KR20050045944A - 항응고제로서의 조직 인자 표적화된 신규 트롬보모둘린융합 단백질 - Google Patents

항응고제로서의 조직 인자 표적화된 신규 트롬보모둘린융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단독의 트롬보모둘린 (TM) EGF456 도메인과 작동가능하게 연결되거나, 또는 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 TM 도메인과 함께 TM EGF456 도메인과 작동가능하게 연결된, 조직 인자 (TF)에 결합하는 표적화 단백질, 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 신규 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 상처 부위에 결합하여 혈전형성 개시를 예방한다. 이 융합 단백질은 심부정맥 혈전증, 산재성 혈관내 응고증 및 급성 관상동맥 증후군 등을 비롯한 다양한 혈전성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

Description

항응고제로서의 조직 인자 표적화된 신규 트롬보모둘린 융합 단백질 {Novel Tissue Factor Targeted Thrombomodulin Fusion Proteins as Anticoagulants}
혈관 내에서 전구 응고제 활성과 항응고제 활성 사이에 적절한 균형을 유지시키는 것은 정상적인 지혈을 위해 필수적이다 (문헌 [Davie, E.W. et al. (1991) Biochemistry, 30(43):10363-10370]). 응고에 대한 균형이 깨지면 심장 마비, 발작, 폐색전증 및 정맥 혈전증을 초래할 수 있는 혈전증이 유발된다. 특정 혈전 질환을 치료하기 위한 보다 효과적이고 안전한 항응고제에 대한 필요성이 제기되고 있다.
조직 인자 ("TF")는 단계적 응고 반응의 주요 개시자인 막횡단 당단백질이다 (문헌 [Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1):180-184]). 정상적인 생리적 조건하에서, 활성인 TF는 혈액과 접촉하지 않는다. 혈관 손상시, 내피하 TF 및 콜라겐이 혈액에 노출되면 응고 인자 및 혈소판이 활성화되어 지혈 플러그를 형성한다. 다양한 임상적 상태에서, TF의 발현이 부적절하게 유도되면 생명을 위협하는 혈전증이 초래되고(되거나) 병리적 합병증이 유발될 수 있다. 플러그 파괴시 수반되는 TF 노출은 급성 심근 경색 및 발작을 초래하는 혈전 폐색을 담당하는 것으로 믿어지고 있다. 이러한 상태에서, 응고 인자에 의해 활성화되는 전염증성 신호전달 경로는 또한 부종 형성을 초래하고, 경색 부위를 증가시킨다. 혈관형성술과 관련된 혈관 손상은 재협착과 관련된 세포 신호전달 경로를 유도하는 것으로 믿어지는 SMC 상의 TF를 상향조절시킨다. 암 및 그람-음성 (gram-negative) 패혈증에서의 TF 과다발현은 생명에 위협적인 혈전증 및 염증성 경로의 활성화를 초래한다.
인자 VIIa ("FVIIa")/TF 복합체는 다양한 혈전 질환의 병원성 메카니즘에 관여하며, 어떤 환자의 경우에는 순환되는 양의 TF가 위험 인자가 된다. FVIIa 및 TF는 혈관 손상시 지혈 유지 및 혈전형성 개시에 중요한 역할을 한다. TF는 정상적으로는 외막에서 발현되지만, 혈관 질환에서는 혈관의 중막 및 신생혈관내막에서 부적절하게 상향조절 및 발현된다. 아테롬성 동맥경화증 플라크에서는 TF 발현이 증가하고, 얇은 섬유질 캡 (cap)에 의해 혈액으로부터 보호되는데, 이 캡이 파괴되면 TF가 노출된다. 풍선 (balloon) 혈관형성술, 협착술 또는 동맥내막절제술과 같은 외과 시술은 혈관벽을 손상시키고, 그 아래에 있는 TF를 노출시킨다. 아테롬성 동맥경화증에서, 지질이 풍부한 얇은-벽 플라크의 자발적인 파괴 또는 내피 침식은 TF 노출 및 혈전형성을 초래하여 불안정성 앙기나 및 심근 경색을 유발한다. TF는 세포로부터 유래된 미세입자에서 순환될 수 있고, 순환하는 TF 수준은 불안정성 앙기나에서 증가하며, 이는 상기 순환하는 TF가 혈전 형성을 초래할 수 있다는 것을 시사한다 (문헌 [Soejima, H. et al. (1999) Circulation 99(22):2908-2913]). 대체로 암은 종양 세포 상에서 TF 과다발현에 기인하는 과다응고 상태와 관련되어 있다. 이는 환자가 심부정맥 혈전증, 폐색전증 및 낮은 등급의 산재성 혈관내 응고증 ("DIC")에 걸리기 쉽게 한다. DIC는 미세혈관에서 다수의 기관 부전을 초래하는 피브린 침착 현상을 일으킨다. 혈전증의 급성 동맥 손상 모델로부터의 결과는 활성 부위가 억제된 인자 VIIa ("FVIIai") 및 조직 인자 경로 억제제 ("TFPI")와 같은 FVIIa/TF의 단백질 기재의 억제제가 트롬빈 및 인자 Xa ("FXa") 억제제에 비해 출혈이 적은 효과적인 항혈전제라는 것을 나타낸다. 또한, FVIIa/TF 억제는 풍선 손상시 수반되는 신생혈관내막의 후막화 및 혈관 협착을 예방하는 데 있어서 다른 항응고제 (예를 들어, 헤파린, FXa 억제제)보다 우수하다 (문헌 [Jang, Y. et al. (1995) Circulation 92 (10):3041-3050]).
트롬보모둘린 ("TM")은 항응고제 특성을 가지며, 혈관을 연결하는 내피 세포의 루멘 표면에서 우세하게 발현되는 막횡단 당단백질이다 (문헌 [Esmon, N.L. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257(2):859-864]; [Salem, H.H. et al. (1983) J. Biol. Chem. 259(19):12246-12251]). 성숙한 전장 TM은 N-말단 소수성 영역 (잔기 1 내지 226), 시스테인-풍부 영역 (잔기 226 내지 462), O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 영역 (잔기 463 내지 497), 소수성 막횡단 영역 (잔기 498 내지 521) 및 C-말단 세포질 꼬리 영역 (잔기 522 내지 557)의 5가지의 구조 도메인으로 구성된 557개 아미노산 잔기의 모듈성 단백질이다.
시스테인-풍부 영역은 상피 성장 인자 ("EGF") 전구체에 상동성인 6개의 반복되는 구조를 포함한다 (EGF-유사, EGF-상동성 또는 EGF 도메인으로 명명됨). 시스테인-풍부 영역은 EGF-유사 반복 영역 1, 2 및 3 ("EGF123", 잔기 226 내지 344), EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 (잔기 345 내지 349) 및 EGF-유사 도메인 4, 5 및 6 ("EGF456", 잔기 350 내지 462)의 3가지 도메인으로 추가 세분할 수 있다. EGF456의 기능은 트롬빈 결합 및 단백질 C의 활성화를 매개하는 것이다. 한 연구는 제5 및 제6 EGF 유사 반복 영역 (각각 "EGF5", 잔기 390 내지 407; 및 "EGF6", 잔기 427 내지 462)이 트롬빈에 결합하는 능력을 보유한다고 제안하고 있으며 (문헌 [Kurosawa, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13):5993-5996]), 다른 연구는 EGF456 도메인이 트롬빈에 의해 매개되어 단백질 C를 활성화시키는 활성에 대한 보조인자로서 작용하기에 충분하다고 제안하고 있다 (문헌 [Zushi, M. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(18):10351-10353). Ser/Thr-풍부 도메인은 EGF456-매개된 트롬빈 결합을 증가시킨다. 제3 EGF-유사 반복 영역 ("EGF3", 잔기 311 내지 344)은 트롬빈에 의해 활성화될 수 있는 피브린 용해 억제제 ("TAFI")의 활성화에 필요하다. EGF3에서의 몇몇 점 (point) 돌연변이는 TAFI의 활성화를 방해하는 것으로 기재되어 있다 (문헌 [Wang, W. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(30):22942-22947]). 트롬빈/TM 복합체는 단백질 C를 활성화된 단백질 C ("APC")로 전환시킨 후에 인자 Va 및 VIIIa를 분해함으로써 추가의 트롬빈 생성을 예방한다. 따라서, TM은 트롬빈을 전구 응고제 형태로부터 항응고제 형태로 전환시키는 분자 스위치로서 작용한다.
TM이 막 표면에 위치하는 경우에 트롬빈/TM 복합체에 대한 단백질 C의 Km 값은 10배 감소한다 (문헌 [Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9(10):946-955]). 혈액에서의 단백질 C 농도 (0.065 μM)는 가용성 TM/트롬빈 복합체에 대해 보고된 Km 값 (5 μM)보다 현저하게 낮고, 따라서 전구 응고제 막 표면 상의 TM이 일부 구역에서 단백질 C의 생성 속도를 현저하게 증가시킬 것이다.
TM은 헤파린 또는 그의 유도체와는 상이한 메카니즘에 의해 혈전증을 억제한다. 헤파린은 항트롬빈 III에 대한 보조인자이며, 항트롬빈 III-의존성 메카니즘을 통해 FXa와 트롬빈 둘 모두를 억제한다. 혈전-결합 트롬빈은 항트롬빈 III의 작용으로부터 보호되며, 이는 기존의 혈병 상에서 헤파린 또는 저분자량 헤파린 ("LMWH")의 항혈전 효능을 제한한다. 이는 헤파린 또는 LMWH이 혈전 증식을 억제하지 못하는 것이 인간을 제외한 영장류 연구에서 혈병-결합 트롬빈 또는 프로트롬비나제에 의해 촉발된다는 것을 설명한다. 이와는 반대로, 재조합 TM은 혈병에 의해 유도된 트롬빈 생성 및 피브린 형성을 투여량에 의존하는 방식으로 감쇠시킨다 (문헌 [Mohri, M. et al. (1998) Thromb. Haemost. 80(6):925-929]). TM의 억제 효과는 항-단백질 C 항체에 의해 제거된다. 혈병-결합 전구 응고제 활성이 보다 빠른 혈전 증식을 초래하고, 결국 혈관 폐색 또는 혈전색전증 합병증을 유발하기 때문에, 혈병-결합된 전구 응고제를 억제하는 것이 임상적으로 타당하다. 혈전 증식을 억제하는 것은 내생 피브린 용해 시스템이 보다 신속하고 완전하게 혈병을 제거하도록 한다. 또한, TM은 DIC와 같이 혈장 항트롬빈이 고갈되는 병리적 증상에서 헤파린보다 더 효과적일 것으로 예상된다. TM과 헤파린 둘 모두 실험적인 DIC에서 혈소판 및 피브리노겐 소비를 억제하지만, 항트롬빈 III의 양이 고갈된 경우에는 TM만이 효과적이다.
<발명의 요약>
본 발명은 단독의 트롬보모둘린 ("TM") EGF456 도메인에 작동가능하게 연결되거나, 또는 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다른 TM 도메인과 함께 TM EGF456 도메인에 작동가능하게 연결된, 조직 인자 ("TF") 또는 인자 VIIa/조직 인자 ("FVIIa/TF") 복합체와 상호작용하는 표적화 단백질, 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하고 항응고제로서 작용하는 신규 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 항응고제 융합 단백질은 손상 부위에서 TF 또는 FVIIa/TF 복합체를 표적으로 하여 이에 결합하며, 이로 인해 손상 부위에 TM을 위치시켜 혈전 형성을 예방함으로써 가용성 항-TF 항체, 또는 가용성 TM 또는 TM의 단편에 비해 항응고제로서의 기능을 보다 효과적으로 수행한다. 패혈증, 산재성 혈관내 응고증, 허혈성 발작, 심부정맥 혈전증, 급성 관상동맥 증후군, 혈관형성술 시술시 수반되는 혈전 합병증, 및 진행성 암에서의 응고증 등을 비롯한 특정 질환 치료시 상기 융합 단백질이 저분자량 헤파린 ("LMWH") 보다 더 효과적이다. 또한, 상기 융합 단백질은 미세혈관 수술, 피부 및 정맥 이식 및 기관 이식에 사용된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 혈전 형성으로부터 보호되어야 할 환자에게 치료상 유효량의 융합 단백질을 투여함으로써 혈소판의 활성화 및 응집과 같은 다른 응고 파라미터에는 직접적인 영향을 미치지 않으면서 트롬빈 생성을 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 혈전 형성으로부터 보호하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료상 유효량의 융합 단백질을 심부정맥 혈전증 (DVT), 산재성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 관상동맥 증후군, 또는 응고 징후가 나타나는 암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 심부정맥 혈전증 (DVT), 산재성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 관상동맥 증후군, 또는 응고 징후가 나타나는 암을 예방하고 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료상 유효량의 융합 단백질을 염증성 반응의 조절이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 염증성 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 융합 단백질은 혈액과 접촉하는 의학 장비의 표면 상에 혈전이 형성되지 않는 코팅을 형성시키는 데 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 TF 또는 FVIIA/TF 복합체에 결합하는 표적화 단백질 및 TM 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 별법으로, 키트는 융합 단백질 성분을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 재조합 및 합성에 의해 제조하는 방법에 개시되어 있다.
도 1. scFv(TF)3e10이 sTF에 결합하면 sTF의 FVIIa에 대한 겉보기 친화도가 증가한다. sTF/FVIIa 활성화 분석을 800 nM scFv(TF)3e10의 존재 및 부재하에서 2 nM FVIIa를 사용하여 실시예 5 (제목: "sTF/FVIIa 활성화 분석")에 기재된 바와 같이 수행하였다. 분석에서 sTF를 적정하고, 발색성 기질 (S2266)의 절단 속도를 측정하였다. sTF에 대한 겉보기 KD 값을 표준 4-파라미터 피트를 이용하여 계산하였다.
