MXPA04010795A

MXPA04010795A - Nuevos anticuerpos dirigidos al factor tisular como anticoagulantes.

Info

Publication number: MXPA04010795A
Application number: MXPA04010795A
Authority: MX
Inventors: Mclean Kirk
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2005-03-07
Also published as: RU2345789C2; CN100563709C; RU2004135308A; AU2003225255A1; RU2004135306A; KR101013697B1; MXPA04010851A; EP1549341A4; DK1549341T3; UA85996C2; CR7584A; BR0304659A; ES2323056T3; US20080019985A1; US7250168B2; PL210582B1; CN1665534A; PT1549341E; US7622122B2; US20080020965A1

Abstract

Esta invencion se refiere a los nuevos anticuerpos que se enlazan con mayor afinidad al complejo de factor VIIa/factor tisular (FVIIa/TF) que al factor tisular (TF) solo, no compite por el enlace a TF con FVII y FX, e inhibe la activacion de FX. Los anticuerpos se enlazan en el sitio de dano y previenen el inicio de la trombosis. Los anticuerpos pueden ser utilizados para tratar una variedad de condiciones tromboticas, que incluyen, pero no estan limitadas a trombosis venosa profunda, coagulacion intravascular diseminada y sindrome coronario agudo.

Description

NUEVOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS AL FACTOR TISULAR COMO ANTICOAGULANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCION El mantenimiento del balance adecuado entre la actividad procoagulante y anticoagulante dentro de los vasos sanguíneos es esencial para la hemostasis normal (Davie, E. . et al. (1991) Biochemistry, 30(43): 10363-10370) . La perturbación del balance hacia la coagulación conduce a la trombosis, la cual puede provocar ataque cardiaco, apoplejía, embolismo pulmonar y trombosis venosa. Existe una necesidad para anticoagulantes más efectivos y más seguros para el tratamiento de desórdenes trombóticos específicos. El factor tisular ( "TF" ) es una glucoproteína transmembranal que es el iniciador mayor de la cascada de la coagulación (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 180-184) . Bajo condiciones fisiológicas normales el TF activo no está en contacto con la sangre. Durante el daño vascular, la exposición a la sangre TF subendotelial y el colágeno conduce a la activación de ¦ los factores de coagulación y de las plaquetas, y subsecuentemente a la formación del tapón hemostático . TF expuesto actúa como un cofactor para la activación catalizada por el factor VIIa ("FVIIa") del factor IX ("FIX") y el factor X ("FX"), que son componentes críticos de los complejos de tenasa intrínseca y de protrombinasa, respectivamente. Esto conduce a la formación rápida de FXa y trombina. La trombina rompe luego el fibrinógeno a fibrina, que subsecuentemente se polimeriza para formar el coágulo de fibrina. La inducción inapropiada de la expresión de TF en una variedad de panoramas clínicos puede conducir a trombosis que amenaza la vida, y/o contribuye a complicaciones patológicas . La exposición a TF después de la ruptura de la placa se cree que es responsable de la oclusión trombótica que conduce al infarto del miocardio agudo y apoplejía. En estos panoramas, las vías de señalización proinflamatorias activadas por el factor de la coagulación también contribuyen a la formación del edema y al tamaño incrementado del infarto. El daño vascular asociado con la angioplastía conduce a suprarregulación de TF sobre los SMC's, que se cree inducen las vías de señalización celular asociadas con la restenosis. La sobre expresión de TF en el cáncer y en la sepsis por gram-negativos conduce a trombosis que amenaza la vida y activación de las vías inflamatorias. El complejo FVIIa/TF está involucrado en el mecanismo patógeno en una variedad de actividades trombóticas y el nivel de circuíación de TF es un factor de riesgo para ciertos pacientes. FVIIA y TF juegan papeles únicos en el daño vascular en el mantenimiento de la hemóstasis y el inicio de la trombosis. TF es expresado en la túnica adventicia normalmente, pero es suprarregulada y expresada inapropiadámente en la media y la neoíntima en la enfermedad vascular. La expresión de TF en las placas ateroescleróticas es incrementada y protegida de la sangre por una tapa fibrosa delgada que puede romperse para exponer TF. Las intervenciones quirúrgicas tales como la angioplastia de globo, la colocación de stents o la endarterectomía dañan la pared de los vasos y exponen el TF subyacente. En la placa de pared delgada, rica en lipidos, ateroesclerótica, la ruptura espontánea o la erosión endotelial conduce a una exposición a TF y trombosis, dando como resultado angina inestable e infarto del miocardio. TF puede circular en las micropartículas derivadas de la célula y los niveles de TF en circulación son elevados en la angina inestable, sugiriendo que este TF circulante puede contribuir a la formación de trombo (Soejima, H. et al. (1999) Circulation 99(22). 2908-2913). Frecuentemente, el cáncer está asociado con un estado hipercoagulable atribuido a la sobreexpresión de TF sobre las células tumorales. Esto predispone al paciente a la trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar y coagulación intravascular diseminada de bajo grado ("DIC"). DIC da como resultado la deposición de la fibrina microvascular contribuyente a la falla de órganos múltiples. Los anticoagulantes basados en proteína que se dirigen a TF incluyen anticuerpos neutralizadores de TF, factor Vlla inhibido en el sitio activo ("FVIIai") inhibidor de la vía del factor tisular ("TFPI"), y proteína anticoagulante de Nematodo ("NAPC2") . Los resultados de los modelos de daño arterial agudo de la trombosis, indican que los inhibidores basados en proteína de FVIIA/TF son antitrombóticos efectivos, con menos sangrado en comparación a la heparina, a los inhibidores directos de la trombina, inhibidores de plaquetas e inhibidores de FXa (Himber, J. et al. (2001) Thromb. Haemost. 85: 475-481; Harker, L.A. et al. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 464-472. Además, la inhibición de FVIIa/TF es superior a otros anticoagulantes (por ejemplo, heparina, inhibidores de FXa) en la prevención del engrosamiento de la neoíntima y estenosis vascular después del daño por globo (Jang, Y. et al. (1995) Circulation 92(10): 3041-3050). La inhibición de TF, FVIIA o el complejo FVIIa/TF es un procedimiento antitrombótico eficaz para prevenir DIC y reducir la mortalidad en modelos experimentales de sepsis. Los análogos de TFPI previenen la DIC inducida por tromboplastina y endotoxina en conejos (Day, K.C. et al. (1990) Blood 76: 1538-1545; Bregengard, C. et al . (1993) Blood Coagul . Fibrinolysis 4: 699-706). Los anticuerpos monoclonales contra FVIIa (Biemond, B.J. et al . (1995) Thromb. Hae ost. 73: 223-230) o (Levi, M. et al . (1994) J". Clin. Invest. 93: 114-120) previenen la DIC inducida por endotoxina en monos. Los anticuerpos neutralizadores de TF, FVIIai, y TFPI, inhiben DIC. y reducen la mortalidad en un modelo de babuino de sepsis inducida por E. coli (Creasey, A.A. et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 2850-2860; Taylor, F.B. et al. (1991a) Bloód 78: 364-368; Taylor, F.B. et al. (1991b) Circ. Shock 33: 127-134; Taylor, F.B. (1996) Haemostasis Suppl. 1 26: 83-91) . El FXa libre y el complejo FVIIa/TF/FXa se sabe que inducen la producción de citocinas proinflamatorias que están asociadas con un riesgo incrementado de muerte para pacientes con sepsis (Riewald, M. et al. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98: 7742-7747). De manera interesante, se mostró que FVIIai disminuye los niveles plasmáticos de IL-6 e IL-8 en el modelo de babuino (Taylor, F.B. et al. (1998) Blood 91. 1609-1615), sugiriendo que la inhibición de FVIIA/TF puede tener efectos antiinflamatorios adicionales no compartidos por otros mecanismos anticoagulantes. Varios anticuerpos que son anticoagulantes efectivos, que se enlazan a y neutralizan TF o el complejo de FVIIA/TF o ambos, han sido descritos (ver por ejemplo, Carson, S.D. et al. (1985) Blood 66(1): 152-156; Tanaka, H. et al. (1985) Thro b. Res. 40(6); 745-756; Kirchhofer, D . et al. (2000) Thro b. Haemost. 84(6); 1072-1081; Kirchhofer, D. et al . (2001) Biochemistry 40(3): 675-682; Faelber, K. et al . (2001) J. Mol. Biol . 313: 83-97; y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,506,134, 5,986,065 y 6,274,142). Los anticuerpos dirigidos a TF de la presente invención son anticoagulantes efectivos que tienen características mejoradas sobre los anticuerpos para TF previamente descritos. En particular, los anticuerpos de la invención se enlazan con mayor afinidad al complejo FVIIA/TF que a TF solo, y no son competitivos con FVII o FX para enlazarse a TF.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona los anticuerpos, que actúan como anticoagulantes, que se enlazan con mayor afinidad al complejo factor VIIa/factor tisular ("FVIIa/TF") que al factor tisular ("TF") solo. En una modalidad, los anticuerpos de la invención se enlazan con al menos una afinidad 2 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo, como se mide en un ensayo de microcalorimetría . En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención se enlazan con al menos una afinidad 5 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo. En una modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención se enlazan con una afinidad al menos 10 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo. En otra modalidad más, los anticuerpos de la invención no compiten para el enlace a TF con uno o más factores de la coagulación seleccionados del grupo que consiste de los factores VII ("FVII"), IX ("FIX") y X ("FX"). En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención no compiten por el enlace a TF con FVII y con FX. En una modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención se enlazan con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que a TF solo, y no compiten para el enlace a TF con FVII y con FX. El anticuerpo anticoagulante de esta invención se dirige a y se enlaza con el complejo FVIIa/TF en el sitio de daño, e .inhibe la activación del factor X ("FX")/ previniendo de este modo la formación del trombo, y con esto funcionando efectivamente como un anticoagulante en el tratamiento de ciertas enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a, sepsis, coagulación intravascular diseminada, apoplejía isquémica, trombosis de venas profundas, síndromes coronarios agudos, complicaciones trombóticas después de la angioplastia, y coagulopatía en cáncer avanzado. Además, el anticuerpo tiene uso en cirugía microvasc lar, en injertos de piel y venas, y transplantes de órganos . En otro aspecto más, la invención proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos mencionados . En otro aspecto más, la invención proporciona un método para proteger a un paciente contra la formación del trombo, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de esta invención al paciente, y con esto la inhibición de la generación de los trombos sin afectar directamente otros parámetros de la coagulación, tales como la activación y agregación de plaquetas . En otro aspecto, la invención se refiere a un método para reducir y tratar la trombosis de venas profundas ("DVT") o coagulación intravascular diseminada ("DIC") o síndrome coronario agudo, o cáncer con evidencia de coagulopatía en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención al paciente. En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para regular la respuesta inflamatoria en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención al paciente.

En otro aspecto más, el anticuerpo de la invención puede ser usado para formar un recubrimiento no trombogénico sobre la superficie de los dispositivos médicos que hacen contacto con la sangre . · En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un equipo que comprende un anticuerpo de la invención, que se enlaza al complejo FVIIa/TF. Alternativamente, el equipo puede comprender secuencias de ADN que codifican para los componentes del anticuerpo. Se describen también los métodos para la elaboración de anticuerpos de la invención, recombinantes y sintéticos .

