JP5162635B2 - 高レベルエキスプレッサー第viii因子ポリペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列および使用方法 - Google Patents
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Description
本研究は、国立衛生研究所助成金RO1 HL40921によって支援されている。
本発明は、組換え分子生物学分野、特に、改変型第VIII因子ポリペプチドおよびその使用に関する。
第VIII因子は、血液凝固の固有経路の不可欠な構成要素として機能する巨大な(約300kDa)糖タンパク質である。これは、A1−A2−B−ap−A3−C1−C2と呼ばれる一連のドメインを含む。第VIII因子のBドメインの機能は知られておらず、凝集活性を失うことなく欠失することができる。第VIII因子タンパク質を減少または欠損させる第VIII因子の遺伝子の変異により、再出血エピソードによって特徴づけられる遺伝病(血友病A)を発症する。血友病Aの治療には、血漿由来第VIII因子または組換え第VIII因子のいずれかの静脈内注入が必要である。
第VIII因子ポリペプチドの高レベル発現が可能な方法および組成物を提供する。より詳細には、本発明は、この第VIII因子ポリペプチドが高レベルで発現する改変型第VIII因子を含む核酸およびアミノ酸配列を含む方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、第VIII因子欠損症(例えば、血友病Aが含まれる)の治療で適用される。
・本発明はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1)配列番号15、配列番号17または配列番号19に対する少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで当該ポリペプチドが、高レベルの発現によって特徴づけられる、単離されたポリペプチド。
・(項目2)
上記ポリペプチドが、配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載の単離されたポリペプチド。
・(項目3)
項目1に記載のポリペプチドを含む、組成物。
・(項目4)
項目2に記載のポリペプチドを含む、組成物。
・(項目5)
配列番号14、配列番号16または配列番号18に対する少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、ここで当該ヌクレオチド配列が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
・(項目6)
項目5に記載の単離された核酸分子であって、上記ヌクレオチド配列が、以下:
a) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に記載される配列を含むヌクレオチド配列;および
b) 配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
・(項目7)
項目5に記載の核酸分子を含むDNA構築物。
・(項目8)
項目6に記載の核酸分子を含むDNA構築物。
・(項目9)
項目5に記載の核酸分子を含むベクター。
・(項目10)
項目6に記載の核酸分子を含むベクター。
・(項目11)
項目5に記載の核酸分子を含む細胞。
・(項目12)
項目6に記載の核酸分子を含む細胞。
・(項目13)
項目9に記載のベクターを含む細胞。
・(項目14)
項目10に記載のベクターを含む細胞。
・(項目15)
ポリペプチドを産生する方法であって、当該方法は、以下:
a) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入する工程であって、ここで当該配列が、当該ポリペプチドをコードし、そして当該ポリペプチドが高発現によって特徴づけられる、工程;および
b) 上記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で当該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
・(項目16)
項目15に記載の方法であって、上記核酸分子が、以下:
a) 配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列:
b) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に記載される配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
・(項目17)
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目15に記載の方法。
・(項目18)
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目16の方法。
・(項目19)
細胞における第VIII因子ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法であって、以下:
a) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を上記細胞に導入する工程であって、当該配列が上記第VIII因子ポリペプチドをコードし、当該第VIII因子ポリペプチドが高い発現によって特徴づけられる、工程;
