RU2320366C2 - Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов - Google Patents
Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2320366C2 RU2320366C2 RU2004135308/15A RU2004135308A RU2320366C2 RU 2320366 C2 RU2320366 C2 RU 2320366C2 RU 2004135308/15 A RU2004135308/15 A RU 2004135308/15A RU 2004135308 A RU2004135308 A RU 2004135308A RU 2320366 C2 RU2320366 C2 RU 2320366C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fusion protein
- protein
- domain
- antibody
- fviia
- Prior art date
Links
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 title claims abstract description 230
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 title claims abstract description 230
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 211
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 211
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 101100226846 Strongylocentrotus purpuratus EGF3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 129
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 claims description 125
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 45
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 43
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 22
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 7
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 7
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 claims description 5
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 claims description 4
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 2
- 230000001453 nonthrombogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 2
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 claims 5
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 claims 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 claims 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 120
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 51
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 47
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 47
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 47
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 47
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 47
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 11
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 7
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 6
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 6
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 6
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 6
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 101100327819 Caenorhabditis elegans chl-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 5
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000000516 activation analysis Methods 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 5
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- -1 peptidyl chloromethyl ketone Chemical compound 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 3
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ZNKZJCICBFSACN-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylbutanoyl)amino]-n-[5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ZNKZJCICBFSACN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 2
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000763314 Homo sapiens Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 101000653189 Homo sapiens Tissue factor pathway inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 101000938391 Homo sapiens Transmembrane protein Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108010090444 Innovin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 2
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 2
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 229940049370 fibrinolysis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003331 prothrombotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N Ellagic acid Chemical compound OC1=C(O)C(OC2=O)=C3C4=C2C=C(O)C(O)=C4OC(=O)C3=C1 AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N Ellagic acid Natural products OC1=C(O)[C@H]2OC(=O)c3cc(O)c(O)c4OC(=O)C(=C1)[C@H]2c34 ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N 0.000 description 1
- 229920002079 Ellagic acid Polymers 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004032 Heparin Cofactor II Human genes 0.000 description 1
- 108090000481 Heparin Cofactor II Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000842288 Hirudo medicinalis Hirudin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 238000012773 Laboratory assay Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101100115713 Mus musculus Stfa3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 206010037459 Pulmonary venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010057469 Vascular stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000007819 clotting time assay Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229960002852 ellagic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004132 ellagic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013171 endarterectomy Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960000610 enoxaparin Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003027 hypercoagulation Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N methylellagic acid Natural products O1C(=O)C2=CC(O)=C(O)C3=C2C2=C1C(OC)=C(O)C=C2C(=O)O3 FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008756 pathogenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 108700003414 solulin Proteins 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/7455—Thrombomodulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается новых слитых белков тромбомодулина, обеспечивающих направленный перенос к тканевому фактору, которые могут применяться в качестве антикоагулянтов. Сущность изобретения включает антикоагулирующий слитый белок, содержащий белок, обеспечивающий направленный перенос, который функционально связан с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF456 и с доменом ТМ, включающим междоменную петлю между EGF3 и EGF4 или их производных или вариантов, и взаимодействующий с тканевым фактором (TF) или комплексом фактора VIIa/TF. Слитый белок связывается в участке повреждения и предотвращает инициацию тромбоза, а также может применяться для терапии различных тромбозных состояний, включая, но без ограничения, тромбоз глубоких вен, коагулопатию потребления и острый коронарный синдром. Преимущество изобретения заключается в расширении области применения. 7 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 ил.
Description
Сохранение надлежащего баланса между прокоагулирующей и антикоагулирующей активностью в кровеносных сосудах существенно для нормального гемостаза (Е.W.Davie и др., Biochemistry, 30 (43), 1991, с. 10363-10370). Нарушение баланса в направлении коагуляции приводит к тромбозам, которые могут вызвать сердечный приступ, инсульт, легочную эмболию и венозный тромбоз. Существует необходимость в создании более эффективных и безопасных антикоагулянтов для лечения специфических тромбозных нарушений.
Тканевой фактор (TF) - это трансмембранный гликопротеин, который является основным инициатором каскада коагуляции (Y.Nemerson, Thromb. Haemost. 74 (1), 1995, с. 180-184). При нормальных физиологических условиях TF не находится в контакте с кровью. При сосудистом повреждении воздействие на кровь субэндотелиального TF и коллагена приводит к активации факторов коагуляции и тромбоцитов и впоследствии к образованию гемостатической пробки. Неуместная индукция экспрессии TF в различных клинических ситуациях может привести к угрожающему жизни тромбозу и/или содействовать патологическим осложнениям. Воздействие TF на последующее разрушение тромбоцита считается ответственным за тромбозную окклюзию, приводящую к острому инфаркту миокарда или инсульту. В этих ситуациях противоспалительные сигнальные пути, активированные факторами коагуляции, содействуют также образованию отека и увеличению объема инфаркта. Сосудистое повреждение, ассоциированное с ангиопластикой, приводит к активации TF на клетках гладкой мышцы (SMC), которая, как считается, индуцирует пути передачи клеточных сигналов, связанные с рестенозом. Сверхэкспрессия TF при раке и грамотрицательном сепсисе приводит к угрожающему жизни тромбозу и активации воспалительных путей.
Комплекс факторов VIIa (FVIIa)/TF включается в патогенетический механизм при различных тромбозных заболеваниях, и циркулирующий уровень TF является фактором риска для некоторых пациентов. Факторы VIIa и TF играют уникальные роли при сосудистом повреждении в сохранении гемостаза и инициации тромбоза. Экспрессируется TF обычно в адвентициальной оболочке, но при сосудистом заболевании несоответственно активируется и экспрессируется в середине и неоинтиме сосуда. Экспрессия TF в атеросклеротических бляшках повышена и экранирована от крови толстым волокнистым слоем, который может разрушаться, высвобождая TF. Хирургические вмешательства, такие как баллонная ангиопластика, установка стента или эндартерэктомия, повреждают сосудистую стенку и высвобождают находящийся под ней TF. В атеросклеротической толстостенной бляшке с высоким содержанием липидов спонтанное разрушение или эрозия эндотелия приводит к воздействию TF и тромбозу, заканчивающимся нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда. TF может циркулировать в происходящих от клеток микрочастицах, и уровни циркулирующего TF при нестабильной стенокардии являются повышенными, допуская предположение о том, что этот циркулирующий TF может содействовать образованию тромба (Н.Soejima и др., Circulation, 99 (22), 1999, с. 2908-2913). Часто злокачественная опухоль ассоциируется с состоянием гиперкоагуляции, объясняемым сверхэкспрессией TF на опухолевых клетках. Это предрасполагает пациента к тромбозу глубоких вен, легочной эмболии и низкой степени коагулопатии потребления (DIC). Коагулопатия потребления приводит к отложениям фибрина в капиллярных сосудах, способствуя повреждению многих органов. Результаты, полученные на моделях тромбоза от острого артериального нарушения, указывают, что основанные на белках ингибиторы FVIIa/TF, такие как ингибитор активного центра фактора VIIa (FVIIai) и ингибитор метаболических путей тканевого фактора (TFPI), являются эффективными антитромбозными средствами с меньшей кровопотерей, по сравнению с ингибиторами тромбина и фактора Ха (FXa). Кроме того, ингибиторы FVIIa/TF превосходят другие антикоагулянты (например, гепарин, ингибиторы FXa) в предотвращении образования утолщения неоинтимы и сосудистого стеноза после нарушения, вызванного баллонной ангиопластикой (Y. Jang и др., Circulation, 92 (10), 1995, с. 3041-3050).
Тромбомодулин (ТМ) - это трансмембранный гликопротеин, который обладает антикоагулирующими свойствами и преимущественно экспрессируется на полостной поверхности эндотелиально-клеточной выстилки кровеносных сосудов (N.L.Esmon и др., J.Biol. Chem. 257 (2), 1982, с. 859-864; H.H. Salem и др., J. Biol. Chem. 259 (19), 1983, с. 12246-12251). Зрелый с полной последовательностью ТМ является модульным белком из 557 аминокислотных остатков, составленным из 5 структурных доменов: N-концевого гидрофобного участка (остатки 1-226); богатого цистеином участка (остатки 226-462); O-гликозилированного Ser/Thr-богатого участка (остатки 463-497); гидрофобного трансмембранного участка (остатки 498-521); и С-концевого цитоплазматического хвоста (остатки 522-557).
Богатый цистеином участок включает шесть повторяющихся структур, гомологичных предшественнику эпидермального фактора роста (EGF), названного EGF-подобный, EGF-гомологичный или EGF-домены. Богатый цистеином участок далее может быть разделен на 3 домена: EGF-подобные повторы 1, 2 и 3 (EGF 123, остатки 226-344), междоменная петля между EGF3 и EGF4 (остатки 345-349) и EGF-подобные домены 4, 5 и 6 (EGF456, остатки 350-462). Функция EGF456 состоит в том, чтобы опосредовать связывание и активацию белка С. Одно исследование предполагает, что пятый и шестой EGF-подобные повторы (EGF5, остатки 390-407 и EGF6, остатки 427-462 соответственно) обладают способностью связывать тромбин (S. Kwosawa и др., J. Biol. Chem. 263 (13), 1988, с. 5993-5996); другое предполагает, что домена EG456 достаточно, чтобы действовать в качестве кофактора опосредованной тромбином активирующей белок С активности (М. Zushi и др., J. Biol. Chem. 264 (18), 1989, с. 10351-10353). Ser/Thr-богатый домен усиливает опосредованное EGF456 связывание тромбина. Третий EGF-подобный повтор (EGF3, остатки 311-344) требуется для активации ингибитора фибринолиза, активируемого тромбином (TAFI). Описано несколько точечных мутантов, которые препятствуют активации TAFI (W. Wang и др., J. Biol. Chem. 275 (30), 2000, с. 22942-22947). Комплекс тромбин/ТМ превращает белок С в активированный белок С (АРС), который, в свою очередь, разрушает факторы Va и Villa, препятствуя тем самым генерации тромбина. Следовательно, ТМ функционирует как молекулярный переключатель, превращая тромбин из прокоагулянта в антикоагулянт.
Значение Кm белка C для комплекса тромбин/ТМ снижается 10-кратно, когда ТМ локализован на поверхности мембраны (C.N.Esmon, ESEB J. 9 (10), 1995, с. 946-955). Концентрация белка С в крови (0,065 мкМ) значительно ниже сообщенного значения Кm (5 мкМ) для растворимого комплекса ТМ/тромбин, отсюда утверждение, что ТМ на прокоагулирующей мембранной поверхности приведет к заметному локальному повышению скорости генерации белка С.
ТМ ингибирует тромбоз по механизму, отличному от гепарина или его производных. Гепарин является кофактором антитромбина III и ингибирует как FXa, так и тромбин по антитромбин III-зависимому механизму. Связанный с тромбом тромбин защищен от действия антитромбина III, который ограничивает антитромбозную эффективность гепарина или гепарина с низкой молекулярной массой (LMWH) на существующих ранее сгустках. Это объясняет отсутствие у гепарина или LMWH способности ингибировать рост тромба, запускаемый связанным со сгустком тромбином или протромбиназой в исследованиях на приматах, кроме человека. В противоположность этому рекомбинантный ТМ ослабляет индуцированную сгустком генерацию тромбина и образование фибрина дозозависимым способом (М. Mohri и др., Thromb. Haemost. 80 (6), 1998, с. 925-929). Ингибирующий эффект ТМ аннулируется антителом к белку С. Подавление связанной со сгустком прокоагулянтной активности является клинически актуальным, т.к. связанная со сгустком прокоагулирующая активность приводит к более быстрому росту тромба и в конечном итоге к сосудистой окклюзии или тромбоэмболическим осложнениям. Ингибирование роста тромба позволяет эндогенной фибринолитической системе удалять сгустки быстрее и полностью. Кроме того, ожидается также, что ТМ более эффективен, чем гепарин, при патологических состояниях, при которых антитромбин в плазме снижен, таких как коагулопатия потребления (DIC). Несмотря на то что как ТМ, так и гепарин ингибируют поглощение тромбоцитов и фибриногена при экспериментальной DIC, только ТМ был эффективен, когда уровни антитромбина III снижались.
