PL210582B1 - Przeciwciało przeciwzakrzepowe, kompozycja farmaceutyczna przeciwciała, sposób zabezpieczania przed powstawaniem skrzepu, sposób regulowania odpowiedzi zapalnej, zestaw zawierający przeciwciało oraz kompozycja do terapii genowej i sekwencja polinukleotydowa - Google Patents
Przeciwciało przeciwzakrzepowe, kompozycja farmaceutyczna przeciwciała, sposób zabezpieczania przed powstawaniem skrzepu, sposób regulowania odpowiedzi zapalnej, zestaw zawierający przeciwciało oraz kompozycja do terapii genowej i sekwencja polinukleotydowaInfo
- Publication number
- PL210582B1 PL210582B1 PL373960A PL37396003A PL210582B1 PL 210582 B1 PL210582 B1 PL 210582B1 PL 373960 A PL373960 A PL 373960A PL 37396003 A PL37396003 A PL 37396003A PL 210582 B1 PL210582 B1 PL 210582B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- fviia
- scfv
- seq
- Prior art date
Links
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 title claims abstract description 274
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 title claims abstract description 274
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims description 20
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title claims description 15
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 68
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 67
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 49
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 22
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 22
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 22
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 16
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 8
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 7
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 7
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 6
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 claims description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 82
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 27
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 abstract 1
- 101100226846 Strongylocentrotus purpuratus EGF3 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 abstract 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 55
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 45
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 24
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 11
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 101100327819 Caenorhabditis elegans chl-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 3
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- -1 pol III Proteins 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 2
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 2
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N Arg-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N 0.000 description 2
- DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZKDGORKGHPCZOV-DCAQKATOSA-N Asn-His-Arg Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZKDGORKGHPCZOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 2
- GYNUXDMCDILYIQ-QRTARXTBSA-N Asp-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N GYNUXDMCDILYIQ-QRTARXTBSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N Phe-Pro-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- DLZKEQQWXODGGZ-KWQFWETISA-N Tyr-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KWQFWETISA-N 0.000 description 2
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- HKYTWJOWZTWBQB-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HKYTWJOWZTWBQB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- FZADUTOCSFDBRV-RNXOBYDBSA-N Tyr-Tyr-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 FZADUTOCSFDBRV-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 2
- LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N Val-Phe-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)O)N CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 2
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 2
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005834 tyrosyl-alanyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNKZJCICBFSACN-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylbutanoyl)amino]-n-[5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ZNKZJCICBFSACN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N Ala Ala Gly Ala Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(O)=O SBGXWWCLHIOABR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003162 Arterial injury Diseases 0.000 description 1
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N Cys-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N 0.000 description 1
- YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N Cys-Thr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940123900 Direct thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000393496 Electra Species 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000481 Heparin Cofactor II Proteins 0.000 description 1
- 102100030500 Heparin cofactor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010090444 Innovin Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N Leu-Val-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 101100115713 Mus musculus Stfa3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N Pro-Asp-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N Pro-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 206010037459 Pulmonary venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000034713 Spontaneous Rupture Diseases 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UUJHRSTVQCFDPA-UFYCRDLUSA-N Tyr-Tyr-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 UUJHRSTVQCFDPA-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- HMQPEDMEOBLSQB-UITYFYQISA-N beta-D-Galp-(1->3)-D-GalpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-UITYFYQISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004715 cellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007819 clotting time assay Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000003331 prothrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/7455—Thrombomodulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
Utrzymanie właściwej równowagi pomiędzy aktywnością prozakrzepową i przeciwzakrzepową wewnątrz naczyń krwionośnych ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej hemostazy (Davie, E.W. i in. (1991) Biochemistry, 30(43): 10363-10370). Zaburzenie równowagi w kierunku koagulacji prowadzi do zakrzepicy, co może spowodować atak serca, udar, zator płucny i zakrzepicę żylną. W leczeniu specyficznych zaburzeń zakrzepowych występuje zapotrzebowanie na bardziej skuteczne i bezpieczniejsze środki przeciwzakrzepowe.
Czynnik tkankowy („TF) jest przezbłonową glikoproteiną, która jest głównym inicjatorem kaskady krzepnięcia (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 180-184).
W normalnych fizjologicznych warunkach aktywny TF nie kontaktuje się z krwią . Przy uszkodzeniu naczyń poddanie podśródbłonkowego TF i kolagenu działaniu krwi prowadzi do aktywacji czynników krzepnięcia i płytek krwi a później do powstania skrzepu hamującego wypływ krwi. Poddany działaniu krwi TF funkcjonuje jako kofaktor dla czynnika VIla („FVIIa) katalizuje aktywację czynnika IX („FIX) i czynnika X („FX), składników o decydującym znaczeniu, odpowiednio, kompleksów wewnętrznej tenazy i protrombinazy. To prowadzi do szybkiego powstawania FXa i trombiny. Trombina dalej enzymatycznie tnie fibrynogen do fibryny, która później polimeryzuje dając skrzep fibrynowy. Niewłaściwa indukcja ekspresji TF w rozmaitych klinicznych przypadkach krzepnięcia może prowadzić do zagrażającej życiu zakrzepicy i/lub przyczyniać się do patologicznych powikłań. Przyjmuje się, że ekspozycja na TF, po której następuje przerwanie płytki odpowiada za okluzję zakrzepową prowadzącą do ostrego zawału serca i udaru. W tych zdarzeniach zakrzepowych, prozapalne szlaki przenoszenia sygnału aktywowane przez czynniki krzepnięcia również przyczyniają się do powstawania obrzęku i zwiększenia obszaru zawału. Uszkodzenie naczyń zwią zane z angioplastyką prowadzi do regulacji w górę TF w SMC co, jak się przyjmuje, indukuje związane z restenozą komórkowe szlaki przenoszenia sygnału. Nadmierna ekspresja TF w przypadku raka i sepsy wywołanej przez bakterie Gram ujemne prowadzi do zagrażającej życiu zakrzepicy i do aktywacji szlaków zapalnych.
Kompleks FVIIa/TF zaangażowany jest w mechanizm patogenezy rozmaitych chorób zakrzepowych a poziom TF w krwi krążącej jest czynnikiem ryzyka u pewnych pacjentów. FVIIa i TF ogrywają wyjątkowe role w utrzymaniu hemostazy i inicjowaniu tworzenia skrzepu w przypadku uszkodzenia naczyń.
Normalnie TF ulega ekspresji w przydance naczynia, lecz podlega regulacji w górę, a w chorobie naczyniowej ulega nieprawidłowej ekspresji w błonie środkowej i neointimie. Ekspresja TF jest zwiększona w tych płytkach miażdżycowych, które są osłonięte przed kontaktem z krwią przez cienką włóknistą osłonkę, która może pęknąć eksponując TF. Zabiegi chirurgiczne, takie jak angioplastyka balonowa, wprowadzanie stentu lub wycięcie błony wewnętrznej tętnicy powodują uszkodzenie ściany naczynia i prowadzą do ekspozycji na znajdujący się poniżej TF. W cienkościennej bogatej w lipidy płytce miażdżycowej, samorzutne pęknięcie lub nadżerka śródbłonka prowadzą do ekspozycji na TF i do zakrzepicy, prowadzą c w efekcie do niestabilnej dusznicy bolesnej i zawał u serca. TF moż e krążyć w pochodzących z komórki mikrocząstkach a poziomy TF w krwi krążącej w niestabilnej dusznicy bolesnej są podwyższone, co sugeruje, że ten krążący TF może przyczyniać się do powstawania skrzepu (Soejima, H. i in. (1999) Circulation 99 (22): 2908-2913). Często, stan nadkrzepliwości powiązany jest z rakiem i nadmierną ekspresją TF na komórkach guza. To predysponuje pacjenta ku zakrzepicy żył głębokich, zatorowi płucnemu i rozsianemu wykrzepianiu wewnątrznaczyniowemu („DIG) małego stopnia. DIG prowadzi do odkładania się mikrowłókienek fibryny przyczyniając się do uszkodzenia wielonarządowego.
Środki przeciwzakrzepowe na bazie białkowej nakierunkowane na TF obejmują przeciwciała neutralizujące TF, czynnik VIla z zablokowanym miejscem aktywnym („FVIIai), inhibitor szlaku czynnika tkankowego („TFPI”) i białko przeciwzakrzepowe nicienia („NAPC2). Wyniki uzyskane na modelach ostrego uszkodzenia tętnic spowodowanego zakrzepicą wskazują, że inhibitory FVIIa/TF na bazie białka są skutecznymi antytrombotykami, powodują mniejsze krwawienie w porównaniu z heparyną, bezpośrednimi inhibitorami trombiny, inhibitorami płytek krwi i inhibitorami FXa (Himber, J. i in. (2001) Thromb. Haemost. 85:475-481; Harker, L.A. i in. (1995) Thromb. Haemost. 74 (1): 464-472. Ponadto, hamowanie FVIIa/TF przewyższa inne środki przeciwzakrzepowe (np, heparynę, inhibitory FXa) w zapobieganiu zagę szczaniu neointimy i zwężeniu naczyń w wyniku uszkodzenia spowodowanego przez balon (Jang, Y. i in. (1995) Circulation 92(10): 3041-3050).
PL 210 582 B1
Hamowanie TF, FVIIa lub kompleksu FVIIa/TF jest skuteczną metodą przeciwzakrzepową w zapobieganiu DIG i zmniejsza ś miertelność w modelach doś wiadczalnych sepsy. Analogi TFPI zapobiegają DIG wywołanemu zarówno tromboplastyną jak i endotoksyną u królików (Day, K.C. i in. (1990) Blood 76:1538-1545; Bregengard, C. i in. (1993) Blood Coagul. Fibrinolysis 4:699-706). Przeciwciała monoklonalne przeciwko FVIIa (Biemond, B.J. i in. (1995) Thromb. Haemost. 73:223-230) lub (Levi, M. i in. (1994) J. Clin. Invest. 93:114-120) zapobiegają wywołanemu endotoksyną DIG u małp. Przeciwciała neutralizujące TF, FVIIai i TFPI, hamują DIG i zmniejszają śmiertelność w modelu sepsy wywołanej E. coli u pawianów (Creasey, A.A. i in. (1993) J. Clin. Invest. 91:2850-2860; Taylor, F.B. i in. (1991 a) Blood 78: 364-368; Taylor, F.B. i in. (1991b) Circ. Shock 33:127-134; Taylor, F.B. (1996) Haemostasis Supl. 1 26:83-91). Wiadomo, że zarówno niezwiązany FXa jak i kompleks FVIIa/TF/FXa indukują produkcję cytokin prozapalnych, związanych ze zwiększonym ryzykiem zgonów pacjentów z sepsą (Riewald, M. i in. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7742-7747).
Co jest interesujące wykazano, że FVIIai obniża poziom IL-6 i IL-8 w osoczu pawiana (Taylor, F.B. i in. (1998) Blood 91:1609-1615), co sugeruje, że hamowanie FVIIa/TF może mieć dodatkowe działanie przeciwzapalne nie występujące w przypadku innych mechanizmów przeciwzakrzepowych.
Opisano kilka przeciwciał będących skutecznymi środkami przeciwzakrzepowymi, łączącymi się z i neutralizującymi TF lub kompleks FVIIa/TF lub oba (np. Carson, S.D. i in. (1985) Blood 66(1): 152-156; Tanaka, H. i in. (1985) Thromb. Res. 40(6):745-756; Kirchhofer, D. i in. (2000) Thromb. Haemost. 84(6); 1072-1081; Kirchhofer, D. i in. (2001) Biochemistry 40(3):675-682; Faelber, K. i in. (2001) J. Mol. Biol. 313:83-97 i opisy patentowe US 5505134, US 5986065 i US 6274142).
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciwzakrzepowe, które łączy się z kompleksem czynnik VIIa/czynnik tkankowy (FVIIa/TF) z większym powinowactwem niż z samym czynnikiem tkankowym (TF).
Przeciwciało łączy się z co najmniej 2-krotnie większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF, co określono stosując test mikrokalorymetryczny. Korzystnie przeciwciało łączy się z powinowactwem co najmniej 5-krotnie a nawet 10-krotnie większym z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF. Przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
Przeciwciało jest przeciwciałem jednołańcuchowym, dimerycznym Fab lub przeciwciałem IgG, korzystnie jest przeciwciałem jednołańcuchowym.
Przeciwciało według wynalazku przeciwciało nie współzawodniczy o wiązanie z TF z jednym lub więcej czynnikami krzepnięcia wybranymi z grupy obejmującej czynnik VII (FVII), czynnik IX (FIX) i czynnik X (FX). Korzystnie czynnikami krzepnię cia są czynnik FVII i czynnik FX.
Korzystnie przeciwciało jest glikozylowane. Korzystnie przeciwciało modyfikuje się dodając glikol polietylenowy. Do przeciwciała dołącza się grupy biotynowe w celu uzyskania wiązania streptawidyny.
Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna przeciwciała, która zawiera przeciwciało w terapeutycznie skutecznej ilości oraz rozczynnik dopuszczalny farmaceutycznie.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób zabezpieczania przed powstawaniem skrzepu, w którym przeciwciało według wynalazku stosuje się w terapeutycznie skutecznej ilości, przy czym przeciwciało hamuje powstawanie trombiny bez bezpośredniego wpływu na inne parametry krzepnięcia, takie jak aktywacja i agregacja płytek krwi.
Sposób stosuje się zapobiegawczo przed powstawaniem skrzepu w przypadku udaru niedokrwiennego, powikłań zakrzepowych w wyniku angioplastyki lub zabiegu operacyjnego na drobnych naczyniach krwionośnych.
Przeciwciało w terapeutycznie skutecznej ilości jest stosowane w ograniczaniu i leczeniu zakrzepicy żył głębokich (DVT), rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIG), ostrego zespołu wieńcowego lub raka z objawem koagulopatii.
Sposób regulowania odpowiedzi zapalnej u pacjenta, polega na tym, że stosuje się terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku.
Sposób stosuje się w przypadku odpowiedzi zapalnej wybranej z grupy obejmującej sepsę, przy przeszczepach skóry i żył oraz przy przeszczepach narządów.
Przeciwciało według wynalazku stosuje się do uzyskania powłoki nie wywołującej powstawania skrzepliny na powierzchni urządzenia medycznego, przy czym urządzenie medyczne wchodzi w kontakt z krwią.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw, który zawiera przeciwciało lub sekwencje DNA kodujące przeciwciało według wynalazku oraz kompozycja do terapii genowej zawierająca sekwencję
PL 210 582 B1 polinukleotydową SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:4, kodującą przeciwciało o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3, w połączeniu z wektorem do terapii genowej, w terapeutycznie skutecznej ilości.
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało przeciwzakrzepowe, a przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe łączące się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF, przy czym przeciwciało nie współzawodniczy o wiązanie z TF z czynnikiem FVII i czynnikiem FX. Przeciwciało to zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3.
Sekwencja polinukleotydowa według wynalazku kodująca określone przeciwciało zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:4.
Przeciwciało przeciwzakrzepowe według wynalazku jest nakierunkowane i łączy się z kompleksem FVIIa/TF w miejscu uszkodzenia i hamuje aktywację czynnika X („FX), zapobiegając zatem powstawaniu skrzepu i tym samym jest skuteczne jako środek przeciwzakrzepowy w leczeniu niektórych chorób w tym między innymi, sepsy, rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, udaru niedokrwiennego, zakrzepicy żył głębokich, ostrego zespołu wieńcowego, powikłań zakrzepowych w wyniku angioplastyki i koagulopatii w zaawansowanym stadium raka. Dalej, przeciwciało ma zastosowanie przy zabiegach operacyjnych na drobnych naczyniach krwionośnych, przeszczepach skóry i żył i przy przeszczepach narządowych.
Przeciwciała ukierunkowane na TF według wynalazku są skutecznymi środkami przeciwzakrzepowymi o ulepszonych właściwościach względem uprzednio opisanych przeciwciał przeciwko TF. W szczególności, przeciwciała według wynalazku łączą się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF i nie konkurują z FVII lub FX o wiązanie z TF.
Opis rysunków
Fig. 1. Aktywność wiążących TF jednołańcuchowych przeciwciał w teście hydrolizy peptydów sTF/FVIIa. Test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa przeprowadzono według opisu w przykładzie 4, stosując równowagową mieszaninę FVIIa (5 nM) i sTF (10 nM), na bazie powinowactwa FVIIa do sTF (KD(app)=~10 nM). Hydrolizę chromogennego substratu białkowego S2266 monitorowano. Wskazano końcowe stężenia ulegających ekspresji w komórkach bakteryjnych jednołańcuchowych przeciwciał i biał ek kontrolnych FVIIai (FVIIa inaktywowane przez peptyd chlorometyloketonowy, PPACK) i Mab#4504 (American Diagnostica).