도 2. scFv(TF)3e10의 sTF에 대한 결합 친화도 측정. sTF/FVIIa 분석은 3 nM sTF 및 2 nM FVIIa를 사용하여 실시예 5 (제목: "sTF/FVIIa 활성화 분석")에 기재된 바와 같이 수행하였다. 사용된 sTF의 농도는 FVIIa에 대한 결합의 KD 값보다 낮았다. scFv(TF)3e10 항체의 결합은 FVIIa에 결합하는 경우의 sTF의 KD 값을 감소시켜 sTF/FVIIa 복합체 형성을 증가시키고, 이에 따라 발색성 기질 S2266의 절단 속도가 증가하였다. scFv(TF)3e10을 농도를 증가시키면서 첨가하고, 표준 4-파라미터 피트를 이용하여 sTF에 대한 항체의 겉보기 KD 값을 측정하기 위해 증가된 반응 속도를 사용하였다.
도 3. 미세열량측정 분석은 scFv(TF)3e10의 sTF/FVIIa 복합체에 대한 친화도가 sTF만에 대한 친화도 보다 20배 높다는 것을 밝히고 있다. 등온 적정 열량측정을 마이크로칼 (MicroCal) VP-ITC 기기를 이용하여 수행하였다. sTF/FVIIa 복합체는 FVIIai를 2.3배 과량의 몰농도로 sTF에 첨가하여 미리 형성시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 sTF가 완전하게 복합체를 형성하였는지 확인하였다. 항체의 복합체에 대한 친화도를 측정하기 위해서, 1.2 μM sTF/VIIa 복합체를 미세열량측정 셀에 첨가하고, 65 μM scFv(TF)3e10 항체를 주사기에 첨가하였다. 항체의 sTF만에 대한 친화도를 측정하기 위하여 10 μM의 sTF를 세포에 첨가하고, 141 μM scFv(TF)3e10을 주사기에 첨가하였다. 마이크로칼 오리진 (MicroCal Origin) 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다. 데이타는 단일 결합 부위에 대해 적합화하였다.
도 4. scFv(TF)3e10은 투여량에 의존하여 FX 활성화 분석을 억제한다. 본 분석에 대한 상세한 내용은 실시예 5 (제목: "인자 X 활성화 분석")에 기재되어 있다. IC50 값은 50％ 최대 억제에 도달하는 데 필요한 투여량을 나타낸다.
도 5. 융합 단백질은 단독의 TF 항체 또는 TMi456보다 더 효과적으로 응고를 억제한다. 프로트롬빈 시간 (PT) 분석을 수행하여 융합 단백질과 단독의 TF 항체 또는 TMi456과 비교하였다. 적절한 부피로 농축된 억제제 (TF 항체 (scFv(TF)3e10), TMi456 또는 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456))를 재조합 인간 트롬보플라스틴 (오르토 레콤비플라스틴; Ortho Recombiplastin) 100 ㎕에 첨가하였다. 대략 2 분 후에 재구성된 인간 혈장 100 ㎕를 첨가하였다. 응고 시간을 헤몰리안스 응고측정기 (Haemoliance Coagulometer)로 측정하였다. 투여량 반응 곡선을 각각의 억제제에 대하여 작성한 후에 회귀분석을 이용하여 응고 시간을 2배 연장시키기 위해 필요한 농도 (nM 단위)를 계산하였다.
도 6. 융합 단백질은 단백질 C를 활성화시키기 위한 완전한 보조인자 활성을 보유한다. 실시예 5 (제목: "단백질 C 활성화 분석 (발색성)")에 기재된 분석물은 TM 샘플 20 ㎕, TMi456 (EGF 도메인 4 내지 6 및 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 함유) 또는 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456), 1.5 μM 단백질 C 20 ㎕ 및 3 nM 알파 트롬빈 20 ㎕를 함유하였다. 활성화를 1 시간 동안 진행시켰다. 0.16 u/ml 히루딘 20 ㎕를 첨가하여 활성화 단계를 중단시켰다. 이어서, 1 mM S2266 100 ㎕를 첨가하고, A405를 30분 동안 10초 간격으로 측정하였다. 반응 속도는 활성화된 단백질 C의 생성량에 따라 달라진다. 데이타는 mOD/분으로 표현하였다.
도 7. 융합 단백질에 의한 단백질 C 활성화 속도는 TF-함유 인지질 표면 상에서 증가한다. TMi456에 의한 단백질 C 활성화 속도는 TF 소포 (vesicle)의 첨가에 의해 영향을 받지 않는다. 실시예 5 (제목: "단백질 C 활성화 분석 (TF-풍부 표면 상에서)")에 기재된 분석물은 TM 샘플 20 ㎕, TMi456 또는 융합체 (scFv (TF)3e10-TMi456), 1.5 μM 단백질 C 20 ㎕, 3 nM 알파 트롬빈 20 ㎕ 및 완충액 또는 TF 소포 20 ㎕ (인노빈 (Innovin), 인간 재조합 TF, PT에 대하여 정상적인 농도의 4배)를 함유하였다. 활성화를 1 시간 동안 진행시켰다. 0.16 u/ml 히루딘 20 ㎕를 첨가하여 활성화 단계를 중단시켰다. 이어서, 1 mM S2266 100 ㎕를 첨가하고, A405를 30분 동안 10초 간격으로 측정하였다. 반응 속도는 활성화된 단백질 C의 생성량에 따라 달라진다. 데이타는 mOD/분으로 표현하였다.
도 8. 융합 단백질의 TF-유도된 응고에 대한 특이성은 TMi456의 특이성보다 현저하게 높은 것으로 밝혀졌다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 분석은 고유하고 중요한 응고 경로의 억제제에 대해 민감하다. 이 분석에서 발생하는 응고는 TF에 독립적이다. 억제제인 TF 항체 (scFv(TF)3e10), TMi456 또는 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456)를 재구성된 인간 혈장 50 ㎕로 희석하여, PT 분석에서 2-배 연장된 시간을 수득하는 최종 농도가 되게 하였다. 이어서, 응고측정기에 APTT (알렉신 (Alexin) HS) 시약 50 ㎕ 및 CaCl2 시약 (0.02 mol/L) 50 ㎕를 첨가하고, 응고 시간을 초 단위로 측정하였다.
도 9. 융합 단백질은 TF-유도 전혈 응고를 그의 단독 성분보다 더 효과적으로 억제한다. 전혈 응고를 헤모스코프 트롬보엘라스토그래프 (Haemoscope Thromboelastogragh) (TEG) 분석기를 이용하여 분석하였다. 시트레이트 처리된 전혈에, 120 nM의 TF 항체 (scFv(TF)3e10), TMi456 또는 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456)를 트롬보플라스틴 시약 (1:64 희석) 10 ㎕ 및 0.2 M CaCl2 20 ㎕와 함께 첨가하였다. R-값 (최초 피브린 형성에 대한 시간)을 각각의 샘플에 대하여 수득하였다. 이어서, 이 값을 억제되지 않는 대조군 R-값에 대한 비율로 전환하였다.
도 10. 융합 단백질은 전혈 응고 분석 (TEG)에서 LMWH보다 더 예측가능한 투여량 반응을 나타낸다. 시트레이트 처리된 전혈에, 트롬보플라스틴 시약 (1:64 희석) 10 ㎕ 및 0.2 M CaCl2 20 ㎕와 함께, 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456)의 농도를 15 nM에서 출발하여 2배씩 증가시켜 첨가하거나, 또는 에녹사파린 (LMWH)의 농도를 0.15 u/ml에서 출발하여 2배씩 증가시켜 첨가하였다. R-값 (최초 피브린 형성에 대한 시간)을 각각의 샘플에 대하여 수득하고, 상대 농도에 대하여 그래프를 작성하였다 (최저 농도를 각 (유사 R-값)에 대하여 1로 세팅한 후 이어서 2배씩 증가시킴).
도 11. 융합 단백질 scFv(TF)3e10-TMi456은 산재성 혈관내 응고증 ("DIC")의 생체내 모델에서 효능이 있다. TF 항체 (scFv(TF)3e10) 및 융합체 (scFv(TF)3e10-TMi456)를 실시예 8에 기재된 래트 혈전색전증 모델에서 (A) 생존률 및 (B) 발병률-사망률 스코어에 대하여 평가하였다. (A) 비히클-처리된 군에서, 사용되는 TF 투여량은 60％ 치사율 (LD60)을 초래하였다. scFv(TF)3e10-TMi456은 0.7 nmol/kg에서 사망을 완전하게 예방하였다. 반면, scFv(TF)3e10은 0.7 nmol/kg에서 사망에 대해 영향을 미치지 않았다. scFv(TF)3e10-TMi456은 10배 높은 투여량의 scFv(TF)3e10보다 더 효능이 있다. (B) 비히클-처리된 군에서, TF의 생체내 투여량은 하기 스코어링 시스템을 기준으로 하여 평균 2.6의 발병률-사망률 스코어를 나타내었다: 0 = 영향을 받지 않음; 1 = 경미한 호흡 곤란 (30 분 이내에 회복); 2 = 중증 호흡 곤란 (빈사상태, 회복하는 데 60 분 이상이 소요됨); 3 = 사망. scFv(TF)3e10-TMi456은 투여량에 의존하여 TF 유도된 사망 및 호흡 곤란을 0.46 nmol/kg (0.019 mg/kg)의 ED50 값으로 예방하였다. scFv(TF)3e10-TMi456은 7.0 nmol/kg에서 사망 및 호흡 곤란을 완전하게 예방하였고, 0.7 nmol/kg에서는 사망을 완전하게 예방하고 호흡 곤란을 상당히 감소시켰다. 이와는 반대로, scFv(TF)3e10은 0.7 nmol/kg에서 사망에 대해 전혀 영향을 미치지 않았으며, 호흡 곤란에 대해서도 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. scFv(TF)3e10-TMi456은 10배 높은 투여량의 scFv(TF)3e10보다 더 효능이 있었다.
본 발명의 항응고제 융합 단백질은 단독의 트롬보모둘린 ("TM") EGF456 도메인에 작동가능하게 연결되거나, 또는 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다른 TM 도메인과 함께 TM EGF456 도메인에 작동가능하게 연결된, 조직 인자 ("TF") 또는 인자 VIIa/조직 인자 ("FVIIa/TF") 복합체와 상호작용하는 표적화 단백질, 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다.
정의:
본 발명의 설명에 있어서, 하기 용어를 다음에 나타낸 바와 같이 정의한다.
"재조합 단백질 또는 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된, 즉 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 외생 DNA 구조물에 의해 형질전환된 세포, 미생물 또는 포유동물로부터 생성된 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 대부분의 박테리아 배양물에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에는 글리칸이 포함되어 있지 않을 것이다. 효모에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현되는 것과 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.
"천연" 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 발생 공급원으로부터 회수된 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 용어 "천연 TM"은 자연적으로 발생한 TM 및 그의 단편을 포함할 것이다.
DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 조절하에 놓여진 경우에 숙주 세포에서 mRNA로 전사되고 폴리펩티드로 번역되는 DNA 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' N-말단의 개시 코돈 및 3' C-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
"융합 단백질"은 작동가능하게 연결된 2개 이상의 이종 코딩 서열이 발현되어 생성된 단백질이다. 본 발명의 융합 단백질은 단독의 트롬보모둘린 ("TM") EGF456 도메인과 작동가능하게 연결되거나, 또는 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 TM 도메인과 함께 TM EGF456 도메인과 작동가능하게 연결된, 조직 인자 (TF) 또는 FVIIa/TF 복합체와 상호작용하는 표적화 단백질, 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다.
"표적화 단백질"은 다른 단백질 또는 단백질 복합체에 결합하거나, 또는 이들과 상호작용하는 단백질이다. 본 발명의 표적화 단백질은 TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 결합하거나, 또는 이들과 상호작용하는 단백질이다. 예를 들어, 항-TF 또는 항-FVIIa/TF 복합체 항체가 본 발명의 표적화 단백질이다. 표적화 단백질의 두 가지 다른 예로는 TF에 결합하여 비활성 FVIIai/TF 복합체를 형성할 수 있는 활성 부위가 억제된 인자 VIIa ("FVIIai"), 및 FVIIa/TF 복합체에 결합하여 이를 불활성화시킬 수 있는 조직 인자 경로 억제제 ("TFPI")가 있다.
"뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드 (아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신 염기)의 헤테로-중합체이다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 합성 cDNA-유래의 DNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커로부터 조립하여, 재조합 발현 벡터에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공할 수 있다. 특정 이중-가닥 DNA 분자의 구조를 논의하는데 있어서, 서열은 cDNA의 비전사 가닥을 따라 단지 5'에서 3'의 방향으로 서열을 제시하는 통상의 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
"재조합 발현 벡터"는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 증폭시키거나 발현시키는 데 사용되는 복제가능한 DNA 구조물이다. 발현 벡터는 DNA 조절 서열 및 코딩 서열을 함유한다. DNA 조절 서열로는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인 및 인핸서를 들 수 있다. 본원에 정의된 재조합 발현 시스템은 조절 요소의 유도시에 융합 단백질을 발현시킬 것이다.
"형질전환된 숙주 세포"는 외생 DNA로 형질전환 및 형질감염된 세포를 의미한다. 외생 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합 (공유 결합)되거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 및 효모에 있어서, 외생 DNA는 에피좀 성분으로, 예를 들어 플라스미드 상에 유지되거나 또는 염색체 DNA에 안정하게 통합될 수 있다. 진핵 세포에 있어서, 안정하게 형질전환된 세포란 외생 DNA가 염색체와 함께 복제되도록 통합된 세포를 말한다. 이러한 안전성은 진핵 세포주 또는 클론이 외생 DNA를 함유하는 딸세포 집단을 생성시키는 능력에 의해 입증된다.
"트롬보모둘린 (TM)"은 트롬빈과 고친화도 복합체를 형성하는 내피 세포 표면의 당단백질을 나타낸다. 천연 TM (그의 게놈 형태 및 cDNA 둘 모두)을 코딩하는 유전자는 소 및 인간으로부터 단리 및 서열분석되어 있다 (문헌 [Jackman, R.W. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(23):8834-8838] 및 [Jackman, R.W. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(18):6425-6429], 둘 모두 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함). 소, 인간 및 마우스 TM에 대한 서열은 서로 고도의 상동성을 나타낸다. 인간 TM의 cDNA는 약 18개 아미노산의 신호 서열을 포함하는 575개 아미노산의 60.3 kDa 단백질을 코딩한다 (미국 특허 제5,827,824호 참조).
