UA81114C2 - Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants - Google Patents

Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants Download PDF

Info

Publication number
UA81114C2
UA81114C2 UA20041109787A UA20041109787A UA81114C2 UA 81114 C2 UA81114 C2 UA 81114C2 UA 20041109787 A UA20041109787 A UA 20041109787A UA 20041109787 A UA20041109787 A UA 20041109787A UA 81114 C2 UA81114 C2 UA 81114C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antibodies
binding
complex
zeo
Prior art date
Application number
UA20041109787A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29401364&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA81114(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of UA81114C2 publication Critical patent/UA81114C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/7455—Thrombomodulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Опис винаходу
Для нормального гемостазу важливу роль відіграє підтримання необхідного балансу між прокоагулювальною 2 й антикоагулювальною активністю у кровоносних судинах (|Оаміе ЕМУ., Віоспетівігу, З0(43), 1991, стор.10363-10370). Зсув балансу у бік коагуляції приводить до тромбозу, який може приводити до серцевого приступу, "удару", легеневої емболії та венозного тромбозу. У зв'язку з вищевказаним існує потреба в більш ефективних і безпечних антикоагулянтах, призначених для лікування специфічних пов'язаних із тромбозом захворювань. 70 Тканинний фактор ("ТФ") являє собою трансмембранний глікопротеїн, який є основним ініціатором каскаду коагуляції |Метегвоп У., Тпиготр. Наетозві., 74(1), 1995, стор.180-184). У нормальних фізіологічних умовах ТФ не має контакту із кров'ю. При пошкодженні судини потрапляння в кров субендотеліального ТФ і колагену приводить до активації факторів згортання й тромбоцитів й, як наслідок, до утворення гемостатичної пробки.
ТФ, який потрапив у кров, діє як кофактор для фактора Мііа ("РМііІа"), який каталізує активацію фактора ІХ 12 СРІХ") ї фактора Х СЕХ"), які являють собою компоненти, що мають вирішальне значення, властивих організму комплексів тенази й протромбінази відповідно. Це приводить до швидкого формування ЕХа і тромбіну. Потім тромбін розщеплює фібриноген з утворенням фібрину, що, у свою чергу, полімеризується з утворенням фібринового згустку. Невідповідна індукція експресії ТФ при різних клінічних симптомах може приводити до тромбозу, який загрожує життю, та/(або викликати патологічні ускладнення. Потрапляння в кров ТФ після руйнування бляшки, імовірно, приводить до тромботичної оклюзії, яка є причиною гострого інфаркту міокарда й "удару. У цих випадках активація факторами згортання шляхів сигналів прозапалення також приводить до утворення набряку й збільшенню розміру інфаркту. Пошкодження судини, зв'язане із пластичною операцією на судині, приводить до підвищувальної регуляції ТФ на поверхні клітин гладенької мускулатури (ЗМО), яка, імовірно, індукує шляхи клітинних сигналів, зв'язаних з рестенозом. Понадекспресія ТФ у пухлині й при с зв'язаному із грамнегативними бактеріями сепсисі приводить до тромбозу, який загрожує життю, й активації Ге) запальних шляхів.
Комплекс ЕМІІа/ТФ бере участь у механізмі патогенезу при різних тромботичних захворюваннях і наявність у кровотоці певної концентрації ТФ є чинником ризику для деяких типів пацієнтів. ЕМІПа і ТФ відіграють унікальну роль у порушенні функції судин у підтриманні гемостазу й ініціації тромбозу при ушкодженні судин. З
ТФ у нормі експресується в адвентиції, але при захворюванні судин відбувається підвищувальна регуляція й «- не властива організму у нормі експресія ТФ у медії й неоінтимі. Експресія ТФ в атеросклеротичних бляшках підвищується й при контакті із ТФ захист крові, що здійснюється за допомогою тонкої фіброзної оболонки -- ("шапочки"), може порушуватися. Хірургічні втручання, такі як пластична операція на судинах з використанням «-- балонів, введення стентів або ендартеректомія, пошкоджують стінки судин і приводить до контакту з ТФ, який
Зо знаходиться в більш глибоких шарах. Спонтанне руйнування або ендотеліальна. ерозія атеросклеротичної со багатої ліпідами тонкостінної бляшки приводить до контакту із ТФ і тромбозу, який викликає нестабільну стенокардію й інфаркт міокарда. ТФ може знаходитися в кровотоці в мікрочастинках клітинного походження, і рівні ТФ у кровотоці підвищуються при нестабільній стенокардії що дозволяє припустити, що ТФ, який « знаходиться в кровотоці, може брати участь в утворенні тромбу |Зоє)|йта Н. і ін. Сігсціайоп, 99(22), 1999, З стор.2908-2913). Рак часто пов'язаний із станом гіперкоагуляції, зумовленої понадекспресією ТФ на поверхні с пухлинних клітин. Це приводить до схильності пацієнта до тромбозу глибоких вен, емболії легенів і до
Із» ДВЗ-синдрому (дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові) невисокого ступеня. ДВЗ приводить до відкладення фібрину в мікросудинах, що приводить до порушення багатьох органів.
Антикоагулянти на основі білків, мішенню яких є ТФ, включають нейтралізуючі ТФ антитіла, які інгібують 49 активний сайт фактора Міа ("ЕМіІаї"), інгібітор шляху метаболізму тканинного фактора (ТЕРІ" і бо антикоагулювальний білок нематод ("МАРС2"). Результати, отримані з використанням моделей тромбозу на - основі гострого артеріального ушкодження, свідчать про те, що білкові інгібітори ЕМПа/ТФ є ефективними щщ антитромботичними агентами, які характеризуються меншою здатністю у порівнянні з гепарином викликати кровотечу, безпосередніми інгібіторами тромбіну, інгібіторами тромбоцитів й інгібіторами ЕХа |Нітрбег .. і - 70 ін., ТйготьЬ. Наетовзі. 85, 2001, стор.475-481; НагкКег І.А. і ін., Тиготр. Наетові. 74(1), 1995, стор.464-472).
Крім того, інгібітори ЕМПа/7Ф є більш ефективними, ніж інші антикоагулянти (наприклад, гепарин, інгібітор
Т» ЕХа) відносно здатності запобігати потовщенню неоінтими й судинний стеноз після пошкодження балоном апа
У. і ін., Сігсшайоп, 92(10), 1995, стор.3041-30501.
За допомогою експериментальних моделей сепсису встановлено, що інгібування ТФ, ЕМПа або комплексу 22 ЕМІа/ТтФ являє собою ефективний антитромботичний шлях запобігання ДВЗ і зниження смертності. Аналоги ТЕРІ
ГФ) запобігають індукованому як тромбопластином, так й ендотоксиному ДВЗ у кроликів |Оау К.С. і ін., Віосд, 76, 1990, стор.1538-1545); Вгедепдага С. і ін., Вісод Соадиї!. Рібгіпоїувів, 4, 1993, стор.699-706). Моноклональні о антитіла до ЕМІа |Віетопа В.). і ін., ТйготЬ. Наетозі, 73, 1993, стор.223-230 або Іемі М. і ін., 9. Сііп.
Іпмеві., 93, 1994, стор.114-120) запобігають індукованому ендотоксином ДВЗ у мавп. Нейтралізуючі ТФ антитіла, 60 ЕМІаі й ТЕРІ інгібують ДВЗ і знижують смертність павіанів при використанні моделі індукованого Е. сої сепсису |Стеазеу А.А. і ін., У. Сійп. Іпмеві. 91, 1993, стор.2850-2860; Тауог Б.В. і ін., Віосд, 78, 1991а, стор.364-368; Тауог Р.В. і ін., Сіте. ЗпосК, 33, 1991р, стор.127-134; Тауюг Е.В. Наетовіазів Зиррі. 1 26, 1996, стор.83-91). Відомо, що як ЕХа, так і комплекс ЕМІа/ТФ/ЕХа індукують виробництво прозапальних цитокинів, які зв'язані з підвищеним ризиком смерті пацієнтів, які страждають від сепсису |Кіемаїа М. і ін., 62 Ргос. Маї), Асай. 5бі. ЗА, 98, 2001, стор.7742-7747). Цікаво відзначити, що, як встановлено з використанням як модельних тваринних павіанів, ЕМіІїаї знижує рівні в плазмі І/-6б й 1/-8 |Гауюг Б.В. і ін., Віоса, 91, 1998, стор.1609-1615), що дозволяє припустити, що інгібування ЕМІа/ТФ може виявляти додаткову протизапальну дію, не пов'язану з іншими антикоагулювальними механізмами.
З літератури відомо декілька антитіл, які є ефективними антикоагулянтами і які зв'язуються або нейтралізують або ТФ, або комплекс ЕМіІІа/ТФ, або і їх обох |див, наприклад, Сагзоп 5.0. і ін., Віосіа, 66(1), 1985, стор.152-156; Тапака Н. і ін., Тиготр. Кевз., 40(6), 1985, стор.745-756; Кігпроїтег О. і ін., Тигоотр.
Наетозві., 84(6), 2000, стор.1072-1081; Кігспроїег О.ї ін, Віоспетівігу, 40(3), 2001, стор.675-682; Раеїрег
Кі їн., У. Мої. ВіоіІ.,313, 2001, стор.83-87 і патенти США 5506134, 5986065 й 6274142). Антитіла до 1ТФ, /о запропоновані в даному винаході, є ефективними антикоагулянтами, які мають поліпшені характеристики в порівнянні з описаними раніше антитілами до ТФ. Зокрема, антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з більшою афінністю з комплексом ЕМІа/ТФ, ніж з вільним ТФ, і вони не конкурують із ЕМІЇ або з ЕХ за зв'язування із ТФ.
Даний винахід стосується антитіл, які діють як антикоагулянти, які зв'язуються з більшою афінністю з 7/5 Комплексом фактор МПа/тканинний фактор ("РМІПа/ТФ"), ніж: з вільним тканинним фактором ("ТФ"). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 2 рази більш високу афінність до зв'язування з комплексом ЕМіІа/ТФ, ніж з вільним ТФ, при оцінці за допомогою мікрокалориметричного аналізу. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 5 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом
ЕМПалФ, ніж з вільним ТФ. Відповідно до ще більш переважного варіанта здійснення винаходу, антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 10 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом
ЕМПалФ, ніж з вільним ТФ. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не конкурують за зв'язування з ТЕ з одним або декількома факторами згортання, вибраними із групи, яка включає фактори МІ! (МІУ, ІЇХ (СРІХУ ї Х (ЕХ). Відповідно до переважного варіанта здійснення сч ов винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не конкурують за зв'язування з ТЕ з факторами РМІЇ й ЕХ.
Відповідно до більш переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються (8) з більшою афінністю з комплексом ЕМІа/1Ф, ніж з вільним ТФ і не конкурують за зв'язування із ТФ із факторами
ЕМІ й ЕХ.
Антикоагулювальне антитіло, запропоноване у винаході, здійснює спрямоване перенесення і зв'язується з «Е зо Комплексом РМІа/ТФ в ділянці пошкодження й інгібує активацію фактора Х (ЕХ"), запобігаючи тим самим утворенню тромбу і внаслідок цього має ефективність як антикоагулянт при лікуванні певних захворювань, - включаючи (але, не обмежуючись ними) сепсис, дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові, ішемічний «- "удар", тромбоз глибоких вен, гострий коронарний синдром, зв'язані з тромбозом ускладнення після пластичної операції на судинах, і коагулопатія при прогресуючому раку. Крім того, антитіло можна застосовувати при -- мікросудинній хірургії, при трансплантації шкіри й вен і трансплантації органів. со
Ще одним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції, які містять запропоновані у винаході антитіла.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб захисту пацієнт від утворення тромбу, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході, і тим самим інгібують утворення тромбіну, не здійснюючи при цьому безпосереднього впливу на інші параметри згортання, « 470 такі як активація й агрегація тромбоцитів. з с Наступним об'єктом винаходу є спосіб зменшення й лікування тромбозу глибоких вен ("ТГВ") або дисемінованого внутрішньосудинного згортання ("ДВЗ") або гострого коронарного синдрому або раку з ознаками ;» коагулопатії в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб регуляції запальної відповіді в пацієнта, який полягає в тому, що
Го! пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході.
Ще одним об'єктом винаходу є антитіло, запропоноване у винаході, яке можна застосовувати для нанесення - нетромбогенного покриття на поверхню медичних пристосувань, які контактують із кров'ю. - Наступним об'єктом винаходу є набір, який містить антитіло, запропоноване у винаході, яке зв'язується з 5р Комплексом РМІПа/1Ф. В іншому варіанті набір може містити послідовності ДНК, які кодують компоненти антитіла. - У винаході запропоновані також способи одержання антитіл, запропонованих у винаході, як шляхом ї» рекомбінації, так і шляхом синтезу.
На кресленнях показано: на Фіг.1 - дані про активність ТФ-зв'язувальних одноланцюгових антитіл, отримані на основі аналізу здатності рРТФ/ЕМіІа здійснювати гідроліз пептиду (пептидний гідроліз). Аналіз здатності РТФ/ЕМІа здійснювати пептидний гідроліз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням зрівноваженої
Ф) суміші ЕМІТа (ЗНМ) і рТФ (ТОНМ), який заснований на афінності ЕМІТа до рТФ (Коо(арру становить «ТОНМ). Гідроліз ка хромогенного пептидного субстрату 52266 оцінювали відповідно до описаного методу. Представлено кінцеві концентрації експресованих у бактеріях одноланцюгових антитіл і контрольних білків ЕМііаії (ЕМПа, який бо інактивується хлорметилкетонним пептидом, РРАСК) і МАт Мо4504 (фірма Атегісап Оіадповііса); на Фіг.2 - дані, які свідчать про те, що зв'язування зсЕм(ТЕ)Зе10 із ртФ підвищує уявну афінність ртФ до
ЕМііа. Аналіз здатності рТФ/ЕМіІа здійснювати цептидний гідроліз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням 2НМ ЕМііа у присутності ЗВООНМ експресованого в бактеріях антитіла зсЕм(ТЕ)Зе10 або без нього. При здійсненні цього аналізу рТФ титрували й визначали швидкість розщеплення хромогенного б5 пептидного субстрату 52266. Уявне значення Ко для рТФ розраховували за допомогою стандартної апроксимації 4-параметричної залежності;
на Фіг.3 - дані про активність антитіл, які зв'язують ТФ, отримані шляхом оцінки протромбінового часу (ПЧ). Аналіз ПЧ здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням рекомбінантного людського тромбоїшастину (фірма ЮОаде, Іпс.), що містить повнорозмірний людський ТФ у фосфоліпідних пухирцях. Визначали кінцеві концентрації експресованих у бактеріях одноланцюгових антитіл і контрольного білка ЕМІаї; на Фіг.4 - дані про уявну афінність до зв'язування зсЕм(ТЕ)Зе10 із рТФ. Аналіз здатності ртФ/ЕМПа здійснювати пептидний гідроліз проводили відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням ЗНМ ртФ й 2нМ РМііа. Застосовувана концентрація рТФ була нижче значення К р, яке характеризує зв'язування з 7/0. ЕМіа. Вносили зростаючі концентрації експресованого в бактеріях зсЕм(ТЕ)Зе10 і зростаюну швидкість реакції використали для визначення уявних значень К р, які характеризують зв'язування цього антитіла із рТФ, за допомогою стандартної апроксимації 4-параметричної залежності; Афінність зсЕм(ТЕ)Зе10 до комплексу
РТФ/РМІа (Ко(арру"-б9нНМ) виявилася вищою, ніж афінність зсЕм(ТЕ)Зе10 до рТФ при вимірюванні за допомогою
ВІАсоге (Ко(дрг)-47ОНМ); на Фіг5 - дані про оафінності до зв'язування зсЕмМ(ТЕ)Зе10 із ТФ і комплексом ЕМіІа/1Ф.
Мікрокалориметричний аналіз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, використовуючи антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10, експресоване в СНО-клітинах. Цей аналіз показав, що зсЕм(ТЕ)Зе10 має - в 20 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом рТФ/ЕМІа ("комплекс"), ніж до рТФ ("вільного ТФ"); на Фіг.б6 - дані про залежну від дози здатність зсЕм(ТЕ)Зе10 інгібувати активацію ЕХ. Аналіз активації ЕХ здійснювали за допомогою методу, описаного в прикладі 4, використовуючи зростаючі концентрації експресованого в бактеріях зсЕм(ТЕ)Зе10, 250НМ ЕХ і комплекс ЕМПа/Т/Ф на поверхні фосфоліпідів (10пМ ЕМПа).
