JP2005532045A - 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織因子（TF）単独に対してよりも第VII a因子/組織因子（FVII a/TF）に対して、より高い親和性を持って結合、EVII 及びFXと、TFへの結合のために競争せず、そしてFX活性化を阻害する新規抗体に関する。前記抗体は損傷の部位で結合し、そして血栓症の開始を妨げる。前記抗体は、種々の血栓状態、例えば深静脈血栓症、散在性血管内凝固及び急性冠状症候群（但し、それらだけには限定されない）を処理するために使用され得る。

Description

背景：
血管内の前凝固活性と抗凝固活性との間の正しい均衡の維持は、正常な止血のために必須である（Davie, E.W. など. (1991) biochemistry, 30 (43): 10363-10370）。凝固に対する均衡の混乱は、心臓発作、卒中、肺塞栓症及び静脈血栓症を引き起こすことができる血栓症を導く。特定の血栓障害の処理のためのより効果的で且つ完全な抗凝固剤についての必要性が存在する。

組織因子("TF")は凝固カスケードの主要甲開始体であるトランスメンブラン糖タンパク質である(Nemerson、Y.(1995)Thromb.Haemost.74(1):180-184)。正常な生理学的条件下で、活性TFは血液と接触しない。血管傷害の間、内皮下TF及び膠原の血液への暴露は凝固因子及び血小板の活性化、及びつづく止血栓形成に導く。暴露されたTFは、第TFは、第IX因子（“FIX”）及び第X因子（“FX”）、すなわち内因性テナーゼ及びプロトロンビナーゼ複合体の決定成分の第VII a因子（“FVII a”）触媒された活性化のための補因子として作用する。

これは、FXａ及びトロンビンの急速な形成を導く。次に、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに分解し、そして続いて、フィブリンクロットを形成するために重合する。種々の臨床学的設定のTF発現の不適切な誘発は、生命脅威の血栓症に通じ、そして/又は、病理学的併発症の原因となる。プラーク裂創につづくTF暴露は、急性の心筋梗塞及び卒中を導く血栓の閉塞を担当すると思われる。また、それらの設定においては、凝固因子により活性化された前炎症性シグナル化経路が、浮腫生成及び高められた梗塞サイズに寄与する。血管形成法に関連する血管傷害は、再狭窄に関連する細胞シグナリング化経路を誘発すると思われるSMCに対するTFのアップレギュレーションに通じる。癌及びグラム陰性菌敗血症におけるTF過発現は、生命脅威の血栓症及び炎症経路の活性化を誘導する。

第Vlla /TF複合体は、種々の血栓疾患における病原性機構に関与し、そして、TFの循環レベルは一定の患者のための危険因子である。FVlla及びTFは、止血の維持及び血栓症の開始における血管傷害において役割を演ずる。TFは外膜において通常、発現されるが、しかし血管病における媒体及び新生内部（neointima）において不適切にアップレギュレーションされ、そして発現される。動脈硬化プラークにおけるTF発現は、高められ、そしてTFを暴露するために破壊することができる薄い線維性被膜により血液から保護される。バルーン血管形成法、ステンチング、又は内膜切除などの外科的介入は、血管壁を破損しそして、基本的なTFを暴露する。

アテローム硬化性、脂質に富んだ、薄膜プラークにおいては、自発的破壊または内皮腐食がTF暴露及び血栓症誘導し、不安定な狭心症及び心筋梗塞をもたらす。TFは細胞誘導の微小粒子中を循環することができ、そして、循環TFレベルは、この循環TFが血栓形成に寄与するかもしれないことを示唆する不安定な狭心症において高められる(H.など(1999)循環99(22): Soejima、2908-2913)。しばしば、癌は、腫瘍細胞におけるTFの過発現の結果と考えられる過凝固状態に関連する。これは、深部静脈血栓症、肺塞栓症、及び下級散在性血管内凝固(“DIC”)に患者を傾かせる。DICは多臓器不全に寄与する微小血管線維素沈着をもたらす。

TFを標的化する、タンパク質基材の抗凝固剤は、TF中和性抗体、活性部位阻害された第VII a因子（“FVII a”）、組織因子経路インヒビター（“TFPI”）、及び線虫抗凝固タンパク質（“NAPC2”）を包含する。血栓症の急性動脈障害モデルからの結果は、FVlla/TFのタンパク質に基づくインヒビターが、ヘパリン、直接的トロンビンインヒビター、血小板インヒビター、及びFXaインヒビターに比べて、それほど出血しない効果的な抗血栓であることを示す（Himber, J. など. (2001) Thromb. Haemost. 85:475-481; Harker, L. A. など. (1995) Thromb. Haemost.74(1): 464-472。さらに、バルーン損傷に続いて、FVlla/TF阻害は新生内部の肥厚化及び血管狭穿症を防ぐことにおいて、他の抗凝固剤(e.g.、ヘパリン、第FXaインヒビター)より優れている(Jang、Y. (1995)Circuration 92(10): 3041-3050)。

TFのほかに、FVII a 又はFVII a/TF複合体は、敗血症の実験モデルにおいてDICを妨げ、そして死亡率を低めるための効果的な抗トロンボンアプローチである。TFPI類似体は、ウサギにおけるトロンボンプラスチン及び内毒素−誘発されたDICの両者を妨げる（Day, K.C.など. (1990) Blood 76: 1538-1545; Bregengard, C. など. (1993) Blood Coagul. Fibrinolysis 4: 699-706）。FVII a(Biemond, B.J. など. (1995) Thromb. Haemost. 73: 223-230)又は（Levi, M. など. (1994) J. Clin. Invest. 93: 114-120）に対するモノクローナル抗体は、サルにおける内毒素−誘発されたDICを妨げる。中和化する抗体FVII ai及びTFPIは、DICを阻害し、そしてE. コリ誘発された敗血症のヒヒモデルにおける死亡率を低める（Creasey, A.A. など. (1993) J. Clin. Invest 91: 2850-2860; Taylor, F.B. など. (1991a) Blood 78: 364-368; Taylor. V.B. など. (1991b) Circ. Shock 33: 127-134; Taylor, F.B. (1996) Haemostasis Suppl. 126: 83-91）。遊離FXa及びFVII a/TF/FXa複合体の両者は、敗血症を有する患者における死の高められた危険性に関連する前炎症性サイトカインの生成を誘発することが知られている（Riewald, M. など. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7742-7747）。興味あることには、FVII aiはヒヒモデルにおけるIL-6及びIL-8の血漿レベルを低めることが示されており（Taylor, F.B. など. (1998) Blood 91- 1609-1615）、このことは、FVII a/TF阻害が他の抗凝固機構により共有されない追加の抗炎症効果を有することを示唆する。

TF又はFVII a/TF複合体のいずれか、又は両者に結合し、そして中和する、効果的抗凝固剤であるいくつかの抗体が記載されている（例えば、Carson, S.D. など. (1985) Blood 66 (1): 152-156; Tanaka, H. など. (1985) Thromb. Res. 40(6): 745-756; Kirchhofer, D. など. (2000) Throomb. Haemost. 84(6); 1072-1081; Kirchhofer, D. など. (2001) Biochemistry 40(3): 675-682; Faelber, K. など. (2001) J. Mol. Boil. 313: 83-97; 及びアメリカ特許第5,506,134号、第5,986,056号及び第6,274,142号を参照のこと）。本発明のTF標的化された抗体は、前に記載されたTF抗体よりも改良された特徴を有する効果的な抗凝固剤である。特に、本発明の抗体は、TF単独に対してよりも、FVII a/TF複合体に対して、より高い親和性を持って結合し、そしてTFへの結合のためにFVII 又はFXと競争しない。

発明の要約：
本発明は、組織因子（“TF”）単独に対してよりも、第VII a因子/組織因子（“FVII a/TF”）複合体に対して、より高い親和性を持って結合する、抗凝固剤として作用する抗体を提供する。１つの態様において、本発明の抗体は、マイクロ熱量測定アッセイにより測定される場合、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも２倍高い親和性を持って結合する。好ましい態様においては、本発明の抗体は、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも５倍高い親和性を持って結合する。

より好ましい態様においては、本発明の抗体は、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも10倍高い親和性を持って結合する。もう１つの態様においては、本発明の抗体は、第VII 因子（FVII ）、第IX因子（FIX）及び第X因子（FX）から成る群から選択された１又は複数の凝固因子と、TFに結合するために競争しない。好ましい態様においては、本発明の抗体は、TFに結合するために、FVD及びFXと競争しない。より好ましい態様においては、本発明の抗体は、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、より高い親和性を持って結合し、そしてTFへの結合のためにFVII 及びFXと競争しない。

本発明の抗凝固剤抗体は、損傷の部分でFVII a/TF複合体を標的化し、そしてそれに結合し、そして第X因子（“FX”）活性化を阻害し、従って、血栓の形成を妨げ、そしてそれにより、一定の疾病、例えば敗血症、散在性血管内凝固、虚血性発作、深静脈血栓症、急性冠状症候群、血管形成に続く血栓合併症、及び進行した癌における凝固障害（但し、それらだけには限定されない）の処理において抗凝固剤として効果的に実施する。さらに、その抗体は、微小血管手術、皮膚及び静脈移植片及び器官移植片に使用される。

もう１つの観点においては、本発明は、対象の抗体を含む医薬組成物を提供する。
もう１つの観点においては、有効量の本発明の抗体を患者に投与し、そしてそれにより、他の凝固剤パラメーター、例えば血小板の活性化及び凝固に直接的に影響を及ぼさないで、トロンビンの生成を阻害することを含んで成る、血栓形成に対して患者を保護するための方法を提供する。
もう1つの観点においては、本発明は、治療的有効量の本発明の抗体を患者に投与することを含んで成る、深静脈血栓症（DVT）、散在性血管内凝固（DIC）、急性冠状症候群、又は患者における凝固障害の現象を伴っての癌を低め、そして処理するための方法に関する。

もう１つの観点においては、本発明は、治療的有効量の本発明の抗体を患者に投与することを含んで成る、前記患者における炎症性応答を調節するための方法に関する。
さらにもう１つの観点においては、本発明の抗体は、血液と接触する医学装置の表面上に非トロンバゲン形成するために使用され得る。
もう１つの観点においては、本発明は、FVII a/TF複合体に結合する本発明の抗体を含んで成るキットに関する。他方では、前記キットは、抗体成分をコードするDNA配列を含むことができる。
本発明の組換え及び成分抗体の製造方法がまた開示される。

発明の詳細な記載：
本発明の抗凝固剤抗体は、組織因子（“TF”）単独に対してよりも、第VII a因子/組織因子（“FVII a/TF”）複合体に対して、より高い親和性を持って結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも２倍高い親和性、好ましくは少なくとも５倍高い親和性及びより好ましくは、少なくとも10倍高い親和性を持って結合する。本発明の抗体は、第VII 因子（FVII ）、第IX因子（FIX）及び第X因子（FX）から成る群から選択された１又は複数の凝固因子と、TFに結合するために競争しない。好ましくは、本発明の抗体は、TFに結合するために、FVII 及びFXと競争しない。

