ES2319745T3 - Secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos que codifican polipeptidos de factor viii de alto nivel de expresion, y metodos de uso. - Google Patents
Secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos que codifican polipeptidos de factor viii de alto nivel de expresion, y metodos de uso. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 19, en el que dicho polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión.
Description
Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que
codifican polipéptidos de factor VIII de alto nivel de expresión, y
métodos de uso.
Este trabajo estaba financiado por la subvención
RO1 HL40921 del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos
(NIH).
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular recombinante, particularmente a un polipéptido
de factor VIII modificado y a métodos de uso.
El factor VIII es una glicoproteína grande
(\sim300 kDa) que funciona como un componente integral de la ruta
intrínseca de la coagulación sanguínea. Contiene una serie de
dominios denominados
A1-A2-B-ap-A3-C1-C2.
El dominio B del factor VIII no tiene función conocida y puede
delecionarse sin pérdida de actividad de coagulación. Las
mutaciones en el gen del factor VIII que dan como resultado una
proteína factor VIII reducida o defectuosa dan origen a la
enfermedad genética hemofilia A, que se caracteriza por episodios de
sangrado recurrentes. El tratamiento de la hemofilia A requiere la
infusión intravenosa de factor VIII recombinante o derivado de
plasma.
Desde la introducción de factor VIII
recombinante para el tratamiento de la hemofilia A, el suministro ha
tenido problemas para atender la demanda debido a que el factor
VIII se expresa y se recupera a bajos niveles en los sistemas de
cultivo de células de mamífero heterólogos usados para la
fabricación comercial (Garber et al. (2000) Nature
Biotechnology 18: 1133). Además, los niveles de factor VIII
durante los ensayos clínicos de terapia génica de la hemofilia A
indican que los niveles de expresión serán una característica
limitante (Roth, et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344:
1735-1742). La importancia de este problema ha dado
como resultado esfuerzos de investigación significativos para
superar la baja barrera de expresión del factor VIII. Se han
identificado varios factores que limitan la expresión. incluyendo
bajos niveles de ARNm (Lynch et al. (1993) Hum. Gene
Ther. 4: 259-272; Hoeben et al. (1995)
Blood 85: 2447-2454; Koeberl et al.
(1995) Hum. Gene Ther. 6: 469-479),
interacción con chaperonas de proteínas y secreción ineficaz (Pipe
et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:
8537-8544; Tagliavacca et al. (2000)
Biochemistry 39: 1973-1981; Kaufman et
al. (1997) Blood Coagul Fibrinolysis 8 Supl. 2:
S3-14) y rápida degradación en ausencia del factor
de von Willebrand (Kaufman et al. (1988) J. Biol.
Chem. 263: 6352-6362 y Kaufman et al.
(1989) Mol. Cell Biol. 9: 1233-1242). Se ha
demostrado que la deleción del dominio B aumenta la producción de
proteína factor VIII en sistemas heterólogos (Toole et al.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:
5939-2942). Una forma con dominio B delecionado del
factor VIII humano (Lind et al. (1995) Euro. J.
Biochem. 232: 19-27) se ha autorizado para uso
clínico.
El documento WO 00/71141 describe aminoácidos
específicos del factor VIII humano que reaccionan con anticuerpos
inhibidores de pacientes con hemofilia y un factor VIII modificado
en el que estos aminoácidos se sustituyen en el dominio A2. El
documento WO 01/68109 describe formas sin dominio B del factor VIII
porcino.
A pesar de los nuevos conocimientos en la
regulación del factor VIII, la expresión continúa siendo
significativamente inferior que la de otras proteínas recombinantes
en los sistemas heterólogos usados en la fabricación comercial
(Kaufman et al. (1997) Blood Coagul. Fibrinolysis 8
Supl. 2: S3-14), así como en aplicaciones de terapia
génica ex vivo (Roth, et al. (2001) N. Engl. J.
Med. 344: 1735-1742) e in vivo (Chuah
et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6:
1363-1377). Son necesarios métodos y composiciones
para una expresión aumentada del factor VIII.
Se proporcionan métodos y composiciones que
permiten un alto nivel de expresión de un polipéptido de factor
VIII. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos
y composiciones que comprenden secuencias de ácidos nucleicos y
aminoácidos que comprenden un factor VIII modificado, que dan como
resultado un alto nivel de expresión del polipéptido. Los métodos y
composiciones de la invención encuentran utilidad en el tratamiento
de la deficiencia de factor VIII, incluyendo, por ejemplo, la
hemofilia A.
En particular, una realización de la presente
invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; una secuencia
de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el
95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en la que dicho
polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión.
En otra realización de la invención, se
proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 18; una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; y una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido factor VIII
aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios
A2, C1 y C2 humanos y que tiene al menos una identidad de secuencia
del 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en el que dicha
secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que se caracteriza
por un alto nivel de expresión. Se proporcionan adicionalmente
casetes de expresión, vectores y células que comprenden las
moléculas de ácido nucleico de la invención.
También se proporcionan composiciones
farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los
polipéptidos de la invención.
Se proporcionan métodos in vitro para la
producción de un polipéptido. En una realización, el método in
vitro comprende introducir en una célula una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEC ID Nº: 19; una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 18; una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido de factor VIII aislado que comprende
los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y
que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 97%, 98% ó
99% con la SEC ID Nº: 19, en la que la secuencia de nucleótidos
codifica un polipéptido caracterizado por un alto nivel de
expresión; y cultivar la célula en condiciones que permitan la
expresión de la secuencia de nucleótidos.
También se proporcionan métodos in vitro
para aumentar el nivel de expresión del polipéptido de factor VIII.
En una realización, el método in vitro comprende introducir
en una célula una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de factor VIII
aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios
A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al
menos el 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en el que la
secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido caracterizado por
un alto nivel de expresión, y cultivar la célula en condiciones que
permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos.
También se proporciona el uso de un polipéptido
o ácido nucleico de la invención en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una deficiencia de factor VIII en un
sujeto.
Las Figuras 1A-1H tomadas en
conjunto proporcionan una comparación de secuencias de aminoácidos
alineadas de las secuencias polipeptídicas del factor VIII humano
(SEC ID Nº: 6), porcino (SEC ID Nº: 2) y de ratón (SEC ID Nº:
8).
La Figura 2 proporciona un esquema de las
construcciones de factor VIII humano, porcino e híbrido
humano/porcino con el dominio B delecionado. La línea continua
entre los dominios A2 y ap representa secuencias
enlazadoras.
La Figura 3 proporciona datos gráficos que
muestran la expresión heteróloga de una proteína factor VIII porcina
con dominio B delecionado recombinante, denominada P/OL, una
proteína factor VIII humano con dominio B delecionado recombinante
y cinco proteínas factor VIII híbrido humano/porcino con dominio B
delecionado recombinantes, denominadas HP1, HP30, HP44, HP46 y
HP47. Se transfectaron células COS-7 (barras
oscuras) y células obtenidas de riñón de cría de hámster,
denominadas células BMK-M (barras sombreadas), con
las construcciones de expresión de factor VIII individuales y ADN
plasmídico de luciferasa y se cultivaron en medios sin suero durante
24 h. Los datos ilustran que se produce un aumento significativo en
la expresión de P/OL, HP44, HP47 y HP46 en comparación con HSQ. Por
el contrario, la expresión de HP1 y HP30 no se aumentó en
comparación con HSQ.
La Figura 4 proporciona la secuencia de
aminoácidos para el polipéptido de factor VIII_{SEP} denominado
en este documento HP44/OL (SEC ID Nº: 15).
Las Figuras 5A-5D proporcionan
la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 14) que codifica el
polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento
HP44/OL.
La Figura 6 proporciona la secuencia de
aminoácidos para el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado
en este documento HP46/SQ (SEC ID Nº: 17).
Las Figuras 7A-7B proporcionan
la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:16) que codifica el
polipéptido factor VIII_{SEP} denominado en este documento
HP46/SQ.
La Figura 8 proporciona la secuencia de
aminoácidos para el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado
en este documento HP47/SQ (SEC ID Nº: 19).
Las Figuras 9A-9B proporcionan
la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 18) que codifica el
polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento
HP47/SQ.
Las Figuras 10A-10B proporcionan
la secuencia de aminoácidos para el polipéptido con dominio B
delecionado del factor VIII humano (SEC ID Nº: 13).
Las Figuras 11A-11B proporcionan
la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 12) que codifica el
polipéptido con dominio B delecionado del factor VIII humano.
La Figura 12 proporciona una representación
esquemática de una posible variante del factor VIII_{SEP} de la
presente invención. La variante, denominada HP63/OL, contiene el
dominio A1 porcino y un dominio ap-A3 parcialmente
humanizado que comprende los aminoácidos porcinos de aproximadamente
1690 a aproximadamente 1804 y de aproximadamente 1819 a
aproximadamente 2019.
La Figura 13 proporciona la secuencia de
aminoácidos (SEC ID Nº: 21) que codifica el polipéptido del factor
VIII_{SEP} denominado en este documento HP63/OL.
Las Figuras 14A-14B proporcionan
la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 20) que codifica el
polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento
HP63/OL.
La presente invención proporciona métodos y
composiciones que permiten un alto nivel de expresión del
polipéptido de factor VIII. El polipéptido de factor VIII contiene
dominios de proteínas de homología definida que tienen la siguiente
nomenclatura:
A1-A2-B-ap-A3-C1-C2.
La presente invención ha identificado regiones dentro de los
dominios de un polipéptido de factor VIII no humano que promueven un
alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. Más
particularmente, se han identificado regiones del polipéptido de
factor VIII porcino que comprenden las regiones A1 y ap-A3 y
variantes y fragmentos de las mismas que confieren un alto nivel de
expresión tanto al polipéptido de factor VIII porcino como humano.
Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos y
composiciones que usan las secuencias del polipéptido de factor VIII
no humano que confieren un alto nivel de expresión y variantes
activas o fragmentos de estas secuencias para construir secuencias
de ácidos nucleicos y polipéptidos que codifiquen un polipéptido de
factor VIII modificado que dé como resultado un alto nivel de
expresión del polipéptido de factor VIII codificado. Los
polipéptidos de factor VIII modificados de la invención
caracterizados por un alto nivel de expresión se denominan en este
documento "factor VIII_{SEP}"
(superexpresión).