트롬빈이 TM에 결합하는 경우, 항응고 효소에 의해 활성화된 단백질 C를 형성하는 단백질 C의 활성화 비율이 1000배 이상 증가할 수 있다. 또한, 트롬빈이 TM에 결합되는 경우, 트롬빈은 더 이상 전구 응고 효소로서 작용하지 않는다. 특히, 트롬빈-촉매의 피브린 형성, 인자 V 활성화 및 혈소판 활성화는 모두 TM의 존재하에 억제된다. 따라서, TM은 트롬빈을 생리학적 항응고제로 전환시킨다.
"트롬보모둘린 (TM) 도메인"은 특징적인 3차 구조 단위와 같은 TM의 특정 기능 또는 특징과 관련될 수 있는 분리된 아미노산 서열을 나타낸다. 전장 TM 유전자는 아미노산 -18 내지 -1: 신호 서열; 아미노산 1 내지 226: N-말단 소수성 영역; 아미노산 227 내지 462: 시스테인-풍부 영역; 도메인간 소펩티드 또는 루프에 의해 연결된 6개의 텐덤 EGF-유사 반복 서열로 구성된 영역; 아미노산 463 내지 497: O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 영역; 아미노산 498 내지 521: 소수성 막횡단 영역; 및 아미노산 522-557: C-말단 세포질 꼬리 영역의 도메인을 함유하는 전구체 또는 프로-폴리펩티드를 코딩한다. 시스테인-풍부 영역은 아미노산 226 내지 344: EGF123 (EGF-유사 반복 서열 1, 2 및 3 (잔기 226-344)으로 이루어짐); 아미노산 345 내지 349: EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프; 및 아미노산 350 내지 462: EGF456 (EGF-유사 도메인 4, 5 및 6으로 이루어짐)의 3개의 도메인으로 추가 분류될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yost, C.S. et al. (1983) Cell 34(3):759-766], [Wen, D.Z. et al. (1987) Biochemistry 26(14):4350-4357] 및 [Wang, W. et al., 상기 문헌], 모두 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함).
용어 "유사체," "단편," "유도체" 및 "변이체"는, 본 발명의 융합 단백질 뿐만 아니라 표적화 단백질 및 TM 도메인을 언급하는 경우, 하기 추가로 기재된 바와 같이, 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 융합 단백질, 표적화 단백질 및 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 및 변이체를 의미한다.
"유사체"는 그의 내부에 본 발명 융합 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 프로-폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 활성 융합 단백질은 천연의 생체내 프로세스에 의해 또는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단에 의해 프로-융합 단백질 분자를 완성하는 추가의 아미노산으로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 천연 TM은 자연적으로 575개 아미노산의 프로-폴리펩티드로 발현된 후 생체내에서 프로세싱되어 557개 아미노산의 활성인 성숙 폴리펩티드를 방출한다.
"단편"은, 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 시험관내 분석에서 밝힌 것처럼 실질적으로 유사한 기능 활성을 보유하는 융합 단백질, 표적화 단백질 또는 TM 도메인(들)의 일부이다.
"유도체"는 본원에 개시된 기능을 실질적으로 보존하며 추가의 구조 및 부수적 기능을 포함하는 융합 단백질에 대한 모든 변형물, 예를 들어 하기에서 추가로 기재된, 긴 반감기를 갖는 PEG화 (PEGylated) 융합 단백질, 콘드로이틴 술페이트의 부가에 의해 변형된 O-글리코실화 융합 단백질 및 비오틴화 융합 단백질을 포함한다.
"실질적으로 유사한 기능적 활성" 및 "실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성"은, 각 폴리펩티드의 생물학적 활성을 동일한 방법 또는 분석에 의해 측정하는 경우, 비교 대상 폴리펩티드에 의해 입증된 생물학적 활성의 약 30％ 내지 100％ 또는 그보다 높은 범위인 생물학적 활성의 정도를 각각 의미한다. 예를 들어, 실시예 2의 융합 단백질 (서열 2)과 실질적으로 유사한 기능적 활성을 갖는 융합 단백질 또는 TM 도메인은 실시예 5에 기재된 단백질 C 활성화 분석 (발색성)에서 시험하는 경우에 활성화된 단백질 C의 축적을 입증하는 것이다. 실시예 1의 항-TF 항체 (서열 1)와 실질적으로 유사한 기능적 활성을 갖는 표적화 단백질은 실시예 5에 기재된 sTF/FVIIa 분석 또는 FX 활성화 분석에서 시험하는 경우에 TF 또는 FVIIa/TF 복합체와 결합하거나 이들을 중화시키는 능력을 입증하는 항체이다.
두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정한다. 이러한 보존적 치환으로는 문헌 [The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff (1978) and by Argos (1989) EMBO J. 8:779-785]에 있는 상기 기술된 것들을 들 수 있다. 예를 들어, 하기 군의 하나에 속하는 아미노산들은 보존적 변화를 나타낸다:
- Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr;
- Cys, Ser, Tyr, Thr;
- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
- Lys, Arg, His;
- Phe, Tyr, Trp, His; 및
- Asp, Glu.
본원에 사용된 다른 모든 기술적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
표적화 단백질:
본 발명의 표적화 단백질은 미리 선별된 특정 표적 분자 (예를 들어, TF 또는 FVIIa/TF 복합체)에 특이적으로 결합한 후, 융합 단백질을 미리 선별된 표적 분자를 보유하는 세포 또는 조직으로 안내하는 능력을 가진 단백질이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 표적화 단백질은 TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 결합하여 이들을 중화시킬 수 있는 항체이다. 본원에 사용된 "항체"는 TF 또는 FVIIa/TF 복합체의 에피토프에 결합할 수 있는 온전한 면역글로불린 ("Ig") 분자 뿐만 아니라 Fab, F(ab')2 및 Fv와 같은 그의 단편을 포함한다. 통상적으로, 에피토프를 형성하는 데에는 6, 8, 10 또는 12개 이상의 연속적인 아미노산이 필요하다. 그러나, 비연속적인 아미노산이 포함된 에피토프는 그 보다 많은, 예를 들어 15, 25 또는 50개의 아미노산이 필요할 수 있다.
통상적으로, TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 분석에 사용되는 경우 다른 단백질을 사용하여 제공된 검출 신호보다 5, 10 또는 20배 이상 높은 검출 신호를 제공한다. 바람직하게는, TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 분석에서 다른 단백질을 검출하지 못하며, 용액으로부터 TF 또는 FVIIa/TF 복합체를 면역침전시킬 수 있다.
TF 또는 FVIIa/TF 복합체는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 (guinea pig), 원숭이 또는 인간과 같은 포유동물을 면역화시켜 폴리클로날 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 바람직하다면, TF 또는 FVIIa/TF 복합체는 소 혈청 알부민, 티로글로불린 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin)과 같은 운반 단백질에 컨주게이션될 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 보조제를 사용해서 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제로는 프로인트 (Freund's) 보조제, 미네랄 겔 (예, 수산화 알루미늄), 및 표면 활성 물질 (예, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀)을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 인간에 사용되는 보조제 중에서, BCG (바실러스 칼메트-구에린 (bacilli Calmette-Guerin)) 및 코르니박테리움 파르붐(Cornybacterium parvum)이 특히 유용하다.
TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 배양물에서 연속 세포주에 의해 항체 분자를 제조하는 임의의 기술을 사용해서 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [Kohler et al. (1985) Nature 256:495-497]; [Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42]; [Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030]; 및 [Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120]).
또한, 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자로 스플라이싱시켜 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻는 기술인 "키메라 항체"의 제조를 위해 개발된 기술을 이용할 수 있다 (문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]; [Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608]; [Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454]). 또한, 모노클로날 및 다른 항체를 "인간화"시킴으로써 환자가 치료적으로 사용되는 항체에 대해 면역 반응을 수행하지 못하도록 할 수도 있다. 이러한 항체는 직접 사용될 인간 항체의 서열과 충분히 유사할 수 있거나 또는 몇몇 핵심 잔기의 변형을 필요로 할 수 있다. 설치류 항체와 인간 서열 사이의 서열 차이는, 각 잔기의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 인간 서열의 잔기와 상이한 잔기를 대체하거나 또는 전체 상보성 결정 영역을 이식 (grafting)하여 최소화할 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 GB2188638B에 기재된 바와 같은 재조합 방법을 이용해서 제조할 수 있다. TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 제5,565,332호에 개시된 바와 같이 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항원-결합 부위를 함유할 수 있다.
별법으로, 당업계에 공지된 방법을 이용해서 단일쇄 항체의 제조를 위한 기술을 변형하여 TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 단일쇄 항체를 제조할 수 있다. 관련된 특이성을 갖지만 구별되는 이디오타입 (idiotypic) 조성의 항체는 랜덤 조합의 Ig 라이브러리로부터의 쇄 셔플링 (chain shuffling)에 의해 생성시킬 수 있다 (문헌 [Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11120-11123]).
또한, 단일쇄 항체는 주형으로서 하이브리도마 cDNA를 사용하여 PCR과 같은 DNA 증폭 방법을 이용해서 구성할 수도 있다 (문헌 [Thirion et al. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5:507-511]). 단일쇄 항체는 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있으며, 2가 또는 4가일 수 있다. 4가의 이중특이적 단일쇄 항체의 구성은 예를 들어 문헌 [Coloma and Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15:159-163]에 교시되어 있다. 2가의 이중특이적 단일쇄 항체의 구성은 문헌 [Mallendar and Voss (1994) J. Biol. Chem. 269:199-216]에 교시되어 있다.
단일쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 수동 또는 자동 뉴클레오티드 합성을 이용해서 구성하고, 표준 재조합 DNA 방법을 사용해서 발현 구조물내에 클로닝하고, 세포내에 도입하여 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 별법으로, 단일쇄 항체는 예를 들어 필라멘트상 파지 디스플레이 기술을 이용해서 직접 제조할 수 있다 (문헌 [Verhaar et al. (1995) Int. J. Cancer 61:497-501] 및 [Nicholls et al. (1993) J. Immunol. Meth. 165:81-91]).
또한, TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 림프구 집단에서 생체내 생성을 유도함으로써 또는 문헌 [Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837] 및 [Winter et al. (1991) Nature 349:293-299]에 개시된 바와 같이 Ig 라이브러리 또는 고특이적 결합 시약의 패널을 스크리닝함으로써 제조할 수도 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 표적화 단백질은 TF에 결합하여 이를 중화시킬 수 있는 항체가 아닌 표적화 잔기이다. 이러한 2가지 예는 활성 부위가 억제된 인자 FVIIa (FVIIai) 및 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)이다.
FVIIa 및 FVIIai 둘 모두는 TF와 고친화도 복합체를 형성한다 (문헌 [Sorenson, B.B. and Rao, L.V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (Suppl 1):S67-71]). FVIIai는 노출된 TF와의 결합에 대해 내생 FVIIa와 경쟁함으로써 작용하는 TF 중화 항응고제이다. FVIIai는 FVIIa의 단백질 가수분해 활성 능력을 억제하여 컴피턴트 (competent) FVIIa-TF 복합체를 형성하며, 이러한 방식으로 응고 개시를 억제한다. TM 도메인을 FVIIai에 유전자적으로 융합시킴으로써, TM을 TF-풍부 전구혈전 (prothrombotic) 표면으로 표적화할 수 있다.
인간 FVII를 코딩하는 cDNA는 단리 및 서열분석되어 있다 (문헌 [Hagen, H.S. et. al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(8):2412-2416]; 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함). 인간 FVII cDNA는 인간의 간으로부터 단리된 mRNA로부터 출발하여 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제작될 수 있다. FVIIai는 활성 부위인 세린을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 돌연변이화시키거나, 또는 활성 부위를 비가역적으로 변형시켜 억제하는 펩티딜클로로메틸케톤으로 촉매적으로 활성인 FVIIa를 화학적으로 처리함으로써 제작될 수 있다.
TFPI는 FVIIa/TF 복합체를 FXa 의존적 방식으로 표적화하여 억제한다 (문헌 [Salemink, I. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(40):28225-28232]). TFPI는 우선 FXa에 결합하고, 이어서 TFPI-FXa 복합체가 FVIIa/TF 복합체에 결합하여 이를 억제한다. TFPI에 TM 도메인을 유전공학적으로 융합시킴으로써, TF가 풍부한 전구혈전 표면에 TM이 표적화될 수 있다.
인간 TFPI를 코딩하는 cDNA는 단리 및 서열분석 되어 있다 (문헌 [Wun, T.C. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004]; 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주함). 인간 TFPI cDNA는 인간의 간으로부터 단리된 mRNA에서 출발하여 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 표적화 단백질 (즉, 항체 또는 다른 관련 단백질)은 당업계에 공지된 방법에 의해 발현 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 단백질은 TF가 결합된 컬럼을 통과함으로써 친화도 정제될 수 있다. 이어서, 결합된 항체 또는 단백질은 높은 염 농도의 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 표적화 단백질은 FVIIa/TF 복합체에 의해 FX의 활성화를 억제하며 FVIIa 결합과 경쟁하지 않는 TF-결합 scFv 항체이다. TF-결합 scFv 항체를 제조하기 위해, 필라멘트상 파지에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리 HuPhaBL3을 고정된 가용성 TF에 대해 선별하였다. TF 결합 파지로부터의 항체를 이. 콜라이 (E. coli)에서 과다발현시키고, e-태그 컬럼을 이용하여 정제하였다. BIAcore를 이용한 sTF 의존성 인자 VIIa 분석법 (sTF/FVIIa 분석법), FX 활성화 분석법 및 PT 분석법으로, 정제된 항체의 특성을 추가로 규명하였다. scFv(TF)3e10으로 명명된 TF-결합 scFv 항체의 서열은 실시예 1에 나타나 있으며, 이는 서열 1과 상응한다. TF-결합 scFv 항체의 단리, 제조 및 특성 규명에 대해서는 하기에 보다 상세히 기재된다.
