreaktivních vlastností.

i$ Doména A2 je nutná pro prokoagulační aktivitu molekuly faktoru VIII. Studie ukázaly, že prasečí faktor VIII má šestkrát vyšší prokoagulační aktivitu než lidský faktor VIII (Lollar P. et al., J. Biol. Chem. 266: 12481-12486, 1991) a že rozdíl v koagulační aktivitě mezi lidským a prasečím faktorem VIII je způsoben rozdílnými aminokyselinovými sekvencemi jednoho nebo více zbytků v doméně A2 (Lollar P. et al., J. Biol. Chem. 267: 23652-23657, 1992). Dále se má za to, že domény A2 a C2 a možná i třetí úsek lehkého řetězce v molekule lidského faktoru VIII nesou epitopy, se kterými reaguje většina, ne-li všechny, inhibující protilátky (Hoyer, Semin. Hematol.31:1-5, 1994).

Molekuly rekombinantního hybridního lidského/zvírecího, zvířecího/zvírecího nebo ekvivalent25 ního faktoru VIII nebo jejich fragmenty lze připravit substitucí alespoň jedné specifické sekvence obsahující jednu nebo několik jedinečných aminokyselin z domén A2, C2 a/nebo jiných domén faktoru VIII jednoho biologického druhu odpovídajícími sekvencemi jiného druhu, přičemž aminokyselinové sekvence se mezi oběma biologickými druhy liší, jak bude ještě ukázáno podrobněji dále. Ve zde popsaném příkladu výhodném provedení poskytuje vynález aktivní rekombinantní hybridní Hdský/praseěí faktor VIII, kde prasečí sekvence je užita k nahrazení lidské sekvence obsahující epitop, přičemž hybridní faktor VIII má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII. V dalším provedení je připravena aktivní hybridní molekula faktoru VIII, která obsahuje sekvence z více než jednoho biologického druhu, kterými byly nahrazeny původní sekvence třetího druhu. Lze také připravit rekombinantní hybridní molekuly lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII, obsahující alespoň jednu sekvenci obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII, jak je dále podrobněji popsáno.

Jakýkoliv hybridní faktor VIII obsahující specifickou aminokyselinovou substituci podle vyná40 lezu může být testován standardními testy koagulační aktivity a reaktivity s inhibičními protilátkami faktoru Vlil, aby se identifikovaly molekuly faktoru VIII se zvýšenou koagulační aktivitou a/nebo sníženou imunoreaktivitou. Mohou být identifikovány také hybridní molekuly, které mají sice nižší koagulační aktivitu než lidský nebo prasečí faktor VIII, ale mají také sníženou reaktivitu s protilátkami. Odborníkovi je zřejmé, že molekuly faktoru Vlil nebo jejich fragmenty, které mají nižší, stejnou nebo větší koagulační aktivitu ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII, jsou užitečné k léčení pacientů s deficiencí faktoru VIII. Zde popsané metody přípravy aktivního hybridního rekombinantního lidského/prasečího faktoru VIII se substitucí specifických aminokyselin lze užít také k přípravě aktivního rekombinantního hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího, hybridního zvířecího-l/zvířecího-2 faktoru VIII nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů.

Hybridní molekuly faktoru VIII se změněnou koagulační aktivitou

Předkládaný vynález poskytuje prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/zvířecí, zvířecí/55 zvířecí nebo ekvivalentní faktor VIII nebo jeho fragment, kde odpovídající aminokyselinová sekvence jednoho biologického druhu je nahrazena alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin majících prokoagulační aktivitu ve faktoru Vlil jiného druhu, a sice připravený v oboru známými metodami místně cílené mutageneze, jak je zde popisováno. Specifické sekvence pro substituce byly vybrány a hybridní konstrukty byly připraveny a testovány na koagulační aktivitu následujícím způsobem. Jako specifický příklad výhodného provedení vynález poskytuje hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující aminokyselinovou substituci v doméně A2. Je zřejmé, že odborník může stejné metody využít k přípravě dalších hybridních molekul jako je hybridní lidský/zvířecí, zvírecí/zvířecí nebo hybridní faktor VIII nebo jeho fragment, které mají změněnou koagulační aktivitu, výhodně zvýšenou ío koagulační aktivitu, ve srovnání s lidským faktorem VIII.

Základem vyšší koagulaění aktivity prasecího faktoru VIII je zřejmě rychlejší, spontánní disociace podjednotky A2 lidského faktoru Vlila než u prasečího faktoru Vlila, která vede ke ztrátě aktivity podle Lollar, P. et al., J. Biol. Chem. 265: 1688-1692, 1990, Lollar, P. et al., J, Biol.

is Chem. 267: 23652-23657, 1992 a Fay, P.J. etak, J. Biol. Chem. 267: 13246-13250, 1992.

Porovnání přiřazených aminokyselinových sekvencí domén A2 (počítání zbytků začíná v poloze 373 vzhledem k aminokyselinové sekvenci lidského faktoru VIII plné délky uvedené zde jako sekvence id. ě. 2) lidského a prasečího faktoru VIII jsou ukázány na obr. 1C. Pro přípravu molekuly hybridního lidského/prasečího faktoru VIII se změněnou koagulaění aktivitou byly vybrány kandidátní sekvence pro mutagenezi srovnáním aminokyselinových sekvencí lidské a prasečí domény A2 (sekvence id. ě. 2 a 6) Jak je uvedeno v tabulce I.

Tabulka I

Sekvence lidského faktoru VIII Vybrané jako vhodné pro mutagenezi.

sekvence	zbytky	neshody	hodnocení změn
398-403	6	4	1
434-444	10	4	3
484-496	13	7	3
598-603	6	4	2
536-541	6	4	0
713-722	10	6	2
727-737	11	6	2

Tabulka I a tučná písmena na obr. IA-1B ukazují sedm sekvencí v lidské a prasečí aminokyselinové sekvenci A2 doména (sekvence id. ě. 2 a 6), které představují pouze 17 % domény A2, ale obsahuje 70 % sekvenčních rozdílů mezi lidskými a prasečími doménami.

Vynález poskytuje rekombinantní hybridní lidský/prasečí konstrukt, kde aminokyseliny Ser373GIu604 v doméně A2 (Ser373-Arg740) byly nahrazeny homologní prasečí sekvencí. Tato zkonstruovaná molekula nereaguje s inhibitory A2, a má stejnou koagulační aktivitu jako lidský (B-)faktor VIII. Dále se popisuje molekula faktoru VIII získaná z plazmy, obsahující úplnou doménu A2 z prasete užitou k substituci v molekule lidského faktoru VIII, přičemž tato hybridní molekula má zvýšenou koagulační aktivitu ve srovnání s lidským faktorem VIII. Srovnání těchto konstruktů ukázalo, že úsek mezi zbytky Asp605 a Arg740 je zodpovědný za rozdíl v aktivitě mezi lidským a prasečím faktorem VIII. Tento úsek lze podrobněji definovat systematickým vytvářením rekombínantních molekul hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, kde úsek mezi

Asp605 a Arg740 je nahrazován prasečími sekvencemi v oboru známým způsobem místně cílené mutageneze, např. metodou SOE, která byla využita extenzivně k vytváření hybridních molekul faktoru VIII obsahujících prasečí sekvence substituované v NH^-terminálním úseku domény A2.

Tyto molekuly lze exprimovat v COS-7 buňkách a ve fetálních ledvinných křečcích buňkách, jak bylo již zmíněno výše. Ty lze purifikovat do homogenity metodami v oboru známými, např. chromatografií s heparin-Sepharose™ nebo imunoafinitní chromatografií. Proteinová koncentrace se pak stanoví absorpcí UV světla při vlnové délce 280 nm a specifická aktivita konstruktů se stanoví dělením koagulační aktivity (měřené v jednotkách na l ml v jednofázovém koagulačním testu) hodnotou A₂₈₀. Lidský faktor VIII má specifickou aktivitu přibližně 3000 až 4000 U/A_2g0, zatímco prasečí faktor VIII má specifickou aktivitu přibližně 20 000 U/A₂go. Ve výhodném provedení prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII má specifickou aktivitu 20 000 U/A₂₈₀ a obsahuje co nejméně prasečích substitucí v doméně A2.

Jak je zde popsáno, metody místně cílené mutageneze byly užity k identifikaci hybridního proteinu s koagulační aktivitou, která je vyšší, stejná nebo nižší než aktivita lidského faktoru VIII, ale výhodně vyšší. V provedení hybridního lídského/prasečího faktoru byly specifické lidské sekvence nahrazeny prasečími sekvencemi, výhodné užitím metody SOE, jak ji popsali

Ho, S.N. et al., Gene 77: 51-59, 1994 nebo dle příkladu 7 a 8, Lze také užít oligonukleotidy řízenou mutagenezí, jak to bylo provedeno pro vyčlenění části lidské domény A2 (viz příklad 7). Když funkční analýza hybridů prokáže koagulační aktivitu, sekvence lze pak dále dělit a mapovat jejich prokoagulační sekvence standardními technikami analýzy bodových mutací.

Předkládaný vynález předpokládá, že cDNA hybridního faktoru VIII a samotný protein jsou charakterizovány v oboru známými a rutinními metodami jako je např. sekvencování DNA, test koagulační aktivity, ELISA test purifikovaného faktoru VIII s měřením UV absorbance při 280 nm, test specifické koagulační aktivity (U/mg), SDS-PAGE analýza purifikovaného faktoru VIII a další. Lze také provádět jiné testy potřebné k testování klinické účinnosti jako je např.

analýza aminokyselin, cukrů, síranů nebo kovových iontů.

Rekombinantní hybridní faktor Vili mající vyšší koagulační aktivitu, ve srovnání s lidským faktorem VIII, je výhodný z hlediska levnější výroby než získávání faktoru VIII z plazmy a také proto, že snižuje množství faktoru VIII potřebné pro účinné léčení deficience faktoru VIII.

Hybridní faktor VIII se sníženou imunoreaktivitou

Epítopy, které jsou imunoreaktivní s protilátkami, které inhibují koagulační aktivitu faktoru VIII („inhibitory“ nebo „inhibiční protilátky“) byly charakterizovány na základě znalosti vztahů mezi strukturou a funkcí v molekule faktoru VIII. Předpokládá se, že inhibitory působí tak, že narušují některou z makromolekulámích interakcí spojenou se strukturou domén faktoru VIII nebo asociaci faktoru VIII s von Willebrandovým faktorem, trombinem, faktorem Xa, faktorem IXa nebo faktorem X. Avšak 90 % inhibičních protilátek proti lidskému faktoru VIII působí tak, že se váží na epítopy lokalizované v doméně faktoru VIII A2 velikosti 40 kDa nebo doméně C2 velikosti 20 kDa, čímž narušují specifické funkce těchto domén, jak to popsali Fulcher et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732, 1985 a Scandella et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156, 1988. Kromě epitopů v doménách A2 a C2 může být třetí epitop v doméně A3 nebo Cl lehkého řetězce faktoru VIII (podle Scandella et al, Blood 82: 1767-1775, 1993). Význam tohoto třetího předpokládaného epitopů je neznámý, ale zdá se že je zodpovědný za malý podíl epitopové reaktivity faktoru VIII.

Protilátky anti-A2 blokují aktivaci faktoru X jak popsali Lollar et al., J. Clin. Invest. 93: 2497-2504, 1994. Předchozí mapovací studie pomocí deleční mutageneze popsané v Ware et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 3: 703-716, lokalizovaly epitop A2 do 20 kDa úseku NH₂-konce domény A2 velikosti 40 kDa. Kompetitivní imunoradiometrický test ukázal, že A2 inhibitory rozpoznávají buďto prostý epitop, nebo blízce nahloučené epítopy, jak popsali Scandella et al., Throm. Hemostas. 67: 665-671, 1992 a jak je také ukázáno v příkladu 8.

Předkládaný vynález poskytuje aktivní rekombinantní hybridní a hybridní ekvivalentní faktor

VIII nebo jeho fragmenty, sekvence nukleové kyseliny kódující takové hybridy, způsoby jejich přípravy a izolace a způsoby jejich charakterizace. K takovým hybridům patří např. lidský/zvířecí, zvířecí/zvířecí nebo ekvivalentní hybridní faktor Vlil, kde aminokyselinová sekvence jednoho biologického druhu byla nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin faktoru VIII druhého druhu, nebo kde specifická sekvence lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru Vlil byla nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí, obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII. Výsledný hybridní faktor VIII má sníženou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami faktoru VIII ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII nebo nemá žádnou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami faktoru ίο VIII.

Užitím postupů pro substituce aminokyselin v molekule faktoru VIII popsaných v předchozích částech přihlášky byla provedena mutační analýza, aby byly vybrány odpovídající aminokyselinové sekvence faktoru VIII jednoho biologického druhu, výhodně prasečí, které se užijí k nahrazení alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin faktoru VIII jiného druhu, výhodně lidských, nebo aminokyselinové sekvence ekvivalentního hybridního faktoru VIII obsahující jednu nebo více kritických oblastí domény A2, C2 nebo jiné, proti kterým jsou namířeny inhibiční protilátky. Dále v textu jsou tyto postupy popsány podrobněji. Výsledný prokoagulační rekombinantní hybridní konstrukt má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami při srovnání s lidským faktorem VIII pomocí standardních testů.

Systematickým nahrazováním stále menších aminokyselinových sekvencí, po kterém vždy následuje test hybridního konstruktu na imunoreaktivitu, jak bude dále popsáno, epitopy všech domén faktoru Vlil byly zmapovány, substituovány aminokyselinovými sekvencemi s menší nebo nulovou imunoreaktivitou a byl připraven hybridní faktor VIII.

Je zřejmé, že odborník může využít tyto postupy kombinující mapování epitopů, konstrukci molekul hybridního faktoru VIII a mutační analýzu konstruktů, pro identifikaci a nahrazení alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin obsažených v epitopů domény A2, C2 a/nebo jiné domény, proti kterým jsou namířeny inhibiční protilátky, a pro konstrukci prokoagulační ho hybridního rekombinantního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecího nebo ekvi30 valentního faktoru VIII nebo jeho fragmentů, který má ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu. Takový postup byl užit vjednom provedení vynálezu, jak je popsáno v příkladu 8, k přípravě rekombinantního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, který má substituci v lidské A2 doméně a neprojevuje žádnou antigenicitu pro protilátky k faktoru VIII.

Obvykle prasečí faktor VIII má omezenou nebo i žádnou reaktivitu s protilátkami proti lidskému faktoru Vlil. Rekombinantní hybridní molekuly lidského/prasečího faktoru Vili se sníženou nebo nulovou reaktivitou s inhibičními protilátkami, která je důsledkem aminokyselinové substituce v doméně A2, byly připraveny jako příklad hybridního faktoru VIII připraveného pomocí faktoru

VIII jiného biologického druhu a substituci v doménách jiných než A2. Prasečí doména A2 byla klonována rutinními postupy, jak jsou popsány v příkladech 6,7 a 8, a pak byla štěpena uvnitř s využitím restrikčních míst pro štěpení cDNA a nebo pomocí metody SOE. Výsledné aminokyselinové sekvence byly užity k nahrazení sekvencí lidské domény A2 a byl tak vytvořen hybridní konstrukt faktoru VIII, který byl vložen do savčího expresního vektoru, výhodně

ReNeo, stabilně transformován do buněk v kultuře, výhodně buněk fetálních křečcích ledvin, a exprimován. Hybridní faktor VIII byl testován na imunoreaktivitu, např. s protilátkami anti-A2 v rutinním „Bethesda“ testu nebo v testu s čistou plazmou a chromogenním substrátem. „Bethesda jednotka“ (BU) se užívá jako standardní měřítko titru inhibitoru. Pokud není „Bethesda titr“ protilátek měřitelný (<0,7 BU/mg IgG) u hybridního konstruktu, pak to znamená, že lidský A2 so epitop byl eliminován v daném úseku substitucí odpovídající prasečí sekvenci. Epitop se postupně progresivně zužuje, takže je možné stanovit specifický epitop A2, aby bylo možné vytvořit hybridní lidskou/prasečí molekulu s co možná nejmenším množstvím prasečí sekvence. Jak je podrobněji dále popsáno, sekvence 25 aminokyselinových zbytků odpovídající sekvenci Arg484-Ile508, která je kritická pro imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami, byla identiCZ 300959 B6 fikována a nahrazena v doméně A2. V této sekvenci je pouze 9 rozdílů mezi lidskou a prasečí sekvencí faktoru VIII. Tento úsek lze dále analyzovat a substituovat.

Lze také připravit hybridní lidský/prasečí faktor VIII, který má sníženou nebo nulovou reaktivitu s inhibičními protilátkami, kde jsou substituce v doménách Cl, C2 nebo jiných, společně a nebo bez substituce v doméně A2. Epitop C2 lze např. mapovat metodou skenování homologů v kombinaci s místně cílenou mutagenezí. Konkrétně je takový postup shodný nebo podobný postupu, který byl zde užit pro substituce v doméně A2, včetně klonování prasečí domény A2 pomocí RT-PCR nebo vyhledáváním z cDNA knihovny prasečích jater pomocí DNA lidské C2 io nebo jiné domény, využití restrikčních míst a/nebo následné metody SOE k mapování a současnému nahrazení epitopů domény C2 nebo jiné, substituce domény C2 nebo jiné v (B-)faktoru VIII, inzerce do expresního vektoru, jako je např. pBluescript, exprese v buněčné kultuře a rutinní testy na imunoreaktivitu. Pro tyto testy lze využít reaktivitu C2 hybridního faktoru VIII s C2-specifickém inhibitorem MR (Scandella et al., Throm. Homeostasis 67:

665-671, 1992 a Lubin et al., 1994) a/nebo jiné C2-specifické protilátky připravené afinitní chromatografií.

Doména C2 obsahuje aminokyselinové zbytky 2173 až 2332 (sekvence id. č. 2). V tomto úseku 154 aminokyselin je zřejmě inhibiční aktivita namířena na úsek v délce 65 aminokyselin mezi zbytky 2248 a 2312 (podle Shima, M. et al., Throimb. Haemostas. 69: 240-246, 1993. Jestliže jsou lidská C2 a prasečí C2 sekvence faktoru VIII v tomto úseku z 85 % identické, jako je tomu v jiných funkčně aktivních úsecích faktoru VIII, pak je přibližně 10 rozdílných aminokyselin mezi lidskou a prasečí aminokyselinovou sekvenci C2 faktoru VIII, které lze využít jako počáteční cíle ke konstrukci hybridů se substitucemi v C2 sekvenci.

Je pravděpodobné, že klinicky významné epitopy faktoru VIII jsou vázány na domény A2 a C2, Avšak byly identifikovány i protilátky k jiným úsekům (Al, A3, B nebo Cl) faktoru VIII, jejichž epitopy lze mapovat a eliminovat postupy popsanými v předkládaném vynálezu, aby se získaly molekuly neantigenního hybridního lidského/prasečího faktoru Vlil.

Konkrétně se např. může mapovat domnělý druhý epitop lehkého řetězce a/nebo jakýkoliv další, epitop v kterékoliv doméně lidského nebo zvířecího faktoru VIII. Na počátku se provede stanovení přítomností třetího inhibitorového epitopů v doménách A2 nebo Cl následujícím postupem. Užitím lidské (H) a prasečí (p) aminokyselinové sekvence faktoru VIII jakožto modelů, se konstruovaly hybridy Alp-A2p-A3p-ClH-C2P a Alp-A2p-A3H-€lp-C2p bez domén B. Inhibiční IgG z plazmy asi 20 pacientů (Dr. Dorothea Scandella, Americký červený kříž), kteří měli nízký nebo nedetekovatelný titr protilátek proti prasečímu faktoru VIII, byl užit v testu proti hybridům. Pokud je třetí epitop v doméně A3, inhibiční IgG bude reagovat s Alp-A2p-A3HClp-C2p ale nikoliv s Alp-A2p-A3p-ClH-C2P hybridem. A naopak, pokud je třetí epitop v doméně Cl, inhibiční IgG bude reagovat s Alp-A2p-A3p-Cl H-C2P ale nikoliv s Alp-A2pA3H-Clp-C2p hybridem. Pokud se identifikuje třetí epitop, charakterizuje se stejným postupem jaký byl popsán pro epitopy A2 a C2. Např. protilátky specifické proti epitopům domén Cl nebo A3 lze izolovat z celkového IgG pacienta pomocí afinitní chromatografíe s užitím hybridů Alp-A2p-A3p-ClH-C2P a Alp-A2p-A3H-Clp-C2p, a eliminací C2 specifických protilátek průchodem Sepharose™ s rekombinantním faktorem VIII. Předpokládaný třetí epitop je pak identifikován pomocí konstruktů metodou SOE, kdy ve výhodném provedení části domén A3 nebo Cl lidského faktoru VIII se systematicky nahrazují prasečími sekvencemi.

Hybridní faktor VIII se sníženou imunogenicitou

Molekula je imunogenní, když může indukovat tvorbu protilátek u Člověka nebo zvířete. Předkládaný vynález poskytuje prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/zvířecí nebo zvířecí/zvtřecí faktor VIII, hybridní ekvivalentní faktor VIII nebo jejich fragmenty, které jsou méně imunogenní než lidský nebo prasečí faktor VIII divokého typu u člověka nebo zvířete, kde odpovídající aminokyselinová sekvence, která má imunogenní aktivitu faktoru VIII jednoho biologického druhuje nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin faktoru Vlil jiného druhu, nebo aminokyselinová sekvence lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII, Taková hybridní molekula se užije ke snížení výskytu vývoje inhibitorů u člověka nebo zvířete a k léčení deficience faktoru VIII, a zvláště výhodně u pacientů s hemofilií dosud neléčených. Ve výhodném provedení hybridní faktor VIII obsahuje lidskou aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII, kde jeden nebo několik alaninových zbytků bylo užito k nahrazení lidské aminokyselinové sekvence s imunogenní aktivitou, čímž vznikla prokoagulační rekombinantní ío hybridní molekula nebo její fragment, které mají sníženou nebo nemají žádnou imunogenicitu pro člověka nebo zvíře.

Zde popsaný postup mapování epitopů a mutační analýzy, kombinovaný se substitucí neantigenních aminokyselinových sekvencí za antigenní v molekule faktoru VIII, užitím hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, vede k přípravě hybridní molekuly s nízkou antígenicitou. Pomocí tohoto modelu a souvisejících postupů lze jakýkoliv konstrukt zde popsaný změnit metodou místně cílené mutageneze tak, že se odstraní co možná největší část funkčního epitopu, aby se snížila možnost imunitního systému rozpoznat hybridní faktor VIII, čímž se níží imunogenictta.

Jednou z metod, která se může užít k dalšímu snížení antigenicity a ke konstrukci méně imunogenních hybridů faktoru VIII je metoda alaninové skenovací mutageneze, kterou popsali Cunningham, B.C. et al., Science 244: 1081-1085, 1989, vybraných specifických aminokyselinových sekvencí lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII. Při této metodě alaninové skenovací mutageneze jsou vedlejší aminokyselinové řetězce, které jsou dle předpokladu součásti epitopů, nahrazeny alaninovými zbytky pomocí místně cílené mutageneze. Srovnáním vazby protilátky na alaninové mutanty a na protein divokého typu dovolí stanovit relativní příspěvek jednotlivých postranních řetězců k vazebné interakci. Alaninové substituce jsou zvláště užitečné, neboť příspěvky postranních řetězců k vazbě protilátek jsou eliminovány za β uhlíkem, ale na rozdíl od substituce glycinem konformace hlavního řetězce je obvykle nezměněna. Alaninová substituce nemá žádné hlavní sterické, hydrofobní nebo elektrostatické účinky, které by ovládaly protein-proteinové interakce.

V proteinových interakcích antigen-protilátka je obvykle 15 až 20 postranních řetězců antigenů v kontaktu s protilátkou. Interakce postranních řetězců, na rozdíl od interakcí vedlejších řetězců, jsou pro interakce protein-protein dominantní. Na základě nedávných studii se předpokládá, že pouze několik málo (3 až 5) z těchto interakcí postranních řetězců přispívá k většině vazebné energie (viz Clackson, T. et al., Science 267: 383-386, 1995). Rozsáhlá analýza epitopů růstových hormonů pro několik myších monoklonálních protilátek ukázala následující hierarchii příspěvků postranních řetězců k celkové vazebné energii: Arg > Pro > Glu - Asp - Phe - Ile, přičemž Trp, Ala, Gly a Cys nebyly testovány (Jin, L. et al, J. Mol. Biol. 226: 851-865). Výsledky s epitopem A2 popsané v předkládaném vynálezu jsou v souladu s tímto zjištěním, neboť dvanáct z 25 zbytků v segmentu 484-508 A2 obsahuje tyto postranní řetězce (viz tabulka 1).

Zjištění, že určité aminokyselinové zbytky jsou zvláště dobře rozpoznávány protilátkami, ukazuje, že odstranění těchto zbytků ze známého epitopu může snížit schopnost imunitního systému rozpoznávat tyto epitopy, tj. učiní danou molekulu méně imunogenní. V případě epitopů A2 lze imunogenní zbytky nahradit, aniž by došlo ke ztrátě koagu lační aktivity. Tak např. v HP9 je Arg484 nahrazen Ser, Pro485 je nahrazen Ala, Arg489 je nahrazen Gly, Pro492 je nahrazen

Leu a Phe501 je nahrazen Met. A dále výsledky získané s plazmou pacientů použitou k testování imunoreaktivity hybridních konstruktů lidských/prasečích faktorů VIII popisované v příkladu 8, ukazují, že protilátky z různých pacientů rozpoznávají stejný nebo velmi podobný strukturní úsek domény A2 a že aminokyselinové zbytky domény A2 podílející se na vazbě A2 inhibitorů vykazují minimální proměnlivost. Takže A2 epitop obsažený v úseku lidského faktoru VIII

484-508 je imunodominantní epitop v tom smyslu, že je rozpoznáván imunitním systémem lépe než jiné strukturní úseky faktoru VIII. Nahrazení této struktury neantigenní sekvencí faktoru VIII z jiného biologického druhu nebo aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru VIII při současném zachování plné koagulační aktivity, vede ke změně rozpoznávání hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII imunitním systémem.

Má se za to, že místně cílená mutageneze pro náhradu velkých a/nebo nabitých aminokyselinových zbytků, které převládají v epitopech, malými neutrálními postranními řetězci (např. alaninem) vede ke vzniku méně imunogenních úseků. Očekává se, že molekuly obsahující to několik takových substitucí v každém významném inhibičním epitopu budou obtížně rozpoznatelné imunitním systémem, neboť nebudou pasovat do mechanismu zámku a klíče, který je typický pro tento druh interakcí antigen-protilátka. Vzhledem k jejich nízké antigenicitě takové hybridní molekuly jsou užitečné k léčení deficience faktoru VIII u pacientů s inhibitory, a vzhledem k jejich nízké imunogenícitě jsou užitečné k léčení dříve neléČených pacientů shemofiliíA.

Obecným výsledkem je, že náhrada jednoho z klíčových zbytků je dostatečná ke snížení vazebné konstanty pro danou protein-proteinovou interakci o několik řádů. Takže je pravděpodobné, že všechny epitopy faktoru VIII obsahují omezený počet aminokyselin, které jsou kritické pro to, aby se vyvinuly inhibitory. Pro každý epitop faktoru Vlil náhrada alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo několik specifických aminokyselin mající imunogenní aktivitu alaninem, může poskytnout aktivní molekulu, která je méně imunogenní než faktor VIII divokého typu. Ve výhodném provedení vynálezu je faktor VIII bez domény B.

Způsob přípravy aktivního rekombinantního hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII substitucí aminokyselin s malou nebo nulovou imunogenní aktivitou za původní aminokyselinové sekvence faktoru VIII, pri kterých se užívá hybridní lidský/prasečí faktor VIII se substitucí aminokyselin v doméně A2, je popsán dále jako jeden z příkladu provedení předkládaného vynálezu. Úsek 484—508 lidského faktoru VIII obsahuje 25 aminokyselinových zbytků.

Místně cílené mutageneze lze užít k tomu, že se každý z těchto zbytků nahradí kteroukoliv z ostatních 19 aminokyselin v celkovém počtu 475 mutant. Kromě toho se mohou konstruovat také mutantní molekuly obsahující více než jednu mutaci.

Hybridní konstrukty se pak testují na antigenicitu měřením vazebné konstanty pro inhibiční proti35 látky, jak popsali Friguet et al., J. Immunol. Methods 77: 305-319, 1985. Ve výhodném provedení vynálezu je hodnota vazebné konstanty snížena nejméně o tri řády, což by vedlo ke snížení Bethesda titru na klinicky nevýznamnou hladinu. Např. IC₅₀ (hrubé měřítko vazebné konstanty) inhibice pro A2 protilátky byla snížena u hybridního konstruktu lidského/prasečího faktoru VIII HP2, HP4, HP5, HP7 a HP9, které jsou popsány v příkladu 8, a to bylo spojeno se snížením

Bethesda titru na neměřitelnou hladinu. Lze předpokládat, že např. dvojitá nebo trojitá alaninová mutanta lidského faktoru VUI (např. trojitá mutanta lidského faktoru VIII Arg484 —> Ala, Arg489 —> Ala, Phe501 —> Ala) poskytne molekulu s dostatečné nízkou antigenicitou pro terapeutické použití. Podobné mutace lze provést v epitopu C2 a také v předpokládaném třetím epitopu. Výhodné provedení vynálezu obsahuje dvě nebo tri alaninové substituce ve dvou nebo třech epitopech faktoru VIII. Lze také provést další substituce v těchto dvou úsecích.

Ve výhodném provedení vynálezu byl identifikován hybridní ekvivalentní faktor VIII, který je méně antigenní a/nebo imunogenní pro člověka a zvíře než lidský nebo prasečí faktor Vlil. Takový hybridní ekvivalentní konstrukt se testuje na zvířatech, zda má sníženou antigenicitu so a/nebo imunogenicitu. Jako zvířecí modely lze užít např. králíky, prasata, psy, myši, primáty a jiné savce, a to jak kontroly tak zvířata s defíciencí faktoru VIII. Podle jednoho experimentálního protokolu se hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII podává systematicky po dobu šesti měsíců až jednoho roku zvířeti, výhodně intravenózními inťuzemi a v dávce 5 až 50 jednotek/kg (U/kg) tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50 U/kg a nejvýhodněji 40 U/kg tělesné hmotnosti.

Protilátky se měří ve vzorcích plazmy odebrané v intervalech po infuzi po dobu testování

Λ rutinními metodami jako je imunotest a Bethesda test. Ve vzorcích se také měří koagulační aktivita rutinním postupem, např. jednofázovým koagulačním testem.

Hybridní ekvivalentní molekuly faktoru VIII se testují na člověku, zda mají sníženou antigenicitu a/nebo imunogenicitu, a to alespoň ve dvou typech klinických testů. V jenom typu klinického testu, který je navržen ke stanovení toho, zdaje hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII imunoreaktivní s inhibičními protilátkami, se podává hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII, výhodně intravenózni infúzí, přibližně 25 pacientům s deficiencí faktoru VIII, kteří mají protilátky proti faktoru VIII, které inhibují koagulační aktivitu terapeutického lidského nebo io prasečího faktoru VIII. Dávka hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII je 5 až 50 jednotek/kg (U/kg) tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50 U/kg a nejvýhodněji 40 U/kg tělesné hmotnosti. Přibližně 1 hodinu po každém podání se měří obnova faktoru VIII ve vzorcích krve jednofázovým koagulačním testem. Vzorky se odebírají znovu přibližně 5 hodin po infúzi a znovu se měří obnova. Celková obnova a rychlost úbytku faktoru VIII ze vzorků slouží k pre15 dikci titrů protilátek a inhibiční aktivity. Když je titr protilátek vysoký, obnova faktoru VIII je obvykle neměřitelná. Výsledky obnovy se srovnávají s obnovou u pacientů, kteří jsou léčeni lidským faktorem VIII získaným z plazmy, rekombinantním lidským faktorem VIII, prasečím faktorem VIII a dalšími obecně užívanými terapeutickými formami faktoru VIII nebo náhražkami faktoru VIII.

Ve druhém typu klinických testů, které jsou navrženy ke zjištění, zdaje hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII imunogenní, tj. zda se proti faktoru VIII u pacienta vytvoří inhibiční protilátky, hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII se podává, jak bylo již popsáno, přibližně 100 dosud neléěených pacientů s hemofilií, u kterých se nevyvinuly protilátky proti faktoru VIII. Léčení se provádí přibližně jednou za dva týdny po dobu 6 měsíců až jednoho roku. V intervalech 1 až 3 měsíců se odebírají vzorky krve a provádí se Bethesda test a další testy ke stanovení přítomnosti inhibičních protilátek. Také se po každé infúzi může provést test obnovy faktoru VIII, jak bylo již výše popsáno. Výsledky se porovnávají u hemofílických pacientů, kteří dostali faktor VIII získaný z plazmy, rekombinantní lidský faktor VIII, prasečí faktor Vlil nebo jinou obecně užívanou terapeutickou formu faktoru VIII nebo náhražku faktoru VIII.

Příprava hybridního faktoru VIII užitím aminokyselinové sekvence lidského a savčího, jiného než lidského a prasečího, faktoru VIII

Stejné metody, jaké byly užity k přípravě hybridního lidského/prasečího faktoru VIII substitucí specifických aminokyselin se užijí také k přípravě rekombinantního hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII nebo zvířecího/zvířecího faktoru VIII, který má ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII, změněnou nebo stejnou koagulační aktivitu a/nebo stejnou nebo sníženou imunoreaktivitu a/nebo imunogenicitu, a to na základě substituce w jedné nebo více aminokyselin v doméně A2, C2 nebo jiní doméně.

Podobná srovnání aminokyselinové sekvenční identity se provedou pro lidská a savčí jiný než lidský a prasečí protein faktoru VIII, aby se stanovily aminokyselinové sekvence, ve kterých spočívá prokoagulační aktivita, anti-A2 a anti-C2 ímunoreaktivita a/nebo imunogenicita nebo ímunoreaktivita a/nebo imunogenicita jiných domén. Podobné metody se užijí k přípravě hybridního lidského/savčího jiného než lidského prasečího faktoru VIII. Jak bylo již popsáno výše, funkční analýza hybridů umožní odhalit ty, které mají sníženou reaktivitu s inhibičními protilátkami a/nebo sníženou imunogenicitu a/nebo zvýšenou koagulační aktivitu, a sekvence se mohou dále podrobněji analyzovat pomocí bodových mutací.

Tak např, výše popsaným postupem lze připravit hybridní lidský/myší faktor VIII. Srovnání a přiřazení aminokyselin lidské domény A2 (sekvence id. č. 2) a myší A2 (sekvence id. č. 6) je ukázáno na obr. IC. Jak popsali Elder et al., protein faktoru VIII kódovaný myší cDNA (sekvence íd. č. 5) obsahuje 2319 aminokyselinových zbytků se 74% sekvenční identitou s lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2) v celém rozsahu sekvence (87% identita při vyloučení domény B) a je o 32 aminokyselin kratší než lidský faktor VIII. Aminokyselinové sekvence myší domény A a C jsou vysoce konzervativní (sekvence id. č. 6) s 84 a 93% sekvenční identitou s lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2), zatímco doména B a dvě krátké kyselé domény mají 42 a 70% sekvenční identitu. Specificky myší aminokyselinové sekvence Al, A2 a A3 (sekvence id. c. 6) jsou v 85%, 85 a 90% identické s odpovídající lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2). Myší aminokyselinové sekvence Cl a C2 jsou v 93 a 84% identické s odpovídající lidskou sekvencí. V predikované aminokyselinové sekvenci myšího faktoru VIII (sekvence id. č. 6), když se užije identita aminokyselin pro účely číslování, jsou domény Al, A2 a A3 homologní s aminokyselinami 1-372, 373-740 a 1690-2032 sekvence lidského faktoru Vílí.

!0

Štěpné místo trombinu/faktoru Xa a všechna ostatní kromě štěpného místa aktivovaného proteinu C jsou zachována v myším faktoru VIII. Také tyrosinový zbytek pro vazbu von Willebrandova faktoru je zachován,

Podle Eldera et al. nukleotidová sekvence myšího faktoru VIII (sekvence id. č. 5) obsahuje 7519 bází a má 67% sekvenční identitu v celém rozsahu sekvence s lidskou nukleotidovou sekvencí (sekvence id. č. 1). Myši kódující sekvence velikosti 6957 párů bází má 82% sekvenční identitu s kódující sekvencí velikosti 7053 párů bází lidského faktoru VIII. Pokud se ze srovnání vynechá doména B, pak je zde 88% nukleotidová sekvenční identita.

Elder et al. popsali, že lidský a myší mají celkovou identitu 74 % a že 95 % zbytků v lidské sekvenci, které, jsou-li změněny, způsobují hemofilii, je zachováno v myší sekvenci. Tyto údaje podporují využití stejných postupů, které byly použity k identifikaci aminokyselinové sekvence s koagulační aktivitou a/nebo ímunoreaktivitou k protilátkám u prasečího faktoru VIII, také u faktoru VIII myší a jiných zvířat ke stanovení obdobných aminokyselinových sekvencí a přípravě hybridních molekul.

Příprava hybridního faktoru VIII se sníženou křížovou reaktivitou užitím aminokyselinové sekvence lidského a savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII a aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII

Prasečí faktor VIII se užívá klinicky k léčení deficience faktoru VIII u pacientů, kteří mají inhibiční protilátky proti faktoru VIII. Křížová reaktivita, kterou lidská plazma reaguje s prasečím faktorem VIII, může být snížena přípravou hybridního lidského a savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII. Ve výhodném provedení vynálezu se provádí stanovení, zda inhibitor specifický proti lidské doméně A2, C2 nebo jiné reaguje se savčím jiným než lidským a prasečím faktorem VIII, a sice pomocí rutinního Bethesda testu a plazmy jiného savce jako standardu. Titry inhibitoru se měří obvykle v plazmě, takže purifikovaný faktor VIII jiného savce není nutný. Pokud inhibitory nereagují s faktorem VIII jiného savce, např. myším faktorem VIII, jehož sekvence je známá, je možné užít sekvence jiného savce k nahrazení sekvencí v úseku epitopu prasečího faktoru VIII, který byl identifikován u lidských/prasečích hybridů. Jakmile je jednou zvířecí sekvence známa, je možné užít metodu místně cílené mutageneze, např. oligonukleotidem zprostředkované mutageneze jak bylo popsáno v práci Kunkel, T.A, et al., Meth. Enzymol. 204: 125-139, k přípravě hybridního prasečího/45 zvířecího faktoru VIII. Pokud je plazma jiného zvířete méně reaktivní s A2, C2 inhibitory nebo jinými inhibitory faktoru Vílí než myší nebo prasečí faktor VIII, zvířecí sekvence odpovídající prasečímu epitopu může být určena rutinním postupem, jako např. RT-PCR a hybridní lidský/zvířecí nebo prasečí/zvířecí faktor VIII lze zkonstruovat místně cílenou mutagenezí. Lze také připravit hybridní lidský/zvířecí nebo prasečí/savčí jiný než prasečí faktor VIII, který má sníže50 nou křížovou reaktivitu s lidskou plazmou ve srovnání s prasečím faktorem VIII, kde je aminokyselinová sekvence nahrazena odpovídající sekvencí jednoho nebo několika zvířat. V dalším provedení vynálezu je možné snížit křížovou reaktivitu tím, že se sekvence prasečího epitopu nahradí aminokyselinovou sekvencí, která nemá žádnou známou identitu s faktorem VIII, výhodně slaninovými zbytky metodou alaninové skenovací mutageneze.