Por "alto nivel de expresión" se pretende
la producción de un polipéptido a niveles aumentados cuando se
comparan con los niveles de expresión del polipéptido de factor
VIII humano correspondiente expresado en las mismas condiciones. Un
aumento en los niveles de polipéptido (es decir, un alto nivel de
expresión) comprende al menos aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 veces o más expresión del
polipéptido de factor VIII_{SEP} en comparación con los niveles de
expresión del polipéptido de factor VIII humano correspondiente.
Como alternativa, un "alto nivel de expresión" puede comprender
un aumento en los niveles de expresión de polipéptido de al menos
1-25 veces, 1-5 veces,
5-10 veces, 10-15 veces,
15-20 veces, 20-25 veces o mayores
niveles de expresión del factor VIII_{SEP} cuando se comparan con
el polipéptido de factor VIII humano correspondiente. Los métodos
para ensayar un "alto nivel de expresión" son rutinarios en la
técnica y se describen en más detalle a continuación.
Por polipéptido de factor VIII
"correspondiente" se pretende un polipéptido de factor VIII que
comprende una secuencia de aminoácidos equivalente. Por ejemplo,
cuando se ensaya un polipéptido de factor VIII modificado que
comprende los dominios
A1-A2-ap-A3-C1-C2
para un alto nivel de expresión, se usará un polipéptido de factor
VIII humano o porcino que contenga los dominios correspondientes (es
decir,
A1-A2-ap-A3-C1-C2).
Cuando se ensaya un fragmento de un polipéptido de factor VIII
modificado para un alto nivel de expresión (es decir,
A1-A2-ap-A3), se ensayará un polipéptido de
factor VIII humano o porcino que tenga los dominios
correspondientes (es decir, A1-A2-ap-A3).
Las composiciones de la invención incluyen las
moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican
polipéptidos de factor VIII caracterizados por un alto nivel de
expresión. Como se describe en más detalle a continuación, el
dominio A1 del factor VIII porcino (restos aminoacídicos
20-391 de la SEC ID Nº: 19) y el dominio
ap-A3 del factor VIII porcino (aminoácidos
1450-1820 de la SEC ID Nº: 19) permiten un alto
nivel de expresión del factor VIII. Se describen en este documento
métodos y composiciones que comprenden polipéptidos de factor
VIII_{SEP} y variantes activa y fragmentos activos de polipéptidos
de factor VIII_{SEP} caracterizados por un alto nivel de
expresión.
En particular, la presente invención proporciona
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido
de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y
los dominios A2, C1 y C2 humanos, que tienen una identidad de
secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 19, en las que dicho
polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión. También
se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden
las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID Nº: 18. Se
describen adicionalmente polipéptidos que tienen una secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico como se
expone en la SEC ID Nº: 19.
La tabla 1 proporciona un resumen de la
estructura de las secuencias que se proporcionan en las SEC ID Nº:
14-19, donde el subíndice "P" designa un
dominio del factor VIII porcino y el subíndice "H" designa un
dominio del factor VIII humano.
La invención incluye composiciones de ácido
nucleico o proteína aisladas o sustancialmente purificadas. Una
molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o
"purificada", o una porción biológicamente activa de las
mismas, está sustancialmente libre de otro material celular o medio
de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o
sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos
cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido
nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente
secuencias codificantes de proteínas) que flanquean de forma
natural al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los
extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del
organismo del que se obtiene el ácido nucleico. Por ejemplo, en
diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede
contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5
kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean de forma
natural a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la
célula de la que se obtiene el ácido nucleico. Una proteína que
está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones
de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%,
5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la
invención o una porción biológicamente activa de la misma se
produce de forma recombinante, preferiblemente el medio de cultivo
representa menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, 5% (en peso
seco) de los precursores químicos o químicos que no sean proteína
de interés.
También se describen fragmentos y variantes de
las secuencias de nucleótidos de factor VIII_{SEP} descritas y
proteínas codificadas por las mismas. Por "fragmento" se
pretende una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción
de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, una proteína
codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de
nucleótidos pueden codificar fragmentos proteicos que conserven la
actividad biológica de los polipéptidos expuestos en la SEC ID Nº:
19 y, por lo tanto, se caracterizan por un alto nivel de expresión
del polipéptido de factor VIII. Por lo tanto, los fragmentos de una
secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente
10, de aproximadamente 20 nucleótidos, de aproximadamente 50
nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente
500 nucleótidos, de aproximadamente 1000 nucleótidos, de
aproximadamente 2000 nucleótidos, de aproximadamente 3000
nucleótidos, de aproximadamente 4000 nucleótidos, de aproximadamente
5000 nucleótidos, de aproximadamente 6000 nucleótidos, de
aproximadamente 7000 nucleótidos, de aproximadamente 8000
nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa
que codifica el polipéptido de factor VIII de la invención de
aproximadamente 9000 nucleótidos.
Un fragmento de una secuencia de nucleótidos
descrita en este documento que codifique una porción biológicamente
activa de una proteína factor VIII_{SEP} que codificará al menos
12, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000,
2100, 2200, 2300 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de
aminoácidos presentes en una proteína factor VIII de longitud
completa de la invención (por ejemplo, 1467 aminoácidos para la SEC
ID Nº: 19) y permitirá un alto nivel de expresión del polipéptido
de factor VIII.
Por "variante" se pretenden secuencias
sustancialmente similares. Para secuencias de nucleótidos, las
variantes conservativas incluyen las secuencias que, debido a la
degeneración del código genético, codifican la secuencia de
aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Las
secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias de
nucleótidos derivadas sintéticamente tales como las generadas, por
ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida, pero que todavía
codificarán una proteína factor VIII_{SEP} caracterizada por un
alto nivel de expresión. Las variantes de una secuencia de
nucleótidos particular de la invención tendrán una identidad de
secuencia de al menos el 95%, 96%, 97% y, más preferiblemente, de
aproximadamente el 98%, 99% o más con esa secuencia de nucleótidos
particular, como se determina mediante programas de alineamiento de
secuencias que se describen en otra parte en este documento.
Por proteína "variante" se pretende una
proteína derivada del polipéptido de la SEC ID Nº: 19 por deleción
(denominada truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos en el
extremo N-terminal y/o C-terminal de
la proteína; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o
más sitios en la proteína; o sustitución de uno o más aminoácidos
en uno o más sitios en la proteína. Las proteínas variantes son
biológicamente activas, es decir continúan poseyendo la actividad
biológica deseada de la SEC ID Nº: 19, por lo tanto, continuarán
permitiendo el alto nivel de expresión del polipéptido de factor
VIII. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de
polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes
biológicamente activas de un polipéptido tendrán una identidad
secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 19, como se determina
mediante programas de alineamiento de secuencias que se describen
en otra parte en este documento usando parámetros por defecto. Una
variante biológicamente activa de una proteína de la invención
puede diferir de esa proteína en tan pocos como
1-100, 1-50, 1-25,
1-15 restos aminoacídicos, tan pocos como
1-10, tales como 6-10, tan pocos
como 5, tan pocos como 4, 3, 2 o incluso 1 resto aminoacídico.
La actividad biológica de los polipéptidos de
factor VII_{SEP} puede ensayarse por cualquier método conocido en
la técnica. Como se ha analizado anteriormente, los polipéptidos de
factor VIII_{SEP} de la invención se caracterizan por un alto
nivel de expresión. Se conocen en la técnica ensayos para medir un
alto nivel de expresión. Por ejemplo, el nivel de expresión del
polipéptido de factor VIII_{SEP} puede medirse por análisis de
transferencia de Western o ELISA. Otros métodos incluyen, por
ejemplo, marcaje de líneas celulares que expresen el polipéptido de
factor VIII con ^{35}S-metionina, seguido de
inmunoprecipitación de moléculas de factor VIII radiomarcadas. Como
alternativa, el nivel de expresión del polipéptido de factor
VIII_{SEP} puede ensayarse por medición de la actividad del
polipéptido de factor VIII. Por ejemplo, podría ensayarse una
expresión de factor VIII aumentada por medición de la actividad del
factor VIII usando ensayos convencionales conocidos en la técnica,
incluyendo un ensayo de coagulación de una fase o un ensayo de
actividad de dos fases. Véase, por ejemplo, la patente de Estados
Unidos Nº 6.458.561 y la sección Experimental a continuación.
En resumen, los ensayos de coagulación se basan
en la capacidad del factor VIII de acortar el tiempo de coagulación
de plasma obtenido de un paciente con hemofilia A. Por ejemplo, en
el ensayo de una fase, se incuban 0,1 ml de plasma con hemofilia A
(George King Biomedical, Inc.) con 0,1 ml de reactivo de
tromboplatina parcial activada (APTT) (Organon Teknika) y 0,01 ml
de muestra o patrón, que consiste en plasma humano normal tratado
con citrato y diluido durante 5 min a 37ºC en un baño de agua. La
incubación se sigue de la adición de 0,1 ml de CaCl_{2} 20 mM y
el tiempo para el desarrollo de un coágulo de fibrina se determina
por inspección visual. Una unidad de factor VIII se define como la
cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal tratado con
citrato.
El ensayo de una fase depende de la activación
endógena del factor VIII por activadores formados en el plasma con
hemofilia A, mientras que el ensayo de dos fases mide la actividad
procoagulante de factor VIII preactivado. En el ensayo de dos
fases, se añaden muestras que contienen factor VIII que se hacen
reaccionar con trombina a una mezcla de tromboplastina parcial
activada y plasma humano con hemofilia A, que se preincuba durante
5 min a 37ºC. Los tiempos de coagulación resultantes se convierten
en unidades/ml en base a la misma curva patrón humana descrita
anteriormente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº
6.376.463.
