CN100412090C - 作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的融合蛋白，其包含与组织因子(TF)结合的靶向蛋白，其可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上，其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。所述融合蛋白结合于损伤部位并阻止血栓形成的启动。所述融合蛋白可以用于治疗多种血栓性病变，包括但不限于深静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血以及急性冠脉综合征。

Description

作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白
背景技术
保持血管内促凝和抗凝活性之间的适当平衡对于正常止血是必要的(Davie，E.W.et al.(1991)Biochemistry，30(43)：10363-10370)。扰乱该平衡使之偏向于凝血将造成血栓形成，这会引起心脏病发作、卒中、肺栓塞和静脉血栓形成。需要更有效和更安全的抗凝剂来治疗特殊的血栓性疾病。
组织因子(“TF”)是一种跨膜糖蛋白，它是凝血级联系统的主要起始物(Nemerson，Y.(1995)Thromb.Haemost.74(1)：180-184)。在正常的生理条件下，活性TF不和血液接触。在血管受损期间，暴露于血液的内皮下TF和胶原导致凝血因子和血小板的活化并随后形成止血栓子。在多种临床情况中，对TF表达的不正确的诱导将造成威胁生命的血栓形成和/或引起病理性并发症。相信斑块(plaque)破裂后的TF暴露是造成引起急性心肌梗死和卒中的血栓性阻塞的原因。在这些情况中，凝血因子所激活的促炎症信号途径也引起水肿形成以及增加梗死面积。与血管成形术相关的血管损伤造成了SMC上TF的上调，相信这诱导了与再狭窄所相关的细胞信号途径。在癌症和革兰氏阴性细菌脓毒症中TF的过表达造成了威胁生命的血栓形成以及炎症途径的激活。
因子VIIa(“FVIIa”)/TF复合物涉及多种血栓性疾病的发病机制，TF的循环水平是某些患者的危险因素。FVIIa和TF在血管损伤中保持止血以及触发血栓形成上发挥着独特的作用。TF正常地表达于外膜，但在血管疾病中TF于中膜和新生内膜被上调并被不适当地表达。TF在动脉粥样硬化斑块中的表达增加，并且被一薄层纤维帽(fibrouscap)将其与血液分隔，该纤维帽可以破裂并暴露TF。例如球囊血管成形术、支架植入或动脉内膜切除术的外科手术破坏血管壁并暴露出其下的TF。在动脉粥样硬化的、富脂的、薄壁的斑块中，自发性破裂或内皮侵蚀造成TF的暴露和血栓形成，引起不稳定的绞痛和心肌梗死。TF可以在细胞来源的微粒中循环，在不稳定绞痛中循环TF的水平是增高的，说明这种循环TF可以引起血栓形成(Soejima，H.et al.(1999)Circulation 99(22)：2908-2913)。癌症通常与高凝状态相关，这是因为TF在肿瘤细胞上的过表达。这使得患者容易发生深静脉血栓形成，肺栓塞和低度弥漫性血管内凝血(“DIC”)。DIC造成了引起多器官衰竭的微血管内纤维素的沉积。来自血栓形成的急性动脉损伤模型的结果表明基于蛋白质的FVIIa/TF抑制剂，如活性位点抑制因子VIIa(“FVIIai”)以及组织因子途径抑制物(“TFPI”)是有效的抗凝剂，而且与凝血酶和因子Xa(“FXa”)抑制物比较，它的出血更少。另外，FVIIa/TF抑制在预防球囊损伤后的新生内膜增厚以及血管狭窄上优于其它的抗凝剂(例如肝素，FXa抑制物)。
血栓调节蛋白(“TM”)是一种跨膜糖蛋白，它具有抗凝性质并且主要表达于血管的内皮细胞的管腔面(lumenal surface)(Esmon，N.L.et al.(1982)J.Biol.Chem.257(2)：859-864；Salem，H.H.et al.(1983)J.Biol.Chem.259(19)：12246-12251)。成熟的全长TM是一种557个氨基酸残基的调节蛋白，它由5个结构域组成：一个N末端疏水性区域(残基1-226)；一个富含半胱氨酸区域(残基226-462)；一个O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域(残基463-497)；一个疏水的跨膜区域(残基498-521)；以及一个C末端的胞质尾区(残基522-557)。
富含半胱氨酸区域包括6个与表皮生长因子(“EGF”)前体同源的被称为EGF样、EGF同源或EGF结构域的重复结构。富含半胱氨酸区域可以被进一步地分成3个结构域：EGF样重复1，2和3(“EGF123”，残基226-344)，EGF3和EGF4之间的域间环(interdomain loop)(残基345-349)以及EGF样结构域4，5和6(“EGF456”，残基350-462)。EGF456的功能是介导凝血酶结合以及蛋白C的活化。一个研究已经表明第5和第6个EGF样重复(分别为“EGF5”，残基390-407以及“EGF6”，残基427-462)具有结合凝血酶的能力(Kurosawa，S.et al.(1988)J.Biol.Chem.263(13)：5993-5996)；另一个研究说明EGF456结构域能有效地作为凝血酶介导的蛋白C活化活性的辅因子(Zushi，M.et al.(1989)J.Biol.Chem.264(18)：10351-10353)。富含Ser/Thr结构域增强了EGF456介导的凝血酶的结合。第三个EGF样重复(“EGF3”，残基311-344)对于凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制物(“TAFI”)的活化是必需的。已经描述了一些EGF3的点突变影响了TAFI的激活(Wang，W.et al.(2000)J.Biol.Chem.275(30)：22942-22947)。凝血酶/TM复合物将蛋白C转化成活化蛋白C(“APC”)，其依次降解因子Va和VIIIa，从而阻止进一步生成凝血酶。因此，TM作为一种将凝血酶从前凝血剂(procoagulant)转化为抗凝剂的分子开关。
当TM定位于膜表面时，蛋白C对凝血酶/TM复合物的Km减少10倍(Esmon，C.T.(1995)FASEB J.9(10)：946-955)。血液中的蛋白C的浓度(0.065μM)显著地低于所报道的对可溶性TM/凝血酶复合物的Km(5μM)，因此证实促凝膜表面的TM将造成蛋白C生成速率的显著的局部增强。
TM通过不同于肝素或其衍生物的机制抑制血栓形成。肝素是一种抗凝血酶III的辅因子并通过抗凝血酶III依赖性机制抑制FXa和凝血酶。血栓部位的凝血酶(thrombus-bound thrombin)不受抗凝血酶III的影响，这限制了肝素或低分子量肝素(“LMWH”)对已存在的血凝块的抗血栓作用。这解释了在非人灵长类动物的研究中肝素或LMWH抑制血凝块部位的凝血酶或凝血酶原酶所触发的血栓生长的失败。相反，重组TM以剂量依赖性方式减少了血凝块诱导的凝血酶的生成以及纤维蛋白的形成(Mohri，M.et al.(1998)Thromb.Haemost.80(6)：925-929)。抗蛋白C抗体消除了TM的抑制作用。抑制血凝块部位的促凝活性是临床相关的，因为血凝块部位的促凝活性造成更快速的血栓生长并最后造成血管阻塞或血栓栓塞并发症。血栓生长的抑制使得内源性纤溶系统可以更快速更完全地清除血凝块。另外，在例如DIC的血浆抗凝血酶被耗竭的病理状态中，也预计TM比肝素更为有效。虽然TM和肝素在试验性DIC中都抑制了血小板和纤维蛋白原的消耗，但当抗凝血酶III水平被耗竭时，只有TM是有效的。
发明简述
本发明提供了作为抗凝剂的新的融合蛋白，它包含一种与组织因子(“TF”)或与因子VIIa/组织因子(“FVIIa/TF”)复合物相互作用的靶向蛋白，其可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上，其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。
本发明的抗凝血融合蛋白在损伤部位靶向并结合TF或FVIIa/TF复合物，将TM定位于损伤部位，并因此防止血栓形成，以及比较于可溶性的抗TF抗体或可溶性TM或TM片段，它是一种更为有效的抗凝剂。融合蛋白在治疗包括但不限于脓毒症、弥漫性血管内凝血、缺血性卒中、深静脉血栓形成、急性冠脉综合征、血管成形术后的血栓并发症以及进行性癌症的凝血病的某些疾病时比低分子量肝素(“LMWH”)更为有效。另外，融合蛋白也可应用于微血管手术、皮肤和静脉移植以及器官移植。
另一方面，本发明提供了包括目标融合蛋白的药用组合物。
另一方面，本发明提供了一种预防患者血栓形成的方法，包括施与上述患者治疗有效量的融合蛋白，从而抑制了凝血酶的形成而不直接影响其它的凝血参数，例如血小板的活化和聚集。
另一方面，本发明涉及一种用于预防及治疗患者的深静脉血栓形成(“DVT”)或弥漫性血管内凝血(“DIC”)或急性冠脉综合征或具有凝血病的癌症的方法，包括施与所述患者治疗有效量的融合蛋白。
另一方面，本发明涉及一种调节患者的炎症反应的方法，包括施与所述患者治疗有效量的融合蛋白。
仍在另一方面，可用本发明的融合蛋白在与血液接触的医学器械表面形成一层非成血栓性包膜。
另一方面，本发明涉及一种包含融合蛋白的试剂盒，该融合蛋白包含与TF或FVIIA/TF复合物结合的靶向蛋白，以及TM结构域。或者，所述试剂盒可包含编码融合蛋白成分的DNA序列。
本发明也阐述了制备本发明融合蛋白的方法，重组和合成方法。
附图说明
图1.scFv(TF)3e10与sTF的结合增加了sTF对FVIIa的表观亲和力(apparent affinity)。在有和无800nM scFv(TF)3e10时，利用2nMFVIIa如实施例5“sTF/FVIIa活化检测”所述进行sTF/FVIIa活化检测。将sTF滴定到测定物中并测定出显色底物(S-2266)的裂解速率。用标准的4-parameter fit计算出sTF的表观KD。
图2.scFv(TF)3e10对sTF的结合亲和力的测定。sTF/FVIIa检测如实施例5“sTF/FVIIa活化检测”所述利用3nM sTF和2nM FVIIa进行。所用的sTF浓度低于与FVIIa结合的KD。与scFv(TF)3e10抗体的结合降低了sTF与FVIIa结合的KD，导致sTF/FVIIa复合物生成的增加，并因此加快了显色底物S2266的裂解速率。以逐渐增加的浓度加入scFv(TF)3e10并利用标准的4-parameter fit用增加的反应速度确定抗体对sTF的表观KD值。
图3.微量量热法分析显示scFv(TF)3e10对sTF/FVIIa复合物的亲和力比对单独sTF的亲和力高出20倍。利用MicroCal VP-ITC设备进行等温滴定量热法。通过将超过2.3倍摩尔量的FVIIai添加到sTF形成sTF/FVIIa复合物。用尺寸排阻层析确认sTF被完全结合。对于抗体对复合物的亲和力的确定，将1.2μM sTF/FVIIa复合物加入到微量量热器孔中并将65μM scFv(TF)3e10抗体加入到注射器中。对于抗体对单独sTF的亲和力的确定，将10μM sTF加入到孔内并将141μMscFv(TF)3e10加入到注射器中。用MicroCal Origin软件进行数据分析。数据适合于单个结合位点。
图4.scFv(TF)3e10剂量依赖性地抑制FX活化检测。在实施例5“因子X活化检测”中描述了该检测的细节。IC50代表达到50％最大抑制所需的剂量。
图5.融合蛋白比TF抗体或单独TMi456能更有效地抑制凝血。进行凝血酶原时间(PT)检测以比较融合蛋白与TF抗体或单独的TMi456。将适当体积的浓缩的抑制物或TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)加入到100μl重组人组织凝血酶原激酶(Ortho Recombiplastin)中。约2分钟后，加入100μl重构人血浆。在Haemoliance测凝计上确定凝血时间。生成每种抑制物的剂量效应曲线以及用回归分析计算出延长凝血时间2倍所需的浓度(nM)。
图6.融合蛋白保留有全部的对蛋白C活化的辅因子活性。在实施例5“蛋白C活化检测(显色法)”中所描述的检测含有20μl TM标品，或含有EGF结构域4-6及EGF3和EGF4之间的域间环的TMi456，或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)，20μl 1.5μM蛋白C以及20μl 3nMα凝血酶。活化进行1小时。通过加入20μl 0.16u/ml蛭素终止活化相。然后加入100μl 1mM S2266并每10秒钟测定A405共30分钟。反应速率依赖于生成的活化蛋白C的量。数据用mOD/min表示。
图7.在含TF的磷脂表面提高了融合蛋白活化蛋白C的速率。加入TF小泡(vesicle)不影响TMi456活化蛋白C的速率。在实施例5“蛋白C活化检测(在富含TF表面)”中所描述的检测含有20μlTM标品，或TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)，20μl的1.5μM蛋白C，20μl的3nMα凝血酶以及20μl的缓冲液或TF小泡(Innovin，人重组TF，4x用于PT的正常浓度)。活化进行1小时。通过加入20μl 0.16u/ml蛭素终止活化相。然后加入100μl 1mM S2266并每10秒钟测定A405共30分钟。反应速率依赖于所生成的活化蛋白C的量。数据用mOD/min表示。
图8融合蛋白显示出比TMi456更高的对TF诱导的凝血的特异性。活化的部分组织促凝血酶原活酶时间(APTT)检测对内源性和凝血中心途径的抑制物是敏感的。在该检测中所发生的凝血与TF无关。将抑制剂，TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)稀释到50μl重构的人血浆中，其终浓度使得PT检测延长了2倍。然后往测凝计加入50μl APTT(Alexin HS)试剂和50μl CaCl2试剂(0.02mol/L)，并按秒测定凝血时间。
图9.融合蛋白比它的任何一种单独成分更有效地抑制TF诱导的全血凝血。利用Haemoscope Thromboelastogragh(TEG)分析仪分析全血凝血。将120nM TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)与10μl组织促凝血酶原激酶试剂(1∶64稀释)及20μl 0.2M CaCl2一起加入到柠檬酸化的全血中。得到每个标本的R值(到开始形成纤维蛋白的时间)。然后将该值转化为未抑制的对照R值的a％。
