RS102404A

RS102404A - Nova antitela koja ciljaju tkivni faktor kao antikoagulanti

Info

Publication number: RS102404A
Application number: YU102404A
Authority: RS
Inventors: David Light; Kirk Mclean
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2006-12-15
Also published as: PT1503785E; WO2003092602A2; TW200307043A; AU2003225256B2; ZA200409692B; ATE427121T1; JP2005532045A; CN1665526A; DK1549341T3; KR101013697B1; ES2354419T3; PT1549341E; DE60326970D1; US7622457B2; AR039515A1; MXPA04010851A; ECSP045468A; NZ536242A; ECSP045467A; KR20050045944A

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na nova antitela koja se vezuju sa većim afinitetom za faktor VIIa/tkivo faktor (FVIIa/TF) kompleks neko samo za tkivo faktor (TF), ne takmiče se za vezivanje za TF sa FVII i FX, i inhibiraju aktiviranje FX. Antitela se vezuju na položaju povrede i sprečavaju iniciranje tromboze. Antitela se mogu upotrebiti za lečenje različitih trombotičnih stanja uključujući ali ne limitirajući na duboku vensku trombozu, razdvojenu intravaskularnu koagulaciju, i akutni koronarni sindrom.

Description

NOVA ANTITELA KOJA CILJAJU TKIVO FAKTOR KAO

ANTIKOAGULANTI

Ova prijava se poziva na U.S. Provisional Application Serial No. 60/376,566, podnesenu 1 .maja 2002.godine koja je vode u celini inkorporisana putem reference.

STANJE TEHNIKE

Održavanje odgovarajućeg balansa između prokoagulantne i antikoagulantne aktivnosti u okviru krvnog suda je esencijalna za normalnu hemostazu (Davie, E.W. et al. (1991)Biochemistry,30(43): 10363-10370). Remećenje balansa ka koagulaciji vodi do tromboze, koja može da izazove srčani udar, šlog, pulmonalnu emboliju, i venoznu trombozu. Postoji potreba za efektnijim i sigurnijim antikoagulantima za lečenje specifičnih trombotičnih poremećaja.

Tkivo faktor ("TF") je glikoprotein transmembrane koji je glavni inicijator koagulacione kaskade (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 180-184). Pod normalnim fiziološkim uslovima aktivni TF nije u kontaktu sa krvi. Tokom vaskularne povrede, izlaganje trombocita subendotelijalnog TF i kolagena vodi do aktivacije faktora koagulacije i trombocita i potom do hemostatičkog formiranja čepa. Izloženi TF deluje kao kofaktor za faktor Vila ("FVIIa") katalizovanu aktivaciju faktora IX

("FIX") i faktora X ("FX"), kritične komponente kompleksa unutrašnje tenaze i protrombinaze, svakog posebno. Ovo vodi do brzog formiranja FXa i trombina. Trombin onda čepa fibrinogen u fibrin, koji potom polimerizuje da se formira fibrin ugrušak. Neodgovarajuća indukcija TF ekspresije u različitim kliničkim podešavanjima može da vodi do opasne po život tromboze i/ili da doprinese patološkim komplikacijama. Za TF izlaganje praćeno sa prekidanjem koluta se veruje da je odgovorno za trombotičku okuiziju koja vodi do akutnog miokardijačkog ir.fakrta i sloga.

U ovim podešavanjima, proinflamatorne signalne putanje aktivirane sa faktorima koagulacije takođe doprinose formiranju edema i povećanoj veličini infarkta. Vaskularna povreda povezana sa angioplastikom vodi do regulisanja na više TF na SMC-ove za šta se veruje da izaziva ćelijske signalne putanje povezane sa restenozom. TF prekomerna ekspresija kod • kancera i gram-negativne sepse vodi do opasne po život tromboze i aktivacije inflamatornih putanji.

FVIIa/TF kompleks je umešan u patogeni mehanizam kod različitih trombotičnih bolesti i cirkulacioni nivo TF je faktor rizika za određene pacijente. FVIIa i TF igraju jedinstvene uloge kod vaskulame povrede u održavanju hemostaze i iniciranju tromboze. TF se ekspresuje u spoljašnji omotač normalno, ali je podešen naviše i ekspresovan neodgovarajuće u medijumu i neointimi kod vaskularne bolesti. TF ekspresija na aterosklerotičnim pločama se ovećava iz krvi putem tanke fibrozne kape koja može da se prekine i izloži dejstvu TF. Hirurške intervencije kao što je balon angioplastika, postavljanje stenta, ili endarterektomija oštećuje zid suda i izlaže dejstvu ispod postavljeni TF. U aterosklerotičnoj, bogatom lipidom, sa tankim zidom pločici, spontani prekid ili endotelijalna erozija vodi do izlaganja dejstvu TF i tromboze, rezultirajući i nestabilnoj angini ili miokardiačkom infarktu. TF može da cirkuliše u ćelijski izvedenim mikročesticama i cirkulišući TF nivoi se pojačavaju u nestabilnu anginu, sugerišući da ovaj cirkulišući TF može da doprinese formiranju tromboze (Soejima, H. et al. (1999)Circulation99(22):2905-2913). Često je kancer povezan sa hiperkoagulativnim stanjem pripisanom prekomernoj ekspresiji TF na ćelije tumora. Ovo predisponira pacijenta ka dubokoj venskoj trombozi, pulmonalnoj emboliji i niskom stepenu rasejane intravaskularne koagulacije ("DIC"). DIC rezultira u uklanjanju mikrovaskularnog fibrina što doprinosi prstanku rada više organa.

Na proteinima bazirani antikoagulanti koji ciljaju TF uključuju TF neutrališuća antitela, faktor Vila aktivnim položajm inhibiran ("FVIIai"), inhibitor putanje faktora tkiva ("TFPI"), i Nematoda antikoagulant faktor (''NAPC2"). Rezultati iz modela tromboze akutne arterijske povrede ukazuju da su na proteinu bazirani inhibitori FVIIa/TF efektivni antitrombotici, sa manje krvarenja nego sa heparinom, direktnim inhibitorima trombina, inhibitorima trombocita, i inhibitorima Fxa (Himber, J.eEtal. (2001)Thromb. Haemost.85:475-481; Harker, L.A. et al. (1995)Thromb. Haemost.74(1):464-472). Dodatno, FVIlarTF inhibicija je superiorna prema drugim antikoagulantima (n.pr. heparin, Fxa inhibitori) u sprečavanju neointimnog stanjivanja i vaskularne stenoze praćene balon povredom (Jang, Y. etal. (1995)Circulation92(10):3041-3050).

Inhibicija TF, FVIIa ili FVIIa/TF kompleksa je efikasan antitrombotički pristup za sprečavanje DIC i smanjenja smrtnosti u eksperimentalnim modlima sepse. TFPI analozi sprečavaju i tromboplastinom i endotoksinom-izazvani DIC kod zečeva (Day, K.C. et al. (1990)Blood76:1538-1545; Bregengard, C. Et al. (1993)Blood Coagul. Fibrinolysis4:699-706). Monoklonalna antitela spram FVIIa (Biemond, B.J. et al.

(1995)Thromb. Haemost.73:223-230) ili (Levi, M. Et al. (1994)J. Clin.

Invest.93:114-120) sprečavaju endotoksinom-izazvani DIC kod majmuna. TF neutrališuća antitela, FVIIai i TFPI, inhibiraju DIC i smanjuju smrtnost kob babun modela sa E. Coli-izazvanom sepsom (Creasev, A.A. et al.

(1993)J. Clin. Invest.91:2850-2860; Taylor, F.B. et al. (1991a)Blood

78:364-368; Tavlor, F.B. et al. (1991b)Circ. Shock 33:127-134;Tavlor, F.B. (1996)Haemostasis Suppl.1 26:83-91). Oba slobodni FXa i Wlla/TF/FXa kompleks su poznati da izazivaju proizvodnju proinflamatornih citokina koji su povezani sa povećanim rizikom smrti pacijenata sa sepsom (Rievvald, M. Et al. (2001)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 98:7742-7747). Interesantno je da, FVIIai prikazuju da snižavaju plazma nivoe IL-6 i IL-8 kod modela babuna (Tavlor, F.B. et al. (1998)Blood 91:1609-1615),sugerišući da FVIIa/TF inhibicija može da ima dodatna antiinflamatorna dejstva koja ne dele i ostali antikoagulantni mehanizmi.

Opisano je nekoliko antitela koja su efektivni antikoagulanti, koji se vezuju

da neutrališu biloTF ili FVIIa/TF kompleks ili oba (videti n.pr., Carson, S.D.'et al. (1985) Blood 66(1): 152-156; Tanaka, H. et al. (1985) Thromb. Res.

40(6):745-756; Kirchhofer, D. et al. (2000) Throomb. Haemost. 84(6);

1072-1081; Kirchhofer, D. etal. (2001) Biochemistrv 40(3):675-682;

Faelber, K. etal. (2001) J. Mol. Biol. 313:83-97; i U.S. Patent Nos. 5,506,134, 5,986,065, i 6,274,142). Antitela koja ciljaju TF ovog pronalaska su efektivni antikoagulanti koji poboljšavaju karakteristike prethodno opisanih TF antitela. Posebno, antitela pronalaska se vezuju sa većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF, i ne takmiče se sa FVII ili FX za vezivanje na TF.

SUŠTINA PRONALASKA

Sadašnji pronalazak obezbeđuje antitela, koja se dejstvuju kao antikoagulanti, koja se vezuju sa većim afinitetom za faktor Vila/tkivo faktor ("FVIIa/TF") kompleks nego samo za tkivo faktor ("TF"). U jednoj realizaciji, antitela pronalaska se vezuju sa bar 2 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF, mereno ogledom mikrokalorimetrije.U pretpostavljenoj realizaiciji, antitela pronalaska sevezujusa bar5putavećim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF. U još poželjnijoj realizaciji, antitela pronalaska se vezuju sa bar 10 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF. U sedećoj realizaciji, antitela pronalaska se ne takmiče za vezivanje za TF sa jednim ili više faktora koagulacije odabranih od grupe koja se sastoji od faktora VII ("FVM"), IX ("FIX"), i X ("FX"). U pretpostavljenoj realizaciji, antitela pronalaska se ne takmiče za vezivanje na TF sa FVII i sa FX. U još poželjnijoj realizaciji, antitela pronalaska se vezuju sa većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF i ne takmiče se za vezivanje za TF sa FVII i sa FX.

Antikoagulantno antitelo ovog pronalaska silja i vezuje se za FVIIa/TF kompleks na položaju povrede i inhibira aktiviranje faktora X ("FX"), tako sprečavajući formiranje tromboze, i prema tome ponaša se efektivno kao antikoagulant u lečenju određenih bolesti uključujući, ali ne limitirajući na, sepsu, raširenu intravaskularnu koagulaciju, ishemični moždani udar, duboku vensku trombozu, akutne koronarne sindrome, trombotične komplikacije praćene posle angioplastike, i koagulopatiju kod uznapredovalog kancera. Dalje, antitelo ima upotrebu kod mikrovaskulame operacije, presada kože i vene, i transplanta organa.

U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje sastave koji sadrže predmetna antitela.

U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak zaštite pacijenta spram formiranja tromba koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine antitela ovog pronalaska navedenom pacijentu, i prema tome inhibiranja generisanja trombina bez direktnog uticanja na druge parametre osim koagulacije, kao što je aktiviranje i sakupljanje trombocita.

U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak smanjivanja i lečenja duboke venske tromboze ("DVT") ili raširene intravaskularne koagulacije ("DIC") ili akutnog koronarnog sindroma ili kancera sa podacima koagulopatije kod pacijenta koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine antitela pronalaska navedenom pacijentu.

U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak regulisanja inflamatornog odgovora kod pacijenta koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine antitela pronalaska navedenom pacijentu.

U još jednom aspektu, antitelo pronalaska može se upotrebiti da se formira ne-trombogenična obloga na površini medicinskih uređaja koji dolaze u kontak sa krvlju.

U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na pribor koji sadrži antitelo pronalaska koje se vezuje za FVIIa/TF kompleks. Alternativno, pribor može sadržati DNK sekvence koje kodiraju komponente antitela.

Takođe su otkriveni postupci za pravljenje antitela pronalaska, i rekombinantnih i sintetičkih.

OPISSLIKA

Slika 1. Aktivnost TF-vezujućih jedno-lančanih antitela u ogledu hidrolize sTF/FVIIa peptida. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida se obavlja kao što je opisano pod Primer4 upotrebom ravnotežne smeše FVIIa (5 nM) i sTF (10 nM), zasnovano na afinitetu FVIIa za sTF (KD(app) = -10 nM). Hidroliza hromogenog supstrata peptida S2266 se prati kao što je opisano. Naznačene su konačne koncentracije bakterijski ekspresovanih jedno-lančanih antitela, i kontrolnih proteina FVIIai (FVIIa inaktiviran sa hlorometilketon peptidom, PPACK) i Mab#4504 (American Diagnostica).

Slika 2. Vezivanje scFv(TF)3e10 za sTF povećava očigledani afinitet sTF za FVIIa. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida se obavlja kao što je opisano u Primeru 4 upotrebom 2 nM FVIIa u prisustvu i odsustvu 800 nM

bakterijski ekspresovanog scFv(TF)3e10. sTF se titrira u ogledu i utvrđuje se brzina cepanja supstrata hromogenog peptida S2266. KDočigledan za sTF se izračunava upotrebom standarnog podudaranja 4-parametra.