Краткое содержание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает новые слитые белки, которые действуют как антикоагулянты и включают белок, который взаимодействует или с тканевым фактором (TF), или с комплексом фактора VIIa/тканевой фактор (FVIIa/TF), и функционально связан с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF456, одним или в комбинации с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из домена N-концевого гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4 и O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.
Антикоагулирующий слитый белок по данному изобретению направлен на и связывает TF или комплекс FVIIa/TF в участке повреждения, локализуя ТМ в участке повреждения и таким образом предотвращая образование тромба и в связи с этим действуя более эффективно в качестве антикоагулянта, по сравнению или с растворимым антителом к TF, или растворимым ТМ, или фрагментами ТМ. Слитый белок более эффективен, чем гепарин с низкой молекулярной массой (LMWH), при лечении некоторых заболеваний, включая, но без ограничения, сепсис, коагулопатию потребления, ишемический удар, тромбоз глубоких вен, острые коронарные синдромы, тромбозные осложнения после ангиопластики и коагулопатию при прогрессирующей злокачественной опухоли. Кроме того, слитый белок применяется в хирургических операциях на капиллярных сосудах, в трансплантатах кожи и вен и при пересадке органов.
В другом аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие в качестве объекта слитые белки.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способ предохранения пациента от образования тромба, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка, и в связи с этим подавление генерации тромбина без непосредственного воздействия на другие параметры коагуляции, такие как активация и агрегация тромбоцитов.
В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения и лечения тромбоза глубоких вен (DVT) или коагулопатии потребления (DIC), или острого коронарного синдрома, или злокачественной опухоли с проявлением коагулопатии у пациента, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка.
В другом аспекте изобретение относится к способу регулирования воспалительного ответа у пациента, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка.
Еще в одном аспекте слитый белок по изобретению может быть использован для образования не являющегося тромбогенным покрытия медицинских инструментов, контактирующих с кровью.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему слитый белок, включающий белок, который обеспечивает направленный перенос и связывает TF или комплекс FVIIa/TF и домены ТМ. Альтернативно набор может включать последовательности ДНК, кодирующие компоненты слитого белка.
Раскрываются также способы получения слитых белков по изобретению как рекомбинантные, так и синтетические.
Описание графиков
Фиг.1. Связывание антитела scFv(TF)3e10 с растворимым TF (sTF) увеличивает кажущееся сродство sTF к FVIIa. Активационный анализ sTF/FVIIa осуществляли, как описано в примере 5, озаглавленном «Анализ активации sTF/FVIIa», используя 2 нМ FVIIa в присутствии и в отсутствие 800 нМ scFv(TF)3e10. Титровали sTF в пробе и определяли скорость расщепления хромогенного субстрата (S-2266). Значение кажущейся KD для sTF рассчитывали, используя стандартную 4-параметрическую аппроксимацию.
Фиг.2. Измерение сродства связывания scFv(TF)3e10 к sTF. Анализ sTF/FVIIa осуществляли, как описано в примере 5, озаглавленном «Анализ активации sTF/FVIIa», используя 3 нМ sTF и 2 нМ FVIIa. Использованная концентрация sTF была ниже значения KD для связывания с FVIIa. Связывание антитела scFv (TF)3e10 снижало значение KD sTF для связывания с FVIIa, приводя к повышению образования комплекса sTF/FVIIa и, следовательно, скорости расщепления хромогенного субстрата S2266. Прибавляли scFv(TF)3e10 при увеличивающихся концентрациях и повышенную скорость реакции использовали, чтобы определить кажущуюся KD антитела для sTF, используя стандартную 4-параметрическую аппроксимацию.
Фиг.3. Микрокалориметрический анализ показывает, что scFv(TF)3e10 имеет 20-кратно более высокое сродство к комплексу sTF/FVIIa, чем к одному sTF. Комплекс sTF/FVIIa был предварительно получен прибавлением 2,3-кратного молярного избытка FVIIai по отношению к sTF. Гранулометрическую эксклюзионную хроматографию использовали, чтобы подтвердить, что sTF полностью комплексирован. Для определения сродства антитела к комплексу прибавляли 1,2 мкМ комплекса sTF/FVIIa в ячейку микрокалориметра и 65 мкМ антитела scFv(TF)3e10 прибавляли в шприц. Для определения сродства антитела к одному sTF прибавляли 10 мкМ sTF в ячейку и 141 мкМ scFv(TF)3e10 прибавляли в шприц. Анализ данных проводили, используя программу MicroCal Origin. Данные были аппроксимированы к одному сайту связывания.
Фиг.4. Антитело scFv(TF)3e10 дозозависимо ингибирует анализ активации фактора Х (FX). Подробности анализа описаны в примере 5, озаглавленном «Анализ активации фактора X». IC50 означает дозу, требуемую для достижения 50% ингибирования.
Фиг.5. Слитый белок сильнее подавляет коагуляцию, чем антитело TF или один ТМi456. Анализ протромбинового времени (ПВ) проводили, чтобы сравнить слитый белок с антителом TF или одним TMi456. Соответствующий объем концентрированного ингибитора или антитела TF (scFv(TF)3e10), TMi456 или слитого белка (scFv(TF)3e10-TMi456) прибавляли к 100 мкл рекомбинантного человеческого тромбопластина (Ortho Recombiplastin). Приблизительно 2 мин позже прибавляли 100 мкл восстановленной человеческой плазмы. Время коагуляции определяли на коагулометре Haemoliance. Кривые ответа на дозу получали для каждого ингибитора и затем использовали регрессионный анализ, чтобы рассчитать концентрацию (в нМ), необходимую для двукратного увеличения времени свертывания крови.
Фиг.6. Слитый белок сохраняет полную кофакторную активность для активации белка С. Анализ, описанный в примере 5, озаглавленный «Анализ (хромогенный) активации белка С», включал 20 мкл образца ТМ или ТМ1456, который содержал домены EGF4-6 и междоменную петлю между EGF3 и EGF4, или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456), 20 мкл 1,5 мкМ белок С и 20 мкл 3 нМ α-тромбин. Активации давали возможность проходить в течение 1 ч. Фазу активации останавливали путем добавления 20 мкл 0,16 ед/мл гирудина. Затем прибавляли 100 мкл 1 мМ хромогена S2266 и А405 определяли каждые 10 сек в течение 30 мин. Скорость реакции зависит от количества генерированного активированного белка С. Данные выражены в мОП/мин.
Фиг.7. Скорость активации белка С слитым белком повышается на содержащих TF фосфолипидных поверхностях. На скорость активации белка С не оказывает влияния прибавление везикул TF. Образец для анализа, описанного в примере 5, озаглавленном «Анализ активации белка С (на TF-богатой поверхности)», содержал 20 мкл образца ТМ, или ТМ1456, или слитый белок (scFv (TF)3e10-TMi456), 20 мкл 1,5 мкМ белка С, 20 мкл 3 нМ α-тромбина и 20 мкл буфера или везикул TF (инновин, человеческий рекомбинантный TF, 4х нормальная концентрация для ПВ). Активации давали проходить в течение 1 ч. Фазу активации останавливали добавлением 20 мкл 0,16 ед/мл гирудина. Затем прибавляли 100 мкл 1 мМ хромогена S2266 и А405 определяли каждые 10 сек в течение 30 мин. Скорость реакции зависела от количества генерированного активированного белка С. Данные выражены в мОП/мин.
Фиг.8. Слитый белок показывает более высокую специфичность к индуцированной TF коагуляции, чем TMi456. Анализ частичного активированного тромбопластинового времени (ЧАТВ) чувствителен к ингибиторам внутреннего и центрального метаболических путей коагуляции. Коагуляция, которая происходит в данном анализе, независима от TF. Ингибиторы - или антитело TF (scFv(TF)3e10), TMi456, или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) - разбавляли в 50 мкл восстановленной человеческой плазмы до конечной концентрации, которая давала двукратное увеличение в анализе протромбинового времени (ПВ). В коагулометр затем прибавляли 50 мкл реагента АРТТ (кефалин из кроличьего мозга в 0,1 мМ эллаговой кислоте, с буфером, стабилизаторами и консервантами; Alexin HS) и 50 мкл раствора CaCl2 (0,02 моль/л) и определяли время свертывания крови в сек.
Фиг.9. Слитый белок сильнее подавляет индуцированную TF коагуляцию цельной крови, чем любой из его компонентов в отдельности. Коагуляцию цельной крови анализировали, используя анализатор тромбоэластограф (TEG) Haemoscope. К цельной крови в цитратном буфере прибавляли 120 нМ антитела TF (scFv(TF)3e10), TMi456 или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) вместе с 10 мкл тромбопластинового реагента (разведение 1:64) и 20 мкл 0,2 М CaCl2. Значение R (время до начального образования фибрина) получали для каждого образца. Данное значение затем превращали в % не ингибированного контрольного значения R.
Фиг.10. Слитый белок проявляет более предсказуемый дозовый ответ, чем LMWH, в анализе коагуляции цельной крови (TEG). К цельной крови в цитратном буфере прибавляли увеличивающиеся концентрации (15 нМ начальная и увеличенные с помощью инкрементов 2х) слитого белка (scFv(TF)3e10-TMi456) или увеличивающиеся концентрации (0,15 ед/мл начальная и увеличенные 2х) эноксапарина (LMWH) наряду с 10 мкл тромбопластинового реагента (разведение 1:64) и 20 мкл 0,2 М CaCl2. Значение R (время до начала образования фибрина) получали для каждого образца и строили график зависимости от относительной концентрации (принимали самую низкую концентрацию за 1 для каждого (подобного значения R), затем последующие концентрации увеличивали 2х).
Фиг.11. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 эффективен in vivo на модели коагулопатии потребления (DIC). Антитело TF (scFv(TF)3e10) и слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) оценивали на крысиной модели тромбоэмболии, описанной в примере 8, по (А) проценту смертности и (Б) количественному показателю распространенность заболевания-смертности. (А) В обработанной наполнителем группе использованная доза TF привела к 60% летальности (LD60). Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 при 0,7 нмоль/кг полностью предотвращал гибель. В противоположность этому, scFv(TF)3e10 при 0,7 нмоль/кг не влияло на гибель. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 был более эффективным, чем 10-кратно более высокая доза scFv(TF)3e10. (Б) В обработанной наполнителем группе применяемая in vivo доза TF приводила к средней количественной оценке распространенности заболевания-смертности в 2,6 балла, основанной на следующей оценке в баллах: 0 - нет воздействия; 1 - слабая дыхательная недостаточность (восстановление в течение 30 мин); 2 - острая дыхательная недостаточность (агонирующее состояние, восстановление требует более чем 60 мин); и 3 - гибель. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 дозозависимым образом предотвращал индуцированную TF гибель и дыхательную недостаточность при значении 50% эффективной дозы ED50 0,46 нмоль/кг (0,019 мг/кг). В дозе 7,0 нмоль/кг scFv(TF)3e10-TMi456 полностью предотвращал как гибель, так и дыхательную недостаточность, а в дозе 0,7 нмоль/кг полностью предотвращал гибель и значительно уменьшал дыхательную недостаточность. В противоположность этому, scFv(TF)3e10 при 0,7 нмоль/кг не оказывало влияния на гибель и слабо либо совсем не действовало на дыхательную недостаточность. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 был более эффективен, чем 10-кратно более высокая доза scFv(TF)3e10.