图10.融合蛋白在全血凝血检测(TEG)上示出比LMWH更多的预期的剂量效应。将逐渐增加浓度(从15nM开始并以2x增量增加)的融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)或逐渐增加浓度(从0.15u/ml开始并以2x增量增加)的依诺肝素(LMWH)与10μl组织促凝血酶原激酶试剂(1∶64稀释)及20μl 0.2M CaCl2一起加入到柠檬酸化的全血中。得到每个标本的R值(到开始形成纤维蛋白的时间)并绘制出对相对浓度的曲线(将每个标品的最低浓度设定为1(相似R值)，然后以2x增加之后的浓度)。
图11.融合蛋白scFV(TF)3e10-TMi456在弥漫性血管内凝血(DIC)的体内模型中是有效的。在实施例8所述的大鼠血栓栓塞模型中评价了TF抗体(scFV(TF)3e10)和融合蛋白(scFV(TF)3e10-TMi456)的(A)死亡百分比和(B)发病率-死亡率分数。(A)在载体(vehicle)治疗组，所用的TF剂量造成了60％死亡率(LD60)。0.7nmol/kg的scFv(TF)3e10-TMi456完全预防了死亡。相反，0.7nmol/kg的scFv(TF)3e10对死亡没有影响。scFv(TF)3e10-TMi456比10倍更高剂量的scFv(TF)3e10更为有效。(B)在载体治疗组，体内剂量的TF造成了2.6的平均发病率-死亡率分数，评分根据下面的评分系统：0＝不受影响；1＝轻微呼吸窘迫(在30min内恢复)；2＝严重呼吸窘迫(垂死的，恢复需要超过60min)；以及3＝死亡。scFv(TF)3e10-TMi456剂量依赖性地预防了TF诱导的死亡和呼吸窘迫，其ED50值为0.46nmol/kg(0.019mg/kg)。scFv(TF)3e10-TMi456在7.0nmol/kg完全预防了死亡和呼吸窘迫，并在0.7nmol/kg完全预防了死亡而且显著地减少了呼吸窘迫。相反，scFv(TF)3e10在0.7nmol/kg对死亡没有影响以及对呼吸窘迫只有很弱或没有作用。scFv(TF)3e10-TMi456比10倍更高剂量的scFv(TF)3e10更为有效。
发明详述
本发明的抗凝血融合蛋白由一种与组织因子(“TF”)或与因子VIIa/组织因子(“FVIIa/TF”)复合物相互作用的靶向蛋白构成，该靶向蛋白被可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上，其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。
定义：
在描述本发明时，按如下所示定义下面的术语。
“重组蛋白质或多肽”指通过重组DNA技术生成的蛋白质或多肽，即被编码所需多肽的外源性DNA构建体所转化的微生物或哺乳动物细胞所生成。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或多肽没有多糖。在酵母菌中表达的蛋白质或多肽可能有着不同于在哺乳动物细胞中所表达的蛋白质或多肽的糖基化形式。
“天然”蛋白质或多肽指从天然存在来源中回收的蛋白质或多肽。术语“天然TM”包括天然存在的TM及其片段。
DNA“编码序列”为当置于适当调节序列的控制下在宿主细胞中能被转录成mRNA并翻译成多肽的DNA序列。编码序列的范围由5’N末端的起始密码子以及3’C末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列以及合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
“融合蛋白”是至少两种可操纵连接的异源编码序列表达所形成的蛋白。本发明的融合蛋白包括一种与TF或与FVIIa/TF复合物相互作用的靶向蛋白，该靶向蛋白可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上，其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。
“靶向蛋白”是与另一种蛋白或蛋白复合物结合或相互作用的蛋白。本发明的靶向蛋白是与TF或FVIIa/TF复合物结合或相互作用的蛋白。例如，抗TF或抗FVIIa/TF复合物抗体是本发明的靶向蛋白。靶向蛋白的两个其它的例子是能与TF结合生成非活化的FVIIai/TF复合物的活性位点抑制因子VIIa(“FVIIai”)，以及能结合并失活FVIIa/TF复合物的组织因子途径抑制物(“TFPI”)。
“核苷酸序列”是脱氧核糖核苷酸(碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的杂聚物。用来自合成cDNA的DNA片段以及短寡核苷酸接头可以装配成编码本发明的融合蛋白的DNA序列，并提供一个能在重组表达载体中表达的合成基因。在讨论特殊的双链DNA分子的结构时，根据只给定cDNA的非转录链的5’到3’方向的序列的正常惯例来描述序列。
“重组表达载体”是用于扩增或表达编码本发明的融合蛋白的DNA的可复制的DNA构建体。一个表达载体含有DNA控制序列和编码序列。DNA控制序列包括启动子序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域以及增强子。在此所定义的重组表达系统将在调节元件的诱导下表达融合蛋白。
“转化的宿主细胞”指已经被外源DNA转化和转染的细胞。外源DNA可以是或可以不是整合到(共价连接于)构成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核细胞和酵母中，外源DNA可以保存于例如质粒的附加体元件(episomal element)中，或稳定地整合到染色体DNA中。对于真核细胞，稳定的转化的细胞是外源DNA已经整合到染色体复制体的细胞。通过真核细胞株或克隆生成含有外源DNA的子代细胞群的能力来验证这种稳定性。
“血栓调节蛋白(TM)”指一种内皮细胞表面糖蛋白，它与凝血酶形成高度亲和的复合物。已经分离并测序来自牛和人的编码天然TM的基因(它的基因组形式和cDNA形式)(Jackman，R.W.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(23)：8834-8838和Jackman，R.W.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(18)：6425-6429，两者在此一同并入参考)。牛、人和小鼠TM序列彼此之间表现出高度同源性。人TM的cDNA编码一个575个氨基酸的60.3kDa的蛋白质，包括约18个氨基酸的信号序列，见例如美国专利5,827,824。
当凝血酶与TM结合时，蛋白C的活化速度可以有1000倍或更多的提高，它形成了抗凝酶活化蛋白C。另外，当凝血酶与TM结合时，凝血酶不再作用为促凝酶。特别的，在存在TM时，凝血酶催化的纤维蛋白形成、因子V活化以及血小板活化都被抑制。因此，TM将凝血酶转化成一种生理性抗凝剂。
“血栓调节蛋白(TM)结构域”指与TM的特殊功能或特性相关的不连续的氨基酸序列，如特征性的三级结构单位。全长TM基因编码含有下面结构域的前体或多肽原(pro-polypeptide)：氨基酸-18--1为信号序列；氨基酸1-226是N末端疏水性区域；氨基酸227-462是富含半胱氨酸区域；由6个被小的域间肽或环所连接的串联EGF样重复组成；氨基酸463-497是O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域；氨基酸498-521为疏水跨膜区域；以及氨基酸522-557是C末端胞质尾区。富含半胱氨酸区域可以被进一步地分成3个结构域：氨基酸226-344是EGF123，由EGF样重复1，2和3(残基226-344)组成；氨基酸345-349是EGF3和EGF4之间的域间环；以及氨基酸350-462是EGF456，由EGF样结构域4，5和6组成。见例如Yost，C.S.et al.(1983)Cell 34(3)：759-766；Wen，D.Z.et al.(1987)Biochemistry 26(14)：4350-4357；和Wang，W.et al.(2000)，supra，在此将这些全部一起并入参考。
当指本发明融合蛋白时，术语“类似物”、“片段”、“衍生物”和“变体”以及靶向蛋白及TM结构域指基本上保留有相同的生物学功能或活性的融合蛋白、靶向蛋白和TM结构域的类似物、片段、衍生物和变体，如下面进一步描述。
“类似物”包括其内包含有本发明融合蛋白的氨基酸序列的多肽原。通过天然的体内加工或通过如酶或化学裂解的本领域熟知的方法可以将本发明的活性融合蛋白从构成前融合蛋白分子(pro-fusionprotein molecule)的其它氨基酸裂解开来。例如，天然TM被天然表达为575个氨基酸的多肽原，然后在体内被加工释放出557个氨基酸的活性成熟多肽。
“片段”为基本上保留了相似的功能活性的融合蛋白、靶向蛋白或TM结构域的一部分，如下面进一步描述的在此阐述的体外检测法所显示的。
“衍生物”包括对融合蛋白的所有修饰物，其基本上保留了在此所阐述的功能并包括其它的结构和附加功能，例如，PEG化的融合蛋白具有更长的半衰期，通过添加硫酸软骨素修饰的O-糖基化融合蛋白，以及生物素化的融合蛋白，如下进一步描述的。
当用相同的方法或检测法确定每个多肽的生物学活性时，“基本上相似的功能活性”以及“基本上相同的生物学功能或活性”指生物学活性度是被比较的多肽所表现出的生物学活性的约30％到100％或更多。例如，当用实施例5中所描述的蛋白C活化检测法(显色法)测定时，具有与实施例2(SEQ ID NO：2)的融合蛋白基本上相似的功能活性的融合蛋白或TM结构域是表现出聚集活化蛋白C的融合蛋白或TM结构域。当用实施例5所描述的sTF/FVIIa检测或FX活化检测法测定时，具有与实施例1的抗TF抗体(SEQ ID NO：1)基本上相似的功能活性的靶向蛋白是表现出结合或中和TF或VFIIa/TF复合物的能力的靶向蛋白。
通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代和第二个多肽的序列来确定两个多肽之间的“相似性”。这些保守取代包括在The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff(1978)和Argos(1989)EMBO J.8：779-785中所述的那些取代。例如，属于下面组之一的氨基酸表示着保守变化：
-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；
-Cys、Ser、Tyr、Thr；
-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
-Lys、Arg、His；
-Phe、Tyr、Trp、His；及
-Asp、Glu。
在此所用的所有的其它技术术语和本发明所属领域的技术人员通常所使用的术语具有相同的含义。
靶向蛋白：
本发明的靶向蛋白是与特定的预先选定的例如TF或FVIIa/TF复合物的靶分子具有特异结合的能力的蛋白质，然后为将融合蛋白定向到具有预先选定的靶分子的细胞或组织中。
在本发明的一个实施方案中，靶向蛋白是能结合并中和TF或FVIIa/TF复合物的抗体。“抗体”在此包括完整的免疫球蛋白(“Ig”)分子及其片段，如Fab、F(ab’)2和Fv，其能结合TF或FVIIa/TF复合物的表位。形成一个表位通常需要至少6、8、10或12个连续氨基酸。然而，含有非连续氨基酸的表位可能需要更多的，例如至少15、25或50个氨基酸。
典型地，在免疫化学检测法中，特异结合TF或FVIIa/TF复合物的抗体所提供的检测信号比其它蛋白所提供的检测信号至少高5、10或20倍。优选地，与TF或FVIIa/TF复合物特异结合的抗体在免疫化学检测中不能检测其它蛋白质，并可以从溶液中免疫沉淀出TF或FVIIa/TF复合物。
可以用TF或FVIIa/TF复合物免疫哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以生成多克隆抗体。如果需要，可以将TF或FVIIa/TF复合物缀合到载体蛋白上，如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白以及匙孔血蓝蛋白。根据宿主的物种，可以用不同的佐剂增强免疫反应。这些佐剂包括但不限于Freund佐剂、无机胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、多肽、油乳剂、匙孔嘁血蓝蛋白和二硝基酚)。在应用于人的佐剂中，BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Cornybacterium parvum)是特别有用的。
利用任何能通过培养连续的细胞株进行抗体分子生产的技术可以制备与TF或FVIIa/TF复合物特异性结合的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV杂交瘤技术(Kohler et al.(1985)Nature 256：495-497；Kozbor et al.(1985)J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030；和Cote et al.(1984)Mol.Cell Biol.62：109-120)。
此外，可以使用生成“嵌合抗体”所发展的技术，将小鼠抗体基因剪接到人抗体基因中以获得具有适宜的抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312：604-608；Takeda et al.(1985)Nature 314：452-454)。单克隆和其它抗体也可以被“人源化”以阻止患者在治疗性应用抗体时触发针对该抗体的免疫反应。这些抗体与直接应用在融合蛋白中的人抗体在序列上是相当相似的或可能需要变更一些关键的残基。通过用单个残基的定点诱变取代不同于人序列的残基或通过移植完整的互补决定区可以将啮齿动物抗体和人序列之间的序列差异最小化。或者，利用如GB2188638B所阐述的重组方法可以生成人源化抗体。与TF或FVIIa/TF复合物特异性结合的抗体可以含有部分或完全人源化的抗原结合位点，如在美国专利5,565,332中所阐述的。