Значення ІСво являє собою дозу, необхідну для досягнення 5095-ного інгібування; на Фіг.7 - дані, які свідчать про те, що зсЕмМ(ТЕ)Зе10 неконкурентно інгібує активацію ЕХ за допомогою комплексу ЕМПа/ТФ. Аналіз активації ЕХ здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, сч ов Використовуючи експресовану в бактеріях зсЕМ(ТЕ)Зе10, 25-400НМ ЕХ і комплекс ЕМПа/ТФ на поверхні фосфоліпіду (10пМ ЕМіІа). У цьому аналізі здійснювали титрування з використанням зростаючих концентрацій і) зсЕМ(ТЕ)Зе10 (ОНМ, незафарбований квадрат; 0,25нМ, незафарбований ромб; 0,74нМ, незафарбований трикутник, 2,2нМ, незафарбоване коло; 6,7нМ, зафарбований ромб; 2ОнНМ, зафарбований трикутник).
Представлений графік залежності І іпем"еамег-Вигк (1/5), де 5 (субстрат) означає фактор Х (мкМ); відносно 1/у, «г зо де М (швидкість) виражають у вигляді мОГ/хв., що характеризує гідроліз 52222 за допомогою ЕхХа, який відбувається протягом 5хв.) свідчить про те, що зсЕм(ТЕ)Зе10 є неконкурентним інгібітором відносно субстрату, -- тобто ЕХ. Всі криві перетинаються на (або поблизу) осі абсцис, що характерно для неконкурентного інгібування «- (при конкурентному інгібуванні всі криві повинні перетинатися на осі ординат); на Фіг.8 - дані, які підтверджують ефективність зсЕмМ(ТЕ)Зе10 на моделі іп мімо дисемінованого -- внутрішньосудинного згортання крові ("ДВЗ"). Антитіло до ТФ зсЕМ(ТЕ)Зе10, експресоване в СНо-клітинах, со оцінювали з використанням моделі тромбоемболії, індукованої в щурів, яка описана в прикладі 6, на основі (А) відсотка смертності й (Б) показника захворюваності-смертності. (А) Для обробленої носієм групи застосовувана доза ТФ викликала 6095-ну смертність (І Ово). Антитіло зсЕмМ(ТЕ)Зе10 у дозі О0,/нмоля/кг не впливало на рівень смертності, але в дозі 7,Онмолів/кг знижувало смертність до рівня «4095. (Б) В обробленої носієм групі іп мімо « застосовувана доза ТФ приводила до одержання середнього показника захворюваності-смертності 2,6. Антитіло ств) с зсЕМ(ТЕ)Зе10 у дозі 0О,7нмоля/кг не впливало на смертність і незначно впливало на респіраторний дистрес-синдром або взагалі не впливало, але при використанні в дозі 14нмолів/кг знижувало середній показник з захворюваності-смертності до «- 1,5.
Антикоагулювальне антитіло, запропоноване в даному винаході, являє собою антитіло, яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом фактор МіІіІа/тканинний фактор (ЕМПа/ТФ"), ніж з вільним тканинним фактором
Го! ("ТФ"). Антитіло, запропоноване у винаході, має принаймні в 2 разів більшу афінність, переважно із принаймні в 5 разів більшу афінність й більш переважно із принаймні в 10 разів більшу афінність до зв'язування з - комплексом ЕМіІа/ТФ, ніж з вільним ТФ. Крім того, антитіло, запропоноване у винаході, не конкурує за - зв'язування із ТФ із одним або декількома факторами згортання, вибраними з ряду, який включає фактор МІЇ
СЕМ), фактор ІХ СРІХ"У) і фактор Х (ЕХ). Переважне антитіло, запропоноване у винаході, не конкурує за - зв'язування із ТФ із ЕМІЇ і з ЕХ. ї» Визначення:
У даному описі наступні поняття мають вказані нижче значення.
Поняття "рекомбінантні білки або поліпептиди" стосується білків або поліпептидів, отриманих за допомогою рекомбінантної ДНК, тобто отриманих із клітин, мікроорганізмів або ссавців, трансформованих екзогенною конструкцією ДНК, яка кодує потрібний поліпептид. Білки або поліпептиди, експресовані в більшості
Ф) бактеріальних культур, повинні бути вільні від глікану. Білки або поліпептиди, експресовані в дріжджах, ка можуть мати схему глікозилювання, відмінну від схеми глікозилювання експресованих у клітинах ссавців білків або поліпептидів. во Поняття "нативні" білки або поліпептиди стосується білків або поліпептидів, виділених із джерела, яке зустрічається в природних умовах. Поняття "нативне антитіло" включає антитіла, які зустрічаються в природних джерелах, і їх ррагменти.
Поняття "кодувальна послідовність" ДНК означає послідовність ДНК, у результаті транскрипції якої синтезується МРНК й яка транслюється в поліпептид у клітині-хазяїні, якщо вона розташована так, що 65 Знаходиться під контролем відповідних регуляторних послідовностей. Межі кодувальної послідовності визначені стартовим кодоном на 5' М-кінці й стоп-кодоном трансляції на 3 С-кінці. Кодувальна послідовність може включати прокаріотичні послідовності, КДНК, отриману на основі еукаріотичної мРНК, геномні послідовності ДНК із еукаріотичної ДНК і синтетичні послідовності ДНК. Послідовність термінатора транскрипції, як правило, повинна бути локалізована на 3'-кінці відносно кодувальної послідовності.
Поняття "нуклеотидна послідовність" означає полімер дезооксирибонуклеотидів (основи аденін, гуанін, тимін або цитозин). Послідовності ДНК, які кодують антитіла, запропоновані в даному винаході, можуть бути зібрані з отриманих із синтетичної КДНК ДНК-фрагментів і коротких олігонуклеотидних лінкерів для створення синтетичного гена, який має здатність експресуватися в рекомбінантному експресійному векторі. Під час обговорення структури конкретних дволанцюгових молекул ДНК у даному описі мається на увазі 70 загальноприйняте позначення послідовностей тільки в напрямку 5-53" нетранскрибованого ланцюга кКДНК.
Поняття "рекомбінантний експресійний вектор" означає здатну до реплікації конструкцію ДНК, яка застосовується або для ампліфікації, або для експресії ДНК, яка кодує антитіла, запропоновані в даному винаході. Експресійний вектор містить контролюючі послідовності й кодувальну послідовність ДНК. Контролюючі послідовності ДНК включають промоторні послідовності, сайти зв'язування рибосом, сигнали поліаденілування, 7/5 послідовності термінаторів транскрипції, розташовані проти ходу транскрипції регуляторні домени й енхансери.
Представлені в описі рекомбінантні експресійні системи повинні експресувати антитіла після індукції регуляторних елементів.
Поняття "трансформовані клітини-хазяї" стосується клітин, трансформованих і трансфектованих екзогенною
ДНК. Екзогенна ДНК може не бути інтегрована або може бути інтегрована (ковалентно зв'язана) у хромосомну
ДНК, доповнюючи геном клітини. У прокаріот і дріжджів, наприклад, екзогенна ДНК може підтримуватися на епісомальному елементі, такому як плазміда, або бути стабільно інтегрована в хромосомну ДНК. Що стосується еукаріотичних клітин, то стабільно трансформована клітина являє собою клітину, у якій екзогенна ДНК інтегрована в реплікативну хромосому. Стабільність можна продемонструвати за здатністю ліній або клонів еукаріотичних клітин продукувати популяцію дочірніх клітин, які містять екзогенну ДНК. с
Поняття "аналог", "фрагмент", "похідне" й "варіант" по відношенню до антитіл, запропонованих у винаході, означає аналоги, фрагменти, похідні й варіанти антитіл, які зберігають практично таку ж біологічну функцію о або активність, і які будуть більш докладно описані нижче.
Поняття "аналог" включає прополіпептид, до складу якого входить амінокислотна послідовність антитіла, запропонованого у винаході. Активне антитіло, запропоноване у винаході, можна відщеплювати від додаткових /-«ф зо амінокислот, які водять до складу молекули проантитіла, за допомогою природних процесів іп мімо або за допомогою методів, добре відомих у даній галузі, таких як ферментативне або хімічне розщеплення. Наприклад, - рекомбінантний поліпептид зсЕМ(ТР)Зе10 (ЗЕО ІЮО МО:1) експресується у ! вигляді прополіпептиду, який «- складається з 282 амінокислот, що процесується іп мімо з вивільненням активного зрілого поліпептиду, який складається з 264 амінокислот. -
Поняття "фрагмент" означає частину антитіла, запропонованого у винаході, яка зберігає практично таку ж Ге) функціональну активність, яка виявлена в аналізах іп міїго, більш докладно описаних нижче.
Поняття "похідне" включає всі модифікації антитіл, запропонованих у винаході, які в основному зберігають необхідні функції й несуть додаткову структуру й мають супутню функцію, наприклад, ПЕГільовані антитіла, які мають більш тривалий час напівжиття, і біотинільовані антитіла, які додатково будуть описані нижче. Похідне « включає також М- або О-зв'язані глікозильовані антитіла, які можна одержувати шляхом вбудовування сайтів М- шщ с або О-глікозилювання в послідовності антитіл за допомогою стандартних методів рекомбінантної ДНК. Поняття й "практично така ж функціональна активність" й "практичні така ж біологічна функція або активність" кожне и"? означає, що рівень біологічної активності становить приблизно 30-10095 або більше від біологічної активності, властивої поліпептиду, з яким проводять порівняння, якщо біологічну активність кожного поліпептиду визначають за допомогою однакових методу або аналізу. Наприклад, можна говорити, що антитіло має практично таку ж о функціональну активність, що й антитіло із прикладу 1 (ЗЕО ІЮО МО:1), якщо воно при оцінці пептидного гідролізу за допомогою рТФ/ЕМІа й активації ЕХ з використанням аналізів, які описані в прикладі 4, - демонструє здатність зв'язуватися й нейтралізувати комплекс ЕМПа/1Ф. - "Подібність" між двома поліпептидам визначають шляхом порівняння амінокислотної послідовності й Консервативних амінокислотних замін одного поліпептиду з послідовністю другого поліпептиду. Такі - консервативні заміни включають заміни, описані вище |в Те Айаз ої Ргоївіп Зедцепсе апа Зігисішге 5 Бу
Та» Бауйоїй (1978) і в Агаоз ЕМВО .). 8, 1989, стор.779-785). Наприклад, амінокислоти, які належать до однієї з наступних груп, являють собою консервативні заміни: -АІа, Рго, Су, Сіп, Авп, Зег, ТАг; -Сув, Зег, Туг, ТАг; -Маї, Не, Геи, Меї, Аа, РНе; (Ф, -Гув, Ага, Нів; ко -РНе, Туг, Тір, Нів; і -Авр, СІМ. во Поняття "антитіло" у контексті даного опису включає інтактні молекули імуноглобулінів ("79"), а також їх фрагменти, такі як Рар-, Е(ар)»- і Ем-фрагменти, які мають здатність зв'язуватися з епітопом вибраного білка-мішені, наприклад, розчинного ТФ ("рТФ"). Як правило, для утворення епітону потрібно принаймні 6, 8, 10 або 12 суміжних амінокислот. Однак для утворення епітопів, які включають не суміжні амінокислоти, може бути потрібна більша кількість, наприклад, принаймні 15, 25 або 50 амінокислот. 65 Всі інші технічні поняття, які застосовуються в даному описі, мають значення, які звичайно застосовують фахівці в даній галузі.
Антитіла, запропоновані М винаході, і їх одержання:
Антикоагулювальні антитіла, запропоновані в даному винаході, зв'язуються з більшою афінністю з комплексом фактор МіІІа/тканинний фактор (ЕМіІа/ТФ"), ніж з вільним тканинним фактором ("ТФ"). Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 2 разів більшу афінність, більш переважно принаймні в 5 разів більшу афінність й ще більш переважно принаймні в 10 разів більшу афінність до зв'язування з комплексом ЕМіІа//ТФ, ніж з вільним ТФ при оцінці за допомогою мікрокалориметричного аналізу. Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення винаходу антитіла також не конкурує за кю зв'язування із ТФ із одним або декількома факторами згортання, вибраними з ряду, який 7/0 Включає фактор МІ! СРМІ"), фактор ІХ СРІХ"У) ії фактор Х СЕХ"). Відповідно до найбільш переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не конкурують за зв'язування із ТФ із ЕМ ї з ЕХ.
Відповідно до найбільш переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з більшою афінністю з комплексом ЕМіІа/ТФ, ніж з вільним ТФ, і не конкурують за зв'язування із ТФ із ЕМІЇ і з ЕХ.
У цілому, антитіло, яке специфічно зв'язується з вибраним білком-мішенню (наприклад, комплексом ЕМПа//Ф або ТФ), при оцінці за допомогою імунохімічного аналізу дає сигнал виявлення принаймні в 5, 10 або 20 разів більше високий, ніж сигнал виявлення інших білків. Переважно антитіла, які специфічно зв'язуються з вибраним білком-мішенню, не виявляють інших білків при оцінці за допомогою імунохімічних аналізів і можуть здійснювати імунопреципітацію білка-мішені з розчину.
Вибраний білок-мішень можна використовувати для імунізації ссавця, такого як миша, кролик, морська свинка, мавпа або людина, для продукування поліклональних антитіл. При необхідності білок-мішень можна кон'югувати із білком-носієм, таким як бичачий сироватковий альбумін, тироглобулін і гемоціанін лімфи равлика. Залежно від видів хазяїв для підвищення імунологічної відповіді можна використовувати різні адюванти. Такі адюванти включають (але, не обмежуючись ними) адювант Фрейнда, мінеральні гелі сч об (наприклад, гідроксид алюмінію) і поверхнево-активні речовини (наприклад, лізолецитин, поліолі плюроніку, поліаніони, пептиди, масляні емульсії, гемоціанін лімфи равлика й динітрофенол). Із застосовуваних для людини і) ад'ювантів особливо переважними є БЦЖ (бацила Кальмета-Герена) і Согпурасіегішт рагмит.
Моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з вибраним білком-мішенню, можна одержувати за допомогою будь-якого методу, який забезпечує одержання молекул антитіл за допомогою стабільних клітинних «Е зо ліній у культурі. Ці методи включають (але, не обмежуючись ними) метод на основі гібридом, метод на основі людської В-клітинної гібридоми й метод на основі ЕВМ-гібридоми |Копйіег й ін., Маїге 256, 1985, стор.495-497; -
Когрог й ін., у. Іттипої. Меїйодз 81, 1985, стор.31-42; Соїе й ін. Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 80, 1983, «- стор.2026-2030; і Согїе й ін., Мої. Сеї| Вісі. 62, 1984, стор.109-1201.
Крім того, можна застосовувати методи, розроблені для одержання "химерних антитіл", сплайсингу мишиних -(Я7 генів антитіл і людських генів антитіл для одержання молекули з відповідною антигенною специфічністю й со біологічною активністю |Моггізоп й ін., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 81, 1984, стор.6851-6855; Мецйбрегдег й ін.,
Маїйге 312, 1984, стор.604-608; Такеда й ін., Маїшге 314, 1985, стор.452-454). Моноклональні й інші антитіла можуть також являти собою "гуманізовані" антитіла, призначені для запобігання в пацієнта імунної відповіді на антитіло при його застосуванні як терапевтичного агента. Для безпосереднього застосування послідовність таких « антитіл може мати достатню подібність із послідовністю людських антитіл або може потребувати зміни декількох пт) с залишків, які мають вирішальне значення. Відмінності в послідовності антитіл гризунів і людських послідовностей можна мінімізувати, заміняючи залишки, які відрізняються від залишків у людських ;» послідовностях, шляхом сайтнаправленного мутагенезу або шляхом трансплантації повних гіберваріабельних ділянок. В іншому варіанті гуманізовані антитіла можна одержувати за допомогою методів рекомбінації, описаних
В ФщВ821886388. Антитіла, які специфічно зв'язуються з вибраним білком-мішенню, можуть містити
Го! антигензв'язувальні центри, які є або частково, або повністю гуманізованими, (як описано в Ш.5. 55653321.
В іншому варіанті методики, призначені для одержання одноланцюгових антитіл, можна адаптувати за - допомогою відомих у даній галузі методів для одержання одноланцюгових антитіл ("5сЕУ"), які специфічно - зв'язуються з вибраним білком-мішенню. Антитіла з спорідненою специфічністю, але які мають інший ідіотиповий 5р склад, можна одержувати шляхом перестановки ланцюгів з випадкових комбінаторних бібліотек Ід (|Випоп, Ргос. - Майн. Асад. Зсі.О5А, 88, 1991, стор.11120-11123). ї» Одноланцюгові антитіла можна також конструювати допомогою методу ампліфікації ДНК, такого як ПЛР, використовуючи кДНК гібридоми як матрицю |ТВігоп й ін., Ецг. 9. Сапсег Ргем. 5, 1996, стор.507-5111.
