TWI343388B - Novel tissue factor targeted thrombomodulin fusion proteins as anticoagulants - Google Patents

Description

1343388 玖、發明說明： 本申請案主張2002年5月1曰申請之美國臨時專利申請案 第No. 60/376,566號之權利，該案之全文以引用的方式併入 本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關新穎的融合蛋白，其包括可結合組織因子 (TF)之標的蛋白質，其可操作地鍵結至單獨的血栓調節素 (TM) EGF456功能部位或組合以至少另一 TM功能部位，選 自由N-末端疏水性區功能部位，EGF1 23功能部位，EGF3 及EGF4間之功能部位間環帶，及Ο-糖基化之Ser/Thr-豐富功 能部位，或其類似物，片段，衍生物或變體組成之群中。 【先前技術】 維持血管内前促凝劑及抗凝劑活性間之適度平衡，是正 常止血所必要的（Davie，E.W. et al. (1991) Biochemistry, 30(43):10363-103 70)。打破平衡使期間凝血會造成血栓形 成，其會造成心臟病發，中風，肺插栓及靜脈血栓。對於 治療特殊的血栓失調症，需較為有效且更安全之抗凝血劑。 組織因子（"TF")是一種穿膜糖蛋白，其為凝血聯級之主要 被動者（Nemerson，Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1):180-1 84)。在正常的生理條件下，具活性之TF並不與血液接觸。 在血管受傷時，内皮下之TF及膠原蛋白與血液接觸，造成 凝血因子及血小板之活化，接下來有止血血栓之形成。在 各樣臨床定位止，T F表現之不適當誘導會造成致命性血栓 形及/或導致病理併發症。TF之曝露繼之斑的瓦解咸信應對 85158 -6 - 血栓阻塞負責’其導致急性心肌梗塞及中風。在這些環境 定位下，由凝血因予所活化之前發炎傳訊路徑，也應對水 腫之形成及梗塞面積增加負責。與血管造形術有關之血管 傷害’造成SMC's上TF之正向調控，咸信可誘導與再狹窄有 關之細胞傳訊路徑。在癌症及革蘭氏陰性膿毒病中TF之過 度表現，會導致致命性血栓形成、及發炎路徑之活化。 第Vila因子（”FVIIa”）/TF複合物涉及於各種血栓疾病之致 病機制，且TF之循環水平是某些病人之危險因子。血管傷 害中，FVIIa及TF在維持止血及啟動血栓形成上扮演獨特的 角色。TF通常在動脈外膜中表現，但可在血管疾病之中及 新内膜中正向調控及不適度表現。動脈粥樣硬化斑中TF之 表現會增加’並由一個薄的纖維狀外罩與血液分隔，此外 罩可瓦解以曝出TF。手術之介入如氣球血管造形術，放入 支架，或動脈内部切開均會損及血管壁並曝出底下之TF。 於動脈粥樣硬化，富含脂質之薄壁斑會自主地瓦解或是内 皮浸蝕造成TF曝出及血栓形成，而有不穩定的心絞痛及心 肌梗塞。TF可在由細胞衍生之微粒中循環，且不穩定心絞 痛時循環TF水平會上升可推知此循環Tf與血栓形成有關 (Soejima，H. et al. (1999) Circulation 99(22):2908-2913)。通 常癌症與可高度凝血之狀態有關，其造成腫瘤細胞中叮之 過度表現。此可使病人傾向於深靜脈血栓，肺插栓及低層 次之瀰漫性管腔内凝血（，，DIC，，）。DIC造成微血管纖維蛋白 沈積’而導致多重器官衰竭。由血栓形成造成急性動脈損 傷模式之結果顯示，以蛋白質為基礎之FVIIa/TF抑制劑， 1343388 如抑制活性部位之第Vila因子（"FVIIai")及組織因子路徑抑 制劑（"TFPI")，與凝血酶及第Xa因子（”FXan)抑制劑比較 下，前二者為流血較少之有效的血栓生成劑。此外，在避 免新内膜加厚及氣球傷害後之血管狹窄上，F VIIa/TF抑制 作用，較其他抗凝血劑（如肝素，FXa抑制劑）為更佳（^1^,丫· et al, (1995) Circulation 92(10):3041-3050)。 血栓調節素（Thrombomodulin, TM)是一種穿膜糖蛋白，其 具有抗凝血特性且主要表現在内皮細胞内襯血管之管腔表 面（Esmon，N.L. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257(2):859-864; Salem, H.H. et al. (1983) J. Biol. Chem. 259(19):12246-12251)。成熟且全長的TM是557個胺基酸殘基之調節蛋白 質，由5個結構功能部位所組成：N-末端，疏水性區（1-226 殘基）；當含半胱胺酸之殘基（226-462殘基）；富含Ο-糖基化 Ser/Thr之區域（463-497殘基）；疏水性穿膜區（498-521殘 基）；及C-末端胞質尾部（殘基522-557)。 富含半胱胺酸之區域包括六個重複結構，類似上皮生長 因子（"EGF")前驅體，稱為類-EGF，EGF-類似物，或EGF功 能部位。富含半胱胺酸的區域可進一步分成3個功能部位： 類-EGF重複子 1，2及 3 (nEGF123”，殘基 226-344)，EGF3 及 EGF4間之功能部位間環帶（殘基345-349)，及類-EGF功能部 位 4 ， 5及6 ("EGF456” ，殘基 350-462) 。 EGF456的功能是調 介凝血酶結合及蛋白質C之活化作用。有一研究建議，第五 及第六類-EGF重複子（分別是’’EGF5”，殘基390-407，及 "EGF6"、殘基427-462)，具有與凝血酶結合之能力（Kurosawa， 85158

1343388 S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13):5993-5996);另一研究 建議，EGF456功能部位在由凝血酶一調介之蛋白質C活化作 用之活性上足以充作輔因子（Zushi，M. et al. (1989) J. Bi〇l-Chem. 264(18):10351-10353)。富含 Ser/Thr 之功能部位可加 強由EGF456-調介之凝血酶結合作用。第三類-EGF重複子 ("EGF3"，殘基31 1-344)是凝血酶可活化之血纖維溶解抑制 劑（"TAFI")於活化時所必要的。EGF3中許多的點突變子， ^ 據稱可干抗TAFI之活化作用（Wang，W. et al. (2000) J. Biol. ^ Chem. 27 5(30):22942-22947)。凝血酶/TM複合物可將蛋白質 C轉化為活化型之蛋白質c (" APC")，接著降解第Va及Vila 因子，由是進一步阻止凝血酶之產生。因此，TM作用是充 作調節轉換劑，可將凝血酶由前促凝劑轉化成抗凝血劑。

當TM定位在膜表面時，蛋白質c對凝血酶/TM複合物之 Km值會減低 10 倍（Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9(10):946-955)。蛋白質C對於可溶性TM/凝血酶複合物之血中濃度 (0.065 μΜ)顯著低於所報告之KnJJ[(5 μΜ)，因此確定位於前 促凝劑表面之ΤΜ ’可使蛋白質c產生速率局部顯著地增加。 ΤΜ經由不同機制抑制肝素或其衍生物之血栓形成。肝素 是抗凝血素III之輔因子，且經由抗凝血酶ΠΙ-有關之抑制可 抑制FXa及凝血酶。與血栓結合之凝血酶可免於抗凝血酶 HI之作用’其可限制預先存在之血塊上，肝素或低分子量 肝素（"LMWH”）之抗凝血效力。此點可解釋肝素或LMWH在 非人類靈長動物研究中為何無法抑制由與血塊結合之凝血 酶或凝血酶原酶啟動之血栓之生長。相反的，重組體TM可 85158 1343388 以與劑量有關之方式，減緩由血塊誘使之產生及血纖維蛋 白之形成（Mohri, M. et al. (1998) Thromb. Haemost. 80(6): 925-929)。TM之抑制作用可由抗-蛋白質C抗體所消除。抑 制與血塊結合之前促凝劑活性在臨床上是相關的，因為與 血塊結合之前促凝劑活性可造成更快速之血栓生長，且最 終造成血管阻塞或血栓插栓之併發症。血栓生長之抑制作 用，可使内源性血纖維蛋白溶解系統可更快速且更完全地 移去血塊。此外，在血漿抗凝血素耗盡之病理狀況下，如 DIC，TM預期也較肝素來得有效。雖然TM及肝素在實驗DIC 中均可抑制血小板及血纖維蛋白原之耗損，但當抗凝血素 III水平耗盡時僅TM有效。 【發明内容】

本發明提出新穎的融合蛋白，其可充作抗凝血劑，且包 括有一標的蛋白質，其或與組織因子（"TF")或第Vila因子/ 組織因子（"FVIIa/TF”）複合物交互作用，其可單獨操作連結 至血栓調節素（”TMn) EGF456功能部位，或組合以至少一種 另外的ΤΜ功能部位，選自由Ν -末端疏水區功能部位， EGF123功能部位，於EGF3及EGF4間之功能部位間環帶， 及富含0-糖基化Ser/Thr之功能部位，或其類似物，片段， 衍生物或變體組成之群。 本發明的抗血融合蛋白可對準且結合受傷部位之TF或 FVIIa/TF複合物，將TM定位在受傷部位，因此，避免血栓之 形成且由是與可溶性抗-TF抗體或可溶性TM或TM片段比較 下，在充作抗凝血劑上可更有效率地進行。在治療某些疾病 85158 -10 - 1343388 上’融合蛋白較低分子量肝素（LMWH)更有效率，疾病包括 膿毒病，觸漫性管腔内凝血，絕血性中風，深靜脈血栓形 成，急性趙狀症候群，血管造形術後之血栓併發症，及在 嚴重癌症中之凝血病變’但並不限於此。再者，融合蛋白 在微血管手術，皮膚及靜脈移植物及器官移植上有用途。 在另一方面，本發明提出包括有本融合蛋白之醫藥組合 物。 在另一方面，本發明提出保護病人拮抗血栓形成之方 法，此方法包括對該病人投予治療有效劑量之融合蛋白， 且由是可抑制凝血酶之產生可不直接影響其他凝血參數， 如血小板之活化及凝集。 在另方面，本發明是有關預防及治療病人深靜脈血栓 形成rDVT”）或彌漫性管腔内凝血（，idic..)或急性冠狀症候 群f有凝血病變證據之癌症之方法，此方法包括對該病人 投予治療有效劑量之融合蛋白。 在另方面’本發明是有關於病人中調控發炎反應之方 法此万法包括對孩病人投予治療有效劑量之融合蛋白。 與姑苗主本發明《融合蛋白可在與血液接觸之醫 子裝置表面形成—非產血栓之外者。 方面纟發明是有關含融合蛋白之套組，其包 括一標的蛋白質，其可蛀入 、、，。口 TF4FVIIA/TF複合物，及ΤΜ# 月匕部位。另外，套相 °匕括編碼融合蛋白組份之DN Α序 歹lj 〇 包括重組的及 在此也揭示製備本發明融合蛋白之方法 合成的。 85158 -11· 1343388 【實施方式】 本發明之抗凝血融合蛋白由標的蛋白質所組成，其或與 組織因子（nTF")或第Vila因子/組織因子（"FVIIa/TFn)複合物 變互作用，並單獨操作連結至血栓調節素（"TM") EGF456 功能部位，或組合以至少一種另一 TM功能部位，選自N-末端疏水性區功能部位，EGF123功能部位，EGF3及EGF4 間之功能部位間環帶，及富含〇-糖基化Ser/Thr功能部位， 或其類似物，片段，衍生物或變體組成之群。 定義: 在描述本發明中，以下術語如下示地定義： ”重組體蛋白質或多肽"指由重組體DNA技術所產生之蛋 白質或多肽，即產自細胞，微生物或哺乳動物，由編碼欲 求多肽之外源DNA構體轉形而成。表現在大多數細菌培養 物中之蛋白質或多肽係無多醣的。表現在酵母之蛋白質或 多肽具有異於在哺乳動物細胞中表現之糖基化型式。 "天然的蛋白質或多肽指自自然發生來源中回收之蛋白 質或多肽。"天然的TM”包括自然生成之TM及其片段。 DNA ”編碼序列"指當置於適度的調控序列控制下，於宿 主細胞中轉錄或mRN A及轉譯成多肽之DN A序列。編碼序列 之界限可由在5' N-末端之起始密碼子及在3' C-末端之轉譯 停止密碼子所決定。編碼序列包括原核序列，來自真核 mRNA之cDNA，來自真核DNA之基因體DNA序列，及合成 的DNA序列。轉錄終結序列通常位在編碼序列之3'端。 ”融合蛋白'’是由至少二個操作連結之異質編碼序列之表 現所生成之蛋白質。本發明之融合蛋白由標的蛋白質組 ί

