ES2256266T3 - Analogos de trombomodulina y su uso farmaceutico. - Google Patents
Analogos de trombomodulina y su uso farmaceutico.Info
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Abstract
Análogo de trombomodulina, donde el análogo tiene más del 100% de la capacidad para potenciar la activación de la proteína C mediada por trombina y menos del 50% de la capacidad para potenciar la activación de TAFI mediada por la trombina, en comparación con la trombomodulina nativa, y donde el análogo tiene la secuencia de aminoácidos de la trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) que está modificada por sustitución, inserción o supresión de aminoácidos en las posiciones 340, 341 ó 343 y en la posición 381, dónde el análogo está numerado según la trombomodulina nativa.
Description
Análogos de trombomodulina y su uso
farmacéutico.
La presente invención se refiere al uso de los
análogos de trombomodulina (TM) que tienen la capacidad de mejorar
la activación de la proteína C mediada por la trombina, pero que
tienen una capacidad considerablemente reducida para activar el
inhibidor de la fibrinólisis (TAFI) activable por la trombolina,
dando como resultado una coagulación disminuida con un aumento en
la fibrinólisis. Estos análogos resultan útiles, por ejemplo, en la
terapia antitrombótica. Se describen las proteínas nuevas, las
secuencias de genes de ácidos nucleicos, los fármacos y métodos
para inhibir la actividad trombótica.
Existen muchos estados de enfermedad que se
beneficiarían del tratamiento con un anticoagulante/antitrombótico
seguro y eficaz. Existe una variación en la naturaleza de estas
condiciones. Por ejemplo, la terapia anticoagulante resulta útil en
las condiciones agudas como p.ej. durante la terapia trombolítica
en el infarto de miocardio o en el tratamiento de la coagulación
intravascular diseminada (CID) relacionado con, por ejemplo, la
septicemia. Los anticoagulantes también son útiles para las
condiciones menos agudas, como p.ej el uso crónico en pacientes que
han recibido implantes valvulares cardíacos o el uso profiláctico
en pacientes de cirugía para reducir el riesgo de la trombosis
venosa profunda (TVP).
La trombomodulina es una proteína de la membrana
celular que ha demostrado tener propiedades anticoagulantes. En los
seres humanos, se distribuye de forma amplia en el endotelio de la
vasculatura y los linfáticos. Se ha estudiado extensivamente su
importancia fisiológica. (Véase, por ejemplo, Esmon et al.
(1982) J.Biol. Chem. 257:859-864, Salem et
al. (1983) J. Biol. Chem.
259:12246-12251).
La trombomodulina funciona como un receptor para
la trombina, una enzima central en la cascada de coagulación.
Cuando está libre, la trombina promueve la coagulación tanto
directamente convirtiendo el fibrinógeno en fibrina, como
indirectamente mediante la activación de otras proteínas en la
cascada de coagulación (Factores V, VIII y XIII, por ejemplo), y
también mediante la activación plaquetaria. Cuando está ligada a la
trombomodulina, no obstante, el complejo de
trombina-trombomodulina está implicado en la
activación de la proteína C a la proteína C activada, la cual luego
reduce la cascada de coagulación inactivando proteolíticamente los
cofactores esenciales, el Factor Va y el Factor Villa (Esmon et
al., Ann. N. Y Acad. Sci. (1991), Vol. 614, págs.
30-43) dando como resultado una actividad
anticoagulante aumentada. El complejo de
trombina-trombomodulina también está implicado en
la activación del inhibidor de la fibrinolisis activado por
trombina (TAFI), que conduce a una inhibición de la fibrinolisis.
(Véase la figura 1).
El gen que codifica la trombomodulina nativa ha
sido aislado y secuenciado a partir de diferentes especies, en su
forma genómica y también como un clon de ADNc (Suzuki et
al., (1987) EMBO Journal 6:1891-1897;
Jackman et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:8834-8838 y (1987) 84:6425-6429.
Las comparaciones con las proteínas conocidas, como el receptor
LDL, han sugerido unos dominios funcionales (Wen, D., et
al., (1987) Biochemistry 26:4350-4357).
Un estudio ha sugerido que los dominios similares al quinto y sexto
factor de crecimiento epidérmico (FCE) tienen la capacidad de
enlazarse a la trombina (Kurosawa, S., et al., (1988) J.
Biol. Chem. 263:5993-5996); otro sugiere que los
dominios similares al FCE 4, 5, y 6 son suficientes para funcionar
como cofactor para la actividad activadora de la proteína C mediada
por trombina. (Zushi, et al., (1989) J. Biol. Chem.
264: 10351-10353). Estudios más recientes han
examinado los elementos estructurales dentro de los dominios de
trombomodulina similares al FCE que se requieren para la activación
de la proteína C y del factor de fibrinolisis activado por la
trombina (TAFI) por el complejo de
trombina-trombomodulina (Kokame et al.
(1998) J. Biol. Chem. 273:12135-12139; Wang
et al. (1998) Intl. Soc. Fibrin. Trom. pág. 11; Wang
et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:
22942-22947). Se puede atribuir la inhibición de la
actividad procoagulante directa de la trombina (conversión del
fibrinógeno en fibrina) en parte a los sustituyentes del
glicosaminoglicano en la molécula de trombomodulina. (Bourin, M. C.
et al., (1986) Pro. Natl. Acad. Sci. USA
83:5924-5928). El dominio de glicosilación enlazado
con O en la trombomodulina contiene sitios potenciales para la
adición de estos tipos de azúcares sulfatados. Además, la
trombomodulina acelera la inhibición directa de la trombina
mediante inhibidores naturales en plasma como el inhibidor de la
proteína C (Rezaie et al., (1995) J. Biol. Chem.
270:25336-25339).
Los análogos solubles de la trombomodulina que
retienen la mayoría, si no toda, la actividad de la proteína nativa
que han sido producidos. Además, se han desarrollado los análogos
solubles de la trombomodulina que son resistentes a las oxidación,
resistentes a la proteólisis, o que han sido modificados de otras
maneras con el fin de poseer una vida media más larga dentro de la
circulación (Glaser et al.). Estas modificaciones han sido
descritas en las patentes estadounidenses no. 5,256,770
(resistencia al la oxidación), 5,863,760 (resistencia a las
proteasas), y 5,466,668 (sitios de glicosilación alterados). Además,
se conoce a partir de WO 93/25675 A que una sustitución His381Ala
no tiene efecto sobre la activación de la proteína C.
Existe una necesidad, no obstante, de las
composiciones de trombomodulina nuevas y mejoradas, tanto solubles
como vinculadas a la membrana, las cuales tienen una selectividad
alterada del complejo de trombina-trombomodulina
para los sustratos proteína C y TAFI, dando como resultado un
aumento global en la actividad anticoagulante. Los análogos de
trombomodulina nuevos, al estar unidos con la trombina, provocan
una activación aumentada de la proteína C y una activación
disminuida de TAFI en comparación con la trombomodulina nativa,
pueden cubrir esta necesidad.
Según la presente invención, se proveen análogos
de TM nuevos, métodos, y composiciones que pueden ser empleados
para tratar las enfermedades trombóticas. Los presentes inventores
han estudiado extensivamente las composiciones
anti-trombóticas de la técnica precedente
producidas por técnicas recombinantes, que han dado como resultado
análogos mejorados, que están descritos en las patentes
estadounidenses 5,256,770, 5,863,760 y 5,466,668. La presente
invención se centra en la modificación de la especificidad del
sustrato del complejo de trombina-trombomodulina
producido cuando se utilizan los nuevos análogos de TM de la
presente invención para formar este complejo.
Esta invención provee nuevos análogos de TM, los
cuales, cuando están enlazados a la trombina, dan como resultado un
complejo de trombina-trombomodulina que demuestra
una activación de la proteína C superior al 100% y una activación
de TAFI inferior al 50% en comparación con la trombomodulina nativa
(Fig 4, SEC ID NO: 2), el análogo teniendo las sustituciones de
aminoácidos en varias posiciones dentro de los 6 dominios similares
al FCE de trombomodulina, entendiéndose varias como al menos
dos.
Las formas de realización de estos análogos de
trombomodulina son aquellos en los que el análogo tiene la
secuencia de aminoácidos de la trombomodulina nativa (SEC ID NO:2)
modificada por la sustitución, inserción o eliminación del
aminoácido en las posiciones 340, 341, ó 343 del bucle c del tercer
dominio similar al FCE y en la posición 381, en la cual se sitúa
dentro del dominio 4 similar al FCE, o en una combinación de estas
posiciones, en la que los análogos están numerados según la
trombomodulina nativa (SEC ID No: 2). Los análogos de
trombomodulina particularmente preferidos contienen la modificación
H381G, combinada con una de las siguientes modificaciones: V340A,
D341A o E343A.
Otra forma de realización preferida del análogo
de TM es un análogo soluble.
Una forma de realización particularmente
preferida del análogo de TM es aquella en la que el análogo es
resistente también a la oxidación y en la que se reemplaza la
metionina en la posición 388 con leucina, en la que el análogo está
numerada con respecto a la trombomodulina nativa (SEC ID No: 2).
Otras formas de realización preferidas de estos
análogos de TM contienen unas modificaciones adicionales para
proporcionar resistencia al seccionamiento de la proteasa y que
muestran un modelo de glicosilación alterado.
Los análogos preferidos son aquellos que
contienen las siguientes modificaciones: eliminación de aminoácidos
1-3; H381G, M388L, R456G, H457Q, S474A, y
cualquiera de las siguientes sustituciones: V340A, D341A, o
E343A.
Los análogos particularmente preferidos son
aquellos que contienen las siguientes modificaciones: la
eliminación de los aminoácidos 1-3, H381G, M388L;
R456G, H457Q, S474A, la terminación en P490, y cualquiera de las
siguientes sustituciones: V340A, D341A, o E343A.
Además, esta invención provee secuencias de ADN
que codifican los análogos de TM descritos anteriormente, así como
los vectores y las células huéspedes para permitir la producción de
dichos análogos de TM en los organismos procarióticos o
eucarióticos.
Además, esta invención provee las composiciones
para emplear en los métodos para tratar o prevenir las enfermedades
trombóticas, comprendiendo la administración de una cantidad eficaz
de dichos análogos de trombomodulina a un paciente que requiere la
terapia anticoagulante.
La Fig 1 muestra la interacción del complejo de
trombomodulina-trombina con la proteína C y
TAFI.
Las abreviaturas empleadas son: APC, proteína C
activada; pCPB, carboxipeptidasa B plasmática o TAFI; pCPBa,
carboxipeptidasa B activada plasmática; TAFIa, TAFI activado; PA,
activador plasminógeno; FDP, péptidos de degradación de
fibrina.
La Fig 2 muestra el nivel de mutantes de TM
presente en los extractos periplásmicos
La Fig 3 (A y B) muestra la actividad del
cofactor de los extractos periplásmicos de los mutantes de
trombomodulina para la activación catalizada con trombina de la
proteína C y TAFI.
La Fig 4 muestra la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID No: 2), usando el sistema de
numeración de Suzuki et al. (1987) Embo J 6:
1891-1897.
Como se utiliza en la especificación yen las
reivindicaciones, a menos que se especifique lo contrario, los
siguientes términos tienen el significado indicado:
El término "residuo" se refiere a un
aminoácido que está incorporado en un péptido. El aminoácido puede
ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se delimite de
otra manera, puede abarcar los análogos conocidos de aminoácidos
naturales que pueden funcionar de una manera similar a los
aminoácidos de origen natural. A los efectos de esta descripción,
los residuos de aminoácidos están indicados en la presente por sus
abreviaturas aceptadas de una o tres letras, o por la anotación
"AA", la cual significa la presencia de un residuo de
aminoácido. Se describen los aminoácidos denominados en este caso
con las designaciones abreviadas como sigue:
| Nomeclatura de aminoácidos | ||
| Nombre | 3-letras | 1-letra |
| Alanina | Ala | A |
| Arginina | Arg | R |
| Asparragina | Asn | N |
| Ácido aspártico | Asp | D |
| Cisteina | Cis | C |
| Ácido glutámico | Glu | E |
| Glutamina | Gln | Q |
| Glicina | Gly | G |
| Histidina | His | H |
| Isoleucina | Ile | I |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| Metionina | Met | M |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Prolina | Pro | P |
| Serina | Ser | S |
| Treonina | Thr | T |
| Triptófano | Trp | W |
| Tirosina | Tyr | Y |
| Valina | Val | V |
Cuando se describe una sustitución de un
aminoácido, a los efectos de esta descripción, se describe la
sustitución proporcionando el aminoácido presente en la
trombomodulina nativa (SEC ID No: 2), la ubicación del aminoácido
dentro de la secuencia de trombomodulina (empleando el sistema de
numeración de Suzuki et al, (1987) EMBO J
6:1891-1897), seguido por el aminoácido que ha sido
sustituido por el original: es decir M388L se refiere a la
sustitución de metionina en la posición 388 con leucina).