Fig. 2. Wiązanie scFv(TF)3e10 z sTF zwiększa obserwowane powinowactwo sTF do FVIIa. Test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując 2 nM FVIIa z 800 nM ulegającemu ekspresji w komórkach bakteryjnych scFv(TF)3e10 i bez. Do próbek testowych miareczkowano sTF i określono szybkość rozrywania chromogennego substratu białkowego S2266. Obliczono obserwowane dla sTF stosując standardowe dopasowanie 4-parametryczne.
Fig. 3. Aktywność wiążących TF jednołańcuchowych przeciwciał w teście czasu protrombinowego (PT). Test PT przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując rekombinowaną ludzką tromboplastynę (Dade, Inc.) zawierającą ludzki TF o pełnej długości w pęcherzykach fosfolipidowych. Wskazano końcowe stężenia ulegających ekspresji w komórkach bakteryjnych jednołańcuchowych przeciwciał i białka kontrolnego FVIIai.
Fig. 4. Określenie obserwowanego powinowactwa wiązania scFv(TF)3e10 do sTF. Test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując 3 nM sTF i 2 nM FVIIa. Zastosowano sTF w stężeniu mniejszym niż wiązania do FVIIa. Dodano scFv(TF)3e10 ulegające ekspresji w komórkach bakteryjnych w zwiększających się stężeniach, a zwiększoną szybkość reakcji zastosowano w celu określenia obserwowanego KD tego przeciwciała względem sTF stosując standardowe dopasowanie 4-parametryczne. Powinowactwo scFv(TF)3e10 względem kompleksu sTF/FVIIa (KD(app) = 65 nM) jest większe niż powinowactwo scFv(TF)3e10 względem sTF zmierzone przy zastosowaniu BIAcore (KD(app)= 470 nM).
Fig. 5. Określenie powinowactwa wiązania scFv(TF)3e10 do TF i kompleksu FVIIa/TF. Test mikrokalorymetryczny przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując scFv(TF)3e10 ulegający ekspresji w komórkach CHO. Test ten wskazuje, że scFv(TF)3e10 ma ~20-krotnie większe powinowactwo względem kompleksu sTF/FVIIa („kompleks) niż względem sTF („niezwiązany TF).
Fig. 6. scFv(TF)3e10 w sposób zależny od dawki hamuje aktywację FX. Test aktywacji FX przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując ulegający ekspresji w komórkach bakteryjnych scFv(TF)3e10 w zwiększających się stężeniach, 250 nM FX i kompleks FVIIa/TF na powierzchni fosfolipidowej (10 pM FVIIa). IC50 oznacza dawkę wymaganą do uzyskania 50% hamowania maksymalnego.
PL 210 582 B1
Fig. 7. scFv(TF)3e10 w sposób niekompetycyjny hamuje aktywację FX przez kompleks FVIIa/TF. Test aktywacji FX przeprowadzono według opisu w przykładzie 4 stosując ulegający ekspresji w komórkach bakteryjnych scFv(TF)3e10, 25 nM do 400 nM FX i kompleks FVIIa/TF na powierzchni fosfolipidowej (10 pM FVIIa). Do próbki testowej miareczkowano scFv(TF)3e10 w zwiększających się stężeniach (0 nM, pusty kwadrat; 0,25 nM, pusty rąb; 0,74 nM, pusty trójkąt, 2,2 nM, puste kółko; 6,7 nM, wypełniony rąb, 20 nM, wypełniony trójkąt). Ten wykres Lineweaver'a-Burk'a (1/[S], w którym S (substrat) = czynnik X (μ m); w zależ noś ci od 1/v, gdzie v (szybkość) = mOD/minutę z hydrolizy S2222 przez FXa przez 5 minut) wskazuje, że scFv(TF)3e10 jest niekompetycyjnym inhibitorem względem substratu, FX. Wszystkie linie przecinały się na (lub w pobliżu) osi x jak przewidywano dla inhibitora niekompetycyjnego (w przypadku inhibitora kompetycyjnego wszystkie linie przecinałyby się na osi y).
Fig. 8. scFv(TF)3e10 jest skuteczne w modelu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego („DIG) in vivo. Na modelu zakrzepu z zatorami u szczura opisanym w przykładzie 6 oszacowano poziom ulegającego ekspresji w komórkach CHO przeciwciała scFV(TF)3e10 przeciwko TF przy czym (A) oznacza procent śmiertelność i (B) zachorowalność-śmiertelność. (A) W grupie otrzymującej rozczynnik, dawka TF dawała w rezultacie 60% śmiertelność (LD60). scFv(TF)3e10 w dawce 0,7 nmola/kg nie miało wpływu na śmiertelność, lecz w dawce 7,0 nmola/kg zmniejszało śmiertelność do < 40%. (B) W grupie otrzymującej rozczynnik, dawka TF in vivo dawała w rezultacie średnią zachorowalność-śmiertelność ocenioną na 2,6. scFv(TF)3e10 w dawce 0,7 nmola/kg nie miało wpływu na śmiertelność i mały lub żaden wpływ na wyczerpanie oddechowe, lecz w dawce 14 nmola/kg, średnia zachorowalność-śmiertelność spadła do ~1,5.
Terminy zdefiniowano następująco:
„rekombinowane białka lub polipeptydy należy rozumieć jako białka lub polipeptydy wytwarzane przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA, tj. produkowane przez komórki drobnoustrojów lub ssacze, transformowane przy zastosowaniu egzogennego konstruktu DNA kodującego pożądany polipeptyd. Białka lub polipeptydy ulegające ekspresji w większości hodowli bakteryjnych będą wolne od glikanu. Białka lub polipeptydy ulegające ekspresji w drożdżach będą glikozylowane inaczej niż te ulegające ekspresji w komórkach ssaka.
Termin białka lub polipeptydy „natywne oznacza białka lub polipeptydy pozyskane ze źródła występującego w przyrodzie. Termin „natywne przeciwciało będzie oznaczał występujące w przyrodzie przeciwciała i ich fragmenty.
Termin „sekwencja kodująca DNA oznacza sekwencję DNA, która po umieszczeniu pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych w komórce gospodarza ulega transkrypcji na mRNA i translacji na polipeptyd. Granice sekwencji kodują cej okreś lają kodon startowy na N-koń cu 5' i kodon końca translacji na C-końcu 3'. Sekwencja kodująca może obejmować sekwencje prokariotyczne, cDNA z mRNA eukariotycznego, sekwencje DNA genomowego z DNA eukariotycznego i syntetyczne sekwencje DNA. Sekwencja końca transkrypcji będzie zazwyczaj umieszczona 3' względem sekwencji kodującej.
Termin „sekwencja nukleotydowa oznacza heteropolimer zbudowany z deoksyrybonukleotydów (zasady adenina, guanina, tymina lub cytozyna). Sekwencje DNA kodujące przeciwciała według wynalazku można zbudować z syntetycznych pochodzących z cDNA fragmentów DNA i krótkich łączących sekwencji oligonukleotydowych uzyskując syntetyczny gen ulegający ekspresji w rekombinowanym wektorze ekspresyjnym. W rozważaniach dotyczących budowy konkretnych dwuniciowych cząsteczek DNA, sekwencje mogą być opisane zgodnie z konwencją, w której podaje się jedynie sekwencję w kierunku 5' do 3' wzdłuż nietranskrybowanej nici cDNA.
Termin „rekombinowany wektor ekspresyjny oznacza ulegający replikacji konstrukt DNA, zastosowany w celu amplifikacji lub ekspresji DNA kodującego przeciwciała według wynalazku. Wektor ekspresyjny zawiera kontrolujące sekwencje DNA i sekwencję kodującą. Kontrolujące sekwencje DNA obejmują sekwencje promotorowe, miejsca wiązania rybosomów, sygnały poliadenylacji, sekwencje końca transkrypcji, domeny regulujące w górę genu i sekwencje wzmacniające. Rekombinowane układy ekspresji, tak jak to tu zdefiniowano, będą prowadziły do ekspresji przeciwciał po indukcji elementów regulatorowych.
Termin „transformowane komórki gospodarza oznacza komórki transformowane i transfekowane przy zastosowaniu egzogennego DNA. Egzogenne DNA może, lecz nie musi, zostać wbudowane (związane kowalencyjnie) w DNA tworzące genom komórki. U Prokaryota i u drożdży np. egzogenne DNA może pozostawać w elemencie episomalnym, takim jak plazmid lub może być trwale wbudowane
PL 210 582 B1 w chromosomalne DNA. W przypadku komórek eukariotycznych, trwale transformowana komórka oznacza komórkę, w której egzogenne DNA zostało wbudowane w chromosom replikacyjny. O stałości tej świadczy zdolność linii komórek eukariotycznych lub klonów do wytworzenia populacji komórek potomnych zawierających egzogenne DNA.
Terminy „analog, „fragment, „pochodna i „wariant, w odniesieniu do przeciwciał według wynalazku oznaczają analogi, fragmenty, pochodne i warianty przeciwciał zachowujące w zasadzie taką samą funkcję lub aktywność biologiczną, jak opisano poniżej.
Termin „analog oznacza propolipeptyd, w tym sekwencję aminokwasów przeciwciała według wynalazku. Aktywne przeciwciało według wynalazku można odciąć od dodatkowych aminokwasów uzupełniających cząsteczkę proprzeciwciała przy zastosowaniu naturalnych, zachodzących in vivo procesów lub stosując metody dobrze znane w dziedzinie, takie jak rozerwanie enzymatyczne lub chemiczne.
Przykładowo, rekombinowany polipeptyd scFV(TF)3e10 (SEQ ID NO:1) ulega ekspresji w postaci 282-aminokwasowego propolipeptydu, który następnie zostaje poddany obróbce in vivo tak, że uwalnia się 264-aminokwasowy aktywny dojrzały polipeptyd.
Termin „fragment oznacza część przeciwciała według wynalazku zachowującą w zasadzie podobną aktywność funkcyjną, jak pokazano w ujawnionych tu testach in vitro.
Termin „pochodna oznacza wszystkie modyfikacje przeciwciała według wynalazku zachowujące w zasadzie ujawnione tu funkcje i zawierające dodatkową strukturę i dodatkowe funkcje np. przeciwciała z dołączoną grupą PEG o dłuższym okresie półtrwania i przeciwciała z dołączoną grupą biotynową. Pochodna obejmuje także glikozylowane przeciwciała związane atomem N lub O, które można wytworzyć wprowadzając miejsca N lub O-glikozylacji do sekwencji przeciwciał przy zastosowaniu standardowych technik rekombinacji DNA.
Każdy z terminów „w zasadzie podobna aktywność funkcyjna i „w zasadzie taka sama funkcja lub aktywność biologiczna oznacza, że stopień aktywności biologicznej stanowi około 30% do 100% lub więcej aktywności biologicznej polipeptydu, z którym są porównywane, gdy aktywność biologiczną każdego polipeptydu określa się przy zastosowaniu takiej samej procedury lub testu. Przykładowo, przeciwciało ma aktywność funkcyjną w zasadzie podobną do przeciwciała według przykładu 1 (SEQ ID NO:1) gdy w badaniu hydrolizy peptydów sTF/FVII i w testach aktywacji FX opisanych w przykł adzie 4, demonstruje zdolność do wią zania i neutralizacji kompleksu FVIIa/TF.
„Podobieństwo pomiędzy dwoma polipeptydami określa się porównując sekwencję aminokwasów i ich konserwowanych substytucji aminokwasowych jednego polipeptydu z sekwencją drugiego polipeptydu. Takie konserwatywne substytucje obejmują te opisane w The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 Dayhoff'a (1978) i przez Argos'a (1989) EMBO J. 8:779-785. Przykładowo, aminokwasy należące do jednej spośród następujących grup oznaczają zmiany konserwatywne:
-Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr:
-Cys, Ser, Tyr, Thr;
-Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
-Lys, Arg, His;
-Phe, Tyr, Trp, His; i
-Asp, Glu.
Stosowany termin „przeciwciało” obejmuje niezmienione cząsteczki immunoglobulin („Ig”), jak również ich fragmenty, takie jak Fab, F(ab')2 i Fv zdolne do wiązania epitopu wybranego białka docelowego np. rozpuszczalnego TF („sTF”). Typowo, do uzyskania epitopu niezbędna jest sekwencja co najmniej 6, 8, 10 lub 12 występujących po sobie aminokwasów. Jednakże, w przypadku epitopów obejmujących sekwencję nie występujących po sobie aminokwasów niezbędne może być więcej aminokwasów np. co najmniej 15, 25 lub 50.
Wszystkie inne stosowane tu terminy techniczne mają takie samo znaczenie jak stosowane powszechnie przez fachowców w dziedzinie, której dotyczy wynalazek.
Przeciwciała według wynalazku i ich otrzymywanie:
Przeciwciała przeciwzakrzepowe według wynalazku łączą się z większym powinowactwem z kompleksem czynnik VIIa/czynnik tkankowy („ FVIIa/TF”) niż z samym czynnikiem tkankowym („TF). W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciała według wynalazku łączą się z co najmniej 2-krotnie większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF, korzystniej z co najmniej 5-krotnie większym powinowactwem i jeszcze korzystniej z co najmniej 10-krotnie większym powinowactwem, co określono w teście mikrokalorymetrycznym.
PL 210 582 B1
W innym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, przeciwciała te nie współzawodniczą z jednym lub wię cej czynnikami krzepnię cia wybranymi z grupy obejmują cej czynniki VII („ FVII), IX („FIX) i X („FX) o wiązanie z TF. W bardziej korzystnym rozwiązaniu, przeciwciała według wynalazku nie współzawodniczą z czynnikiem FVII i z czynnikiem FX o wiązanie z TF. W najkorzystniejszym rozwiązaniu, przeciwciała według wynalazku łączą się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF i nie współzawodniczą o wiązanie z TF z czynnikiem FVII i z czynnikiem FX.
Ogólnie mówiąc, przy zastosowaniu testu immunochemicznego przeciwciało łączące się specyficznie z wybranym białkiem docelowym (np. kompleksem FVIIa/TF lub TF) powoduje, że sygnał jest co najmniej 5-, 10- lub 20-krotnie bardziej wykrywalny niż w przypadku innych białek. Korzystnie, przeciwciała łączące się specyficznie z wybranym białkiem docelowym w testach immunochemicznych nie wykrywają innych białek i mogą wytrącić białko docelowe z roztworu.
Wybrane białko docelowe można stosować do immunizacji ssaka, takiego jak mysz, szczur, królik, świnka morska, małpa lub człowiek w celu otrzymania przeciwciał poliklonalnych. Jeśli to pożądane, białko docelowe można sprzęgać z białkiem nośnikowym, takim jak albumina surowicy bydlęcej, tyroglobulina i keyhole limpet hemocyjanina. Zależnie od gatunku gospodarza, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej można stosować różne środki wspomagające. Takie środki wspomagające obejmują między innymi adiuwant Freund'a, żele mineralne (np. wodorotlenek glinu) i substancje powierzchniowo czynne (np. lizolecytyna, poliole (pluronic), polianiony, peptydy, emulsje olejowe, keyhole limpet hemocyjanin i dinitrofenol). Spośród środków wspomagających stosowanych u ludzi, szczególnie przydatne są BCG (bacilli Calmette-Guerin) i Cornybacterium parvum.
Przeciwciała monoklonalne łączące się specyficznie z wybranym białkiem docelowym można wytworzyć stosując dowolną technikę, w wyniku której otrzymuje się cząsteczki przeciwciała w kolejnych pokoleniach linii komórkowych w hodowli. Techniki te obejmują między innymi technikę hybrydomy, technikę hybrydomy ludzkich limfocytów B i technikę hybrydomy EBV (Kohler i in. (1985) Nature 256:495-497; Kozbor i in. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote i in. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; i Cote i in. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120).
Ponadto, można stosować techniki opracowane w celu otrzymania „przeciwciał chimerycznych, łączenia genów mysich przeciwciał z genami ludzkich przeciwciał w celu uzyskania cząsteczki o odpowiedniej specyficzności antygenowej i aktywności biologicznej, (Morrizon i in. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger i in. (1984) Nature 312:604-608; Takeda i in. (1985) Nature 314:452-454). Przeciwciała monoklonalne i inne można także „humanizować aby uniknąć u pacjenta rozwinięcia się odpowiedzi immunologicznej przeciwko stosowanemu terapeutycznie przeciwciału. Takie przeciwciała mogą mieć dostatecznie podobną sekwencję do sekwencji ludzkich przeciwciał aby zastosować je bezpośrednio lub może być niezbędna zmiana kilku kluczowych reszt. Różnice w sekwencjach pomiędzy sekwencjami przeciwciał gryzoni i ludzi można zmniejszyć do minimum zastępując reszty, które się różnią od reszt w sekwencjach przeciwciał człowieka przy zastosowaniu miejscowo ukierunkowanej mutagenezy konkretnych reszt lub poprzez wprowadzenie całych rejonów determinujących komplementarność. Alternatywnie, humanizowane przeciwciała można wytworzyć stosując metody rekombinacji, tak jak to opisano w brytyjskim opisie patentowym GB2188638B. Przeciwciała łączące się specyficznie z wybranym białkiem docelowym mogą zawierać miejsca wiążące antygen, które są częściowo lub całkowicie humanizowane, jak to ujawniono w US 5565332.