Slika 3. Aktivnost TF-vezujućih jedno-lančanih antitela u ogledu protrombinskog vremena (PT). PT ogled se obavlja kao što je opisano u Primeru 4 upotrebom rekombinantnog humanog tromboplastina (Dade, Inc.) koji sadrži humani TF pune dužine u mehurićima fosfolipida. Naznačene su konačne koncentracije bakterijski ekspresovanih jedno-lančanih antitela i kontrolnog proteina FVIIai.

Slika4.Merenje očiglednog afiniteta vezivanja scFv(TF)3e10 za sTF. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida se obavlja kao što je opisano u Primeru 4 upotrebom 3 nM sTF i 2 nM FVIIa. Koncentracija sTF koja se upotrebljava se ispod KDza vezivanje za FVIIa. Bakterijski ekspresovan scFv(TF)3e10 se dodaje pri povećanim koncentracijama i povećana brzina reakcije se upotrebljava da se utvrdi očigledan KDovog antitela za sTF upotrebom standarnog poklapanja 4-parametra. Afinitet scFv(TF)3e10 za sTF/FVIIa kompleks (KD(app) = 65 nM) je veći nego afinitet scFv(TF)3e10 za sTF mereno upotrebom BlAcore (KD(app) = 470 nM).

Slika5. Merenje afiniteta vezivanja scFv(TF)3e10 za TF i FVIIa/TF

■ XWI ■ l^lWl>w. ~ • —j ~a.w_ .j_ j_ „ komnleks OvaiOaled rn\\ <rn\ <a\ rir\ rnetr\] ei se nhavlipi kan što nni?ann ii Primeru 4 upotrebom scFv(TF)3e10 ekspresovanog u CHO ćelije. Ovaj ogled pokazuje da scFv(TF)3e10 i~20 puta veći afinitet za sTF/FVIIa kompleks ("Kompleks") nego za sTF ("Slobodni TF").

Slika 6.Zavisno scFv(TF)3e10 doza inhibira aktiviranje FX. Ogled aktiviranja FX se obavlja kao što je opisano u Primeru 4 upotrebom povećanih koncentracija bakterijski eskpresovanih scFv(TF)3e10, 250 nM FX, i FVIIa/TF kompleksa an fosfolipidnoj površini (10 pM FVIIa). IC50predstavlja dozu koja se zahteva da se postigne 50% maksimalne inhibicije.

Slika7. Nekompetitivno scFv(TF)3e10 inhibira aktiviranje FX sa FVIIa/TF kompleksom. Ogled aktiviranja FX se obavlja kao što je opisano u Primeru 4 upotrebom bakterijski ekspresovanih scFv(TF)3e10, 25 nM do 400 nM FX, i FVIIa/TF kompleksa na fosfolipidnoj površini (10 pM FVIIa). Povećane koncentracije scFv(TF)3e10 se titriraju u ogledu (0 nM, beli kvadratić; 0,25 nM, beli romb; 0,74 nM, beli trougao, 2,2 nM, beli kružić; 6,7 nM, crni romb, 20 nM, crni trougao). Ovaj Lineweaver-Burk nacrt (1/[S], gdeje S (supstrat) = faktor X (u.M); spram 1/v, gde je v (przina) = mOD/min od S2222 hidrolize sa FXa proizvedenim tokom 5. minutnog intervala) ukazuje da je scFv(TF)3e10 nekompetativni inhibitor u pogledu supstrata, FX. Sve linije presecanja na (ili blizu) x-ose su predviđene za nekompetativni inhibitor (za kompetativni inhibitor sve linije bi se presecale na y-osi).

Slika8. scFv(TF)3e10 je efikasan uin vivomodelu raširene intravaskularne koagulacije ("DIC"). TF-antitelo scFv(TF)3e10 ekspresovanog u CHO ćelijama se procenjuje u modelu tromboembolije kod pacova u Primeru 6 za (A) procenat smrtnosti i (B) bolesno stanje-smrtnost rezultat. (A) U sa nosačem tretiranoj grupi, upotrebljena doza TF rezultira u 60% smrtnosti (LD60). scFv(TF)3e10 pri 0,7 nmol/kg nema uticaja na smrtnost, ali pri 7,0 nmol/kg smanjuje smrtnost do <40%. (B) U sa nosačem tretiranoj grupi,in vivodoza TF rezultira u prosečnom rezultatu bolesno stanje-smrtnost od 2,6. scFv(TF)3e10 pri 0,7 nmol/kg nema uticaja na smrtnost i malo ili nikakvo dejstvo na respiratorni bol, ali pri 14 nmol/kg, prosečan rezultat bolesno stanje-smrtnost se smanjuje do~1,5.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Antikoagulantno antitelo sadašnjeg pronalaska je antitelo koje se vezuje sa većim afinitetom za faktor Vila/tkivo faktor ("FVIIa/TF") kompleks nego samo na tkivo faktor ("TF"). Antitelo pronalaska se vezuje sa bar 2 pute većim afinitetom, pretpostavljeno bar 5 puta većim afinitetom, i poželjnije sa bar 10 puta većim afinitetom, za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF. Antitelo pronalaska takođe se ne takmiči za vezivanje za TF sa jednim ili više faktora koagulacije odabranih od grupe koja se sastoji od Faktora VII

("FVII"), faktora IX ("FIX"), i faktora X ("FX"). Pretpostavljeno, antitelo pronalaska se ne takmiči za vezivanje za TF sa FVII i sa FX.

Definicije:

U opisivanju sadašnjeg pronalaska, sledeći pojmovi su definisani kao što je dole naznačeno.

"Rekombinantni proteini ili polipeptidi" se odnose na proteine ili polipeptide proizvedene putem rekombinantnih DNK tehnika, odnosno, proizvedenih iz ćelija, mikrobskih ili sisarskih, transformisanih sa egzogenim DNK konstruktom koji kodira željeni polipeptid. Proteini ili polipeptidi ekspresovani u najvećem broju bakterijskih kultura će biti oslobođene od glikana. Proteini ili polipeptidi ekspresovani u kvascu mogu imat8i različit obrazac glikozilacije od onih ekspresovanih u sisarskim ćelijama.

"Matični" proteini ili polipeptidi se odnosi na proteine ili polipeptide dobijene iz izvora koji se pojavljuje u prirodi. Pojam "matično antitelo" će takođe uključiti prirodno nastala antitela i njihove fragmente.

DNK "kodirajuća sekvenca" je DNK sekvenca koja se transkribuje na mRNK i prevodi u polipeptid u ćeliji domaćina kada se postavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence su utvrđene početnim kodonom na 5' N-završetku i kodonom za prekid prevođenja na 3' C-završetku. Kodirajuća sekvenca može da uključi prokariotske sekvence, cDNK iz eukariotske mRNK, genomne DNK sekvence iz eukariotske DNK, i sintetičke DNK sekvence. Sekvenca za prekid transkripcije će uobičajeno biti locirana 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu.

"Nukleotidna sekvenca" je heteropolimer deoksiribonukleotida (baze adenin, gvanin, timin, ili citozin). DNK sekvence koje kodiraju antitela ovog pronalaska mogu biti sakupljene iz sintetičkih cDNK-izvedenih DNK fragmenata i kratikh oligonukleotid linkera da se dobije sintetički gen koji je sposoban da bude ekspresovan u rekokombinantni ekspresioni vektor. U razmatranju strukture određenih dvostruko-vlaknastog DNK molekula, sekvence mogu biti ovde opisane prema normalnoj konvenciji dajući samo sekvence u 5' do 3' pravaca duž netranskribovanog vlakna cDNK.

"Rekombinantni ekspresioni vektor" je DNK konstrukt koji se može replicirati i koristi se bilo da pojača ili da ekspresuje DNK kodiranje antitela sadašnjeg pronalaska. Ekspresioni vektor sadrži DNK kontrolne sekvence i kodirajuće sekvence. DNK kontrolne sekvence uključuju promoter sekvence, položaje vezivanja ribozoma, signale poliadenilacije, sekvence za prekid transkripcije, uzlazno regulatorne domene i pojačivače. Rekombinantni ekspresioni sistemi kako su ovde definisani će ekspresovati antitela posle indukcije regulatornih elemenata.

"Transformisane ćelije domaćina" se odnosi na ćelije koje su transformisane i izmenjene infekcijom sa egzogenom DNK. Egzogena DNK može ili ne mora biti integrisana (kovalentno povezana) za hromozomsku DNK sačinjavajući genom ćelije. U prokariotima i kvascu, na primer, egzogena DNK se može održati na epizomskom elementu, kao što je plazmid ili stabilno integrisana u hromozomski DNK. U pogledu eukariotskih ćelija, stabilno transformisane ćelija je jedna u kojoj egzogena DNK postaje integrisana u replikaciju hromozoma. Ova stabilnost je demonstrirana sposobnošću eukariotskih ćelijskih linija ili klonova da proizvedu populaciju ćelija ćerki koje sadrže egzogenu DNK.

Pojmovi "analog", "fragment", "derivat", i "varijanta", kada se odnose na antitela pronalaska znače analoge, fragmente, derivate i varijante antitela koje zadržavaju suštinski istu biološku funkciju ili aktivnost, kao što je dole dalje opisano.

"Analog" uključuje pro-polipeptid koji u okviru toga uključuje, sekvencu amiiiu imocin ic ai imuia uiuy jji ui iaiaoi\a. ni\n vi iu ai uiitiu uvuy yji ui iaiaoi\cJ može se cepati iz dodatnih amino kiselina da se završi stvaranje molekula pro-antitela putem prirodnih,in vivopostupaka ili putem postupaka poznatim stručnjacima iz ove oblasti nauke kao što su enzimsko i hemijsko cepanje.

Na primer, rekombinantni scFV(TF)3e10 polipeptid (SEQ ID NO:1) se ekspresuje kao 282 pro-polipeptid amino kiseline koji se onda procesuirain vivoda se oslobodi 264 aktivni zreli polipeptid amino kiseline.

"Fragment" je deo antitela pronalaska koji zadržava suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost, kao što je prikazano uin vitroogledima ovde otkrivenim kao što je opisano dole u daljem tekstu.

"Derivat" uključuje sve modifikacije antitela ovog pronalaska koji suštinski čuvaju funkcije koje su ovde otkrivene i uključuje dodatnu strukturu i zavisnu funkciju, n.pr. PEGilovano antitelo koje ima veći polu-život, i biotinilovana antitela, kao što je dole u daljem tekstu opisano. Derivat takođe uključuje N- ili O-povezana glikozilovana antitela koja mogu biti generisana umetanjem N- ili O-položaja glikolizacije u sekvencu antitela putem standardne rekombinantne DNK tehnologije.

"Suštinski slična funkcionalna aktivnost" i "suštinski ista biološka funkcija ili aktivnost" svaki znači daje stepen biološke aktivnosti koja je u okviru 30% do 100% ili više od biološke aktivnosti koja se demonstrira polipeptidom sa kojim se upoređuje kada je biološka aktivnosti svakog polipeptida utvrđena istim postupkom ili ogledom. Na primer, antitelo koji ima suštinski sličnu

funkcionalnu aktivnost sa antitelom iz Primera 1 (SEQ ID NO:1) je ono koja, kada se testira u ogledima hidrolize sTF/FVIIa peptida i FX aktivacije opisanim u Primeru 4, demonstrira sposobnost da se vezuje i neutrališe FVIIa/TF kompleks.

"Sličnost" između polipeptida se utvrđuje upoređivanjem sekvence amino kiseline i njenih konzervisane zamena amino kiseline polipeptida prema sekvenci drugog polipeptida. Takve konzervativne supstitucije uključuju one opisane gore uThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5od strane Dayhoff-a (1978) i od strane Argos-a (1989) EMBO J. 8:779-785. Na primer, amino kiseline koje pripadaju jednoj od sledećih grupa predstavljaju konzervativne promene:

"Antitelo" kako se to ovde koristi uključuje intact molekule imunoglobulina ("Ig"), kao i njihove fragmente, kao što su Fab, F(ab')2, i Fv, koji su sposobni da vezuju epitop odabranog ciljanog proteina, na primer, rastvorljivi TF ("sTF"). Tipično treba bar 6, 8, 10 ili 12 dodirnih amino

kiseline da se formira epitop. Pa ipak, epitopi koji uključuju ne-dodirne amino kiseline mogu zahtevati više, n.pr. bar 15, 25 ili 50 amino kiselina.

Svi ostali tehnički pojmovi koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje kao što se uobičajeno upotrebljavaju od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke kojima sadašnji pronalazak i pripada.

/ Vntitoja pronalaska i njihovo cjsnsrisanžs.

Antikoagulantna antitela ovog pronalaska se vezuju sa većim afinitetom za faktor Vila/tkivo faktor ("FVIIa/TF") kompleks nego samo za tkivo faktor ("TF"). U pretpostavljenoj realizaciji, antitela pronalaska se vezuju sa bar 2 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF, poželjnije vezuju se sa bar 5 puta većim afinitetom, još poželjnije vezuju se sa bar 10 puta većim afinitetom mereno ogledom kalorimetrije. U sledećoj pretpostavljenoj realizaciji, antitela pronalaska se takođe ne takmiče za vezivanje za TF sa jednim ili više faktora koagulacije odabranih od grupe koja se sastoji od faktora VII ("FVII"), IX ("FIX"), i X ("FX"). U još poželjnijoj realizaciji, antitela pronalaska se ne takmiče za vezivanje na TF sa FVII i sa FX. U najpoželjnijoj realizaciji, antitela pronalaska se vezuju sa većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF i ne takmiče se za vezivanje za TF sa FVII i sa FX.