85158 • 12· 1343388 成，其或與TF或FVIIa/TF複合物交互作用，並可單獨操作 連結至血栓調節素（"TM") EGF456功能部位，或組合以至少 一種另一 TM功能部位，選自由N-末端疏水性區功能部位， EGF123功能部位，EGF3及EGF4間之功能部位間環帶，及 富含0-糖基化Ser/Thr功能部位，或其類似物，片段，衍生 物或變體組成之群。 ”標的蛋白質"是一種可結合或與另一蛋白質或蛋白質複 合物交互作用之蛋白質。本發明的標的蛋白質是可與TF或 FVIIa/TF複合物結合或交互作用之蛋白質。例如，抗-TF或 抗-FVIIa/TF複合物抗體是本發明的標的蛋白質。標的蛋白 質的另二個實例是活性位置受抑制之第Vila因子（"FVIIai") ，其可結合至TF以形成失活的FVIIai/TF複合物，及組織因 予路徑抑制劑（"TFPIn)，其可結合並使FVIIa/TF複合的失活。 ”核苷酸序列"是去氧核糖核甞酸之異聚合物（鹼基為腺嘌 呤，鳥糞嘌呤，胸腺嘧啶，或胞啶啶）。編碼本發明融合蛋 白之DNA序列，可由合成cDNA-衍生之DNA片段及短的寡 核誓酸連接子所組合，以生成可在重組體表現載體中表現 之合成的基因。在討論特殊雙股DNA分子之結構中，序列 之描述在此可依據傳統慣例，只給予5’至3'方向之序列，加 上非轉錄之cDNA股。 重組體表現載體”，是一種可複製之DNA載體，可用來 擴大或表現編碼本發明融合蛋白之DNA。表現載體含DNA 控制序列及編碼序列。DN A控制序列包括啟動子序列，核 糖體結合位置，聚腺苷化訊號，轉錄終結序列，上游調控

85158 -13 - 1343388 功能部份及加強子。如此中定義的重組體表現系統，一旦 為調控元件所誘導時可表現融合蛋白。 ••轉形的宿主細胞”指已為外源DNA所轉形及轉感之細 胞。外源DNA可或可不整合（共價連結）至染色體DNA以組 成細胞之基因體。於原核細胞及酵母中，外源DNA可維持 在基因附體元件上，如質體或穩定整合至染色體DNA内。 關於真核細胞，穩定轉形的細胞是其中外源DNA已整合至 染色體複製中之細胞。此穩定性可由真核細胞株或純系產 生含外源DNA之子細胞族群之能力而證知。 ”血栓調節素（TM)’’指可與凝血酶形成高親和力複合物之 内皮細胞表面糖蛋白。編碼天然TM之基因（有其基因體型 及cDNA)已自牛及人類中分離及定序（Jackman, R.W. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(23):8834-8838 及

Jackman, R.W. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(18): 642 5-6429，在此均列為本案參考）。牛、人類及老鼠TM之 序列互補呈現高度之同質性。人類TM之cDNA可編碼一 60.3 kDa蛋白質，具575個胺基酸包括約18個胺基酸之訊號序 列，見US Pat. 5,827,824。 當凝血酶與TM結合時，蛋白質C之活化速率可增加1000 倍以上，在此其形成抗凝血酵素活化之蛋白質C。此外，當 凝血酶結合至TM，則凝血酶不再作用為前促酵素。特言 之，凝血酶-催化之血纖維蛋白形成，第V因子活化，及血 小板之活化，均可因TM之存在而受抑制。因此，TM可將 凝血酶轉化成生理上之抗凝血劑。

V 85158 -14 - 1343388 ”血栓調節素（TM)功能部位”指分離的胺基酸序列，其與 ΤΜ特殊之功能或特性有關，如見特性之三級結構單位。全 長的ΤΜ基因可編碼含有以下功能部位之前驅體或前一多 肽··胺基酸-18--1是記號序列；胺基酸1-226是Ν-末端疏水 性區；胺基酸227-462是富含半胱胺酸之區域；由小的功能 部位間肽或環帶所連接之6個縱列的類-EGF重複子所組 成；胺基酸463-497是富含0-糖基化Ser/Thr之區域；胺基酸 498-521是疏水性穿膜區域；且胺基酸522-557是C-末端胞質 之尾部。富含半胱胺酸之區域可進一步分成3個功能部位： 胺基酸226-344是EGF123，由EGF-重複子1，2及3 (殘基 226-344)所組成；胺基酸345-349是介於EGF3及EGF4間之功 能部位間環帶；胺基酸350-462是EGF456,由類-EGF功能部 位4，5及6所組成，如見Yost, C.S. et al. (1983) Cell 34(3): 759-766; Wen, D.Z. et al. (1987) Biochemistry 26(14): 4350-4357 ;及 Wang, W. et al. (2000),上文，以上均列為本 案參考。 而類似物"，"片段M、"衍生物”及''變體"，當指本發明之 融合蛋白，以及標的蛋白質及TM功能部位時，表示本發明 融合蛋白，標的蛋白質及TM功能部位之類似物，片段，衍 生物及變體，其實質上保有相同的生物功能或活性，如下 文進一步所述。 "類似物π包括前-多肽，其内部含有本發明融合蛋白之胺 基酸序列。本發明具活性之融合蛋白可自額外的胺基酸中 解離，其可經由天然的，活體内過程或技藝中熟知之步驟， 85158 -15- 酵素或化學解離，完成前_融合蛋白。例如，天然的 可以575個胺基酸之前_多肽型式天然地表現，其再於活體 内處理修飾，釋出557個胺基酸之具活性且成熟的多肤。 '片段"是融合蛋白’標的蛋白質或TM功能部位的一部 伤，其實質上保有相似的功能活性，如此中所揭示之試管 内分析法所示，下文將進—步解述。 衍生物包括融合蛋白所有的處理修飾，其實質上保有 此中所揭示之功能，且包括額外的結構及減弱子功能，如 pEG化《融合蛋白，其有較長的半衰期，〇糖基化之融合 蛋白因加入硫酸軟骨素而修飾，及生物素化之融合蛋白， 如下文進一步所述。 實質上類似的功能活性，，及”實質上相同的生物功能或 活性"各自表示生物活性程度在與之比較之多肽之生物活 性又約30%至1〇〇〇/0之内或以上，此係當各多肽之生物活性 係由相同的步驟或分析法決定而言。例如，具有與實例2融 合蛋白（SEQ ID NO: 2)實質上類似功能活性之融合蛋白或 TM功能邵位，為其當以實例5之蛋白質c活化分析法（產色 原）測試時，可證明有活化之蛋白質c累積者。具有與實例ι 之抗-TF抗體（SEQ ID NO: 1)實質上類似功能活性之標的蛋 白質，為當以實例5之sTF/FVIIa分析法或FX活化分析法測 試時，可證明有可與TF或F VIIa/TF複合物結合或與之中和 之能力者。 類似性’’於二多肽間係由一多肽之胺基酸序列及其固有 心胺基酸取代基與第二多肽之序列經比較而決定的。此固 85158 •16· 1343388 有之取代包括述於 The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff (1978) and by Argos (1989) EMBO J. 8:779-785。例如，屬於下列各組之一之胺基酸代表固有之 變化： -Ala, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Thr: -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, lie, Leu, Met, Ala, Phe;

-Lys, Arg, His; -Phe，Tyr，Trp，His ;及 -Asp，Glu。 此中所用的其他所有的技術性術語具有如參與本案之精 藝者常用之相同定義。 標的蛋白質·

本發明的標的蛋白質為具有可特異結合至特定預選定標 的分子能力之蛋白質’如TF或FVIIa/TF複合物’之後可用 來指令融合蛋白至攜有所選定標的分子之細胞或組織。 在本發明的一個具體實例中’標的蛋白質是可結合及中 和TF或FVIIa/TF複合物之抗體。”抗體"如此中所用的包括 完整的免疫球蛋白（，，Ig")分子，以及其片段，如Fab’ F(at〇2 ’ 及Fv，其可以結合TF或FVIIa/TF複合物上之表位。典型而 言，與形成表位至少需要6, 8，10或12個連續的胺基酸。 然而，涉及非-連續胺基酸之表位可能需較多的胺基酸，如 至少15，25或50個。 典型而言，可特異結合至TF或FVIIa/TF複合物之抗體， 85158 -17- 1343388 當應用於免疫化學分析時，其可提供之偵測訊號至少較另 外蛋白質可提供的高出5-，10-或20-倍以上。較好，可特異 結合至TF或FVIIa/TF複合物之抗體，在免疫化學分析法中 不會偵測其他的蛋白質，且可自溶液中免疫沈澱出TF或 FVIIa/TF複合物。 TF或FVIIa/TF複合物可用來免疫接種哺乳動物，如老 鼠，大鼠，兔子，天竺鼠，猴子，或人類以產生多株抗體。 若欲求時，TF或FVIIa/TF複合物可共軛至載劑蛋白質，如 牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白，及鑰蜮血藍質。依據宿主 種類而定，可使用各種佐劑來增加免疫反應。此類佐劑包 括Freund's佐劑，無機凝膠（如氫氧化鋁）及表面活性物質（如 溶血卵磷脂，多元醇，聚陰離子，肽類，油乳劑，輪蜮血 藍質，及二硝基酚）。在應用於人類之佐劑中，尤以BCG (卡 介苗 bacilli Calmette-Guerin)及小棒桿菌（Cornybacterium parvum)為有用。 可特異結合至TF或FVIIa/TF複合物之單株抗體，可利用 以培養中之連續細胞株產製抗體分子之任何技術製備之。 這些技術包括融合瘤技術，人類B-細胞融合瘤技術，及EBV-融合瘤技術，但亦不限於此（Kohler et al. (1985) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 ;及 Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120)。 此外，也可使用為產製''嵌合抗體"而發展之技術，即將 老鼠抗基因剪接至人類抗體基因，以得到有適當抗原特異 85158 -18 - 1343388 性及生物活性之分子。（Molτisonetal·(1984)Proc·Natl·

Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454) ° 單株 抗體及其他抗體也可用來"人類化"以避免當治療應用時， 病人為拮抗抗體而發動免疫反應。此抗體可與直接用於融 合蛋白之人類抗體在序列上充份類似，或有一些關鑑殘基 需有所變化。齧齒類抗體及人類序列間之序列差異可由替 換人類序列中有異殘基而減至最少，可利用個別殘基之位 置指令的突變作用，或整個互補決定區之接枝。另外，利 用重組方法可產生人類化抗體，如GB2188638B所述。可與 TF或F VIIa/TF複合物特異結合之抗體可含有抗原-結合位 置，其或部份或完全人類化；如US Pat. No. 5,565,332中所 揭示的。 另外，產製單鏈抗體之技術均可使用技藝中已知方法改 變之，以產生可特異結合至TF或F VIIa/TF複合物之單鏈抗 體。利用鏈撥合可自任意的組合Ig庫中產生有相關特異 性，但不同的遺傳性型組成之抗體（Burton (1 99 1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11120-11123)。 單鏈抗體也可利用DNA擴大方法構築，如PCR，其中以 融合瘤 cDNA為模板（Thirion et al. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5:507-5 1 1)。單鏈抗體可為單或雙特異的，且可為二價或四 價。構築四價，雙特異之單鏈抗體，可見於如Coloma and Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15:1 59-163。構築四價， 雙特異單鏈抗體可見 Mallendar and Voss (1994) J. Biol. 85158 -19 -