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Actividad de los anticuerpos de cadena simple que se enlazan a TF, en el ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa. El ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4 utilizando una mezcla en equilibrio de FVIIa (5 nM) y sTF (10 nM) , con base en la afinidad de FVIIa para sTF (¾(app)aproximadamente 10 nM) . La hidrólisis del sustrato peptídico cromogénico S2266 fue monitorizada como se describe. Son también- indicadas las concentraciones finales de los anticuerpos de cadena simple bacterianamente expresados, y las proteínas de control FVIIai (FVIIa inactivado por un péptido de clorometilcetona, PPACK) y Mab#4504 (American Diagnostica) . Figura 2. Enlace de scFv(TF)3elO a sTF incrementa la afinidad aparente de sTF por FVIIa. El ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4 utilizando FVIIa 2 nM en presencia y ausencia de 800 nM de scFv(Tf)3elO expresado en bacterias . El sTF fue titulado en el ensayo y se determinó la velocidad de escisión del sustrato peptídico cromogénico S2266. La D aparente para sTF fue calculada utilizando un ajuste estándar de 4 parámetros. Figura 3. Actividad de los anticuerpos de cadena simple que se enlazan a TF en el ensayo de tiempo de protrombina (PT) . El ensayo de PT fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4 utilizando tromboplastina humana recombinante (Dade, Inc.) que contiene TF humano de longitud completa, en vesículas fosfolipídicas . Se indicaron las concentraciones finales de los anticuerpos de cadena simple expresados en bacterias, y la proteína control FVIIai. Figura 4. Medición de la afinidad de enlace aparente de scFv(TF)3el0 para sTF. El ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa fue realizado como se describe bajo ¦ el Ejemplo 4, utilizando sTF 3 nM y FVIIa 2 nM. La concentración de sTF utilizada estuvo por debajo de la KD para el enlace a FVIIa. scFv(TF)3elO expresado en bacterias, -.se agregó a concentraciones cada vez mayores y se utilizó la velocidad incrementada de la reacción para determinar la D aparente de este anticuerpo para sTF utilizando un ajuste estándar de 4 parámetros. La afinidad del scFv(TF)3elO para el complejo sTF/FVUa (KD(app)=65 nM) es mayor que la afinidad de scFv(TF)3elO para sTF medida utilizando BIAcore nM) . Figura 5. Medición de la afinidad de enlace de scFv(TF)3elO para TF y el complejo FVIIa/TF. El ensayo microcalorimétríco fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4, utilizando el scFv(TF)3elO expresado en células CHO. Este ensayo permite que el scFv(TF)3elO tenga una afinidad aproximadamente 20 veces mayor para el complejo sTF/FVIIa ("Complejo") que para sTF ("TF Libre") . Figura 6. La dosis de scFv(TF)3elO inhibe dependíentemente la activación de FX. El ensayo de activación de FX fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4 utilizando concentraciones cada vez mayores del scFv(TF)3e!0 expresado en bacterias, FX 250 nM, y el complejo FVIIa/TF sobre una superficie de fosfolípido (FVIIa 10 pM) . La IC50 representa la dosis requerida para alcanzar 50% de inhibición máxima.

Figura 7. scFv(TF)3elO inhibe no competitivamente la activación de FX por el complejo FVIIa/TF. El ensayo de activación de FX fue realizado como se describe bajo el Ejemplo 4, utilizando scFv(TF)3elO expresado en bacterias, 25'nM a 400 nM de FX, y el complejo FVIIa/TF sobre una superficie fosfolipídica (FVIIa 10 p ) . Se titularon concentraciones cada vez mayores de scFv(TF)3elO en el ensayo (0 nM, cuadro abierto; 0.25 nM, diamante abierto; 0.74 nM, triángulo abierto, 2.2 nM, círculo abierto; 6.7 nM, diamante relleno, 20 nM, triángulo relleno) . Esta gráfica de Lineweaver-Burk de (1/ [S] , donde S (sustrato) -factor X (µ?) ; versus l/v, donde v (velocidad) = mOD/min a partir de la hidrólisis S2222 por el FXa producido durante un intervalo de 5 minutos) índica que scFv(TF)3elO es un inhibidor no competitivo con respecto al sustrato FX. Todas las líneas interceptan sobre o (cerca) del eje x como se anticipa para un inhibidor no competitivo (para un inhibidor competitivo todas las líneas se interceptarían en el eje y) . Figura 8. scFv(TF)3el0 es eficaz en un. modelo in vivo de coagulación intravascular diseminada ( "DIC" ) . El TF-anticuerpo scFv(TF)3el0 expresado en células CHO fue evaluado en el modelo de tromboembolismo de rata descrito en el Ejemplo 6 para (A) la mortalidad porcentual y (B) la calificación de morbididad-mortalidad. (A) En el grupo tratado con vehículo, la dosis de TF utilizada dio como resultado 60% de letalidad (LD60) . scFv(TF)3elO a 0.7 nmol/kg no tuvo impacto sobre la muerte, pero a 7.0 nmol/kg redujo la letalidad a menos de 40%. (B) En el grupo tratado con vehículo, la dosis in vivo de TF dio como resultado una calificación de morbididad-mortalidad promedio de 2.6. scFv(TF)3elO a 0.7 nmol/kg no tuvo impacto sobre la muerte y el título, o ningún efecto sobre la insuficiencia respiratoria, pero a 14 nmol/kg, la calificación de morbididad-mortalidad promedio fue reducida a aproximadamente 1.5.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El anticuerpo anticoagulante de la presente invención es un anticuerpo que se enlaza con mayor afinidad al complejo factor Vlla/factor tisular ("FVIIa/TF") que al complejo tisular ("TF") solo. El anticuerpo de la invención se enlaza con una afinidad de al menos 2 veces mayor, preferentemente al menos una afinidad 5 veces mayor, y más preferentemente al menos 10 veces mayor, al complejo FVIIa/TF que a TF solo. El anticuerpo de la invención tampoco compite por el enlace a TF con uno o más factores de la coagulación seleccionados del grupo que consiste del factor VII ("FVII"), factor IX ("FIX"), y factor X (WFX").

Preferentemente, el anticuerpo de la invención no compite por el enlace a TF con FVII y con FX.

Definiciones: En la descripción de la presente invención, los siguientes términos son definidos como se indica más adelante . "Proteínas o polipeptidos ' recombinantes" se refieren a las proteínas o polipeptidos producidos por las técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, producidas a partir de células, microbianas o de mamífero, transformadas por una construcción de ADN exógeno que codifica para el polipéptido deseado. Las proteínas o polipeptidos expresados en la mayoría de los cultivos bacterianos estarán libres de glicano. Las proteínas o polipeptidos expresados en levadura pueden tener un patrón de glucosilacion diferente de aquel expresado en las células de mamífero. Proteínas o polipeptidos "nativos" se refieren a las proteínas o polipeptidos recuperados de una fuente de origen natural. El término "anticuerpo nativo" podría incluir los anticuerpos de origen natural y fragmentos de los mismos. Una "secuencia que codifica" para ADN es una secuencia de ADN que es transcrita en el ARNm y traducida en un polipéptido en una célula hospedera, cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación son determinados por un codón de inicio en el extremo N 5' y un codón de detención de la traducción en el extremo C 3'. Una secuencia de codificación puede incluir secuencias procarióticas, ADNc proveniente de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico provenientes de ADN eucariótico, y secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de la transcripción estará usualmente localizada 3' a la secuencia de codificación. La "secuencia nucleotídica" es un heteropolímero de desoxirribonucleótidos (bases de adenina, guanina, timina o citosina) . Las secuencias de ADN que codifican para los anticuerpos de esta invención pueden ser ensambladas a partir de fragmentos de ADN derivados de ADNc sintético, y ligadores oligonucleotídicos cortos para proporcionar un gen sintético que es capaz de ser expresado en un vector de expresión recombinante . En la discusión de la estructura de las moléculas de ADN de doble hebra, particulares, pueden ser descritas las secuencias en la presente de acuerdo a la convención normal de dar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita del ADNc.

"Vector de expresión recombinante" es una construcción de ADN replicable utilizada ya sea para amplificar o expresar el ADN que codifica para los anticuerpos de la presente invención. Un vector de expresión contiene las secuencias de control de ADN y una secuencia de codificación. Las secuencias de control de ADN incluyen las secuencias promotoras, los sitios de enlace al ribosoma, las señales de poliadenilación, las secuencias de terminación de la transcripción, los dominios reguladores corriente arriba (5') y aumentadores . Los sistemas de expresión recombinantes como se definen en la presente expresarán los anticuerpos después de la inducción de los elementos reguladores . "Células hospederas transformadas" se refieren a las células que han sido transformadas y transíectadas con ADN exógeno. El ADN exógeno puede o no ser integrado (covalentemente enlazado) al ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula. En los procariotes y levadura, por ejemplo, el ADN exógeno puede ser mantenido en un elemento episomal, tal como un plásmido o establemente integrado dentro del ADN cromosómico. Con respecto a las células eucarióticas , una célula establemente transformada es una en la cual el ADN exógeno se ha llegado a integrar dentro de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la habilidad de las líneas de células eucarióticas o los clones, para producir una población de células hijas que contienen el ADN exógeno. Los términos "análogo", "fragmento", "derivado" y "variante" cuando se hace referencia a los anticuerpos de esta invención significa los análogos, fragmentos derivados y variantes de los anticuerpos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica, como se describe más adelante en la presente . Un "análogo" incluye un pro-polipéptido que incluye dentro de éste la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de esta invención. El anticuerpo activo de esta invención puede ser escindido a partir de aminoácidos adicionales que completan la molécula pro-anticuerpo por procedimientos naturales, in vivo o mediante procedimientos bien conocidos en la. técnica, mediante escisión enzimática o química. Por ejemplo, el polipéptido scF (TF) 3el0 recombinante (SEQ ID NO: 1) es expresado como un pro-polipéptido de 282 aminoácidos el cual es luego procesado in vivo para liberar el polipéptido maduro activo de 264 aminoácidos. Un "fragmento" es una porción del anticuerpo de la invención que conserva actividad funcional sustancialmente similar, como es mostrado en los ensayos in vi tro, descritos en la presente, como se describe más adelante.

Un "derivado" incluye todas las modificaciones a los anticuerpos de esta invención que conservan sustancialmente las funciones descritas en la presente, e incluyen la estructura adicional y la función en cuestión, por ejemplo, los anticuerpos PEGilados que tienen mayor vida media, y anticuerpos biotinilados, como se describe más adelante . Un derivado también incluye los anticuerpos glucosilados N- u O-enlazados, que pueden ser generados mediante la inserción de los sitios de N- u O-glucosilación dentro de las secuencias de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante, estándar. "Actividad funcional sustancialmente similar" y "sustancialmente la misma función o actividad biológica" cada una significa que el grado de actividad biológica que está dentro de aproximadamente 30% a 100% o más de esa actividad biológica, demostrada por el polipéptido al cual ésta está siendo comparada cuando la actividad biológica de cada polipéptido es determinada por el mismo procedimiento 0 ensayo. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene actividad funcional sustancialmente similar al anticuerpo del Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 11) es uno que, cuando es probado en la hidrólisis del péptido sTF/FVIIa y los ensayos de activación de Fx descritos en el Ejemplo 4, demuestra la actividad para enlazarse a y neutralizar el complejo FVIIa/TF.

La "similitud" entre dos polipéptidos es determinada por la comparación de la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. Tales sustituciones conservadoras incluyen aquellas descritas anteriormente en The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff (1978) y por Argos (1989) EMBO J. 8: 779-785. Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservadores: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, lie, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His,--Phe, Tyr, Trp, His; y -Asp, Glu. "Anticuerpo" como se utiliza en la presente, incluye las moléculas de inmunoglobulina ("Ig") intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab' )2/ y Fv, que son capaces de enlazarse a un epitopo de la proteína objetivo seleccionada, por ejemplo, TF soluble ("sTF"). Típicamente, son requeridas al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epitopo. No obstante, los epitopos que involucran los aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos. Todos los otros términos técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que es comúnmente utilizado para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención.