或者，利用本领域已知的方法可以采用所述的用于生产单链抗体的技术生产与TF或FVIIa/TF复合物特异性结合的单链抗体。通过从随机组合Ig文库的链替换(chain shuffling)可以生成具有相关特异性但不同的独特型组成的抗体(Burton(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11120-11123)。
利用如PCR的DNA扩增方法用杂交瘤cDNA作为模板也可以构建单链抗体(Thirion et al.(1996)Eur.J.Cancer Prev.5：507-511)。单链抗体可以是单或双特异的，以及可以是二价或四价的。例如，在Coloma and Morrison(1997)Natl.Biotechnol.15：159-163中教导了四价、双特异性单链抗体的构建。在Mallendar and Voss(1994)J.Biol.Chem.269：199-216中教导了二价、双特异性单链抗体的构建。
利用人工的或自动的核苷酸合成可以构建编码单链抗体的核苷酸序列，利用标准的重组DNA方法可以将其克隆进表达构建体中，并将其导入到细胞内表达编码序列。或者，用例如丝状噬菌体展示技术可以直接生成单链抗体(Verhaar et al.(1995)Int.J.Cancer 61：497-501；和Nicholls et al.(1993)J.Immunol.Meth.165：81-91)。
如文献中所阐述的，通过诱导体内生产淋巴细胞群或筛选Ig库或高度特异的结合试剂组(panel)也可以生成与TF或FVIIa/TF复合物特异性结合的抗体(Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：3833-3837；Winter et al.(1991)Nature 349：293-299)。
在本发明的另一个实施方案中，靶向蛋白是一个能结合并中和TF的靶向部分(targeting moiety)而不是抗体。两个这样的实例是活性位点抑制因子FVIIa(FVIIai)和组织因子途径抑制物(TFPI)。
FVIIa和FVIIai都和TF形成高度亲和的复合物(Sorenson，B.B.and Rao，L.V.(1998)Blood Coagul.Fibrinolysis 9(Suppl 1)：S67-71)。FVIIai是一种中和TF的抗凝剂，它通过与内源性FVIIa竞争结合暴露的TF而发挥作用。FVIIai抑制了蛋白裂解活化的FVIIa形成活性FVIIa-TF复合物的能力并以这种方式抑制了凝血的启动。通过将TM结构域遗传学地融合到FVIIai，TM可以被靶向到富含TF的促血栓形成(prothrombotic)表面。
已经分离并测序了编码人FVII的cDNA(Hagen，H.S.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(8)：2412-2416，在此一同并入参考)。通过标准的重组DNA技术可以从分离于人肝脏的mRNA开始制备出人FVII cDNA。通过标准的重组DNA技术突变活性位点丝氨酸或通过用肽基氯甲基酮(peptidyl chloromethylketon)化学处理催化活性的FVIIa可以制备FVIIai，这是不可逆的修饰并抑制了活性位点。
TFPI以FXa依赖性方式靶向并抑制FVIIa/TF复合物(Salemink，I.et al.(1999)J.Biol.Chem.274(40)：28225-28232)。TFPI首先与FXa结合，然后TFPI-FXa复合物结合并抑制FVIIa/TF复合物。通过将TM结构域遗传学地融合到TFPI中，TM将被靶向到富含TF的促血栓形成的表面。
已经分离并测序了编码人TFPI的cDNA(Wun，T.C.et al.(1988)J.Biol.Chem.263(13)：6001-6004，在此一同并入参考)。通过标准的重组DNA技术可以从分离于人肝脏的mRNA开始制备出人TFPIcDNA。
利用本领域熟知的方法可以表达并纯化本发明的靶向蛋白(即抗体或其它相关蛋白质)。例如，利用流经结合有TF的柱可以亲和纯化抗体及蛋白质。然后用具有高盐浓度的缓冲液可以将所结合的抗体或蛋白质从柱上洗脱下来。
在本发明的一个优选的实施方案中，靶向蛋白是结合TF的scFv抗体，它抑制了FVIIa/TF复合物对FX的激活且不与FVIIa竞争结合。为了生成结合TF的scFv抗体，从展示于丝状噬菌体的人抗体文库HuPhaBL3选择固定化的可溶性TF。将来自结合TF的噬菌体的抗体在大肠杆菌(E.coli)中过度表达并用e-tag柱亲和纯化。用BIAcore，一种sTF依赖的因子VIIa检测法(sTF/FVIIa检测法)、FX活化检测法和PT检测法进一步特征化所纯化的抗体。在实施例1中显示了称为scFv(TF)3e10的结合TF的scFV抗体的序列并对应于SEQ ID NO：1。下面将更详细地描述结合TF的scFv抗体的分离、生产和特性。
血栓调节蛋白：
融合蛋白的TM结构域部分作用为凝血酶催化的蛋白C活化的辅因子，活化蛋白C依次降解因子Va和VIIIa，因此阻止了进一步的血栓形成。TM的结构域包括例如N末端疏水性区域结构域、EGF123、EGF3和EGF4之间的域间环、EGF456结构域和O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域结构域。EGF456结构域特别地介导与凝血酶的结合以及蛋白C的活化(Kurosawa，S.et al.(1988)，supra；和Zushi，M.et al.(1989)supra)。在本发明的优选的实施方案中，融合蛋白的TM结构域部分包括单独的EGF456结构域或组合有一个或多个其它的TM结构域。在本发明更优选的实施方案中，EGF456结构域含有使得蛋白质更耐受氧化损伤和蛋白酶和/或增加它的催化效率的点突变。
编码人TM的全长DNA序列有助于基因的制备并被用为构建编码TM肽和含有TM及TM片段/肽的融合蛋白的DNA序列的起始点。
一些方法可以制备TM的全长基因。人基因组文库是商业化可获得的。利用已发表的基因序列可以合成特异于这些基因的寡核苷酸探针。用寡核苷酸探针筛选基因组文库的方法是已知的。TM的基因序列的文章表明在编码区域内没有内含子。因此，基因组克隆提供了用已知方法构建TM的表达质粒所必需的原材料。
通过利用已经在基因两侧或内部区域所确定的限制性核酸内切酶位点可以找到编码TM的DNA片段(Jackman，R.W.et al.(1987)，supra)。或者，从cDNA库(cDNA bank)中也可以得到全长基因。例如，从内皮细胞制备得到的信使RNA提供了制备cDNA的适当的原材料。制备cDNA库的方法是熟知的(见例如Sambrook，J.F.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)，在此一同并入参考)。
融合蛋白：
本发明的抗凝血融合蛋白包括一种与TF或FVIIa/TF复合物结合的靶向蛋白，并且其被可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的TM EGF456结构域上，其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。融合蛋白可以包括与任何组合的TM结构域相连接的靶向蛋白。
在一个特别优选的实施方案中，融合蛋白包括与TF结合的抗体，它被可操纵地连接到TM EGF456结构域以及EGF3和EGF4之间的域间环(“TMi456”)或其类似物、片段、衍生物或变体。
本发明的融合蛋白包括但不限于：单链抗体的C末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端部分融合的构建体、IgG抗体的C末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端部分融合的构建体、Fab抗体的C末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端部分融合的构建体、单链抗体的N末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的C末端部分融合的构建体、IgG抗体的N末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的C末端部分融合的构建体、Fab抗体的N末端部分与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的C末端部分融合的构建体、多于一个的单链抗体与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端和C末端部分融合的构建体、多于一个的IgG抗体与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端和C末端部分融合的构建体、多于一个的Fab抗体与TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体的N末端和C末端部分融合的构建体、多于一个的TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体与单链抗体的N末端和C末端部分融合的构建体、多于一个的TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体与IgG抗体的N末端和C末端部分融合的构建体、多于一个的TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体与Fab抗体的N末端和C末端部分融合的构建体、一个或多于一个的TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体与嵌合单链抗体的N末端和C末端部分融合的构建体。
本发明的融合蛋白包括实施例2(SEQ ID NO：2)和实施例3(SEQ ID NO：3)的融合蛋白，以及那些在序列上与它们有着非本质差异的融合蛋白。“非本质差异”将包括基本上保持了本发明多肽的至少一种生物学功能，优选为凝血酶介导的蛋白C活化的辅因子活性的任何序列、取代或缺失变体。这些功能等价物可以优选包括与SEQ IDNO：2或3的融合蛋白有至少约90％相同性，以及更优选与SEQ IDNO：2或3的融合蛋白有至少95％相同性，以及仍更优选与SEQ IDNO：2或3的融合蛋白有至少97％相同性的融合蛋白，以及还包括这些具有基本上相同的生物学活性的融合蛋白的部分。然而，本发明的内容包括表现出如在此进一步描述的功能等效性的任何在氨基酸序列上具有与SEQ ID NO：2和3的融合蛋白非本质差异的融合蛋白。
在另一个实施方案中，融合蛋白包括与TF结合的被可操纵地连接到TM结构域EGF3的抗体，其对于激活凝血酶活化的纤维蛋白溶解激动剂(TAPI)是必需的。
类似物、片段、衍生物和变体：
本发明的融合蛋白、靶向蛋白或TM结构域的类似物、片段、衍生物或变体可以是：(i)其中的一个或多个氨基酸残基被一个保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)所取代，以及这些取代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传学密码子所编码的氨基酸；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括有一个取代基团；或(iii)其中成熟的融合蛋白与另外一种化合物融合，如一种提高融合蛋白的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸被融合进成熟的融合蛋白中，如前导或分泌序列或用于纯化成熟融合蛋白的序列；或(v)其中多肽序列与一个更大的多肽融合，即人白蛋白、抗体或Fc以延长作用时间。在此所提及的这些类似物、片段、衍生物和变体被认为是在在此说明的本领域人员的范围内。
优选地，本发明的衍生物将包含在一个或多个预定的，优选非必需氨基酸残基上进行的保守氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是在蛋白质的野生型序列上可以被改变但不改变生物学活性的残基，其中“必需”氨基酸对于生物学活性是必需的。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。在本领域已经识别了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)、具有非带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。对保守氨基酸残基或对于在保守蛋白质结构域内的氨基酸残基不能进行非保守取代，除非进行的非保守取代使得所生成的融合蛋白更能耐受氧化损伤以及蛋白酶和/或增强它们的催化效率。片段或生物学活性部分包括适合用为药物、研究试剂等等的多肽片段。片段包括含有足够类似于或衍生于本发明的融合蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列并表现出该多肽的至少一种活性的肽，但它含有比在此阐述的全长多肽更少的氨基酸。典型地，生物学活性部分包括具有多肽的至少一种活性的结构域或基序。多肽的生物学活性部分可以是长度为例如5个或更多个氨基酸的肽。这些生物学活性部分可以被合成制备或通过重组技术制备，以及利用在此阐述的和/或本领域熟知的手段评价活性部分的本发明多肽的一个或多个功能活性。
另外，本发明优选的衍生物包括已经与另一种化合物融合的成熟的融合蛋白，如这种化合物可以提高多肽的半衰期和/或减少多肽潜在的免疫原性(例如，聚乙二醇，“PEG”)。PEG可用于赋予水溶性、大小、减慢肾脏清除速率以及减少融合蛋白的免疫原性。见例如美国专利6,214,966。对于PEG化，利用本领域人员已知的任何方法都可以完成融合蛋白与PEG的融合。例如，首先通过将一个半胱氨酸突变引入到融合蛋白内，随后通过PEG-马来酰亚胺的位点特异性衍生可以完成PEG化。可以将半胱氨酸添加到肽的C末端，见例如Tsutsumi et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(15)：8548-8553。可以对融合蛋白进行的另一个修饰涉及生物素化。在某些情况下，将融合蛋白生物素化可能是有用的，使得它容易与链霉亲和素相互作用。蛋白质生物素化的方法在本领域是熟知的。此外，硫酸软骨素可以和融合蛋白相连接。