트롬보모둘린 (Thrombomodulin):
융합 단백질의 TM 도메인(들) 부분은 트롬빈 촉매에 의한 단백질 C 활성화에 있어서의 보조인자로서 작용하고, 이후에 인자 Va 및 VIIIa를 분해함으로써 추가의 혈전 형성을 예방한다. TM의 도메인으로는, 예를 들어 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프, EGF456 도메인, 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인이 있다. 특히, EGF456 도메인은 트롬빈 결합 및 단백질 C 활성화를 매개한다 (Kurosawa, S. et al. (1988), 상기 문헌; 및 Zushi, M. et al. (1989) 상기 문헌). 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질의 TM 도메인(들) 부분은 EGF456 도메인을 단독으로 포함할 수도, 또는 하나 이상의 다른 TM 도메인과 함께 포함할 수도 있다. 본 발명의 보다 더 바람직한 실시양태에서, EGF456 도메인은, 단백질이 산화성 손상 및 프로테아제에 대해 보다 내성이 커지도록하고(하거나) 단백질의 촉매 효율이 증가되도록 하는 점 돌연변이를 함유한다.
인간 TM을 코딩하는 전장 DNA 서열은 유전자의 제조를 용이하게 하고, TM과 TM의 단편/펩티드를 함유하는 융합 단백질 및 TM 펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 제작을 위한 출발점으로 이용된다.
TM에 대한 전장 유전자는 여러가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 상업적으로 시판되고 있다. 이들 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 공개된 유전자 서열을 이용하여 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 공지되어 있다. TM에 대한 유전자 서열의 공개 결과, 코딩 영역 내에 인트론이 없음이 입증되어 있다. 따라서, 게놈 클론은 공지의 방법을 이용한 TM용 발현 플라스미드 제작에 필요한 출발 물질을 제공한다.
TM 코딩 DNA 단편은 유전자의 측면에 위치하거나 유전자 내부에 있는 영역에서 확인된 제한효소 부위를 이용하여 얻을 수 있다 (Jackman, R.W. et al. (1987), 상기 문헌). 별법으로, 전장 유전자는 cDNA 뱅크로부터 얻을 수도 있다. 예를 들어, 내피 세포로부터 제조한 전령 RNA는 cDNA 제조에 적합한 출발 물질을 제공한다. cDNA 뱅크를 제조하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 문헌 [Sambrook, J.F. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] 참조).
융합 단백질:
본 발명의 항응고제 융합 단백질은 단독의 TM EGF456 도메인과 작동가능하게 연결되거나, 또는 TM EGF456 도메인 뿐 아니라 N-말단 소수성 영역 도메인, EGF123 도메인, EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 및 O-글리코실화 Ser/Thr-풍부 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 TM 도메인과 함께 TM EGF456 도메인과 작동가능하게 연결된, TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 결합하는 표적화 단백질, 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다. 융합 단백질은 임의로 조합된 TM의 도메인과 연결된 표적화 단백질을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 한 실시양태에서, 융합 단백질은 TM EGF456 도메인 및 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 ("TMi456")와 작동가능하게 연결된 TF에 결합하는 항체, 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에는, 단일쇄 항체의 C-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 부분에 융합된 구조물; IgG 항체의 C-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 부분에 융합된 구조물; Fab 항체의 C-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 부분에 융합된 구조물; 단일쇄 항체의 N-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 C-말단 부분에 융합된 구조물; IgG 항체의 N-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 C-말단 부분에 융합된 구조물; Fab 항체의 N-말단 부분이 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 C-말단 부분에 융합된 구조물; 2개 이상의 단일쇄 항체가 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 IgG 항체가 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 Fab 항체가 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체가 단일쇄 항체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체가 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체가 Fab 항체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물; 2개 이상의 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체가 다이머 단일쇄 항체의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 융합된 구조물이 포함되나, 이들에 제한되지는 않는다.
본 발명의 융합 단백질에는 실시예 (서열 2) 및 실시예 3 (서열 3)의 융합 단백질, 및 상기 서열에 실제로 변하지 않는 (insubstantial) 변이체를 갖는 융합 단백질이 포함된다. "실제로 변하지 않는 변이체"란 본 발명의 폴리펩티드가 지닌 하나 이상의 생물학적 기능 (바람직하게는 트롬빈에 의해 매개되는 단백질 C 활성화에 대한 보조인자 활성)을 실질적으로 유지하는 임의 서열의 치환 또는 결실 변이체를 포함하는 것이다. 이러한 기능적 등가물에는, 바람직하게는 서열 2 또는 3의 융합 단백질과 약 90％ 이상의 동일성을 갖는 융합 단백질, 보다 바람직하게는 서열 2 또는 3의 융합 단백질과 95％ 이상의 동일성을 갖는 융합 단백질, 보다 더 바람직하게는 서열 2 또는 3의 융합 단백질과 97％ 이상의 동일성을 갖는 융합 단백질, 및 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 지닌 상기 융합 단백질의 일부가 포함될 수 있다. 그러나, 서열 2 또는 3의 융합 단백질로부터 실제로 변하지 않는 아미노산 서열 변이체를 가지며 본원에서 추가로 설명하는 기능적 등가성을 나타내는 임의의 융합 단백질이 본 발명의 설명 내에 포함되는 것이다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 트롬빈에 의해 활성화될 수 있는 피브린 용해 활성화 인자 (thrombin-activatable fibrinolysis activator; TAFI)의 활성화에 필요한 TM 도메인 EGF3과 작동가능하게 연결된 TF에 결합하는 항체를 포함한다.
유사체, 단편, 유도체 및 변이체:
본 발명의 융합 단백질 및 표적화 단백질 또는 TM 도메인(들)의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고, 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않는 것; (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; (iii) 성숙 융합 단백질이 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합된 것; (iv) 리더 또는 분비 서열, 또는 성숙 융합 단백질의 정제에 사용되는 서열과 같은 부가 아미노산이 성숙 융합 단백질과 융합된 것; 또는 (v) 폴리펩티드 서열이 효과의 지속 시간을 증가시키기 위한 더 큰 폴리펩티드 (즉, 인간 알부민, 항체 또는 Fc)와 융합된 것일 수 있다. 그러한 유사체, 단편, 유도체 및 변이체는 본원의 교시 내용으로부터 당업자의 기술 범위 내에 있는 것으로 간주한다.
바람직하게는, 본 발명의 유도체는 하나 이상의 예상된 잔기, 바람직하게는 비필수 아미노산 잔기에서의 보존적 아미노산 치환 (하기에 추가로 정의됨)을 함유할 것이다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 야생형 단백질 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이며, "필수" 아미노산은 생물학적 활성에 필요한 잔기이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이들 군에는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 비보존적 치환은, 이러한 비보존적 치환에 의해 생성된 융합 단백질이 산화성 손상 및 프로테아제에 대해 보다 내성이 커지고(커지거나) 단백질의 촉매 효율이 증가하는 경우에만, 보존적 아미노산 또는 보존적 단백질 도메인 내에 있는 아미노산 잔기에 대해 이루어질 것이다. 단편 또는 생물학적 활성 부분에는 의약 및 연구용 시약 등으로서 사용하기 적합한 폴리펩티드 단편이 포함된다. 이러한 단편에는, 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열 또는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 폴리펩티드의 활성 중 하나 이상을 나타내지만 본원에 개시된 전장 폴리펩티드의 아미노산 서열보다는 개수가 작은 펩티드가 포함된다. 통상적으로, 생물학적 할성 부분은 폴리펩티드의 활성 중 하나 이상을 지닌 도메인 또는 모티프를 포함한다. 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어 길이가 5개 이상인 아미노산으로 이루어진 펩티드일 수 있다. 그러한 생물학적 활성 부분은 합성법 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으며, 본원에 개시된 수단 및(또는) 당업계에 널리 공지된 수단에 의해 본 발명 폴리펩티드의 기능적 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 유도체에는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키고(시키거나) 폴리펩티드의 잠재적 면역원성을 감소시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, "PEG")과 같은 다른 화합물과 융합된 성숙 융합 단백질이 포함된다. PEG는 융합 단백질에 수 용해도, 크기, 신장을 통한 제거 속도의 완화, 및 면역원성 감소를 부여하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,214,966호 참조). PEG화의 경우, 융합 단백질의 PEG와의 융합은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, PEG화는 우선 융합 단백질에 시스테인 돌연변이를 도입한 후에, PEG-말레이미드를 사용한 부위-특이적 유도체화에 의해 달성될 수 있다. 시스테인은 펩티드의 C-말단에 부가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tsutsumi et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15):8548-8553] 참조). 융합 단백질에서 이루어질 수 있는 다른 변형에는 비오틴화 (biotinylation)가 포함된다. 특정한 경우, 융합 단백질은 스트렙타비딘과 용이하게 반응할 수 있도록 비오틴화되는 것이 유용할 수 있다. 단백질의 비오틴화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 콘드로이틴 술페이트가 융합 단백질과 연결될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질, 표적화 단백질 및 TM 도메인(들)의 변이체에는 본래의 융합 단백질, 표적화 단백질 및 TM 도메인(들)의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"이란 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열이 공통의 구조 도메인 및(또는) 공통의 기능적 활성을 갖도록 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기는 충분한 개수로 함유하고 등가인 아미노산 잔기는 최소 개수로 함유하는 것을 의미한다. 예를 들어, 공통의 구조 도메인을 함유하며 약 45％ 이상, 바람직하게는 약 75％ 내지 98％ 동일한 아미노산 서열이 본원에서 충분히 유사한 것으로 정의된다. 바람직하게는, 변이체는 본 발명에 따른 바람직한 융합 단백질의 아미노산 서열과 충분히 유사할 것이다. 변이체에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체와 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 융합 단백질의 변이체가 포함된다. 그러한 변이체는 일반적으로 본 발명에 따른 융합 단백질의 기능적 활성을 보유한다. 폴리뉴클레오티드 단편의 라이브러리를 사용하여, 스크리닝 및 추후 선별을 위한 다채로운 단편 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 한 분자 당 약 1회의 닉 (nick)만이 발생하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 이중-가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중-가닥 DNA를 변성시키고, 상기 DNA를 복구시켜 상이한 닉 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중-가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레아제로 처리하여 변형된 이중체 (duplex)로부터 단일-가닥 DNA를 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 라이게이션시킴으로써 단편 라이브러리를 제조할 수 있다. 이 방법에 의해, 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 다양한 크기의 N-말단 단편 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.
변이체에는, 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열이 다른 융합 단백질, 및 표적화 단백질 및 TM 도메인(들)이 포함된다. 트롬빈에 의해 매개되는 단백질 C 활성화에 대한 보조인자 활성을 지닌 변이체는, 실시예 5에 기재된 단백질 C 활성화 분석법을 이용하여 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 TM 도메인(들)에 대한 돌연변이체 (예를 들어, 말단절단 (truncation) 또는 점 돌연변이체)의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. TF- 또는 FVIIa/TF 복합체-결합 활성을 지닌 변이체는, 실시예 5에 기재된 sTF/FVIIa 분석법 또는 FX 활성화 분석법을 이용하여 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 표적화 단백질에 대한 돌연변이체 (예를 들어, 말단절단 또는 점 돌연변이체)의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 또한, 융합 단백질의 생체등가성 (bioequivalent) 유사체는, 융합 단백질이 산화성 손상 또는 프로테아제에 대해 보다 내성이 커지도록 하거나 (예를 들어, 미국 특허 제5,827,824호 참조; 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주함) 융합 단백질의 촉매 효율을 증가시키는 (예를 들어, 문헌 [Adler, M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(40):23366-23372] 및 2001년 12월 27일 공개된 PCT 특허 출원 WO01/98352 참조; 상기 문헌 모두 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주함) 다양한 치환을 융합 단백질의 TM 도메인(들) 부분의 잔기 또는 서열에 도입함으로써 제작할 수 있다.
한 실시양태에서, 다채로운 변이체 라이브러리는 핵산 수준에서의 조합 돌연변이유발에 의해 생성되며, 다채로운 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 다채로운 변이체 라이브러리는, 예를 들어 잠재적 변이체 아미노산 서열의 다의성 (degenerate) 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 별법으로 서열들의 세트를 내부에 함유하는 큰 융합 단백질 세트 (예컨대, 파지 디스플레이를 위한 것)로서 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 효소에 의해 유전자 서열로 라이게이션시킴으로써 생성될 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 이용될 수 있는 방법은 다양하다. 다의성 유전자 서열의 화학 합성을 자동화 DNA 합성기에서 수행하고, 이어서 합성 유전자를 적당한 발현 벡터 내에 라이게이션시킬 수 있다. 다의성 유전자 세트를 사용하면, 잠재적 변이체 서열의 원하는 세트를 코딩하는 모든 서열을 하나의 혼합물에 제공할 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang (1983) Tetrahedron 39:3], [Itakura et al. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323], [Itakura et al. (1984b) Science 198:1056], [Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).
점 돌연변이 또는 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선별된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러가지 기술이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 기술은 융합 단백질, 및 표적화 단백질 및 TM 도메인(들)의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리를, 트롬빈에 의해 매개되는 단백질 C 활성화 또는 TF- 또는 FVIIa/TF 복합체-결합 활성에 대한 보조인자 활성에 대해 신속하게 스크리닝하도록 개조될 수 있다. 통상적으로, 고처리량 분석을 수행하여 대규모 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 이용되는 기술에는, 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터로 클로닝하는 것, 생성된 벡터 라이브러리로 적당한 세포를 형질전환시키는 것, 및 원하는 활성의 검출이 검출된 유전자 생성물을 코딩하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것이 포함된다. 라이브러리 내에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술인 순환성 앙상블 (recursive ensemble) 돌연변이유발 (REM)을 스크리닝 분석과 함께 이용하여 원하는 변이체를 확인할 수 있다.
융합 단백질의 제조:
본 발명의 융합 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 표적화 단백질을 TM 도메인(들) 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체와 융합시키거나 이와 결합시킴으로써 제조된다. 상기 2가지 성분은 널리 공지된 임의의 다양한 화학적 절차에 의해 화학적으로 함께 결합될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합은 헤테로-이관능성 가교결합 물질 (예를 들어, SPDP, 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등)에 의한 것일 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 표적화 단백질은 재조합 수단에 의해, 예를 들어 표적화 단백질과 TM 도메인(들) 코딩 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 핵산을 제조하고, 상기 DNA 서열을 이. 콜라이 (E. coli) 또는 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에서 발현시키는 재조합 DNA 기술을 이용하여 융합될 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 당업자에게 공지된 임의의 클로닝 절차에 의해 cDNA 형태 또는 게놈 DNA 형태로 클로닝될 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook, J. F. et al. (1989)] 참조).