Одноланцюгові антитіла можуть бути моно- або біспецифічними й можуть бути бівалентними або тривалентними. Конструювання тетравалентних біспецифічних одноланцюгових антитіл описано, наприклад, в
Соота й Могтізоп, Май). ВіобесппоЇ. 15, 1997, стор.159-163). Конструювання бівалентних біспецифічних (Ф) одноланцюгових антитіл описане |в МаПепааг й Мозв, 9. ВіоЇ. Спет., 269, 1994, стор.199-2161. ка Нуклеотидну послідовність, яка кодує одноланцюгове антитіло, можна конструювати за допомогою ручного або автоматичного синтезу нуклеотидів, клонування в призначеній для експресії конструкції за допомогою бо стандартних методів рекомбінантної ДНК й інтродукції в клітину для експресії кодувальної послідовності. В іншому варіанті одноланцюгові антитіла можна одержувати безпосередньо, застосовуючи, наприклад, технологію на основі дисплейної бібліотеки ниткоподібного фата |Мегпааг й ін., Іпї 9. Сапсег 61, 1995, стор.497-501; і Місноїв й ін., У. Іттипої. Мей. 165, 1993, стор.81-911.
Антитіла, які специфічно зв'язуються з вибраним білком-мішенню, можна одержувати також шляхом індукції іп бБ УМО виробництва популяції лімфоцитів або шляхом скринінгу бібліотек Ід або панелей реагентів, які зв'язуються з високою специфічністю, згідно із описаними у літературі методами (Опапаї й ін., Ргос. Маї|.
Асай. 5сі. ОБА 86, 1989, стор.3833-3837; ММіпіег й ін., Майте 349, 1991, стор.293-299).
ДНК, у якій клоновано антитіло, запропоноване у винаході, можна клонувати у формі кДНК або геномної ДНК за допомогою будь-якої процедури клонування, відомої фахівцеві в даній галузі (див, наприклад, Затбгоок,
У.Б. ї ін. МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагброг І арогаїогу (1989)), публікація включена в даний опис як посилання).
У випадку, коли антитіло являє собою моноклональне антитіло, то якщо ідентифіковано послідовність ДНК, яка кодує Еум-фрагмент, який при експресії має здатність до специфічного зв'язування, то антитіла, які містять цей Ем-фрагмент, можна одержувати за допомогою методів, добре відомих фахівцеві в даній галузі. Так, 70 Інаприклад, в Спацапагу М.К. і ін., Маїшге, 339(6223), 1989, стор.394-397; Вага 9.К. і ін., 9. ВіоЇї. Спет. 265(25), 1990, стор.15198-15202; Ваїга 9.К. і ін., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 86(21), 1989, стор.8545-8549;
Спацанагу М.К. і ін. Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 87(3), 1990, стор.1066-1070) (всі публікації включені в даний опис як посилання), описане одержання білків різних одноланцюгових антитіл.
Відповідно до переважного варіанта антитіла, які зв'язують ТФ, запропоновані у винаході, являють собою 7/5 одноланцюгові антитіла, які одержують за допомогою фагової дисплейної бібліотеки. Конструюють епітопзв'язувальний центр одноланцюгового антитіла, який складається із двох доменів варіабельної ділянки: один з важкого ланцюга, а другий з легкого ланцюга. На першій стадії конструювання фагової дисплейної бібліотеки гени варіабельних ланцюгів (Мн (з ЗМ), Му і Му) клонують за допомогою ПЛР із нульованої мРНК із людського кісткового мозку, лімфатичного вузла й селезінки з використанням набору специфічних для сімейства праймерів. Отримані бібліотеки рСІТЕ-Му (3,8х109 членів), р7б04-МК (1,6х107) і р7604-М, (3,2х107) являють собою бібліотеки постійних й які мають широку розмаїтість М-генів. Потім Ми-гени ампліфікують з бібліотеки рРСІТЕ-Мн. За допомогою ПЛР із бібліотек р26б04-М, і р7604-М, ампліфікують МК- і М, - гени, які несуть зворотну
Ун-ділянку і лінкерну послідовність на 5-кінці. Потім очищені на гелі ПЛР-продукти, які містять М н, МКкі М, лігують один з одним, одержуючи набір генів зсЕм. Набір генів зсЕм клонують у фагмідному векторі р2бО3 й су отриманий у результаті літування продукт вводять шляхом електропорації в компетентні клітини Е. соїї лінії о
ТО1, створюючи фагову дисплейну бібліотеку зсЕм, позначену НиРПарі З, яка несе 5,2 х109 індивідуальних трансформантів (Кау В.К. і ін. (1996) Рпаде Оізріау ої Реріїдев апа Ргоїеіпе: А І арогаїогу Мапиаї, вид-во
Асадетіс Ргезз, Зап ЮОіедо СА; Магке У.О. і ін. 9У. Мої. ВіоЇї. 222(3), 1991, стор.581-597; ЗПпееїв М.О. і ін.,
Ргос. Май). Асад. 5сі. ОА 95(11), 1998, стор.6157-61621. «І
ТФ-зв'язувальний фаг з фагової дисплейної бібліотеки зсЕм відбирають, ампліфікують і потім ідентифікують «- за допомогою методів пеннінгу, добре відомих у даній галузі. Розчинний ТФ іммобілізують на пластикових пробірках, при цьому для зменшення неспецифічного зв'язування із пластиком можна використовувати «- знежирене молоко. Популяцію фага, який експресує зсЕм (зсЕу-фага), наносять на іммобілізований р/Ф у «- пластикові пробірки, і незв'язаний фаг видаляють шляхом інтенсивного відмивання. зсЕу-фаг, який зв'язує ТФ, елююють із пробірок і потім ампліфікують, заражаючи клітини Е.соїї ТО1 у розчині. Вказану процедуру пеннінгуї СО повторюють тричі й отриманий зсЕму-фаг, який зв'язує ТФ, виділяють шляхом трансформації клітин лінії ТО1.
Трансформанти, які експресують антитіла, які зв'язують ТФ, ідентифікують за допомогою стандартного методу
ЕПІЗА, для здійснення якого використовують рТФ, іммобілізований на пластикових 96-лункових планшетах. «
Секвенують ДНК-вставки одноланцюгового антитіла позитивних за даними ЕГІЗА трансформантів. На основі секвенування виявлено 6 унікальних одноланцюгових антитіл, тобто зсЕм(ТЕ)2с1, зсЕм(ТР)2с11, зсЕм(ТР)2а3, - с зсЕМ(ТЕ)2Н6, зсЕм(ТЕ)Зе10 й зсЕм(ТЕ)ЗН2, які експресують і виділяють із Е.соїї і характеристики яких описані и нижче в прикладі 5. -» Експресія й очищення антитіл, запропонованих М винаході:
Існує декілька шляхів експресії іп мійго рекомбінантних антитіл, запропонованих у винаході, включаючи
Е.соїї, бакуловіруси, клітини дріжджів і ссавців або інші системи експресії. Методи експресії клонованих (ее) генів у бактеріях добре відомі. Для одержання високого рівня експресії клонованого гена в прокаріотичній - системі важливу роль відіграє конструювання експресійних векторів, які містять, як мінімум, сильний промотор для забезпечення термінації транскрипції мРНК. Прикладами регуляторних ділянок, які можна застосовувати для -й цієї мети, є промоторна й операторна ділянка гена бета-глюкозидази Е.соїї, гени шляху біосинтезу триптофану -о 20 БЕ.сої або "зворотний" промотор фага лямбда. Можна включати селектовані маркери у векторні ДНК, якими трансформують Е.соїї. Прикладами таких маркерів є гени, які забезпечують стійкість до ампіциліну,
Я» тетрацикліну або хлорамфеніколу.
Для експресії антитіл, запропонованих у винаході, і їх аналогів, фрагментів, похідних або варіантів можна застосовувати системи на основі клітин вищих еукаріотичних організмів, які можна вибирати із численних
Клітинних систем. Наведеними з метою ілюстрації прикладами клітинних ліній ссавців є (але, не обмежуючись о ними) клітини КРМІ 7932, МЕКО й Неї! а, лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО), УМІЗ8, ВНК, СО5-7, С127 або МОСК. Переважною лінією клітин ссавців є СНІ -1. Коли застосовують лінію СНІ -1, то як маркер селекції для ко еукаріотичних клітин використовують гігроміцин. СНІ -1-клітини одержують із клітин меланоми лінії КРМІ 7032, яка являє собою легко доступну людську лінію клітин. Лінія клітин СНІ --1 відповідно до Будапештського договору 60 депонована в АТСС 18 червня 1987р. під реєстраційним номером СК. 9446. Клітини, які можна застосовувати згідно із даним винаходом, можна одержувати з АТСС. Як ілюстративні приклади клітин можна привести клітини комах Зродоріега Ігидірегда й Вотрбух тогі.
У прокаріотичній системі, такій як Е.соїї, не можна здійснювати пост/трансляційну модифікацію, таку як глікозилювання. Крім того, білки зі складною системою дисульфідних містків часто мають помилки в укладанні 65 при експресії в Е.соїї. При застосуванні прокаріотичної системи експресований білок або присутній у клітинній цитоплазмі в нерозчиненій формі у вигляді так званих внутрішньоклітинних тілець, які знаходяться у розчинній фракції після лізису клітин, або його переносять у периплазму, додаючи відповідні секреторні сигнальні послідовності. Якщо експресований білок знаходиться в нерозчинних внутрішньоклітинних тільцях, то, як правило, потрібна солюбілізація й наступне повторне укладання внутрішньоклітинних тілець.
Фахівцям у даній галузі відомий багато прокаріотичних експресійних векторів, які надходять у продаж, таких як рКК223-3 (фірма Рпагтасіа Ріпе Спетісаіз, Уппсала, Швеція), рКК233-2 (фірма Сіопіесп, Пало-Альто, шт. Каліфорнія, США) і рОєМІ (фірма Рготеда Віоїесі, Медісон, шт. Вісконсин, США).
Промотори, які звичайно застосовують у рекомбінантних експресійних системах на основі мікроорганізмів, включають промоторні системи бета-лактамази (пеніцилінази) і лактози |Спапоа А.С. і ін., Маїшге, 275(5681), 7/0. 1978, стор.617-624; Сбоеаде! О.М. ї ін., Майиге 281(5732), 1979, стор.544-548), промоторну систему триптофану (гр) (Соєдаєї О.М. і ін., МисіІ. Асідв Кев. 8(18), 1980, стор.4057-4074| і промотор (ас (|Мапіаїй»: Т. і ін.,
Моіесшіаг Сіопіпд:. А Іарогагу МапиаіЇ, Со Зргіпд Нагрог Іарогаїгу (1982) В інших придатних бактеріальних системах експресії застосовують промотор фага лямбда рі і термоіндукований репресор сії5857
ІВегттага Н.О. ї ін. Сепе, 5(1), 1979, стор.59-76; Іоме С.А. і ін.,, Сепе 176(1-2), 1996, стор.49-53).
Рекомбінантні антитіла можна експресувати також у хазяїнах-дріжджах, таких як Засспаготусез сегемізіае. Це, як правило, дозволяє здійснювати різні посттрансляційні модифікації. Експресоване антитіло можна секретувати у супернатант культури, у якому не присутні залишки багатьох інших білків, що спрощує очищення. Вектори на основі дріжджів, призначені для експресії антитіл, запропонованих у винаході, несуть певні потрібні структури. Елементи вектора, як правило, одержують із дріжджів і бактерій для здійснення розмноження го плазміди в обох типах клітин. Бактеріальні елементи включають сайт ініціації реплікації й селектований маркер. Елементи дріжджів включають послідовність сайту ініціації реплікації (АК5), селектований маркер, промотор і термінатор транскрипції.
Придатними промоторами в експресійних векторах на основі дріжджів є промотори гена ТКРІ1, гена АСНІ або
АРНІ, гена кислої фосфатази (РНОЗ або РНОЗ5), гена ізоцитохрому або промотори, які беруть участь у гліколізі, сч сов такі як промотор єнолази, гліцеральдегід-З-фосфат-дегідрогенази (ЗАОРН), З-фосфогліцераткінази (РОК), гексокінази, піруваткінази, тріозофосфатізомерази й глюкозофосфатізомерази |Ніїбетап К.А. і ін., 9. Віої. і)
Спет. 255(24), 1980, стор.12073-12080; Незвв В. і ін., У. Адм. Еплуте Кед. 7, 1968, стор.149-167; і НоЇапа
М..). ї НоПага, 9.Р., Віоспетівігу 17(23), 1978, стор.4900-4907).
Вектори на основі дріжджів, які надходять у продаж, включають рУЕЗ2, рРІСУ (фірма Іпмийгодеп, Сан-Дієго, «г зо шт. Каліфорнія), Уерс-раОНга, русОЕ-1 (Ууазпіпоуїюп Кезеагсоп, Сіетл, шт. Вашингтон), рВС102-К22 (АТСС
Моб7255) і УроОХ265Б5АЇ4 (АТСС Моб7233). Лінії клітин ссавців, які можна застосовувати для експресії - рекомбінантних антитіл, запропонованих у винаході, включають (але, не обмежуючись ними) СО5-7, І -клітини, «-
С127, ЗТ3, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), НеГа, ВНК, СНІ-1, М5О й НЕК293. Рекомбінантні білки, які продукуються в клітинах ссавців, як правило, є розчинними й глікозидьованими й мають автентичні М-кінці. --
Експресійні вектори на основі клітин ссавців можуть містити нетранскрибовані елементи, такі як сайт ініціації со реплікації, промотор й енхансер й 5- або 3- нетрансльовані послідовності, такі сайта зв'язування рибосом, сайт поліаденілування, акцепторний сайт і донор для сплайсингу, і послідовності термінаторів транскрипції.
Прикладами промоторів, які звичайно застосовують в експресійних векторах на основі клітин ссавців, є вірусні промотори, такі як промотори вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу Т-клітинного лейкозу (НТІМ), мавпячого «
Вірусу 40 (ОВ 40) і людського цитомегаловірусу (СМУ). з с Залежно від вибраної системи експресії й хазяїна гомогенне рекомбінантне антитіло можна одержувати за допомогою різних сполучень загальноприйнятих методів хроматографії, які застосовують для очищення білків. ;» Вони включають: імуноафінну хроматографію, хроматографію із оберненою фазою, катіонообмінну хроматографію, аніонообмінну хроматографію, хроматографію на основі гідрофобних взаємодій,
Гель-фільтрацію й РХВР. Якщо система експресії секретує антитіло в живильні середовища, то білок можна
Го! очищати безпосередньо із середовищ. Якщо не відбувається секреція антитіла, то його виділяють із клітинних лізатів. Руйнування клітин можна здійснювати за допомогою будь-якого загальноприйнятого методу, включаючи - цикли заморожування-відтавання, опромінення ультразвуком, механічне руйнування або застосування - лізувальних клітини агентів.
Для експресії в бактеріях одноланцюгового антитіла, запропонованого у винаході, застосовують плазмідну - конструкцію на основі РСАМТАВ5 (фірма РПагтасіа). Наприклад, плазміда, яка містить одноланцюгове антитіло ї» зеЕМ(ТЕ)Зе10, являє собою плазміду р2612/Зе10, і вона кодує послідовність одноланцюгового антитіла, за якою розташована послідовність мітки е-їау, що застосовується для очищення білка. Амінокислотна послідовність антитіла зсЕМ(ТЕ)Зе10 відповідає 5БО ІЮО МО: 1 (приклад 1), а послідовність ДНК, яка кодує зсЕм(ТЕ)Зе10 5Б відповідає ЗЕО ІЮ МО:2.
Плазмідну конструкцію, основою якої є рІНК5б25 |див. 05 5827824), використовують для експресії (Ф, одноланцюгових антитіл, запропонованих у даному винаході, у клітинах ссавців. Наприклад, конструюють ка праймери для створення ДНК-фрагмента, який перекриває амінокислотну послідовність про-зсЕм(ТЕ)Зе10, включаючи М-кінцеву сигнальну послідовність й С-кінцеву е-їад-послідовність, у бактеріальній експресійній бо плазміді. Здійснюють ПЛР для створення ДНК-фрагмента, які вбудовують в експресійну плазміду ссавців, що містить ген, який зумовлює стійкість до ампіциліну, і гени маркерів селекції гігроміцину й ОНЕК (дигідрофолатредуктази). Експресія одноланцюгових антитіл, запропонованих у винаході, знаходилася під контролем промотору | ТКМРБОМ.
Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу експресійними конструкціями, призначеними для 65 клітин ссавців, трансфектують СНоО-клітини лінії ОХВ11. Відбирають стабільні популяції, використовуючи 40Омкг/мл гігроміцину В у середовищі НАМ5/Е12. Рівні експресії становлять приблизно 50Омкг/л. Для підвищення рівнів експресії для відбору популяції використовують 100НМ метотрексат у середовищі альфа-МЕМ. Рівень експресії цієї популяції становить приблизно 5мг/л.
Антитіла, запропоновані в даному.винаході, можна очищати за допомогою методів, добре відомих у даній галузі. Наприклад, антитіла можна очищати за допомогою афінної хроматографії на колонці, з якою зв'язаний
ТФ. Потім комплекс ТФ-антитіла можна елюювати із колонки за допомогою буфера з високою концентрацією солі.
Одноланцюгові антитіла, запропоновані у винаході, містять на С-кінці білка послідовність е-їад. Колонки для афінної хроматографії, які містять антитіла до е-ї(ад, одержують від фірми Атегісап/Рпагтасіа Віоїесі. 70 Середовища для культури клітин фільтрують через фільтр із розміром отворів 0,22мкм і вносять в 5-мілілітрову колонку, завантажену е-їад, із швидкістю 2мл/хв. Колонку відмивають 0,2М фосфатним буфером, доповненим 0,0595 Мама, рН7,0, і потім продукт збирають у пробірки, які містять 0,1 об'єму ЇМ Трис-буфера, рНВ,2, для нейтралізації буфера для елюювання. В іншому варіанті профільтроване культуральне середовище вносять у колонку, завантажену протеїном А. У цьому випадку колонку відмивають 50ММ лимонною кислотою, ЗООмММ Масі, 75 РНб,5 й елююють цим же буфером, рНЗ.0. В обох випадках очищені зразки потім вносять у колонку, заповнену
Зерпадех 200, для відділення мономерних форм антитіла від димерних форм.
Відбір антитіл, запропонованих у винаході:
Після того як антитіла отримані, експресовані й очищені їх можна додатково характеризувати за допомогою
ВІАсоге, аналізу оцінки рІФ-залежного фактора Мііа (аналіз здатності рІФ/ЕМІЦа здійснювати пептидний гідроліз), аналізу активації ЕХ й оцінки ПЧ, які описані в прикладі 4, для ідентифікації антитіл, запропонованих у даному винаході.
Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу зсЕм-антитіла, які зв'язують ТФ, які зв'язуються з більшою афінністю з комплексом ЕМПа/ТФ, ніж з вільним ТФ, відбирають за допомогою аналізу здатності рТФ/ЕМіїа здійснювати пептидний гідроліз. При оцінці цим аналізом для антитіл до ТФ, які зв'язуються з с більшою афінністю з комплексом ЕМіїа/ТФ, ніж з вільним ТФ, повинні бути характерні більш високі значення К р(арру На Фіг.2 показано, що для одноланцюгового антитіла зсЕм(ТЕ)Зеї10 значення К ду(арру о підвищується «в 5 разів. Для оцінки афінності антитіл до ТФ до комплексу ЕМІІа/ТФ у порівнянні з одним ТФ застосовують мікрокалориметричний аналіз. На Фіг5 показано, що одноланцюгове антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 характеризується значеннями К р зв'язування з комплексом ЕМііа/ТФ і з вільним ТФ, що становлять бО0НМ й «І
ЗЗНМ відповідно, що свідчить про «20-кратне підвищення афінності до комплексу ЕМІа/ТФ у порівнянні з вільним
ТФ. Антитіла, запропоновані в даному винаході, мають принаймні в 2 рази, переважно принаймні в 5 разіві (37 найбільш переважно принаймні в 10 разів більш високу афінність до комплексу ЕМІІа/ТФ, ніж до ТФ. «--
ТвсЕу-антитіла, які зв'язують ТФ, які не конкурують із ЕМІЇ за зв'язування із ТФ, відбирають за допомогою аналізу здатності РТФ/ЕМіІІа здійснювати пеїігтидний гідроліз. У цьому аналізі антитіла до ТФ, які конкурують - із ЕМіа за зв'язування із ТФ, повинні інгібувати гідроліз хромогенного субстрату 52266. На Фіг.1 показано, Ге) що одноланцюгове антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 не інгібує, а фактично підвищує активність ЕМІа. зсегЕу-антитіла, які зв'язують ТФ, які інгібують активацію ЕХ, відбирають за допомогою оцінки ПЧ й аналізу активації ЕХ. При здійсненні аналізу ПЧ слід очікувати, що антитіла до ТФ, які пролонгують ПЧ, повинні інгібувати активацію ЕХ. На Фіг.3 показано, що одноланцюгове антитіло зсЕмМ(ТЕ)Зе10 пролонгує ПЧ, що « дозволяє припустити, що це антитіло інгібує активацію ЕХ. При аналізі активації ЕХ антитіла до ТФ, які шщ с інгібують активність ЕХа, повинні інгібувати гідроліз хромогенного субстрату 52222. На Фіг.б показано, що й одноланцюгове антитіло зсЕМ(ТЕ)Зе10 інгібує активність ЕХа. «» зсЕу-антитіла, які зв'язують ТФ, які не конкурують із ЕХ за зв'язування із ТФ, відбирають за допомогою аналізу активації ЕХ. У цьому аналізі антитіла до ТФ, які не конкурують із ЕХ, повинні інгібувати активацію
ЕХ незалежно від застосовуваної концентрації ЕХ. На Фіг.7 показано, що одноланцюгове антитіло зсЕм(ТЕ)Зе1о о інгібує активність ЕХа незалежно від концентрації ЕХ.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу виявлене одноланцюгове антитіло - (зсЕм(ТР)Зе10), яке несе один М Ц/М,-зв'язувальний центр для ТФ. Амінокислотна послідовність зсЕм(ТЕ)Зе1о - представлена в прикладі 1 і відповідає ЗЕО ІЮ МО:1. Послідовність ДНК, яка кодує зсЕм(ТЕ)Зе10, відповідає 5ЕС) - Аналоги, фрагменти, похідні й варіанти антитіл, запропонованих у винаході:
Та» Під аналогом, фрагментом, похідним або варіантом антитіл, запропонованих у даному винаході, мають на увазі аналог, фрагмент, похідне або варіант, у якому: (І) один або декілька амінокислотних залишків замінені консервативним або неконсервативним амінокислотним залишком (переважно консервативним амінокислотним
Залишком), і такий замінений амінокислотний залишок може кодуватися таким же або відмінним генетичним кодом; або (ІІ) у якому один або декілька амінокислотних залишків включають групу замісника, або (І) у іФ) якому зріле антитіло злите з іншою Сполукою, наприклад, із сполукою, яка збільшує час напівжиття антитіла ко (наприклад, з поліетиленгліколем), або (ІМ) у якому додаткові амінокислоти злиті зі зрілим антитілом, такі як лідерна або секреторна послідовність або послідовність, яку застосовують для очищення зрілого антитіла. З бо наведеного опису фахівцям у даній галузі повинне бути очевидне поняття "аналоги", фрагменти", "похідні" й "варіанти".
Переважно похідні, запропоновані в даному винаході, повинні містити консервативні амінокислотні заміни (додатково описані нижче) одного або декількох передбачених, переважно замінних амінокислотних залишків. "Замінний" амінокислотний залишок являє собою залишок, який може бути замінений у послідовності білка б5 дикого тину без зміни біологічної активності, а "незамінний" амінокислотний залишок необхідний для прояву біологічної активності. Поняття "консервативна амінокислотна заміна" означає заміну, при якій амінокислотний залишок замінюють амінокислотним залишком, який має аналогічний боковий ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які мають аналогічні бокові ланцюги, відомі в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Неконсервативні заміни не можуть стосуватися консервативних амінокислотних залишків 7/0 або амінокислотних залишків, розташованих в консервативному домені білка, якщо заміни не роблять із метою відбору варіанта антитіл, що буде додатково описано нижче. Фрагменти або біологічно активні білки включають поліпептидні фрагменти, придатні для застосування як лікарський засіб, реагент для дослідження й т.п.
Фрагменти включають пептиди, які містять амінокислотні послідовності, аналогічні або виведені з амінокислотних послідовностей антитіла, запропонованого в даному винаході, і які мають принаймні одну /5 активність вказаного поліпептиду, але які включають менше амінокислот у порівнянні з описаними повнорозмірними поліпептидами.
Крім того, переважні похідні, запропоновані в даному винаході, включають зрілі антитіла, злиті з іншою сполукою, наприклад, із сполукою, яка подовжує час напівжиття поліпептиду та/або знижує потенційну імуногенність поліпептиду (наприклад, з поліетиленгліколем, "ПЕГУ). ПЕГ можна застосовувати для впливу на 2о Водорозчинність, розмір, повільну швидкість ниркового кліренсу й для зниження імуногенності антитіла |див., наприклад, 05 6214966). При ПЕГілюванні злиття антитіла з ПЕГ можна здійснювати за допомогою будь-яких методів, відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, ПЕГілювання можна здійснювати спочатку шляхом інтродукції цистеїну за допомогою мутації в антитіло з наступною сайтспецифічною дериватизацією з використанням ПЕГ-малеїміду. Цистеїн можна додавати до С-кінця пептидів Ідив., наприклад, Тзці8иті й ін., сч
Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 97(15), 2000, стор.8548-85531). Інша модифікація, якій можна піддавати антитіло, включає біотинілювання. У певних випадках може знадобитися, щоб антитіло було біотинільовано так, щоб легко і) вступати в реакцію із стрептавідином. Методи біотинілювання білків добре відомі в даній галузі. Крім того, можна інтродукувати сайта М- або О-глікозилювання в послідовності антитіл для того, щоб постгрансляційне зв'язане з М або О глікозилювання антитіл могло відбуватися іп мімо. «г зо Варіанти антитіл, запропоновані в даному винаході, включають поліпептиди, амінокислотна послідовність яких аналогічна до амінокислотної послідовності вихідних антитіл. Поняття "аналогічна" означає, що перша - амінокислотна, послідовність містить достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних «- амінокислотних залишків відносно другої амінокислотної послідовності, так що перша й друга амінокислотні послідовності мають загальний структурний домен та/або загальну функціональну активність. Наприклад, ї"7 амінокислотні послідовності, які містять загальний структурний домен, ідентичний принаймні приблизно на 4595, со переважно приблизно на 75-9895, розглядаються в контексті даного опису як аналогічні. Переважно варіанти повинні бути аналогічні до амінокислотної послідовності переважних антитіл, запропонованих у даному винаході.
Варіанти включають варіанти антитіл, що кодуються полінуклеотидом, який гібридизується з полінуклеотидом, запропонованим у даному винаході, або його комплементом у строгих умовах. Такі варіанти, як правило, « зберігають функціональну активність антитіл, запропонованих у даному винаході. Для створення різнорідної з с популяції фрагментів, призначеної для скринінгу й наступного відбору, можна застосовувати бібліотеки . фрагментів полінуклеотидів. Наприклад, бібліотеку фрагментів можна створювати шляхом обробки и?» дволанцюгового ПЛР-фрагмента полінуклеотиду нуклеазою в умовах, при яких відбувається приблизно тільки один одноланцюговий розрив ("нік") на молекулу, денатурації дволанцюгової ДНК, ренатурації ДНК із утворенням дволанцюгової ДНК, що може включати смислові/антисмислові пари з різних, отриманих у результаті "ніків" о продуктів, видалення одноланцюгових ділянок з перетворених дуплексів шляхом обробки нуклеазою 51 і вбудовування шляхом літування отриманої бібліотеки фрагментів в експресійний вектор. За допомогою цього - методу можна створювати експресійну бібліотеку, яка кодує М-кінцеві й внутрішні фрагменти різних розмірів - антитіл, запропонованих у даному винаході.
Варіанти включають антитіла, які мають відмінності в амінокислотній послідовності в результаті - мутагенезу. Наприклад, мутагенез можна здійснювати за допомогою методів рекомбінантної ДНК, які добре ї» відомі в даній галузі, модифікуючи М, - і Му-ділянки легких і важких ланцюгів Ід, створюючи варіанти, які мають більш високу афінність до зв'язування з комплексом ЕМіІІа/ТФ, ніж з вільним ТФ. Особливо переважні варіанти включають антитіла, які мають модифікації в гіперваріабельних ділянках М, - і Мн-ділянок.
Варіанти включають також антитіла, які мають відмінності в амінокислотній послідовності через вставки або делеції амінокислотних залишків, отриманих у результаті мутагенезу. Наприклад, мутагенез можна здійснювати (Ф) за допомогою методів рекомбінантної ДНК, які добре відомі в даній галузі, для вбудовування або делеції ка амінокислот в М-кінцевих або С-кінцевих ділянках М, - і Му-ділянок легких і важких ланцюгів Ід, одержуючи варіанти, які зберігають практично таку ж функціональну активність. Особливо переважні варіанти включають бо одноланцюгові антитіла із вставками або делеціями амінокислотних залишків в М Н-Мі-лінкери між Му- і
МіІ-ділянками. М Д-М, -лінкерна послідовність в одноланцюговому антитілі, описаному в прикладі 1, складається з 5 амінокислотних залишків. Очевидно, що можна використовувати інші короткі лінкерні послідовності, які складаються з 0-20 амінокислот, якщо антитіло зберігає практично аналогічну функціональну активність.
Модифікації існуючого МН-М,-лінкера можна використовувати для підвищення стабільності димерної форми 65 одноланцюгового антитіла.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу бібліотеку із широкою розмаїтістю варіантів одержують шляхом комбінаторного мутагенезу на нуклеотидному рівні, і вона кодується бібліотекою із широкою розмаїтістю генів. Бібліотеку із широкою розмаїтістю варіантів можна одержувати, наприклад, шляхом ферментативного лігування суміші синтетичних олігонуклеотидів у генних послідовностях, таким чином, щоб вироджений набір потенційних варіантів амінокислотних послідовностей міг експресуватися у вигляді індивідуальних поліпептидів, або в іншому варіанті у вигляді більших злитих білків (наприклад, для фагової дисплейної бібліотеки), які містять набір послідовностей. Відомий цілий ряд методів, які можна застосовувати для створення бібліотек потенційних варіантів з виродженої олігонуклеотидної послідовності. Хімічний синтез виродженої генної послідовності можна здійснювати в автоматичному синтезаторі ДНК і потім вбудовувати 7/0 шляхом лігування синтетичний ген у відповідний експресійний вектор. Застосування виродженого набору генів дозволяє об'єднувати в одній суміші всі послідовності, які кодують необхідний набір послідовностей потенційних варіантів. Методи синтезу вироджених олігонуклеотидів відомі в даній галузі |див., наприклад,
Магапо, Тейапедгоп 39, 1983, с.3; Макига й ін, Аппи. Кем. Віоспет. 53, 1984а, с.323; Макига й ін,
Зсіепсе 198, 19846, с.1056; Іке й ін., Мисівїс Асій Кев. 11,1983, с.477).
У даній галузі відомо декілька методів скринінгу генних продуктів комбінаторних бібліотек, створених за допомогою точкових мутацій або укорочування, і для скринінгу бібліотек КДНК із метою введення генних продуктів, що несуть відібрану ознаку. Такі методи можна адаптувати для швидкого скринінгу генних бібліотек, створених шляхом комбінаторного мутагенезу антитіл, на здатність зв'язуватися із ТФ- або з комплексом
ЕМНа//Ф або на здатність інгібувати активацію ЕХ. Найбільш широко використовувані методи, які можна 2о застосовувати для великомасштабного скринінгу більших генних бібліотек, як правило, включають клонування генної бібліотеки в здатні до реплікації експресійних векторах, трансформацію відповідних клітин з одержанням бібліотеки векторів й експресію комбінаторних генів в умовах, при яких виявлення необхідної активності полегшує виділення вектора, що кодує ген, продукт якого був виявлений. Для ідентифікації необхідних варіантів можна застосовувати в сполученні з методами скринінгу рекурсивний груповий мутагенез (КЕМ), метод, який сч об ДОЗВОЛЯЄ збільшувати частоту функціональних мутантів у бібліотеках.