Подробное описание изобретения
Антикоагулирующий слитый белок по настоящему изобретению включает белок, который обеспечивает направленный перенос и взаимодействует или с тканевым фактором (TF), или с комплексом фактор VIIa/тканевой фактор (FVIIa/TF), который функционально связан с доменом EGF456 тромбомодулина (ТМ), одним или в комбинации по меньшей мере с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из N-концевого домена гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4, O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.
Определения
В описании по настоящему изобретению определены следующие термины, как указано ниже.
Термин «рекомбинантные белки или пептиды» относится к белкам или пептидам, полученным с использованием методик рекомбинантной ДНК, т.е. полученным из микробных клеток и клеток млекопитающих, трансформированных с помощью конструкции экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид. Белки или полипептиды, экспрессированные в большинстве бактериальных культур, будут свободны от гликана. Белки и полипептиды, экспрессированные в дрожжевых клетках, имеют гликозилированную структуру, отличную от таковой, экспрессированной в клетках млекопитающих.
Термин «нативные» белки или полипептиды относится к белкам или полипептидам, выделенным из природных источников. Термин «нативный ТМ» будет включать существующий в природе ТМ и его фрагменты.
Термин «кодирующая последовательность» ДНК означает последовательность ДНК, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в полипетид в клетке-хозяине при помещении под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют с помощью инициирующего кодона на 5'-N-конце и трансляционного терминирующего кодона на 3'-С-конце. Кодирующая последовательность может включать прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической мРНК, геномные последовательности ДНК и синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно будет располагаться в положении 3' по отношению к кодирующей последовательности.
Термин «слитый белок» означает белок, возникающий в результате экспрессии по меньшей мере двух функционально связанных гетерологичных кодирующих последовательностей. Слитый белок по изобретению состоит из белка, который обеспечивает направленный перенос и взаимодействует или с TF, или с комплексом FVIIa/TF, который функционально связан только с доменом EGF456 тромбомодулина (ТМ) или находится в комбинации по меньшей мере с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из N-концевого домена гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4, O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.
Термин «белок, который обеспечивает направленный перенос» означает белок, который связывается или взаимодействует с другим белком или белковым комплексом. Белок, обеспечивающий направленный перенос, по данному изобретению означает белок, который связывается или взаимодействует с TF или комплексом FVIIa/TF. Например, антитело к TF или к комплексу FVIIa/TF является белком, обеспечивающим направленный перенос, по данному изобретению. Двумя другими примерами белков, обеспечивающих направленный перенос, являются ингибированный по активному центру фактор VIIa (FVIIai), который может связывать TF, образуя неактивный комплекс FVIIai/TF, и ингибитор метаболизма тканевого фактора (TFPI), который может связывать и инактивировать комплекс FVIIa/TF.
Термин «нуклеотидная последовательность» означает гетерополимер из дезоксирибонуклеотидов (основания - аденин, гуанин, тимин или цитозин). Последовательности ДНК, кодирующие слитые белки по данному изобретению, могут быть составлены из синтетических фрагментов ДНК, происходящих от кДНК, и коротких олигонуклеотидных линкеров, чтобы обеспечить получение синтетического гена, который способен экспрессироваться с помощью рекомбинантного вектор экспрессии. При обсуждении структуры отдельных двухцепочечных молекул ДНК последовательности могут быть описаны в контексте согласно обычному правилу приведения последовательности только в направлении от 5'-конца к 3'-концу вдоль не транскрибированной цепи кДНК.
Термин «рекомбинантный вектор экспрессии» означает конструкцию реплицируемой ДНК, использованную для того, чтобы или амплифицировать, или экспрессировать ДНК, кодирующую слитые белки по настоящему изобретению. Вектор экспрессии содержит контролирующие последовательности ДНК и кодирующую последовательность. Контролирующие последовательности ДНК включают промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, сигналы полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции, расположенные против хода транскрипции домены и энхансеры. Рекомбинантные системы экспрессии, как определено в контексте, будут экспрессировать слитые белки при индукции регуляторных элементов.
Термин «трансформированные клетки-хозяева» относится к клеткам, которые были трансформированы и трансфицированы экзогенной ДНК. Экзогенная ДНК может быть или может не быть интегрирована (ковалентно связана) с хромосомной ДНК, составляющей геном клетки. Например, в прокариотах и дрожжах экзогенная ДНК может сохраняться в эписомальном элементе, таком как плазмида, или устойчиво интегрировать в хромосомную ДНК. Что касается эукариотических клеток, то устойчиво трансформированная клетка означает клетку, в которой экзогенная ДНК стала интегрированной в репликацию хромосом. Эта стабильность демонстрируется способностью линий или клонов эукариотических клеток продуцировать популяцию дочерних клеток, содержащих экзогенную ДНК.
Термин «тромбомодулин (ТМ)» относится к гликопротеину поверхности клеток эндотелия, который образует с высоким сродством к комплексу с тромбином. Гены, кодирующие нативный ТМ (как его геномную форму, так и в форме кДНК), были выделены из бычьего и человеческого источников и секвенированы (R.W.Jackman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (23), 1986, с. 8834-8838 и R.W. Jackman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (18), 1987, с. 6425-6429, обе ссылки включены в контекст путем цитирования). Последовательности ТМ для быка, человека и мыши обладают высокой степенью гомологии друг с другом. В случае человеческого ТМ кДНК кодирует белок 60,3 кДа из 575 аминокислот, включающий сигнальную последовательность примерно из 18 аминокислот, см., например, патент US 5827824.
Когда тромбин связывается с ТМ, может быть тысячекратное или большее увеличение скорости активации белка С, которая образует активированный антикоагулирующим ферментом белок С. Кроме того, когда тромбин связывается с ТМ, тромбин больше не работает в качестве прокоагулирующего фермента. А именно, катализируемые тромбином образование фибрина, активация фактора V и активация тромбоцитов, - все ингибируются в присутствии ТМ. Таким образом, ТМ превращает тромбин в физиологический антикоагулянт.
Термин «тромбомодулиновый (ТМ) домен» относится к дискретной аминокислотной последовательности, которая может быть ассоциирована с особой функцией или особенностью ТМ, такой как структура, характерная для третичной структуры. Ген ТМ полной протяженности кодирует предшественник или прополипептид, содержащий следующие домены: аминокислоты 18-1 - сигнальная последовательность; аминокислоты 1-226 - N-концевой гидрофобный участок; аминокислоты 227-462 - богатый цистеином участок; состоящий из 6 тандемных EGF-подобных повторов, соединенных небольшими междоменными пептидами или петлями; аминокислоты 463-497 - O-гликозилированный Ser/Thr-богатый участок; аминокислоты 498-521 - гидрофобный трансмембранный участок и аминокислоты 522-557 - С-концевой цитоплазматический хвост. Богатый цистеином участок может быть далее разделен на 3 домена: аминокислоты 226-344 - EGF123, состоящий из EGF-подобных повторов 1, 2 и 3 (остатки 226-344); аминокислоты 345-349 - междоменная петля между EGF3 и EGF4 и аминокислоты 350-462 - EGF456, состоящий из EGF-подобных доменов 4, 5 и 6 (см., например, C.S. Yost и др., Cell, 34 (3): 1983, с. 759-766; D.Z. Wen и др., Biochemistry, 26 (14), 1987, с. 4350-4357, и W. Wang и др., 2000, см. выше, при этом все публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки).
Термины «аналог», «фрагмент», «производное» и «вариант», когда относятся к слитым белкам по данному изобретению, а также к белкам, обеспечивающим направленный перенос и доменам ТМ, означают аналоги, фрагменты, производные и варианты слитых белков, белков, обеспечивающих направленный перенос, и доменов ТМ, которые фактически сохраняют такую же биологическую функцию или активность, как описанные ниже.
Термин «аналог» включает прополипептид, который содержит внутри себя аминокислотную последовательность слитого белка по данному изобретению. Активный слитый белок по данному изобретению может быть отщеплен от дополнительных аминокислот, которые замыкают молекулу предшественника слитого белка, с помощью природных превращений in vivo или с помощью методик, хорошо известных специалистам, таких как энзиматическое или химическое расщепление. Например, нативный ТМ естественно экспрессируется как полипептид из 575 аминокислот, который затем подвергается процессингу in vivo, высвобождая активный зрелый полипептид из 557 аминокислот.
Термин «фрагмент» означает часть слитого белка, белка, обеспечивающего направленный перенос, или доменов ТМ, которые фактически сохраняют одинаковую функциональную активность, как показано в анализах in vivo, раскрытых в контексте, как описано далее.
Термин «производное» включает все модификации слитого белка, которые фактически сохраняют функции, раскрытые в контексте, и включают дополнительную структуру с сопутствующей функцией, например, слитые белки, модифицированные полиэтиленгликолем (PEG), которые имеют большее время полувыведения, O-гликозилированные слитые белки, модифицированные добавлением сульфата хондроитина, и биотинилированные слитые белки, как описано далее.
Термины «по существу подобная функциональная активность» и «по существу та же самая биологическая функция или активность» означают каждый, что интенсивность биологической активности находится в интервале 30-100% или более от биологической активности, продемонстрированной полипептидом, с которым происходит сравнение, когда биологическая активность каждого полипептида определена с использованием той же методики или того же анализа. Например, слитый белок или домен ТМ, который имеет по существу подобную функциональную активность, что и слитый белок примера 2 (последовательность с идентификационным номером 2 (SEQ ID No:2)), означает, что белок при тестировании в анализе (хромогенном) активации белка С, описанном в примере 5, демонстрирует накопление активированного белка С. Белок, который обеспечивает направленный перенос и имеет по существу подобную функциональную активность, что и антитело к TF примера 1 (SEQ ID No:1), означает, что белок при тестировании в анализе sTF/FVIIa или в анализах активации FX, описанных в примере 5, демонстрирует способность связывать или нейтрализовать TF или комплекс FVIIa/TF.
Термин «подобие» между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных заместителей одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Такие консервативные заместители включают таковые, описанные выше в The Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Dayhoff и Argos (1989) EMBO J. 8, 1987, с. 779-785. Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из следующих групп, представляют консервативные изменения:
-Ala, Pro, Gly, GLN, Asn, Ser, Thr;
-Cys, Ser, Tyr, Thr;
-Val, ILe, Leu, Met, Ala, Phe;
-Lys, Arg, His;
-Phe, Tyr, Trp, His и
-Asp, Glu.
Все другие технические термины, использованные в контексте, имеют такое же значение, которое используют специалисты в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Белок, обеспечивающий направленный перенос
Белок, обеспечивающий направленный перенос, по изобретению означает белок, который обладает способностью специфически связываться с конкретной предварительно выбранной молекулой-мишенью, например TF или комплексом FVIIa/TF, и затем служит для направления слитого белка в клетку или ткань, содержащую предварительно выбранную молекулу-мишень.