La "trombomodulina nativa" se refiere a la
proteína entera como ocurre en la naturaleza (Fig 4: SEC ID No: 2).
Se sabe que la trombomodulina nativa contiene poliformismos de
origen natural en determinados residuos. Por ejemplo, en la
posición 455, hay una variación de origen natural en el aminoácido
encontrado en esta posición, con una alanina presente en el 82% de
los casos y una valina presente en el 18% de los casos (Van der
Velden et al. (1991) Throm. Haemeostasis
65:511-513.) A los efectos de esta invención, la
secuencia de trombomodulina nativa mostrada (Fig 4; SEC ID No: 2)
es una que contiene valina en la posición 455, según está descrito
por Suzuki et al. (1987) EMBO J
6:1891-1897. No obstante, todos los poliformismos de
origen natural están incluidos dentro del campo de los análogos
reivindicados. Cuando se describen las actividades biológicas con
referencia a la TM nativa, el término abarca una forma acuosa
solubilizada de detergente. A menudo, en el contexto de comparación
a una actividad, un polipéptido soluble transfectado puede mostrar
unas propiedades sustancialmente idénticas.
Los "análogos de trombomodulina" son
péptidos que sustancialmente mantienen la actividad biológica de la
TM natural, como se ha mencionado anteriormente, y los cuales
tienen una estructura molecular diferente de aquella de una versión
natural de TM. Por ejemplo, el término se refiere a las proteínas
que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica o homóloga a
aquella de la trombomodulina nativa (SEC ID No: 2), y a los
péptidos o fragmentos de trombomodulina insolubles y solubles, y a
las especies de TM resistente a la oxidación, todos teniendo una
actividad similar a la trombomodulina. Estos análogos contienen
modificaciones de la secuencia de TM nativa, cuando estas
modificaciones pueden abarcar las sustituciones, inserciones, y
eliminaciones de los aminoácidos. Estos análogos también incluyen
derivados y moléculas que comprenden los cambios de los aminoácidos
que no reducen de forma significante las propiedades de los
cofactores de la activación de la proteína C cuando se compara con
la TM
nativa.
nativa.
El término "TM mutante" se refiere a un
análogo de TM conteniendo la sustitución designada (según se ha
descrito anteriormente) u otra modificación indicada.
Los términos "péptidos" y
"polipéptidos" aluden a las cadenas de aminoácidos cuyos
\alpha carbonos están conectados por enlaces peptídicos formados
mediante una reacción de condensación entre el grupo carboxilo de
\alpha carbono de un aminoácido y el grupo amino de otro
aminoácido. En consecuencia, el aminoácido terminal en un extremo
de la cadena (amino terminal) tiene un grupo amino libre, mientras
que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (carboxi
terminal) tiene un grupo carboxilo libre.
Un "sitio de proteasa" se refiere a un
aminoácido o una serie de aminoácidos en un polipéptido de TM que
define un sitio de reconocimiento, de unión, de división u otro
sitio susceptible de actividad proteasa, por ejemplo, cuando se
sustituyen uno o más residuos de aminoácidos abarcados por esto
sitio por otro u otros residuos de aminoácido o se eliminan, la
proteasa ya es no capaz seccionar la TM en este sito. Este término
también engloba las regiones de la molécula de TM que resultan
intrínsecamente susceptibles a las proteasas, p. ej., estando
expuestas y disponibles en su configuración a la actividad
proteasa.
Un "sitio de seccionamiento de proteasa" se
refiere a la ubicación precisa en la que una proteasa divide el
análogo polipéptido de TM:
Un "N-terminal único" y un
"C-terminal único" tienen significados
literales que funcionalmente aluden a la propiedad de la
composición, p. ej., cuando, al realizar el análisis de la
secuencia convencional del aminoácido secuencial, cada ciclo de
degradación ocasiona la eliminación de un residuo de aminoácido que
esencialmente carece de un residuo de aminoácido diferente. Por lo
tanto, después de varios ciclos, p. ej., 10 ciclos, de eliminación
gradual de los aminoácidos N-terminales,
esencialmente sólo se recupera un aminoácido en cada ciclo. En
particular, no se detecta más heterogeneidad en la secuencia que la
que se podría esperar estadísticamente de un polipéptido
monocatenario completamente puro según el procedimiento analítico
empleado.
"Retiene sustancialmente la actividad biológica
de la trombomodulina nativa" y los términos similares, como se
utilizan en la presente, significa que la trombomodulina comparte
las actividades biológicas con una molécula de TM enlazada a una
membrana nativa. En general, la actividad en unidades por miligramo
de proteína es de al menos aproximadamente un 50%, más típicamente
del 75%, normalmente del 85%, más normalmente del 95%,
preferiblemente 100% y más preferiblemente superior al 100% de la
actividad de trombomodulina nativa (SEC ID No: 2). Esta actividad
biológica puede constituir la activación de la proteína C mediada
por la trombina (APC), el tiempo de coagulación de tromboplastina
parcial activada (PTTa), el tiempo de coagulación de la trombina
(TCT), o cualquiera de las actividades biológicas, preferiblemente
terapéuticas, de la TM. El nativo de comparación estándar es una
versión enlazada a la membrana entera de la TM, pero en muchos
casos, una TM soluble que comprende el dominio de
Iectina/EGF/enlazado con O (TM.sub.LEO) puede ser utilizado como un
estándar más conveniente.
Los "sitios de glicolisación" se refiere a
los residuos de aminoácidos que una célula eucariótica reconoce
como sitios para la fijación de residuos de azúcar. Los aminoácidos
en que se fijan los azucares típicamente son Asn (para los azúcares
enlazados con N), los residuos de treonina o serina (para azúcares
enlazados con O). Normalmente, el sitio específico de fijación está
señalado por una secuencia de aminoácidos, p. ej.,
Asn-X-(Tr o Ser) para la mayoría de las fijaciones
enlazadas en O y (Tr o
Ser)-X-X-pro para la
mayoría de las fijaciones enlazadas en O, donde X es cualquier
aminoácido. La secuencia de reconocimiento para los
glicosaminoglicanos (un tipo específico de azúcar sulfatado) es
generalmente
Ser-Gly-X-Gly, pero
también puede ser
X-Ser-Gly-X-Val.
Los términos enlazado con N y enlazado con O aluden al grupo químico
que sirve como sitio de fijación entre la fracción de azúcar y el
residuo de aminoácido. Los azúcares enlazados con N están fijados
mediante un grupo amino; los azúcares enlazados con O están fijados
mediante un grupo de hidróxilo.
La "media vida en circulación in
vivo" se refiere al tiempo promedio que tarda una actividad
de plasma administrado en un mamífero en reducirse a la mitad.
El "dominio de glicolisación enlazado con O"
se refiere a la secuencia de aminoácidos numerados de 463 a 497 de
la secuencia de trombomodulina nativa como se muestra en la tabla 2
(Véase la página 10).
Los "análogos resistentes a la oxidación" se
refiere a análogos de la trombomodulina que son capaces de mantener
una cantidad sustancial de actividad biológica después de la
exposición a un agente de oxidación como radicales de oxígeno,
Cloramina T, peróxido de hidrógeno, o neutrófilos activados.
Los "excipientes farmacéuticos" se refieren
a los materiales no tóxicos, médicamente aceptables que se emplean
para completar un terapéutico médico. Estos materiales pueden ser
inertes, como el agua y la sal, o biológicamente activos, como un
antibiótico o un analgésico.
La "capacidad reducida" se refiere a una
reducción estadísticamente significativa de una propiedad
biológica. La propiedad es ilimitada y la medición o cuantificación
de la propiedad es realizada por medios estándar.
Los "residuos de azúcar" se refieren a la
hexosa e hidratos de carbono de pentosa que incluyen las
glucosaminas y otros derivados de hidratos de carbono y fracciones
que están enlazadas a una proteína por un enlace covalente.
Los "sustituyentes de sulfato" son los
sustituyentes que contienen azufre en azúcares de pentosa o de
hexosa.
La "conversión del fibrinógeno a fibrina
mediada por la trombina" se refiere a la actividad enzimática
por la cual la trombina secciona el fibrinógeno de la proteína
precursora para hacer un monómero de fibrina, que posteriormente se
polimeriza para formar un coágulo de sangre.
La "enfermedad trombótica" se refiere a una
condición patógena en un mamífero caracterizada por la formación de
uno o más trombos que son o pueden resultar perjudiciales para la
salud del mamífero.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" se
refiere a la cantidad de análogo de TM que mejora los síntomas o
condiciones de una enfermedad trombótica en un mamífero.
El "vector de transferencia" se refiere a un
vector cotransfectado en otra célula, p. ej., una célula de
insecto, con, p. ej., un baculovirus tipo salvaje. Se construye el
vector de transferencia de tal manera que promueva una
recombinación entre un genoma vírico, p. ej., el baculovirus, y el
vector de transferencia, p. ej., sustituyendo el gen del poliedro
del baculovirus con un gen diana heterólogo. En el caso que una
célula huésped mantenga el vector, o bien el vector puede ser
replicado de forma estable por las células durante la mitosis como
una estructura autónoma, o bien se incorpora dentro del genoma del
huésped.
Un "análogo de TM soluble" es un análogo de
TM que es soluble en una solución acuosa, y normalmente puede ser
segregado por una célula. Para la administración farmacológica, se
puede combinar opcionalmente el análogo de TM soluble o un análogo
insoluble con vesículas de fosfolípidos, detergentes, u otros
compuestos similares bien conocidos por los expertos en la técnica
de la formulación farmacológica. Los análogos de TM preferidos de
la presente invención son solubles en el flujo sanguíneo, haciendo
que los análogos sean útiles en diversas terapias anticoagulantes y
otras terapias. Las modificaciones que hacen que la TM sea soluble
normalmente no afecta de manera significativa a muchas actividades
relacionadas con la trombomodulina nativa (SEC ID No: 2), p. ej.,
la afinidad para la trombina o una actividad en la activación de la
proteína C.
Se puede encontrar una gran parte de la
nomenclatura y de los procedimientos generales de laboratorio a los
que se hace referencia en esta solicitud en Sambrook et. al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vol
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York, 1989 o en Berger and Kimmel, Guide to
Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152
(Academic Press, Inc., San Diego, CA). Se hace referencia a los
manuales a partir de aquí como "Sambrook" o "Berger"
respectivamente.
La patología subyacente de los trastornos
trombóticos es que se forma un coágulo en respuesta a un estímulo
como, por ejemplo, una pared vascular dañada. Este estímulo provoca
la cascada de coagulación y de esa manera genera la trombina que
tiene la capacidad para convertir el fibrinógeno en fibrina, la
matriz del coágulo. La trombomodulina es una membrana de célula
endotelial proteínica que funciona como receptor para la trombina.