표적화 단백질이 항체인 경우, 일단 DNA 서열이 발현시 특이적 결합 활성을 나타내는 Fv 영역을 코딩하는 것으로 확인되면, 상기 Fv 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 문헌 [Chaudhary, V.K. et al. (1989) Nature 339(6223):394-397], [Batra, J.K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265(25):15198-15202], [Batra, J.K. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21):8545-8549] 및 [Chaudhary, V.K. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(3):1066-1070]에는 다양한 단일쇄 항체 융합 단백질의 제조법이 기재되어 있다. Fv 영역은 TM 도메인(들)에 직접 융합될 수도, 또는 링커 서열을 통해 결합될 수도 있다. 링커 서열은 표적화 잔기와 TM 도메인(들) 사이에서 단지 공간을 제공하기 위해 존재할 수도, 또는 이들 영역 사이에서의 이동을 용이하게 하여 이들이 각각 최적 형태에 도달할 수 있도록 하기 위해 존재할 수도 있다. 연결부 (connector)를 포함하는 DNA 서열은 또한 클로닝을 용이하게 하는 서열 (예를 들어, 프라이머 또는 제한효소 부위)을 포함하거나, 또는 표적 잔기를 코딩하는 서열과 TM 도메인(들)을 코딩하는 서열 사이에서 리딩 프레임을 유지할 수 있다. 그러한 연결부 펩티드의 디자인은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 있어서, 링커 서열은 표적화 단백질을 TM 도메인(들)과 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서는, 단일쇄 항체, TM EGF456 도메인, 및 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프 (TMi456)로 구성된 융합 단백질을 제작하기 위해 2개의 링커를 사용한다. 제1 링커는 단일쇄 항체의 중쇄 도메인과 경쇄 도메인을 연결한다. 제1 링커 서열은 아미노산 5개의 길이이다. 0 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 다른 짧은 링커 서열도 사용될 수 있음은 명백할 것이다. 본 발명의 제2 링커는 항체를 TM 도메인(들)과 연결시키는, 15개 아미노산의 링커이다. 당업자에게는 다수의 다른 링커 서열이 사용될 수 있고, 그러한 서열이 사용되더라도 항응고 활성 및 단백질 C 활성화 능력을 보유하는 융합 단백질이 생성될 수 있음이 명백할 것이다. 기존의 링커를 변형하여, TF-함유 포스포리피드 표면 상에서의 단백질 C 활성화를 최대로 증진시킬 수 있을 것이다.
바람직한 접근법에서, 단일쇄 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 제조하였다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하는 제1 단계에서, 인간 골수, 림프절 및 비장으로부터 수집한 mRNA로부터 군에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 가변 유전자 [(IgM으로부터의) VH, Vκ 및 VL]를 PCR 클로닝하였다. 생성된 pCITE-VH (3.8 ×109개), pZ604-Vκ (1.6 ×107개) 및 pZ604-V L (3.2 ×107개) 라이브러리는 영구적인 고밀도의 V 유전자를 나타낸다. VH 유전자를 pCITE-VH 라이브러리로부터 증폭하였다. Vκ 및 VL 유전자를, 5' 말단의 링커 서열 및 역방향 JH 를 사용하여 pZ604-Vκ 및 pZ604-VL 라이브러리로부터 증폭하였다. 이어서, PCR 생성물을 함유하는, 겔에서 정제된 VH, Vκ 및 VL을 함께 스플라이싱하여 scFv 유전자 레파토리를 제조하였다. scFv 유전자 레파토리를 파지미드 벡터인 pZ603에 클로닝하고, 라이게이션 생성물을 컴피턴트 TG1 이. 콜라이 (E. coli) 세포 내로 전기천공 (electroporation)시켜 scFv 파지 디스플레이 라이브러리인 HuPhabL3 (개별 형질전환체 5.2 ×109개)을 생성하였다 (문헌 [Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA]; [Marks, J.D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222(3):581-597]; [Sheets, M.D. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6157-6162]).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, TF에 대한 단일 VH/VL 결합 부위를 갖는 단일쇄 항체 (scFv(TF)3e10)를 제조하였다. scFv(TF)3e10의 아미노산 서열 (서열 1)은 실시예 1에 도시되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, NotI 부위가 측면에 위치한 TMi456 서열을 함유하는 PCR 단편 (M388L 및 H381G 돌연변이)을 pZ612/3e10 (파마시아 (Pharmacia)로부터의 pCANTAB5에 기초한 scFv(TF)3e10 발현용 박테리아 벡터)의 NotI 부위에 서브클로닝하였다. 본원에서, 본 발명에 따른 융합 단백질의 TM 부분에서의 점 돌연변이는 천연 TM의 아미노산에 대한 1글자 명칭 뒤쪽에 성숙 TM의 아미노산 위치 번호와 돌연변이 아미노산의 1글자 명칭을 기입하여 특정한다. 예를 들어, M388L은 성숙 TM의 388 아미노산 위치에 있는 메티오닌이 류신으로 변했음을 나타낸다. NotI 부위는 항체 서열과 e-태그 서열 사이에 있다. 그 결과, scFv(TF)3e10 - 15개의 아미노산 링커 - TMi456, 그리고 그 뒤쪽에 있는 e-태그 서열로 구성된 융합 단백질에 대한 박테리아 발현 구조물 (pKM101)이 생성되었다. 포유동물 발현 벡터를 생성하기 위해, 우선 pKM101 주형으로부터 PCR 단편을 생성하였다. 이 단편은 TM 발현 벡터인 pTHR525의 StuI/MscI 부위로의 라이게이션을 위해 디자인되었다. 그 결과, 솔룰린 (Solulin) 신호 서열과 그 뒤쪽에 순차적으로 성숙 융합 단백질에 대한 서열 및 e-태그 서열을 갖는 벡터 (pKM113)가 생성되었다. 이 벡터는 앰피실린 내성 유전자와, 하이드로마이신 및 DHFR 선별 마커를 함유한다. 발현은 MPSV LTR 프로모터에 의해 유도된다. 상기 벡터에 부위 지정 돌연변이유발 (site directed mutagenesis)을 수행하여, TM 부분에 프로테아제 내성을 부여하는 R456G 및 H457Q 돌연변이를 포함시켰다. 생성된 벡터를 pKM115로 명명한다. pMK115 벡터는 VH 도메인과 VL 도메인을 분리하는 15개 아미노산의 링커, 및 VL 도메인과 TMi456을 분리하는 다른 15개 아미노산의 링커를 갖고 있었다. VH 도메인과 VL 도메인을 분리하는 링커를 5개의 아미노산으로 감소시켜 다이머 형성 경향이 높은 다이머를 형성하였고, 이를 pHM115.5로 명명하였다. pHM115.5에 의해 코딩되는 융합 단백질인 scFv(TF)3e10-TMi456 (서열 2)은 실시예 2에 도시되어 있다. 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여, VH 도메인과 VL 도메인을 분리하는 5개 아미노산의 링커 사이에서 3개의 아미노산 (GAP)을 결실시키고, 융합 단백질의 C-말단에서 e-태그를 결실시킴으로써, 추가의 벡터 pKM125를 생성하였다. 생성된 융합 단백질인 scFv(TF)3e10-TMi456Δ (서열 3)은 실시예 3에 도시되어 있다.
융합 단백질의 발현 및 정제:
이. 콜라이 (E. coli), 배큘로바이러스, 효모, 포유동물 세포 또는 다른 발현 시스템을 비롯하여, 시험관내에서 재조합 융합 단백질을 발현하는 여러가지 방법이 있다. 클로닝된 유전자를 박테리아에서 발현하는 방법은 널리 공지되어 있다. 클로닝된 유전자를 원핵세포 시스템에서 높은 수준으로 발현시키기 위해서는, 최소한 강력한 프로모터를 함유하여 mRNA 전사 종결을 유도하는 발현 벡터를 제작하는 것이 필수적이다. 이러한 목적에 적합한 조절 영역의 예로는 이. 콜라이 (E. coli) 베타-글루코시다제 유전자의 프로모터 및 오퍼레이터 (operator) 영역, 이. 콜라이 (E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터, 또는 파지 람다로부터의 왼쪽방향 (leftward) 프로모터가 있다. 이. 콜라이 (E. coli)에 형질전환된 DNA 벡터 내에 선별 마커를 포함시키는 것이 유용하다. 그러한 마커의 예로는 앰피실린, 테트라싸이클린 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 특정하는 유전자가 있다.
융합 단백질 및 그의 유사체를 발현하는 데 유용한 다른 고등 진핵세포 시스템 중에서, 무수한 세포 시스템을 선택할 수 있다. 포유동물 세포주의 예로는 RPMI 7932, VERO 및 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7, C127 또는 MDCK 세포주가 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 포유동물 세포주는 CHL-1이다. CHL-1이 사용되는 경우, 진핵세포 선별 마커로서 하이그로마이신이 포함된다. CHL-1 세포는 용이하게 입수가능한 인간 세포주인 RPMI 7032 흑색종 세포로부터 유래한 것이다. CHL-1 세포주는 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 1987년 6월 18일자로 기탁되어 #CRL 9446을 지정받았다. 본 발명에 사용하기 적합한 세포는 ATCC로부터 구입가능하다. 세포주의 예로는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)가 있다.
원핵세포 시스템인 이. 콜라이 (E. coli)에는 글리코실화와 같은 번역후의 변형 과정이 없다. 또한, 복잡한 이황화 패턴을 갖는 단백질이 이. 콜라이 (E. coli)에서 별현되는 경우에 잘못 폴딩되는 경우가 있다. 본원에 기재된 융합 단백질의 경우, 상기한 2가지 활성이 존재하기는 하였지만 트롬보모둘린 보조인자 활성이 현저하게 감소하였다. 원핵세포 시스템에 있어서, 발현된 단백질은 소위 봉입체 (inclusion body) 형태로 세포의 세포질 내에 존재 (세포를 용해시킨 후에는 가용성 분획에서 발견됨)하거나, 또는 적당한 분비 신호 서열의 부가에 의해 세포질 주변으로 이동하여 존재한다. 발현된 단백질이 불용성 봉입체인 경우, 봉입체의 가용화 및 후속 재폴딩이 통상적으로 필요하다.
상업적으로 시판되는 pKK223-3 (파미시아 파인 케미칼스 (Pharmacia Fine Chemicals; Uppsala, Sweden)), pKK233-2 (클론테크 (Clontech; Palo Alto, CA, USA)) 및 pGEM1 (프로메가 바이오테크 (Promega Biotech; Madison, WI, USA))과 같은 많은 원핵세포 발현 벡터가 당업자에게 공지되어 있다.
재조합 미생물 발현 시스템에 통상적으로 사용되는 프로모터로는 베타-락타마제 (페니실리나제) 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275(5681):617-624]; [Goeddel, D.V. et al. (1979) Nature 281(5732):544-548]), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, D.V. et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8(18):4057-4074]) 및 tac 프로모터 (문헌 [Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)])가 있다. 다른 유용한 박테리아 발현 시스템은 람다 파지 pL 프로모터 및 clts857 열-유도가능한 리프레서 (thermoinducible repressor) (문헌 [Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5(1):59-76]; [Love, C.A. et al. (1996) Gene 176(1-2):49-53])를 이용한다. 재조합 융합 단백질은 또한 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 숙주에서 발현될 수도 있다. 효모는 대체로 다양한 번역후의 변형을 수행하는 능력을 제공한다. 발현된 융합 단백질은 다른 다수의 단백질이 존재하지 않는 배양 상층액으로 분비되어 정제를 보다 용이하게 할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 발현하기 위한 효모 벡터는 특정한 필수 특징을 함유한다. 이 벡터의 성분은 일반적으로 효모 및 박테리아로부터 유래하여 상기 미생물 둘 다에서 플라스미드의 증식이 가능하다. 박테리아에서 유래한 성분으로는 복제 기점 및 선별 마커가 있다. 효모에서 유래한 성분으로는 복제 기점 서열 (ARS), 선별 마커, 프로모터 및 전사 터미네이터가 있다.
발현용 효모 벡터에 포함된 적합한 프로모터로는 TRP1 유전자의 프로모터, ADH1 또는 ADHII 유전자의 프로모터, 산 포스파타제 (PH03 또는 PH05) 유전자의 프로모터, 이소시토크롬 유전자의 프로모터, 또는 해당 과정에 관여하는 프로모터 (예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GADPH), 3-포스포글리세레이트 키나아제 (PGK), 헥소키나아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제 및 포스포글루코스 이소머라제의 프로모터)가 있다 (문헌 [Hitzeman, R.A. et al. (1980) J. Biol. Chem. 255(24):12073-12080]; [Hess, B. et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149-167]; 및 [Holland, M.J. and Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17(23):4900-4907]).
상업적으로 시판되는 효모 벡터로는 pYES2, pPIC9 (인비트로젠 (Invitrogen; San Diego, CA)), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (워싱턴 리서치 (Washington Research; Settle, WA)), pBC102-K22 (ATCC #67255) 및 YpGX265GAL4 (ATCC #67233)가 있다. COS-7, L 세포, C127, 3T3, 차이니스 햄스터 난소 (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO 및 HEK293 등을 비롯한 포유동물 세포주도 본 발명의 재조합 융합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 생산된 재조합 단백질은 통상적으로 가용성이고, 글리코실화되며, 진정한 N-말단을 가지고 있다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 프로모터 및 인핸서와 같은 비-전사 성분; 및 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 수용체 부위 및 스플라이스 공여체, 및 전사 종결 서열과 같은 5' 또는 3' 비번역 서열을 함유할 수 있다. 대체로, 포유동물 발현 벡터에 사용하는 프로모터는, 예를 들어 폴리오마, 아데노바이러스, HTLV, 원숭이 바이러스 40 (SV 40) 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)와 같은 바이러스 프로모터이다.