Generalno govoreći, antitelo koje se specifično vezuje za odabrani ciljani protein (n.pr., FVIIa/TF kompleks ili TF) obezbeđuje detekcioni signal bar 5-, 10-, ili 20-puta veći neko detekcioni signal obezbeđen sa drugim proteinima kada se koriste u imunohemijskom ogledu. Pretpostavljeno, antitela koja se vezuju specifično za odabrani ciljani protein ne detektuju druge proteine u imunohemijskom ogledu i mogu da imuno talože ciljani protein iz rastvora.

Odabrani ciljani protein se može upotrebiti da imunizira sisara, kao što je miš, pacov, zec, zamorče, majmun ili čovek da se proizvedu poliklonalna antitela. Ukoliko se to želi, ciljani protein može biti konjugovan za protein nosač, kao što je volovski serum albumin, tiroglobulin, i prilepak za praćenje hernocijanin. U zavisnosti od vrste domaćina, različiti adjuvant: se mogu upotrebiti da povećaju imunološki odgovor. Takvi adjuvanti uključuju, ali nisu limitirani na, Freund-ov adjuvant, mineralne gelove (n.pr., aluminijum hidroksid), i površinski aktivne supstance (n.pr., lizolecitin, pluronski polioli, polianjoni, peptidi, uljane emulzije, prilepak za praćenje hernocijanin, i dinitrofenol). Među adjuvantima koje se koriste kod ljudi, posebno su korisni BCG( bacilli Calmette- Guerin)iCornybacterium

parvum.

Monoklonalna antitela koja se vezuju specifično na odabrani ciljani protein mogu se pripremiti upotrebom tehnike koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela putem kontinuiranih ćelijskih linija u kulturi. Ove tehnike uključuju, ali nisu limitirane na, hibridoma tehniku, humanu B-ćelija hibridoma tehniku, i EBV-hibridoma tehniku (Kohleretal. (1985)Nature256:495-497; Kozboret al. (1985)J. Immunol. Methods81:31-42; Cote et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:2026-2030; i Cote et al. (1984)

Mol. CellBiol. 62:109-120).

Dodatno, mogu se upotrebiti tehnike razvijene za proizvodnju "himeričnih antitela", splicing mišjih antitelo gena za humane antitelo gene da se dobije molekul sa odgovarajućom antigen specifičnošću i biološkom aktivnošću (Morrison et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855; Neubergeretal. (1984)Nature312:604-608; Takeda etal. (1985)Nature314:452-454). Monoklonalna i druga antitela mogu se "humanizovati" da se spreči kod pacijenta sklapanje imunog odgovora spram antitela kada se upotrebljava terapeutski. Takva antitela mogu biti dovoljno slična u sekvenci sa humanim antitelima da se mogu direktno upotrebiti ili mogu zahtevati menjanje nekoliko ključnih ostataka. Razlike u sekvenci između antitela glodara i humanih sekvenci mogu biti minimizirane zamenomostataka kojiserazlikujuodonih kod humanihsekvenci putem mutageneze usmerene na položaj individualnih ostataka ili putem presađivanja selih regiona koji određuju komplementarnost. Alternativno, humanizovana antitela mogu se proizvesti upotrebom rekombinantnih postupaka, kao što je opisano u GB2188638B. Antitela koja se vezuju specifično na odabrani ciljani protein mogu sadržati antigen-vezujuće položaje koji su bilo delimično ili u potpunosti humanizovani, kao što je otkriveno u U.S. Patent-u 5,565,332.

Alternativno, tehnike opisane za proizvodnju jedno-lančanih antitela mogu biti adaptirane upotrebom postupaka poznatih u nauci da se proizvedu jedno-lančana antitela ("scFv") koja se vezuje specifično na odabrani ciljani protein. Antitela sa odnosnom specifičnošću, ali sa različitim idiotipskim sastavom, mogu biti generisana putem povlačenja lanca iz nasumičnih kombinatornih Ig biblioteka (Burton (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:11120-11123).

Jedno-lančana antitela mogu takođe da se konstruišu upotrebom DNK postupka pojačavanja, kao što je PCR, upotrebom hibridoma cDNK kao uzorka (Thirion etal. (1996)Eur. J. CancerPrev.5:507-511). Jedno-lančana antitela mogu biti mono- ili bispecifična, i mogu biti bivalentna ili tetravalentna. Konstrukcija tatravalentnih, bispecifičnih jedno-lančanih antitela se uči, na primer, kod Coloma and Morrison (1997)Natl. Biotechnol.15:159-163. Konstrukcija bivalentnih, bispecifičnih jedno-lančanih antitela se uči kod Mallendar and Voss (1994)J. Biol. Chem.269:199-216.

Nukleotidna sekvenca koja kodira jedno-lančano antitelo može biti konstruisana upotrebom manualne ili automatizovane sinteze nukleotida, klonirana u ekspresioni konstrukt upotrebom standarnih rekombinantnih DNK postupaka, i uvedena u ćeliju da ekspresuje kodirajuću sekvencu. Alternativno, jedno-lančana antitela mogu biti proizvedena direktno upotrebom, na primer, tehnologije izlaganja filamentne fage (Verhaar et al.

(1995)Int. J.Cancer61:497-501; i Nicholis et al. (1993)J. Immunol. Meth.165:81-91).

Antitela koja se vezuju specifično na odabrani ciljani protein mogu biti takože proizvedena putem izazivanjain vivoproizvodnje u populaciji limfocita ili putem pretraživanja Ig biblioteka ili panela krajnje specifičnih reagensa za vezivanje kao što je otkriveno u literaturi (Orlandi et al.

(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833-3837, VVinter et al. (1991)Nature349:293-299).

DNK koja kodira antitelo pronalaska može biti klonirana u cDNK ili u genomskom obliku butem bilo kog postupka kloniranja poznatog stručnjacima iz ove oblasti nauke. Videti na primer, Sambrook, J.F. et al.

(1989)MolecularCIoning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv (1989), koje je ovde inkorporisano putem reference).

U slučaju gde je antitelo monoklonalno antitelo, kada se identifikuje DNK sekvenca koja kodira Fv region koji kada se ekspresuje pokazuje specifičnu aktivnost vezivanja, antitela koja sadrže taj Fv region mogu biti pripremljena postupcima poznatim stručnjacima iz ove oblasti nauke. Tako, na primer, Chaudharv, V.K.et al. (1989)Nature339(6223): 394-397; Batra, J.K. et al. (1990)J. Biol. Chem.265(25): 15198-15202; Batra, J.K. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86(21 ):8545-8549; Chaudharv, V.K. et. al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87(3): 1066-1070, svi inkorporisani putem reference, opisuju pripremanje različitih proteina JVMI IW I 14 I I W—4 I I ^ V^l III LVIM.

U pretpostavljenom pristupu, TF-vezujuća antitela pronalaska su jedno-lančana antitela, koja se pripremaju upotrebom izložene biblioteke fage. Epitop-vezujući region jedno-lančanog antitela je sačinjen od dva varijabilna domena: jedna od teškog lanca i drugi od lakog lanca. U prvom koraku konstruisanja izložene biblioteke fage, varijabilni geni (VH(od IgM) V«i VL) su PCR klonirani iz potopljene mRNK od humane koštane srži, limfnog čvora i slezine upotrebom seta familije specifičnih prajmera. Rezultirajuće pCITE-VH(3,8 x 10<9>članova), pZ604-VK(1,6 x 10<7>) i pZ604-VL(3,2 x 10<7>) biblioteke predstavljaju permanentnu i visoku raznolikost V gena. VHgeni se onda pojačavaju iz pCITE-VHbiblioteke. VKi VLgeni se PCR pojačavaju iz pZ604-VKi pZ604-VLbiblioteke sa reversnim JHi linker sekvencom na 5' kraju. Gelom prečišćeni VH, VKi VLkoji sadrže PCR proizvode se onda upletene zajedno da se napravi raspored izlaganja scFv gena. Raspored izlaganja scFv se klonira na fagemid vektor pZ603, i proizvod ligacije se elektroporiše u kompetentne TG1E. colićelije da se generiše scFv izložene biblioteke fage, HuPhabL3, sa 5,2 x 10<9>individualnim transformantima (Kay, B.K et al. (1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. et al. (1991)J. Mol. Biol.222(3):581-597; Sheets, M.D. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95(11):6157-6162).

Odabire se TF-vezujuća faga od scFv izložene biblioteke fage, pojačava, i potom identifikuje upotrebom tehnika sa posudama koje su dobro poznate u nauci. Rastvorljivi TF je imobiliše u plastične cevčice, i može se upotrebiti ne-masno mleko da se smanje ne-specifično vezivanje na plastiku. Populacija scFv fage se izlaže imobilisanim sTF u plastičnim cevčicama, i nevezana faga se uklanja putem ekstenzivnog pranja. TF-vezujuca scFv fage se elutuju iz cevcica i potom pojačavaju infekcijom TG1E. colićelija u rastvoru. Ovaj postupak sa sudovima se ponavlja tri puta, i rezulitirajuće TF-vezujuće scFv fage se izoluju sa transformirajućim TG1 ćelijama. Transformanti koji ekspresuju TF-vezujuća antitela se identifikuju upotrebom standardnog ELISA sa sTF imobilisanim na plastici u posudama sa'96 bazenčića. DNK umetaka jedno-lančanog antitela ELISA-pozitivnih transformanata se sekvenciraju. Na osnovu DNK sekvenciranja, ovde je identifikovano 6 jedinstvenih jedno-lančanih antitela, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 i scFv(TF)3h2, i ekspresuju se i prečiste izE. coli,i karakterišu kao što je opisano u Primeru 5.

Ekspresija i prečišćavanje antitela pronalaska:

Postoji nekoliko načina da se ekspresuju rekombinantna antitela

pronalaskain vitro,uključujućiE. colibakulovirus, sisarske ćelije kvasca ili drugi ekspresioni sistemi. Dobro su poznati postupci ekspresije kloniranih gena u bakteriji. Da bi se obazbedio visok nivo ekspresije kloniranih gena u prokariotskom sistemu, osnovno je konstruisati vektore ekspresije koji sadrže, minimum, jak promoter da usmeri mRNK završetak transkripcije. Primeri regulatornih regiona odgovarajućih u ovu svrhu su promoter i operator regionE. colibeta-glukozidaza gena,E. colitriptofan biosintetička

putanja, ili promoter nalevo od fage Lambda. Uključivanje selekcionih markera u DNK vektore transformisane uE. coli jekorisno. Primeri takvih markera uključuju gene koji specifikuju otpornost na ampicilin, tetraciklin ili hloramfenikol.

Od viših eukariotskih ćelijskih sistema korisnih za ekspresiju antitela pronalaska, i njihovih analoga, fragmenata, derivata i varijanti, postoje brojni ćelijski sistemi od kojih se može odabirati. Ilustrativni primeri sisarskih ćelijskih linija uključuju ali nisu limitirani na RPMI 7932, VERO i HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka(CHO), WI38, BHK, COS-7, C127 ili MDCK ćelijske linije. Pretpostavljene sisarske ćelijske linije su CHL-1. Kada se CHL-1 upotrebljava uključuje se higromicin kao eukariotski selekcioni marker. CHL-1 ćelije su izvedene iz RPMI 7032 melanoma ćelija, već dostupne humane ćelijske linije. CHL-1 ćelijska linija je deponovana kod ATCC u skladu sa uslovima Budampeštanskog sporazuma i označena je kao #CRL 9446, deponovana 18. juna 1987. godine. Odgovarajuće ćelije za upotrebu u ovom pronalasku su komercijalno dostupne od ATCC. Ulustrativne ćelijske linije uključujuSpodoptera frugiperdai6omoyx mori.

Prokariotski sistem,E. coli,nije u stanju da učini post-translacione modifikacije, kao što je glikozilacija. Dodatno, proteini sa kompleksom disulfid uzoraka su često pogrešno savijeni kada se ekspresuju uE. coli.Sa prokariotskim sistemom, ekspresovani protein je ili prisutan u ćelijskoj citoplazmi u nerastvorljivom takozvanom obliku uključenog tela, pronađenim u rastvorljivoj frakciji pošto se ćelija lizuje, ili je usmeren u periplazmu dodavanjem odgovarajućih sekvenci sekrecionog signala. Ukoliko je ekspresovani protein u nerastvoljivim uključenim telima, obično se zahteva rastvaranje i potonje ponovno uvijanje uključenih tela.

Mnogi prokariotski ekspresioni vektori su poznati stručnjacima u nauci kao što su pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švedska), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA), i pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA), koji su komercijalno dostupni.