В одном варианте воплощения по данному изобретению белок, обеспечивающий направленный перенос, означает антитело, которое может связываться и нейтрализовать TF или комплекс FVIIa/TF. Термин «антитело», как он использован в контексте, включает интактные молекулы иммуноглобулина (Ig), а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связывать эпитоп TF или комплекса FVIIa/TF. Обычно требуется по меньшей мере 6, 8, 10 или 12 смежных аминокислот, чтобы образовать эпитоп. Однако для эпитопов, которые включают не являющиеся смежными аминокислоты, может потребоваться больше аминокислот, например, по крайней мере 15, 25 или 50.
Обычно антитело, которое специфически связывается с TF или комплексом FVIIa/TF, обуславливает детектирующий сигнал по меньшей мере 5-, 10- или 20-кратно более сильный, чем детектирующий сигнал, обусловленный другими белками при использовании в иммунохимическом анализе. Предпочтительно антитела, которые связываются специфически с TF или комплексом FVIIa/TF, не детектируют другие белки в иммунохимических анализах и могут образовывать иммунопреципитат TF или комплекса FVIIa/TF из раствора.
TF или комплекс FVIIa/TF могут быть использованы для иммунизации млекопитающего, такого как мышь, крыса, кролик, морская свинка, обезьяна или человек, чтобы продуцировать поликлональные антитела. Если требуется, TF или комплекс FVIIa/TF могут быть конъюгированы с белком-носителем, таким как бычий сывороточный альбумин, тироглобулин и гемоцианин из Megathura crenulata. В зависимости от вида хозяина могут применяться различные адъюванты, чтобы усилить иммунологический ответ. Такие адъюванты включают, но без ограничения, адъювант Фрейнда, минеральные гели (например, гидроксид алюминия) и поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин из Megathura crenulata и динитро фенол). Среди адъювантов, применяемых у человека, особенно полезными являются BCG (bacilli Calmette-Guerin) и Cornybacteriuparvum.
Моноклональные антитела, которые специфически связываются с TF или комплексом FVIIa/TF, могут быть получены с использованием любой методики, которая обеспечивает продукцию молекул антител стабильными клеточными линиями в культуре. Эти методики включают, но без ограничения, гибридомную технику, технику человеческой В-клеточной гибридомы и технику гибридомы вируса Эпштейна-Барра (EBV) (Kohler и др., Nature 256, 1987, с. 495-497; Kozbor и др., J. Immunol. Methods 81, 1985, с. 31-42; Cote и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, с. 2026-2030; и Cote и др., Mol. Cell Biol. 62, 1984, с. 109-120).
Кроме того, могут быть использованы методики, созданные для продукции «химерных антител», сплайсинг генов мышиного и человеческого антител, чтобы получить молекулу с соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison и др., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, с. 6851-6855; Neuberger и др., Nature 312, 1984, с. 604-608; Takeda и др., Nature 314, 1985, с. 452-454). Моноклональные и другие антитела могут быть также «гуманизированы», чтобы предотвратить у пациента формирование иммунного ответа к антителам, когда оно применяется в терапевтических целях. Такие антитела обладают достаточным сходством с последовательностью человеческого антитела, чтобы непосредственно использоваться в слитом белке, или могут потребовать изменения нескольких ключевых остатков. Различия в последовательностях между антителами грызунов и человеческими последовательностями может быть сведено к минимуму путем замены остатков, которые отличаются от таковых в человеческих последовательностях, с помощью сайт-направленного мутагенеза отдельных остатков или с помощью трансплантации полностью комплементарных детерминирующих участков. Альтернативно гуманизированные антитела могут быть продуцированы с использованием рекомбинантных способов, как описано в патенте GB 2188638В. Антитела, которые связываются специфично с TF или комплексом FVIIa/TF, могут содержать антиген-связывающие сайты, которые или частично, или полностью гуманизированы, как раскрывается в патенте US 5565332.
Альтернативно методики, описанные для продуцирования одноцепочечных антител, могут быть адаптированы, используя способы, известные специалистам, для продуцирования одноцепочечных антител, которые специфично связываются с TF или комплексом FVIIa/TF. Антитела с родственной специфичностью, но отличающегося идиотипического состава, могут быть получены путем перестановки цепи из случайных комбинаторных библиотек Ig (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, с. 11120-11123).
Одноцепочечные антитела могут быть также сконструированы с применением способа амплификации ДНК, такого как полимеразная цепная реакция, используя гибридомную кДНК в качестве матрицы (Thirion и др., Eur. J. Cancer Prev.5, 1996, с. 507-511). Одноцепочечные антитела могут быть моно- или биспецифичными и могут быть бивалентными или тетравалентными. Конструкция тетравалентных биспецифичных одноцепочечных антител сообщена, например, Coloma Morrison Natl. Biotechnol. 15, 1997, с. 159-163. Конструкция бивалентных биспецифичных одноцепочечных антител сообщена Mallendar и Voss J. Biol. Chem. 269, 1994, с. 199-216.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть построена с применением ручного или автоматизированного синтеза нуклеотидов, клонирована в конструкцию экспрессии с использованием стандартных способов рекомбинантной ДНК и введена в клетку, чтобы экспрессировать кодирующую последовательность. Альтернативно одноцепочечные антитела могут быть продуцированы непосредственно с использованием, например, техники отображения нитевидного фага (Verhaar и др., Int. J. Cancer, 61, 1996, с. 497-501; и Nicholls и др., J. Immunol. Meth. 165, 1993, c. 81-91).
Антитела, которые связываются специфично с TF или комплексом FVIIa/TF, могут быть также получены путем индуцирования in vivo продукции в популяции лимфоцитов или путем скрининга библиотек Ig или панелей реагентов с высокой специфичностью связывания, как раскрывается в литературе (Orlandi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3, 1989, с. 833-3837; Winter и др, Nature 349,1991, с. 293-299).
В другом варианте воплощения по данному изобретению белок, обеспечивающий направленный перенос, является частью, обеспечивающей направленный перенос, иного, чем антитело, белка, который может связывать и нейтрализовать TF. Двумя такими примерами являются ингибированный по активному центру фактор FVIIa (FVIIai) и ингибитор метаболизма тканевого фактора (TFPI).
Как FVIIa, так и FVIlai с высоким сродством образуют комплекс с TF (В.В. Sorenson, В.В и L.V. Rao, Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (доп.1), 1998, с. 67-71). Фактор FVIIai является нейтрализующим TF антикоагулянтом, который действует, конкурируя с эндогенным FVIIa за связывание с экспонированным TF. Фактор FVIIai подавляет способность протеолитически активного FVIIa образовывать компетентный комплекс FVIIa-TF и таким способом подавляет инициацию коагуляции. Путем генетического слияния доменов ТМ в FVIIai тромбомодулин мог быть нацелен на богатые TF протромбозные поверхности.
кДНК, кодирующая человеческий FVII, была выделена и секвенирована (H.S. Hagen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (8), 1986, с. 2412-2416, ссылка включена в контекст путем цитирования). Человеческий FVIIa, кодируемый кДНК, может быть получен по стандартным методикам рекомбинантной ДНК, исходя из мРНК, выделенной из печени человека. Фактор FVIIai может быть получен с помощью изменения серина в активном центре по стандартным методикам рекомбинантной ДНК или химической обработкой каталитически активного FVIIa пептидилхлорметилкетоном, который необратимо модифицирует и ингибирует активный центр.
TFPI нацелен на комплекс FVIIa/TF и ингибирует его FXa-зависимым образом (I. Salemink и др., J. Biol. Chem. 274 (40), 1999, с. 28225-28232). TFPI сначала связывается с FXa, и затем комплекс TFPI-FXa связывается с комплексом FVIIa/TF и ингибирует его. При генетическом слиянии доменов ТМ в TFPI тромбомодулин (ТМ) мог быть нацелен на TF-богатые протромбозные поверхности.
кДНК, кодирующая человеческий TFPI, была выделена и секвенирована (Т.С. Wun и др., J. Biol. Chem. 263 (13), 1988, с. 6001-6004, ссылка включена в контекст цитированием). Человеческий TFPI, кодируемый кДНК, может быть получен с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК, исходя из мРНК, выделенной из печени человека.
Белок, обеспечивающий направленный перенос, по данному изобретению (т.е. антитело или другие относящиеся к делу белки) может быть экспрессирован и очищен способами, хорошо известными специалистам. Например, антитела и белки могут быть очищены аффинным способом путем пропускания через колонку, в которой TF находится в связанном состоянии. Связанные антитела или белки могут затем элюироваться из колонки с использованием буфера с высокой концентрацией соли.
В одном предпочтительном варианте воплощения по данному изобретению белком, обеспечивающим направленный перенос, является TF-связывающее антитело scFv, которое подавляет активацию FX с помощью комплекса FVIIa/TF и не конкурирует со связыванием FVIIa. Для того чтобы получить TF-связывающее антитело scFv, библиотека человеческих антител HuPhaBL3 на нитевидном фаге была отобрана с помощью иммобилизованного растворимого TF. Антитела TF-презентирующего фага были сверхэкспрессированы в Е.coli и аффинно очищены с использованием колонки с последовательностью e-tag. Очищенные антитела были далее охарактеризованы, используя BIAcore, анализ sTF-зависимого фактора Vila (анализ sTF/FVIIa), анализ активации FX и анализ протромбинового времени (ПВ). Последовательность TF-связывающего антитела scFv, обозначенного scFv(TF)3e10, показана в примере 1 и соответствует SEQ ID No:1. Выделение, продукция и характеристика TF-связывающего антитела scFv описаны более подробно ниже.
Тромбомодулин
Тромбомодулиновая (ТМ) доменная часть слитого белка действует как кофактор катализируемой тромбином активации белка С, который, в свою очередь, подвергает деградации факторы Va и VIIa, предотвращая тем самым дальнейшее тромбообразование. Домены ТМ включают, например, домен N-концевого гидрофобного участка, домен EGF123, междоменную петлю между EGF3 и EGF4, домен EGF456 и домен O-гликозилированного Ser/Thr-богатого участка. Домен EGF456, в частности, опосредует связывание тромбина и активацию белка С (S. Kurosawa и др. (1988), выше; и М. Zushi и др. (1989), выше). В предпочтительных воплощениях по данному изобретению тромбомодулиновая доменная часть слитого белка включает домен EGF456, один или в комбинации с одним доменом или несколькими другими доменами ТМ. В еще более предпочтительных вариантах воплощения по данному изобретению домен EGF456 содержит точечные мутации, которые делают белок более устойчивым к окислительному повреждению и действию протеаз и/или увеличивают каталитическую эффективность.
Полная протяженность последовательности ДНК, кодирующей человеческий ТМ, способствует получению генов и используется как исходная точка для создания последовательностей ДНК, кодирующих пептиды ТМ и слитые белки, содержащие ТМ и фрагменты/пептиды ТМ.
Ген полной длины ТМ может быть получен несколькими способами. Человеческие геномные библиотеки коммерчески доступны. Олигонуклеотидные зонды, специфичные для этих генов, могут быть синтезированы с использованием опубликованной генной последовательности. Известны способы скрининга геномных библиотек с олигонуклеотидными зондами. Опубликованные генные последовательности ТМ демонстрируют, что внутри кодирующего участка нет интронов. Таким образом, геномный клон обеспечивает необходимый исходный материал, чтобы сконструировать плазмиду экспрессии для ТМ, используя известные способы.