발현 시스템 및 선택된 숙주에 따라, 단백질 정제를 위해 통상적으로 사용되는 크로마토그래피를 다양하게 조합하여 이용함으로써 균일한 재조합 융합 단백질을 수득할 수 있다. 이러한 크로마토그래피에는 면역친화도 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 HPLC가 포함된다. 발현 시스템이 융합 단백질을 증식 배지로 분비하는 경우에는 이 단백질을 배지로부터 직접 정제할 수 있다. 융합 단백질이 분비되지 않는 경우, 이 단백질은 세포 용해물로부터 단리된다. 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 통상적인 방법을 이용하여 세포를 파쇄할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 발현 구조물을 CHO DXB11 세포 내로 형질감염시켰다. HAMS/F12 배지 중 400 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B를 사용하여 안정한 군집을 선별하였다. 발현 수준은 대략 500 ㎍/ℓ였다. 발현 수준을 증가시키기 위해, 알파 MEM 배지 중 100 nM의 메토트렉세이트를 사용하여 소정의 군집을 선별하였다. 이 군집의 발현 수준은 대략 5 ㎎/ℓ였다.
융합 구조물은 단백질의 C-말단에 e-태그 서열을 함유한다. 항-e-태그 친화도 컬럼을 아메리칸/파마시아 바이오테크 (American/Pharmacia Biotech)로부터 구입하였다. 0.22 ㎛ 필터를 통해 세포 배양 배지를 여과하여, 2 ㎖/분의 유속으로 5 ㎖의 e-태그 컬럼에 로딩하였다. 0.2 M 포스페이트 완충액/0.05％ NaN3 (pH 7.0)으로 컬럼을 세척한 후, 용출 완충액을 중화시키기 위한 1 M 트리스 완충액 (pH 8.2)이 0.1배 부피로 들어있는 튜브에 용출액을 수집하였다. 별법으로, 여과된 배양 배지를 단백질 A 컬럼에 로딩하였다. 이 경우, 50 mM 시트르산/300 mM NaCl (pH 6.5)로 컬럼을 세척하고, pH 3.0의 동일한 완충액으로 용출하였다. 상기 2가지 모두의 경우에, 정제된 샘플을 후속적으로 세파덱스 (Sephadex) 200 컬럼에 로딩하여 융합 단백질의 다이머 형태로부터 모노머를 분리하였다.
제약 조성물:
또한, 본 발명은 치료 효과를 달성하기 위해 환자에게 투여될 수 있는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은, 원하는 정도의 순도를 갖는 융합 단백질을 제약상 허용되는 제약상 유효량의 담체와 조합하여 투여하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 정맥내 투여, 피하 투여 또는 경막내 투여용 제약 조성물에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 기재된 융합 단백질은 5％ 덱스트로스, 락테이트 처리된 링거액, 통상의 염수, 멸균수, 또는 정맥내 관주용으로 디자인된 임의의 다른 시판용 생리 완충액과 같은 허용가능한 멸균 제약 담체와 조합되는 것이 바람직하다. 담체 용액의 선택, 및 조성물의 투여량 및 투여법은 대상체 및 특정한 임상적 환경에 따라 달라질 것이고, 이것이 표준 의학 절차에 의해 제어된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 이들 제약 조성물은 대상체에서의 과량의 트롬빈 생성과 관련한 병리적 결과를 억제하는 데 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
융합 단백질은 정맥내 볼루스 주사, 일정한 정맥내 관주, 또는 상기 2가지 경로의 조합에 의해 투여될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 적당한 부형제와 혼합된 융합 단백질은 근육내 부위로부터 순환될 수 있다. 융합 단백질을 사용한 전신 처치는, 환자로부터 채취한 일련의 혈액 샘플에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (PT)을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이 분석법에서 관찰된 응고 시간은, 융합 단백질이 순환계에 충분한 양으로 존재하는 경우에 연장된다.
본 발명의 재조합 융합 단백질 및 제약 조성물은 비경구, 국소, 정맥내, 경구 또는 국부 투여에 유용하다. 투여 방법에 따라, 제약 조성물은 다양한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 단위 투여 형태는 정제, 캡슐, 분말, 용액 및 에멀젼 등을 비롯한 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 재조합 융합 단백질 및 제약 조성물은 정맥내 투여에 특히 유용하다. 투여용 조성물은 통상적으로 단일쇄 항체의 용액을 포함하거나, 또는 제약상 허용되는 담체 (바람직하게는 수성 담체) 중에 용해된 단일쇄 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함할 것이다. 예를 들어, 완충 염수 등과 같은 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균된 것이며, 일반적으로 원치않는 물질이 없는 것이다. 이 조성물은 널리 공지된 통상의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
통상적인 정맥내 투여용 제약 조성물은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여되는 양은 분명히 단백질에 특이적이며, 그의 효능 및 약물동력학적 프로파일에 따라 달라진다. 비경구 투여용 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 분명한 것이며, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980)]과 같은 간행물에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 그의 칵테일 (즉, 다른 단백질과의 혼합물)을 함유하는 조성물은 치료제로서 투여될 수 있다. 치료 분야에 있어서, 조성물은 출혈성 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자에게, 출혈을 치유하거나 적어도 출혈을 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적당한 양을 "치료 유효량"으로 정의한다. 이 용도에 효과적인 양은 질환의 중증도 및 환자의 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
환자가 필요로 하고 허용할 수 있는 투여량 및 투여 빈도에 따라, 조성물을 1회 또는 다수회 투여할 수 있다. 어떤 경우에든, 상기 조성물은 환자를 치료하기에 효과적인 충분한 양으로 본 발명의 단백질을 제공해야만 한다.
본 발명의 융합 단백질 또는 그의 제약상 허용되는 조성물은, 사용된 특정 융합 단백질의 활성; 융합 단백질의 대사 안정성 및 작용 지속 시간; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 방식 및 투여 시간; 배설 속도; 약물 병용 여부; 구체적인 질환 상태의 중증도; 치료법을 수행받는 숙주를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라지는 치료 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 일일 치료 유효량은 하루에 체중 1 ㎏당 본 발명의 융합 단백질 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 약 0.14 ㎎ 내지 약 14.3 ㎎으로 투여하는 것이고, 바람직하게는 하루에 체중 1 ㎏당 약 0.7 ㎎ 내지 약 10 ㎎으로 투여하는 것이며, 가장 바람직하게는 하루에 체중 1 ㎏당 약 1.4 ㎎ 내지 약 7.2 ㎎으로 투여하는 것이다. 예를 들어, 체중이 70 ㎏인 사람에게 투여하는 경우, 투여량 범위는 본 발명의 융합 단백질 또는 제약상 허용되는 그의 조성물 약 10 ㎎/일 내지 약 1.0 g/일이고, 바람직하게는 약 50 ㎎/일 내지 약 700 ㎎/일이며, 가장 바람직하게는 약 100 ㎎/일 내지 약 500 ㎎/일이다.
유전자 치료법:
또한, 본 발명의 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 생체내에서 발현시킴으로써 (대체로 "유전자 치료법"으로 언급됨) 본 발명에 따라 사용될 수도 있다. 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)로 세포를 생체외에서 유전공학적으로 조작하고, 이어서 융합 단백질로 처치될 환자에게 상기 조작된 세포를 제공할 수 있다. 이런 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 당업계 공지의 절차에 의해 세포를 유전공학적으로 조작할 수 있다.
유전자 치료법을 이용하여 본 발명의 항응고제 융합 단백질을 국부 전달함으로써, 표적 영역 (내피 세포 연결 혈관)에 치료제를 제공할 수 있다.
시험관내 및 생체내 둘 모두의 유전자 치료법을 고려할 수 있다. 잠재적 치료 유전자를 정해진 세포 군집으로 전달하는 여러가지 방법이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mulligan (1993) Science 260:926-931] 참조). 이러한 방법으로는 하기 전달 방법이 포함된다:
1) 직접 유전자 전달 (예를 들어, 문헌 [Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468] 참조);
2) 리포좀에 의해 매개되는 DNA 전달 (예를 들어, 문헌 [Caplen et al. (1995) Nature Med. 3:39-46], [Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17], [Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285] 참조);
3) 레트로바이러스에 의해 매개되는 DNA 전달 (예를 들어, 문헌 [Kay et al. (1993) Science 262: 117-119], [Anderson (1992) Science 256:808-813] 참조);
4) DNA 바이러스에 의해 매개되는 DNA 전달 (상기 DNA 바이러스에는 아데노바이러스 (바람직하게는 Ad2 또는 Ad5에 기초한 벡터), 허피스 바이러스 (바람직하게는 허피스 심플렉스 바이러스에 기초한 벡터) 및 파르보바이러스 (바람직하게는 "결함" 또는 비-자발성 파르보바이러스에 기초한 벡터, 보다 바람직하게는 아데노-관련 바이러스에 기초한 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2에 기초한 벡터)가 포함됨; 예를 들어, 문헌 [Ali et al. (1994) Gene Therapy 1:367-384], 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 미국 특허 제4,797,368호, 및 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 미국 특허 제5,139,941호 참조).
목적하는 유전자를 전달하기 위한 특정 벡터 시스템은 다양한 인자에 따라 다르게 선택될 것이다. 중요한 인자 중 하나는 표적 세포 군집의 성질이다.
레트로바이러스 벡터가 널리 연구되고, 다수의 유전자 치료법 응용에 사용되지만, 이들 벡터는 비-분열 세포 감염에는 일반적으로 적합하지 않다. 또한, 레트로바이러스는 종양 형성에 대한 잠재력을 가진다. 그러나, 렌티바이러스 벡터 분야에서의 최근 발전은 이들 일부 제한을 교묘하게 회피할 수 있다 (문헌 [Naldini et al. (1996) Science 272: 263-267] 참조).
상술된 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스에는 몰로니 뮤린 (Moloney Murine) 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예컨대 로우스 육종 바이러스, 하비 (Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유도된다.
아데노바이러스는 넓은 숙주 범위를 가지고, 무활동 또는 최종적으로 분화된 세포, 예컨대 뉴런 또는 간세포를 감염시킬 수 있고, 실질적으로 비-종양 형성으로 나타나는 장점을 가진다 (Ali et al. (1994), 상기 문헌, p. 367 참조). 아데노바이러스는 숙주 게놈 내로 삽입되는 것으로 보이지는 않는다. 아데노바이러스가 염색체외에 존재하기 때문에, 삽입 돌연변이유발의 위험이 크게 감소된다 (Ali et al. (1994), 상기 문헌, p. 373 참조).
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 아데노바이러스-기재 벡터로서 유사한 장점을 나타낸다. 그러나, AAV는 인간 염색체 19에 대한 부위-특이 삽입을 나타낸다 (Ali et al. (1994), 상기 문헌, p. 377).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 코딩 DNA는 심부정맥 혈전증, 산재성 혈관내 응고증, 급성 관상동맥 증후군 또는 응고증을 수반하는 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 질병에 대한 유전자 치료법에 사용된다.
이 실시양태에 따라, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 사용하는 유전자 치료법은 진단과 동시에 또는 직후에 그 치료가 필요한 환자에게 제공된다.
당업자는 본 발명의 융합 단백질 코딩 DNA 또는 본 발명의 융합 단백질의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체 코딩 DNA를 함유하는 임의의 적합한 유전자 치료법 벡터가 이 실시양태에 따라 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 벡터의 작제에 대한 기술은 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Anderson, W.F. (1998) Nature 392:25-30]; [Verma I.M. and Somia, N. (1998) Nature 389:239-242] 참조). 표적 부위로의 융합 단백질 DNA-함유 벡터의 도입은 공지된 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
유전자 치료법 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터에는 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CVM) 프로모터 (문헌 [Miller et al. (1989) Biotechniques 7(9):980-990]에 기재됨), 또는 임의의 다른 프로모터 (예컨대, 세포 프로모터, 예컨대 히스톤, pol III, 및 β-액틴 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 진핵 세포 프로모터)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터에는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제 (TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선별은 본원에 포함된 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터에는 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터; 또는 이종성 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터; 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 프로모터; 유도가능 프로모터, 예컨대 MMT 프로모터, 메탈로티오네인 (metallothionein) 프로모터; 열 충격 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예컨대 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR (상술된 변형 레트로바이러스 LTR을 포함함); β-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주를 형질도입시켜 프로듀서 세포주를 형성시키는 데 사용된다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예에는 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+#-86, GP+envAm12, 및 문헌 [Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14]에 기재된 DAN 세포주가 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다. 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방식을 통해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이러한 방식에는 전기천공법, 리포좀의 사용법, 및 CaPO4 침전법이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 별법으로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀 내로 캡슐화하거나 또는 지질에 커플링하고, 이어서 숙주에 투여할 수 있다. 프로듀서 세포주는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 이어서 시험관내 또는 생체내에서 진핵 세포를 형질도입시키는 데 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포에는 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포 뿐만 아니라, 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근육모세포, 각질형성세포, 내피 세포, 및 기관지 상피 세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
유전자 치료법에 대한 다른 접근법은 휴지기의 염색체 유전자를 유도하도록 환자의 세포를 체외에서 처리하여 환자에 재도입시킨 후에 목적하는 단백질을 생산하는 "트랜스케리오틱 치료법 (transkaryotic therapy)"이다. 트랜스케리오틱 치료법은 개체가 활성화에 요구되는 유전자의 정상적인 보완물을 가지는 것으로 추정한다. 트랜스케리오틱 치료법은 초기 유전자를 활성화시킬 수 있는 프로모터 또는 다른 외생 조절 서열을 체외에서 환자 세포의 염색체 DNA 내로 도입시키는 것, 활성 단백질-생산 세포에 대한 배양 및 선별, 및 이어서 활성화된 세포를 완전히 정착시킬 목적으로 환자 내로 재도입시키는 것을 수반한다. "유전자 활성화된" 세포는 이어서 얼마의 유의한 시간 동안, 가능하다면 환자가 생존하는 만큼 목적하는 단백질을 생산한다. 미국 특허 제5,641,670호 및 동 제5,733,761호에 이 개념이 상세히 개시되어 있으며, 이들 전문이 본원에 참고로 인용된다.
키트:
본 발명은 또한 연구용 또는 진단용 키트와 관련된다. 키트는 전형적으로 본 발명의 단일쇄 항체를 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 키트는 유도체화에 적합한 형태의 단일쇄 항체를 제2 분자, 예컨대, TM 도메인(들) 또는 그의 단편과 함께 함유하는 용기를 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, 키트는 서열 2 또는 서열 3의 융합 단백질을 함유하는 용기를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 키트는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는 이들 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 그에 의한 발현에 적합한 플라스미드에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서 DNA의 발현을 조절하는 프로모터 (종종, 유도가능한 프로모터)를 함유할 수 있다. 또한, 플라스미드는 다른 DNA 서열을 플라스미드 내로 삽입하여 각종 융합 단백질의 생산을 촉진하는 적절한 제한효소절단 부위를 함유할 수 있다. 또한, 플라스미드는 클로닝 및 코딩 단백질의 발현을 촉진하는 다수의 다른 요소를 함유할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 여기에는 예를 들면 선별가능 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등이 포함된다.