Promoteri koji se uobičajeno upotrebljavaju u rekombinantnim mikrobskim ekspresionim sistemima uključuju beta-laktamaza (penicilinaza) i laktoza promoter sistem (Chang, A.C. etal. (1978)Nature275(5681 ):617-624; Goeddel, D.V. et al. (1979)Nature281(5732):544-548), triptofan (trp) promoter sistem (Goeddel, D.V. et al. (1980)Nucl. Acids Res.8(18):4057-4074) i tac promoter (Maniatis, T. Et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv (1982)). Sledeći korisni bakterijski ekspresioni sistem upošljava lambda fage pL promoter i cits857 represor koji se može termo izazvati (Bernard, H.U. et al. (1979)Gene5(1):59-76; Love, CA. et al. (1996)Gene176(1-2):49-53). Rekombinantna antitela mogu takođe biti ekspresovana u domaćinima kvascima kao što suSaccharomyces cerevisiae.To uobičajeno daje sposobnost da se rade različite post-translacione modifikacije. Ekspresovano antitelo može biti sekretovano u u kulturu površinskog sloja gde nema mnogo drugih proteina, čineći prečišćavanje lakšim. Vektori kvasca za ekspresiju antitela ovog pronalaska sadrže određene neophodne karakteristike. Elementi kvasca uključuju poreklo od replikacione sekvence (ARS), markera koji odabirljiv, promoter, i transkripcioni terminator.

Odgovarajući promoteri u vektorima kvasca za ekspresiju uključuju promotere TRP1 gena, ADH1 ili ADHII gena, kiseli fosfataza (PH03 ili PH05) gen, izocitohrom gen, ili promoter uključen sa glikolitičkom putanjom, kao što je promoter enolaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GADPH), 3-fosfolicerat kinaza (PGK), heksokinaza, piruvat kinaza, tirosefosfat izomeraza i fosfoglukoza izomaraza (Hitzeman, R.A. etal.(1980) J. Biol. Chem.255(24): 12073-12080; Hess. B. Etal.

(1968)J. Adv. Enzyme Reg.7:149-167; i Holland, M.J. i Holland, J.P.

(1978)Biochemistn/17(23):4900-4907).

Komercijalno dostupni vektori kvasca uključuju pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcĐE-1 (VVashington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC #67255), i YpGX265GAL4 (ATCC # 67233). Sisarske ćelijske linije uključuju ali nisu limitirane na COS-7, L ćelije, C127, 3T3, jajnik kineskog hrčka (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO, i HEK293 i mogu biti uposlene da ekspresuju rekombinantna antitela u ovom pronalasku. Rekombinantni proteini proizvedeni u sisarskim ćelijama su normalno rastvorljive i glokozilovane i imaju autentični N-završetak. Sisarski ekspresioni vektori mogu sadržati ne-transkribovane elemente kao što su poreklo replikacije, promoter i pojačivač, i 5' ili 3' neprevedene sekvence kao što su položaji vezivanja ribozoma, položaj poliadenilacije, akceptor položaj i upleteni davalac, i transkripcione sekvence terminacije. Promoteri za upotrebu u sisarskim vektorima ekspresije uobičajeno su na primer viralni promoteri kao što su Polioma, Adenovirus, HTLV, Simian Virus 40 (SV 40), i humani citomegalovirus (CMV).

U zavisnosti od sistema ekspresije i odabranog domaćina, homogeno rekombinantno antitelo može se dobiti upotrebom različitih kombinacija konvencionalne hromatografije upotrebljene za prečišćavanje proteina. Ovo uključuju: hromatografiju imunoafiniteta, hromatografuju reversne faze, hromatografija razmene katjona, hromatografija razmene anjona, hromatografija hidrofobične interakcije, hromatografija gel filtriranja, i HPLC. Ukoliko sistem ekspresije sekretuje antitelo u medijum rasta, protein može biti prečišćen direktno iz medijuma. Ukoliko antitelo nije sekretovano, izoluje se iz ćelijskih lizata. Ćelijski prekid može biti učinjen putem bilo kog konvencionalnog postupka, uključujući cikluse zamrznuto-odmrznuto, sonikacije, mehanički prekid, ili uz pomoć sredstava za ćelijsko lizovanje.

Plazmid konstrukt zasnovan na pCANTAB5 (Pharmacia) se upotrebljava za bakterijsku ekspresiju jedno-lančanih antitela ovog pronalaska. Na primer, plazmid koji sadrži jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 je pZ612/3e10 i kodira sekvencu jedno-lančanog antitela praćeno sa e-označenom sekvencom, koja se može upotrebiti da se prečisti protein. Sekvenca amino kiseline scFv(TF)3e10 antitela korespondira sa SEQ ID NO:1 (Primer 1), a DNK sekvenca koja kodira scFv(TF)3e10 korespondira sa SEQ ID NO:2.

Plazmid konstrukt zasnovan na pTHR525 (videti U:S. Patent Br. 5,827,824) se upotrebljava za sisarsku ekspresiju jedno-lančanih antitela ovog pronalaska. Na primer, prajmeri se dizajniraju da generišu DNK fragmenta koji zahvataju pro-scFv(TF)3e10 sekvencu amino kiseline, uključijući N-krajnju signalnu sekvencu i C-krajnju e-označenu sekvencu, u bakterijski ekspresioni plazmid. PCR se izvodi da se generiše DNK fragment koji je umetnut u sisarski ekspresioni plazmid, koji sadrži gen otporan na ampicilin, i higromicin i DHFR selekcione markere. Ekspresija jedno-lančanih antitela pronalaska se vodi putem MPSV LTR promotera.

U pretpostavljenoj realizaciji ovog pronalaska, sisarski ekspresioni konstrukti se izmene infekcijom u CHO DXB11 ćelijama. Stabilne populacije se odabiru upotrebom 400 (ig/mL higormicina B u HAMS/F12 midijum. Nivoi ekspresije su otprilike 500 u.g/L. Da se povećaju nivoi ekspresije odabire se populacija upotrebom 100 nM metotreksata u alfa MEM medijumu. Aproksimativni nivo ekspresije ove populacije je 5 mg/L.

Antitela ovog pronalaska mogu biti prečišćena postupcima dobro poznatim u nauci. Na primer, antitela mogu biti prečišćena po afinitetu prolaskom preko kolone na koju je TF vezan. Vezana TF-antitela mogu onda biti elutovana iz kolone upotrebom pufera sa visokom koncentracijom soli.

Ovde opisana jedno-lančana antitela sadrže e-označenu sekvencu na C-završetku proteina. Anti-e-označene kolone afiniteta se kupuju od American/Pharmacia Biotech. Medijum ćelijske kulture se filtrira kroz 0,22 \ irh filter i puni u 5 mL e-označenu kolonu pri 2 mL/min. Kolona se opere sa 0,2 M fosfat puferom 0,05% NaN3, pH 7,0, i potom sakuplja u cevčice koje sadrže 0,1 zapremine 1M Tris pufer, pH 8,2 da se neutrališe elucioni pufer. Alternativno, filtrirani medijum kulture se puni na protein A kolonu. U ovom slučaju, kolona se opere sa 50 mM limunovom kiselinom, 300 mM NaCI, pH 6,5 i elutuje sa istim puferom pri pH 3,0. U oba slučaja, prečišćeni uzorci se potom pune na Sephadex 200 kolonu da se odvoji monomerni od dimernih oblika antitela.

Odabiranje antitela pronalaska:

Jednom kada su antitela generisana, espresovana i prečišćena, mogu se dalje karakterisati upotrebom BlAjezgra, ogledom od sTF zavisnog faktora Vila (ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida), ogledom aktivacije FX, i PT ogledom opisanom u Primeru 4 da bi se identifikovala antitela ovog pronalaska.

U pretpostavljenoj realizaciji ovog pronalaska, TF-vezujuća scFv antitela koja se vezju za većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF se odabiru upotrebom ogleda hidrolize sTF/FVIIa peptida. U ovom ogledu, od TF-antitela koja se vezuju sa većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego za TF se očekuje da povećaju KD(app). Slika 2 pokazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 povećava KD(app.)-5-puta. Ogled mikrokalorimetrije se upotrebljava da se izmeri afinitet TF-antitela za FVIIa/TF kompleks upoređeno sa samim TF. Slika 5 pokazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 ima KDvezivanja za FVIIa/TF kompleks i slobodni TF od 600 nM i 33 nM, svaki posebno, što korespondira sa -20-puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks upoređeno samo sa TF. Antitela ovog pronalaska imaju bar 2-puta, pretpostavljeno 5-puta, i poželjnije bar 10-puta veći afinitet za FVIIa/TF kompleks nego za TF.

TF-vezujuća scFv antitela, koja se ne takmiče sa FVII za vezivanje za TF se odabiru upotrebom ogleda hidrolize sTF/FVIIa peptida. U ovom ogledu, od TF-antitela koja se takmiče sa FVIIa za vezivanje za TF se očekuje da inhibiraju hidrolizu hromogenog supstrata s2266. Slika 1 pokazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 ne inhibira, već u stvari povećava, FVIIa aktivnost.

TF-vezujuća scFv antitela koja inhibiraju FX aktiviranje su odabrana upotrebom PT ogleda i ogleda FX aktiviranja. U PT ogledu, od TF-antitela koja prolongiraju PT se očekuje da inhibiraju TF aktiviranje. Slika 3 prikazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 prolongira PT, ukazujući da ovo antitelo inhibira FX aktiviranje. U ogledu FX aktiviranja, od TF-antitela koja inhibiraju FXa aktivnost se očekuje da inhibira hidrolizu hromogenog supstrata S2222. Slika 6 prikazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 inhibira FXa aktivnost.

TF-vezujuća scFv antitela koja se ne takmiče sa FX za vezivanje za TF su odabrana upotrebom ogleda FX aktiviranja. U ovom ogledu, od TF-antitela koja nisu kompetativna sa FX se očekuje da inhibiraju FX aktiviranje nezavisno od koncentracije FX koja se upotrebljava. Slika 7 prikazuje da jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 inhibira FXa aktivnost na od FX koncentracije nezavisan način.

U pretpostavljenoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, jedno-lančano antitelo (scFv(TF)3e10) se identifikuje a koje ima jedan VH/VLpoložaj vezivanja za TF. Sekvenca amino kiseline scFv(TF)3e10, je pikazana u Primeru 1 i korespondira sa SEQ ID NO:1. DNK sekvenca koja kodira scFv(TF)3e10 korespondira sa SEQ ID NO:2.

Analozi, fragmenti, derivati i verijante antitela pronalaska:

Analog, fragment, derivat ili varijanta antitela sadašnjeg pronalaska mogu biti: (i) jedan u kome su jedan ili više ostataka amino kiseline supstituisani sa konzervisanim ili nekonzervisanim ostatkom amino kiseline (pretpostavljeno konzervisanim ostatkom amino kiseline) i takav supstituisani ostatak amino kiseline može ili ne mora biti onaj koji je kodiran putem genetičkog koda; ili (ii) jdan u kome jedan ili više ostataka amino kiseline uključuje supstituent grupu, ili (iii) jedan u kome je zrelo antitelo spojeno sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje koja povećava polu-život antitela (na primer, polietilen glikol), ili (iv) jedno u kom su dodatne amino kiseline spojene za zrelo antitelo, kao što su vodeća ili sekreciona sekvenca ili sekvenca koja se upošljava za prečišćavanje zrelog antitela. Takvi analozi, fragmenti, derivati, i varijante se smatraju da su u okviru stručnjaka iz ove oblasti nauke iz ovde datih učenja.

Pretpostavljeno, derivati sadašnjeg pronalaska će sadržati konzervativne supstitucije amino kiseline (dalje u donjem tekstu definisane) sačinje na jednom ili više predviđenih, pretpostavljeno ne-esencijalnih ostataka amino kiseline. "Ne-esencijalni" ostatak amino kiseline je ostatak koji može biti zamenjen iz sekvence divljeg tipa proteina bez druge biološke aktivnosti, pri čemu se zahteva "esencijalni" ostatak amino kiseline za biološku aktivnost. "Supstitucija konzervativne amino kiseline" je ona u kojoj je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kiseline koja ima sličan bočni lanac. Familije ostataka amino kiseline koje imaju slične bočne lance su definisane u nauci. Ove familije uključuju amino kiseline sa osnovnim bočnim lancima (n.pr., lizin, arginin, histidin), kiseli bočni lanci (n.pr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenapunjeni polarni bočni lanci (n.pr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (n.pr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-račvasti bočni lanci (n.pr., treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (n.pr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Nekonzervisane supstitucije neće biti napravljene za konzervisane ostatke amino kiseline ili za ostatke amino kiseline koje se nalaze u okviru konzervisanog protein domena, osim ukoliko se supstitucije ne čine u svrhu odabiranja za varijante antitela kao što je dalje dole opisano. Fragmenti ili biološki aktivni delovi uključuju fragmente polipeptida koji odgovaraju za upotrebu kao medikament, kao reagens za proučavanje, i slično. Fragmenti uključuju peptide koji sadrže sekvence amino kiseline dovoljno slične sa ili izvedene iz sekvenci amino kiseline antitela ovog pronalaska i prikazuju bar jednu aktivnost tog polipeptida, ali koji uključuju manje amino kiselina nego polipeptidi pune dužine koji su ovde otkriveni.

Šta više, pretpostavljeni derivati sadašnjeg pronalaska uključuju zrela antitela koja su spojena sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje za povećanje polu-života polipeptida i/ili smanjenje potencijalne imunogeničnosti polipeptida (na primer, polietilen glikol, "PEG"). PEG se može upotrebiti da daju rastvorljivost u vodi, veličinu, sporu brzinu čišćenja bubrega, i smanjenu imunogeničnost prema antitelu. Videti n.pr., U.S.