En los seres humanos se distribuye sobre el endotelio de los vasos
sanguíneos y linfáticos de todos los órganos. La trombina tiene la
capacidad de enlazarse reversiblemente a la trombomodulina. Cuando
se enlaza a la trombomodulina, la trombina pasa de ser una enzima
procoagulante a una enzima anticoagulante. El complejo de
trombina/trombomodulina inhibe la cascada de coagulación de al menos
dos maneras diferentes. En primer lugar, la unión de la trombina a
la trombomodulina potencia la activación de la proteína C mediada
por la trombina, convirtiendo un cimógeno en una proteasa de serina
activa (Foster et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
4673-4677). La proteína C activada proteolíticamente
desactiva otros componentes procoagulantes de la cascada de
coagulación, como los Factores Va y VIIIa, que a su vez inhibe la
conversión de más protrombina en trombina. La activación mediada
por la trombina de la proteína C es mejorada notablemente cuando la
trombina está enlazada a la trombomodulina, es decir, el ritmo de la
activación de la proteína C aumenta al menos 1000 veces. En segundo
lugar, la unión a la trombomodulina tiene efectos anticoagulantes
directos como la inhibición de la conversión mediada por la
trombina del fibrinógeno en fibrina y la activación mediada por la
tromblina y la agregación plaquetaria. Además, el complejo de
trombina-trombomodulina también tiene efectos
antifibrinolíticos mediante la activación del TAFI, una proteína
plasmática que, como la proteína C, es un sustrato macromolecular
para el complejo trombomodulina-trombina. El TAFI
está activado por una división proteolítica única con el fin de
producir el TAFI activado, una carboxipeptidasa con una
especificidad para los residuos de arginina y lisina carboxi
terminales. De hecho, cuando se descubrió el TAFI fue denominado
pCPB, para carboxipeptidasa B del plasma (véase Eaton et al.
(1991) J. Biol. Chem. 266:21833-21838; Patente U.S.
N°. 5,206,161) y se mostró que era idéntica a la proteína
denominada TAFI (inhibidor de la fibrinólisis activable por
trombina) por Nesheim et al. ((1995) J. Biol. Chem.
270:14477-14484). El TAFI activado inhibe la
fibrinolisis de forma muy notable.
El uso de análogos de trombomodulina solubles
será eficaz para prevenir la formación de trombos, además son más
seguros que los antitrombóticos nativos de trombomodulina y otros
antitrombóticos conocidos en la técnica. Los análogos de
trombomodulina preferidos de esta invención protegerán contra la
formación de trombos al administrarse sistémicamente ya que, al
enlazarse con la trombina, el complejo de
trombina-trombomodulina formado mostrará un aumento
de la actividad anticoagulante y una actividad fibrinólitica
aumentada en comparación con la trombomodulina nativa (SEC ID No:
2)
Las enfermedades en las que el trombo desempeña
un papel etiológico considerable incluyen el infarto de miocardio,
la coagulación intravascular diseminada, trombosis venosa profunda,
embolia pulmonar, shock séptico, síndrome de dificultad
respiratoria aguda, angina inestable, y otras condiciones oclusivas
arteriales o venales. Los análogos de la trombomodulina de esta
invención resultan útiles en todas estas aplicaciones, así como en
otras enfermedades en las que la formación del trombo es
patológica. Se entiende el término útil en el sentido que los
compuestos resultan útiles para el tratamiento, o bien para
prevenir la enfermedad o bien para prevenir su desarrollo a un
estado más grave. Los compuestos de esta invención también proveen
un anticoagulante seguro y eficaz, por ejemplo, en el caso de los
pacientes que reciben bioprótesis, como las válvulas cardíacas.
Estos compuestos pueden reemplazar la heparina y la warfarina en el
tratamiento, por ejemplo, de la embolia pulmonar o el infarto de
miocardio agudo.
En particular, estos compuestos se encontrarían
un papel en la prevención de la trombosis venosa profunda (TVP),
por ejemplo después de la cirugía. La formación de coágulos
sanguíneos en la pierna no es una condición mortal en sí, no
obstante se vincula muy estrechamente con el desarrollo de la
embolia pulmonar (EP), la cual resulta difícil de diagnosticar y
puede ser mortal. A pesar de la investigación y el uso clínico de
diversos regimenes profilácticos, la TVP y la EP resultante siguen
siendo un problema considerable para muchos grupos de pacientes y
particularmente para los pacientes que se someten a la cirugía
ortopédica. Los tratamientos profilácticos existentes como la
heparina, la warfarina, y dextrano típicamente reducen la
incidencia de la TVP en los pacientes sometidos a cirugía
ortopédica en más de un 50% en los pacientes en peligro que no
reciben la profilaxis hasta un 25-30% en los
pacientes que reciben tratamiento. Existen efectos secundarios
graves, principalmente con respecto a las complicaciones derivadas
de la hemorragia. Actualmente, se requieren pruebas de laboratorio
diarias y ajustes en la dosificación para minimizar los episodios de
sangrado mientras se retiene un cierto nivel de eficacia. Basándose
en los inconvenientes de los profilácticos existentes, un
antitrombótico que resulta eficaz en la prevención de la TVP, sin
predisponer al paciente a la hemorragia, podría impactar de forma
considerable en la recuperación y bienestar del paciente.
La angioplastia es un procedimiento empleado
frecuentemente para devolver la patencia en las arterias ocluidas.
Aunque se puede devolver la patencia, es inherente en un
procedimiento de angioplastia que el revestimiento endotelial de la
arteria sea dañado gravemente, y que se empiecen a formar coágulos
sanguíneos de forma frecuente. Los análogos de la trombomodulina
solubles administrados junto con la angioplastia previenen este
efecto secundario perjudicial.
Actualmente, se trata una gran parte de las
enfermedades trombóticas y embólicas agudas con la terapia
fibrinolítica con el fin de eliminar el trombo. La condición que ha
sido investigada más ampliamente es el infarto de miocardio agudo
(ataque al corazón). Actualmente, los agentes en uso para tratar el
infarto de miocardio agudo incluyen la estreptoquinasa, activador
tisular del plasminógeno y la uroquinasa. El uso de estos agentes
puede llevar a complicaciones graves derivadas de la hemorragia.
Frecuentemente padecen de reoclusión del vaso afectado, es decir,
se vuelve a formar un coágulo, los pacientes que se han sometido a
la terapia fibrinolítica para extraer un trombo y en los que el
flujo sanguíneo ha sido reestablecido. Se han hecho intentos para
prevenir las reoclusiones aumentando la dosis o el tiempo de
tratamiento con un agente trombolítico, pero la incidencia de la
hemorragia aumenta después. Por lo tanto, el índice terapéutico de
estos medicamentos es limitado.
La coagulación intravascular diseminada (CID) es
un síndrome adquirido caracterizado por una activación sistémica de
la coagulación intravascular que lleva a la formación de trombos
microvasculares en diversos órganos y eventualmente contribuye al
desarrollo de la insuficiencia de múltiples órganos. La CID está
asociada estrechamente con diversas enfermedades y diversas
condiciones clínicas, como la septicemia, traumatología grave,
malignidad y la cirugía. En la fase inicial de la CID, la
activación de la coagulación está compensada por la presencia de
inhibidores dando como resultado la falta de resultados clínicos.
No obstante, se pueden detectar los niveles de plasma aumentados en
los marcadores de activación de la coagulación como los complejos
de trombina-antitrombina (TAT) en el análisis de
laboratorio. En la segunda y tercera fase de la CID, el tiempo de
protrombina (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activado
(aPTT) aumentan de forma considerable mientras que disminuye
considerablemente el recuento plaquetario, la concentración
fibrinógena y las concentraciones de inhibidores. El consumo de
proteínas de coagulación y plaquetas debido a la coagulación actual
puede inducir a complicaciones graves derivadas de la hemorragia.
Los análogos de trombomodulina, especialmente cuando se administran
en la fase inicial de la CID, prevendrán la amplificación de la
producción de la trombina, y consecuentemente reducirán la
deposición de fibrina. Además, los análogos de TM que
preferiblemente activan la proteína C sin la activación concurrente
del TAFI dan como resultado unos coágulos de fibrina que son más
susceptibles de eliminación mediante fibrinólisis endógena.
El uso de los análogos de trombomodulina protege
contra la reoclusión en parte ya que su acción es localizada, es
decir, donde se genera o libera trombina de un coágulo. En
consecuencia, cuando se usa en combinación con un agente
trombolítico cuya dosis puede ser disminuida posteriormente, se
puede reducir sustancialmente el riesgo de la hemorragia.
Se pueden administrar análogos de trombomodulina
mediante una inyección intravenosa en el bolo, una perfusión gota a
gota, o mediante una combinación de los dos métodos. También, se
puede introducir la trombomodulina soluble mezclada con excipientes
adecuados en la circulación desde un sitio intramuscular. Se puede
controlar el tratamiento sistémico con los análogos de
trombomodulina determinando el tiempo de tromboplastina parcial
activada (aPTT) en muestras en serie de sangre tomadas del
paciente. El tiempo de coagulación observado en este ensayo es
prolongado cuando se consigue un nivel suficiente de trombomodulina
en la circulación. No obstante, ésta es una medición sistémica
eficaz, y los inventores han descubierto que una dosis eficaz del
análogo de TM soluble no necesariamente afecta al aPTT. Como se
utiliza en este caso, se define una dosis terapéuticamente eficaz
como el nivel de análogo de TM suficiente para prevenir la
formación de coágulos patológicos. Un experto en la materia puede
ajustar los niveles de dosificación y los regimenes rutinariamente
de modo que se mantenga una concentración adecuada de
trombomodulina como se ha medido, por ejemplo, según el tiempo de
coagulación de tromboplastina parcial activada (aPTT), el tiempo de
coagulación de trombina (TCT), o los ensayos de conversión de
proteína C en proteína C activada (APC).
Varios métodos son conocidos para la detección y
control de la enfermedad trombótica. Se puede detectar la trombosis
venosa profunda, por ejemplo, mediante la venografía contrastada,
(Kerrigan, G. N. W., et al., (1974) British Journal of
Hematology 26: 469); ultrasonido Doppler (Barnes, R. W.. (1982)
Surgery Clinics in North America 62:489-500);
barrido de captación con fibrinógeno marcado sup.125 I (Kakkar, V.
V., et al., (1972) Archives of Surgery 104:156,
Kakkar, V. V., et al., (1970) Lancet 1:
540-542); pletismografía de impedancia (Bynum, L.
J., et al., (1978) Annals of Internal Medicine
89:162): y thromboscintoscan (Ennis, J. T. and Elmes, R. J. (1977)
Radiology 125:441). Estos métodos resultan útiles para
controlar la eficacia de los métodos y composiciones descritos en
la presente.
Una secuencia de ADN (SEC ID No: 1) que codifica
la proteína de trombomodulina humana nativa entera ha sido aislada
(Suzuki, et al., (1987) EMBO J
6:1891-1897. La secuencia codifica una proteína de
60.3 kDa de 575 ami-
noácidos, que incluyen una secuencia de señalización de aproximadamente 18 aminoácidos (Fig 4; SEC ID NO: 2).
noácidos, que incluyen una secuencia de señalización de aproximadamente 18 aminoácidos (Fig 4; SEC ID NO: 2).
Las secuencias de la trombomodulina bovina, de
ratón y humana muestran un alto nivel de homología entre sí.
Estableciendo una analogía con otras proteínas, la estructura de
trombomodulina presuntamente puede ser dividida en dominios. El
término "dominio" se refiere a una secuencia de aminoácidos
discreta que puede ser asociada con una función particular o
característica. Normalmente, un dominio muestra una unidad
estructural terciaria característica. El gen de trombomodulina
entero codifica un péptido precursor conteniendo los siguientes
dominios:
| Dominios de TM | |
| Posición aproximada del aminoácido | Dominio |
| (-18)-(-1) | Secuencia señal |
| 1-226 | Dominio N-terminal (dominio lectina; L) |
| 227-462 | 6 Dominios similares al EGF(E) |
| 463-497 | Glicosilación enlazada con O (D) |
| 498-521 | Transmembrana |
| 522-557 | Dominio Citoplásmico |
| Véase C. S. Yost et al., (1983) Cell, 34:759-766 y D. Wen et al., (1987) Biochemistry, 26:4350-4357. |
La unión de la trombina a la trombomodulina
produce un complejo de trombina-trombomodulina cuya
actividad es importante tanto para la activación de la proteína C,
que en última instancia inhibe la coagulación de la sangre, como
para la activación de una carboxipeptidasa de plasma denominada
inhibidor de fibrinólisis activable por la trombina (TAFI), el cual
está implicado en el retraso de la tisis del coágulo.