Alternatywnie, można przystosować techniki opisane do wytwarzania jednołańcuchowych przeciwciał wykorzystując metody znane w dziedzinie w celu wytworzenia jednołańcuchowych przeciwciał („scFv) łączących się specyficznie z wybranym białkiem docelowym. Przeciwciała o pokrewnej specyficzności, lecz o wyraźne idiotypowej kompozycji, można otrzymać posługując się łańcuchem wybranym z losowych kombinatorycznych bibliotek Ig (Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11120-11123).
Jednołańcuchowe przeciwciała można także skonstruować stosując metodę amplifikacji DNA, taką jak PCR, wykorzystując jako sondę cDNA hybrydomy (Thirion i in. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5:507-511). Jednołańcuchowe przeciwciała mogą być jedno- lub dwuspecyficzne i mogą być dwu lub czterowartościowe. Sposób skonstruowania czterowartościowych, dwuspecyficznych jednołańcuchowych przeciwciał przedstawili np. Coloma i Morrizon (1997) Natl. Biotechnol. 15:159-163. Sposób skonstruowania dwuwartościowych, dwuspecyficznych jednołańcuchowych przeciwciał przedstawili Mallendar i Voss (1994) J. Biol. Chem. 269:199-216.
Sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało jednołańcuchowe można skonstruować stosując ręczną lub zautomatyzowaną syntezę nukleotydową, klonowanie na konstrukt ekspresyjny
PL 210 582 B1 z wykorzystaniem standardowych technik rekombinowania DNA i wprowadzają c do komórki w celu uzyskania ekspresji sekwencji kodującej. Alternatywnie, jednołańcuchowe przeciwciała można wytworzyć bezpośrednio stosując np. technikę filamentous phage display (Verhaar i in. (1995) Int. J. Cancer 61:497-501; i Nicholls i in. (1993) J. Immunol. Meth. 165:81-91).
Przeciwciała łączące się specyficznie z wybranym białkiem docelowym można także wytwarzać poprzez indukowanie produkcji in vivo w populacji limfocytów lub przez przeszukiwanie bibliotek Ig lub zestawów silnie wiążących specyficznie reagentów takich jak przedstawione w literaturze (Orlandi i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter i in. (1991) Nature 34 9:293-299).
DNA kodujące przeciwciało według wynalazku można klonować w formie cDNA lub genomowej przy zastosowaniu dowolnej procedury klonowania znanej fachowcom w dziedzinie, np. Sambrook, J.F. i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
Gdy przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, z chwilą gdy zidentyfikuje się sekwencję DNA kodującą region Fv, który po ekspresji wskazuje specyficzną aktywność wiązania, przeciwciała zawierające ten region Fv można wytworzyć posługując się metodami znanymi fachowcom w dziedzinie. Przykładowo Chaudhary, V.K. i in. (1989) Nature 339(6223): 394-397; Batra, J.K. i in. (1990) J. Biol. Chem. 265(25): 15198-15202; Batra, J.K. i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21): 8545-8549; Chaudhary, V.K. i in. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(3):1066-1070 opisują wytwarzanie różnych białek przeciwciał jednołańcuchowych.
W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciałami wiążącymi TF według wynalazku są przeciwciała jednołańcuchowe, które wytwarza się przy zastosowaniu biblioteki fagowej. Region przeciwciała jednołańcuchowego wiążący epitop zbudowany jest z dwóch domen regionu zmiennego: jedna z łańcucha ciężkiego a druga z łańcucha lekkiego. W pierwszym etapie konstruowania biblioteki fagowej, zmienne geny (VH (z IgM) i VK + VL) klonuje się przy zastosowaniu techniki PCR ze spulowanego mRNA ze szpiku kostnego, węzła chłonnego i śledziony człowieka posługując się zestawem rodzin specyficznych starterów.
Uzyskane biblioteki pCITE-VH (3,8x109 elementów rodziny), pZ604-VK (1,6x109) i pZ604-VL (3,2x107) reprezentują stale występujące i duże zróżnicowanie genów V. Potem amplifikuje się geny VH z biblioteki pCITE-VH. Geny VK + VL amplifikuje się z bibliotek pZ604-VK i pZ604-VL stosują c technikę PCR przy zastosowaniu odwrotnego VH i sekwencji łączącej na 5'-końcu. Oczyszczone na żelu produkty PGR zawierające VH, VK, i VL łączy się dalej razem w celu uzyskania genu scFv. Gen scFv klonuje się na fagmid pZ603 i produkt do ligacji wprowadza się metodą elektroporacji do kompetentnych komórek E. coli TG1 w celu wytworzenia biblioteki fagowej scFv, HuPhabL3, z ilością indywidualnych transformantów 5,2x109 (Kay, B.K. i in. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. i in. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3):581-597; Sheets, M.D. i in. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11):6157-6162).
Z biblioteki fagowej scFv wybiera się faga wiążącego TF, amplifikuje a póź niej identyfikuje stosując panoramowania dobrze znane w dziedzinie techniki. Rozpuszczalny TF unieruchamia się w plastikowych probówkach a w celu ograniczenia niespecyficznego wiązania z plastikiem można stosować odtłuszczone mleko. Unieruchomiony w plastikowych probówkach sTF poddaje się działaniu populacji faga scFv, a niezwiązanego faga usuwa się poprzez obfite przemywanie. Faga scFv wiążącego TF wymywa się z probówek potem się amplifikuje zakażając komórki E. coli TG1 w roztworze. Tę procedurę panoramowania powtarza się trzy razy, a uzyskanego faga scFv wiążącego TF wydziela się transformując komórki TG1. Transformanty eksprymujące przeciwciała wiążące TF identyfikuje się stosując standardową technikę ELISA z wykorzystaniem sTF unieruchomionego na plastikowych 96-studzienkowych płytkach. Sekwencjonuje się DNA insertów jednołańcuchowego przeciwciała transformantów dających pozytywny wynik w teście ELISA. W oparciu o technikę sekwencjonowania DNA zidentyfikowano sześć wyjątkowych jednołańcuchowych przeciwciał, scFv(TF)2c1, scFv(TF) 2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 i scFv(TF)3h2 uzyskano ich ekspresję, oczyszczono z E. coli i scharakteryzowano tak jak to opisano w przykł adzie 5.
Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał według wynalazku:
Istnieje kilka sposobów uzyskania ekspresji in vitro rekombinowanych przeciwciał według wynalazku, w tym u E. coli, w bakulowirusie, drożdżach, komórkach ssaczych lub innych układach ekspresji. Sposoby ekspresji sklonowanych genów u bakterii są dobrze znane. Aby uzyskać wysoki poziom ekspresji sklonowanego genu w układzie prokariotycznym niezbędne jest skonstruowanie wektorów ekspresyjnych zawierających, co najmniej, silny promotor kierujący zakończeniem transkrypcji mRNA. Przykładami regionów regulatorowych odpowiednich do tego celu są region promotora i operatora
PL 210 582 B1 genu beta-glukozydazy E. coli, szlaku biosyntezy tryptofanu E. coli lub lewy promotor faga Lambda. Do DNA wektorów, którymi transformowano E. coli przydatne jest wprowadzenie wybranych markerów. Przykłady takich markerów obejmują geny warunkujące oporność na ampicylinę, tetracyklinę lub chloramfenicol.
Można wybrać spośród wielu bardziej zaawansowanych układów komórki eukariotycznej przydatnych przy ekspresji przeciwciał według wynalazku i ich analogów, fragmentów, pochodnych lub wariantów. Przykładami ssaczych linii komórkowych są między innymi RPMI 7932, VERO i komórki HeLa, linie komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), linie komórek WI38, BHK, COS-7, C127 lub MDCK. Korzystną ssaczą linią komórkową jest CHL-1. Gdy stosuje się CHL-1 wówczas eukariotycznym znacznikiem z wyboru jest hygromycyna. Komórki CHL-1 wywodzą się z komórek czerniaka RPMI 7032, łatwo dostępnej ludzkiej linii komórkowej. Linię komórek CHL-1 zdeponowano w ATCC 18 stycznia 1987 zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego i przypisano numer CRL 9446. Komórki odpowiednie do zastosowania według tego wynalazku można uzyskać z ATCC. Przykładowe linie komórkowe obejmują komórki Spodoptera frugiperda i Bombyx mori.
W ukł adzie prokariotycznym E. coli, modyfikacja potranslacyjna taka jak glikozylacja nie jest możliwa. Ponadto, białka o złożonych układach disiarczkowych po ekspresji w E. coli często ulegają złemu złożeniu. W układzie prokariotycznym, eksprymowane białko występuje na terenie cytoplazmy komórkowej w formie nierozpuszczalnej tak zwanych ciał inkluzyjnych, znajdowanych we frakcji rozpuszczalnej po zlizowaniu komórki lub kierowane jest do przestrzeni peryplazmatycznej po zaopatrzeniu w odpowiednie sekrecyjne sekwencje sygnałowe. Jeśli eksprymowane białko występuje w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych, zazwyczaj niezbędne jest rozpuszczenie i późniejsze ponowne sfałdowanie ciał inkluzyjnych.
Fachowcy w dziedzinie znają wiele prokariotycznych wektorów ekspresyjnych, takich jak dostępne w handlu pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) i pGEMl (Promega Biotech, Madizon, WI, USA).
Promotory powszechnie stosowane w rekombinowanych układach ekspresji mikroorganizmów obejmują układ promotorowy beta-laktamazy (penicylazy) i laktozy (Chang, A.C. i in. (1978) Nature 275(5681):617-624; Goeddel, D.V. i in. (1979) Nature 281(5732):544-548), układ promotorowy dla syntezy tryptofanu (trp) (Goeddel, D.V. i in. (1980) Nucl. Acids Res. 8(18):4057-4074) i promotor tac (Maniatis, T. i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Inny przydatny bakteryjny układ ekspresyjny wykorzystuje promotor faga lambda pL i indukowany wysoką temperaturą represor clts857 (Bernard, H.U. i in. (1979) Gene 5(1):59-76; Love, CA. i in. (1996) Gene 176 (1-2) :49-53). Rekombinowane przeciwciała mogą także ulegać ekspresji w drożdżach takich jak Saccharomyces cerevisiae. Zazwyczaj daje to możliwość różnych modyfikacji potranslacyjnych. Eksprymowane przeciwciało może zostać wydzielone do pożywki hodowlanej gdzie nie występuje wiele innych białek, co ułatwia oczyszczanie. Drożdżowe wektory ekspresyjne przeciwciał według tego wynalazku zawierają pewne wymagane elementy. Elementy wektora na ogół pochodzą z drożdży i bakterii co umożliwia namnażanie plazmidu w nich obu. Elementy bakteryjne obejmują sekwencję rozpoczęcia replikacji i znacznik umożliwiający selekcję. Elementy drożdżowe obejmują sekwencję rozpoczęcia replikacji (ARS), znacznik umożliwiający selekcję, promotor i terminator transkrypcji.
Odpowiednie promotory w drożdżowych wektorach ekspresji obejmują promotory genu TRPl, genu ADH1 lub ADHII, genu kwaśnej fosfatazy (PH03 lub PH05), genu izocytochromu lub promotory zaangażowane szlak glikolizy, takie jak promotor enolazy, dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GADPH), kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK), heksokinazy, kinazy pirogronianowej, izomerazy triozofosforanowej i izomerazy fosfoglukozowej (Hitzeman, R.A. i in. (1980) J. Biol. Chem. 255(24): 12073-12080; Hess, B. i in. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149-167; i Holland, M.J. i Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17 (23):4900-4907).
Dostępne w handlu wektory drożdżowe obejmują pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC Nr 67255) i YpGX265GAL4 (ATCC Nr 67233). W celu uzyskania ekspresji rekombinowanych przeciwciał wedł ug wynalazku można stosować ssacze linie komórkowe obejmujące między innymi COS-7, komórki L, C127, 3T3, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO i HEK293. Rekombinowane białka wytwarzane w komórkach ssaczych normalnie się rozpuszczają i są glikozylowane oraz posiadają autentyczne N-końce. Ssacze wektory ekspresyjne mogą zawierać nieulegające transkrypcji elementy, takie jak sekwencja rozpoczęcia replikacji, promotor i enhancer oraz nieulegające
PL 210 582 B1 translacji sekwencje 5' lub 3', takie jak miejsca wiązania rybosomów, miejsce poliadenylacji, miejsce akceptorowe i miejsce łączenia oraz sekwencje zakończenia transkrypcji. Zazwyczaj w ssaczych wektorach ekspresji stosuje się promotory takie jak np. promotory wirusowe takie jak promotory Polioma, Adenowirus, HTLV, małpiego wirusa 40 (SV 40) i ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV).
Zależnie od wybranego układu ekspresji i gospodarza, homogeniczne rekombinowane przeciwciało można otrzymać stosując różne kombinacje stosowanej typowo przy oczyszczaniu białka chromatografii. Obejmują one: chromatografię powinowactwa immunologicznego, chromatografię w fazach odwróconych, chromatografię kationowymienną, chromatografię anionowymienną, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię żelową i HPLC. Jeśli przy danym układzie ekspresji dochodzi do wydzielenia przeciwciała do pożywki hodowlanej, wówczas białko można oczyścić bezpośrednio z pożywki. Jeśli przeciwciało nie jest wydzielane, wówczas wydziela się je z lizatów komórkowych. Komórkę można rozbić przy zastosowaniu dowolnej typowej metody, w tym cykli zamrażania i roztapiania, sonikowania, zniszczenia mechanicznego lub przy wykorzystaniu ś rodków lizują cych komórkę.
W celu uzyskania ekspresji bakteryjnej jednołańcuchowych przeciwciał według wynalazku zastosowano konstrukt plazmidu na bazie pCANTABS (Pharmacia). Przykładowo, plazmidem zawierającym przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 jest pZ612/3e10 i koduje sekwencja przeciwciała jednołańcuchowego po której występuje sekwencja znacznikowa e-tag, którą można wykorzystać do oczyszczania białka. Sekwencja aminokwasów przeciwciała scFV(TF)3e10 odpowiada SEQ ID NO:1 (przykład 1) a sekwencja DNA kodującego scFv(TF)3e10 odpowiada SEQ ID NO:2.
W celu uzyskania ekspresji ssaczej jednołańcuchowych przeciwciał według wynalazku zastosowano konstrukt plazmidu na bazie pTHR525 (US 5827824). Przykładowo, startery zaprojektowano tak, aby w bakteryjnym plazmidzie ekspresyjnym uzyskać fragment DNA obejmujący sekwencję aminokwasów pro-scFv(TF)3e10, w tym N-końcową sekwencję sygnałową i C-końcową sekwencję znacznikową e-tag. W celu uzyskania fragmentu DNA wprowadzonego do ssaczego plazmidu ekspresyjnego zawierającego gen oporności na ampicylinę i hygromycynę i markery selekcyjne DHFR przeprowadzono PCR. Ekspresję jednołańcuchowych przeciwciał według wynalazku pobudzał promotor MPSV LTR.
W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, komórki CHO DXB11 transformowano ssaczymi konstruktami ekspresyjnymi. Wybrano trwałe populacje stosując 400 μg/ml hygromycyny B w podłożu HAMS/F12. Poziom ekspresji wynosił około 500 μg/l. W celu zwiększenia poziomu ekspresji wybrano populację stosując 100 nM metotreksat w podłożu alfa MEM. Przybliżony poziom ekspresji w tej populacji wynosił 5 mg/l.
Przeciwciała według wynalazku można oczyścić stosując metody dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, przeciwciała można oczyścić wykorzystując powinowactwo przepuszczając przez kolumnę, z którą związany jest TF. Przeciwciała związane z TF można potem wymywać z kolumny stosując bufor o dużym stężeniu soli.
Opisane jednołańcuchowe przeciwciała zawierają na C-końcu białka sekwencję znacznikową e-tag. Kolumny o powinowactwie względem e-tag zakupiono od American/Pharmacia Biotech. Podłoża hodowli komórkowych przesączono przez filtr 0,22 μm i wprowadzano na kolumnę e-tag 5 ml z szybkością 2 ml/minutę. Kolumnę przemyto 0,2 M buforem fosforanowym 0,05% NaN3, pH 7,0 po czym eluat zebrano do probówek zawierających 0,1 objętości 1M buforu Tris, pH 8,2 w celu zobojętnienia buforu do wymywania. Alternatywnie, przesączone podłoże hodowlane wprowadzono na kolumnę z białkiem A. W tym przypadku, kolumnę przemyto 50 mM kwasem cytrynowym, 300 mM NaCl, pH 6,5 i eluowano takim samym buforem przy pH 3,0.