Patent 6,214,966. U slučaju PEGilacija, spajanje antitela za PEG može se postići prvo uvođenjem cistein mutacije u antitelo, praćeno sa po položaju specifičnom dervitaizacijom sa PEG-maleimidom. Cistein može biti dodat C-završetku peptida. Videti, n.pr., Tsutsumi et al. (2000)Proc. Natl. Sci. USA97(15):8548-8553. Sledeća modifikacija koja može biti načinjena antitelu uključuje biotinilaciju. U određenim instancama, može biti korisno da se ima biotinilovano antitelo tako da može spremno da reakuje sa streptavidinom. Postupci biotinilacije proteina su dobro poznati u nauci. Dodatno, polođžaji N- ili O-glikolizacije mogu biti uvedeni u sekvence antitela tako da post-translaciona N- ili O-povezana glikozilacija antitela može nastatiin vivo.

Varijante antitela ovog pronalaska uključuju polipeptide koji imaju sekvencu amino kiseline dovoljno sličnu sekvenci amino kiseline originalnih antitela. Pojam "dovoljno sličnu" znači da prva sekvenca amino kiseline sadrži dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih ostataka amino kiseline u odnosu na drugu sekvencu amino kiseline tako da prva i druga sekvenca amino kiseline imaju zajednički strukturalni domen i/ili zajedničku funkcionalnu aktivnost. Na primer, sekvence amino kiseline koje sadrže zajedinički strukturalni domen koji je bar 45%, pretpostavljeno 75% do 98% identičan, su ovde definisane kao dovoljno slične. Pretpostavljeno, varijante će biti dovoljno slične sekvenci amino kiseline pretpostavljenih antitela ovog pronalaska. Varijante uključuju varijante antitela koje su kodirane od strane polinukleotida koji hibridizuje na polinukleotid ovog pronalaska ili njegov komplement pod strogim uslovima. Takve varijante generalno zadržavaju funkcionalnu aktivnost antitela ovog pronalaska. Biblioteke fragmenata polinukleotida mogu biti upotrebljene da se generišu raznolike populacija fragmenata za pretraživanje i potonje odabiranje. Na primer, biblioteka fragmenata može biti generisana tretiranjem dvostruko-vlaknastog PCR fragmenta polinukleotida sa nukleazom pod uslovima gde dolazi do slaganja samo oko jedanput po molekulu, denaturišući dvostruko-vlaknaste DNK, ponovo naturišući DNK da se formira'dvostruko-vlaknasta DNK koja može da uključi sens/antisens parove iz različito složenih proizvoda, uklanjajući jedno-vlaknaste delove iz reformisanih dupleksa tretmanom sa S1 nukleazom, i ligatovanjem rezultirajuće biblioteke fragmenta u vektor ekspresije. Ovim postupkom, može se izvesti biblioteka ekspresije koja kodira N-završetak i unutrašnje fragmente različitih veličina antitela ovog pronalaska.

Varijante uključuju antitela koja se razlikuju u sekvenci amino kiseline usled mutageneze. Na primer, mutageneza može biti obavljena prema rekombinantnim DNK tehnikama dobro poznatim u nauci da se modifikuju VL i VHdomeni Ig lakih i teških lanaca da se kreiraju varijante koje imaju povećani afinitet vezivanja za FVIIa/TF kompleks upoređeno sa slobodnim TF. Posebno pretpostavljene varijante uključuju antitela sa modifikacijama u okrviru regiona koji utvrđuju komplementarnost VLi VHdomena. Varijante takođe uključuju antitela koja se razlikuju u sekvenci amino kiseline usled umetanja ili uklanjanja ostataka amino kiseline putem mutageneze. Na primer, mutageneza može biti obavljena prema rekombinantnim DNK tehnikama dobro poznatim u nauci da se umetnu ili uklone amino kiseline u N-završetak ili C-završetak delovima VHili VLdomena Ig lakih ili teških lanaca da se kreiraju varijante koje zadržavaju suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost. Posebno pretpostavljene varijante uključuju jedno-lančana antitela sa umetcima ili uklanjanjima ostataka amino kiseline u VH-VLlinkeru između VHi VLdomena. VH-VLlinker sekvenca u jedno-lančanom antitelu opisana u Primeru 1 je 5 ostataka amino kiseline u dužini. Biće očigledno da druge kratke linker sekvence, od 0 do 20 amino kiselina mogu biti upotrebljene, pri čemu antitelo zadržava suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost. Modifikacije postojećeg VH-VLlinkera mogu biti usmerene u povećavanju stabilnosti dimernog oblika jedno-lančanog antitela.

U jednoj realizaciji, raznolika biblioteka varijanti se generiše kombinatornom mutagenezom na nivou nukleinske kiseline i kodira se putem biblioteke raznolikih gena. Raznolika biblioteka varijanti može biti proizvedena sa, na primer, enzimski ligatovanjem smeše sintetičkih oligonukleotida u sekvencama gena tako da se degenerisani set potencijalnih varijanti sekvenci amino kiseline može ekspresovati kao individualni polipeptidi, ili, alternativno, kao set većih spojenih proteina (na primer, izložba fage) koji sadrži unutra set sekvenci. Postoje različiti postupci koji se mogu upotrebiti da se proizvedu biblioteke potencijalnih varijanti iz degenerisane oligonukleotid sekvence. Hemijska sinteza degenerisane gen sekvence može biti obavljena u automatskom DNK sintetizeru, i sintetički gen potom ligatovan u odgovarajući vektor ekspresije. Upotreba degenerisanog seta gena dopušta snabdevanje, u jednoj smeši, svih sekvenci koje kodiraju željeni set potencijalnih sekvenci varijanti. Postupci sintetizovanja degenerisanih oligonukleotida su poznati u nauci (videti, n.pr., Narang (1983)Tetrahedron39:3; Itakura et al.

(1984a)Annu. Rev. Biochem.53:323; Itakura et al. (1984b)Science198:1056; Ike etal.(1983) Nucleic Acid Res.11:477).

Nekoliko tehnika je poznato u nauci za pretraživanje gen proizvoda kombinatornih biblioteka sačinjenih putem mutacija ili odsecanja, i za pretraživanje cDNK biblioteka za gen proizvode koji imaju odabranu osobinu. Takve tehnike se mogu adaptirati za brzo pretraživanje biblioteke gena generisanih putem kombinatorne mutageneze antitela za TF- ili FVIIa/TF kompleks-vezujuću aktivnost ili FX aktiviranja inhibitorne aktivnosti. Najšire korištene tehnike, koje su podložne analizi visoke propustljivosti za pretraživanje velikih gen biblioteka tipično uključuju kloniranje gen biblioteke u vektore ekspresije koji se mogu replicirati, transformisanje odgovarajućih ćelija sa rezultujućom biblotekom vektora i ekspresovanje kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti potpomaže izolovanje vektora koji kodira gen čiji je proizvod detektovan. Rekurzivna ansambl mutageneza (REM), tehnika koja pojačava frekvenciju funkcionalnih mutanata u bibliotekama, može biti upotrebljena u kombinaciji sa ogledima pretraživanja da se identifikuju željene varijante.

Primer 1 opisuje sekvencu amino kiseline jednog TF-vezujućeg jedno-lančanog antitela, scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1), i opisuje VH-VL linker i VHi VLdomene. Varijante koja imaju TF- ili FVIIa/TF kompleks-vezujuću aktivnost ili inhibiraju FX aktiviranje mogu biti identifikovane putem pretraživanja kombinatornih biblioteka mutanata, na primer umetnuti, odsečeni ili mutanti tačke, antitela ovog pronalaska upotrebom hidrolize sTF/FVIIa peptida ili ogledima FX aktiviranja opisanih u Primeru 4. Antitela sadašnjeg pronalaska uključuju antitela iz Primera 1 i 3 (SEQ ID Nos:1 i 3), kao i ona antitela koja imaju iz toga nesupstancijalne varijacije u sekvenci. "Nesupstancijalna varijacija" uključuje bilo koju sekvencu, supstituciju, ili uklanjanje varijante koje održava suštinski bar jednu biološku funkciju antitela ovog pronalaska, n.pr., sposobnost da inhibira FX aktiviranje. Ovi funkcionalni ekvivalenti mogu pretpostavljeno uključiti antitela koja imaju bar oko 90% identičnost sa VLili VHregion domenima jedno-lančanog antitela iz SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3, i poželjnije bar oko 97%o identičnost sa VLili VHregion domenima jedno-lančanog antitela iz SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3, i takođe uključuju delove takvog antitela koje ima suštinski istu biološku aktivnost. Pa ipak, bilo koje antitela koje ima nesupstancijalnu verijaciju u sekvenci amino kiseline od antitela SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3 koje demonstrira funkcionalnu ekvivalentnost kao što je dalje ovde opisano je uključeno u opis sadašnjeg pronalaska.

Farmaceutski sastavi:

Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske sastave koji se mogu davati pacijentu da se postigne terapeutsko dejstvo. Farmaceutski sastavi ovog pronalaska mogu biti pripremljeni za davanje kombinovanjem antitela ovog pronalaska koja imaju željeni stepen čistoće i famraceutski efektivnu količinu sa fiziološki prihvatljvim nosačima.

Antitela sadašnjeg pronalaska mogu biti upotrebljena u farmaceutskim sastavima, za intravenozno davanje ili potkožno davanje ili intratekalno davanje. Tako će gore opisana antitela pretpostavljeno biti kombinovana sa prihvatljivim sterilnim farmaceutskim nosačem, kao što je peto-procentna dekstroza, laktatovani Ringer-ov rastvor, normalni slani rastvor, sterilna voda, ili bilo koji drugi komercijalno pripremljeni fiziološki pufer rastvor dizajniran za intravenoznu infuziju. Razume se da će odabiranje rastvora nosača i doze i davanja sastava varirati sa subjektom i određenim kliničkim podešavanjem, i da će se njime upravljati standarnim medicinskim procedurama.

U skladu sa postupcima sadašnjeg pronalaska, ovi farmaceutski sastavi mogu biti davani u količinama koje su efektivne da inhibiraju patološke konsekvence povezane sa viškom generisanja trombina u subjektu.

Davanje antitela može biti putem bolus intravenoznog ubrizgavanja, putem konstantne intravenozne infuzije ili putem kombinovanja oba pravca. Alternativno, ili dodatno, antitelo pomešano sa odgovarajućim vezivnim sredstvima može biti unešeno u cirkulaciju iz intramuskularnog položaja. Sistemski tretman sa antitelom može se pratiti utvrđivanjem aktiviranog delimičnog tromboplastin vremena (PT) na serijama uzoraka krvi uzetih od pacijenta. Vreme koagulacije primećeno u ovom ogledu se produžava kada se dovoljan nivo antitela postigne u cirkulaciju.

Rekombinantna antitela i farmaceutski sastavi ovog pronalaska su korisni za parenteralno, topično, intravenozno, oralno i lokalno davanje. Farmaceutski sastavi mogu biti davani u različitm jediničnim oblicima doza u zavisnosti od postupka davanja. Na primer, jedinični oblici doza mogu biti dati u obliku uključujući ali ne limitirajući na, tablete, kapsule, puder, rastvore, i emulzije.

Rekombinantna antitela i farmaceutski sastavi ovog pronalaska su posebn korisni za intravenozno davanje. Sastavi za davanje će uobičajeno sadržati rastvor jedno-lančanog antitela rastvoren u farmaceutski prihvatljivom nosaču, pretpostavljeno u vodenom nosaču. Različiti vodeni nosači se mogu upotrebiti, n.pr., puferovani slani rastvor i slično. Ovi rastvori su generalno oslobođeni od neželjene materije. Ovi sastavi mogu biti sterilizovani putem konvencionalnih, dobro pozantih tehnika sterilizacije.

Tipični farmaceutski sastav za intravenozno davanje može biti lako utvrđen od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke. Količine koje se daju su jasno protein specifične i zavise od njegove potentnosti i farmakokinetičkog profila. Aktuelni postupci za pripremanje sastava koji se mogu parenteralno davati će biti poznati ili očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke i opisani su detaljnije u takvi publikacijama kao što jeRemington' s Pharmaceutical Science,15<th>ed., Mack Publishin Compahv; Easton, Pa

(1980).

Sastavi koji sadrže sadašnja antitela pronalaska ili njihov koktel (odnosno, sa drugim proteinima) mogu biti davani kao terapeutski tretmani. U terapeutskim primenama, sastavi se daju pacijentu koji pati od poremećaja ili bolesti krvarenja u količini dovoljnoj leči ili barem delimično zaustavi krvarenje. Količina adekvatna da se ovo postigne je definisana kao "terapeutski efektivna količina". Efektivne količine za ovu upotrebu će zavisiti od ozbiljnosti bolesti i opšteg stanja pacijentovog zdravlja.

Jedinično ili višestruko davanje sastava može biti dato u zavisnosti od doze i frekvencije koja se zahteva i toleriše od strane pacijenta. U bilo kom slučaju, sastav treba da obezbedi dovoljnu količinu proteina ovog pronalaska da efektivno leči pacijenta.