Los polipéptidos de factor VIII_{SEP} de la
invención pueden alterarse de diversas formas incluyendo
sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de
aminoácidos. Se conocen en general en la técnica métodos para dichas
manipulaciones. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la
secuencia de aminoácidos de las proteínas factor VIII_{SEP} por
mutaciones en el ADN. Se conocen bien en la técnica métodos para
mutagénesis y modificaciones de la secuencia de nucleótidos. Véase,
por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
488-492, Kunkel et al. (1987) Methods in
Enzymol. 154: 367-382; Patente de Estados
Unidos Nº 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in
Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y
las referencias citadas en los mismos. Pueden encontrarse
orientaciones en lo que respecta a sustituciones de aminoácidos
apropiadas que no afecten a la actividad biológica (es decir, alto
nivel de expresión) del factor VIII_{SEP} en el modelo de Dayhoff
et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.), incorporado en este
documento como referencia. Pueden preferirse sustituciones
conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido con otro
que tenga propiedades similares. Como alternativa, se conocen en la
técnica métodos para minimizar el número de aminoácidos porcinos en
los dominios A_{1} y ap-A_{3} del factor VIII_{SEP} y
aún continuar conservando el alto nivel de expresión del factor
VIII_{SEP} e incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida
establecida tal como mediante corte y empalme por extensión de
solapamiento, como se describe en otra parte en este documento.
Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica
la variante no deben situar la secuencia fuera de la fase de
lectura y, preferiblemente, no generarán regiones complementarias
que producirían una estructura de ARNm secundaria. Véase, la
Publicación de Solicitud de Patente EP Nº 75.444.
Cuando es difícil predecir el efecto exacto de
la sustitución, deleción o inserción antes de realizarla, un
especialista en la técnica apreciará que el efecto se evaluará
mediante ensayos de exploración de rutina. Es decir, la actividad
puede evaluarse por un alto nivel de expresión del polipéptido de
factor VIII, como se analiza en detalle en otra parte en este
documento.
Por "identidad de secuencia" se entiende
que los mismos nucleótidos o restos aminoacídicos se encuentran
dentro de la secuencia variante y una secuencia de referencia
cuando un segmento contiguo especificado de la secuencia de
nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la variante se alinea y se
compara con la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos
de la secuencia de referencia. Se conocen bien en la técnica métodos
para el alineamiento de secuencias y para determinar la identidad
entre secuencias. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds.
(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19
(Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva
York); y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) in Atlas of
Polypeptide Sequence and Structure 5: Supl. 3 (National
Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Con respecto al
alineamiento óptimo de dos secuencias de nucleótidos, el segmento
contiguo de la secuencia de nucleótidos variante puede tener
nucleótidos adicionales o nucleótidos delecionados con respecto a
la secuencia de nucleótidos de referencia. Así mismo, con el fin de
un alineamiento óptimo de dos secuencias de aminoácidos, el segmento
contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener restos
aminoacídicos adicionales o restos aminoacídicos delecionados con
respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento
contiguo usado para comparación con la secuencia de nucleótidos de
referencia o secuencia de aminoácidos de referencia comprenderá al
menos 20 nucleótidos contiguos, o restos aminoacídicos, y puede ser
de 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos o restos aminoacídicos. Pueden
realizarse correcciones para una identidad de secuencia aumentada
asociadas con la inclusión de huecos en la secuencia de nucleótidos
o la secuencia de aminoácidos de la variante por asignación de
penalizaciones por huecos. Se conocen bien en la técnica métodos de
alineamiento de
secuencias.
secuencias.
La determinación del porcentaje de identidad
entre dos secuencias se consigue usando un algoritmo matemático. En
concreto, para los fines de la presente invención, el porcentaje de
identidad de una secuencia de aminoácidos se determina usando el
algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman
usando una búsqueda de 6 huecos afines con una penalización por
apertura de huecos de 12 y una penalización por extensión de huecos
de 2, matriz BLOSUM 62. El algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman se muestra en Smith y Waterman (1981)
Adv. Appl. Math 2: 482-489, incorporado en
este documento como referencia. Como alternativa, para los fines de
la presente invención, el porcentaje de identidad de una secuencia
de nucleótidos se determina usando el algoritmo de búsqueda
homología de Smith-Waterman usando una penalización
por apertura de huecos de 25 y una penalización por extensión de
huecos de 5. Dicha determinación de la identidad de secuencia puede
realizarse usando, por ejemplo, el DeCypher Hardware Accelerator de
TimeLogic.
Se reconoce además que cuando se considera el
porcentaje de identidad de aminoácidos, algunas posiciones de
aminoácidos pueden diferir como resultado de sustituciones de
aminoácidos conservativas, que no afectan a las propiedades de
función del polinucleótido. En estos casos, el porcentaje de
identidad de secuencia debe ajustarse hacia arriba para tener en
cuenta la similitud en aminoácidos sustituidos de forma
conservativa. Dichos ajustes se conocen bien en la técnica. Véase,
por ejemplo, Meyers et al. (1988) Computer Applic. Biol.
Sci. 4: 11-17.
Se reconoce que variantes de secuencias de la
invención pueden codificar polipéptidos de factor VIII_{SEP} que
contengan solamente los restos aminoacídicos de los dominios
A1_{P} y ap-A3_{P}, que confieren el alto nivel de
expresión al polipéptido de factor VIII. Por consiguiente, los
dominios A1_{P} y A3_{P} pueden humanizarse progresivamente de
modo que sólo los restos necesarios para conservar el alto nivel de
expresión se conserven en el polipéptido de factor VIII_{SEP}. Los
especialistas en la técnica conocen dichos métodos y también se
analizan en más detalle a continuación. Véase también, por ejemplo,
las Patentes de Estados Unidos Nº 6.376.463; 6.48.563; 5.744.466;
5.888.974; 5.663.060; 5.364.771; 5.859.204; y 6.180.371;
incorporándose todas ellas en este documento como referencia.
Además, se reconoce que puede usarse un modelo tridimensional de
los dominios A1-A2-A3 del factor
VIII humano para identificar regiones lejos de la interfaz del
dominio. Un especialista será capaz de usar este modelo para
identificar restos aminoacídicos diana para la humanización.
Se reconoce que el factor VIII_{SEP} variante
o fragmentos del mismo pueden construirse (1) por sustitución de
las subunidades humanas o subunidades animales correspondientes por
subunidades animales o subunidades humanas aisladas derivadas de
plasma (cadenas pesadas o ligeras); (2) por sustitución de los
dominios animales o dominios humanos correspondientes por dominios
humanos o dominios animales (A1, A2, A3, B, C1 y C2); (3) por
sustitución de partes de dominios animales o dominios humanos por
partes de dominios humanos o dominios animales; (4) por sustitución
del aminoácido o aminoácidos animales o humanos correspondientes por
al menos una secuencia específica que incluya uno o más aminoácidos
humanos o animales únicos; o (5) por sustitución de al menos una
secuencia que incluye uno o más restos aminoacídicos específicos en
el factor VIII humano, animal o variante o fragmentos del mismo por
una secuencia de aminoácidos que no tenga una identidad de secuencia
conocida con el factor VIII. Pueden obtenerse reemplazos de
aminoácidos individuales por mutagénesis dirigida del ADN
codificante del segmento correspondiente.
En una molécula de factor VIII, un
"dominio", como se usa en este documento, es una secuencia
continua de aminoácidos que se define por una identidad de
secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica
por trombina. A menos que se especifique otra cosa, los dominios del
factor VIII incluyen los siguientes restos aminoacídicos, cuando
las secuencias se alinean con la secuencia aminoácidos humana (SEC
ID Nº: 6): A1, restos Ala1-Arg372; A2, restos
Ser373-Arg740; B, restos
Ser741-Arg1648; A3, restos
Ser1690-Ile2032; C1, restos
Arg2033-Asn2172; C2, restos
Ser2173-Tyr2332. La secuencia
A3-C1-C2 incluye los restos
Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, los restos
Glu1649-Arg1689, se denomina habitualmente el
péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. El
factor VIII se activa proteolíticamente por trombina o factor Xa,
que lo disocia del factor de von Willebrand, formando el factor
VIII, que tiene función procoagulante. La función biológica del
factor VIIIa es aumentar la eficacia catalítica del factor IXa
hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El
factor activado por trombina VIIIa es un heterotrímero
A1/A2/A3/-C1-C2 de 160 kDa que forma un complejo
con el factor IXa y el factor X en la superficie de plaquetas o
monocitos. Un "dominio parcial", como se usa en este
documento, es una secuencia continua de aminoácidos que forman parte
de un dominio. Las "subunidades" de factor VIII humano animal
(es decir, ratón, cerdo, perro, etc.), como se usan en este
documento, son las cadenas pesada y ligera de la proteína. La
cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2 y B.
La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3,
C1 y C2. Un resto aminoacídico o secuencia "única", como se
usa en este documento, se refiere a una secuencia o resto
aminoacídico en la molécula de factor VIII de una especie que es
diferente del resto o secuencia homóloga en la molécula de factor
VIII de otra especie. Como se usa en este documento, la expresión
"factor VIII de mamífero" incluye un factor VIII con una
secuencia de aminoácidos procedente de cualquier mamífero no humano
a menos que se especifique otra cosa. El término "animal",
como se usa en este documento, se refiere a un cerdo y otros
mamíferos no humanos.
Puesto que la actual información indica que el
domino B no tiene ningún epítopo inhibidor y no tiene ningún efecto
conocido sobre la función del factor VIII, las variantes del factor
VIII_{SEP} pueden tener un dominio B o una porción del mismo.
Además, las variantes del factor VIII_{SEP} también pueden tener
el dominio B del factor VIII con el domino B del factor V porcino o
humano. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.004.803. Un factor VIII_{SEP} variante "sin dominio B" o
fragmento del mismo, como se usa en este documento, se refiere a
una cualquiera de las construcciones de factor VIII_{SEP} variante
descritas en este documento que carecen del domino B o de una
porción del mismo.
Un especialista en la técnica estará enterado de
las técnicas que permiten que subunidades individuales, dominios o
partes continuas de dominios de ADNc de factor VIII animal o humano
se clonen y sustituyan las subunidades, dominios o partes de
dominios humanos o porcinos correspondientes por técnicas de
mutagénesis establecidas y, por lo tanto, generen un factor
VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, Lubin
et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (12):
8639-8641 describe técnicas para sustituir el
dominio humano por el dominio A2 porcino usando sitios de
restricción convenientes. Otros métodos para sustituir el ADNc del
factor VIII de otra especie por una región del ADNc del factor VIII
de una especie incluyen corte y empalme por extensión de
solapamiento ("SOE"), como se describe por Horton et al.
(1993) Meth. Enzymol 217: 270-279.