定義：
本発明を記載する際、次の用語は、下記に示されるように定義される。
“組換えタンパク質又はポリペプチド”とは、組換えDNA技法により生成される、すなわち所望するポリペプチドをコードする外因性DNA構造体により形質転換された細胞、微生物又は哺乳類から生成されるタンパク質又はポリペプチドを言及する。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、グリカンを有さないであろう。酵母において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、哺乳類細胞において発現されるグリコシル化パターンとは異なるパターンを有することができる。

“生来”のタンパク質又はポリペプチドとは、天然において存在する源から回収されたタンパク質又はポリペプチドを言及する。用語“生来の抗体”とは、天然に存在するTM及びそのフラグメントを包含する。

DNA“コード配列”とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合、宿主細胞においてmRNAに転写され、そしてポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5’側N−末端での開始コドン及び3’側C−末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核配列、真核mRNAからのcDNA、真核DNAからのゲノムDNA配列、及び合成DNA配列を含むことができる。転写停止配列は通常、3’側のコード配列に位置するであろう。

“ヌクレオチド配列”とは、デオキシリボヌクレオチド（塩基アデノシン、グアニン、チミン又はシトシン）のへテロポリマーである。本発明の抗体をコードするDNA配列は、組換え発現ベクターにおいて発現され得る合成遺伝子を供給するために、合成cDNA由来のDNAフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカーからアセンブリーされ得る。特定の二本鎖DNA分子の構造を論じる場合、配列は、転写されていないcDNA鎖に沿って5’から3’側の方向に配列を単に与える通常の慣例に従って記載され得る。

“組換え発現ベクター”は、本発明の抗体をコードするDNAを増幅するか又は発現するために使用される複製できるDNAである。発現ベクターは、DNA制御配列及びコード配列を含む。DNA制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写停止配列、上流の調節ドメイン及びエンハンサーを含む。本明細書において定義されるような組換え発現システムは、調節要素の誘発に基づいて抗体を発現するであろう。

“形質転換された宿主細胞”とは、外因性DNAにより形質転換され、そしてトランスフェクトされた細胞を言及する。外因性DNAは、細胞のゲノムを製造する染色体DNAに連結されても、又はされなくても良い（共有結合されても又はされなくても良い）。例えば、原核生物及び酵母においては、外因性DNAは、エピソーム要素、例えばプラスミド上に維持され、又は染色体DNA中に安定して組込まれ得る。真核細胞に関しては、安定して形質転換された細胞は、外因性DNAが染色体複製中に組込まれている細胞である。この安定性は、外因性DNAを含む娘細胞集団を生成する真核細胞系又はクローンの能力により示される。

用語“類似体”、“フラグメント”、“誘導体”及び“変異体”とは、本発明の抗体を言及する場合、下記にさらに記載されるように、実質的に同じ生物学的機能を保持する、抗体の類似体、フラグメント、誘導体及び変異体を意味する。

“類似体”とは、本発明の抗体のアミノ酸配列を、その内部に含むプロ−ポリペプチドを包含する。本発明の活性抗体は、天然のインビボ方法により、又は当業界において良く知られている方法により、例えば酵素又は化学分解により、プロ−抗体分子を完結する追加のアミノ酸から分解され得る。例えば、組換えscFv(TF)3e10ポリペプチド（配列番号１）は、282個のアミノ酸のプロ−ポリペプチドとして、天然において発現され、これは次に、264個のアミノ酸活性成熟ポリペプチドをインビボで開放するよう処理される。

“フラグメント”は、下記にさらに記載されるように、本明細書に開示されるインビトロアッセイに示されるように、実質的に類似する機能的活性を保持する、本発明の抗体の一部である。

“誘導体”とは、下記にさらに記載されるように、本明細書に開示される機能を実質的に保持し、そして追加の構造及び付随する機能、例えば高い半減期を有するPEG化された抗体、コンドロイチン硫酸の添加により修飾されたO−グリコシル化された抗体、及びビオチニル化された抗体を包含する本発明の抗体へのすべての修飾を包含する。誘導体はまた、N−又はO−グリコシル化部位を、抗体配列中に、標準の組換えDNA技法により挿入することにより生成され得る、N−又はO−結合された、グリコシル化された抗体も包含する。

“実質的に類似する機能的活性”及び“実質的に同じ生物学的機能又は活性”とはそれぞれ、個々のポリペプチドの生物学的活性が同じ方法又はアッセイにより決定される場合、比較されるポリペプチドにより示されるその生物学的活性の約30％〜100％又はそれ以上である生物学的活性の程度を意味する。例えば、例１の抗体（配列番号１）に実質的に類似する機能的活性を有する、抗体は、例４に記載されるsTF/FVII aペプチド加水分解及びFX活性化アッセイにより試験される場合、FVII a/ TF複合体に結合し、そして中和する能力を示すものである。

２種のポリペプチド間の“類似性”は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を、第２のポリペプチドの配列に比較することによって決定される。そのような保存性置換は、Dayhoff (1978) 及び Argos (1989) EMBO J. 8: 779-785によるThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5において上記に記載されるそれらを包含する。例えば、次のグループの１つに属するアミノ酸は、保存性変化を表す：
- Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr；
- Cys, Ser, Tyr, Thr;
- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
- Lys, Arg, His;
- Phe, Tyr, Trp, His;及び
-Asp, Glu。

“抗体”とは、本明細書において使用される場合、選択された標的タンパク質、例えば溶解性TF（“sTF”）のエピトープを結合することができる、損なわれていない免疫グロブリン（“Ig”）分子、及びそのフラグメント、例えばFab、F(ab’)₂及びFvを包含する。典型的には、少なくとも６，８，10又は12個の連続したアミノ酸がエピトープを形成するために必要とされる。しかしながら、非連続的アミノ酸を包含するエピトープは、少なくとも15, 25又は50個のアミノ酸を必要とされ得る。
本明細書において使用されるすべての他の技術用語は、本発明が属する当業者により通常使用されるのと同じ意味を有する。

本発明の抗体類及びそれらの生成：
本発明の抗凝固剤抗体は、組織因子（“TF”）単独に対してよりも、第VII a因子/組織因子（“FVII a/TF”）複合体に対して、より高い親和性を持って結合する。１つの好ましい態様において、本発明の抗体は、マイクロ熱量測定アッセイにより測定される場合、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも２倍高い親和性、好ましくは少なくとも５倍高い親和性及びより好ましくは、少なくとも10倍高い親和性を持って結合する。

本発明のもう１つの好ましい態様においては、抗体は、第VII 因子（FVII ）、第IX因子（FIX）及び第X因子（FX）から成る群から選択された１又は複数の凝固因子と、TFに結合するために競争しない。さらに好ましい態様においては、本発明の抗体は、TFに結合するために、FVD及びFXと競争しない。最も好ましい態様においては、本発明の抗体は、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、より高い親和性を持って結合し、そしてTFへの結合のためにFVII 及びFXと競争しない。

一般的に言及すると、選択された標的タンパク質（例えば、FVII a/TF複合体又はTF）に対して特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイに使用される場合、他のタンパク質により供給される検出シグナルよりも少なくとも５，10又は20倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、選択された標的タンパク質に対して特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液から標的タンパク質を免疫沈澱することができる。

選択された標的タンパク質は、ポリクローナル抗体を生成するために、哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、テンジュクネズミ、サル又はヒト免疫化するために使用され得る。所望には、標的タンパク質は、キャリヤータンパク質、“例えば”ウシ血清アルブミン、チログロビン及びキーホール・リンペットヘモシアニンに接合され得る。宿主種に依存して、種々のアジュバントが、免疫学的応答を高めるために使用され得る。そのようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）及び界面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ヒトに使用されるアジュバント間で、BCG（バシリ・カルメテ−グエリン（bacilli Calmette-Guerin）及びコルニバクテリウム・パルビューム（Cornybacterium parvum）が特に有用である。

選択された標的タンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養物における連続細胞系により抗体分子の生成を提供するいずれかの技法を用いて調製され得る。それらの技法は、ハイブリドーマ技法、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技法及びEBV−ハイブリドーマ技法を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Kohlerなど. (1985) Nature 256: 495-497; Kozbor など. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote など. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; 及び Cote など. (1984) Mol. CellBiol. 62: 109- 120）。

さらに、“キメラ抗体”の生成のために開発された技法、すなわち適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためにヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングが使用され得る（Morrison など. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger など. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda など. (1985) Nature 314: 452-454）。モノクローナル及び他の抗体はまた、それが治療的に使用される場合、抗体に対する免疫応答の患者における蓄積を妨げるために、“ヒト適合”され得る。そのような抗体は、直接的に使用されるヒト抗体に配列的に十分に類似し、又は少数のキー残基の変更を必要とする。

齧歯動物抗体とヒト配列との間の配列差異は、個々の残基の特定部位の突然変異誘発によりヒト配列における残基とは異なる残基を置換することによって、又は完全な相補性決定領域の移植により最少にされ得る。他方では、ヒト適合された抗体は、GB2188638B号に記載されるように、組換え方法を用いて生成され得る。選択された標的タンパク質に対して特異的に結合する抗体は、アメリカ特許第5,565,332号に開示されるように、部分的に又は十分に適合された抗原−結合部位を含むことができる。

他方では、一本鎖抗体の生成のために記載される技法は、選択された標的タンパク質に対して特異的に結合する一本鎖抗体を生成するために、当業界において知られている方法を用いて適合され得る。関連する特異性を有するが、但し明確なイディオタイプ組成の抗体が、ランダム組合せIgライブラリーからの鎖シャフリングにより生成され得る（Burton（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123）。

一本鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマcDNAを用いて、DNA増幅、例えばPCRを用いて構成され得る（Thirionなど. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5: 507-511）。一本鎖抗体は、一又は二特異的であり得、そして二価又は三価であり得る。四価の二特異的一本鎖抗体の構成は、例えばColoma and Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15: 159-163に教授されている。二価の二特異的一本鎖抗体の構成は、Mallendar and Voss (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-216に教授されている。

一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動又は自動化されたヌクレオチド合成を用いて構成され、標準の組換えDNA方法を用いて発現構造体にクローン化され、そしてコード配列を発現するために細胞中に導入される。他方では、一本鎖抗体は、例えば線上ファージ表示技法を用いて、直接的に生成され得る（Verhaarなど. (1995) Int. J. Cancer 61: 497-501 ; 及び Nicholls などl. (1993) J. Immunol. Meth. 165: 81-91）。

選択された標的タンパク質に対して特異的に結合する抗体はまた、文献に開示されるように、リンパ球集団においてインビボ生成を誘発することにより、又はIgライブラリー、又は高い特異性の結合試薬のパネルのスクリーニングにより生成される（Orlandi など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; Winter など. (1991) Nature 349: 293-299）。

本発明の抗体をコードするDNAは、cDNA又はゲノム形で、当業者に知られているいずれかのクローニング方法によりクローン化され得る。例えば、Sambrook, J. F. など. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照のこと。