Кодирующий ТМ фрагмент ДНК может быть возвращен в прежнее состояние путем использования сайтов эндонуклеаз рестрикции, которые были идентифицированы в участках, расположенных сбоку или являющихся внутренними по отношению к гену (R.W.Jackman и др. (1987), выше). Альтернативно гены полной длины могут также быть получены из банка кДНК. Например, матричная РНК, полученная из клеток эндотелия, обеспечивает соответствующий исходный материал для получения кДНК. Способы создания банков кДНК хорошо известны (смотри, например, J.F.Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), ссылка включена в контекст путем цитирования).
Слитый белок
Антикоагулирующий слитый белок по данному изобретению включает белок, который обеспечивает направленный перенос и связывается или с TF, или с комплексом FVIIa/TF и функционально связан с доменом EGF456 тромбомодулина (ТМ), одним или в комбинации по меньшей мере с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из домена N-концевого гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4 и O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов. Слитый белок может включать белок, обеспечивающий направленный перенос, связанный с доменами ТМ в любой комбинации.
В одном особенно предпочтительном варианте воплощения слитый белок включает антитело, которое связывает TF, функционально связанный с тромбомодулиновым доменом EGF456 и междоменной петлей между EGF3 и EGF4 (ТМ1456) или их аналогами, фрагментами, производными или вариантами.
Слитый белок по настоящему изобретению включает, но без ограничения, конструкции, в которых С-концевая часть одноцепочечного антитела соединяется с N-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, С-концевая часть антитела IgG соединяется с N-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, С-концевая часть антитела Fab соединяется с N-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, N-концевая часть одноцепочечного антитела соединяется с С-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, N-концевая часть антитела IgG соединяется с С-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, N-концевая часть антитела Fab соединяется с С-концевой частью аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, более чем одно одноцепочечное антитело соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, более чем одно антитело IgG соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, более чем одно антитело Fab соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями аналога, фрагмента, производного или варианта домена ТМ, более чем один аналог, фрагмент, производное или вариант домена ТМ соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями одноцепочечного антитела, более чем один аналог, фрагмент, производное или вариант домена ТМ соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями антитела IgG, более чем один аналог, фрагмент, производное или вариант домена ТМ соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями антитела Fab, один или более чем один аналог, фрагмент, производное или вариант домена ТМ соединяется как с N-концевой, так и с С-концевой частями димерного одноцепочечного антитела.
Слитые белки по настоящему изобретению включают слитые белки примера 2 (SEQ ID No:2) и 3 (SEQ ID No:3), а также те слитые белки, которые имеют несущественные отклонения в последовательности от них. Термин «несущественное отклонение» включает любую последовательность, замещение или делеционный вариант, которые сохраняют в значительной степени по меньшей мере одну биологическую функцию полипептидов по данному изобретению, предпочтительно кофакторную активность для опосредованной тромбином активации белка С. Эти функциональные эквиваленты могут предпочтительно включать слитые белки, которые имеют по меньшей мере примерно 90% идентичность с слитыми белками SEQ ID Nos:2 или 3 и более предпочтительно - по меньшей мере 95% идентичность со слитыми белками SEQ ID Nos:2 или 3 и еще более предпочтительно - по меньшей мере 97% идентичность со слитыми белками SEQ ID Nos:2 или 3, и также включают части таких слитых белков, имеющих в значительной мере такую же биологическую активность. Однако любой слитый белок, имеющий несущественное отклонение в аминокислотной последовательности от слитых белков SEQ ID Nos:2 или 3, который проявляет функциональную эквивалентность, как описано далее в контексте, включен в описание по настоящему изобретению.
В другом варианте воплощения изобретения слитый белок включает антитело, которое связывает TF, функционально связанный с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF3, который требуется для активации ингибитора активируемого тромбином фибринолиза (TAFI).
Аналоги, фрагменты, производные и варианты
Аналог, фрагмент, производное или вариант слитых белков, а также белки, обеспечивающие направленный перенос, и домены ТМ по настоящему изобретению могут быть: (i) одним, в котором один или несколько аминокислотных остатков замещены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замещенный аминокислотный остаток может или не может быть остатком, кодированным с помощью генетического кода; или (ii) одним, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают заместитель; или (iii) одним, в котором зрелый слитый белок соединяется с другим соединением, таким как соединения для увеличения времени полувыведения слитого белка (например, полиэтиленгликоль); или (iv) один, в котором дополнительные аминокислоты соединены со зрелым слитым белком, таким как лидерная или секреторная последовательность, или последовательность, которая используется для очистки зрелого слитого белка; или (v) одним, в котором полипептидная последовательность соединена с более длинным полипептидом, т.е. человеческим альбумином, антителом или белком Fc, для увеличения продолжительности эффекта. Считается, что такие аналоги, фрагменты, производные и варианты доступны специалисту в данной области из сообщений в контексте.
Предпочтительно производные по настоящему изобретению будут содержать консервативные аминокислотные замещения (определенные ниже), сделанные в одном или нескольких прогнозируемых остатках, предпочтительно в остатках заменимых аминокислот. Термин «заменимый» аминокислотный остаток означает остаток, который может меняться в белковой последовательности дикого типа без изменения биологической активности, тогда как «незаменимый» аминокислотный остаток необходим для биологической активности. Термин «консервативное аминокислотное замещение» означает замещение, при котором аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Неконсервативные замещения не проводятся для консервативных аминокислотных остатков или аминокислотных остатков, располагающихся внутри консервативного белкового домена, если неконсервативные замещения не проводятся, чтобы сделать образующийся слитый белок более устойчивым к окислительному повреждению и действию протеаз и/или повысить его каталитическую эффективность. Фрагменты биологически активных частей включают полипептидные фрагменты, подходящие для применения в качестве лекарственного средства, в качестве реагента для исследований и тому подобного. Фрагменты включают пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, подобные аминокислотным последовательностям или происходящие от аминокислотных последовательностей слитого белка по данному изобретению и по меньшей мере обладающие активностью того полипептида, но которые включают меньше аминокислот, чем полипептид полной протяженности, раскрытый в контексте. Обычно биологически активные части включают домен или мотив по меньшей мере с активностью полипептида. Биологически активная часть полипептида может быть пептидом, т.е., например, длиной в 5 или более аминокислот. Такие биологически активные части могут быть получены синтетически или с помощью рекомбинантных методик и могут быть оценены на одну или несколько функциональных активностей полипептида по данному изобретению способами, раскрытыми в контексте и/или хорошо известными специалистам.
Более того, предпочтительные производные по настоящему изобретению включают зрелые слитые белки, которые соединены с другим соединением, таким как соединение для увеличения времени полувыведения полипептида и/или для снижения потенциала иммуногенности полипептида (например, полиэтиленгликоль, PEG). Полиэтиленгликоль может применяться, чтобы придать слитому белку растворимость в воде, габариты, малую скорость почечного клиренса и сниженную иммуногенность. Смотри, например, патент US 6214966. В случае модификации полиэтиленгликолем соединение слитого белка с PEG может быть выполнено любыми способами, известными специалистам в этой области. Например, модификация полиэтиленгликолем может быть осуществлена сначала введением цистеиновой мутации в слитый белок с последующим получением производного с PEG-малеимидом. Цистеин может быть добавлен к С-концу пептидов. Смотри, например, Tsutsumi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (15), 2000, с. 8548-8553. Другая модификация, которая может быть проведена со слитым белком, включает биотинилирование. В некоторых случаях может быть полезным иметь биотинилированный слитый белок, чтобы он мог легко реагировать со стрептавидином. Способы биотинилирования белков хорошо известны специалистам. Кроме того, со слитым белком может быть связан сульфат хондроэтина.
Варианты слитых белков, белков, обеспечивающих направленный перенос, и доменов ТМ по изобретению включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в значительной мере подобную аминокислотной последовательности исходных слитых белков, белков, обеспечивающих направленный перенос, и доменов ТМ. Термин «подобные» означает первую аминокислотную последовательность, которая содержит достаточное или минимальное число идентичных или эквивалентных аминокислотных остатков относительно второй аминокислотной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные последовательности имеют общий структурный домен и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, который идентичен по меньшей мере примерно на 45%, предпочтительно примерно на 75-98%, определяются в контексте как идентичные. Предпочтительно варианты будут подобны аминокислотной последовательности преимущественных слитых белков по данному изобретению. Варианты включают варианты слитых белков, кодированных полинуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом по данному изобретению или комплементарен ему в жестких условиях. Такие варианты, как правило, сохраняют функциональную активность слитых белков по данному изобретению. Библиотеки фрагментов полинуклеотидов могут быть использованы, чтобы получать разнообразную популяцию фрагментов для скрининга и последующей селекции. Например, библиотека фрагментов может быть получена обработкой с нуклеазой полученного ПЦР двухцепочечного фрагмента полинуклеотида в условиях, где одноцепочечный разрыв происходит только примерно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией ДНК, чтобы образовать двухцепочечную ДНК, которая может включать смысловые/антисмысловые пары от различных продуктов с одноцепочечным разрывом, удалением одноцепочечных частей от реформированных дуплексов путем обработки с нуклеазой S1 и лигированием образующейся библиотеки фрагментов в вектор экспрессии. Этим способом можно получить библиотеку экспрессии, которая кодирует N-концевой и внутренний фрагменты слитых белков различной величины по данному изобретению.
Варианты включают слитые белки, а также белки, обеспечивающие направленный перенос, и домен ТМ, которые отличаются по аминокислотной последовательности из-за мутагенеза. Варианты, которые обладают кофакторной активностью для опосредованной тромбином активации белка С, могут быть идентифицированы с помощью скрининговых комбинаторных библиотек мутантов, например отсечение или точечные мутанты слитых белков или доменов ТМ по данному изобретению, и использованием анализа активации белка С, описанного в примере 5. Варианты, которые обладают активностью связывания TF или комплекса FVIIa/TF, могут быть идентифицированы с помощью скрининговых комбинаторных библиотек мутантов, например расщепление или точечные мутанты слитых белков или белков, обеспечивающих направленный перенос, по данному изобретению с использованием анализа sTF/FVIIa или анализы по активации FX примера 5, описанные в примере 5. Кроме того, биоэквивалентные аналоги слитых белков могут также быть образованы путем проведения различных замещений по остаткам или последовательностям в доменной части ТМ слитого белка, которые могут сделать слитый белок более устойчивым к окислительному повреждению или действию протеазы, смотри, например, патент US 5827824, или увеличить каталитическую эффективность слитого белка, смотри, например, М. Adier и др., J. Biol. Chem. 270 (40), 1995, с. 23366-23372 и заявку WO 01/98352, опубликованную 27.12.2001, все полностью включены в контекст путем цитирования.
В одном варианте воплощения изобретения разнообразная библиотека вариантов генерируется путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот и кодируется разнообразной генной библиотекой. Разнообразная библиотека вариантов может быть получена, например, энзиматическим лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в генные последовательности таким образом, что вырожденный набор потенциальных вариантных аминокислотных последовательностей экспрессируется в виде индивидуальных полипептидов, или альтернативно в виде набора слитых белков большей протяженности (например, для развертки фага), содержащих набор их последовательностей. Существует множество способов, которые могут применяться для получения библиотек потенциальных вариантов их вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности может быть осуществлен в автоматическом синтезаторе ДНК, и затем синтетический ген встраивают в соответствующий вектор экспрессии. Применение вырожденного набора генов допускает обеспечение в одной смеси всех последовательностей, кодирующих требуемый набор потенциальных вариантных последовательностей. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны специалистам (смотри, например, Narang, Tetrahedron 39, 1983, с.3; Itakura и др., Annu. Rev.Biochem. 53, 1984а, с.323; Itakura и др.. Science 198, 1984b, с.1056; Ike и др., Nucleic Acid Res. 11, 1983 с.47).