b) 上記核酸分子の発現を可能にする条件下で当該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
・(項目20)
項目19に記載の方法であって、上記核酸分子が、以下:
a) 配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列;および
b) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に記載される配列を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
・(項目21)
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目19の方法。
・(項目22)
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目20の方法。
・(項目23)
第VIII因子欠乏症を処置する方法であって、当該方法は、
当該処置を必要とする被験体に、治療有効量のポリペプチドを含む組成物を投与する工程であって、ここで当該ポリペプチドは、配列番号15、配列番号17、または配列番号19に対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして当該ポリペプチドが、高レベル発現によって特徴づけられる、工程、を包含する、方法。
・(項目24)
上記ポリペプチドが配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含む、項目23に記載の方法。
・(項目25)
第VIII因子欠乏症を処置する方法であって、当該方法は、当該処置を必要とする被験体に、治療有効量の核酸分子を含む組成物を投与する工程であって、ここで当該核酸分子は、配列番号14、配列番号16または配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ここで当該核酸分子が、高レベル発現によって特徴づけられる第VIII因子ポリペプチドをコードする、工程、を包含する、方法。
・(項目26)
項目25に記載の方法であって、ここで:上記核酸分子が、以下:
a) 配列番号14、配列番号16または配列番号18に記載される配列を含むヌクレオチド配列;および
b) 配列番号15、配列番号17または配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
概観
本発明は、第VIII因子ポリペプチドを高レベルで発現可能な方法および組成物を提供する。第VIII因子ポリペプチドは、以下の用語A1−A2−B−ap−A3−C1−C2を有する相同性定義(homology−defined)タンパク質ドメインを含む。本発明は、第VIII因子ポリペプチドの高レベル発現を促進する非ヒト第VIII因子ポリペプチドのドメイン内の領域を同定している。より詳細には、ブタおよびヒトの第VIII因子ポリペプチドの両方を高レベル発現させるA1およびap−A3領域ならびにその改変体およびフラグメントを含むブタ第VIII因子ポリペプチドの領域を同定した。したがって、本発明は、コードされた第VIII因子ポリペプチドを高レベルで発現する改変型第VIII因子ポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチド配列を構築するための高レベル発現させる非ヒト第VIII因子ポリペプチド配列およびこれらの配列の活性改変体またはフラグメントを使用する方法および組成物を提供する。高レベル発現によって特徴づけられる改変型第VIII因子ポリペプチドを、本明細書中で「第VIIISEP因子」(超発現)(Super Expression)という。
・「高レベル発現」は、同一条件下で発現する対応するヒト第VIII因子ポリペプチドの発現レベルと比較した場合にレベルが増加したポリペプチド産生を意図する。ポリペプチドレベルの増加(すなわち、高レベル発現)は、対応するヒト第VIII因子ポリペプチドの発現レベルと比較して少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20倍またはそれ以上の第VIIISEP因子ポリペプチド発現を含む。あるいは、対応するヒト第VIII因子と比較した場合に第VIIISEP因子の発現レベルが少なくとも1〜25倍、1〜5倍、5〜10倍、10〜15倍、15〜20倍、20〜25倍またはそれ以上のポリペプチド発現レベルの増加を含み得る。「高レベル発現」のアッセイ方法は、当該分野で慣用的であり、以下により詳細に概説する。
本発明の組成物は、高レベル発現によって特徴づけられる第VIII因子ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。以下にさらに詳細に概説するように、ブタ第VIII因子のA1ドメイン(配列番号19のアミノ酸残基20〜391)およびブタ第VIII因子のap−A3ドメイン(配列番号19のアミノ酸1450〜1820)は、第VIII因子を高レベル発現する。したがって、本発明は、第VIIISEP因子ポリペプチドならびに高レベル発現によって特徴づけられる第VIIISEP因子ポリペプチドの活性改変体および活性フラグメントを含む方法および組成物を提供する。