У прикладі 1 представлена амінокислотна послідовність одного із одноланцюгових антитіл, які зв'язують ІТФ, (8) а саме зсЕм(ТЕ)Зе10 (ЗЕО ІЮО МО), і делінеаризовані МН-М,-лінкер й Му- і Мі-ділянки. Варіанти, які мають здатність зв'язувати ТФ або комплекс ЕМіІа/ТФ або інгібувати активацію ЕХ, можна виявляти шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек мутантів, наприклад, інсерційних, укорочених або точкових мутантів антитіл, «г зо Запропонованих у даному винаході, за допомогою аналізу здатності РТФ/ЕМІа здійснювати пептидний гідроліз або аналізу активації ЕХ, які описані в прикладі 4. Антитіла, запропоновані в даному винаході, включають - антитіла, описані в прикладах 1 й З (ЗЕБЕО ОО МО:1 й 3), а також антитіла, які мають несуттєві варіації «- послідовності. Поняття "несуттєва варіація" включає будь-який варіант послідовності, пов'язаний із заміною або делецією, яка зберігає в значній мірі принаймні одну біологічну функцію антитіл, запропонованих у даному 77 винаході, наприклад, здатність інгібувати активацію ЕХ. Такі функціональні еквіваленти переважно можуть со включати антитіла, у яких домени М ,- або Му-ділянки ідентичні принаймні на 9095 до вказаних доменів одноланцюгового антитіла, яке має послідовність ЗЕО ІЮ МО:1 або ЗЕО ІО МОЗ, і більш переважно принаймні на 95965 ідентичні до доменів М, - або Му-ділянки одноланцюгового антитіла, яке має послідовність ЗЕО ІЮ МО:1 або 5ЕО ІО МО:3, і ще більш переважно принаймні на 9795 ідентичні до доменів М,;- або Мр-ділянки « одноланцюгового антитіла, яке має послідовність ЗЕО ІЮО МО: або 5ЕО ІЮО МО:3, а також включають ділянки в с такого антитіла, які мають практично однакову біологічну активність. Однак під обсяг даного винаходу підпадає будь-яке антитіло, амінокислотна послідовність якого має незначну варіацію відносно антитіла, яке має ЗЕО ІЮ ;» МО 1 або 5ЕО ІЮО МО:3, що є функціональним еквівалентом, як це буде описано нижче.
Фармацевтичні композиції:
Винахід стосується також фармацевтичних композицій, які можна вводити пацієнтові для досягнення
Го! терапевтичної дії. Фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, можна готувати для введення, об'єднуючи антитіло, запропоноване в даному винаході, яке має необхідний ступінь чистоти й взято у - фармацевтично ефективній кількості, з фізіологічно прийнятними носіями. - Антитіла, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати у вигляді фармацевтичних композицій, призначених для внутрішньовенного введення або підшкірного введення або внутрішньотрахеального введення. - Таким чином, описані вище антитіла переважно об'єднують із прийнятним стерильним фармацевтичним ї» носієм, таким як 595-на декстроза, лактований розчин Рінгера, звичайний фізіологічний розчин, стерильна вода або будь-який інший фізіологічний буферний розчин, який надходить у продаж, призначений для внутрішньовенної інфузії. Повинно бути очевидно, що вибір розчину-носія й доза, а також шлях введення в Композиції повинні змінюватися залежно від пацієнта й конкретної клінічної вимоги й повинні регулюватися стандартними медичними процедурами. (Ф) Відповідно до способів, запропонованих у даному винаході, вказані фармацевтичні композиції можна вводити ка в кількостях, ефективних для інгібування патологічних станів, які зв'язані з надлишковим утворенням тромбіну в індивідуума. во Введення антитіла можна здійснювати шляхом болюсної внутрішньовенної ін'єкції шляхом постійної внутрішньовенної інфузії або шляхом об'єднання обох шляхів. В іншому або додатковому варіанті антитіло, змішане з відповідними ексципієнтами, може потрапляти в кровоток із внутрішньом'язової ділянки. Системне лікування за допомогою антитіла можна оцінювати, визначаючи активований парціальний тромбопластиновий час (АПТУ) на серійних зразках крові, взятої в пацієнта. Час згортання, який визначається в цьому досліді, 65 подовжується, коли в кровотоці досягається достатній титр антитіла.
Рекомбінантні антитіла й фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати для парентерального, місцевого, внутрішньовенного або локального введення. Фармацевтичні композиції можна вводити у вигляді різних стандартних доз лікарських засобів залежно від методу введення. Наприклад, стандартні дози лікарських засобів можна вводити у формі, що включає (але, не обмежуючись ними) таблетки, капсули, порошок, розчини й емульсії.
Рекомбінантні антитіла й фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, найбільш придатні для внутрішньовенного введення. Призначені для введення композиції, як правило, містять розчин одноланцюгового антитіла у фармацевтично прийнятному носії, переважно водному носії. Можна застосовувати різні водні носії, наприклад, забуферений фізіологічний розчин і т.п. Ці розчини є стерильними й, як правило, не містять 70 небажаних продуктів. Композиції можна стерилізувати за допомогою загальноприйнятих добре відомих методів стерилізації.
Типову фармацевтичну композицію для внутрішньовенного введення може легко вибрати фахівець у даній галузі. Кількості, які вводять, безумовно, визначаються специфічністю білка й залежать від його ефективності й фармакокінетичного профілю. Сучасні методи приготування композицій, які вводяться парентерально, добре 75 відомі фахівцям у даній галузі й більш докладно описані |в Кетіпдіоп'з Рпагтасеціїса! Зсіепсе, 152 вид., вид-во
Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еазіоп, Ра (1980).
Композиції, які містять антитіла, запропоновані в даному винаході, або їх суміш (тобто суміш із іншими білками) можна вводити як терапевтичний лікарський засіб. Для терапевтичного застосування композиції вводять пацієнтові, який страждає від зв'язаних із кровотечею порушень або захворювань, у кількості, достатній для лікування або принаймні часткового припинення кровотечі. Необхідну для цього кількість називають "терапевтично ефективною кількістю". Ефективна для вказаної мети кількість повинна залежати від серйозності захворювання й загального стану здоров'я пацієнта.
Композиції можна застосовувати у вигляді однократної дози або декількох доз залежно від рівня дози й необхідної частоти введення й переносимості пацієнтом. У будь-якому випадку композиція повинна Га забезпечувати достатню кількість білків, запропонованих у даному винаході, для ефективного лікування пацієнта. і9)
Антитіла, запропоновані у винаході, або їх фармацевтично прийнятні композиції вводять у терапевтично ефективній кількості, яка повинна змінюватися залежно від різних факторів, таких як активність специфічного застосовуваного антитіла; метаболічна стабільність і тривалість дії антитіла; вік, вага тіла, загальний стан «І зо здоров'я, стать й раціон пацієнта; шлях і час введення; швидкість виведення; комбінація лікарських засобів; серйозність конкретного хворобливого стану; і лікування, якому піддається хазяїн. Як правило, добова -- терапевтично ефективна кількість становить від приблизно 0,14 до приблизно 14,Змг/кг ваги тіла в день че антитіла, запропонованого у винаході, або його фармацевтично прийнятної композиції; переважно від приблизно 0,7 до приблизно 1Омг/кг ваги тіла в день; і найбільш переважно від приблизно 1,4 до приблизно 7,2мг/кг ваги - тіла в день. Наприклад, для введення людині вагою 7Окг дози повинні становити від приблизно 1Омг до с приблизно 1,0г на день антитіла, запропонованого у винаході, або його фармацевтично прийнятної композиції, переважно від приблизно 50 до приблизно 7ООмг на день, і найбільш переважно від приблизно 100 до приблизно
БООмг на день. «
Клітинна та генна терапія:
Антитіло, запропоноване у винаході, можна застосовувати згідно із даним винаходом шляхом експресії такого ЩО с антитіла іп мімо за допомогою методу, який називають "клітинна терапія". Так, наприклад, можна створювати ц клітини, які несуть полінуклеотид (ДНК або РНК), який кодує антитіло ех мімо, і потім вводити створені и"? клітини пацієнтові для лікування за допомогою антитіла. Такі методи добре відомі в даній галузі. Наприклад, клітини можна створювати за допомогою процедур, добре відомих у даній галузі, шляхом застосування ретровірусної частинки, яка містить РНК, що кодує антитіло, запропоноване в даному винаході. (ее) Антитіло, запропоноване у винаході, можна застосовувати також згідно із даним винаходом шляхом експресії такого антитіла іп мімо за допомогою методу, який називають "генна терапія". Так, наприклад, можна створювати - вірус, який несе полінуклеотид (ДНК або РНК), який кодує антитіло, і потім вводити створений вірус пацієнтові - для лікування за допомогою антитіла. Такі методи добре відомі в даній галузі. Наприклад, за допомогою цу процедур, добре відомих у даній галузі, можна створювати рекомбінантні аденовіруси, які містять ДНК, що кодує антитіло, запропоноване в даному винаході.
ГТ» Локальне введення антикоагулювальних антитіл, запропонованих у даному винаході, з використанням клітинної або генної терапії може забезпечувати введення терапевтичного агента в галузь-мішень, тобто вистілку кровоносних судин, яка складається з епітеліальних клітин.
Під обсяг винаходу підпадають методи іп мійго й іп мімо як клітинної, так і генної терапії. Відомо декілька методів перенесення потенційно терапевтичних генів у певні клітинні популяції |див., наприклад, іФ) Миїїдап, Зсіепсе 260,1993, стор.926-931). Ці методи включають: ко 1) безпосереднє перенесення генів |див., наприклад, УМоїй й ін, Зсіепсе, 247, 1990, стор.1465-14681; 2) опосередковуване ліпосомами перенесення ДНК |див., наприклад, Сарієп й ін., Майте Мей 3, 1995, бо стор.39-46; СтузвіаІ!, Майїге Меа. 1, 1995, стор.15-17; бао й Ниапо, Віоспет. Віорпуз. Ке5. Сотт. 179, 1991, стор.280-2851; 3) опосередковуване ретровірусом перенесення ДНК |див., наприклад, Кау й ін., Зсіепсе 262, 1993, стор.117-119; Апаеггоп, 5сіепсе 256, 1992, стор.808-8131; 4) опосередковуване ДНКовими вірусом перенесення ДНК. Такі ДНКові віруси включають аденовіруси 65 (переважно вектори на основі Ад2 або Аа), віруси герпесу (переважно вектори на основі вірусу герпеса простого) і парвовіруси (переважно вектори на основі "дефектних або не автономних парвовірусів, більш переважно вектори на основі аденоасоційованого вірусу, більш переважно вектори на основі ААМ-2) (Ідив., наприклад, АЙ й ін., Сепе ТНегару 1, 1994, стор.367-384; 5 4797368, включений у даний опис як посилання, і 51399411, включений у даний опис як посилання). 5 Вибір конкретної векторної системи для перенесення гена, який представляє інтерес, повинен залежати від ряду факторів. Одним з важливих факторів є природа клітинної популяції-мішені. Хоча ретровірусні вектори широко вивчені й знайшли застосування в різних аспектах генної терапії, ці вектори, як правило, не можна застосовувати для зараження клітин, що не діляться. Крім того, ретровіруси мають потенційну канцерогенність.
Однак сучасні розробки в галузі лентивірусних векторів дозволяють подолати деякі із цих обмежень |див. 70 Маїаїпі й ін., Зсіепсе 272, 1996, стор.263-2671.
Ретровіруси, на основі яких можна створювати вказані вище ретровірусні плазмідні вектори, включають (але, не обмежуючись ними), вірус мишиного лейкозу Молоні, вірус некрозу селезінки, ретровіруси, такі як вірус саркоми Рауса, вірус саркоми Гарвея, вірус лейкозу птахів, вірус лейкозу гібонів, вірус імунодефіциту людини, аденовірус, вірус мієлопроліферативної саркоми й вірус пухлини молочної залози. В одному з варіантів здійснення винаходу, ретровірусний плазмідний вектор одержують із вірусу мишиного лейкозу Молоні.
Перевагою аденовірусів є широкий спектр їх хазяїв, їх здатність заражати спочиваючі або повністю диференційовані клітини, такі як нейрони або гепатоцити й те, що, імовірно, вони в основному не є канцерогенними |див., наприклад, АМ й ін. (1994), вище, с.367)|. Аденовіруси, імовірно, не інтегруються в геном хазяїна. Оскільки вони існують поза хромосомами, ризик інсерційного мутагенезу в значній мірі знижений
ІА й ін. (1994), вище, с.37 31.
Аденоасоційовані віруси мають такі ж переваги, що й вектори на основі аденовірусів. Однак для ААМ характерна сайтспецифічна інтеграція в людську хромосому 19 |АЇЇ й ін. (1994), вище, с 3771.
Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу ДНК, яка кодує антитіла, запропоновані в даному винаході, застосовують у клітинній або генній терапії для порушень, які включають (але, не обмежуючись ними) сч ов тромбоз глибоких вен, дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові, гострий коронарний синдром або рак з о ознакою коагулопатії.
Відповідно до цього варіанта здійснення винаходу клітинну або генну терапію з використанням ДНК, яка кодує антитіла, запропоновані в даному винаході, застосовують для лікування пацієнта, який має потребу в цьому, при встановленні діагнозу або відразу після цього. «г зо Фахівцям у даній галузі повинне бути очевидно, що відповідно до цього варіанта здійснення винаходу можна застосовувати будь-який придатний для генної терапії вектор, який містить ДНК, яка кодує антитіло, - запропоноване у винаході або ДНК, яка кодує аналоги, фрагменти, похідні або варіанти антитіла, «- запропонованого у винаході. Методи конструювання такого вектора добре відомі |див., наприклад, Апдегзоп МУР.
Майте 392, 1998, стор.25-30; Мегта І.М. і Ботіа М. Майте 389, 1998, стор.239-242)|. Інтродукцію вектора, -- який містить ДНК антитіла, у галузь-мішень можна здійснювати відомими методами. со
Вектори, які застосовують для клітинної або генної терапії включають один або декілька промоторів.
Прийнятні промотори, які можна застосовувати, включають (але, не обмежуючись ними) ТК ретровірусу; промотор ОВ-40 і промотор людського цитомегаловірусу (СММ), описані |в Міїег й ін, ВіоФесппідцез 7(9), 1989, стор.980-990), або будь-який інший промотор (наприклад, клітинні промотори, такі як промотори еукаріотичних « клітин, які включають (але, не обмежуючись ними), промотори пістону, ро! ПІ й В-актину). Інші вірусні з с промотори, які можна застосовувати, включають (але, не обмежуючись ними), промотори аденовірусів, промотори тимідинкінази (ТК) і промотори парвовірусу В19. Вибір придатного промотору повинен бути ;» очевидний фахівцям у даній галузі після ознайомлення з даним описом.
Нуклеотидна послідовність, яка кодує антитіло, запропоноване в даному винаході, знаходиться під контролем прийнятного промотору. Прийнятні промотори, які можна застосовувати, включають (але, не обмежуючись ними)
Го! промотори аденовірусів, наприклад, основний пізній промотор аденовірусу; або гетерологічні промоторів, наприклад, промотор цитомегаловірусу (СММ); опромотор респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ); - індуцибельні промотори, наприклад, промотор ММТ, промотор металотіонеїну; промотори теплового шоку; - промотор альбуміну; промотор АроА!; промотори людського глобіну; промотори вірусної тимідинкінази, 5р Наприклад, промотор тимідинкінази вірусу герпесу простого; ретровірусні ГТК (включаючи модифіковані - ретровірусні І ТК, які описаний вище); промотор В-актину; і промотор людського гормону росту. ї» Ретровірусний плазмідний вектор застосовують для трансдукції клітинних ліній, що упаковують, для одержання клітинних ліній- продуцентів. Приклади пакувальних клітин, які можна трансфектувати, включають (але, не обмежуючись ними) РЕБО1, РАЗ17, хр-2, у-АМ, РА12, Т19-14Х; МТ-19-17-Н2, у СКЕ, уСтІР, ОР Я-86, 5в ОгРжепуАт?і2 і клітинних ліній САМ, які описані (в МіПег, Нитап Сепе Тнегару 1, 1990, стор.5-14), публікація повністю включена в даний опис як посилання. Вектором можна трансдукувати пакувальні клітини за допомогою іФ) будь-яких методів, відомих у даній галузі. Такі методи включають (але, не обмежуючись ними) електропорацію, ко застосування ліпосом й осадження за допомогою СаРоО )у. Як одна з альтернатив ретровірусний плазмідний вектор можна капсулювати у ліпосому або зшивати з ліпідом, а потім вводити хазяїнові. Клітинна бо Ллінія-продуцент утворює інфекційні ретровірусні частинки, які включають нуклеотидну(і) послідовність (послідовності), яка(ї) кодує(ють) поліпептиди. Такі частинки ретровірусних векторів можна потім застосовувати для трансдукції еукаріотичних клітин або іп мійго, або іп мімо. Трансдуковані еукаріотичні клітини повинні експресувати нуклеотидну(і) послідовність (послідовності), яка(ї) кодує(ють) поліпептиди.