Los elementos estructurales dentro de la molécula
de trombomodulina que son necesarias para la unión de trombina, así
como para la activación de la proteína C y el TAFI han sido
investigados por varios grupos (Veáse Kokame et al. (1998)
J. Biol. Chem. 273:12135-12139; Wang et
al. (1998) Intl. Soc. Fibrin. Throm. pág 11; Wang et
al. (2000) J. Biol. Chem. 275:
22942-22947). Dentro de los seis dominios
interconectados similares al EGF contenidos dentro de la estructura
de trombomodulina, se requieren los dominios similares al EGF 4, 5,
y 6, más los residuos que conectan los dominios similares al EGF 3
y 4, para la activación eficaz de la proteína C. La activación del
TAFI requiere, además de estos elementos estructurales, la
presencia del bucle c del tercer dominio similar al EGF (residuos
333-344).
Las nuevas composiciones de la presente invención
han utilizado estos datos para producir los análogos de
trombomodulina, los cuales, cuando están enlazados a la trombina,
producen una actividad alterada del complejo de
trombomodulina-trombina hacia los sustratos, la
proteína C y el TAFI. Se combina una modificación a la molécula de
trombomodulina en el bucle c del tercer dominio similar al EGF con
una modificación de al menos un residuo dentro de los dominios
similares al EGF 4-6, para producir unas
composiciones nuevas con una actividad alterada hacia los
sustratos, la proteína C y el TAFI. Las modificaciones introducidas
que son sustituciones, inserciones o eliminaciones del aminoácido
producen los análogos de trombomodulina los cuales, cuando se
combinan con la trombina, forman un complejo de
trombina-trombomodulina que muestra una activación
de la proteína C superior al 100% y una activación del TAFI inferior
al 50% con respecto a un complejo formado empleando la
trombomodulina nativa (SEC ID No: 2).
Una modificación preferida en los dominios
similares al EGF 4-6 es H381 G. Las modificaciones
preferidas en el bucle c del tercer dominio similar al EGF son
V340A, D341A, o E343A.
El trabajo realizado anteriormente por los
inventores relacionado con los análogos de trombomodulina trataba
el problema de la inactivación de la trombomodulina mediante la
oxidación de la molécula de TM y proveían los análogos de TM que
eran resistentes a la oxidación debido a la sustitución de la
metionina en la posición 388 de la trombomodulina con la leucina
(M388L). Esta modificación ha sido descrita en la patente
estadounidense 5,256,770.
Las composiciones de análogos de la TM
particularmente preferidas son aquellos que, además de teniendo las
modificaciones que afectan la especificidad del complejo de la
trombina-trombomodulina, poseen la sustitución M388L
que hace que los análogos sean resistentes a la oxidación.
Además de las modificaciones descritas
anteriormente, otras modificaciones de la molécula de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) pueden resultar útiles para
aumentar la eficacia terapéutica de los análogos de trombomodulina
de la presente invención.
Las composiciones de análogos de TM
particularmente preferidas son aquellas que, además de las
modificaciones descritas anteriormente, tienen una o más de las
siguientes características:
- (i)
- muestran resistencia a la proteasa,
- (ii)
- tienen un terminal N o C homogéneo,
- (iii)
- han sido modificadas de forma postraduccional, p. ej., por glicosilación de al menos algunos de los sitios de glicosilación de la trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2),
- (iv)
- tienen propiedades de enlace de trombina dobles recíprocas lineales,
- (v)
- son solubles en una solución acuosa en cantidades relativamente reducidas de detergentes y normalmente carecen de una secuencia de transmembrana.
Estas modificaciones han sido descritas en las
patentes estadounidenses nos. 5,256,770, 5,863,760, y 5,466,668,
las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.
En particular, las modificaciones preferidas
realizadas en la molécula de la TM relacionadas con estas
características incluyen la eliminación de los aminoácidos
1-3, la terminación en P490, y las siguientes
sustituciones: R456G y H457Q (ambas para la resistencia
proteolítica) y S474A (bloquea la adición del glicosaminoglicano y
decelera la eliminación).
Esta invención abarca las manipulaciones
genéticas moleculares que se pueden conseguir en una variedad de
maneras conocidas. Las células recombinantes, los plásmidos, y las
secuencias de ADN de la presente invención proveen un medio para
producir los compuestos farmacéuticamente útiles en los que el
compuesto, segregado a partir de células recombinantes, es un
derivado soluble de trombomodulina.
En general, se pueden encontrar las definiciones
de la nomeclatura y las descripciones de los procedimientos de
laboratorio generales empleados en esta solicitud en J. Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. A partir de
aquí se hará referenia al manual como Sambrook y está incorporado a
la presente a modo de referencia. Además, Ausubel et al.,
eds., Current Protocols in Molecular Biology, (1987 y
actualizaciones periódicas) Greene Publishing Associates,
Wiley-Interscience, New York, expone métodos útiles
para esta solicitud.
Todas las enzimas se utilizan según las
instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos que no están
disponibles comercialmente pueden ser sintetizados químicamente
según el método de fosforamidita triéster de fase sólida descrito
por primera vez por S. L. Beaucage y M. H. Caruters, (1981)
Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862
empleando un sintetizador automatizado, como se describe en D. R.
Needham-Van Devanter et al., (1984)
Nucleic Acids Res., 12:6159-6168. Se realizó
la purificación de los oligonucleótidos o bien mediante
electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC de
intercambio aniónico como se describe en Pearson, J. D., and
Regnier, F. E. (1983) J. Chrom., 255:137-149. Las
dimensiones de los nucleótidos se dan en kilobases (kb) o en pares
de bases (bp). Se trata de estimaciones derivadas de la
electroforesis en gel de agarosa o de acrilamida o de secuencias de
ADN publicadas.
Se puede verificar la secuencia de los genes
clonados y los oligonucleótidos sintéticos usando el método de
degradación química de Maxam, A. M., et al., (1980)
Methods in Enzymology, 65:499-560, o métodos
similares. La secuencia puede ser confirmada después del ensamblaje
de los fragmentos de oligonucleótidos en la secuencia de ADN
bicatenario usando el método de Maxam y Gilber, supra, o el
método de terminación en cadena para la secuenciación de los moldes
bicatenarios de Wallace, R. B., et al., (1981) Gene,
16:21-26. Las técnicas de hibridación de Southern
Blot fueron realizadas según Southern et al., (1975) J.
Mol. Biol., 98:503.
A menudo las formas de realización de esta
invención implican la creación de péptidos nuevos y genes por
mutagénesis in vitro. Se aislan los genes diana en vectores
intermedios y se clonan para la amplificación en procariotas como
E. coli, Bacillus, o Streptomyces. El más
preferido es E. coli puesto que resulta más fácil cultivar
este organismo y está más comprendido que otras especies
procariotas. El manual de Sambrook contiene la metodología
suficiente para realizar todas las clonaciones descritas
posteriormente en E. coli. La Cepa MH-1 es
más preferida a menos que se indique lo contrario. Se cultivan
todas las cepas de E. coli en caldo Luria (LB) con glucosa,
o un medio M9 complementado con glucosa y aminoácidos de ácido
hidrolizado de caseína. Las cepas con resistencia a los
antibióticos fueron mantenidas con concentraciones de medicamento
descritas en Sambrook. Se realizaron las transformaciones según el
método descrito por Morrison, D.A. (1977) J. Bact.,
132:349-351 o por Clark-Curtiss, J.
E., and Curtiss, R. (1983) Methods in Enzymology,
101:347-362, Eds. R. Wu et al., Academic
Press, New York. Los vectores representativos incluyen pBR322 y
la serie pUC que están disponibles por fuentes comerciales.
Se conocen los métodos por los cuales se pueden
eliminar o reemplazar los aminoácidos en la secuencia de una
proteína. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra;
Ausubel et al., supra; Pat. U.S. N°. 4,737,462; Pat.
U.S. N°. 4,588,585; EP-0285 123; y las referencias
citadas en ellas. Los genes que codifican un péptido con una
secuencia de aminoácidos alterada pueden ser producidos
sintéticamente, por ejemplo. Un método preferido es el uso de la
mutagénesis dirigida in vitro. La mutagénesis dirigida
implica el uso de un oligodeoxiribonucleótido sintético conteniendo
una sustitución, inserción o eliminacón de nucleótido deseada,
diseñada para alterar de forma específica la secuencia de
nucleótidos de ADN diana monocatenario. La hibridación de este
oligonucleótido, también llamada cebador, al molde monocatenario y
la posterior prolongación del cebador produce un ADN heterodúplex
que, cuando se replica en una célula transformada, codificará una
secuencia proteínica con la mutación deseada. Se pueden emplear los
ciclos secuenciales de mutagénesis dirigida para producir análogos
con sustituciones múltiples.
El gen que codifica la trombomodulina nativa (SEC
ID No: 1) ha sido aislado y secuenciado a partir de diferentes
especies, en su forma genómica y como un ADNc (Suzuki et
al., (1987) EMBO Journal 6:1891-1897;
Jackman, R., et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 83:8834-8838 y (1987)
84:6425-6429, todos ellos incorporados en la
presente a modo de referencia).
La publicación de la secuencia de ADN entera que
codifica la trombomodulina y trombina humana facilita la
preparación de los genes y se usa como punto de partida para
construir las secuencias de ADN que codifican los péptidos de TM.
Véase, p. ej., Genbank Register c/o IntelliGenetics, Inc., Mountain
View, Calif. Preferiblemente los péptidos de la presente invención
son derivados solubles que carecen de la secuencia de terminación
de la transferencia de la TM además de tener sustituciones de
aminoácidos internas, aunque los derivados conteniendo la secuencia
de terminación de la transferencia también están previstos. Además,
estos análogos están segregados a partir de las células
eucarióticas que han sido transfectadas o transformadas con
plásmidos que contienen los genes que codifican estos polipéptidos.
Se conocen los métodos para realizar las modificaciones, como las
sustituciones o eliminaciones de aminoácidos, o la adición de
secuencias señal a los genes clonados. Se describen a continuación
los métodos específicos usados en la presente.
El gen entero para trombomodulina puede ser
preparado mediante diversos métodos. Las bibliotecas genómicas
humanas están comercialmente disponibles. Se pueden sintetizar las
sondas de oligonucleótidos, específicas para estos genes, empleando
la secuencia de genes publicada. Se conocen los métodos para
seleccionar las bibliotecas genómicas con las sondas de
oligonucleótidos. La publicación de la secuencia de genes para la
trombomodulina demuestra que no existen intrones en la zona de
codificación. Por lo tanto, un clon genómico provee el material de
partida necesario para construir un plásmido de expresión para la
trombomodulina usando los métodos conocidos.
Un fragmento de ADN que codifica la
trombomodulina puede ser recuperado aprovechando de los sitios de
endonucleasa de restricción que se han identificado en las regiones
que rodean o se encuentran dentro del gen. (Jackman, R. W., et
al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
84:6425-6429). De forma alternativa, se pueden
obtener los genes enteros obtenidos a partir de una biblioteca de
ADNc. Por ejemplo, el ARN mensajero preparado a partir de células
endoteliales proporciona el material de partida adecuado para la
preparación de ADNc. Se identifica una molécula de ADNc conteniendo
el gen que codifica la trombomodulina en el modo descrito
anteriormente. Los métodos para realizar una biblioteca de ADNc son
conocidos (Véase Sambrook, supra).
Se pueden hacer los genes que codifican los
péptidos de TM a partir de los genes de TM de tipo salvaje
construidos en primer lugar usando el gen que codifica la
trombomodulina entera. Un método preferido para producir los genes
peptídicos de TM de tipo salvaje para las mutaciones posteriores
combina el uso de los cebadores de oligonucleótidos sintéticos con
la extensión de polimerasa en un molde de ARNm o de ADN. Este
método que implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
amplifica la secuencia de nucleótidos deseada. Las patentes
estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,683,202 describen este método.