치료적 처방:
혈전 형성이 유의한 병인학적 역할을 수행하는 질환에는 심근 경색증, 산재성 혈관내 응고증, 심부정맥 혈전증, 폐색전증, 허혈성 쇼크, 패혈성 쇼크, 급성 호흡 곤란 증후군, 불안정성 협심증 및 다른 동맥 및 정맥 폐색 증상이 포함된다. 본 발명의 융합 단백질이 이들 모두 뿐만 아니라 혈전 형성이 병리인 다른 질환에 유용하다. 본 발명의 융합 단백질이 유용할 수 있는 다른 병리학적 증상에는 응고증 및 염증을 수반하는 암이 포함된다. 화합물은 또한 피부 및 정맥 이식편 및 기관 이식물에서 용도를 찾을 수 있다. 이 유용성은 화합물이 질환을 예방하거나 또는 더 중증으로의 그의 진행을 차단하기 위한 처리에 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 화합물은 예를 들면 생체적합-보철물 (bioprostheses), 예컨대 심장 밸브를 가진 환자에게 안전하고 유효한 항응고제를 제공한다. 이들 화합물은 예를 들면 폐색전증 또는 급성 심근 경색증의 치료에서 헤파린 및 와파린을 대신할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 응고가 중요한 문제인 코팅 의료 장치에서 용도를 찾을 수도 있다.
분석:
본 발명의 융합 단백질의 TM 활성을 측정하기 위한 다수의 실험실 분석을 이용할 수 있다. 단백질 C 활성은 문헌 [Salem, H.H. et al. (1984), 상기 문헌], 및 [Galvin, J.B. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262(5):2199-2205]에 기재된 분석으로 측정할 수 있다. 요약하면, 분석은 2 단계로 이루어진다. 제1 단계는 정해진 조건하에 시험 융합 단백질을 트롬빈 및 단백질 C와 인큐베이션하는 것이다. 제2 단계에서, 트롬빈은 히루딘 또는 항트롬빈 III 및 헤파린에 의해 불활성화되고, 활성화된 단백질 C의 단백질가수분해 활성에 의해 발색체가 유리되는 발색성 기질을 사용하여 새롭게 활성화된 단백질 C의 활성을 측정한다. 이 분석은 정제된 제제를 사용하여 수행된다.
별법으로, 혈장 응고 시간 분석, 예컨대 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT), 트롬빈 응고 시간 (TCT) 및(또는) 프로트롬빈 시간 (PT)을 이용하여 융합 단백질의 효과를 측정할 수 있다. 이들 분석은 응고 억제의 상이한 메카니즘들을 구별하고, 단백질 C의 활성화를 수반한다. 임의의 하나의 이들 분석에서 응고 시간의 연장은 분자가 혈장의 응고를 억제할 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
상기 분석은 모든 정제 시스템 및 혈장 주위에서 트롬빈에 결합하고 단백질 C를 활성화시킬 수 있는 TM 활성을 갖는 융합 단백질을 동정하기 위해 사용된다. 이어서, 추가의 분석이 천연 TM의 다른 활성, 예컨대 피브리노겐으로부터의 피브린의 트롬빈 촉매 형성에 대한 억제 (문헌 [Jakubowski, H.V. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261(8):3876-3882]), 인자 V의 트롬빈 활성화의 억제 (문헌 [Esmon, C.T. et al. (1982). J. Biol. Chem. 257(14):7944-7947]), 항트롬빈 III 및 헤파린 보조인자 II에 의한 트롬빈의 가속화된 억제 (문헌 [Esmon, N.L. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258(20):12238-12242]), 인자 XIII의 트롬빈 활성화의 억제 (문헌 [Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58(1):140]), 단백질 S의 트롬빈 매개 불활성화의 억제 (문헌 [Thompson, E.A. and Salem, H.H. (1986) J. Clin. Inv. 78(1):13-17]), 및 트롬빈 매개 혈소판 활성화 및 응집의 억제 (문헌 [Esmon, N.L. et al. (1983), 상기 문헌])를 평가하기 위해 사용된다.
하기 실시예 5에 상세히 기재하는 하기 분석은 본 발명의 융합 단백질의 하기 시험관내 효능을 측정하기 위해 사용한다: 1) 단백질 C 활성화 분석 (발색성); 2) sTF/FVIIa 활성화 분석; 3) 인자 X 활성화 분석; 및 4) 단백질 C 활성화 분석 (TF-풍부 표면 상에서).
본 발명의 방법의 수행에서, 특정 완충액, 매질, 시약, 세포, 배양 조건 등에 대한 참조는 제한되지 않지만, 당업자가 논의가 있는 특정 상황에서 목적하거나 또는 유용한 것으로 인지하는 모든 관련 재료를 포함하도록 해석되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 종종 완충액 시스템 또는 배양 배지를 또다른 것으로 대체하여 동일하지는 않더라도 여전히 유사한 결과를 달성할 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 방법 및 절차를 이용하여 그의 목적을 최적으로 제공할 만큼 과도한 실험 없이 이러한 대체를 수행할 수 있도록 이러한 시스템 및 방법에 대해 충분한 지식을 가질 것이다.
본 발명을 이제 추가로 비-제한적인 실시예로서 설명할 것이다. 실시예의 개시함에 있어서, 본 발명에 따라 개시된 방법과 상이한 다른 실시양태는 당업자에게 의심할 바 없이 그 자체를 제시할 것임을 분명히 유념하여야 한다.
추가 상세한 설명이 없더라도, 당업자는 상기 설명을 이용하여 본 발명을 완전한 수준까지 이용할 것으로 생각된다. 따라서, 하기 바람직한 특정 실시양태는 단지 설명을 위함이지 어떠한 방식으로 무엇이든 개시된 것을 제한하려는 것이 아니다.
상기 및 하기 실시예에서, 달리 지시하지 않은 한 모든 온도는 섭씨로 정정하여 기재하지 않고, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다.
상기 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.
*****
하기 실시예는 본 발명의 실행을 돕는 지침으로서 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
단일쇄 항-TF 항체 구조물 scFv(TF)3e10
단일쇄 항-TF 항체 scFv(TF)3e10 (서열 1)은 신호 펩티드 (-18 내지 -1), VH 도메인 (1 내지 126), VHVL 링커 (127 내지 131), VL 도메인 (132 내지 246), 및 e-태그 서열 (247 내지 264)로 이루어져 있다.
실시예 2
융합 단백질 구조물 1-scFv(TF)3e10-TMi456
scFv(TF)3e10-TMi456 융합 단백질 (서열 2)은 신호 펩티드 (-18 내지 -1), VH 도메인 (1 내지 126), VH-VL 링커 (127 내지 131), VL 도메인 (132 내지 246), VL-TM 링커 (247 내지 264), TMi456 도메인 (265 내지 382), 및 e-태그 서열 (383 내지 400)로 이루어져 있다. TMi456에서 H381G, M388L, R456G 및 H457Q 돌연변이에 밑줄을 쳤다.
실시예 3
융합 단백질 구조물 2-scFv(TF)3e10-TMi456Δ
scFv(TF)3e10-TMi456Δ 융합 단백질 (서열 3)은 신호 펩티드 (-18 내지 -1), VH 도메인 (1 내지 126), VHVL 링커 (127 내지 131), VL 도메인 (132 내지 243), VL-TM 링커 (244 내지 261), 및 TMi456 도메인 (262 내지 379)으로 이루어져 있다. TMi456에서 H381G, M388L, R456G 및 H457Q 돌연변이에 밑줄을 쳤다.
실시예 4
박테리아/포유류 세포에서의 융합 단백질의 발현
박테리아 발현이 가능하지만, 매우 감소된 TM 보조인자 활성을 갖는 단백질을 수득하였다. 융합 단백질은 CHO 세포에서 발현되었다. 발현 플라스미드는 하이그로마이신 B 및 DHFR 선별 마커를 모두 함유하였다. 최초 선별은 하이그로마이신 400 ㎍/ml에서 수행하여 개체군을 선별하였다. 생성된 개체군을 이어서 100 nM 메토트렉세이트 선별 처리하였다. 이 선별 동안, 증폭된 카피의 DNA 영역 (선별 마커를 함유함) 및 표적 유전자를 보유한 세포를 개체군으로부터 선별하였다. 이 선별의 결과로서 발현 수준이 약 0.3 mg/L 내지 약 6 mg/L로 증가하였다.
실시예 5
시험관내 분석
1. 단백질 C 활성화 분석 (발색성)
20 ㎕의 하기 단백질 각각을 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하여 이 분석을 수행하였다: TM 샘플 (공지되지 않음 또는 표준), 트롬빈 (3 nM), 및 단백질 C (1.5 μM). 단백질 각각에 대한 분석 희석제는 20 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 2.5 mM CaCl2, BSA 2.5 mg/ml, pH 7.4이었다. 웰을 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후에, 단백질 C 활성화를 분석 희석제 중의 히루딘 (370 nM, 0.16 단위/㎕) 20 ㎕의 첨가 및 추가 10 분 동안의 인큐베이션에 의해 종결시켰다.
(분석 희석제 중의) 1 mM S2266 100 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 플레이트의 인큐베이션을 지속하여 형성된 활성화된 단백질 C의 양을 검출하였다. 몰리큘러 디바이스 (Molecular Devices) 플레이트 판독기를 이용하여 각 웰에서 405 nm에서의 흡광도를 매 10 초 마다 30 분 동안 판독하였다. 흡광도 데이타를 저장하고, 각 웰에서의 초 당 흡광도의 변화 (슬로프)를 계산하였다. 초 당 흡광도의 변화는 활성화된 단백질 C의 pmol/ml에 비례한다.
이 비율은 전체적으로 활성화된 단백질 C의 다양한 농도를 사용하여 실험적으로 결정하였다. 0 내지 1.5 μM의 단백질 C를 60 nM 토끼 TM 및 30 nM 트롬빈과 혼합하고, 0 내지 4 시간 동안 인큐베이션하고, 히루딘을 첨가하고, 상기한 바와 같이 S2266 활성을 측정하여 100％ 활성화된 단백질 C를 함유한 샘플을 생산하였다. 100％의 단백질 C가 활성화되는 조건을 S2266 활성 (A405/초)이 평탄 지역에 도달하는 것으로 정의하였다.
활성 단위를 상기 정의한 제제 조건하에 1 ml/분 당 생성되는 활성화된 단백질 C의 1 pmole로서 정의한다. 별법으로, 활성 값을 천연 계면활성제 가용화 토끼 TM과 비교하여 보고한다.
2. sTF/FVIIa 활성화 분석
이 분석의 원리를 하기에 기술한다. 기질의 트리펩티드 p-니트로아닐라이드 아미드 결합을 sTF/FVIIa 복합체에 의해 가수분해한다. 유리된 발색체 생성물인 p-니트로아닐라이드를 405 nm에서 모니터링하고, 9920 M-1 cm-1의 몰 흡광 계수를 이용하여 단위 시간 당 형성된 생성물의 농도를 계산한다. 초기 비율을 4 파라미터 방정식으로 맞추어 IC50 값 (C)을 측정하였다: Y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA ⇒ H-D-Val-Leu-Arg + p-NA
S2266 기질 트리펩티드 발색체
시약 및 용액:
1. 분석 완충액: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1％ BSA, pH 7.5
2. 인간 FVIIa (HCVIIA-0060, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크. (Haematologic Technologies Inc.)): 10 x 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 20 nM 용액을 제조함.
3. 가용성 TF (베를렉스 (Berlex)): 10 x 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 30 nM 용액을 제조함.
4. 발색성 기질 S2266 (카비 파마시아 헤파르 인크 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.)): 원액: H2O 중에서 10 mM, 4 ℃에서 보관함. 2.5 x 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 2.5 mM 용액을 제조함.
5. 항체: 사용 전에 분석 완충액 중의 2.5 x 희석액을 제조함.
분석 조건:
분석을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 실온에서 수행하였다. 구성분의 최종 농도는 하기와 같았다:
sTF 3 nM
항체 1000 내지 0.625 nM로 다양함
FVIIa 2 nM
S2266 1 mM
분석 절차:
1. 2.5 x AB (또는 완충액 대조군) 0.1 ml를 각각의 웰 내로 파이펫으로 옮김.
2. 10 x sTF 0.025 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
3. 10 x FVIIa 0.025 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
4. 2.5 x S2266 기질 0.1 ml를 첨가하고, 플레이트를 플레이트 판독기 내로 즉시 옮기고, 효소 반응 속도 405 nm에서 10 초 간격으로 15 분 동안 측정함.
3. 인자 X 활성화 분석:
이 분석의 원리를 하기에 기술한다. FVIIa를 재조합 인간 TF 막소포와 인큐베이션하여 기질인 FX를 활성화시킬 수 있는 단백질분해효소 복합체를 형성시킨다. 이 복합체는 상이한 농도의 항체의 존재 (또는 부재)하에 형성되고, 이어서 기질 FX를 도입하고, 반응을 진행시켜 생성물인 활성 단백질분해효소 FXa를 형성시키며, 여기서 활성 단백질분해효소 FXa는 발색성 기질 S2222의 p-니트로아닐라이드 아미드 결합을 가수분해할 수 있다. 유리된 발색체 생성물인 p-니트로아닐라이드를 405 nm에서 모니터링하고, 9920 M-1 cm-1의 몰 흡광 계수를 이용하여 단위 시간 당 형성된 생성물의 농도를 계산한다. 초기 비율을 4 파라미터 방정식으로 맞추어 IC50 값 (C)을 측정하였다:
Y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA ⇒ Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA
S2266 기질 발색체
시약 및 용액:
1. 분석 완충액: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1％ BSA, pH 7.5
2. 인간 FVIIa (HCVIIA-0031, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크.): 4 x 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 100 pM 용액을 제조함.