Еукаріотичні клітини, які можна трансдукувати, включають (але, не обмежуючись ними) ембріональні стовбурові б5 Клітини, ембріональні ракові клітини, а також гематопоетичні стовбурові клітини, гепатоцити, фібробласти, міобласти, кератиноцити, ендотеліальні клітини й бронхіальні епітеліальні клітини.
Альтернативним генної терапії підходом є "транскаріотична терапія", при здійсненні якої клітини пацієнта обробляють ех мімо для того, щоб індуцкувати у мовчазних хромосомних генів здатність продукувати білок, який представляє інтерес, після зворотної інтродукції в організм пацієнта. Транскаріотична терапія має на увазі,
ЩО пацієнт має нормальний комплемент генів, необхідний для активації. Транскаріотична терапія передбачає інтродукцію промотору або іншої екзогенної регуляторної послідовності, яка має здатність активувати гени, що знаходяться на стадії виникнення, у хромосомній ДНК клітин пацієнта ех мімо, культивування й відбір клітин, які продукують активний білок, і наступну зворотну інтродукцію активованих клітин в організм пацієнта для того, щоб вони потім повністю відновилися. Після цього "активована геном" клітина продукує білок, який /о представляє інтерес, протягом деякого значного проміжку часу, можливо, протягом всього пацієнта життя. |В О5 5641670 й 5733761) докладно викладена ця концепція, і вони повністю включені в даний опис як посилання.
Набори:
Даний винахід стосується також наборів для дослідження або діагностичних цілей. Набори, як правило, включають один або декілька контейнерів, які містять антитіла, запропоновані в даному винаході. Відповідно до /5 переважного варіанта здійснення винаходу набори включають контейнери, які містять одноланцюгові антитіла у формі, придатній для дериватизації з використанням другої молекули. Відповідно до найбільш переважного варіанта здійснення винаходу набори включають контейнери, які містять антитіло, яке має послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 1 або 5ЕО ІО МО:3.
Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу набори можуть містити послідовності ДНК, які кодують 2о антитіла, запропоновані у винаході. Переважно послідовності ДНК, які кодують ці антитіла, присутні в плазміді, яку можна застосовувати для трансфекції клітини-хазяїна й експресії в ній. Плазміда може містити промотор (часто індуцибельний промотор) для регуляції експресії ДНК у клітині-хазяїні. Плазміда може містити також відповідні сайта рестрикції для полегшення вбудовування інших послідовностей ДНК у плазміду з метою одержання різних антитіл. Плазміди можуть містити також численні інші елементи, призначені для полегшення сч об Клонування й експресії кодованих білків. Такі елементи добре відомі фахівцям у даній галузі й включають, наприклад, селектовані маркери, ініціюючі кодони, термінуючі кодони й т.п. Відповідно до більш переважного (8) варіанта здійснення винаходу набори включають контейнери, які містять послідовності ДНК 5ЕО ІЮ МО:2 або
ЗЕО І МО4.
Терапевтичні показання: «г зо Хвороби, в етіології яких утворення тромбу відіграє дуже важливу роль, включають інфаркт міокарда, дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові, тромбоз глибоких вен, емболію легенів, ішемічний "удар", -- септичний шок, гострий респіраторний дистрес-синдром, нестабільну стенокардію й інші артеріальні й венозні - п зв'язані з оклюзією стани. Антитіла, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати у всіх вказаних випадках, а також при інших захворюваннях, при яких утворення тромбу є патологічним. Інші патологічні стани, -- з5 при яких можна застосовувати антитіло, запропоноване в даному винаході, включають рак, який со супроводжується коагулопатією і запаленням. Антитіла можуть знайти також застосування при трансплантації шкіри й вен і трансплантації органів. Під поняттям "можна застосовувати" ("корисні") розуміють, що антитіла приносять користь при лікуванні, або запобігаючи захворюванню, або запобігаючи його переходу у більш серйозну стадію. Антитіла, запропоновані в даному винаході, є також безпечними й ефективними « антикоагулянтами, наприклад, їх можна використовувати для пацієнтів, які мають біопротез, наприклад, клапанів з с серця. Ці антитіла можуть замінювати гепарин і варфарин при лікуванні, наприклад, емболії легенів або гострого інфаркту міокарда. Антитіла, запропоновані в даному винаході, можуть знайти також застосування як ;» покриття медичних пристроїв, у яких може мати місце згортання.
Аналізи:
Відомий ряд лабораторних аналізів, які можна застосовувати для оцінки іп міго антикоагулювальної
Го! активності антитіла, запропонованого в даному винаході. Антикоагулювальну дію антитіла можна оцінювати на основі аналізів часу згортання в плазмі, таких як активований парціальний тромбопластинови час (АПТЧ"), час - утворення тромбіну (час згортання під впливом тромбіну) ("ТЗЧ") і/або протромбіновий час ("ПЧ"). Ці аналізи - дозволяють відрізняти різні механізми інгібування згортання й включають активацію білка С. Пролонгування часу
Згортання, встановлене в одному із цих аналізів, свідчить про те, що молекула може інгібувати згортання в - плазмі. Аналізи, перераховані вище, застосовують для виявлення антитіл з антикоагулювальною активністю, які ї» можуть зв'язувати ТФ як в очищених системах, так й у плазматичних середовищах. Крім того, для оцінки активності антитіл, запропонованих у винаході, застосовують додаткові аналізи, такі як аналіз катализізованого тромбіном утворення фібрину з фібриногену Шакиромуекі Н.М. і ін., У. Віої. Спет. 261(8), дво 1986, стор.3876-3882)|, аналіз інгібування активації тромбіном фактора М (Евзтоп С.Т. і ін., 9. Віої. Спет. 257(14), 1982, стор.7944-7947|), аналіз посилення інгібування тромбіну антитромбіном І! гепариновим
Ф) кофактором І ІЕвтоп М.Ї. і ін., у. Віої Спет. 258(20), 1983, стор.12238-122421), аналіз інгібування ка активації тромбіном фактора ХІІ (РоЇдаг 9. і ін., Тиготр. Наетові. 58(1), 1987, с.140), аналіз інгібування опосередковуваної тромбіном інактивації білка З |Ппотрзоп Е.А. і Заіет Н.Н., 9. Сііп. Іпм. 78(1), 1986, бо стор.13-17) і аналіз інгібування опосередковуваних тромбіном активації й агрегації тромбоцитів (Езтоп М... і ін. (1983), вище).
Наступні, докладно описані в прикладі 4 аналізи, застосовують для оцінки іп міго ефективності або оцінки іп о мійго афінності до зв'язування антитіл, запропонованих у винаході: 1) аналіз здатності рТФ/ЕМПа здійснювати пептидний гідроліз; 2) аналіз активації фактора Х; 3) оцінка ПЧ; і 4) мікрокалориметричний аналіз. 65 При здійсненні методів, які застосовують у даному винаході, природно повинно бути очевидно, що посилання на конкретні буфери, середовища, реагенти, клітини, умови культивування й т.п., не слід розглядати як такі,
що " обмежують обсяг винаходу, а як такі, що включають всі споріднені продукти, які, як очевидно фахівцям у даній галузі, можуть становити інтерес або мати значення в конкретному контексті даного опису. Наприклад, часто можна замінювати одну буферну систему або культуральне середовище на інше, досягаючи при цьому аналогічного або ідентичного результату. Фахівцям у даній галузі відомі системи й методики, за допомогою яких без зайвих експериментів можна здійснювати такі заміни і які можуть служити для оптимізації методів і процедур, представлених у даному описі.
Нижче даний винахід буде більш докладно описаний на прикладах, які не обмежують його обсяг. Повинно бути очевидно, що замість методів, застосовуваних у конкретних прикладах, фахівець у даній галузі безумовно 7/0 може сам запропонувати інші варіанти їх здійснення.
Вище й у наведені нижче прикладах, якщо не вказане інше, всі температури дані в градусах Цельсію, всі частини й відсотки представлені в мас.част. або в мас.9о.
Повний опис всіх процитованих вище заявок на патенти, патентів і публіка цій включений в даний опис як посилання.
Приклад 1
Конструкція одноланцюгового антитіла до ТФ зсЕм(ТЕ)Зе1о (Л)МІСМІМІСА АГ АСІУМЕРЕМАОМУМІ КЕЗ 2 ССОСТтТІМОРОСО5ЗІКІВСААЗОБЕЗЕТОПАМУМЗ М
УКОАРОКЕдДЛД ЕММУ551555655551АООСЗМУКО с 5 КЕТтТІБКО МКГ УчЧІОоМІКАЕО0ТтТАМчИМС о
Ані ТПочуУумоМмМрУмсотмМтТМ5АСО
СО5ЗОСАРМЕМІЕТОРНЗМУМЗАЗРОКТМУТІСтТАЕ « " 58505МА5БУуМОМУООБРОЗБРТІТМІХЕОМН -
РО МРОКЕбЗО5ІО0Т5555А5171151КтТЕ0 --
Ед СОУ ОМІММОБОТКІ ТтТМІААА ід г)
СсСАРМРУРЮОРКЕРНКА А (264)
Одноланцюгове антитіло до ТФ взсЕМ(ТЕ)Зе10 (ЗЕБО ІЮО МО:1) складається із сигнального пептиду (від « положення -18 до положення -1), М -ділянки (1-126), М Н-М,/-лінкера (127-131), М,-ділянки (132-246) і послідовності е-іад (247-264). Послідовність ДНК зсЕм(ТЕ)Зе10 (5ЕО ІЮ МО:2) кодує амінокислотну послідовність - с ЗБОЮ МО. 1. и Приклад 2 ,» Конструкція одноланцюгового антитіла до ТФ зсЕм(ТЕ)Зе10А -334 19)МІСВМІМІ ВА А АСІМЕРЕМАОММІ КЕ 5 (ее) а ОоООСТІМОРОБЗІКІ5СААЗОЕЗЕТОАММ М - У/«КкКОАРОКЕ ЕШУ55І55 065111 ААБ5МУКО - 0 ВЕТІБНОЧМЗУКМІТІХі!ОММІІНАЕОТАМУХС ї» АКМІБС ТОоч"УуУхУчсОоОМмМОЛУуМООоОтТ МТУ АСВС
СО5МЕМГгТтТОРНЗУЗАЗРОКТУТ!ІСТТ55ЗОо о 5вБМАБУІ МОМ ООКРОБЗРІТМІМЕОМНКРБ5 о СМРОоОКЕ5О51І10Т55М5А5ВІТІВвСІКТЕСЛЕАВ й /ІчХбО05УОМіММБОООТКкКІТМІлЛААвАР
МРУРОРІ ЕРА А (243)
Одноланцюгове антитіло до ТФ зсЕм(ТЕ)Зет104 (ЗЕО ІЮО МОО:З3) складається із сигнального пептиду (від положення -18 до положення -1), М р-ділянки (1-126), М Н-М,/-лінкера (127-131) і М,-ділянки (132-243). 65 8сЕМ(ТЕ)Зет10А відрізняється від зсЕмМ(ТЕ)Зе10 делецією трьох амінокислот (ЗАР) на М-кінці МІ домену і деліцією С-кінцевої е-їад сигнальної послідовності. Послідовність ДНК зсЕм(ТР)Зе10А (ЗЕО ІЮ МО:4) кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:3.
Приклад З
Експресія антитіл до ТФ у бактеріальних клітинах та клітинах ссавців
З фагу, який зв'язує ТФ, було ідентифіковано шість різних одноланцюгових антитіл, зсЕжм(ТЕ)2с1,
ЗСЕМ(ТЕ)2с11, зсЕмМ(ТЕ)2аз, звсЕм(Те)2п6, зсЕм(ТЕ)Зет10 і зсЕм(ТЕ)ЗН2, які понадекспресували у Е.соїї. та афінно очищали за допомогою е-їад афінної колонки, як описано вище. Афінність шести очищених антитіл до ртФ вимірювали за допомогою ВіАсоге, і потім ці антитіла були охарактеризовані в аналізах рТФ/ЕМІа пептидного гідролізу, активації ЕХ, ПЧ та мікрокалориметричного аналізу, описаних в прикладі 4, результати яких описані змо В прикладі 5. зсЕМ(ТЕ)Зе10 антитіло (5ЕО ІЮ МО:1) також експресували в клітинах СНО. Плазміда експресії містила послідовність ДНК, яка кодує зсЕм(ТЕ)Зе10 антитіло (ЗЕО ІО МО:2), а також гігроміцин В і селектовані маркери
ОНЕК. Первинна селекція була проведена при 40Омкг/мл гігроміцину, щоб відібрати популяцію. Утворену популяцію потім піддавали селекції з ТООнНМ метотрексатом. У ході даної селекції клітини, які мають /5 ампліфіковані копії ділянки ДНК, що містить селектований маркер, і ген-мішень, відбирають серед популяції. У результаті даної селекції рівні експресії були підвищеними від приблизно 0,Змг/л до приблизно бмг/л.
Приклад 4
Аналізи іп міго ефективності й афінності до зв'язування. 1. Аналіз здатності рТФ/ЕМІа здійснювати пептидний гідроліз
Нижче описаний принцип цього аналізу. Трипептидний пара-нітроанілідамідний зв'язок субстрату гідролізують за допомогою комплексу рТФ/ЕМІа. Вивільнення хромофора, тобто пара-нітроаніліду (р-МА), оцінюють при 405нм і концентрацію продукту, що утворився за одиницю часу, розраховують із використанням коефіцієнта молярної екстинкції 9920М "см". Значення ІСво (С) визначають шляхом апроксимації початкових швидкостей з допомогу. 4-параметричного рівняння М-(А-041(х/С)АВ)НО Га о
Н-О-МаІ-Геш-Агд-р-МА -5Н-О-Ма!-Геи-Агджр-МА субстрат 52266 трипептид хромофор
Реагенти й розчини: «г зо 1. Буфер для аналізу (БА): 50мМ Трис-НСІ, 150мМ Масі, 5мм Сасі», 0,195БСА, ріН7,5 2. Людський ЕМПа (НСМПА-0060, фірма Наетаїйіодіс Тесппоіодієев Іпс.): 10-кратний (х) робочий розчин - 00/07 готують 20НМ розчин у буфері для аналізу перед застосуванням. «-
З. Розчинний ТФ (фірма Вепех): 10-кратний робочий розчин - готують ЗОНМ розчин у буфері для аналізу перед застосуванням. - 4. Хромогенний субстрат 52266 (фірма Карі Рпагтасіа Нераг Іпс.): Маточний розчин: Л0ММ в Но, який со зберігався при 490. 2,5-кратний робочий розчин - готують 2,58М розчин у буфері для аналізу перед застосуванням. 5. Антитіло: готують 2,5-кратні розведення в буфері для аналізу перед застосуванням. «
Умови проведення аналізу:
Аналізи здійснюють в О9б-лунковому титраційному мікропланшеті при кімнатній температурі. Кінцеві с концентрації компонентів становлять: ;з» ртФ ЗНМ
Антитіло 1000-0,62508М
ЕУМа /гнм
Го! 82266. 1ММ - Процедура аналізу: - 1. Вносять піпеткою 0,1мл 2,5хБА (або контрольного буфера) у кожну лунку. 2. Додають 0,025мл 1ОхрТФ й інкубують 10Охв. при кімнатній температурі, обережно струшуючи. - 3. Додають 0,025мл 10ХЕМІІа, інкубують 10Охв. при кімнатній температурі, обережно струшуючи.
ГТ» 4. Додають О,1мл 2,5хсубстрату 52266, негайно переносять планшет у планшет-рідер і вимірюють кінетичні характеристики ферменту при 405нм протягом 15хв. із 10с інтервалами.