Π I

Pro identifikaci klinicky významných epitopů jsou exprimovány molekuly rekombinantního hybridního faktoru Vlil, které mají menší nebo stejnou křížovou reaktivitu ve srovnání s prasečím faktorem Vlil, když se testují in vitro proti celé řadě vzorků plazmy s inhibitory. Výhodně jsou tyto molekuly kombinované hybridy A2/C2, kde je imunoreaktivní amino5 kyselinová sekvence v těchto doménách nahrazena doménou jiného savce. Lze provést další mutagenezí těchto úseků, aby se snížila krizová reaktivita. Snížená křížová reaktivita, ačkoliv je žádoucí, není nutným požadavkem u produktu, který je výhodnější než současný existující koncentrát prasečího faktoru Vlil, který má vedlejší účinky diky kontaminaci prasečími proteázami a může způsobovat nežádoucí účinky díky imunogenicitě sekvencí prasečího faktoru VIII. ío Hybridní lidský/savčí nebo prasečí/savčí faktor VIII neobsahuje cizorodé prasečí proteiny. Kromě toho, extenzivní mapování epitopů dokončené u prasečí domény A2 ukázalo, že více než % sekvence terapeutického hybridního lidského/prasečího faktoru VIII je lidského původu.

Příprava ekvivalentů hybridního faktoru VIII

Metody substitucí aminokyselin ve faktoru VIII popsané zde a v příkladech lze užít k přípravě ekvivalentních molekul prokoagulačního rekombinantního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, kde alespoň jedna specifická aminokyselinová sekvence obsahující antigenní a/nebo imunogenní místo v lidském, zvířecím nebo hybridním faktoru VIII, byla nahrazena alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou aminokyselinovou sekvenční, identitu s faktorem VIII („sekvencí odlišnou od faktoru VIII“). Výsledný ekvivalentní aktivní hybridní faktor VIII má menší nebo stejnou reaktivitu s inhibičními protilátkami faktoru VIII a/nebo menší imunogenicitu pro člověka a zvířata než lidský, zvířecí nebo hybridní faktor VIII bez substituce.

K vhodným aminokyselinovým sekvencím, které se mohou užít k nahrazení sekvencí kritických pro koagulační a/nebo antigenní a/nebo imunogenní aktivitu v lidském, zvířecím nebo hybridním lidském/zvířecím faktoru VIII, aby se připravil hybridní ekvivalentní faktor VIII, patří jakákoliv aminokyselinová sekvence, která nemá žádnou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII, která má koagulační, antigenní nebo imunogenní aktivitu. Ve výhodném provedení se k nahrazení užije sekvence alaninových zbytků a metoda alaninové skenovací mutageneze,

K ekvivalentním molekulám hybridního faktoru VIII podle vynálezu patří také molekuly, kde sekvencemi, které nemají žádnou známou identitu se zvířecím faktorem VIII, jsou nahrazeny aminokyselinové sekvence, které nejsou kritické pro koagulační, antigenní nebo imunogenní aktivitu.

Jak bylo již popsáno výše, v jednom provedení ekvivalentního hybridního faktoru VIII má faktor VIII sníženou křížovou reaktivitu s plazmou. Byly identifikovány v křížově reagujícím faktoru

Vlil jeden a více epitopů, které byly nahrazeny aminokyselinovou sekvencí odlišnou od faktoru VIII, výhodně alaninovými zbytky, např. metodou alaninové skenovací mutageneze.

Ve výhodném provedení vynálezu byla připravena ekvivalentní molekula prokoagulačního rekombinantního hybridního faktoru VIII, kde alespoň jedna sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin obsahujících epitop a/nebo obsahující jednu nebo více aminokyselin obsahujících imunogenní místo, výhodné lidského faktoru VIII, je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, výhodně sekvencí alaninových zbytků. Výsledný ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami k faktoru

VIII a/nebo sníženou nebo nulovou imunogenicitu pro člověka nebo zvíře. Způsoby identifikace specifické antigenní sekvence aminokyselin v doméně A2 lidského faktoru VIII jsou popsány v příkladech 7 a 8 a slouží jako příklad identifikace antigenních sekvencí v doméně A2 nebo jiných doménách lidského a zvířecího faktoru VIII a užití metod místně cílené mutageneze, jako je alaninové skenovací mutageneze, k substituci aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII.

Jelikož lidský epitop A2 byl zúžen na 25 aminokyselin, jak je popsáno v příkladu 8, lze provést alaninovou skenovací mutagenezí na omezeném počtu konstruktů hybridního faktoru VIII s lidskou aminokyselinovou sekvencí, aby se stanovilo, které konstrukty hybridního faktoru VIII založené na substituci aminokyselin v A2 jsou prokoagulační, nejsou imunoreaktivní a/nebo imunogenní. V doméně A2 jsou kandidáty pro substituci v hybridním konstruktu pro dosažení snížené imunogenicity a imunoreaktivity aminokyseliny Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, io Arg489, Pro492, Val495, Phe501 a Ile508. Vazebná afinita hybridních konstruktů obsahujících každou z těchto mutant s monoklonální protilátkou mAB413 a panelem IgG specifických pro A2 z pacientů se stanovuje testem ELISA. Kterákoliv mutanta, která je aktivní a má vazebnou afinitu k A2 inhibitorům nižší nejméně o 2 řády je kandidátem pro A2 substituci v molekule faktoru VIII. Vyberou se konstrukty, které mají více než jednu mutaci na základě předpokladu, že čím více je epitop změněn, tím méně je imunogenní. Je možné, že jsou v úseku Arg484-lle508 i další zbytky jako kandidáti, neboť zde mohou být klíčové zbytky epitopů, které jsou společné pro lidský a prasečí faktor VIII. Tak např. nabité zbytky se často účastní protein-proteinových interakcí a skutečně substitucí Arg490 alaninem byl získán prokoagulační faktor VIII mající pouze 0,2% reaktivitu s inhibitory lidského faktoru VIII (viz tabulka VI). Podobně náhrada Lys493 alaninem je také kandidátem.

Tyto postupy se provedou také na epítopu C2 a na předpokládaném třetím epitopu, který zřejmě leží v doméně A3 nebo Cl, a také na kterémkoliv epitopu identifikovaném na faktoru VIII, pro přípravu hybridních konstruktů faktoru VIII.

Diagnostické testy cDNA hybridního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII a/nebo z ní exprimovaný protein, celek nebo část, se mohou užít jako diagnostické činidlo v tes30 těch pro detekci ínhibičních protilátek k lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII nebo hybridního lidského/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII v substrátech, jako jsou např. vzorky séra a tělních tekutin z pacientů, kteří trpí deficiencí faktoru VIII. K těmto protilátkovým testům patří např. ELISA test, imunopřenos („immunoblot“), radioimunotest, imunodifúzní test a test biologické aktivity faktoru VIII, tj. koagulační test. Způsoby přípravy reagencií a postupy těchto testů jsou odborníkům známy, tak např. imunotest pro detekci ínhibičních protilátek ve vzorku pacientova séra spočívá v reakci testovaného vzorku s dostatečným množstvím hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII, který obsahuje alespoň jedno antigenní místo, přičemž toto množství je dostatečné k tomu, že se ve vzorku vytvoří detekovatelný komplex s inhibičními protilátkami.

Sondy z nukleových kyselina nebo aminokyselin lze připravit z cDNA nebo příslušných proteinů hybridního lidského/prasečího, lidského/savčího jiného než lidského a prasečího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII nebo jejich fragmentů. V některých provedeních předkládaného vynálezu se tyto sondy značí užitím barviv nebo enzymaticky, fluorescenčně nebo chemiluminiscencí nebo radioaktivní značkou, které jsou komerčně dostupné. Aminokyselinové sondy se užívají např. pro screening séra nebo jiné tělesné tekutiny, pokud jsou v podezření z přítomnosti inhibitorů k lidskému, zvířecímu nebo hybridnímu lidskému/zvírecí faktoru VIII. Lze tak kvantifikovat hladiny inhibitorů u pacientů s rovnat se zdravými kontrolními jedinci, což lze užít např. ke stanovení toho, zda pacient s deficiencí faktoru VIII může být léčen hybridním nebo ekvivalentním hybridním faktorem Vlil. Sondy cDNA se mohou užít pro výzkumné účely ke screeningu DNA knihoven.

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky obsahující hybridní lidský/zvířecí, prasečí/savčí jiný než lidský a prasečí, zvířecí-l/zvířecí-2 nebo ekvivalentní faktor VIII, samotný nebo v kombinaci

s vhodnými farmaceutickými stabilizátory, vehikuly a/nebo nosiči, jsou připravovány známými metodami, např. jak je popsal E.W. Martin v Remingtonů Pharmaceutical Sciences.

V jednom výhodném provedení vynálezu výhodným nosičem nebo vehikulem pro intravenózní infúze je fyziologický roztok nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok.

V jiném výhodném provedení vynálezu vhodnou stabilizační sloučeninou, vehikulem a nosičem je např. jiný lidský nebo zvířecí protein, jako např, albumin, přičemž vynález není omezen pouze na tento protein.

Fosfolipidové vehikuly nebo liposomové suspenze jsou také výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče nebo vehikula. Lze je připravit odborníkům známými metodami a patří k nim např. sloučeniny fosfytidylserin/fosfatidylcholin nebo jiné sloučeniny fosfolipidu nebo detergentů, které společně propůjčují na povrch negativní náboj, jelikož se faktor VIII váže na negativně nabité fosfolipidové membrány, Liposomy lze připravit rozpuštěním vhodných lipidů (jako je is např. stearoylfosfatidyletanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachidoylfosfatidylcholin nebo cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se pak odpaří a zanechá tenký film suchého lipidu na stěně nádoby. Vodný roztok hybridního faktoru VIII se pak přidá do nádoby a nádob se pak v ruce otáčí, aby se lipidový materiál uvolnil ze stěn nádoby a dispergovaly se lipidové agregáty, čímž se vytvoří suspenze liposomu.

Hybridní faktor nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII se může kombinovat s dalšími vhodnými stabilizujícími sloučeninami, vehikuly a/nebo nosiči, k nimž patří koagulační faktor závislý na vitaminu K, tkáňový faktor a von Wilíebrandův faktor (vWf) nebo jeho fragment, který obsahuje vazebné místo pro faktor VIII, a polysacharidy jako je např. sacharóza.

Hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII lze podávat také pomocí genové terapie stejně jako se může podávat lidský faktor VIII, např. pomocí retrovirových vektorů. Tento postup spočívá v inkorporaci cDNA faktoru VIII do lidských buněk, které se pak transplantují přímo pacientovi s deficiencí faktoru VIII nebo se vloží do implantátu, který je propustný pro faktor ίο VIII a nikoliv pro buňky, který se pak implantuje pacientovi. Výhodným způsobem přenosu je retrovirem zprostředkovaný přenos genu. Při tomto způsobu se exogenní gen (např. cDNA faktoru VIII) klonuje do genomu modifikovaného retroviru. Gen je pak vložen do genomu hostitelské buňky mechanismem retrovirové integrace, kde je pak buňkou exprimován. Retrovirový vektor je modifikován tak, že neprodukuje virus, čímž je zabráněno virové infekci hostitele. Obecné principy takové terapie jsou odborníkům známy a jsou přehledně popsány v odborné literatuře (viz např. Kohn, D.B., et al., Transfusion 29: 812-820,1989).

Hybridní faktor Vlil se může uchovávat navázaný na von Wilíebrandův faktor (vWf), aby se zvýšil poločas a doba skladovatelnosti hybridní molekuly, kromě toho lyofilizace faktoru VIII může zlepšit výtěžek aktivních molekul v přítomnosti vWf. Současné způsoby skladování lidského a zvířecího faktoru VIII užívané komerčními dodavateli lze užít i k uskladnění hybridního faktoru VIII, K těmto metodám patří např. I) lyofilizace faktoru VIII v částečně purifíkovaném stavu, tj. jako tzv. koncentrát faktoru VIII, který se bez další purifikace podává infuzí, 2) imunoafinitní purifikace faktoru VIII Zimmermanovou metodou a lyofilizace v přítomnosti albuminu, která stabilizuje faktor VIII a 3) lyofilizace rekombinantního faktoru VIII v přítomnosti albuminu.

Kromě toho faktor VIII je stabilní nekonečně dlouho při 4 °C v roztoku obsahujícím 0,6M NaCl, 20mM MES a 5mM CaCL, pH 6,0, a také může být uchováván jako zmražený v tomto pufru, kdy po roztátí dochází k minimální ztrátě aktivity.

Použití faktoru VIII k léčení

Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII se užívá k léčení nekontrolovatelného krvácení v důsledku deficience faktoru VIII (např. intraartikulámího, íntrakraniálního nebo gastrointestiCZ 300959 B6 nálního krvácení) u hemofiliků s inhibičními protilátkami nebo bez nich a u pacientů se získanou deficiencí faktoru Vlil po rozvinutí inhibičních protilátek. Aktivní materiály jsou výhodně podávány intravenózně.

Kromě toho hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII může být podáván transplantací geneticky upravených buněk, které produkují hybridní faktor VIII, nebo implantací zařízení, které obsahuje takové buňky, jak již bylo zmíněno.

Ve výhodném provedení vynálezu farmaceutické přípravky obsahující hybridní nebo ekvivalentio ní hybridní faktor VIII samotný nebo v kombinaci se stabilizátory, vehikuly a/nebo nosiči, jsou podávány pacientovi intravenózní infúzí stejným způsobem, jaký se užívá k infúzí lidského faktoru VIII.

Dávky přípravku hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII, které je třeba podávat pacientovi, který takové léčení potřebuje, kolísají v závislosti na závažnosti deficience faktoru VIII. Obecně je frekvence, trvání a velikost dávky nastavena v souladu se závažností a trváním krvácivé episody každého pacienta. Tudíž hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII je přítomen ve farmaceuticky přijatelném nosiči, vehikulu nebo stabilizátoru v množství dostatečném k tomu, aby pacientovi bylo podáno terapeuticky účinné množství hybridního faktoru VIII k zastavení krvácení, jak je měřeno standardními koagulačními testy.

Faktor VIII je klasicky definován jako látka přítomná v krevní plazmě, která napravuje defekt koagulace v plazmě jedince s hemofilií A. Koagulační aktivita in vitro purifikovaných a částečně purifikovaných forem faktoru VIII se užívá k výpočtu dávek pro inťúze pacientům a je spolehli25 vým indikátorem aktivity obnovené v plazmě pacienta a nápravy jeho krvácení in vivo. Nebyly popsány žádné rozpory mezi standardními testy nových molekul faktoru VIII in vitro ajejich chováním při infúzích na psím modelu nebo u lidí (viz Lusher J.M. et al., New England J. med. 328: 453—459, Pittman, D.D. et al., Blood 79: 389-397, 1992 a Brinkhous et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 8752-8755, 1985).

Obvykle plazmatická hladina faktoru VIII, které je třeba dosáhnout u pacienta podáváním hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII, je v rozmezí 30 až 100 % normální hodnoty. Pri výhodném způsobu podávání hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII se přípravek podává intravenózně ve výhodné dávce 5 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnosti, výhod35 nějí 10 až 50 a nejvýhodněji 20 až 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti, s frekvencí 8 až 24 hodin (u silně postižených hemofiliků) a délkou trvání léčení 1 až 10 dnů nebo až do zastavení krvácení (viz např, Roberts H.R. a M.R. Jones, „Hemophilia and related conditions - Congenital Deficinces of Prothrombin (Factor II, Factor IV and Factors VII to XII)“, kapitola 153, s. 14531474, 1460, v: Hematology, Williams, W.J. et al. (ed.), 1990). Pacienti s inhibičními protilátkami vyžadují vyšší dávky hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru Vlil nebo pacienti vyžadují méně hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII vzhledem k jeho vyšší specifické aktivitě ve srovnání s lidským faktorem VIII nebo snížené reaktivitě s protilátkami nebo snížené ímunogenicitě. Stejně jako pri léčení lidským nebo prasečím faktorem Vílí, množství hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII podávané infúzí je určeno na základě jednofázového koagulačního testu a ve vybraných případech se určí obnova in vivo měřením faktoru VIII v plazmě pacienta po infuzi. Je třeba mít na zřeteli, že pro každého jednotlivého pacienta je třeba stanovit specifický dávkovači režim na základě jeho individuální potřeby a dle profesionálního úsudku odborníka, který podává nebo dohlíží na podávání přípravku, a tedy že koncentrace uvedené zde slouží jen jako příklady a nijak neomezují použití přípravku podle předkládaného vynálezu.

Léčení může mít formu podávání jednotlivých intravenózních dávek přípravku nebo periodických nebo souvislých podávání po určité delší období v závislosti na potřebě. Alternativně hybridní nebo hybridní rekombinantní faktor Vílí může být podáván subkutánně nebo perorálně pomocí liposomů v jedné nebo několika dávkách v různých časových intervalech.

Hybridní nebo hybridní rekombinantní faktor VIII může být užit také k léčení nekontrolovatelného krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII u hemofiliků, u kterých se vyvinuly protilátky proti lidskému faktoru Vlil. V takovém případě koagulační aktivita vyšší než koagulační aktivita lidského nebo zvířecího faktoru VIII není nutná. Koagulační aktivita i nižší než koagulační aktivita lidského faktoru VIII (tj. menší než 3000 jednotek/mg) je užitečná, pokud nedochází k její neutralizaci v plazmě pacienta.

Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII a způsoby jeho izolace, charakterizace, přípravy io a použití dosud jen obecně popisované jsou pro lepší pochopení dále popsány formou příkladů, které však předmět vynálezu nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test prasečího faktoru Vili a hybridního prasečího/lídského faktoru VIII

Prasečí faktor VIII má na základě specifické aktivity molekuly větší koagulační aktivitu než lidský faktor VIII. Tyto výsledky jsou ukázány v tabulce III v příkladu 4. Tento závěr je založen na použití příslušných standardních křivek, které umožňují přímé srovnání lidského a prasečího faktoru VIII. Koagulační testy jsou založeny na schopnosti faktoru VIII zkrátit dobu srážlivosti plazmy pocházející od pacienta s hemofilií A. Byly použity dva typy testů: jednostupňový a dvoustupňový test.

V jednostupňovém testu se 0,1 ml plazmy od pacienta s hemofilií A (George King Biomedical, lne.) inkubovalo 5 minut ve 37 °C ve vodní lázni s 0,1 ml reagencie pro aktivovaný parciální tromboplastinový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorku nebo standardu, který se skládal z naředěné citrátové normální lidské plazmy. Po inkubaci bylo přidáno 0,1 ml 20mM CaCl₂, a vizuálně se určoval čas vzniku fibrinové sraženiny.

Jednotka faktoru Vlil je definována jako množství přítomné v 1 ml citrátové normální lidské plazmy. Aktivita prasečího a lidského faktoru VIII se srovnávala přímo při použití lidské plazmy jako standardu. Ředění plazmatického standardu nebo purifikovaných proteinů se provádělo 0,15M NaCl, 0,02M HEPES, pH 7,4. Standardní křivka se konstruovala na základě 3 nebo 4 ředění plazmy, nejvyšši ředění bylo 1/50, vynesením logio koagulaěního času do grafu proti logio koncentraci v plazmě, což vedlo k vytvoření lineárního grafu. Jednotky faktoru VIII v neznámém vzorku se určovaly interpolaci z této standardní křivky.

Jednostupňový test spočívá v endogenní aktivaci faktoru Vlil prostřednictvím aktivátorů tvoře40 ných v plazmě hemofilika A, zatímco dvoustupňový test měří prokoagulační aktivitu předem aktivovaného faktoru Vlil. Ve dvoustupňovém testu jsou vzorky obsahující faktor VIII, který reagoval s trombinem, přidány ke směsi aktivovaného parciálního tromboplastinu a lidské plazmy hemofilika A, která byla předem inkubována 5 minut ve 37 °C. Výsledné koagulační časy pak byly konvertovány na jednotky/ml na základě stejné lidské standardní křivky popsané výše.

Relativní aktivita ve dvoustupňovém testu byla vyšší než v jednostupňovém, protože faktor VIII byl předem aktivován.

Příklad 2

Charakteristika funkční odlišnosti mezi lidským a prasečím faktorem VIII

Izolace prasečího a z lidské plazmy pocházejícího faktoru VIII a lidského rekombinantního faktoru VIII byla v literatuře popsána v práci autorů (Fulcher, C.A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA, 79, 1648-1652, 1982, Toole et al, Nátuře, 312, 342-347, 1984, (Genetícs Institute), Gitschier et al., Nátuře, 312, 326-330, 1984, (Genentech), Wood et al., Nátuře, 312, 330-337, 1984, (Genentech), Vehar et al., Nátuře, 312,337-342,1984, (Genentech), Fass et al., Blood, 59, 594, 1982, Toole et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 5939-5942, 1986). To se může provádět několika způsoby. Co se týče složení podjednotek, všechny tyto izolace jsou podobné, přestože je ve stabilitě mezi lidským a prasečím faktorem Vílí funkční rozdíl.

Pro srovnání lidského rekombinantního a prasečího faktoru Vlil byly preparáty vysoce purifikovaného lidského rekombinantního faktoru VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasen) čího faktoru VIII (imunologicky purifikovaného tak, jak je popsáno v práci Fass et al., Blood, 59,

594, 1982) podrobeny analýze vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na iontoměničové koloně (Pharmacia, lne.) Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ), Účelem kroku na HPLC Mono Q™ byla eliminace menších nečistot při změně pufru specifického pro lidský a prasečí faktor VIII na společný pufr pro účely srovnávání. Zkumavky obsahující 1000 až 2000 jednotek faktoru VIII byly rekonstruovány 5 ml H₂O. Pak byl přidán HEPES (2M, pH 7,4) do finální koncentrace 0,02 M. Faktor Vlil byl pak nanesen na kolonu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanou 0,15M NaCI, 0,02 HEPES, 5mM CaCl₂, pH 7,4, (pufr A plus 0,15M NaCI), promyt 10 ml pufru A + 0,15M NaCI a eluován 20 ml lineárním gradientem 0,15M až 0,90M NaCI v pufru A při rychlosti průtoku 1 ml/minutu.

Pro srovnávání faktoru VIII pocházejícího z lidské plazmy (purifikovaného prostřednictvím Mono Q™ HPLC) a prasečího faktoru Vili, purifikovaného imunoafinitně, byl faktor VIII pocházející z prasečí plazmy naředěn 1:4 s 0,04M HEPES, 5mM CaCi₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, a podroben Mono Q™ HPLC ve stejných podmínkách, jak jsou popsané v předchozím odstavci pro lidský faktor VIII. Tyto postupy izolace lidského a prasečího faktoru VIII jsou pro odborníka standardními postupy.

Frakce z kolon byly testovány na aktivitu faktoru VIII prostřednictvím jednostupňového koagulačního testu. Průměrné výsledky testu vyjádřené v jednotkách aktivity na A₂₈o materiálu jsou uvedeny v tabulce II, a ukazují, že prasečí faktor VIII má při použití jednostupňového testu alespoň šestkrát větší aktivitu než lidský faktor VIII.

Tabulka II

Srovnání koagulační aktivity lidského a prasečího faktoru Vlil

Faktor Vlil	Aktivita (U/A280)
Prasečí	21 300
Pocházející z lidské plazmy	3 600
Lidský rekombinantní	2 400

Příklad 3

Srovnáni stability lidského a prasečího faktoru Vlil

Výsledky jednostupňového testu pro faktor VIII jsou odrazem aktivace faktoru Vili na faktor Vlila ve vzorku a možné ztráty aktivity vytvářeného faktoru Vlila. Bylo prováděno přímé srovnání stability lidského a prasečího faktoru VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) byly naředěny na stejnou koncentraci a složení pufru a ponechaly se reagovat s trombinem. V různé časy byly vzorky přeneseny do dvojstupňového koagulačního testu. Typic45 ky byla vrcholná aktivita (ve 2 minutách) 10 krát větší u prasečího faktoru Vlila než u lidského faktoru Vlila, a potom se aktivity obou faktorů Vlila, prasečího i lidského, snižovaly, přičemž aktivita lidského faktoru Vlila klesala rychleji.

Obecně pokusy izolovat stabilní lidský faktor Vlila nejsou úspěšné, dokonce i když jsou použity podmínky, ve kteiých vzniká stabilní prasečí faktor Vlila. Aby se toto prokázalo, byl lidský faktor VIII purifikovaný na Mono Q^rM HPLC aktivován trombinem a podroben kationtoměničové (Pharmacia, lne.) Mono S^IM HPLC v podmínkách, ve kterých se tvoří stabilní prasečí faktor Vlila, jak je popsáno autory Lollar et al. (Biochemistry, 28, 666, 1989).

Lidský faktor Vlil, 43 pg/ml (0,2 μΜ) v 0,2M NaCI, 0,01M HEPES, 2,5mM CaCl·, v pH 7,4, v celkovém objemu 10 ml, se nechal reagovat s trombinem (0,036 μΜ) 10 minut, v této době byl přidán FPR-CH₂Cl D-fenylprolylarginylchlormetylketon do koncentrace 0,2 μΜ pro ireverziío bilní inaktivaci trombinu. Směs se pak naředila 1:1 s 40mM 2-(N-morfolino)etansulfonovou kyselinou (MES), 5mM CaCl₂, v pH 6,0 a nanesla rychlosti 2 ml/minutu na kolonu Mono S^IM

HR 5/5 HPLC (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou 5mM MES, 5mM CaCL, v pH 6,0 (pufr B) a 0,lM NaCI. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s 20 ml gradientu 0,lM NaCI až 0,9M NaCI v pufru B rychlosti 1 ml/mtn.

V těchto podmínkách byla ve dvoustupňovém testu eluována frakce s koagulační aktivitou jako jeden vrchol. Specifická aktivita vrcholové frakce byla přibližně 7500 U/A?₈o« Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) vrcholové frakce Mono S^1Mfaktoru Vlila, po které následovalo barvení proteinu stříbrem, odhalila dva pásy odpovídající heterodimerickému (A3-CI -C2/A1) derivátu faktoru Vlil. Ačkoliv díky nízké koncentraci nebyl identifikován barvením stříbrem za těchto podmínek fragment A2, byl identifikován jako stopová složka pomocí značení ⁱ²⁵I.

Na rozdíl od výsledků s lidským faktorem Vlil měl prasečí faktor Vlila izolovaný prostřednic25 tvím Mono S^IM HPLC za stejných podmínek specifickou aktivitu 1,6 x 10⁶ U/A_2g0. Analýza prasečího faktoru Vlila prostřednictvím SDS-PAGE odhalila 3 fragmenty odpovídající podjednotkám AI, A2 a A3-C1-C2, což dokazuje, že prasečí faktor Vlila má tři podjednotky.

Výsledky analýzy Mono S^rM HPLC preparátů lidského faktoru VUI aktivovaného trombinem v pH 6,0 ukazují, že lidský faktor Vlila je labilní v podmínkách, které poskytují stabilní prasečí faktor Vlila. Ale ačkoliv bylo ve vrcholové frakci identifikováno stopové množství fragmentu A2, nebylo možné z této metody samotné určit, zda koagulační aktivita byla důsledkem malého množství heterotrimerického faktoru Vlila nebo heterodimerického faktoru Vlil, který má nízkou specifickou aktivitu.

Aby se vyřešila tato otázka, je žádoucí izolovat, lidský faktor Vlila před tím, než ztratí svou podjednotku A2. Za tím účelem se prováděla izolace podle postupu, který zahrnoval snížení pH pufrů Mono S™ na pH 5. Lidský faktor VIII purifikovaný Mono Q™ (0,5 mg) byl naředěn H₂O za vzniku konečné koncentrace 0,25 mg/ml (1 μΜ) faktoru VIII v 0,25M NaCI, 0,01M HEPES, w 2,5mM CaCl₂, 0,005% Tween-80, pH 7,4, (celkový objem 7,0 ml). Trombin byl přidán do konečné koncentrace 0,072 μΜ a 3 minuty ponechán reagovat. Trombin byl pak inaktivován

FPR-CH₂C1 (0,2 μΜ). Směs se pak naředila 1:1 40mM acetátem sodným, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 5,0, a nanesla rychlosti 2 ml/minutu na kolonu Mono S™ HR 5/5 HPLC ekvilibrovanou 0,01M acetátem sodným, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 5,0, a 0,lM NaCI.

Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s 20 ml gradientu 0,lM NaCI až l,0M NaCI ve stejném pufru rychlosti 1 ml/minutu. To mělo za následek obnovu koagulační aktivity ve vrcholu, který obsahoval detekovatelné množství fragmentu A2, jak ukázáno pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Specifická aktivita vrcholové frakce byla desetkrát větší než frakce získané v pH 6,0 (75 000 U/A_2g0 proti 7 500 U/A₂₈o). Ale na rozdíl do prasečího faktoru Vlila izolova50 ného v pH 6,0, který je trvale stabilní ve 4 °C, aktivita lidského faktoru Vlila klesala rovnoměrně po dobu několika hodin po eluci z kolony Mono S™. Navíc specifická aktivita faktoru Vlila purífíkovaného v pH 5,0 a okamžitě testovaného je pouze 5 % aktivity prasečího faktoru Vlila, což svědčí pro to, že před testem nastala podstatná disociace.

Tyto výsledky dokazují, že jak lidský, tak prasečí faktor Vlila jsou složeny ze tří podjednotek (Al, A2 a A3-C1-C2), Disociace podjednotky A2 je za určitých podmínek, jako je fyziologická iontová síla, pH a koncentrace, odpovědná za ztrátu aktivity jak lidského tak prasečího faktoru Vlila. Relativní stabilita prasečího faktoru Vlila za určitých podmínek je způsobena silnější asociací podjednotky A2.

Příklad 4

Příprava hybridního lidského/prasečího faktoru VIII rekonstitucí podjednotek

Lehké řetězce prasečího faktoru VIII a těžké řetězce faktoru VIII byly izolovány následujícím způsobem. K prasečímu faktoru VIII purifikovanému pomocí Mono Q™ byl přidán 0,5M roztok EDTA, pH 7,4, do konečné koncentrace 0,05M a byl ponechán při teplotě místnosti 18 až 24 hodin. Byl přidán stejný objem lOmM histidin—Cl, lOmM EDTA, 0,2% (objem.) Tween 80, pH 6,0 (pufr B), a roztok byl nanesen rychlosti I ml/minutu na kolonu Mono S™ HR 5/5 předem ekvilibrovanou pufrem A a 0,25M NaCl. Těžké řetězce faktoru VIII se nenavázaly na pryskyřici, jak bylo vyhodnoceno pomocí SDS-PAGE. Lehký řetězec faktoru VIII byl eluován pomocí 20 ml lineárního gradientu 0,1 až0,7M NaCl v pufru A rychlosti 1 ml/minutu a byl homogenní na SDS-PAGE. Těžké řetězce faktoru VIII byly izolovány prostřednictvím Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) následujícím způsobem. Těžké řetězce faktoru VIII se neadsorbují na Mono S™ během purifikace lehkých řetězců faktoru VIII. V látce prošlé kolonou, která obsahovala těžké řetězce faktoru Vlil, bylo upraveno pH na 7,2 přidáním 0,5M pufru HEPES, pH 7,4, a byla nanesena na kolonu Mono Q™ HR 5/5 HPLC (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou 0,lM NaCl, 0,02M HEPES, 0,01% Tween-80, pH 7,4. Kolona byla promyta

10 ml tohoto pufru a těžké řetězce faktoru VIII byly eluovány 20 ml gradientu 0,1 až 1,OM NaCl v tomto pufru. Lidské lehké řetězce a těžké řetězce byly izolovány stejným způsobem.

Lidské a prasečí lehké a těžké řetězce byly rekonstituovány podle následujících kroků. 10 μί lehkého řetězce lidského nebo prasečího faktoru VIII, 100 pg/ml, bylo smícháno v 1M NaCl, jo 0,02M HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, s 1) 25 pl heterologního těžkého řetězce, pg/ml, ve stejném pufru, 2) 10 pl 0,02M HEPES, 0,01% Tween-80, pH 7,4, a 3) 5 pl 0,6M

CaCl₂, po dobu 14 hodin při teplotě místnosti. Směs byla naředěna 1/4 0,02M MES, 0,01%

Tween-80, 5mM CaCl₂, pH 6, a nanesena na kolonu Mono S™ HR 5/5 ekvilibrovanou 0,lM

NaCl, 0,02M MES, 0,01% Tween-80, 5mM CaCl₂, pH 6,0. 20 ml gradient byl puštěn s 0,1 až 35 l,0M NaCl ve stejném pufru rychlostí 1 ml/minutu a sbíraly se 0,5 ml frakce. Ve 280 nm se odečítala absorbance frakcí a frakce se testovaly pomocí měření absorbance na aktivitu faktoru

VIII jednostupůovým koagulačním testem. Těžké řetězce se vyskytovaly v nadbytku, protože volný lehký řetězec (neasociovaný s těžkým řetězcem) také váže Mono S™, nadbytek těžkých řetězců zajišťuje, že částí preparátu nejsou volné lehké řetězce. Rekonstituční pokusy následo40 váné purifikací Mono S™ HPLC byly prováděny se všemi čtyřmi možnými kombinacemi řetězců: lidský lehký řetězec/lidský těžký řetězec, lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, prasečí lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, prasečí lehký řetězec/ lidský těžký řetězec. Tabulka III ukazuje, že faktor VIII kombinující lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec má aktivitu srovnatelnou s nativním prasečím faktorem VIII (tabulka II), což ukazuje, že strukturální prvky prasečího těžkého řetězce jsou odpovědné za zvýšenou koagulační aktivitu prasečího faktoru VIII ve srovnání s lidským faktorem VIII.

Tabulka lil

Srovnání koagulační aktivity hybridního lidského/prasečího faktoru VIII s lidským a prasečím faktorem VIII

	Aktivita (U/A; ? o)
Prasečí lehký řetězec/praseči těžký řetězec	30 600
Lidský lehký řetězec/praseči těžký řetězec	4 4 100
Praseči lehký řetězec/' lidský těžký řetězec	1 100
lidský lehký řetězec/lídský těžký řetězec	1 100

Příklad 5

Příprava aktivního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII rekonstitucí domén

Z prasečí nebo lidské krve byl izolován prasečí dimer A1/A3-C1-C2, prasečí doména A2, lidský dimer A1/A3-C1-C2 a lidská doména A2, podle metody popsané v práci autorů Lollar et al. (J. Biol. Chem., 267(33), 23652-23657, 1992). Například, aby se izoloval prasečí dimer A1/A3C1-C2, bylo zvýšeno pH prasečího faktoru Vlila (140 pg) z pH 6,0 na pH 8,0 přidáním 5N NaOH po dobu 30 minut, za vzniku disociované domény A2 a 95% inaktivace při koagulačním testu. Směs byla nareděna 1:8 pufrem B (20mM HEPES, 5mM CaCL, 0,01% Tween-80, pH 7,4) a nanesena na kolonu Mono S^1M ekvilibrovanou v pufru B. Dimer A1/A3-C1-C2 byl eluován jako jeden ostrý vrchol v přibližně 0,4M NaCl při použití gradientu 0,1 až l,0M NaCl v pufru B. Pro izolaci prasečí domény A2 byl získán prasečí faktor VIII podle metody autorů Lollar et al. (Biochem., 28, 666-674, 1989), začínalo se s 0,64 mg faktoru VIII. Volná prasečí doména A2

2fi byla izolována jako minoritní složka (50 pg) v 0,3M NaCl na chromatogramů Mono S™.

Hybridní prasečí/lidské molekuly faktoru VIII byly rekonstituovány z dimerů a domén následujícím způsobem. Koncentrace a podmínky pufru byly tyto: prasečí A2, 0,63 pM v pufru A (5mM MES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 6,0) a 0,3M NaCl, prasečí A1/A3-C1-C2, 0,27 pM v pufru B a 0,4M NaCl, pH 7,4, lidská A2, 1 pM v 0,3M NaCl, lOmM histidin-HCl, 5mM CaCIj, 0,01% Tween-20, pH 6,0, lidský A1/A3-C1-C2, 0,18 pM v 0,5M NaCl, 10mM histidin—Cl, 2,5mM CaCI₂, 0,1% Tween-20, pH 6,0. Rekonstituční pokusy se prováděly smísením stejných objemů domény A2 a dimeru A1/A3-C1-C2. Ve směsných pokusech s prasečím dimerem A1/A3-C1-C2 bylo pH sníženo na 6,0 přidáním 0,5M MES, pH 6,0, na 70mM.

Koagulační aktivity všech čtyř možných hybridních molekul faktoru Vlila - [pA2/(hAl/A3-ClC2)], [hA2/(pAl/A3-C 1-C2)], [pA2/(pA 1/A3-C1-C2)] a [hA2/(hAl/A3-Cl-C2)] - byly zjištěny pomocí dvoustupňového koagulačního testu v různých časech.

Vytvoření aktivity po smíchání domén A2 a dimeru A1/A3-C1-C2 bylo téměř kompletní po jedné hodině a bylo stabilní po přinejmenším 24 hodin při 37 °C. Tabulka IV ukazuje aktivitu rekonstituovaných hybridních molekul faktoru Vlila, když byly testovány v 1 hodině. Dvoustupňový test, kterým byly získány specifické aktivity molekul faktoru Vlila, se liší od jednostupňového testu a hodnoty nemohou být srovnány s hodnotami aktivity molekul faktoru VIII získanými jednostupňovým testem.

Tabulka IV

Srovnání koagulačních aktivit hybridního lidského/prasečího faktoru Vlila se substituovanou doménou

Hybridní fVIIIa	Specifická aktivita (U/mg)
Prasečí A2 + lidský Al/A3-Cl^C2	140 000
Prasečí A2 + prasečí A1/A3-C1-C2	70 000
Lidská A2 + prasečí A1/A3-C1-C2	40 000
Lidská A2 + lidský A1/A3-C1-C2	40 000

Tabulka IV ukazuje, že největší aktivitu vykazovaly prasečí doména A2/lidský dimer

A1/A3-C1-C2, po kterém následovaly prasečí doména A2/prasečí dimer A1/A3-C1-C2.

Když byla doména A2 prasečího faktoru Vlila spojena s dimerem A1/A3-C1-C2 lidského faktoru Vlila, bylo tedy dosaženo koagulační aktivity. Dále bylo dosaženo koagulační aktivity, io když byla spojena doména A2 lidského faktoru Vlila s dimerem A1/A3-C1-C2 prasečího faktoru Vlila. Samotné oblasti A2, Al a A3-C1-C2 neměly koagulační aktivitu.

Příklad 6

Izolace a sekvencování domény A2 prasečího faktoru VIII

Pouze nukleotidová sekvence kódující doménu B a část domény A2 prasečího faktoru VIII byly dříve sekvencovány (Toole et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 5939-5942, 1986). Zde jsou popsány cDNA a predikované aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 3 a 4) pro celou doménu A2 prasečího faktoru VIII.

Doména A2 prasečího faktoru VIII byla klonována pomocí reverzní transkripce z celkové RNA prasečí sleziny a pomocí amplifikace PCR (polymerázovou řetězovou reakcí), byly použity degenerované primery založené na známé sekvenci cDNA lidského faktoru VIII a přesný prasečí primer založený na části sekvence prasečího faktoru VIII. Byl izolován produkt PCR o velikosti kb a byl amplifikován pomocí inzerce do fagemidového vektoru Bluescript™ (Stratagene).

Prasečí doména A2 byla kompletně sekvencována prostřednictvím dideoxynukleotidového sekvencování. cDNA a predikované aminokyselinové sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 3 a 4, v daném pořadí.