Anticuerpos de la Invención y su Generación; Los anticuerpos anticoagulantes de esta invención se enlazan con mayor afinidad al complejo factor VIIa/f ctor tisular ("FVIIa/TF") que al factor tisular ("TF") solo. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención se enlazan con una afinidad al menos 2 veces mayor al complejo FVIla/TF que a TF solo, más preferentemente con una afinidad al menos 5 veces mayor, y todavía más preferentemente con una afinidad al menos 10 veces mayor, como se mide en un ensayo de microcalorimetría . En una modalidad preferida de esta invención, los anticuerpos tampoco compiten con uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste de los factores VII ("FVII"), IX ("FIX"), y X ("FX") para el enlace a TF. En una modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención no compiten con FVII y con FX para el enlace a TF . En la modalidad más preferida, los anticuerpos de la invención se enlazan con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF solo y no compiten para el enlace a TF con FVII y con FX. Hablando en general, un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína objetivo seleccionada (por ejemplo, el complejo FVIIa/TF o TF) proporciona una señal de detección al menos 5, 10 o 20 veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se utiliza en un ensayo inmunoquímico . Preferentemente, los anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína objetivo seleccionada, no detectan otras proteínas en ensayos inmunológicos y pueden inmunoprecipitar la proteína objetivo de la solución. La proteína objetivo seleccionada puede ser utilizada para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobayo, mono o humano para producir anticuerpos policlonales . Si se desea, la proteína objetivo puede ser conjugada a una proteína portadora, tal como la albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura. Dependiendo de las especies hospederas, pueden ser utilizados diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica . Tales adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) , y sustancias activas de superficie (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, y dinitrofenol) . Entre los adyuvantes utilizados en humanos, son especialmente útiles BCG (jacilli Calmette-Guerin) y Comybacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a una proteína objetivo seleccionada pueden ser preparados a partir de cualquier técnica que proporcione la producción de las moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma EBV (Kohler et al. (1985) Nature 256: 495-497; Kozbor et al. (1985) J". Immunol . Methods 81: 31-42; Cote et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80: 2026-2030; y Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol . 62: 109-120) . Además, pueden ser utilizadas las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de los genes de anticuerpo de ratón a los genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) JVature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452-454). Los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos pueden también ser "humanizados" para prevenir que un paciente monte una respuesta inmune contra el anticuerpo, cuando éste es utilizado terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos para ser utilizados directamente o pueden requerir alteración de unos pocos residuos clave. Las diferencias secuenciales entre los anticuerpos de roedor y las secuencias humanas pueden ser reducidas al mínimo mediante el reemplazo de residuos que difieren de aquellas en las secuencias humanas, mediante mutagenesis dirigida al sitio de los residuos individuales, o mediante inserto de regiones completas de determinación de la complementariedad . Alternativamente, los anticuerpos humanizados pueden ser producidos utilizando métodos recombinantes, como se describe en la Patente Británica GB2188638B. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteina objetivo seleccionada, pueden · contener sitios de enlace al antígeno que son ya sea parcial o completamente humanizados, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,565,332. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de ' cadena simple pueden ser adaptadas utilizando métodos conocidos en la materia, para producir anticuerpos de cadena simple (wscFv") que se enlazan específicamente a una proteína objetivo seleccionada. Los anticuerpos con especificidad , relacionada, pero de distinta composición idiotípica, pueden ser generados mediante entremezclado de cadenas a partir de bibliotecas de Ig combinatorias, aleatorias (Burton (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 11120-11123). Los anticuerpos de cadena simple también pueden ser construidos utilizando un método de amplificación de ADN, tal como PCR, utilizando el ADNc hibridoma como una plantilla (Thirion et al. (1996) Eur. J. Cáncer Prev. 5: 507-511) . Los anticuerpos de cadena simple pueden ser mono- o bi-específicos, o pueden ser bivalentes o tetravalentes . La construcción de los anticuerpos de cadena simple biespecíficos, tetravalentes es mostrada, por ejemplo, en Coloma y Morrison (1997) Nati. Biotechnol . 15: 159-163. La construcción de anticuerpos de cadena simple, biespecíficos, bivalentes, es mostrada en Mallendar y Voss (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-216. Una secuencia nucleotídica que codifica para un anticuerpo de cadena simple, puede ser construida utilizando síntesis manual o automatizada de nucleótidos, clonada dentro de una construcción de expresión utilizando métodos de ADN recombinante estándares, e introducida dentro de una célula para expresar la secuencia de codificación. Alternativamente, los anticuerpos de cadena simple pueden ser producidos directamente utilizando, por ejemplo, la tecnología de representación visual de fagos filamentosos (Verhaar et al. (1995) Jnt. J. Cáncer 61: 497-501; y Nicholls et al. (1993) J. Jmmunol. Met . 165: 81-91) . Los anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína objetivo seleccionada pueden ser también producidos mediante la inducción de la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante selección de las bibliotecas o paneles de Ig de los reactivos de enlace altamente específicos, como se describe en la literatura (Orlandi et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 3833-3837; Winter et al. (1991) tature 349: 293-299). El ADN que codifica para el anticuerpo de la invención puede ser clonado en ADNc o en la forma genómica, mediante cualquier procedimiento de clonación conocido por aquellos expertos en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook, J.F. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) , la cual se incorpora por referencia en la presente. En el caso donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, una vez que una secuencia de ADN ha sido identificada la cual codifica a una región Fv que cuando se expresa muestra actividad de enlace específica, los anticuerpos que comprenden esa región Fv pueden ser preparados mediante métodos conocidos por una persona de experiencia en la técnica. De este modo, por ejemplo, Chaudhary, V.K. et al. (1989) Nature 339 (6223): 394-397; Batra, J.K. et al. (1990) J". Biol . Chem. 265(25): 15198-15202; Batra, J.K. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86(21): 8545-8549; Chaudhary, V.K. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87(3): 1066-1070, todas incorporadas por referencia en la presente, describen la preparación de diversas proteínas de anticuerpo de cadena simple. En un procedimiento preferido, los anticuerpos que se enlazan a TF de la invención, son anticuerpos de cadena simple, los cuales son preparados utilizando una biblioteca de representación visual de fagos. La región de enlace al epitopo de un anticuerpo de cadena simple, está constituida de dos dominios de región variable: una de la cadena pesada y otra de la cadena ligera. En el primer paso de construcción de una biblioteca de representación visual de fago, los genes variables (VH (de Ig ) VK y VL) son clonados por PCR a partir del AR m combinado, proveniente de médula ósea humana, nodulo linfático y bazo humanos utilizando un grupo de cebadores específicos de familia. Las bibliotecas resultantes de pCITE-VH (3.8 x 109 miembros), pZ604-VK (1.6xl07) y pZ604-VL (3.2xl07) representan una diversidad permanente y alta de genes V. Los genes de VH son luego amplificados a partir de la biblioteca pCITE-VH. Los genes VK y VL son amplificados por PCR a partir de la biblioteca de pZ604-VK y pZ604-VL con la secuencia JH inversa y la secuencia ligadora en el extremo 5' . Los productos de PCR que contienen VH, VK y VL, purificados en gel, son luego empalmados entre sí para elaborar el repertorio de genes de scFv. El repertorio de genes de scFv es clonado a un vector fagémido pZ603, y el producto de ligadura es sometido a electroporesis dentro de células de E. coli competentes TG1 para generar la biblioteca de representación visual del fago scFv, HuPhabL3, con 5.2xl09 transformantes individuales ( ay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; arks, J.D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222(3): 581-597; Sheets, .D. et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 95(11): 6157-6162) . El fago que se enlaza a TF proveniente de la biblioteca de representación visual de fago scFv, se selecciona, se amplifica y subsecuentemente se identifica utilizando las técnicas de representación panorámica que son bien conocidas en la técnica. TF soluble es inmovilizado en tubos de plástico, y puede ser utilizada leche sin grasa para reducir el enlace no específico al plástico. La población del fago scFv es expuesta al sTF inmovilizado en tubos de plástico, y los fagos no enlazados son removidos mediante lavados intensivos . Los f gos de scFv que se enlazan a TF son eluidos de los tubos y luego amplificados mediante infección de las células de E. coli TG1, en solución. Este procedimiento de representación panorámica es repetido tres veces, y los fago de scFv que se enlazan a TF, resultantes son aislados mediante la transformación de las células TG1. Los transformantes que expresan los anticuerpos que se enlazan a TF son identificados utilizando un e.nsayo de ELISA estándar, con sTF inmovilizado sobre el plástico en las placas de 96 pozos. El ADN de los insertos de anticuerpo de cadena simple de los transformantes positivos a ELISA fueron secuenciados . Con base en el secuenciamiento de ADN, seis anticuerpos únicos de cadena simple, scFv(TF)2cl, scFv(TF) 2cll, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2hS, scFv(TF)3elO y scFv(TF)3h2, son identificados en la presente, y fueron expresados y purificados a partir de E. coli y caracterizados como se describe más adelante bajo el Ejemplo 5.

Expresión y Purificación de los Anticuerpos de la Invención Existen varias formas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención in vi tro, incluyendo E. coli, baculovirus, células de levadura, de mamífero y otros sistemas de expresión. Los métodos para la expresión de los genes clonados en bacterias, son bien conocidos. Para obtener expresión de alto nivel de un gen Clonado en un sistema procariótico, es esencial construir los vectores de expresión que contienen, al mínimo, un promotor fuerte para dirigir la terminación de la transcripción del ARNm. Los ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este propósito, son la región promotora y operadora del gen de la beta-glucosidasa de E. coli, la vía biosintética del triptofano de E. coli , o el promotor izquierdo proveniente del fago lambda. La inclusión de los marcadores de selección en vectores de ADN transformados en E. coli, es útil. Los ejemplos de tales marcadores incluyen los genes que especifican la resistencia a la ampicilina, a la tetraciclina o al cloranfenicol . De los sistemas de células eucarióticas superiores útiles para la expresión de los anticuerpos de la invención, y los análogos, fragmentos, derivados o variantes de los mismos, existen numerosos sistemas celulares de los cuales seleccionar. Los ejemplos ilustrativos de las líneas celulares de mamífero incluyen pero no están limitados a las células RPMI 7932, VERO y HeLa, las líneas células de ovario de hámster Chino (CHO) , las líneas celulares I38, BHK, COS-7, C127 o MDCK. La línea celular de mamífero preferida es CHL-1. Cuando CHL-1 es utilizada, se incluye la higromicina como un marcador de selección eucariótico. Las células CHL-1 son derivadas de células de melanoma RPMI 7032, una línea de células humanas fácilmente disponibles. La línea celular CHL-l ha sido depositada con la . ATCC de acuerdo a las condiciones del Tratado de Budapest y se le ha asignado el #CRL 9446, depositada el 18 de junio de 1987. Las células adecuadas para el uso en esta invención son comercialmente disponibles de la ATCC. Las líneas celulares ilustrativas incluyen Spodoptera. frugiperda y Bowbyx mori. El sistema procarió ico, E. coli, no es adecuado para realizar la modificación post-traduccional , tal como la glucosilación. Además, las proteínas con patrones disulfuro complejos son frecuentemente mal plegadas cuando son expresadas en E. coli. Con el sistema procariótico, la proteína expresada está ya sea presente en el citoplasma celular en una forma soluble insoluble denominada cuerpos de inclusión, encontrada en la fracción soluble después de que la célula ha sido lisada, o bien que es dirigida hacia el periplasma por adición de las secuencias de señal de secreción apropiadas . Si la proteína expresada está en cuerpos de inclusión insolubles, se requiere usualmente la solubilización y el replegamiento subsiguiente de los cuerpos de inclusión.