抗体がモノクローナル抗体である場合、発現される場合、特異的結合活性を示すFv領域をコードするDNA配列が同定されると、そのFv領域を含んで成る抗体が、当業者に知られている方法により調製され得る。従って、例えばChaudhary, V. K. など. (1989) Nature 339(6223): 394-397; Batra, J. K. など. (1990) J. Biol. Chem. 265(25): 15198-15202; Batra, J. K. など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21): 8545-8549; Chaudhary, V. K. など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(3):1066-1070（引用により、本明細書に組込まれる）は、種々の一本鎖抗体タンパク質の調製を記載する。

好ましいアプローチにおいては、本発明のTF−結合抗体は、ファージ表示ライブラリーを用いて調製される一本鎖抗体である。一本鎖のエピトープ−結合領域は、次の２種の可変領域ドメインから製造される：H鎖からのドメイン及びL鎖からドメイン。ファージ表示ライブラリーの構成の第１段階においては、種々の遺伝子（V_H（IgMからの）、V_K及びV_L）は、ファミリー特異的プライマー組を用いて、ヒト骨髄、リンパ節及び脾臓からのプールされたmRNAからPCRクローン化された。得られるpCITE-V_H (3.8×10⁹のメンバー)、pZ604-V_K (1.6×107)及びpZ604-V_L (3.2×10⁷)ライブラリーが、V遺伝子の永久的及び高い多様性を提供する。V_K及びV_L遺伝子は、5’末端で逆J_H及びリンカー配列を有するpZ604-V_K及びpZ604-VLライブラリーからPCR増幅された。

PCR生成物を含む、ゲル精製されたV_H, V_K及びV_Lが、scFV遺伝子レパートリーを製造するために、一緒にスプライスされた。scFV遺伝子レパートリーは、ファーゲミドベクター、pZ603にクローン化され、そしてその連結生成物がコンピテントTG1 E. コリ細胞にエレクトロポレートされ、5.2×10⁹個の個々の形質転換体を有するscFVファージ表示ライブラリーHuPhabL3が生成された（Kay, B. K. など. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins : A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J. D. など. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3): 581-597; Sheets, M. D. など. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-6162）。

scFvファージ表示ライブラリーからのTF−結合ファージが、当業界において良く知られているパンニング技法を用いて、選択され、増幅され、そして続いて、同定される。可溶性TFがプラスチック管に固定され、そして脱脂乳がプラスチックへの非特異的結合を低めるために使用され得る。scFvファージの集団がプラスチック管における固定されたsTFに暴露され；そして結合されなかったファージが集中的な洗浄により除去される。TF−結合scFcファージが管から溶出され、そして次に、溶液におけるTG1 E. コリ細胞を感染することにより増幅される。

このパンニング方法が３度、反復され、そして得られるTF−結合scFVファージが、TG1細胞の形質転換により単離される。TF−結合抗体を発現する形質転換体が、96ウェル皿におけるプラスチック上に固体されるstFにより、標準のELISAを用いて同定される。ELISA−陽性形質転換体の一本鎖抗体挿入体のDNAが配列決定される。DNA配列決定に基づいて、次の６種のユニーク一本鎖抗体、すなわちscFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3ｅ10及びscFv(TF)3h2がここで同定され、そして下記例５に記載のようにして、発現され、そしてE.コリから精製され、そして特徴づけられる。

本発明の抗体の発現及び精製：
インビトロで、例えばE. コリ、バキュロウィルス、酵母、哺乳類細胞又は他の発現システムにおいて組換え本発明の抗体を発現するいくつかの手段が存在する。細菌におけるクローン化された遺伝子の発現方法は良く知られている。原核システムにおいてクローン化された細胞の高いレベル発現を得るためには、mRNA転写終結を指図するための強いプロモーターを、最少でも含む発現ベクターを構成することが必須である。この目的のために適切な調節領域の例は、E. コリβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター及びオペレーター領域、E. コリトリプトファン生合成経路、又はファージλからの左方向プロモーターである。E. コリにおいて形質転換されたDNAベクターにおける選択マーカーの包含は、有用である。そのようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子を包含する。

本発明の抗体及びその類似体、フラグメント、誘導体又は変異体の発現のために有用な高等真核細胞系のうち、選択すべき多くの細胞系が存在する。哺乳類細胞系の例として、RPMI7932、VERO及びHeLa細胞チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、W138, BHK, COS-7, C127又はMDCK細胞系を列挙することができるが、但しそれらだけには限定されない。CHL−１が使用される場合、ヒグロマイシンが真核選択マーカーとして含まれる。CHL−１細胞は、RPMI7032メラノーマ細胞、すなわち容易に入手できるヒト細胞系に由来する。CHL−１細胞系は、ブダペスト条約に従ってATCCに寄与され、そして1987年６月18日、＃CRL9446の受託番号を得た。本発明への使用のために適切な細胞は、ATCCから商業的に入手できる。例示的な細胞系は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）及びボムビックス・モリ（Bombyx mori）を包含する。

原核系E. コリは、後−翻訳修飾、例えばグリコシル化を行うことはできない。さらに、複雑なジスルフィドパターンを有するタンパク質はしばしば、E. コリにおいて発現される場合、誤って折りたたまれる。原核システムに関しては発現されたタンパク質は、細胞が溶解した後、可溶性画分に見出される、不溶性形、いわゆる封入体で細胞質に存在し、又は適切な分泌シグナル配列の付加によりペリプラスマに向けられる。発現されたタンパク質が不溶性封入体に存在する場合、封入体の可溶化及び続く折りたたみ通常、必要とされる。

多くの原核発現ベクター、例えばpK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、pKK233-2（Clontech, Palo Alto, CA, USA）、及びpGEM1（Promega Biotech, Madison, WI, USA）は、当業者に知られており、そしてそれらは市販されている。

組換え微生物発現システムに通常使用されるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーターシステムを包含する（Chang, A. C. など. (1978) Nature 275 (5681): 617-624; Goeddel, D. V. など. (1979) Nature 281 (5732): 544-548), the tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, D. V. など. (1980) Nucl. Acids Res. 8 (18): 4057-4074) and tac promoter (Maniatis, T. など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)）。もう１つの有用な細菌発現システムは、λファージpLプロモーター及びClts857熱誘発性リプレッサーを使用する（Bernard, H. U. など. (1979) Gene 5 (1) : 59-76; Love, C. A. など. (1996) Gene 176 (1-2): 49-53）。

組換え抗体はまた、酵母宿主、例えばサッカロミセス・セレビシアエにおいて発現され得る。それは通常、種々の後−翻訳修飾を行う能力を与える。発現された本発明の抗体は、多くの他のタンパク質が存在せず、精製を容易にする培養上清液中に分泌され得る。本発明における抗体の発現のための酵母ベクターは、一定の必要な特徴を含む。ベクターの要素は一般的に、プラスミドの増殖を可能にするために酵母及び細菌から誘導される。細菌要素は、複製の起点及び選択マーカーを含む。酵母要素は、複製配列の起点（ARS）、選択マーカー、プロモーター及び転写ターミネーターを含む。

発現のための酵母ベクターにおける適切なプロモーターは、TRP1遺伝子のプロモーター、ADH1又はADHII遺伝子、酸性ホスファアーゼ（PH03又はPH05）遺伝子、イソチトクロム遺伝子、又は解糖系に関与するプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GADPH）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼのプロモーター包含する（Hitzeman, R. A. など. (1980) J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-12080; Hess, B. など. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149-167; 及び Holland, M. J. and Holland, J. P. (1978) Biochemistry 17 (23): 4900-4907）。

市販の酵母ベクターは、pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Settle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255), 及び YpGX265GAL4 (ATCC # 67233)を包含する。哺乳類細胞系、例えばCOS-7, L 細胞, C127, 3T3, チャイニーズ・ハムスター卵巣 (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO, 及び HEK293（但し、それらだけには限定されない）が、本発明の組換え抗体を発現するために使用され得る。哺乳類において生成される組換えタンパク質は通常、可溶性であり、そしてグリコシル化され、そして確実なN−末端を有する。哺乳類発現ベクターは、非転写要素、例えば複数の起点、プロモーター及びエンハンサー、及び5’又は3’非翻訳配列、例えばリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、受容体部位及びスプライスドナー、及び転写終結配列を含むことができる。哺乳類発現ベクターに使用するためのプロモーターは通常、ウィルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウィルス、HTLV、SV40及びヒトサイトメガロウィルス。（CMV）である。

発見システム及び選択された宿主に依存して、相同組換え抗体が、タンパク質精製のために使用される従来のクロマトグラフィーの種々の組合せを用いることにより得られる。それらは次のものを包含する：免疫親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過のクロマトグラフィー及びHPLC。発現システムが増殖培地中に抗体を分泌する場合、そのタンパク質は培地から直接的に精製され得る。抗体が分泌されない場合、それは細胞溶解物から単離される。細胞破壊は、いずれかの従来の方法、例えば凍結−融解循環、音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用により行われ得る。

pCANTAB5（Pharmacia）に基づくプラスミド構造体が、本発明の一本鎖抗体の細菌発現のために使用された。例えば、一本鎖抗体scFv(TF)3e10を含むプラスミドは、pZ612/3e10であり、そして一本鎖抗体配列、続いてe-標識配列（タンパク質の精製のために使用され得る）をコードする。scFv(TF)3e10抗体のアミノ酸配列は、配列番号１（例１）に対応し、そしてscFv(TF)3e10をコードするDNA配列は配列番号２に対応する。

pTHR525（アメリカ特許第5,827,824号を参照のこと）に基づくプラスミド構造体が、本発明の一本鎖抗体の哺乳類発現のために使用された。例えば、プラスミドが、細菌発現プラスミドにおいてN−末端シグナル配列及びC−末端e-標識配列を含むプロ−scFv(TF)3e10アミノ酸配列を拡張するDNAフラグメントを生成するよう企画された。PCRが、アンピシリン耐性遺伝子及びヒグロマイシン及びDHFR選択マーカーを含む、哺乳類発現ベクター中に挿入されたDNAフラグメントを生成するために行われた。本発明の一本鎖抗体の発現は、MPSV LTRプロモーターにより駆動された。

本発明の好ましい態様においては、哺乳類発現構造体がCHO DXB11細胞中にトランスフェクトされた。安定した集団が、HAMS/F12培地中、400μg/mlのヒグロマイシンBを用いて選択される。発現レベルは約500μg/lであった。発現レベルを高めるために、集団がαMEM培地中、100nMのメトトレキセートを用いて選択された。この集団のおおよその発現レベルは5mg/lであった。
本発明の抗体は、当業界において知られている方法により精製され得る。例えば、抗体は、TFが結合されるカラムの通過により親和性精製され得る。次に結合されたTF−抗体が、高い塩濃度を有する緩衝液を用いて、カラムから溶出され得る。