Příklad 7

Příprava rekombinantního hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII

Nukleotidové a predikované aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 1 a 2) lidského faktoru

VIII byly popsány v literatuře [Toole et al., Nátuře, 312, 342-347, 1984, (Genetics Institute),

Gitschier et al., Nátuře, 312, 326-330, 1984, (Genentech), Wood et al., Nátuře, 312, 330-337,

1984, (Genentech), Vehar et al., Nátuře, 312,337-342, 1984, (Genentech)].

Vytvoření rekombinantního hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII vyžaduje odstranění cDNA oblasti lidského faktoru VIII (Biogen Corp.) a vložení zvířecí sekvence cDNA, která má určitou sekvenční identitu. Pak je hybridní cDNA exprimována v příslušném expresním systému.

Lze uvést příklad, kdy byly klonovány cDNA hybridního faktoru VIII, ve kterých některé nebo všechny lidské sekvence A2 byly nahrazeny odpovídajícími prasečími doménami A2. Nejprve byla vystřižena celá sekvence cDNA odpovídající doméně A2 lidského faktoru VIII, a pak menší část domény A2 pomocí olígonukleotidem zprostředkované mutageneze, metody odborníkovi obecně známé (viz např. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, kapitola 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Jednotlivé kroky celého postupu byly prováděné následujícím způsobem.

Materiál

Metoxykarbonyl-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilid (Spectro-zyme™ Xa) a ío monoklonální protilátky antifaktor VIII ESH4 a ESH8 byly zakoupeny od firmy American

Diagnostica (Greenwich, CT). Uní lamelami (jednovrstevné) fosfatidylcholin/fosfatídylserinové (75/25, hmot.) vehikuly byly připraveny podle metody autorů Barenholtz, V, et al. (Biochemistry, 2806-2810, 1977). Přípravek rekombinantního desulfatohirudinu byl získán od Dr. R.B. Wallise, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA). Prasečí faktory IXa, X, Xa a trombin byly izolovány podle metod autorů Lollar et al. (Blood, 63, 1303-1306, 1984) a Duffy, E.J., et al. (J, Biol. Chem., 207, 7621-7827, 1992). Čistý rekombinantní lidský faktor VIII bez albuminu byl získán od firmy Baxter-Biotech (Deerfield, IL).

Klonování domény A2 prasečího faktoru VIII ²⁰ cDNA kódující prasečí doménu A2 byla získána po PCR reverzně transkribované mRNA z prasečí sleziny izolované podle popisu autorů Chromczynski et al. (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987). cDNA byla připravena s použitím soupravy pro syntézu cDNA (First-strand cDNA Synthesis Kit) s náhodnými hexamery jako primery (Pharmacia, Piscataway, N.J.). PCR se provádělo s použitím degenerovaného 5' koncového primeru: 5-AARCAYCCNAARACNTGGG-3' (sekvence id. č. 11) založeném na krátké známé aminokyselinové sekvenci prasečí A2 a s použitím 3' koncového přesného primeru 5'-GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC-3' (sekvence id. č. 12), založeném na známé prasečí sekvenci DNA bezprostředně 3' od prasečí domény A2. Tyto oligonukleotidy odpovídají nukleotidům 1186-1203 a 2289-2313 v lidské sekvenci (sekvence id. č. 1), Amplifikace se prováděla 35 cyklů (1 minuta 94 °C, 2 minuty 50 °C, 2 minuty 72 °C) s použitím Taq DNA polymerázy (Promega Corp, Madison, Wl). Amplifikovaný fragment o velikosti 1,1 kb byl klonován do pBluescript II KS- (Stratagene) v místě EcoRV s použitím postupu s T-vektorem, jak je popsán autory Murchuk, D., et al. (Nucl. Acids Res., 19, 1154, 1991). Byly transformovány kompetentní buňky Escherichia coli XLl-Blue a byla izolo35 vána plazmidová DNA. Sekvencování se provádělo v obou směrech s použitím Sequenase™ verze 2.0 (U.S. Biochemical Corp., Division of Amersham LifeScience, lne., Arlington Hts, IL). Tato sekvence byla ověřena prostřednictvím totožné sekvence, která byla získána přímým sekvencováním produktu PCR z nezávislé reverzní transkripce RNA ze sleziny z téhož prasete (CircumVent™, New England Biolabs, Beverly, MA). Oblast obsahující epitop pro autoproti40 látku RC byla identifikována jako 373-536 v lidském faktoru Vlil (sekvence id. č. 2).

Konstrukce a exprese cDNA hybridního lidského/prasečího faktoru VIII

Lidský faktor VIII bez domény B (HB“, Biogen, lne., Cambridge, MA), který nemá sekvence kódující aminokyselinové zbytky 741-1648 (sekvence id. č. 2), byl použit jako výchozí materiál pro konstrukci hybridního lidského/prasečího faktoru VIII. HB byl klonován do expresního vektoru ReNeo. Aby se usnadnila manipulace, byla cDNA faktoru VIII izolována jako fragment Xhol/Hpal z ReNeo a klonována do pBIueScript II KS štěpeného Xhol/EcoRV. Oligonukleotid 5-CCTTCCTTTATCCAAATACG TAG ATC AAGAGG AAATTGAC-3' (sekvence id. č. 7) byl použit v reakci pro místně cílenou mutagenezi při použití fágové DNA obsahující uráčil, jak je popsáno autory Kunkel, T.A. et al, (Meth. Enzymol., 204, 125-139, 1991), aby současně vystřihl lidskou sekvenci A2 (nukleotidy 1169-2304 ze sekvence id. č. 1) a vnesl restrikční místo SnaBI. Plazmid obsahující lidský faktor VIII bez domény A2 byl naštěpen se SnaBI, po čemž následovalo přidání linkerů Clal. Prasečí doména A2 pak byla amplifikována pomocí PCR při použití fosforylovaného 5' primeru (sekvence id. č. 8):

5' -GTAGCGTTGCC AAG AAGC ACCCTAAG ACG-3' a 3' primem (sekvence id. č. 9):

'-GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC-3'.

K produktu PCR. byly přidány linkery Clal, po čemž následovala ligace do vektoru obsahujícího lidský faktor VIII. Spojení A1/A2 a A2/A3 byla opravena, aby se obnovily přesné sekvence pro štěpení tromblnem a hraniční sekvence, pomocí místně cílené mutageneze s použitím oligonukleotidu uvedeného v sekvenci id. č. 8 a nukleotidů 1-22 (5' GAA...TTC ze sekvence id. č. 9) pro korekci 5' a 3' koncových spojení. Ve výsledném konstruktu označeném HP1 byla lidská io doména A2 přesně nahrazena prasečí doménou A2. Předběžný produkt obsahoval nežádoucí thymidinn ve spojení A1-A2 jako důsledek PCR amplifíkace prasečí domény A2. Tato jedna báze byla vystřižena při použití mutagenního oligonukleotidu 5-CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG-3' (sekvence id. č. 10). Výsledná hybridní nukleotidová sekvence kódovala aktivní faktor VIII mající lidskou doménu A1, prasečí doménu A2 a lidské domény A3,

ClaC2.

Oblast obsahující 63 % NH₂-koncové prasečí domény A2, která obsahuje předpokládaný epitop A2, nahradila homologní lidskou sekvenci v cDNA bez domény B tak, že se vyměnily fragmenty Spel/BamHI mezi plazmidy pBIueScript, které obsahovaly cDNA lidského faktoru VIII a cDNA lidského/prasečí A2 faktoru VIII. Sekvence byla ověřena sekvencováním domény A2 a míst sestřihu. Nakonec byl fragment Spel/Apal obsahující celou sekvenci A2 dosazen na odpovídající místo v sekvenci HB za vzniku konstruktu HP2.

Přechodná exprese HB a HP2 v buňkách COS-7 byla testována po transfekci DNA zprostředko25 vane DEAE-dextranem, jak je popsáno autorem Seldon, R.F. (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., editor, 9.21-9.36, Wiley Interscience, N.Y.). Poté, co byla ověřena exprese aktivního faktoru VIII a byly provedeny předběžné inhibiční studie s protilátkou, byla HB a HP2 DNA trvale transfekována do fetálních buněk ledvin křečka při použití transfekce zprostředkované lipozomy (Lipofectin® Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD).

Klony obsahující plazmidy byly selektovány na rezistenci na G418 v médiu F12 podle Eagla modifikovaného Dulbeccem, s 10% fetálním telecím sérem (DMEM-F12/10% fetální telecí sérum), obsahujícím 400 pg/ml G418, po čemž následovalo pěstování v DMEM-F 12/10% fetálním telecím séru obsahujícím lOOpg/ml G418. Kolonie vykazující maximální expresi aktivity HB a HP2 faktoru Vlil byly selektovány pomocí kruhového klonování a množeny pro další charakterizaci.

Exprese HB faktoru VIII a HP2 faktoru VIII byla srovnávána prostřednictvím testu faktoru VIII bez plazmy, jedno stupňovým koagulačním testem a testem ELISA při použití purifikovaného rekombinantního lidského faktoru VIII jako standardu. Pro HB a HP2 byly dosaženy specifické koagulační aktivity 2600 a 2580 jednotek/mg, v daném pořadí. HB a HP2 produkovaly 1,2 a 1,4 jednotek/ml/48 hodin/10⁷ buněk. To je totožné s konstruktem divokého typu (2600 ± 200 jednotek/mg). V testu faktoru VIII bez plazmy byly specifické aktivity HB’ a HP2 nerozeznatelné.

Biologická aktivita rekombinantního hybridního lidského/zvířecího a odpovídajícího faktoru VIII se substitucemi domén Al, A2, A3, Cl a/nebo C2 může být vyhodnocena nejprve pri použití přechodného expresního systému se savčími buňkami COS. Hybridní lidská/zvířecí a odpovídající cDNA může být transfekována do buněk COS a supematanty mohou být analyzovány na aktivitu faktoru VIII při použití jednostupňového a dvoustupňového koagulačního testu, jak je popsáno výše. Navíc aktivita faktoru VIII může být měřena při použití testu s chromogenním substrátem, což je citlivější a umožňuje analýzu velkého množství vzorků. Podobné testy jsou standardní v testování aktivity faktoru VIII (Wood et al., Nátuře, 312, 330-337, 1984, Toole et al., Nátuře, 312, 342-347, 1984). Exprese rekombinantního faktoru VIII v buňkách COS je také standardní postup (Toole et al, Nátuře, 312, 342-347, 1984, Pittman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 2429-2433,1988).

cDNA lidského faktoru Vlil použitá jako výchozí materiál pro rekombinantní molekuly zde popsané byla exprimována v buňkách COS za vzniku produktu s biologickou aktivitou. Tento materiál Jak je popsáno výše, může být použit jako standard ke srovnávání hybridních lidských/5 zvířecích molekul faktoru Vlil. Aktivita v testech je přeměněna na specifickou aktivitu pro řádné srovnávání hybridních molekul. Za tímto účelem je nezbytné měření množství faktoru VIII tvořeného buňkami a může se provádět pomocí imunotestu s purifikovaným lidským a/nebo zvířecím faktorem VIII jako standardy. Imunotesty pro faktor VIII jsou pro odborníka rutinním postupem (viz např. Lollar et al., Blood, 71, 137-143, 1988).

to

Příklad 8

Určováni inhibiční aktivity u hybridního lidského/zvířecího a ekvivalentního faktoru Vlil

Sekvence lidského a zvířecího faktoru VIII přicházející v úvahu jako epitopy (tj. jako rozpoznávací místa pro inhibiční protilátky, které reagují s faktorem VIII) mohou být určovány s použitím rutinních postupů, například použitím testu s protilátkami k faktoru VIII spojeným s technikami místně cílené mutageneze, jako je metoda SOE, jak je ukázáno níže. Mohou být identifikovány sekvence zvířecího faktoru VIII, které nejsou antigenní ve srovnání s odpovídajícími antigenními lidskými sekvencemi, a mohou být tvořeny substituce pro vnesení zvířecích sekvencí a odstranění lidských sekvencí podle standardních metod rekombinantní DNA. Sekvence aminokyselin, jako jsou alaninové zbytky, které nemají žádnou známou identickou sekvenci s faktorem VIII, mohou být také substituovány standardními metodami rekombinantní DNA nebo alaninovou skenovací mutagenezí. Prasečí faktor Vlil reaguje s některými inhibičními protilátkami slaběji než lidský faktor Vílí, což poskytuje základnu pro současnou léčbu pacientů inhibitory. Poté, co jsou vytvořeny rekombinantní hybridy, mohou být testovány in vitro na reaktivitu rutinními testy, včetně inhibitorového testu Bethesda. Tyto konstrukty, které jsou méně reaktivní než nativní lidský faktor VIII a nativní zvířecí faktor VIII jsou kandidáty pro substituční léčbu.

so Má se za to, že epitopy, proti kterým je namířena většina (ne—li všechny) inhibičních protilátek reaktivních s lidským faktorem VIII, jsou umístěny ve dvou oblastech v molekule lidského faktoru Vlil o 2332 aminokyselinách, doméně A2 (aminokyselinové zbytky 373-740) a doméně C2 (aminokyselinové zbytky 2173-2332, obě sekvence uvedené v sekvenci id. č. 2). Epitop A2 byl eliminován tvořením rekombinantního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, ve kterém je část lidské domény A2 nahrazena prasečí sekvencí, která má sekvenci shodnou s nahrazenou lidskou aminokyselinovou sekvencí. To bylo provedeno, jak je popsáno v příkladu 7, klonováním prasečí domény A2 standardními technikami molekulární biologie, a pak štěpením a sestřihem v doméně A2 s použitím restrikčních míst. Ve výsledném konstruktu označeném HP2, byly zbytky 373-604 (sekvence id. č. 4) prasečího faktoru VIII substituovány do lidské domény A2.

HP2 byl testován na imunoreaktivitu s protilátkami proti lidskému faktoru VIII s použitím následujících metod.

Test ELISA na faktor VIII

Jamky mikrotitrační destičky byly povlečeny 0,15 ml 6 pg/ml ESH4, protilátky proti lehkému řetězci lidského faktoru VIII, a inkubovány přes noc. Poté byla destička třikrát promyta H₂O, jamky byly blokovány 1 hodinu roztokem 0,15M NaCl, lOmM fosfát sodný, 0,05% Tween 20, 0,05% netučné sušené mléko, 0,05% azid sodný, pH 7,4. Aby se zvýšila senzitivita, byly vzorky obsahující faktor VIII 15 minut aktivovány 30nM trombinem. Aby se inhiboval trombin, byl pak přidán rekombinantní desulfatohirudin. Destička byla opět promyta a bylo přidáno 0,1 ml vzorku nebo čistého rekombinantního lidského faktoru VIII (10 až 600 ng/ml) jako standardu. Po 2 hodinách inkubace byla destička promyta a do každé jamky bylo přidáno OJ ml bíotinylované ESH8, další protilátky proti lehkému řetězci lidského faktoru VIII. ESH8 byla biotinylována s použitím biotinylační soupravy firmy Pierce se sulfosukcinimidyl~6~{biotinamid)hexanoátem. Po 1 hodině inkubace byla destička promyta a do každé jamky bylo přidáno 0,1 ml streptavidinu s alkalickou fosfatázou. Destička byla vyvolána při použití soupravy firmy Biorad se substrátem reagujícím s alkalickou fosfatázou a výsledná absorbance se určovala ve 405 nm pro každou jamku při použití čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky Vmax (Molecular Devices, lne., Sunnyville,

CA). Neznámé koncentrace faktoru VIII se určovaly z lineární části standardní křivky pro faktor VIII.

Testy faktoru VIII io HB“ faktor VIII a HP2 faktor VIII byly testovány v jednostupňovém koagulačním testu, který byl proveden jak bylo již dříve popsáno (Bowie, E.J.W, a C.A.Owen, Disorders of Hemostasis, Ratnoff a Forbes, ed., s. 43-72, Grunn & Stratton, lne., Orlando, FL, 1984) nebo testem bez plazmy, jak je dále popsáno. Vzorky HB a HP2 faktoru VIII byly aktivovány 40nM trombinem v pufru obsahujícím Ó,15mM NaCI, 20mM HEPES, 5mM CaCL, 0,01% Tween-80, pH 7,4, v přítomnosti lOnM faktoru IXa, 425nM faktoru X a 50 μΜ jednovrstevných fosfatidylserinfofstatidylcholinových (25/75hmot) vehikulů. Po pěti minutách byla reakce zastavena 0,05 M EDTA a lOOmM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem způsobem, který popsali Hill-Eubanks et al., J. Biol. Chem. 265: 17854-17858. Za těchto podmínek bylo množství vytvářeného faktoru Xa lineárně úměrné počáteční koncentraci faktoru VIII, jak lze soudit podle purifikovaného rekombinantního faktoru VIII (Baxter Biotech, Deerfíeld, IL) užitého jako standard.

Před koagulačním testem byly vzorky HB a HP2 faktoru VIII koncentrovány ze 48 hodin kondiciovaného média užitím chromatografie s heparin-Sepharose na koncentraci 10 až 15 jednotek/ml. HB' nebo HP2 faktor VIII se přidal k plazmě s hemofilií A (George Ring Biomedical), aby byla finální koncentrace 1 jednotka/ml, Titry inhibitoru v RC nebo MR plazmě nebo v zásobním roztoku byly měřeny Bethesda testem, jak to popsali Kasper, C.K. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869-872, 1975. Inhibitorový IgG byl připraven podle Leyte, A., et al., J. Biol. Chem. 266: 740-746, 1991.

HP2 faktor VIII nereagoval s protilátkami anti-A2. Tudíž zbytky 373-603 musí obsahovat epitop pro anti-A2 protilátky.

Příprava hybridního lidského/prasečího faktoru VIII a testy pomocí metody sestřihu překrývající se extenzí (SOE)

Byly připraveny další molekuly prokoagulačního rekombinantního hybridní lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B, kde je lidský úsek domény A2 nahrazen prasečími aminokyseliny, aby byl dále úžeji definován epitop A2. Kromě metody restrikčních míst byla užita metoda sestřihu překrývající se extenzí, SOE, jak ji popsali Ho et al., Gene 77: 51-59, 1989, aby se nahradil jakýkoliv zvolený úsek cDNA prasečího faktoru VIII. Při metodě SOE je sestříhové místo definováno překrývajícími se oligonukleotidy, které lze amplifikovat a vytvořit požadovanou cDNA pomocí PCR. Byly tak připraveny cDNA konstrukty označené postupně HP4 až HP13. Byly vloženy do expresního vektoru ReNeo, stabilně transfekovány do fetálních ledvin45 ných buněk křečka a exprimovány (0,5 až 1 pg, tj. přibližně 3 až 6 jednotek/10⁷ buněk/24 hodin) jak bylo popsáno v příkladu 7. Koagulační aktivita testovaného faktoru VIII byla stanovena za přítomnosti a bez přítomnosti monoklonálních modelových myších inhibičních protilátek specifických proti doméně A2, mAb413. V nepřítomnosti inhibitoru měly všechny testované konstrukty koagulační aktivitu, která byla neodlišítelná od aktivity lidského faktoru Vílí bez domény B.

Konstrukty hybridního lidského/prasečího faktoru VIII byly testovány na reaktivitu s anti-A2 inhibitorovou protilátkou mAb413 užitím tzv. Bethesda testu (Kasper, C.K. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869-872, 1975). Měření Bethesda jednotek (BU) je standardní postup pro měření titru inhibitoru. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V a jsou porovnány s rekombinantním lidským faktorem VIII,

Tabulka V ? Srovnání imunoreaktivity hybridních lidských/prasečích faktorů VIII s aminokyselinovými substitucemi

Konstrukt	Substituce prasečí sekvence	Inhibice (BU/mg IgG)	raAb4l3
lidský (B-)fvm	žádná	1470
HP4	373-540	<0_z7
HP5	373-508	<0/ 7
KP6	373-444	1450
HP7	445-508	<0/7
HP 8	373-433	1250
HP 9	484-508	<0/ 7
HP 10	373-403	1170
HP 11	404-508	<0,7
HP 12	489-508	<0,7
HP 13	484-488	<0,7

Hranice substituované prasečí sekvence jsou definovány první aminokyselinou, která se odlišuje mezí lidským a prasečím faktorem VIII na NH2-konci a C-konci vloženého úseku. Jak je io ukázáno v tabulce V, když Bethesda titr není měřitelný (<0,7 BU/mg IgG), pak A2 epitop leží v úseku nahrazeném prasečí sekvencí. Epitop byl tak postupně zúžen do úseku aminokyselinových zbytků 484-509 (sekvence id. ě. 2) obsahujícího pouze 25 aminokyselin, jak ukazuje to, že

HP9 je nereaktivní s mAB413, Z konstruktů HP4 až HP 11 byl HP9 nejvíce „humanizovaný“ konstrukt, který nereagoval s inhibitorem. To ukazuje na to, že kritický úsek A2 epitopů leží v sekvenci Arg484-Ile508.

Na základě srovnání aminokyselinových sekvencí tohoto kritického úseku lidského a prasečího faktoru VIII byly připraveny dva další konstrukty HP12 a HP13, kde lidská sekvence aminokyselin 489-508 a 484^188 byla nahrazena odpovídající prasečí sekvencí. Žádný z nich nereago20 val s mAb413, To ukazuje, že aminokyselinové zbytky na každé straně spojení Arg488-Ser489 jsou důležité pro reakci s A2 inhibitory. V HP12 je pouze 5 aminokyselinových zbytků odlišných od lidské sekvence a v HP 13 jsou to pouze 4 aminokyselinové zbytky. Hybridy s prasečí substituci v úsecích 484-508, 484-488 a 489-508 vykazovaly sníženou inhibici A2 inhibitory ve čtyřech vzorcích plazmy, což ukazuje na to, že je jen malá variabilita struktury epitopů A2.

Reaktivita nejvíce humanizovaných konstruktů HP9, HP 12 a HP 13 se dvěma anti-A2 IgG preparáty získanými z inhibiční plazmy byla také stanovena. Podobně jako mAb413 ani tyto protilátky nereagovaly s HP9, HP12 ani HP 13, ale reagovaly s kontrolními konstrukty HP(-) a HP8.

Pro konečnou identifikaci kritického epitopů A2 může být úsek mezi aminokyselinami 484-508 dále analyzován stejným postupem.

Postupy popsané v příkladech 7 a 8 lze užít k přípravě dalších hybridních lidských/savčích jiných než prasečích faktorů VIII, kde jsou aminokyselinové substituce v lidské A2 doméně, a dále hybridních lidských/zvířecích nebo zvířecích/zvířecích faktorů VIII, kde jsou aminokyselinové substituce v kterékoliv doméně, nebo ekvivalentních hybridních faktorů VIII nebo jejich fragmentů, které mají sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s protilátkami proti faktoru VIII.

Příklad 9

Eliminace reaktivity lidského faktoru VIII s A2 inhibitory metodou místně cílené mutageneze

Příklad 8 ukázal, že substituce části lidské domény A2 faktoru VIII prasečí sekvencí aminoio kyselinových zbytků 484-508 poskytne molekulu, která má výrazně sníženou reaktivitu s panelem specifických inhibitorů proti A2 faktoru VIII (viz také Healey et al., I Biol. Chem. 270:

14505-14509, 1995). V tomto úseku je 9 aminokyselin odlišných v lidském a prasečím faktoru VIII. Těchto 9 odlišných aminokyselin R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501 a 1508 (jednopísmenné kódy aminokyselin), bylo ve faktoru VIII bez domény B jednotlivě nahrazeno alaninem metodou místně cílené mutageneze. Kromě toho, pro usnadnění klonování byla restřikční místa Mlul a Sac2 vnesena na 5 ' a 3'-konce sekvence cDNA A2 faktoru VIII, aniž by došlo ke změně aminokyselin odpovídajícím těmto místům. 9 mutant bylo stabilně transfekováno do buněk fetálních ledvin křečka a exprimováno. Všech devět produkovalo biologicky aktivní faktor VIII. Tyto faktory VIII byly částečně purifikovaný a koncentrovány heparin-Sepharose chromatografií podle Healey et al.

Mutanty byly charakterizovány na základě jejich reaktivity s protilátkou mAb413, jak bylo popsáno v příkladu 7. Tato inhibiční protilátka rozpoznává stejný nebo velmi blízko přilehlý epitop v doméně A2 jako všechny dosud zkoumané lidské inhibitory. Reaktivita s inhibitorem byla měřena Bethesda testem. Stručně shrnuto, Bethesda titr inhibitoru je takové ředění inhibitoru, které inhibuje faktor VIII z 50 % ve standardním jednostupňovém koagulačním testu faktoru VIII, Tak např. jestliže je roztok protilátky ředěn 1/420 a inhibuje testovaný vzorek rekombinantního faktoru VIII z 50 %, pak je Bethesda titr 420 U. V případě čisté monoklonální protilátky jako je mAb413 je hmotnost protilátky známa, takže se Bethesda titr vyjadřuje v Bethesda jednotkách (BU) na miligram protilátky mAb413. Aby byl nalezen bod 50% inhibice, provede se ředicí řada protilátky mAb413 a hodnota odpovídající 50 % se hledá metodou prokládání příslušné křivky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VI.

Tabulka VI

Mutace	Titr mAb4l3 (BU/mg)	% reaktivity*
Divoký typ, B(-)fVIII	9400	—
R484 -> A	160	1,7
P485 -> A	4000	42
Y487 -> A	50	0, 53
P488 -> A	3500	37
R489 -> A	1/5	0,015
R490 -> A	—	(0/2)
P492 -> A	630	6/7
V495 -> A	10700	113
F501 -> A	11900	126
1508 -> A	5620	60

* vztaženo k divokému typu

Tyto výsledky ukazují, že je možné snížit antigenicitu faktoru Vlil vzhledem k modelovému A2 inhibitoru více než 10 x tím, že se provedou alaninové substituce v polohách 484, 487, 489 a 492. Reaktivita mutanty R489 —> A je dokonce snížena o čtyři řády. Kterákoliv z těchto alaninových substitucí může být terapeuticky užitečná pro snížení antigenicity a imunógenicity faktoru VIII.

Výsledky potvrdily účinnost alaninové skenovací mutageneze a dále ukázaly, že biologická aktivita faktoru VIII je zachována, i když byla změněna aminokyselinová sekvence epitopů, který reaguje s inhibiěními protilátkami. Pět z devíti míst, kde se lidská a prasečí sekvence faktoru Vlil io liší, jsou také místy, kde se liší lidská a myší sekvence. Molekuly faktoru VIII s alaninovými substitucemi v těchto místech jsou proto příklady hybridního ekvivalentního faktoru VIN, který obsahuje sekvence, které nemají sekvenční identitu s žádným dosud známých savčím faktorem

VIII.

Další modifikace, např. kombinace dvou alaninových substitucí, mohou také poskytnout silně sníženou antigenicitu pro celou řadu pacientů, neboť varianty polyklonální protilátky se liší pacient od pacienta a mohou reagovat s variantami epitopů A2 faktoru VIII. Kromě toho imunogenicita (schopnost indukovat tvorbu protilátek) je dále snížena inkorporací více než jedné aminokyselinové substituce. K takovým substitucím patří jak alanin tak aminokyseliny specifické pro prasečí sekvenci nebo i jiné aminokyseliny, která mají nízký imunogenní potenciál. Substi20 tuce v polohách 490, 495 a 501 jsou užitečné ke snížení imunógenicity. Navíc tyto substituce pravděpodobně sníží reaktivitu s protilátkami u některých pacientů.

Jiné účinné, antigenicitu snižující substituce, kromě alaninu, lze provádět, pokud se věnuje péče tomu, aby se vyhnulo užití těch, které jsou hlavními přispěvateli k vazebné energii antigen-proti25 látka nebo mají velké a nebo nabité postranní řetězce. Aminokyseliny, jejichž substituce vede ke snížení antigenní reaktivity jsou zde proto nazývány aminokyseliny „snižující imunoreaktivitu“. Kromě alaninu k dalším aminokyselinám snižujícím imunoreaktivitu patří methionin, leucin, šeřin a glycin, aniž by však výčet byl omezující. Je třeba mít namysli, že míra snížení imunoreaktivity dosažená danou aminokyselinou také závisí na účinku dané substituce na konformaci .to proteinu, přístupnost epitopů a podobně.

Příklad 10

Klenowův fragment, fosforylované linkery Clal, Notl linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza byly koupeny od Promega (Madison, Wisconsin). PolynukleotidyIkináza byla získána od Life Technologies, lne. (Gaithersburg, Maryland). γ³²Ρ-ΑΤΡ (Redivue, >5000 Ci/mmol) byl koupen od Amersham. pBluescrípt II KS- a buňky E. coli Epicurean XLl-Blue byly získány od Strategene (La Jolla, Califomia). Syntetické oligonukleotidy pocházely od Life Technologies, lne.

nebo Curachem, lne. Když byly PCR produkty připravovány pro klonovací účely, byly užity 5'-fosforylované oligonukleotidové primery. Číslování nukleotidů (nt) oligonukleotidů užitých jako primery pro amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) prasečí cDNA fVIN nebo genomové DNA je vztaženo k cDNA lidského fVIII (Wood et al., 1984, viz výše).

Celková RNA ze sleziny prasete byla izolována metodou užívající guanidinium-thiokyanátfenol-chloroformové extrakce (Chromczynski et al„ Anal. Bioechem. 162: 156-159, 1987). Prasečí cDNA byla připravena z celkové RNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z viru Moloneyho myší leukémie a náhodných hexamerů jakožto primerů reakce (souprava First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokud není uvedeno jinak. RT reakce obsahovala so 45mM Tris-CI, pH 8,3, 68mM KCI, 15mM DTT, 9mM MgCl₂, 0,08 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA) a I,8mM deoxynuleotidtrifosfátů (dNTP). Prasečí genomová DNA byla izolována ze sleziny standardním postupem (Strauss, W.M. v Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1995, str. 2.2.1 - 2.2.3). Izolace DNA zagaróCZ 300959 B6 zového gelu byla provedena pomocí soupravy Geneclean II (Bio 101) nebo Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakce byla provedena pomocí termocyklovacího zařízení Hybaid OmniGene. Pro PCR reakci užívající Taq DNA polymerázu reakční směs obsahovala 0,6mM MgCl₂, 0,2mM směs dNTP, 0,5mM oligonukleotidové primery, 50 U/ml polymerázy a 0,1 objemu reakční směsi ze syntézy prvního řetězce cDNA. Pokud není uvedeno specificky jinak, PCR produkty byly purifikovány z agarózového gelu, zatupeny užitím Klenowova fragmentu, precipitovány etanolem, a pak buďto ligovány do míst EcoRV v defosforylovaném pBluescript II SK- nebo ligovány io s fosforylovanými linkery Clal pomocí T4 ligázy, naštěpeny Clal, purifikovány chromatogfrafn na Sephacryl 400 a pak ligovány do pBluescript II KS- naštěpeného Clal a defosforylovaného. Ligace byly provedeny pomocí T4 DNA ligázy (Souprava rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim), pokud není uvedeno jinak. Inzerty obsahující plazmtdy pBluescript KS- byly užity k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue.

Sekvencování plazmidu bylo provedeno užitím automatického sekvenátoru Applied Biosystems 373a a terminační soupravy s fluoresenčními barvivý PRISM nebo ručním sekvencováním užitím soupravy Sequenase v, 2 (Amersham Corp.), Přímé sekvencování produktů PCR včetně koncového značení ³²P oligonukleotidů bylo provedeno pomocí cyklického sekvencovacího protokolu

2ΰ (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Izolace klonů prasečí cDNA fVIII obsahujících netranslatované sekvence 5-konce, signálního peptidu a kodony domény Al

Úsek prasečí fVIII cDNA od 5-konce k doméně A2 byl amplifikován „hnízdovou“ PCR užitím celkové RNA ze sleziny se samice prasete metodou rychlé amplifikace cDNA konců (5-RACE) užitím soupravy Marathon cDNA Amplification (Clontech, verze PR55453). To zahrnuje syntézu prvního řetězce pomocí „lock-docking“ oligo(dT) primeru (viz Borson et al., PCR Methods Appl. 2: 144—148, 1992), syntézu druhého řetězce cDNA užitím polymerázy I z E. coli a ligaci s 5' prodlouženým dvojřetězcovým adaptorem (sekvence id. č. 13):

5' -CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ' - 3'-NH2-CCCGTCCA-PO4-S', jehož krátký řetězce byl blokován na 3-konci aminoskupínou, aby se snížilo nespecifické PCR a byl komplementární k 8 nukleotidům 3'-konce (Siebert P.D. et al., Nucleic Acids Res. 23: 10871088, 1995). První běh PCR byl proveden s adaptorově-specifíckým oligonukleotidem (sekvence id. č.14):

5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (označeným API) jakožto „sense“ primerem a oligonukleotidem specifickým pro A3 doménu prasečího fVIII (sekvence id. č. 15):

5'-CCATTGACATGAAGACCGTTTCTC-3' (nt2081-2104) jakožto antisepse“ primerem. Druhý běh PCR byl proveden pomocí hnízdových adaptorově specifických oligonukleotidů, a sice AP2 (sekvence id. č. 16):

5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' jakožto „sense“ primeru a hnízdového oligonukleotidů specifického pro prasečí doménu A2 (nt 1497-1520) jakožto „antisepse“ primer (sekvence id. č. 17):

' -GGGTGCAAAGCGCTGACATCAGTG-3 ' .

PCR se prováděly pomocí komerčně dostupné soupravy (Advantage cDNA PCR COre Kit), která užívá protilátkou zprostředkovaný protokol pro horký start (Kellog, D.E. et al., BioTechnoques 16: 1134-1137, 1994). PCR podmínky obsahovaly denaturaci 60 s 94 °C, nasednutí primerů 30 s při 60 °C a prodlužování 4 minuty pri 68 °C s kontrolou teploty ve zkumavce. Tento postup vedl k vytvoření hlavního produktu tvořícího pás velikosti 1,6 kb, což je v souladu s amplifikací fragmentu zasahujícího přibližně 150 bp do netranslatovaného úseku 5'-konce. Produkt PCR byl klonován do pBluescript pomocí linkerů Clal. Inzerty ze čtyř klonů byly sekvencovány v obou směrech.

Sekvence těchto klonů obsahovaly úsek zahrnující 137 bp netranslatovaného úseku 5'-konce, io signální peptid, doménu Al a část domény A2. Shoda byla dosažena přinejmenším vždy ve 3 ze míst. Avšak klony obsahovaly 4 mutace zjevně vnesené prostřednictvím PCR, pravděpodobně díky četným běhům PCR potřebným k vytvoření klonovatelného produktu. Proto byla užita sekvence z úseku signálního peptidu k navržení sekvence fosforylovaného „sense“ primeru (sekvence id. č. 18):

_]5 5 ' -CCTCTCGAGCCACCATGTCGAGCCACCATGCAGCTAGAGCTCTCCACCTG-3 ' označeného RENEOPIGSP pro syntézu jiného produktu PCR k potvrzení sekvence a pro klonování do expresního vektoru. Sekvence uvedená tučně představuje počáteční kodon. Sekvence směrem 5' od něho je sekvence identická s místem inzerce do savčího expresního vektoru ReNeo použitého pro expresi fVIII (Lubin et al, 1994 viz výše). Místo obsahuje štěpné místo Xhol (podtržené). RENEOPIGSP a oligonukleotid nt 1497-1420 byly užity pro PCR reakci s Taq polymerázou na templátu s cDNA ze sleziny samice prasete. Polymeráze od několika dalších výrobců selhala a neposkytla detekovatelný produkt. PCR podmínky obsahovaly denaturaci 4 min při 94 °C, nasednutí primerů 2 min při 55 °C a prodlužování 2 minuty při 72 °C s konečným prodlužovacím krokem 5 minut pri 72 °C. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím linkerů Clal. Inzerty ze dvou takových klonů byly sekvencovány a v obou směrech a shodovaly se s kanonickou sekvencí.

Izolace prasečích klonů fVIII cDNA obsahujících A3, Cl a 5'-polovinu domény C2

Nejdříve byly klonovány dva RT-PCR produkty z prasečí sleziny odpovídající fragmentu domén B-A3 (nt 4519-5571) a C1-C2 (nt 6405 - 6990). 3'-konec domény C2 byl získán prodloužením úseku exonu 26, což je koncový exon fVIII. Produkt B-A3 byl připraven užitím primeru specifického pro prasečí doménu B (sekvence id. č. 19):

5'-CGGGCGGCCGCGCATCTGGCAAAGCTGAGTT-3', kde podtržená část odpovídá úseku prasečího fVIII, který se shoduje s úsekem nt 4519—4530 lidského fVIII. 5'-konec oligonukleotidu obsahuje místo Notl, které bylo zamýšleno pro účely klonování. „Antisepse“ primer použitý k vytvoření produktu B-A3 (sekvence id. č. 20):

5' -GAAATAAGCCCAGGCTTTGCAGTCRAA-3' byl založen ne reverzním komplementu sekvence cDNA lidského fVIII nt 5545-5571. Reakce

PCR obsahovala 50mM KCI, lOmM Tris-Cl, pH9,0, 0,1% Triton X-100, l,5mM MgCI₂, 2,5mM směs dNTP, 20 μΜ oligonukleotidové příměry, 25U/mI Taq polymerázy a 1/20 objemu směsi RT reakce. PCR podmínky obsahovaly denaturaci 3 min při 94 °C po které následovaly cykly obsahující denaturaci 1 min při 94 °C, nasednutí primerů 2 min pri 50 °C a prodlužování 2 minuty pri 72 °C. Produkty PCR byly fosforylovány užitím T4DNA kinázy a byly přidány linkery Notl. Po naštěpení Notl byly PCR fragmenty klonovány do místa Notl plazmidu pBluescript II KS- a transformovány do buněk E. coli XLl-Blue.

Produkt C1-C2 byl připraven využitím známé sekvence lidské cDNA pro syntézu oligonukleotidových primerů nt 6405—6426 (sekvence id. č. 21):

' -AGGAAATTCCACTGGAACCTTN-3 ' a reverzního komplementu k nt 6966-6990 (sekvence id. č. 22):

5'-CTGGGGGTGAATTCGAAGGTAGCGN-3' .

Podmínky pro PCR byly shodné s podmínkami pro přípravu produktu B-A2. Výsledný fragment byl vložen do klonovacího vektoru pNOT užitím soupravy Prime PCR Cloner Cloning Systém (5-Prime3, lne., Boulder, Colorado) a klonován v buňkách JMI09.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 byly částečně sekvencovány, aby bylo možné připravit „sense“ a „antisepse“ oligonukleotidy specifické pro prasečí sekvence, nt 4551-4573 (sekvence id. č. 23):

5'- GAGTTCATCGGGAAGACCTGTTG -3' ío a nt 6541-6564 (sekvence id. č. 24):

5'- ACAGCCCATCAACTCCATGCGAAG -3'.

Tyto oligonukleotidy byly užity jako primery pro přípravu RT-PCR produktu velikosti 2013 bp pomocí soupravy Advantage cDNA PCR (Clontech). Tento produkt odpovídající nt 4551-6564 v lidské sekvenci, obsahuje úsek zodpovědný za aktivační peptid lehkého řetězce (nt 5002—5124), doménu A3 (nt 5125-6114) a většinu domény C1 (nt 6115-6573). Sekvence C1-C2 klonu potvrdila, že sekvence lidské a prasečí cDNA od nt 6565 do 3'-konce Cl domény jsou identické. Produkt PCR byl klonován do místa EcoRV plazmidu pBluescript KS- Čtyři klony byly plně sekvencovány v obou směrech. Shody bylo dosaženo přinejmenším vždy ve 3 místech ze 4.