Muchos vectores de expresión procarióticos son conocidos por aquellos expertos en la técnica pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) , pK 233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, EUA) , y pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI, EUA), que son comercialmente disponibles. Los promotores comúnmente utilizados en los sistemas de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema promotor de la beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275(5681): 617-624; Goeddel, D.F. et al. (1979) Nature 281(5732): 544-548), el sistema promotor del triptofano (trp) (Goeddel, D.V. et al. (1980) Nucí. Acids Res. 8(18): 4057-4074) y el promotor tac (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ) . Otro sistema de expresión bacteriano útil emplea el promotor pL del fago lambda y el represor termoinducible clts857 (Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5(1): 59-76; Love, CA. et al. (1996) Gene 176 (1-2): 49-53). Los anticuerpos recombinantes pueden también ser expresados en hospederos de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae. Este da usualmente la habilidad para realizar diversas modificaciones post-traduccionales . El anticuerpo expresado puede ser secretado hacia el sobrenadante, de cultivo donde no muchas otras proteínas residen, haciendo más fácil la purificación. Los vectores de levadura para la expresión de los anticuerpos de la invención contienen ciertas características requeridas. Los elementos del vector son en general derivados de levaduras y bacterias para permitir la propagación del plásmido en ambos. Los elementos bacterianos incluyen un origen de replicación y un marcador seleccionable . Los elementos de levadura incluyen un origen de la secuencia de replicación (ARS) , un marcador seleccionable, un promotor, y un terminador de la transcripció . Los promotores adecuados en los vectores de levadura para la expresión incluyen los promotores del gen TRP1, el gen ADH1 o ADHII , el gen de la fosfatasa acida (PH03 o PH05) , el gen del isocitocromo, o los promotores involucrados con la via glucolítica, tales como el promotor de enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) , la 3-fosfoglicerato-cinasa (PGK) , la hexocinasa, la piruvato-cinasa, la triosafosf to-isomerasa y la fosfoglucosa-isomerasa (Hitzeman, R.A. et al. (1980) <J. Biol. Chem. 255(24): 12073-12080; Hess, B. et al. (1968) J. Adv. Enzy e Reg. 7: 149-167,- y Holland, M.J. y Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17 (23): 4900-4907). Los vectores de levadura comercialmente disponibles incluyen pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA) ; Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC #67255), e YpGX265GAL4 (ATCC #67233).

Las líneas de células de mamífero que incluyen, pero no están limitadas a las células COS-7, células L, C127, 3T3, Ovario de Hámster Chino (CHO) , HeLa, BHK, CHL-1, NSO y HEK293 pueden ser empleadas para expresar los anticuerpos recombinantes en esta invención. Las proteínas recombinantes producidas en células de mamífero son normalmente solubles y glucosiladas y tienen extremos N auténticos. Los vectores de expresión de mamífero pueden contener elementos no transcritos tales como un origen de replicación, promotor y aumentador, y secuencias no traducidas 5' o 3' no traducidas tales como los sitios de enlace al ribosoma, un sitio de poliadenilación, un sitio aceptor y un donador de empalme, y las secuencias de terminación de la transcripción. Los promotores para el uso en los vectores de expresión de mamífero usualmente son por ejemplo promotores virales tales como Polyoma, Adenovirus, HTLV, Virus 40 de Simio (SV 40) , y cxtomegalovirus humano (CMV) . Dependiendo del sistema de expresión y del hospedero seleccionado, puede ser obtenido un anticuerpo recombinante homogéneo mediante el uso de diversas combinaciones de cromatografía convencional utilizada para la purificación de proteínas. Estas incluyen: cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel , y HPLC si el sistema de expresión secreta el anticuerpo hacia el medio de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente a partir del medio. ' Si el anticuerpo no es secretado, éste es aislado de los lisados celulares . La desintegración de la célula puede ser realizada mediante cualquier método convencional, incluyendo los ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, desintegración mecánica, o el uso de agentes de lisis celular. La construcción plasmídica basada en pCANTAB5 (Pharmacia) fue utilizada para la expresión en bacteria de los anticuerpos de cadena simple de esta invención. Por ejemplo, un plásmido que contiene el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO es pZ612/3elO y codifica para la secuencia del anticuerpo de cadena- simple seguida por una secuencia e-tag (marcador e) , que puede ser utilizada para purificar la proteína. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv(TF)3elO corresponde a la SEQ ID NO: 1 (Ejemplo 1) , y la secuencia de ADN que codifica para scFv(TF)3elO corresponde a la SEQ ID NO: 2. La construcción plasmídica basada en pTH 525 (ver Patente de los Estados Unidos No. 5,827,824) se utilizó para la expresión en mamífero de los anticuerpos de cadena simple de esta invención. Por ejemplo, fueron diseñados los cebadores para generar un fragmento de ADN que abarca la secuencia de aminoácidos pro-scF (TF) 3el0 , incluyendo la secuencia de señal N-terminal y la secuencia de marcador e C-terminal, en el pl smido de expresión bacteriano. Se realizó PCR para generar un fragmento de ADN que fue insertado dentro del plásmido de expresión en mamífero, que contiene el gen de resistencia a la ampicilina y los marcadores de selección de higromicina y DHFR. La expresión de los anticuerpos de cadena simple de la invención fue impulsada por el promotor PSV LTR. En una modalidad preferida de esta invención, las construcciones de expresión en mamífero fueron transfectadas dentro de células CHO DXB11. Poblaciones estables fueron seleccionadas utilizando 400 µg/ l de higromicina B en medio HA S/F12. Los niveles de expresión fueron aproximadamente 500 µg/litro. Para incrementar los niveles de expresión, se seleccionó una población utilizando metotrexato 100 nM en medio alfa MEM. El nivel de expresión aproximado fue de 5 mg/litro. Los anticuerpos de esta invención pueden ser purificados mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser purificados por afinidad mediante el paso sobre una columna a la cual se enlaza TF . Los anticuerpos enlazados a TF pueden ser luego eluidos de la columna utilizando un amortiguador con una alta concentración salina. Los anticuerpos de cadena simple descritos en la presente contienen la secuencia e-tag en el extremo C de la proteína. Las columnas de afinidad anti-e-tag fueron adquiridas de American/Pharmacia Biotec . El medio de cultivo celular se filtró a través de un filtro de 0.22 µt? y se cargó dentro de una columna de 5 mml de e-tag a 2 ml/minuto. La columna se lavó con amortiguador de fosfato 0.2 M, 0.05% de NaN3í pH 7.0, y luego se recolectó en tubos que contenían un volumen de 0.1 mi de amortiguador de Tris 1 M, pH 8.2 para neutralizar el amortiguador de elución. Alternativamente, el medio de cultivo filtrado se cargó sobre una columna de proteína A. En este caso, la columna se lavó con ácido cítrico 50 iriM, cloruro de sodio 300 mM, pH 6.5 y se eluyó con el mismo amortiguador a pH 3.0. En ambos casos, las muestras purificadas fueron subsecuentemente cargadas sobre una columna Sephadex 200 para separar el monómero de las formas diméricas del anticuerpo.

Selección de los Anticuerpos de la Invención: Una vez que los anticuerpos son generados, expresados y purificados, éstos pueden ser además caracterizados utilizando BIAcore, un ensayo del factor VIla dependiente de sTF (ensayo de hidrólisis de péptido sTF/FVIIa) , un ensayo de activación de FX, y el ensayo de PT descrito bajo el Ejemplo 4, con el fin de identificar los anticuerpos de esta invención. En una modalidad preferida de esta invención, los anticuerpos scFv que se enlazan a TF, que se enlazan con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que a TF solo, son seleccionados utilizando el ensayo de hidrólisis de péptido sTF/FVIIa. En este ensayo, los anticuerpos para TF que se enlazan con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que a TF, se espera que incrementen la D(a p) . La Figura 2 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3e!0 incrementó la KD(aPp) aproximadamente 5 veces. Un ensayo de microcalorimetría es utilizado para medir la afinidad de los anticuerpos de TF para el complejo FVIIa/TF en comparación a TF solo. La Figura 5 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO tiene una D de enlace al complejo FVIIa/TF y TF libre de 600 nM y 33 nM, respectivamente, que corresponde a una afinidad aproximadamente 20 veces mayor para el complejo FVIIa/TF en comparación a TF solo . Los anticuerpos de esta invención tienen al menos 2 veces, preferentemente al menos 5 veces, y más preferentemente al menos 10 veces mayor afinidad para el complejo FVIIa/TF que para TF.

Los anticuerpos scFv que se enlazan a TF que no compiten con FVII para el enlace a TF se seleccionan utilizando el ensayo de hidrólisis de péptido TF/FVIla. En este ensayo, los anticuerpos de TF que compiten con FVIIa para el enlace a TF, se espera que inhiban la hidrólisis del sustrato cromogénico S2266. La Figura 1 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO no inhibió, y efectivamente incrementó la actividad de FVIIa. Los anticuerpos scFv que se enlazan a TF, que inhiben la activación de FX son seleccionados utilizando el ensayo de PT, y el ensayo de activación de FX. En el ensayo de PT, los anticuerpos de TF que prolongan PT se espera que inhiban la activación de FX. La Figura 3 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO prolongó el PT, indicando que este anticuerpo inhibe la activación de FX. En el ensayo de activación de FX, los • anticuerpos de TF que inhiben la actividad de FXa se espera que inhiban la hidrólisis del sustrato cromogénico S2222. La Figura 6 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO inhibió la actividad de FXa. Los anticuerpos de scFv que se enlazan a TF que no compiten con FX para enlazarse a TF, se seleccionan utilizando el ensayo de activación de FX. En este ensayo, los anticuerpos de TF que son no competitivos con FX, se espera que inhiban la activación de FX independientemente de la concentración de FX utilizado. La Figura 7 muestra que el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO inhibió la actividad de FXa de una manera independiente de la concentración de Fx. En una modalidad preferida de la presente invención, un anticuerpo de cadena simple (scF (TF) 3el0) fue identificado, el cual tiene un sitio de enlace simple a VH/Vl para TF. La secuencia de aminoácidos scF (TF) 3el0 , se muestra en el Ejemplo 1, y corresponde a la SEQ ID NO. 1. La secuencia de ADN que codifica para scFv(TF)3e!0 corresponde a la SEQ ID NO: 2.

Análogos, Fragmentos, Derivados y Variantes de Anticuerpos de la Invención Un análogo, fragmento, derivado o variante de los anticuerpos de la presente invención puede ser: (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos estén sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético; o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluya un grupo sustituyente, o (iii) uno en .el cual el anticuerpo maduro sea fusionado con otro compuesto más, tal como un compuesto para incrementar la vida media del anticuerpo (por ejemplo, polietilenglicol) , o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales sean fusionados al anticuerpo maduro, tal como una secuencia guia o secretora o una secuencia que es empleada para la purificación del anticuerpo maduro. Tales análogos, fragmentos, derivados y variantes se considera que están dentro del alcance de aquellos expertos de la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Preferentemente, los derivados de la presente invención contendrán sustituciones de aminoácidos conservadoras (definidas más adelante en la presente) realizadas en uno o más residuos de aminoácidos predichos, preferentemente no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre de una proteína sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es requerido para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucína, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Las sustituciones no conservadoras podrían ser realizadas para residuos de aminoácidos conservados o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un dominio de proteína conservado, a no ser que las sustituciones fueran realizadas para fines de selección de los anticuerpos variantes como se describe adicionalmente más adelante. Los fragmentos o las porciones biológicamente activas incluyen fragmentos polipeptídicos adecuados para el uso como un medicamento, como un reactivo de investigación, y similares . Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo de esta invención y que muestran al menos una actividad de ese polipéptido, pero que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos de longitud completa descritos en la presente .