La secuencia de nucleótidos que codifica los
polipéptidos de factor VIII_{SEP} o variantes activas o fragmentos
de los mismos puede estar contenida en una construcción de ADN. La
construcción de ADN puede incluir una diversidad de
potenciadores/promotores de fuentes tanto virales como de mamíferos,
que dirijan la expresión del polipéptido de factor VIII_{SEP} en
el tipo celular deseado. La construcción de ADN puede contener
además secuencias reguladoras 3' y secuencias de ácido nucleico que
faciliten la subclonación y recuperación del ADN.
El promotor de la transcripción y, si se desea,
el elemento potenciador de la transcripción, están unidos
operativamente a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido de
factor VIII. Un "promotor" se define como una secuencia de ADN
mínima que es suficiente para dirigir la transcripción de una
secuencia de ácido nucleico. Un "elemento potenciador de la
transcripción" se refiere a una secuencia de ADN reguladora que
estimula la transcripción del gen adyacente. La secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido de factor VIII está unida
operativamente a la secuencia promotora. Véase, por ejemplo, Goeddel
(1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185
(Academic Press, San Diego, CA).
Por "unida operativamente" se pretende un
enlace funcional entre el promotor regulador y la secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido de factor VIII. El enlace
funcional permite la expresión génica del factor VIII cuando están
presentes las proteínas activadoras de la transcripción
apropiadas.
Por lo tanto, la construcción de ADN puede
incluir un promotor que puede ser nativo o extraño. Por
"extraño" se entiende una secuencia que no se encuentra en el
organismo nativo. Además, los elementos reguladores de la
transcripción pueden ser heterólogos a la secuencia de nucleótidos
que codifica el factor VIII. Por "heterólogo" se pretende
cualquier secuencia de nucleótidos que no se encuentre de forma
natural cadena arriba de la secuencia que codifica el polipéptido
de factor VIII. El promotor puede ser una secuencia natural o una
secuencia sintética. Además, el promotor puede ser activo
constitutivamente, específico de tejido o inducible. Un promotor
específico de tejido se activa preferentemente en un tejido dado y
da como resultado la expresión de un producto génico en el tejido
donde se activa.
Para el uso en células de mamífero, los
promotores pueden obtenerse de un virus. Por ejemplo, los promotores
usados comúnmente proceden de polioma, virus de los simios 40
(SV40) y adenovirus 2. Los promotores temprano y tardío del virus
SV40 son tan útiles como el promotor tardío principal de adenovirus.
Además, también es posible, y con frecuencia deseable, utilizar
secuencias promotoras o de control asociadas normalmente con la
secuencia génica deseada, con tal de que dichas secuencias de
control sean compatibles con el sistema de célula hospeda-
dora.
dora.
En ciertas realizaciones, la introducción de la
secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII en una célula
puede identificarse in vitro o in vivo por inclusión
de un marcador en la construcción de ADN. El marcador dará como
resultado un cambio identificable en la célula transformada
genéticamente. Los marcadores de selección de fármacos incluyen,
por ejemplo, neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina
e histidinol. Como alternativa, pueden usarse enzimas tales como la
timidina quinasa del virus herpes simple (TK) o marcadores
inmunológicos. Se conocen bien en la técnica ejemplos adicionales de
marcadores de selección.
Se reconoce que pueden preverse múltiples
modificaciones para el diseño de la construcción de ADN usada en
los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la construcción
puede diseñarse para la inserción de la secuencia de nucleótidos
que codifica el polipéptido de factor VIII_{SEP} usando sistemas
de recombinación homóloga o específica de sitio (es decir, sistemas
de recombinación Cre o FLP).
La construcción de ADN también puede contener al
menos un gen adicional que se va a cointroducir en las células
hospedadoras.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden estar contenidas en un vector de expresión. Un
"vector de expresión" es un elemento de ADN, con frecuencia de
estructura circular, que tiene la capacidad de replicarse de forma
autónoma en una células hospedadora deseada o de integrarse en un
genoma de célula hospedadora, y que además posee ciertas
características bien conocidas que, por ejemplo, permiten la
expresión de un ADN codificante insertado en la secuencia del
vector en el sitio apropiado y en la orientación apropiada. Dichas
características pueden incluir, pero sin limitación, una o más
secuencias promotoras para dirigir el inicio de la transcripción
del ADN codificante y otros elementos de ADN tales como
potenciadores, sitios de poliadenilación y similares, todos igual
de bien conocidos en la técnica.
Otros vectores, incluyendo vectores tanto
plasmídicos como virales de eucariotas, pueden usarse para expresar
una construcción génica recombinante en células eucariotas
dependiendo de la preferencia y del criterio del médico
especialista (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Capítulo
16). Por ejemplo, se conocen en la técnica muchos vectores virales
incluyendo, por ejemplo, retrovirus, virus adenoasociados y
adenovirus. Otros virus útiles para la introducción de un gen en
una célula incluyen, pero sin limitación, virus herpes, virus de
las paperas, poliovirus, virus Sindbis, virus vaccinia tales como el
virus de la viruela del canario. Los métodos para producir
partículas virales de replicación deficiente y para manipular los
genomas virales se conocen bien. Véase, por ejemplo, Rosenfeld
et al. (1991) Science 252: 431-434,
Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:
143-155 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.882.877
(adenovirus); Patente de Estados Unidos Nº 5.139.941 (virus
adenoasociado); Patente de Estados Unidos Nº 4.861.719, Patente de
Estados Unidos Nº 5.681.746 y Miller et al. (1993)
Methods in Enzymology 217: 581 (retrovirus), incorporándose
todas como referencia en este documento. Por lo tanto, dados los
conocimientos en la técnica, pueden construirse fácilmente vectores
virales para el uso en la introducción de las secuencias del factor
VIII en una célula. Pueden usarse otros vectores y sistemas de
expresión, incluyendo sistemas de células bacterianas, de levadura e
insecto, pero no se prefieren debido a diferencias en o a ausencia
de glicosilación.
Los polipéptidos de factor VIII de la invención
pueden expresarse en una diversidad de células usadas comúnmente
para cultivo y expresión de proteína de mamífero recombinante. En
particular, se ha descubierto que varias líneas celulares de
roedores son hospedadores especialmente útiles para la expresión de
proteínas grandes. Las líneas celulares preferidas, disponibles en
la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., incluyen,
pero sin limitación, células de riñón de cría de hámster y células
de ovario de hámster chino (CHO), que se cultivan usando
procedimientos y medios de rutina. Las células de interés
adicionales pueden incluir células de vertebrados tales como VERO,
células HeLa, W138, COS-7 y líneas celulares MDCK.
Para otros sistemas de expresión adecuados véanse los capítulos 16
y 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A
Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, NY). Véase, Goeddel (1990) in Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San
Diego, CA).
La construcción de ADN de la presente invención
puede introducirse en una célula (procariota o eucariota) por
métodos convencionales. Como se usan en este documento, los términos
"transformación" y "transfección" pretenden referirse a
una diversidad de procedimientos reconocidos en la técnica para
introducir un ADN en una célula hospedadora. Dichos métodos
incluyen, por ejemplo, transfección incluyendo, pero sin limitación,
liposoma-polibreno, transfección mediada por DEAE
dextrano, electroporación, precipitación con fosfato de calcio,
microinyección o microproyectiles dirigidos de alta velocidad
("biolística"). Dichas técnicas son bien conocidas por un
especialista en la técnica. Véase, Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed. Cold Spring
Harbor Lab Press, Plainview, NY). Como alternativa, se podría usar
un sistema que suministre la construcción de ADN en un vehículo de
administración génica. El vehículo de administración génica puede
ser viral o químico. Pueden usarse diversos vehículos de
administración génica virales con la presente invención. En
general, los vectores virales están compuestos por partículas
virales procedentes de virus de origen natural. Los virus de origen
natural se han modificado genéticamente para ser de replicación
deficiente y no generar virus infecciosos adicionales. El vector
viral también contiene una construcción de ADN capaz de expresar la
proteína factor VIII.
La construcción de ADN que contiene secuencias
de ácido nucleico que codifican el polipéptido factor VIII_{SEP}
también puede administrarse a una célula mediante un vehículo de
administración de genes no viral. Dichos vehículos de
administración de genes químicos incluyen, por ejemplo, una
formulación de complejo de ADN o ARN-liposoma o un
ADN desnudo. Véase, por ejemplo, Wang et al. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7851, Patente de Estados Unidos Nº
5.844.107, Patente de Estados Unidos Nº 5.108.921 y Wagner et
al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:
4255-4259, incorporándose todas en este documento
como referencia.
Se reconoce que el método de introducción del
polipéptido factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo en
una célula puede dar como resultado una integración estable en el
genoma celular o una expresión episomal transito-
ria.
ria.
Como se define en este documento, el "producto
de expresión" de un ADN que codifica un polipéptido factor
VIII_{SEP} o un fragmento o variante del mismo es el producto
obtenido a partir de la expresión del ADN citado en una célula
hospedadora adecuada, incluyendo dichas características de
modificación pre o post-traduccional de la proteína
codificada por el ADN citado, incluyendo pero sin limitación,
glicosilación, escisión proteolítica y similares. Se sabe en la
técnica que dichas modificaciones pueden aparecer y pueden diferir
algo dependiendo del tipo de célula hospedadora y de otros
factores, y pueden dar como resultado isoformas moleculares del
producto, con conservación de la actividad procoagulante. Véase, por
ejemplo, Lind et al, (1995) Eur. J. Biochem. 232:
1927, incorporado en este documento como referencia.
En una realización, se inserta ADNc que codifica
factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento del mismo en un
vector de expresión de mamífero tal como ReNeo. Se consigue una
caracterización preliminar del factor VIII_{SEP} por expresión
transitoria en el vector de expresión ReNeo que contiene la
construcción de factor VIII_{SEP} en células
COS-7. Después, puede realizarse una determinación
de si se expresa una proteína factor VIII_{SEP} activa. La
construcción de vector de expresión se usa adicionalmente para
transfectar de forma estable células en cultivo, tales como células
de riñón de cría de hámster, usando métodos que son rutinarios en
la técnica, tales como transfección mediada por liposomas
(Lipofectin.TM., Life Tecyhnologies, Inc.). La expresión de la
proteína factor VIII_{SEP} puede confirmarse, por ejemplo, por
secuenciación, transferencia de Northern y Western o reacción en
cadena a la polimerasa (PCR).