Специалистам известны несколько методик скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных с помощью точечных мутаций или расщепления, и скрининга библиотек кДНК для генных продуктов, имеющих выбранное свойство. Такие методики адаптируются для быстрого скрининга генных библиотек, полученных путем комбинаторного мутагенеза слитых белков, а также белков, обеспечивающих направленный перенос, и доменов ТМ, на кофакторную активность опосредованной тромбином активации белка С или активности связывания TF или комплекса FVIIa/TF. Наиболее широко применяемые методики, которые подлежат анализу с высокой пропускной способностью для скрининга больших генных библиотек, обычно включают клонирование генной библиотеки в реплицируемые векторы экспрессии, трансформацию соответствующих клеток с образующейся библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых детектирование требуемой активности благоприятствует выделению вектора, кодирующего ген, чей продукт был детектирован. Рекуррентный групповой мутагенез (REM), методика, которая повышает частоту функциональных мутантов в библиотеках, может быть применен в комбинации со скрининговыми анализами, чтобы идентифицировать требуемые варианты.
Получение слитых белков
Слитый белок по изобретению получают соединением белка, обеспечивающего направленный перенос, или иначе - связыванием его с доменами ТМ или их аналогами, фрагментами, производными или вариантами любым способом, известным специалистам в этой области. Два компонента могут быть химически связаны вместе с помощью множества хорошо известных химических методик. Например, связь может быть образована с помощью гетеробифункциональных мостиковых линкеров, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP), карбодиимида, глутарового альдегида и тому подобного.
В более предпочтительном варианте воплощения белок, обеспечивающий направленный перенос, по данному изобретению может быть соединен с доменами ТМ рекомбинантными способами, такими как использование методик рекомбинантной ДНК для получения нуклеиновой кислоты, которая кодирует как белок, обеспечивающий направленный перенос, так и полипептид, кодирующий домены ТМ, и экспрессия последовательности ДНК в клетке-хозяине, такой как Е.coli или клетке млекопитающего. ДНК, кодирующая слитый белок, может быть клонирована в кДНК или в геномной форме с помощью любой методики клонирования, известной специалистам в этой области. Смотри, например, J.F. Sambrook и др. (1989), выше.
В случае, когда белок, обеспечивающий направленный перенос, является антителом, если была идентифицирована последовательность ДНК, которая кодирует участок Fv, который при экспрессии проявляет специфическую связывающую активность, слитые белки, включающие тот участок Fv, могут быть получены способами, известными специалисту. Так, например, V.K. Chaudhary и др., Nature 339 (6223), 1989, с. 394-397; J.K. Batra и др., J. Biol. Chem. 265 (25), 1990, с. 15198-15202; J.K. Batra и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (21), 1989, с. 8545-8549; V.K. Chaudhary и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (3) 1990, с. 1066-1070, все публикации, включенные путем цитирования, описывают получение слитых белков на основе различных одноцепочечных антител. Участок Fv может быть соединен непосредственно с доменами ТМ или может быть связан посредством линкерной последовательности. Линкерная последовательность может присутствовать просто для того, чтобы обеспечить пространство между частью, обеспечивающей направленный перенос, и доменами ТМ или содействовать мобильности между этими участками, чтобы дать возможность каждому из них достигнуть своей оптимальной конформации. Последовательность ДНК, включающая соединяющий фрагмент, может также обеспечить последовательности (такие как праймерные или рестрикционные сайты) для содействия клонированию или может сохранять рамку считывания между последовательностью, кодирующей часть, обеспечивающую направленный перенос, и последовательностью, кодирующей домены ТМ. Создание таких связующих пептидов хорошо известно специалистам в данной области.
По настоящему изобретению линкерные последовательности могут применяться для связывания белка, обеспечивающего направленный перенос, с доменами ТМ. В одном предпочтительном варианте воплощения по настоящему изобретению две линкерные последовательности применяются в создании конструкции слитого белка, состоящего из одноцепочечного антитела и тромбомодулинового (ТМ) домена EGF456 и междоменной петли между EGF3 и EGF4 (TMi456). Первая связывает тяжелый и легкий домены одноцепочечного антитела. Первая линкерная последовательность имеет протяженность из 5 аминокислот. Будет очевидным, что могут применяться и другие короткие линкерные последовательности, от 0 до 10 аминокислот. Второй линкер по настоящему изобретению является линкером из 15 аминокислот, который связывает антитело с доменами ТМ. Будет очевидным для специалистов в данной области, что много различных линкерных последовательностей может использоваться и по-прежнему приводить к слитому белку, который сохраняет антикоагулирующую активность и способность к активации белка С. Модификации существующего линкера будут ставить своей целью самое большое усиление активации белка С на содержащих TF фосфолипидных поверхностях.
В предпочтительном подходе одноцепочечное антитело получали, используя фаговую дисплейную библиотеку. На первом этапе конструирования фаговой дисплейной библиотеки гены (VH (из IgM), VK и VL) были с помощью ПЦР клонированы от объединенной мРНК из человеческого костного мозга, лимфатического узла и селезенки, используя набор семейства специфических праймеров. Образовавшиеся библиотеки pCITE-VH (3.8×109 членов), pZ604-VK (1.6×107) и pZ604-VL (3.2×107) представляют перманентное и большое разнообразие генов V. Гены VH были амплифицированы с помощью библиотеки pCITE-VH. Гены VK и VL были амплифицированы с помощью ПЦР от библиотеки pZ604-VK и pZ604-VL с обратной JH и линкерной последовательностью на 5'-конце. Очищенные в геле VH, VK и VL, содержащие продукты ПЦР, были затем подвергнуты совместному сплайсингу, чтобы получить набор генов scFv. Набор генов scFv клонировали в фагмидный вектор pZ603 и продукт лигирования электропорировали в компетентные клетки Е.coli TG1, чтобы получать фаговую дисплейную библиотеку scFV, HuPabL3, с 5,2×109 индивидуальных трансформантов (В.К.Кау и др., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; J.D. Marks и др., J. Mol. Biol. 222 (3), 1991, с. 581-597; M.D. Sheets и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11), 1998, с. 6157-6162).
В предпочтительном варианте воплощения по настоящему изобретению получали одноцепочечное антитело (scFv(TF)3e10), которое имело один связывающий сайт VH/VL для TF. Аминокислотная последовательность scFv(TF)3e10 (SEQ ID No:1) изображена в примере 1.
В предпочтительном варианте воплощения по настоящему изобретению фрагмент ПЦР, содержащий последовательность TMi456 (с мутациями M388L и H381G), фланкированную с помощью сайтов Notl, субклонировали в сайт Notl вектора pZ612/3e10 (бактериальный вектор экспрессии для scFv(TF)3e10, основанный на pCANTAB5 от Pharmacia). В контексте точечные мутации в частях ТМ слитых белков по изобретению обозначаются однобуквенным символом аминокислотного остатка нативного ТМ, сопровождающимся номером положения аминокислотного остатка в зрелом ТМ и однобуквенным символом аминокислотной мутации. Например, M388L указывает на то, что метионин в положении 3888 аминокислоты зрелого ТМ заменен лейцином. Сайт Notl расположен между последовательностью антитела и последовательностью e-tag. Это позволяет получить бактериальную конструкцию экспрессии (pKM101) для слитого белка, состоящую из scFv(TF)3e10 - линкера из 15 аминокислот - TMi456 и последовательность e-tag. Чтобы получить вектор экспрессии для млекопитающего, фрагмент ПЦР сначала получали на матрице pKM101. Этот фрагмент был создан для встраивания в сайты Stul/Msd тромбомодулинового вектора экспрессии pTHR525. Это позволило получить вектор (рКМ113), который имел сигнальную последовательность Solulin, последовательность зрелого слитого белка, последовательность e-tag. Вектор содержит ген устойчивости к ампициллину и селектируемые маркеры гигромицина и дигидрофолатредуктазы (DHFR). Экспрессия запускается промотором MPSV LTR. Сайт-специфический мутагенез осуществляли на данном векторе, чтобы включить мутации R456G и H457Q, которые придают части ТМ устойчивость к протеазе. Образующийся вектор обозначали как рКМ115. Вектор рКМ115 содержал линкер из 15 аминокислот, разделяющий домены VH и VL, и другой линкер из 15 аминокислот, отделяющий домен VL от TMi456. Линкер, разделяющий VH и VL, был уменьшен до 5 аминокислот, чтобы провести образование димера более высокой авидности, обозначенного как рНМ115,5. Слитый белок, кодированный рНМ115,5, scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID No:2), изображен в примере 2. Дополнительный вектор рКМ125 генерировали, используя стандартные методики рекомбинантной ДНК, путем удаления 3 аминокислот (GAP) между линкером из 5 аминокислот, разделяющим домены VH и VL, и удаления e-tag на С-конце слитого белка. Образующийся слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456A (SEQ ID No:3) изображен в примере 3.
Экспрессия и очистка слитых белков
Существует несколько путей, чтобы экспрессировать рекомбинантные слитые белки in vitro, включая Е.coli, бакуловирусы, клетки дрожжей и млекопитающих или другие системы экспрессии. Способы экспрессии клонированных генов в бактериях хорошо известны. Чтобы получить высокий уровень экспрессии клонированного гена в прокариотической системе, необходимо создать векторы экспрессии, которые содержат как минимум сильный промотор, чтобы направлять терминацию транскрипции мРНК. Примерами регуляторных участков, подходящих для этой цели, являются промоторный и операторный участок гена β-глюкозидазы Е.coli, биосинтетический путь триптофана Е.coli или левый промотор фага К. Полезным является включение селектируемых маркеров в векторы ДНК, трансформирующие в Е.coli. Примеры таких маркеров включают гены, определяющие устойчивость к ампициллину, тетрациклину или хлорамфениколу.
Существуют многочисленные клеточные системы, которые могут быть использованы для обора эукариотических клеточных систем, наиболее пригодных для экспрессии слитых белков и их аналогов. Иллюстративные примеры линий клеток млекопитающих включают, но без ограничения, клетки RPMI 7932, VERO и HeLa, линии клеток яичника китайского хомяка (СНО), линии клеток W138, ВНК, COS-7, С 127 или MDCK. Предпочтительной линией клеток млекопитающих является CHL-1. При использовании клеток CHL-1 гигромицин включают в качестве эукариотического селектируемого маркера. Клетки CHL-1 происходят от клеток меланомы RPMI 7032, легко доступной линии человеческих клеток. Линия клеток CHL-1 была заложена на хранение Американской коллекцией тканевых культур (АТСС) в соответствии с будапештским договором и была обозначена #CRL 9446, депонирована 18.06.1987. Клетки, подходящие для применения по данному изобретению, коммерчески доступны от АТСС. Иллюстративные линии клеток включают Spodoptera frugiperda и Bombix mori.