Antitela pronalaska, ili njihovi farmaceutski prihvatljivi sastavi, se daju u terapeutski efektivnoj količini, koja će varirati u zavisnosti od različitih faktora uključujući aktivnost specifičnog antitela koje je uposleno; metabolitičke stabilnosti i dužine dejstva antitela; starosti, telesne težine, opšteg stanja zdravlja, pola i dijete pacijenta; načina i vremena davanja; brzine ekskrecije; kombinacije leka; ozbiljnosti određene bolesti-stanja; i domaćina koji je podvrgnut terapiji. Generalno, dnevna terapeutski efektivna količina je od oko 0,14 mg do oko 14,3 mg/kg telesne težine na dan antitela pronalaska, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog sastava; pretpostavljeno od oko 0,7 mg do oko 10 mg/kg telesne težine na dan; i najpoželjnije od oko 1,4 mg do oko 7,2 mg/kg telesne težine na da. Na primer, za davanje osobi koja ima težinu od 70 kg, raspon doze će biti od 10 mg do oko 1,0 g na dan antitela pronalaska, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog sastava, pretpostavljeno od oko 50 mg do oko 700 mg na dan, i najpoželjnije od oko 100 mg do oko 500 mg na dan.

Ćelijskai genskaterapija:

Antitelo pronalaska može biti uposleno u skladu sa sadašnjim pronalaskom putem ekspresije takvog antitelain vivopostupkom koji se naziva "elijska terapija". Tako, na primer, ćelije mogu biti izgrađene sa polinukleotidom (DNK ili RNK) koji kodira antiteloex vivo,i izgrađene ćelije se onda obezbeđuju za pacijenta da bude tretiran sa antitelom. Takvi postupci su dobro poznati u nauci. Na primer, ćelije mogu biti izgrađene postupcima pozantim u nauci upotrebom retroviralne čestice koja sadrži RNK koja kodira antitelo sadašnjeg pronalaska.

Antitelo pronalaska može takođe biti uposleno u skladu sa sadašnjim pronalaskom ekspresijom takvog antitelain vivopostupkom koji se naziva "genska terapija". Tako, na primer, virus može biti izgrađen sa polinukleotidom (DNK ili RNK) koji kodira antitelo, i izgrađeni virus se onda obezbeđuje za pacijenta da bude tretiran sa antitelom. Takvi postupci su dobro pozanti u nauci. Na primer, rekombinantni adenovirusi mogu biti izgrađeni postupcima poznatim u nauci koji sadrže DNK koja kodira antitelo sadašnjeg pronalaska.

Lokalna isporuka antikoagulantnih antitela sadašnjeg pronalaska upotrebom ćelijske ili genske terapije može obezbediti terapeutsko sredstvo za ciljanu oblast, entodelijalne ćelije koje oblažu krvne sudove.

Razmatrane su iin vitroiin vivometodologije ćelijske i genske terapije. Poznato je nekoliko postupaka za transfer potencijalno terapeutskih gena definisanim ćelijskim populacijama. Videti, n.pr., Mulligan (1993)Science260:926-931. Ovi postupci uključuju: 1) Direktni transfer gena. Videti, n.pr. VVolff etal. (1990)Science247:1465-1468; 2) Lipozomom-posredovani DNK transfer. Videti, n.pr., Caplen et al. (1995)Nature Med.3:39-46; Crvstal (1995)Nature Med.1:15-1; Gao i Huang (1991)Biochem. Biophys. Res. Comm.179:280-285; 3) Retrovirusom-posredovani DNK transfer. Videti, n.pr., Kay et al. (1993)Science262:117-119; Anderson (1992)Science256:808-813. 4) DNK virusom-posredovani DNK transfer. Takvi DNK virusi uključuju adenoviruse (pretpostavljeno Ad2 ili Ad5 zasnovane vektore), herpes viruse (pretpostavljeno herpes simpleks virus zasnovani vektor), i parvoviruse (pretpostavljeno "defektne" ili ne-autonomne parvovirus zasnovane vektore, poželjnije

adeno-povezani virus zasnovani vektori, najpoželjnije AAV-2 zasnovani vektori). Videti, n.pr., Ali et al. (1994)Gene Therapy1:367-384; U.S. Patent 4, 797,368, inkorporisan ovde putem reference, i U.S. Patent 5,139,941, inkorporisan ovde putem reference.

Izbor određenog vektorskog sistema za transferisanje gena od interesa će zavisiti od različitih faktora. Jedan važan faktor je priroda ciljane ćelijske populacije, lako su retroviralni vektori ekstenzivno proučavani i upotrebljavani u brojnim primenama genske terapije, ovi su vektori generalno neodgovarajući za inficiranje ne-deljivih ćelija. Dodatno, retrovirusi imaju potencijalnu onkogeničnost. Pa ipak, skoriji uspesi na polju lentiviralnih vektora mogu da ponište neke od ovih limitacija. Videti Naldini et al. (1996) Science 272:263-267.

Retrovirusi iz kojih ovde i gore pomenuti retroviralni plazmid vektori mogu biti izvedeni uključuju, ali nisu limitirani na, Molonev mišji virus leukemije, nekroza virus slezine, retroviruse kao što su Rous virus sarkoma, Harvev virus sarkoma, virus avian leukoza, virus leukemije gibon majmuna, humani virus imunonedostatka, adenovirus, Mijeloproliferativni virus sarkoma, sisarski virus tumora. U jednoj realizaciji, retroviralni plazmid vektor se izvodi iz Molonev mišjeg virusa leukemije.

Adenovirusi imaju prednost da imaju širok raspon domaćina, mogu inficirati nepokretne ili krajnje diferencirane ćelije, kao što su neuroni ili hepatociti, i pojavljuju se generalno ne-onkogeno. Videti, n.pr., Ali etal. (1994),supra,p. 367. Izgleda da se adenovirusi ne integrišu u genomu domaćina. Pošto postoje ekstrahromozomno, rizik mutageneze umetanjem je uveliko

smanjena. Ali et al. (1994)supra.p. 373.

Adeno-povezani virusi prikazuju slične prednosti kao adenovirus-zasnovani vektori. Pa ipak, AAV-ovi prikazuju položajem specifičnu integraciju na humani hromozom 19 (Ali et al. (1994)supra,p. 377).

U pretpostavljenoj realizaciji, DNK koja kodira antitela ovog pronalaska se upotrebljava u ćelijskoj i genskoj terapiji za poremećaje uključujući, ali ne limitirajući na, duboku vensku trombozu, razdvojenu intravaskularnu koagulaciju, akutni koronarni sindrom ili kancer sa dokazom koagulopatije.

Prema ovoj realizaciji, ćelijska ili genska terapija sa DNK koja kodira antitela ovog pronalaska se obezbeđuje pacijentu kome je neophodna, zajedno sa, ili neposredno posle dijagnoze.

Vešt stručnjak će ceniti da bilo koji odgovarajući vektor genske terapije koji sadrži DNK koja kodira antitelo pronalaska ili DNk koja kodira analoge, fragmente, derivate ili varijante antitela pronalaska može biti upotrebljen u skladu sa ovom realizacijom. Poznate su tehnike konstruisanja takvog vektora. Videti, n.pr., Anderson, W.F. (1998)Nature392:25-30; Verma I.M. i Somia, N. (1998)Nature389:239-242. Uvođenje antitela DNK koji sadrži vektor na ciljani položaj može biti postignuto poznatim tehnikama.

Vektor ćelijske ili genske terapije uključuje jedan ili više promotera. Odgovarajući promoteri koji se mogu uposliti uključuju, ali nisu limitirani na, retroviralni LTR; SV40 promoter; i humani citomegalovirus (CMV) promoter opisano kod Miller et al. (1989)Biotechniques7(9):980-990. ili bilo koji drugi promoter (n.pr., ćelijski promoteri kao što su eukariotski ćelijski promoteri uključujući, ali ne limitirajući na, histon, pol III, i p-aktin promotere). Drugi viralni promoteri koji mogu biti uposleni uključuju, ali nisu limitirani na, adenovirus promotere, timidin kinaza (TK) promotere, i B19 parvovirus promotere. Odabiranje odgovarajućeg promotera će biti očigledno stručnjacima iz ove oblasti nauke iz tehnika koje se ovde sadrže.

Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antitelo sadašnjeg pronalaska je pod kontrolom od strane odgovarajućeg promotera. Odgovarajući promoteri koji se mogu uposliti uključuju, ali nisu limitirani na, adenoviralne promotere, kao što je adenoviralni glavni kasni promoter; ili heterologe promotere, kao što je citomegalovirus (CMV) promoter; respiratorni sincitijalni virus (RSV) promoter; promotere koji se mogu indukovati, kao što je MMT promoter, metalotionein promoter; promoteri temperaturnog šoka; albumin promoter; ApoAI promoter; humani globin promoteri; viralni timidin kinaza promoteri, kao što je Herpes Simplex timidin kinaza promoter; retroviralni LTR-ovi (uključujući modifikovane retroviralne LTR-ove koji su ovde i u gornjem tekstu opisani); p-aktin promoter; i humani hormon rasta promoter.

Retroviralni plazmid vektor se upošljava da transdukuju pakovanje ćelijskih linija da se formiraju proizvodne ćelijske linije. Primeri ćelija za pakovanje koji mogu biti izmenjene infekcijom uključuju, ali nisu limitirani na, PE501, PA317, i]/-2, v)/-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2,\|/CRE, v|/-CRIP, GP+#-86, GP+envAm12, i DAN ćelijske linije kao što je opisano kod Miller (1990)Human Gene Therapy1:5-14, koji je uključen ovde putem reference u celosti. Vektor može transdukovati ćelije za pakovanje putem sredstava poznatih u nauci. Takva sredstva uključuju, ali nisu limitirana na, elktroporaciju, upotrebu lipozoma, i CaP04taloženje. U jednoj alternativi, retroviralni plazmid vektor može biti inkapsulirane u lipozom, ili sparen za lipid, i potom dat domaćinu. Proizvodne ćelijske linije generišu čestice retroviralnog vektora koje uključuju sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira polipeptide. Takve čestice retroviralnog vektora onda mogu biti uposlene, da transdukuju eukariotske ćelije, biloin vitroili in vivo. Transdukovane eukariotske ćelije će ekspresovati sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Eukariotske ćelije koje mogu biti transdukovane uključuju, ali nisu limitirane na, embrionalne stem ćelije, embrionalne ćelije karcinoma, kao i hematopoetične stem ćelije, hepatocite, fibroblaste, mioblaste, keratinocite, endotelijalne ćelije, i bronhijalne epitelijalne ćelije.

Rezličit pristup genskoj terapiji je "transkariotska terapija" pri čemu su pacijentove ćelije tretiraneex vivoda se izazovu pospani hromozomski geni da se proizvede protein od interesa posle reindukcije pacijentu. Transkariotska terapija podrazumeva da individua ima komplementarne gene neophodne za aktiviranje. Transkariotska terapija uključuje uvođenje promotera ili druge egzogene regulatorne sekvence sposobne da aktivira stvoreni gene, u hromozomsku DNK pacijentovih ćelija ex vivo, kultivišući i odabirajući aktivne protein-proizvodeće ćelije, i potom ponovnim uvođenjem aktiviranih ćelija u pacijenta nameru da tamo postanu u potpunosti uspostavljene. "Gen aktivirane" ćelije onda proizvode protein od interesa u nekoj značajnoj količini vremena, pretpostavljeno sve dok traje život pacijenta. U.S. Patent Nos. 5,641,670 i 5,733,761 otkrivaju detaljno ovaj koncept, i ovde su inkorporisani putem reference u celosti.

Pribori:

Pronalazak se dalje odnosi na pribore za istraživanje ili u dijagnostičke svrhe. Pribori tipično uključuju jedan ili više kontejnera koji sadrže antitela sadašnjeg pronalaska. U pretpostavljenoj realizaciji, pribori se sastoje od kontejnera koji sadrže jedno-lančana atnitela u obliku koji odgovara za derivatizaciju sa drugim molekulom. U još poželjnijoj realizaciji pribori se sastoje od kontejnera koji sadrže atnitelo SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3.

U sledećoj realizaciji, pribori mogu sadržati DNK sekvence koje kodiraju antitela pronalaska. Pretpostavljeno DNK sekvence koje kodiraju ova antitela se obezbeđuju u plazmidu koji je pogodan za transfekciju u i ekspresiju od strane ćelije domaćina. Plazmid može sadržati promoter (često promoter koji se može indukovati) da reguliše ekspresiju DNK u ćeliji domaćina. Plazmid može takođe sadržati odgovarajuće položaje restrikcije da se potpomogne umetanje drugih DNK sekvenci u plazmid da se proizvedu različita antitela. Plazmidi mogu takođe sadržati brojne druge elemente da potpomognu kloniranje i ekspresiju kodiranih proteina. Takvi elementi su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke i uključuju, na primer, markere koji se mogu odabirate, kodone za inicijaciju, kodone za prekidanje, i slično. U poželjnijoj realizaciji pribori se sastoje od kontrejnera koji sadrže DNK sekvence SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4.