Chem. 269:199-216 ° 編碼單鏈抗體之核诘酸可利用手動或自動核苷酸合成法 來構築，利用標準的重組體DNA方法選殖至表現構體内，引 入細胞内以表現編碼序列。另外，單鏈抗體可直接利用如纖 維狀嗟菌體呈現技術產製（Verhaar et al. (1995) Int. J. Cancer 61:497-501 ;及 Nicholls et.al. (1983) J. Immunol. Meth. 165:81-91)。 特異結合至TF或FVIIa/TF複合物之抗體，也可由在淋巴 球族群中誘導活體内產製而生成，或篩選Ig庫或高度特異 之結合試劑列而成，如文獻中所揭示的（Orlandi et al. (1989)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter et al. (1991) Nature 349:293-299) ° 在本發明另一具體實例中，標的蛋白質是抗體以外可與TF 結合及中和的標的部份。此二實例為活性位置受抑制之第 Vila因子（FVIIai)及組織因子路徑抑制劑（TFPI)。 FVIIa及FVIIai二者均可與TF形成高度親和力之複合物 (Sorenson, B.B. and Rao, L.V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9(Suppl 1):S67-71)。FVIIai是一種TF可中和之 抗凝血劑，其作用係始自與内源FVIIa共同競爭與曝出之TF 之結合。FVIIai可抑制蛋白水解而具活性之FVIIa形成競爭 性F VIIa-TF複合物之能力，且如此抑制凝血之啟動。經由 TM功能部位遺傳融合至FVIIai，TM可對準富含TF之前凝血 酶表面。 編碼人類FVII之cDNA已被分離及定序（Hagen, H.S. et al. 85158 -20- 1343388 (1986) Proc· Natl‘ Acad. Sci· USA 83(8):2412-2416，其已列 為本案參考）。人類FVII cDNA可由分離自人類肝臟之mRNA 經標準重組體DNA技術而製成。F VIlai之製成係以標準重組 體DNA技術將活性位置該胺基酸突變而成，或以肽基氣甲 基酮化學性處理在催化上具活性之F Vila，其可不可逆地修 飾及抑制活性位置。 TFPI可以FXa相關方式對準及抑制FVIa/TF複合物 (Salemink, I. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(40):28225-28232)。TFPI去結合至FXa，再來TFPI-FXa複合物可結合及 抑制FVIIa/TF複合物。TM功能部位經遺傳融合至TFPI，TM 可對準至富含TF之前凝血酶表面。 編碼人類TFPI之cDNA已被分離及定序（Wun，T.C. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004，其已列為本案參 考）。人類TFPI cDNA可由分離來自人類肝臟之mRNA利用 標準重組體DNA技術製成。 本發明之標的蛋白質（即抗體或其他相關的蛋白質）可以 技藝中熟知之方法表現及純化。被結合之抗體或蛋白質再 利用有高鹽濃度之緩衝溶液自管柱中溶離。 在本發明一個較佳具體實例中，標的蛋白質是TF-結合性 scFv抗體，其可抑制FVIa/TF複合物對FX之活作用，且不與 FVIIa競爭結合。為了產生TF-結合性svFv抗體，人類抗體 庫HuphaBL3，其在纖維狀噬菌體上呈現，可因拮抗固化之 可溶性TF而選出。來自TF結合噬菌體之抗體在E. coli中過 度表現，並可利用e-tag管柱親和力純化。經純化的抗體利 85158 •21 · 用BIAcore，sTF相關的第Vila因子分析法（sTF/F Vila分析 法），FX活化分析法，及PT分析法特性化。TF-結合性scFV 抗體，命名為scFv(TF)3elO，其序列示於實例1，且相當於 SEQIDNO:卜 TF-結合性 scFv抗體，命名為 scFv(TF)3elO， 其序列示於實例1且相當於SEQ ID NO: 1。TF-結合性scFv 抗體之分離，產製及特性化，詳述於下。 血栓調節素： 融合蛋白之TM功能部位作用是凝血酶催化的蛋白質C活 化作用之輔因子，其接著會降解第Va因子及Villa因子，由 是避免血栓進一步的形成。TM的功能部位，包括如N-末端 疏水性區功能部位，EGF123功能部位，介於EGF3及EGF4 間之功能部位。特別是EGF456功能部位可調介凝血酶結合 及蛋白質C活化作用（Kurosawa，S. et al. (1988)，上文；及 Zushi，Μ· et al. (1989)上文）。在本發明的較佳具體實例中， 融合蛋白的TM功能部位包括單獨的EGF456功能部位，或組 合以一種以上其他的TM功能部位。又在本發明更佳具體實 例中，EGF456功能部位含有點突變，使蛋白質更可抗阻氧 化損傷及蛋白酶，及/或增加其催化效率。 編碼人類TM之全長DN A序列有助於基因之製備，且可充 作起始點以構築編碼TM肽之DNA序列，及含有TM及TM片 段/肽之融合蛋白。 TM之全長基因可以許多方法製備。人類基因體庫則可購 得。可利用已發展之基因序列合成與這些基因特異之寡核 苷酸。以寡核苷酸探針篩選基因庫之方法是已知的。TM基 85158 -22- 因序列之發展證明在編碼區内無插入子。因此，基因體純 系可提供必要的起始物質，以可採用已知方法構築表現質 體。 編碼DNA片段之TM可利用與基因鄰接或在其内部區域 中已鑑知之核酸内切限制酶而修補之。（Jackman, R.W. et al. (1987)，上文）。另外，全長基因也可得自cDNA庫。例如， 製備自内皮細胞之傳訊RNA，可在cDNA之製備中提供適合 的起始物。製作cDNA庫之方法是熟知的（如見Sambrook, J.F. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)，其已列為本案參考）。 融合蛋白 : 本發明的抗凝血融合蛋白包括標的蛋白質，其可結合至 TF或FVIIa/TF複合物，且可單獨地操作連結至TM EGF456 功能部位或組合以至少一種其他TM功能部位，選自由N-末端疏水性區功能部位，EGF123功能部位，EGF3及EGF4 間之功能部位間環帶，及富含〇-糖基化之Ser/Thr功能部 位，或其類似物，片段，衍生物或變體組成之群。融合蛋 白包括與TM功能部位任何組合連接之標的蛋白質。 在一個特佳具體實施例中，融合蛋白包括一抗體，其可 結合TF，操作連結至TM EGF456功能部位及介於EGF3及 EGF4間之功能部位環帶（"ΤΜι456π)或其類似物，片段，衍 生物或變體。 本發明之融合蛋白包括下列構體，但不限於此：其中單 鏈抗體之C-末端部份融合至ΤΜ功能部位之類似物，片段， 85158 -23 - 衍生物或變體之N-末端部份，IgG抗體之C-末端部份融合至 TM功能部位之類似物，片段，衍生物或變體之N-末端部 份，Fab抗體之C-末端部份融合至TM功能部位之類似物， 片段，衍生物或變體之N-末端部份，單鏈抗體之N-末端部 份融合至TM功能部位之類似物，片段，衍生物或變體之C-末端部份，IgG抗體之N-末端部份融合至TM功能部位之類 似物，片段，衍生物或變體之C-末端部份，Fab抗體之N-末端部份融合至TM功能部位之類似物，片段，衍生物或變 體之C-末端部份，一個以上的單鏈抗體融合至TM功能部位 之類似物，片段，衍生物或變體之N-末端部份，一個以上 的IgG抗體融合至TM功能部位之類似物，片段，衍生物或 變體之N-末端部份及C-末端部份，一個以上的Fab抗體融合 至TM功能部位之類似物，片段，衍生物或變體之N-末端部 份及C-末端部份，一個以上的TM功能部位之類似物，片 段，衍生物或變體融合至單鏈抗體之N-末端部份及C-末端 部份，一個以上的TM功能部位之類似物，片段，衍生物或 變體融合至IgG抗體之N-末端部份及C-末端部份，一個以上 的TM功能部位之類似物，片段，衍生物或變體融合至Fab 抗體之N-末端部份及C-末端部份，一個以上的TM功能部位 之類似物，片段，衍生物或變體融合至二聚之單鏈抗體之 N-末端部份及C-末端部份。 本發明的融合蛋白包括實例2之融合蛋白（SEQ ID NO: 2) 及實例3之融合蛋白（SEQ ID NO: 3)，以及序列與之有實質 變化之融合蛋白。”實質的變化”包括可實質地維持本發明 85158 -24- 1343388 多肽至少一種生物功能，較好是凝血酶-調介的蛋白質c活 化作用之輔因子活性之任何序列，置換，或刪除變體。這 些功能同等物較好包括與SEQ IDN〇: 2或3之融合蛋白有至 90%同一性之融合蛋白，且較好與seq ip 2或3之融 合蛋白有至少95%同一性，且又較好與SEQ m N〇 2或3之 融合蛋白有至少97%同—性，且也包括具實質上相同生物活 性之此融合蛋白之部份。然而，經證明功能同等性如此中 進-步所述之與SEqIDN0:243之融合蛋白在胺基酸序列 上有非實質變化《任何融合蛋白，也包括在本發明的說明 中。 在另一具體實例中，融合蛋白包括可結合1^之抗體，並 操作連結至TM功能部位EGF3，其對於活化凝血酶可活化 之血纖維蛋白溶解作用活化子（TAFI)是必需要的。 類似物，片段，衍峰物及變體： 本發明的類似物，片段，衍生物或變體，以及標的蛋白 質或TM功能部位可為：⑴其一個以上的胺基酸殘基為固有 的或非固有的胺基酸殘基（較好一個固有的胺基酸殘基）所 取代，且此經取代的胺基酸殘基可或可不為遺傳密碼的編 碼者；或（ii)其一個以上的胺基酸殘基包括有—取代基，或 其成熟的融合蛋白融合至另一化合物，如可增加融合蛋 白半衰期之化合物（如聚乙二醇），或（iv)其額外的胺基酸融 合至成熟的融合蛋白，如領導子或分泌序列，或其可用來 純化成熟融合蛋白之序列，或（v)其多肽序列融合至一較大 多肽，即人類白蛋白，抗體或以，以增加作用期。此類似 85158 -25- 物，片段，衍生物及變體由此中之教示中知確實在精藝者 範圍之内。 較好，本發明的衍生物在一個以上預定且較好非必要之 胺基酸殘基上可有固有的胺基酸取代。（如下文所定義）。，，非 必要''胺基酸殘基是可在未改變生物活性下可自蛋白質之 野生型序中改變之殘基，由是”必要”胺基酸殘基是生物活 性所必要的。”固有的胺基酸取代"是其中胺基酸殘基為具 有類似側鏈之胺基酸殘基所取代。具類似側鏈之胺基酸殘 基族如技藝中所定義。這些族包括有驗性側鏈之胺基酸（如 賴胺酸，精胺酸，組胺酸），酸性側鏈（如天冬胺酸，穀胺酸）， 未荷電之極性側鏈（如甘胺酸，天冬酿胺，穀胺酿胺，絲胺 酸’蘇胺酸，酪胺酸，半胱胺酸），非極性側鏈（如丙胺酸， 纈胺酸，白胺酸，異白胺酸，脯胺酸，苯丙胺酸，甲硫胺 酸，色胺酸）’ β-分支的側鏈（如蘇胺酸，_胺酸，異白胺酸） 及芳族側鏈（如路胺酸，苯丙胺酸’色胺酸，組胺酸）。對於 固有的胺基酸殘基或駐留在固有蛋白質功能部位之胺基酸 殘基’無法製作非固有之取代作用，除非製作非固有之取 代作用使生成的融合蛋白更耐受氧化作用之損傷及蛋白酶 及/或增加其催化效率。片段或生物活性部份包括適用於醫 藥品，研究試劑等之多肽片段。片段包括其所含之胺基酸 序列與本發明融合蛋白之胺基酸序列充份地類似或由之衍 但其包括之胺基酸 ，生物活性部份包 生’且呈現該多肽至少一種活性之肽， 少於此中所揭示之全長多肽。典型而言 括有多肽至少一活性之功能部位或基序。多肽之生物活性 85158 -26- 1343388 部份可為一肽’即如長度為5個胺基酸以上。此生物活性部 份可合成地製備’可經由重組體技術，且可利用此中所揭 示及/或技藝中熟知之方法，評估多肽一種以上的功能活 性。 再者’本發明較佳的衍生物包括成熟的融合蛋白，其已 融合有另一化合物，如可增加多肽半衰期及/或減少多肽可 能的免疫原性之化合物（如聚乙二醇，"PEG”）。PEG可用來 授予水溶解度’大小’減緩腎之清除率，及減少對融合蛋 白之免疫原性。如見U.S. Pat. 6,214,966。在PEG化之例子 中’融合蛋白與PEG之融合可以精藝者已知之任何方法完 成。例如’ PEG化之完成先要在融合蛋白内引入一個半胱 胺酸突變’繼之以PEG-馬來醯亞胺以位置-特異的衍生化作 用。半胱胺故可加至肤之C-末端’如見Tsutsumi et al. (2000) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 97(15):8548-85 53。在融合蛋白中 可製作的另一修飾是生物素化作用。在某些例子中，其可 使融合蛋白被生物變化，如此其可與鏈抗生物素蛋白容易 地反應。蛋白質生物素化作用之方法是技藝中所熟知的。 另外，硫酸軟骨素可連結至融合蛋白。 本發明融合蛋白之變體，標的蛋白質及TM功能部位，包 括其胺基酸序列與原先融合蛋白’標的蛋白質及TM功能部 位之胺基酸序列充份類似之多肽。而"充份類似"表示第— 胺基酸序列相較於第二胺基酸序列，含有充份或最少數之 相同或相當胺基酸殘基’如此第一及第二胺基酸序列具有 共同的結構功能部位及/或共同的功能活性。例如，所含之 85158 •27· 1343388 共同結構功能部位為至少約45%，較好约75〇/〇至98%相同之 胺基酸序列在此定義為充份相似。較好，變體可與本發明 較佳融合蛋白之胺基酸序列充份地相似。