本明細書に記載される一本鎖抗体は、タンパク質のC-末端でe-標識配列を含む。抗−e−標識親和性カラムは、American/Pharmacia Biotechから購入された。細胞培養培地が、0.22μmのフィルターを通して濾過され、そして2ml/分で5mlのe−標識化ラム中に負荷された。カラムが0.2Mのリン酸緩衝液、0.05%のNaN₃（pH7.0）により洗浄され、そして次に、0.1体積の１Mのトリス緩衝液（pH8.2）を含む管中に集められ、溶出緩衝液が中和された。他方では、濾過された培養培地がプロテインAカラム上に負荷された。この場合、カラムは、50mMのクエン酸、300mMのNaCl（pH6.5）により洗浄され、そして同じ緩衝液（pH3.0）により溶出された。両者の場合、精製されたサンプルは、抗体のダイマー形からモノマーを分離するために、Sephadex 200カラム上に負荷された。

本発明の抗体の選択：
抗体が生成され、発現され、そして精製されると、それらはさらに、本発明の抗体を同定するために、BIAcore, STF依存性第VII a因子アッセイ（sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイ）、FX活性化アッセイ、及び例４に記載されるPTアッセイを用いて特徴づけられ得る。

本発明の好ましい態様においては、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、より高い親和性をもって結合するTF−結合scFv抗体が、sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイを用いて選択される。このアッセイにおいては、TFに対してよりもFVII a/TF複合体に対して、より高い親和性をもって結合するTF−抗体は、K_D(app)を高めることが予測される。図２は、一本鎖抗体scFV(TF)3e10がK_D(app)を約５倍、高めることを示す。マイクロ熱量計測アッセイが、TF単独に比較して、FVII a/TF複合体に対してのTF−抗体の親和性を測定するために使用される。図５は、一本鎖抗体scFv(TF)3e10が、TF単独に比較して、FVII a/TF複合体に対して、約20倍高い親和性に対応する、600nM及び33nMのFVII a/TF複合体及び遊離TFへの結合のK_Dを有することを示す。本発明の抗体は、TFに対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍及びより好ましくは少なくとも10倍高い親和性を有する。

TFへの結合のためにFVII と競争しないTF−結合scFv抗体が、sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイを用いて選択される。このアッセイにおいては、TFへの結合のためにFVII aと競争するTF−抗体は、色原体基質S2266の加水分解を阻害すると思われる。図１は、一本鎖抗体scFv(TF)3e10がFVII a活性を阻害せず、そして実際的に高めた。

FX活性化を阻害するTF−結合scFv抗体は、PTアッセイ及びFX活性化アッセイを用いて選択される。PTアッセイにおいては、PTを延長するTF−抗体は、FX活性化を阻害すると思われる。図３は、一本鎖抗体scFv(TF)3e10がPTを延長することを示し、このことは、この抗体がFX活性化を阻害することを示唆する。FX活性化アッセイにおいては、FXa活性を阻害するTF−抗体は、色原体基質S2222の加水分解を阻害すると思われる。図６は、一本鎖抗体scFv(TF)3e10がFXa活性を阻害したことを示す。

TFへの結合のためにFXと競争しないTF−結合scFv抗体が、FX活性化アッセイを用いて選択される。このアッセイにおいては、FXと競争しないTF−抗体は、使用される濃度のFXとは無関係にFX活性化を阻害すると思われる。図７は、一本鎖抗体scFV(TF)3e10がFX濃度−独立の態様でFXa活性を阻害したことを示す。
本発明の好ましい態様においては、TFのために単一のV_H/V_L結合部位を有する一本鎖抗体（scFV(TF)3e10）が同定された。scFv(TF)3e10のアミノ酸配列は、例１に示されており、そして配列番号１に対応する。scFv(TF)3e10をコードするDNA配列は、配列番号２に対応する。

本発明の抗体の類似体、フラグメント、誘導体及び変異体：
本発明の抗体の類似体、フラグメント、誘導体又は変異体、及び標的タンパク質又はTMドメインは、
（ｉ）１又は複数のアミノ酸残基が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）により置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされる残基であっても又はそうでなくても良いもの；又は
（ii）１又は複数のアミノ酸残基が置換基を包含するもの；又は
（iii）成熟抗体がもう１つの化合物、例えば本発明の抗体の半減期を高めるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）により融合されるもの；又は

（iv）追加のアミノ酸が成熟抗体、リーダー又は分泌配列、又は成熟抗体の精製のために使用される配列に融合されるもの；又は（V）ポリペプチド配列がより大きなポリペプチド、すなわち効果の高められた持続期間のために、ヒトアルブミン、抗体又はFcにより融合されるものであり得る。そのような類似体、フラグメント、誘導体及び変異体は、本明細書における教授から当業者の範囲内にあると思われる。

好ましくは、本発明の誘導体は、１又は複数の予測される、好ましくは非必須のアミノ酸残基で製造される保存性アミノ酸置換（さらに下記定義される）を含むであろう。“非必須”アミノ酸残基は、生物学的活性を変更しないで、タンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、そして“必須”アミノ酸残基が生物学的活性のために必要とされる。“保存性アミノ酸置換”は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸前記により置換されている置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界に追いて定義されている。

それらのファミリーは、塩基性鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−枝分かれ側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。

非保存性置換は、その置換が下記にさらに記載されるように変異体抗体のための酸化損傷及びプロテアーゼに対して、得られる本発明の抗体を選択するために行わなければ、保存されたアミノ酸残基、又は保存されたタンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基のために行われない。フラグメント又は生物学的活性の部分は、医薬として、研究試薬として、及び同様のものとしての使用のために適切なポリペプチドフラグメントを包含する。フラグメントは、本発明の抗体のアミノ酸配列に十分に類似するか又は又はその配列に由来するアミノ酸配列を含んで成り、そしてポリペプチドの少なくとも１つの活性を含むが、しかし本明細書に開示される十分な長さのポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含むペプチドを包含する。

さらに、本発明の好ましい誘導体は、もう１つの化合物、例えばポリペチド半減期を高めるために及び/又はポリペプチドの可能性ある免疫原性を低めるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール、“PEG”）により融合された成熟抗体を包含する。PEGは、水溶解性、サイズ、及び速度の腎クリアランス及び抗体に対する低められた免疫原性を付与するために使用され得る。例えば、アメリカ特許第6,214,966号を参照のこと。PEG化の場合、PEGへの抗体の融合は、当業界に知られているいずれかの手段により達成され得る。

例えばPEG化は、まず、抗体中へのシステイン突然変異の導入、続くPEG−マレイミドによる部位特異的融合体化により達成される。システインは、ペプチドのC−末端に付加され得る。例えば、Tsutsumi など. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15): 8548-8553を参照のこと。本発明の抗体に製造され得るもう１つの修飾は、ビオチニル化を包含する。ある場合、ストレプタビジンと容易に反応できるようビオチニル化された抗体を有することが有用である。タンパク質のビオチニル化のための方法は当業界において良く知られている。さらに、N-又はO-グリコシル化部位は、抗体配列中に導入され、その結果、抗体の後−翻訳N-又はO-結合されたグリコシル化がインビボで生じることができる。

本発明の抗体、標的タンパク質及びTMドメインの変異体は、元の抗体、標的タンパク質及びTMドメインのアミノ酸配列に対して十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。用語“十分に類似する”とは、第１及び第２のアミノ酸配列が共通する構造ドメイン及び/又は共通する機能的活性を有するよう、第２のアミノ酸配列に対して、十分な又は最少数の同一又は同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約45％、好ましくは約75％〜98％同一である共通構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似するものとして、本明細書においては定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましい抗体のアミノ酸配列に対して十分に類似するであろう。変異体は、緊縮条件下で本発明のポリペプチド又はその補体に加水分解するポリヌクレオチドによりコードされる抗体の変異体を包含する。

そのような変異体は、一般的に、本発明の抗体の機能的活性を保持する。ポリヌクレオチドのフラグメントのライブラリーは、スクリーニング及び続く選択のためのフラグメント集団を生成するために使用され得る。例えば、フラグメントのライブラリーは、二本鎖のPCRフラグメントを処理し、二本鎖DNAを変性し、異なったニックされた生成物から、センス/アンチセンス対を包含する二本鎖DNAを形成するためにDNAを再結合し、S1ヌクレアーゼによる処理により、再形成された重複体から一本鎖部分を除去し、そしてその得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成され得る。この方法により、本発明の種々のサイズの抗体のN−末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。

変異体は、突然変異のためにアミノ酸配列において異なる抗体を包含する。例えば、突然変異誘発は、遊離TFに比較して、FVII a/TF複合体に対して高められた結合親和性を有する変異体を創造するために、Ig L鎖及びH鎖のV_L及びV_Hドメインを修飾することが当業界において知られている組換えDNA技法に従って行われ得る。特に好ましい変異体は、V_L及びV_Hドメインの相補性決定領域内に修飾を有する抗体を包含する。

変異体はまた、突然変異によるアミノ酸残基の挿入又は欠失のためにアミノ酸配列において異なる抗体を包含する。例えば、突然変異誘発は、実質的に類似する機能的活性を保持する変異体を創造するために、Ig L鎖及びH鎖のV_H又はV_LドメインのN−末端又はC−末端におけるアミノ酸を挿入し又は欠失する当業界において良く知られている組換えDNA技法に従って行われ得る。特に好ましい変異体は、V_H及びV_Lドメイン間のV_H−V_Lリンカーにおけるアミノ酸残基の挿入又は欠失を有する一本鎖抗体を包含する。例１に記載される一本鎖抗体におけるV_H−V_Lリンカー配列は、１〜5個の長さのアミノ酸残基である。0〜20個のアミノ酸の他の短いリンカー配列が使用され得るが、ところが抗体は実質的に類似する機能活性を保持すべきであることは明らかであろう。存在するV_H−V_Lリンカーの修飾は、一本鎖抗体のダイマー形の安定性を高めることを目的とする。

１つの態様においては、変異体の種々のライブラリーが、核酸レベルでの組合せが突然変異誘発により生成され、そして種々の遺伝子ライブラリーによりコードされる。変異体の種々のライブラリーは、変性組の可能性ある変異体アミノ配列が個々のポリペプチドとして、又は他方では、そこにおける配列組を含む大きな本発明の抗体組（例えば、ファージ表示のための）として発現できるよう、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより生成され得る。変性オリゴヌクレオチド配列から可能性ある変異体のライブラリーを生成するために使用され得る種々の方法が存在する。

変性遺伝子配列の化学的合成は、自動DNA合成機により行われ、そして次に、合成遺伝子が適切な発現ベクター中に連結される。変性組の遺伝の使用は、所望する組の可溶性ある変異体配列をコードするすべての配列の供給を、１つの混合物において可能にする。変性オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業界において知られている（例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura など. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura など (1984b) Science 198: 1056 ; Ike など. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477を参照のこと）。