Izolace klonů cDNA prasečího fVIII obsahujících 3 -polovinu C2 domény

Doména C2 lidského fVIII (nukleotidy 6574-7053) je obsažena v exonech 24 až 26 (Gitscher J. et al., Nátuře 312: 326-330, 1984). Lidský exon 26 obsahuje 1958 nukleotidů a odpovídá poloze nt 6901-8858. Zahrnuje také úsek 1478 bp netranaslatované sekvence 3'-konce (3'UTR).

Pokusy klonovat cDNA exonu 26 odpovídající 3 -konci domény C2 a 3'UTR, ať už metodou 3'RACE (Siebert et al., 1995, viz výše), inverzní PCR (Ochtnan, H, et al., Biotechnology (N.Y.)8: 759-760, 1990), PCR s restrikčními místy (Sarkar G. et al., PCR Meth. Appl, 2: 318-322, 1993), PCR s „nepredikovatelným nasednutím primerů“ (Dominguez, O. et al., Nud. Acids Res. 22: 3247-3248, 1994) nebo screeningem cDNA prasečích jater, byly neúspěšné.

Metoda 3'RACE byla znovu vyzkoušena s cDNA knihovnou ligovanou stejnými dvouřetězcovými adaptory, která byla užita k úspěšnému klonování 5-konce cDNA prasečího fVIIL Tudíž selhání této metody nebylo způsobeno nepřítomností cDNA odpovídající exonu 26.

Ke klonování 3-poloviny domény C2 byla užita metoda cíleného procházení genu pomocí PCR (Parker J.D. et al., Nud. Acids Res. 19: 3055-3060, 1991). „Sense“ primer specifický pro prasečí sekvenci nt 6904-6924 (sekvence id. č. 25):

5'- TCAGGGCAATCAGGACTCC -3' byl syntetizován na základě počáteční sekvence domény C2 a byl použit v PCR společně s nespecifickým „kráčejícím“ primerem vybraným z oligonukleotidu dostupných v laboratoři.

PCR produkty pak byly zaměřeny analýzou extenze primem (Parker et al., BioTechniques 10: 94-101, 1991) užitím vnitřního primem značeného ³²P specifického pro prasečí sekvenci nt 6932-6952 (sekvence id. č. 26):

5'- CCGTGGTGAACGCTCTGGACC -3'

Bylo zajímavé, že ze 40 testovaných nespecifických primerů pouze dva poskytly pozitivní produkt analýzou extenze primerů a odpovídaly přesné a degenerované lidské sekvenci 3 '-konce domény C2, a sice primer sekvence id. č. 27 (nt 7030-7053):

5'- GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' a primer sekvence id. č. 28 (nt 7027-7053):

5'- GTAGAGSTSCTGKGCCCTCRCAKCCYAG -3'.

Tyto primery byly původně navrženy pro získání produktu pomocí konvenční RT-PCR, ale selhaly a neposkytly dostatečné množství produktu, které by mohlo být vizualizováno barvením etidiumbromidem. Avšak produkt byl identifikován citlivější metodou extenze primeru. Produkt pak byl purifikován na agarózovém gelu a přímo sekvencován. To prodloužilou sekvenci prasečího fVIII k nukleotidu 7026.

Další sekvence byla získána analýzou extenze primeru produktu získaného „hnízdovou“ PCR na io dvouřetězcové adaptory ligované cDNA knihovně užitím 5'RACE protokolu popsaného již drive.

První běh reakce užíval přesný primer prasečí sekvence id. č. 29 (nt 6541-6564):

5'- cttcgcatggagttgatgggctgt -3' a primer API. Druhý běh reakce užíval primer sekvence id. č. 30 (nt 6913-6934):

' - AATCAGGACTCCTCCCACCCCCG- 3 ' is a primer AP2. Přímé PCR sekvencování prodloužilo sekvenci směrem 3' ke konci domény C2 (nt 7053). Sekvence C2 domény byla jednoznačná až na nt 7045 blízko 3-konce C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcí ukázala buďto A, G, nebo dvojité A/G v tomto místě.

Sekvencování bylo prodlouženo do 5'UTR užitím dalších dvou příměrů, a sice sekvence id. č. 31 (NT 6977-6996):

5'- GGATCCACCCCACGAGCTGG -3' a sekvence id. č. 32 (nt 7008-7031):

5'- CGCCCTGAGGCTCGAGGTTCTAGG -3'

Úsek přibližně 15 bp ze 3 'UTR sekvence, byl získán, ačkoliv sekvence byla na několika místech nejasná. Pak bylo syntetizováno několik „antisepse“ primeru na základě co nejlepšího určení 3 netranslatované sekvence. Tyto primery obsahovaly reverzní komplement stop kodonů TGA na svém 3'-konci. PCR produkty byly získány jak s genomové DNA, tak i cDNA prasečí sleziny pomocí specifických primerů sekvence id. č. 33 (nt 6913-6934):

5'- AATCAGGACTCCTCCACCCCCG -3' a 3 'UTR „antisepse“ primeru sekvence íd. č. 34:

5'- CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3' a byly vizualizovány barvením etidiumbromidem na agarózovém gelu. Pro získání dostatečného množství materiálu pro klonování byl proveden druhý běh PCR s „hnízdovými“ primery sekvence id. ě. 35 (nt 6932):

5'- CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' a shodným „antisepse“ primerem. Výsledný produkt PCR velikosti 141 bp byl klonován do pBluescript II KS- naštěpeného EcoRV. Sekvence třech, klonů získaných zgeonomové DNA a třech klonů pocházejících z cDNA byla získána sekvencováním v obou směrech. Sekvence byla zcela jednoznačná až na nt 7045, kde genomová DNA ukázala vždy A a cDNA vždy G.

Srovnání sekvencí lidského, prasečího a myšího faktoru VIII (obrázky 1A až IH).

Srovnání přiřazením sekvencí úseků signálního peptidů, Al, A2, A3, Cl a C2 bylo provedeno pomocí počítačového programu CLUSTALW (Thompson, J.D. et al„ Nud. Acids Res. 22:

4673-4680, 1994). Negativní bodové ohodnocení pro otevřenou mezeru a rozšířenou mezeru bylo 10 a 0,5. Srovnání domény B člověka, prasete a myši bylo již publikováno drive (Elder et

CZ 300959 Bó al., 1993, viz výše). Lidská sekvence A2 odpovídá úseku aminokyselin 373-740 v sekvenci id. č. 2. Aminokyselinová sekvence prasečí domény A2 je uvedena v sekvenci id. č. 4 a aminokyselinová sekvence myší domény A2 je uvedena v sekvenci id. č. 6 (aminokyseliny 392-759).

Přikladli

Exprese aktivního rekombinantního prasečího faktoru VIII bez domény B (PB )

Použité materiály ío Plazma ošetřená citrátem z pacientů s hemofilií A a kontrolních zdravých jedinců byla získána od firmy George King Biomedical lne. Fetální sérový albumin, geneticin, penicilín, streptomycin, médium DMEM/F12 a AIM-V byly koupeny od Life Technologies, lne. Taq DNA polymeráza byla od Promega, Vent polymeráza byla koupena od New England Biolabs, Pfu DNA polymeráza a fagemid pBluescript KS- byly od Stratagene. Syntetické oligonukleotidy byly koupeny od Life Technologies a Curachem, lne. Restrikční enzymy pocházely New England Biolabs nebo Promega. 5-fosforylované primery byly užity, když PCR produkty byly připravovány pro klonovací účely. Číslování nukleotidů (nt) oligonukleotidů použitých jako primery pro amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) prasečí genomové DNA nebo cDNA užívá pro srovnání cDNA lidského faktoru VIII (Wood et al., Nátuře 312: 330-337, 1984). Expresní vektor fVIII označený HB7ReNeo byl získán od Biogen, lne. ΗΒ'/ReNeo obsahoval geny rezistence k ampicilinu a genetícinu a cDNA lidského fVIII postrádající doménu B, která je vymezena úsekem Ser741-Argl648, což je fragment vzniklý štěpením trombinem. Pro zjednodušení mutageneze cDNA C2 domény fVIII, která je na 3-konci ťVIII inzertu v plazmidu ReNeo, bylo vneseno místo Notl směrem 3' o dvě báze ke stop kodonu HB7ReNeo mutagenezí metodou SOE („splicing by overlap extension“, Horton, R.M. et al., Methods Enzymol. 217: 270-279, 1993). Výsledný konstrukt byl označen HB-ReNeo/NotL

Celková RNA byla izolována guanídinium-thiokyanát-fenol-chloroformovou extrakcí (Chromczynski et al., Anal. Bioechem. 162: 156-159, 1987). cDNA byla připravena z celkové

RNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z viru Moloneyho myší leukémie a náhodných hexamerů jakožto primerů reakce (souprava First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plazmidová DNA byla purifikována pomocí soupravy Qiagen Plazmid Maxi Kit (Qiagen). PCR reakce byla provedena pomocí termocyklovacího zařízení Hybaid OmniGene s užitím Taq DNA polymerázy, Vent DNA polymerázy nebo Pfu DNA polymerázy. PCR produkty byly purifikovány z agarózového gelu, zatupeny užitím Klenowova fragmentu, precipitován etanolem, a pak ligovány do plazmidové DNA užitím T4 ligázy (Souprava Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim). Plazmidy obsahující inzerty byly užity k transformaci k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue. Všechny nové sekvence fVIII DNA vytvořené užitím PCR byly ověřeny sekvencováním dideoxynukleotidovou metodou pomocí automatického sekvenátoru Applied

Biosystems 373a a terminační soupravy s barvivý PRISM.

Konstrukce expresního vektoru hybridního faktoru Vlil HP20, který obsahuje prasečí doménu C2 cDNA prasečího fVIII odpovídající 3'-konci domény Cl a celé doméně C2 byla klonovány pBluescript pomocí RT-PCR z celkové RNA užitím RT-PCR na celková RNa a primerů založených na známé sekvenci cDNA prasečího fVIII (Healy, J.F. et al., Blood 88: 4209-4214, 1996). Tento konstrukt a ΗΒ/ReNeo byly užity jako templáty ke konstrukci fúzního produktu „lidská Cl - prasečí C2“ v plazmidu pBluescript mutagenezí metodou SOE. Fragment C1-C2 z tohoto plazmidu byl odstraněn restrikčními enzymy Apal a Notl a ligován do HB7ReNeo/NotI naŠtěpeného Apal/Notí, čímž byl vytvořen HP20/ReNEo/NotL

Konstrukce hybridního lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B obsahujícího prasečí lehký řetězec (HP 18)

Λ 7

Lehký řetězec lidského faktoru VIII obsahuje aminokyselinové zbytky Aspl649-tyr2332. Tento úsek v mutantě bez domény Β (HB) byl nahrazen odpovídajícími zbytky prasečí cDNa fVIII, čímž byla vytvořena molekula hybridního lidského/prasečího faktoru VIII nazvaná HP 18. To bylo provedeno nahrazením odpovídajícího úseku v HP20 nahrazením PCR produktem, který s odpovídal úseku A2, doméně A3, doméně Cl a části domény C2 prasete. Pro usnadnění konstrukce bylo synonymní místo AvrlI vneseno do nt 2273 na spoji domén A2 a A3 v HP20 metodou SOE mutageneze.

Konstrukce hybridního lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B obsahujícího prasečí io signální peptid a domény A1 a A2 (HP22)

Signální peptid a domény Al a A2 lidského faktoru VIII zaujímají úsek aminokyselin Met(-19)-Arg740, Tento úsek v mutantě bez domény Β (HB') byl nahrazen odpovídajícími úseky prasečí cDNA fVIII, čímž byla vytvořena molekula nazvaná HP22. Navíc synonymní místo AvrlI bylo vneseno do nt 2273 na spoji domén A2 a A3 v HP20 metodou SOE mutageneze. HP22 byl konstruován fúzí prasečího fragmentu signální peptid-Al-část A2 v pBluescript (Helay et al., 1996, viz výše) s hybridním lidským/prasečím faktorem VIII bez domény B obsahujícím prasečí doménu A2 nazvaným HP1 (Lubin et al., 1994, viz výše).

Konstrukce prasečího faktoru VIII bez domény Β (PB)

Fragment Spel/Notl z HPI8/BS (+AvrlI) byl štěpen AvrlI/Notl a ligován do HP22/BS (+AvrlI) štěpeného AvrlI/Notl, který obsahoval prasečí fVIII postrádající celou doménu Β. PB- byl klonován do ReNeo ligací fragmentu Xbal/Notl z PB-/BS(+AvrII) do HP22/ReNeo/NotI (+AvrII).

Exprese rekombinantních molekul faktoru VIII

PB-/ReNeo/NotI (+AvrII.) a HP22/ReNeo/NotI (+AvrlI) byly transfekovány do COS buněk a dočasně exprimovány, jak bylo dříve publikováno (Lubin, I.M. et al., J. Biol. Chem. 269:

863 9-8641). HB-/ReNeo/NotI a žádná DNA (slepá kontrola) byly transfekovány jako kontroly.

Aktivita faktoru VIII mutant PB-, HP22 a HB- byla měřena následujícím chromogenním testem. Vzorky fVIII v supematantu z buněk COS byly aktivovány 40nM trombinem v pufru obsahujícím 0,15mM NaCl, 20mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, v přítomnosti lOnM faktoru IXa, 425 nM faktoru X a 50 μΜ jednovrstevných fosfatidylserin-fofstatidylcholinových (25/75 hmotn.) vehikulů. Po pěti minutách byla reakce zastavena 0,05 M EDTA a lOOmM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem. V testu s chromogenním substrátem byl přidán 0,4mM Spectrozyme Xa a byla stanovena rychlost uvolňování para-nitoanilidu měřením absorbance při 405 nm.

Výsledky ze supematantu dvou nezávisle transfekovaných buněčných kultur (změna absorbance ve 405 nm za minutu):

HB“: 13,9, PB : 139, HP22; 100 a slepá kontrola: < 0,2.

Tyto výsledky ukazují, že prasečí faktor VIII bez domény B a faktor VIII bez domény B obsahující prasečí podjednotky Al a A2 jsou aktivní a mají vyšší aktivitu než lidský fVIII bez domény B.

PB“ byl částečně purifikován a koncentrován z růstového média chromatografií na heparin50 Sepharose. Heparin-Sepharose (10 ml) byla ekvilibrována pufrem obsahujícím 0,075 NaCl, lOmM HEPES, 2,5mM CaCI₂, 0,005% Tween-80, 0,02% azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z exprimujících buněk bylo naneseno, na kolonu s heparin-Sepharose, která pak byla propláchnuta 30 ml ekvitibračního pufru bez azidu sodného. PB” pak byl eluován pufrem obsahujícím 0,65 NaCl, 20mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4 a pak uschován do -80 °C. Výtěžek koagulační aktivity faktoru Vlil byl typicky 50 až 75 %.

Stálá exprese prasečího faktoru VIII bez domény Β (PB)

Transfekované buněčné linie byly udržovány v médiu DMEM-F12 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum, 50 U/ml penicilinu a 50 pg/ml streptomycinu. Fetální hovězí sérum bylo před použitím tepelně inaktivováno 1 hodinu v 50 °C. HB“/ReNeo a PB7ReNeo/NotI(+AvrII) byly trvale transfekovány do buněk BHK a selektovány na rezistenci ke geneticinu podle obecně ío známého protokolu popsaného v Lubin et al, Biol. Chem 269: 8639-8641, 1994, kromě toho, že exprimující buňky byly kultivovány v médiu s 600 pg/ml geneticinu. Buňky z kultivačních lahví

Corning T-75 pěstované do konfluence byly přeneseny do trojitých lahví Nunc do média s 600 pg/ml geneticinu a opět kultivovány do konfluence. Médium bylo odstraněno a nahrazeno médiem bez séra AIM-V (Life Technologies, Inc.) a bez geneticicnu. Exprese faktoru Vlil byla sledována jedno stupňovým testem koagulační aktivity (popsaným výše) a 100 až 150 ml média bylo odebráno jednou denně po 4 až 5 dnů. Maximální hladina exprese v médiu pro HB“ a PB“ byla 1 až 2 jednotky/ml a 10 až 12 jednotek/ml koagulační aktivity faktoru VIII.

Purifikace PB“

PB“ byl precipitován ze supematantu buněčné kultury užitím 60% nasyceného síranu amonného a pak byl purifikován imunoafinitní chromatografií a vysokotlakovou kapalinovou chromatografií na koloně monoQ, jak bylo již popsáno pro purifikaci prasečího faktoru VIII získaného z plazmy (Lollar et al., Factor VlII/factor Vlila. Methods in Enzymol. 222; 128-143, 1993). Specifická koagulační aktivita PB“ byla měřena jednostupňovým testem koagulační aktivity (viz Lollar et al., 1993) a byla podobná jako u prasečího faktoru VIII získaného z plazmy.

Pri analýze elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu se ukázalo, že preparát PB“ obsahuje tři pásy se zjevnou molekulovou hmotností 160 kDa, 82 kDa a 76 kDa. Pásy velikostí 82 kDa a

76 kDa byly j iž dříve popsány jako heterodimer obsahuj ící domény A1-A2 a ap-A3-C 1 —C2 (kde ap označuje aktivační peptid) (viz Toole et al., Nature 312: 342-347, 1984). Pás velikosti 160 kDa byl přenesen, na polyvinylidenfluoridovou membránu a podroben NH₂-terminálnímu sekvencování, které poskytlo sekvenci Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx představuje neurčenou aminokyselinu), což je NH₂-koncová sekvence jednořetězcového faktoru VIII (Toole et al.,

1984), Takže PB“ je částečně upravován štěpením mezi doménami A2 a A3, takže je tvořen dvěma formami, jednoretězcovým proteinem Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodimerem AlA2/ap-A3-C1472. Podobné úpravy rekombinantního HB“ byly také popsány (Lind et al., Eur. J. Biochem. 232: 19-27, 1995).

Charakterizace prasečího faktoru VIII

Byla určena sekvence cDNA prasečího faktoru VIII odpovídající úsek obsahující 137 bp 5'UTR, kódující sekvenci signálního peptidu (57 bp) a domény Al (1119 bp), A3 (990 bp), Cl (456 bp) a C2 (483bp). A tato sekvence společně s drive publikovanými sekvencemi B domény a úseků lehkého řetězce aktivačního peptidu (Toole et al., 1986, viz výše) a domény A2 (Lubin et al., 1994, viz výše) doplňuje a zakončuje stanovení sekvence cDNA prasečího faktoru Vlil odpovídající translatovanému produktu. Fragment cDNA obsahující úsek 5'UTR, signální peptid a doménu Al byl klonován pomocí protokolu 5'RACE RT-PCR. Oligonukleotidový primer založený na sekvenci lidské C2 byl úspěšný pri vytvoření RT-PCR produktu, který umožnil klonování A3, Cl a 5 poloviny domény C2. cDNA odpovídající 3'polovině domény C-2 a 3 LITR cDNA byla obtížně klonovatelná. Zbytek domény C2 byl nakonec klonován metodou cíleného procházení genu PCR (Parker et al., 1991, viz výše).

Sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 36 byla zcela jednoznačná až na nt 7045 v blízkosti

3-konce domény C2, kterým je buďto A, nebo G, jak bylo již uvedeno výše. Odpovídající kodony pak jsou GAC (Asp) nebo AAC (Asn). Lidské a myší kodony jsou GAC a CAG (Gin). Zda se jedná o polymorfismus nebo reprodukovatelný artefakt vnesený PCR není známo. cDNA pro rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor Vlil bez domény B obsahující substituci prasečí domény C2 jak s kodonem GAC tak AAC byly trvale exprimovány, aniž by byl zjištěn deteko5 vatelný rozdíl v prokoagulační aktivitě. To ukazuje, že mezi těmito dvěma variantami C2 domény není funkční rozdíl.

Srovnání predikovaných aminokyselinových sekvencí úplné sekvence prasečího faktoru Vílí, sekvence id. č. 37, s publikovanou lidskou sekvencí (Wood et al., viz výše) a myší sekvencí io (Elder et al., 1993, viz výše) je uvedeno na obr. IA až IH společně s vyznačenými místy potranslačních modifikací, proteolytického štěpení a rozpoznávání jinými makromolekulami.

Stupeň identity přiřazených sekvencí je uveden v tabulce VII. Jak již bylo zmíněno dříve, B domény těchto druhů jsou více rozdílné (divergentní) než domény A nebo C. To je v souladu s pozorováním, že B doména nemá i přes svou značnou velikost žádnou známou funkci (Elder et i? al. 1993, Tool et al. 1986). Výsledky uvedené v předkládaném vynálezu potvrdily doména B v prasečím faktoru Vlil není nutná pro jeho aktivitu. Na základě sekvenčních dat zde představených prasečí faktor VIII mající odstraněnou celou nebo část domény B se dá syntetizovat expresí cDNA kódující prasečí faktor VIII, která má deletované kodony pro část nebo celou doménu B.

Je také rozsáhlejší divergence v sekvenci odpovídající peptidu „Al doména APC/štěpné místo faktoru IXa“ (zbytky 337—372) a lehkého řetězce aktivačního peptidu (tabulka VII). Štěpné místo pro trombin v poloze 336 tvořící peptid 337-372 je zjevně ztraceno v myší sekvenci, nebol je zde glutamin místo argininu (Elder et al., 1993, viz výše). Relativně rychlá divergence štěpného peptidu pro trombin (u myšího faktoru VIII naznačený aktivační peptid 337-372) byla zaznamenána již dříve u fibrinopeptidů (Creighton, T.E., Proteins: Structures and Molecular Properties,

W.H.Freeman, New York, s. 105-138, 1993). Nepřítomnost biologické funkce u těchto peptidů jakmile jsou naštěpený, byla popsána jako možný důvod rychlé divergence. Arg562 v lidském ťVIII byl navržen jako důležitější štěpné místo pro aktivační protein C v průběhu inaktivace fVIII a fVIIIa (Fay P.J. et al., J. Biol, Chem. 266: 20139-20145, 1991). Toto místo je zachováno v lidské, prasečí i myší sekvenci faktoru VIII.

Na obrázcích 1A až 1H jsou tučně označena potenciální místa N-vázané glykosylace. Je zde 8 konzervativních míst potenciální místa N-vázané glykosylace, a sice jedno v doméně A1, jedno v doméně A2, čtyři v doméně B, jedno v doméně A3 a jedno v doméně Cl. 19 cysteinů domén A a C je zachováno, zatímco v cysteinech domény B je značná divergence. Šest z těchto sedmi disulfidických vazeb faktoru VIII bylo zjištěno také na homologních místech faktoru V a cerulopllasminu a obě disulfidické vazby domény C byly nalezeny u faktoru V (McMullen, B.A. et al., protein Sci. 4: 740-746, 1995). Lidský faktor VIII obsahuje sulfatované tyrosiny v polohách 346, 718, 719, 723, 1664 a 1680 (Pittmann, D.D. et al., Biochemistry 31: 3315-3325, 1992, Michnick, D.A. et al., J, Biol. Chem. 269: 20095-20102, 1994). Tyto aminokyselinové zbytky jsou konzervativní v myším a prasečím faktoru Vlil (obr, 1), i když program CLUSTALW nepřiřadil správně myší ty ros i n odpovídající Tyr346 v lidském ťVIII.

Myší a prasečí plazma může napravit nedostatečnou koagulaci plazmy člověka s hemofilii A, což je v souladu s mírou konzervativnosti sekvencí A a C domén u těchto biologických druhů.

Prokoagulační aktivita prasečího faktoru VIII je vyšší než u lidského faktoru VIII (Lollar et al, J. Biol. Chem. 267: 23652-23657, 1992). Rekombinantní prasečí faktor VIII (s odstraněnou doménou B) exprimovaný a purifikovaný podle předkládaného vynálezu projevuje také vyšší specifickou koagulační aktivitu ve srovnání s lidským ťVIII a je srovnatelná s aktivitou faktoru VIII izolovaného z prasečí plazmy. To může být způsobenou sníženou spontánní disociací A2 podjednotky z aktivního heterotrimeru A1/A2/A3-C1-C2 faktoru VIII. Zda tyto rozdíly v prokoagulační aktivitě odrážejí evoluční změny funkce jako příklad adaptace druhů (Perutz, M.F., Adv. Protein. Chem., 1996) není dosud známo. Nyní, když je úplná sekvence cDNA prasečího faktoru VIII odpovídající translatovanému produktu známá, metoda homologní skenovací mutageneze (Cunningham B.C. et al., Science 243: 1330-1336, 1989) může být cestou jak identiCZ 300959 B6 fikovat strukturní rozdíly mezí lidským a prasečím faktorem VIII, které jsou zodpovědné za vyšší aktivitu prasečího faktoru VIII.

Prasečí faktor VIII je typicky méně reaktivní s inhibičními protilátkami, které se tvoří u hemo5 filiků, kterým byla podána transfúze faktoru VIII nebo které se tvoří jako autoprotilátky v obecné populaci. To je základem pro užívání koncentrátu prasečího faktoru VIII pří léčení pacientů s inhibičními protilátkami (Hay a Lozier, 1995, viz výše). Většina inhibičních protilátek je namířena proti epitopům lokalizovaným v doméně A2 nebo C2 (Fulcher C.A. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732, 1985, Scandella, D. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 6152io 6156, 1988, Scandella, D. et al., Blood 74: 1618-1626, 1989). Navíc byl identifikován epitop neznámého významu, který se nalézá v doméně A3 nebo Cl (Scandella et al., 1989 viz výše, Scandella, D., Blood 82: 1767-1775, 1993, Nakai, H. et al., Blood 84: 224a, 1994). Epitop A2 byl mapováním lokalizován do úseku 484-508 homologní skenovací mutagenezí (Healey et al., 1995, viz výše). V tomto segmentu obsahujícím 25 aminokyselinových zbytků je relativně malý podíl identických sekvencí (16/25 neboli 64 %). Je zajímavé, že tento úsek, který se zdá být funkčně důležitý na základě toho, že protilátky proti němu jsou inhibiční, byl zjevně vystaven rychlejšímu genetickému posunu. Srovnáni prasečích domén A2 a A3 ukazuje, že epitop A2 nesdílí žádnou detekovatelnou homologií s doménou A3.

Inhibitorový epitop C2 lidského fVIII byl lokalizován mezi zbytky 2248 až 2312 delečním mapováním (Scandella, D., Blood 86: 1811-1819, 1995). Lidský a prasečí faktor VIII jsou z 83% identické v tomto segmentu obsahujícím 65 aminokyselinových zbytků. Avšak homologní skenovací mutageneze tohoto úseku vedla k charakterizaci C2 epitopu, jehož hlavní antigenní determinanta byla neočekávaně lokalizována do úseku odpovídajícího aminokyselinám 2181-2243 lidské sekvence (sekvence id. č. 2 a obr. IH).

Byly připraveny proteiny hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, kde různé části domény C2 byly nahrazeny odpovídající částí prasečího faktoru VIII užitím strategie popsané v předkládaném vynálezu (viz příklad 8). Syntéza různých C2-hybridních faktorů VIII byla provedena tak, že byla zkonstruována hybridní kódující DNA, a sice užitím nukleotidové sekvence kódující prasečí úsek C2 uvedené zde jako sekvence id.č. 37. Každý hybrid byl exprimován v transfekovaných buňkách, takže hybridní faktor VIII mohl být částečně purifikován z růstového média. Aktivita, v nepřítomnosti jakéhokoliv inhibitoru, byla měřena jednostupňovým koagulačním testem,

Panel pěti lidských inhibitorů byl užit k testování každého hybridního faktoru VIII. Bylo již dříve prokázáno, že plazma obsahující protilátku anti-faktor VIII je namířena proti lidské C2 doméně, neboť rekombinantní C2 doména neutralizuje inhibicí. Ve všech testovaných plazmách titr inhibitoru byl neutralizován z více jak 79 % doménou C2 nebo lehkým řetězcem ale méně než z 10% rekombinantní lidskou doménou A2. Kromě toho C2-hybridní faktory VIII byly testovány proti myší monoklonální protilátce, která se váze na doménu C2, a podobně jako lidské C2 inhibující protilátky, inhibuje vazbu faktoru VIII k fosfolipidům a k von Willebrandovu faktoru.

Srovnáním titrů inhibičních protilátek proti C2-hybridním faktorům VIII bylo ukázáno, že hlavní determinanta lidského C2 inhibitorového epitopu leží v úseku definovaném aminokyselinovým zbytky 2181-2243 (sekvence id. č. 2, viz také obr. IH). Protilátky anti_C2 namířené proti úseku COOH konce ke zbytku 2253 nebyl identifikovány u čtyřech z pěti sér pacientů. Při srovnání hybridy obsahující prasečí sekvenci odpovídající lidské sekvence aminokyselinových zbytků 2181-2199 a 2207-2243 se ukázalo, že oba tyto úseky přispívají k vazbě protilátky. Prasečí aminokyselinová sekvence odpovídající lidské sekvenci zbytků 2181-2243 je očíslována 19822044 v sekvenci id. č. 37. Sekvence prasečí DNA kódující prasečí aminokyseliny 1982-2004 představuje nukleotidy 5944-6132 v sekvenci id. č. 35.

S odkazem na obr. IH, je vidět, že v úseku 2181-2243 je rozdíl v 16 aminokyselinách mezi lidskou a prasečí sekvencí, Rozdíly byly nalezeny v aminokyselinách 2181, 2182, 2188,

2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 a 2243. Lze provést náhradu jedné nebo několika aminokyselin v těchto polohách a tím připravit modifikovaný faktor Vili, který je nereaktivní s inhibičními protilátkami proti lidské C2. Alaninová skenovací mutageneze poskytuje vhodnou metodu pro vytváření ataninových substitucí neutrálních zbytků, jak bylo již dříve popsáno. K nahrazováni lze užít i jiné aminokyseliny než alanin, jak se popisuje v předkládaném vynálezu. Náhrada jednotlivých aminokyselin alaninem, a to zejména těch aminokyselin, které nejsou shodné v lidské a prasečí sekvenci nebo lidské a myší sekvenci nebo které s velkou pravděpodobností přispívají k vazbě protilátky, může poskytnout modifikovaný faktor VIII se sníženou reaktivitou s inhibičními protilátkami.

io

Kromě toho strategie vložení aminokyselin s nižším irnunogenním potenciálem do definovaného úseku aminokyselinových zbytků 2181-2243 může poskytnout modifikovaný faktor VIII, který má sníženou imunogenicitu. Faktor VIII se sníženou imunogenicitou je vhodný jako náhražka faktoru VIII při léčení hemofilie u pacientů, která je výhodnější než faktor VIII s přirozenou sekvencí. U pacientů léčených faktorem VIII se sníženou imunogenicitou se s menší pravděpodobností vyvinou inhibiční protilátky a tudíž s menší pravděpodobností budou trpět sníženou účinností léčení po celou dobu života.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1A až IH společně ukazují srovnání přiřazených aminokyselinových sekvencí lidského, prasečího a myšího faktoru VIII. Obr. IA srovnává úsek signálního peptidu (lidský sekvence id. č. 40, prasečí sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1-19, myší sekvence id. č. 6, aminokyseliny

1-19). Aminokyselinové sekvence na obrázcích lAaž IH jsou číslovány tak, že první alanin zralého proteinu má číslo 1 a aminokyseliny signálního peptidu jsou tedy číslovány zápornými čísly. Sekvence lidského faktoru VIII id. č. 2 také začíná prvním alaninem zralého proteinu jakožto aminokyselinou číslo 1. V aminokyselinové sekvenci myšího faktoru VIII (sekvence id. č. 6) a prasečího faktoru VIII (sekvence íd. č. 37) první aminokyselina zralé sekvence (alanin) je aminokyselina očíslovaná 20. Obr. 1A až IH ukazují přiřazení odpovídajících sekvencí lidského, myšího a prasečího faktoru VIII, takže sekvence s největší identitou aminokyselin jsou přiřazeny k sobě. Číslování aminokyselin na obr. lAaž IH se vztahuje pouze k lidské sekvenci faktoru Vílí. Obr. 1B ukazuje aminokyselinové sekvence lidské domény Al (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 1-372), prasečí (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 20-391) a myší domény Al (sekvence id. ě. 6, aminokyseliny 20-391). Obr. IC ukazuje aminokyselinové sekvence lidské domény A2 faktoru VIII člověka (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 373-758), prasete (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 392-759) a myši (sekvence id. č. 6, aminokyseliny 392-759). Obr. ID ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidské domény B faktoru Vlil člověka (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 741-1648), prasete (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 760-1449) a myši (sekvence id. č. 6, aminokyseliny 760-1640). Obr. 1E porovnává aminokyselinové sekvence lehkého řetězce aktivačního peptidu faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 1649-1689, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1450-1490, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 1641-1678, v uvedeném pořadí). Obr. 1F poskytuje srovnání aminokyselinové sekvence domény A3 faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny

1690-2019, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1491-1820, sekvence id. č. 6, aminokyseliny

1679-2006, v uvedeném pořadí). Obr. 1G poskytuje aminokyselinové sekvence domén Cl faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 2020-2172, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1821-1973, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 2007-2159, v uvedeném pořadí). A nakonec obr. 1H uvádí sekvenční data domén C2 faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 2173-2332, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1974-2133, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 2160-2319, v uvedeném pořadí).

Kosočtverci jsou vyznačena místa sulfatace tyrosínu, tučné písmo označuje potenciální glykosylaČní místa, navrhovaná vazebná místa pro faktor IXa, fosfolipid a protein C jsou dvojitě podtržena a úseky účastnící se vazby inhibičních protilátek anti-A2 a anti-C2 jsou zvýrazněny kurzívou. Hvězdičky označují konzervativní aminokyselinově sekvence. Viz také sekvence id. č. 36 (cDNA prasečího faktoru VIII) a sekvence id. č. 37 (dedukovaná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII), bylo použito stejného číslování lidské sekvence faktoru VIII jako v referenční práci (Wood et al., 1984, viz výše). Domény Al, A2 a B jsou definovány pomocí štěpných míst pro trombin v polohách 372, 740 a místa pro neznámou proteázu v poloze 1648 jako segmenty zbytků 1-372, 373-740 a 741-1648 (Eatona, D.L. et al,, Biochemistry 25: 8343-8347, 1986). Domény A3, Cl a C2 jsou definovány jako segmenty zbytků 1690-2019, 2020-2172 a 2173-2332, v uvedeném pořadí (vehar et al., 1984, viz výše). Štěpná míst pro trombin (faktor Ila), faktor IXa, faktor X a APC (Fay et al., 1991, viz výše, Eaton, D, et al., io Biochemistry 25: 505-512, 1986, Lamphear, B.J. et al., Blood , 80: 3120-3128, 1992) jsou znázorněna tak, že název enzymu je uveden nad příslušným reaktivním argininem. Kyselý peptid je odštěpen od lehkého řetězce faktoru VIII trombinem nebo faktorem Xa v pozici 1689, Předpokládaná vazebná místa faktoru IXa (Fay et al., J. Biol. Chem. 269: 20522-20527, 1994, Lenting, P.J. et al., J. Biol, Chem. 269: 7150-7155, 1994), fosfolipid (Foster, P.A. et al., Blood

75: 1999-2004, 1990) a protein C (Walker, F.J. et al., J. Biol. Chem. 265: 1484-1489, 1990) jsou dvojitě podtržena. Úseky účastnící se vazby inhibičních protilátek anti-A2 (Lubin et al,, 1994., viz výše, Healey et aL, 1995, viz výše) a dříve předpokládaných anti-C2 jsou uvedena kurzívou. Inhibitorový epitop C2 identifikovaný podle předkládaného vynálezu (aminokyseliny 2181-2243 v lidské sekvenci) je znázorněn jednoduchým podtržením na obr. IH. Tyrosinová sulfatační místa

2o (Pittman et al., 1992, viz výše, Michnick et al., 1994, viz výše) jsou znázorněna symboly ♦. Rozpoznávací místa pro potenciální N-navázané gly kosy láce (NXS/T, kde X není prolin) jsou zvýrazněna tučně.

Nukleotidová sekvence kódující protein faktoru VIII postrádající doménu B je zde uvedena jako sekvence id. ě. 38 a odpovídající predikovaná aminokyselinová sekvence jako sekvence id. Č. 39.