W obu przypadkach, oczyszczone próbki wprowadzono później na kolumnę Sephadex 200 w celu oddzielenia formy monomerycznej przeciwciała od formy dimerycznej.
Selekcja przeciwciał według wynalazku:
Wytworzone, eksprymowane i oczyszczone przeciwciała, w celu identyfikacji przeciwciał według wynalazku, można dalej charakteryzować posługując się BIAcore, testem z wykorzystaniem zależnego od sTF czynnika VIIa (test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa), testem aktywacji FX i testem PT opisanym w przykładzie 4.
W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, wybiera się przeciwciała scFv wiążące TF, które łączą się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF stosując test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa. W teście tym, oczekuje się, że przeciwciała przeciwko TF, które łączą się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z TF będą zwiększać KD(app). Fig. 2 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 spowodowało ~5-krotne zwiększenie KD(app).
PL 210 582 B1
Do pomiaru powinowactwa przeciwciał przeciwko TF względem kompleksu FVIIa/TF w porównaniu z samym TF stosuje się test mikrokalorymetryczny.
Fig. 5 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 ma wiązania z kompleksem FVIIa/TF i niezwiązanym TF odpowiednio 600 nM i 33 nM, co odpowiada ~20-krotnie większemu powinowactwo względem kompleksu FVIIa/TF w porównaniu z samym TF. Przeciwciała według wynalazku wykazują co najmniej 2-krotnie, korzystnie co najmniej 5-krotnie i korzystniej co najmniej 10-krotnie większe powinowactwo względem kompleksu FVIIa/TF niż względem TF.
Przeciwciała scFv wiążące TF niewspółzawodniczące z FVII o wiązanie z TF wybiera się stosując test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa. W teście tym oczekuje się, że przeciwciała przeciwko TF współzawodniczące z FVIIa o wiązanie z TF będą hamowały hydrolizę chromogennego substratu S2266.
Fig. 1 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 nie hamuje a właściwie zwiększa aktywność FVIIa.
Przeciwciała scFv wiążące TF hamujące aktywację FX wybiera się stosując test PT i test aktywacji FX. W teście PT, oczekuje się, że przeciwciała przeciwko TF przedłużające PT będą hamować aktywację FX. Fig. 3 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 przedłużało PT, wskazując, że przeciwciało to hamuje aktywację FX. W teście aktywacji FX, oczekuje się, że przeciwciała przeciwko TF hamujące aktywność FXa będą hamowały hydrolizę chromogennego substratu S2222. Fig. 6 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFV(TF)3e10 hamuje aktywność FXa.
Przeciwciała scFv wiążące TF niewspółzawodniczące z FX o wiązanie z TF wybiera się stosując test aktywacji FX.
W teście tym, oczekuje się, ż e przeciwciała przeciwko TF, które nie konkurują z FX będą hamowały aktywację FX niezależnie od zastosowanego stężenia FX. Fig. 7 świadczy o tym, że przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 będzie hamować aktywność FXa w sposób niezależny od stężenia FX.
W korzystnym rozwiązaniu wedł ug wynalazku, zidentyfikowano przeciwciał o jednoł a ńcuchowe (scFv(TF)3e10) o pojedynczym miejscu wiążącym VH/VL względem TF. Sekwencję aminokwasów scFv(TF)3e10 pokazano w przykładzie 1 i odpowiada ona SEQ ID NO:1. Sekwencja DNA kodująca scFv(TF)3e10 odpowiada SEQ ID NO: 2.
Analogi, fragmenty, pochodne i warianty przeciwciał według wynalazku:
Analog, fragment, pochodna lub wariant przeciwciał według wynalazku może być: (i) analogiem, fragmentem, pochodną lub wariantem przeciwciała, w którym jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest podstawiona przez konserwowaną lub niekonserwowaną resztę aminokwasową (korzystnie konserwowaną resztę aminokwasową), a taka podstawiona reszta aminokwasowa może lecz nie musi być kodowana przez kod genetyczny; lub (ii) analogiem, fragmentem, pochodną lub wariantem przeciwciała, w którym jedna lub więcej reszt aminokwasowych obejmuje grupę podstawnikową lub (iii) analogiem, fragmentem, pochodną lub wariantem przeciwciała, w przypadku których dojrzałe przeciwciało skondensowane jest z innym związkiem, takim jak związek wydłużający okres półtrwania przeciwciała (np. glikol polietylenowy) lub (iv) analogiem, fragmentem, pochodną lub wariantem przeciwciała, w przypadku których dodatkowe aminokwasy skondensowano z dojrzałym przeciwciałem, jak np. sekwencja liderowa lub sekrecyjna lub sekwencja, którą stosuje się do oczyszczania dojrzałego przeciwciała. Uważa się, że skonstruowanie takich analogów, fragmentów, pochodnych i wariantów przy wykorzystaniu przedstawionych tu wskazówek będzie się mieścić w zakresie umiejętności fachowców w dziedzinie.
Korzystnie, pochodne według wynalazku będą zawierać konserwatywne substytucje aminokwasowe (określone poniżej) jednej lub więcej przewidywanych, korzystnie niedecydujących reszt aminokwasowych. „Niedecydująca reszta aminokwasowa oznacza resztę, którą w sekwencji białka typu dzikiego można zmienić bez zmiany aktywności biologicznej, podczas gdy „decydująca reszta aminokwasowa jest niezbędna dla zachowania aktywności biologicznej. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe oznacza podstawienie, w którym resztę aminokwasową zastępuje się resztą aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych o podobnych łańcuchach bocznych zdefiniowano w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), polarnymi łańcuchami bocznymi bez ładunku (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), z łańcuchami bocznymi rozgałęzionymi na węglu beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i z aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna,
PL 210 582 B1 fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Substytucje niekonserwatywne nie będą dotyczyły konserwowanych reszt aminokwasowych lub ani reszt aminokwasowych wewnątrz konserwowanej domeny białkowej, o ile tych substytucji nie przeprowadza się w celu wyselekcjonowania wariantów przeciwciał, jak opisano poniżej. Fragmenty lub części o aktywności biologicznej obejmują fragmenty polipeptydowe odpowiednie do zastosowania jako lekarstwo, jako odczynnik doświadczalny itp. Fragmenty obejmują peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe dostateczne podobne lub pochodzące od sekwencji aminokwasowych przeciwciała według wynalazku i wykazujące co najmniej jedną aktywność tego peptydu, lecz które zawierają mniej aminokwasów niż ujawnione tu polipeptydy o pełnej długości.
Ponadto, korzystne pochodne według wynalazku obejmują dojrzałe przeciwciała skondensowane z innym związkiem takim jak związek wydłużający okres półtrwania polipeptydu i/lub zmniejszający potencjalną immunogenność polipeptydu (np. glikol polietylenowy, „PEG). PEG można stosować w celu uzyskania rozpuszczalnoś ci w wodzie, odpowiedniego wymiaru, zmniejszenia szybkoś ci klirensu nerkowego i zmniejszenia immunogenności względem przeciwciała, US 6214966. W przypadku dołączania grup PEG, fuzję przeciwciało z PEG można przeprowadzić przy zastosowaniu dowolnych metod znanych fachowcom w dziedzinie. Przykładowo, grupy PEG można dołączyć wywołując na początku w przeciwciele mutację w miejscu zajmowanym przez cysteinę, a dalej przeprowadzając specyficzną dla miejsca derywatyzację z zastosowaniem PEG-maleimidu. Cysteinę można dodać do peptydów na C-końcu, np. Tsutsumi i in. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15):8548-8553. Inna modyfikacja, której można poddać przeciwciała obejmuje dołączanie grup biotynowych. W pewnych przypadkach, może okazać się przydatne posiadanie przeciwciała z dołączonymi grupami biotynowymi tak, aby mogło ono łatwo reagować z streptawidyną. Sposoby dołączania grup biotynowych do białek są dobrze znane w dziedzinie. Ponadto, do sekwencji przeciwciał można wprowadzić miejsca N- lub O-glikozylacji tak, aby in vivo mogło dojść do potranslacyjnej glikozylacji przeciwciał związanej z atomem N lub O.
Warianty przeciwciał według wynalazku obejmują polipeptydy o sekwencji aminokwasów dostatecznie podobnej do sekwencji aminokwasów oryginalnych przeciwciał. Termin „dostatecznie podobny oznacza, że pierwsza sekwencja aminokwasów zawiera wystarczającą lub minimalną liczbę identycznych lub równoważnych reszt aminokwasowych w stosunku do drugiej sekwencji aminokwasowej tak, że pierwsza i druga sekwencja aminokwasowa mają taką samą domenę strukturalną i/lub taką samą aktywność funkcyjną. Przykładowo, zgodnie z tą definicją dostatecznie podobne są sekwencje aminokwasowe zawierające taką samą domenę strukturalną tj. co najmniej identyczną w około 45%, korzystnie w około 75% do 98%. Korzystnie, warianty będą dostatecznie podobne do sekwencji aminokwasów korzystnych przeciwciał według wynalazku. Warianty obejmują warianty przeciwciał kodowane przez polinukleotyd, który w surowych warunkach hybrydyzuje z polinukleotydem według wynalazku lub jego dopełnieniem. Takie warianty na ogół zachowują aktywność funkcyjną przeciwciał według wynalazku. Dla oszacowania i późniejszej selekcji w celu wytworzenia zróżnicowanej populacji fragmentów można stosować biblioteki fragmentów polinukleotydów. Przykładowo, bibliotekę fragmentów można otrzymać przez potraktowanie uzyskanego techniką PCR dwuniciowego fragmentu polinukleotydu nukleazą w warunkach, w których do cięcia dochodzi tylko około raz na cząsteczkę, denaturowanie dwuniciowego DNA, denaturowanie DNA z wytworzeniem dwuniciowego DNA, które może zawierać pary sensowne/antysensowne z różnych pociętych produktów, usuwanie części jednoniciowych z uformowanych ponownie dupleksów poprzez potraktowanie nukleazą S1 i ligację uzyskanej biblioteki fragmentów z wektorem ekspresyjnym. Tą metodą, można uzyskać bibliotekę ekspresyjną kodującą N-końcowe i wewnętrzne fragmenty różnych wymiarów przeciwciał według wynalazku.
Warianty obejmują przeciwciała różniące się w sekwencji aminokwasów ze względu na mutagenezę. Przykładowo, mutagenezę można przeprowadzić według dobrze znanych w dziedzinie technik rekombinowania DNA modyfikując domeny VL i VH lekkich i ciężkich łańcuchów Ig uzyskując warianty o zwię kszonym powinowactwie wią zania z kompleksem FVIIa/TF w porównaniu z niezwiązanym TF. Szczególnie korzystne warianty obejmują przeciwciała z modyfikacjami w regionach determinujących komplementarność domen VL i VH.
Warianty obejmują także przeciwciała różniące się w sekwencji aminokwasów z uwagi na insercję lub delecję reszt aminokwasowych w wyniku mutagenezy. Przykładowo, mutagenezę można przeprowadzić według dobrze znanych w dziedzinie technik rekombinowania DNA wprowadzając lub usuwając aminokwasy w N-końcowych lub C-końcowych częściach domen VH lub VL lekkich i ciężkich łańcuchów Ig w celu uzyskania wariantów zachowujących w zasadzie podobną aktywność funkcyjną. Szczególnie korzystne warianty obejmują jednołańcuchowe przeciwciała z insercjami lub delecjami
PL 210 582 B1 reszt aminokwasowych w sekwencji łączącej VH-VL pomiędzy domenami i VH i VL. Sekwencja łącząca VH-VL w jednołańcuchowym przeciwciele przedstawiona w przykładzie 1 ma długość 5 reszt aminokwasowych. Oczywiste będzie, że można stosować inne krótkie sekwencje łączące o od 0 do 20 aminokwasach, przy czym przeciwciało zachowa w zasadzie podobną aktywność funkcyjną. Celem modyfikacji istniejącej sekwencji łączącej VH-VL może być zwiększenie trwałości dimerycznej formy jednołańcuchowego przeciwciała.
W jednym rozwią zaniu, zróż nicowaną bibliotekę wariantów wytwarza się przez kombinatoryczną mutagenezę na poziomie kwasu nukleinowego, a kodowane są one przez zróżnicowaną biblioteką genową. Zróżnicowaną bibliotekę wariantów można wytworzyć np. przez ligację enzymatyczną mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów z sekwencjami genów, jako takich tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji aminokwasowych wariantów ulega ekspresji w postaci oddzielnych polipeptydów lub alternatywnie jako zestaw większych białek fuzyjnych (np. fagowych) zawierających w sobie zestaw sekwencji. Istnieje wiele róż nych metod, które moż na stosować w celu uzyskania bibliotek potencjalnych wariantów ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Syntezę chemiczną zdegenerowanej sekwencji genu można przeprowadzić w automatycznym syntetyzatorze DNA, a dalej ligować syntetyczny gen z odpowiednim wektorem ekspresyjnym. Zastosowanie zdegenerowanego zestawu genów umożliwia zgromadzenie w jednej mieszaninie wszystkich sekwencji kodujących pożądanego zestawu potencjalnych sekwencji wariantów. W dziedzinie znane są metody syntetyzowania zdegenerowanych oligonukleotydów (np. Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i in. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i in. (1984b) Science 198:1056; Ike i in. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).
W dziedzinie znanych jest kilka technik klasyfikowania produktów genowych kombinatorycznych bibliotek otrzymanych w wyniku mutacji punktowych lub cięcia i klasyfikowania bibliotek cDNA pod kątem produktów genowych o wybranej właściwości. Takie techniki nadają się do szybkiej klasyfikacji bibliotek genowych, uzyskanych poprzez kombinatoryczną mutagenezę przeciwciał, pod kątem aktywności wiązania TF lub kompleksu FVIIa/TF lub aktywności hamowania aktywacji FX. Najczęściej stosowane techniki, umożliwiające bardzo wydajną analizę w przypadku klasyfikowania dużych bibliotek genowych typowo obejmują klonowanie biblioteki genowej na replikujące się wektory ekspresyjne, transformowanie odpowiednich komórek uzyskaną biblioteką wektorów i eksprymowanie kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia oddzielanie wektora kodującego gen, którego produkt wykryto. W celu zidentyfikowania pożądanych wariantów w połączeniu z testami klasyfikującymi można stosować technikę typu recursive ensemble mutagenesis (REM) zwiększającą częstotliwość mutantów funkcyjnych w bibliotekach.
W przykł adzie 1 przedstawiono sekwencję aminokwasów jednego wiążącego TF jednoł a ń cuchowego przeciwciała, scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1) i opisano sekwencję łączącą VH-VL oraz domeny VH i VL. Warianty wykazujące aktywność wiązania TF lub kompleksu FVIIa/TF lub hamowania aktywacji FX można zidentyfikować poprzez klasyfikowanie kombinatorycznych bibliotek mutantów np. przez insercję, przecięcie lub mutacje punktowe przeciwciał według wynalazku stosując hydrolizę peptydów sTF/FVII lub testy aktywacji FX opisane w przykładzie 4. Przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciała według przykładu 1 i 3 (SEQ ID NO:1 i 3), jak również przeciwciała wykazujące nieistotne zmiany w sekwencji. Termin „wariant z nieistotną zmianą będzie oznaczał wariant o dowolnej sekwencji, podstawieniu lub delecji zachowujący w zasadzie co najmniej jedną funkcję biologiczną przeciwciał według wynalazku np. zdolność do hamowania aktywacji FX. Te równoważniki funkcyjne mogą korzystnie obejmować przeciwciała o co najmniej około 90% identyczności z domenami regionów VL lub VH jednołańcuchowego przeciwciała SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3, a korzystniej co najmniej o 95% identycznoś ci z domenami regionów VL lub VH jednoł a ń cuchowego przeciwciał a SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3, a jeszcze korzystniej z co najmniej 97% identycznością z domenami regionów VL lub VH jednołańcuchowego przeciwciała SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3 i obejmują także części takiego przeciwciała o w zasadzie takiej samej aktywności biologicznej. Jednakże, opis wynalazku dotyczy również dowolnego wariantu przeciwciała z nieistotną zmianą w sekwencji aminokwasów w stosunku do przeciwciała o sekwencji SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3 o równoważnej funkcji, jak opisano poniżej.
Kompozycje farmaceutyczne:
Przedmiotem wynalazku są także kompozycje farmaceutyczne, które można stosować u pacjenta w celu uzyskania efektu terapeutycznego. Można wytworzyć kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do stosowania przez połączenie przeciwciała według wynalazku o pożądanym stopniu czystości i fizjologicznie dopuszczalnych nośników w farmaceutycznie skutecznej ilości.