Además, los derivados preferidos de la presente invención incluyen anticuerpos maduros que han sido fusionados con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido y/o para reducir la inmunogenicidad potencial del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol , "PEG") . El PEG puede ser utilizado para impartir solubilidad en agua, tamaño, velocidad lenta de despejo del riñon, e inmunogenicidad reducida al anticuerpo. Ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,214,966. En el caso de las PEGilaciones , la fusión del anticuerpo al PEG puede ser lograda mediante cualquier medio conocido por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la PEGilación puede ser lograda primeramente mediante la introducción de una mutación de cisteína dentro del anticuerpo, seguida por la derivatización específica del sitio con PEG-maleimida . La cisteína puede ser agregada al extremo C de los péptidos . Ver, por ejemplo, Tsutsumi et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97(15): 8548-8553. Otra modificación, más que puede ser realizada al anticuerpo involucra la biotinilación. En ciertos casos, puede ser útil tener el anticuerpo biotinilado de modo que éste puede reaccionar fácilmente con estreptavidina . Los métodos para la biotinilación de proteína son bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, los sitios de N- u O-glucosilación pueden ser introducidos dentro de las secuencias del anticuerpo de modo que la glucosilación N- u O-ligada post-traduccional de los anticuerpos, puede ocurrir in vivo. Las variantes de los anticuerpos de esta invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos originales. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes con relación a una segunda secuencia de aminoácidos, tal que la primera y segunda secuencias de aminoácidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que es al menos aproximadamente 45%, preferentemente aproximadamente 75% a 98%, idénticas son definidas en la presente como suficientemente similares. Preferentemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos preferidos de esta invención. Las variantes incluyen las variantes de los anticuerpos codificadas por un polinucleótido que se híbrida a un polinucleótido de esta invención o un complemento del mismo bajo condiciones estrictas. Tales variantes conservan en general la actividad funcional de los anticuerpos de esta invención. Las bibliotecas de fragmentos de los polinucleótidos pueden ser utilizadas para generar una población abigarrada' de fragmentos para la clasificación y selección subsecuente. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos puede ser generada mediante tratamiento de un fragmento de PC de doble hebra de un polinucleótido, con una nucleasa, bajo condiciones en donde ocurre la mella o corte únicamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble hebra, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble hebra, el cual puede incluir partes en sentido/antisentido de diferentes productos recortados, removiendo las porciones de una sola hebra de los dúplex reformados, mediante tratamiento con la nucleasa SI, y ligando la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica para los fragmentos interno y N-terminal de diversos tamaños de los anticuerpos de esta invención. Las variantes incluyen los anticuerpos que difieren en secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Por ejemplo, la mutagénesis puede ser realizada de acuerdo a las técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia, para modificar los dominios VL y VH de las cadenas ligera y pesada de Ig, para crear variantes que tienen afinidad de enlace incrementada al complejo FVIIa/TF en comparación a TF libre. Las variantes particularmente preferidas incluyen anticuerpos con modificaciones dentro de las regiones que determinan la complementariedad, de los dominios VL y VH. Las variantes también incluyen los anticuerpos que difieren en secuencia de aminoácidos debido a la inserción o supresión de los residuos de aminoácidos mediante mutagénesis. Por ejemplo, la mutagénesis puede ser realizada de acuerdo a las técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la materia para insertar o suprimir aminoácidos en las porciones N-terminal o C-terminal de los dominios VH o VL de las cadenas ligera y pesada de Ig para crear variantes que conservan sustancialmente actividad funcional similar. Las variantes particularmente preferidas incluyen anticuerpos de cadena simple con inserciones o supresiones de residuos de aminoácidos en el ligador VH- L entre los dominios VH y VL. La secuencia ligadora VH-VL en el anticuerpo de cadena simple descrito en el Ejemplo 1, es de 5 residuos de aminoácidos de longitud. Será aparente que otras secuencias ligadoras cortas, de 0 a 20 aminoácidos pueden ser utilizadas, en donde el anticuerpo conserva sustancialmente actividad funcional similar. Las modificaciones del ligador VH-VL existente pueden ser dirigidas a incrementar la estabilidad de la forma dimérica del anticuerpo de cadena simple. En una modalidad, una biblioteca abigarrada de variantes es generada mediante mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico, y es codificada con una biblioteca de genes abigarrada. Una biblioteca abigarrada de variantes puede ser producida mediante, por ejemplo, la ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias génicas tal que un grupo degenerado de secuencias de aminoácidos variantes, potenciales, es expresable como polipéptidos individuales, o, alternativamente, como un grupo de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la representación visual del fago) que contiene el grupo de secuencias en ésta. Existe una variedad de métodos que puede ser utilizada para producir bibliotecas de variantes potenciales a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede ser realizada en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético es luego ligado en un vector de expresión apropiado . El uso de un grupo degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican para el grupo deseado de secuencias variantes potenciales. Los métodos para sintetizar los oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984b) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477) . Son conocidas varias técnicas en la materia para seleccionar o clasificar productos génicos de bibliotecas combinatorias elaboradas mediante mutaciones o truncamiento, y para seleccionar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para la selección rápida de las bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatorias de los anticuerpos para la actividad del enlace al complejo TF- o FVIIa/TF o una actividad inhibitoria de la activación de FX. Las técnicas más ampliamente utilizadas, las cuales son apropiadas para el análisis de alto rendimiento para la selección de bibliotecas de genes grandes, incluyen típicamente la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresando los genes combinatorios bajo condiciones en los cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica para el gen cuyo producto fue detectado. Mutagénesis grupal recurrente (REM) , una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser utilizada en combinación con los ensayos de selección para identificar las variantes deseadas . El Ejemplo 1 describe la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de cadena simple que se enlaza a TF, scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 1) y delinea el ligador VH-VL y los dominios VH y VL. Las variantes que tienen la actividad de enlace al complejo de TF- o FVIIa/TF o que inhiben la activación de FX, pueden ser identificadas mediante la selección de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo la inserción, truncamiento o mutaciones puntuales de los anticuerpos de esta invención, utilizando la hidrólisis peptidica de sTF/FVIIa o los ensayos de activación de FX descritos en el Ejemplo 4. Los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos del ejemplo 1 y 3 (SEQ ID NOs : 1 y 3) , así como aquellos anticuerpos que tienen variaciones sustanciales en secuencia de ésta. Una "variación insustancial" podría incluir cualquier secuencia, sustitución, o variante de supresión que mantenga sustancialmente al menos una función biológica de los anticuerpos de esta invención, por ejemplo, la habilidad para inhibir la activación de FX. Estos equivalentes funcionales pueden incluir preferentemente anticuerpos que tienen al menos aproximadamente una identidad de 90% a los dominios de la región VL o VH del anticuerpo de cadena simple de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO : 3 y más preferentemente al menos una identidad de 95% a los dominios de la región VL o VH del anticuerpo de cadena simple de la SEQ ID NO: l o de la SEQ ID NO: 3, y todavía más preferentemente al menos una identidad de 97% a los dominios de la región VL o VH del anticuerpo de cadena simple de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 3, y también incluyen porciones de tal anticuerpo que tiene sustancialmente la misma actividad biológica. No obstante, cualquier anticuerpo que tenga variación no sustancial en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 3, que demuestre equivalencia funcional como se describe adicionalmente en la presente, es incluido en la descripción de la presente invención.

Composiciones Farmacéuticas; La invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que pueden ser administradas a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser preparadas para la administración por combinación del anticuerpo de esta invención que tiene el grado deseado de pureza y la cantidad farmacéuticamente efectiva con portadores fisiológicamente aceptables.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados en composiciones farmacéuticas, para la administración intravenosa o administración subcutánea o administración intratecal . De este modo, los anticuerpos anteriormente descritos serán combinados preferentemente con un portador farmacéutico estéril, aceptable, tal como dextrosa al 5%, solución lactatada de inger, solución salina normal, agua estéril, o cualquier otra solución amortiguadora fisiológica, comercialmente preparada diseñada para la infusión intravenosa. Se entenderá que la selección de la solución portadora y la dosificación y administración de la composición variarán con el sujeto y con el cuadro clínico particular, y será gobernado por procedimientos médicos estándares . De acuerdo con los métodos de la presente invención, estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en cantidades efectivas para inhibir las consecuencias patológicas asociadas con la generación de trombina en exceso, en el sujeto. La administración del anticuerpo puede ser mediante una inyección intravenosa de bolo, mediante una infusión intravenosa constante, como una combinación de ambas rutas. Alternativamente, o en adición, el anticuerpo mezclado con los excipientes apropiados puede ser recogido en la circulación desde un sitio intramuscular. El tratamiento sistémico con anticuerpo puede ser monitorizado por la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (PT) en muestras en serie de sangre tomada del paciente. El tiempo de coagulación observado en este ensayo es prolongado cuando es alcanzado un nivel suficiente del anticuerpo en la circulación. Los anticuerpos recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son útiles para la administración parenteral, tópica, intravenosa, oral o local. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una variedad de formas de dosis unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosis unitaria pueden ser administradas en la forma que incluye, pero no está limitada a tabletas, cápsulas, polvo, soluciones y emulsiones. Los anticuerpos recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración intravenosa. Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo de cadena simple disuelto en un portador farmacéutic mente aceptable, preferentemente en un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos puede ser utilizadas, por ejemplo, solución salina amortiguada y similares. Estas soluciones son estériles y en general libres de material indeseable. Las composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas . Una composición farmacéutica típica para la administración intravenosa puede ser fácilmente determinada por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Las cantidades administradas son claramente específicas de la proteína, y dependen de su potencia y de su perfil farmacocinético . Los métodos efectivos para la preparación de las composiciones parenterelamente administrables, serán conocidos o aparentes para aquellos expertos en la técnica, y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980) . Las composiciones que contienen los presentes anticuerpos de la invención o un coctel de los mismos (por ejemplo, con otras proteínas) pueden ser administradas como tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente que sufre de un desorden de sangrado o de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener el sangrado. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como una "cantidad terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente. 1 La administración simple o múltiple de las composiciones puede ser administrada dependiendo de la dosis y la frecuencia como se requiera y como sea tolerado por el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar efectivamente al paciente. Los anticuerpos de la invención, o sus composiciones farmacéuticamente aceptables, son administrados en una cantidad terapéuticamente efectiva, que variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo la actividad del anticuerpo específico empleado; la estabilidad metabólica y la longitud de acción del anticuerpo; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción; la combinación del fármaco; la severidad de los estados de enfermedad particulares; y el hospedero que sufre terapia. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva diaria es de aproximadamente 0.14 g a aproximadamente 14.3 mg/kg de peso corporal por día de un anticuerpo de la invención, o una cantidad farmacéuticamente aceptable del mismo; preferentemente, de aproximadamente 0.7 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día; y lo más preferentemente, de aproximadamente 1.4 mg a aproximadamente 7.2 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, para la administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosis podría ser de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1.0 gramo por día de un anticuerpo de la invención, o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, preferentemente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 700 mg por día, y lo más preferentemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg por día.