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。「単離」または「精製」核酸分子またはタンパク質またはその生物活性部分は、組換え技術によって産生された場合に他の細胞物質や培養培地を実質的に含まないか、化学合成した場合に化学的前駆体や他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムDNA中の核酸に天然に隣接する配列(すなわち、核酸の5’および3’末端に存在する配列)(好ましくは、タンパク質コード配列)を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムDNA中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列を約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約30%、20%、10%、5%(乾燥重量で)未満の夾雑タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本発明のタンパク質またはその生物活性部分を組換え産生する場合、好ましくは、化学的前駆体または目的としないタンパク質化学物質が約30%、20%、10%、または5%(重量で)未満である。
第VIIISEP因子ポリペプチドまたはその活性改変体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、DNA構築物に含めることができる。DNA構築物は、所望の細胞型で第VIIISEP因子ポリペプチドの発現を駆動するウイルスおよび哺乳動物供給源由来の種々のエンハンサー/プロモーターを含み得る。DNA構築物は、3’調節配列ならびにDNAのサブクローニングおよび収率を促進する核酸配列をさらに含み得る。
本発明のDNA構築物を、標準的な方法によって細胞(原核細胞または真核細胞)に移入することができる。本明細書中で使用される、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞にDNAを移入するための認識された種々の技術をいうことを意図する。このような方法には、例えば、トランスフェクション(リポソーム−ポリブレン、DEAEデキストラン媒介トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない)、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、または速度駆動微粒子銃(「遺伝子銃(biolistic)」)が含まれる。このような技術は、当業者に周知である。Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manaual(2 ed.Cold Spring Harbor Lab Press,Plainview,N.Y.)を参照のこと。あるいは、遺伝子送達体中のDNA構築物を送達させる系を使用することができる。遺伝子送達体は、ウイルス的または化学的であり得る。種々のウイルス遺伝子送達体を本発明で使用することができる。一般に、ウイルスベクターは、天然に存在するウイルス由来のウイルス粒子から構成される。天然に存在するウイルスを、複製欠損してさらなる感染性ウイルスが産生されないように遺伝的に改変されている。ウイルスベクターはまた、第VIII因子タンパク質を発現することができるDNA構築物を含む。
本明細書中で使用される、「診断アッセイ」には、いくつかの様式で薬物療法の選択を補助するための試験サンプル中に存在する特定の抗体を検出および/または定量するために抗原−抗体相互作用を使用するアッセイが含まれる。当業者に公知の多数のこのようなアッセイが存在する。しかし、本明細書中で使用される、「第VIIISEP因子DNAまたはその改変体もしくはフラグメントおよびこれらから発現するタンパク質」の全体または一部を別の公知のアッセイにおいて対応する試薬に置換することができ、それにより、修正アッセイを使用して第VIII因子に対する抗体を検出および/または定量することができる。アッセイは、これらの試薬、ヒトもしくは動物の第VIII因子またはハイブリッドヒト/動物第VIII因子に対する抗体を検出するための公知のアッセイを修正する第VIIISEP因子DNA、その改変体もしくはフラグメントまたはこれらから発現されるタンパク質を使用する。本明細書中で使用される、「第VIIISEP因子またはこのタンパク質の少なくとも1つのエピトープを含むその改変体もしくはフラグメント」を診断試薬として使用することができる。
本発明は、さらに、本発明の高レベル発現第VIIISEP因子またはその改変体もしくはフラグメントをコードする核酸分子およびポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、本発明の核酸およびポリペプチドを単独かMartin et al.Remington’s Pharmaceutical Sciences(本明細書中で参考として援用される)に記載の公知の方法によって調製した適切な薬学的安定化化合物、送達賦形剤、および/またはキャリア賦形剤と組み合わせてを含み得る。