變體包括為聚核 苷酸所編碼之融合蛋白之變體，其在迫切條件下可與本發 明之聚核：y：酸或其互補物雜交。此變體通常保有本發明融 合蛋白之功能活性。聚核苷酸之片段庫可用來產生各樣的 片段族群用以篩選及接下來的選擇。例如，片段庫之產生 係以核酸酶處理聚核苷酸之雙股pcr片段，其條件是每分 子僅發生約一次的缺口，變性雙股dna，再回復DNA使形 成雙股DNA，其包括由不同有缺口產物來之意識/反意識 對，以S1核酸酶處理自再形成之雙聯體中移去單股部份， 將生成之片段庫連接至表現載體。經由此方法，吾等可衍 生出表現庫，其係編碼本發明融合蛋白之…末端及各種尺 寸之内部片段。 變體包括融合蛋白，以及標的蛋白質&TM功能部位其 因突變而胺基酸序列有異。可鑑定具有對凝血酶·調介之蛋 白質C活化作用具辅因子活性之變體，係利用實例5所述之 蛋白質C活化作用分析法來篩選本發明融合蛋白或TM功能 部位之突變體（如截斷的或點突變株）之組合庫。可鑑定具有 TF-或FVila/ rF複合物·結合活性之變體，係利用實例5所述 々sTF/FVIIa分析法或Fx活化作用分析法篩選本發明融合 蛋白或標的蛋白質之突變體（如截斷或點突變株）之組合 庫。此外’在融合蛋白TM功能部位中製作各種殘基或序列 之置換’也可構築融合蛋白之生物相當之類似物，如此使 85158 •28· 1343388 融合蛋白更可抗阻氧化作用損害或蛋白酶作用，如見u.s. Pat. 5,827,824，或增加融合蛋白之催化效率，如見Adler, Μ. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(40):23366- 23372，及PCT案 WOOl/983 52，於2001年12月27日發表，以上均列為本案參 考。 在一個具體實例中，經由在核酸水平之組合突變可產生 各樣的變體庫，且由各樣基因庫所編碼。各樣變體庫之產 生係將合成的寡核甞酸混合物酵素性連接至基因序列，如 此可能的變體胺基酸序列之簡併組可以個別的多肽表現， 或另外呈含有此中之序列組之較大的融合蛋白組（如用於 噬菌體呈現）表現。自簡併的寡核苷酸序列中產生可能變體 之基因庫可有各樣的方法可採用。簡併基因序列之化學合 成可在自動化DNA合成儀上進行，且合成基因再連接至適 合的表現載體内。使用簡併的基因組可在一混合物中提供 編碼可能之變體序列欲求組所有的序列。簡併寡核I酸之 合成方法是技藝中已知的（如見Narang (1 983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984b) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 1 1:477)。 由點突變或截斷而製成之基因產物，其組合庫之篩選方 法技藝中已知有許多技術，而具所選定特性之基因產物， 點cDNA庫之篩選亦然。此種技術可使適合於基因庫針對凝 血酶-調介的蛋白質C活化作用之輔因子活性或TF-或 FVIIa/TF複合物-結合活性之快速篩選，而基庫係由融合蛋 85158 -29 - 白以及標的蛋白質及TM功能部位之組合突變作用而生 成。可顺應高輸出量分析以篩選大基因庫最廣泛使用之技 術通常包括選殖基因庫至可複製的表現載體，以所生成之 載體庫轉形於適合的細胞，並表現組合之基因，其所在之 條件使欲求活性之偵測有助於載體之分離，而載體所編碼 之基因產物係被偵測者。回歸的整體突變作用（recursive ensemble mutagenesis, REM)是可加強庫中具功能突變子頻 率之技術，可組合以篩選分析法應用於鑑定欲求之變體。 產製融合蛋白： 為了產製本發明融合蛋白，可利用精藝者已知之任何方 法。將標的蛋白質融合或另外結合至TM功能部位，或其類 似物，片段，衍生物或變體上。二種組份可以各種熟知化 學步驟中之任一方法，化學地連結在一起。例如，經由異 雙官能交又連接子連結，如SPDP，碳化二亞胺，戊二醛等。 在一個較佳具體實例中，本發明標的蛋白質，可利用重 组方法融合至TM功能部位，如採用重組體DNA技術，以產 生編碼標的蛋白質之核酸，及編碼TM功能部位之多肽，並 在如E. coli或哺乳動物細胞之宿主中表現出該DNA序列。編 碼融合蛋白之DN A可以呈cDNA或基因體型式，利用精藝者 已知之任何選殖步驟選殖。可見Sambrook，J.F. et al. (1989) 上文。 在標的蛋白質是抗體之例子中，一旦DNA序列被鑑知可 編碼Fv區域，則其表現時可示出特異之結合活性，而含Fv 區域之融合蛋白可以精藝者已知之方式製備。如：Chaudhary， 85158 -30 - 1343388 V.K. et al. (1989) Nature 339(6223):394-397; Batra, J.K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265(25): 15198-15202; Batra, J.K. et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86(21):8545-8549； Chaudhary, V.K. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(3):1066-1070 (以上均列為本案參考）均描述各種單鏈抗 體融合蛋白之製備方法。Fv區域可直接融合至TM功能部 位，或可經由連接子序列（linker)連接。連接子序列之存在 可僅是單純地在標的部份及TM功能部位間提供空間，或是 促進這些區域間之移動性，使其各自達到最適宜構型。含 有連接子之DNA序列，對於促進選殖或維持編碼標的部份 之序列及編碼TM功能部位之序列間之讀取架構，也可提供 序列（如引子或限制位置）。此種連結子肽（connector peptide) 之設計是精藝者熟知的。 在本發明中，連接子序列（linker sequences)可用於連接標 的蛋白質及TM功能部位。在本發明一個較佳具體實例中， 二個連接子序列可用於構築含有單鏈抗體及TM EGF456功 能部位及EGF3及EGF4間功能部位間環帶（TMi456)之融合 蛋白。首先是連接單鏈抗體之重及輕鏈功能部位。第一個 連接子序列長度為5個胺基酸。顯然也可使用其他含〇至10 個胺基酸之較短的連接子。本發明第二連接子長15個胺基 酸，可連接抗體至TM功能部位。藝者明白，也可使用各種 不同的連接子序列，且尤可生成保有抗凝血活性及蛋白質C 活化作用之融合蛋白。現有連接予之修飾可針對蛋白質C 在含有TF之磷脂表面之活化作用使其達最大而成。 85158 -31 - 1343388 在一個較佳途徑中，單鏈抗體可利用噬菌呈現庫來製 備。在構築噬菌體呈現庫的第一步騾中，可變基因（vH (來 自IgM) VK及VL)自由人類骨髓、淋巴結及脾所匯集之mRNA 中，利用一組特異引子族行PCR而選殖之。所生成之口(：1丁£-VH (3.8x109成員），pZ604-VK (1.6xl07)及pZ604-VL (3.2x1 07) 庫代表V基因永久且高度多樣化。VH基因由pCITE-VH庫中 擴大。VK及VL基因以反向JH及在5'端之連接子序列，自 pZ604-Vk及pZ604-Vl庫擴大而來。以凝膠純化之含有Vh， VK及VL之PCR產物再一起剪切以製成scFV基因全版。scFV 基因選殖至噬質體載體pZ603，且連接產物電泳脈動至可勝 任之TGI E. coli細胞内，以生成scFV嗤菌體呈現庫， HuPhabL3,有 5·2χ109個個別的轉形子（Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222(3):581-597; Sheets, M.D. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95(11).6157-6162)。 在本發明之較佳具體實例中，製備單鏈抗體（scFv(TF)3elO) 其有單一的VH/VLTF結合位置。scFv(TF)3elO之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 1)示於實例 1。 在本發明之較佳具體實例中，含有TMi456序列（有M3 88L 及H381G突變）鄰接Notl位置之PCR片段，繼代選殖至 pZ612/3elO之Notl位置（用於scFv(TF)3elO之細菌表現載 體，以pCANTAB5為基礎，來自Pharmacia)。在此，本發明 融合蛋白TM部份之點突變詳述天然TM胺基酸殘基之單一 85158 -32 - 1343388 字母命名，繼之是成熟TM中胺基酸位置數及胺基酸突變之 單一字母命名。例如，M3 88L表示成熟ΤΜ第3 88位置胺基酸 之甲硫胺酸已變成白胺酸。Notl位置介於抗體序列及e-tag 序列之間。此產生一個細菌表現構體（pKMl01)用於由 svFv(TF)3elO - 15個胺基酸之連接子-TMi456組成之融合 蛋白，繼之是e-tag序列。為了產生哺乳動物表現載體，先 自pKMIOl模板上產生PCR片段。此片段用以連接至TM表現 載體pTHR525之StuI/MscI位置。此產生了載體（pKM113)， 其有一 Solulin訊號序列，繼之成熟融合蛋白之序列，及e-tag 序列。載體含有氨苄青霉素抗性基因，及潮霉素及DHFR篩 選標幡。表現則由MPSV LTR啟動子所驅動。在此載體上進 行位置指令之突變作用，以包括R456G及H457Q突變，其可 提供TM部份對蛋白酶之抗性。所生成之載體稱為 PKM115。pKM115載體有一 15胺基酸之連接子，分隔了 VH 及VL功能部位，另一 15胺基酸連接子則將VL功能部位自 ΤΜι456中分出。分隔VH及VL之連接子減少至5個胺基酸， 以驅使有更高抗體親抗原性之二聚體之形成，稱為PHM115.5 。為pHM115.5所編碼之融合蛋白，scFv(TF)3elO-TMi456 (SEQ ID NO: 2)示於實例2中。另一載體，pKM125，則利用 標準的重組體DNA技術產生，係將在分隔VH及VL功能部位 之5胺基酸連接子間刪去3個胺基酸（GAP)，並刪去融合蛋白 C-末端之e-tag。所生成之融合蛋白，scFv(TF)3 el 0- TMi456A (SEQ ID NO: 3)，示於實例3中。 融合蛋白之表現及純化： 85158 -33 - 1343388 於試管内表現重組體融合蛋白有許多方式，包括E c〇h， 桿病毒，酵母哺乳動物或其他表現系統。在細胞菌中表現 所選殖基因之方法是熟知的4 了在原㈣統中獲得選殖 基因高水平的表現，必需構築最少含有強啟動子之表現載 體，以指令mRNA轉錄作用之終止。適料此用的之調控區 實例有E. C〇U β-配醣酶基因之啟動子及操作子區，e 色胺酸生合成路徑，或來自λ噬菌體之向左啟動子。為在 E.coH中轉形，在DNA載體中納入篩選標幟是有用的。此標 幟之實例包括明示㈣氨Μ霉素’四環素，或氣微素具 抗性之基因。 至於可用於表現融合蛋白及其類似物之較高等的真核細 胞系統，此中有許多細胞系統可供選擇。哺乳動物細胞系 之說明實例包括RPMI 7932, VER0及HeLa細胞，中國倉鼠 卵（CHO)細胞系 ’ W138，BHK，COS-7，C127 或 MDCK細胞 系，但不限於此。以CHL-1為較佳的哺乳動物細胞系。當使 用CHL-1時，可納有潮霉素為真核系篩選標幟。chlj細胞 衍生自RPMI 7032黑色素瘤細胞，為一易得之人類細胞系。 CHL-1細胞系已依據布達佩斯約定寄存於ATcc，且編號為 #CRL 9446 ’於1987年6月18日寄存。適用於本發明之細胞 可購自ATCC。可供說明之細胞系包括草地黏蟲（Sp〇d〇ptera frugiperda)及家繁（Bombyx mori)。 原核系之E. coli，無法進行轉譯後之修飾，如糖基化作 用。此外有複雜一硫化物型式之蛋白質，當在E. coli中表現 時常會錯誤地折疊。至於此中所述之融合蛋白，當在E. coli 85158 -34- 1343388 中表現時，其血栓調節素輔因子活性會顯著降低，雖然活 性仍存在。至於原核系統，所表現之蛋白質或以所謂的包 涵體不溶型式存在於胞質内，於細胞溶解後才見於可溶部 份’或加上適合的分泌訊號序列直接至質週中。若表現出 之蛋白質呈不溶之包涵體型式，通常必須行助溶溶解及接 續包涵體之再折疊。 許多原核表現載體係精藝者已知的如pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) » pKK233-2 (Clontech, Palo Alto，CA, USA)，及 pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI， USA)，其可買得到。 常用於重組微生物表現系之啟動子包括β-内醯胺酶（音 黴素酶）及乳糖啟動子系統（Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275(5681):617-624; Goeddel, D.V. et al. (1979) Nature 281(5732).544-548)，色胺酸（trp)啟動子系統（Goeddel，D.V. et al· (1980) Nucl_ Acids Res. 8(18):4057-4074)及tac啟動子

(Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Hartbor Laboratory (1982))。另一有用之細菌表 現系應用久噬菌體pL啟動子及clts857熱可誘導之抑制子 (Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5(l):59-76; Love, C.A. et al. (1996) Gene 176(1-2):49-53)。重組體融合蛋白也可在酵母宿 主中表現，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。其通常 有能力進行各種轉譯後之修飾。表現出之融合蛋白再分泌 至培養物上清液中，在此並無其他蛋白質駐留，使純化更 為容易。本發明融合蛋白表現用之酵母載體，含有特定先 85158 -35 - 決特色。載體之要件通常衍生自酵母及細菌，以令質體在 二者中均可增殖。細菌要件包括複製源及可篩選之標幟。 酵母要件包括複製序列源（ARS)，可篩選之標幟，啟動子， 及轉錄終結子。 可用於表現之酵母載體適合之啟動子包括TRP1基因， ADH1或ADHII基因，酸性磷酸酶（PH03或PH05)基因，異細 胞色素基因，或涉及於糖解路徑之啟動子，如烯醇酶，甘 油链-3-填酸脫氫酶（GADPH)，3-难酸甘油酸鹽激酶（PGK)， 己糖激酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶及磷酸葡萄異構 酶之啟動子（Hitzeman，R.A. et al. (1980) J. Biol. Chem. 255(24):12073-12080; Hess, B. et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149-167 ;及 Holland, M.J.及 Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17(23):4900-4907)。 商品化之酵母載體包括pYES2，pPIC9 (Invitrogen，San Diego, CA) » Yepc-pADH2a 5 pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA)，pBC102-K22 (ATCC # 67255)，及 YpGX265GAL4 (ATCC # 67233)。哺乳動物細胞株包括COS-7，L細胞， C127，3T3，中國倉鼠卵（CHO)，HeLa，ΒΗΚ，CHL-1，NSO， 及HEK293，但不限於此，可用來表現本發明重組體配合蛋 白質。在哺乳動物細胞中產製之重組體蛋白質通常是可溶 的且己糖基化’並有確實的N-末端。哺乳動物表現載體可 含有非-轉錄元件’如複製源，啟動子及加強子，及5'或3' 非轉譯序列’如核糖體結合位置，聚腺#化位置，接受子 位置及剪接供者’及轉錄終止序列。可用於哺乳動物表現 85158 -36· 載體之啟動子，通常如病毒啟動子，如多瘤病毒，腺病毒， HTLV，猿猴病毒40 (SV 40)，及人類巨細胞病毒（CMV)。 依據所選用之表現系統及宿主，利用傳統蛋白質純化之各 種層析組合，可得均質的重組體融合蛋白。這些包括：免疫 親和力層析，逆相層析，陽離子交換層析，陰離子交換層析， 疏水性交互作用層析，凝膠過濾層析，及HPLC此係若表現 系將融合蛋白分泌至生長基時，蛋白質可培養基中直接純 化。若融合蛋白不被分泌，其可自溶胞產物中分離。細胞 可以任何傳統方法瓦解，包括冷凍-解凍循環，音波震動， 機械瓦解，或使用細胞溶解作用劑。 在本發明較佳具體實例中，哺乳動物表現構體轉感至 CHO DXB11細胞内。利用400微克/毫升潮霉素B (hygromycin B)於HAMS/F12培養基，可選出穩定的族群。表現水平約500 微克/升。為了增加表現水平，利用100 nM胺甲碟呤於αΜΕΜ 培養基中可選出一族群。此族群大約之表現水平是5毫克/ 升。 融合構體在蛋白質之C-末端含有e-tag序列。抗-e-tag親和 力管柱可購自American/Pharmacia Biotech。細胞培養物經由 0.22微米濾膜過濾，再以2毫升/分填加至5毫升e-tag管柱。 管柱以0.2 Μ磷酸鹽緩衝溶液，0.05% NaN3，pH 7.0洗滌， 再收集至含有0.1倍體積1M Tris緩衝溶液，pH 8.2之管中， 以中和溶解緩衝溶液。另外，已過濾之培養基填加至蛋白 質A管柱。在此例子中，管柱以50 mM檸檬酸，300 mM NaCl，pH 6.5洗務，再以相同的緩衝溶液，pH 3 ·0溶離。於 85158 -37- ^343388 -例中’㉟純化的樣品再填加至㈣^“綱管柱以自融合 蛋白二聚體型式中分出單體。 醫藥組会物： 本發明也提出可投予至病人之醫藥組合物，以達到治療 作用。本發明之醫藥組合物，可由具欲求純化程度之融合 蛋白在藥學有效劑量下組合以生理可接受載劑，製備而成。 一本發明的融合蛋白可用於醫藥組合物中，以供靜脈内投 樂或皮下投藥或鞘内投藥。因此上述的融合蛋白較好可混 。以可接丈 < 無菌藥用載劑，如5%右旋糖，乳-酸化之林格 氏硬’生理食鹽水’無菌水’或其他針對靜脈内輸液所設 :之商品化生理緩衝溶液。冑了解，載劑溶液及組合物劑 量及投藥之選擇，可依個體及特殊臨床定位而變化，且可 由標準醫學步驟管轄。 依據本發明方法，這些醫藥組合物可以有效劑量投予， 以抑制個體中與過量凝血酶產生有關之病理關係。 融合蛋白之投予可採靜脈内快速濃注，靜脈内固定輸 液’或二路徑之組合方式。另夕卜，或除此之外，混合以適 當賦形劑之融合蛋白，可由肌内位置帶入循環之内。以融 合蛋白全身性處理’可由取自病人之系列血樣中被活化之 部份促凝血酶原激酶時間（PT)之決定而追踪。在此分析中 所觀察到ι凝血時間，於循環中達到充份融合蛋白水平時 可予以延長。 本發明之重組體融合蛋白及醫藥組合物，可用於腸外， 局部，靜脈内，口服或局部投藥。依據投藥方法，醫藥組 85158 1343388 合物可以各種單位劑型投予。例如，可呈如錠劑，膠囊劑， 散劑，溶液劑及乳劑等型式，但不限於此。 本發明之重組體融合蛋白及醫藥組合物，特別可用於靜 脈投藥。所投予之組合物常包括單鏈抗體溶液，或含單鏈 抗體溶於藥學上可接受載劑之融合蛋白，較好是在水性載 劑之中。可使用各種水性載劑，如經緩衝之食鹽水等。這 些溶液是無菌的且通常無非欲求物質。組合物可以傳統， 熟知之滅菌技術滅菌之。 供靜脈内投藥之典型醫藥組合物，可由精藝者容易地決 定。投予之劑量很清楚乃蛋白質特異的，且依其強度及藥 物動力學概況而定。腸外投予組合物確實之製法是熟知 的，或為精藝者顯而易知的，且詳述於如Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed_，Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980)。 含有本融合蛋白或其摻合物（即加有其他蛋白質）之組合 物，可以治療性處理方式投予。在治療應用上，組合物投 予至有流血失調症或疾病之病人，其劑量足以治癒或至少 可部份遏止流血。將足以完成此點之劑量定義為''治療有效 劑量”。用於此點之有效劑量依疾病之嚴重度及病人一般健 康狀況而定。 组合物單或多數投藥，可依所需之劑量及頻率及病人的 财受性而定。在任一狀況下，組合物應可提供充份劑量之 本發明蛋白質以有效地治療病人。 本發明之融合蛋白，或其藥學上可接受之組合物，可以 85158 -39- 1343388 治療有效劑量投予’此中依據各種因素而定，包括：所應 用之特異融合蛋白之活性，融合蛋白之代謝穩定性及作用 期長短；病人之年齡、體重'一般健康狀況，性別及飲食； 投藥模式及次數；排泄速率；藥物配合禁忌；特定疾病狀 況之嚴重’及在進行治療之宿主。一般而言，每天之治療 有效劑量是由約0.14毫克至約14.3毫克/公斤體重/天之本發 明融合蛋白’或其醫藥上可接受之組合物；較好每天每公 斤體重由約0.7毫克至約丨〇毫克；又最好每天每公斤體重約 1-4毫克至約7.2毫克。例如，當投予至7〇公斤之個人時，劑 量範圍應是每天由約10毫克至約1〇克之本發明融合蛋 白’或其醫藥上可接受之組合物，又較好每天由約5〇毫克 至約700毫克’又最好每天由約1〇〇毫克至約5〇〇毫克。 基因治瘓: 本發明之融合蛋白也可依據本發明而應用，係於活體内 表現融合蛋白，其常稱之為"基因治療，^因此，例如，細 胞可以於活體内編碼融合蛋白之聚核站酸（DNA或rna)遺 傳操作之，經此遺傳工程之細胞再提供給欲以融合蛋白治 療之病人此方去疋技藝中熟知的。例如，細胞可以技藝 中已知 < 步驟遺傳操作，其中使用含RNA之反轉錄病毒粒 子’而RNA可指導合成本發明之融合蛋白。 本發明抗凝血融合蛋白之局部遞送，在利用基因治療下 可對標的區域提供治療劑，即有内皮細胞内襯之血管。 試皆内及活體内基因治療法均是欲求的。為明定細胞族 群，4多轉移潛在性治療基因之方法是已知的。如見， 85158 -40- 1343388