Seznam sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCÍ S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9009 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (F) TYP TKÁNĚ: Játra (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 5125..7053 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= „struktura domény“ /poznámka^ „odpovídající doméně A3-C1-C2“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1 „2277 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt^ „struktura domény“ /poznámka= „odpovídající doméně A1-A2“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ; různé znaky (B) POZICE: L.2277 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= „doména“ io /poznámka= „cDNA kódující lidský faktor VIII“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

CAGTGGGTAA	GTTCCTTAAA	TGCTCTGCAA	AGAAATTGGG	ACTTTTCATT	AAATCAGAAA	60
TTTTACTTTT	TTCCCCTCCT	GGGAGCTAAA	GATATTTTAG	AGAAGAATTA	ACCTTTTGCT	120
TCTCCAGTTG	AACATTTGTA	GCAATAAGTC	ATGCAAATAG	AGCTCTCCAC	CTGCTTCTTT	180
CTGTGCCTTT	TGCGATTCTG	CTTTAGTGCC	ACCAGAAGAT	ACTACCTGGG	TGCAGTGGAA	240
CTGTCATGGG	ACTATATGCA	AAGTGATCTC	GGTGAGCTGC	CTGTGGACGC	AAGATTTCCT	300
CCTAGAGTGC	CAAAATCTTT	TCCATTCAAC	ACCTCAGTCG	TGTACAAAAA	GACTCTGTTT	360
GTAGAATTCA	CGGTTCACCT	TTTCAACATC	gctaagccaa	GGCCACCCTG	GATGGGTCTG	420

Cl 300959 B6

CTAGGTCCTA	CCATCCAGGC	TGAGGTTTAT	GATACAGTGG	TCATTACACT	TAAGAACATG	480
GCTTCCCATC	CTGTCAGTCT	TCATGCTGTT	GGTGTATCCT	ACTGGAAAGC	TTCTGAGGGA	540
GCTGAATATG	ATGATCAGAC	CAGTCAAAGG	GAGAAAGAAG	ATGATAAAGT	CTTCCCTGGT	600
GGAAGCCATA	CATATGTCTG	GCAGGTCCTG	AAAGAGAATG	GTCCAATGGC	CTCTGACCCA	650
CTGTGCCTTA	CCTACTCATA	TCTTTCTCAT	GTGGACCTGG	TAAAAGACTT	GAATTCAGGC	720
CTCATTGGAG	CCCTACTAGT	ATGTAGAGAA	GGGAGTCTGG	CCAAGGAAAA	GACACAGACC	730
TTGCACAAAT	TTATACTACT	TTTTGCTGTA	TTTGATGAAG	GGAAAAGTTG	GCACTCAGAA	840
ACAAAGAACT	CCTTGATGCA	GGATAGGGAT	GCTGCATCTG	CTCGC-GCCTG	GCCTAAAATG	900
CACACAGTCA	AT GGTTATGT	AAACAGGTCT	CTGCCAGGTC	TGATTGGATG	CCACAGGAAA	950
TCAGTCTATT	GGCATGTGAT	TGGAATGGGC	ACCACTCCTG	AAGTGCACTC	AATATTCCTC	1020
GAAGGTCACA	CATTTCTTGT	GAGGAACCAT	CGCCAGGCGT	CCTTGGAAAT	CTCGCCAATA	1080
actttcctta	CTGCTCAAAC	ACTCTTGATG	GACCTTGGAC	AGTTTCTACT	GTTTTGTCAT	1140
ATCTCTTCCC	ACCAACATGA	TGGCATGGAA	GCTTATGTCA	AAGTAGACAG	CTGTCCAGAG	1200
GAACCCCAAC	TACGAATGAA	AAATAATGAA	GAAGCGGAAG	ACTATGATGA	TGATCTTACT	1260
GATTCTGAAA	TGGATGTGGT	CAGGTTTGAT	GATGACAACT	CTCCTTCCTT	TATCCAAATT	1320
CGCTCAGTTG	CCAAGAAGCA	TCCTAAAACT	TGGGTACATT	ACATTGCTGC	TGAAGAGGAG	1380
GACTGGGACT	ATGCTCCCTT	AGTCCTCGCC	CCCGATGACA	GAAGTTATAA	AAGTCAATAT	1440
TTGAACAATG	GCCCTCAGCG	GATTGGTAGG	AAGTACAAAA	AAGTCCGATT	TATGGCATAC	1500
ACAGATGAAA	CCTTTAAGAC	TCGTGAAGCT	ATTCAGCATG	AATCAGGAAT	CTTGGGACCT	1560
TTACTTTATG	GGGAAGTTGG	AGACACACTG	TTGATTATAT	TTAAGAATCA	AGCAAGCAGA	1620
CCATATAACA	TCTACCCTCA	CGGAATCACT	GATGTCCGTC	CTTTGTATTC	AAGGAGATTA	1630
CCAAAAGGTG	TAAAACATTT	GAAGGATTTT	CCAATTCTGC	CAGGAGAAAT	ATTCAAATAT	1740
AAATGGACAG	TGACTGTAGA	AGATGGGCCA	ACTAAATCAG	ATCCTCGGTG	CCTGACCCGC	1800
TATTACTCTA	GTTTCGTTAA	TATGGAGAGA	GATCTAGCTT	CAGGACTCAT	TGGCCCTCTC	1860
CTCATCTGCT	A.CAAAGAATC	TGTAGATCAA	AGAGGAAACC	AGATAATGTC	AGACAAGAGG	1920
AATGTCATCC	TGTTTTCTGT	ATTTGATGAG	AACCGAAGCT	GGTACCTCAC	AGAGAATATA	1980
CAACGCTTTC	TCCCCAATCC	AGCTGGAGTG	CAGCTTGAGG	ATCCAGAGTT	CCAAGCCTCC	2040
AACATCATGC	ACAGCATCAA	TGGCTATGTT	TTTGATAGTT	TGCAGTTGTC	AGTTTGTTTG	2100
CATGAGGTGG	CATACTGGTA	CATTCTAAGC	ATTGGAGCAC	AGACTGACTT	CCTTTCTGTC	2160

C 1

TTCTTCTCTG	GATATACCTT	CAAACACAAA	ATGGTCTATG	AAGACACACT	CACCCTATTC	2220
CCATTCTCAG	C-AGAAACTGT	CTTCATGTCG	ATGGAAAACC	CACGTCTATG	GATTCTGGGG	2280
TGCCA.CAACT	CAGACTTTCG	GAACAGAGGC	ATGACCGCCT	TACTGAAGGT	TTCTAGTTGT	2340
GACAAGAACA	CTGGTGATTA	TTACGAGGAC	AGTTATGAAG	ATATTTCAGC	ATACTTGCTG	2400
AGTAAAAACA	ATGCCATTGA	accaagaagc	TTCTCCCAGA	ATTCAAGACA	CCCTAGCACT	2460
AGGCAAAAGC	AATTTAATGC	CACCACAATT	CCAGAAAATG	ACATAGAGAA	GACTGACCCT	2520
TGGTTTGCAC	ACAGAACACC	TATGCCTAAA	ATACAAAATG	TCTCCTCTAG	TGATTTGTTG	2580
ATGCTCTTGC	GACAGAGTCC	TACTCCACAT	GGGCTATCCT	TATCTGATCT	CCAAGAAGCC	2640
AAA.TATGAGA	CTTTTTCTGA	TGATCCATCA	CCTGGAGCAA	TAGACAGTAA	TAACAGCCTG	2700
TCTGAAATGA	CACACTTCAG	GCCACAGCTC	CATCACAGTG	GGGACATGGT	ATTTACCCCT	2760
GAGTCAGGCC	TCCAATTAAG	ATTAAATGAG	AAACTGGGGA	CAACTGCAGC	AACAGAGTTG	2Θ20
AAGAAACTTG	ATTTCAAAGT	TTCTAGTACA	TCAAATAATC	TGATTTCAAC	AATTCCATCA	2880
GACAATTTGG	CAGCAGGTAC	TG AT AAT ACA	AGTTCCTTAG	GACCCCCAAG	TATGCCAGTT	2940
CATTATGATA	GTCAATTAGA	TACCACTCTA	TTTGGCAAAA	AGTCATCTCC	CCTTACTGAG	3000
TCTGGTGGAC	CTCTGAGCTT	GAGTGAAGAA	AATAATGATT	CAAAGTTGTT	AGAATCAGGT	3060
TTAATGAATA	Gc CAAGAAAG	TTCATGGGGA	AAAAATGTAT	CGTCAACAGA	GAGTGGTAGG	3120
TTATTTAAAG	GGAAAAGAGC	TCATGGACCT	GCTTTGTTGA	CTAAAGATAA	TGCCTTATTC	3180
aaagttagca	TCTCTTTGTT	AAAGACAAAC	AAAACTTCCA	ATAATTCAGC	AACTAATAGA	3240
AAGACTCACA	TTGATGGCCC	ATCATTATTA	ATTGAGAATA	GTCCATCAGT	CTGGCAAAAT	3300
ATATTAGAAA	GTGACACTGA	GTTTAAAAAA	GTGACACCTT	TGATTCATGA	CAGAATGCTT	3360
ATGGACAAAA	ATGCTACAGC	TTTGAGGCTA	AATCATATGT	CAAATAAAAC	TACTTCATCA	3420
AAAAACATGG	AAATGGTCCA	ACAGAAAAAA	GAGGGCCCCA	TTCCACCAGA	TGCACAAAAT	3480
CCAGATATGT	CGTTCTTTAA	GATGCTATTC	TTGCCAGAAT	CAGCAAGGTG	GATACAAAGG	3540
ACTCATGGAA	AGAACTCTCT	GAACTCTGGG	CAAGGCCCCA	GTCCAAAGCA	ATTAGTATCC	3600
TTAGGACCAG	AAAAATCTGT	GGAAGGTCAG	AATTTCTTGT	CTGAGAAAAA	CAAAGTGGTA	3660
GTAGGAAAGG	GTGAATTTAC	AAAGGACGTA	GGACTCAAAG	AGATGGTTTT	TCCAAGCAGC	3720
AGAAACCTAT	TTCTTACTAA	CTTGGATAAT	TTACATGAAA	ATAATACACA	CAATCAAGAA	3780
AAAAAAATTC	AGGAAGAAAT	AGAAAAGAAG	GAAACATTAA	TCCAAGAGAA	TGTAGTTTTG	3840
CCTCAGATAC	ATACAGTGAC	TGGCACTAAG	AATTTCATGA	AGAACCTTTT	CTTACTGAGC	3900

ACTAGGCAAA	ATGTAGAAGG	TTCATATGAG	GGGGCATATG	CTCCAGTACT	TCAAGATTTT	3960
AGGTCATTAA	atgattcaac	AAATAGAACA	AAGAAACACA	CAGCTCATTT	CTCAAAAAAA	4020
GGGGAGGAAG	AAAACTTGGA	AGGCTTGGGA	AATCAAACCA	AGCAAATTGT	AGAGAAATAT	4080
GCATGCACCA	CAAGGATATC	TCCTAATACA	AGCCAGCAGA	ATTTTGTCAC	GGAACGTAGT	4140
AAGAGAGCTT	TGAAACAATT	CAGACTCCCA	CTAGAAGAAA	CAGAACTTGA	AAAAAGGATA	4200
attgtggatg	ACACCTCAAC	CCAGTGGTCC	AAAAACATGA	AACATTTGAC	CCCGAGCACC	4260
CTCACACAGA	TAGACTACAA	TGAGAAGGAG	AAAGGGGCCA	TTACTCAGTC	TCCCTTATCA	4320
GATTGCCTTA	CGAGGAGTCA	TAGCATCCCT	CAAGCAAATA	GATCTCCATT	ACCCATTGCA	4380
AAGGTATCAT	CATTTCCATC	TATTAGACCT	ATATATCTGA	CCAGGGTCCT	ATTCCAAGAC	4440
AACTCTTCTC	ATCTTCCAGC	AGCATCTTAT	AGAAAGAAAG	ATTCTGGGGT	CCAAGAAAGC	4500
AGTCATTTCT	TACAAGGAGC	CAAAAAAAAT	AACCTTTCTT	TAGCCATTCT	AACCTTGGAG	4560
ATGACTGGTG	ATCAAAGAGA	GGTTGGCTCC	CTGGGGACAA	GTGC.CACAAA	TTCAGTCAGA	4620
TACAAGAAAG	TTGAGAACAC	TGTTCTCCCG	AAACCAGACT	TGCCCAAAAC	ATCTGGCAAA	4580
GTTGAATTGC	TTCCAAAAGT	TCACATTTAT	CAGAAGGACC	TATTCCCTAC	GGAAACTAGC	4740
AATGGGTCTC	CTGGCCATCT	GGATCTCGTG	GAAGGGAGCC	TTCTTCAGGG	AACAGAGGGA	4800
GCGATTAAGT	GGAATGAAGC	AAACAGACCT	GGAAAAGTTC	CCTTTCTGAG	AGTAGCAACA	4860
GAAAGCTCTG	CAAAGACTCC	CTCCAAGCTA	TTGGATCCTC	TTGCTTGGGA	TAACCACTAT	4920
GGTACTCAGA	TACCAAAAGA AGAGTGGAAA	TCCCAAGAGA	AGTCACCAGA	AAAAACAGCT	4980
TTTAAGAAAA	AGGATACCAT	TTTGTCCCTG	AACGCTTGTG	AAAGCAATCA	TGCAATAGCA	5040
GCAATAAATG	AGGGACAAAA	TAAGCCCGAA	ATAGAAGTCA	CCTGGGCAAA	GCAAGGTAGG	5100
ACTGAAAGGC	TGTGCTC-TCA	AAACCCACCA	GTCTTGAAAC	GCCATCAACG	GGAAATAACT	5160
CGTACTACTC	TTCAGTCAGA	TCAAGAGGAA ATTGACTATG	ATGATACCAT	ATCAGTTGAA	5220
ATGAAGAAGG	AAGATTTTGA	catttatgat	GAG GAT G AAA	ATCAGAGCCC	CCGCAGCTTT	5280
CAAAAGAAAA	CACGACACTA	TTTTATTGCT	GCAGTGGAGA	GGCTCTGGGA	TTATGGGATG	5340
AGTAGCTCCC	CACATGTTCT	AAGAAACAGG	GCTCAGAGTG	GCAGTGTCCC	TCAGTTCAAG	5400
AAAGTTGTTT	TCCAGGAATT	TACTGATGGC	TCCTTTACTC	AGCCCTTATA	CCGTGGAGAA	5450
CTAAATGAAC	ATTTGGGACT	CCTGGGGCCA	TATATAAGAG	CAGAAGTTGA	AGATAATATC	5520
ATGGTAACTT	TCAGAAATCA	GGCCTCTCGT	CCCTATTCCT	TCTATTCTAG	CCTTATTTCT	5580
TATGAGGAAG	ATCAGAGGCA	AGGAGCAGAA	CCTAGAAAAA	ACTTTGTCAA	GCCTAATGAA	5640

. *·>.

ACCAAAACTT	ACTTTTGGAA	AGTGCAACAT	CATATGGCAC	CCACTAAAGA	tgagtttgac	5700
TGCAAAGCCT	GGGCTTATTT	CTCTGATGTT	GACCTGGAAA	AAGATGTGCA	CTCAGGCCTG	5760
ATTCGACCCC	TTCTGGTCTG	CCACACTAAC	ACACTGAACC	CTGCTCATGG	GAGACAAGTG	5820
ACAGTACAGG	AATTTGCTCT	_GTTTTTCACC	ATCTTTGATG	AGACCAAAAG	CTGGTACTTC	5380
ACTGAAAATA	TGGAAAGAAA	CTGCAGGGCT	CCCTGCAATA	TCCAGATGGA	AGATCCCACT	5940
TTTAAAGAGA	ATTATCGCTT	CCATGCAATC	AATGGCTACA	TAATGGATAC	ACTACCTGGC	6000
TTAGTAATGG	CTCAGGATCA	AAGGATTCGA	TGGTATCTGC	TCAGCATGGG	CAGCAATGAA	6060
AACATCCATT	CTATTCATTT	CAGTGGACAT	GTGTTCACTG	TACGAAAAAA	AGAGGAGTAT	6120
aaaatggcac	TGTACAATCT	CTATCCAGGT	GTTTTTGAGA	CAGTGGAAAT	GTTACCATCC	6180
AAAGCTGGAA	TTTGGCGGGT	GGAATGCCTT	ATTGGCGAGC	ATCTACATGC	TGGGATGAGC	6240
ACACTTTTTC	TGGTGTACAG	CAATAAGTGT	CAGACTCCCC	TGGGAATGGC	TTCTGGAGAC	6300
ATTAGAGATT	TTCAGATTAC	AGCTTCAGGA	CAATATGGAC	AGTGGGCCCC	AAAGCTGGCC	6360
AGACTTCATT	ATTCCGGATC	AATCAATGCC	TGGAGCACCA	AGGAGCCCTT	TTCTTGGATC	6420
AAGGTGGATC	TGTTGGCACC	AATGATTATT	CACGGCATCA	AGACCCAGGG	TGCCCGTCAG	6480
aagttctcca	GCCTCTAGAT	CTCTCAGTTT	ATCATCATGT	ATAGTCTTGA	TGGGAAGAAG	6540
TGGCAGACTT	ATCGAGGAAA	TTCCACTGGA	ACCTTAATGG	TCTTCTTTGG	CAATGTGGAT	6600
TCATCTGGGA	TAAAACACAA	TATTTTTAAC	CCTCCAATTA	TTGCTCGATA	CATCCGTTTG	6660
CACCCAACTC	ATTATAGCAT	TCGCAGCACT	CTTCGCATGG	AGTTGATGGG	CTGTGATTTA	6720
AATAGTTGCA	GCATGCCATT	GGGAATGGAG	AGTAAAGCAA	TATCAGATGC	ACAGATTACT	6780
GCTTCATCCT	ACTTTACCAA	TATGTTTGCC	ACCTGGTCTC	CTTCAAAAGC	TCGACTTCAC	6840
CTCCAAGGGA	GGAGTAATGC	CTGGAGACCT	CAGGTGAATA	ATCCAAAAGA	GTGGCTGCAA	6900
G7GGACTTCC	AGAAGACAAT	GAAAGTCACA	GGAGTAACTA	CTCAGGGAGT	AAAATCTCTG	5960
CTTACCAGCA	TGTATGTGAA	GGAGTTCCTC	ATCTCCAGCA	GTCAAGATGG	CCATCAGTGG	7020
ACTCTCTTTT	TTCAGAATGG	CAAAGTAAAG	GTTTTTCAGG	GAAATCAAGA	CTCCTTCACA	7030
CCTGTGGTGA	actctctaga	CCCACCGTTA	CTGACTCGCT	ACCTTCGAAT	TCACCCCCAG	7140
AGTTGGGTGC	ACCAGATTGC	CCTGAGGATG	GAGGTTCTGG	gctgcgaggc	ACAGGACCTC	7200
TACTGAGGGT	GGCCACTGCA	GCACCTGCCA	CTGCCC-TCAC	CTCTCCCTCC	TCAGCTCCAG	7260
GGCAGTGTCC	CTCCCTGGCT	TGCCTTCTAC	CTTTGTGCTA	AATCCTAGCA	GACACTGCCT	7320
TGAAGCCTCC	TGAATTAACT	AT CAT CAGT C	CTGCATTTCT	ŤTGGTGGGGG	GCCAGGAGGG	7380

TGC ATC CAA?	TTAACTTAAC	TCTTACCTAT	TTTCTGCAGC	TGCTCCCAGA	TTACTCCTTC	7440
CTTCCAATAT	AACTAGGCAA	AAAGAAGTGA	GGAGAAACCT	GCATGAAAGC	ATTCTTCCCT	7500
GAAAAGTTAG	GCCTCTCAGA	GTCACCACTT	CCTCTGTTGT	AGAAAAACTA	TGTGATGAAA	7560
CTTTGAAAAA	GATATTTATG	ATGTTAACAT	TTCAGGTTAA	GCCTCATACG	TTTAAAATAA	7620
AACTCTCAGT	TGTTTATTAT	CCTGATCAAG	CATGGAACAA	AGCATGTTTC	AGGATCAGAT	7680
CAATACAATC	TTGGAGTCAA	AAGGCAAATC	ATTTGGACAA	TCTGCAAAAT	GGAGAGAATA	7740
CAATAACTAC	TACAGTAAAG	TCTGTTTCTG	CTTCCTTACA	CATAGATATA	ATTATGTTAT	7800
TTAGTCATTA	TGAGGGGCAC	ATTCTTATCT	CCAAAACTAG	CATTCTTAAA	CTGAGAATTA	7350
TAGATGGGGT	TCAAGAATCC	CTAAGTCCCC	TGAAATTATA	TAAGGCATTC	TGTATAAATG	7920
CAAATGTGCA	TTTTTCTGAC	GAGTGTCCAT	AGATATAAAG	CCATTGGTCT	TAATTCTGAC	7980
CAATAAAAAA	ATAAGTCAGG	AGGATGCAAT	TGTTGAAAGC	TTTGAAATAA	AATAACATGT	3040
CTTCTTGAAA	TTTGTGATGG	CCAAGAAAGA	AAATGATGAT	GACATTAGGC	TTCTAAAGGA	8100
CATACATTTA	ATATTTCTGT	GGAAATATGA	GGAAAATCCA	TGGTTATCTG	AGATAGGAGA	8160
TACAAACTTT	GTAATTČTAA	TAATGCACTC	AGTTTACTCT	CTCCCTCTAC	TAATTTCCTG	8220
CTGAAAATAA	CACAACAAAA	ATGTAACAGG	GGAAATTATA	TACCGTGACT	GAAAACTAGA	8280
GTCCTACTTA	CATAGTTGAA	ATATCAAGGA	GGTCAGAAGA	AAATTGGACT	GGTGAAAACA	8340
GAAAAAACAC	TCCAGTCTGC	CATATCACCA	CACAATAGGA	TCCCCCTTCT	TGCCCTCCAC	8400
CCCCATAAGA	TTGTGAAGGG	TTTACTGCTC	CTTCCATCTG	CCTGCACCCC	TTCACTATGA	8460
CTACACAGAA	CTCTCCTGAT	AGTAAAGGGG	GCTGGAGGCA	AGGATAAGTT	ATAGAGCAGT	8520
TGGAGGAAGC	ATCCAAAGAC	TGCAACCCAG	GGCAAATGGA	AAACAGGAGA	TCCTAATATG	8580
AAAGAAAAAT	GGATCCCAAT	CTGAGAAAAG	GCAAAAGAAT	GGCTACTTTT	TTCTATGCTG	8640
GAGTATTTTC	TAATAATCCT	GCTTGACCCT	TATCTGACCT	CTTTGGAAAC	TATAACATAG	3700
CTGTCACAGT	ATAGTCACAA	TCCACAAATG	ATGCAGGTGC	AAATGGTTTA	TAGCCCTGTG	8760
AAGTTCTTAA	AGTTTAGAGG	CTAACTTACA	GAAATGAATA	AGTTGTTTTG	TTTTATAGCC	8820
CGGTAGAGGA	GTTAACCCCA	AAGGTGATAT	GGTTTTATTT	CCTGTTATGT	TTAACTTGAT	8880
aatcttattt	tggcattctt	TTCCCATTGA	CTATATACAT	CŤCTATTTCT	CAAATGTTCA	8940
TGGAACTAGC	TCTTTTATTT	TCCTGCTGGT	TTCTTCAGTA	ATGAGTTAAA	TAAAACATTG	9000

ACACATACA

9009 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2332 aminokyselin 5 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (F) TYP TKÁNĚ: Játra (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Ala Thr 1

Arg Arg

Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp

Tyr

5

10

15

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

20

25

30

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

Val

Tyr

Lys

35

40

45

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

Leu

Phe

Asn

Ile

Ala

Lys

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

Glu

Val

65

70

75

90

Tyr

Asp

Thr

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

35

90

95

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

Ser

Giu

Gly

Ala

100

105

110

Glu

Tyr

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp

Lys

Val

115

120

125

Phe

Pro

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

130

135

140

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

145

150

155

160

His Val· Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175

Leu

Val

Cys

Arg 180

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala 185

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin 190

Thr

Leu

His

Lys

Phe 195

Ile

Leu

Phe

Ala 200

Val

Phe

Asp

Glu

Gly 205

Lys

Ser

Trp

His

Ser 210

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser 215

Leu

Met

Gin

Asp

Arg 220

Asp

Ala

Ser

Ala 225

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys 230

Met

His

Thr

Val

Asn 235

Gly Tyr

Val

Asn

Arg 240

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 245

Ile

Gly

Cys

His

Arg 250

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp 255

His

Val

Ile

Gly

Met 260

Gly

Thr

Pro

Glu 265

Val

His

Ser

Ile

Phe 270

Leu

Glu

Gly

His

Thr 275

Phe

Leu

Val

Arg

Asn 280

His

Arg

Gin

Ala

Ser 285

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 290

Ile

Thr

Phe

Leu

Thr 295

Ala

Gin

Thr

Leu

Leu 300

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 305

Phe

LeU

Leu

Phe

Cys 310

His

Ile

ser

Ser

His 315

Gin

His

Asp

Gly

Met 320

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys 325

Val

Asp

Ser

Cys

Pro 330

Glu

Pro

Gin

Leu 335

Arg

Met

Lys

Asn

Asn 340

Glu

Ala

Glu

Asp 345

Tyr

Asp

Leu 350

Thr

Asp

Ser

Glu

Met 355

Asp

Val

Arg

Phe 360

Asp

Asn

Ser 365

Pro

Ser

Phe

Ile

Gin 370

Ile

Arg

Ser

Val

Ala 375

Lys

His

Pro

Lys 380

Thr

Trp

Val

His

Tyr 385

Ile

Ala

Glu

Glu 390

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr 395

Ala

Pro

Leu

Val

Leu 400

Ala

Pro

Asp

Arg 405

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin 410

Tyr

Leu

Asn

Gly 415

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg 420

Lys

Tyr

Lys

Lys 425

Val

Arg

Phe

Met

Ala 430

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr 435

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu 440

Ala

Ile

Gin

His

Glu 445

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly 450

Pro

Leu

Tyr

Gly 455

Glu

Val

Gly

Asp

Thr 460

Leu

Ile

Phe 465

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser 470

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile 475

Tyr

Pro

His

Gly

Ile 480

4*

Thr Asp

Val Arg

Pro 485

Leu

Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 490

Gly

Val 495

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys

Tyr

Lys

500

505

510

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

515

520

525

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Phe

Val

Asn

Met

Glu

Arg

Asp

Leu

Ala

530

535

540

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

545

550

555

560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Ile

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

565

570

575

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

Ile

Gin

580

585

590

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

595

600

605

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

val

Phe

Asp

Ser

610

615

620

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu

625

630

635

640

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

645

650

655

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

660

665

670

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

675

680

685

Ile

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

690

695

700

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Asp

Lys

Asn

Thr

Gly

Asp

Tyr

Glu

705

710

715

720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Ala

Tyr

Leu

Ser

Lys

Asn

Ala

725

730

735

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

740

745

750

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

Ile

Pro

Glu

Asn

Asp

Ile

Glu

Lys

755

760

765

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys lie Gin Asn 770 ' 775 780

Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro
735	790	795	800
His	Gly Leu Ser Leu Ser Asp 805	Leu Gin Glu Ala Lys 810	Tyr Glu Thr Phe 815
Ser	Asp Asp Pro Ser Pro Gly 820	Ala lle Asp Ser Asn 825	Asn Ser Leu Ser 830
Glu	Met Thr His Phe Arg Pro 835	Gin Leu His His Ser 840	Gly Asp Met Val 845
Phe	Thr Pro Glu Ser Gly Leu 850 855	Gin Leu Arg Leu Asn 860	Glu Lys Leu Gly
Thr 865	Thr Ala Ala Thr Glu Leu 870	Lys Lys Leu Asp Phe 875	Lys Val Ser Ser 880
Thr	Ser Asn Asn Leu lle Ser 885	Thr lle Pro Ser Asp 890	Asn Leu Ala Ala 895
Gly	Thr Asp Asn Thr Ser Ser 900	Leu Gly Pro Pro Ser 905	Met Pro Val His 910
Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr 915	Thr Leu Phe Gly Lys 920	Lys Ser Ser Pro 925
Leu	Thr Glu Ser Gly Gly Pro 930 935	Leu Ser Leu Ser Glu 940	Glu Asn Asn Asp
Ser 945	Lys Leu Leu Glu Ser Gly 950	Leu Met Asn Ser Gin 955	Glu Ser Ser Trp 960
Gly	Lys Asn Val Ser Ser Thr 965	Glu Ser Gly Arg Leu 970	Phe Lys Gly Lys 975
Arg	Ala His Gly Pro Ala Leu 980	Leu Thr Lys Asp Asn 985	Ala Leu Phe Lys 990
Val	Ser lle Ser Leu Leu Lys 995	Thr Asn Lys Thr Ser 1000	Asn Asn Ser Ala 1005
Thr	Asn Arg Lys Thr His lle Asp Gly Pro Ser Leu Leu Tle Glu Asn 1010 1015 1020
Ser Pro Ser Val Trp Gin Asn 1025 1030	lle Leu Glu Ser Asp 1035	Thr Glu Phe Lys 1040
Lys	Val Thr Pro Leu lle His 1045	Asp Arg Met Leu Met 1050	Asp Lys Asn Ala 1055
Thr	Ala Leu Arg Leu Asn His 1060	Met Ser Asn Lys Thr 1065	Thr Ser Ser Lys 1070
Asn	Met Glu Met Val Gin Gin	Lys Lys Glu Gly Pro	lle Pro Pro Asp

1075 1080 1085 cn

Ala Gin Asn	Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu
	1090	1095	1100
Ser	Ala Arg	Trp Ile Gin Arg Thr His Gly Lys	Asn Ser Leu Asn Ser
1105	1110 1115 1120
Gly	Gin Gly	Pro Ser Pro Lys Gin Leu Val Ser	Leu Gly Pro Glu Lys
		1125 1130	1135
Ser	Val Glu	Gly Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys	Asn Lys Val Val Val
		1140 1145	1150
Gly	Lys Gly	Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu	Lys Glu Met Val Phe
	1155 1160	1165
Pro	Ser Ser	Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu	Asp Asn Leu His Glu
	1170	1175	1180
Asn	Asn Thr	His Asn Gin Glu Lys Lys Ile Gin	Glu Glu Ile Glu Lys
1185	1190 1195 1200
Lys	Glu Thr	Leu Ile Gin Glu Asn. Val Val Leu	Pro Gin Ile His Thr
		1205 1210	1215
Val	Thr Gly	Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu	Phe Leu Leu Ser Thr
		1220 1225	1230
Arg	Gin Asn	Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala	Tyr Ala Pro Val Leu
	1235 1240	1245
Gin	Asp Phe	Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn	Arg Thr Lys Lys His
	1250	1255	1260
Thr	Ala His	Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu	Asn Leu Glu Gly Leu
1265	1270 1275 1280
Gly	Asn Gin	Thr Lys Gin Ile Val Glu Lys Tyr	Ala Cys Thr Thr Arg
		1285 1290	1295
Ile	Ser Pro	Asn Thr Ser Gin Gin Asn Phe Val	Thr Gin Arg Ser Lys
		1300 1305	1310
Arg	Ala Leu	Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu	Glu Thr Glu Leu Glu
	1315 1320	1325
Lys	Arg Ile	Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gin	Trp Ser Lys Asn Met
	1330	1335	1340
Lys	His Leu	Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin Ile	Asp Tyr Asn Glu Lys
1345	1350 1355 1360
Glu Lys Gly	Ala Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser	Asp Cys Leu Thr Arg

1365 1370 1375

Ser His Ser Tle Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1335 1390

Val	Ser	Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro	Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu 1405
1395	1400
Phe	Gin Asp Asn	Ser Ser His Leu Pro	Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
	1410	1415	1420
Asp	Ser	Gly Val	Gin Glu Ser Ser His	Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys
1425		1430	1435 1440
Asn	Asn	Leu Ser	Leu Ala Ile Leu Thr	Leu Glu Met Thr Gly Asp Gin
			1445	1450 1455
Arg	Glu	Val Gly	Ser Leu Gly Thr Ser	Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr
		1460 1465 1470
Lys	Lys	Val Glu	Asn Thr Val Leu Pro	Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
		1475	1480	1485
Ser	Gly	Lys Val	Glu Leu Leu Pro Lys	Val His Ile Tyr Gin Lys Asp
	1490	1495	1500
Leu	phe	Pro Thr	Glu Thr Ser Asn Gly	Ser Pro Gly His Leu Asp Leu
1505		1510	1515 1520
Val	Glu	Gly Ser	Leu Leu Gin Gly Thr	Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn
			1525	1530 1535
Glu	Ala	Asn Arg	Pro Gly Lys Val Pro	Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu
		1540 1545 1550
Ser	Ser	Ala Lys	Thr Pro Ser Lys Leu	Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp
		1555	1560	1565
Asn	His	Tyr Gly	Thr Gin Ile Pro Lys	Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu
	1570	1575	1580
Lys	Ser	Pro Glu	Lys Thr Ala Phe Lys	Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser
1585		1590	1595 1600
Leu	Asn	Ala Cýs	Glu Ser Asn His Ala	Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly
			1605	1610 1615
Gin	Asn	Lys Pro	Glu Ile Glu Val Thr	Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr
		1620 1625 1630
Glu	Arg	Leu Cys	Ser Gin Asn Pro Pro	Val Leu Lys Arg His Gin Arg
		1635	1640	1645
Glu	Xle	Thr Arg	Thr Thr Leu Gin Ser	Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr
	1650	1655	1660
Asp	Asp	Thr Ile	Ser Val Glu Met Lys	Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
1665		1670	1675 1680

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695

His	Tyr	Phe	Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu	Trp	Asp	Tyr Gly Met 1710	Ser
1700	1705
Ser	Ser	Pro	His Val Leu Arg	Asn Arg Ala	Gin	Ser	Gly Ser Val	Pro
		1715	1720			1725
Gin	Phe	Lys	Lys Val Val Phe	Gin Glu Phe	Thr	Asp	Gly Ser Phe	Thr
	1730	1735		1740
Gin	Pro	Leu	Tyr Arg Gly Glu	Leu Asn Glu	His	Leu	Gly Leu Leu	Gly
1745		1750		1755		1760
Pro	Tyr	Ile	Arg Ala Glu Val	Glu Asp Asn	Ile	Met	Val Thr Phe	Arg
			1765	1770		1775
Asn	Gin	Ala	Ser Arg Pro Tyr	Ser Phe Tyr	Ser	Ser	Leu Ile Ser	Tyr
			1780	1785			1790
Glu	Glu	Asp	Gin Arg Gin Gly	Ala Glu Pro	Arg	Lys	Asn Phe Val	Lys
		1795	1800			1805
Pro	Asn	Glu	Thr Lys Thr Tyr	Phe Trp Lys	Val	Gin	His His Met	Ala
	1810	1315		1820
Pro	Thr	Lys	Asp Glu Phe Asp	Cys Lys Ala	Trp	Ala	Tyr Phe Ser	Asp
1825		1830		1835		1840
Val	Asp	Leu	Glu Lys Asp Val	His Ser Gly	Leu	Ile	Gly Prc Leu	Leu
			1845	1850		1855
Val	Cys	His	Thr Asn Thr Leu	Asn Pro Ala	His	Gly	Arg Gin Val	Thr
			1860	1865			1870
Val	Glri	Glu	Phe Ala Leu phe	Phe Thr Ile	Phe	Asp	Glu Thr Lys	Ser
		1875	1880			1885
Trp	Tyr	Phe	Thr Glu Asn Met	Glu Arg Asn	Cys	Arg	Ala Pro Cys	Asn
	1890	1895		1900
Ile	Gin	Met	Glu Asp Pro Thr	Phe Lys Glu	Asn	Tyr	Axg Phe His	Ala
1905		1910		1915		1920
Ile	Asn	Gly	Tyr Ile Met Asp	Thr Leu Pro	Gly	Leu	Val Met Ala	Gin
			1925	1930		1935
Asp	Gin	Arg	Ile Arg Trp Tyr	Leu Leu Ser	Met	Gly	Ser Asn Glu	Asn
			1940	1545			1950
Ile	His	Ser	Ile His Phe Ser	Gly His Val	Phe	Thr	Val Arg Lys	Lys
		1955	1960			1965
Glu	Glu	Tyr	Lys Met Ala Leu	Tyr Asn Leu	Tyr	Pro	Gly Val Phe	Glu

1970 1975 1930

Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys 1985 1990 1995 2000

Leu	Ile Gly Glu	His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
2005	2010	2015
Tyr	Ser Asn Lys	Cys Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser	Gly His Ile
	2020 2025	2030
Arg Asp Phe Gin	Ile Thr Ala Ser Gly	Gin Tyr Gly Gin	Trp Ala Pro
	2035	2040	2045
Lys Leu Ala Arg	Leu His Tyr Ser Gly	Ser Ile Asn Ala	Trp Ser Thr
	2050	2055	2060
Lys	Glu Pro Phe	Ser Trp Ile Lys Val	Asp Leu Leu Ala	Pro Met Ile
2065	2070	2075	2080
Ile	His Gly Ile	Lys Thr Gin Gly Ala	Arg Gin Lys Phe	Ser Ser Leu
		2085	2090	2095
Tyr	Ile Ser Gin	Phe Ile Ile Met Tyr	Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
	2100 2105	2110
Gin	Thr Tyr Arg	Gly Asn Ser Thr Gly	Thr Leu Met Val	Phe Phe Gly
	2115	2120	2125
Asn	Val Asp Ser	Ser Gly Ile Lys His	Asn Ile Phe Asn	Pro Pro Ile
	2130	2135	2140
Ile	Ala Arg Tyr	Ile Arg Leu His Pro	Thr His Tyr Ser	Ile Arg Ser
2145	2150	2155	2160
Thr	Leu Arg Met	Glu Leu Met Gly Cys	Asp Leu Asn Ser	Cys Ser Met
		2165	2170	2175
Pro	Leu Gly Met	Glu Ser Lys Ala Ile	Ser Asp Ala Gin	Ile Thr Ala
	2180 2185	2190
Ser	Ser Tyr Phe	Thr Asn Met Phe Ala	Thr Trp Ser Pro	Ser Lys Ala
	2195	2200	2205
Arg	Leu His Leu	Gin Gly Arg Ser Asn	Ala Trp Arg Pro	Gin Val Asn
	2210	2215	2220
Asn	Pro Lys Glu	Trp Leu Gin Val Asp	Phe Gin Lys Thr	Met Lys Val
2225	2230	2235	2240
Thr	Gly Val Thr	Thr Gin Gly Val Lys	Ser Leu Leu Thr	Ser Met Tyr
		2245	2250	2255
Val	Lys Glu Phe	Leu Ile Ser Ser Ser	Gin Asp Gly His	Gin Trp Thr
	2260 2265	2270
Leu	Phe Phe Gin	Asn Gly Lys Val Lys	Val Phe Gin Gly	Asn Gin Asp
	2275	2280	2285
Ser	Phe Thr Pro	Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu	Leu Thr Arg

2290 2295 2300

Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp Val His Gin Ile Ala Leu Arg 2305 2310 2315 2320

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 2330 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 1130 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní to (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Prase (F) TYP TKÁNĚ: krev (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..1130 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= „oblast“ /poznámka^ „cDNA kódující doménu A2 prasečího faktoru VIII“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

TAAGCACCCT	AAGACGTGGG	TGCACTACAT	CTCTGCAGAG	GAGGAGGACT	GGGACTACGC	60
CCCCGCGGTC	CCCAGCCCCA	GTGACAGAAG	TTATAAAAGT	CTCTACTTGA	ACAGTGGTCC	120
TCAGCGAATT	GGTAGGAAAT	ACAAAAAAGC	TCGATTCGTC	GCTTACACGG	ATGTAACATT	130
TAAGACTCGT	AAAGCTATTC	CGTATGAATC	AGGAATCCTG	GGACCTTTAC	TTTATGGAGA	240
AGTTGGAGAC	ACACTTTTGA	TTATATTTAA	GAATAAAGCG	AGCCGACCAT	ATAACATCTA	300
CCCTCATGGA	ATCACTGATG	TCAGCGCTTT	GCACCCAGGG	AGACTTCTAA	AAGGTTGGAA	350
ACATTTGAAA	GACATGCCAA	TTCTGCCAGG	AGAGACTTTC	aagtataw	ggacagtgac	420
TGTGGAAGAT	GGGCCAACCA	AGTCCGATCC	TCGGTGCCTG	ACCCGCTACT	ACTCGAGCTC	480
CATTAATCTA	GAGAAAGATC	TGGCTTCGGG	ACTCATTGGC	CCTCTCCTCA	TCTGCTACAA	540
AGAATCTGTA	GACCAAAGAG	GAAACCAGAT	GATGTCAGAC	AAGAGAAACG	TCATCCTGTT	600
TTCTGTATTC	GATGAGAATC	AAAGCTGGTA	CCTCGCAGAG	AATATTCAGC	GCTTCCTCCC	660

CAATCCGGAT	GGATTACAGC	CCCAGGATCC	AGAGTTCCAA	GCTTCTAACA	TCATGCACAG	720
CATCAATGGC	TATGTTTTTG	ATAGCTTGCA	GCTGTCGGTT	TGTTTGCACG	AGGTGGCATA	780
CTGGTACATT	CTAAGTGTTG	GAGCACAGAC	GGACTTCCTC	TCCGTCTTCT	TCTCTGGCTA	840
CACCTTCAAA	CACAAAATGG	TCTATGAAGA	CACACTCACC	CTGTTCCCCT	TCTCAGGAGA	900
AACGGTCTTC	ATGTCAATGG	AAAACCCAGG	TCTCTGGGTC	CTAGGGTGCC	ACAACTCAGA	960
CTTGCGGAAC	AGAGGGATGA	CAGCCTTACT	GAAGGTGTAT	AGTTGTGACA	GGGACATTGG	1020
TGATTATTAT	GACAACACTT	ATGAAGATAT	TCCAGGCTTC	ttgctgagtg	GAAAGAATGT	1080
CATTGAACCC	AGAAGCTTTG	CCCAGAATTC	AAGACCCCCT	AGTGCGAGCA		1130

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 368 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Prase (F) TYP TKÁNĚ: slezina (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: Protein 25 (B) POZICE: 1..368 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „predikovaná aminokyselinová sekvence domény A2 prasečího faktoru VIII, definovaná jako zbytky homologní k lidskému faktoru VIII, aminokyseliny 373-740, Zbytky 1-4 jsou ze známé prasečí aminokyselinové sekvence.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

Ser 1

Val

Ala

Ly3 Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ser Ala

5

10

15

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

20

25

30

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly

35

40

45

ct

Arg Lys 50

Tyr

Lys Lys Ala Arg Phe Val Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe

55

60

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

lle

Pro

Tyr

Glu

Ser

Gly

lle

Leu

Gly

Pro

Leu

65

70

75

80

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly Asp

Thr

Leu

Xle

Phe

Lys

Asn

Lys

85

90

95

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

lle

Tyr

Pro

His

Gly

Xle

Thr

Asp

Val

Ser

100

105

110

Ala

Leu

His

Pro

Gly Arg

Leu

Lys

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

115

120

125

Met

Pro

lle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

130

135

140

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

145

150

155

160

Tyr

Ser

lle

Asn

Leu

Glu

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

lle

165

170

175

Gly

Pro

Leu

lle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

180

185

190

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

Xle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

195

200

205

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

Asn

lle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

210

215

220

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

lle

Met

His

Ser

lle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

245

250

255

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

Xle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

260

265

270

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

275

280

285

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

290

295

300.