Прокариотическая система Е.coli не способна осуществлять посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование. Кроме того, часто нарушается укладка белков со сложными дисульфидными структурами при экспрессии в Е.coli. Для слитого белка, описанного в контексте, наблюдалось заметное снижение тромбомодулиновой кофакторной активности при экспрессии в Е.coli, хотя обе активности еще присутствовали. В случае прокариотической системы экспрессированный белок или присутствует в цитоплазме клетки в нерастворимой форме, в виде так называемых телец включения, найденных в растворимой фракции после лизиса клетки, или направляется в периплазму при добавлении соответствующей секреторной сигнальной последовательности. Если экспрессированный белок находится в виде телец включения, обычно требуются растворение и последующая повторная укладка телец включения.
Специалистам известно много прокариотических векторов экспрессии, таких как рКК.223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pKK.233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) и pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI, USA), которые коммерчески доступны.
Промоторы, обычно применяемые в рекомбинантных микробных системах экспрессии, включают р-лактамазу (пенициллиназу) и систему лактозного промотора (F.C. Chang и др., Nature 275 (5681), 1978, с. 617-624; D.V. Goeddel и др., Nature 281 (5732), 1979, с. 544-548), промоторную систему триптофана (trp) (D.V. Goeddel и др., Nucl. Acids Res. 8 (18), 1980, с. 4057-4074) и промотор tac (Т. Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Другая подходящая бактериальная система экспрессии использует промотор pL фага К и термоиндуцируемый репрессор clts857 (H.U. Bernard и др., Gene 5 (1), 1979, с. 59-76; С.А. Love и др., Gene 176 (1-2), 1996, с. 49-53). Рекомбинантные слитые белки могут быть также экспрессированы в дрожжах-хозяевах, таких как Saccharomyces cerevisiae. Обычно это дает возможность проводить различные посттрансляционные модификации. Экспрессированный слитый белок может быть секретирован в культуральный супернатант, где остается немного других белков, что облегчает очистку. Дрожжевые векторы для экспрессии слитых белков по данному изобретению сохраняют некоторые необходимые свойства. Элементы вектора обычно получают из дрожжей и бактерий, чтобы сделать возможным воспроизведение плазмиды в обеих системах. Бактериальные элементы включают источник репликации и селектируемый маркер. Дрожжевые элементы включают источник репликационной последовательности (ARS), селектируемый маркер, промотор и терминатор транскрипции.
Соответствующие промоторы в дрожжевых векторах для экспрессии включают промоторы гена TRP1, ADH1 или гена ADHII, ген кислой фосфатазы (РН03 или РН05), ген изоцитохрома или промоторы, включенные в гликолитический путь обмена, такие как промотор енолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GADPH), 3-фосфоглицераткиназы (PGK), гексокиназы, пируваткиназы, триозафосфатизомеразы и фосфоглюкозаизомеразы (R.A. Hitzeman и др., J. Biol. Chem. 255 (24), 1980, 12073-12080; В. Hess и др., J. Adv.Enzyme Reg. 7,1968, с. 149-167; и M.J. Holland и J. P. Holland., Biochemistry, 17 (23), 1978, с. 4900-4907).
Коммерчески доступные дрожжевые векторы включают pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255) и YpGX265GAL4 (ATCC # 67233). Линии клеток млекопитающих, включающие, но без ограничения, COS-7, клетки L, C127, ЗТЗ, клетки яичника китайского хомяка (СНО), HeLa, BHK, CHL-1, NSO и НЕК293, могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных слитых белков по данному изобретению. Рекомбинантные белки, продуцированные в клетках млекопитающих, обычно растворимы, гликозилированы и имеют аутентичные N-концы. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как источник репликации, промотор и энхансер, и нетранслируемые 5'- или 3'-последовательности, такие как сайты связывания рибосом, сайты полиаденилирования, акцепторный сайт и сплайсинг-донор, и последовательности терминации транскрипции. Промоторы, пригодные для использования в векторах экспрессии млекопитающих, обычно являются, например, промоторами вирусов, таких как вирус полиомы, аденовирус, вирус человеческого Т-клеточного лейкоза (HTLV), вирус обезьяны 40 (SV 40) и человеческий цитомегаловирус (CMV).
В зависимости от системы экспрессии и выбранного хозяина гомогенный рекомбинантный слитый белок может быть получен с использованием различных комбинаций общеизвестной хроматографии, применяемой для очистки белка. Это включает иммуноаффинную хроматографию, обращеннофазовую хроматографию, катионообменную хроматографию, анионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрационную хроматографию и ВЭЖХ. Если система экспрессии секретирует слитый белок в ростовую среду, белок может быть очищен непосредственно из среды. Если слитый белок не секретируется, он выделяется из клеточных лизатов. Разрушение клеток может быть осуществлено любым общеизвестным способом, включая чередование замораживания-оттаивания, облучение ультразвуком, механическое разрушение или применение агентов, лизирующих клетки.
В предпочтительном варианте воплощения по данному изобретению конструкции экспрессии млекопитающих были трансфицированы в клетки СНО DXB11. Устойчивые популяции были отобраны с использованием 400 мкг/мл гигромицина В среде HAMS/F12. Уровни экспрессии составили приблизительно 500 мкг/л. Чтобы повысить уровни экспрессии, была отобрана популяция с использованием 100 нМ метотрексата в среде α-МЕМ. Примерный уровень экспрессии данной популяции составил 5 мкг/л.
Эта конструкция содержала последовательность e-tag на С-конце белка. Колонки со сродством к e-tag были приобретены у American/Pharmacia Biotech. Среду клеточной культуры фильтровали через фильтр 0,22 мкм и загружали в колонку на 5 мл с последовательностью e-tag со скоростью 2 мл/мин. Колонку промывали 0,2 М фосфатным буфером с 0,05% NaNs, pH 7,0 и затем элюат собирали в пробирки, содержащие 0,1 объема 1 М трис-буфера, pH 8,2, чтобы нейтрализовать буфер элюции. Альтернативно фильтрованную культуральную среду загружали в колонку с белком А. В данном случае колонку промывали 50 мМ лимонной кислотой, 300 мМ NaCl, pH 6,5 и элюировалй тем же самым буфером при pH 3,0. В обоих случаях очищенные образцы затем загружали в колонку с сефадексом 200, чтобы отделить мономер от димерной формы слитого белка.
Фармацевтические композиции
Изобретение обеспечивает также фармацевтические композиции, которые могут быть введены пациенту для достижения терапевтического эффекта. Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть получены для введения путем комбинирования слитого белка, обладающего требуемой степенью чистоты и фармацевтически эффективным количеством, с физиологически приемлемыми носителями.
Слитые белки по настоящему изобретению могут применяться в фармацевтических композициях для внутривенного введения, или подкожного введения, или подоболочечного введения. Так, описанные выше слитые белки предпочтительно будут комбинироваться с приемлемым стерильным фармацевтическим носителем, таким как 5% декстроза, модифицированный лактатом раствор Рингера, нормальный физиологический раствор, стерильная вода или любой другой приготовленный для продажи физиологический буферный раствор, созданный для внутривенной инфузии. Будет понятно, что выбор раствора-носителя и дозы и способа введения композиции будут меняться в зависимости от субъекта и конкретной клинической ситуации и будут обусловлены стандартными медицинскими процедурами.
В соответствии со способами по настоящему изобретению эти фармацевтические композиции могут быть введены в количествах, эффективных для подавления патологических последствий, ассоциированных с избыточной генерацией тромбина у субъекта.
Введение слитого белка может быть болюсной внутривенной инъекцией, непрерывной внутривенной инфузией или комбинацией обоих путей. Альтернативно или дополнительно слитый белок, смешанный с соответствующими наполнителями, может попасть в систему кровообращения из внутримышечного участка. Систематическую обработку слитым белком можно контролировать определением активированного неполного тромбопластинового времени (ПВ) на серийных образцах крови, взятых у пациента. Время коагуляции, наблюдаемое в этом анализе, является длительным, когда в системе кровообращения достигается достаточный уровень слитого белка.
Рекомбинантные слитые белки и фармацевтические композиции по данному изобретению применимы для парентерального, местного, внутривенного, перорального или локального введения. Фармацевтические композиции могут быть введены в разнообразных стандартных дозированных формах в зависимости от способа введения. Например, стандартные дозированные формы могут быть введены в лекарственной форме, включающей, но без ограничения, таблетки, капсулы, порошки, растворы и эмульсии.
Рекомбинантные слитые белки и фармацевтические композиции по данному изобретению применимы для внутривенного введения. Композиции для введения обычно будут содержать раствор одноцепочечного антитела или слитого белка, включающего одноцепочечное антитело, растворенное в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут применяться разнообразные водные носители, например забуференный физиологический раствор и тому подобное. Эти растворы стерильны и, как правило, свободны от нежелательного материала. Композиции могут стерилизоваться обычными, хорошо известными способами.
Типичная фармацевтическая композиция для внутривенного вливания может быть легко определена специалистом в данной области. Вводимые количества совершенно очевидно являются специфическим белком и зависят от его эффективности и фармакокинетического профиля. Современные способы получения парентерально вводимых композиций будут известны или очевидны специалистам и описаны более подробно в таких публикациях, как Remington's Pharmaceutical Science, 15ое изд., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980).
Композиции, содержащие настоящие слитые белки или коктейль на их основе (т.е. с другими белками), могут вводиться в виде терапевтических курсов лечения. При терапевтическом применении композиции вводят пациенту, страдающему кровотечением в результате нарушения или заболевания, в количестве, достаточном, чтобы лечить или по меньшей мере остановить кровотечение. Количество, достаточное для того, чтобы это осуществить, определено как «терапевтически эффективное количество». Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния здоровья пациента.
Единственное или множественное введение композиций может проводиться в зависимости от дозы и частоты, которые требуются и переносимы пациентом. В любом случае композиция должна обеспечить достаточное количество белков по данному изобретению для эффективного лечения пациента.
Слитые белки по изобретению или их фармацевтически приемлемые композиции вводят в терапевтически эффективном количестве, которое будет меняться в зависимости от множества факторов, включая активность применяемого специфического слитого белка; метаболическую стабильность и длительность действия слитого белка; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; способ действия и время введения, скорость экскреции; комбинацию препаратов; тяжесть конкретного заболевания-состояния и реципиента, подвергающегося терапии. Как правило, ежедневное терапевтически эффективное количество составляет от примерно 0,14 мг до примерно 14,3 мг/кг массы тела/день слитого белка по изобретению или его фармацевтически приемлемой композиции; предпочтительно от примерно 0,7 мг до 10 мг/кг массы тела/день и наиболее предпочтительно от примерно 1,4 мг до примерно 7,2 мг/кг массы тела/день. Например, для введения человеку с массой 70 кг дозовый диапазон был бы от примерно 10 мг до примерно 1,0 г/день слитого белка по изобретению или его фармацевтически приемлемой композиции, предпочтительно от примерно 50 мг до примерно 700 мг/день и наиболее предпочтительно от примерно 100 мг до примерно 500 мг/день.
Генная терапия
Слитый белок по изобретению может быть также использован согласно настоящему изобретению путем экспрессии такого слитого белка in vivo, которую часто относят к «генной терапии». Так, например, клетки могут быть сконструированы с полинуклеотидом (ДНК или РНК), кодирующим слитый белок ех vivo, затем созданные клетки вводят пациенту, который должен быть подвергнут терапии слитым белком. Такие способы хорошо известны специалистам. Например, клетки могут быть сконструированы с помощью методик, известных специалистам, с использованием ретровирусных частиц, содержащих РНК, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению.
Локальная доставка антикоагулирующих слитых белков по настоящему изобретению, использующая генную терапию, может обеспечить терапевтический агент в области-мишени, эндотелиальной клеточной выстилке кровеносных сосудов.