Mulligan (1993) Science 260:926-931。這些方法包括： 1)直接基因轉移，如見Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468 ； 2) 脂質體-調介之DNA轉移，如見Caplen et al. (1995) Nature Med. 3:39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285 ； 3) 反轉錄病毒-調介之DNA轉移，如見Kay et al_ (1993)

Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813 4) DNA病毒-調介之DNA轉移。此DNA病毒包括腺病毒 (較好是以Ad2或Ad5為基礎之載體），疱疹病毒（較好是 以單純疱疹病毒為基礎之載體），及細小病毒（較好是 以"缺陷性”或非自主細小病毒為基礎之載體，較好是 與腺體-有關之病毒為基礎之載體，又最好是以AAV-2 為基礎之載體）。如見，Ali et al· (1994) Gene Therapy 1:367-384; U.S. Pat. 4,797,368，已列為本案參考，及 U_S. Pat. 5,139,941，已列為本案參考。 轉移重點基因而選用特定載體系統依各種因子而定。一 個重要的因素是標的細胞族群之本質。雖然反轉錄病毒載 體已被充份研究並已應用於各種基因治療應用上，但這些 載體通常還是不適合感染於未分化之細胞。此外，反轉錄 病毒有致癌之潛在性。然而，近來在慢病毒載體領域上之 發展可克服某些限制。見Naldini et al. (1996) Science 85158 -41 - 1343388 272:263-267 〇 於上述反轉錄病毒質體載體出處之反轉錄病毒，可衍生 自如：Moloney氏餐齒類白血病病毒，脾壞死病毒，反轉錄 病毒如Rous氏肉瘤病毒，Harvey氏肉瘤病毒，禽造白細胞 組織增生病毒，類人猿白血病病毒，人類免疫缺失病毒， 腺病毒，骨髓增生性肉瘤病毒，及乳腺腫瘤病毒，但不限 於此。在一個具體實例中，反轉錄病毒質體載體係衍生自 Moloney氏蓄齒類白血病病毒。 腺病毒具有廣大宿主範圍之優點，可感染靜止或分化末 期之細胞，如神經元或肝細胞，且基本上似乎是無致癌性 的。如見Ali et al. (1994)，上文，p. 367。腺病毒似乎不會 嵌合至宿主基因體内。因為其於染色體外存在，嵌入性突 變之危險性大大地減低。Ali et al. (1994)上文，p. 373。 與腺體有關之病毒與以腺病毒為基礎之載體呈現類似之 優點。然而，AAVs可在人類第19號染色體上呈現位置一特 異之整合作用。（Ali et al. (1994)，上文，ρ· 377)。 在一個較佳具體實例中，編碼本發明融合蛋白之DNA， 可應用於包括下列疾病之基因治療中，如深靜脈血栓形 成，瀰漫性管腔内凝血，急性冠狀症候群或有凝血病變證 據之癌症。 依據此具體實例，以編碼本發明融合蛋白之DN A行基因 治療，可在診斷之同時或之後立即提供給有所需之患者。 精藝者明白，依據本具體實例可使用任何適合的基因治 療載體，其中含編碼本發明融合蛋白之DNA或編碼其類似 85158 -42 - 物，片段，衍生物或變體之DNA。構築此載體之技術是已 知的。如見Anderson, W.F. (1998) Nature 392:25-30; Verma I.M. and Somia, Ν· (1998) Nature 389:239-242。將含融合蛋 白DNA之載體引入標的位置，可利用已知技術完成。 基因治療載體包括一個以上的啟動子。可應用之適合啟 動基因包括反轉錄病毒LTR ; SV40啟動子；及人類巨細胞 病毒（CVM)啟動子，述於 Miller et al. (1989) Biotechniques 7(9):980-990，或其他任何啟動子（如細胞啟動子，如真核細 胞啟動子，包括組織蛋白，polIII，及β-肌動蛋白啟動子， 但不限於此）。其他可應用之病毒啟動予包括腺病毒啟動 子，胸甞激酶（ΤΚ)啟動子，及Β 19細小病毒啟動子，但亦不 限於此。適合的啟動子，其選擇是精藝者由此中之教示顯 而易知的。 編碼本發明融合蛋白之核酸序列，係在適合的啟動子控 制之下。可應用之適合啟動子包括腺病毒啟動子，如腺病 毒主要晚期啟動子；或異質啟動子，如巨細胞病毒（CMV) 啟動子；呼吸道合胞病毒（RSV)啟動子；可誘導之啟動子， 如ΜΜΤ啟動子，金屬硫新質啟動子；熱休克啟動子；白蛋 白啟動子；ΑροΑΙ啟動子；人類球蛋白啟動子；病毒胸甞激 酶啟動子，如單純疱渗胸'^激酶啟動子；反轉錄病毒LTRs (包括上述經修飾之反轉錄病毒LTRs) ; β-肌動蛋白啟動子； 及人類生長激素啟動子。 反轉錄病毒質體載體用來轉導包裝之細胞系，以形成產 製者細胞系。可被轉感之包裝細胞實例包括下列，但不限 85158 -43 - 1343388 ΜΚ:ΡΕ501，ΡΑ317，ψ-2，ψ-ΑΜ，ΡΑ12，Τ19-14Χ; VT-19-17-H2，vj/CRE，h/CRIP，GP+#-86，GP + envAml2，及 DNA細胞系，如Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14， 其已全文列為本案參考。載體可經由技藝中已知之任何方 法轉導包裝細胞。此方法包括電泳脈動，脂質體之使用， 及CaP04沈澱作用，但亦不限於此。在一變化法中，反轉錄 病毒質體可包膠至脂質體内，或偶合至脂質，再投予至宿 主。產製者細胞系可產生具感染性之反轉錄病毒載體粒 子，其包括有編碼多肽之核酸序列。此反轉病毒載體粒子， 可再用於試管内或活體内轉導真核細胞。所轉導之真核細 胞可表現編碼多肽之核酸序列。可被轉導之真核細胞包括 胚胎幹細胞，胚胎癌細胞，以及造血幹細胞，肝細胞，纖 維母細胞，肌胚細胞，角質細胞，内皮細胞，及支氣管上 皮細胞，但不限於此。 基因治療另一不同的途徑是"轉核治療（transkaryotic therapy)"，其中病人的細胞於活體外處理以誘導靜止的染 色體基因，於再引入病人後可產生重點蛋白質。轉核治療 是設若個體有活化必需之正常基因全數。轉核治療涉及將 可活化初生基因之啟動子或其他外源調控序列，於活體外 引入病人細胞之染色體DNA内，培養並篩選可產生活性蛋 白質之細胞，之後已活化之細胞再引入病人，意圖其接著 可被完全確立。”基因被活化之"細胞之後可較長期製造重 點蛋白質，可能可長達病人之終身。U.S. Pat. Nos. 5,641,670 及5,733,761詳細揭示此概念，且已全文列為本案參考。 85158 -44- 1343388 套組·· 本發明進一步是有關研究或診斷目的之套組。套組通常 包括一個以上的容器，内含本發明的單鏈抗體。在一較佳 具體實例中，套組包括含有單鏈抗體之容器，其型式適於 第二分子所衍生代，如TM功能部位或其片段。在一較佳具 體實施例中，套組中含有包括有SEQ ID N〇: 2或SEQ ID NO. 3之融合蛋白之容器。 在另一具體實例中，套組可含編碼融合蛋白之DN A序 列。較好編碼這些融合蛋白之DNA序列，可以質體提供， 適於宿主細胞所轉感及表現。質體中可含啟動予（常是可誘 導之啟動子），以在宿主細胞中調控DN A之表現。質體也可 有適合之限制位置，以助其他DNA序列嵌入質體内以產生 各種融合蛋白。質體也可含有許多其他元件，以助所編碼 蛋白質之選殖及表現。此元件為技藝中熟知的，且包括如 可選擇之標幟，啟動密碼子，終止密碼子，等。 治療適鹿扃： 血栓形成扮演重要病因學角色的疾病包括有：心肌梗 塞’瀰漫性管腔内凝血’深靜脈血栓形成，肺插栓，絕血 性中風’敗血性休克’急性呼吸窘迫症候群，不穩定心絞 痛，及其他動脈及靜脈阻狀況。本發明的融合蛋白可在這 些中均有用，以及其中血栓形成是病理之其他疾病。本發 明融合蛋白有用之其他病理狀況包括有凝血病變及發炎之 癌症。本化合物也可用於皮膚及靜脈移植物及器官移植。 而有用的意指可用於治療之化合物，或避免疾病或避免其 85158 -45- 1343388 演變成更嚴重狀態。本發明化合物也可提供一安全且有效 4抗凝血劑，例如在接受如心瓣膜之生物彌補物之病人 中。而在治療如肺插栓或急性心肌梗塞時，這些化合物可 取代肝素及殺鼠靈（warfarin)。本發明之融合蛋白在凝血是 關切之主題下，也可用於塗佈醫藥裝置。 分析法: 偵測本發明融合蛋白TM活性時，可運用許多實驗室分析 法。蛋白質C活性可在Salem，η H et aL 〇98句上文，及 Galvin, J. B. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262(5):2199-2205 所述之刀析中測知。簡言之，分析由二個步驟組成。第一 個步驟是在明確條件τ ’將受試之融合蛋白與凝血酶及蛋 白貝C /、培同第一步驟中，凝血酶以水蛭素或抗凝血素 及肝素失活’音斤活化之蛋白質c之活性再度用產色受質決 定，由是發色團為已活化之蛋白質c之蛋白水解活性所釋 出。此分析法以經純化之試劑進行。 另外，可利用血漿凝塊時間分析法來測定融合蛋白之作 用，如已活化惑部份促凝血酶原激酶時間（ΑΡΤΤ)，凝血酶 凝塊時間（TCT)及/或凝血酶原時間（ΡΤ)。這些分析法可區別 凝血抑制作用間不同的機制，並涉及蛋白質C之活化。在這 些分析法任-者^塊時間之延長可證明分予可㈣血浆中 之凝固作用。 上述的分析可用來鑑定有⑽性之融合蛋白，其在純化 系統及在血漿環境中可結合凝血酶及可活化蛋白^。再以 進-步分析來評估天然TM其他活性，如抑制由凝血酶催化 85158 • 46 - 1343388 的纖維蛋白由纖維蛋白原之形成（】仏111)0'^1^,札'^·6131-(1986) J. Biol. Chem. 261(8): 3876-3882) ’ 抑制第 V因子之凝 血酶活化作用（£5111〇11，0：.1\61&1.(1982).：^8{〇1.(：116111· 257(14):7944-7947)，加速由抗凝血素III及肝素輔因子Π對 凝血酶之抑制作用（Esmon, N，L, et al. (1983) J, Biol. Chem. 258(20):12238-12242)，抑制凝血酶為第XIII因子之活化作 用（Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58(1):140)，抑 制凝血酶調介之蛋白質S失活作用（Thompson, E.A, and Salem, H.H. (1986) J. Clin. Ιην· 78(1): 13-17)，及抑制凝血酶 調介之血小板活化作用及凝集作用（Esmon, N,L. et al. (1983)，上文）。 以下分析法，詳述於下實例5 ’可用來測出本發明融合蛋 白之試管内強度：1)蛋白質C活化作用分析（產色的）；2) sTF/FVIIa活化作用分析；3)第X因子活化作用分析；及4) 蛋白質C活性作用分析（在富含TF之表面）。 在進行本發明步驟中’當然要了解關於特殊緩衝溶液， 培養基，試劑，細胞，培養條件等並不予以限制，但了解 包括所有相關物質’其中精藝者就目前所討論之特殊内容 可確涊是令人感興趣或有價值的^例如’常可將某—緩衝 落硬系統或培養基以另一者替換且仍可達到非相同也是相 似的結果。精藝者對此系統及方法均有充份的了解，如此 在無不當實驗下，於使用此中揭示之方法及步驟中，可進 行此替換便更盡善完成本發明。 本發明將以下列非受限實例，進—步詳述。在應用實例 8S158 -47- 1343388 之揭示中’應清楚牢記在心的是依據本發明所揭示之其他 及不同的方法具體㈣’將可無慮地將本身推薦給於相關 技藝中之精藝者。 不欲進一步贅言，咸信精藝者使用前述說明，將可利用 本發明至完全程度。因此，以下較佳之特異實例僅供說明， 不欲以任何方式限制本揭示其餘部份。 在上述及以下實例中，所有溫度均以攝氏度數未校正下 示出，且所有部份及百分率均按重計，除非另有所示。 上文所有申請案，專利及刊物之完全揭示均列為本案參 考。 以下實例可作為指導以助本發明之實行，且不欲限制本 發明範圍。 實例1

單鏈抗-TF抗體構件scFv(TF)3elO

(- 18) M L G V L V V N L R E S G G G F S F T D A W S I S G s G G s N s K N T L Y L R V L S L T D Y S A G G G G S G G K T V T I S C Q R P G S S P T F S G S I D T S A D Y Y C Q s Y L G A A A G A P

L G A L A L A G T L V Q P G G S M S w V R Q A P T Y Y A G S V K Q M N S L R A E Y W Y G M D V W A P N F M L T Q T R S S G S V A T V 工 Y E D N H S N S A S L T I D S N N L V V F V P Y P D P L E L V F P E M A Q L R L s C A A s G K E L E W V s G R F T I S R D D T A V Y Y C A G Q G T L V T V P H S V S A s P s Y Y V Q W y Q R P s G V P D R S G L K T E D E G G G T K L T V P R A A (264) 單鏈抗-TF抗體，scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 1)由訊號肽 • 48 - 85158 1343388 大減低。融合蛋白在CHO細胞中表現。表現質體含有潮霉 素B及DHFR選擇標幟。原先之選擇在4〇〇微克/毫升潮霉素 中進行以選出一族群。於此篩選中，由族群中選出含篩選 標幟之DN A區域有擴大套數，及標的基因之細胞^由於此 篩選’表現水平可由約〇·3毫克/升增加至約6毫克/升。 實例5 試管内分析法 1 ·蛋白質C活代分析（產色的） 分析之進行是在微滴定盤中混合各2 〇微升之下列蛋白 質· ΤΜ樣品（未知的或標準品），凝血酶（3ηΜ)，及蛋白質c (1·5 μΜ)。各蛋白質之分析稀劑為2〇 Tris-HCl，0.1Μ Naa’ 2·5 mM CaCl2 ’ 2.5 毫克/毫升 BSA ’ pH 7 4。孔洞在 37°C下培育2小時，之後蛋白質c活化作用之中止係加入2〇 微升水蛭素（0.16單位/微升370 nM)於分析稀釋劑中，並再 培育10分鐘。 所形成之活化的蛋白質C含量，其測度是加入1 〇 〇微升的i mMS2266 (於分析稀釋劑），盤於37χ：下繼續地培育。每ι〇 秽項取各孔洞在4〇5毫微米波長下之吸光度，歷3〇分鐘，利 用Molecular Devices讀盤機。吸光度數據貯存，再計算出各 孔洞中每秒之吸光度變化（斜率）。每秒之吸光度變化和微微 莫耳/毫升之活化的蛋白質C成比例。 此比例可由變化總活化蛋白質c之濃度而實驗地決定。將 0至1.5 μΜ之蛋白質c混合以60 nM兔子TM及30 ΠΜ凝血酶 可產生含有100%被活化蛋白質c之樣品，培育〇至4小時， 85158 -51 - 1343388 加入水經素，並如上測出S 2 2 6 6活性。將蛋白質C 10 Ο %被活 化之條件定義為其中S2266活性（Α405/秒）到達高原之條件。 活性單位定義為在上文定義之試劑條件下，每毫升/分鐘 下產生/微微莫耳經活化蛋白質C定義為1單位活性。另外， 活性數值與天然去污劑溶解之免子ΤΜ比較下而報告。 2. sTF/FVIIa活化作用分析