本发明的融合蛋白、靶向蛋白和TM结构域的变体包括具有与原始融合蛋白、靶向蛋白以及TM结构域的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽。术语“足够相似”指相对于第二个氨基酸序列，第一个氨基酸序列含有足够的或最小数目的相同或等价氨基酸残基，使得第一个和第二个氨基酸序列具有共同的结构结构域和/或共同的功能活性。例如，在此将含有至少约45％，优选约75％到98％相同的共同的结构结构域的氨基酸序列定义为足够相似。优选地，变体与本发明的优选融合蛋白的氨基酸序列足够相似。变体包括在严格条件下与本发明的多核苷酸或其互补物杂交的多核苷酸所编码的融合蛋白的变体。这些变体通常保留了本发明的融合蛋白的功能活性。可以用多核苷酸的片段文库生成用于筛选和随后选择的片段的多样化群(variegated population)。例如，在其中每分子只发生约1次缺口的条件下，通过用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片段，变性双链DNA和复性DNA形成可以包括来自不同缺口产物的有义/反义碱基对的双链DNA、通过用S1核酸酶处理从新形成的双链体中去除单链部分并将所生成的片段文库连接到表达载体中可以生成片段文库。通过这个方法，可以生成编码本发明融合蛋白的多种大小的N末端和内部片段的表达文库。
变体包括因为诱变而在氨基酸序列上有所不同的融合蛋白以及靶向蛋白和TM结构域。利用实施例5所述的蛋白C活化检测法通过筛选例如截短突变或点突变的突变体的组合文库可以确定具有凝血酶介导的蛋白C活化的辅因子活性的本发明的融合蛋白或TM结构域的变体。利用实施例5所述的实施例5的sTF/FVIIa检测法或FX活化检测法通过筛选例如截短突变或点突变的突变体的组合文库可以鉴定具有TF或FVIIa/TF复合物结合活性的本发明的融合蛋白或靶向蛋白的变体。另外，通过在融合蛋白的TM结构域部分的残基或序列上进行不同的取代也可以构建融合蛋白的生物等价类似物，它可以使得融合蛋白对氧化损伤或蛋白酶的耐受性更强，见例如，美国专利5,827,824，或增加融合蛋白的催化效率，见例如Adler，M.et al.(1995)J.Biol.Chem.270(40)：23366-23372，和2001年12月27日出版的PCT专利申请WO01/98352，在此将所有的这些一起并入参考。
在一个实施方案中，通过在核酸水平的组合诱变生成变体的多样化文库并通过多样化基因文库将其编码。例如，通过将合成寡核苷酸的混合物酶连到基因序列使得潜在的变体氨基酸序列的简并组(degenerate set)可表达为独立的多肽或一组含有一组在此的序列的更大的融合蛋白(例如噬菌体展示)，这样可生成变体的多样化文库。有多种方法可用于从简并寡核苷酸序列生成潜在变体文库。可以在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连接到合适的表达载体中。应用基因的简并组可以提供编码所需的潜在变体序列组的所有序列的混合物。合成简并寡核苷酸的方法在本领域是已知的(见，例如Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1984a)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura et al(1984b)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。
在本领域已知有一些技术可用于筛选点突变或截短突变所形成的组合文库的基因产品，以及用于筛选cDNA文库的具有所选择的性能的基因产品。这些技术适于快速筛选融合蛋白以及靶向蛋白和TM结构域的组合诱变所形成的基因文库的凝血酶介导的蛋白C活化的辅因子活性或TF-或FVIIa/TF复合物结合活性。通常用于筛选大基因文库的最广泛使用的能进行高通量分析的技术包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所形成的载体文库转化合适的细胞并在对所需活性的检测有助于分离编码生成所检测的产物的基因的载体的条件下表达组合基因。递归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis，REM)，一种增强文库内功能性突变频率的技术，可以和筛选检测一起用于鉴定所需的变体。
生成融合蛋白：
利用任何本领域人员已知的方法通过将靶向蛋白融合或结合到TM结构域或其类似物、片段、衍生物或变体可以生成本发明的融合蛋白。利用多种已知的化学方法中的任何一种方法都可以将两种成分化学地结合在一起。例如，连接可以是异源双功能的交联物(crosslinker)形式，例如，SPDP、碳二亚胺、戊二醛等等。
在一个更优选的实施方案中，用例如通过应用重组DNA技术生成同时编码靶向蛋白和编码TM结构域并在例如大肠杆菌或哺乳动物细胞的宿主细胞内表达DNA序列的多肽的核酸的重组手段可以将本发明的靶向蛋白融合到TM结构域。用任何本领域技术人员已知的克隆方法可以以cDNA或基因组的形式克隆出编码融合蛋白的DNA。见例如，Sambrook，J.F.et al.(1989)supra。
对于靶向蛋白是抗体的情况，一旦鉴定出编码Fv区域的DNA序列，当被表达时Fv序列表现出特异的结合活性，用本领域人员已知的方法可以制备包含该Fv区域的融合蛋白。因此，例如，Chaudhary，V.K.et al.(1989)Nature 339(6223)：394-397；Batra，J.K.et al.(1990)J.Biol.Chem.265(25)：15198-15202；Batra，J.K.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(21)：8545-8549；Chaudhary，V.K.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(3)：1066-1070，在此一同并入参考，它们描述了多种单链抗体融合蛋白的制备。Fv区域可以直接融合到TM结构域或通过一个接头(linker)序列连接。存在的接头序列可以仅仅提供靶向部分和TM结构域之间的空间，以有助于这些区域之间的活动以保证它们彼此之间保持它们的最佳构象。包含连接子(connector)的DNA序列也可以提供有助于克隆的序列(例如引物或限制性位点)或可以保留编码靶向部分的序列和编码TM结构域的序列之间的读框。本领域人员对于设计这样的连接肽(connector peptide)是熟知的。
在本发明中，接头序列可以用于连接靶向蛋白和TM结构域。在本发明的一个优选的实施方案，在构建包括单链抗体和TM EGF456结构域以及EGF3与EGF4之间的域间环(TMi456)的融合蛋白时使用了两个接头序列。第一个连接单链抗体的轻链和重链结构域。第一个接头序列为5个氨基酸长。显而易见的是可以使用其它的从0到10个氨基酸长的短接头序列。本发明的第二个接头是一个15个氨基酸的接头，它将抗体连接到TM结构域。对本领域人员显而易见的是可以使用许多不同的接头序列且仍形成保留有抗凝活性以及活化蛋白C的融合蛋白。对现有的接头的修饰将着力于最大化地增强含TF的磷脂表面的蛋白C的活化。
在一个优选的方案中，利用噬菌体展示文库制备单链抗体。在构建噬菌体展示文库的第一个步骤中，利用一组家族特异性引物从人骨髓、淋巴结和脾脏的混合mRNA(pooled mRNA)通过PCR克隆出可变区基因(VH(来自IgM)、Vκ和VL)。所形成的pCITE-VH(3.8×109个成员)、pZ604-Vκ(1.6×107)和pZ604-VL(3.2×107)文库具有永久及高多样性的V基因。从pCITE-VH文库中扩增出VH基因。从pZ604-Vκ和pZ604-VL文库中PCR扩增出在5’末端具有反向JH和接头序列的Vκ和VL基因。然后将凝胶纯化的含有VH、Vκ和VL的PCR产物一起剪接生成scFv基因库((gene repertoire))。将scFv基因库克隆进噬粒载体pZ603并将连接产物电穿孔到合适的感受态TG1大肠杆菌中生成具有5.2×109个单一转化体的scFv噬菌体展示文库，HuPhabL3(Kay，B.K.et al.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：ALaboratory Manual，Academic Press，San Diego CA；Marks，J.D.et al.(1991)J.Mol.Biol.222(3)：581-597；Sheets，M.D.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)：6157-6162)。
在本发明的一个优选的实施方案中，制备了具有对TF的单VH/VL结合位点的单链抗体(scFv(TF)3e10)。在实施例1中显示了scFv(TF)3e10(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，将含有在两侧具有NotI位点的TMi456序列(具有M388L和H381G突变)的PCR片段亚克隆到pZ612/3e10(基于来自Pharmacia的pCANTAB5的用于scFv(TF)3e10的细菌表达载体)的NotI位点。在此，将本发明的融合蛋白的TM部分的点突变表示为天然TM的氨基酸残基的单字母的名称，随后是在成熟TM中的氨基酸位置的数字以及氨基酸突变的单字母的名称。例如，M388L表示成熟TM的388位氨基酸的蛋氨酸变为亮氨酸。NotI位点在抗体序列和e-tag序列之间。这形成了包括scFV(TF)3e10-15个氨基酸的接头-TMi456，之后是e-tag序列的融合蛋白的细菌表达构建体(pKM101)。为了形成哺乳动物表达载体，首先从pKM101模板生成PCR片段。该片段被设计用于连接到TM表达载体pTHR525的StuI/MscI位点上。这形成了一种载体(pKM113)，其具有Solulin信号序列，后接成熟融合蛋白序列，之后是e-tag序列。该载体含有氨苄青霉素抗性基因和潮霉素以及DHFR选择标记。MPSV LTR启动子驱动表达。在该载体上进行的定点诱变以包括R456G和H457Q突变，这赋予TM部分的蛋白酶耐受性。所形成的载体被称为pKM115。pKM115载体具有一个分离VH和VL结构域的15个氨基酸的接头以及另一个分离VL结构域与TMi456的15个氨基酸的接头。将分离VH和VL的接头减少到5个氨基酸使之形成具有更高亲和力的二聚体，称为pHM115.5。在实施例2中描述了pHM115.5所编码的融合蛋白，scFv(TF)3e10-TMi456(SEQ ID NO：2)。利用标准的重组DNA技术通过缺失分离VH和VL结构域的5个氨基酸的接头中的3个氨基酸(GAP)以及缺失融合蛋白C末端的e-tag形成另外一种载体，pKM125。在实施例3中描述了所形成的融合蛋白，scFv(TF)3e10-TMi456Δ(SEQ ID NO：3)。
融合蛋白的表达和纯化：
有一些体外表达重组融合蛋白的方法，包括大肠杆菌、杆状病毒、酵母哺乳动物细胞或其它的表达系统。在细菌内表达所克隆的基因的方法是熟知的。为了在原核系统内得到所克隆的基因的高水平表达，必需要构建含有至少指导mRNA转录终止的强启动子的表达载体。适合于这个目的的调节区域的实例为大肠杆菌的色氨酸生物合成途径的大肠杆菌β-葡糖苷酶基因启动子和操纵子区域，或λ噬菌体的左侧启动子。在转化进大肠杆菌的DNA载体内包含选择标记是有用的。这些标记的实例包括特异地耐受氨苄青霉素、四环素或氯霉素的基因。
从用于表达融合蛋白及其类似物的更高级的真核细胞系统中可选择出多种细胞系统。所列举的哺乳动物细胞株例如包括但不限于RPMI 7932、VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株、W138、BHK、COS-7、C127或MDCK细胞株。一个优选的哺乳动物细胞株是CHL-1。当使用CHL-1时，所含的潮霉素作为真核选择标记。CHL-1细胞来源于RPMI 7032黑素瘤细胞，一种容易获得的人细胞株。根据布达佩斯条约的约定，CHL-1细胞株已经于1987年6月18日被保藏于ATCC，保藏号为#CRL 9446。在本发明中适合使用的细胞是从ATCC商业化获得的。列举的细胞株包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)和家蚕(Bombyx mori)。
原核系统大肠杆菌不能进行翻译后修饰，例如糖基化。另外，当在大肠杆菌中表达时，具有复杂二硫键形式的蛋白经常错误地折叠。对在此所描述的融合蛋白而言，当在大肠杆菌中表达时，尽管血栓调节蛋白辅因子的两种活性仍然存在，但其辅因子活性显著下降。在原核系统中，所表达的蛋白或以所谓的包涵体的非可溶性形式存在于细胞质中，发现于细胞裂解后的可溶性组分中，或通过添加适宜的分泌信号序列被直接地分泌到周质中。如果所表达的蛋白位于非可溶的包涵体内，那么通常需要对包涵体的可溶性化以及之后的再折叠。
本领域人员已知的许多原核表达载体，如pKK223-3(PharmaciaFine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)是商业化可获得的。
在重组微生物表达系统中常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang，A.C.et al.(1978)Nature 275(5681)：617-624；Goeddel，D.V.et al.(1979)Nature 281(5732)：544-548)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，D.V.et al.(1980)Nucl.Acids Res.8(18)：4057-4074)以及tac启动子(Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。另一种有用的细菌表达系统采用了λ噬菌体pL启动子和clts857热诱导阻抑物(Bernard，H.U.et al.(1979)Gene 5(1)：59-76；Love，C.A.et al.(1996)Gene 176(1-2)：49-53)。也可以在例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母宿主中表达重组融合蛋白。这通常具有进行多种翻译后修饰的能力。所表达的融合蛋白可以被分泌到没有许多其它蛋白存在的培养基上清中，使得纯化更为容易。用于表达本发明的融合蛋白的酵母载体具有某些必需的特性。载体的元件通常来源于酵母和细菌以容许质粒在两者中扩增。细菌元件包括复制起点以及选择标记。酵母元件包括复制序列起点(ARS)、选择标记、启动子和转录终止子。