PL 210 582 B1
Przeciwciała według wynalazku można stosować w kompozycjach farmaceutycznych, do podawania dożylnego lub podskórnego lub dooponowego. Zatem, opisane przeciwciała korzystnie będzie się łączyć z dopuszczalnym jałowym nośnikiem farmaceutycznym, takim jak 5% dekstroza, mleczanowy roztwór Ringer'a, normalna solanka, jałowa woda lub dowolny inny dostępny w handlu zbuforowany roztwór fizjologiczny zaprojektowany do wlewu dożylnego. Zrozumiałe będzie, że dobór roztworu nośnika, dawkowania i sposobu podawania kompozycji będzie się zmieniać w zależności od pacjenta i konkretnego przypadku klinicznego w zależności od standardowych metod leczenia.
Zgodnie ze sposobami według wynalazku, te kompozycje farmaceutyczne można stosować w iloś ciach skutecznych do hamowania konsekwencji patologicznych nadmiernej produkcji trombiny u pacjenta.
Przeciwciało można podawać w postaci zastrzyku w bolusie, poprzez stały wlew dożylny lub przy zastosowaniu kombinacji tych dwóch metod. Alternatywnie lub ponadto, przeciwciało w połączeniu z odpowiednimi rozczynnikami może przejść do układu krążenia z mięśni. Leczenie systemowe z użyciem przeciwciała można monitorować określając częściowy czas tromboplastyny po aktywacji (PT) w pobieranych seryjnie próbkach krwi pacjenta. Obserwowany w tym teście czas krzepnięcia wydłuża się gdy w układzie krążenia uzyskuje się wystarczający poziom przeciwciała.
Rekombinowane przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są przydatne do podawania pozajelitowego, naskórnego, dożylnego, doustnego lub miejscowego. Kompozycje farmaceutyczne można podawać w rozmaitych jednostkowych postaciach dawkowania zależnie od sposobu podawania. Przykładowo, jednostkowe postacie dawkowania można podawać w postaci między innymi tabletek, kapsułek, proszku, roztworów i emulsji.
Rekombinowane przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku szczególnie przydatne są do podawania dożylnego. Kompozycje typowo zawierać będą roztwór jednołańcuchowego przeciwciała rozpuszczony w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Można stosować rozmaite wodne nośniki np. buforowaną solankę itp. Roztwory te są jałowe i na ogół pozbawione niepożądanych substancji. Kompozycje mo ż na jał owić przy zastosowaniu typowych dobrze znanych technik.
Fachowiec w dziedzinie może łatwo określić typową kompozycję farmaceutyczną do podawania dożylnego. Podawane ilości będą wyraźnie zależeć od specyficznego białka i jego mocy oraz profilu farmakokinetycznego. Obecnie stosowane sposoby wytwarzania kompozycji do podawania pozajelitowego będą znane lub oczywiste dla fachowców w dziedzinie a opisano je bardziej szczegółowo w takich publikacjach jak Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 15, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980).
Kompozycje zawierające przeciwciała według wynalazku lub ich koktajl (tj. wraz z innymi białkami) można stosować w ramach terapii leczniczej. W przypadku innych zastosowań terapeutycznych, pacjentowi cierpiącemu na zaburzenie lub chorobę związaną z krzepliwością krwi podaje się kompozycje w ilości wystarczającej do zwalczenia lub co najmniej częściowego zahamowania krwawienia. Ilość odpowiednią do uzyskania tego efektu określa się jako „terapeutycznie skuteczną. Ilość skuteczna dla takiego zastosowania będzie zależała od stanu zaawansowania choroby i ogólnego stanu zdrowia pacjenta.
Kompozycje można podawać raz lub wielokrotnie zależnie od wymaganego i tolerowanego przez pacjenta dawkowania i częstotliwości. W każdym przypadku, kompozycja powinna zapewniać ilość białka według wynalazku wystarczającą do skutecznego leczenia pacjenta.
Przeciwciała według wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje, stosuje się w terapeutycznie skutecznej ilości, która będzie się zmieniać zależnie od rozmaitych czynników obejmujących aktywność specyficznego stosowanego przeciwciała, trwałość metaboliczną i długość działania przeciwciała, wiek, masę ciała, ogólny stan zdrowia, płeć i dietę pacjenta, tryb i czasokres podawania, szybkość wydalania, kombinację leków, stan zaawansowania poszczególnych stanów chorobowych i leczonego pacjenta. Na ogół, dzienna terapeutycznie skuteczna ilość przeciwciała według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej kompozycji wynosi od około 0,14 mg do około 14,3 mg/kg masy ciała na dzień a korzystnie, od około 0,7 mg do około 10 mg/kg masy ciała na dzień, a najkorzystniej, od około 1,4 mg do około 7,2 mg/kg masy ciała na dzień. Przykładowo, w przypadku osoby o masie do 70 kg, zakres dawkowania przeciwciała według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej kompozycji wynosiłby od około 10 mg do około 1,0 grama dziennie, korzystnie od około 50 mg do około 700 mg dziennie a najkorzystniej od około 100 mg do około 500 mg dziennie.
PL 210 582 B1
Terapia komórkowa i genowa:
Zgodnie z wynalazkiem przeciwciało według wynalazku można stosować eksprymując takie przeciwciało in vivo przy zastosowaniu metody zwanej „terapią komórkową. Zatem np. komórki przy zastosowaniu inżynierii molekularnej można zaopatrzyć w polinukleotyd (DNA lub RNA) kodujący przeciwciało ex vivo podawać potem pacjentowi leczonemu przy zastosowaniu przeciwciał. Takie metody są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, przy wykorzystaniu znanych w dziedzinie metod inżynierii molekularnej można wprowadzić do komórek cząsteczkę retrowirusową zawierającą RNA kodujące przeciwciało według wynalazku.
Zgodnie z wynalazkiem można także stosować przeciwciało według wynalazku eksprymując takie przeciwciało in vivo posługując się metodą zwaną „terapią genową. Zatem np. przy zastosowaniu inżynierii molekularnej wirusa można zaopatrzyć w polinukleotyd (DNA lub RNA) kodujący przeciwciało i potem wprowadzić go do organizmu pacjenta poddawanego terapii z zastosowaniem przeciwciał. Takie metody są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, przy zastosowaniu znanych w dziedzinie metod inżynierii molekularnej można uzyskać rekombinowane adenowirusy zawierające DNA kodujące przeciwciało według wynalazku.
Dzięki miejscowemu podawaniu przeciwzakrzepowych przeciwciał według wynalazku przy zastosowaniu terapii komórkowej lub genowej można dostarczyć środek terapeutyczny do obszaru docelowego, komórek śródbłonka wyściełających naczynia krwionośne.
Wynalazek dotyczy metod terapii komórkowej i genowej zarówno in vitro jak i in vivo. Znanych jest kilka metod przenoszenia potencjalnie terapeutycznych genów do określonych populacji komórkowych, np. Mulligan (1993) Science 260:926-931. Metody te obejmują:
1) Bezpośrednie przeniesienie genu, np. Wolff i in. (1990) Science 247: 1465-1468;
2) Przeniesienie DNA z wykorzystaniem liposomów, np. Caplen i in. (1995) Nature Med. 3:39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao i Huang (1991J Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285;
3) Przeniesienie DNA z wykorzystaniem retrowirusa, np. Kay i in. (1993) Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813.
4) Przeniesienie DNA z wykorzystaniem wirusa DNA. Takie wirusy DNA obejmują adenowirusy (korzystnie wektory na bazie Ad2 lub Ad5), wirusy opryszczki (korzystnie wektory na bazie wirusa Herpes simplex) i parwowirusy (korzystnie wektory na bazie „defektywnych lub nieautonomicznych parwowirusów, korzystniej wektory na bazie wirusów związanych z adenowirusami, najkorzystniej wektory na bazie AAV-2), np. Ali i in. (1994) Gene Therapy 1:367-384, US 4797368, US 5139941.
Wybór konkretnego układu wektorowego do przenoszenia danego genu będzie zależał od rozmaitych czynników. Jednym ważnym czynnikiem są własności docelowej populacji komórkowej. Chociaż wektory retrowirusowe często badano i wykorzystywano w licznych zastosowaniach terapii genowej, wektory te nie nadają się na ogół do zakażania niedzielących się komórek. Ponadto, retrowirusy mogą być onkogenne. Jednakże, ostatnie opracowania w dziedzinie wektorów lentiwirusowych mogą pomóc ominąć niektóre z tych ograniczeń, Naldini i in. (1996) Science 272:263-267.
Retrowirusy, z których można uzyskać wymienione retrowirusowe wektory plazmidowe mogą obejmować między innymi takie jak mysi wirus białaczki Moloney'a, wirus martwicy śledziony, retrowirusy, takie jak wirus mięsaka Rous'a, wirus mięsaka Harvey'a, ptasi wirus białaczki, wirus białaczki gibbona, ludzki wirus niedoboru odporności, adenowirus, wirus mięsaka mieloproliferacyjnego i wirus guza gruczołu mlecznego. W jednym rozwiązaniu, retrowirusowy wektor plazmidowy wywodzi się z mysiego wirusa białaczki Moloney'a.
Zaletą adenowirusów jest to, że można je stosować u wielu gatunków, mogą infekować komórki w fazie spoczynkowej lub ostatecznie zróż nicowane, takie jak neurony lub hepatocyty i w zasadzie są nieonkogenne. Patrz np. Ali i in. (1994), powyżej, str. 367. Adenowirusy nie wbudowują się do genomu gospodarza. Ponieważ występują poza chromosomami, ryzyko mutacji spowodowanej przez insercję jest znacznie mniejsze, Ali i in. (1994), str. 373.
Wirusy związane z adenowirusami wykazują podobne zalety jak wektory na bazie adenowirusów.
Jednakże, AAV wykazują miejscową specyficzność integracji z ludzkim chromosomem 19 (Ali i in. (1994), str.377).
W korzystnym rozwiązaniu, DNA kodują ce przeciwciał a wedł ug wynalazku stosuje się w terapii komórkowej lub genowej zaburzeń obejmujących, między innymi, zakrzepicę żył głębokich, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, ostry zespół wieńcowy lub raka z objawem koagulopatii.
PL 210 582 B1
Według tego rozwiązania, terapię komórkową lub genową z zastosowaniem DNA kodującego przeciwciała według wynalazku stosuje się u wymagającego tego pacjenta, równocześnie lub bezpośrednio po diagnozie.
Fachowiec będzie świadomy, że zgodnie z tym rozwiązaniem można stosować każdy nadający się dla terapii genowej wektor zawierający DNA kodujące przeciwciało według wynalazku lub DNA kodujące analogi, fragmenty, pochodne lub warianty przeciwciała według wynalazku. Znane są techniki konstruowania takiego wektora, Anderson, W.F. (1998) Nature 392:25-30; Verma I.M. i Somia, N. (1998) Nature 389:239-242. Wektor zawierający DNA przeciwciała można wprowadzić do miejsca docelowego posługując się znanymi technikami.
Wektor dla terapii komórkowej lub genowej zawiera jeden lub więcej promotorów. Odpowiednie promotory, które można stosować obejmują między innymi retrowirusowy LTR; promotor SV40; i promotor ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV) opisany przez Miller'a i in. (1989) Biotechniques 7(9):980-990 lub dowolny inny promotor (np. promotory komórkowe, takie jak eukariotyczne promotory komórkowe obejmujące, między innymi, promotory histonowe, pol III i β-aktyny). Inne promotory wirusowe, które można stosować obejmują między innymi promotory adenowirusowe, promotory kinazy tymidynowej (TK) i promotory parwowirusa B19. Dobór odpowiedniego promotora, w oparciu o zawarte tu wskazówki, będzie oczywisty dla fachowców w dziedzinie.
Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca przeciwciało według wynalazku kontrolowana jest przez odpowiedni promotor. Odpowiednie promotory, które można stosować obejmują między innymi promotory adenowirusowe takie jak główny późny promotor adenowirusowy lub promotory heterologiczne takie jak promotor wirusa cytomegalii (CMV); promotor wirusa syncytium nabłonka układu oddechowego (RSV); promotory indukowane, takie jak promotor MMT, promotor metalotioneiny; promotory białek szoku termicznego; promotor albumin; promotor ApoAl; promotory globiny ludzkiej; promotory wirusowej kinazy tymidynowej takie jak promotor kinazy tymidynowej Herpes simplex; retrowirusowe LTR (w tym opisany zmodyfikowany retrowirusowy LTR); promotor β-aktyny i promotor ludzkiego hormonu wzrostu.
Do transdukcji zwykłych linii komórkowych stosuje się retrowirusowy wektor plazmidowy uzyskując linie komórek producentów. Przykłady zwykłych komórek, które można transfekować obejmują między innymi PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+#-86, GP+envAm12 i DAN opisane przez Millera (1990) w Human Gene Therapy 1:5-14. Przy zastosowaniu wektora można transdukować zwykłe komórki posługując się dowolnymi metodami znanymi w dziedzinie. Takie metody obejmują między innymi elektroporację, zastosowanie liposomów i wytrącanie przy użyciu CaPO4. W jednym alternatywnym przypadku, retrowirusowy wektor plazmidowy można umieścić w liposomie lub sprzęgać z lipidem i później podać gospodarzowi. Linia komórek producentów wytwarza zakaźne cząstki wektora retrowirusowego zawierające sekwencję (sekwencje) kwasu nukleinowego kodującą polipeptydy. Takie cząstki wektora retrowirusowego można stosować, do transdukcji komórek eukariotycznych in vitro lub in vivo. W transdukowanych komórkach eukariotycznych będzie zachodzić ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego kodującej (sekwencji kodujących) polipeptyd. Komórki eukariotyczne, które można transdukować obejmują między innymi embrionalne komórki pnia, embrionalne komórki nowotworowe, jak również komórki pnia układu krwiotwórczego, hepatocyty, fibroblasty, mioblasty, keratynocyty, komórki śródbłonka i komórki nabłonka oskrzelowego.
Innym podejściem do terapii genowej jest „terapia transkariotyczna”, w której komórki pacjenta poddaje się ex vivo zabiegom wywołującym indukcję nieczynnych genów chromosomowych w celu uzyskania potrzebnego białka po ponownym wprowadzeniu ich do organizmu pacjenta. W terapii transkariotycznej zakłada się, że u pacjenta występują prawidłowe komplementarne geny konieczne dla aktywacji. W terapii transkariotycznej wprowadza się promotor lub inną egzogenną sekwencję regulatorową zdolną do aktywacji tworzonych genów, do chromosomalnego DNA komórek pacjenta ex vivo, hoduje i selekcjonuje aktywne komórki produkujące białko po czym wprowadza się ponownie aktywowane komórki do organizmu pacjenta z nadzieją, że nie zostaną odrzucone. Dalej komórki ze „zaktywowanym genem przez dłuższy czas wytwarzają potrzebne białko, możliwe, że przez całe życie pacjenta. W opisach patentowych US 5641670 i US 5733761 ujawniono szczegóły tej koncepcji.
Zestawy:
Kolejnym przedmiotem wynalazku są zestawy przeznaczone do celów badawczych lub diagnostycznych. Zestawy składają się typowo z jednego lub więcej pojemników zawierających przeciwciała według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu, zestawy składają się z pojemników zawierających jednołańcuchowe przeciwciała w formie odpowiedniej dla utworzenia pochodnej przy użyciu drugiej
PL 210 582 B1 cząsteczki, w bardziej korzystnym rozwiązaniu zestawy składają się z pojemników zawierających przeciwciało SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO: 3.
W innym rozwiązaniu, zestawy mogą zawierać sekwencje DNA kodują ce przeciwciała według wynalazku. Korzystnie sekwencje DNA kodujące te przeciwciała zawarte są w plazmidzie odpowiednim dla transfekcji komórek gospodarza i ekspresji przez nie tego białka. Plazmid może zawierać promotor (często promotor indukowany) regulujący ekspresję DNA w komórce gospodarzu. Plazmid może także zawierać odpowiednie miejsca restrykcji ułatwiające wprowadzenie innych sekwencji DNA do plazmidu w celu wytworzenia różnych przeciwciał. Plazmidy mogą zawierać także liczne inne elementy ułatwiające klonowanie i ekspresję kodowanych białek. Takie elementy są dobrze znane fachowcom w dziedzinie i obejmują np. markery umożliwiające selekcję, kodony początkowe, kodony końcowe itp. W bardziej korzystnym rozwiązaniu zestawy składają się z pojemników zawierających sekwencje DNA SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:4.