Terapeutske indikacije:

Bolesti u kojima formiranje tromba igra značajnu etiološku ulogu uključuju infarkt miokarda, razdvojenu intravaskularnu koagulaciju, duboku vensku trombozu, pulmonalnu emboliju, ishemični šlog, septički šok, sindrom akutnog respiratornog bola, nestabilnu anginu i druga arterijska i venska okulzivna stanja. Antitela ovog pronalaska su korisna u svemu ovome, kao i kod drugih bolesti u kojima je formiranje tromba patološko. Druga patološka stanja gde antitelo ovog pronalaska može biti korisno uključuju kancer sa koagulopatijom i inflamacijom. Antitela mogu takođe da nađu primenu kod presađivanja kože i vena i kod transplantiranih organa. Pod korisnim se misli da su antitela korisna za lečenje, bolo da se bolest spreči ili da se spreči progresija kao pogoršanom stanju. Antitela ovog pronalaska takođe obezbeđuju sigurno i efektivno koagulantno sredstvo, na primer, kod pacijenata koji dobijaju bioproteze kao što su srčani ventili. Ova antitela mogu zameniti heparin i varfarin u lečenju, na primer, pulmonalne embolije ili akutnog infarkta miokarda. Antitela ovog pronalaska mogu takođe da nađu primenu u oblaganju medicinskih uređaja gde je problematično pitanje koagulacija.

Ogledi:

• Dostupni su brojni laboratorijski ogledi za merenjein vitroantikoagulantne aktivnosti antitela ovog pronalaska. Antikoagulantno dejstvo antitela može biti mereno upotrebom ogledima vremena zgrušavanja plazme kao što je aktiviranje parcijalnog tromboplastin vremena ("APTT"), vremena zgrušavanja trombina ("TCT") i/ili protrombinsko vreme ("PT"). Ovi ogledidistinguishizmeđu različitih mehanizama inhibicije koagulacije, i uključuju aktiviranje proteina C. Prolongiranje vremena zgrušavanja u bilo kom od ovih ogleda demonstrira da molekul može da inhibira koagulaciju u plazmi.

Gornji ogledi se upotrebljavaju da se identifikuju antitela sa antikoagulantnom aktivnošću koja su sposobna da vežu TF u oba prečišćena sistema i u miljeu plazme. Dalji ogledi se potom upotrebljavaju da se procene druge aktivnosti antitela pronalaska, kao što su trombinom katalizovano formiranje fibrina iz fibrinogena (Jakubovvski, H:V: et al.

(1986)J. Biol. Chem.261(8):3876-3882), inhibicija trombinskog aktivaciranja faktora V(Esmon, C.T. etal. (1982).J. Biol. Chem.257(14):7944-7947), ubrzana inhibicija trombina sa antitrombinom III i heparin kofaktorom II (Esmon, N.L. etal. (1983)J. Biol. Chem.258(20):12238-12242), inhibicija trombinskog aktiviranja faktora XIII (Polgar, J. et al. (1987)Thromb. Haemost.58(1). 140), inhibicija trombinom posredovanog inaktiviranja proteina S (Thompson, E.A. i Salem, H.H.

(1986)J. Clin. Inv.78(1): 13-17), i inhibicija trombinom posredovanog aktiviranja trombocita i agregacije (Esmon, N.L. et al. (1983),supra).

Sledeći ogledi, opisani detaljno u Primeru 4, se upotrebljavaju da se meriin vivopotencija iliin vitroafinitet vezivanja antitela pronalaska: 1) ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida; 2) ogled aktiviranja faktora X; 3) PT ogled; i 4) ogled mikrokalorimetrije.

U obavljanju postupaka sadašnjeg pronalaska naravno da se ima razumeti da upućivanje na određene pufere, medijume, reagense, uslove kulture i slično ne treba razumeti kao limitirajuće, već ih čitati na takav način da

uključuju sve povezane materijale koji stručnjak iz ove oblasti nauke može prepoznati kao od interesa ili vrednosti u određenom kontekstu u kojem je razmatranje prezentovano. Na primer, često je moguće supstituisati jedan sistem pufera ili medijum kulture za drugi i opet postići slične ili identične rezultate. Stručnjaci iz ove oblasti nauke koji imaju dovoljno znanja o takvim sistemima i metodologijama da mogu bez nepotrebnog eksperimentisanja učine takve supstitucije koje će optimalno služiti njihovoj svrsi u korišćenju postupaka i procedura koje su ovde otkrivene.

Sadašnji pronalazak će dalje biti opisan putem sledećih nelimitirajućih primera kao vodiča za asistiranje u praktičnoj primeni pronalaska. U primeni otkrića iz primera traba imati jasno u glavi da će se druge i različite realizacije postupaka otkrivenih prema sadašnjem pronalasku bez sumnje sugerisati stručnjacima iz ove oblasti nauke.

U prethodnom i primerima koji slede, sve temperature su podešene nekorigovane u stepenima Celzijusa i, svi delovi i procenti su maseni, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

Celokupno otkriće(a) svih primena, patenata i publikacija, koji su gore citirani su ovde inkorporisani putem reference.

Jedno-lančano anti-TF antitelo scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1) se sastoji od signalnog peptida (-18 do-1), VHdomena (1 do 126), VH-VLlinkera (127 do 131), VLdomena (132 do 246), i e-označene sekvence (247 do 264). ScFv(TF)3e10 DNK sekvenca (SEQ ID NO:2) kodira sekvencu amino kiseline SEQ ID NO:1.

Jedno-lančano anti-TF antitelo scFv(TF)3e10A (SEQ ID NO:3) se sastoji od signalnog peptida (-18 do -1), VHdomena (1 do 126), VH-VLlinkera (127 do 131), i VL domena (132 do 243). scFv(TF)3e10A se razlikuje od scFv(TF)3e10 sa uklanjanjem 3 amino kiseline (GAP) na N-završetku VL domena i uklanjanjem C-završetak e-označene sekvence. scFv(TF)3e10A DNK sekvenca (SEQ ID NO:4) kodira sekvencu amino kiseline SEQ ID NO:3.

PRIMER 3

Ekspresija anti-TF antitela u bakterijskim i sisarskim ćelijama

Šest različitih lanaca antitela, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 i scFv(TF)3h2, se identifikuju iz TF-vezujuće fage, prekomerno-ekspresovane uE. coli,i prečišćene na afinitet upotrebom e-označene kolone afiniteta kao što je gore opisano. Afiniteti šest prečišćenih antitela za sTF se mera upotrebom BlAjezgra, i potom se ova antitela karakterišu u ogledu hidrolize sTF/FVIIa peptida, aktiviranju FX, PT, i ogledima mikrokalorimetrije opisanim u Primeru 4, čiji su rezultati opisani u Primeru 5.

scFv(TF)3e10 antitelo (SEQ ID NO:1) se takođe ekspresuje u CHO ćelije. Plazmid ekspresije koji se sadrži u DNK sekvenci koja kodira scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:2) i oba higromicin B i DHFR selekcionim markerima. Originalno odabiranje se čini u 400 i^g/mL higromicina da se odabere populacija. Rezultirajuća populacija se onda podvrgava 100 nM metotreksat odabiranju. Tokom ovog odabiranja, ćelije koje imaju pojačane kopije regiona DNK koje sadrže selekcioni marker i ciljani gen se odabiru između populacije. Nivoi ekspresije se povećavaju iz otprilike 0,3 mg/L do oko 6 mg/L kao rezultat ovog odabiranja.

PRIMER 4

Oglediin vitropotencije i afiniteta vezivanja

1.Ogled hidrolizesTF/FVIIa peptida

Princip ovog ogleda je dole opisan. Tripeptid p-nitroanilid amid veza supstrata se hidrolizuje sa sTF/FVIIa kompleks. Oslobođeni proizvod hromofone, p-nitroanilid, se prati na 405 nm i koncentracija formiranog proizvoda po jedinici vremena se izračunava upotrebom molarnog koeficijenta izumiranja od 9920 m"<1>cm"<1.>IC50vrednosti (C) se utvrđuju putem umetanja inicijalnih odnosa u jednačinu sa 4 parametra: Y = (A-D)/(1+(x/C)<A>B)+D

Reagensi i rastvori:

1. Pufer ogleda: 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, 0,1%

BSA, pH 7,5

2. Humani FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): 10 x radni rastvor - pripremiti 20 nM rastvora u ogledu pufera pre

upotrebe.

3. Rastvorljivi TF (Berlex): 10 x radni rastvor - pripremiti 30 nM rastvora u ogledu pufera pre upotrebe. 4. Hromogeni supstrat S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Stok rastvor: 10 mM u H20, uskladišteno na 4 C, 2,5 x radni rastvor-pripremiti 2,5 mM rastvora u ogledu pufera pre upotrebe.

Uslovi ogleda:

Ogledi se obavljaju na mikrotiter ploči sa 96 bazenčića na sobnoj temperaturi. Konačne koncentracije komponenti su sledeće:

Postupak ogleda:

1. Pipetovati 0,1 ml_ 2,5x AB (ili pufer kontrola) u svaki bazenčić.

2. Dodati 0,025 mL 10x sTF i inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 3. Dodati 0,025 mL 10x FVIIa, inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 4. Dodati 0,1 mL 2,5x S2266 supstrat, trenutno transferisati ploču u čitač ploče i izmeriti kinetiku enzima na 405 nm u 10-sekundnom intervalu tokom 15 minuta.

Ovaj ogled se može upotrebiti da se meri očigledna KDvezivanja antitela pronalaska za sTF ili FVIIa/TF kompleks, i da se utvrdi da li se antitela pronalaska takmiče sa FVII za vezivanje za TF.

2. Ogled aktiviranja faktora X

Princip ovog ogleda je dole opisan. FVIIa se inkubira sa rekombinantnim humanim TF vezikulama da se formira kompleks proteaze sposoban za aktiviranje supstrata, FX. Ovaj kompleks je formiran u prisustvu (ili odsustvu) različitih koncentracija antitela, onda se supstrat FX uvodi i reakciji se dopušta da se nastavi da se formira proizvod, aktivna proteaza FXa, koja je sposobna da hidrolizuje p-nitroanilid amid vezu hromogenog supstrata S2222. Oslobođeni proizvod hromofore, p-nitroanilid, se prati na 405 nm i formirana koncentracija proizvoda po jedinici vremena se izračunava upotrebom molarnog koeficijenta izumiranja od 9920 M"<1>cm"<1>.. IC50vrednosti (C) se utvrđuju putem umetanja inicijalnih odnosa u jednačinu sa 4 parametra: Y = (A-D)/(1+(x/C)<A>B)+D

Reagensi i sastavi:

1. Pufer ogleda: 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, 0,1%

BSA, pH 7,5

2. Humani FVIIa (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4 x radni rastvor - pripremiti 100 pM rastvora u ogledu pufera pre

upotrebe.

3. Rekombinantni humani TF (rekonstituisani u našoj laboratoriji od Innovin, Dade): radni rastvor - pripremiti 1:480 razređenje u ogledu

pufera pre upotrebe.

4. Humani faktor X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 x radni rastvor- pripremiti 1000 nM rastvor u ogledu pufera pre

upotrebe.

5. Hromogeni supstrat S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):

Stok rastvor: 6 mM u H20, uskladišteno na 4 C.

Radni rastvor - pripremiti 0,78 mM rastvor u 3,57 mM EDTA (da se zaustavi reakcija), 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,5 pre

upotrebe.

6. Antitelo:

Pripremiti 4x razređenje u ogledu pufera pre upotrebe.

Uslovi ogleda:

Postupak ogleda:

1. Pipetovati 0,15 mL 4x AB (ili pufer kontrola) u svaki bazenčić.

2. Dodati 0,015 mL 4x rTF vezikule.

3. Dodati 0,015 mL 4x FVIIa, inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 4. Dodati 0,015 mL 4x FX, inkubirati 5 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 5. Dodati 0,14 mL S2222 supstrat, trenutno transferisati ploču u čitač ploče i izmeriti kinetiku enzima na 405 nm u 10-sekundnom intervalu tokom 15 minuta.

Ovaj ogled može biti upotrebljen da se utvrdi da li antitela pronalaska inhibiraju FVIIa/TF kompleks da aktivira FX, i da se utvrdi da li se antitela pronalaska takmiče sa FX za vezivanje na FVIIa/TF kompleks.

3.Ogledprotrombinskog vremena (PT)

Za standardnu PT reakciju, 90 uL odgovarajuće koncentracije antitela ili PBS se dodaje u 20 j_lL Tromboplastina IS (Dade) i 90 uL 25 mM CaCI2u kuvetu. Smeša se inkubira 1 min na 37°C, onda se 100 yiL citrirane plazme (Helena Laboratories). Alternativno, odgovarajuća zapremina koncentrisanog antitela se dodaje u 100 (iL rekombinantnog humanog tromboplastina (Ortho Recombiplastin) i otprilike 2 min kasnije, dodaje se 100f.iL rekonstituisane plazme. Vreme zgrušavanja za svaki individualni ogled koagulacije se meri uzimanjem prošeka od dva merenja upotrebom Electra 900C Koagulometra (Hemoliance) i prosečne vrednosti se utvrđuju iz repliciranih ogleda (n=3 ili 4). Krive odgovora na dozu se generišu za svaki inhibitor i potom se upotrebljava regresiona analiza da se izračuna koncentracija (u nM) neophodna za dvostruko produživanje vremena zgrušavanja.

Ovaj ogled se može upotrebiti za se oceni dejstvo antitela pronalaska na spoljašnju putanju koagulacije krvi. Utvrđuje se količina antitela koja se zahteva da se duplira PT, i može biti upoređena sa drugim antikoagulantima da se oceni relativna potencija antitela pronalaska.