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

305

310

315

320

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

325

330

335

Tyt

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

Xle

Gly

Asp

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

340

345

350

Asp lle Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly Lys Asn Val lle Glu Pro Arg 355 360 365 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7493 párů bází 5 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA io (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: repetice (B) POZICE: 1..407 (D) DALŠÍ INFORMACE: /typ repetice= „koncová“ /poznámka= „5' UTR“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 7471..7476 (D) DALŠÍ INFORMACE: /funkce- „signál polyA“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: repetice (B) POZICE: 7368..7493 (D) DALŠÍ INFORMACE: / typ repetice = „koncová“ /poznámka= „3' UTR“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 408..7367 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkte „koagulační faktor VIII“ (x) INFORMACE K PUBLIKACI:

(A) AUTOŘI: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J.

(B) TITUL: Sequence of the murine Factor VIII cDNA (C) ČASOPIS: Genomics (D) DÍL: 16 (F) STRÁNKY: 374-379 (G) DATUM: 1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

TCTAGAGTTT CTTTGCTACA GGTACCAAGG AACAGTCTTT TAGAATAGGC TAGGAATTTA

AATACACCTG	AACGCCCCTC	CTCAGTATTC	TGTTCCTTTT	CTTAAGGATT	CAAACTTGTT	120
AGGATGCACC	CAGCAGGAAA	TGGGTTAAGC	CTTAGCTCAG	CCACTCTTCC	TATTCCAGTT	130
TTCCTGTGCC	TGCTTCCTAC	TACCCAAAAG	GAAGTAATCC	TTCAGATCTG	TTTTGTGCTA	240
ATGCTACTTT	CACTCACAGT	AGATAAACTT	CCAGAAAATC	CTCTGCAAAA	TATTTAGGAC	300
TTTTTACTAA	ATCATTACAT	ttctttttgt	TCTTAAAAGC	TAAAGTTATT	TTAGAGAAGA	360
GTTAAATTTT	CATTTCTTTA	GTTGAACATT	TTCTAGTAAT	AAAAGCCATG	CAAATAGCAC	42 0
TCTTCGCTTG	CTTCTTTCTG	AGCCTTTTCA	A.TTTCTGCTC	TAGTGCCATC	AGAAGATACT	480
ACCTTGGTGC	AGTGGAATTG	TCCTGGAACT	ATATTCAGAG	TGATCTGCTC	AGTGTGCTGC	540
ATACAGACTC	AAGATTTCTT	CCTAGAATGT	CAACATCTTT	TCCATTCAAC	ACCTCCATCA	600
TGTATAAAAA	GACTGTGTTT	GTAGAGTACA	AGGACCAGCT	TTTCAACATT	GCCAAGCCCA	660
GGCCACCCTG	GATGGGTTTG	CTAGGTCCTA	CCATTTGGAC	TGAGGTTCAT	GACACAGTGG	720
TCATTACACT	TAAAAACATG	GCTTCTCATC	CTgTcagtct	TCATGCTGTT	GGTGTGTCCT	780
ACTGGAAAGC	TTCTGAGGGA	GATGAATATG	AAGATCAGAC	AAGCCAAATG	GAGAAGGAAG	340
ATGATAAAGT	TTTCCCTGGT	GAAAGTCATA	CTTATGTTTG	GCAAGTCCTG	AAAGAGAATG	900
GTCCAATGGC	CTCTGACCCT	CCATGTCTCA	CTTACTCATA	TATGTCTCAT	GTGGATCTGG	950
TGAAAGATTT	GAATTCAGGC	CTCATTGGAG	CTCTGCTAGT	ATGTAAAGAA	GGCAGTCTCT	1020
CCAAAGAAAG	AACACAGATG	TTGTACCAAT	TTGTACTGCT	TTTTGCTGTA	TTTGATGAAG	1080
GGAAGAGCTG	GCACTCAGAA	ACAAACGACT	CTTATACACA	GTCTA7GGAT	TCTGCATCTG	1140
CTAGAGACTG	GCCTAAAATG	CACACAGTCA	ATGGCTATGT	AAACAGGTCT	CTTCCAGGTC	1200
TGATTGGATG	CCATAGGAAA	TCAGTCTACT	GGCACGTGAT	TGGAATGGGC	ACCACTCCTG	1260
AAATACA.CTC	AATATTCCTC	GAAGGTCACA	CATTTTTTGT	GAGGAACCAC	CGTCAAGCTT	1320
CATTGGAGAT	ATCACCAATA	ACTTTCCTTA	CTGCTCAAAC	ACTCTTGATA	GATCTTGGGC	1330
AGTTCCTACT	ATTTTGTCAT	ATCTCTTCCC	ATAAACATGA	TGGCATGGAA	GCTTATGTCA	1440
AAGTAGATAG	CTGCCCTGAG	GAATCCC.AAT	GGCAAAAGAA	AAATAATAAT	GAGGAAATGG	1500
AAGATTATGA	TGATGATCTT	TATTCAGAAA	TGGATATGTT	CACATTGGAT	TATGACAGCT	1560
CTCCTTTTAT	CCAAATTCGC	TCGGTTGCTA	AAAAGTACCC	TAAAACTTGG	ATACATTATA	1620
TTTCTGCTGA	GGAGGAAGAC	TGGGACTATG	CACCTTCAGT	TCCTACCTCG	GATAATGGAA	1680
GTTATAAAAG	CCAGTATCTG	AGCAATGGTC	CTCATCGGAT	TGGTAGGAAA	TATAAAAAAG	1740
TCAGATTTAT	AGCATACACA	GATGAAACCT	TTAAGACTCG	TGAAACTATT	CAGCATGAAT	1ΘΟΟ

CAGGACTCTT	gggacctťta	CTTTATGGAG	AAGTTGGAGA	CACACTGTTG	ATTATTTTTA	1860
AGAATCAAGC	AAGCCGACCA	TATAACATTT	ACCCTCATGG	AATCACTGAT	GTCAGTCCTC	1920
TACATGCAAG	GAGATTGCCA	AGAGGTATAA	AGCACGTGAA	GGATTTGCCA	ATTCATCCAG	1980
GAGAGATATT	CAAGTACAAG	TGGACAGTTA	CAGTAGAAGA	TGGACCAACT	AAATCAGATC	2040
CACGGTGCCT	GACCCGCTAT	TATTCAAGTT	TCATTAACCC	TGAGAGAGAT	CTAGCTTCAG	2100
GACTGATTGG	CCCTCTTCTC	atctgctaca	AAGAATCTGT	AGATCAAAGG	GGAAACCAGA	2160
TGATGTCAGA	CAAAAGAAAT	GTCATCCTGT	TTTCTATATT	TGATGAGAAC	CAAAGCTGGT	2220
ACATCACAGA	GAACATGCAA	CGCTTCCTCC	CCAATGCAGC	TAAAACACAG	CCCCAGGACC	2280
CTGGGTTCCA	GGCCTCCAAC	ATCATGCACA	GCATCAATGG	CTATGTTTTT	GATAGCTTGG	2340
AGTTGACAGT	TTGTTTGCAT	GAGGTGGCAT	ACTGGCACAT	TCTCAGTGTT	GGAGCACAGA	2400
CAGACTTCTT	ATCTATCTTC	TTCTCTGGAT	ATACTTTCAA	ACACAAAATG	GTCTATGAAG	2460
ATACACTTAC	CCTGTTCCCA	TTCTCAGGAG	AAACTGTCTT	TATGTCGATG	GAAAACCCAG	2520
GTCTATGGGT	CTTGGGGTGT	CATAATTCAG	ACTTTCGGAA	GAGAGGTATG	ACAGCATTGC	2580
TGAAAGTTTC	TAGTTGTGAC	AAGAGCACTA	GTGATTATTA	TGAAGAAATA	TATGAAGATA	2640
TTCCAACACA	GTTGGTGAAT	GAGAACAATG	TCATTGATCC	CAGAAGCTTC	TTCCAGAATA	2700
CAAATCATCC	TAATACTAGG	AAAAAGAAAT	TCAAAGATTC	CACAATTCCA	AAAAATGATA	2760
TGGAGAAGAT	TGAGCCTCAG	TTTGAAGAGA	TAGCAGAGAT	GCTTAAAGTA	CAGAGTGTCT	2820
CAGTTAGTGA	CATGTTGATG	CTCTTGGGAC	AGAGTCATCC	TACTCCACAT	GGCTTATTTT	2880
TATCAGATGG	CCAAGAAGCC	ATCTATGAGG	CTATTCATGA	TGATCATTCA	CCAAATGCAA	2940
TAGACAGCAA	TGAAGGCCCA	TCTAAAGTGA	CCCAACTCAG	GCCAGAATCC	CATCACAGTG	3000
AGAAAATAGT	ATTTACTCCT	CAGCCCGGCG	TCCAGTTAAG	ATCCAATAAA	AGTTTGGAGA	3060
CAACTATAGA	AGTAAAGTGG	AAGAAACTTG	GTTTGCAAGT	TTCTAGTTTG	CCAAGTAATC	3120
TAATGACTAC	AACAATTCTG	TCAGACAATT	TGAAAGCAAC	TTTTGAAAAG	ACAGATTCTT	3L30
CAGGATTTCC	AGATATGCCA	GTTCACTCTA	GTAGTAAATT	AAGTACTACT	GCATTTGGTA	3240
AGAAAGCATA	TTCCCTTGTT	GGGTCTCATG	TACCTTTAAA	CGCGAGTGAA	GAAAATAGTG	3300
ATTCCAACAT	ATTGGATTCA	ACTTTAATGT	ATAGTCAAGA	AAGTTTACCA	AGAGATAATA	3360
TATTATCAAT	AGAGAATGAT	AGATTACTGA	GAGAGAAGAG	GTTTCATGGA	ATTGCTTTAT	3420
TGACCAAAGA	TAATACTTTA	TTCAAAGACA	ATGTCTCCTT	AATGAAAACA	AACAAAACAT	3480
ATAATCATTC	AACAACTAAT	GAAAAACTAC	ACACTGAGAG	CCCAACATCA	ATTGAGAATA	3540

zn

GTACAACAGA	CTTGCAAGAT	GCCATATTAA	AGGTCAATAG	TGAGATTCAA	GAAGTAACAG	3600
CTTTGATTCA	TGATGGAACA	CTTTTAGGCA	AAAATTCTAC	ATATTTGAGA	CTAAACCATA	3660
TGCTAAATAG	AACTACCTCA	ACAAAAAATA	AAGACATATT	TCATAGAAAA	GATGAAGATC	3720
CTATTCCACA	AGATGAAGAG	AATACAATCA	TGCCATTTTC	CAAGATGTTG	TTCTTGTCAG	3780
AATCTTCAAA	TTGGTTTA^A	AAGACCAATG	GAAATAATTC	CTTGAACTCT	GAGCAAGAAC	3040
ATAGTCCAAA	GCAATTAGTA	TATTTAATGT	TTAAAAAATA	TGTAAAAAAT	CAAAGTTTCT	3300
TGTCAGAGAA	AAATAAAGTC	ACAGTAGAAC	AGGATGGATT	TACAAAGAAC	ATAGGACTTA	3360
AAGACATGGC	TTTTCCACAT	AATATGAGCA	TATTTCTTAC	CACTTTGTCT	AACGTACATG	4020
AAAATGGTAG	GCACAATCAA	gaaaaaaata	TTCAGGAAGA	GATAGAGAAG	GAAGCACTAA	4080
TTGAAGAGAA	AGTAGTTTTG	CCCCAGGTGC	ACGAAGCAAC	TGGCTCTAAG	AATTTCTTGA	.4140
AAGACATATT	GATACTAGGC	ACTA.GGCAAA	ATATAAGTTT	ATATGAAGTA	CATGTACCAG	4200
TACTTCAAAA	CATCACATCA	ATAAACAATT	CAACAAATAC	AGTACAGATT	CACATGGAGC	4260
ATTTCTTTAA	AAGAAGGAAG	GACAAGGAAA	CAAATTCAGA	AGGCTTGGTA	AATAAAACCA	4320
GAGAAATGGT	AAAAAACTAT	CCAAGCCAGA	AGAATATTAC	tactcaacgt	AGTAAACGGG	4380
CTTTGGGACA	ATTCAGACTG	TCAACTCAAT	GGCTTAAAAC	CATAAACTGT	TCAACACAGT	4440
GTATCATTAA	ACAGATAGAC	CACAGCAAGG	AAATGAAAAA	GTTCATTACT	AAATCTTCCT	4500
TATCAGATTC	TTCTGTGATT	AAAAGCACCA	CTCAGACAAA	TAGTTCTGAC	TCACACATTG	4560
TAAAAACATC	AGCATTTCCA	CCAATAGATC	TCAAAAGGAG	TCCATTCCAA	AACAAATTTT	4620
CTCATGTTCA	AGCATCATCC	TACATTTATG	ACTTTAAGAC	AAAAAGTTCA	AGAATTCAAG	4600
AAAGCAATAA	TTTCTTAAAA	GAAACCAAAA	TAAATAACCC	TTCTTTAGCC	ATTCTACCAT	4740
GGAATATGTT	CATAGATCAA	GGAAAATTTA	CCTCCCCAGG	GAAAAGTAAC	ACAAACTCAG	4300
TCACATATAA	GAAACGTGAG	AACATTATTT	TCTTGAAACC	AACTTTGCCT	GAAGAATCTG	4860
GCAAAATTGA	ATTGCTTCCT	CAAGTTTCCA	TTCAAGAGGA	AGAAATTTTA	CCTACAGAAA	4920
CTAGCCATGG	ATCTCCTGGA	CACTTGAATC	TCATGAAAGA	GGTCTTTCTT	CAGAAAATAC	4980
AGGGGCCTAC	TAAA7GGAAT	AAAGCAAAGA	GGCATGGAGA	AAGTATAAAA	GGTAAAACAG	5040
AGAGCTCTAA	AAATACTCGC	TCAAAACTGC	TAAATCATCA	TGCTTGGGAT	TATCATTATG	5100
CTGCACAGAT	ACCAAAAGAT	ATGTGGAAAT	CCAAAGAGAA	GTCACCAGAA	ATTATATCCA	5160
TTAAGCAAGA	GGACACCATT	TTGTCTCTGA	GGCCTCATGG	AAACAGTCAT	TCAATAGGGG	5220
CAAATGAGAA	ACAAAATTGG	CCTCAAAGAG	AAACCACTTG	GGTAAAGCAA	GGCCAAACTC	5280

CZ 300959 Bó

AAAGGACATG	CTCTCAAATC	CCACCAGTGT	TGAAACGACA	TCAAAGGGAA	CTTAGTGCTT	5340
TTCAA.TCAGA	ACAAGAAGCA	ACTGACTATG	ATGATGCCAT	CACCATTGAA	ACAATCGAGG	5400
ATTTTGACAT	TTACAGTGAG	GACATAAAGC	AAGGTCCCCG	CAGCTTTCAA	CAGAAAACAA	5460
GGCACTATTT	TATTGCAGCT	GTGGAACGAC	TCTGGGACTA	TGGGATGAGT	ACATCTCATG	5520
TTCTACGAAA	TAGGTATCAA	AGTGACAATG	TACCTCAGTT	CAAGAAAGTA	GTTTTCCAGG	5590
AATTTACTGA	TGGCTCCTTT	AGTCAGCCCT	TATATCGTGG	AGAATTAAAT	GAACACCTGG	5640
GGTTGTTGGG	CCCATATATA	AGAGCAGAAG	TTGAAGACAA	CATTATGGTA	ACTTTCAAAA	5700
ACCAGGCCTC	CCGTCCCTAC	TCCTTCTATT	CTAGCCTCAT	TTCTTATAAA	GAAGATCAGA	5760
GAGGAGAAGA	ACCTAGAAGA	AACTTTGTCA	AGCCTAAT6A	AACCAAAATT	TATTTTTGGA	5820
AAGTACAACA	TCATATGGCA	CCCACAGAAG	ATGAGTTTGA	ctgcaaggcc	TGGGCTTATT	5380
TCTCTGATGT	TGATCTTGAA	AGAGATATGC	ACTCGGGATT	AATTGGACCC	CTTCTGATTT	5940
GCCACGCGAA	CACACTGAAT	CCTGCTCATG	GGAGACAAGT	GTC AGT A CAG	GAATTTGCTC	6000
TGCTTTTCAC	TATCTTTGAT	GAGACCAAGA	GCTGGTACTT	CACTGAAAAC	GTGAAAAGGA	6060
ACTGCAAGAC	ACCCTGCAAT	TTCCAGATGG	AAGACCCCAC	TTTGAAAGAG	AATTATCGCT	6120
TCCATGCAAT	CAATGGTTAT	GTAATGGATA	CCCTACCAGG	CTTAGTAATG	GCTCAAGATC	6180
AAAGGATTCG	ATGGTATCTT	CTCAGCATGG	GCAACAATGA	GAACATCCAA	TCTATTCATT	6240
TCAGTGGACA	TGTTTTCACT	GTACGGAAAA AAGAGGAGTA	TAAAATGGCA	GTGTACAACC	6300
TCTACCCAGG	TGTTTTTGAG	ACTCTGGAAA	TGATACCATC	CAGAGCTGGA	ATATGGCGAG	6360
TAGAATGCCT	TATTGGCGAG	CACTTACAGG	CTGGGATGAG	CACTCTTTTT	CTGGTGTACA	6420
GCAAGCAGTG	TCAGATTCCT	CTTGGAATGG	CTTCTGGAAG	CATCCGTGAT	TTCCAGATTA	6480
CAGCTTCAGG	ACATTATGGA	CAGTGGGCCC	CAAACCTGGC	AAGACTTCAT	TATTCCGGAT	6540
CAATCAATGC	CTGGAGTACC	AAGGAGCCCT	TTTCTTGGAT	CAAGGTAGAT	CTGTTGGCAC	6600
CAATGATTGT	TCA.TGGCATC	AAGACTCAGG	GTGCTCGTCA	GAAATTTTCC	AGCCTTTATA	6660
TCTCTCAATT- TATCATCATG	TATAGCCTGG	ATGGGAAGAA	GTGGCTGAGT	TATCAAGGAA	6720
ATTCCACTGG	AACCTTAATG	GTTTTCTTTG	GCAATGTGGA	CTCATCTGGG	ATTAAGCATA	6790
ATAGTTTTAA	TCCTCCAATT	ATTGCTCGAT	ATATCCGTTT	GCACCCCACT	CATTCTAGCA	6840
TCCGTAGTAC	TCTTCGCATG	GAGTTGATGG	GCTGTGATTT	AAACAGTTGC	AGCATACCAT	6900
TGGGAATGGA	AAGTAAAGTA	ATATCAGATA	CACAAATCAC	TGCCTCATCC	TACTTCACCA	6960
ACATGTTTGC	TACTTGGTCT	CCTTCACAAG	CTCGACTTCA	CCTCCAGGGA	AGGACTAATG	7020

1

CCTGGCGACC	TCAGGTGAAT	GATCCAAAAC	AATGGTTGCA	AGTGGACTTA	CAAAAGACAA	7080
TGAAAGTCAC	7GGAATAATA	ACCCAGGGAG	TGAAATCTCT	CTTTACCAGC	ATGTTTGTGA	7140
AAGAGTTCCT	TATTTCCAGC	AGTCAAGATG	GCCATCACTG	GACTCAAATT	TTATACAATG	7200
GCAAGGTAAA	GGTTTTTCAG	GGGAATCAGG	ACTCATCCAC	ACCTATGATG	AATTCTCTAG	7260
ACCCACCATT	ACTCACTCGC	TATCTTCGAA	TTCACCCCCA	GATCTGGGAG	CACCAAATTG	7320
CTCTGAC-GCT	TGAGATTCTA	GGATGTGAGG	CCCAGCAGCA	ATACTSAGGT	AGCCTCTGCA	7380
TCACCTGCTT	ATTCCCCTTC	CTCAGCTCAA	AGATTGTCTT	AATGTTTTAT	TGCTGTGAAG	7440
AGACACTATG	ACCATGGCAA	CTCTTTATAA	AATAAAGCAT	TTAATCAGGG	CTT	7493

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2319 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární i o (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (x) INFORMACE K PUBLIKACI:

(A) AUTOŘI: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J.

(B) TITUL: Sequence of the Murine Factor VIII cDNA (C) ČASOPIS: Genomics (D) DÍL: 16 (F) STRÁNKY: 374-379 (G) DATUM: 1993 (K) RELEVANTNÍ ZBYTKY V SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: OD

DO 2319 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

Met Gin Ile Ala Len Phe Ala Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Phe 15 10 15

Cys Ser Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30

Cl 300959 B6

Trp Asn Tyr

Ile Gin

Ser

Asp

Leu Leu Ser Val Leu His

Thr

Asp

Ser

35

40

45

Arg

Phe

Leu

Pro

Arg

Met

Ser

Thr

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

Ile

50

55

60

Met

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Tyr

Lys

Asp

Gin

Leu

Phe

Asn

65

70

75

30

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

85

SO

95

Trp

Thr

Glu

Val

His

Asp

Thr

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser

His

Pra

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

115

120

125

Ser

Glu

Gly Asp

Glu

Tyr

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Met

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Glu

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

val

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

Ser

Tyr

Met

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

Ile

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Leu

Ser

Lys

Glu

Arg

195

200

205

Thr

Gin

Met

Leu

Tyr

Gin

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Asn

Asp

Ser

Tyr

Thr

Gin

Ser

Met

225

230

235

240

Asp

Ser

Ala

Ser

Ala

Arg

Asp

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Arg

Lys

Ser

260

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Pro

Glu

Ile

His

Ser

275

280

285

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Val

Arg

Asn

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Ile

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu

305

310

315

320

Ile

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

P.he

Cys

His

Ile

Ser

His

Lys

325 330 335 ~I7

His

Asp

Gly

Met 340

Glu Ala Tyr VaL Lys Val 345

Asp

Ser

Cys

Pro 350

Glu

GLu

Ser

Gin

Trp

Gin

Lys

Asn

Glu

Met

Glu

Asp

Tyr

Asp

355

360

365

Asp

Leu

Tyr

Ser

Glu

Met

Asp

Met

Phe

Thr

Leu

Asp

Tyr

Asp

Ser

370

375

380

Ser

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

385

390

335

400

Trp

Ile

His

Tyr

Ile

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

Ser

Val

Pro

Thr

Ser

Asp

Asn

Gly

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Ser

420

425

430

Asn

Gly

Pro

His

Arg

Ile

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Val

Arg

Phe

ile

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Thr

Ile

Gin

HÍS

Glu

450

455

460

Ser

Gly

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro

485

490

495

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Pro

Leu

His

Ala

Arg

Leu

Pro

Arg

500

505

510

Gly

Ile

Lys

His

Val

Lys

Asp

Leu

Pro

Ile

His

Pro

Gly

Glu

Ile

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Phe

Ile

Asn

Pro

Glu

Arg

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

530

585

550

Ile

Leu

Phe

Ser

Ile

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Ile

Thr

Glu

595

600

605

Asn

Met

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Gin

Asp

610 615 620

Pro Gly Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640

CZ 300959 Bó

Phe

Asp

Ser

Leu

Glu Leu Thr Val Cys 645

Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

650

655

His

Ile

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Ile

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

690

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

Asp

725

730

735

Tyr

Glu

Ile

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Thr

Gin

Leu

Val

Asn

Glu

740

745

750

Asn

Val

Ile

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Asn

Thr

Asn

His

Pro

755

760

765

Asn

Thr

Arg

Lys

Phe

Lvs

Asp

Ser

Thr

Ile

Pro

Lys

Asn

Asp

770

775

780

Met

Glu

Lys

Ile

GlU

Pro

Gin

Phe

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Leu

Lys

785

790

795

800

Val

Gin

Ser

Val

Ser

Val·

Ser

Asp

Met

Leu

Met

Leu

Gly

Gin

Ser

805

810

815

His

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Phe

Leu

Ser

Asp

Gly

Gin

Glu

Ala

Ile

820

825

830

Tyr

Glu

Ala

Ile

His

Asp

His

Ser

Pro

Asn

Ala

Ile

Asp

Ser

Asn

835

840

845

Glu

Gly

Pro

Ser

Lys

Val

Thr

Gin

Leu

Arg

Pro

Glu

Ser

His

Ser

850

855

860

Glu

Lys

Ile

Val

Phe

Thr

Pro

Gin

Pro

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Ser

Asn

865

870

975

880

Lys

Ser

Leu

Glu

Thr

Ile

Glu

Val

Lys

Trp

Lys

Leu

Gly

Leu

385

890

895

Gin

Val

Ser

Leu

Pro

Ser

Asn

Leu

Met

Thr

Ile

Leu

Ser

900

905

910

Asp

Asn

Leu

Lys

Ala

Thr

Phe

Glu

Lys

Thr

Asp

Ser

Gly

Phe

Pro

915

920

925

Asp

Met

Pro

Val

His

Ser

ser

Lys

Leu

Ser

Thr

Ala

Phe

Gly

930

935

940

CZ 300959 Bó

Lys 945

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu Val 950

Gly

Ser

His Val 955

Pro

Leu

Asn

Ala

Ser 960

Glu

Asn

Ser

Asp 965

Ser Asn

Ile

Leu

Asp Ser 970

Thr

Leu

Met

Tyr 97 5

Ser

Gin

Glu

Ser

Leu 980

Pro

Arg Asp

Asn

Ile 985

Leu Ser

Ile

Glu

Asn 990

Asp

Arg

Leu

Arg 995

Glu

Lys

Arg Phe

His Gly 1000

Ile Ala

Leu

Leu Thr 1005

Lys

Asp

Asn

Thr Leu 1010

Phe

Lys

Asp Asn Val 1015

Ser

Leu Met

Lys Thr 1020

Asn

Lys

Thr

Tyr Asn 1025

His

Ser

Thr

Thr Asn 1030

Glu

Lys

Leu His Thr 1035

Glu

Ser

Pro

Thr 1040

Ser

Ile

Glu

Asn

Ser Thr Thr 1045

Asp

Leu

Gin Asp 1C50

Ala

Ile

Leu

Lys Val 1055

Asn

Ser

Glu

Ile Gin 1060

Glu Val

Thr

Ala Leu Ile 1065

His

Asp

Gly Thr 1070

Leu

Gly

Lys Asn 1075

Ser

Thr Tyr

Leu Arg 1080

Leu Asn

His

Met Leu 1085

Asn

Arg

Thr

Thr Ser 1090

Thr

Lys

Asn Lys Asp 1095

Ile

Phe His

Arg Lys 1100

Asp

Glu,

, Asp

Pro Ile 1105

Pro

Gin

Asp

Glu Glu 1110

Asn

Thr

Ile Met Pro 1115

Phe

Ser

Lys

Met 1120

Leu

Phe

Leu

Ser

Glu Ser Ser 1125

Asn

Trp

Phe Lys 1130

Lys

Thr

Asn

Gly Asn 1135

Asn

Ser

Leu

Asn Ser 1140

Glu Gin

Glu

His Ser Pro 1145

Lys

Gin

Leu Val 1150

Tyr

Leu

Met

Phe Lys 1155

Lys

Tyr Val

Lys 116C

Asn )

Gin Ser

Phe

Leu Ser 1165

Glu

Lys

Asn

Lys 117C

Val 1

Thr

Val

Glu Gin 1175

Asp

Gly

Phe Thr

Lys Asn 1180

Ile

Gly

Leu

Lys 1185

Asp I

Met

Ala

Phe

Pro His 1190

Asn

Met

Ser Ile 1195

Phe 1

Leu

Thr

Leu 1200

Ser

Asn

Val

His

Glu 1205

Asn Gly l·

Arg

His

Asn Gin 1210

Glu

Lys

Asn

Ile 1215

Gin 1

Glu

Ile

Glu

Lys

Glu Ala

Leu

Ile

Glu Glu

Lys

Val

Leu

Pro

1220 1225 1230

Gin Val His Glu Ala Thr Gly Ser Lys Asn Phe Leu Lys Asp Ile Leu 1235 1240 1245

Ile Leu Gly	Thr Arg Gin Asn Ile Ser Leu Tyr Glu Val His Val	Pro
1250	1255	1260
Val Leu Gin 1265	Asn Ile Thr Ser Ile Asn Asn 1270	Ser Thr Asn Thr Val 1275	Gin 1280
Ile His Met	Glu His Phe Phe Lys Arg Arg Lys Asp Lys Glu Thr Asn 1285 1290 1295
Ser Glu Gly	Leu Val Asn Lys Thr Arg Glu 1300 1305	Met Val Lys Asn Tyr 1310	Pro
Ser Gin Lys Asn Ile Thr Thr Gin Arg Ser 1315 1320	Lys Arg Ala Leu Gly 1325	Gin
Phe Arg Leu 1330	Ser Thr Gin Trp Leu Lys Thr 1335	Ile Asn Cys Ser Thr 1340	Gin
Cys Ile Ile 1345	Lys Gin Ile Asp His Ser Lys 1350	Glu Met Lys Lys Phe 1355	Ile 1360
Thr Lys Ser	Ser Leu Ser Asp Ser Ser Val Ile Lys Ser Thr Thr Gin 1365 1370 1375
Thr Asn Ser	Ser Asp Ser His Ile Val Lys 1380 1385	Thr Ser Ala Phe Pro 1390	Pro
Ile Asp Leu Lys Arg Ser Pro Phe Gin Asm 1395 1400	Lys Phe Ser His Val 1405	Gin
Ala Ser Ser 1410	Tyr Ile Tyr Asp Phe Lys Thr 1415	Lys Ser Ser Arg Ile 1420	Gin
Glu Ser Asn 1425	Asn Phe Leu Lys Glu Thr Lys 1430	Ile Asn Asn Pro Ser 1435	Leu 1440
Ala Ile Leu	Pro Trp Asn Met Phe Ile Asp Gin Gly Lys Phe Thr Ser 1445 1450 1455
Pro Gly Lys	Ser Asn Thr Asn Ser Val Thr 1460 1465	Tyr Lys Lys Arg Glu 1470	Asn
Ile Ile Phe Leu Lys Pro Thr Leu Pro Glu 1475 14Θ0	Glu Ser Gly Lys Ile 1485	Glu
Leu Leu Pro 1490	Gin Val Ser Ile Gin Glu Glu 1495	Glu Ile Leu Pro Thr 1500	Glu
Thr Ser His 1505	Gly Ser Pro Gly His Leu Asn 1510	Leu Met Lys Glu Val 1515	Phe 1520
Leu Gin Lys	Ile Gin Gly Pro Thr Lys Trp	Asn Lys Ala Lys Arg	His

1525 1530 1535

Gly Glu Ser Ile Lys Gly Lys Thr Glu Ser Ser Lys Asn Thr Arg Ser 1540 1545 1550

Cl 300959 B6

Lys Leu Leu Asn His His Ala Trp Asp Tyr His Tyr Ala Ala Gin Ile
	1555	1560	1565
Pro	Lys Asp Met Trp Lys Ser	Lys Glu	Lys Ser Pro Glu Ile Ile Ser
	1570 1575	1580
ile	Lys Gin Glu Asp Thr Ile	Leu Ser	Leu Arg Pro His Gly Asn Ser
1585 1590		1595 1600
His	Ser Ile Gly Ala Asn Glu	Lys Gin	Asn Trp Pro Gin Arg Glu Thr
	1605		1610 1615
Thr	Trp Val Lys Gin Gly Gin	Thr Gin	Arg Thr Cys Ser Gin Ile Pro
	1620	1625 1630
Pro	Val Leu Lys Arg His Gin	Arg Glu	Leu Ser Ala Phe Gin Ser Glu
	1635	1640	1645
Gin	Glu Ala Thr Asp Tyr Asp	Asp Ala	Ile Thr Ile Glu Thr Ile Glu
	1650 1655	1660
Asp	Phe Asp Ile Tyr Ser Glu	Asp Ile	Lys Gin Gly Pro Arg Ser Phe
1665 1670		1675 1680
Gin	Gin Lys Thr Arg His Tyr	Phe Ile	Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
	1685		1690 1695
Asp	Tyr Gly Met Ser Thr Ser	His Val	Leu Arg Asn Arg Tyr Gin Ser
	1700	1705 1710
Asp	Asn Val Pro Gin Phe Lys	Lys Val	Val Phe Gin Glu Phe Thr Asp
	1715	1720	1725
Gly	Ser Phe Ser Gin Pro Leu	Tyr Arg	Gly Glu Leu Asn Glu His Leu
	1730 1735	1740
Gly	Leu Leu Gly Prc Tyr Ile	Arg Ala	Glu Val Glu Asp Asn Ile Met
1745	> 1750		1755 1760
Val	Thr Phe Lys Asn Gin Ala	Ser Arg	Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
	1765		1770 1775
Leu	Ile Ser Tyr Lys Glu Asp	Gin Arg	Gly Glu Glu Pro Arg Arg Asn
	1780	1795 1790
Phe	Val Lys Pro Asn Glu Thr	Lys Ile	Tyr Phe Trp Lys Val Gin His
	1795	1800	1805
His	Met Ala Pro Thr Glu Asp	Glu Phe	Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr
	1810 1815	1820
Phe	Ser Asp Val Asp Leu Glu	Arg Asp	Met His Ser Gly Leu Ile Gly
1825	1930		1335 1840

Pro Leu Leu Ile Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg

1345 1850 1855

Gin Val Ser Val Gin Glu Phe Ala Leu Leu Phe Thr lle Phe Asp Glu
	1850	1865	1870
Thr Lys	Ser Trp Tyr Phe	Thr Glu Asn Val Lys Arg Asn Cys Lys Thr
	1875	1880 1885
Pro Cys	Asn Phe Gin Met	Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu	Asn Tyr Arg
1890	1895 1900
Phe His	Ala Tle Asn Gly	Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro	Gly Leu Val
1905	1910 1915	1920
Met Ala	Gin Asp Gin Arg	lle Arg Trp Tyr Leu Leu Ser	Met Gly Asn
	1925	1930	1935
Asn Glu	Asn lle Gin Ser	lle His Phe Ser Gly His Val	Phe Thr Val
	1940	1945	1950
Arg Lys	Lys Glu Glu Tyr	Lys Met Ala Val Tyr Asn Leu	Tyr Pro Gly
	1955	1960 1965
Val Phe	Glu Thr Leu Glu	Met Tle Pro Ser A_rg Ala Gly	Xle Trp Arg
1970	1975 1980
Val Glu	Cys Leu Tle Gly	Glu His Leu Gin Ala Gly Met	Ser Thr Leu
1985	1990 1995	2000
Phe Leu	Val· Tyr Ser Lys	Gin Cys Gin lle Pro Leu Gly	Met Ala Ser
	2005	2010	2015
Gly Ser	lle Arg Asp Phe	Gin lle Thr Ala Ser Gly His	Tyr Gly Gin
	2020	2025	2030
Trp Ala	Pro Asn Leu Ala	Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser	lle Asn Ala
	2035	2040 2045
Trp Ser	Thr Lys Glu Pro	Phe Ser Trp lle Lys Val Asp	Leu Leu Ala
2050	2055 2060
Pro Met	lle Val His Gly	lle Lys Thr Gin Gly Ala Arg	Gin Lys Phe
2065	2070 2075	2080
Ser Ser	Leu Tyr Xle Ser	Gin Phe lle Tle Met Tyr Ser	Leu Asp Gly
	2085	2090	2095
Lys Lys	Trp Leu Ser Tyr	Gin Gly Asn Ser Thr Gly Thr	Leu Met Val
	2100	2105	2110
Phe Phe	Gly Asn Val Asp	Ser Ser Gly lle Lys His Asn	Ser Phe Asn
	2115	2120 2125
Pro Pro	lle lle Ala Arg	Tyr lle Arg Leu His Pro Thr	His Ser Ser
2130	213S 2140
lle Arg	Ser Thr Leu Arg	Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser

2145

2150

2155

2160

Cys	Ser Ile	Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Val	Ile Ser Asp Thr Gin 2175
2165	2170
Ile	Thr Ala	Ser Ser Tyr 2180	Phe Thr Asn Met Phe 2185	Ala Thr Trp Ser Pro 2190
Ser	Gin Ala Arg Leu His 2195	Leu Gin Gly Arg Thr 2200	Asn Ala Trp Arg Pro 2205
Gin	Val Asn 2210	Asp Pro Lys	Gin Trp Leu Gin Val 2215	Asp Leu Gin Lys Thr 2220
Met Lys Val 2225	Thr Gly ile ile Thr Gin Gly Val Lys Ser Leu Phe Thr 2230 2235 2240
Ser	Met Phe	Val Lys Glu 2245	Phe Leu Ile Ser Ser 2250	Ser Gin Asp Gly His 2255
His	Trp Thr	Gin Ile Leu 2260	Tyr Asn Gly Lys Val 2265	Lys Val Phe Gin Gly 2270
Asn	Gin Asp Ser Ser Thr 2275	Pro Met Met Asn Ser 2280	Leu Asp Pro Pro Leu 2235
Leu	Thr Arg 2290	Tyr Leu Arg	Ile His Pro Gin Ile 2295	Trp Glu His Gin Ile 2300
Ala 2305	Leu Arg	Leu Glu Ile 231C	Leu Gly Cys Glu Ala Gin Gin Gin Tyr i 2315

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7: CCTTCCTTTA TCCAAATACG TAGATCAAGA GGAAATTGAC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární cz 300959 B6 (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

GTAGCGTTGC CAAGAAGCAC CCTAAGACG 2 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

.. GAAGAGTAGT ACGAGTTATT TCTCTGGGTT CAATGAC 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne 40 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

CCTTTATCCA AATACGTAGC GTTTGCCAAG AAG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

O 1 (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky io (B) POZICE: 1..19 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka- „R je A nebo G a N je A, T, G nebo C.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM II:

AARCAYCCNA ARACNTGGG 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

_írt GCTCGCACTA GGGGGTCTTG AATTC 25 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: obě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (A) DESCRIPTION: /desc ^_ „oligonukleotidový primer, dvouvláknový od nukleotidů

37-44, 3' konec krátkého vlákna blokován aminoskupinou.“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 37..44

CZ 300959 Bó (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „dvouvláknový v oblasti od nukleotidů 37-44, 3' konec je blokován aminoskupinou pro redukci nespecifického nasedání primerů.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

lo (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární 15 (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

CCATTGACAT GAAGACCGTT TCTC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 páru bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární so (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

GGGTGCAAAG CGCTGACATC AGTG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů bází so (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

CCTCTCGAGC CACCATGTCG AGCCACCATG CAGCTAGAGC TCTCCACCTG 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

CGCGCGGCCG CGCATCTGGC AAAGCTGAGT T 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 25..27 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „V pozici 25, R je A nebo G.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

GAAATAAGCC CAGGCTTTGC AGTCRAA 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární 40 (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 21..22 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „V pozici 22, N je A,G,C nebo T “ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

oc

AGGAAATTCC ACTGGAACCT TN 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ϋ) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..25 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka“ „V pozici 25, N je A,G,C nebo T.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

CTGGGGGTGA ATTCGAAGGT AGCGN 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

GAGTTCATCG GGAAGACCTG TTG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

ACAGCCCATC AACTCCATGC GAAG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché is (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

TCAGGGCAAT CAGGACTCC 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární _ 87 _

CZ 300959 Bó (ií) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

GTAGAGGTCC TGTGCCTCGC AGCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází ís (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..27 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka- „S je G nebo C, K je G nebo T, Rje A nebo G, a Y je C nebo T “ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

GTAGAGSTSC TGKGCCTCRC AKCCYAG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

CTTCGCATGG AGTTGATGGG CTGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární to (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30: AATCAGGACT CCTCCACCCC CG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31: GGATCCACCC CACGAGCTGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne so (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

_ eo _

CGCCCTGAGG CTCGAGGTTC TAGG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární o (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

AATCAGGACT CCTCCACCCC CG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

CCTTGCAGGA ATTCGATTCA 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6402 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité to (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Prase (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: L.6402 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

ATG Met 1

CAG CTA GAG CTC TCC

ACC TGT GTC TTT CTG TGT CTC TTG

CCA Pro 15

CTC Leu

43

Gin Leu

Glu Leu 5

Ser

Thr Cys

Val

Phe Leu 10

Cys

Leu

GGC

TTT

AGT

GCC

ATC

AGG

AGA

TAC

CTG

GGC

GCA

GTG

GAA

CTG

TCC

S6

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

TGG

GAC

TAC

CGG

CAA

AGT

GAA

CTC

CGT

GAG

CTG

CAC

GTG

GAC

ACC

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

AGA

TTT

CCT

GCT

ACA

GCG

CCA

GGA

GCT

CTT

CCG

TTG

GGC

CCG

TCA

GTC

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

CTG

TAC

AAA

AAG

ACT

GTG

TTC

GTA

GAG

TTC

ACG

GAT

CAA

CTT

TTC

AGC

240

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

GTT Val

GCC AGG CCC

AGG Arg 85

CCA CCA TGG ATG

GGT CTG Gly Leu 90

CTG GGT Leu Gly

CCT Pro

ACC Thr 95

ATC Ile

233

Ala

Arg

Pro

Trp

Met

CAG

GCT

GAG

GTT

TAC

GAC

ACG

GTG

GTC

GTT

ACC

CTG

AAG

AAC

ATG

GCT

336

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

TCT

CAT

ccc

GTT

AGT

CTT

CAC

GCT

GTC

GGC

GTC

TCC

TTC

TGG

AAA

TCT

334

ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

TCC

GAA

GGC

GCT

GAA

TAT

GAG

GAT

CAC

ACC

AGC

CAA

AGG

GAG

AAG

GAA

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

GAC

GAT

AAA

GTC

CTT

CCC

GGT

AAA

AGC

CAA

ACC

TAC

GTC

TGG

CAG

GTC

430

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

CTG

AAA

GAA

AAT

GGT

CCA

ACA

GCC

TCT

GAC

CCA

TGT

CTC

ACC

TAC

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

TCA

TAC

CTG

TCT

CAC

GTG

GAC

CTG

GTG

AAA

GAC

CTG

AAT

TCG

GGC

CTC

576

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

130

185

190

ATT

GGA

GCC

CTG

GTT

TGT

AGA

GAA

GGG

AGT

CTG

ACC

AGA

GAA

AGG

624

Ile

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

ACC

CAG

AAC

CTG

CAC

GAA

TTT

GTA

CTÁ

CTT

TTT

GCT

GTC

TTT

GAT

GAA

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

GGG

AAA

AGT

TGG

CAC

TCA

GCA

AGA

AAT

GAC

TCC

TGG

ACA

CGG

GCC

ATG

720

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ma

Met

225

230

235

240

GAT

ccc

GCA

CCT

GCC

AGG

GCC

CAG

CCT

GCA

ATG

CAC

ACA

GTC

AAT

GGC

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Acg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

TAT

GTC

AAC

AGG

TCT

CTG

CCA

GGT

CTG

ATC

GGA

TGT

CAT

AAG

AAA

TCA

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

GTC

TAC

TGG

CAC

GTG

ATT

GGA

ATG

GGC

ACC

AGC

CCG

GAA

GTG

CAC

TCC

364

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Prc

Glu

Val

His

Ser

275

280

2S5

ATT

TTT

CTT

GAA

GGC

CAC

ACG

TTT

CTC

GTG

AGG

CAC

CAT

CGC

CAG

GCT

912

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

HÍS

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ma

290

295

300

TCC TTG GAG ATC TCG

CCA CTA ACT TTC CTC ACT GCT

CAG ACA TTC

CTG Leu 320

960

Ser Leu Glu 305

Ile

Ser

Pro 310

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Phe

ATG

GAC

CTT

GGC

CAG

TTC

CTA

CTG

TTT

TGT

CAT

ATC

TCT

TCC

CAC

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

HÍ5

His

325

330

335

CAT

GGT

GGC

ATG

GAG

GCT

CAC

GTC

AGA

GTA

GAA

AGC

TGC

GCC

GAG

1056

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

340

345

350

CCC

CAG

CTG

CGG

AGG

AAA

GCT

GAT

GAA

GAG

GAA

GAT

TAT

GAT

GAC

AAT

1104

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

TTG

TAC

GAC

TCG

GAC

ATG

GAC

GTG

GTC

CGG

CTC

GAT

GGT

GAC

GTG

1152

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly Asp

Asp

Val

370

375

380

TCT

CCC

TTT

ATC

CAA

ATC

CGC

TCG

GTT

GCC

AAG

CAT

CCC

AAA

ACC

1200

Ser

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

TGG

GTG

CAC

TAC

ATC

TCT

GCA

GAG

GAC

TGG

GAC

TAC

GCC

CCC

1248

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

GCG

GTC

CCC

AGC

CCC

AGT

GAC

AGA

AGT

TAT

AAA

AGT

CTC

TAC

TTG

AAC

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

AGT

GGT

CCT

CAG

CGA

ATT

GGT

AGG

AAA

TAC

AAA

GCT

CGA

TTC

GTC

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile.