Los sitios de endonucleasa de restricción pueden ser incorporados
en los cebadores. Los genes amplificados por la reacción PCR pueden
ser purificados de geles de agarosa y clonados en un vector
adecuado. Se pueden introducir las alteraciones en la secuencia de
genes naturales mediante las técnicas de mutagénesis in vitro
o usando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores que
han sido diseñados para incorporar las mutaciones adecuadas.
(Innis, M. et al., eds. (1990), PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, Academic Press.) Aunque se proveen
las secuencias de oligonucleótidos específicos usados en la
mutagénesis dirigida para producir los análogos de TM de la presente
invención (veáse Ejemplo 1), un experto en la técnica podría
cambiar los oligonucleótidos para emplear otros codones que
codifican para los mismos aminoácidos.
Los péptidos de TM descritos en la presente
normalmente están segregados cuando se expresan en el cultivo
celular eucariótico. Se puede obtener la secreción mediante el uso
de la secuencia señal nativa del gen de trombomodulina. De forma
alternativa, los genes que codifican los péptidos de TM de la
presente invención pueden estar ligados en un marco de lectura
apropiado a una secuencia señal que no sea la que corresponde al
gen de trombomodulina nativa. Por ejemplo, la secuencia señal del
activador del plasminógeno tisular (t-PA), (véase WO
89/00605 incorporada en la presente a modo de referencia) o de la
hipodermina A o B (véase EP 326,419 incorporada por la presente por
referencia) puede ser enlazada con el polipéptido (Véase Tabla 2).
En una forma de realización preferida de la presente invención, se
emplea la secuencia señal del t-PA que contiene el
segundo intrón del gen de t-PA humano. La inclusión
del intrón mejora el nivel de expresión del gen estructural
adyacente.
En el caso de determinados análogos de esta
invención, se eliminan las partes del gen que codifican la
transferencia de la terminación y los dominios citoplásmicos de la
región carboxilo terminal del gen de la trombomodulina nativa. En
consecuencia, es preciso añadir un codón de terminación de modo que
se termine la traducción en la posición deseada. De forma
alternativa, un codón de terminación puede ser provisto por el
plásmido de expresión deseado. Además, se puede emplear una
secuencia de poliadenilación con el fin de asegurar el tratamiento
adecuado del ARNm en las células eucarióticas que codifican el
análogo de TM. También, puede resultar útil proporcionar un codón de
iniciación, si uno no está presente, para la expresión de los
péptidos de TM. Estas secuencias pueden ser proporcionadas por el
gen nativo o por el plásmido de expresión.
A continuación se describen los vectores de
clonación adecuados para la replicación y la integración en las
procariotas o las eucariotas y que contienen terminadores de la
transcripción y la traducción, secuencias de iniciación, y
promotores útiles para la regulación de la expresión de los péptidos
de TM. Los vectores están compuestos de casetes de expresión que
contienen al menos una secuencia de terminación independiente, las
secuencias permitiendo la replicación del plásmido tanto en las
eucariotas como en las procariotas, es decir, los vectores
lanzadera, y los marcadores de selección tanto para los sistemas
procarióticos como los eucarióticos.
Además del uso de los métodos de clonación en
E. coli para la amplificación de las secuencias de ácidos
nucleicos clonados, puede resultar deseable expresar los análogos
de TM en las procariotas. Como se menciona con mayor detalle a
continuación, las fracciones de hidratos de carbono de la proteína
madura no son esenciales para realizar la actividad como un cofactor
para la activación de la proteína C, no obstante afectan a las
propiedades anticoagulantes directas de los análogos de TM así como
a la vida media de la molécula en la circulación. La expresión de
los análogos de trombomodulina en E. coli ha proporcionado
una herramienta útil para el análisis de este asunto. Es posible
recuperar una proteína terapéuticamente funcional del E. coli
transformado con un plásmido de expresión que codifica un análogo
de TM soluble.
Se conocen bien los métodos para la expresión de
los genes clonados en bacterias. Con el fin de obtener una
expresión de alto nivel de un gen clonado en un sistema
procariótico, a menudo es fundamental construir los vectores de
expresión que contienen, como mínimo, un promotor fuerte para
dirigir la terminación de la transcripción del ARNm. Unos ejemplos
de las regiones reguladoras adecuadas para este objetivo son la
región del promotor y del operador del gen de la
beta-galactosidasa de E. coli, la ruta
biosintética del triptófano de E. coli, o el promotor
izquierdo del fago lambda. La inclusión de marcadores de selección
en los vectores de ADN transformados en E. coli resultan
útiles. Unos ejemplos de tales marcadores incluyen los genes que
especifican la resistencia a la ampicilina, la tetraciclina, o el
cloranfenicol.
Véase Sambrook, supra, para los detalles
referentes a los marcadores y promotores de la selección que se
pueden emplear en E. coli. En una forma de realización
descrita de esta invención, se utiliza el pUC19 como vector para la
subclonación y la amplificación de las secuencias de genes
deseadas.
Se espera que los expertos en la técnica sean
entendidos en los sistemas de expresión seleccionados para la
expresión de los péptidos de TM deseados y por tanto no se
describen con detalle los varios métodos conocidos para la
expresión de las proteínas en las eucariotas.
La secuencia de ADN que codifica un análogo de TM
soluble puede ser ligada a varios vectores de expresión para
utilizar en la transformación de los cultivos de células huéspedes.
Los vectores habitualmente contienen los genes marcadores y las
secuencias de genes para iniciar la transcripción y la traducción
del gen heterólogo.
Los vectores preferiblemente contienen un gen
marcador para proveer una característica fenotípica para la
selección de células huéspedes transformadas como la dihidrofolato
reductasa, metalotioneína, higromicina, o neomicina
fosfotransferasa. La proteína vírica poliédrica nuclear de
Autographa californica resulta útil para seleccionar las
líneas celulares de insectos transfectadas de Spodoptera
frugiperda y de Bombix mori con el fin de identificar
recombinantes. En el caso de la levadura, Leu-2,
Ura-3, Trp-1, y
His-3 son marcadores genéticos conocidos (Gene
(1979) 8:17-24). Existen varios otros marcadores,
tantos conocidos como desconocidos, que incorporan los principios
científicos mencionados anteriormente, todo de los cuales
resultarían útiles como marcadores para detectar aquellas células
eucarióticas transfectadas con los vectores abarcadas en esta
invención.
Entre los sistemas de células eucarióticas
superiores útiles para la expresión de los análogos de TM, existen
numerosos sistemas de células de los cuales se pueden seleccionar.
Entre los ejemplos ilustrativos de líneas celulares mamíferas se
encuentran las células RPMI 7932, VERO, y HeLa, líneas celulares de
ovarios de hámster chino (CHO), y líneas celulares WI38, BHK,
COS-7, C127, o MDCK. Una línea celular de mamífero
preferida es CHL-1 o CHO. En el caso que se utilice
CHL-1, se incluye la higromicina como marcador
genético eucariótico. Las células CHL-1 están
derivadas de las células del melanoma RPMI 7932, una línea celular
humana fácilmente disponible. La línea celular CHL-1
ha sido depositada con el ATCC según las condiciones del Tratado de
Budapest y ha sido asignada #CRL 9446, depositada el 18 de junio de
1987. Las células adecuadas para ser utilizadas en esta invención
están disponibles comercialmente por American Type Culture
Collection. Unas líneas celulares de insecto ilustrativas incluyen
Spodoptera frugiperda (gusano cogollero) y Bombix mori
(gusano de seda).
Como se ha indicado anteriormente, el vector de
expresión, p. ej., el plásmido, que se utiliza para transformar la
célula huésped, preferiblemente contiene las secuencias de genes
para iniciar la transcripción, y las secuencias para controlar la
traducción de la secuencia de genes del péptido de TM. Dichas
secuencias se denominan secuencias de control de la expresión.
Cuando la célula huésped proviene de un insecto o es de origen
mamífero, las secuencias de control de la expresión ilustrativas
incluyen pero no se limitan a lo siguiente: los promotores de la
repetición terminal larga retrovíricos (1982) Nature,
297:479- 483), promotor SV40 (1983) Science,
222:524-527), promotor de quinasa timidina
(Banerji, J., et al., (1982) Cell,
27:299-308), o el promotor
beta-globina (Luciw, P. A., et al., (1983)
Cell, 33: 705-716). Se divide el ácido
nucleico del vector de receptor conteniendo las secuencias de
control de expresión usando las enzimas de restricción y se ajusta
sus dimensiones según sea necesario o deseable. Este segmento está
ligado a una secuencia de ADN que codifica un péptido de TM
empleando los medios bien conocidos en la técnica.
Cuando se emplean las células huéspedes de animal
superiores, normalmente hace falta incorporar secuencias de
poliadenilación o de terminación de la transcripción en el vector.
Un ejemplo de una secuencia de poliadenilación es la secuencia de
poliadenilación de SV40, que también puede funcionar como un
terminador de la transcripción.
Los genes incorporados en los vectores apropiados
pueden ser utilizados para dirigir la síntesis de las proteínas sea
en los sistemas de expresión transitoria o en los clones estables.
Haciendo referencia al primer caso, los rendimientos son bajos,
pero los experimentos se realizan de forma rápida. Haciendo
referencia al último caso, se tarda más tiempo en aislar los clones
con una producción elevada. Se pueden utilizar los vectores
diferentes para los dos tipos diferentes de experimentos. En
particular, en el caso de la expresión transitoria, las secuencias
pueden ser incluidas dentro del plásmido que permite que el plásmido
replique a un número alto de copias dentro de la célula. Estas
secuencias pueden derivar de un virus como SV40 (p. ej., Doyle, C.
et al., (1985) J. Cell Biol.,
100:704-714) o de secuencias de replicación
cromosómica como las secuencias de replicación autónomas de murina
(Weidle et al., (1988) Gene,
73:427-437). También el vector que se usa en la
expresión transitoria a menudo contiene un promotor fuerte como el
promotor temprano SV40 (p. ej., van Zonnenfeld, A. et al.,
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
83:4670-4674) para controlar la transcripción del
gen de interés. Mientras que la expresión transitoria provee un
método rápido para el ensayo de los productos genéticos, el ADN del
plásmido no se incorpora en el cromosoma de la célula huésped. Por
lo tanto, el uso de los vectores de expresión transitorios no
provee líneas celulares transfectadas de forma estable. Una
descripción de un plásmido adecuado para la expresión transitoria
está provista por Aruffo, A., y Seed, B. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 84: 8573-8577.
De forma alternativa, se pueden producir los
análogos de TM en las líneas celulares de insecto descritas
anteriormente usando el sistema de baculovirus. Este sistema ha
sido descrito por Luckow, V. A., and Summers, M. D.. (1988)
Bio/Technology, 6:47-55. Generalmente, este
sistema de expresión provee un nivel de expresión superior al que
provee la mayoría de los sistemas mamíferos. El baculovirus infecta
las células huéspedes del insecto, replica su genoma a través de
numerosos ciclos, y luego produce grandes cantidades de cristales
poliédricos. Se puede reemplazar el gen del poliedro con un gen del
péptido de TM. A continuación, el promotor del poliedro producirá
grandes cantidades de proteínas análogas después de la infección de
la célula huésped del cultivo y la replicación del genoma de
baculovirus. Se recoge el producto genético no segregado del
huésped 3-7 días después de la infección. De forma
alternativa, el péptido de TM puede ser segregado de las células si
las secuencias señal apropiadas están presentes en la proteína. Las
células huéspedes son competentes o se hacen competentes para la
transfección mediante varios medios. Existen varios métodos
conocidos para introducir ADN en las células animales. Los cuales
incluyen: la precipitación de fosfato de calcio, la técnica
DEAE-dextrano, la fusión de las células receptoras
con protoplastos bacterianos conteniendo el ADN, el tratamiento de
las células receptoras con liposomas conteniendo el ADN, la
electroporación, y la microinyección del ADN directamente en las
células. Véase, Perbal, B. "Practical Guide to Molecular
Cloning,"2ª edición, John Wiley & Sons, New York and
Wigler, et al., (1987) Cell, 16:777-785.