Los polipéptidos de factor VIII_{SEP} o
fragmentos o variantes de los mismos en los medios de cultivo en
los que se mantienen las células transfectadas que expresan de forma
estable la proteína pueden precipitarse, sedimentarse, lavarse y
resuspenderse en un tampón apropiado y la proteína factor
VIII_{SEP} o variante o fragmento de la misma se purifica por
técnicas convencionales, incluyendo cromatografía de inmunoafinidad
usando, por ejemplo, un monoclonal
anti-A2-Sepharose^{TM}.
Una "proteína de fusión" o "factor
VIII_{SEP} de fusión o fragmento del mismo", como se usa en
este documento, es el producto de un gen híbrido en el que la
secuencia codificante para una proteína está considerablemente
modificada, por ejemplo, por fusión de parte de la misma con la
secuencia codificante de una segunda proteína de un gen diferente
para producir un gen híbrido que codifique la proteína de
fusión.
En una realización adicional, el factor
VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo se expresa como una
proteína de fusión de una molécula recombinante en la que la
secuencia que codifica un proteína o péptido que aumenta, por
ejemplo, la estabilidad, secreción, detección, aislamiento o similar
se inserta en un lugar adyacente a la secuencia que codifica el
factor VIII. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
4.965.199 que describe un método de ADN recombinante para producir
factor VIII en células hospedadoras de mamífero y purificación del
factor VIII humano. Se ha descrito la expresión de factor VIII
humano en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de
riñón de cría de hámster). Se conocen y se usan rutinariamente en
la técnica protocolos establecidos para el uso de secuencias de
control de la expresión de especies homólogas o heterólogas
incluyendo, por ejemplo, promotores, operadores y reguladores en la
preparación de proteínas de fusión. Véase, Ausubel et al.
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience,
N. Y., incorporado en este documento como referencia. Se señala
adicionalmente que la expresión se aumenta por inclusión de
porciones del dominio B. En particular, la inclusión de esas partes
del dominio B denominadas "SQ" (Lind et al. (1995)
Eur. J. Biochem. 232: 1927, incorporado en este documento
como referencia) da como resultado una expresión favorable. Las
construcciones de "SQ" carecen de todo el dominio B humano
excepto por 5 aminoácidos del extremo N-terminal
del dominio B y 9 aminoácidos del extremo C-terminal
del domino B.
Se reconoce adicionalmente que el polipéptido
factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo de la invención
puede prepararse mediante métodos de reconstitución. En esta
realización, el factor VIII_{SEP}, variantes o fragmentos del
mismo se preparan por aislamiento de subunidades, dominios o partes
continuas de dominios de factor VIII derivado de plasma, seguido de
reconstitución y purificación para producir un polipéptido de
factor VIII_{SEP} de la invención. Como alternativa, el factor
VIII_{SEP}, variante o fragmento del mismo puede prepararse por
métodos de ADN recombinante, seguidos de reconstitución y
purificación.
Más particularmente, el método de preparación de
un factor VIII_{SEP} por métodos de reconstitución puede
realizarse mediante una modificación de los procedimientos descritos
por Fay et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6197; y
Lollar et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10451, que
implica el aislamiento de subunidades (cadenas pesada y ligera) del
factor VIII humano y animal seguido de recombinación de la cadena
pesada humana y la cadena ligera animal o por recombinación de la
cadena ligera humana y la cadena pesada animal.
El aislamiento de las subunidades individuales
tanto humanas como animales implica la disociación del dímero de
cadena ligera/cadena pesada. Esto se consigue, por ejemplo, por
quelación de calcio con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
seguido de HPLC monoS^{TM} (Pharmacia-LKB,
Piscataway, N. J.). Las moléculas de factor VIII híbrido
humano/animal se reconstituyen a partir de subunidades aisladas en
presencia de calcio. El factor VIII híbrido de cadena ligera
humana/cadena pesada animal o cadena ligera animal/cadena pesada
humana se aísla a partir de las cadenas pesadas sin reaccionar por
HPLC monoS^{TM} mediante procedimientos para el aislamiento del
factor VIII porcino, tales como los descritos por Lollar et
al. (1988) Blood 71: 137-143 y en la
Patente de Estados Unidos Nº 6.376.463, incorporándose ambas en este
documento como referencia.
Como se usan en este documento, los "ensayos
de diagnóstico" incluyen ensayos que en cierta forma utilizan la
interacción antígeno-anticuerpo para detectar y/o
cuantificar la cantidad de un anticuerpo particular que esté
presente en una muestra de ensayo para ayudar a la selección de
terapias médicas. Existen muchos de dichos ensayos conocidos por
los especialistas en la técnica. Como se usa en este documento, sin
embargo, el ADN del factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento
del mismo y la proteína expresada a partir del mismo, en su
totalidad o en parte, pueden sustituir a los reactivos
correspondientes en los ensayos conocidos de otra forma, por lo que
los ensayos modificados pueden usarse para detectar y/o cuantificar
anticuerpos contra factor VIII. Es el uso de estos reactivos, el
ADN del factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo o la
proteína expresada a partir del mismo, el que permite la
modificación de ensayos conocidos para la detección de anticuerpos
contra factor VIII humano o animal o contra factor VIII híbrido
humano/animal. Como se usa en este documento, el factor
VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo, que incluyen al
menos un epítopo de la proteína, puede usarse como el reactivo de
diagnóstico.
La secuencia de ADN o aminoácidos del factor
VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo puede usarse en
ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de
anticuerpos inhibidores contra factor VIII humano o animal,
incluyendo, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de
pacientes humanos con deficiencia de factor VIII. Estos ensayos de
anticuerpos incluyen ensayos tales como ensayos de ELISA,
inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión
y ensayo de actividad biológica de factor VIII (por ejemplo, por
ensayo de coagulación). Los ejemplos de otros ensayos en los que
puede usarse factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento del
mismo incluyen el ensayo de Bethesda y ensayos de anticoagulación.
Las técnicas para preparar estos reactivos y métodos para el uso de
los mismos se conocen por los especialistas en la técnica. Por
ejemplo, un inmunoensayo para la detección de anticuerpos
inhibidores en una muestra de suero de paciente puede incluir hacer
reaccionar la muestra de ensayo con una cantidad suficiente del
factor VIII_{SEP} que contiene al menos uno sitio antigénico,
donde la cantidad es suficiente para formar un complejo detectable
con los anticuerpos inhibidores en la muestra.
Pueden prepararse sondas de ácidos nucleicos y
aminoácidos basadas en la secuencia del ADN de factor VIII_{SEP}
o de la molécula proteica o fragmentos o variantes de la misma. En
algunas realizaciones, éstas pueden marcarse usando colorantes o
marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes o
radioactivos que estén disponibles en el mercado. Las sondas de
aminoácidos pueden usarse, por ejemplo, para explorar sueros u otros
fluidos corporales en los que se sospeche la presencia de
inhibidores para factor VIII humano, animal o híbrido humano/animal.
Los niveles de inhibidores pueden cuantificarse en pacientes y
compararse con controles sanos y pueden usarse, por ejemplo, para
determinar si un paciente con una deficiencia de factor VIII puede
tratarse con un factor VIII_{SEP} o fragmento activo o variante
del mismo. Pueden usarse las sondas de ADNc, por ejemplo, con fines
de investigación en la exploración de genotecas de ADN.
Se proporcionan adicionalmente composiciones
farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los
polipéptidos que codifican el factor VIII_{SEP} de alto nivel de
expresión de la presente invención o variantes o fragmentos del
mismo. Dichas composiciones pueden comprender ácidos nucleicos y
polipéptidos de la invención en solitario o en combinación con
compuestos de estabilización farmacéutica apropiados, vehículos de
administración y/o vehículos excipientes, que se preparan de acuerdo
con métodos conocidos, como se describe en Martin et al.
Remington's Pharmaceutical Sciences, incorporado en este
documento como referencia.
En una realización, los excipientes o vehículos
de administración preferidos para infusión intravenosa son solución
salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.
En otra realización, los compuestos de
estabilización adecuados, vehículos de administración y vehículos
excipientes incluyen, pero sin limitación, otras proteínas humanas
o animales tales como albúmina.
También pueden usarse en vesículas de
fosfolípidos o suspensiones liposomales como excipientes o vehículos
de administración farmacéuticamente aceptables. Estos pueden
prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas
en la técnica y pueden contener, por ejemplo,
fosfatidilserina-fosfatidilcolina u otras
composiciones de fosfolípidos o detergentes que juntos confieran una
carga negativa a la superficie, puesto que el factor VIII se une a
membranas de fosfolípidos cargadas negativamente. Pueden prepararse
liposomas por disolución de un lípido o lípidos apropiados (tal
como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidilcolina,
araquidoil fosfatidilcolina y colesterol) en un disolvente
inorgánico que después se evapora, dejando tras de sí una película
delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Después,
se introduce una solución acuosa del factor VIII_{SEP} de la
presente invención en el recipiente. Después, el recipiente se agita
a mano para liberar el material lipídico de los laterales del
recipiente y para dispersar los agregados de lípidos, formando de
este modo la suspensión liposomal.
Las moléculas de factor VIII_{SEP} de la
invención pueden combinarse con otros compuestos de estabilización
adecuados, vehículos de administración y/o vehículos excipientes
incluyendo factores de coagulación dependientes de vitamina K,
factor tisular y factor de von Willebrand (vWf) o un fragmento de
wVf que contenga el sitio de unión a factor VIII y polisacáridos
tales como sacarosa.
Las moléculas de factor VIII_{SEP} de la
invención también pueden administrarse por terapia génica usando
medios de administración tales como vectores retrovirales. Este
método consiste en la incorporación de una secuencia de nucleótidos
que codifica el polipéptido factor VIII_{SEP} deseado de la
invención en células humanas que se transplantan directamente en un
paciente deficiente en factor VIII_{SEP} o que se colocan en un
dispositivo implantable, permeable a las moléculas de factor VIII
pero impermeable a células, que después se transplantan.
En una realización, el método será de
transferencia génica mediada por retrovirus. En este método, una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de factor VIII
de la invención se clona en el genoma de un retrovirus modificado.
El gen se inserta en el genoma de la célula hospedadora mediante la
maquinaria viral, donde se expresará por la célula. El vector
retroviral se modifica de modo que no producirá virus, evitando la
infección vírica del hospedador. Los principios generales para este
tipo de terapia se conocen por los especialistas en la técnica y se
han revisado en la bibliografía (Kohn et al. (1989)
Transfusion 29: 812-820).