Terapia Celular y Génica; Un anticuerpo de la invención puede ser empleado de acuerdo con la presente invención, mediante la expresión de tal anticuerpo in vivo por un método denominado como "terapia celular". De este modo, por ejemplo, las células pueden ser manipuladas mediante ingeniería genética con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para el anticuerpo in vivo, y las células manipuladas mediante ingeniería genética son luego proporcionadas a un paciente que va a ser tratado con el anticuerpo. Tales métodos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las células pueden ser manipuladas mediante ingeniería genética mediante procedimientos descritos en la técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica para el anticuerpo de la presente invención. Un anticuerpo de la invención puede también ser empleado de acuerdo con la presente invención, por expresión de tal anticuerpo in vivo mediante un método denominado como "terapia génica" . De este modo, por ejemplo, un virus puede ser manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para el anticuerpo, y el virus manipulado por ingeniería genética es luego proporcionado a un paciente que va a ser tratado con el anticuerpo. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden ser manipulados por ingeniería mediante procedimientos conocidos en la técnica que contienen el ADN que codifica para el anticuerpo de la presente invención. La distribución local de los anticuerpos anticoagulantes de la presente invención utilizando terapia celular o génica puede proporcionar el agente terapéutico al área objetivo, las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos . Las metodologías de terapia celular y génica in vitro e in vivo, son contempladas. Varios métodos para transferir los genes potencialmente terapéuticos a las poblaciones celulares definidas, son conocidos. Ver, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260: 926-931. Estos métodos incluye : 1) Transferencia directa de genes. Ver, por ejemplo Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468; 2) Transferencia de ADN mediada por liposomas. Ver, por ejemplo, Caplen et al. (1995) Nature Med. 3: 39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao y Huang (1991) Biochem. Biophys . Res. Conuri. 179: 280-285; 3) Transferencia de ADN mediada por retrovirus . Ver, por ejemplo, Kay et al. (1993) Science 262: 117-119; Anderson (1992) Science 256: 808-813. 4) Transferencia de ADN mediada por virus de ADN. Tales virus de ADN incluyen adenovirus (preferentemente vectores basados en Ad2 o Ad5) , herpes-virus (preferentemente vectores basados en el virus del herpes simple) , y parvovirus (preferentemente, vectores basados en parvovirus no autónomo "defectuosos" , más preferentemente los vectores basados en virus adeno-asociados , más preferentemente vectores basados en AAV-2) . Ver, por ejemplo, Ali et al., (1994) Gene Therapy 1: 367-384; Patente de los Estados Unidos No. 4,797,368, incorporada por referencia en la presente, y la Patente de los Estados Unidos No. 5,139,941, incorporada por referencia en la presente . La elección de un sistema vector particular para transferir el gen de interés dependerá de una variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población de células diana u objetivo. Aunque han sido extensamente estudiados vectores retrovirales y utilizados en un número de aplicaciones de terapia génica, estos vectores son en general no adecuados para la infección de células que no se dividen. Además, los retrovirus tienen el potencial para la oncogenicidad. No obstante, desarrollos recientes en el factor de vectores lentivirales , pueden evitar algunas de estas limitaciones. Ver Naldini et al. (1996) Science 272: 263-267. Los retrovirus a partir de los cuales pueden ser derivados los vectores plasmídicos retrovirales anteriormente mencionados aquí, incluyen, pero no están limitados a, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como Virus de Sarcoma de Rous, Virus de Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia de mono gibbon, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus de Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor mamario. En una modalidad, el vector plasmídico retroviral es derivado del Virus de la Leucemia Murina de Moloney. Los adenovirus tienen la ventaja de que éstos tienen un amplio intervalo de hospederos, pueden infectar células en reposo o terminalmente diferenciadas, tales como neuronas o hepatocitos, y parecen esencialmente, no oncogénicos. Ver, por ejemplo, Ali et al. (1994), supra, p. 367. Los adenovirus no parecen integrarse dentro del genoma del hospedero. Debido a que éstos existen extracromosómicamente, se reduce en general el riesgo de mutagénesis insercional. Ali et al. (1994), supra, p. 373. Los virus adenoasociados muestran ventajas similares como los vectores basados en adenovirus. No obstante, los AAVs muestran integración específica del sitio sobre el cromosoma humano 19 (Ali et al. (1994), supra, p . 377) . En una modalidad preferida, el ADN que codifica para los anticuerpos de esta invención es utilizado en terapia celular o génica para los desórdenes que incluyen, pero no están limitados a, trombosis de venas profundas, coagulación intravascular diseminada, síndrome coronario agudo o cáncer con evidencia de coagulopatí . De acuerdo a esta modalidad, la terapia celular o génica con el ADN que codifica para el anticuerpo de esta invención, es proporcionado en un paciente en necesidad del mismo, concurrente con, o inmediatamente después del diagnóstico . El técnico experto apreciará que cualquier vector de terapia génica adecuado que contenga el ADN que codifica para el anticuerpo de la invención o el ADN que codifica para los análogos, fragmentos, derivados o variantes del anticuerpo de la invención, puede ser utilizado de acuerdo con esta modalidad. Las técnicas para construir tal vector son conocidas. Ver, por ejemplo, Anderson, W.F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I.M. y Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242. La introducción del anticuerpo que contiene el ADN del anticuerpo, al sitio objetivo, puede ser lograda utilizando técnicas conocidas. El vector de terapia celular o génica incluye uno o más promotores . Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, el LTR retroviral ; el promotor SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (C V) descrito en Miller et al. (1989) Biotechniqv.es 7(9): 980-990, o cualquier otro promotor (por ejemplo, los promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no están limitados a, promotores de histona, de pol III y de ß-actina) . Otros promotores virales que pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, promotores adenovirales , promotores de la timidina-cinasa (T ) , y promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será aparente para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas aquí. La secuencia de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío mayor adenoviral; o los promotores heterólogos, tal como el promotor de citomegalovirus (C V) ; el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneina,-promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de. ApoAl; los promotores de globina humana; promotores de timidina-cinasa viral, tal como el promotor de la timidina-cinasa del Herpes Simplex; LTRs retrovirales (incluyendo los LTRs retrovirales modificados, anteriormente descritos aquí) ; el promotor de ß-actina; y el promotor de la hormona humana del crecimiento. El vector plasmídico retroviral es empleado para transducir las líneas celulares de empaquet miento para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células de empaquetamiento que pueden ser transfectadas incluyen, pero no están limitados a las líneas celulares PE501, PA317, ?-2, ?-? , PA12 , T19-14X; VT-19-17-H2, \|/CRE, i|/CRIP( GP+#-86, GP+envAml2 y DAN como se describe en Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14, que se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaquetamiento a través de cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no están limitados a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con fosfato de calcio. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede ser encapsulado dentro de un liposoma, o acoplado a un lípido, y luego administrado a un hospedero. La línea celular productora genera partículas infecciosas del vector retroviral que incluyen la o las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos . Tales partículas del vector retroviral pueden ser entonces empleadas para transducir células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la o las secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no están limitadas a, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos , fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, ' células endoteliales , y células del epitelio bronquial. Un procedimiento diferente a la terapia génica es la "terapia transcariótica" en donde las células del paciente son tratadas ex vivo para inducir los genes cromosómicos dormidos para producir la proteína de interés después de la reintroducción al paciente. La terapia transcariótica asume que el individuo tiene un complemento normal de genes, necesarios para la activación. La terapia transcariótica involucra la introducción de un promotor u otra secuencia reguladora exógena capaz de activar los genes nacientes, dentro del ADN cromosómico de las células del paciente ex vivo, cultivando y seleccionando para las células productoras de proteína activa, y luego reintroduciendo las células activadas dentro del paciente con el intento de que éstas se vuelvan completamente establecidas. Las células "activadas por el gen" fabrican entonces la prcteína de interés por alguna cantidad significativa de tiempo, quizás por tanto como la vida del paciente. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,641,670 y 5,733,761 describen con detalle este concepto, y son incorporadas, por referencia en la presente, en su totalidad.

Equipos ; Esta invención se refiere además a los equipos para fines de investigación o de diagnóstico. Los equipos incluyen típicamente uno o más recipientes que contienen los anticuerpos de la presente invención. En una modalidad preferida, los equipos comprenden los recipientes que contienen anticuerpos de cadena simple en una forma adecuada para derivatización con una segunda molécula. En una modalidad más preferida, los equipos comprenden recipientes que contienen el anticuerpo de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO : 3. .

En otra modalidad más, los equipos pueden contener secuencias de ADN que codifican para los anticuerpos de la invención. Preferentemente, las secuencias de ADN que codifican para estos anticuerpos son proporcionadas en un plásmido adecuado para la transfección dentro y la expresión por una célula hospedera. El plásmido puede contener un promotor (frecuentemente un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula hospedera. El plásmido puede también contener sitios de restricción apropiados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN dentro del plásmido, para producir diversos anticuerpos . Los plásmidos pueden también contener otros numerosos elementos para facilitar la clonación y expresión de las proteínas codificadas. Tales elementos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores seleccionables, codones de inicio, codones de terminación y similares. En una modalidad más preferida, los equipos comprenden recipientes que contienen las secuencias de ADN de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

Indicaciones Terapéuticas: Las enfermedades en las cuales la formación del trombo juega un papel etiológico significativo incluyen infarto del miocardio, coagulación intravascular diaeminada, trombosis de venas profundas, embolismo pulmonar, apoplejía isquémica, choque séptico, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, angina inestable y otras condiciones oclusivas de las arterias y de las venas. Los anticuerpos de esta invención son útiles en todas éstas, así como en otras enfermedades en las cuales la formación del trombo es patológica. Otras condiciones patológicas donde el anticuerpo de esta invención puede ser útil incluyen cáncer con coagulopatía e inflamación. Los anticuerpos pueden también encontrar uso en injertos de piel y de venas, y en trasplantes de órganos. Por útil se entiende que los anticuerpos son útiles para el tratamiento, ya sea para prevenir la enfermedad o para prevenir su progresión a un estado más severo . Los anticuerpos de esta invención también proporcionan un anticoagulante seguro y efectivo, por ejemplo, en pacientes que reciben bioprótesis tales como válvulas cardiacas. Estos anticuerpos pueden reemplazar la heparina y la warfarina en el tratamiento de, por ejemplo, embolismo pulmonar o infarto agudo del miocardio. Los anticuerpos de esta invención pueden también encontrar uso en dispositivos médicos de recubrimiento donde la coagulación es un problema de interés.

Ensayos ; Un número de ensayos de laboratorio para medir la actividad anticoagulante in vitro de un anticuerpo de esta invención, son disponibles. El efecto anticoagulante de un anticuerpo puede ser medido utilizando los ensayos de tiempo de coagulación plasmático tales como el tiempo de tromboplastina parcial activada ( "APTT" ) , tiempo de coagulación de trombina ("TCT") y/o tiempo de protrombina ("PT"). Estos ensayos se distinguen entre los diferentes mecanismos de inhibición de la coagulación, e involucran la activación de la proteina C. La prolongación del tiempo de coagulación en cualquiera de estos ensayos demuestra que la molécula puede inhibir la coagulación en plasma. Los ensayos anteriores son utilizados para identificar los anticuerpos con actividad an icoagulante que son capaces de enlazarse a TF en los sistemas purificados y en un medio plasmático. Son entonces utilizados ensayos adicionales para evaluar otras actividades de los anticuerpos de la invención, tales como la inhibición de la formación catalizada por trombina de la fibrina a partir del fibrinógeno (Jakubowski, H.V. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261(8): 3876-3882), inhibición de la activación del factor V por trombina (Esmon, C.T. et al. (1982), J. Biol. Chem. 257(14): 7944-7947), inhibición acelerada de la trombina por antitrombina III y cofactor II de eparina (Esmon, N.L. et al. (1983) J. Biol . Chem. 258(20): 12238-12242), inhibición de la activación de la trombina del factor XIII (Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58(1): 140), inhibición de la inactivación de protelna S mediada por trombina (Thompson, E.A. y Salem, H.H. (1986) J. Clin. Inv. 78(1): 13-17), e inhibición de la activación y agregación plaquetaria, mediada por trombina (Esmon, N.L. et al. (1983), supra) . Los siguientes ensayos, descritos con detalle bajo el Ejemplo 4, son utilizados para medir la potencia in vitro o la afinidad de enlace in vit.ro de los anticuerpos de la invención: 1) el ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa; 2) el ensayo de activación del factor X; 3) ensayo de PT; y 4) ensayo de microcalorimetría . Al llevar a cabo los procedimientos de la presente invención se entiende por supuesto que la referencia a los amortiguadores, medios, reactivos, células, condiciones de cultivo particulares, y similares, no están destinados a ser limitantes, sino que deben ser considerados como incluyentes de todos los materiales relacionados que una persona de experiencia ordinaria en la técnica podría reconocer como de interés o de valor en el contexto particular en que esa discusión se presenta. Por ejemplo, es frecuentemente posible sustituir un sistema amortiguador o medio de cultivo por otro más y todavía lograr resultados similares si no es que idénticos. Aquellos de experiencia en la técnica tendrán suficientemente conocimiento de tales sistemas y metodologías, para ser capaces, sin experimentación debida, de realizar tales sustituciones como sirvan óptimamente a sus propósitos en el uso de los métodos y procedimientos descritos en la presente. La presente invención será ahora además descrita por los siguientes ejemplos no limitantes, como una guía para ayudar en la práctica de la invención. En la aplicación de la descripción del ejemplo debe quedar claramente en mente que otras y diferentes modalidades de los métodos descritos de acuerdo a la presente invención, sin duda serán sugeridas por sí mismas para aquellos de experiencia en la técnica relevante. En lo anterior y en los siguientes ejemplos, todas las temperaturas se describen no corregidas en grados Celsius y, todas las partes y porcentajes están en peso, a no ser que se indique de otro modo. Las descripciones completas de todas las solicitudes, patentes, y publicaciones, citadas anteriormente, son incorporadas por referencia en la presente .