Se prefiere que la célula huésped sea capaz de
realizar un cultivo celular rápido y que sea capaz de glicosilar de
forma adecuada los productos genéticos expresados. Las células
conocidas que son adecuadas para el crecimiento denso en el cultivo
tisular son particularmente deseables y una variedad de células,
invertebradas o vertebradas, tanto normales como transformadas, han
sido empleadas en la técnica. En particular, las células que son
huéspedes adecuados para la expresión de TM recombinante y que
producen o contienen, bajo las condiciones de cultivo, una proteasa
que provoca la división de la trombomodulina nativa, no plantean
ningún inconveniente al seccionar el análogo de TM mutado no
sensible a la proteasa. Entre los ejemplos de tales células se
encuentran CHO, CHL-1 (caracterizado como una célula
de melanoma humana), las células Sf9, etc., que están disponibles
públicamente por el ATCC.
Se cultivan las células empleando unos medios
bien conocidos en la técnica. Para ver unos ejemplos, véase Kuchler
et al. (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and
Virology. Se recogen los productos de expresión del medio
celular en estos sistemas en los que se segrega la proteína de la
célula huésped o de la suspensión celular después de la ruptura del
sistema celular huésped por, p. ej., medios mecánicos o
enzimáticos, que son bien conocidos en la técnica.
Se prefiere que los péptidos de TM de esta
invención sean segregados por las células eucarióticas
recombinantes cultivadas. Se producen los análogos de TM en los
medios sin suero o complementados con suero y se segregan de forma
intacta. Si se utilizan las células procarióticas, los análogos de
TM pueden ser depositados intracelularmente. Los péptidos pueden
ser glicosilados completamente o parcialmente o no glicosilados.
Después del crecimiento de las células recombinantes y la secreción
concomitante de los análogos de TM en los medios de cultivo, se
recoge este "medio condicionado". A continuación se clarifica
el medio condicionado por centrifugado o filtración con el fin de
eliminar las células y los fragmentos celulares. Las proteínas
contenidas en los medios clarificados son concentrados por la
adsorción a cualquier resina adecuada como, por ejemplo, la Q
Sefarosa o los queladores metálicos, o usando el fraccionamiento de
sulfato amónico, la precipitación de polietileno glicol, o por
ultrafiltración. Otros medios conocidos en la técnica pueden
resultar igualmente adecuados. Se puede llevar a cabo la
purificación adicional de los análogos de TM según la manera
descrita en Galvin, J. B., et al., (1987) J. Biol.
Chem., 262:2199-2205 y Salem, H. H. et
al., (1984) J. Biol. Chem.,
259:12246-12251 y según la manera descrita en la
forma de realización expuesta en la presente. La purificación de
los análogos de TM segregados por las células cultivadas puede
requerir el uso adicional de, por ejemplo, la cromatografía de
afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por
exclusión de tamaños, u otras técnicas convencionales de
purificación de proteínas. Véase p. ej., Deutscher (ed.), "Guide
to Protein Purification" en Methods in Enzymology, Vol.
182 (1990).
Se pueden encontrar los análogos de TM
recombinantes en formas distintas que son distinguibles bajo
condiciones cromatográficas no reductoras. Es deseable eliminar
estas especies que tienen una actividad específica y se esto
consigue mediante una variedad de técnicas cromatográficas que
incluyen el intercambio aniónico o la cromatografía de exclusión
por tamaños. Los análogos de TM recombinantes pueden ser
concentrados por diálisis de presión e intercambiados por tampones
directamente en tampones volátiles (p. ej.,
N-etilmorfolina (NEM), bicarbonato de amonio,
acetato de amonio, y acetato de piridina). Además, se pueden
liofilizar las muestras directamente de estos tampones volátiles
dando como resultado un polvo de proteína estable sin sal y ni
detergentes. Además, las muestras liofilizadas de análogos
recombinantes pueden ser solubilizadas de nuevo antes de ser
utilizadas en los tampones compatibles por infusión (p. ej.,
solución salina con tampón fosfato). Otras sales o tampones
adecuados pueden incluir hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato,
acetato, benzoato, malato, citrato, glicina, glutamato, y
aspartato.
Varios ensayos de laboratorio que sirven para
medir la actividad de TM están disponibles. Se puede medir la
actividad del cofactor de la proteína C en el ensayo descrito por
Salem, et al., (1984) J. Biol. Chem.
259(19):12246-12251 y Galvin, et al.,
(1987) J. Biol. Chem.
262(5):2199-2205. En resumen, este ensayo
consiste en dos fases. La primera es la incubación del análogo de TM
de prueba con la trombina y la proteína C bajo condiciones
definidas (véanse los Ejemplos a continuación). En la segunda fase,
se desactiva la trombina con hirudina o antitrombina Ill y
heparina, y se determina la actividad de la proteína C recién
activada mediante el uso de un sustrato cromogénico, el cual libera
el cromóforo mediante la actividad proteolítica de la proteína C
activada. Se realiza este ensayo con los reactivos purificados.
De forma alternativa, se puede medir el efecto de
un análogo de TM empleando plasma en los ensayos de tiempo de
coagulación tales como el tiempo de tromboplastina parcial activada
(aPTT), tiempo de coagulación de la trombina (TCT), y/o el tiempo
de protrombina (PT). El ensayo de aPTT depende tanto de la
activación de la proteína C, como de la inhibición directa de la
trombina, mientras que los ensayos de TCT y PT sólo dependen de la
inhibición de la trombina. La prolongación del tiempo de
coagulación en cualquiera de estos ensayos demuestra que la
molécula puede inhibir la coagulación en el plasma. Se pueden
realizar los ensayos con un coagulómetro según las instrucciones del
fabricante; Medical Laboratory Automation Inc. distribuido por
American Scientific Products, McGaw Park, III. (Véase también H. H.
Salem et al., (1984) J. Biol. Chem.,
259:12246-12251, que se incorpora en la presente a
modo de referencia).
La activación de TAFI puede ser medida como se
describe por Wang et al. ((2000) J. Biol. Chem.),
utilizando el hecho de que el TAFI activado es una
carboxipeptidasa. En este ensayo, se incuban unos extractos
conteniendo el análogo de TM en cuestión con trombina, y después se
incuba la mezcla con TAFI purificado. Se determina la cantidad de
TAFI activado producida mediante el uso de un sustrato cromogénico,
el cual libera el cromóforo por la acción proteolítica del TAFI
activado (véase el ejemplo 2). De forma alternativa, se puede
evaluar la activación del TAFI por un ensayo de tisis de un coágulo
en el plasma, sea en un sistema definido empleando las proteínas
purificadas, o sea en un medio plasmático (Nagashima et al.
(2000) Throm. Research 98:333-342).
Se utilizan los ensayos descritos anteriormente
para identificar los análogos de TM solubles que son capaces de
enlazar la trombina y con el fin de evaluar la capacidad del
complejo de trombina-trombomodulina formado con
estos análogos para activar sea la proteína C o sea el TAFI, tanto
en los sistemas purificados como en un medio plasmático. Se pueden
utilizar ensayos adicionales para evaluar otras actividades de la
trombomodulina nativa como la inhibición de la formación de fibrina
de fibrinógeno catalizada por la trombina (Jakubowski, et
al., (1986) J. Biol. Chem. 261
(8):3876-3882), la inhibición de la activación del
Factor V por la trombina (Esmon, et al., (1982) J. Biol.
Chem. 257: 7944-7947), la inhibición acelerada
de la trombina por la antitrombina Ill y el cofactor de heparina II
(Esmon, et al., (1983) J. Biol Chem.
258:12238-12242), la inhibición de la activación del
Factor XIII por la trombina (Polgar, et al., (1987)
Thromb. Haemostas. 58: 140), la inhibición de la
inactivación de la proteína S mediada por la trombina. (Thompson
and Salem, (1986) J. Clin. Inv.
78(1):13-17) y la inhibición de la
activación y agregación de plaquetas mediada por la trombina (Esmon,
et al., (1983) J. Biol. Chem.
258:12238-12242).
Los análogos de TM solubles descritos en la
presente pueden ser preparados en una formulación liofilizada o
líquida. Se provee el material en una concentración adecuada para
su uso farmacéutico como una preparación inyectable o
intravenosa.
Se pueden administrar estos análogos por separado
o como mezclas con otros materiales activos aceptables
fisiológicamente, como los antibióticos, otros anticoagulantes,
t-PA monocatenario, o materias inactivas, o con
portadores adecuados como, por ejemplo, agua o solución salina
normal. Estos análogos pueden ser administrados parenteralmente,
por ejemplo, por inyección. La inyección puede ser subcutánea,
intravenosa o intramuscular. Estos análogos son administrados en
cantidades farmacéuticamente eficaces y a menudo como sales
farmacéuticamente aceptables, como las sales de adición de ácido,
Estas sales pueden incluir, entre otros, p. ej., hidrocloruro,
hidrobromuro, fosfato, sulfato, acetato, benzoato, malato, citrato,
glicina, glutamato, y aspartato. Véase, p. ej., Remington's
Pharmaceutical Sciences (17ª ed.), Mack Publishing Company,
Easton, Pennsylvania, y Goodman & Gilman's, The
Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press,
1985, los cuales se incorporan en la presente por referencia. Los
análogos descritos en la presente pueden mostrar una actividad
in vivo mejorada por incorporación en las micelas y/o los
agregados de fosfolípidos. Se conocen los métodos para la
incorporación en agregados de detergentes iónicos o micelas de
fosfolípidos.
Se puede preparar un agente antitrombótico usando
los análogos de TM solubles descritos en la presente y pueden
consistir en un análogo completamente purificado sólo o en
combinación con un agente trombolítico según el modo descrito
anteriormente. Los análogos de la presente invención que demuestran
que tienen los efectos fisiológicos citados anteriormente pueden ser
empleados en varias aplicaciones terapéuticas como, por ejemplo, la
inhibición de la formación de coágulos de sangre. Por lo tanto, se
pueden emplear estos compuestos como agentes terapéuticos en el
tratamiento de varios trastornos circulatorios, como, por ejemplo,
la embolia coronaria o pulmonar, los ataques cerebrovasculares, así
como la prevención de la reoclusión después de una terapia
trombolítica, y estos compuestos resultan útiles para interrumpir
el crecimiento adicional de un coágulo durante un infarto. Además,
los análogos descritos pueden ser útiles para el tratamiento de los
trastornos de coagulación sistémica como la coagulación
intravascular diseminada (CID), que se suele asociar con la
septicemia, determinados cánceres, y la toxemia del embarazo.
Se pueden administrar estos análogos a los
mamíferos para el uso veterinario, por ejemplo con los animales
domésticos, y para el uso clínico en los seres humanos de modo
similar a otros agentes terapéuticos, es decir, en un portador
aceptable fisiológicamente. En general, la dosificación de la
administración para el análogo de TM varia de aproximadamente al
menos 0.0002 \mug/kg, más normalmente 0.02 \mug/kg, y menos de
5000 \mug/kg, normalmente menos de 2000 \mug/kg, más
normalmente menos de 500 \mug/kg, normalmente 0.02 a 2000
\mug/kg y más normalmente de 0.02 a 500 \mug/kg del peso
corporal del huésped. Estas dosificaciones pueden ser administradas
mediante perfusión constante durante un periodo extendido, hasta
que se consiga un nivel de circulación deseado, o preferiblemente
como una inyección en el bolo. Un experto en la materia puede
determinar rutinariamente las dosificaciones óptimas para un
paciente particular.
Los análogos de trombomodulina según la presente
invención pueden ser empleados según la presente invención por la
expresión de tales polipéptidos in vitro e in vivo,
en los métodos de tratamiento que a menudo se denominan "terapia
genética."
Por lo tanto, por ejemplo, se pueden modificar
las células de un paciente con un polinucleótido, como un ADN o
ARN, codificando un polipéptido ex vivo, y entonces las
células modificadas pueden ser proporcionadas a un paciente que se
tratará con el polipéptido. Por ejemplo, se pueden modificar las
células ex vivo mediante el uso de un vector de plásmido
retrovírico que contiene ARN que codifica un polipéptido de la
presente invención. Estos métodos son bien conocidos en la técnica
y su uso en la presente invención será evidente a partir de estas
instrucciones.