点突然変異又は切断より製造される組合せライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするための、及び選択された性質を有する遺伝子生成物のためのcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法は、当業界において知られている。そのような技法は、TF-又はFVIIa/TF複合体−結合活性又はFX活性化阻害活性の組合せ突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの急速なスクリーニングのために適切である。大きな遺伝子ライブアリーをスクリーニングするための高処理量分析に従うことができる、最も広く使用されている技法は、複製できる発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーによる適切な細胞の形質転換、及び所望する活性の検出が生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下での組合せ遺伝子の発現を包含する。帰納的アンサンブル突然変異誘発（REM）、すなわちライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高め技法が、所望する変異体を同定するためにスクリーニングアッセイと組合して使用され得る。

例１は、１つのTF−結合一本鎖抗体scFv(TF)3e10（配列番号１）のアミノ酸配列を示し、そしてV_H-V_Lリンカー及びV_H及びV_Lドメインを明確に記載する。TF−又はFVII a/TF複合体−結合活性を有するか、又はFX活性化を阻害する変異体は、例４に記載されるsTF/FVII aペプチド加水分解又はFX活性化アッセイを用いて、本発明の抗体の変異体、例えば挿入、又は点突然変異の組合せライブラリーをスクリーニングする同定され得る。本発明の抗体は、例１及び３に記載される抗体（配列番号１及び３）、及びそれからの配列における非実質的な変動を有するそれらの抗体を包含する。

“非実質的な変動”とは、本発明の抗体の実質的に少なくとも１つの生物学的機能、例えばFX活性化を阻害する能力を保持する、いずれかの配列、置換又は欠失変異体を包含する。それらの機能的同等物は好ましくは、配列番号１又は３の一本鎖抗体のV_L又はV_H領域ドメインと少なくとも約90％の同一性、及びより好ましくは、配列番号１又は３の一本鎖抗体のV_L又はV_H領域ドメインと少なくとも95％の同一性、及びさらにより好ましくは、配列番号１又は３の一本鎖抗体のV_L又はV_H領域ドメインと少なくとも91％の同一性を有し、そして実質的に同じ生物学的活性を有するこのような抗体の一部を含む抗体を包含することができる。しかしながら、さらに本明細書に記載されるような機能的同等性を示す配列番号１又は３の抗体からのアミノ酸配列において非実質的な変動を有するいずれかの抗体が、本発明の記載に包含される。

医薬組成物：
本発明はまた、治療効果を達成するために患者に投与され得る医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、所望する程度及び医薬的有効量の本発明の抗体を生理学的に許容できるキャリヤーとを組合すことによって、投与のために調製され得る。
本発明の抗体は、静脈内投与又は皮下投与又は鞘内投与のために、医薬組成物に使用され得る。従って、上記抗体は好ましくは、許容できる医薬キャリヤー、例えば５％デキストロース、乳酸化されたリンガー溶液、通常の塩溶液、無菌水又は静脈内注入のために企画されたいずれか他の市販の生理学的緩衝溶液と共に組み合わされるであろう。キャリヤー溶液の選択、及び組成物の用量及び投与は対象及び特定の臨床学的設定により変化し、そして標準の医学的方法により支配されることが理解されるであろう。

本発明の方法に従って、それらの医薬組成物は、対象における過剰トロンビン生成に関連する病理学的結果を阻害するために効果的量で投与され得る。
本発明の抗体の投与は、ボーラス静脈内注射、一定の静脈内注入又は両経路の組合せによることができる。他方では、又はさらに、適切な賦形剤と共に混合された本発明の抗体が筋肉内部位から循環中に取られ得る。本発明の抗体による全身性処理は、患者から採取される一連の血液サンプルに対して活性化された部分的トロンボプラスチン時間（PT）を決定することによりモニターされ得る。このアッセイにおいて観察される凝固時間は、十分なレベルの本発明の抗体が循環において達成される場合、延長される。

本発明の組換え抗体及び医薬組成物は、非経口、局所、静脈内、経口又は局部投与のために有用である。医薬組成物は、投与方法に依存して、種々の単位用量形で投与され得る。例えば、単位用量形は、錠剤、カプセル、粉末、溶液及びエマルジョンの形で投与され得る。
本発明の組換え本発明の抗体及び医薬組成物は、静脈内投与のために特に有用である。投与のための組成物は通常、医薬的に許容できるキャリヤー、例えば、水性キャリヤーに溶解された一本鎖抗体の溶液を含んで成る。種々の水性キャリヤー、例えば緩衝溶液及び同様のものが使用され得る。それらの溶液は、無菌であり、そして一般的に所望しない物質を含まない。組成物は、従来のよく知られている殺菌技法により殺菌され得る。

静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、当業者により用意に決定され得る。投与される量は、明確にタンパク質特異的であり、そしてその能力及び薬物力学プロフィールに依存する。非経口的に投与できる阻止物を調製するための実際の方法は、当業者に知られているかまたは明らかであり、そして（Remington's Pharmaceutical Science, 15n ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980）の出版物により詳細に記載されている。

本発明の本発明の抗体又はそのカクテル（すなわち、他のタンパク質を含む）を含む組成物が、治療処理剤として投与され得る。治療用途においては、組成物は、出血を治癒するか、又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量、出血障害又は疾患を有する患者に投与される。これを達成するために適切な量は、“治療的有効量”として定義される。この作用のために効果的な量、疾病の重症性及び患者の健康の一般的状態に依存するであろう。
組成物の一回の投与又は複数回の投与は、患者により必要とされ、そして耐えられる用量及び頻度に依存するであろう。とにかく、組成物は、患者を効果的に処理するために、十分な量の本発明のタンパク質を供給すべきであろう。

本発明の抗体、又はその医薬的に許容できる組成物は、種々の因子、例えば使用される特定の抗体の活性；本発明の抗体代謝安定性及び作用の長さ；年齢；体重；一般的健康性；性別及び患者の食事；投与の型及び時間；排泄の速度；薬物の組合せ；特定の疾病状態の重症性；及び治療を受ける宿主に依存して変化するであろう治療的有効量で投与される。一般的に、毎日の治療的有効量は、約0.14mg〜約14.3mg/kg体重/日の本発明の本発明の抗体又は医薬的に許容できるその組成物；好ましくは、約0.7mg〜約10mg/kg体重/日；及び最も好ましくは、約1.4mg〜約7.2mg/Kg体重/日である。例えば70kgの人への投与に関しては、投与量範囲は、約10mg〜約1.0g/日の本発明の本発明の抗体、又は医薬的に許容できるその組成物、好ましくは約50mg〜約700mg/日、及び最も好ましくは、約100mg〜約500mg/日である。

細胞及び遺伝子療法：
本発明の抗体はまた、“細胞療法”として言及される、そのような抗体のインビボでの発現により、本発明に従って使用され得る。従って、例えば細胞が、その抗体をコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）によりエクスビボで構築され、次にその構築された細胞が、抗体により処理されるべき患者に供給される。そのような方法は、当業界において良く知られている。例えば、細胞は、本発明の抗体をコードするRNAを含むレトロウィルス粒子の使用により、当業界において知られている方法に従って構築され得る。

本発明の抗体はまた、“遺伝子療法”として言及される、そのような抗体のインビボでの発現により、本発明に従って使用され得る。従って、例えばウィルスが、その抗体をコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）によりエクスビボで構築され、次にその構築されたウィルスが、抗体により処理されるべき患者に供給される。そのような方法は、当業界において良く知られている。例えば、組換えアデノウィルスは、本発明の抗体をコードするDNAを含むレトロウィルス粒子の使用により、当業界において知られている方法に従って構築され得る。

細胞又は遺伝子療法を用いての本発明の抗凝固抗体の局部供給は、治療剤を標的領域、すなわち血管の内部の内皮細胞に供給することができる。
インビトロ及びインビボ細胞又は遺伝子療法が企画される。可能性ある治療剤を、定義された細胞集団にトランスファーするためのいくつかの方法は知られている。例えば、Mulligam（1993）Science 260:926-931を参照のこと。それらの方法は、次のものを包含する：

１）直接的な遺伝子トランスファー。例えば、Wolff など. (1990) Science 247: 1465-1468を参照のこと。
２）リポソーム介在性DNAトランスファー。例えば、Caplen など. (1995) Nature Med. 3: 39- 46; Crystal (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285を参照のこと。
３）レトロウィルス介在性DNAトランスファー。例えば、Kay など. (1993) Science 262: 117- 119; Anderson (1992) Science 256: 808-813を参照のこと。

４）DNAウィルス介在性DNAトランスファー。そのようなDNAウィルスは、アデノウィルス（好ましくは、Ad2又はAd5に基づくベクター）、ヘルペスウィルス（好ましくは、ヘルペス単純ウィルスに基づくベクター）、及びパルボウィルス（好ましくは、“欠損性”又は非自発的パルボウィルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ−関連ウィルスに基づくベクター、最も好ましくはAAV−２に基づくベクター）を包含する。例えば、Ali など. (1994) Gene Therapy 1: 367-384; アメリカ特許第4,797, 368号（引用により本明細書に組込まれる）, 及びアメリカ特許第 5,139, 941号, （引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。

興味ある遺伝子をトランスファーするための特定のベクターシステムの選択は、種々の因子に依存するであろう。１つの重要な因子は、標的細胞集団の性質である。レトロウィルスベクターは集中的に研究され、そして多くの遺伝子療法用として使用されて来たが、それらのベクターは一般的に、非分裂細胞を感染するのには適切でない。さらに、レトロウィルスは腫瘍形成のための可能性を有する。しかしながら、レンチウィルスベクターの分野における最近の開発は、それらの制限のいくつかを回避することができる。Naldiniなど. (1996) Science 272: 263-267を参照のこと。

上記に言及されるレトロウィルスプラスミドベクターが由来するレトロウィルスは、Molongネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、レトロウィルス、例えばラウス肉腫ウィルス、Harrey肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、ヒト免疫欠員ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス及び乳癌ウィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されない。１つの態様においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、Molongネズミ白血病ウィルスに由来する。

アデノウィルスは、それらが広い宿主範囲を有する利点を有し、静止細胞又は最終的に分化された細胞、例えばニューロン又は肝細胞を感染することができ、そして実質的に非腫瘍形成であるように思える。例えば、Aliなど. (1994)、前記、p.367を参照のこと。アデノウィルスは、宿主ゲノム中に組込むように思えない。それらは染色体外に存在するので、挿入突然変異の危険性が非常に低められる。Aliなど. (1994)、前記、p373を参照のこと。

アデノ−関連ウィルスは、アデノウィルスに基づくベクターに類似する利点を示す。しかしながら、AAVは、ヒト染色体19上への部位特異的組込みを示す（Aliなど. (1994), 前記、p.377）。
好ましい態様においては、本発明の抗体をコードするDNAは、障害、例えば深静脈血栓症、散在性血管内凝固、急性冠状症候群、又は凝固障害の証拠を有する癌（但し、それらだけには限定されない）についての遺伝子療法に使用される。
この態様によれば、本発明の抗体をコードするDNAによる細胞又は遺伝子療法は、診断と同時に又は診断の直後、その必要な患者に提供される。