El polipéptido de factor VIII_{SEP} de la
invención puede almacenarse unido a vWf para aumentar la vida media
y la vida útil de la molécula polipeptídica. Además, la
liofilización del factor VIII_{SEP} puede mejorar los
rendimientos de moléculas activas en presencia de vWf. Los métodos
actuales para almacenamiento de factor VIII humano y animal usados
por proveedores comerciales pueden emplearse para almacenamiento del
factor VIII recombinante. Estos métodos incluyen: (1) liofilización
de factor VIII_{SEP} en un estado parcialmente purificado (como
un factor VIII "concentrado" que se infunde sin una
purificación adicional); (2) purificación por inmunoafinidad de
factor VIII_{SEP} por el método de Zimmerman y liofilización en
presencia de albúmina, que estabiliza el factor VIII; (3)
liofilización del factor VIII_{SEP} recombinante en presencia de
albúmina.
Además, los polipéptidos de factor VIII pueden
almacenarse a 4ºC en NaCl 0,6 M, MES 20 mM y CaCl_{2} 5 mM a pH
6,0. Los polipéptidos también pueden almacenarse congelados en estos
tampones y descongelarse con una pérdida mínima de actividad.
Puede usarse factor VIII_{SEP} o fragmentos o
variantes del mismo para tratar el sangrado incontrolado debido a
deficiencia de factor VIII (por ejemplo, hemorragia intraarticular,
intracraneal o gastrointestinal) en hemofílicos con y sin
anticuerpos inhibidores y en pacientes con deficiencia de factor
VIII adquirida debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los
materiales activos se administran preferiblemente por vía
intravenosa.
La "deficiencia de factor VIII", como se
usa en este documento, incluye la deficiencia en la actividad de
coagulación causada por producción de factor VIII deficiente, por
producción inadecuada o no producción de factor VIII, o por
inhibición parcial o total del factor VIII por inhibidores. La
hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII que es el
resultado de una deficiencia en un gen ligado al cromosoma X y la
ausencia o deficiencia de la proteína factor VIII que codifica.
Adicionalmente, el factor VIII_{SEP} o
fragmentos y variantes del mismo pueden administrarse por
transplante de células modificadas por ingeniería genética para
producir el factor VIII_{SEP} o por implantación de un
dispositivo que contenga dichas células, como se ha descrito
anteriormente.
En una realización, las composiciones
farmacéuticas de factor VIII_{SEP} o fragmentos y variantes del
mismo en solitario o en combinación con estabilizantes, vehículos
de administración y/o excipientes se infunden en pacientes por vía
intravenosa de acuerdo con el mismo procedimiento que se usa para la
infusión de factor VIII_{SEP}.
Las dosificaciones de tratamiento de la
composición de factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del
mismo que deben administrarse a un paciente que necesite dicho
tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia
de factor VIII. En general, el nivel de dosificación se ajusta en
frecuencia, duración y unidades de acuerdo con la gravedad y
duración de cada episodio de sangrado del paciente. Por
consiguiente, el factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del
mismo se incluyen en el excipiente, vehículo de administración o
estabilizante farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente
para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz
del híbrido para detener el sangrado, como se mide por ensayos de
coagulación convencionales.
La "actividad específica", como se usa en
este documento, se refiere a la actividad que corregirá la
deficiencia de coagulación de plasma deficiente en factor VIII
humano. La actividad específica se mide en unidades de actividad de
coagulación por miligramo de proteína de factor VIII total en un
ensayo convencional en el que el tiempo de coagulación del plasma
deficiente en factor VIII humano se compara con el de plasma humano
normal. Una unidad de actividad de factor VIII es la actividad
presente en un mililitro de plasma humano normal. En el ensayo,
cuanto más corto el tiempo para la formación del coágulo, mayor la
actividad del factor VIII que ese está ensayando. La actividad
específica de los polipéptidos de factor VIII, variantes o
fragmentos de los mismos puede ser menor que, igual a o superior a
la del factor VIII humano derivado de plasma o recombinante.
El factor VIII se define clásicamente como esa
sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige la
deficiencia de coagulación en plasma procedente de individuos con
hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de formas
purificadas y parcialmente purificadas de factor VIII_{SEP} se usa
para calcular la dosis del factor VIII para infusiones en pacientes
humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada del
plasma del paciente y de corrección de la deficiencia de sangrado
in vivo. No existen discrepancias descritas entre el ensayo
convencional de nuevas moléculas de factor VIII in vitro y su
comportamiento en el modelo de infusión de perro o en pacientes
humanos, de acuerdo con Lusher et al. New Engl. J. Med.
328: 453-459; Pittman et al. (1992)
Blood 79: 389-397; y Brinkhous et al.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:
8752-8755.
El aumento de factor VIII_{SEP} en el plasma
será suficiente para producir un efecto terapéutico. Un "efecto
terapéutico" se define como un aumento en la actividad de
coagulación sanguínea en el plasma de pacientes que es superior a
la actividad de coagulación observada en el sujeto antes de la
administración de la molécula de factor VIII_{SEP}. En un ensayo
de coagulación sanguínea convencional, cuanto más corto el tiempo
para la formación del coágulo mayor la actividad del factor VIII
que se está ensayando. Un aumento en la actividad del factor VIII
en el plasma deficiente en factor VIII de al menos el 1% o superior
será terapéuticamente beneficioso.
Habitualmente, el nivel de factor VIII en plasma
deseado para conseguir en el paciente a través de la administración
del factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo está en el
intervalo del 30-100% del normal. En un modo de
administración del factor VIII_{SEP} o un fragmento o variante del
mismo, la composición se administra por vía intravenosa a una
dosificación preferida en el intervalo de aproximadamente 5 a 50
unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en un intervalo
de 10-50 unidades/kg peso corporal y, más
preferiblemente, a una dosificación de 20-40
unidades/kg peso corporal; la frecuencia del intervalo está en el
intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas (en hemofílicos
gravemente afectados); y la duración del tratamiento en días está
en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que se resuelva el episodio
de sangrado. Véase, por ejemplo Roberts et al. (1990)
Hematology, Williams et al. ed. Cap. 153,
1453-1474, incorporado en este documento como
referencia. Los pacientes con inhibidores puede requerir más factor
VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo, o los pacientes
pueden requerir menos factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes
del mismo. Como en el tratamiento con factor VIII humano o porcino,
la cantidad de factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes
infundidas está desacreditada por el ensayo de coagulación de factor
VIII de una fase y, en casos seleccionados, la recuperación in
vivo se determina por medición del factor VIII en el plasma del
paciente después de la infusión. Debe entenderse que para cualquier
sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos
deberían ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad
individual y el juicio profesional de la persona que administre o
supervise la administración de las composiciones, y que los
intervalos de concentración expuestos en este documento son
ejemplares solamente y no pretenden limitar al alcance o la práctica
en la composición que se reivindica.
El tratamiento puede adoptar la forma de una
única administración intravenosa de la composición o la
administración periódica o continua a lo largo de un período de
tiempo prolongado, según sea necesario. Como alternativa, el factor
VIII_{SEP} o fragmentos o variantes del mismo pueden administrarse
por vía subcutánea u oral con liposomas en una o varias dosis a
intervalos de tiempo variables.
El factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes
del mismo también pueden usarse para tratar un sangrado incontrolado
debido a deficiencia de factor VIII en hemofílicos que han
desarrollado anticuerpos contra el factor VIII humano.
Ejemplo
1
Se aísla factor VIII tanto porcino como humano
de plasma como una proteína de dos subunidades. Las subunidades,
conocidas como la cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen
juntas mediante un enlace no covalente que requiere calcio u otros
iones metálicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII
contiene tres dominios, A1, A2 y B que están unidos covalentemetne.
La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios,
denominados A3, C1 y C2. El dominio B no tiene función biológica
conocida y puede eliminarse o eliminarse parcialmente de la
molécula proteolíticamente o por métodos de tecnología de ADN
recombinante sin una alteración significativa en ningún parámetro
medible del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene
una estructura y función similares al factor VIII derivado de
plasma aunque no está glicosilado a menos que se exprese en células
de mamífero. El factor VIII activado tanto humano como porcino
("factor VIIIa") tiene tres subunidades debido a la escisión
de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se
denomina A1/A2/A3-C1-C2.
La secuencia de ADNc del factor VIII porcino que
se corresponde con la región codificante del péptido señal, los
dominios A1, B, la región peptídica de actividad de cadena ligera
A3, C1 y C2 se proporcionan en la SEC ID Nº: 1. La traducción del
ADNc porcino se proporciona en la SEC ID Nº: 2.
El alineamiento de la secuencia de aminoácidos
predicha del factor VIII porcino de longitud completa (SEC ID Nº:
2) con las secuencias humana (Wood et al. (1984)
Nature 312: 330-337) (SEQ ID Nº: 6) y murina
(Elder et al. (1993) anteriormente) (SEQ ID Nº: 8)
publicadas se muestra en las figuras 1A-1H junto
con sitios para modificación postraduccional, escisión proteolítica
y reconocimiento por otras macromoléculas.
Pueden observarse sitios de glicosilación
ligados a N potenciales (NXS/T donde X no es prolina) en las figuras
1A-1H. Existen ochos sitios de glicosilación
ligados a N conservados: uno en el domino A1, uno en el dominio A2,
cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3 y uno en el dominio C1.
Las 19 cisteínas de los dominios A y C están conservadas mientras
que existe una divergencia en las cisteínas del domino B. Seis de
los siete puente disulfuro en el factor VIII se encuentran en
sitios homólogos en el factor V y ceruloplasmina y ambos enlaces
disulfuro del dominio C se encuentran en el factor V (McMullen et
al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746). El
factor VIII humano contiene tirosinas sulfatadas en las posiciones
346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 (Pittman et al. (1992)
Biochemistry 31: 3315-3325; Michnick et
al. (1994) J. Biol. Chem. 269:
20095-20102). Estos restos están conservados en el
factor VIII de ratón y en el factor VIII porcino (Figura 1), aunque
el programa CLUSTALW no consiguió alinear la tirosina de ratón
correspondiente a la Tyr346 en el factor VIII humano. Se
representan en la Figura 1 epítopos de los diversos dominios del
polipéptido factor VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los niveles de expresión de factor VIII humano
son significativamente inferiores a los niveles de otras proteínas
de coagulación in vivo y en sistemas de expresión heterólogos
in vitro. El bajo nivel de expresión del factor VIII humano
recombinante ha limitado el tratamiento de la hemofilia A usando
infusión de proteína recombinante y protocolos de terapia génica.