De forma similar, se pueden modificar las células
in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo
mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
se puede modificar un polinucleótido de la invención para la
expresión en un vector retrovírico de replicación defectuosa, como
se ha mencionado anteriormente. A continuación, se puede aislar el
constructo de expresión retrovírica e introducirlo en una célula de
empaquetamiento transducida con un vector del plásmido retrovírico
conteniendo el ARN que codifica un polipéptido de la presente
invención de manera que la célula de empaquetamiento produzca
partículas víricas infecciosas conteniendo el gen de interés. Estas
células productoras pueden ser administradas a un paciente para
modificar las células in vivo y la expresión del polipéptido
in vivo. Estos y otros métodos de administración de un
polipéptido de la presente invención que usan este método deberían
ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las
instrucciones de la presente
invención.
invención.
Los retrovirus de los cuales se pueden derivar
los vectores del plásmido retrovírico mencionados anteriormente
incluyen, pero no se limitan, el virus de la leucemia murina de
Moloney, el virus de necrosis del bazo, los retrovirus como el
virus del sarcoma de rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus
de leucosis aviar, el virus de leucemia de mono Gibbon, el virus de
la inmunodeficiencia humana, el virus Lenti, el virus de sarcoma
mieloproliferativo, y el virus del tumor mamario. En una forma de
realización, el vector del plásmido retrovírico está derivado del
virus de la leucemia murina de Moloney.
Los virus que no sean retrovirus pueden también
ser usados para introducir los polinucleótidos de TM seleccionados;
es decir los virus del ADN, como adenovirus y el virus
adenoasociado y el virus herpes, y sus derivados. Los plásmidos
conteniendo las secuencias nucleótidas de interés pueden también ser
introducidos en los complejos con lípidos o los derivados lipídicos
y en los complejos con una variedad de otros reactivos bioquímicos
y químicos que facilitan la introducción de los polinucleótidos en
las células in vitro o in vivo.
Estos vectores incluirán uno o más promotores
para la expresión del polipéptido. Los promotores adecuados que se
pueden incluir, pero no se limitan, el LTR retrovírico; el promotor
del SV40; y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) (Miller
et al., Biotechniques 7: 980-990,
1989), o cualquier otro promotor (p. ej., los promotores celulares
como los promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no se
limitan a estos, la histona, ARN-polimerasa III, y
los promotores de (\beta-actina). Otros
promotores víricos que se pueden emplear incluyen, pero no se
limitan a estos, los promotores de adenovirus, los promotores de
timidina quinasa (TK), y los promotores del parvovirus B19. El
promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen
que codifica el polipéptido. La elección de un promotor adecuado
será evidente para los expertos en la técnica a partir de las
instrucciones contenidas en la
presente.
presente.
Se emplea el vector del plásmido retrovírico para
transducir las líneas celulares de empaquetamiento para formar las
líneas celulares productoras. Entre los ejemplos de las células de
empaquetamiento que pueden ser modificadas se encuentran, pero no
se limitan a éstas, PESOI, PA317,Y-2,
Y-AM, PAl2, T19-14X,
VT-19-17-H2, YCRE,
YCRIP, GP+E-86, GP+envAml2, y las líneas celulares
DAN como se describen en Miller, A., Human Gene Therapy
1:5-14, 1990. Se puede transducir el vector en las
células de empaquetamiento mediante cualquiera de los medios
conocidos en la técnica. Estos medios incluyen, pero no se limitan a
la electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación de
CaPO_{4}. En una alternativa, el vector del plásmido retrovírico
puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplada a un lípido, y
después administrado a un huésped.
La línea celular productora generará las
partículas del vector retrovírico infecciosas, las cuales incluyen
la o las secuencias de polinucleótidos que codifican los
polipéptidos. A continuación se pueden emplear estas partículas del
vector retrovírico con el fin de transducir las células
eucarióticas, sea in vitro o sea in vivo. Las células
eucarióticas transducidas expresarán el o los polinucleótidos que
codifican el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser
transducidas incluyen, pero no se limitan a las células madre
embrionarias, las células de carcinoma embrionarias, así como las
células madre hematopoyéticas, los hepatocitos, los fibroblastos,
los mioblastos, los queratinocitos, las células endoteliales, y las
células epiteliales bronquiales. Se pueden utilizar los vectores
víricos y no víricos del tipo descrito anteriormente para introducir
las secuencias polinucleótidas que codifican al análogo de
trombomodulina que se elija. Los polinucleótidos pueden codificar
para el ARNm del análogo de trombomodulina entero o fragmentos
suyos. La introducción de estas secuencias de polinucleótidos en
los pacientes después de la cirugía de derivación podría servir para
proteger el endotelio, ya que evita la coagulación así como la
aterosclerosis acelerada en los sitios donde se injerte.
Sin explicar con más detalle, se entiende que un
experto en la técnica puede, usando la descripción precedente,
utilizar la presente invención de la forma más amplia. En
consecuencia se interpretan las siguientes formas de realización
específicas preferidas de modo meramente ilustrativo y no limitativo
de ninguna manera con respecto a lo que queda de la
descripción.
En los ejemplos anteriores y en los siguientes,
se presentan todas las temperaturas sin corregir en grados Celsius;
y, a menos que se indique lo contrario, se presentan todas las
partes y los porcentajes en peso.
Clonación Se aislaron genes para producir
péptidos análogos de trombomodulina recombinantes como se describe
en las Patentes U.S. Nos. 5.256.770 y 5.466.668, cada una
incorporada a la presente a modo de referencia. En resumen, se usó
ADN humano par aislar un gen codificador de los 6 dominios
similares al EGF de la trombomodulina correspondiendo a los
aminoácidos 227-462, así como otras partes del
péptido de trombomodulina (Veáse Tabla 2). Este ADN fue aislado de
hígado fetal según el método de Blin, N. and Stafford, D.W. ((1976)
Nucleic Acids Res. 3:2303-2308). El ADN fue
luego usado como molde en una reacción en cadena de la polimerasa
con cebadores sintéticamente derivados seleccionados para rodear las
regiones deseadas. Veáse p. ej., Innis et al., (1990) PCR
Protocol, A Guide to Methods and Applications, Academic
Press.
Aislamiento de genes codificadores de los
aminoácidos 227-462. Las fases siguientes
proveen un medio para obtener un injerto de ADN codificador de los
aminoácidos 227-462 y que utiliza los cebadores
#1034 (5'CCGGGATCCTCAACAGTCGGTGCCAATGTGGCG3') (SEC ID NO: 3) y
#1033 (5'CCGGGATCCTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGC3') (SEC ID NO: 4). Se
entiende que mediante la modificación de los procedimientos
establecidos más abajo usando cebadores alternativos, se podrán
obtener otros análogos de TM.
La secuencia de los cebadores #1034 y #1033
corresponde a las extremidades 5' y 3' del dominio deseado (6
dominios similares a EGF), pero se han modificado con el fin de que
contengan un sitio BamHI. Un codón terminal (TGA) fue introducido
después de la base 1590. La reacción en cadena de la polimerasa fue
realizada bajo las condiciones descritas por Saiki, et al.,
(1988) Science 320:1350-1354, excepto por el
hecho de que la temperatura inicial de recocido fue 37°C. Después
de 10 ciclos, la temperatura de recocido fue aumentada a 45°C para
los 30 ciclos restantes. Una parte alícuota de los productos
reactivos fue separada en un gel de poliacrilamida al 5% y
visualizada por coloración con bromuro de etidio. Una banda del
tamaño predicho (700 bp) podrá verse claramente. De forma
alternativa se podría secuenciar esta banda o hibridizarla a una
sonda interna para confirmar su identidad.
Este fragmento, a través de una serie de
constructos intermedios, fue puesto bajo el control del promotor de
\beta-lactamasa y la secuencia señal en pKT279.
Un fragmento EcoR5-Bgl2 del plásmido
resultante y un fragmento ScaI- SacI de
pGEM-3Zf ADN conteniendo el origen f1 de la
replicación fueron luego insertados en el vector
pSELECT-1 en los sitios
EcoR5-BamHI y
ScaI-SacI, respectivamente, para construir
un vector de expresión de E. coli, pTHR211, que codifica
para un análogo de TM conteniendo los 6 dominios similares a EGF
(TM_{E}). El plásmido pTHR211 fue usado para generar el plásmido
pMJM57 conteniendo una sustitución de leucina para la metionina en
la posición 388 (M388L), usando la mutagénesis
sitio-dirigida como se describe más abajo.
Mutagénesis sitio-diriga.
Los plásmidos que codifican para los mutantes de TM fueron
construidos usando la mutagénesis sitio-dirigida sea
como se describe por Kunkel et al. ((1987) Methods in
Enzym. 154:367-382) o como se describe en el
protocolo para el equipo de mutagénesis
sitio-dirigida QuikChange^{TM} (Stratagene,
LaJolla, CA). En el primer protocolo, un molde de ADN de uracilo
monocatenario, obtenido a partir de la cepa CJ236 de E. coli
con el fago auxiliar R408, fue usado para la síntesis de la cadena
mutagénica en presencia de los oligonucleótidos específicos con T4
ADN polimerasa y T4 ADN igasa. Los oligonucleótidos específicos
usados están catalogados más abajo (todos dados en la dirección 5'
a 3').
\newpage
para D338A: CTA CCC TAA CTA TGC ATT
GGT GGA CGG CG (SEQ ID NO:
9);
para L339A: CCT MC TAC GAC GCG GTC
GAC GGC GAG TGT (SEQ ID NO:
10);
para V340A: ACT ACG ACC TGG CGG ACG
GCG AAT GCG TGG AGC CCG TG (SEQ ID NO:
11);
para D341A: ACO ACC TGG TGG CCG GCG
MT GCG TGG AGC CCG TG (SEQ ID NO:
12);
para E343A: TGG TGG ACG GCG CAT GCG
TGG AGC CCG TG (SEQ ID NO:
13);
para D349A: GGC GAG TGT GTG GAG CCC
GTG GCG CCG TGC TTC AGA GCC MC TGC G
\hbox{(SEQ ID NO:
14);}
para E357A: CCC GTG CTT CAG AGC CAA
CTG CGC ATA CCA GTG CCA GCC CCT GM CC
\hbox{(SEQ ID NO:
15);}
para Y358A: GCC MC TGC GAG GCC CAG
TGT CAA CCC CTG AAC CAA'(SEQ ID NO:
16).
\vskip1.000000\baselineskip
Un sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción fue incorporado en cada oligonucleótido sin cambiar la
secuencia de aminoácidos, y los transformantes resultantes fueron
caracterizados por la digestión de la enzima de restricción,
seguido de la confirmación de la secuencia de ADN.
En el segundo método, se usó un ADN bicatenario
como molde en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en
presencia de oligonucleótidos específicos según las instrucciones
del fabricante. Los cebadores usados para producir H381 G fueron
5'GCG CCC ATT CCC GGC GAG CCG CAC AG3' (SEC ID NO: 17)y
5'CTG TGC GGC TCG CCG GGA ATG GGC GC3' (SEC ID NO: 18). Los
productos de la PCR fueron digeridos con una enzima de restricción,
Dpn1, y transformados en células DH5\alpha competentes. Los
transformantes fueron caracterizados por análisis de la secuencia
de ADN.
Se produjeron análogos conteniendo modificaciones
múltiples de la secuencia usando los métodos descritos de una
manera secuencial. Después del primer ciclo de la mutagénesis y el
análisis de la secuencia de ADN, el ADN modificado una sola vez fue
usado como molde para el siguiente ciclo de mutagénesis.
Preparación de Extractos Periplásmicos.