当業者は、本発明の抗体をコードするDNA、又は本発明の抗体の類似体、フラグメント、誘導体又は変異体をコードするDNAを含むいずれかの適切な遺伝子療法がこの態様に従って使用され得ることを理解するであろう。そのようなベクターを構成するための技法は知られている。例えば、Anderson, W. F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I. M. and Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242を参照のこと。標的部位への抗体DNA−含有ベクターの導入は、既知の方法を用いて達成され得る。

細胞又は遺伝子療法ベクターは、１又は複数のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウィルスLTR；SV40プロモーター；及びMillerなど. (1989) Biotechniques 7(9):980-990に記載されるヒトサイトメガロウィルス（CVM）プロモーター、又はいずれか他のプロモーター（例えば、細胞プロモーター、例えば真核細胞プロモーター、例えばヒストン、Pol III 及びβ−アクチンプロモーター）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。使用され得る他のウィルスプロモーターは、アデノウィルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウィルスプロモーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教授から当業者に明らかであろう。

本発明の抗体をコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アデノウィルスプロモーター、例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター；又は異種プロモーター、例えばサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター；呼吸シンチチウムウィルス（RSV）プロモーター；誘発プロモーター、例えばMMTプロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoA1プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウィルスチミジンキナーゼプロモーター、例えばヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーター；レトロウィルスLTR（上記に記載される修飾されたレトロウィルスLTRを包含する）；β−アクチンプロモーター；及びヒト成長ホルモンプロモーター。

レトロウィルスプラスミドベクターは、生成体細胞系を形成するパッケージング細胞系を形質導入するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、引用により本明細書に組込まれるMiller（1990）Human Gene Therapy 1:5-14に記載されるような、PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+#- 86, GP+envAm12、及びDNA細胞系を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは、当業界において知られているいずれかの手段によりパッケージング細胞を形質導入することができる。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びCaPO₄沈殿を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

１つの変法においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、リポソーム中に封入されるか、又は脂質に結合され、そして次に、宿主中に投与される。生成体細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する感染性レトロウィルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウィルスベクター粒子は、インビトロ又はインビボで、真核細胞に形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入され得る核酸細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞及び造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び気管支上皮細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

遺伝子療法への異なったアプローチは、患者の細胞が、患者への再導入の後、興味あるタンパク質を生成するよう休眠染色体遺伝子を誘発するためにエクスビボで処理される“トランスカーヨチック療法（transkaryotic theropy）”である。トランスカーヨチック療法は、個人が活性化のために必要な遺伝子の正常な補体を有することを想定する。トランスカーヨチック療法は、新生遺伝子を活性化できるプロモーター又は他の外因性調節配列を、患者の細胞の染色体DNA中にエクスビボで導入し、活性タンパク質−生成細胞を培養し、そして次に、それらが次に十分に確立されるように成る患者中にその活性化された細胞を再導入することを包含する。次に、“遺伝子活性化された”細胞が、興味ある細胞を、有意な時間、たぶん患者の生命が続く限り製造する。アメリカ特許第5,641,670号及び第5,733,761号は、この概念を詳細に開示し、そしてそれらは引用により本明細書に組込まれる。

キット：
本発明はさらに、研究又は診断目的のためにキットに関する。キットは典型的には、本発明の一本鎖抗体を含む、１又は複数の容器を含む。好ましい態様においては、キットは、一本鎖抗体を、第２分子により誘導するために適切な形で含む容器を含んで成る。より好ましい態様においては、キットは、配列番号１又は３の抗体を含む容器を含んで成る。

もう1つの態様においては、キットは、本発明の抗体をコードするDNAを含むことができる。好ましくは、それらの抗体をコードするDNA配列は、宿主細胞中へのトランスフェクション及びその細胞による発現のために適切なプラスミドに供給される。プラスミドは、宿主細胞においてDNAの発現を調節するためにプロモーター（しばしば、誘発プロモーター）を含むことができる。プラスミドはまた、種々の抗体を生成するためにプラスミド中への他のDNA配列の挿入を促進するための適切な制限部位を含むことができる。プラスミドはまた、コードされるタンパク質のクローニング及び発現を促進するために多くの他の要素を含むことができる。そのような要素は、当業者に良く知られており、そして例えば、選択マーカー、開始コドン、終結コドン、及び同様のものを包含する。より好ましい態様においては、キットは、配列番号２又は４のDNA配列を含む容器を含んで成る。

治療適用：
血栓形成が有意な病因学的役割を演じる疾病は、心筋梗塞、散在性血管内凝固、深静脈血栓症、肺塞栓症、虚血性発作、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、不安定狭心症、及び他の動脈及び静脈閉塞状態を包含する。本発明の抗体は、それらのすべてにおいて、及び血栓形成が病理学的である他の疾病において有用である。本発明の抗体が有用である他の病理学的状態は、凝固障害及び炎症を有する癌を包含する。化合物はまた、皮膚及び静脈移植及び器官移植にも使用され得る。

有用なとは、化合物が疾病を妨げるために、又はより重度な状態へのその進行を妨げるために有用であることを意味する。本発明の化合物はまた、例えば生物補綴、例えば心臓弁を受ける患者において安全且つ効果的な抗凝固剤を提供する。それらの化合物は、例えば肺塞栓症又は急性心筋梗塞の処理においてヘパリン及びワルファリンを置換することができる。本発明の抗体はまた、凝固が関心の中心である医学装置の被覆においても使用され得る。

アッセイ：
本発明の抗体のインビボ抗凝固活性を測定するための多くの実験用アッセイが入手できる。抗体の抗凝固効果は、血漿凝固時間アッセイ、例えば活性化された部分トロンボプラスチン時間（“APTT”）、トロンビン凝固時間（“TC”）及び/又はプロトンビン時間（“PT”）を用いて測定され得る。それらのアッセイは、凝固阻害の異なった機構間を区別し、そしてプロテインCの活性化を包含する。それらのアッセイのいずれか１つにおける凝固時間の延長は、分子が血漿における凝固を阻害できることを示す。

上記アッセイは、精製されたシステム及び血漿環境の両者において、TFを結合できる抗凝固活性を有する抗体を同定するために使用される。さらなるアッセイは、本発明の抗体の他の活性、例えばフィブリノーゲンからのフィブリンのトロンビン触媒された形成の阻害（Jakubowski, H. V. など. (1986) J. Biol. Chem. 261 (8): 3876-3882）、第V因子のトロンビン活性化の阻害（Esmon, C. T.など. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14): 7944-7947）、抗トロンビンIII 及びヘパリン補因子IIによるトロンビンの促進された阻害（Esmon, N. L. など. (1983) J. Biol. Chem. 258 (20): 12238-12242）、第XIII 因子のトロンビン活性化の阻害（Polgar, J. など. (1987) Thromb. Haemost. 58 (1) : 140）、プロテインSのトロンビン介在性不活性化の阻害（Thompson, E. A. and Salem, H. H. (1986) J. Clin. Inv. 78 (1) : 13-17）、及びトロンビン介在性血小板活性化及び凝集の阻害（Esmon, N. L. など. (1983), 前記）を評価するために使用される。

下記例４に詳細に記載される次のアッセイが本発明の抗体のインビボ能力又はインビトロ結合親和性を測定するために使用される：１）sTF/FVII aペプチド加水分解圧制；２）第X因子活性化アッセイ；３）PTアッセイ；及び４）マイクロ熱量測定アッセイ。

本発明の方法の実施においては、もちろん、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件及び同様のものについての言及は制限を意図するものではなく、当業者がその論議が提供される特定の情況における興味又は価値あるものとして認識するすべての関連する材料を包含するよう読み取られることが理解される。例えば、１つの緩衝液システム又は培養培地をもう１つのものと置換し、そしてさらに、同一の結果でない場合、類似性を達成することがしばしば可能である。当業者は、本明細書に開示される方法を用いることにおいて最適にそれらの目的を満たすためにそのような置換も、過度の実験を伴わないで、行うことができるよう、そのようなシステム及び方法論の十分な知識を有するであろう。

本発明は現在、次の非制限的例によりさらに記載されるであろう。例の開示の適用においては、本発明に従って開示される方法の他の及び異なった態様が当業者にそれ自体提案するであろうことを明確に考慮すべきである。
前述の及び次の例においては、特に断らない限り、すべての温度は℃で示され、そしてすべての部及び％は重量によるものである。
上記に引用されるすべての出願、特許及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。

例１．一本鎖抗−TF抗体構造体scFv(TF)3e10

一本鎖抗−TF抗体scFv(TF)3e10 (配列番号１)は、シグナルペプチド（−18〜−１）、V_Hドメイン（１〜126）、V_H−V_Lリンカー（127−131）、V_Lドメイン（132〜246）及びe-標識配列（247〜264）から成る。scFv(TF)3e10 DNA配列（配列番号２）は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。

例２．一本鎖抗体−TF抗体構造体scFv(TF)3e10Δ

一本鎖抗−TF抗体scFv(TF) 3e10Δ(配列番号３)は、シグナルペプチド（−18〜−１）、V_Hドメイン（１〜126）、V_H−V_Lリンカー（127−131）、及びV_Lドメイン（132〜243）から成る。scFv(TF)3e10Δは、V_LドメインのN−末端での３個のアミノ酸（GAP）の欠失により、及びC−末端e−標識配列の欠失によりscFv(TF)3e10とは異なる。scFv(TF)3e10Δ DNA配列（配列番号４）は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする。

例３．細菌及び哺乳類細胞における抗−TF抗体の発現
次の６種の異なった一本鎖抗体scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3ｅ10及びscFv(TF)3h2を、E.コリにおいて過剰発現されるTF−結合ファージ、及び上記のようなe−標識カラムを用いて精製された親和性から同定した。sTFに対する前記６種の精製された抗体の親和性を、BIAcoreを用いて測定し、そして次に、それらの抗体を、例４に記載されるsTF/FVII aペプチド加水分解、FX活性化、PT及びマイクロ熱量測定アッセイにおいて特徴づけ、その結果は例５に記載される。

scFV(TF)3e10抗体（配列番号１）を、CHO細胞において発現した。発現プラスミドは、scFv(TF)3e10をコードするDNA配列（配列番号２）、及びヒグロマイシンB及びDHFR選択マーカーを含んだ。本来の選択は、集団を選択するために400μg/mlのヒグロマイシンにおいて行われた。次に、得られる集団を、100nMのメトトレキセート選択にゆだねた。この選択の間、選択マーカー及び標的遺伝子を含むDNAの領域のコピーを増幅した細胞を、前記集団から選択する。発現レベルを、この選択の結果として、約0.3mg/lから約6mg/lに高めた。

例４．インビトロ能力及び結合親和性抗体
１．sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイ
このアッセイの原理は下記に示される。基質のトリペプチドp−トロアニリドアミド結合を、sTF/FVII a複合体により加水分解する。生成される発色団生成物、ｐ−ニトロアニリドを、405nmでモニターし、そして単位時間当たりの形成される生成物の濃度を、9920M^-1cm^-1のモル消衰計数を用いて計算する。IC₅₀値（C）を、開始速度を、４パラメーター等式：Y＝（A-D）/（１＋(X/C)^B）＋D中に適合せしめることにより決定する。