Цей аналіз можна використовувати для оцінки уявного значення К р, яке характеризує зв'язування антитіл, запропонованих у винаході, із рІФ або з комплексом ЕМііа/ТФ і для визначення чи конкурують антитіла, запропоновані у винаході, з ЕМІЇ за зв'язування із ТФ. і) 2. Аналіз активації фактора Х ко Нижче описаний принцип цього аналізу. ЕМІІа інкубують з нухирцями, які містять рекомбінантний людський
ТФ, одержуючи протеазний комплекс, що має здатність активувати субстрат, тобто ЕХ. Цей комплекс формують 60 у присутності (або за відсутності) різних концентрацій антитіла, потім вводять субстрат ЕХ і реакції дають відбуватися до утворення продукту, тобто активної протеази ЕХа, яка має здатність гідролізувати пара-нітроанілідамідний зв'язок хромогенного субстрату 52222. Вивільнення хромофора, тобто пара-нітроаніліду, оцінюють при 405нм і концентрацію продукту, який утворився за одиницю часу, розраховують із використанням коефіцієнта молярної екстинкції 9920М "см". Значення ІС 5о (С) визначають шляхом 65 апроксимації початкових швидкостей за допомогою 4-параметричного рівняння: М-(А-0О341ж(х/С) АВ)О
В2-Пе-сти-с1Іу-Агд-р-МА - 582-Пе-сіи-с1у-Агда-ОНяр-МА субстрат 52222 хромофор
Реагенти й розчини: 1. Буфер для аналізу: 50 М Трис-НСЇІ, 150ММ Масі, 5ммМ Сасі», 0,195 БСА, рН7,5. 2. Людський ЕМІТа (НСМІПА-0031, фірма Наетаїйоіодіс Тесппоіодієв Іпс.): 4-кратний робочий розчин - готують 100пМ розчин у буфері для аналізу перед застосуванням.
З. Рекомбінантний людський ТФ (відновлений у лабораторії заявників із препарату фірми Іппоміп, Юаде): 70 робочий розчин - готують розведення 1:480 у буфері для аналізу перед застосуванням. 4. Людський фактор Х (НСХ-0060, фірма Наетайіодіс Тесппоіодієз Іпс.): 4-кратний робочий розчин - готують 1000нНМ розчин у буфері для аналізу перед застосуванням. 5. Хромогенний субстрат 52222 (фірма Карі Рпагтасіа Нераг Іпс.): Маточний розчин: бмМ в НО, який зберігався при 42С Робочий розчин - готують 0,78ММ розчин в 3,57мММ ЕДТК (для припинення реакції), 150мММ масі, 50мММ Трис-НСЇ, рН7,5 перед застосуванням. 6. Антитіло:
Готують 4-кратні розведення в буфері для аналізу перед застосуванням.
Умови проведення аналізу:
Аналізи здійснюють в 9б-лунковому титраційному мікропланшеті при кімнатній температурі. Кінцеві концентрації компонентів становлять:
Пухирці рТФ:1/4 від розведення 1:480
Антитіло: 1000-0,6250М
ЕМна 2БпМ
ЕХ 2БОНМ с 82222 о,БабММ о
Процедура аналізу: 1. Вносять піпеткою 0,015мл 4хХБА (або контрольного буфера) у кожну лунку. « 20 2. Додають 0,015мл 4хпухирців рТФ. 3. Додають 0,015мл 4ХхЕМіІІа, інкубують протягом 10Охв. при кімнатній температурі, обережно струшуючи. «- 4. Додають 0,015мл 4ХЕХ, інкубують протягом 5хв. при кімнатній температурі, обережно струшуючи. «- 5. Додають 0,14мл 52266, негайно переносять планшет у планшет-рідер і вимірюють кінетичні характеристики ферменту при 405нм протягом 15хв. із 10 з інтервалами. -
Цей аналіз можна використовувати для визначення того, чи можуть антитіла, запропоновані у винаході, со інгібувати активацію ЕХ комплексом ЕМііІа/ТФ і чи можуть антитіла, запропоновані у винаході, конкурувати з ЕХ за зв'язування з комплексом ЕМІПа/ТФ. 3. Визначення протромбінового часу
При здійсненні стандартної реакції для визначення ПЧ ООмкл відповідної концентрації антитіла або ЗФР « додають у кювету до суміші, яка містить 2омкл тромбопластину ІЗ (фірма Оаде) і УОмкл 25мМ СасСі». Суміш с інкубують протягом їхв. при 37 2С, потім додають 100мкл цитрованої плазми (фірма Неїепа І арогайюгієев). В ц іншому варіанті відповідний об'єм концентрованого антитіла додають до 10О0мкл рекомбінантного людського "» тромбопластину (фірма Огійо Кесотріріазіпй) і приблизно через 2хв. додають 100мкл відновленої людської плазми. Час згортання в кожному індивідуальному досліді з оцінки коагуляції оцінюють, визначаючи середнє значення для двох вимірювань, отриманих за допомогою пристрою для вимірювання згортання (коагулометра) (ее) тину ЕІесіга 900С (фірма Нетоїіапсе), і визначають середні значення для проведених з дублюванням аналізів з (п-3 або 4). Одержують криві залежності реакції від дози для кожного інгібітора й потім застосовують регресійний аналіз для розрахунку концентрації (у НМ), необхідної для двократного збільшення часу згортання. - Цей аналіз можна використовувати для оцінки впливу антитіл, запропонованих у винаході, на зовнішній цу (нехарактерний) шлях згортання крові. Визначають кількість антитіла, необхідну для подвоєння ПЧ, яку можна порівнювати з іншими антикоагулянтами, визначаючи тим самим відносну ефективність антитіл, запропонованих
Чл» у винаході. 4. Мікрокалориметричний аналіз
Мікрокалориметричний (ізотермічна титраційна калориметрія) аналіз застосовують для визначення афінності до Зв'язування (К р) антитіл, запропонованих у винаході, з вільним ТФ або з комплексом ЕМіІіа/ТФ. Цей аналіз здійснюють за допомогою пристрою МісгоСа! МР-ІТС. Попередньо одержують комплекс ЕМІІа/ТФ, додаючи
Ф, 2,3-кратний молярний надлишок ЕМііІаії до рТФ. Для підтвердження того, що ртТФ у цьому аналізі повністю ко входить у комплекс, застосовують гель-фільтрацію. Для визначення афінності антитіла до комплексу 1,2МмкМ комплекс МІа/ТФ додають у комірку мікрокалориметра й б5мкМ розчин антитіла вносять у шприц. Для бо визначення афінності антитіла до вільного рТФ 10мкМ рТФ додають у комірку й 141мкМ розчин антитіла вносять у шприц. Для аналізу даних застосовують програмне забезпечення МісгоСаї! Огідіп. Дані відповідають одному сайту зв'язування.
Приклад 5
Характеристики іп міо антитіл до ТФ, запропонованих у даному винаході 65 Шість різних антитіл, які зв'язують ТФ, виділяють із фагової дисплейної бібліотеки повних людських одноланцюгових антитіл: зсЕм(ТЕ)2с1, зсЕМ(ТЕ)2с11, зсЕМм(ТР)2а3, зсЕМ(ТР)216, зсЕм(ТЕ)Зе10 й 5сЕм(ТЕ)ЗН2.
Афінність цих антитіл, які зв'язують рТФ, експресованих в Е.соїї, при оцінці за допомогою ВіАсоге, становить 35-47О0НМ. Аналіз здатності рТФ//Па здійснювати пептидний гідроліз, який описаний у прикладі 4, використовують для визначення того, чи можуть ці антитіла блокувати утворення активного комплексу МІПа/ТФ.
При такому аналізі зв'язування Мііа із рТФ збільшує швидкість розщеплення хромогенного пептидного субстрату 52266 більш ніж в 20 разів. Антитіла, які інгібують зв'язування ЕМіІа із ТФ, блокують це збільшення швидкості. Для 5 одноланцюгових антитіл, тобто зсЕм(ТЕ)2с1, зсЕм(ТЕ)2с11, зсЕм(ТР)243, зсЕм(ТР)2и6 й зсЕМ(ТЕ)ЗА2, виявлена здатність інгібувати гідроліз 52266, що дозволяє припустити, що вони інгібують зв'язування ЕМііа із рТФ (Фіг.1). На відміну від цього одноланцюгове антитіло зсЕМ(ТЕ)Зе10 не інгібує 70 пептидний гідроліз, який здійснюється рТФ/ЛПа, а фактично це антитіло підвищує швидкість гідролізу 52266, що дозволяє припустити, що зсЕм(ТЕ)Зе10 підвищує афінність рІФ до ЕМІа. За допомогою аналізу здатності ртФ/МІа здійснювати пептидний гідроліз встановлено, що антитіло зсЕм(«ТЕ)Зе10 підвищує афінність ЕМПа до рТФ, знижуючи тим самим уявне значення Кор в 5 разів (Фіг.2). Антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 не впливає на швидкість гідролізу, який здійснюється ЕМііа, за відсутності рРТФ, що свідчить про те, що це антитіло не взаємодіє з 7/5 Вільним ЕМіа. Значення Кр, яке характеризує зв'язування антитіла зсгж(ТЕ)Зе10 із рТФ, що визначають за допомогою аналізу здатності рІФ/РМІПа здійснювати опептидний гідроліз, становить 654нМ (Фіг.4).
Мікрокалориметричний аналіз застосовують для порівняння афінності зсЕм(ТЕ)Зе10 до ТФ і до комплексу
ЕмМПа/1Ф. Ці експерименти дозволяють встановити, що експресоване в клітинах ссавців зсЕм(ТЕ)Зе10 має - в 20 разів більш високу афінність до комплексу ТФ/ЕМіІа, ніж до вільного рТФ (ЗЗнм проти бООнм, Фіг.5).
Шість одноланцюгових антитіл, які зв'язують ТФ, експресованих у бактеріях, порівнюють із використанням аналізу активації ЕХ й аналізу ПЧ. Жодне з п'яти антитіл, які інгібують швидкість гідролізу 52266 за допомогою комплексу рТФ/ЕМіІІа, а саме зсЕм(ТЕ)2с1, зсЕм(ТЕ)2с11, зсЕм(ТР)2а3, зсЕм(ТР)216 й зсЕЖ(ТЕ)ЗН2, не подовжують ПЧ у порівнянні з контролем (ЗФР-буфер) (Фіг.3). На відміну від цього, хоча антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 не має найвищу афінність за даними, отриманими за допомогою ВіАсоге, і підвищує афінність ЕМІа до рІтФ, сч ов ЗСЕЖ(ТЕ)Зе10 являє собою єдине антитіло в групі, яке інгібує активацію ЕХ (Фіг.б і не представлені дані) і пролонгує час згортання при аналізі ПЧ (Фіг.3). Значення ІС 55, яке характеризує здатність антитіла і) зсЕМ(ТЕ)Зе10 (димер) інгібувати активацію ЕХ, становить 0,44нМ (Фіг.б). І, нарешті, аналіз активації ЕХ використовують для визначення того, чи може антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 конкурувати з ЕХ за зв'язування з комплексом ЕМІІа/ТФ. Антитіло зсЕЖ(ТЕ)Зе10 залежно від дози інгібує активацію ЕХ, при цьому значення К рд/(арр) «г зо Залишається однаковим при всіх концентраціях субстрату ЕХ, що свідчить про те, що зсЕм(ТЕ)Зе10 не конкурує з
ЕХ і не зв'язується із ТФ або з комплексом ЕМІа/1 Ф у тім же сайті, що й ЕХ (Фіг.7). --
Антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 виявлене на основі зв'язування з рекомбінантним людським розчинним ТФ. Гомологія «- послідовності ТФ у людини й миші або людини й кролика становить 58 й 7195 відповідно. Імовірно, антитіло зв'язується з унікальним епітопом на людському ТФ, який впливає на активацію ЕХ комплексом ЕМПа/1/Ф. --
Фізіологічно це антитіло має перевагу в порівнянні з антитілами, які конкурують із ЕМІИ або ЕМііа за со зв'язування із ТФ. Значення К р, яке характеризує зв'язування ЕМііа з розчинним ТФ, становить «1ОНМ (Фіг.2), це значення узгоджується з опублікованим значеннями для зв'язування ЕМііа із рТФ |(4,8НнМ, Мецепзспмапаег Р.Р.
Її Моїтіззеу ..Н., У. Віої. Спет. 269(11), 1994, стор.8007-8013| або для зв'язування ЕМІІ, ЕМПа й інактивованого за допомогою ОІР. ЕМііІаі з повнорозмірним ТФ, відновленим у нейтральних фосфатидилхолінових « пухирцях |Васп МК. їі ін., Віоспетівігу 25, 1986, стор.4007-4020). Афінність зв'язування РМІ! або ЕМІа з з с повнорозмірним ТФ підвищується в значній мірі, коли заряджений фосфотидилом серин включають у . фосфоліпідні пухирці (Васі К. і ін. (1986), вище), через взаємодію СІ А-домену ЕМІЇ або ЕМііа із зарядженою и?» мембранною поверхнею |Мецепзспу/лапдег Р.Р. і Могтіззеу У.Н. (1994), вище). У цих оптимальних умовах ЕМІІа зв'язується з повнорозмірним ТФ із дуже високою афінністю (41пМ). В антитіла до ТФ, яке конкурує за
Зв'язування з РМІ! або ЕРМіІІа, повинна бути утруднена здатність конкурувати за зв'язування із цим комплексом
Го! ЕМПалФ, який має високу афінність. На відміну від цього антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 не тільки має більш високу афінність до комплексу ЕМіІІа/ТФ, ніж до ТФ, але й не конкурує з ЕМііа за зв'язування із ТФ. Антитіло, таке як - зсЕМ(ТЕ)Зе10, яке не конкурує з ЕМіІїа, повинне інгібувати активацію ЕХ не залежно від концентрації РМІЇ у - плазмі, яка становить -ТОНМ.
Антитіло зсЕм(ТЕ)Зе10 також має перевагу в порівнянні з антитілами, які конкурують із ЕХ за зв'язування - із ТФ. Значення Ку, яке характеризує зв'язування ЕХ з комплексом МІІа/ТФ, становить 0,061-0,099мкмМ, що видно ї» з даних, представлених на Фіг.7, це узгоджується з опублікованими значеннями (О,їмкМ, Вацой КМ... і ін.,».
Вісі. Спет. 275(37), 2000, стор.28826-28833). Концентрація ЕХ у людській плазмі становить 140нНМ (значення К п вище в 1,4-2 рази). Антитіло, таке як зсЕм(ТЕ)Зе10, що не конкурує з ЕХ, що видно з Фіг.7, повинне інгібувати ов активацію ЕХ не залежно від концентрації ЕХ у плазмі.
Приклад 6
Ф) Модель тромбоемболії іп мімо, створена на щурах ка Одноланцюгове антитіло зсЕмМ(ТЕ)Зе1, яке зв'язує ТФ, є специфічним у відношенні ТФ приматів. Модель тромбоемболії, викликаної людським ТФ (із застосуванням як реагенту тромбопластину, що містить людський во рекомбінантний ТФ, фірма Огійо), створюють у самців щурів Зргадое-Оаулеу, які знаходяться при свідомості, (350-400г, п»7/групу). На цій моделі дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові (ДВЗ) ТФ у результаті ін'єкції тромбопластину індукує відкладення фібрину в легенях, викликаючи тим самим порушення дихання й смерть. Певні дози клітин ссавців, які експресують зсЕм(ТЕ)Зе10, або носія ін'єкують у хвостову вену, а потім через 15хв. здійснюють болюсну ін'єкцію тромбопластину (0,5мл/кг). У групі, обробленій носієм, ця доза ТФ б5 Викликає загибель 6095 особин (І Ово), як правило, через 5хв. ін'єкції тромбопластину. Стан щурів оцінюють за допомогою наступної бальної системи захворюваності-смертності: 0 - відсутність дії; 1 - слабкий респіраторний дистрес-синдром (відновлення через ЗОхв.); 2 - серйозний респіраторний дистрес-синдром (стан агонії, для відновлення потрібно більше бОхв.); і З - смерть. Для порівняння ефективності лікування різних груп використовують середній бал. Результати, отримані в цьому аналізі іп мімо, представлені на Фіг.8. У цьому досліді встановлено, що антитіло, запропоноване у винаході, має здатність знижувати смертність і зменшувати респіраторний дистрес-синдром.
Описані вище приклади можна відтворювати, одержуючи аналогічний результат, заміняючи в цілому або деякі описані реактанти та/(або умови проведення випробувань, що застосовують при здійсненні вищенаведених прикладів. 70 Незважаючи на те, що винахід проілюстрований на прикладі одержання певних конструкцій антитіл, очевидно, що можна здійснювати варіації й модифікації без відхилення від суті й обсягу винаходу.

Claims (24)

Формула винаходу , , , ,
1. Антикоагулювальне антитіло, яке є антитілом до тканинного фактора (ТФ) і яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом фактор МіІа/тканинний фактор (ТФ), ніж з вільним тканинним фактором (ТФ), і яке має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:1 або ЗЕО ІЮ МО:3.