此分析之原則示於下。受質之三肽對位-硝基醯替苯胺醯 胺鍵以sTF/F Vila複合物水解。釋出之產色團產物，對位-硝基醯替苯胺，在405毫微米下追蹤，再利用9920 1VT1公分」 之莫耳濃度消長係數計算每單位時間下所形成之產物濃 度。IC50值（C)由最初速率加至4參數方程式：Y = (A-D)/(1 + (x/C)AB)+ D

H-D-Val-Leu-Arg-p-NA H-D-Val-Leu-Arg + p-NA S2266受質 三肽 發色團 試劑及溶液： 1. 分析緩衝溶液：50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5mM CaCl2，0.1% BSA，pH7.5

2. 人類 FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.) : 10 x操作溶液-使用前在分析緩衝溶液中製備30 nM 溶液。 3. 可溶性TF (Berlex) : 10 X操作溶液-在使用前於分析緩 衝溶液中製備30 nM溶液。 4. 產色受質 S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):貯液 10 mM 於H20，貯於4°C，2.5 x操作溶液-在使用前才於分析緩衝 85158 -52 - 1343388 溶液中製備2.5 mM溶液。 5.抗體：使用前才於分析緩衝溶液中製備2.5x稀釋液。 分析條件： 分析於室溫下於96-孔洞微量滴定盤中進行。組份之最終 濃度如下：

sTF 3 nM

抗體 由1000變化至0.625 mM

FVIIa 2 nM

S2266 1 mM 分析步驟： 1·將0.1毫升2.5x AB (或緩衝溶液對照組）吸量至各孔洞β 2. 加入0.025毫升10χSTF，並在室溫及緩和震盪下培育10 分鐘。 3. 加入0.025毫升10x FVIIa，在室溫及緩和震盪下培育1〇 分鐘。 4. 加入0.1毫升2.5x S2266受質，盤立即轉移至讀取計並在 4〇5毫微下以1〇秒間隔測出酵素動力學，共15分鐘。 3 ·第X因子活化分析： 此分析之原則如下示。FVIIa與重組體人類TF囊共培育， 以形成可活化受質，FX ’之蛋白胺複合物。此複合物在有 不同抗體濃度存在（或不存在下）形成，之後受質FX再引 入；並令反應進行以形成產物，活化之蛋白酶Fxa，其可水 解產色團受質S2266之對位·硝基醯替苯胺之醯胺鍵。所釋 出之產色團產物，對位-硝基醯替苯胺，於405毫微米下追 85158 -53- 1343388 踪，再利用9920 vr1公分―1之莫耳濃度消長係數，計算每單 位時間下形成之產物濃度。IC50值（C)由最初速率加至4-參 數方程式：Y = (A-D)/(l+ (x/C)AB)+ D Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA — Bz-Ile-Glu-Arg-OH + p-NA S2222受質 產色團 試劑及溶液： 1·分析緩衝溶液：50 mM Tris-Ηα，150 mM NaC卜 5raM CaCl2，0.1% BSA，pH7.5 2.人類 FVIIa (HCVIIA-003 1, Haematologic Technologies Inc.) : 4 x操作溶液-於使用前才於分析緩衝溶液中製備 100微微莫耳濃度溶液。 3 .重組體人類TF (在吾等實驗室中重組，來自Innovin, Dade): 操作溶液-於使用前才於分析緩衝溶液中製備1:480稀釋液。 4. 第 X 因子（HCX-0060，Haematologic Technologies Inc.): 4 X 操作溶液-於使用前才於分析緩衝溶液中製備1000 nM溶 液。 5. 產色團受質 S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): 貯液：6 mM於H20，貯於4°C。 操作溶液-於使用前才於3.57 mM EDTA製備0.78 mM溶 液（以終止反應）’ 1 50 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5 β 6. 抗體： 使用前才於分析緩衝溶液中製備4x稀釋液。 分析條件： 分析在室溫下於96-孔洞微量滴定盤中進行。組份之最終 濃度如下： 85158 -54- 1343388 rTF囊 1:480稀釋液之1/4