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

GCT

TAC

ACG

GAT

GTA

ACA

TTT

AAG

ACT

CGT

AAA

GCT

ATT

CCG

TAT

GAA

1392

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lyš

Ala

Ile

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

TCA

GGA

ATC

CTG

GGA

CCT

TTA

CTT

TAT

GGA

GAA

GTT

GGA

GAC

ACA

CTT

1440

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly Asp

Thr

Leu

465

470

475

430

TTG

ATT

ATA

TTT

AAG

AAT

AAA

GCG

AGC

CGA

CCA

TAT

AAC

ATC

TAC

CCT

1488

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro

485

490

495

CAT

GGA

ATC

ACT

GAT

GTC

AGC

GCT

TTG

CAC

CCA

GGG

AGA

CTT

CTA

AAA

1536

HiS

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

500

505

510

GGT

TGG

AAA

CAT

TTG

AAA

GAC

ATG

CCA

ATT

CTG

CCA

GGA

GAG

ACT

TTC

1534

Gly

Trp

Lys

HÍS

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

GlU

Thr

Phe

515

520

525

m

CZ 300959 Bó

AAG TAT

AAA TGG ACA GTG ACT GTG GAA GAT GGG

CCA ACC

AAG Lys

TCC Ser

GAT Asp

1632

Lys

Tyr 530

Lys

Trp Thr Val Thr 535

Val

Glu

Asp

Gly

Pro 540

Thr

CCT

CGG

TGC

CTG

ACC

CGC

TAC

TCG

AGC

TCC

ATT

AAT

CTA

GAG

AAA

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

GAT

CTG

GCT

TCG

GGA

CTC

ATT

GGC

CCT

CTC

ATC

TGC

TAC

AAA

GAA

172 8

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

5S5

570

575

TCT

GTA

GAC

CAA

AGA

GGA

AAC

CAG

ATG

TCA

GAC

AAG

AGA

AAC

GTC

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

ATC

CTG

TTT

TCT

GTA

TTC

GAT

GAG

AAT

CAA

AGC

TGG

TAC

CTC

GCA

GAG

1824

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

AAT

ATT

CAG

CGC

TTC

CTC

CCC

AAT

CCG

GAT

GGA

TTA

CAG

CCC

CAG

GAT

1872

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

CCA

GAG

TTC

CAA

GCT

TCT

AAC

ATC

ATG

CAC

AGC

ATC

AAT

GGC

TAT

GTT

1920

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn.

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

525

630

635

640

TTT

GAT

AGC

TTG

CAG

CTG

TCG

GTT

TGT

TTG

CAC

GAG

GTG

GCA

TAC

TGG

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

TAC

ATT

CTA

AGT

GTT

GGA

GCA

CAG

ACG

GAC

TTC

CTC

TCC

GTC

TTC

2016

Tyr

Ile

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

AAA

CAC

AAA

ATG

GTC

TAT

GAA

GAC

ACA

CTC

ACC

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

CTG

TTC

CCC

TTC

TCA

GGA

GAA

ACG

GTC

TTC

ATG

TCA

ATG

GAA

AAC

CCA

2112

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

GGT

CTC

TGG

GTC

CTA

GGG

TGC

CAC

AAC

TCA

GAC

TTG

CGG

AAC

AGA

GGG

2160

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

ATG

ACA

GCC

TTA

CTG

AAG

GTG

TAT

AGT

TGT

GAC

AGG

GAC

ATT

GGT

GAT

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly

Asp

725

730

735

TAT

GAC

AAC

ACT

TAT

GAA

GAT

ATT

CCA

GGC

TTC

TTG

CTG

AGT

GGA

2256

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

740 745 750

AAG AAT GTC ATT GAA CCC AGA AGC TTT GCC CAG AAT TCA AGA CCC CCT	2304
Lys	Asn	Val 755	Ile Glu Pro	Arg Ser Phe 760	Ala Gin	Asn	Ser 765	Arg	Pro	Pro
AGT	GCG	AGC	CAA AAG CAA	TTC CAA ACC	ATC ACA	AGT	CCA	GAA	GAT	GAC	2352
Ser	Ala 770	Ser	Gin Lys Gin	Phe Gin Thr 775	Ile Thr	Ser 780	Pro	Glu	Asp	Asp
GTG	GAG	CTT	GAC CCG CAG	TCT GGA GAG	AGA ACC	CAA	GCA	CTG	GAA	GAA	2400
Val 785	Glu	Leu	Asp Pro Gin 790	Ser Gly Glu	Arg Thr 795	Gin	Ala	Leu	Glu	Glu 800
CTA	AGT	GTC	CCC TCT GGT	GAT GGG TCG	ATG CTC	TTG	GGA	CAG	AAT	CCT	2443
Leu	Ser	Val	Pro Ser Gly Asp Gly Ser 805	Met Leu 810	Leu	Gly	Gin	Asn 815	Pro
GCT	CCA	CAT	GGC TCA TCC	TCA TCT GAT	CTT CAA	GAA	GCC	AGG	AAT	GAG	2496
Ala	Pro	His	Gly Ser Ser 820	Ser Ser Asp 825	Leu Gin	Glu	Ala	Arg 830	Asn	Glu
GCT	GAT	GAT	TAT TTA CCT	GGA GCA AGA	GAA AGA	AAC	ACG	GCC	CCA	TCC	2544
Ala	Asp	Asp 835	Tyr Leu Pro	Gly Ala Arg 340	Glu Arg	Asn	Thr 845	Ala	Pro	Ser
GCA	GCG	GCA	CGT CTC AGA	CCA GAG CTG	CAT CAC	AGT	GCC	GAA AGA	GTA	2592
Ala	Ala 350	Ala	Arg Leu Arg	Pro Glu Leu 855	His His	Ser 860	Ala	Glu	Arg	Val
CTT	ACT	CCT	GAG CCA GAG	AAA GAG TTG	AAG AAA	CTT	GAT	TCA	AAA	ATG	2640
Leu 865	Thr	Pro	Glu Pro Glu 870	Lys Glu Leu	Lys Lys 875	Leu	Asp	Ser	Lys	Met 880
TCT	AGT	TCA	TCA GAC CTT	CTA AAG ACT	TCG CCA	ACA	ATT	CCA	TCA	GAC	268Θ
Ser	Ser	Ser	Ser Asp Leu 885	Leu Lys Thr	Ser Pro 890	Thr	Ile	Pro	Ser 895	Asp
ACG	TTG	TCA	GCG GAG ACT	GAA AGG ACA	CAT TCC	TTA	GGC	CCC	CCA	CAC	2736
Thr	Leu	Ser	Ala Glu Thr gaa	Glu Arg Thr 905	His Ser	Leu	Gly	Pro 910	Pro	His
CCG	CAG	GTT	AAT TTC AGG	AGT CAA TTA	GGT GCC	ATT	GTA	CTT	GGC	AAA	27S4
Pro	Gin	val 915	Asn Phe Arg	Ser Gin Leu 920	Gly Ala	Ile	Val 925	Leu	Gly	Lys
AAT	TCA	TCT	CAC TTT ATT	GGG GCT GGT	GTC CCT	TTG	GGC	TCG	ACT	GAG	2832
Asn	Ser 930	Ser	His Phe Ile	Gly Ala Gly 935	Val Pro	Leu 94Q	Gly	Ser	Thr	Glu
GAG	GAT	CAT	GAA AGC TCC	CTG GGA GAA	AAT GTA	TCA	CCA	GTG	GAG	AGT	2880
Glu 945	Asp	His	Glu Ser Ser 950	Leu Gly Glu	Asn Val 955	Ser	Pro	Val	Glu	Ser 950
GAC	GGG	ATA	TTT GAA AAG	GAA AGA GCT	CAT GGA	CCT	GCT	TCA	CTG	ACC	2928
Asp	Gly	Ile	Phe Glu Lys	Glu Arg Ala	His Gly	Pro	Ala	Ser	Leu	Thr

965 970 975

AAA GAC GAT

GTT Val 980

TTA TTT AAA GTT

AAT ATC TCT TTG GTA AAG ACA AAC

2976

Lys

Asp

Leu Phe

Lys

Val

Asn 985

lle

Ser

Leu

Val

Lys 990

Thr

Asn

AAG

GCA

CGA

GTT

TAC TTA

AAA

ACT

AAT

AGA

AAG

ATT

CAC

ATT

GAT

GAC

3024

Lys

Ala

Arg 995

Val

Tyr Leu

Lys

Thr Asn 1000

Arg

Lys

lle

His lle 1005

Asp

GCA

GCT

TTA

ACT GAG

AAT

AGG

GCA

TCT

GCA

ACG

TTT

ATG

GAC

AAA

3072

Ala

Ala Leu 1010

Leu

Thr Glu

Asn Arg 1015

Ala

Ser

Ala

Thr Phe 1020

Met

Asp

Lys

AAT

ACT

ACA

GCT

TCG GGA

TTA

AAT

CAT

GTG

TCA

AAT

TGG

ATA

AAA

GGG

3120

Asn Thr 1025

Thr

Ala

Ser Gly Leu 1030

Asn

His

Val

Ser Asn 1035

Trp

lle

Lys

Gly 1040

CCC

CTT

GGC

AAG

AAC CCC

CTA

AGC

TCG

GAG

CGA

GGC

CCC

AGT

CCA

GAG

3168

Pro

Leu

Gly

Lys

Asn Pro 1045

Leu

Ser

Glu Arg 1050

Gly

Pro

Ser

Pro Glu 1055

CTT

CTG

ACA

TCT

TCA GGA

TCA

GGA

AAA

TCT

GTG

AAA

GGT

CAG

AGT

TCT

3216

Leu

Thr

Ser Ser Gly 1060

Ser

Gly

Lys Ser 1065

Val

Lys

Gly

Gin Ser 1070

Ser

GGG

CAG

GGG

AGA

ATA CGG

GTG

GCA

GTG

GAA

GAG

GAA

CTG

AGC

AAA

3264

Gly

Gin

Gly Arg 1075

lle Arg

Val

Ala Val 1080

Glu

Glu Leu 1085

Ser

Lys

GGC

AAA

GAG

ATG

ATG CTT

CCC

AAC

AGC

GAG

CTC

ACC

TTT

CTC

ACT

AAC

3312

Gly

Lys Glu 1090

Met

Met Leu

Pro Asn 1095

Ser

GlU

Leu

Thr Phe 1100

Leu

Thr

Asn

TCG

GCT

GAT

GTC

CAA GGA

AAC

GAT

ACA

CAC

AGT

CAA

GGA

AAA

AAG

TCT

3360

Ser Ala 1105

Asp

Val

Gin Gly Asn 1110

Asp

Thr

His

Ser Gin 1115

Gly

Lys

Ser 1120

CGG

GAA

GAG

ATG

GAA AGG

AGA

GAA

AAA

TTA

GTC

CAA

GAA

AAA

GTC

GAC

3403

Arg

Glu

Met

Glu Arg 1125

Arg

Glu

Lys

Leu Val 1130

Gin

Glu

Lys

Val Asp 1135

TTG

CCT

CAG

GTG

TAT ACA

GCG

ACT

GGA

ACT

AAG

AAT

TTC

CTG

AGA

AAC

3456

Leu

Pro

Gin

Val 114C

Tvc Thr l

Ala

Thr

Gly Thr 1145

Lys

Asn

Phe

Leu Arg 1150

Asn

ATT

TTT

CAC

CAA

AGC ACT

GAG

CCC

AGT

GTA

GAA

GGG

iprprp

GAT

GGG

35Q4

lle

Phe

His 1155

Gin i

Ser Thr

Glu

Pro Ser 1160

Val

Glu

Gly

Phe Asp 1165

Gly

TCA

CAT

GCG

CCG

GTG CCT

CAA

GAC

AGC

AGG

TCA

TTA

AAT

GAT

TCG

GCA

3552

Ser

HÍS 1170

Ala 1

Pro

Val Pro

Gin 1173

Asp 1

Ser

Arg

Ser

Leu 1L8C

Asn 1

Asp

Ser

Ala

GAG AGA GCA GAG ACT CAC ATA GCC CAT TTC TCA GCA ATT AGG GAA GAG

Glu Arg Ala Glu Thr His lle Ala His Phe Ser Ala Xle Arg Glu Glu

1135 1190 1195 1200

3600

GCA CCC TTG GAA GCC CCG GGA AAT CGA ACA GGT CCA GGT CCG AGG AGT	364 3
Ala Pro Leu Glu Ala Pro	Gly	Asn	Arg Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser
	1205	1210	1215
GCG	GTT CCC CGC CGC GTT	AAG	CAG	AGC TTG AAA	CAG ATC AGA CTC CCG	3696
Ala	Val Pra Arg Arg Val 1220	Lys	Gin	Ser Leu Lys 1225	Gin Ile Arg Leu Pro 1230
CTA	GAA GAA ATA AAG CCT	GAA AGG	GGG GTG GTT	CTG AAT GCC ACC TCA	3744
Leu	Glu Glu Ile Lys Pro 1235	Glu	Arg Gly Val Val 1240	Leu Asn Ala Thr Ser 1245
ACC	CGG TGG TCT GAA AGC	AGT	CCT	ATC TTA CAA	GGA GCC AAA AGA AAT	3792
Thr	Arg Trp Ser Glu Ser 1250	Ser Pro 1255	Ile Leu Gin	Gly Ala Lys Arg Asn 1260
AAC	CTT TCT TTA CCT 'TTC	CTG	ACC	TTG GAA ATG	GCC GGA GGT CAA GGA	3840
Agn Leu Ser Leu Pro Phe Leu 1265 1270	Thr	Leu Glu Met Ala Gly Gly Gin Gly 1275 1230
AAG	ATC AGC GCC CTG GGG	AAA	AGT	GCC GCA GGC	CCG CTG GCG TCC GGG	3838
Lys	Ile Ser Ala Leu Gly 1235	Lys	Ser	Ala Ala Gly 1290	Pro Leu Ala Ser Gly 1295
AAG	CTG GAG AAG GCT GTT	CTC	TCT	TCA GCA GGC	TTG TCT GAA GCA TCT	3936
Lys	Leu Glu Lys Ala Val 1300	Leu	Ser	Ser Ala Gly 1305	Leu Ser Glu Ala Ser 1310
GGC	AAA GCT GAG TTT CTT	CCT	AAA	GTT CGA GTT	CAT CGG GAA GAC CTG	3934
Gly	Lys Ala Glu Phe Leu 1315	Pro	Lys Val Arg Val 1320	His Arg Glu Asp Leu 1325
TTG	CCT CAA AAA ACC AGC	AAT	GTT	TCT TGC GCA	CAC GGG GAT CTC GGC	4032
Leu	Pro Gin Lys Thr Ser 1330	Asn Val 1335	Ser Cys Ala	His Gly Asp Leu Gly 1340
CAG	GAG ATC TTC CTG CAG	AAA	ACA	CGG GGA CCT	GTT AAC CTG AAC AAA	4080
Gin Glu Ile Phe Leu Gin Lys 1345 1350	Thr	Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys 1355 1360
GTA	AAT AGA CCT GGA AGG	ACT	CCC	TCC AAG CTT	CTG GGT CCC CCG ATG	4123
Val	Asn Arg Pro Gly Arg 1365	Thr	Pro	Ser Lys Leu 1370	Leu Gly Pro Pro Met 1375
CCC	AAA GAG TGG GAA TCC	CTA	GAG	AAG TCA CCA	AAA AGC ACA GCT CTC	4176
Pro	Lys Glu Trp Glu Ser 1380	Leu	Glu	Lys Ser Pro 1385	Lys Ser Thr Ala Leu 1390
AGG	ACG AAA GAC ATC ATC	AGT	TTA	CCC CTG GAC	CGT CAC GAA AGC AAT	4224
Arg	Thr Lys Asp Ile Ile 1395	Ser	Leu Pro Leu Asp Arg His Glu Ser Asn 1400 1405
CAT	TCA ATA GCA GCA AAA	AAT	GAA	GGA CAA GCC	GAG ACC CAA AGA GAA	4272
His	Ser Ile Ala Ala Lys	Asn	Glu	Gly Gin Ala	Glu Thr Gin Arg Glu

1410 1415 1420

GCC GCC TGG ACG	AAG CAG GGA GGG CCT GGA AGG CTG TGC	GCT ALa	CCA Pro	AAG Lys 1440	4320
Ala Ala Trp 1425	Thr	Lys	Gin Gly Gly Pro Gly Arg Leu	Cys
1430	1435
CCT CCG GTC	CTG	CGA	CGG CAT CAG	AGG GAC ATA AGC	CTT	CCT	ACT	TTT	4 3 63
Pro Pro Val	Leu	Arg Arg His Gin 1445	Arg Asp Tle Ser 1450	Leu	Pro	Thr 145	Phe 5
CAG CCG GAG	GAA	GAC	AAA ATG GAC	TAT GAT GAT ATC	TTC	TCA	ACT	GAA	4416
Gin Pro Glu	Glu Asp 1460	Lys Met Asp	Tyr Asp Asp Ile 1465	Phe	Ser Thr 14 70	Glu
ACG AAG GGA	GAA	GAT	TTT GAC ATT	TAC GGT GAG GAT	GAA	AAT	GAG	GAC	4464
Thr Lys Gly Glu 1475	Asp	Phe Asp Tle Tyr Gly Glu Asp 1480	Glu Asn 1485	Gin	Asp
CCT CGC AGC	TTT	CAG	AAG AGA ACC	CGA CAC TAT TTC	ATT	GCT	GCG	GTG	4512
Pro Arg Ser 1490	Phe	Gin	Lys Arg Thr 1495	Arg His Tyr Phe Ile 1500	Ala	Ala	Val
GAG CAG CTC	TGG	GAT	TAC GGG ATG	AGC GAA TCC CCC	CGG	GCG	CTA	AGA	4560
Glu Gin Leu 1505	Trp	Asp	Tyr Gly Met 1510	Ser Glu Ser Pro 1515	Arg	Ala	Leu	Arg 1520
AAC AGG GCT	CAG	AAC	GGA GAG GTG	CCT CGG TTC AAG	AAG	GTG	GTC	TTC	4608
Asn Arg Ala	Gin	Asn Gly Glu Val 1525	Pro Arg Phe Lys 1530	Lys	Val	Val Phe 1535
CGG GAA TTT	GCT	GAC	GGC TCC TTC	ACG CAG CCG TCG	TAC	CGC	GGG	GAA	4 656
Arg Glu Phe	Ala Asp 1540	Gly Ser Phe	Thr Gin Pro 3er 1545	Tyr	Arg Gly 155C	Glu
CTC AAC AAA	CAC	TTG	GGG CTC TTG	GGA CCC TAC ATC	AGA	GCG	GAA	GTT	4704
Leu Asn Lys His 1555	Leu	Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile 1560	Arg Ala 1565	Glu	Val
GAA GAC AAC	ATC	ATG	GTA ACT TTC	AAA AAC CAG GCG	TCT	CGT	CCC	TAT	4752
Glu Asp Asn 1570	Tle	Met	Val Thr Phe 1575	Lys Asn Gin Ala Ser 1530	Arg	Pro	Tyr
TCC TTC TAC	TCG	AGC	CTT ATT TCT	TAT CCG GAT GAT	CAG	GAG	CAA	GGG	4800
Ser Phe Tyr 1535	Ser	Ser	Leu Ile Ser 15SQ	Tyr Pro Asp Asp 1595	Gin	Glu	Gin	Gly 1600
GCA GAA CCT	CGA	CAC	AAC TTC GTC	CAG CCA AAT GAA	ACC	AGA	ACT	TAC	4348
Ala Glu Pro	Arg	His Asn Phe Val 1605	Gin Pro Asn Glu 1610	Thr	Arg	Thr Tyr 1615
TTT TGG AAA	GTG	CAG	CAT CAC ATG	GCA CCC ACA GAA	GAC	GAG	TTT	GAC	4896
Phe Trp Lys	Val 162 0	Gin 1	His His Met	Ala Pro Thr Glu 1625	Asp	Glu 163C	Phe 1	Asp
TGC AAA GCC	TGG	GCC	TAC TTT TCT	GAT GTT GAC CTG	GAA	AAA	GAT	GTG	4944
Cys Lys Ala	Trp Ala	Tyr Phe Ser	Asp Val Asp Leu	Glu	Lys Asp	Val

1635 1640 1645

CAC TCA GGC TTG ATC	GGC Gly	CCC CTT CTG ATC TGC CGC GCC AAC	ACC Thr	CTG Leu	4992
His	Ser Gly Leu Ile 1650	Pro Leu Leu 1655	Ile	Cys Arg Ala 1660	Asn
AAC	GCT GCT CAC GGT	AGA	CAA GTG ACC	GTG	CAA GAA TTT	GCT	CTG	TTT	5040
Asn Ala Ala His Gly 1665	Arg Gin Val Thr 1670	Val	Gin Glu Phe 1675	Ala	Leu	Phe 1680
TTC	ACT ATT TTT GAT	GAG	ACA AAG AGC	TGG	TAC TTC ACT	GAA	AAT	GTG	5088
Phe	Thr Ile Phe Asp Glu 1635	Thr Lys. Ser	Trp Tyr Phe Thr 1690	Glu	Asn Val 1695
GAA	AGG AAC TGC CGG	GCC	CCC TGC CAC	CTG	CAG ATG GAG	GAC	CCC	ACT	5136
Glu	Arg Asn Cys Arg 1700	Ala	Pro Cys His Leu 1705	Gin Met Glu	Asp Pro 1710	Thr
CTG	AAA GAA AAC TAT	CGC	TTC CAT GCA	ATC	AAT GGC TAT	GTG	ATG	GAT	5184
Leu	Lys Glu Asn Tyr 1715	Arg	Phe His Ala 1720	Ile	Asn Gly Tyr Val 1725	Met	Asp
ACA	CTC CCT GGC TTA	GTA	ATG GCT CAG	AAT	CAA AGG ATC	CGA	TGG	TAT	5232
Thr	Leu Pro Gly Leu 1730	Val	Met Ala Gin 1735	Asn	Gin Arg Ile 1740	Arg	Trp	Tyr
CTG	CTC AGC ATG GGC	AGC	AAT GAA AAT	ATC	CAT TCG ATT	CAT	TTT	AGC	5280
Leu Leu Ser Met Gly 1745	Ser Asn Glu Asn 1750	lle	His Ser Ile 1755	His	Phe	Ser 1760
GGA	CAC GTG TTC AGT	GTA	CGG AAA AAG	GAG	GAG TAT AAA	ATG	GCC	GTG	5328
Gly	His Val Phe Ser Val 1765	Arg Lys Lys	Glu Glu Tyr Lys 1770	Met	Ala Val 1775
TAC	AAT CTC TAT CCG	GGT	GTC TTT GAG	ACA	GTG GAA ATG	CTA	CCG	TCC	5376
Tyr	Asn Leu Tyr Pro 1780	Gly	val Phe Glu Thr 1785	Val Glu Met	Leu Pro 1790	Ser
AAA	GTT GGA ATT TGG	CGA	ATA GAA TGC	CTG	ATT GGC GAG	CAC	CTG	CAA	5424
Lys	Val Gly lle Trp 1795	Arg	Ile Glu Cys 1800	Leu	Ile Gly Glu His 1805	Leu	Gin
GCT	GGG ATG AGC ACG	ACT	TTC CTG GTG	TAC	AGC AAG GAG	TGT	CAG	GCT	5472
Ala	Gly Met Ser Thr 1810	Thr	Phe Leu Val 1815	Tyr	Ser Lys Glu 1820	cys	Gin	Ala
CCA	CTG GGA ATG GCT	TCT	GGA CGC ATT	AGA	GAT TTT CAG	ATC	ACA	GCT	5520
Pro 1325	Leu Gly Met Ala	Ser Gly Arg Ile 1830	Ařg	Asp Phe Gin 1335	Ile	Thr	Ala 1840
TCA	GGA CAG TAT GGA	CAG	TGG GCC CCA	AAG	CTG GCC AGA	CTT	CAT	TAT	5568
Ser	Gly Gin Tyr Gly Gin 1845	Trp Ala Pro	Lys Leu Ala Arg 1850	Leu	His Tyr 1855
TCC	GGA TCA ATC AAT	GCC	TGG AGC ACC	AAG	GAT CCC CAC	TCC	TGG	ATC	5616
Ser	Gly Ser Ile Asn Ala 1860	Trp Ser Thr Lys Asp Pro His 1865	Ser Trp 1870	Ile

- 00 .

AAG GTG GAT CTG

TTG Leu

GCA Ala

CCA Pro

ATG ATC Met Ile 1880

ATT Ile

CAC His

GGC ATC ATG

ACC Thr

CAG Gin

5664

Lys

Val

.Asp Leu 1875

Gly

Tle Met 1895

GGT

GCC

CGT CAG

AAG

TTT

TCC

AGC CTC

TAC

ATC

TCC

CAG TTT

ATC

5712

Gly

Ala Arg Gin 1390

Lys

Phe

Ser Ser Leu 1895

Tyr

Ile

Ser Gin Phe 1900

Ile

ATG

TAC

AGT CTT

GAC

GGG

AGG

AAC TGG

CAG

AGT

TAC

CGA GGG

AAT

TCC

5760

Met Tyr 1905

Ser Leu

Asp

Gly Arg 1910

Asn Trp

Gin

Ser Tyr 1915

Arg Gly

Asn

Ser 1920

ACG

GGC

ACC TTA

ATG

GTC

TTC

TTT GGC

AAT

GTG

GAC

GCA TCT

GGG

ATT

5303

Thr

Gly

Thr Leu

Met Val 1925

Phe

Phe Gly

Asn Val 1930

Asp

Ala Ser

Gly Ile 1935

AAA

CAC

AAT ATT

TTT

AAC

CCT

CCG ATT

GTG

GCT

CGG

TAC ATC

CGT

TTG

5656

Lys

His

Asn Ile Phe 1940

Asn

Pro

Pro Ile Val 1945

Ala

Arg

Tyr Ile Arg 1950

Leu

CAC

CCA

ACA CAT

TAC

AGC

ATC

CGC AGC

ACT

CTT

CGC

ATG GAG

TTG

ATG

5904

His

Pro

Thr His 1355

Tyr

Ser

Ile

Arg Ser 1960

Thr

Leu

Arg

Met Glu 1965

Leu

Met

GGC

TGT

GAT TTA

AAC

AGT

TGC

AGC ATG

CCC

CTG

GGA

ATG CAG

AAT

AAA

5952

Gly

Cys Asp Leu 1970

Asn

Ser

Cys Ser Met 1975

Pro

Leu

Gly Met Gin 1980

Asn

Lys

GCG

ATA

TCA GAC

TCA

CAG

ATC

ACG GCC

TCC

CAC

CTA AGC

AAT

ATA

6000

Ala Tle 1985

Ser Asp

Ser

Gin Ile 1990

Thr Ala

Ser

Ser His 1995

Leu Ser

Asn

Ile 2000

TTT

GCC

ACC TGG

TCT

CCT

TCA

CAA GCC

CGA

CTT

CAC

CTC CAG

GGG

CGG

6048

Phe

Ala

Thr Trp

Ser Pro 2005

Ser

Gin Ala

Arg Leu 2010

His

Leu Gin

Gly Arg 2015

ACG

AAT

GCC TGG

CGA

CCC

CGG

GTG AGC

AGC

GCA

GAG

GAG TGG

CTG

CAG

6096

Thr

Asn

Ala Trp Arg 2020

Pro

Arg

Val Ser Ser 2025

Ala

Glu

Glu Trp Leu 2030

Gin

GTG

GAC

CTG CAG

AAG

ACG

GTG

AAG GTC

ACA

GGC

ATC

ACC ACC

CAG

GGC

6144

Val

Asp

Leu Gin 2035

Lys

Thr

Val

Lys Val 2040

Thr

Gly

Ile

Thr Thr 2045

Gin

Gly

GTG

AAG

TCC CTG

CTC

AGC

ATG TAT

GTG

AAG

GAG

TTC CTC

GTG

TCC

6192

Val

Lys 2Q5C

Ser Leu )

Leu

Ser

Ser Met Tyr 2055

Val

Lys

Glu Phe Leu 2060

Val

Ser

AGT

CAG GAC

GGC

CGC

TGG ACC

CTG

TTT

CTT

CAG GAC

GGC

CAC

6240

Ser 205 =

Ser >

Gin Asp

Gly

Arg Arg 2070

Trp Thr

Leu

Phe 2075

Leu >

Gin Asp

Gly

His 2030

ACG

AAG

GTT TTT

CAG

GGC

AAT

CAG GAC

TCC

ACC

CCC GTG

GTG

AAC

6288

Thr

Lys

Val Phe

Gin

Gly Asn

Gin Asp

Ser

Thr

Pro Val

Val

Asn

2035 2090 2095

6336

GCT Ala

CTG Leu

GAC Asp

CCC CCG Pro Pro 2100

CTG Leu

TTC Phe

ACG Thr

CGC TAC Arg Tyr 2105

CTG Leu

AGG Arg

ATC Ile

CAC CCC His Pro 2110

ACG Thr

AGC

TGG

GCG

CAG CAC

ATC

GCC

CTG

AGG CTC

GAG

GTT

CTA

GGA TGT

GAG

Sec

Tep

Ala

Gin His

Ile

Ala

Leu

Arg Leu

Glu

Val

Leu

Glv Cys

Glu

2115

2120

2125

GCA

CAG

GAT

CTC TAC

TGA

Ala

Gin

Asp

Leu Tyr

*

2130

6384

6402 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2134 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

Met Gin Leu Glu Leu

Ser

Thr Cys Val Phe 10

Leu

Cys

Leu

Pro 15

LeU

1

5

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

Val

Ala

Arg

Pra

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

85

90

95

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

i ni

Ser

Tyr

Leu

Ser His Val 130

Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu

185

190

Ile

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

His

325

330

335

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

cys

Ala

Glu

340

345

350

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

370

375

380

Ser

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp

Val

His

Tyr

Tle

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

Ile

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480

Leu

Tle

Ile

Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485

490

495

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

500

505

510

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Il.e

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lvs

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Giu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn.