Sin embargo, se expresa factor VIII porcino con dominio B
delecionado recombinante a niveles 10-14 veces
superiores que el factor VIII humano con dominio B delecionado
recombinante in vitro. Para identificar las secuencias del
factor VIII porcino necesarias para esta propiedad, se produjeron
ADNc de factor VIII híbrido humano/porcino con dominio B delecionado
que contenían una sustitución de secuencias humanas con las
secuencias porcinas correspondientes. Estos ADNc se transfectaron de
forma transitoria en células COS-7 o se
transfectaron de forma estable en células derivadas de BHK y se
midió la expresión de factor VIII en los medios extracelulares
mediante un ensayo de coagulación de una fase. Los ADNc de factor
VIII híbrido humano/porcino que contenían 1) los dominios A1, A2 y
A3 del factor VIII porcino y los dominios C1 y C2 del factor VIII
humano o 2) los dominios A1 y A3 del factor VIII porcino y los
dominios A2, C1 y C2 del factor VIII humano, demostraron niveles de
expresión de factor VIII comparables a las del factor VIII porcino.
Una molécula de factor VIII híbrido humano/porcino que demuestre un
alto nivel de expresión puede ser valiosa para mejorar la
producción de factor VIII para infusión intravenosa o para terapia
génica de células somáticas de la hemofilia A.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adquirió solución salina tamponada con
fosfato de Dulbecco, suero fetal bovino (FBS), penicilina,
estreptomicina, DMEM:F12, medio de cultivo AIM V sin suero,
lipofectina, lipofectamina 2000 y geneticina de Invitrogen. Se
obtuvieron células derivadas de riñón de cría de hámster denominadas
células BHK-M (Funk et al. (1990)
Biochemistry 29: 1654-1660), por cortesía del
Dr. Ross. Macgillivray, University of British Columbia. Las
transfecciones transitorias se controlaron para eficacia de
transfección usando el vector RL-CMV y un kit de
ensayo dual de luciferasa (Promega, Madison, WI). Se adquirieron
plasma deficiente en factor VIII tratado con citrato y plasma
humano normal tratado con citrato combinado (FACT) en George King
Biomedical (Overland Park, KA). Se adquirió reactivo de
tromboplastina parcial activada (aPTT) en Organon Teknika (Durham,
NC). Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos por Life
Technologies. Se adquirieron ADN polimerasa Pfu y células
E. coli XL-1 Blue de Stratagen (La Jolla,
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los vectores de expresión de factor VIII
en este estudio estaban contenidos en el plásmido de expresión de
mamíferos ReNeo (Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem.
232: 19-27). Los insertos de ADNc de factor VIII
carecen de la secuencia 5'-UTR del factor VIII
endógeno y contienen los primeros 749 de los 1805 nt de la
3'-UTR del factor VIII humano.
Se generó un ADNc de factor VIII con domino B
delecionado humano denominado HSQ (Figura 2) por clonación del ADNc
del factor VIII humano en el vector de expresión de mamíferos ReNeo
como se ha descrito anteriormente (Doerin et al. (2002)
J. Biol. Chem. 277: 38345-38349). El ADNc de
HSQ codifica una secuencia enlazadora SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº: 9)
entre los dominios A2 y ap. Este enlazador incluye la
secuencia de reconocimiento RHQR (SEC ID Nº: 10) para el
procesamiento proteolítico intracelular por PACE/furina (Seidah
et al. (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:
602-607). Este acontecimiento de escisión convierte
el factor VIII de cadena sencilla en un heterodímero (Lind et
al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19-27).
El factor VIII heterodimérico se considera la forma fisiológica del
factor VIII (Fass et al. (1982) Blood 59:
594-600).
Una forma con dominio B delecionado del ADNc del
factor VIII porcino se ligó en ReNeo como se ha descrito
anteriormente (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem.
277: 38345-38349). El ADNc denominado P/OL (Figura
2) codifica una secuencia enlazadora derivada de porcino
SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº: 11) entre los dominios A2 y
ap para el reconocimiento de PACE/furina.
Una molécula de factor VIII híbrido
humano/porcino sin dominio B denominada HP1, que contiene el domino
A2 porcino y los dominios A1, ap-A3, C1 y C2 humanos, se
preparó como se ha descrito anteriormente (Lubin et al.
(1994) J. biol. Chem. 269: 8639-8641). El
ADNc que codifica la secuencia enlazadora obtenida de humano
SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº: 9) se insertó entre los dominios A2 y
ap de HP1 por mutagénesis de corte y empalme por extensión
de solapamiento (SOE) (Horton et al. (1993) Methods
Enzymol. 217: 270-279) produciendo HP1/SQ
(Figura 2).
El HP30, que contiene el dominio ap-A3
porcino y los dominios A1, A2, C1 y C2 humanos se preparó como se
ha descrito anteriormente (Barrow et al. (2000) Blood
95: 557-561). El ADNc que codifica la secuencia
enlazadora obtenida de porcino SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº:
11) se insertó entre los dominios A2 y ap de HP30 por
mutagénesis de SOE produciendo HP30/OL (Figura 2).
El HP44/OL, que contiene los dominios A1, A2,
ap-A3 porcinos, la secuencia enlazadora obtenida de porcino
SFAQNSRPPSASAPKPPVLREHQR (SEC ID Nº: 11) y los dominios C1 y C2
humanos (Figura 2) se preparó de la forma siguiente. Se digirió
P/OL ReNeo con AvrII y el fragmento que contenía la secuencia
A1, A2 y ReNeo se purificó en gel. El HP30/OL se digirió con
AvrII y el fragmento que contenía las secuencias ap-A3
porcina y C1 y C2 humanas se purificó en gel. La ligación de los
productos, transformación de células E.coli
XL-1 y purificación plasmídica se realizaron como se
ha descrito anteriormente (Healey et al. (1998) Blood
92: 3701-3709).
El HP46/SQ, que contiene el domino A1 porcino y
los dominios A2, ap-A3, C1 y C2 humanos y la secuencia
enlazadora SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº:11) humana (Figura 2), se
preparó mediante mutagénesis de SOE. Se usaron P/OL en ReNeo y HSQ
en ReNeo como moldes en las reacciones de SOE de la primera vuelta.
El cebador 5' en la reacción de P/OL era complementario a la
secuencia 5' de ReNeo para el ADNc del factor VIII. El cebador 3'
flanqueaba el dominio A1 porcino. El cebador 5' en la reacción de
HSQ era parcialmente complementario al cebador 3' usado en la
primera reacción. El cebador 3' era complementario a la secuencia A2
humana. Después de la purificación en gel de los productos de las
reacciones de la primera vuelta, se realizó la segunda reacción de
SOE, obteniéndose un producto que contiene la secuencia 5' de ReNeo
para el inserto de ADNc del factor VIII, el dominio A1 porcino y
parte del dominio A2 humano. Este producto se digirió con
XhoI, en la unión de ReNeo y el inserto del factor VIII y
con MluI en el dominio A2 humano y se ligó en HSQ/ReNeo
digerido con XhoI/MluI. El plásmido resultante se amplificó
por transformación en células E. coli XL-1
Blue como se ha descrito anteriormente.
El HP47/OL que contiene los dominios A1,
ap-A3 porcinos, secuencia enlazadora obtenida de porcino
SFAQNSR
PPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº:11) y dominios A2, C1 y C2 humanos (Figura 2) se preparó de la forma siguiente. El HP46/SQ en ReNeo se digirió con AvrII que escinde el plásmido en la secuencia 5 de ReNeo para el inserto del factor VIII y en la unión A2-ap. El fragmento que contiene los dominios A1 y A2 se ligó purificado en gel a un fragmento de HP30/OL en ReNeo producido por digestión con AvrII.
PPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº:11) y dominios A2, C1 y C2 humanos (Figura 2) se preparó de la forma siguiente. El HP46/SQ en ReNeo se digirió con AvrII que escinde el plásmido en la secuencia 5 de ReNeo para el inserto del factor VIII y en la unión A2-ap. El fragmento que contiene los dominios A1 y A2 se ligó purificado en gel a un fragmento de HP30/OL en ReNeo producido por digestión con AvrII.
Las secuencias producidas por mutagénesis de SOE
se confirmaron mediante secuenciación de ADN didesoxi.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células COS-7
hasta una confluencia del 70-80% en pocillos de 2
cm^{2} que contenían 1 ml de DMEM:F12 suplementado con FBS al
10%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Las
células se transfectaron con una proporción en masa de 2000:1 de
plásmido de factor VIII:ADN plasmídico de luciferasa usando
Lipofectamina 2000. Veinticuatro horas después de la transfección
las células se aclararon dos veces con 1 ml de PBS y se añadieron a
cada pocillo 0,5 ml de medio AIM V sin suero. Las células se
cultivaron 24 h antes de que se recogieran los medios
acondicionados y se midiera la actividad de factor VIII como se
describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células BHK-M se
transfectaron usando Lipofectina junto con un plásmido ReNeo que
contenía ADNc de factor VIII y se cultivaron en presencia de
DMEM:F12 que contenía FBS al 10%, penicilina 100 unidades/ml,
estreptomicina 100 \mug/ml y geneticina 500 \mug/ml durante 10
días. El vector ReNeo contiene el gen de neomicina fosfotransferasa
para resistencia al antibiótico geniticina. Veinticuatro a 72 clones
resistentes a geniticina se exploraron para determinar la
producción de factor VIII. El clon de cada construcción de ADNc que
presentaba el mayor nivel de actividad de factor VIII se transfirió
en un matraz de 75 cm^{2}, se cultivó hasta una confluencia del
90-95% y después se cambió a 25 ml de medio AIM V
sin suero. Después de 24 h, los medios acondicionados se
reemplazaron con 25 ml de medio sin suero recién preparado AIM V y
se cultivaron durante 24 h adicionales. Los medios recogidos de
cada punto de tiempo se ensayaron para determinar la actividad de
factor VIII como se describe a continua-
ción.