3. 재조합 인간 TF (이노빈 (다데 (Dade))로부터 본 발명자 실험실에서 재구성함): 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 1:480 희석액을 제조함.
4. 인자 X (HCX-0060, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크.): 4 x 활동 용액-사용 전에 분석 완충액 중의 1000 nM 용액을 제조함.
5. 발색성 기질 S2222 (카비 파마시아 헤파르 인크):
원액: H2O 중에서 6 mM, 4 ℃에서 보관함.
활동 용액-사용 전에 3.57 mM EDTA (반응을 정지시키기 위함), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5 중의 0.78 mM 용액을 제조함.
6. 항체:
사용 전에 분석 완충액 중의 4 x 희석액을 제조함.
분석 조건:
분석을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 실온에서 수행하였다. 구성분의 최종 농도는 하기와 같았다:
rTF 막소포 1:480 희석물 중의 1/4
항체 1000 내지 0.625 nM로 다양함
FVIIa 25 pM
FX 250 nM
S2222 0.546 mM
분석 절차:
1. 4 x AB (또는 완충액 대조군) 0.015 ml를 각각의 웰 내로 파이펫으로 옮김.
2. 4 x rTF 막소포 0.015 ml를 첨가함.
3. 4 x FVIIa 0.015 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
4. 4 x FX 0.015 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 5 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
5. S2222 기질 0.14 ml를 첨가하고, 플레이트를 플레이트 판독기 내로 즉시 옮기고, 효소 반응 속도 405 nm에서 10 초 간격으로 15 분 동안 측정함.
4. 단백질 C 활성화 분석 (TF-풍부 표면 상에서)
이 분석은 이 분석에서 트롬빈 및 단백질 C를 첨가하기 전에 인간 TF-함유 PC/PS 막소포를 융합 단백질 또는 대조군 TM에 첨가하는 것을 제외하고는 상기 열거한 발색성 단백질 C 활성화 분석과 같이 수행하였다.
실시예 6
항-TF 항체의 특성
7개의 상이한 TF-결합 항체를 완전 인간 단일쇄 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. sTF 결합 항체의 친화도를 BIAcore를 이용하여 측정하였으며, 그 친화도는 35 내지 470 nM이었다. sTF/VIIa 분석을 사용하여 항체가 활성 VIIa/TF 복합체의 형성을 블로킹하는지를 결정하였다. sTF/VIIa 분석에서, sTF에 대한 VIIa의 결합은 발색성 펩티드 기질 S2266에 대한 절단 속도를 20배 초과까지 가속화하였다. TF에 대한 FVIIa의 결합을 억제하는 항체는 이 가속화를 블로킹한다. 단리된 7개의 상이한 항체 중에서, 이들 중 단지 하나인 scFv(TF)3e10은 sTF/VIIa 분석을 억제하지 않았다. 이 항체는 sTF에 대한 FVIIa의 친화도를 증가시키고, KD 값을 5배 감소시켰다 (도 1). sTF에 대한 scFv(TF)3e10 항체의 KD 값을 sTF/FVIIa 분석을 이용하여 측정하고, 그 KD 값은 65.4 nM이었다 (도 2). 미량열량계를 사용하여 FVIIa/TF 복합체에 비해 TF에 대한 scFv(TF)3e10의 친화도를 비교하였다. 이들 실험은 항체가 유리 sTF에 비해 TF/FVIIa 복합체에 대해 20배 높은 친화도를 가지는 것으로 나타냈다 (33 nM 대 600 nM, 도 3). 이 항체를 FX 활성화 분석을 이용하여 비교하였으며, 이 항체는 인지질 막소포 중의 전장 TF, FVIIa 및 FX로 이루어져 있었다. 생성된 FXa의 양을 발색성 기질 S2765를 사용하여 측정하였다. scFv(TF)3e10 항체가 BIAcore에 의해 측정하는 경우에 최고의 친화도를 가지지 않고, sTF에 대한 FVIIa의 친화도를 증가시키지만, FX 활성화를 억제하고 PT 분석에서 응고 시간을 연장시키는 군 중의 유일한 항체였다. FX 활성화 분석에서 억제에 대한 scFv(TF)3e10 (다이머) 항체의 IC50 값은 0.44 nM이고 (도 4), PT의 2배 연장은 417 nM에서 발생하였다 (도 5).
scFv(TF)3e10 항체를 재조합 인간 가용성 TF에 대한 결합을 기준으로 하여 동정하였다. 인간 및 뮤린 또는 인간 및 토끼 간의 TF의 서열 상동성은 각각 58％ 및 71％이다. 항체는 FVIIa/TF 복합체에 의해 FX의 활성화를 방해하는 인간 TF 상의 특이한 에피토프에 결합한다. 생리학적으로, 항체는 TF에 대한 FVII 또는 FVIIa 결합이 경쟁하는 항체보다 장점을 가진다. 인간 혈장 중의 FVII 및 FVIIa의 KD 값은 모두 10 nM이고, 또는 KD 값보다 100 내지 1000배 크다. 높은 친화도 복합체에 대한 오프-속도는 늦어질 것이다 (70 내지 700 초, k온= 108 M-1초 -1로 가정함). 대조적으로, VIIa/TF 복합체에 대한 FX의 Km 값은 0.200 내지 4 μM이고, 인간 혈장 중의 FX의 농도는 130 nM이다 (0.03 내지 0.65배 KD). 응고에서의 FVIIa/TF 복합체의 주요 기능은 FX를 FXa로 전환시키는 것이다.
실시예 7
융합 단백질 scFv(TF)3e10-TMi456의 시험관내 특성
본 발명의 융합 단백질인 scFv(TF)3e10-TMi456의 특성을 각종 시험관내 분석으로 평가하였다. 융합 단백질인 scFv(TF)3e10-TMi456은 FVIIa/TF 복합체에 의한 FX 활성화의 억제능을 보유하고 (IC50 = 0.5 nM, 데이타를 나타내지 않음), 단백질 C의 트롬빈 촉매 활성화에 대한 보조인자로서 작용하였다 (발색성 분석, 도 6). TF-함유 인지질 막소포의 부재하에 융합 단백질 및 Tmi456 단독 간에 TM 보조인자 활성에서의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 대조적으로, TMi456을 제외한 융합 단백질의 TM 보조인자 활성은 TF-함유 인지질 막소포의 존재하에 5배 초과 증강되었다 (도 7). TF-유도 응고에 대한 융합 단백질인 scFv(TF)3e10-TMi456의 시험관내 효능 (PT 분석, 외생 응고 경로)은 scFv(TF)3e10 항체보다 6배 및 TMi456 단독보다는 17배 양호해졌다 (도 5). 대조적으로, 내생 및 일반 응고 경로에 대한 융합 단백질의 시험관내 효능은 유의하게 영향을 끼치지 못하였다 (APTT 및 TCT 분석, 데이타를 나타내지 않음). 따라서, PT에서 2배 연장을 일으키는 융합 단백질의 투여량은 APTT에 대해 별로 크지 않은 영향만 가지지만, TMi456은 PT에서의 동등한 투여량으로 APTT에서 4배의 증강을 일으켰다 (도 8). 이 시험관내 프로파일은 혈전증 동물 모델에서의 출혈 속도에 대한 우수한 효능을 가지는 것으로 공지된 TF/FVIIa-직접 항응고제에 대해 기대되는 것과 일치한다. 혈장-기준 응고 분석과 일치하게, 융합 단백질 scFv(TF)3e10-TMi456은 scFv(TF)3e10 또는 Tmi456 단독보다 TF-유도 전혈 응고 분석 (트롬보엘라스토그라프, TEG)에서 더 효능이 있었다 (도 9). 또한, 융합 단백질 scFv(TF)3e10-TMi456은 저분자량 헤파린보다 TF-유도 전혈 응고 분석에서 더 예측가능한 투여량 반응을 가졌다 (LMWH, 도 10). 요약하면, 상기 데이타는 본 발명의 융합 단백질이 시험관내에서 효능을 가지고, 선택적 항응고제임을 나타낸다.
실시예 8
생체내 래트 혈전색전증 모델
융합 단백질 scFv(TF)3e10-TMi456의 TF 항체 부분은 영장류 TF에 대해 특이적이다. 인간 TF (인간 재조합 TF를 함유하는 트롬보플라스틴 제제, 오르토 (Ortho))에 의해 유도되는 혈전색전증 모델을 의식있는 수컷 스프라그-돌리 래트 (350-400 g, n > 7/군)에서 개발하였다. 산재성 혈관내 응고증 (DIC)의 이 모델에서, 트롬보플라스틴 주사를 통한 TF가 폐 피브린 침착, 호흡 부전증, 및 사망을 유도하였다. 동등한 투여량의 scFv(TF)3e10-TMi456 또는 scFv(TF)3e10, 또는 비히클을 꼬리 정맥 내로 주사하고, 15 분 후에 트롬보플라스틴 (0.5 ml/kg)을 일시 주사하였다. 비히클 처리 군에서, 이 투여량의 TF는 보통 트롬보플라스틴 주사 후 5 분 내에 치사율 (LD60)을 초래하였다. 래트를 하기 발병률-사망률 점수 시스템에 따라 채점하였다: 0 = 영향을 받지 않음; 1 = 경미한 호흡 곤란 (30 분 이내에 회복); 2 = 중증 호흡 곤란 (빈사상태, 회복하는 데 60 분 이상이 소요됨); 및 3 = 사망. 평균 점수를 사용하여 4개의 상이한 처리 군의 효능을 비교하였다. 이 생체내 분석을 이용하는 결과를 도 11에 도시한다. 본 발명의 융합 단백질은 이 분석에서 사망 및 호흡 곤란을 억제할 수 있었다.
일반적으로 또는 특정하게 기재된 반응물을 대체하고(거나) 상기 실시예에 이용된 것들에 대한 본 발명의 조건들로 수행함으로써 상기 실시예를 반복하여 유사한 결과를 가질 수 있었다.
본 발명은 특정 융합 단백질 구조물의 생산에 관해 설명되었지만, 본 발명의 변법 및 별법이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 만들어 질 수 있다는 것은 명백하다.
SEQUENCE LISTING <110> Light, David McLean, Kirk <120> A Targeted Soluble Tissue Factor Antibody Thrombomodulin Fusion Protein as an Anticoagulant <130> 52295AUSM1 <150> US 60/376,566 <151> 2002-05-01 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial <400> 1 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe 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Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His 145 150 155 160 Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg 180 185 190 Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro 195 200 205 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220 Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg 275 280 285 Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu 290 295 300 Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg 305 310 315 320 Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro 325 330 335 Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp 340 345 350 Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 355 360 365 Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly 370 375 380 Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys 385 390 395

Claims (29)

  1. 트롬보모둘린 (TM) EGF456 도메인 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 및 변이체와 단독으로 작동가능하게 연결되거나, 또는 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프, EGF123 도메인, O-연결된 글리코실화 도메인 및 N-말단 소수성 영역 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 TM 도메인과 함께 작동가능하게 연결된, 조직 인자 (TF) 또는 인자 VIIa/TF (FVIIa/TF) 복합체와 상호작용하는 표적화 단백질, 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 항응고제 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, TM 도메인이 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프를 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 EGF456 도메인이 상기 융합 단백질의 산화적 손상 또는 프로테아제 활성에 대한 내성을 강화시키거나, 또는 촉매 효율성을 증가시키는 점 돌연변이를 함유하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 EGF456 도메인이 H381G, M388L, R456G 및 H457Q로 이루어진 군으로부터 선택된 점 돌연변이를 하나 이상 함유하는 것인 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 EGF456 도메인이 H381G, M388L, R456G 및 H457Q의 점 돌연변이로 이루어진 것인 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표적화 단백질이 TF에 결합하는 항체인 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 단독의 TF에 결합할 때보다 높은 친화도으로 FVIIa/TF 복합체에 결합하는 것인 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 단일쇄 항체, Fab 다이머 항체 또는 IgG 항체인 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 단일쇄 항체인 융합 단백질.
  11. 제7항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 2개 이상의 TM 도메인에 작동가능하게 연결된 것인 융합 단백질.
  12. 제7항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 TF를 중화시키는 것인 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 글리코실화된 것인 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 폴리에틸렌 글리콜의 부가에 의해 변형된 것인 융합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 스트렙타비딘과의 결합을 위해 비오틴화된 것인 융합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 표적화 단백질이 FVIIai인 융합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 표적화 단백질이 TFPI인 융합 단백질.
  18. 제약상 허용되는 부형제 및 치료상 유효량의 제1항의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  19. 혈소판의 활성화 및 응집과 같은 다른 응고 파라미터에 직접적인 영향을 미치지 않고 트롬빈 생성을 억제하는 제1항의 융합 단백질을 치료상 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 혈전 형성을 예방하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 방법이 허혈성 발작, 혈관형성술에 수반되는 혈전 합병증, 또는 미세혈관 수술에서의 혈전 형성을 예방하기 위한 것인 방법.
  21. 치료상 유효량의 제1항의 융합 단백질을 심부정맥 혈전증 (DVT), 산재성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 관상동맥 증후군, 또는 응고 징후가 나타나는 암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 심부정맥 혈전증 (DVT), 산재성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 관상동맥 증후군, 또는 응고 징후가 나타나는 암을 예방하고 치료하는 방법.
  22. 치료상 유효량의 제1항의 융합 단백질을 염증성 반응의 조절이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 염증성 반응을 조절하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 염증성 반응이 패혈증, 피부 및 정맥 이식, 및 기관 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 혈액과 접촉하게 되는 의학 장비의 표면에 혈전이 생성되지 않는 코팅을 형성시키는 데 사용될 수 있는 융합 단백질.
  25. 제1항의 융합 단백질을 포함하는 키트.
  26. 제1항의 융합 단백질 성분을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 키트.
  27. 치료상 유효량의 유전자 치료용 벡터와 함께 서열 2 또는 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는, 유전자 치료용 조성물.
  28. H381G, M388L, R456G 및 H457Q의 점 돌연변이로 이루어진 TM EGF456 도메인, 및 EGF3과 EGF4 사이의 도메인간 루프에 작동가능하게 연결된 TF 또는 FVIIa/TF 복합체와 상호작용하며, TF에 결합하는 단일쇄 항체인 표적화 단백질을 포함하는 항응고제 융합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열 2 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
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