EJEMPLO 1 Construcción scFv(TF)3elO del Anticuerpo Anti-TF de Cadena Simple (-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E A Q V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F T D A W M S V R Q A P G K E L E W V S S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R V L S L T D Y Y Y G M D V W G Q G T L V T V S A G G G G S G A P N F L T Q P H S V S A S P G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E A D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264) El anticuerpo scFv(TF)3elO anti-TF de cadena simple (SEQ ID NO: 1) consiste de un péptido de señal (-18 a -1), el dominio VH (1 a 126), ligador VH-VL (127 a 131), dominio VL (132 a 246), y la secuencia e-tag (247 a 264)., La secuencia de ADN de scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 2) codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

EJEMPLO 2 Construcción scF (TF) 3elOA del Anticuerpo Anti-TF de Cadena Simple (-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E V S S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R V L S L T D Y Y Y G M D V G Q G T L V T V S A G G G G S N F M L T Q P H S V S A S P G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E A D Y V C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (243) El anticuerpo scF (TF) 3elOÁ anti-TF de cadena simple (SEQ ID NO: 3) consiste de un peptido de señal (-18 a -1) , el dominio VH (1 a 126) , el ligador VH-VL (127 a 131), y el dominio VL (132 a 243). scF (TF) 3elOA difiere del scFv(TF)3elO por la supresión de 3 aminoácidos (GAP) en el extremo N del dominio VL y por supresión de la secuencia e-tag C-terminal . La secuencia de ADN del scF (TF) 3elOA (SEQ ID NO: 4) codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

EJEMPLO 3 Expresión de los Anticuerpos Anti-TF en Células de Bacteria y de Mamífero Seis diferentes anticuerpos de cadena simple, scFv(TF)2cl, scFv(TF) 2cll, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3elO y scFv(TF)3h2, fueron identificados a partir del fago que se enlaza a TF, sobre expresados en E. coli, y purificados por afinidad utilizando una columna de afinidad e-tag como se describió an eriormente. Las afinidades de los seis anticuerpos purificados para sTF fueron medidas utilizando BIAcore, y luego estos anticuerpos fueron caracterizados en la hidrólisis del péptido sTF/FVIIa; la activación de FX, PT y los ensayos de microcalorimetría descritos bajo el Ejemplo 4, los resultados de los cuales se describen bajo el Ejemplo 5. El anticuerpo scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 1) fue también expresado en células CHO. El plásmido de expresión contenía la secuencia de ADN que codifica para el scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 2) y para los marcadores de selección de higromicina B y DHFR. La selección original fue realizada en 400 µg/ml de higromicina para seleccionar una población. La población resultante fue luego sometida a selección con metotrexato 100 nM. Durante esta selección, las células que tienen copias amplificadas de la región del ADN que contiene el marcador de selección, y el gen objetivo, se seleccionan de entre la población. Los niveles de expresión fueron incrementados de aproximadamente 0.3 mg/litro hasta aproximadamente 6 mg/litro como resultado de esta selección.

EJEMPLO 4 Potencia In Vit.ro y Ensayos de Afinidad de Enlace 1. Ensayo de Hidrólisis del Péptido sTF/FVIIa El principio de este ensayo se describe más adelante. El enlace amida de la p-nitroanilida tripeptidico del sustrato es hidrolizado por el complejo sTF/FVIIa. El producto cromóforo liberado, la p-nitroanilida, es monitorizado a 405 nm y la concentración del producto formado por unidad de tiempo es calculada utilizando un coeficiente de extinción molar de 9920 M^cm" 1. Los valores IC5o (C) son determinados mediante el ajuste de las velocidades iniciales en la ecuación de 4 parámetros: Y = (A-D) / (1+ (x/C)AB) +D H-D-Val-Leu-Arg-p-NA -> H-D-Val-Leu-ARg + pNA Sustrato S2266 tripéptido cromóforo Reactivos y soluciones: 1. Amortiguador de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1%, pH 7.5 2. FVIIa humano (HCVIIA-0060 , Haematologic Technologies Inc.) : 10 x solución de trabajo-preparar solución 20 nM en amortiguador de ensayo antes del uso . 3. TF soluble (Berlex) : 10 x solución de trabajo-preparar solución 30 nM en amortiguador de ensayo antes del so . 4. Sustrato cromogénico S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Solución de reserva: 10 mM en agua, almacenado a 4°C, 2.5 x solución de trabajo-preparar solución 2.5 mM en amortiguador de ensayo antes del uso. 5. Anticuerpo: Preparar diluciones 2.5x en amortiguador de ensayo antes del uso.

Condiciones de Ensayo: Los ensayos son realizados en una placa de microtitulación de 96 pozos a temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los componentes son como sigue: STF 3 nM Anticuerpo varía de 1000 a 0.625 nM FVIIa 2 nM S2266 1 nM Procedimiento de Ensayo: 1. Colocar con pipeta en cada pozo 0.1 mi de 2.5x AB (o control de amortiguador) 2. Agregar 0.025 mi de lOx sTF e incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación leve. Agregar 0.025 mi de lOx FVIIa, incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación leve. · Agregar 0.1 mi de 2.5x sustrato S2266, transferir inmediatamente la placa a un lector de placas y medir la cinética enzimática a 405 nm a intervalos de 10 segundos por 15 minutos .

Este ensayo puede ser utilizado para medir una KD aparente de los enlaces de los anticuerpos de la invención a sTF o el complejo FVIIa/TF, y para determinar si los anticuerpos de la invención compiten con FVII para el enlace a TF. 2. Ensayo de Activación del Factor X El principio de este ensayo es descrito más adelante. FVIIa es incubado con vesículas de TF humano recombinante, para formar un complejo de proteasa capaz de activar el sustrato, FX. Este complejo es formado en presencia (o ausencia) de diferentes concentraciones de anticuerpo, cuando el FX sustrato es introducido y la reacción se deja proceder para formar el producto, la proteasa activa FXa, que es capaz de hidrolizar el enlace amida de la p-nitroanilida del sustrato cromogénico S2222. El producto cromóforo liberado, p-nitroanilida, es monitorizado a 405 nm y la concentración del producto formado por unidad de tiempo se calcula utilizando un coeficiente de extinción molar de 9920 M_1cnf1. Los valores de ICS0 son determinados mediante el ajuste de las velocidades iniciales en la ecuación de 4 parámetros: Y= (A-D) / (1+ (x/C)AB)+D Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA -> Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+p-NA Sustrato S2222 Cromóforo Reactivos y soluciones: 1. Amortiguador de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1%, pH 7.5 2. FVIIa humano (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4 x solución de trabajo-preparar solución 100 nM en amortiguador de ensayo antes del uso. 3. TF Humano ecombinante (reconstituido en nuestro laboratorio de Innovin, Dade) : solución de trabajo- preparar dilución 1:480 en amortiguador de ensayo antes del uso . 4. Factor X humano (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.) 4 x solución de trabajo-preparar solución 1000 nM en amortiguador de ensayo antes del uso. 5. Sustrato cromogénico S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc . ) : solución de reserva: 6 mM en agua, almacenada a 4°C. solución de trabajo-preparar solución de 0.78 mM en EDTA 3.57 mM (para detener la reacción), cloruro de sodio 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7.5 antes del uso. 6. Anticuerpo: Preparar diluciones 4x en amiloidosis de ensayo antes del uso.

Condiciones de Ensayo : Los ensayos son realizados en una placa de microtitulación de 96 pozos a temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los compuestos son como sigue: Vesículas de rTF 1/4 de dilución 1:480 Anticuerpo varía de 1000 a 0.625 nM FVIIa 25 pM FX 250 nM S2222 0.546 mM Procedimiento de Ensayo : 1. Colocar con pipeta en cada pozo 0.015 mi de 4x ?? (o amortiguador control) . 2. Agregar 0.015 mi de vesículas 4x rTF. 3. Agregar 0.015 mi de 4x FVIIa, incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. 4. Agregar 0.015 mi de 4x FX, incubar 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. 5. Agregar 0.14 mi de sustrato S2222, transferir inmediatamente la placa a un lector de placas y medir la cinética enzim tica a 405 nm a intervalos de 10 segundos por 15 minutos .

Este ensayo puede ser utilizado para determinar si los anticuerpos de la invención inhiben el complejo FVIIa/TF para activar FX, y para determinar si los anticuerpos de la invención compiten con FX para el enlace al complejo FVIIa/TF. 3. Ensayo de Tiempo de Protrombina (PT) Para la reacción de PT estándar, 90 µ? de una concentración apropiada del anticuerpo o de PBS se agregan a 20 µ? de la tromboplastina IS (Dade) y 90 µ? de cloruro de calcio 25 mM en una cubeta. La mezcla se incuba por 1 minuto a 37°C, luego 100 µ? de plasma citratado (Helena Laboratories) . Alternativamente, se agrega un volumen apropiado del anticuerpo concentrado a 100 µ? de la tromboplastina humana recombinante (Ortho Reco biplastin) y aproximadamente 2 minutos más tarde, se agregan 100 µ? de plasma humano reconstituido. El tiempo de coagulación para cada ensayo de coagulación individual es medido al tomar el promedio de dos mediciones utilizando un coagulómetro Electra 900 C (Hemoliance) y los valores promedio determinados a partir de los ensayos por duplicado (n=3 ó 4) . Las curvas de dosis-respuesta fueron generadas para cada inhibidor y luego se utilizó el análisis de regresión para calcular la concentración (en n ) necesaria para una extensión doble del tiempo de coagulación. Este ensayo puede ser utilizado para evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención sobre la vía de coagulación extrínseca de la sangre . La cantidad del anticuerpo requerida para duplicar el PT es determinada, y puede ser comparada a otros anticoagulantes para evaluar la potencia relativa de los anticuerpos de la invención. 4. Ensayo de Microcalorimetría El ensayo de microcalorimetría (calorimetría de titulación isotérmica) se utiliza para medir la afinidad de enlace (KD) de los anticuerpos de la invención a TF solo el complejo FVIIa/TF. Este ensayo es realizado utilizando un instrumento MicroCal VP-ITC. El complejo FVIIa/TF es preformado mediante la adición de un exceso de 2.3 veces molar de FVIIai a sTF . La cromatografía de exclusión de tamaño se utiliza para verificar que el sTF en el ensayo es completamente formado en complejo. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo para el complejo, se agrega 1.2 µ? del complejo VIIa/TF a la celda de microcalorimetría y se agrega al anticuerpo 65 µ? a la jeringa. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo para sTF solo, se agrega sTF 10 µ? a la celda y se agrega al anticuerpo 141 µ? a la jeringa. El análisis de datos es realizado utilizando el software MicroCal Origin. Los datos son ajustados a un sitio de enlace simple.