2. Антитіло за п. 1, де антитіло має принаймні в 2 рази більш високу афінність до зв'язування з /Комплексом ЕМІПал Ф, ніж з вільним ТФ при вимірюванні за допомогою мікроколориметричного аналізу.
З. Антитіло за п. 2, де антитіло має принаймні в 5 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом ЕМіІІа/1ТФ, ніж з вільним ІТФ.
4. Антитіло за п. З, де антитіло має принаймні в 10 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом ЕМіІІа/1ТФ, ніж з вільним ІТФ. сч
5. Антитіло за п. 1, де антитіло являє собою моноклональне антитіло.
6. Антитіло за п. 5, де антитіло являє собою одноланцюгове антитіло, Рар-димерне антитіло або антитіло у (о) вигляді дО.
7. Антитіло за п. 6, де антитіло являє собою одноланцюгове антитіло.
8. Антитіло за п. 7, де антитіло не конкурує за зв'язування із ТФ із одним або декількома факторами «т зо Згортання, вибраними з ряду, який включає фактор МІ! (РМІЇ), фактор ІХ (РІХ) і фактор Х (ЕХ).
9. Антитіло за п. 8, де фактори згортання являють собою ЕМІЇ й ЕХ. «-
10, Антитіло за п. 1, де антитіло є глікозильованим. «-
11. Антитіло за п. 1, де антитіло модифікують шляхом додавання поліетиленгліколю.
12. Антитіло за п. 1, де антитіло біотинілюють для зв'язування із стрептавідином. -
13. Антикоагулювальна фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 1, де композиція включає со фармацевтично прийнятний ексципієнт і терапевтично ефективну кількість антитіла.
14. Спосіб запобігання утворенню тромбу, який полягає в тому, що вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1, де антитіло інгібує утворення тромбіну, безпосередньо не впливаючи на інші параметри згортання, такі як активація й агрегація тромбоцитів. « 20
15. Спосіб за п. 14, де спосіб призначений для захисту від утворення тромбу при ішемічному ударі, з с тромботичних ускладненнях після пластичної операції на судинах або мікросудинній хірургії.
16. Спосіб зниження й лікування тромбозу глибоких вен (ТГВ), дисемінованого внутрішньосудинного :з» згортання крові (ДВЗ), гострого коронарного тромбозу або раку з ознаками коагулопатії в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1.
17. Спосіб регуляції запальної відповіді в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять оо терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1.
18. Спосіб за п. 17, де запальну відповідь вибирають із ряду, який включає сепсис, трансплантати шкіри й - вен і трансплантати органів. -
19. Антитіло за п. 1, де антитіло можна застосовувати для формування нетромбогенного покриття на поверхні медичного пристрою, де медичний пристрій контактує із кров'ю. -
20. Антикоагулювальний набір, який містить антитіло за п. 1 та звичайні допоміжні речовини. Їх»
21. Антикоагулювальний набір, який містить послідовності ДНК, які кодують антитіло за п. 1, та звичайні допоміжні речовини.
22. Композиція для генної терапії, яка містить полінуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2 або ЗЕО ІЮО МО4, яка кодує антитіло, амінокислотна послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО 1 або 5ЕО ІЮО МО:3, причому дана полінуклеотидна послідовність вбудована в придатний вектор таким чином, що здатна експресувати (Ф; протеїни з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:1 або ЗЕО ІЮО МО:3. ГІ
23. Антикоагулювальне антитіло, яке є антитілом до тканинного фактора (ТФ) і являє собою одноланцюгове антитіло, яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом ЕМііа/ТФ, ніж з вільним ТФ, і де антитіло не бо Конкурує за зв'язування із ТФ із РМІЇ й ЕХ, і яке містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО:3.
24. Полінуклеотидна послідовність, яка кодує антитіло за п. 23, де полінуклеотидна послідовність містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2 або ЗЕО ІЮ МО:4. б5
UA20041109787A 2002-05-01 2003-04-30 Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants UA81114C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37656602P 2002-05-01 2002-05-01
PCT/US2003/013521 WO2003093422A2 (en) 2002-05-01 2003-04-30 Novel tissue factor targeted antibodies as anticoagulants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA81114C2 true UA81114C2 (en) 2007-12-10

Family

ID=29401364

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA20041109788A UA85996C2 (uk) 2002-05-01 2003-04-30 Злитий антикоагулювальний білок тромбомодуліну, який забезпечує спрямоване перенесення до тканинного фактора
UA20041109787A UA81114C2 (en) 2002-05-01 2003-04-30 Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA20041109788A UA85996C2 (uk) 2002-05-01 2003-04-30 Злитий антикоагулювальний білок тромбомодуліну, який забезпечує спрямоване перенесення до тканинного фактора

Country Status (29)

Country Link
US (3) US7250168B2 (uk)
EP (2) EP1503785B1 (uk)
JP (2) JP4460443B2 (uk)
KR (2) KR101013697B1 (uk)
CN (2) CN100412090C (uk)
AR (1) AR039515A1 (uk)
AT (2) ATE427121T1 (uk)
AU (2) AU2003225256B2 (uk)
BR (2) BR0304660A (uk)
CA (2) CA2483909A1 (uk)
CR (1) CR7584A (uk)
DE (2) DE60334538D1 (uk)
DK (2) DK1549341T3 (uk)
EC (2) ECSP045467A (uk)
ES (2) ES2323056T3 (uk)
HK (1) HK1080372A1 (uk)
IL (3) IL164733A0 (uk)
MX (2) MXPA04010795A (uk)
NO (2) NO20035848L (uk)
NZ (2) NZ536242A (uk)
PE (1) PE20040597A1 (uk)
PL (2) PL373945A1 (uk)
PT (2) PT1503785E (uk)
RS (2) RS104504A (uk)
RU (2) RU2345789C2 (uk)
TW (1) TWI343388B (uk)
UA (2) UA85996C2 (uk)
WO (2) WO2003092602A2 (uk)
ZA (2) ZA200409692B (uk)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1188830T3 (da) 1999-06-02 2010-04-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10
AU7445900A (en) * 1999-09-27 2001-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel hemopoietin receptor protein, nr12
EP2325337A1 (en) 2000-09-26 2011-05-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
US7579000B2 (en) * 2002-05-01 2009-08-25 Bayer Schering Pharma Ag Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants
JP4460443B2 (ja) * 2002-05-01 2010-05-12 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体
WO2004003144A2 (en) 2002-07-01 2004-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to reg iv
US7425328B2 (en) 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
US7833978B2 (en) * 2004-02-20 2010-11-16 Emory University Thrombomodulin derivatives and conjugates
CN1980947B (zh) 2004-04-22 2013-01-30 雷加多生物科学公司 改良的凝血因子调节物
CN101189334B (zh) 2005-06-03 2013-11-06 持田制药株式会社 抗cd14抗体融合蛋白质
US20090130104A1 (en) * 2005-10-05 2009-05-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fusion proteins for inhibition and dissolution of coagulation
ES2353084T3 (es) * 2006-04-07 2011-02-25 Novo Nordisk Health Care Ag Complejo covalente de factor vii y factor tisular.
CA2654623C (en) 2006-06-08 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An anti-nr10/il-31ra antibody for use in preventing or treating an inflammatory disease
KR20090051777A (ko) * 2006-10-06 2009-05-22 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군의 치료 및/또는 개선제
US9649499B2 (en) * 2007-03-28 2017-05-16 Medtronic ATS Medical, Inc. Method for inhibiting platelet interaction with biomaterial surfaces
CN101855243A (zh) * 2007-09-20 2010-10-06 伯拉考成像股份公司 用于制备新的寡克隆抗体的方法
MX2010006097A (es) 2007-12-05 2010-08-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para tratar el prurito.
US8333973B2 (en) * 2008-01-02 2012-12-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting recombinant therapeutics to circulating red blood cells
UA112050C2 (uk) * 2008-08-04 2016-07-25 БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
MX2011001696A (es) * 2008-08-14 2011-03-25 Merck Sharp & Dohme Metodos para purificar anticuerpos usando cromatografia de afinidad con proteina a.
WO2010045518A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof
US20120165244A1 (en) * 2008-10-30 2012-06-28 Hua-Lin Wu Methods for binding lewis y antigen
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
EP2230251A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-22 Bracco Imaging S.p.A Antibodies specifically active in the coronary plaque and method for their identification
US20120178693A1 (en) * 2009-08-28 2012-07-12 Bayer Healthcare Llc Cofactors for Thrombin Activation of Factor VII and Uses Thereof
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
ES2676874T3 (es) 2010-06-04 2018-07-25 Tiumbio Co., Ltd. Proteína de fusión que tiene actividad del factor VII
NZ604718A (en) 2010-06-15 2015-01-30 Genmab As Human antibody drug conjugates against tissue factor
JP6234224B2 (ja) * 2010-08-05 2017-11-22 カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ 血栓溶解及び抗凝固特性を有するタンパク質融合構築物
RU2445365C1 (ru) * 2010-11-03 2012-03-20 Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный Центр "Новые Технологии и Материалы" (ООО "ИЦ Новтехмат") Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты)
CN107614016B (zh) 2015-04-14 2022-06-17 中外制药株式会社 包含il-31拮抗剂作为活性成分的用于预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物
US10954502B2 (en) * 2015-04-28 2021-03-23 Saint Louis University Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as protein C activators
WO2017189943A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 Saint Louis University Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as a powerful anticoagulant
PE20190966A1 (es) * 2016-11-16 2019-07-08 Bayer Healthcare Llc Factor viii direccionado a los globulos rojos y metodo para su uso
BR102017005783A2 (pt) * 2017-03-21 2018-10-02 Fund Butantan processo de obtenção de esculptina e seus fragmentos, esculptina recombinante e seus usos
EP3861127A1 (en) * 2018-10-04 2021-08-11 Thrombosis and Coagulation AB Method for the determination of protein s levels
KR102416078B1 (ko) 2019-11-20 2022-07-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 함유 제제
CN114686444B (zh) * 2020-12-31 2024-05-31 广州万孚生物技术股份有限公司 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114686443B (zh) * 2020-12-31 2023-11-03 广州万孚生物技术股份有限公司 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
ZA862768B (en) * 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US5589173A (en) * 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5223427A (en) * 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5437864A (en) * 1987-03-31 1995-08-01 The Scripps Research Institute Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor
US4912207A (en) * 1987-05-06 1990-03-27 Washington University DNA clone of human thrombomodulin and portions thereof
DK299087D0 (da) 1987-06-12 1987-06-12 Novo Industri As Proteins and derivatives thereof
US5298599A (en) * 1988-12-30 1994-03-29 Oklahoma Medical Research Foundation Expression and purification of recombinant soluble tissue factor
JPH04505554A (ja) * 1989-02-17 1992-10-01 コドン 可溶性トロンボモジュリン類似体
US5466668A (en) * 1989-04-28 1995-11-14 Schering Aktiengesellschaft Superior thrombomodulin analogs for pharmaceutical use
US5256770A (en) * 1990-04-09 1993-10-26 Schering Ag Oxidation resistant thrombomodulin analogs
US6063763A (en) * 1989-04-28 2000-05-16 Schering Aktiengesellschaft Protease-resistant thrombomodulin analogs
KR930008093B1 (ko) * 1990-08-03 1993-08-25 아사히가세이고오교 가부시끼가이샤 신규 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 하는 의약조성물
US5506134A (en) 1990-10-22 1996-04-09 Corvas International, Inc. Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex
US5843442A (en) * 1990-10-22 1998-12-01 Corvas International, Inc. Blood coagulation protein antagonists and uses therefor
JPH0578397A (ja) * 1991-01-29 1993-03-30 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 血栓溶解タンパク質
JPH06133780A (ja) * 1992-10-23 1994-05-17 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 新規なｔ−ＰＡ改変体
US5916874A (en) * 1994-04-20 1999-06-29 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for treating liver injury
US5736364A (en) * 1995-12-04 1998-04-07 Genentech, Inc. Factor viia inhibitors
US5986065A (en) * 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
JP3998419B2 (ja) * 1998-04-03 2007-10-24 中外製薬株式会社 ヒト組織因子（ｔｆ）に対するヒト型化抗体およびヒト型化抗体の作製方法
CA2402596A1 (en) * 2000-03-16 2001-09-27 Genentech, Inc. Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency
US6632791B1 (en) * 2000-06-21 2003-10-14 Schering Aktiengesellschaft Thrombomodulin analogs for pharmaceutical use
TWI338009B (en) * 2001-10-29 2011-03-01 Genentech Inc Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
WO2003057911A2 (en) 2002-01-08 2003-07-17 Bayer Healthcare Ag Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy
JP4460443B2 (ja) * 2002-05-01 2010-05-12 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体
US7579000B2 (en) 2002-05-01 2009-08-25 Bayer Schering Pharma Ag Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants

Also Published As

Publication number Publication date
DK1549341T3 (da) 2009-07-06
US20040063632A1 (en) 2004-04-01
JP4460443B2 (ja) 2010-05-12
WO2003093422A3 (en) 2004-07-15
BR0304660A (pt) 2005-06-07
KR20050045944A (ko) 2005-05-17
KR101013697B1 (ko) 2011-02-10
DE60326970D1 (de) 2009-05-14
ES2354419T3 (es) 2011-03-14
US20080020965A1 (en) 2008-01-24
CN1665534A (zh) 2005-09-07
NO20035849L (no) 2004-02-27
WO2003092602A3 (en) 2004-08-26
EP1503785B1 (en) 2010-10-13
CA2483909A1 (en) 2003-11-13
NZ536243A (en) 2006-06-30
US20080019985A1 (en) 2008-01-24
UA85996C2 (uk) 2009-03-25
IL164733A0 (en) 2005-12-18
JP2005538046A (ja) 2005-12-15
CN100412090C (zh) 2008-08-20
TWI343388B (en) 2011-06-11
AU2003225256B2 (en) 2009-06-04
KR101080587B1 (ko) 2011-11-04
IL164732A0 (en) 2005-12-18
ECSP045467A (es) 2005-01-28
AU2003225255B2 (en) 2008-07-31
ES2323056T3 (es) 2009-07-06
US7622457B2 (en) 2009-11-24
EP1549341B1 (en) 2009-04-01
CN100563709C (zh) 2009-12-02
JP4567437B2 (ja) 2010-10-20
RS104504A (sr) 2007-02-05
CR7584A (es) 2006-05-30
RU2004135306A (ru) 2005-07-10
CN1665526A (zh) 2005-09-07
DK1503785T3 (da) 2011-02-07
NZ536242A (en) 2006-04-28
US7250168B2 (en) 2007-07-31
RU2320366C2 (ru) 2008-03-27
ATE427121T1 (de) 2009-04-15
EP1549341A2 (en) 2005-07-06
PT1503785E (pt) 2011-01-17
BR0304659A (pt) 2004-09-21
PT1549341E (pt) 2009-05-29
EP1549341A4 (en) 2006-10-18
WO2003092602A2 (en) 2003-11-13
PL373945A1 (en) 2005-09-19
RS102404A (sr) 2006-12-15
ATE484524T1 (de) 2010-10-15
MXPA04010851A (es) 2005-02-14
PE20040597A1 (es) 2004-10-06
PL373960A1 (en) 2005-09-19
HK1080372A1 (zh) 2006-04-28
RU2004135308A (ru) 2005-08-10
CA2483910A1 (en) 2003-11-13
EP1503785A2 (en) 2005-02-09
RU2345789C2 (ru) 2009-02-10
EP1503785A4 (en) 2007-02-14
WO2003093422A2 (en) 2003-11-13
JP2005532045A (ja) 2005-10-27
AU2003225255A1 (en) 2003-11-17
NO20035848L (no) 2004-02-27
DE60334538D1 (de) 2010-11-25
ZA200409694B (en) 2006-02-22
ZA200409692B (en) 2006-07-26
AU2003225256A1 (en) 2003-11-17
PL210582B1 (pl) 2012-02-29
TW200307043A (en) 2003-12-01
IL164733A (en) 2011-05-31
MXPA04010795A (es) 2005-03-07
KR20050045945A (ko) 2005-05-17
US7622122B2 (en) 2009-11-24
ECSP045468A (es) 2005-01-28
AR039515A1 (es) 2005-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA81114C2 (en) Novel antibodies to tissue factor as anticoagulants
US7960532B2 (en) Polynucleotides encoding anticoagulant antibodies
JP2007325602A (ja) 血栓症治療において有用な抗凝固剤
JP7139332B2 (ja) 第ｘｉ因子抗体および使用方法
JP2008531023A (ja) 血栓溶解剤としての標的化プラスミノーゲンアクチベーター融合タンパク質