在酵母载体中用于表达的适宜启动子包括TRP1基因、ADH1或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH03或PH05)基因、异细胞色素(isocytochrome)基因启动子或糖酵解途径中所包含的启动子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶和磷酸葡糖异构酶启动子(Hitzeman，R.A.et al.(1980)J.Biol.Chem.255(24)：12073-12080；Hess，B.et al.(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7：149-167；和Holland，M.J.andHolland，J.P.(1978)Biochemistry 17(23)：4900-4907)。
商业化可获得的酵母载体包括pYES2、pPIC9(Invitrogen，SanDiego，CA)、Yepc-pADH2a、pYcDE-1(Washington Research，Seattle，WA)、pBC102-K22(ATCC#67255)和YpGX265GAL4(ATCC#67233)。可以采用包括但不限于COS-7、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、BHK、CHL-1、NSO和HEK293的哺乳动物细胞株表达本发明的重组融合蛋白。在哺乳动物细胞内生成的重组蛋白通常可溶并被糖基化，以及具有真实的N末端。哺乳动物表达载体可以含有非转录元件如复制起点、启动子和增强子以及5’或3’非翻译序列如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、受体位点和剪接供体以及转录终止序列。在哺乳动物表达载体中所用的启动子通常是例如病毒启动子，如多形瘤、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。
根据所选择的表达系统以及宿主，通过使用用于蛋白质纯化的传统层析的不同组合可以获得均一的重组融合蛋白。这些包括：免疫亲和层析、反相层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析以及HPLC，如果表达系统将融合蛋白分泌到生长培养基中，就可以从培养基中直接纯化蛋白。如果融合蛋白是非分泌的，就从细胞裂解物中分离蛋白。用任何传统的方法包括冻融循环、超声波、机械裂解或使用细胞裂解试剂可以进行细胞裂解。
在本发明的一个优选的实施方案中，用哺乳动物表达构建体转染CHO DXB11细胞。用400μg/ml潮霉素B的HAMS/F12培养基选择稳定群(population)。表达水平为大约500μg/L。为了增加表达水平，用100nM氨甲蝶呤的αMEM培养基选择群。该群的近似表达水平是5mg/L。
融合构建体在蛋白的C末端含有e-tag序列。抗e-tag亲和柱购自American/Pharmacia Biotech。用0.22μm滤膜滤过细胞培养基并以2ml/min装入到5ml的e-tag柱中。用0.2M磷酸缓冲液0.05％NaN3，pH7.0洗柱，然后收集到含有0.1容积的1M Tris缓冲液，pH8.2的试管内以中和洗脱缓冲液。或者，将滤过后的培养基装入到蛋白A柱中。在这种情况中，用50mM柠檬酸，300mM NaCl，pH6.5洗涤柱子并用pH3.0的相同缓冲液洗脱。在两种情况中，随后都将纯化的样本装入到Sephadex 200柱中，将融合蛋白的单体与二聚体分离开来。
药用组合物：
本发明还提供了能施用给患者以达到治疗作用的药用组合物。通过组合具有所需纯化程度的融合蛋白以及药用有效量的生理上可接受的载体可以制备用于施用的本发明的药用组合物。
本发明的融合蛋白可以应用于用于静脉内施用或皮下施用或鞘内施用的药用组合物。因此，上述的融合蛋白优选与可接受的无菌药用载体组合，这些载体如5％葡萄糖、乳酸林格液、生理盐水、无菌水或设计用于静脉内注入的其它任何商业化制备的生理性缓冲溶液。要知道对载体溶液和组合物的剂量及施用的选择会因为治疗对象和特殊的临床背景的不同而有所不同，并被标准的医学操作所决定。
根据本发明的方法，可以施用有效量的这些药用组合物以抑制对象中与凝血酶的过度生成相关的病理性后果。
可以丸式静脉内注射(bolus intravenous injection)、持续静脉内注射或组合两种途径施用融合蛋白。或者，或另外，可以从肌内部位将与适宜的赋形剂相混合的融合蛋白带入到循环中。通过测定取自患者的一系列血液标品的活化部分组织促凝血酶原激酶时间(activatedpartial thromboplastin time)(PT)可以监测融合蛋白的全身治疗。当融合蛋白在循环中达到了足够水平时，在这个检测中观察到凝血时间延长。
本发明的重组融合蛋白和药用组合物可用于肠外、局部、静脉内、口服或局灶施用。依照施用的方法，可以以多种单位剂量的形式施用药用组合物。例如，可以以包括但不限于片剂、胶囊、粉末、溶液和乳剂的形式施用单位剂量形式。
本发明的重组融合蛋白和药用组合物对于静脉内施用是特别有用的。用于施用的组合物通常包含单链抗体或含有溶解于药用可接受的载体内，优选溶解于水溶液的单链抗体的融合蛋白的溶液。可以使用多种水溶液载体，例如缓冲盐水等等。这些溶液是无菌的并且通常不含非必需的物质。可以用传统的、熟知的消毒技术消毒组合物。
本领域人员可以轻易地确定用于静脉内施用的常用的药用组合物。施用的量明显是蛋白特异的并且依赖于它的疗效(potency)以及药物动力学的情况。用于制备肠外施用组合物的实际方法对于本领域人员是已知的或显而易见的，并且在例如Remington′s PharmaceuticalScience，15thed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1980)的出版物中被更为详细地描述。
可以施用含有本融合蛋白或其鸡尾酒配方(即组合其它蛋白)的组合物用作治疗性处理。在治疗性应用中，将能治愈或至少部分地阻止出血的足够量的组合物施用给患出血异常或疾病的患者。能达到这一点的足够量被定义为“治疗有效量”。对此应用的有效量将依赖于疾病的严重程度以及患者的一般健康状况。
组合物的单次或多次施用依赖于所需的及患者所耐受的剂量和频率。在任何时候，组合物应当提供能有效地治疗患者的足够量的本发明的蛋白质。
以治疗有效量施用本发明的融合蛋白或它们的药用可接受的组合物，治疗有效量的不同依赖于多种因素，包括所采用的特异融合蛋白的活性；融合蛋白作用的代谢稳定性及时间长短；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的方式和次数；排泄速率；药物组合；特殊疾病状态的严重程度；患者正进行的治疗。通常，每天的治疗有效量为每天约0.14mg到约14.3mg/kg体重的本发明的融合蛋白或其可药用可接受的组合物；优选为每天约0.7mg到约10mg/kg体重；以及最优选每天约1.4mg到约7.2mg/kg体重。例如，给一个70kg的人施用，剂量范围为每天约10mg到约1g的本发明的融合蛋白或其药用可接受的组合物；优选每天约50mg到约700mg；以及最优选每天约100mg到约500mg。
基因治疗：
依照本发明也可以通过体内表达这种融合蛋白来利用本发明的融合蛋白，这通常被称作为“基因治疗”。因此，例如，可以用编码融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)体外(ex vivo)工程化细胞，然后将工程化的细胞提供给需要用融合蛋白治疗的患者。这些方法在技术上是熟知的。例如，利用本领域已知的方法通过使用含有编码本发明的融合蛋白的RNA的逆转录病毒颗粒可以工程化细胞。
使用基因治疗局部输送本发明的抗凝血融合蛋白可以将治疗试剂提供给靶部位，位于血管内的内皮细胞。
体外和体内基因治疗的方法学都是被关注的。已知一些用于将潜在的治疗基因转移到特定的细胞群中的方法。见，例如，Mulligan(1993)Science 260：926-931。这些方法包括：
1)直接基因转移。见，例如Wolff et al.(1990)Science 247：1465-1468；
2)脂质体介导的DNA转移。见，例如Caplen et al.(1995)Nature Med.3：39-46；Crystal(1995)Nature Med.1：15-17；Gao and Huang(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179：280-285；
3)逆转录病毒介导的DNA转移。见，例如Kay et al.(1993)Science 262：117-119；Anderson(1992)Science 256：808-813；
4)DNA病毒介导的DNA转移。这些DNA病毒包括腺病毒
(优选基于Ad2或Ad5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)以及细小病毒(优选基于“缺陷的”或非自主的细小病毒的载体，更优选基于腺相关病毒的载体，最优选基于AVV-2的载体)。见，例如Ali et al.(1994)Gene Therapy l：367-384；美国专利4,797,368，在此一起并入参考，以及美国专利5,139,941，在此一同并入参考。
对用于转移感兴趣的基因的特殊的载体系统的选择依赖于多种因素。一个重要的因素是靶细胞群的性质。尽管逆转录病毒载体已经被广泛地研究并用于许多基因治疗应用，但这些载体通常不适合用于感染非分裂细胞。另外，逆转录病毒具有致癌的潜能。然而，最近在慢病毒载体领域的进展可以避免这些局限中的一些局限。见Naldini etal.(1996)Science 272：263-267。
可能生成上述的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：Moloney鼠白血病毒、脾脏坏死病毒、逆转录病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)以及乳癌病毒。在一个实施方案中，逆转录病毒质粒载体来源于Moloney鼠白血病毒。
腺病毒的优点是它们具有广泛的宿主范围，并能感染静止的或终末分化的细胞，如神经元或肝细胞，以及基本上表现为非致癌性。见，例如Ali et al.(1994)，supra，p.367。腺病毒不整合到宿主基因组中。因为它们存在于染色体外，极大地减少了插入诱变的危险。Ali et al.(1994)，supra，p.373。
腺相关病毒具有与基于腺病毒的载体相似的优点。然而，AAV定点整合到人的19号染色体(Ali et al.(1994)，supra，p.377)。
在一个优选的实施方案中，用编码本发明的融合蛋白的DNA进行基因治疗的疾病包括但不限于：深静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血、急性冠脉综合征或具有凝血病表现的癌症。
根据该实施方案，在诊断的同时或诊断后即刻，将用编码本发明的融合蛋白的DNA的基因治疗提供给所需的患者。
根据该实施方案，本领域技术人员明白可以使用任何合适的含有编码本发明的融合蛋白的DNA或编码本发明的融合蛋白的类似物、片段、衍生物或变体的DNA的基因治疗载体。构建这样一个载体的技术是已知的。见，例如Anderson，W.F.(1998)Nature 392：25-30；Verma I.M.and Somia，N.(1998)Nature 389：239-242。用已知的技术可以可以将含有融合蛋白DNA的载体导入到靶位点。
基因治疗载体包括一个或多个启动子。可以采用的合适的启动子包括但不限于：逆转录病毒LTR；SV 40启动子和在Miller et al.(1989)Biotechniques 7(9)：980-990中所描述的人巨细胞病毒(CVM)启动子或其它任何的启动子(比如，细胞启动子，例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可以采用的其它病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子以及B19细小病毒启动子。从在此所包含的教导中选择合适的启动子对于本领域人员是显而易见的。
编码本发明的融合蛋白的核酸序列是在合适的启动子的控制下。可以采用的合适的启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括修饰后的上述逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子以及人生长激素启动子。
用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞株形成生产细胞株。可以被转染的包装细胞的实例包括但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X；如在Miller(1990)Human Gene Therapy 1：5-14中所描述的VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+#-86、GP+envAm12和DAN细胞株，在此将其全部内容一同并入参考。载体可以通过本领域任何已知的方法转导包装细胞。这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体以及CaPO4沉淀。在一个方法中，可以将逆转录病毒质粒载体装入脂质体内，或与脂类偶联，然后施用给宿主。生产细胞株生产包含编码多肽的核酸序列的感染性逆转录病毒载体颗粒。然后可以用这些逆转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
一种不同的基因治疗的方法是“经核治疗(transkaryotictherapy)”，其中体外(ex vivo)处理患者的细胞诱导静止的染色体基因在重新导入到患者后生产感兴趣的蛋白。经核治疗假定个体具有活化所必需的基因的正常互补。经核治疗包括将能激活新生基因的启动子或其它外源调节序列体外(ex vivo)导入到患者细胞的染色体DNA内，培养并选择活化的蛋白生产细胞，然后将活化的细胞重新导入到患者体内，目的是之后这些细胞被完全地建立。然后“基因活化”细胞生产感兴趣的蛋白一段显著长的时间，可能是患者的终生。美国专利5,641,670和5,733,761详细阐述了这个概念，在此将其全部内容一起并入参考。