4. Ogled mikrokalorimetrije

Ogled mikrokalorimetrije (Kalorimetrija izotermalnog titriranja) se upotrebljava da se meri afinitet vezivanja (KD) antitela pronalaska samo za TF ili za FVIIa/TF kompleks. Ovaj ogled se obavlja upotrebom MicroCal VP-ITC instrumenta. FVIIa/TF kompleks se obavlja dodavanjem 2,3 puta molarnog viška FVIIai sTF-u. Hromatografija isključivanja veličine se upotrebljava da se verifikuje da je sTF u ogledu potpuno kompleksovan. Za utvrđivanje afiniteta antitela za kompleks, 1,2 u.M Vlla/TF kompleksa se dodaje mikrokalorimetar ćeliji i 65 (.iM antitela se dodaje brizgalici. Za utvrđivanje afiniteta antitela samo za sTF, dodaje se 10 u.M sTF ćeliji i 141f.iM antitela se dodaje brizgalici. Podaci odgovaraju jediničnom položaju vezivanja.

PRIMER 5

In vitro karakteristike anti-TF antitela ovog pronalaska

Šest različitih TF-vezujučih antitela se izoluju iz potpune humane jedno-lančano antitelo izložene biblioteke fage: scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 i scFv(TF)3h2. Afiniteti ovih TF-vezujućih antitela, ekspresovanih uE. coli,kako se meri upotrebom BlAjezgra, i između su 35 i 470 nM. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida opisan u Primeru 4, se upotrebljava da se utvredi da li ova antitela blokiraju formiranje aktivnog Vlla/TF kompleksa. U ovom ogledu vezivanje Vila za sTF se ubrzava brzinu cepanja spram supstrata hromogenog peptida S2266 za >20 puta. Antitela koja inhibiraju vezivanje FVIIa za TF blokiraju ovo ubrzanje. Pet od jedno-lančanih antitela, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 i scFv(TF)3h2, inhibira hidrolizu S2266, sugerišući da oni inhibiraju FVIIa vezivanje za sTF (Slika 1). Nasuprot tome, jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 ne inhibira ogled hidrolize sTF/Vlla peptida, čak šta više, ovo antitelo povećava brzinu hidrolize S2266, sugerišući da scFv(TF)3e10 povećava afinitet sTF za FVIIa. Upotrebom ogleda hidrolize sTFA/lla peptida, scFv(TF)3e10 anitelo povećava afinitete FVIIa za sTF, smanjujući KD očigledno 5 puta (Slika 2). scFv(TF)3e10 ne utiče na brzinu hidrolize sa FVIIa u odsustvu sTF,

ukazujući da ovo antitelo ne reaguje međusobno samo sa FVIIa. KDscFv(TF)3e10 antitela za sTF, mereno upotrebom ogleda hidrolize sTF/FVIIa peptida, je 65,4 nM (Slika 4). Ogled mikrokalorimetrije se upotrebljava da uporedi afinitet scFv(TF)3e10 za TF upoređeno sa FVIIa/TF kompleks. Ovi eksperimenti otkrivaju da sisarska ćelija ekspresuje da scFv(TF)3e10 ima -20 puta veći afinitete za TF/FVIIa kompleks upoređeno sa slobodnim sTF (33 nM spram 600 nM, Slika 5).

Šest TF-vezujućih jedno-lančanih antitela, ekspresovanih u bakteriju, se upoređuje upotrebom ogleda aktiviranja FX i PT ogledom. Nijedno od pet antitela koja inhibiraju brzinu S2266 hidrolize sa sTF/FVIIa kompleksom, scFv(TF)2d, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 i scFv(TF)3h2, nije proširilo PT iza PBS puferske kontrole (Slika 3). Nasuprot tome, iako scFv(TF)3e10 antitelo nema najveći afinitet mereno sa BlAjezgrom, i što povećava afinitet FVIIa za sTF, scFv(TF)3e10 je jedino antitelo u grupi koje inhibira aktiviranje FX (Slika 6 i podaci koji nisu prikazani) i produženo vreme zgrušavanja u PT ogledu (Slika 3). IC50scFv(TF)3eq10 (dimer) antitela za inhibiciju u ogledu aktiviranje FX je 0,44 nM (Slika 6. Konačno, ogled aktiviranja FX se upotrebljava da se utvrdi da li se scFv(TF)3e10 antitelo takmiči sa FX za vezivanje za FVIIa/TF kompleks. scFv(TF)3e10 doza zavisno ihibira aktiviranje FX sa istim KD(app} pri svim koncentracijama supstrata FX, ukazujući da scFv(TF)3e10 nije kompetativan sa FX i ne vezuje za TF ili za FVIIa/TF kompleks u istom položaju kao FX (Slika 7).

scFv(TF)3e10 antitelo se identifikuje na bazi vezivanja za rekombinantni

humani rastvorljivi TF. Homologija sekvence TF između humanog i mišjeg ili humanog i zečjeg je 58% i 71%, svaka posebno. Izgleda da se antitelo vezuje za jedinstveni epitop na humanom TF koji se meša sa aktiviranjem FX sa FVIIa/TF kompleksom. Fiziološki, ovo antitelo ima prednost spram

antietla koja se takmiče sa FVII ili FVIIa vezivanjem za TF. KDFVIIa za rastvorljivi TF je~10 nM (Slika 2), vrednost koja je konzistentna sa objavljenim vrednostima za vezivanje FVIIa za sTF (4,8 nM, Neuenschvvander, P.F. i Morrissev, J.H. (1994)J. Biol. Chem.

269(11 ):8007-8013) ili vezivanje FVII, FVIIa i DIP inaktivirani-FVIIai za TF pune dužine rekonstituisan u neutralnim fosfatidilholin vezikulama (Bach R. et al. (1986)Biochemistry 25:4007-4020).Afinitet FVII ili FVIIa vezivanja za TF pune dužine se povećava uveliko kada se uključi napunjeni fosfatidil serin u fosfolipidnim vezikulama (Bach R. et al. (1986),supra),usled interakcije GLA domena FVII ili FVIIa sa napunjenom površinom membrane (Neuenschvvander, P.F. i Morrissev, J.H. (1994) supra). Pod ovim optimalnim uslovima, FVIIa se vezuje za TF pune dužine sa vrlo visokom afinitetom (41 pM). TF antitelo koje se takmiči sa FVII ili FVIIa vezivanjem će imati teškoće takmičeći se sa ovim visokom afinitetom FVIIa/TF kompleksa. Nasuprot tome, scFv(TF)3e10 antitelo ne samo da ima veći afinitet za FVIIa/TF kompleks nego za TF, već se ono ne takmiči sa FVIIa za vezivanje za TF. Antitelo kao što je scFv(TF)3e10, koje sa ne takmiči sa FVIIa, će inhibirati aktiviranje FX nezavisno od plazma koncentracije FVII, koja je~10 nM.

Takođe scFv(TF)3e10 antitelo ima prednost nad antitelima koja se takmiče sa FX za vezivanje na TF. Kmod FX za Vlla/TF kompleks je između 0,061 i 0,099 (iM na osnovu podataka prikazanih na Slici 7, konzistentan sa objavljenim vrednostima (0,1 uM, Baugh, RJ. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(37):28826-28833). Koncentracija FX u humanoj plazmi je 140 nM (1,4 do 2-puta Km). Antitelo kao što je scFv(TF)3e10, koje se ne takmiči sa FX kao što je prikazano na Slici 7, će inhibirati aktiviranje FX nezavisno od koncentracije plazme FX.

PRIMER 6

In vivomodel tromboembolije kod pacova

TF-vezujuće jedno-lančano antitelo scFv(TF)3e10 je specifično za TF primata. Model tromboembolije pokrenut sa humanim TF (tromboplastin reagens koji sadrži humani rekombinantni TF, Ortho) je razvijen kod svesnih mužjaka Sprague-Dawley pacova (350 -400 g, n >7/grupa). Ovde model razdvojene intravaskularne koagulacije (DIC), TF, putem ubrizgavanja tromboplastina, izaziva uklanjanje pulmonalnog fibrina, respiratorni prekid, i smrt. Doze sisarske ćelije koja ekspresuje scFv(TF)3e10 ili nosač se ubrizgavaju u repnu venu praćeno, 15 min kasnije, ubrizgavanjem velike pilule tromboplastina (0,5 ml_/kg). U sa nosačem tretiranoj grupi, ova doza TF rezultira u 60% smrtnosti (LD6o), uobičajeno u okviru 5 min posle ubrizgavanja tromboplastina. Pacovi se ocenjuju prema sledećem morbidnost-mortalitet sistemu ocenjivanja: 0 = bez uticaja; 1 = blagi respiratorni bol (oporavak u okviru 30 min); 2 = ozbiljan respiratorni bol (umirući, zahtevani oporavak više od 60 min); i 3 = smrt. Prosečan rezultat se upotrebljava da se uporedi efikasnost različitih tretiranih grupa. Rezultati upotrebomin vivoogleda su opisani na Slici 8. Antitelo pronalaska je sposobno da smanji mortalitet i smanji respiratorni distres u ovom ogledu.

Prethodni primeri mogu biti ponovljeni sa sličnim uspehom supstituisanjem generički ili specifično opisanih reaktanata i/ili uslova rada ovog pronalaska upotrebljenih u prethodnim primerima.

Dok je pronalazak ilustrativan u pogledu proizvodnje određenih antitelo konstrukata, očigledno je da varijacije i modifikacije pronalaska mogu biti učinjene bez napuštanja duha i obima pronalaska.

Claims

1. Antikoagulantno antitelo,naznačeno time,što se vezuje sa većim afinitetom za faktor Vila/tkivo faktor (FVIIa/TF) kompleks nego samo za tkivo faktor (TF).

2. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što se navedeno antitelo vezuje sa bar 2 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF kako je izmereno u ogledu mikrokalorimetrije.

3. Antitelo prema zahtevu 2,naznačeno time,što se navedeno antitelo vezuje sa bar 5 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF.

4. Antitelo prema zahtevu 3,naznačeno time,što se navedeno antitelo vezuje sa bar 10 puta većim afinitetom za FVIIa/TF kompleks nego samo za TF.

5. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što je navedeno antitelo monoklonalno antitelo.

6. Antitelo prema zahtevu 5,naznačeno time,što je navedeno antitelo jedno-lančano antitelo, Fab dimer antitelo ili IgG antitelo.

7. Antitelo prema zahtevu 6,naznačeno time,što je navedeno antitelo jedno-lančano antitelo.

8. Antitelo prema zahtevu 7,naznačeno time,što se navedeno antitelo ne takmiči za vezivanje za TF sa jednim ili više faktora koagulacije odabranih od grupe koja se sastoji od faktora VII (FVII), faktora IX (FIX), i faktora X (FX).

9. Antitelo prema zahtevu 8,naznačeno time,što su navedeni faktori koagulacije FVII i FX.

10. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što je navedeno antitelo glikozilovano.

11. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što je navedeno antitelo modifikovano dodavanjem polietilen glikola.

12. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što je navedeno antitelo biotinilovano za vezivanje streptavidina.

13. Farmaceutski sastav,naznačen time,što sadrži antitelo prema zahtevu 1, čiji sastav se sastoji od farmaceutski prihvatljivog vezivnog sredstva i terapeutski efektivne količine navedenog antitela.

14. Postupak zaštite od formiranja tromba,naznačen time,što se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine antitela prema zahtevu 1, pri čemu navedeno antitelo inhibira generisanje trombina bez direktnog uticanja na druge parametre koagulacije kao što je aktiviranje i agregacija trombocita.

15. Postupak prema zahtevu 14,naznačen time,što navedeni postupak služi da se zaštiti od formiranja tromba kod ishemičnog šoka, trombotičkih komplikacija posle angioplastike, ili mikrovaskularne operacije.

16. Postupak smanjenja i lečenja duboke venske tromboze (DVT), razdvojene intravaskularne koagulacije (DIC), akutnog koronarnog sindroma, ili kancera sa dokazom koagulopatije kod pacijenta,naznačen time,što se sastoji od davanja navedenom pacijentu terapeutski efektivne količine antitela prema zahtevu 1.

17. Postupak regulisanja inflamatornog odgovora kod pacijenta, naznačen time, što se sastoji od davanja navedenom pacijentu terapeutski efektivne količine antitela prema zahtevu 1.

18. Postupak prema zahtevu 17,naznačen time,što je navedeni inflamatorni odgovor izabran od grupe koja se sastoji od sepse, presađivanja kože i vena, i transplanta organa.

19. Antitelo prema zahtevu 1,naznačeno time,što se navedeno antitelo koristi da se formira ne-trombogena obloga na površini medicinskog uređaja, pri čemu navedeni medicinski uređaj dolazi u kontakt sa krvlju.

20. Pribor,naznačen time,što sadrži antitelo prema zahtevu 1.

21. Pribor,naznačen time,što sadrži DNK sekvence koje kodiraju antitelo prema zahtevu 1.

22. Sastav za gensku terapiju, naznačen time, što sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4, koja kodira antitelo koje se sastoji od sekvence amino kiseline SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3, u kombinaciji sa terapeutski efektivnom količinom vektora genske terapije.

23. Antikoagulantno antitelo,naznačeno time,što je navedeno antitelo jedno-lančano antitelo koje se vezuje sa većim afinitetom za FVIIa(TF kompleks nago samo za TF i pri čemu se navedeno antitelo ne takmiči za vezivanje za TF sa FVII i FX.

24. Antitelo prema zahtevu 23,naznačeno time,što navedeno antitelo sadrži sekvenu amino kiseline SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO.3.

25. Polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo prema zahtevu 23,naznačena time,što navedena polinukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4.