Wskazania terapeutyczne:
Choroby, w których etiologii znaczącą rolę odgrywa powstawanie skrzepu, obejmują zawał serca, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, zakrzepicę żył głębokich, zator płucny, udar niedokrwienny, wstrząs septyczny, ostry zespół zaburzeń oddechowych, niestabilną dusznicę bolesną i inne schorzenia okluzyjne tętnic i żył. Przeciwciała według wynalazku są przydatne we wszystkich tych chorobach jak również w innych, w których powstawanie skrzepu jest patologią. Inne stany patologiczne, w przypadku których przydatne może być zastosowanie przeciwciała według wynalazku obejmują raka z koagulopatią i stan zapalny. Przeciwciała mogą także znaleźć zastosowanie w przeszczepach skóry i żył oraz w przeszczepach narządowych. Termin „przydatne oznacza, że przeciwciała są przydatne w leczeniu lub zapobieganiu chorobie lub zapobieganiu jej rozwoju do stanu poważniejszego. Przeciwciała według wynalazku są także bezpiecznymi i skutecznymi środkami przeciwzakrzepowymi np. w przypadku pacjentów z bioprotezami takimi jak zastawki serca. Przeciwciała te mogą zastąpić heparynę i warfarynę w leczeniu np. zatoru płucnego lub ostrego zawału serca. Przeciwciała według wynalazku mogą także znaleźć zastosowanie przy powlekaniu urządzeń medycznych, w których przypadku istotną sprawą jest tworzenie się skrzepów.
Testy:
Dostępnych jest wiele testów laboratoryjnych określających in vitro aktywność przeciwzakrzepową przeciwciała według wynalazku. Działanie przeciwzakrzepowe przeciwciała można określić stosując testy czasu krzepnięcia osocza, takie jak czas częściowej tromboplastyny po aktywacji („APTT), czas krzepnięcia trombiny („TCT) i/lub czas protrombinowy („PT).
Testy te dają rozróżnienie pomiędzy różnymi mechanizmami hamowania krzepnięcia i związane są z aktywacją białka C. Wydłużenie czasu krzepnięcia w którymkolwiek z testów świadczy o tym, że cząsteczka może hamować krzepnięcie w osoczu.
Powyższe testy stosuje się w celu identyfikacji przeciwciał o aktywności przeciwzakrzepowej zdolnych do wiązania TF zarówno w oczyszczonych układach jak i w środowisku osocza. W celu oceny innych aktywności przeciwciał według wynalazku stosuje się inne testy, takie jak hamowanie katalizowanego przez trombinę powstawania fibryny z fibrynogenu (Jakubowski, H.V. i in. (1986) J. Biol. Chem. 261(8): 3876-3882), hamowanie aktywacji czynnika V przez trombinę (Esmon, C.T. i in. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14) :7944-7947), przyśpieszone hamowanie trombiny przez antytrombinę III i kofaktor II heparyny (Esmon, N.L. i in. (1983) J. Biol. Chem. 258(20): 12238-12242), hamowanie aktywacji czynnika XIII przez trombinę (Polgar, J. i in. (1987) Thromb. Haemost. 58(1):140), hamowanie inaktywacji białka S przez trombinę (Thompson, E.A. i Salem, H.H. (1986) J. Clin. Inv. 78(1): 13-17) i hamowanie aktywacji i agregacji pł ytek krwi przez trombinę (Esmon, N.L i in. (1983), jak powyż ej).
Testy opisane szczegółowo w przykładzie 4, stosuje się do określenia mocy in vitro lub powinowactwa wiązania przeciwciał według wynalazku in vitro: 1) test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa; 2) test aktywacji czynnika X; 3) test PT i 4) test mikrokalorymetryczny.
Oczywiście zrozumiałe będzie, że sposobu przeprowadzenia procedur według wynalazku nie ogranicza zastosowanie odnośnych konkretnych buforów, pożywek, odczynników, komórek, warunków hodowli itp., lecz należy odczytywać to tak, że włącza się wszystkie pokrewne materiały, które fachowiec w dziedzinie uzna za potrzebne lub przydatne w konkretnym przypadku, którego dotyczy to omówienie. Przykładowo, często możliwe jest zastąpienie jednego układu buforów lub podłoża hodowlanego innym a mimo to uzyskanie podobnych, jeśli nie identycznych wyników. Fachowcy w dziedzinie będą dysponowali wystarczającą wiedzą na temat takich układów i metodologii tak, aby bez
PL 210 582 B1 niepotrzebnych doświadczeń dokonać takich zmian, które nadawałyby się optymalnie dla ich celów, posługując się ujawnionymi tu metodami i procedurami.
Jako wskazówkę ułatwiającą praktyczne zastosowanie wynalazku zamieszczono opis wynalazku opierając się na następujących nieograniczających przykładach tak, że fachowcy w dziedzinie będą w stanie zastosować inne i odmienne metody niż te ujawnione.
W przykł adach, wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza bez korekcji a wszystkie części i procenty podano wagowo, jeśli nie wskazano tego inaczej.
P r z y k ł a d 1
Konstrukt jednołańcuchowego przeciwciała scFv(TF)3e10 przeciwko TF (-18) mlgvlvlgalalaglvfpemaq VNLRESGGTLVQPGGSLRLSCAAS GFSFTDAWMSWVRQAPGKELEWVS SISGSGGSTYYAGSVKGRFTISRD NSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RVLSLTDYYWYGMDVWGQGTLVTV SAGGGGSGAPNFMLTQPHSVSASP GKTVTISCTRSSGSVASYYVQWYQ qrpgsspttviyednhrpsgvpdr fsgsidtssnsasltisglktede ADYYCQSYDSNNLVVFGGGTKLTV LGAAAGAPVPYPDPLEPRAA (264)
Jednołańcuchowe przeciwciało scFv(TF)3e10 przeciwko TF (SEQ ID NO:1) składa się z peptydu sygnałowego (-18 do -1), domeny VH (1 do 126), sekwencji łączącej YH-YL (127 do 131), domeny VL (132 do 246) i sekwencji znacznikowej e-tag (247 do 264). Sekwencja DNA scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:2) koduje sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:1.
P r z y k ł a d 2
Konstrukt jednołańcuchowego przeciwciała scFv(TF)3e10Δ przeciwko TFA
| (-18) | M | L | G | V | L | V | L | G | A | L | A | L | A | G | L | V | F | P | E | M | A | Q | |
| V | N | L | R | E | s | G | G | T | L | V | Q | P | G | G | S | L | R | L | S | C | A | A | S |
| G | F | S | F | T | D | A | W | M | S | W | V | R | e | A | P | G | K | E | L | E | W | V | S |
| S | I | S | G | S | G | G | s | T | Y | Y | A | G | s | V | K | G | R | F | T | I | S | R | D |
| N | s | K | N | T | L | Y | L | Q | M | N | S | L | R | A | E | D | T | A | V | Y | Y | C | A |
| R | V | L | S | L | T | D | Y | Y | W | Y | G | M | D | V | W | G | Q | G | T | L | V | T | V |
| S | A | G | G | G | G | S | N | F | M | L | T | Q | P | H | S | V | s | A | s | P | G | K | T |
| V | T | I | S | C | T | R | S | S | G | S | V | A | S | Y | Y | V | Q | W | Y | Q | Q | R | P |
| G | S | s | P | T | T | V | I | Y | E | D | N | H | R | P | S | G | V | P | D | R | F | S | G |
| S | I | D | T | s | s | N | s | A | S | L | T | I | S | G | I» | K | T | E | D | E | A | D | Y |
| Y | c | Q | s | Y | D | S | N | N | I» | V | V | F | G | G | G | T | X | L | T | V | L | G | A |
| A | A | G | A | P | V | P | Y | P | D | P | I* | E | P | R | A | A | (243) | ||||||
| Jednołańcuchowe przeciwciało | scFv(TF) 3e10Δ przeciwko | TF | (SEQ | ID | NO: | 3) | składa się |
z peptydu sygnałowego (-18 do -1), domeny VH (1 do 126), sekwencji łączącej VH-VL (127 do 131) i domeny VL (132 do 243). scFv(TF) 3e10Δ różni się od scFv(TF)3e10 delecją 3 aminokwasów (GAP)
PL 210 582 B1 na N-końcu domeny VL i delecją C-końcowej sekwencji znacznikowej e-tag. Sekwencja DNA scFv(TF)3e10A (SEQ ID NO:4) koduje sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3.
P r z y k ł a d 3
Ekspresja przeciwciał przeciwko TF w komórkach bakteryjnych i ssaczych
Z faga wiążącego TF zidentyfikowano sześć różnych jednołańcuchowych przeciwciał scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 i scFv(TF)3h2, uzyskano ich podwyższoną ekspresję w E. coli i oczyszczono stosując kolumnę o powinowactwie do e-tag, jak opisano. Określono powinowactwa 6 oczyszczonych przeciwciał względem sTF posługując się BIAcore, po czym przeciwciała te scharakteryzowano posługując się testami hydrolizy peptydów sTF/FVIIa, aktywacji FX, PT i testem mikrokalorymetrycznym opisanymi w przykładzie 4, a ich wyniki przedstawiono w przykładzie 5.
Przeciwciało scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO: 1) ulega ekspresji również w komórkach CHO. Plazmid ekspresyjny zawierał sekwencję DNA kodującą scFV(TF)3e10 (SEQ ID NO:2) oraz oba markery selekcyjne hygromycynę B i DHFR. W celu wybrania populacji pierwszą selekcję przeprowadzono w 400 μ g/ml hygromycynie. Uzyskaną populację selekcjonowano potem stosują c 100 nM metotreksat. Podczas tej selekcji, z populacji wybiera się komórki, w których doszło do powielenia kopii regionu DNA zawierającego znacznik selekcyjny oraz gen docelowy. W wyniku tej selekcji uzyskano wzrost poziomu ekspresji od około 0,3 mg/l do około 6 mg/l.
P r z y k ł a d 4
Testy in vitro mocy i powinowactwa wiązania
1. Test hydrolizy peptydów sTF/FVIIa
Zasadę działania tego testu przedstawiono poniżej. Kompleks sTF/FVIIa hydrolizuje wiązanie amidowe p-nitroanilidu substratu tripeptydowego.
Uwolniony produkt chromofor, p-nitroanilid, monitoruje się przy 405 nm a stężenie produktu utworzonego w jednostce czasu oblicza się posługując się molowym współczynnikiem ekstynkcji 9920 M-1cm-1.
Wartości IC50 (C) określono dopasowując wielkości początkowe do 4-parametrycznego równania: Y = (A-D)/(1 + (x/C)AB)+D
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA H-D-Val-Leu-Arg + p-NA
Substrat S2266 Tripeptyd Chromofor
Odczynniki i roztwory:
1. Bufor testowy: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5mM CaCl2, 0,1% BSA, pH 7,5
2. Ludzki FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): 10 x roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 20 nM roztwór w buforze testowym.
3. Rozpuszczalny TF (Berlex): 10 x roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 30 nM roztwór w buforze testowym.
4. Chromogenny substrat S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Roztwór podstawowy: 10 mM w H2O, przechowywać w temperaturze 4°C. 2,5 x roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 2,5 mM roztwór w buforze testowym.
5. Przeciwciało: Przed użyciem przygotować rozcieńczenia 2,5 x w buforze testowym.
Warunki testowe:
Testy przeprowadzono w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenia składników były takie jak następuje:
sTF 3 nM
Przeciwciało stężenie zmieniało się od 1000 do 0,625 nM
FVIIa 2 nM
S2266 1 mM
Procedura testowa:
1. Do każdej studzienki dodano pipetą 0,1 ml 2,5x AB (lub bufor kontrolny).
2. Dodano 0,025 ml 10x sTF i inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu.
3. Dodano 0,025 ml 10x FVIIa, inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu.
4. Dodano 0,1 ml 2,5x substratu S2266, natychmiast przeniesiono płytkę do czytnika płytek i określano kinetykę enzymu przy 405 nm w odstępach 10-sekundowych przez 15 minut.
PL 210 582 B1
Test ten można stosować do pomiaru obserwowanego wiązania przeciwciał według wynalazku z sTF lub kompleksem FVIIa/TF i w celu określenia czy przeciwciała według wynalazku współzawodniczą z FVII o wiązanie z TF.
2. Test aktywacji czynnika X
Zasadę działania tego testu przedstawiono poniżej. FVIla inkubuje się z pęcherzykami zawierającymi rekombinowany ludzki TF uzyskując kompleks proteazy zdolny do aktywacji substratu, FX. Kompleks ten powstaje w obecności (lub bez) przeciwciała w różnych stężeniach, potem wprowadza się substrat FX i mieszaninę reakcyjną pozostawia się do chwili uzyskania produktu, aktywnej proteazy FXa, która może hydrolizować wiązanie amidowe p-nitroanilidu chromogennego substratu S2222. Uwolniony produkt chromofor, p-nitroanilid, monitoruje się przy 405 nm, a stężenie produktu utworzonego w jednostce czasu oblicza się posługując się molowym współczynnikiem ekstynkcji 9920 M-1cm-1. Wartości IC50 (C) określono dopasowując wielkości początkowe do 4-parametrycznego równania:
Y = (A-D)/(1 + (x/C)AB)+D
Bz-lle-Glu-Gly-Arg-p-NA Bz-lle-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA
S2222 Substrat Chromofor
Odczynniki i roztwory:
1. Bufor testowy: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1% BSA, pH 7,5
2. Ludzki FVIIa (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4 x roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 100 pM roztwór w buforze testowym.
3. Rekombinowany ludzki TF (odtworzony w naszym laboratorium, zakupiony od Innovin, Dade): roztwór roboczy - przed użyciem przygotować rozcieńczenie 1:480 w buforze testowym.
4. Ludzki czynnik X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 x roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 1000 nM roztwór w buforze testowym.
5. Chromogenny substrat S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):
Roztwór podstawowy: 6 mM w H2O, przechowywać w temperaturze 4°C.
Roztwór roboczy - przed użyciem przygotować 0,78 mM roztwór w 3,57 mM EDTA (do zatrzymania reakcji), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5.
6. Przeciwciało:
Przed użyciem przygotować 4x rozcieńczenia w buforze testowym.
Warunki testowe:
Testy przeprowadzono w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenia składników były takie jak następuje:
Pęcherzyki rTF ¼ rozcieńczenia 1:480
Przeciwciało stężenie zmieniało się od 1000 do 0,625 nM
FVIIa 25 pM
FX 250 nM
S2222 0,546 mM
Procedura testowa:
1. Do każdej studzienki dodano pipetą 0,015 ml 4xAB (lub bufor kontrolny)
2. Dodano 0,015 ml 4x pęcherzyków rTF.
3. Dodano 0,015 ml 4x FVIIa, inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu.
4. Dodano 0,015 ml 4x FX, inkubowano 5 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu.
5. Dodano 0,14 ml substratu S2222, natychmiast przeniesiono płytkę do czytnika płytek i określano kinetykę enzymu przy 405 nm w odstępach 10-sekundowych przez 15 minut.
Test ten można stosować w celu określenia czy przeciwciała według wynalazku hamują aktywację FX przez kompleks FVIIa/TF i w celu określenia czy przeciwciała według wynalazku współzawodniczą z FX o wiązanie z kompleksem FVIIa/TF.
3. Test czasu protrombinowego (PT)
W przypadku wzorcowej reakcji PT, do kuwetki z 20 μΐ tromboplastyny IS (Dade) i 90 μΐ 25 mM CaCl2 90 μΐ dodaje się przeciwciało w odpowiednim stężeniu lub PBS. Mieszaninę inkubuje się przez 1 minutę w temperaturze 37°C, potem dodaje się 100 μl osocza cytrynianowego (Helena Laboratories). Alternatywnie, do 100 μl rekombinowanej ludzkiej tromboplastyny (Orto Recombiplastin) dodaje się odpowiednią objętość stężonego przeciwciała, a około 2 minuty później, dodaje się 100 μI odtworzonego ludzkiego osocza. Czas krzepnięcia dla każdego oddzielnego testu określa się biorąc średnią
PL 210 582 B1 z dwóch pomiarów uzyskanych przy zastosowaniu koagulometru Electra 900C Coagulometer (Hemoliance) i średnie wartości z testów równoległych (n = 3 lub 4). Dla każdego inhibitora wykreślono krzywe odpowiedzi na dawkę po czym do obliczenia stężenia (w nM) koniecznego dla dwukrotnego wydłużenia czasu krzepnięcia posłużono się analizą regresji.
Test ten można stosować w celu oceny wpływu przeciwciał według wynalazku na zewnętrzny szlak krzepnięcia krwi. Określa się ilość przeciwciała wymaganego dla dwukrotnego przedłużenia PT i aby ocenić względną moc przeciwciał według wynalazku można ją porównać z innymi środkami przeciwzakrzepowymi.