第VIIISEP因子またはそのフラグメントおよび改変体を使用して、阻害抗体を有するか有さない血友病および阻害抗体の発生によって第VIII因子を欠損した患者における第VIII因子に起因する制御不可能な出血(例えば、動脈内出血、頭蓋内出血、または胃腸出血)を治療することができる。活性物質を静脈内投与することが好ましい。
実施例1
第VIII因子の配列の特徴
ブタおよびヒトの第VIII因子を、2つのサブユニットタンパク質として血漿から単離する。重鎖および軽鎖として公知のサブユニットを共にカルシウムまたは他の2価の金属イオンを必要とする非共有結合によって保持する。第VIII因子の重鎖は、共有結合した3つのドメイン(A1、A2、およびB)を含む。第VIII因子の軽鎖は、A3、C1、およびC2と呼ばれる3つのドメインを含む。Bドメインの生物学的機能は知られておらず、第VIII因子の任意の測定可能なパラメーターを有意に変化させることなくタンパク質分解または組換えDNA技術によって除去するか部分的に除去することができる。ヒト組換え第VIII因子は、血漿第VIII因子と類似の構造および機能を有するが、哺乳動物細胞で発現しない場合にグリコシル化されない。ヒトおよびブタの活性化第VIII因子(「第VIIIa因子」)は、A1ドメインとA2ドメインとの間の重鎖の切断に起因する3つのサブユニットを有する。この構造を、A1/A2/A3−C1−C2と示す。
まとめ
ヒト第VIII因子の発現レベルは、インビボ(in vivo)およびインビトロ(in vitro)での異種発現系での他の凝固タンパク質レベルよりも有意に低い。組換えヒト第VIII因子の低レベル発現は、組換えタンパク注入および遺伝子治療プロトコールを使用した血友病Aの治療を制限していた。しかし、組換えBドメイン欠失ブタ第VIII因子は、インビトロ(in vitro)で組換えBドメイン欠失ヒト第VIII因子よりも10〜14倍のレベルで発現する。この性質に必要なブタ第VIII因子の配列を同定するために、ヒト配列が対応するブタ配列に置換されたBドメイン欠失ヒト/ブタハイブリッド第VIII因子cDNAを産生した。これらのcDNAを、COS−7細胞に一過性にトランスフェクトするか、BHK由来の細胞に安定にトランスフェクトし、細胞外液(extracellular media)への第VIII因子の発現を1段階凝固アッセイによって測定した。1)ブタ第VIII因子のA1、A2、およびA3ドメイン並びにヒト第VIII因子のC1およびC2ドメインまたは2)ブタ第VIII因子のA1およびA3ドメインおよびヒト第VIII因子のA2、C1、およびC2ドメインを含むヒト/ブタハイブリッド第VIII因子cDNAにより、ブタ第VIII因子と類似の第VIII因子発現レベルが証明された。高レベル発現が証明されたヒト/ブタハイブリッド第VIII因子分子は、血友病Aの静脈内注入治療または体細胞遺伝子治療のための第VIII因子産生の改良に有益であり得る。
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシン、DMEM:F12、無血清AIM V培養培地、リポフェクチン、リポフェクタミン2000、およびゲネチシンを、Invitrogenから購入した。BHK−M細胞と呼ばれるベビーハムスター腎臓由来細胞(Funk et al.(1990)Biochemistry 29:1654−1660)は、University of British Columbia のDr.Ross Macgillivrayから譲渡された。RL−CMVベクターおよびDual−Luciferaseアッセイキット(Promega,Madison,Wis.)を使用してトランスフェクション効率について一過性トランスフェクションを制御した。クエン酸加第VIII因子欠損血漿およびプールしたクエン酸加正常ヒト血漿(FACT)を、George King Biomedical(Overland Park,Kans.)から購入した。活性化部分トロンボプラスチン試薬(aPTT)を、Organon Teknika(Durham,N.C.)から購入した。オリゴヌクレオチドプライマーを、Life Technologiesによって合成した。Pfu DNAポリメラーゼおよびE.coli XL−1ブルーセルを、Stratagene(La Jolla,Calif.)から購入した。
本研究における全ての第VIII因子発現ベクターは、ReNeo哺乳動物発現プラスミド中に含まれていた(Lind et al.(1995)Eur.J.Biochem.232:19−27)。第VIII因子cDNAインサートは、内因性第VIII因子5’−UTR配列を欠き、1805ntのヒト第VIII因子3’−UTRの最初の749ntを含む。
10%FBS、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充した1mlのDMEM:F12を含む2cm2ウェル中で、COS−7細胞を70〜80%コンフルエントまで増殖させた。リポフェクチン2000を使用した質量比2000:1の第VIII因子プラスミド:ルシフェラーゼプラスミドDNAで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を1mlのPBSで2回リンスし、0.5mlの無血清AIMV培地を各ウェルに添加した。下記のように、細胞を24時間培養し、その後馴化培地を回収し、第VIII因子活性を測定した。