試薬及び溶液；
１．アッセイ緩衝液：50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.1%BSA, pH7.5。
２．ヒトFVII a（HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.）：10×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において2.0nMの溶液を調製する。
３．可溶性TF(Berlex)：10×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において30nMの溶液を調製する。
４．色原体基質S2266（Kabi Pharmacia Hepar Inc.）：原液：水中、10mM、4℃での貯蔵された、2.5×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において2.5mMの溶液を調製する。
５．抗体：使用の前、アッセイ緩衝液において2.5×希釈溶液を調製する。

アッセイ条件：
アッセイを室温で96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。成分の最終濃度は次の通りである：
sTF:3nM；抗体：1000〜0.625nMに変化する；FVII a：2nM；S2266：1mM。

アッセイ方法：
１．0.1mlの2.5×AB（又は緩衝液対照）を個々のウェルにピペットで取る。
２．0.025mlの10×STFを添加し、そして軽く振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
３．0.025mlの10×FVII aを添加し、軽く振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
４． 0.1mlの2.5×S2266基質を添加し、すぐにそのプレートをプレートリーダーに移し、そして10秒間隔で15分間、405nmで酵素動力学を測定する。
このアッセイは、sTF又はFVII a/TF複合体への本発明の抗体の結合の見掛けK_Dを測定するために、及び本発明の抗体がTFに結合するためにFVII と競争するかどうかを決定するために使用され得る。

２．第X因子活性化アッセイ
このアッセイの原理は下記に示される。FVII aを組換えヒトTF小胞と共にインキュベートし、基質FXを活性化できるプロテアーゼ複合体を形成する。この複合体を、異なった濃度の抗体の存在（又は不在）下で形成し、次に基質FXを導入し、そして反応を進行せしめ、色素原基質S2222のp−ニトロアニリドアミド結合を加水分解できる生成物、すなわち活性プロテアーゼFXaを形成する。生成される発色団生成物、すなわちp−ニトロアニリドを、405nmでモニターし、そして単位時間当たりに形成される生成物の濃度を、9920M^-1cm^-1のモル消衰計数を用いて計算する。IC₅₀値（C）を、初期速度を４−パラメーター等式中に適合することにより決定する：Y＝（A-D）/（１＋(X/C)^B）＋D

試薬及び濃度：
１．アッセイ緩衝液：50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.1%BSA, pH7.5。
２．ヒトFVII a（HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.）：４×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において100pMの溶液を調製する。
３．組換えヒトTF (Innovin, Dadeからのものを本発明者の実験室で再構成される)：作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において１：480希釈溶液を調製する。
４．第X因子（HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.）；４×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において1000nMの溶液を調製する。
５．色原体基質S2222（Kabi Pharmacia Hepar Inc.）: 作業溶液−使用の前、3.57mMのEDTA（反応を停止するあめの）、150mMのNaCl, 50mMのトリス−HCl、pH7.5において0.78mMの溶液を調製する。
６．抗体：使用の前、アッセイ緩衝液において４×希釈溶液を調製する。

アッセイ条件：
アッセイを室温で96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。成分の最終濃度は次の通りである：
rTF小胞：１：480の希釈溶液の1/4；抗体：1000〜0.625nMに変化する；FVII a：25pM；FX：250nM；S2222：0.546mM。

アッセイ方法：
１．0.015mlの４×AB（又は緩衝液対照)を個々のウェル中にピペットで入れる。
２．0.015mlの４×rTF小胞を添加する。
３．0.015mlの４×FVII aを添加し、室温で10分間、軽い振盪を伴ってインキュベートする。
４．0.015mlの４mlの４×FXを添加し、軽く振盪しながら室温で５分間インキュベートする。
５．0.14mlのS2222基質を添加し、すぐにプレートをプレートリーダーに移し、そして10秒間隔で15分間、405nmで酵素動力学を測定する。
このアッセイは、本発明の抗体がFXを活性化するためにFVII a/TF複合体を阻害するかどうかを決定するために、そして本発明の抗体がFVII a/TF複合体への結合のためにFXと競争するかどうかを決定するために使用され得る。

３．プロトロンビン時間（PT）アッセイ
標準のPT反応に関して、90μlの適切な濃度の抗体又はPBSを、キュベットにおける20μlのトロンボプラスチンIS（Dade）及び90μlの25mMのCaCl₂に添加する。その混合物を37℃で１分間インキュベートし、次に100μlのクエン酸処理された血漿（Helena Laboratories）を添加する。他方では、適切な体積の濃縮された抗体を、100μlの組換えヒトトロンボプラスチン（Ortho Recombiplaotin）及び約２分後、100μlの再構成されたヒト血漿が添加される。個々の凝固アッセイについての凝固時間は、Electra 900C凝固メーター（Hemoliance）を用いて、２種の測定値の平均を取ることにより測定され、そして平均値は反復アッセイ（n＝３又は４）から決定される。用量応用曲線を個々のインヒビターについて生成し、そして次に、回帰分析を、凝固時間の２倍の拡張のために必要な濃度（nM）を計算するために使用した。

このアッセイは、外因性血液凝固経路に対する本発明の抗体の効果を評価するために使用され得る。PTを２倍にするために必要とされる抗体の量を決定し、そして本発明の抗体の相対的能力を評価するために、他の抗凝固剤に比較することができる。

４．マイクロ熱量測定アッセイ
マイクロ熱量測定（等温滴定熱量測定）アッセイを用いて、TF単独又はFVII a/TF複合体に対する本発明の抗体の結合親和性（K_D）を測定する。このアッセイは、MicroCal VP-IPC装置を用いて行われる。FVII a複合体は、sTFへの2.3倍モル過剰のFVII aiの添加により行われる。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、アッセイにおけるsTFが完全に複合体化されたことを確証する。複合体に関する抗体親和性の決定のために、1.2μMのVII a/TF複合体をマイクロ熱量計セルに添加し、そして65μMの抗体を注射器に充填する。sTF単独についての抗体親和性の決定のために、10μMのsTFをセルに添加し、そして141μMの抗体を注射器に充填する。データ分析を、MicroCal Origiソフトウェアを用いて行う。データは、単一の結合部位に適合される。

例５．本発明の抗−TF抗体のインビトロ特徴化
次の6種の異なったTF−結合抗体を、十分なヒト一本鎖抗体ファージ表示ライブラリーから単離した： scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3ｅ10及びscFv(TF)3h2。BIAcoreを用いて測定されるように、E.コリにおいて発現されたそれらのsTF結合抗体の親和性は、35〜470nMであった。例４に記載されるsTF/VII aペプチド加水分解アッセイを用いて、それらの抗体が活性VII a/TF複合体の形成を阻止するかどうかを決定した。このアッセイにおいては、sTFへのVII aの結合は、色原体ペプチド基質S2266に対する分解速度を20倍以上、促進する。

TFへのFVVII aの結合を阻害する抗体は、この促進を阻止する。５種の一本鎖抗体scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、及びscFv(TF)3h2は、S2266加水分解を阻害し、このことは、それらがsTFに対するFVII a結合を阻害スルことを示唆する（図１）。対照的に、一本鎖抗体scFv(TF)3e10はsTF/VII aペプチド加水分解アッセイを阻害せず、そして実際、この抗体はS2266加水分解の速度を早め、このことは、scFv(TF)3e10がFVII aに対するsTFの親和性を高めることを示唆する。sTF/VII aペプチド加水分解アッセイを用いれば、scFv(TF)3e10抗体は、sTFに対するFVII aの親和性を高め、見掛けK_Dを５倍低めた（図２）。

scFv(TF)3e10は、sTFの不在下でFVII aによる加水分解速度に影響を与えず、このことは、この抗体がFVII a単独とは相互反応しないことを示唆する。sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイを用いて測定される、sTFに対するscFv(TF)3e10抗体のK_Dは、65.4nMであった（図４）。マイクロ熱量測定アッセイを用いて、FVII a/TF複合体に比較して、scFv(TF)3e10の親和性を比較した。それらの実験は、哺乳類細胞発現のscFv(TF)3e10が、遊離sTFに比較して、TF/FVII a複合体に対して約20倍高い親和性を有することを示した（33nM対して600nM、図５）。

細菌において発現される６種のTF−結合一本鎖抗体を、FX活性化アッセイ及びPTアッセイを用いて比較した。sTF/FVII a複合体によるs2266加水分解速度を阻害した５種の抗体scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、及びscFv(TF)3h2のどれも、PBS緩衝液対照以上にPTを拡張しなかった（図３）。対照的に、scFv(TF)3e10抗体は、BIAcoreにより測定される場合、最高の親和性を有さず、そしてそれはsTFに対するFVII aの親和性を高めたが、scFv(TF)3e10は、FX活性化を阻害し（図６、及びデータは示されていない）、そしてPTアッセイにおける凝固時間を延長した（図３）グループにおける唯一の抗体であった。

FX活性化アッセイにおける阻害についてのscFv(TF)3e10（ダイマー）抗体のIC₅₀は0.44nMであった（図６）。最終的に、FX活性化アッセイを用いて、scFv(TF)3e10抗体がFVII a/IF複合体への結合のためにFXと競争するかどうかを決定した。scFv(TF)3e10は、基質FXのすべての濃度での同じK_D(app)を伴ってFX活性化を同量依存的に阻害し、このことは、scFv(TF)3e10がFXと非競争性であり、そしてFXと同じ部位でTF又はFVII a/TF複合体に結合しないことを示唆する（図７）。

scFV(TF)3e10抗体を、組換えヒト可溶性TFへの結合に基づいて同定した。ヒトとネズミ又はヒトとウサギとの間のTFの配列相同性は、それぞれ58％及び71％である。抗体は、FVII a/TF複合体によるFXの活性化を妨げるヒトTFとのユニークエピトープに結合すると思われる。生理学的に、この抗体は、TFに結合するFVII 又はFVIIaと競争する抗体よりも利点を有する。可溶性TFについてのFVII aのK_Dは約10nMであり（図２）、この値は、sTFへのFVII aの結合（4.5nM, Neuenschwander, P.F. and Morrissey, J.H. (1994) J. Biol. Chem. 269 (11): 8007-8013）、又は中性ホスファチジルコリン小胞において再構成される十分な長さのTFへのFVII 、FVII a及びDIP不活性化されたFVII aiの結合（Bach R. など. (1986) Biochemistry 25: 4007-4020）についての公開された値と一致する。