试剂盒：
本发明进一步涉及用于研究或诊断目的的试剂盒。试剂盒通常包括一个或多个含有本发明的单链抗体的容器(container)。在一个优选的实施方案中，试剂盒包括含有适合于用第二种分子例如TM结构域或其片段衍生化的形式的单链抗体的容器。在一个更优选的实施方案中，试剂盒包括含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的融合蛋白的容器。
在另一个实施方案中，试剂盒可以含有编码融合蛋白的DNA序列。优选以适合于转染宿主细胞并被宿主细胞表达的质粒提供编码这些融合蛋白的DNA序列。质粒可以含有调节宿主细胞内DNA表达的启动子(通常是可诱导启动子)。质粒也可以含有适宜的限制性位点以有助于其它DNA序列插入到质粒内以生成多种融合蛋白。质粒也可以含有许多其它的有助于编码蛋白克隆与表达的元件。这些元件对于本领域人员是熟知的，包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等等。
治疗适应症：
血栓形成起重要的病原作用的疾病包括心肌梗死、弥漫性血管内凝血、深静脉血栓形成、肺栓塞、缺血性卒中、感染性休克、急性呼吸窘迫综合征、不稳定绞痛和其它的动脉和静脉阻塞性病变。本发明的融合蛋白在所有的这些情况以及血栓形成是病理性的其它疾病中都是有用的。本发明的融合蛋白可能有用的其它病理性病变包括具有凝血病表现的癌症以及炎症。也可以发现化合物可以用于皮肤和静脉移植物和器官移植。有用的意思是化合物能用于治疗，或预防疾病或阻止它进展到更严重的状态。本发明的化合物也给例如接受生物假体如心瓣膜的患者提供了一种安全有效的抗凝剂。这些化合物可以取代肝素和华法林治疗例如肺栓塞或急性心肌梗死。本发明的融合蛋白也可以用于包被凝血是相关的问题的医疗器械。
检测：
多种用于测定本发明的融合蛋白的TM活性的实验室检测是可利用的。在Salem，H.H.et al.(1984)，supra和Galvin，J.B.et al.(1987)J.Biol.Chem.262(5)：2199-2205中所描述的检测可测定蛋白C活性。简要地，检测由两个步骤组成。第一步是在所设定的条件下将试验的融合蛋白和凝血酶及蛋白C一起孵育。第二步，用蛭素或抗凝血酶III以及肝素失活凝血酶，利用显色底物测定新活化蛋白C的活性，其中通过活化蛋白C的蛋白裂解活性释放出生色团。用纯化试剂进行该检测。
或者，利用例如活化部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)和/或凝血酶原时间(PT)的血浆凝血时间检测可以测定融合蛋白的作用。这些检测区分了凝血抑制的不同机制并涉及蛋白C的活化。在任何一个检测中，凝血时间的延长都说明分子能抑制血浆内凝血。
用上述的检测鉴定具有TM活性的融合蛋白，其在纯化系统和血浆介质中都能结合凝血酶并激活蛋白C。然后用进一步的检测法评价天然TM的其它活性，如对凝血酶催化的纤维蛋白原生成纤维蛋白的抑制(Jakubowski，H.V.et al.(1986)J.Biol.Chem.261(8)：3876-3882)、对凝血酶活化因子V的抑制(Esmon，C.T.et al.(1982).J.Biol.Chem.257(14)：7944-7947)、促进抗凝血酶III和肝素辅因子II对凝血酶的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)J.Biol.Chem.258(20)：12238-12242)、对凝血酶活化因子XIII的抑制(Polgar，J.et al.(1987)Thromb.Haemost.58(1)：140)、对凝血酶介导的蛋白S的失活的抑制(Thompson，E.A.and Salem，H.H.(1986)J.Clin.Inv.78(1)：13-17)以及对凝血酶介导的血小板的活化和聚集的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)，supra)。
用在实施例5中详细描述的以下检测法测定本发明的融合蛋白的体外效力(potency)：1)蛋白C活化检测(显色法)；2)sTF/FVIIa活化检测；3)因子X活化检测；以及4)蛋白C活化检测(在富含TF的表面)。
在进行本发明的操作时，当然要明白所引述的特定的缓冲液、培养基、试剂、细胞、培养条件等均是非限制性的，而是应包括本领域技术人员在阅读任一所讨论的特定上下文中时能认识到的所有感兴趣的或有价值的相关材料。例如，用一种缓冲体系或培养基取代另一种经常是可能的，并仍能取得即使不相同也是相似的结果。本领域技术人员有着这些系统和方法学的足够多的知识，使得他们不进行过多的试验就能进行这样的取代并最优化在此所描述的方法和操作。
用下面的非限制性实施例进一步描述本发明，以帮助实施本发明。在应用实施例的阐述时，应理解的是相关领域的技术人员能够认识到本发明方法的其它不同的实施方案。
没有进一步的阐述，相信本领域人员能通过先前的描述将本发明应用到最完全的程度。因此，下面优选的特殊的实施方案只是举例说明，而不是以任何一种方式阐述其它内容。
在先前的和下面的实施例中，除非有特殊的说明，所有的温度被非修正地设定为摄氏度，所有部分和百分比为重量百分比。
上面所引用的所有申请、专利和出版物全部一同并入参考。
所提供的下面的实施例将作为进行本发明实践的一个指导，并不意图对本发明的范围进行限制。
实施例1
单链抗TF抗体构建体scFv(TF)3e10
(-18) M  L  G  V  L  V  L  G  A  L  A  L  A  G  L  V  F  P  E  M  A  Q
V  N  L  R  E  S  G  G  T  L  V  Q  P  G  G  S  L  R  L  S  C  A  A  S
G  F  S  F  T  D  A  W  M  S  W  V  R  Q  A  P  G  K  E  L  E  W  V  S
S  I  S  G  S  G  G  S  T  Y  Y  A  G  S  V  K  G  R  F  T  I  S  R  D
N  S  K  N  T  L  Y  L  Q  M  N  S  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A
R  V  L  S  L  T  D  Y  Y  W  Y  G  M  D  V  W  G  Q  G  T  L  V  T  V
S  A  G  G  G  G  S  G  A  P  N  F  M  L  T  Q  P  H  S  V  S  A  S  P
G  K  T  V  T  I  S  C  T  R  S  S  G  S  V  A  S  Y  Y  V  Q  W  Y  Q
Q  R  P  G  S  S  P  T  T  V  I  Y  E  D  N  H  R  P  S  G  V  P  D  R
F  S  G  S  I  D  T  S  S  N  S  A  S  L  T  I  S  G  L  K  T  E  D  E
A  D  Y  Y  C  Q  S  Y  D  S  N  N  L  V  V  F  G  G  G  T  K  L  T  V
L  G  A  A  A  G  A  P  V  P  Y  P  D  P  L  E  P  R  A  A  (264)
单链抗TF抗体scFv(TF)3e10(SEQ ID NO：1)由信号肽(-18到-1)、VH结构域(1到126)、VH-VL接头(127到131)、VL结构域(132到246)以及e-tag序列(247到264)组成。
实施例2
融合蛋白构建体1-scFv(TF)3e10-TMi456
Figure C0381570200511
(-18) M  L  G  V  L  V  L  G  A  L  A  L  A  G  L  V  F  P  E  M  A  Q
V  N  L  R  E  S  G  G  T  L  V  Q  P  G  G  S  L  R  L  S  C  A  A  S
G  F  S  F  T  D  A  W  M  S  W  V  R  Q  A  P  G  K  E  L  E  W  V  S
S  I  S  G  S  G  G  S  T  Y  Y  A  G  S  V  K  G  R  F  T  I  S  R  D
N  S  K  N  T  L  Y  L  Q  M  N  S  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A
R  V  L  S  L  T  D  Y  Y  W  Y  G  M  D  V  W  G  Q  G  T  L  V  T  V
S  A  G  G  G  G  S  G  A  P  N  F  M  L  T  Q  P  H  S  V  S  A  S  P
G  K  T  V  T  I  S  C  T  R  S  S  G  S  V  A  S  Y  Y  V  Q  W  Y  Q
Q  R  P  G  S  S  P  T  T  V  I  Y  E  D  N  H  R  P  S  G  V  P  D  R
F  S  G  S  I  D  T  S  S  N  S  A  S  L  T  I  S  G  L  K  T  E  D  E
A  D  Y  Y  C  Q  S  Y  D  S  N  N  L  V  V  F  G  G  G  T  K  L  T  V
L  G  A  A  A  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  V  E  P  V
D  P  C  F  R  A  N  C  E  Y  Q  C  Q  P  L  N  Q  T  S  Y  L  C  V  C
A  E  G  F  A  P  I  P  G  E  P  H  R  C  Q  L  F  C  N  Q  T  A  C  P
A  D  C  D  P  N  T  Q  A  S  C  E  C  P  E  G  Y  I  L  D  D  G  F  I
C  T  D  I  D  E  C  E  N  G  G  F  C  S  G  V  C  H  N  L  P  G  T  F
E  C  I  C  G  P  D  S  A  L  A  G  Q  I  G  T  D  C  A  A  A  G  A  P
V  P  Y  P  D  P  L  E  P  R  A  A  (400)
融合蛋白scFV(TF)3e10-TMi456(SEQ ID NO：2)由信号肽(-18到-1)、VH结构域(1到126)、VH-VL接头(127到131)、VL结构域(132到246)、VL-TM接头(247到264)、TMi456结构域(265到382)以及e-tag序列(383到400)组成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突变用下划线表示。
实施例3
融合蛋白构建体2-scFv(TF)3e10-TMi456Δ
Figure C0381570200521
(-18) M  L  G  V  L  V  L  G  A  L  A  L  A  G  L  V  F  P  E  M  A  Q
V  N  L  R  E  S  G  G  T  L  V  Q  P  G  G  S  L  R  L  S  C  A  A  S
G  F  S  F  T  D  A  W  M  S  W  V  R  Q  A  P  G  K  E  L  E  W  V  S
S  I  S  G  S  G  G  S  T  Y  Y  A  G  S  V  K  G  R  F  T  I  S  R  D
N  S  K  N  T  L  Y  L  Q  M  N  S  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A
R  V  L  S  L  T  D  Y  Y  W  Y  G  M  D  V  W  G  Q  G  T  L  V  T  V
S  A  G  G  G  G  S  N  F  M  L  T  Q  P  H  S  V  S  A  S  P  G  K  T
V  T  I  S  C  T  R  S  S  G  S  V  A  S  Y  Y  V  Q  W  Y  Q  Q  R  P
G  S  S  P  T  T  V  I  Y  E  D  N  H  R  P  S  G  V  P  D  R  F  S  G
S  I  D  T  S  S  N  S  A  S  L  T  I  S  G  L  K  T  E  D  E  A  D  Y
Y  C  Q  S  Y  D  S  N  N  L  V  V  F  G  G  G  T  K  L  T  V  L  G  A
A  A  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  V  E  P  V  D  P  C
F  R  A  N  C  E  Y  Q  C  Q  P  L  N  Q  T  S  Y  L  C  V  C  A  E  G
F  A  P  I  P  G  E  P  H  R  C  Q  L  F  C  N  Q  T  A  C  P  A  D  C
D  P  N  T  Q  A  S  C  E  C  P  E  G  Y  I  L  D  D  G  F  I  C  T  D
I  D  E  C  E  N  G  G  F  C  S  G  V  C  H  N  L  P  G  T  F  E  C  I
C  G  P  D  S  A  L  A  G  Q  I  G  T  D  C  (379)
融合蛋白2-scFv(TF)3e10-TMi456Δ(SEQ ID NO：3)由信号肽(-18到-1)、VH结构域(1到126)、VH-VL接头(127到131)、VL结构域132到243)、VL-TM接头(244到261)以及TMi456结构域(262到379)组成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突变用下划线表示。