ST art Coagulation Instrument(Diagnostica Stago,Asnieres,France)を使用した1段階凝固アッセイによって、第VIII因子活性を測定した。5μlのサンプルまたは標準を50μl第VIII因子欠損血漿に添加し、その後50μlのaPTT試薬を添加し、37℃で3分間インキュベートした。50μlの20mMのCaCl2を添加して反応を開始し、フィブリン凝塊形成に必要な時間を粘度的に測定した。プールした正常なヒト血漿の数種の希釈物を使用して検量線を作成し、血漿希釈物の逆数の対数に対する凝固時間の直線回帰分析に供した。第VIII因子活性の決定のために、サンプルを、検量線の範囲内の濃度までHEPES緩衝化生理食塩水で希釈した。
高レベル発現を付与するブタ第VIII因子中の領域を同定するために、図2に示すヒト/ブタハイブリッド第VIII因子分子を構築し、COS−7細胞およびBHK−M細胞におけるその発現レベルを測定した。COS−7細胞のトランスフェクション後、発現プラスミドはゲノムDNAに組み込まないが、エピソームDNAとして一過性に存在する。COS−7細胞由来の発現レベルは、細胞集団の平均である。図3は、4連でトランスフェクトしたCOS−7ウェルの結果を示す。HSQと比較して、P/OL、HP44、HP47、およびHP46の発現が有意に増加する。対照的に、HP1およびHP30の発現はHSQと比較して増加しなかった。
組換えBドメイン欠失ブタ第VIII因子は、組換えヒト第VIII因子よりも14倍までのレベルで発現する(Doering et al.(2002)J.Biol.Chem.277:38345−38349)。このレベルは、第VIII因子発現の以前に公開された報告よりも実質的に高い(表2)。高発現現象の機構は確立されなかった。しかし、P/OLおよびHSQ発現カセットは内因性第VIII因子5’UTR配列を含まない一方で、共にヒト第VIII因子3’UTRの(1805ntのうちの)最初の749ntを含むので、高レベル発現は翻訳配列中のヒトとブタとのBドメイン欠失第VIII因子の相違に起因する。さらに、BHK−M細胞におけるP/OLおよびHSQのmRNAレベルが相違しないので、この効果は翻訳後レベルで起こる(Doering et al.(2002)J.Biol.Chem.277:38345−38349)。
本発明の第VIIISEP因子配列の改変体を作製した。例えば、HP63/OLの第VIIISEP因子を作製することができる。図12〜14を参照のこと。
添付の図面を参照して本発明を上に記載しているが、本発明の実施形態を幾らかは示すが全部は示していない。実際、これらの発明を多数の異なる形態で実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、この開示が法的必要条件を満たすようにこれらの実施形態を記載している。全体を通して、類似の数字は、類似の要素を示す。
Claims (7)
- 配列番号18に示されるポリヌクレオチド配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む改変型第VIII因子ポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、
該ヌクレオチド配列は、同一条件下で発現された対応するヒト第VIII因子ポリペプチドと比較した場合の高レベル発現により特徴付けられるポリペプチドをコードし、
該ポリペプチドは、配列番号19に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、
ここで、該ポリペプチドは、A1ドメイン、A2ドメイン、apドメイン、A3ドメイン、C1ドメイン、およびC2ドメインを含み、該A1ドメイン、apドメイン、およびA3ドメインはブタ第VIII因子に由来し、
但し、該ポリペプチドは、配列番号19に示される配列を有さない、
単離された核酸分子。 - 請求項1に記載の核酸分子を含む、DNA構築物。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む、細胞。
- 請求項3に記載のベクターを含む、細胞。
- 改変型第VIII因子ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、
a)配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入する工程であって、
該配列は、該ポリペプチドをコードし、
該ポリペプチドは、同一条件下で発現された対応するヒト第VIII因子ポリペプチドと比較した場合の高レベル発現により特徴付けられ、
該ポリペプチドは、配列番号19に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、
ここで、該ポリペプチドは、A1ドメイン、A2ドメイン、apドメイン、A3ドメイン、C1ドメイン、およびC2ドメインを含み、該A1ドメイン、apドメイン、およびA3ドメインがブタ第VIII因子に由来し、
但し、該ポリペプチドは、配列番号19に示される配列を有さない、
工程;および
b)該ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程、を包含する、方法。 - 前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
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