Las células DH5\alpha que expresan mutantes de TM fueron
desarrolladas hasta su saturación en 1.5 ml de caldo de L
conteniendo ampicilina (50 \mug/ml) a 37°C. Las células fueron
recogidas por centrifugado a 14.000 rpm en una microcentrifugadora
durante 25 s y lavadas una vez con 0.5 ml de 100 mM de
Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl. Las células fueron
suspendidas durante 10 minutos a la temperatura ambiente en 0.5 ml
de 300 mM de Tris-HCl, pH 8.0;20% de sacarosa, 1 mM
de EDTA, 0.5 mM de MgCl_{2}. Las células fueron centrifugadas
como antes y resuspendidas durante 10 minutos en 0.15 ml de 0.5 mM
MgCl_{2} enfriado en hielo. Los extractos periplásmicos fueron
recogidos por centrifugado.
Activación de la Proteína C. Todos los
reactivos fueron diluidos en 2.5 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaC),
5 mg/ml BSA, 20 mM de Tris-HCl, pH 7.4. Quince
\mul de cada extracto periplásmico fue incubado con proteína C (1
\muM final) y trombina (3.6 nM final) durante 1 hr a 37°C. Se
añadió un exceso de hirudina (2 U/ml final) para detener la
activación. Después de 5 minutos a 37°C, un sustrato cromogénico,
S-2266 (0.5 mM final) fue añadido y el nivel de
aumento de la absorbencia a 405 nm (mOD/minutos) fue medido usando
un Lector de Microplacas Cinético Vmax y programas Softmax
(Molecular Devices, Menlo Park, CA).
Ensayo de la activación de TAFI. Para la
activación de TAFI, una parte alícuota de 20 ul de extracto
periplásmico de cada mutante fue preincubada con trombina (13 nM
final) en 20 mM de HEPES, pH 7.5/150 mM de NaCl/5 mM de CaCl_{2}
durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas fueron
incubadas con TAFI recombinante purificado (18 nM final) y un
sustrato, hipuril-arginina (1.0 mM final) en un
volumen total de 60 ul durante 60 minutos. La cantidad de TAFI
activado fue cuantificada midiendo la hidrólisis de
hipuril-arginina a ácido hipúrico, seguido de la
conversión de ácido hipúrico en un cromógeno con 80 \mul tampón de
fosfato (0.2 m, pH 8.3) y 60 ul de cloruro de cianuro al 3% en
dioxano (p/v). Después de mezclarlo bien, se midió la absorbencia
del sobrenadante claro a 382 nm. La cantidad de la activación de
TAFI dependiente de la trombina fue calculada restando la
absorbencia anterior producida en ausencia de trombina para cada
mutante.
Los ensayos para la activación de la Proteína C y
el TAFI contenían extractos de células DH5\alpha modificadas con
el vector pSelect-1 (sin TM_{E}), tipo salvaje
(TM_{E}M388 (pTHR211), o TM_{E}M388L(pMJM57) como
controles internos. Las actividades del cofactor de los mutantes de
alanina TM_{E}(M388L) fueron expresadas en porcentajes de
actividad de TM_{E}(M388L). Cada mutante de TM fue
evaluado para la activación de la proteína C y TAFI por duplicado
usando tres preparaciones independientes de extractos. (véase
figura 3).
Se produjeron los anticuerpos monoclonales 43B y
531 de ratón según el procedimiento de Esmon et al. (1987)
Dev. Biol. Stand. 67:75-82), tras la
inmunización con TM_{E}(Sf9)WT (Clarke et al.
(1993) J. Biol. Chem. 268: 6309-6315). 4
placas de microvaloración Dynatech Immulon fueron revestidas con 43B
monoclónico anti-TM; se añadieron 100 \mul de 7.5
\mug/ml de 43B en 0.1 M de MOPS, 150 mM de NaCl, 5 mM de
CaCl_{2}, pH 7 a cada pocillo y se incubó durante toda la noche a
4°C. Las placas fueron luego lavadas cinco veces con PBST (PBS +
0.05% Tween 20, v/v), bloqueadas con 200 \mul de 0.1% de BSA en
PBST/pocillo durante 2 hr a 37°C, y lavadas como antes. TM estándar
(TME(Sf9)WT) o desconocidas en la gama de
3-30 ng/ml fueron añadidas en 100 \mul de BSA al
0.1% en PBST, se incubó durante 1 hr a 37°C, y se lavó como antes.
Anti-TM 531 marcado con biotina, 100 \mul de 500
ng/ml en 0.1% BSA en PBST/pocillo, fue incubado durante 1 hr a 37°C
y lavado. Estreptavidina-Fosfatasa alcalina (100
\mul de 0.3 \mug/ml) conteniendo 0.1% de BSA en PBST fue añadida
e incubada durante 1 hr a 37°C y lavada. Se añadió sustrato de
fosfato P-Nitrofenilo a 1 mg/ml en un tampón
sustrato (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA), 100
\mul/pocillo, y se incubó durante 30 minutos a la temperatura
ambiente. La placa fue leída en un lector de placas de
microvaloración a 405 nm.
<110> Light, David
\hskip1cmMorser, Michael J
\hskip1cmNagashima, Mariko
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Análogos de Trombomodulina para Uso
Farmacéutico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Análogos mejorados de
Trombomodulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/213,678
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mad_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (205)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (151)..(1875)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggatcct caacagtcgg tgccaatgtg gcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatcct gcagcgtgga gaacggcggc tgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccacgagc cgcacaggtg ccagctgttt tgcaaccaga ctgcctgtcc agccg
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagtgccac tgtgcaccta actacgac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactgctacc ctgcatatga cctggtggac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccactgctac ccgaatgccg acctggtgga
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaccctaac tatgcattgg tggacggcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctaactacg acgcggtcga cggcgagtgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactacgacct ggcggacggc gaatgcgtgg agcccgtg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgacctggt ggccggcgaa tgcgtggagc ccgtg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtggacgg cgcatgcgtg gagcccgtg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgagtgtg tggagcccgt ggcgccgtgc ttcagagcca actgcg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgtgcttc agagccaact gcgcatacca gtgccagccc ctgaacc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaactgcg aggcccagtg tcaacccctg aaccaa
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcccattc ccggcgagcc gcacag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgcggtt cgccgggaat gggcgc
\hfill26
Claims (34)
1. Análogo de trombomodulina, donde el análogo
tiene más del 100% de la capacidad para potenciar la activación de
la proteína C mediada por trombina y menos del 50% de la capacidad
para potenciar la activación de TAFI mediada por la trombina, en
comparación con la trombomodulina nativa, y donde el análogo tiene
la secuencia de aminoácidos de la trombomodulina nativa (SEC ID NO:
2) que está modificada por sustitución, inserción o supresión de
aminoácidos en las posiciones 340, 341 ó 343 y en la posición 381,
dónde el análogo está numerado según la trombomodulina nativa.
2. Análogo de trombomodulina, donde el análogo
tiene más del 100% de la capacidad para potenciar la activación de
la proteína C mediada por trombina y menos del 50% de la capacidad
para potenciar la activación de TAFI mediada por trombina, en
comparación con la trombomodulina nativa, y donde el análogo tiene
la secuencia de aminoácidos de trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2)
que está modificada por sustitución, inserción o supresión de
aminoácidos al menos en dos posiciones dentro de los 6 dominios
similares al EGF de la trombomodulina, en el cual una modificación
en el bucle c del tercer dominio similar al EGF se combina con una
modificación al menos en un residuo dentro de los dominios
4-6 similares al EGF, donde una modificación es
H381 G.
3. Análogo de trombomodulina según la
reivindicación 1 ó 2, donde la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada por
sustitución, inserción o supresión de aminoácidos en las posiciones
340, 341 ó 343 y en la posición 381, en la cual la modificación en
la posición 381 es glicina.
4. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la posición 340, 341 ó 343 del
análogo de trombomodulina está reemplazado con una alanina y donde
la histidina en la posición 381 del análogo de trombomodulina está
reemplazado con una glicina.
5. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el análogo es soluble.
6. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde el análogo es resistente a la
oxidación y donde la metionina en la posición 388 del análogo de
trombomodulina está reemplazado con una leucina.
7. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde el análogo está modificado en los
residuos de azúcar del dominio de glicosilación enlazado en O de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2).
8. Análogo de trombomodulina según la
reivindicación 7, donde el análogo está modificado de manera que el
dominio de glicosilación enlazado en O no tenga sulfato de
condroitina.
9. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde el análogo es resistente al
seccionamiento de la proteasa.
10. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
V340A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
11. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
D341A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
12. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
E343A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
13. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
V340A
H381G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminando en P490.
14. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
D341A
H381G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminando en P490.
15. Análogo de trombomodulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) está modificada en las
posiciones siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
E343A
H381 G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminando en P490.
16. Composición para el uso en un método de
tratamiento de una enfermedad trombótica en un paciente humano,
donde dicha composición comprende un análogo de trombomodulina que
tiene más del 100% de la capacidad para potenciar la activación de
la proteína C mediada por trombina y menos del 50% de la capacidad
para potenciar la activación de TAFI mediada por trombina, en
comparación con la trombomodulina nativa, y dicho análogo tiene la
secuencia de aminoácidos de la trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2)
modificada por sustitución, inserción o supresión de aminoácidos en
al menos dos posiciones con los 6 dominios similares al EGF de la
trombomodulina; y donde dicho método comprende la administración de
una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho análogo a dicho
paciente, donde la secuencia de aminoácidos de la trombomodulina
nativa (SEC ID NO: 2) está modificada por sustitución, inserción o
supresión de los aminoácidos en las posiciones 340, 341 ó 343 y en
la posición 381. donde el análogo está numerado según la
trombomodulina nativa.
17. Composición según la reivindicación 16, donde
la valina en la posición 340 del análogo de trombomodulina está
reemplazada con una alanina y donde la histidina en la posición 381
del análogo de trombomodulina está reemplazada con una glicina.
18. Composición según la reivindicación 16, donde
el ácido aspártico en la posición 341 del análogo de trombomodulina
está reemplazado con una alanina y donde la histidina en la
posición 381 del análogo de trombomodulina está reemplazada con una
glicina.
19. Composición según la reivindicación 16, donde
el ácido glutámico en la posición 343 del análogo de trombomodulina
está reemplazado con una alanina y donde la histidina en la
posición 381 del análogo de trombomodulina está reemplazada con una
glicina.
20. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina es soluble.
21. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina es resistente a la oxidación y donde
la metionina en la posición 388 del análogo de trombomodulina está
reemplazada con una leucina.
22. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina está modificado en los residuos de
azúcar del dominio de glicosilación enlazado en O de la
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2).
23. Composición según la reivindicación 22, donde
el análogo de trombomodulina está modificado de manera que el
dominio de glicosilación enlazado en O no tenga sulfato de
condroitina.
24. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina es resistente al seccionamiento de la
proteasa.
25. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
V340A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
26. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
D341A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
27. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
E343A
H381G
M388L
R456G
H457Q, y
S474A.
28. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
V340A
H381G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminada en P490.
29. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
D341A
H381G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminada en P490.
30. Composición según la reivindicación 16, donde
el análogo de trombomodulina tiene la secuencia de aminoácidos de
trombomodulina nativa (SEC ID NO: 2) modificada en las posiciones
siguientes:
eliminación de aminoácidos
1-3
E343A
H381G
M388L
R456G
H457Q
S474A, y
terminada en P490.
31. Composición según la reivindicación 16 donde
dicha cantidad terapéuticamente eficaz del análogo es administrada
suministrando al paciente un polinucleótido que codifica el análogo
y que expresa el análogo in vivo.
32. Composición estéril útil para tratar una
enfermedad trombótica o condición en mamíferos, que comprende una
dosis terapéuticamente eficaz de un análogo de trombomodulina
purificado, donde dicho análogo es el análogo de trombomodulina
según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
33. Uso de un análogo de trombomodulina en la
producción de un medicamento para tratar una enfermedad trombótica
en un paciente humano; donde dicho análogo es el análogo de
trombomodulina según cualquiera de las reivindicaciones
1-15.
34. Método in vitro de entrega a una
célula de mamífero de un análogo de trombomodulina, donde dicho
análogo es el análogo de trombomodulina según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15.
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