4. Test mikrokalorymetryczny
Test mikrokalorymetryczny (izotermiczna kalorymetria miareczkowa) stosuje się do pomiaru powinowactwa wiązania (Kq) przeciwciał według wynalazku z samym TF lub z kompleksem FVIIa/TF. Test ten przeprowadzono stosując urządzenie MicroCal VP-ITC. Kompleks FVIIa/TF przygotowano dodając do sTF 2,3-krotny nadmiar molowy FVIIai. Dla potwierdzenia czy sTF w próbce testowej przeszedł całkowicie w formę kompleksu stosuje się chromatografię wykluczania. W celu określenia powinowactwa przeciwciała względem kompleksu, do komory mikrokalorymetru dodaje się 1,2 pm kompleksu VIIa/TF a do strzykawki dodaje się 65 μm przeciwciała. W celu określenia powinowactwa przeciwciała względem samego sTF do komory dodaje się 10 Lim sTF a do strzykawki dodaje się 141 μm przeciwciała. Analizę danych przeprowadzono stosując oprogramowanie MicroCal Origin. Dane dopasowano do pojedynczego miejsca wiążącego.
P r z y k ł a d 5
Charakterystyka in vitro przeciwciał przeciwko TF według wynalazku
Z kompletnej biblioteki fagowej ludzkich jednołańcuchowych przeciwciał wydzielono sześć różnych przeciwciał wiążących TF: scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(tF)3e10 i scFv(TF)3h2. Powinowactwa sprzeciwciał wiążących sTF ulegających ekspresji w E. coli, określone przy zastosowaniu BIAcore, wynosiły pomiędzy 35 i 470 nM. W celu określenia czy przeciwciała te blokują powstawanie aktywnego kompleksu VIIa/TF zastosowano opisany w przykładzie 4 test hydrolizy peptydów sTF/VII.
W teście tym, wiązanie VIla z sTF przyśpiesza rozrywanie chromogennego substratu białkowego S2266 >20-krotnie. Przeciwciała hamujące wiązanie FVIIa z TF blokują to przyśpieszenie. Pięć jednołańcuchowych przeciwciał, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 i scFv(TF)3h2, hamowało hydrolizę S2266, co sugeruje że hamują one wiązanie FVIIa z sTF (Fig. 1). Odwrotnie, przeciwciało jednołańcuchowe scFv(TF)3e10 nie hamuje hydrolizy peptydów sTF/VIIa a właściwie, przeciwciało to przyśpiesza hydrolizę S2266 co sugeruje, że scFv(TF)3e10 zwiększa powinowactwo sTF względem FVIIa. W teście hydrolizy peptydów sTF/VIIa, przeciwciało scFv(TF)3e10 zwiększyło powinowactwo FVIIa względem sTF, zmniejszyło obserwowaną KD 5-krotnie (Fig. 2). scFv(TF)3e10 nie miało wpływu na szybkość hydrolizy przy FVIIa bez sTF, wskazując na to, że przeciwciało nie oddziaływuje z samym FVIIa. KD przeciwciała scFv(TF)3e10 względem sTF, zmierzona przy zastosowaniu testu hydrolizy peptydów sTF/FVIIa, wynosiła 65,4 nM (Fig. 4). W celu porównania powinowactwa scFv(TF)3e10 do TF w porównaniu z kompleksem FVIIa/TF posłużono się testem mikrokalorymetrycznym. Doświadczenia te ujawniły, że eksprymowane przez komórki ssacze scFv(TF)3e10 wykazuje ~20-krotne większe powinowactwo względem kompleksu TF/FVIIa w porównaniu z niezwiązanym sTF (33 nM względem 600 nM, Fig. 5).
Posługując się testem aktywacji FX i testem PT porównano sześć ulegających ekspresji u bakterii jednołańcuchowych przeciwciał wiążących TF. Żadne spośród pięciu przeciwciał opóźniających hydrolizę S2266 przy zastosowaniu kompleksu sTF/FVIIa, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 i scFv(TF)3h2, nie wydłużało PT bardziej niż bufor kontrolny PBS (Fig. 3). Odwrotnie, chociaż przeciwciało scFv(TF)3e10 nie wykazywało najwyższego powinowactwa określonego przy zastosowaniu BIAcore i zwiększało powinowactwo FVIIa względem sTF, to scFv(TF)3e10 było jedynym przeciwciałem w grupie, które hamowało aktywację FX (Fig. 6 i dane nie przedstawione) i wydłużało czas krzepnięcia w teście PT (Fig. 3). IC50 przeciwciała scFv(TF)3e10 (dimer) dla hamowania w teście aktywacji FX wynosiło 0,44 nM (Fig. 6). Na koniec, w celu określenia czy przeciwciało scFv(TF)3e10 współzawodniczy z FX o wiązanie z kompleksem FVIIa/TF posłużono się testem aktywacji FX. scFv(TF)3e10 w sposób zależny od dawki hamowało aktywację FX przy takiej samej KD(app) we wszystkich stężeniach substratu FX, wskazując na to, że scFv(TF)3e10 nie konkuruje z FX i nie łączy się z TF ani z kompleksem FVIIa/TF w tym samym miejscu co FX (Fig. 7).
PL 210 582 B1
Przeciwciało scFv(TF)3e10 zidentyfikowano na podstawie wiązania z rekombinowanym ludzkim rozpuszczalnym TF. Homologia sekwencji pomiędzy TF ludzkim i mysim lub ludzkim i króliczym wynosi odpowiednio 58% i 71%. Przeciwciało wiąże się z wyjątkowym epitopem ludzkiego TF, co zakłóca aktywację FX przez kompleks FVIIa/TF. W sensie fizjologicznym, przeciwciało ma przewagę nad przeciwciałami współzawodniczącymi z FVII lub FVIIa o wiązanie z TF. FVIIa dla rozpuszczalnego TF wynosi ~10 nM (Fig. 2), która to wartość jest zgodna z wartościami opublikowanymi dla wiązania FVIIa z sTF (4,8 nM, Neuenschwander, P. F. i Morrissey, J. H. (1994) J. Biol. Chem. 269 (11) :8007-8013) lub dla wiązania FVII, FVIIa i FVIIai inaktywowanego przez DIP z TF o pełnej długości odtworzonym w obojętnych pęcherzykach fosfatydylocholinowych (Bach R. i in. (1986) Biochemistry 25:4007-4020). Powinowactwo wiązania FVII lub FVIIa z TF o pełnej długości zwiększa się znacznie gdy w skład pęcherzyków fosfolipidowych wchodzi obdarzona ładunkiem fosfatydyloseryna (Bach R. i in. (1986)), z uwagi na oddziaływanie domeny GLA FVII lub FVIIa z obdarzoną ładunkiem powierzchnią błony (Neuenschwander, P. F. i Morrissey, J. H. (1994)).
W tych optymalnych warunkach, FVIIa łączy się z TF o pełnej długości z bardzo dużym powinowactwem (41 pM). Przeciwciało przeciwko TF, które współzawodniczy o wiązanie z FVII lub FVIIa będzie z trudnością współzawodniczyć z kompleksem FVIIa/TF o dużym powinowactwie. Odwrotnie, przeciwciało scFv(TF)3e10 nie tylko wykazuje większe powinowactwo względem kompleksu FVIIa/TF niż względem TF, lecz nie współzawodniczy z FVIIa o wiązanie z TF. Przeciwciało takie jak scFv(TF)3e10, które nie współzawodniczy z FVIIa, będzie hamować aktywację FX niezależnie od stężenia FVII w osoczu które wynosi ~10 nM.
Przeciwciało scFv(TF)3e10 ma również tę przewagę nad przeciwciałami, że współzawodniczy z FX o wiązanie z TF. W oparciu o dane przedstawione na Fig. 7, wynika, że KM FX dla kompleksu VIIa/TF wynosi pomiędzy 0,061 i 0,099 co jest zgodne z wartościami opublikowanymi (0,1 um, Baugh, R. J. i in. (2000) J. Biol. Chem. 275(37):28826-28833). Stężenie FX w ludzkim osoczu wynosi 140 nM (1,4 do 2-krotnej wartości KM). Przeciwciało takie jak scFv(TF)3e10, które nie współzawodniczy z FX jak pokazano na Fig. 7, będzie hamować aktywację FX niezależnie od stężenia FX w osoczu.
P r z y k ł a d 6
Model tromboembolizmu u szczura in vivo
Wiążące TF jednołańcuchowe przeciwciało przeciwko scFv(TF)3e10 jest specyficzne względem TF naczelnych. U przytomnych samców szczura Sprague-Dawley (350-400 g, n>7/grupę) podając ludzki TF (tromboplastyna obejmująca ludzki rekombinowany TF, Orto) wywołano model zakrzepu z zatorami. W tym modelu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIG), w wyniku zastrzyku tromboplastyny TF indukuje odkładanie fibryny w płucach, uszkodzenie dróg oddechowych i śmierć. Do żyły ogonowej wstrzyknięto dawki scFv(TF)3e10 eksprymowanego w komórkach ssaczych lub rozczynnika, po czym 15 minut później wstrzyknięto tromboplastynę w bolusie (0,5 ml/kg). W grupie otrzymującej rozczynnik, ta dawka TF powodowała 60% śmiertelność (LD60) zazwyczaj w ciągu 5 minut od zastrzyku tromboplastyny. Zachorowalność-śmiertelność u szczurów oceniano według następującej punktacji: 0 = bez zmian; 1 = łagodne wyczerpanie oddechowe (powrót do stanu wyjściowego w ciągu 30 minut); 2 = ciężkie wyczerpanie oddechowe (stan agonalny, powrót do stanu wyjściowego w czasie dłuższym niż 60 minut) i 3 = śmierć.
W celu porównania efektywności środków w różnych grupach doświadczalnych posłużono się oceną średnią. Wyniki uzyskane przy zastosowaniu tego testu in vivo przedstawiono na Fig. 8. W teście tym przeciwciało według wynalazku powodowało zmniejszenie śmiertelności i zmniejszenie wyczerpania oddechowego.
PL 210 582 B1
Lista sekwencji <110> Light, David McLean, Kirk <120> Nowe przeciwciała nakierunkowane na czynnik tkankowy działające jako środki przeciwzakrzepowe <130> 52295AWOM2 <150> US 60/376566 <151> 2002-05-01 <160> 4 <170> Patentln wersja 3,1 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasów przeciwciała scFv(TF)3elO <400> 1
| Met | Leu | Gly | Val | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Leu | Ala | Leu | Ala | Gly | Leu | Val |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Phe | Pro | Glu | Met | Ala | Gin | Val | Asn | Leu | Arg | Glu | Ser | Gly | Gly | Thr | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Phe | Thr | Asp | Ala | Trp | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Ala | Pro | Gly | Lys |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Glu | Trp | Val | Ser | Ser | Ile | Ser | Gly | Ser | Gly | Gly | Ser | Thr | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Tyr | Ala | Gly | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys | Ala | Arg | Val | Leu | Ser | Leu | Thr | Asp | Tyr | Tyr | Trp |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Tyr | Gly | Met | Asp | Val | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Leu | Val | Thr | Val | Ser | Ala |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Ala | Pro | Asn | Phe | Met | Leu | Thr | Gin | Pro | His |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
PL 210 582 B1
| Ser | Val | Ser | Ala | Ser 165 | Pro | Gly | Lys | Thr | Val 170 | Thr | Ile | Ser | Cys | Thr 175 | Arg |
| Ser | Ser | Gly | Ser | Val | Ala | Ser | Tyr | Tyr | Val | Gin | Trp | Tyr | Gin | Gin | Arg |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Pro | Gly | Ser | Ser | Pro | Thr | Thr | Val | Ile | Tyr | Glu | Asp | Asn | His | Arg | Pro |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Val | Pro | Asp | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Ile | Asp | Thr | Ser | Ser | Asn |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ser | Ala | Ser | Leu | Thr | Ile | Ser | Gly | Leu | Lys | Thr | Glu | Asp | Glu | Ala | Asp |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Tyr | Tyr | Cys | Gin | Ser | Tyr | Asp | Ser | Asn | Asn | Leu | Val | Val | Phe | Gly | Gly |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Gly | Thr | Lys | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Ala | Ala | Ala | Gly | Ala | Pro | Val | Pro |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Tyr | Pro | Asp | Pro | Leu | Glu | Pro | Arg | Ala | Ala |
275 280 <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> sekwencja DNA kodująca przeciwciało scFv(TF)3elO <400> 2 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60 gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac 240 tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta 360 ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc 420 accgtctcgg ccggtggcgg cggatctggc gcgccaaatt ttatgctgac tcagccccac 480 tctgtgtcgg cgtctccggg gaagacggta accatctcct gcacccgcag cagtggcagc 540 gttgccagct actatgtgca gtggtaccag cagcgcccgg gcagttcccc caccactgtg 600 atctatgagg ataaccacag accctctggg gtccctgatc ggttctctgg ctccatcgac 660 acctcctcca actctgcctc cctcaccatc tctggactga agactgagga cgaggctgac 720 tactactgtc agtcttatga tagcaacaac cttgtggttt tcggcggagg gaccaagctg 780 accgtcctag gtgcggccgc aggagctccg gtgccggatc cggatccgct ggaaccgcgt 840 gccgcatga 849
PL 210 582 B1 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasów przeciwciało scFv(TF)3el0delta <400> 3
| Met | Leu | Gly | Val | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Leu | Ala | Leu | Ala | Gly | Leu | Val |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Phe | Pro | Glu | Met | Ala | Gin | Val | Asn | Leu | Arg | Glu | Ser | Gly | Gly | Thr | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Phe | Thr | Asp | Ala | Trp | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Ala | Pro | Gly | Lys |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Glu | Trp | Val | Ser | Ser | Ile | Ser | Gly | Ser | Gly | Gly | Ser | Thr | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Tyr | Ala | Gly | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys | Ala | Arg | Val | Leu | Ser | Leu | Thr | Asp | Tyr | Tyr | Trp |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Tyr | Gly | Met | Asp | Val | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Leu | Val | Thr | Val | Ser | Ala |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Asn | Phe | Met | Leu | Thr | Gin | Pro | His | Ser | Val | Ser |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ala | Ser | Pro | Gly | Lys | Thr | Val | Thr | Ile | Ser | Cys | Thr | Arg | Ser | Ser | Gly |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ser | Val | Ala | Ser | Tyr | Tyr | Val | Gin | Trp | Tyr | Gin | Gin | Arg | Pro | Gly | Ser |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ser | Pro | Thr | Thr | Val | Ile | Tyr | Glu | Asp | Asn | His | Arg | Pro | Ser | Gly | Val |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Pro | Asp | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Ile | Asp | Thr | Ser | Ser | Asn | Ser | Ala | Ser |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Leu | Thr | Ile | Ser | Gly | Leu | Lys | Thr | Glu | Asp | Glu | Ala | Asp | Tyr | Tyr | Cys |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Gin | Ser | Tyr | Asp | Ser | Asn | Asn | Leu | Val | Val | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys |
| 245 | 250 | 255 |
PL 210 582 B1
Leu Thr Val Leu Gly 260 <210> 4 <211> 783 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> sekwencja DNA kodująca przeciwciało scFv(TF)3el0delta <400> 4 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60 gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac 240 tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta 360 ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc 420 accgtctcgg ccggtggcgg cggatctaat tttatgctga ctcagcccca ctctgtgtcg 480 gcgtctccgg ggaagacggt aaccatctcc tgcacccgca gcagtggcag cgttgccagc 540 tactatgtgc agtggtacca gcagcgcccg ggcagttccc ccaccactgt gatctatgag 600 gataaccaca gaccctctgg ggtccctgat cggttctctg gctccatcga cacctcctcc 660 aactctgcct ccctcaccat ctctggactg aagactgagg acgaggctga ctactactąt 720 cagtcttatg atagcaacaa ccttgtggtt ttcggcggag ggaccaagct gaccgtecta 780 ggt 783
Claims (25)
1. Przeciwciało przeciwzakrzepowe, znamienne tym, że łączy się z kompleksem czynnik VIIa/czynnik tkankowy (FVIIa/TF) z większym powinowactwem niż z samym czynnikiem tkankowym (TF).
2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z co najmniej 2-krotnie większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF, co określono stosując test mikrokalorymetryczny.
3. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z co najmniej 5-krotnie większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF.
4. Przeciwciało według zastrz. 3, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z co najmniej 10-krotnie większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF.
5. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne.
6. Przeciwciało według zastrz. 5, znamienne tym, że przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe, przeciwciało dimeryczne Fab lub przeciwciało IgG.
7. Przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe.
8. Przeciwciało według zastrz. 7, znamienne tym, że przeciwciało nie współzawodniczy o wiązanie z TF z jednym lub więcej czynnikami krzepnięcia wybranymi z grupy obejmującej czynnik VII (FVII), czynnik IX (FIX) i czynnik X (FX).
9. Przeciwciało według zastrz. 8, znamienne tym, że czynnikami krzepnięcia są czynnik FVII i czynnik FX.
PL 210 582 B1
10. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest glikozylowane.
11. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało modyfikuje się dodając glikol polietylenowy.
12. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że do przeciwciała dołącza się grupy biotynowe w celu uzyskania wiązania streptawidyny.