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly

Asp

725

730

735

Tyr

Ty_r

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

740

745

750

Lys

Asn

Val

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

755

760

765

Ser

Ala

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe

Gin

Thr

Ile

Thr

Ser

Pro

Glu

Asp

770 775 780 i m

Val Glu 785	Leu Asp	Pro Gin Ser Gly Glu Arg Thr Gin Ala Leu Glu Glu
790	795	800
Leu Ser	Val Pro	Ser Gly 305	Asp Gly Ser Met Leu Leu Gly Gin 810	Asn Pro 315
Ala Pro	His Gly 820	Ser Ser	Ser Ser Asp Leu Gin Glu Ala Arg 825 930	Asn Glu
Ala Asp	Asp Tyr 835	Leu Pro	Gly Ala Arg Glu Arg Asn Thr Ala 840 345	Pro Ser
Ala Ala 850	Ala Arg	Leu Arg	Pro Glu Leu His His Ser Ala Glu 855 860	Arg Val
Leu Thr 865	Pro Glu	Pro Glu 370	Lys Glu Leu Lys Lys Leu Asp Ser 875	Lys Met 880
Ser Sec	Ser Ser	Asp Leu 885	Leu Lys Thr Ser Pro Thr Ile Pro 890	Ser Asp 895
Thr Leu	Ser Ala 900	Glu Thr	Glu Arg Thr His Ser Leu Gly Pro 905 910	Pro His
Pro Gin.	Val Asn 915	Phe Arg	Ser Gin Leu Gly Ala Ile Val Leu 920 925	Gly Lys
Asn Ser 930	Ser His	Phe Ile	Gly Ala Gly Val Pro Leu Gly Ser 935 940	Thr Glu·
Glu Asp 945	His Glu	Ser Ser 950	Leu Gly Glu Asn Val Ser Pro Val 955	Glu Ser 960
Asp Gly	Ile Phe	Glu Lys 965	Glu Arg Ala His Gly Pro Ala Ser 970	Leu Thr 975
Lys Asp	Asp Val 980	Leu Phe	Lys Val Asn Ile Ser Leu Val Lys 985 990	Thr Asn
Lys Ala	Arg Val 995	Tyr Leu	Lys Thr Asn Arg Lys Ile His Ile 1000 1005	Asp Asp
Ala Ala Leu Leu 1010	Thr Glu	Asn Arg Ala Ser Ala Thr Phe Met 1015 1020	Asp Lys
Asn Thr 1025	Thr Ala	Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp Ile 1030 1035	Lys Gly 1040
Pro Leu	Gly Lys	Asn Pro 1045	Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser 1050	Pro Glu 1055
Leu Leu	Thr Ser Ser Gly 1060	Ser Gly Lys Ser Val Lys Gly Gin 1065 107C	Ser Ser )

Gly Gin Gly Arg Ile Arg Val Ala Val Glu Glu Glu Glu Leu Ser Lys 1075 1080 1085

Gly Lys Glu	Met Met	Leu	Pro Asn Ser Glu Leu Thr Phe Leu Thr Asn
	1090	1095	1100
Ser Ala Asp	Val Gin	Gly Asn Asp Thr His	Ser Gin Gly Lys Lys Ser
1105		1110	1115 1120
Arg	Glu Glu	Met Glu	Arg Arg Glu Lys Leu	Val Gin Glu Lys Val Asp
		1125	1130 1135
Leu	Pro Gin	Val Tyr	Thr	Ala Thr Gly Thr	Lys Asn Phe Leu Arg Asn
		1140		1145	1150
Ile	Phe His	Gin Ser	Thr	Glu Pro Ser Val	Glu Gly Phe Asp Gly Gly
	1155		1160	1165
Ser	His Ala	Pro Val	Pro	Gin Asp Ser Arg	Ser Leu Asn Asp Ser Ala
	1170			1175	1180
Glu	Arg Ala	Glu Thr	His	Tle Ala His Phe	Ser Ala Ile Arg Glu Glu
1185		1190	1195 1200
Ala	Pro Leu	Glu Ala	Pro	Gly Asn Arg Thr	Gly Pro Gly Pro Arg Ser
		1205	1210 1215
Ala	Val Pro	Arg Arg	Val	Lys Gin Ser Leu	Lys Gin Ile Arg Leu Pro
		1220		1225	1230
Leu	Glu Glu	Ile Lys	Pro	Glu Arg Gly Val	Val Leu Asn Ala Thr Ser
	1235		1240	1245
Thr	Arg Trp	Ser Glu	Ser	Ser Pro Ile Leu	Gin Gly Ala Lys Arg Asn
	1250			1255	1260
Asn	Leu Ser	Leu Pro	Phe	Leu Thr Leu Glu	Met Ala Gly Gly Gin Gly
1265		1270	1275 1280
Lys	Ile Ser	Ala Leu	Gly	Lys Ser Ala Ala	Gly Pro Leu Ala Ser Gly
		1285	1290 1295
Lys	Leu Glu	Lys Ala	Val	Leu Ser Ser Ala	Gly Leu Ser Glu Ala Ser
		1300		1305	1310
Gly	Lys Ala	Glu Phe	Leu	Pro Lys Val Arg	Val His Arg Glu Asp Leu
	1315		1320	1325
Leu	Pro Gin	Lys Thr	Ser	Asn Val Ser Cys	Ala His Gly Asp Leu Gl'y
	1330			1335	1340
Gin	Glu Ile	Phe Leu	Gin	Lys Thr Arg Glv	Pro Val Asn Leu Asn Lys
1345		1350	1355 1360
Val	Asn Arg	Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys	Leu Leu Gly Pro Pro Met
		1365	1370 1375
Pro	Lys Glu	Trp Glu	Ser	Leu Glu Lys Ser	Pro Lys Ser Thr Ala Leu

1380 1385 1390

1ÍK

Arg Thr Lys Asp Ile Ile Ser Leu Pro	Leu Asp	Arg His Glu Ser 1405	Asn
	1395	1400
His	Ser Ile Ala	Ala Lys Asn Glu Gly	Gin Ala	Glu Thr Gin Arg	Glu
	1410	1415		1420
Ala	Ala Trp Thr	Lys Gin Gly Gly Pro	Gly Arg	Leu Cys Ala Pro	Lys
1425	1430	1435	1440
Pro	Pro Val Leu	Arg Arg His Gin Arg Asp Ile	Ser Leu Pro Thr	Phe
		1445	1450	1455
Gin	Pro Glu Glu	Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp	Ile Phe Ser Thr	Glu
	1460 1465	1470
Thr	Lys Gly Glu	Asp Phe Asp Ile Tyr	Gly Glu	Asp Glu Asn Gin	Asp
	1475	1480		1485
Pro	Arg Ser Phe	Gin Lys Arg Thr Arg	His Tyr	Phe Ile Ala Ala	Val
	1490	1495		1500
Glu	Gin Leu Trp	Asp Tyr Gly Met Ser	Glu Ser	Pro Arg Ala Leu	Arg
1505	1510	1515	1520
Asn	Arg Ala Gin	Asn Gly Glu Val Pro	Arg Phe	Lys Lys Val Val	Phe
		1525	1530	1535
A_rg	Glu Phe Ala	Asp Gly Ser Phe Thr	Gin Pro	Ser Tyr Arg Gly	Glu
	1540 1545	1550
Leu	Asn Lys His	Leu Gly Leu Leu Gly	Pro Tyr	Ile Arg Ala Glu	Val
	1555	1560		1565
Glu	Asp Asn Ile	Met Val Thr Phe Lys	Asn Gin	Ala Ser Arg Pro	Tyr
	1570	1575		1580
Ser	Phe Tyr Ser	Ser Leu Ile Ser Tyr	Pro Asp	Asp Gin Glu Gin	Gly
1535	1590	1595	1600
Ala	Glu Pro Arg	His Asn Phe Val Gin	Pro Asn	Glu Thr Arg Thr	Tyr
		1605	1610	1615
Phe	Trp Lys Val	Gin His His Met Ala	Pro Thr	Glu Asp Glu Phe	Asp
	1620 1625	1630
Cys	Lys Ala Trp	Ala Tyr Phe Ser Asp	Val Asp	Leu Glu Lys Asp	Val
	1635	1640		1645
His	Ser Gly Leu	Ile Gly Pro Leu Leu	Ile Cys	Arg Ala Asn Thr	Leu
	1650	1655		1660
Asn	Ala Ala His	Gly Arg Gin Val Thr	Val Gin	Glu Phe Ala Leu	Phe
1665	1670	1675	1680

Phe Thr ile phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val 1685 1690 1695

Glu Arg Asn Cys Arg Ala	Pro Cys	His Leu Gin Met Glu Asp Pro	Thr
	1700	1705	1710
Leu	Lys Glu Asn Tyr Arg	Phe His	Ala Ile Asn	Gly Tyr Val Met	Asp
	1715	1720	1725
Thr	Leu Pro Gly Leu Val	Met Ala	Gin Asn Gin	Arg Ile Arg Trp	Tyr
	1730	1735		1740
Leu	Leu Ser Met Gly Ser	Asn Glu	Asn Ile His	Ser Ile His Phe	Ser
1745 1750	1755	1760
Gly	His Val Phe Ser Val	Arg Lys	Lys Glu Glu	Tyr Lys Met Ala	Val
	1765		1770	1775
Tyr	Asn Leu Tyr Pro Gly	Val Phe	Glu Thr Val	Glu Met Leu Pro	Ser
	1780		1785	1790
Lys	Val Gly Ile Trp Arg	Ile Glu	Cys Leu Ile	Gly Glu His Leu	Gin
	1795	1800	1805
Ala	Gly Met Ser Thr Thr	Phe Leu	Val Tyr Ser	Lys Glu Cys Gin	Ala
	1810	1815		1820
Pro	Leu Gly Met Ala Ser	Gly Arg	Tle Arg Asp	Phe Gin Ile Thr	Ala
1825 1830	1835	1840
Ser	Gly Gin Tyr Gly Gin	Trp Ala	Pro Lys Leu	Ala Arg Leu His	Tyr
	1845		1850	1855
Ser	Gly Ser Ile Asn Ala	Trp Ser	Thr Lys Asp	Pro His Ser Trp	Ile
	1860		1865	1870
Lys	Val Asp Leu Leu Ala	Pro Met	Ile Ile His	Gly Ile Met Thr	Gin
	1875	1880	1385
Gly	Ala Arg Gin Lys Phe	Ser Ser	Leu Tyr Ile	Ser Gin Phe Ile	Ile
	1890	1895		1900
Met	Tyr Ser Leu Asp Gly	Arg Asn	Trp Gin Ser	Tyr Arg Gly Asn	Ser
1905 1910	1915	1920
Thr	Gly Thr Leu Met Val	Phe Phe	Gly Asn Val	Asp Ala Ser Gly	Ile
	1925		1930	1935
Lys	His Asn Ile Phe Asn	Pro Pro	Tle Val Ala	Arg Tyr Tle Arg	Leu
	1940		1945	1950
His	Pro Thr His Tyr Ser	Ile Arg	Ser Thr Leu	Arg Met Glu Leu	Met
	1955	1960	1965
Gly	Cys Asp Leu Asn Ser	Cys Ser	Met Pro Leu	Gly Met Gin Asn	Lys
	1970	1975		1980
Ala	Ile Ser Asp Ser Gin	Ile Thr	Ala Ser Ser	His Leu Ser Asn	Ile
1985 1990	1995	2000

_ tm _

Phe Ala	Thr	Trp Ser Pro 2005	Ser	Gin	Ala	Arg Leu 2010	His	Leu	Gin Gly Arg 2015
Thr Asn	Ala	Trp Arg Pro	Arg	Val	Ser	Ser Ala	Glu	Glu	Trp Leu Gin
		2020			2025			203C
Val Asp	Leu	Gin Lys Thr	Val	Lys	Val	Thr Gly	Ile	Thr	Thr Gin Gly
	2035		2040			2045
Val Lys	Ser	Leu Leu Ser	Ser	Met	Tyr	Val Lys	Glu	Phe	Leu Val Ser
2050		2055			2060
Ser Ser	Gin	Asp Gly Arg	Arg	Trp	Thr	Leu Phe	Leu	Gin	Asp Gly His
2065		2070			2075		2080
Thr Lys	Val	Phe Gin Gly	Asn	Gin	ASp	Ser Ser	Thr	Pro	Val Val Asn
		2085				2090			2095
Ala Leu	Asp	Pro Pro Leu	Phe	Thr	Arg	Tyr Leu	Arg	Ile	His Pro Thr
		2100			2105			2110
Ser Trp	Ala	Gin His Ile	Ala	Leu	Arg	Leu Glu	Val	Leu	Gly Cys Glu

2115 2120 2125

Ala Gin Asp Leu Tyr * 2130 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4334 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní io (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: Faktor VIII postrádající doménu B (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 3..4334 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

GA ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TGT GTC TTT CTG TGT CTC TTG CCA Met Gin Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro

10 15

CTC

GGC

TTT

AGT

GCC

ATC

AGG

AGA

TAC

CTG

GGC

GCA

GTG

GAA

CTG

Leu

Gly

Phe

Ser

Ala 20

Ile

Arg Arg

Tyr

Tyr 25

Leu

Gly

Ala

Val

Glu 30

Leu

TCC

TGG

GAC

TAC

CGG

CAA

AGT

GAA

CTC

CGT

GAG

CTG

CAC

GTG

GAC

Ser

Trp

Asp

Tyr 35

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu 40

Leu

Arg

Glu

Leu

His 45

Val

Asp

ACC

AGA

TTT

CCT

GCT

ACA

GCG

CCA

GGA

GCT

CTT

CCG

TTG

GGC

CCG

TCA

Thr

Arg

Phe 50

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu 60

Giy

Pro

Ser

GTC

CTG

TAC

AAA

AAG

ACT

GTG

TTC

GTA

GAG

TTC

ACG

GAT

CAA

CTT

TTC

Val

Leu 65

Tyr

Ly3

Lys

Thr

Val 70

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 75

Asp

Gin

Leu

Phe

AGC

GTT

GCC

AGG

CCC

AGG

CCA

TGG

ATG

GGT

CTG

GGT

CCT

ACC

Ser 90

Val

Ala

Arg

Pro

Arg 95

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Gly

Pro

Thr 95

ATC

CAG

GCT

GAG

GTT

TAC

GAC

ACG

GTG

GTC

GTT

ACC

CTG

AAG

AAC

ATG

Ile

Gin

Ala

Glu

val 100

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 105

Val

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

GCT

TCT

CAT

CCC

GTT

AGT

CTT

CAC

GCT

GTC

GGC

GTC

TCC

TTC

TGG

AAA

Ala

Ser

His

Pro 115

Val

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

TCT

TCC

GAA

GGC

GCT

GAA

TAT

GAG

GAT

CAC

ACC

AGC

CAA

AGG

GAG

AAG

Ser

Glu 130

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu 135

Asp

His

Thr

Ser

Gin 140

Arg

Glu

Lys

GAA

GAC

GAT

AAA

GTC

CTT

CCC

GGT

AAA AGC

CAA

ACC

TAC

GTC

TGG

CAG

Glu

Asp 145

Asp

Lys

val

Leu

Pro 150

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

GTC

CTG

AAA

GAA

AAT

GGT

CCA

ACA

GCC

TCT

GAC.

CCA

TGT

CTC

ACC

Val 150

Leu

Lys

Glu

Asn

Glv 165

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp 170

Pro.

Pro

Cys

Leu

Thr 175

TAC

TCA

TAC

CTG

TCT

CAC

GTG

GAC

CTG

GTG

AAA

GAC

CTG

AAT

TCG

GGC

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 130

His

Val

Asp

Leu

Val 185

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

CTC

ATT

GGA

GCC

CTG

GTT

TGT

AGA

GAA

GGG

AGT

CTG

ACC

AGA

GAA

Leu

Ile

Gly

Ala 195

Leu

Val

Cys

Arg 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr 205

Arg

Glu

AGG

ACC

<AG

AAC

CTG

CAC

GAA

TTT

GTA

CTA

CTT

TTT

GCT

GTC

TTT

GAT

Acg

Thr

Gin 210

Asn

Leu

His

Glu

Phe 215

Val

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

GAA

GGG

AAA

AGT

TGG

CAC

TCA

GCA

AGA

AAT

GAC

TCC

TGG

ACA

CGG

GCC

Glu

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser 230

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser 235

Trp

Thr

Arg

Ala

143

191

239

237

335

383

431

479

527

575

623

671

719

ATG

GAT

CCC

GCA

CCT

GCC

AGG

GCC

CAG

CCT

GCA

ATG

CAC

ACA

GTC

AAT

Met 240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala 245

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala 250

Met

His

Thr

Val

Asn 255

GGC

TAT

GTC

AAC

AGG

TCT

CTG

CCA

GGT

CTG

ATC

GGA

TGT

CAT

AAG

AAA

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Lys 270

Lys

TCA

GTC

TAC

TGG

CAC

GTG

ATT

GGA

ATG

GGC

ACC

AGC

CCG

GAA

GTG

CAC

Ser

Val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

Gly

Met 230

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu 285

Val

His

TCC

ATT

TTT

CTT

GAA

GGC

CAC

ACG

TTT

CTC

GTG

AGG

CAC

CAT

CGC

CAG

Ser

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Gly

His

Thr 295

Phe

Leu

val

Arg

His 300

His

Arg

Gin

GCT

TCC

TTG

GAG

ATC

TCG

CCA

CTA

ACT

TTC

CTC

ACT

GCT

CAG

ACA

TTC

Ala

Ser 305

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 310

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Phe

CTG

ATG

GAC

CTT

GGC

CAG

TTC

CTA

CTG

TTT

TGT

CAT

ATC

TCT

TCC

CAC

Leu 320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

His 335

CAC

CAT

GGT

GGC

ATG

GAG

GCT

CAC

GTC

AGA

GTA

GAA

AGC

TGC

GCC

GAG

His

Gly

Met 340

Glu

Ala

His

Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

GAG

CCC

CAG

CTG

CGG

AGG

AAA

GCT

GAT

GAA

GAG

GAA

GAT

TAT

GAT

GAC

Glu

Pro

Gin

Leu 355

Arg

Lys

Ala

Asp 360

Glu

Asp

Tyr 365

Asp

AAT

TTG

TAC

GAC

TCG

GAC

ATG

GAC

GTG

GTC

CGG

CTC

GAT

GGT

GAC

Asn

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp 375

Val

Arg

Leu

Asp 330

Gly

Asp

GTG

TCT

CCC

TTT

ATC

CAA

ATC

CGC

TCG

GTT

GCC

AAG

CAT

CCC

AAA

Val

Ser 335

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

ACC

TGG

GTG

CAC

TAC

ATC

TCT

GCA

GAG

GAC

TGG

GAC

TAC

GCC

Thr 400

Trp

Val

His

Tyr

Ile 4Q5

Ser

Ala

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

CCC

GCG

GTC

CCC

AGC

CCC

AGT

GAC

AGA

AGT

TAT

AAA

AGT

CTC

TAC

TTG

Pro

Ala

Val

Pro

Ser 420

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr 430

Leu

AAC

AGT

GGT

CCT

CAG

CGA

ATT

GGT

AGG

AAA

TAC

AAA

AAA.

GCT

CGA

TTC

Asn

Ser

Gly

Pro 435

Gin

Arg

Ile

Gly Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Ala 445

Arg

Phe

GTC

GCT

TAC

ACG

GAT

GTA

ACA

TTT

AAG

ACT

CGT

AAA

GCT

ATT

CCG

TAT

Val

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Val

Thr

Phe 455

Lys

Thr

Arg

Ly⁵

Ala 460

Ile

Pro

Tyr

67

315

863

911

959

1007

1055

1103

1151

1199

1247

1295

1343

1391

GAA TCA Glu Ser 465

GGA Gly

ATC CTG Ile Leu

GGA Gly

CCT TTA CTT TAT GGA GAA GTT GGA GAC ACA

1439

Pro Leu 470

Leu Tyr

Gly Glu Val 475

Gly

Asp

Thr

CTT

TTG

ATT

ATA

TTT

AAG

AAT

AAA

GCG

AGC

CGA

CCA

TAT

AAC

ATC

TAC

1487

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

430

485

490

495

CCT

CAT

GGA

ATC

ACT

GAT

GTC

AGC

GCT

TTG

CAC

CCA

GGG

AGA

CTT

CTA

1535

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

500

505

510

AAA

GGT

TGG

AAA

CAT

TTG

AAA

GAC

ATG

CCA

ATT

CTG

CCA

GGA

GAG

ACT

1533

Lys

Gly Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

515

520

525

TTC

AAG

TAT

AAA

TGG

ACA

GTG

ACT

GTG

GAA

GAT

GGG

CCA

ACC

AAG

TCC

1631

Phe

LV5

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

530

535

540

GAT

CCT

CGG

TGC

CTG

ACC

CGC

TAC

TCG

AGC

TCC

ATT

AAT

CTA

GAG

1679

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

545

550

555

AAA

GAT

CTG

GCT

TCG

GGA

CTC

ATT

GGC

CCT

CTC

ATC

TGC

TAC

AAA

1727

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pra

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

560

565

570

575

GAA

TCT

GTA

GAC

CAA

AGA

GGA

AAC

CAG

ATG

TCA

GAC

AAG

AGA

AAC

1775

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

530

585

590

GTC

ATC

CTG

TTT

TCT

GTA

TTC

GAT

GAG

AAT

CAA

AGC

TGG

TAC

CTC

GCA

1823

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

595

600

605

GAG

AAT

ATT

CAG

CGC

TTC

CTC

CCC

AAT

CCG

GAT

GGA

TTA

CAG

CCC

CAG

1871

Glu

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

610

615

620

GAT

CCA

GAG

TTC

CAA

GCT

TCT

AAC

ATC

ATG

CAC

AGC

ATC

AAT

GGC

TAT

1919

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

625

630

635

GTT

TTT

GAT

AGC

TTG

CAG

CTG

TCG

GTT

TGT

TTG

CAC

GAG

GTG

GCA

TAC

1967

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

640

645

650

655

TGG

TAC

ATT

CTA

AGT

GTT

GGA

GCA

CAG

ACG

GAC

TTC

CTC

TCC

GTC

TTC

2015

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

TTC

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

AAA

CAC

AAA

ATG

GTC

TAT

GAA

GAC

ACA

CTC

2063

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

675

680

685

1 t

ACC Thr

CTG Leu

TTC CCC TTC TCA GGA GAA ACG GTC TTC ATG TCA ATG GAA

AAC Asn

2Π1

Phe 690

Pro

Phe Ser

Gly

Glu 695

Thr

Val

Phe

Met

Ser Mec 700

Glu

CCA

GGT

CTC

TGG

GTC

CTA

GGG

TGC

CAC

AAC

TCA

GAC

TTG

CGG

AAC

AGA

2159

Pro

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

705

710

715

GGG

ATG

ACA

GCC

TTA

CTG

AAG

GTG

TAT

AGT

TGT

GAC

AGG

GAC

ATT

GGT

2207

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly

720

725

730

735

C-AT

TAT

GAC

AAC

ACT

TAT

GAA

GAT

ATT

CCA

GGC

TTC

TTG

CTG

AGT

2255

Asp

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

740

745

750

C-GA

AAG

AAT

GTC

ATT

GAA,

CCC

AGA

GAC

ATA

AGC

CTT

CCT

ACT

TTT

CAG

2303

Gly

Lys

Asn

Val

Ile

Glu

Pro

Arg

Asp

Ile

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

Gin

755

760

765

CCG

GAG

GAA

GAC

AAA

ATG

GAC

TAT

GAT

ATC

TTC

TCA

ACT

GAA

ACG

2351

Pro

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

Ile

Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

770

775

780

AAG

GGA

GAA

GAT

TTT

GAC

ATT

TAC

GGT

GAG

GAT

GAA

AAT

CAG

GAC

CCT

2399

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

785

790

735

CGC

AGC

TTT

CAG

AAG

AGA

ACC

CGA

CAC

TAT

TTC

ATT

GCT

GCG

GTG

GAG

2447

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

Ile

Ala

Val

Glu

300

805

810

815

CAG

CTC

TGG

GAT

TAC

GGG

ATG

AGC

GAA

TCC

CCC

CGG

GCG

CTA

AGA

AAC

2495

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Glu

Ser

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg

Asn

820

825

830

AGG

GCT

CAG

AAC

GGA

GAG

GTG

CCT

CGG

TTC

AAG

GTG

GTC

TTC

CGG

2543

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

Phe

Lys

Val

Phe

Arg

835

840

845

GAA

TTT

GCT

GAC

GGC

TCC

TTC

ACG

CAG

CCG

TCG

TAC

CGC

GGG

GAA

CTC

2591

Glu

Phe

Ala

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly

Glu

Leu

850

855

860

AAC

AAA

CAC

TTG

GGG

CTC

TTG

GGA

CCC

TAC

ATC

AGA

GCG

GAA

GTT

GAA

2639

Asn

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

Tyr

Ile

Arg

Ala

Glu

Val

Glu

365

870

875

GAC

AAC

ATC

ATG

GTA

ACT

TTC

AAA

AAC

CAG

GCG

TCT

CGT

CCC

TAT

TCC

2687

Asp

Asn

Ile

Met

Val

Thr

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser

880

885

890

835

TTC

TAC

TCG

AGC

f-irpíp

ATT

TCT

TAT

CCG

GAT

CAG

GAG

CAA

GGG

GCA

2735

Phe

Tyr

Ser

Leu

Ile

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly

Ala

900 905 910

GM CCT CGA CAC AAC TTC GTC CAG CCA AAT GAA ACC AGA ACT TAC TTT 2783

Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gin Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe

915 920 925

TGG AAA GTG CAG CAT CAC ATG GCA CCC ACA GAA GAC GAG TTT GAC TC-C 2831

Trp Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys

930 935 940

AAA GCC TGG GCC TAC TTT TCT GAT GTT GAC CTG GAA AAA GAT GTG CAC 2879

Ly3 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

945 950 955

TCA GGC TTG ATC GGC CCC CTT CTG ATC TGC CGC GCC AAC ACC CTG AAC 2927

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn

950 965 970 975

GCT GCT CAC GGT AGA CAA GTG ACC GTG CAA GAA. TTT GCT CTG TTT TTC 297 5

Ala Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe

980 985 990

ACT ATT TTT GAT GAG ACA AAG AGC TGG TAC TTC ACT GAA AAT GTG GAA 3023

Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu

995 1000 1005

AGG AAC TGC CGG GCC CCC TGC CAC CTG CAG ATG GAG GAC CCC ACT CTG 3071

Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gin Met Glu Asp Pro Thr Leu

1010 1015 1020

AAA GAA AAC TAT CGC TTC CAT GCA ATC AAT GGC TAT GTG ATG GAT ACA 3119

Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Mn Gly Tyr Val Met Asp Thr

1025 1030 1035

CTC CCT GGC TTA GTA ATG GCT CAG AAT CAA AGG ATC CGA TGG TAT CTG 3167

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asn Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu

1040 1045. 1050 1055

CTC AGC ATG GGC AGC AAT GAA AAT ATC CAT TCG ATT CAT TTT AGC GGA 3215

Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly

1060 1065 1070

CAC GTG TTC AGT GTA CGG AAA AAG GAG GAG TAT AAA ATG GCC GTG TAC 3263

His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyt

1075 1080 1085

AAT CTC TAT CCG GGT GTC TTT GAG ACA GTG GAA ATG CTA CCG TCC AAA 3311

Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys

1090 1095 1100

GTT GGA ATT TGG CGA ATA GM. TGC CTG ATT GGC GAG CAC CTG CAA GCT 3359

Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gin Ala

1105 1110 1115

GGG ATG AGC ACG ACT TTC CTG GTG TAC AGC AAG GAG TGT CAG GCT CCA 3407

Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gin Ala Pro

1120 1125 1130 1135 .111

CTG Leu

GGA Gly

ATG Met

GCT Ala

TCT GGA Ser Gly 1140

CGC Arg

ATT Ile

AGA Arg

GAT TTT Asp Phe 1145

CAG Gin

ATC Ile

ACA Thr

GCT TCA Ala Ser 1150

3455

GGA

CAG

TAT

GGA

CAG TGG

GCC

CCA

AAG

CTG GCC

AGA

CTT

CAT

TAT TCC

3503

Gly

Gin

Tyr

Gly Gin Trp 1155

Ala

Pro

Lys Leu Ala 1160

Arg

Leu

His 116!

Tyr Ser 5

GGA

TCA

ATC

AAT

GCC TGG

AGC

ACC

AAG

GAT CCC

CAC

TCC

TGG

ATC AAG

3551

Gly

Ser

Ile Asn 1170

Ala Trp

Ser

Thr Lys 1175

Asp Pro

His

Ser Trp 1180

Ile Lys

GTG

GAT

CTG

TTG

GCA CCA

ATG

ATC

ATT

CAC GGC

ATC

ATG

ACC

CAG GGT

3599

Val

Asp Leu 1135

Leu

Ala Pro

Met Ile 1190

Ile

His Gly

Ile Met 1195

Thr

Gin Gly

GCC

CGT

CAG

AAG

TTT TCC

AGC

CTC

TAC

ATC TCC

CAG

TTT

ATC

ATC ATG

3647

Ala Arg 1200

Gin

Lys

Phe Ser Ser 1205

Leu

Tyr

Ile ser Gin 1210

Phe

Ile

Ile Met 1215

TAC

AGT

CTT

GAC

GGG AGG

AAC

TGG

CAG

AGT TAC

CGA

GGG

AAT

TCC ACG

3695

Tyr

ser

Leu

Asp

Gly Arg 1220

Asn

Trp

Gin

Ser Tyr 1225

Arg

Gly

Asn

Ser Thr 1230

GGC

ACC

TTA

ATG

GTC TTC

TTT

GGC

AAT

GTG GAC

GCA

TCT

GGG

ATT AAA

3743

Gly

Thr

Leu

Met Val Phe 1235

Phe

Gly

Asn Val Asp 1240

Ala

Ser

Gly Ile Lys 1245

CAC

AAT

ATT

TTT

AAC CCT

CCG

ATT

GTG

GCT CGG

TAC

ATC

CGT

TTG CAC

3791

His

Asn

Ile Phe 1250

Asn Pro

Pro

Ile Val 1255

Ala Arg

Tyr

Ile Arg 1260

Leu His

CCA

ACA

CAT

TAC

AGC ATC

CGC

AGC

ACT

CTT CGC

ATG

GAG

TTG

ATG GGC

3839

Pro

Thr His 1265

Tyr

Ser íls

Arg Ser 1270

Thr

Leu Arg

Met Glu 1275

Leu

Met Gly

TGT

GAT

TTA

AAC

AGT TGC

AGC

ATG

CCC

CTG GGA

ATG

CAG

AAT

AAA GCG

3887

Cys Asp 1280

Leu

Asn

Ser Cys Ser 1285

Met

Pro

Leu Gly Met 1290

Gin

Asn

Lys Ala 1295

ATA

TCA

GAC

TCA

CAG ATC

ACG

GCC

TCC

TCC CAC

CTA

AGC

AAT

ATA TTT

3935

Tle

Ser

Asp

Ser

Gin Ile 1300

Thr

Ala

Ser

Ser His 1305

Leu

Ser

Asn

Ile Phe 1310

GCC

ACC

TGG

TCT

CCT TCA

CAA

GCC

CGA

CTT CAC

CTC

CAG

GGG

CGG ACG

3983

Ala

Thr

Trp

Ser 1315

Pro Ser i

Gin

Ala

Arg 132C

Leu His 1

Leu

Gin

Gly Arg Thr 1325

AAT

GCC

TGG

CGA

CCC CGG

GTG

AGC

GCA GAG

GAG

TGG

CTG

CAG GTG

4031

Asn

Ala

Trp 133C

Arg )

Pro Arg

Val

Ser Ser 1335

Ala Glu

Glu

Trp 134C

Leu 1

Gin Val

GAC

CTG

CAG

AAG

ACG GTG

AAG

GTC

ACA

GGC ATC

ACC

CAG

GGC GTG

4079

Asp

Leu 1345

Gin l·

Lys

Thr Val

Lys 135G

Val 1

Thr

Gly Ile

Thr 1355

Thr 1

Gin

Gly Val

AAG TCC CTG CTC AGC AGC ATG TAT	GTG AAG	GAG TTC CTC GTG TCC AGT	4127
Lvs Ser Leu Leu Ser Ser Met	Tyr	Val	Lys	Glu Phe 1370	Leu	Val	Ser	Ser 1375
1360	1365
AGT CAG GAC GGC	CGC CGC TGG	ACC	CTG	TTT	CTT CAG	GAC	GGC	CAC.	ACG	4175
Ser Gin Asp Gly Arg Arg Trp	Thr	Leu	Phe	Leu Gin	Asp	Gly	His	Thr
	1380			1385			1390
AAG GTT TTT CAG	GGC AAT CAG	GAC	TCC	TCC	ACC CCC	GTG	GTG	AAC	GCT	4223
Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin	Asp	Ser	Ser	Thr Pro	Val	Val	Asn	Ala
1395		1400			1405
CTG GAC CCC CCG	CTG TTC ACG	CGC	TAC	CTG	AGG ATC	CAC	CCC	ACG	AGC	4271
Leu Asp Pro Pro	Leu Phe Thr	Arg	Tyr	Leu	Arg Ile	His	Pro	Thr	Ser
1410		1415			1420
TGG GCG CAG CAC	ATC GCC CTG	AGG	CTC	GAG	GTT CTA	GGA TGT	GAG	GCA	4319
Trp Ala Gin His	Ile Ala Leu	Arg	Leu	Glu	Val Leu	Gly Cys	GlU	Ala

1425 1430 1435

CAG GAT CTC TAC TGA 4334

Gin Asp Leu Tyr *

1440 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1444 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

Met Gin Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu

l

5

10

15

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu

Tyt

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

85

90

95

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100 105 110 i r

Ser

His

Pro Val 115

Ser

Leu His Ala Val Gly 120

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

Tle

Gly

Ala

Leu

LeU

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

lie

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

Tle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin·

Phe

Leu

Phe

Cys

His

ile

Ser

His

325

330

335

His

Gly

GlV

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

340

345

350

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly Asp

Asp

Val

370

375

380

Ser

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415

Ala Val

Pro

Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu

420

425

430

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

Ile

Pro

Tyr

450

455

460

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

465

470

475

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

485

490

495

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

5,00

505

510

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

530

535

540

Pra

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

545

550

555

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

580

585

590

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

595

600

605

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

625

630

635

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

645

650

655

Tyr

Ile

Leu

Ser

val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His.

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

705 710 715

Asn

Val

Glu

Leu

490

Pro

Lys

Phe

Asp

Lys

560

Glu

Val

Glu

Asp

Val

640

Trp

Phe

Thr

Pro

Gly

720 .117CZ 300959 B6

Met

Thr

Ala

Leu

Leu 725

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly 735

Asp

Tyr

Asp

Asn 740

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile 745

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu 750

Ser

Gly

Lys

Asn

Val 755

Ile

Glu

Pro

Arg

Asp 760

Ile

Ser

Leu

Pro

Thr 765

Phe

Gin

Pro

Glu

Glu 770

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr 775

Asp

Ile

Phe

Ser 730

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly 785

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile 790

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu 795

Asn

Gin

Asp

Pro

Arg 300

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg 305

Thr

Arg

His

Tyr

Phe 310

Ile

Ala

Val

Glu 815

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr 820

Gly

Met

Ser

Glu

Ser 325

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg 830

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn 835

Gly

Glu

Val

Pro

Arg 840

Phe

Lys

Val

Val 845

Phe

Arg

Glu

Phe

Ala 850

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr 855

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg 360

Gly

Glu

Leu

Asn

Lys 865

His

Leu

Gly

Leu

Leu 870

Gly

Pro

Tyr

Ile

Arg 875

Ala

Glu

Val

Glu

Asp 880

Asn

Ile

Met

Val

Thr 335

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala 890

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser 895

Phe

Tyr

Ser

Leu 900

Ile

Ser

Tyr

Pro

Asp 905

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly 910

Ala

Glu

Pro

Arg

His 915

Asn

Phe

Val

Gin

Pro 920

Asn

Glu

Thr

Arg

Thr 925

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val 930

Gin

His

Met

Ala 935

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu 940

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala 945

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser 950

Asp

Val

Asp

Leu

Glu 955

Lys

Asp

Val

His

Ser 960

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 965

Leu

Ile

Cys

Arg 970

Ala

Asn

Thr

Leu

Asn 975

Ala

His

Gly

Arg 980

Gin

Váli Thr

Val

Gin 985

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe 990

Phe

Thr

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Val

Glu

Arg

995 1000 1005

Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gin Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys 1010 1015 1020

Glu Asn 1025	Tyr	Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu
1030	1035	1040
Pro Gly	Leu	Val Met Ala Gin 1045	Asn Gin Arg Ile Arg 1050	Trp Tyr Leu Leu 1055
Ser Met	Gly	Ser Asn Glu Asn 1060	Ile His Ser Ile His 1065	Phe Ser Gly His 1070
Val Phe	Ser Val Arg Lys Lys 1075	Glu Glu Tyr Lys Met 1080	Ala Val Tyr Asn 1085
Leu Tyr Pro 1090	Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val 1095 1100
Gly Ile 1105	Trp	Arg Ile Glu Cys 1110	Leu Ile Gly Glu His 1115	Leu Gin Ala Gly 1120
Met Ser	Thr	Thr Phe Leu Val 1125	Tyr Ser Lys Glu Cys 1130	Gin Ala Pro Leu 1135
Gly Met	Ale	Ser Gly Arg Ile 1140	Arg Asp Phe Gin Ile 1145	Thr Ala Ser Gly 1150
Gin Tyr	Gly Gin Trp Ala Pro 1155	Lys Leu Ala Arg Leu 1160	His Tyr Ser Gly 1165
Ser Ile Asn 1170	Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His Ser Trp Ile Lys Val 1175 1190
Asp Leu 1185	Leu	Ala Pro Met Ile 1190	Ile His Gly Ile Met 1195	Thr Gin Gly Ala 1200
Arg Gin	Lys	Phe Ser Ser Leu 1205	Tyr Ile Ser Gin Phe 1210	Ile Ile Met Tyr 1215
Ser Leu	Asp	Gly Arg Asn Trp 1220	Gin Ser Tyr Arg Gly 1225	Asn Ser Thr Gly 1230
Thr Leu	Met Val Phe Phe Gly 1235	Asn Val Asp Ala Ser 1240	Gly Ile Lys His 1245
Asn Tle Phe 1250	Asn Pro Pro Ile Val Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1255 1260
Thr His 1265	Tyr	Ser Ile Arg Ser 1270	Thr Leu Arg Met Glu 1275	Leu Met Gly Cys 1230
Asp Leu	Asn	Ser Cys Ser Met 1285	Pro Leu Gly Met Gin 1290	Asn Lys Ala Ile 1295
Ser Asp	Ser	Gin Ile Thr Ala 1300	Ser Ser His Leu Ser 1305	Asn Ile Phe Ala 1310
Thr Trp	Ser	Pro Ser Gin Ala	Arg Leu His Leu Gin	Gly Arg Thr Asn

1315 1320 1325 i in

CZ 300959 Bó

Ala Trp Arg Pro 1330	Arg	Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gin Val Asp
1335	1340
Leu Gin Lys Thr 1345	Val	Lys Val Thr 1350	Gly Ile Thr Thr Gin Gly Val Lys 1355 1360
Ser Leu Leu Ser	Ser Met Tyr Val 1365	Lys Glu Phe Leu Val Ser Ser Ser 1370 1375
Gin Asp Gly Arg Arg 1380	Trp Thr Leu	Phe Leu Gin Asp Gly His Thr Lys 1385 1390
Val Phe Gin Gly 1395	Asn	Gin Asp Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Ala Leu 1400 1405
Asp Pro Pro Leu 1410	Phe	Thr Arg Tyr 1415	Leu Arg Ile His Pro Thr Ser Trp 1420
Ma Gin His Ile	Ala	Leu Arg Leu	Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin

1425	1430	1435	1440
Asp Leu Tyr *

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: není relevantní io (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: Peptid 20 (B) POZICE: 1..19 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka^ „Signální peptid lidského faktoru VIII.“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 15 10 15

Cys Phe Ser

QZ 300959 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující amino5 kyselinovou sekvenci prasečího faktoru VIII uvedenou jako sekvence id. č. 37, kde DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č, 36.
2. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu Al prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 20 až 391 v sekvenci id. č. 37, kde DNA io obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 36 od pozice 58 do 1173.
3. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu A3 prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1491 až 1820 v sekvenci id. č. 37, kde DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 36 od pozice 4471 do 5460.
4. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu Cl prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1821 až 1973 v sekvenci id. č. 37, kde DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 36 od pozice 5461 do 5919.

20 5. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu C2 prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1974 až 2133 v sekvenci id. č, 37, kde DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 36 od pozice 5920 do 6399.

6. DNA podle nároku 1, kde nukleotidové sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci

25 uvedenou jako sekvence id. č. 39.

7. DNA podle nároku 6, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 38.

30 8. DNA kódující hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující substituce kódující sekvenci prasečího faktoru VIII, kde nukleotidová sekvence lidského faktoru VIII kódující aminokyseliny číslo 2181 až 2243 je nahrazena nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny č. 1982 až 2004 v sekvenci id. č. 37,

35 9. DNA podle nároku 8, kde kódující DNA prasečího faktoru VIII je sekvence nukleotidů

5944 až 6132 v sekvenci id. č, 36.

10. DNA kódující prasečí faktor VIII obsahující kodony kódující aminokyseliny 20 až 2133 v sekvenci id. č. 37, kde DNA má nukleotidovou sekvenci nukleotidů 58 až 6399 sekvence

40 id. č. 36.

11. DNA kódující prasečí faktor Vlil bez domény B, která obsahuje kodony kódující aminokyseliny 20 až 1443 v sekvenci id. č. 39.

45 12. DNA podle nároku 11, která má nukleotidovou sekvenci nukleotidů 60 až 4331 sekvence id. č. 38.

13. Izolovaný a purifikovaný protein, který je produktem exprese DNA podle nároku 11.

so 14. Izolovaný a purifikovaný protein, který je produktem exprese DNA podle nároku 12.

15. Způsob přípravy prasečího faktoru VIII, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy je exprimována DNA kódující aminokyselinovou sekvenci id. č. 37 obsahující alespoň aminokyseliny 20 až 2133 ve vhodné savčí hostitelské buňce v kultivačním médiu a protein

55 faktoru VIII se purifíkuje z hostitelských buněk nebo z kultivačního média.

ni

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci v podstatě jako sekvence id. č. 36 obsahující přinejmenším nukleotidy 58 až 6399.
5 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že DNA kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. ě. 37.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. ě. 36.

io

19. Způsob přípravy prasečího faktoru VIII bez domény B, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy je exprimována DNA kódující aminokyselinovou sekvenci id. č. 36 obsahující alespoň aminokyseliny 20 až 1443 ve vhodné savčí hostitelské buňce v kultivačním médiu a protein faktoru VIII se purifíkuje z hostitelských buněk nebo z kultivačního média.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci v podstatě jako sekvence id. č. 38 obsahující přinejmenším nukleotidy 60 až 4331.

21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že DNA kóduje aminokyselinovou 20 sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 39.

22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 38 od nukleotidu č. 3 do nukleotidu ě. 4331.