ción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la actividad de factor VIII mediante un
ensayo de coagulación de una fase usando un instrumento de
coagulación ST art (Diagnostics Stago, Asnieres, Francia). Se
añadieron cinco \mul de muestra o patrón a 50 \mul de plasma
deficiente en factor VIII seguido de adición de 50 \mul de
reactivo aPTT e incubación durante 3 min a 37ºC. Se añadieron
cincuenta microlitros de CaCl_{2} 20 mM para iniciar la reacción y
el tiempo necesario para desarrollar un coágulo de fibrina se midió
viscosimétricamente. Se generaron curvas patrón usando varias
diluciones de plasma humano normal combinado y se sometieron a un
análisis de regresión lineal del tiempo de coagulación frente al
logaritmo de la dilución plasmática recíproca. Para determinación
de la actividad de factor VIII, las muestras se diluyeron en
solución salina tamponada con HEPES a una concentración dentro del
intervalo de la curva patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar regiones en el factor VIII
porcino que confieran alto nivel de expresión, se construyeron las
moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que se muestran en
la Figura 2 y se midieron sus niveles de expresión en células
COS-7 y BHK-M. Después de la
transfección de células COS-7, el plásmido expresión
no se integra en el ADN genómico pero se presenta de forma
transitoria como un ADN episomal. Los niveles de expresión de
células COS-7 representan una media de la población
celular. La Figura 3 muestra los resultados de pocillos de
COS-7 transfectadas por cuadriplicado. Existe un
aumento significativo en la expresión de P/OL, HP44, HP47 y HP46 en
comparación con HSQ. Por el contrario, la expresión de HP1 y HP30 no
se aumentó en comparación con HSQ.
La expresión de factor VIII a partir de células
BHK-M concordaba con los resultados en células
COS-7. Después de la transfección de células
BHK-M, los clones que contenían ADN plasmídico que
se incorporaba de forma estable en el genoma se seleccionaron
usando el antibiótico geneticina. Las células que no contienen el
gen de la neomicina fosfotransferasa contenido en el plásmido no
sobreviven a la presencia de geniticina. Aproximadamente el 50% de
los clones resultantes de la transfección de células
BHK-M con las construcciones que se muestran en la
Figura 2 no expresaban niveles detectables de factor VIII (no se
muestran los datos). Esto concuerda con los resultados anteriores
con HSQ y P/OL (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem.
277: 38345-38349) y se espera porque la expresión
del propio factor VIII no se selecciona durante la selección con
geneticina. Los niveles de expresión medios para clones que
producían factor VIII eran significativamente superiores para las
construcciones P/OL, HP44, HP47 y HP46 pero no para la HP1 y HP30 en
comparación con HSQ (no se muestran los datos). Cada construcción
de ADNc de factor VIII, el clon que producía los niveles más altos
de factor VIII se expandió y se cambió a medio AIM V sin suero. De
acuerdo con los resultados anteriores, los niveles de factor VIII
para HP44, HP47 y HP46 pero no para HP1 y HP30 eran comparables a
P/OL (Figura 3).
La Figura 3 muestra la expresión heteróloga de
factor VIII porcino recombinante OL y factor VIII humano
recombinante SQ. Las células COS-7 (barras oscuras)
se transfectaron con las construcciones de expresión de factor VIII
individuales y ADN plasmídico de luciferasa y se cultivaron en
medios sin suero durante 24 h como se describe en los
Procedimientos experimentales. Los medios acondicionados se
ensayaron para determinar la actividad de factor VIII mediante un
ensayo de coagulación de una fase. Después de la recogida de medios,
las células se lisaron y se ensayaron para determinar la actividad
luciferasa. Los datos se presentan como la proporción de actividad
de factor VIII:actividad de luciferasa (media +/- desviación típica
de cuatro pocillos de células transfectadas por cada muestra)
normalizada para el nivel medio de HSQ. Los datos que se muestran
son representativos de experimentos que implican tres cultivos
separados de células COS-7. Las células
BHK-M (barras rayadas) se transfectaron con las
construcciones de expresión de factor VIII individuales y se
seleccionaron para integración estable del transgén. El clon más
productor para cada construcción se dividió en un matraz de 75
cm^{2}, se cultivó hasta una confluencia superior al 90%, se
aclaró dos veces con PBS y se cultivó 24 h en medio sin suero.
Después de 24 h, los medios se recogieron y se ensayaron para
determinar la actividad de factor VIII. Los datos se expresan con
respecto a la expresión de HSQ, que era de 2,8 unidades/10^{6}
células/24 h en células BHK-M.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor VIII porcino con dominio B delecionado
recombinante se expresa a niveles de hasta 14 veces superiores que
el factor VIII humano recombinante (Doering et al. (2002)
J. Biol. Chem. 277: 38345-38349). Los
niveles son sustancialmente superiores que en informes previamente
publicados de expresión de factor VIII (Tabla II). El mecanismo
para el fenómeno de alta expresión no se ha establecido. Sin
embargo, el alta nivel de expresión se debe a una diferencia entre
el factor VIII con domino B delecionado humano y porcino en la
secuencia traducida porque los casetes de expresión P/OL y HSQ no
contienen la secuencia 5'-UTR del factor VIII
endógeno, mientras que ambos poseen los primeros 749 nt (de 1805 nt)
de la 3'UTR del factor VIII humano. Además, el efecto se produce a
nivel postranscripcional porque no existen diferencias en los
niveles de ARNm de P/OL y HSQ en células BHK-M
(Doering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:
38345-38349).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
3
Pueden generarse variantes de las secuencias de
factor VIII_{SEP} de la invención. Por ejemplo, puede generarse
el factor VIII_{SEP} HP63/OL. Véanse las Figuras
12-14.
Se han identificado dos epítopos de factor VIII
humano principales que son reconocidos por anticuerpos inhibidores:
en el dominio A2 en un segmento unido por los restos
484-508 (Healey et al. (1995) J. Biol.
Chem. 270: 14505-14509) y en el dominio C2 en
un segmento unido por los restos 2181-2252 (Healey
et al. (1998) Blood 92: 3701-3709 y
Barrow et al. (2001) Blood 97:169-174,
incorporándose todos como referencia en este documento). La
numeración de secuencia se refiere al factor VIII humano maduro de
longitud completa de acuerdo con la convención de la norma (Vehar
et al. (1984) Nature 312: 337-342).
También se han identificado anticuerpos que reconocen el péptido de
activación de cadena ligera, ap, (Barrow et al. (2000)
Blood 95: 557-561) y el dominio A3 en una
región unida por los restos 1804-1819 (Zhong et
al. (1998) Blood 92: 136-142), pero son
menos comunes (Prescott et al. (1997) Blood
89:3663-3671). Se han identificado ocasionalmente
otros epítopos pero se consideran poco habituales.
Puede generarse una variante de una molécula de
factor VIII_{SEP} que contenga los dominios A2, ap y C2
humanos, la secuencia humana 1804-1819 y el dominio
A1 porcino y las secuencias A3 porcinas de aproximadamente 1690 a
1803 y de aproximadamente 1820 a 2019. Esta variante de factor
VIII_{SEP} se representa en la Figura 12 como HP63. Las
secuencias de aminoácidos y nucleótidos se proporcionan en la SEC ID
Nº:20 y 21. Dicha molécula se predice que es una molécula de
superexpresión que tiene las características antigénicas del factor
VIII humano. Se describen en otra parte en este documento ensayos
para medir la actividad de alto nivel de expresión de la
variante
HP63.
HP63.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La presente invención se ha descrito
anteriormente con respecto a los dibujos adjuntos en los que se
muestran algunas pero no todas las realizaciones de la invención.
De hecho, estas invenciones pueden incluirse en realizaciones de
muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a
las realizaciones expuestas en este documento; en su lugar, estas
realizaciones se proporcionan de modo que esta descripción cumpla
los requerimientos legales aplicables. Los números similares se
refieren a elementos similares a lo largo de toda la misma.
Muchas modificaciones y otras realizaciones de
las invenciones expuestas en este documento vendrán a la mente de
un especialista en la técnica a la que pertenecen estas invenciones,
teniendo el beneficio de los contenidos presentados en las
descripciones anteriores y en los dibujos asociados. Por lo tanto,
debe entenderse que las invenciones no se limitan a las
realizaciones específicas descritas y que esas modificaciones y
otras realizaciones pretenden incluirse dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean en este documento
términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo
solamente y no con fines de limitación.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de
los especialistas en la técnica a la que pertenece esta
invención.
<110> Lollar, John S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de ácidos nucleicos y
aminoácidos que codifican polipéptidos de Factor VIII de alto nivel
de expresión y métodos de uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 07157/254319
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/327.388
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
05-10-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6399)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor VIII - - Longitud
completa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6399)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4401)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor VIII - - Dominio B
delecionado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4401)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9009
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor VIII- Longitud completa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (208)...(7203)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6996
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor VIII- Secuencia codificante
de longitud completa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia enlazadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia enlazadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
Claims (14)
1. Un polipéptido de factor VIII aislado que
comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2
humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%
con la SEC ID Nº: 19, en el que dicho polipéptido se
caracteriza por un alto nivel de expresión.
2. El polipéptido aislado de la reivindicación
1, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.
3. Una composición que comprende el polipéptido
de la reivindicación 1 ó 2.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica el polipéptido de la reivindicación 1.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 4, en la que dicha secuencia de nucleótidos se
selecciona de:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº:18; y
b) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.
6. Una construcción de ADN que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5.
7. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 4 ó 5.
8. Una célula que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 4 ó 5.
9. Una célula aislada que comprende el vector de
la reivindicación 7.
10. Un método in vitro de producir un
polipéptido que comprende:
a) introducir en una célula la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 4;
b) cultivar dicha célula en condiciones que
permitan la expresión de dicha secuencia de nucleótidos.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende
una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.
b) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº:18.
12. Un método in vitro para aumentar el
nivel de expresión de un polipéptido de factor VIII en una célula
que comprende:
a) introducir en dicha célula una molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5; y
b) cultivar dicha célula en condiciones que
permitan la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.
13. El método de la reivindicación 10, 11 ó 12,
que comprende además aislar dicho polipéptido.
14. Uso de un polipéptido de la reivindicación 1
ó 2, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5,
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
deficiencia de Factor VIII en un sujeto.
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