EJEMPLO 5 Características In Vitro de los Anticuerpos anti-TF de esta Invención Seis anticuerpos diferentes que se enlazan a TF fueron aislados a partir de una biblioteca de representación visual de fagos, de anticuerpos de cadena simple, completamente humanos : scFv(TF)2cl, scF (TF) 2cll, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3elO y scFv(TF)3h2. Las afinidades de estos anticuerpos que se enlazan a sTF, expresados en E. coli, como se mide utilizando BIAcore, estuvieron entre 35 y 470 nM. El ensayo de hidrólisis del péptido sTF/VIIa descrito bajo el Ejemplo 4 se utilizó para determinar si estos anticuerpos bloquearon la formación de un complejo activo de VIIa/TF. En este ensayo, el enlace de Vlla a sTF acelera la velocidad de escisión contra el sustrato peptídico cromogénico S2266 por >20 veces. Los anticuerpos que inhiben el enlace de FVIIa a TF bloquean esta aceleración. Cinco de los anticuerpos de cadena simple, scFv(TF)2cl, scFv (TF) 2cll , scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, y scFv(TF)3h2 inhibieron la hidrólisis de S2266, sugiriendo que éstos inhiben el enlace de FVIIa a sTF (Figura 1) . En contraste, el anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO no inhibió el ensayo de hidrólisis del péptido sTF/VIIa y, de hecho, este anticuerpo incrementó la velocidad de S2266, sugiriendo que el scFv(TF)3elO incrementa la afinidad del sTF por FVIIa. Utilizando el ensayo de hidrólisis del péptido sTF/VIIa, el anticuerpo enfermedades incrementó la afinidad de FVIIa por sTF, disminuyendo la KD aparente 5 veces (Figura 2) . El scFv(TF)3elO no afectó la velocidad de hidrólisis de FVIIa en ausencia de sTF, indicando que este anticuerpo no interactúa con FVIIa solo. La KD del anticuerpo scFv(TF)3el0 para sTF, medida utilizando el ensayo de hidrólisis del péptido sTF/FVIIa, fue de 65.4 nM (Figura 4) . Se utilizó un ensayo de microcalorimetría para comparar la afinidad de scFv(TF)3el0 para TF, en comparación al complejo FVIla/TF. Estos experimentos revelaron que el scFv(TF)3elO expresado en células de mamífero tiene una afinidad aproximadamente 20 veces mayor para el complejo TF/FVTIa en comparación a sTF libre (33 nM versus 600 nM, Figura 5) . Los seis anticuerpos de cadena simple que se enlazan a TF, expresados en bacterias, fueron comparados utilizando el ensayo de activación de FX y el ensayo de PT. Ninguno de los cinco anticuerpos que inhibieron la velocidad de hidrólisis de S2266 por el complejo sTF/FVIIa, scFv(TF)2cl, scFv(TF) 2cll, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, y scF (TF) 3h2 , prolongaron el PT más allá del amortiguador control PBS (Figura 3) . En contraste, aunque el anticuerpo scFv(TF)3el0 no tuvo la mayor afinidad como se midió por BIAcore, y éste incrementó la afinidad de FVIIa para sTF, scFv(TF)3el0 fue el único anticuerpo en el grupo que inhibió la activación de FX (Figura 6 y datos no mostrados) y prolongó el tiempo de coagulación en el ensayo de PT (Figura 3). La ICS0 del anticuerpo scFv(TF)3e!0 (dímero) para la inhibición en el ensayo de activación de FX fue de 0.44 nM (Figura 6) . Finalmente, el ensayo de activación de FX fue utilizado para determinar si el anticuerpo scFv(TF)3elO compite con FX para el enlace al complejo FVIIa/TF. scFv(TF)3elO inhibió la activación de FX independientemente de la dosis, con la misma KD(app) .a todas las concentraciones del sustrato FX, indicando que scFv(TF)3elO es no competitivo con FX y no se enlaza a TF o al complejo FVIIa/TF en el mismo sitio que FX (Figura 7) . El anticuerpo scFv(TF)3elO fue identificado con base en el enlace al TF soluble humano, recombinante . La homología secuencial de TF entre el humano y el murino, o el humano y el conejo es de 58% y 71%, respectivamente. El anticuerpo parece enlazarse a un epitopo único sobre TF humano que interfiere con la activación de FX por el complejo FVIIa/TF. Fisiológicamente, este anticuerpo tiene una ventaja sobre los anticuerpos que compiten con FVII o FVIIa que se enlazan a TF. La KD de FVIla para TF soluble es de aproximadamente 10 nM (Figura 2) , un valor que es consistente con los valores publicados para el enlace de FVIIa a sTF (4.8 nM, Neuenschwander, P.F. y Morrissey, J.H. (1994) J. Biol. Chem. 269(11): 8007-8013) o el enlace de FVII, FVIIa y FVIIai inactivado por DIP, a TF de longitud completa, reconstituido en vesículas de fosfatidilcolina neutras (Bach R. et al. (1986) Biochemistry 25: 4007-4020). La afinidad del enlace de FVII o FVIIa a TF de longitud completa, se incrementa en gran medida cuando la fosfatidilcolina cargada es incluida en las vesículas fosfolip'idicas (Bac R. et al. (1986) supra) , debido a la interacción del dominio de GLA de FVII o FVIIa con la superficie de la membrana cargada (Neuenschwander, P.F. y Morrissey, J.H. (1994 supra) . Bajo estas condiciones óptimas, el FVIIa se enlaza a TF de longitud completa con una afinidad muy alta (41 pM) . Un anticuerpo para TF que compite con el enlace de FVII o FVIIa, tendrá dificultad en competir por este complejo FVI a/TF de alta afinidad. En contraste, el anticuerpo scFv(TF)3elO no solamente tiene mayor afinidad por el complejo FVIIa/TF que a TF, sino que no compite con FVIIa para el enlace a TF. Un anticuerpo tal como scFv(TF) 3el0, el cual no compite con FVIIa, inhibirá la activación de FX independientemente de la concentración plasmática de FVII, que es de aproximadamente 10 nM. El anticuerpo scFv(TF)3elO también tiene una ventaja sobre los anticuerpos que compiten con FX para enlazarse a TF. La K» de FX para el complejo VIIa/TF está entre 0.061 y 0.099 µ?, con base en los datos mostrados en la Figura 7, consistente con los valores publicados (0.1 µ?, Baugh, R.J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 (37) : 28826-28833) . La concentración de FX en el plasma humano es de 140 nM (1.4 a 2 veces ? . Un anticuerpo tal como scFv (TF) 3el0 , el cual no compite con FX como se muestra en la Figura 7, inhibirá la activación de FX independientemente de la concentración plasmática de FX.

EJEMPLO 6 Modelo de Troitiboembolismo de Rata In vivo El anticuerpo de cadena simple scFv(TF)3elO que se enlaza a TF es específico para TF de primate. Un modelo de tromboembolismo disparado por TF humano (el reactivo de tromboplastina que contiene el TF humano reco binante, Ortho) fue desarrollado en ratas macho Sprague-Dawley concientes (350-400 g, n>7/grupo) . En este modelo de coagulación intravascular diseminada (DIC) , TF, vía la inyección de tromboplastina, induce deposición de fibrina pulmonar, insuficiencia respiratoria y muerte. Las dosis del scFv(TF)3elO expresado en células de mamífero o vehículo, fueron inyectadas dentro de la vena de la cola seguida por, 15 minutos después, una inyección de bolo de tromboplastina (0.5 m/kg) . En el grupo tratado con vehículo, esta dosis de TF dio como resultado letalidad del 60% (LDso) / usualmente dentro de 5 minutos después de la inyección de tromboplastina. Las ratas fueron calificadas de acuerdo al siguiente sistema de calificación de morbididad-mortalidad: 0=sin afectación; 1= insuficiencia respiratoria leve (recuperación dentro de 30 minutos) ; 2=insuficiencia respiratoria severa (moribunda, la recuperación requirió más de 60 minutos) ; y 3=muerte. La calificación promedio fue utilizada para comparar la eficacia de los diferentes grupos de tratamiento. Los resultados que utilizan este ensayo in vivo son descritos en la Figura 8. El anticuerpo de la invención fue capaz de reducir la mortalidad y reducir la insuficiencia respiratoria en este ensayo. Los ejemplos precedentes pueden ser repetidos con éxito similar al sustituir los reactivos genérica o específicamente descritos y/o las condiciones de operación de esta invención por aquellas utilizadas en los ejemplos precedentes . Mientras que la invención ha sido ilustrada con respecto a la producción de ciertas construcciones de anticuerpo, es aparente que pueden ser realizadas variaciones y modificaciones de la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anticoagulante que se enlaza con mayor afinidad al complejo factor Vlla/factor tisular (FVIIa/TF) que al factor tisular TF solo.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se enlaza con una afinidad al menos 2 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo, como se mide en un ensayo de microcalorimetría .

3. El anticuerpo según la reivindicación 2, en donde el anticuerpo se enlaza con una afinidad al menos 5 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo.

4. El anticuerpo según la reivindicación 3, en donde el anticuerpo se enlaza con una afinidad al menos 10 veces mayor al complejo FVIIa/TF que a TF solo.

5. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

6. El anticuerpo según la reivindicación 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo dimerico de Fab o un anticuerpo IgG.

7. El anticuerpo según la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple.

8. El anticuerpo según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo no compite por el enlace a TF con uno o más de los factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste de factor VII (FVII) , factor IX (FIX) y factor X (FX) .

9. El anticuerpo según la reivindicación 8, en donde los factores de coagulación son FVII y FX.

10. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es glucosilado.

11. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado por la adición de polietilenglicol .

12. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es biotinilado para el enlace a la estreptavidina .

13. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1, cuya composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo.

14. Un método para proteger contra la formación de trombos, que comprende el administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe la generación de la trombina sin afectar directamente otros parámetros de la coagulación tales como la activación y la agregación de plaquetas.

15. El método según la reivindicación 14, en donde el método es para proteger contra la formación de trombos en apoplejía isquémica, complicaciones trombóticas después de la angioplastia o cirugía microvascular.

16. Un método para reducir y tratar trombosis venosa profunda (DVT) , coagulación intravascular diseminada (DIC) , síndrome coronario agudo, o cáncer con evidencia de coagulopatía en un paciente, que comprende el administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo según la reivindicación 1, al paciente.

17. Un método para regular la respuesta inflamatoria en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo según la reivindicación 1 al paciente.

18. El método según la reivindicación 17, en donde la respuesta inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de sepsis, injertos de piel de venas, y trasplantes de órganos .

19. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo puede ser utilizado para formar un recubrimiento no trombogénico sobre la superficie de un dispositivo médico, en donde el dispositivo médico entra en contacto con la sangre .

20. Un equipo, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1.

21. Un equipo, que comprende secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo según la reivindicación 1.

22. Una composición de terapia génica, que comprende la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, que codifica para el anticuerpo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3; en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de terapia génica.

23. Un anticuerpo anticoagulante, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple que se enlaza con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que a TF solo, y en donde el anticuerpo no compite por el enlace a TF con FVII y FX.

24. El anticuerpo según la reivindicación 23, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

25. Una secuencia polinucleotídica que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 23, en donde la secuencia polinucleotídica comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.