13. Kompozycja farmaceutyczna przeciwciała określonego w zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera przeciwciało w terapeutycznie skutecznej ilości oraz rozczynnik dopuszczalny farmaceutycznie.
14. Sposób zabezpieczania przed powstawaniem skrzepu, znamienny tym, że przeciwciało określone w zastrz. 1 stosuje się w terapeutycznie skutecznej ilości, przy czym przeciwciało hamuje powstawanie trombiny bez bezpośredniego wpływu na inne parametry krzepnięcia, takie jak aktywacja i agregacja płytek krwi.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się zapobiegawczo przed powstawaniem skrzepu w przypadku udaru niedokrwiennego, powikłań zakrzepowych w wyniku angioplastyki lub zabiegu operacyjnego na drobnych naczyniach krwionośnych.
16. Przeciwciało określone w zastrz. 1, znamienne tym, że w terapeutycznie skutecznej ilości jest stosowane w ograniczaniu i leczeniu zakrzepicy żył głębokich (DVT), rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIG), ostrego zespołu wieńcowego lub raka z objawem koagulopatii.
17. Sposób regulowania odpowiedzi zapalnej u pacjenta, znamienny tym, że stosuje się terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała określonego w zastrz. 1.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się w przypadku odpowiedzi zapalnej wybranej z grupy obejmującej sepsę, przy przeszczepach skóry i żył oraz przy przeszczepach narządów.
19. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało stosuje się do uzyskania powłoki nie wywołującej powstawania skrzepliny na powierzchni urządzenia medycznego, przy czym urządzenie medyczne wchodzi w kontakt z krwią.
20. Zestaw, znamienny tym, że zawiera przeciwciało określone w zastrz. 1.
21. Zestaw według zastrz. 20, znamienny tym, że zawiera sekwencje DNA kodujące przeciwciało określone w zastrz. 1.
22. Kompozycja do terapii genowej, znamienna tym, że zawiera sekwencję polinukleotydową SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 4, kodującą przeciwciało o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3, w połączeniu z wektorem do terapii genowej, w terapeutycznie skutecznej ilości.
23. Przeciwciało przeciwzakrzepowe, znamienne tym, że przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe łączące się z większym powinowactwem z kompleksem FVIIa/TF niż z samym TF, przy czym przeciwciało nie współzawodniczy o wiązanie z TF z czynnikiem FVII i czynnikiem FX.
24. Przeciwciało według zastrz. 23, znamienne tym, że przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:1 lub SEQ ID NO:3.
25. Sekwencja polinukleotydowa kodująca przeciwciało określone w zastrz. 23, znamienna tym, że sekwencja polinukleotydowa zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO:2 lub
SEQ ID NO:4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37656602P | 2002-05-01 | 2002-05-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL373960A1 PL373960A1 (pl) | 2005-09-19 |
| PL210582B1 true PL210582B1 (pl) | 2012-02-29 |
Family
ID=29401364
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL03373945A PL373945A1 (pl) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Nowe trombomodulinowe białka fuzyjne ukierunkowane na czynnik tkankowy działające jako antykoagulanty |
| PL373960A PL210582B1 (pl) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Przeciwciało przeciwzakrzepowe, kompozycja farmaceutyczna przeciwciała, sposób zabezpieczania przed powstawaniem skrzepu, sposób regulowania odpowiedzi zapalnej, zestaw zawierający przeciwciało oraz kompozycja do terapii genowej i sekwencja polinukleotydowa |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL03373945A PL373945A1 (pl) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Nowe trombomodulinowe białka fuzyjne ukierunkowane na czynnik tkankowy działające jako antykoagulanty |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7250168B2 (pl) |
| EP (2) | EP1549341B1 (pl) |
| JP (2) | JP4460443B2 (pl) |
| KR (2) | KR101013697B1 (pl) |
| CN (2) | CN100412090C (pl) |
| AR (1) | AR039515A1 (pl) |
| AT (2) | ATE427121T1 (pl) |
| AU (2) | AU2003225255B2 (pl) |
| BR (2) | BR0304659A (pl) |
| CA (2) | CA2483910A1 (pl) |
| CR (1) | CR7584A (pl) |
| DE (2) | DE60326970D1 (pl) |
| DK (2) | DK1549341T3 (pl) |
| EC (2) | ECSP045468A (pl) |
| ES (2) | ES2323056T3 (pl) |
| HK (1) | HK1080372A1 (pl) |
| IL (3) | IL164733A0 (pl) |
| MX (2) | MXPA04010851A (pl) |
| NO (2) | NO20035849L (pl) |
| NZ (2) | NZ536242A (pl) |
| PE (1) | PE20040597A1 (pl) |
| PL (2) | PL373945A1 (pl) |
| PT (2) | PT1503785E (pl) |
| RS (2) | RS104504A (pl) |
| RU (2) | RU2320366C2 (pl) |
| TW (1) | TWI343388B (pl) |
| UA (2) | UA81114C2 (pl) |
| WO (2) | WO2003092602A2 (pl) |
| ZA (2) | ZA200409692B (pl) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1188830T3 (da) * | 1999-06-02 | 2010-04-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10 |
| AU7445900A (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel hemopoietin receptor protein, nr12 |
| AU9630501A (en) | 2000-09-26 | 2002-04-08 | Univ Duke | Rna aptamers and methods for identifying the same |
| JP4460443B2 (ja) * | 2002-05-01 | 2010-05-12 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体 |
| US7579000B2 (en) | 2002-05-01 | 2009-08-25 | Bayer Schering Pharma Ag | Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants |
| CA2490280A1 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that specifically bind to reg iv |
| US7425328B2 (en) | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
| US7833978B2 (en) * | 2004-02-20 | 2010-11-16 | Emory University | Thrombomodulin derivatives and conjugates |
| CN103045601B (zh) | 2004-04-22 | 2015-04-01 | 雷加多生物科学公司 | 改良的凝血因子调节物 |
| CN101189334B (zh) | 2005-06-03 | 2013-11-06 | 持田制药株式会社 | 抗cd14抗体融合蛋白质 |
| WO2008039206A2 (en) * | 2005-10-05 | 2008-04-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fusion proteins for inhibition and dissolution of coagulation |
| CN101466400B (zh) * | 2006-04-07 | 2014-06-25 | 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 | 共价凝血因子ⅶ-组织因子复合物 |
| ES2429407T3 (es) | 2006-06-08 | 2013-11-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agente preventivo o remedio para enfermedades inflamatorias |
| US20100152106A1 (en) * | 2006-10-06 | 2010-06-17 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Agent for therapy and/or improvement of disseminated intravascular coagulation |
| US9649499B2 (en) | 2007-03-28 | 2017-05-16 | Medtronic ATS Medical, Inc. | Method for inhibiting platelet interaction with biomaterial surfaces |
| CA2700293A1 (en) * | 2007-09-20 | 2009-03-26 | Bracco Imaging Spa | Method for the preparation of new oligoclonal antibodies |
| MX2010006097A (es) | 2007-12-05 | 2010-08-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para tratar el prurito. |
| WO2009086552A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-07-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeting recombinant therapeutics to circulating red blood cells |
| UA112050C2 (uk) * | 2008-08-04 | 2016-07-25 | БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі | Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi) |
| SG2013061528A (en) * | 2008-08-14 | 2015-03-30 | Merck Sharp & Dohme | Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography |
| US20110262466A1 (en) * | 2008-10-16 | 2011-10-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof |
| US20120165244A1 (en) * | 2008-10-30 | 2012-06-28 | Hua-Lin Wu | Methods for binding lewis y antigen |
| UA109633C2 (uk) | 2008-12-09 | 2015-09-25 | Антитіло людини проти тканинного фактора | |
| EP2230251A1 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-22 | Bracco Imaging S.p.A | Antibodies specifically active in the coronary plaque and method for their identification |
| EP2470201A4 (en) * | 2009-08-28 | 2013-01-30 | Bayer Healthcare Llc | COFACTORS ENABLING THE THROMBINIC ACTIVATION OF FACTOR VII AND THEIR USES |
| GB201007356D0 (en) | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Leverton Licence Holdings Ltd | Conjugated factor VIIa |
| US9644197B2 (en) * | 2010-06-04 | 2017-05-09 | Sk Chemicals Co., Ltd. | Fusion protein having factor VII activity |
| CN106084053B (zh) | 2010-06-15 | 2020-01-17 | 根马布股份公司 | 针对组织因子的人抗体药物缀合物 |
| CA2807749C (en) | 2010-08-05 | 2023-02-28 | Council Of Scientific & Industrial Research | Protein fusion constructs possessing thrombolytic and anticoagulant properties |
| RU2445365C1 (ru) * | 2010-11-03 | 2012-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный Центр "Новые Технологии и Материалы" (ООО "ИЦ Новтехмат") | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) |
| MA43918A (fr) | 2015-04-14 | 2018-12-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composition pharmaceutique pour la prã‰vention et/ou le traitement de la dermatite atopique contenant comme principe actif un antagoniste de l'il-31 |
| WO2016176440A2 (en) * | 2015-04-28 | 2016-11-03 | Saint Louis University | Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as protein c activators |
| US11085031B2 (en) | 2016-04-28 | 2021-08-10 | Saint Louis University | Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as a powerful anticoagulant |
| KR20190083355A (ko) * | 2016-11-16 | 2019-07-11 | 바이엘 헬쓰케어 엘엘씨 | 적혈구 표적화된 인자 viii 및 이를 사용하는 방법 |
| BR102017005783A2 (pt) * | 2017-03-21 | 2018-10-02 | Fund Butantan | processo de obtenção de esculptina e seus fragmentos, esculptina recombinante e seus usos |
| US20210318338A1 (en) * | 2018-10-04 | 2021-10-14 | Thrombosis And Coagulation Ab | Method for the determination of protein s levels |
| TW202128222A (zh) | 2019-11-20 | 2021-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 含有抗體之製劑 |
| CN114686444A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| CN114686443B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-11-03 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| ZA862768B (en) * | 1985-04-17 | 1986-12-30 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US5589173A (en) | 1986-11-04 | 1996-12-31 | Genentech, Inc. | Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction |
| US5223427A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
| US5437864A (en) * | 1987-03-31 | 1995-08-01 | The Scripps Research Institute | Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor |
| US4912207A (en) | 1987-05-06 | 1990-03-27 | Washington University | DNA clone of human thrombomodulin and portions thereof |
| DK299087D0 (da) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | Novo Industri As | Proteins and derivatives thereof |
| US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
| KR920701459A (ko) * | 1989-02-17 | 1992-08-11 | 코돈 | 트롬보모듈린의 가용성 유사체 |
| US6063763A (en) | 1989-04-28 | 2000-05-16 | Schering Aktiengesellschaft | Protease-resistant thrombomodulin analogs |
| US5256770A (en) * | 1990-04-09 | 1993-10-26 | Schering Ag | Oxidation resistant thrombomodulin analogs |
| US5466668A (en) | 1989-04-28 | 1995-11-14 | Schering Aktiengesellschaft | Superior thrombomodulin analogs for pharmaceutical use |
| KR930008093B1 (ko) | 1990-08-03 | 1993-08-25 | 아사히가세이고오교 가부시끼가이샤 | 신규 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 하는 의약조성물 |
| US5843442A (en) * | 1990-10-22 | 1998-12-01 | Corvas International, Inc. | Blood coagulation protein antagonists and uses therefor |
| US5506134A (en) | 1990-10-22 | 1996-04-09 | Corvas International, Inc. | Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex |
| JPH0578397A (ja) * | 1991-01-29 | 1993-03-30 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 血栓溶解タンパク質 |
| JPH06133780A (ja) * | 1992-10-23 | 1994-05-17 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規なｔ−ＰＡ改変体 |
| US5916874A (en) | 1994-04-20 | 1999-06-29 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for treating liver injury |
| US5736364A (en) * | 1995-12-04 | 1998-04-07 | Genentech, Inc. | Factor viia inhibitors |
| US5986065A (en) * | 1997-03-10 | 1999-11-16 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| ES2364266T3 (es) * | 1998-04-03 | 2011-08-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticuerpo humanizado hacia el factor tisular humano (tf) y procedimiento para construir el anticuerpo humanizado. |
| AU2001250814B2 (en) * | 2000-03-16 | 2007-02-15 | Genentech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency |
| US6632791B1 (en) | 2000-06-21 | 2003-10-14 | Schering Aktiengesellschaft | Thrombomodulin analogs for pharmaceutical use |
| TWI338009B (en) * | 2001-10-29 | 2011-03-01 | Genentech Inc | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| EP1465998A2 (en) | 2002-01-08 | 2004-10-13 | Bayer HealthCare AG | Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy |
| JP4460443B2 (ja) | 2002-05-01 | 2010-05-12 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体 |
| US7579000B2 (en) | 2002-05-01 | 2009-08-25 | Bayer Schering Pharma Ag | Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants |
-
2003
- 2003-04-30 JP JP2004501558A patent/JP4460443B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 KR KR1020047017456A patent/KR101013697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 RU RU2004135308/15A patent/RU2320366C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 MX MXPA04010851A patent/MXPA04010851A/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 MX MXPA04010795A patent/MXPA04010795A/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 NZ NZ536242A patent/NZ536242A/en unknown
- 2003-04-30 AT AT03721974T patent/ATE427121T1/de active
- 2003-04-30 WO PCT/US2003/013522 patent/WO2003092602A2/en active Application Filing
- 2003-04-30 PL PL03373945A patent/PL373945A1/pl not_active Application Discontinuation
- 2003-04-30 PT PT03721975T patent/PT1503785E/pt unknown
- 2003-04-30 AU AU2003225255A patent/AU2003225255B2/en not_active Ceased
- 2003-04-30 RS YUP-1045/04A patent/RS104504A/sr unknown
- 2003-04-30 US US10/427,805 patent/US7250168B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 BR BR0304659-1A patent/BR0304659A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 DE DE60326970T patent/DE60326970D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 IL IL16473303A patent/IL164733A0/xx unknown
- 2003-04-30 EP EP03721974A patent/EP1549341B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 WO PCT/US2003/013521 patent/WO2003093422A2/en active Application Filing
- 2003-04-30 RS YU102404A patent/RS102404A/sr unknown
- 2003-04-30 EP EP03721975A patent/EP1503785B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 DK DK03721974T patent/DK1549341T3/da active
- 2003-04-30 CN CNB038157020A patent/CN100412090C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 PE PE2003000426A patent/PE20040597A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-04-30 UA UA20041109787A patent/UA81114C2/uk unknown
- 2003-04-30 PL PL373960A patent/PL210582B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 DK DK03721975.5T patent/DK1503785T3/da active
- 2003-04-30 UA UA20041109788A patent/UA85996C2/ru unknown
- 2003-04-30 AR ARP030101529A patent/AR039515A1/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 KR KR1020047017458A patent/KR101080587B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 CA CA002483910A patent/CA2483910A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-30 AU AU2003225256A patent/AU2003225256B2/en not_active Ceased
- 2003-04-30 RU RU2004135306/13A patent/RU2345789C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 NZ NZ536243A patent/NZ536243A/en unknown
- 2003-04-30 CN CNB038157039A patent/CN100563709C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 ES ES03721974T patent/ES2323056T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 DE DE60334538T patent/DE60334538D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 PT PT03721974T patent/PT1549341E/pt unknown
- 2003-04-30 BR BR0304660-5A patent/BR0304660A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 ES ES03721975T patent/ES2354419T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 JP JP2004500787A patent/JP4567437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 CA CA002483909A patent/CA2483909A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-30 TW TW092110159A patent/TWI343388B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 AT AT03721975T patent/ATE484524T1/de active
- 2003-12-30 NO NO20035849A patent/NO20035849L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-12-30 NO NO20035848A patent/NO20035848L/no not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-10-20 IL IL16473204A patent/IL164732A0/xx unknown
- 2004-10-20 IL IL164733A patent/IL164733A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-11-24 CR CR7584A patent/CR7584A/es not_active Application Discontinuation
- 2004-11-30 ZA ZA200409692A patent/ZA200409692B/xx unknown
- 2004-11-30 EC EC2004005468A patent/ECSP045468A/es unknown
- 2004-11-30 EC EC2004005467A patent/ECSP045467A/es unknown
- 2004-11-30 ZA ZA200409694A patent/ZA200409694B/en unknown
-
2006
- 2006-01-06 HK HK06100300.9A patent/HK1080372A1/zh unknown
-
2007
- 2007-06-21 US US11/766,160 patent/US7622122B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 US US11/766,155 patent/US7622457B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1549341B1 (en) | Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants | |
| US7960532B2 (en) | Polynucleotides encoding anticoagulant antibodies | |
| US8252287B2 (en) | Blood coagulation factor VIII activation-enhancing antibodies | |
| JP2022523007A (ja) | 抗血栓症作用および抗炎症作用を有する、第ｘｉ因子に対する新規ヒト化抗体およびその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130430 |