抗體 由1000變化至0.625 mM

FVIIa 25 pM

FX 250 nM

S2222 0.546 mM 分析步驟： 1. 將0.015毫升4xAB (或緩衝溶液對照組）吸量至各孔洞中。 2. 加入0.015毫升4x rTF囊 3. 加入0.015毫升4x FVIIa，在室溫及緩和震盪下培育10分 鐘。 4. 加入0.01 5毫升4x FX，在室溫及緩和震盪下培育5分鐘。 5. 加入0.14毫升S2222受質，盤立即轉至讀取機，並在405 毫微米下以10秒間隔測出酵素動力學，共1 5分鐘。 4.蛋白質C活化作用分析（於富含TF之表面） 此分析之進行如同上列之產色蛋白質C活化作用分析，除 了在此分析中於加入凝血酶及蛋白質C之前，係將含有人類 TF之PC/PS囊加至融合蛋白，或對照組TM。 實例6 抗-TF抗體之鑑定特性 自一完全的人類單鏈抗體噬菌體呈現庫中分離7個不同 的TF結合抗體。以BIAcore測得之sTF結合抗體之親和力介 於35及470 nM之間。sTF/VIIa分析法可用來決定抗體是否可 阻斷活性VIIa/TF複合物之形成。於sTF/VIIa分析中，Vila 結合至sTF可加速拮抗產色肽受質S2266之解離達20倍以 85158 -55 - 上。可抑制FVIIa與TF結合之抗體可阻斷此加速作用。在所 分離的7個不同抗體中，僅一者’ scFv(TF)3elO，不會抑制 sTF/VIIa分析。此抗體可增加FVIieisTF之親和力，減少KD 達 5倍（圖 1)。scFv(TF)3el〇 抗體對 sTF 之 KD’ 以 sTF/FVIIa 分 析測得為65.4 nM (圖2)。可以微熱量計來比較scFv(TF)3elO 對TF及對FVIIa/TF複合物之親和力。這些實驗顯示，和自 由態sTF比較下，抗體對TF/FVIIa複合物之親和力高出20倍 (33 nM vs. 600 nM，圖3)。採用FX活化作用分析可比較抗 體，其在磷脂囊中全長TF，FVIIa及FX所組成。FXa產生之 量可利用產色受質S2765來決定。雖然以BIAcore無法測知 scFv(TF)3el0抗體有最高之親和力，且其可增加FVIIa對sTF 之親和力，但其為此組中唯一可抑制FX活化及在PT分析中 延長凝塊時間之抗體。FX活化作用分析中，scFV(TF)3elO (二聚體）抗體對抑制作用之ICso為0.44 nM (圖4)，而PT之二 倍延長發生在417 nM (圖5)。 scFv(TF)3elO抗體以其結合至重組體人類可溶TF之基礎 上被鑑知。在人類及餐齒類或人類及兔子間’ T F之序列同 質性分別為58%及71%。抗體可與人類TF上獨特之表位結 合，其可干擾FVIIa/TF複合物對FX之活化作用。就生理學 而言，此抗體之優點勝過與FVII或FVIIa競爭與TF結合之抗 體。FVII及FVIIa在人類血漿中之KD值均為10 nM，可在KD 100-及1000-倍更高值之間。高親和力複合物之離-速率 (off-rate)將十分緩慢（假設k〇n = lOSlV^sec·1，為 70-700秒）。 相反的，FX對VIIa/TF複合物之km值在0.200至4 μΜ之間， 85158 -56- 1343388 且人類血漿中FX濃度是130 nM (0.03-及0.65倍KD之間）。 FVIIa/TF複合物在凝血作用中之主要功能是將FX轉化成 FXa。 實例7 融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456之試管内特性鑑定 本發明融合蛋白，scFv(TF)3el0-TMi456，在各種試管内 分析中評估特性。融合蛋白，scFv(TF)3elO-TMi456，保有 抑制FVIIa/TF複合物對FX活化之能力（IC5〇 = 0.5 nM，數據 未示出），且在凝血酶催化之蛋白質C活化作用中，其作用 是輔因子（產色分析，圖6)。融合蛋白及單獨的Tmi456之 間，在含有TF之磷脂囊不存在下並未觀察到TM輔因子活性 有何顯著的差異。相反的，含有TF之磷脂囊存.在下，融合 蛋白（但非TMi456)之TM輔因子活性可加強5倍以上（圖7)。 融合蛋白，scFv(TF)3elO-TMi45 6於試管内拮抗TF-誘生之凝 血作用（PT分析，外在凝血路徑）之強度為scFv(TF)3elO抗體 之6倍強，為單獨的TMi456之17倍強（圖5)。相反的，融合蛋 白於試管内拮抗内在的及一般凝血路徑之強度，並未顯著地 受影響（APTT及TCT分析，數據未示出）。因此，在PT中引起 二倍延長之融合蛋白之劑量，在APTT上僅是中度作用，而 ΤΜι456，在PT之相當劑量下在APTT可引起4倍之加強作用 (圖8)。此試管内概況與TF/F Vila—指令之抗凝血劑所預期 的符合，已知其在血栓成之動物模式中有極佳之效力對流 血比例。在同意以血漿為基礎之凝血分析中，融合蛋白 5〇卩¥(丁？）3 610-丁]^1456在丁？-誘生之全血凝固分析中（凝血彈 85158 -57- 1343388 性描記圖 Thromboelastograph, TEG)較 scFv(TF)3elO或單獨 的Τππ456住一者均更具強度（圖此外，融合蛋白 SCFV(TF)3el〇-TMl456在TF-誘生之全血凝固分析中較低分 子量肝素（LMWH，圖10)有更可預測之測量反應。综合而 :，上述之數據證明，本發明的融合蛋白於試管内是強力 且具選擇性之抗凝血劑。 實例8 活體内大鼠血栓插栓模式 融合蛋白seFvCTFPelO-TMWSG之TF抗體部份為靈長類 TF所特異的。為人類TF所啟動之血栓插栓模式（含有重組體 TF之促凝血酶試劑，0rtho)於意識清楚之公的 Dawley大鼠中展開（350-400克，n>7/組）。在此瀰漫性管腔 内凝血（DIC)模式中，TF，經由促凝血酶原激酶注射，可誘 使肺血纖維蛋白沈積，呼吸衰竭，及死亡。丨5分鐘後，經 由促凝血酶原激酶之快速濃注（0.5毫升/公斤）將等莫耳濃 度劑量之 SCFV(TF)3el〇-TMi456 或 SCFv(TF)3elO，或溶媒注 入尾部靜脈内。於溶媒對照組中，此劑量之TF可造成6〇% 致死率（LDeo) ’通常在促凝血酶原激酶注入後5分鐘之内死 亡。依據以下的罹病率-死亡率給分系統，將大鼠計分：〇 = 未受影響；1 =緩和的呼吸窘迫（30分鐘内恢復）；2 =嚴重呼 吸窘迫（垂死的，恢復需60分鐘以上）；及3 =死亡。平均分 數可用來比較4組不同處理組之效力。利用活體内分析之結 果示於圖11。在此分析中’本發明的融合蛋白可抑制死亡 及呼吸窘迫。 85158 -58 - 1343388 上述實例將一般或特述反應物及/或操作條件替換以上 述實例所用者，仍可重覆地獲得類似的成功。 雖然本發明已就某些融合蛋白構體之產製而加以說明， 但明顯地只要不偏離本發明之精義或範疇，此中仍有進行 變化及修飾。 【圖式簡單說明】 圖1 scFv(TF)3elO與sTF之結合可增加sTF對FVIIa之表觀 親和力。如標題為"sTF/FVIIa活化分析”之實例5所述，進行 sTF/FVIIa活化作用分析，其中在800 nM scFv(TF)3elO存在 及不存在下使用2 nM FVIIa。sTF滴定至分析内再決定產色 受質（S-2266)解離之速率。利用標準的4-參數帶入可計算出 sTF之KD表觀值。 圖2測出scFv(TF)3elO對sTF之結合親和力。如標題為 "sTF/FVIIa活化作用分析”之實例5所述，利用3 nM sTF及2 nM FVIIa進行sTF (FVIIa分析。sTF之使用濃度較與FVIIa結 合之KD值低。與scFv(TF)3el0抗體結合可減低sTF與FVIIa 結合之Kd值，使sTF/F Vila複合物之形成增加，且因此增加 產色受質S2266之解離速率。scFv(TF)3el0以漸增之濃度加 入，以增加之反應速率來決定抗體對sTF之表觀KD值，此中 利用4-參數帶入式。 圖3微熱量計分析顯示，scFv(TF)3el0對sTF/FVIIa複合物 之親和力20倍高於單獨的sTF。利用MicroCal VP-ITC設備進 行等溫滴定熱量測定法。加2.3倍莫耳濃度過量之FVIIai至 sTF可預先形成sTF/F Vila複合物。進行大小排阻層析以證實 85158 -59- 1343388 sTF已完全被絡合了。為了決定抗體對複合物之親和力，1.2 μΜ sTF/VIIa複合加至微熱量計小池，而65 μΜ scFv(TF)3elO 抗體加至注射器内。為決定抗體對單獨sTF之親和力，10 μΜ sTF加至小池内，141 μΜ scFv(TF)3elO加至注射器内。以 MicroCal Origin軟體進行數據分析。數據配合單一結合位 置。 圖4 scFv(TF)3el0以劑量依賴方式抑制FX活化分析。此分 析法詳述如標準為''第X因子活化作用分析”之實例5所述。 IC5G代表達到50%最大抑制作用所需之劑量。 圖5融合蛋白抑制凝血作用之強度勝過TF抗體或單獨的 TMi456。進行凝血酶原時間（PT)分析，比較融合蛋白與TF 抗體或單獨的ΤΜΪ456。適量的濃縮抑制劑，或是TF抗體 (scFv(TF)3elO)，TMi456，或融合蛋白（scFv(TF)3elO-TMi456) 加至100微升重組體人類促凝血酶原激酶（Ortho Recombiplastin) 。約2分鐘後，加入1 00微升重組的人類血漿。於Haemolianc 凝固計上決定凝固時間。對各抑制劑產生劑量反應曲線，再 以迴歸分析計算凝塊時間2倍延長所需之濃度（按nM計）。 圖6融合蛋白對蛋白質C之活化保有完全的輔因子活性。在 標題為"蛋白質C活化分析（產色的）"實例5所述之分析中含有 20微升TM樣品，或為ΤΜι456，其含有EGF功能部位4-6，及 EGF3及EGF4間之功能部位間環帶，或融合蛋白 (scFv(TF)3elO-TMi4 56)，20微升 1.5 μΜ蛋白質 C，及20微升 3 ηΜ α凝血酶。全活化作用進行1小時。活化階段之中止 係加入20微升0.16單位/毫升水蛭素。再加入100微升的1 85158 -60 - 1343388 mM S2266，並於每10秒決定A405，共歷30分鐘。反應速率 依所產生之經活化蛋白質C含量而定。數據以mOD/分鐘表 示。 圖7蛋白質C為融合蛋白之活化速率可在含TF之磷脂表 面上加強。蛋白質C為TMi456之活化速率並不因TF囊之加 入而受影響。標題為π蛋白質C活化作用分析（於富含TF表 面）”之實例5分析中含有20微升ΤΜ樣品，可為TMi456或融 合蛋白（scFv(TF)3el0-TMi456)，20微升的 1.5 μΜ蛋白質 C， 20微升的3 ηΜ α凝血酶，及20微升緩衝溶液或TF囊 (Innovin，人類重詛體TF，4Χ正常濃度於ΡΤ)。令活化作用 進行1小時。活化階段之中止係加入20微升0.16單位/毫升水 蛭素。再加100微升1 mM S2266，並每10秒決定A405，共30 分鐘。反應速率依所產生之經活化蛋白質C量而定。數據以 mOD/分鐘表示a 圖8融合蛋白對TF-誘生之凝固作用之特異性大於 TMi450。經活化的部份促凝血酶原激酶時間（APTT)分析對 凝固之内在及中央路徑之抑制劑敏感。在此分析中發生之 凝固作用和TF無關。抑制劑，不論是TF抗體（scFv(TF)3el0)， TMi456，或融合蛋白（scFv(TF)3elO-TMi456)，稀釋至 50微 升再重組之人類血漿，使最終濃度在PT分析中可生成二倍 之延伸。凝固計再加入50微升APTT (Alexin HS)試劑及50 微升CaCl2試劑（0.02莫耳/升），並決定按秒計之凝塊時間。 圖9融合蛋白在抑制TF-誘使之全血凝固作用上，較其任 一單獨組份均強力。全血凝固作用中用Hae mo scope血栓彈 85158 -61 - 1343388 性描計圖（TEG)分析儀分析。為檸檬鹽化全血蛋白質 (scFv(TF)3elO-TMi4 56)，並加入10微升使凝血酶原激酶試 劑（1:64稀釋）及20微升0.2M CaCl2。取得各樣品之R-值（最初 血纖維蛋白形成之時間）。此值再轉化成未受抑制之對照組 R-值之百分率。 圖10在全血液凝固分析中（TEG)，融合蛋白有較LMWH更 可預測之劑量反應。為擰檬酸化全血，加入濃度漸增（]5 nM 開始’以2X增加比例增加）之融合蛋白（scFv(TF)3ei〇_ 丁1\^456)，或濃度漸增（〇.15微克/毫升開始並以2父增加）之依 諾肝素（enoxaparin (LMWH))，以及10微升促凝血酶原激酶 試劑（1:64稀釋）及20微升〇.2M CaCl2。求得各樣品之R·值（血 纖維蛋白開始形成之時間）’並以相對濃度作圖（對各（類似 R-值）最低濃度為1，再以2X濃度增加）。 圖Π融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456在瀰漫性管腔内凝固 作用（nDIC")之活體内模式中是有效的。在實例8所述之大 鼠血栓插栓模式中’針對（A)死亡率及罹病率_死亡率分 數，評估TF 抗體（scFv(TF)3elO)及融合蛋白（scFv(TF)3el0- TMi456)。（A)在以溶媒處理之組中，所用之TF劑量可造成 60。/。致死率（LD6〇)。0.7毫微莫耳/公斤之 可完全避免死亡》相反的，0.7毫微米/公斤之scFv(TF)3el〇 對此亡並無衝擊Q scFv(TF)3elO-TMi456較1〇倍較高劑量之 scFv(TF)3elO更為有效。（b)在以溶媒_處理之組中tF之活體 内劑量可造成2.6之平均罹病率_死亡率分數，此乃依以下分 數系統為準· 〇=未党影響；丨=緩和的呼吸窘迫（在3〇分鐘内 85158 -62 · 1343388 恢復）；2 =嚴重的呼吸窘迫（垂死的，恢復需60分鐘以上）； 及3=死亡。scFv(TF)3elO-TMi456以劑量-依賴方式避免tf 誘生之死亡及呼吸窘迫，EDm值為0.46毫微米/公斤/0.019毫 克/公斤）。7.0毫微米/公斤之scFv(TF)3el〇_TMi45H完全避 免死ττ及呼吸窘迫，且在〇7毫微莫耳/公斤下可完全避免死 相反的’ 0.7毫微米/公斤之 且對呼吸窘迫少或無影響。 以上劑量之scFv(TF)3el0更有 亡及顯著減少呼吸窘追。 scFv(TF)3el0對死亡無衝擊， seFv(TF)3elO-TMi456較 1〇 件 效。 85158 •63 - 1343388 序列表 <110〉Light, David McLean, Kirk <120>作為抗凝血劑之標的可溶性組織因子抗體血栓調結素融合蛋白 <130> 52295AUSM1 <140> 092110159 <141> 2003-04-30 <150> US 60/376,566 <151> 2002-05-01 <160> 3 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213〉人工的 <400> 1

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 15 10 15

Phe Pro Glu Met Ala Gin Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30

Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45

Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60

Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 85158

Gly Gly Gly Gly 145 Ser Val Ser Ala

Ser Ser Gly Ser 180 Pro Gly Ser Ser 195 Ser Gly Val Pro 210 Ser Ala Ser Leu 225 Tyr Tyr Cys Gin

Gly Thr Lys Leu 260 Tyr Pro Asp Pro 275 <210> 2 <211〉 418 <212> PRT <213〉人工的 <400> 2 Met Leu Gly Val 1 Phe Pro Glu Met 20 Val Gin Pro Gly 35 Ser Phe Thr Asp 50 Glu Leu Glu Trp 65

Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met: Leu Thr Gin Pro His 150 155 160

Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg 165 170 175

Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg 185 190

Pro Thr Thr Val lie Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro 200 205

Asp Arg Phe Ser Gly Ser lie Asp Thr Ser Ser Asn 215 220

Thr lie Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 230 235 240

Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly 245 250 255

Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro 265 270

Leu Glu Pro Arg Ala Ala 280

Leu Val Leu Gly Ala Leu 5 10

Ala Gin Val Asn Leu Arg 25

Gly Ser Leu Arg Leu Ser 40

Ala Trp Met Ser Trp Val 55

Val Ser Ser lie Ser Gly 70

Ala Leu Ala Gly Leu Val 15 Glu Ser Gly Gly Thr Leu 30 Cys Ala Ala Ser Gly Phe 45 Arg Gin Ala Pro Gly Lys 60 Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 75 80 85158 -2- 1343388

Leu Asp Asp Gly Phe lie Cys Thr Asp lie Asp Glu Cys Glu Asn Gly 355 360 365

Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 370 375 380 lie Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gin lie Gly Thr Asp Cys 385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro A'rg 405 410 415

Ala Ala <210> 3 <211> 397 <212> PRT <213〉人工的 <400> 3

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 15 10 15

Phe Pro Glu Met Ala Gin Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20' 25 30

Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45

Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60

Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 4 - 85158

Claims (1)

1343388

第 09211〇β9 中文申請專 Μ 拾、申料观[― : 1. 一種抗凝血劑融合蛋白，其包括可與組織因子（TF)或第 Vila因子/TF (FVIIa/TF)複合物結合之單鏈抗體，其可操 作地連結至血栓調節素（TM) EGF456功能部位及£(^3及 EGF4間之功能部位間環帶其中該抗凝血劑融合蛋白包含 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白，其中該抗 凝血劑融合蛋白係糖基化者。 3. 根據申請專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白，其中該抗 凝金劑融合蛋白因加入聚乙二醇而經修飾。 4. 根據申請專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白，其中該抗 凝血劑融合蛋白經生物素化以結合鏈抗生物素蛋白。 5' 一種醫藥組合物，此組合物含有治療有效劑量之根據申 請專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白及醫藥上可接受 之賦形劑。 6. 一種可保護拮抗血栓形成之醫藥組合物，其中含治療有 效劑量之根據申請專利範圍第丨項之抗凝血劑融合蛋 白，及醫藥上可接受之賦形劑，其中該抗凝血劑融合蛋 白可抑制凝血酶之產生但不會直接影響其他凝固作用參 數’如血小板之活化作用及凝集作用。 7·根據申請專利範圍第6項之醫藥組合物，纟中該組合物可 在絕血性休克，血管造形術後之血栓併發症，或微血管 手術中保護拮抗血栓形成。 8.—種用於預防及治療病人之深靜脈血栓形成（DVT)、瀰漫 85158-1000218 d〇c 1343388 性管腔内凝固作用（DIC)、急性冠狀症候群、或有凝血病 變證據之癌症之醫藥組合物，其令含有治療有效劑量之 根據申請專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白及醫藥上 可接受之賦形劑。

一種可調控病人發炎反應之醫藥組合物，其中含有治療 有效劑量之根據申請專利範圍第丨項之抗凝血劑融2蛋 白及醫藥上可接受之賦形劑。 根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中該發炎反應 選自由菌血症，皮膚及靜脈移植物，及器官移植組成之 群中。 根據申吻專利範圍第1項之抗凝血劑融合蛋白，其中該抗 凝企劑融合蛋白可在醫學裝置之表面形成非_血栓生成之 塗層’其中該醫藥裝置係與血液接觸。 種套，且其3有根據申請專利範圍第1項之抗凝血劑融 合蛋白。 13· —種套組，其含有編碼根據申請專利範圍第i項之抗凝血 劑融合蛋白組份之DNA序列。 14. -種用於基因治療之醫藥組合物，其包含編碼由啊 NO: 2或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列組成之抗凝血劑融合 蛋白之DNA，並組合以治療有效劑量之基因治療載體。 85158-1000218.doc