十分な長さのTFへのFVII 又はFVII a結合の親和性は、荷電されたホスファチジルセリンがリン脂質小胞に含まれる場合（Bach R. など. (1986) 前記）、荷電された膜表面とFVII 又はFVII aのGLAドメインの相互作用（Neuenschwander P.F. and Morrissey, J. H. (1994)前記）のために、非常に上昇する。それらの最適な条件下で、FVII aは、非常に高い親和性（41pM）を伴って、十分な長さのTFに結合する。FVII 又はFVII a結合と競争するTF抗体は、この高い親和性FVII a/TF複合体との競争のための困難性を有する。対照的に、scFv(TF)3e10抗体は、TFに対してよりもFVII a/TF複合体に対して高い親和性を有するのみならず、またTFへの結合のためにFVII aと競争しない。FVII aと競争しない抗体、例えばscFv(TF)3e10は、約10nMである、FVII の血漿濃度に関係なく、FXの活性化を阻害するであろう。

scFv(TF)3e10抗体はまた、TFへの結合のためにFXと競争する抗体よりも利点を有する。VII a/TF複合体についてのFXのKmは、図７に示されるデータに基づいて0.061〜0.099μMであり、これは公開された値と一致する（0.1μM、Baugh, R.J. など. (2000) J. Biol. Chem 275 (37): 28826-28833）。ヒト血漿におけるFXの濃度は140nM（1.4〜２倍のKm）である。図７に示されるようにFXと競争しない、抗体、例えばscFv(TF)3e10は、FXの血漿濃度に関係なく、FXの活性化を阻害するであろう。

例６．インビボ血栓塞栓症モデル
TF−結合一本鎖抗体scFv(TF)3e10は、霊長類TFに対して特異的である。ヒトTF（ヒト組換えTFを含むトロンボプラスチン試薬、Ortho）により誘発された血栓塞栓症を、意識のある雄Sprague-Dawleyラット（350〜400g；n＝グループ当たり７匹以上）において進行せしめた。散在性血管内凝固（DIC）のこのモデルにおいて、トロンボプラスチン注入を通してのTFは、肺フィブリン沈着、呼吸障害及び死を誘発する。哺乳類細胞発現のscFv(TF)3e10又はビークルの用量を、尾の静脈に注射し、続いて15分後、トロンボプラスチンのボーラス注射（0.5ml/kg）を行った。

ビークル処理されたグループにおいては、この用量のTFは、通常トロンボプラスチン注射の５分以内に、60％の致死性（LD₆₀）をもたらした。ラットは、次の罹病率−死亡率の評点システムに従って評点を付けられた：0＝影響されていない；１＝軽い呼吸困難（30分以内に回避する）；２＝重度の困難（瀕死、回復のためには60分以上を要する）；及び３＝死。平均評点を、４種の異なった処理グループの効能を比較するために使用した。このインビボアッセイを用いての結果は、図８に示される。本発明の抗体は、このアッセイにおいて死及び呼吸困難を阻害することができた。

前述の例は、遺伝子的に又は特異的に記載される本発明の反応及び/又は操作条件と前述の例に使用されるそれらとを置換することにより、類似するこの結果を伴って反復され得る。
本発明はある抗体構造体の生成に関して例示されてきたが、本発明の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは明らかであろう。

図１は、sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイにおけるTF−結合一本鎖の抗体の活性を示す。sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイは、sTFに対するFVII aの親和性（K_D(app)＝約10nM）に基づいて、FVII a(5nM) 及びsTF(10nM)の等混合物を用いて、例４下に記載のようにして行われた。色原体ペプチド基質S2266の加水分解を、記載のようにしてモニターした。最終濃度の細菌的に発現された一本鎖抗体、及び対照タンパク質FVII ai（クロロメチルケトンペプチドにより不活性化されたFVII a, PPACK）及びMab#4504 (American Diagnostica)が示される。

図２は、sTFへのscFv(TF)3e10の結合が、FVII aに対するsTFの明らかな親和性を高めることを示す。sTF/FVII aペプチド加水分解アッセイが、800nMの細菌的に発現されたscFv(TF)3e10の存在及び不在下で2nMのFVII aを用いて、“sTF/FVII a活性化アッセイ”と称する例４に記載されるようにして行った。sTFがアッセイ中に滴定され、そして色原体基質（S-2266）の分解速度が決定された。sTFについての見掛けK_Dは、標準の４−パラメーター適合を用いて計算された。

図３は、プロトロンビン時間（PT）アッセイにおけるTF−結合一本鎖抗体の活性を示す。PTアッセイは、リン脂質小胞に十分な長さのヒトTFを含む組換えヒトトロンポプラスチン（Dade, Inc.）を用いて、例４下記に記載のようにして行われた。細菌的に発現された一本鎖抗体及び対照タンパク質FVII aiの最終濃度が示される。

図４は、sTFに対するscFv(TF)3e10の見掛け結合親和性の測定を示す。sTF/FVII aペプチド加水分解が、3nMのsTF及び2nMのFVII aを用いて例４に記載のようにして行われた。使用されるsTFの濃度は、FVII aへの結合についてのK_D以下であった。細菌的に発現されたscFv(TF)3e10が、上昇する濃度で添加され、そして高められた反応が、標準の４−パラメーター適合性を用いて、sTFに対するこの抗体の見掛けK_Dを決定するために使用された。sTF/FVII a複合体に対するscFv(TF)3e10の親和性（K_D(app)＝65nM）は、BIAcoreを用いて測定されたsTFに対するscFv(TF)3e10の親和性（K_D(app)＝470nM）よりも高い。

図５は、TF及びFVII a/TF複合体に対するscFv(TF)3e10の結合親和性の測定を示す。マイクロ熱量測定アッセイが、CHO細胞に発現されるscFv(TF)3e10を用いて、例４に記載のようにして行われた。このアッセイは、scFv(TF)3e10が、sTF（“遊離TF”）に対するよりも、sTF/FVII 複合体（“複合体”）に対して約20倍高い親和性を有する。

図６は、scFv(TF)3e10がFX活性化を用量依存的に阻害することを示す。FX活性化アッセイが、リン脂質表面（10pMのFVII a）上での上昇する濃度の細菌的に発現されたscFv(TF)3e10、250nMのFX及びFVII a/TF複合体を用いて、例４に記載の通りに行われた。IC₅₀は、50％の最大阻害に達するために必要とされる用量を表す。

図７は、scFv(TF)3e10がFVII a/TF複合体によるFX活性化を非競争的に阻害することを示す。FX活性化アッセイは、リン脂質表面（10pMのFVII a）上での細菌的に発現されたscFv(TF)3e10、25nM〜400nMのFX及びFVII a/TF複合体を用いて、例４に記載の通りに行われた。上昇する濃度のscFv(TF)3e10がアッセイ中に滴定された（OnM、空白の正方形；0.25nM、空白のダイヤモンド；0.74nM、空白の三角；2.2nM、空白の円；6.7nM、塗りつぶされたダイヤモンド；20nM, 塗りつぶされた三角）。（1/[S]、ここでS（基質）＝第X因子（μM）；対1/v, ここでv（速度）＝５分間隔の間に生成されるFXaによるS2222加水分解からのmOD/分）のこのLineweaver−Burkプロットは、scFv(TF)3e10が基質FXに対して非競争性インヒビターであることを示す。すべての線は、非競争性インヒビターについて（競争インヒビターに関しては、すべての線はｙ軸上で交差する）、予測されるようにX軸上で（又は近くで）交差する。

図８において、scFv(TF)3e10は、散在性静脈内凝固（“DIC”）のインビボモデルにおいて効果的であることを示す。CHO細胞において発現されたTF抗体(scFv(TF)3e10)を、（A）％死亡率及び（B）罹病率−死亡率評点について例６に記載されるラットトロンボエンポリズムモデルにおいて評価した。（A）ビークル−処理されたグループにおいては、使用される用量のTFが60％の致死率（LD₆₀）をもたらした。0.7nモル/kgでのscFv(TF)3e10は死の影響を有さなかったが、しかし7.0nモル/kgで40％以下に致死率を低めた。（B）ビークル処理されたグループにおいては、インビボ用量のTFは、次の評点システムに基づいて、2.6の平均罹病率−死亡率評点をもたらした。

0.7nモル/kgでのscFv(TF)3e10は、死に対して影響を有さず、そして呼吸困難に対してほとんどか又はまったく効果を有さなかったが、しかし14nモル/kgで、平均罹病率−死亡率評点は、約1.5に低められた。

Claims (25)

1. 組織因子（TF）単独に対してよりも第VII a因子/組織因子（FVII a/TF）に対して、より高い親和性を持って結合する抗凝固剤抗体。
2. 前記抗体が、マイクロ熱量測定アッセイにより測定される場合、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも２倍高い親和性を持って結合する請求項１記載の抗体。
3. 前記抗体が、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも５倍高い親和性を持って結合する請求項２記載の抗体。
4. 前記抗体が、TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、少なくとも10倍高い親和性を持って結合する請求項３記載の抗体。
5. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
6. 前記抗体が、一本鎖抗体、Fabダイマー抗体又はIgG抗体である請求項５記載の抗体。
7. 前記抗体が、一本鎖抗体である請求項６記載の抗体。
8. 前記抗体が、第VII 因子（FVII ）、第IX因子（FIX）及び第X因子（FX）から成る群から選択された１又は複数の凝固因子と、TFに結合するために競争しない請求項７記載の抗体。
9. 前記凝固因子がFVII 及びFXである請求項８記載の抗体。
10. 前記抗体がグリコシル化される請求項１記載の抗体。
11. 前記抗体が、ポリエチレングリコールの添加により修飾される請求項１記載の抗体。
12. 前記抗体が、ストレプタビジンを結合するためにピオチニル化される請求項１記載の抗体。
13. 治療的有効量の請求項１記載の抗体及び医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物。
14. 他の凝固パラメーター、例えば血小板の活性化及び凝固に直接的に影響を及ぼさないで、トロンビンの生成を阻害する、治療的有効量の請求項１記載抗体を投与することを含んで成る、血栓形成に対する保護方法。
15. 虚血性発作、血管形成に続く血栓合併症、又は微小血管手術における血栓形成に対して保護することである請求項14記載の方法。
16. 治療的有効量の請求項１記載の抗体を患者に投与することを含んで成る、深静脈血栓症（DVT）、散在性血管内凝固（DIC）、急性冠状症候群、又は患者における凝固障害の現象を伴っての癌を予防し、そして処理するための方法。
17. 治療的有効量の請求項１記載の抗体を患者に投与することを含んで成る、前記患者における炎症性応答を調節するための方法。
18. 前記炎症性応答が、敗血症、皮膚及び静脈移植片、及び器官移植片から成る群から選択される請求項17記載の方法。
19. 前記抗体が、血液と接触する医学用装置の表面上に非トロンボゲン性被膜を形成するために使用され得る請求項１記載の抗体。
20. 請求項１記載の抗体を含んで成るキット。
21. 請求項１記載の抗体をコードするDNA配列を含んで成るキット。
22. 配列番号１又は３のアミノ酸配列から成る抗体をコードする、配列番号２又は４のポリヌクレオチド配列を、治療的有効量の遺伝子療法ベクターと共に含んで成る遺伝子療法を組成物。
23. TF単独に対してよりもFVII a/TF複合体に対して、より高い親和性を持って結合する一本鎖抗体であり、そしてTFへの結合のためにFVII 及びFXと競争しない抗凝固抗体。
24. 前記抗体が配列番号１又は３のアミノ酸配列を含んで成る請求項23記載の抗体。
25. 配列番号２又は４の核酸配列を含んでなる、請求項23記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列。

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