实施例4
融合蛋白在细菌/哺乳动物细胞内的表达
细菌表达是可能的，但它所生成的蛋白所具有的TM辅因子活性被极大地减低。在CHO细胞中表达融合蛋白。表达质粒含有潮霉素B和DHFR选择标记。初始选择在400μg/ml潮霉素中进行以选择出一个群。然后对所得到的群进行100nM氨甲蝶呤选择。在这个选择期间，从群中选择出具有含有选择标记和靶向基因的DNA区域的扩增拷贝的细胞。作为选择的结果，表达水平从近0.3mg/L增加到约6mg/L。
实施例5
体外检测
1.蛋白C活化检测(显色法)
通过在微量滴度板内混合下列蛋白的每一种蛋白各20μl进行本检测：TM样品(未知的或标准的)、凝血酶(3nM)和蛋白C(1.5μM)。每种蛋白的检测稀释液为20mM Tris-HCl、0.1M NaCl、2.5mM CaCl2、2.5mg/ml BSA、pH7.4。在37℃下孵育2个小时，随后加入20μl蛭素(0.16单位/μl 370nM)至检测稀释液并另外孵育10分钟以终止蛋白C的活化。
通过加入100μl 1mM S2266(检测稀释液)检测所形成的活化蛋白C的量，并继续在37℃孵育。用Molecular Devices读板器每10秒读取每个孔在405nm的吸光度共30分钟。储存吸光度数据并计算出每秒钟吸光度的变化(斜率)。每秒钟吸光度的变化与pmol/ml活化蛋白C成比例。
利用不同浓度的总活化蛋白C经验性地确定该比率。通过将0到1.5μM的蛋白C和60nM兔TM以及30nM凝血酶混合，孵育0到4小时，如上加入蛭素并测定S2266活性可以生成含有100％活化蛋白C的样品。100％蛋白C被活化的条件被定义为S2266活性(A405/sec)达到平台的条件。
每单位活性被定义为在上述的试剂条件下每ml/min生成1pmol活化蛋白C。或者，给出比较于天然去污剂可溶的兔TM的活性数值。
2.sTF/FVIIa活化检测
下面描述了本检测的原理。底物三肽p-nitroanilide的酰胺键被sTF/FVIIa复合物水解。在405nm监测所释放的生色团产物p-nitroanilide，用摩尔消光系数9920M-1cm-1计算出每单位时间所形成的产物浓度。将初始速率加入到4参数方程：Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可测定出IC50值(C)。
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA→H-D-Val-Leu-Arg+p-NA
S2266底物               三肽         生色团
试剂和溶液：
1.检测缓冲液：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、
0.1％BSA，pH7.5
2.人FVIIa(HCVIIA-0060，Haematologic Technologies Inc.)：
10x工作溶液-在使用前配成20nM检测缓冲液溶液。
3.可溶性TF(Berlex)：10x工作溶液-在使用前配成30nM检测缓冲液溶液。
4.显色底物S2266(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)：储存溶液：
10nM H2O溶液，4℃下储存。2.5x工作溶液-在使用前配成2.5mM检测缓冲液溶液。
5.抗体：在使用前配成2.5x检测缓冲液稀释液。
检测条件：
室温下在96孔微量滴度板内进行检测。各种成分的最终浓度如下：
sTF    3nM
抗体   从1000到0.625nM不等；
FVIIa  2nM
S2266  1mM
检测步骤：
1.将0.1ml 2.5xAB(或缓冲液对照)吸入到每个孔内。
2.加入0.025ml 10x sTF，在室温下轻晃孵育10min。
3.加入0.025ml 10x FVIIa，在室温下轻晃孵育10min。
4.加入0.1ml 2.5x S2266底物，马上将滴度板转移到读板器并在405nm每隔10秒钟测定酶动力学共15分钟。
3.因子X活化检测：
下面描述了本检测的原理。将FVIIa与重组人TF小泡(vesicle)一起孵育形成能活化底物FX的蛋白酶复合物。在存在(或不存在)不同浓度的抗体时形成该复合物，然后引入底物FX，进行反应以形成产物，活化的蛋白酶FXa能水解显色底物S2222的p-nitroanilide酰胺键。在405nm监测所释放出的生色团产物p-nitroanilide，用摩尔消光系数9920M-1cm-1计算出每单位时间所形成的产物浓度。将初始速率加入到4参数方程：Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可测定出IC50值(C)。
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA→Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+p-NA
S2222底物                                    生色团
试剂和溶液：
1.检测缓冲液：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA，pH7.5
2.人FVIIa(HCVIIA-0031，Haematologic Technologies Inc.)：4x工作溶液-在使用前配成100pM检测缓冲液溶液。
3.重组人TF(来自Innovin，Dade，在我们实验室重构)：工作溶液-在使用前配成1∶480检测缓冲液稀释液。
4.因子X(HCX-0060，Haematologic Technologies Inc.)：4x工作溶液-在使用前配成1000nM检测缓冲液溶液。
5.显色底物S2222(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)：
储存溶液：6mM H2O溶液，4℃下储存
工作溶液-在使用前配成0.78mM的3.57mM EDTA(用于终止反应)、150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.5的溶液。
6.抗体：
在使用前配成4x检测缓冲液稀释液。
检测条件：
在室温下96孔微量滴度板内进行检测。各种成分的最终浓度如下：
rTF小泡    1/4的1∶480稀释液；
抗体    从1000到0.625nM不等；
FVIIa   25pM；
FX      250nM；
S2222   0.546mM；
检测步骤：
1.将0.015ml 4x AB(或缓冲液对照)吸入到每个孔内。
2.加入0.015ml 4xr TF小泡。
3.加入0.015ml 4x FVIIa，在室温下轻晃孵育10min。
4.加入0.015ml 4x FX，在室温下轻晃孵育5min。
5.加入0.14ml S2222底物，马上将滴度板转移到读板器并在405nm每隔10秒钟测定酶动力学共15分钟。
4.蛋白C活化检测(在富含TF表面)
按上述的显色法蛋白C活化检测法进行本检测，除了在本检测中在添加凝血酶和蛋白C之前将含有人TF的PC/PS小泡添加到融合蛋白中。
实施例6
抗TF抗体的特性
从完整的人单链抗体噬菌体展示文库中分离得到七种不同的TF结合抗体。用BIAcore测定的sTF结合抗体的亲和力在35和470nM之间。用sTF/VIIa检测确定抗体是否能阻断活性VIIa/TF复合物的形成。在sTF/VIIa检测中，VIIa与sTF的结合加快显色肽底物S2266的裂解速率大于20倍。抑制FVIIa与TF结合的抗体阻断了这种加速。在所分离到的七种不同的抗体中，它们中只有一种，scFv(TF)3e10不抑制sTF/VIIa检测。该抗体增加了FVIIa与sTF的亲和力，降低了KD5倍(图1)。利用sTF/FVIIa检测所测定的scFv(TF)3e10抗体对sTF的KD值为65.4nM(图2)。用微量量热法比较scFv(TF)3e10对TF及对FVIIa/TF复合物的亲和力。这些试验发现抗体对TF/FVIIa复合物的亲和力是对游离sTF亲和力的20倍(33nM对600nM，图3)。用FX活化检测比较抗体，它由磷脂小泡中的全长TF、FVIIa和FX组成。用显色底物S2765测定所生成的FXa的量。尽管scFv(TF)3e10抗体没有BIAcore所测定的最高亲和力以及它增加了FVIIa对sTF的亲和力，但是它是这一组中唯一能抑制FX活化及在PT检测中能延长凝血时间的抗体。scFv(TF)3e10(二聚体)抗体在FX活化检测中的抑制作用的IC50为0.44nM(图4)并且在417nM时出现PT的2倍延长(图5)。
依照与重组人可溶性TF的结合鉴定scFv(TF)3e10抗体。人与鼠或人与兔之间TF的序列同源性分别为58％和71％。抗体与人TF的独特表位的结合干扰了FVIIa/TF复合物对FX的活化。生理上，该抗体具有优于与FVII或FVIIa竞争结合TF的抗体的优点。人血浆中的FVII和FVIIa的KD为10nM，或比该KD高出100倍到1000倍之间。高亲和复合物的脱离速率(off-rate)将是低的(70到700秒钟，预期Kon＝108M-1sec-1)。相反，FX对VIIa/TF复合物的Km为0.200到4μM之间以及人血浆中的FX浓度为130nM(在0.03和0.65倍KD之间)。FVIIa/TF复合物在凝血上的主要功能是将FX转化为FXa。
实施例7
融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的体外特性
在多种体外检测中评价了本发明的融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的特性。融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456保留了抑制FVIIa/TF复合物活化FX的能力(IC50＝0.5nM，数据未示出)以及作为凝血酶催化的蛋白C的活化的辅因子(显色检测，图6)。在缺少含TF的磷脂小泡时，在融合蛋白和单独Tmi456之间没有观察到对TM的辅因子活性的显著差异。相反，在存在含TF磷脂小泡时，融合蛋白但不是TMi456的TM辅因子活性增强了＞5倍(图7)。融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456抗TF诱导的凝血(PT检测、外源性凝血途径)的体外效力比scFv(TF)3e10抗体高出6倍，比单独TMi456高出17倍(图5)。相反，融合蛋白抗内源性和常见凝血途径的体外效力不受显著影响(APTT和TCT检测，数据未示出)。因此，造成PT2倍延长的融合蛋白的剂量对APTT只有轻微影响，而对PT有等价作用剂量的TMi456造成了APTT的4倍延长(图8)。这个体外数据与在血栓形成的动物模型中所预期的TF/FVIIa定向抗凝剂的结果是一致的，已知该抗凝剂在出血率上有更好的作用。与基于血浆的凝血检测一致，融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456比scFv(TF)3e10或单独Tmi456在TF诱导的全血凝血检测(thromboelastograph，TEG)中有着更强的作用(图9)。另外，融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456比低分子量肝素(LMWH)在TF诱导的全血凝血检测中有更多的预期的剂量效应(图10)。综上，上述数据说明本发明的融合蛋白在体外是有效的和选择性的抗凝剂。
实施例8
体内大鼠血栓栓塞模型
融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的TF抗体部分特异于灵长类TF。在清醒的雄性Sprague-Dawley大鼠(350-400g，n＞7/组)上用人TF(含有人重组TF的组织促凝血酶原激酶试剂，Ortho)触发形成血栓栓塞模型。在这个弥漫性血管内凝血(DIC)模型中，通过组织促凝血酶原激酶注射，TF诱导了肺内纤维素沉积、呼吸衰竭和死亡。将等摩尔量的scFv(TF)3e10-TMi456或scFv(TF)3e10或小泡注射到尾静脉内，15分钟后丸式注射(bolus injection)组织促凝血酶原激酶(0.5ml/kg)。在载体(vehicle)治疗组中，这种剂量的TF造成了60％的死亡率(LD60)，通常发生在组织促凝血酶原激酶注射后的5分钟内。根据下面的发病率-死亡率评分系统将大鼠评分：0＝不受影响；1＝轻微呼吸窘迫(在30min内恢复)；2＝严重呼吸窘迫(垂死的，恢复需要超过60min)；以及3＝死亡。用平均分数比较4组不同处理组的效果。在图11中描述了利用这种体内检测方法的结果。本发明的融合蛋白在这个检测中能抑制死亡和呼吸窘迫。
用通常或特殊描述的反应物和/或本发明的操作条件取代在上述实施例中所使用的反应物和/或操作条件可以重复出具有相似成功率的上述实施例。
虽然本发明已经被举例说明某些融合蛋白构建体的生成，但显而易见的是在不脱离本发明的精神和范围时可以对本发明进行变化和修饰。
序列表
<110>舍林股份公司
<120>作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白
<130>BERLX 282WO
<140>PCT/US03/13522
<141>2003-04-30
<150>60/376,566
<151>2002-05-01
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>282
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Fusion
     Protein
<400>1
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
        35                  40                  45
Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His
145                 150                 155                 160
Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg
            180                 185                 190
Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro
        195                 200                 205
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn
    210                 215                 220
Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp
225                 230                 235                 240
Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro
            260                 265                 270
Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala
        275                 280
<210>2
<211>418
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Fusion
     Protein
<400>2
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
        35                  40                  45
Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His
145                 150                 155                 160
Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg
            180                 185                 190
Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro
        195                 200                 205
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn
    210                 215                 220
Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp
225                 230                 235                 240
Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser
            260                 265                 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Val Asp Pro
        275                 280                 285
Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
    290                 295                 300
Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro Gly Glu
305                 310                 315                 320
Pro His Arg Cys Gln Leu Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
                325                 330                 335
Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
            340                 345                 350
Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
        355                 360                 365
Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
    370                 375                 380
Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys
385                 390                 395                 400
Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg
                405                 410                 415
Ala Ala
<210>3
<211>397
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Fusion
     Protein
<400>3
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
        35                  40                  45
Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser
145                 150                 155                 160
Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser
            180                 185                 190
Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val
        195                 200                 205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser
    210                 215                 220
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
225                 230                 235                 240
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
                245                 250                 255
Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
        275                 280                 285
Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu
    290                 295                 300
Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro Gly Glu Pro His Arg
305                 310                 315                 320
Cys Gln Leu Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro
                325                 330                 335
Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp
            340                 345                 350
Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
        355                 360                 365
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly
    370                 375                 380
Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys
385                 390                 395

Claims (29)

1. 一种抗凝血融合蛋白，包括一种与组织因子(TF)或因子VIIa/TF(FVIIa/TF)复合物相互作用的靶向蛋白，该靶向蛋白被可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上，其中所述靶向蛋白选自由与TF结合的抗体、与FVIIa/TF复合物结合的抗体、FVIIai以及TFPI组成的组中，所述其它的TM结构域选自由EGF3和EGF4之间的域间环、EGF123结构域、O-连接的糖基化结构域以及N末端疏水性区域结构域组成的组中。
2. 权利要求1的融合蛋白，其中TM结构域包括EGF3和EGF4之间的域间环。
3. 权利要求2的融合蛋白，其中所述EGF456结构域含有使得所述融合蛋白更耐受氧化损伤或蛋白酶活性或者增加所述融合蛋白的催化效率的点突变。
4. 权利要求3的融合蛋白，其中所述EGF456结构域含有至少一种选自由H381G、M388L、R456G和H457Q组成的组中的点突变。
5. 权利要求4的融合蛋白，其中所述EGF456结构域由在H381G、M388L、R456G和H457Q的点突变组成。
6. 权利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是一种与TF结合的抗体。
7. 权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体是一种单克隆抗体。
8. 权利要求7的融合蛋白，其中所述单克隆抗体与FVIIa/TF复合物结合比与单独TF结合具有更高的亲和力。
9. 权利要求8的融合蛋白，其中所述单克隆抗体是一种单链抗体、Fab二聚体抗体或IgG抗体。
10. 权利要求9的融合蛋白，其中所述单克隆抗体是一种单链抗体。
11. 权利要求7的融合蛋白，其中所述单克隆抗体被可操纵地连接到一个以上TM结构域上。
12. 权利要求7的融合蛋白，其中所述单克隆抗体中和TF。
13. 权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白是糖基化的。
14. 权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白通过添加聚乙二醇被修饰。
15. 权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白是生物素化的以结合链霉亲和素。
16. 权利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是FVIIai。
17. 权利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是TFPI。
18. 权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白被用于在医疗器械的表面形成非成血栓性包膜，其中所述医疗器械与血液接触。
19. 一种药用组合物，包括权利要求1的融合蛋白，其中组合物包括药用可接受的赋形剂以及治疗有效量的所述融合蛋白。
20. 权利要求1的融合蛋白在制备用于预防血栓形成的药物中的应用。
21. 权利要求20的应用，其中所述药物预防缺血性卒中、血管成形术后的血栓性并发症或微血管手术中的血栓形成。
22. 权利要求1的融合蛋白在制备用于预防和治疗患者的深静脉血栓形成(DVT)、弥漫性血管内凝血(DIC)、急性冠脉综合征、或具有凝血病表现的癌症的药物中的应用。
23. 权利要求1的融合蛋白在制备用于调节患者的炎症反应的药物中的应用。
24. 权利要求23的应用，其中所述炎症反应选自由脓毒症、皮肤和静脉移植以及器官移植组成的组中。
25. 一种包括权利要求1的融合蛋白的试剂盒。
26. 一种包括编码权利要求1的融合蛋白成分的DNA序列的试剂盒。
27. 一种基因治疗组合物，包括编码由SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的氨基酸序列组成的融合蛋白的DNA，以及组合有治疗有效量的基因治疗载体。
28. 一种抗凝血融合蛋白，包括与TF或FVIIa/TF复合物相互作用的靶向蛋白，其中所述靶向蛋白是一种与TF结合的单链抗体，它被可操纵地连接到TM EGF456结构域和EGF3与EGF4之间的域间环，其中所述EGF456结构域由在H381G、M388L、R456G和H457Q的点突变组成。
29. 权利要求28的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
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