Рассматриваются методологии генной терапии как in vitro, так и in vivo. Известно несколько способов переноса потенциально терапевтических генов, чтобы определять клеточную популяцию. Смотри, например, Mulligan, Science 260, 1993, с. 936-931. Эти способы включают:
(1) прямой перенос гена. Смотри, например, Wolff и др. (1990) Science 247: 1465-1468;
(2) опосредованный липосомой перенос ДНК. Смотри, например, Caplen и др., Nature Med. 3, 1995, с. 39-46; Crystal, Nature Med. 1, 1995, c.15-17; Gao и Huang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 1991, с. 280-285;
(3) опосредованный ретровирусом перенос ДНК. Смотри, например, Кау и др., Science 262, 1993, с. 117-119; Anderson, Science 256, 1992, с. 808-813;
(4) опосредованный ДНК-содержащим вирусом перенос ДНК. Такие ДНК-содержащие вирусы включают аденовирусы (предпочтительно векторы на основе Ad2 или Ad5), вирусы герпеса (предпочтительно векторы на основе вируса простого герпеса) и парвовирусы (предпочтительно векторы на основе «дефектных» или неавтономных парвовирусов, более предпочтительно векторы на основе адено-ассоциированных вирусов, наиболее предпочтительно векторы на основе AAV-2). Смотри, например, Ali и др., Gene Therapy, I, 1994, с. 367-384; патент US 4797368, включенный в контекст путем цитирования, и патент US 5139941, включенный в контекст путем цитирования.
Выбор конкретной векторной системы для переноса гена, представляющего интерес, будет зависеть от множества факторов. Одним важным фактором является клеточная популяция-мишень. Хотя ретровирусные векторы широко изучены и использовались во многих случаях применения генной терапии, эти векторы, как правило, не подходят для заражения неделящихся клеток. Кроме того, ретровирусы обладают потенциалом онкогенности. Однако недавние разработки в области лентивирусных векторов могут обойти некоторые из этих ограничений. Смотри Naldini и др., Science 272, 1996, с. 263-267.
Ретровирусы, на основе которых могут быть получены ретровирусные плазмидные векторы, упомянутые выше, включают, но без ограничения, вирус мышиного лейкоза Молони, вирус некроза селезенки, ретровирусы, такие как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы Харви, вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза гиббонов, вирус иммунодефицита человека, аденовирус, вирус миелопролиферативной саркомы и вирус опухоли молочной железы. В одном варианте воплощения изобретения ретровирусный плазмидный вектор создается на основе вируса мышиного лейкоза Молони.
Аденовирусы обладают тем преимуществом, что они имеют широкий диапазон хозяев, могут заражать покоящиеся или полностью дифференцированные клетки, такие как нейроны или гепатоциты, и, по-видимому, в существенной мере не являются онкогенными. Смотри, например, Ali и др. (1994), выше, стр.367. Аденовирусы, по-видимому, не интегрируют в геном хозяина. Из-за того, что они существуют экстрахромосомально, опасность инсерционного мутагенеза сильно снижена. Ali и др. (1994), выше, стр.373.
Адено-ассоциированные вирусы обладают подобными преимуществами, что и векторы на основе аденовирусов. Однако AAVs обладают свойством сайт-специфичной интеграции в человеческую хромосому 19 (Ali и др., 1994, с.377).
В предпочтительном варианте воплощения изобретения ДНК, кодирующая слитые белки по данному изобретению, применяется в генной терапии нарушений, включая, но без ограничения, тромбоз глубоких вен, коагулопатию потребления, острый коронарный синдром или злокачественную опухоль с признаками коагулопатии.
Согласно данному варианту воплощения генная терапия с ДНК, кодирующей слитые белки по данному изобретению, проводится нуждающемуся в этом пациенту параллельно или незамедлительно после постановки диагноза.
Квалифицированный специалист признает, что любой соответствующий вектор для генной терапии, содержащий ДНК, кодирующую слитый белок по изобретению, или ДНК, кодирующую аналоги, фрагменты, производные или варианты слитого белка по изобретению, может быть применен в соответствии с данным вариантом воплощения. Методики создания такого вектора известны. Смотри, например, W.F. Anderson, Nature 392,1998, с. 25-30; I.M. Verma и N. Somia, Nature 389, 1998, c. 239-242. Введение ДНК-содержащего вектора слитого белка в сайт-мишень может быть выполнено с использованием известных методик.
Вектор для генной терапии включает один или несколько промоторов. Соответствующие промоторы, которые могут использоваться, включают, но без ограничения, ретровирусный длинный концевой повтор (LTR); промотор вируса SV40 и промотор человеческого цитомегаловируса (CMV), описанный Miller и др., Biotechniques 7 (9), 1989, c. 980-990, или любой другой промотор (например, клеточные промоторы, такие как эукариотические клеточные промоторы, включающие, но без ограничения, гистоновый, pol III и β-актиновый промоторы). Другие вирусные промоторы, которые могут использоваться, включают, но без ограничения, аденовирусные промоторы, тимидинкиназные (ТК) промоторы и промоторы парвовируса В 19. Выбор соответствующего промотора из содержащихся в контексте указаний будет очевидным для специалиста в данной области.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по настоящему изобретению, находится под контролем соответствующего промотора. Соответствующие промоторы, которые могут использоваться, включают, но без ограничения, аденовирусные промоторы, такие как аденовирусный основной поздний промотор; или гетерологичные промоторы, такие как промотор цитомегаловируса (CMV); промотор респираторного синтициального вируса (RSV); индуцируемые промоторы, такие как промотор мышиной опухоли молочной железы (ММТ), промотор металлотионеина; промоторы теплового шока; альбуминовый промотор; промотор аполипопротеина Al (ApoAl); промоторы человеческого глобина; промоторы вирусной тимидинкиназы, такие как промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса; ретровирусные LTRs (включая модифицированные ретровирусные LTRs, описанные выше); промотор β-актина и промотор человеческого гормона роста.
Ретровирусный плазмидный вектор используется, чтобы трансдуцировать упакованные клеточных линий с целью образования продуцирующих линий клеток. Примерами упакованных клеток, которые могут быть трансфицированы, включают, но без ограничения, линии клеток РЕ501, РА317, ψ-2, ψ-AM, PA12, Т19-14Х; VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+#-86, GP+envAm12 и DAN, как описано в публикации Miller, Human Gene Therapy, 1990, c. 15-14, которая включена в контекст полностью путем цитирования. Вектор может трансдуцировать упакованные клетки посредством любых способов, известных специалистам. Такие способы включают, но без ограничения, электропорацию, применение липосом и осаждение фосфатом кальция. По одной из альтернативных возможностей ретровирусный плазмидный вектор может быть инкапсулирован в липосому или соединен с липидом и затем введен хозяину. Продуцирующая линия клеток генерирует инфекционные ретровирусного частицы вектора, которые включают нуклеиновые последовательности, кодирующие полипептиды. Такие частицы ретровирусного вектора затем могут использоваться для трансдукции эукариотических клеток или in vitro, или in vivo. Трансдуцированные эукариотические клетки будут экспрессировать нуклеиновые последовательности, кодирующие полипептид. Эукариотические клетки, которые могут быть трансдуцированы, включают, но без ограничения, эмбриональные стволовые клетки, эмбриональные клетки карциномы, а также гемопоэтические стволовые клетки, гепатоциты, фибробласты, миобласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки и бронхиальные эпителиальные клетки.
Другим подходом к генной терапии является «транскариотическая терапия», где клетки пациентов обрабатывают ex vivo для индукции у покоящихся хромосомных генов способности продуцировать представляющий интерес белок после обратного введения пациенту. Транскариотическая терапия предполагает, что реципиент имеет нормальный комплект генов, необходимых для активации. Транскариотическая терапия включает введение промотора или другой экзогенной регуляторной последовательности, способной активировать находящиеся на стадии возникновения гены в хромосомную ДНК клеток пациента ех vivo, культивирование и отбор клеток, продуцирующих активный белок, и затем повторное введение активированных клеток пациенту с намерением, что они там полностью восстанавливаются. Клетки, «активированные геном», затем производят представляющий интерес белок в течение некоторого значительного периода времени, возможно, такой продолжительности, как жизнь пациента. Патенты US 5641670 и 5733761 раскрывают детали этой концепции и тем самым включены во всей полноте путем цитирования.
Наборы
Кроме того, данное изобретение относится к наборам для исследовательских или диагностических целей. Обычно набор включает один или несколько контейнеров, содержащих одноцепочечные антитела по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте воплощения изобретения наборы включают контейнеры, содержащие одноцепочечные антитела в форме, подходящей для получения производного со второй молекулой, например доменом ТМ или его фрагментами. В более предпочтительном варианте воплощения наборы включают контейнеры, содержащие слитые белки с последовательностями SEQ ID No:2 или SEQ ID No:3.
В другом варианте воплощения изобретения наборы могут содержать последовательности ДНК, кодирующие слитые белки. Предпочтительно последовательности ДНК, кодирующие эти слитые белки, обеспечиваются в плазмиде, подходящей для трансфекции в клетку-хозяин и экспрессии в хозяйской клетке. Плазмида может содержать промотор (часто индуцируемый промотор) для регуляции экспрессии ДНК в клетке-хоязяине. Плазмида может также содержать соответствующие сайты рестрикции для содействия вставке в плазмиду другой последовательности ДНК, чтобы продуцировать различные слитые белки. Плазмиды могут также содержать многочисленные другие элементы, чтобы содействовать клонированию и экспрессии кодированных белков. Такие элементы хорошо известны специалистам и включают, например, селектируемые маркеры, кодоны инициации, кодоны терминации и тому подобное.
Терапевтические показания
Заболевания, при которых образование тромба играет важную этиологическую роль, включают инфаркт миокарда, коагулопатию потребления, тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, ишемический удар, септический шок, острый респираторный дистресс-синдром, нестабильную стенокардию и другие артериальные и венозные обтурирующие состояния. Слитые белки по настоящему изобретению полезны при всех этих, а также других заболеваниях, при которых тромбообразование является патологическим. Другие патологические состояния, при которых слитый белок по данному изобретению может быть полезен, включают злокачественную опухоль с коагулопатией и воспаление. Соединения могут также найти применение при пересадках кожи и вен и трансплантации органов. Термин «полезный» означает, что соединения полезны для терапии, или для предупреждения заболевания, или для его прогрессирования в более тяжелое состояние. Соединения по данному изобретению обеспечивают также безопасный и эффективный антикоагулянт, например, у пациентов, получающих биопротезы, такие как сердечные клапаны. Эти соединения могут заменить гепарин и варфарин в лечении, например, легочной эмболии или острого инфаркта миокарда. Слитые белки по данному изобретению могут также найти применение в нанесении покрытия на медицинские приспособления, где коагуляция является предметом озабоченности.
Анализы
Много лабораторных анализов для измерения активности ТМ в слитом белке по изобретению являются доступными. Активность белка С может быть измерена в анализе, описанном Н.Н. Salem и др., 1984 выше, и J.B. Galvin и др., J. Biol. Chem. 262 (5), 1987, с. 2199-2205. Кратко анализ состоит из двух этапов. Первым этапом является инкубация тестируемого слитого белка с тромбином и белком С при определенных условиях. На втором этапе тромбин инактивируют гирудином или антитромбином III и гепарином, и активность вновь активированного белка С определяют с применением хромогенного субстрата, посредством чего хромофор высвобождается с помощью протеолитической активности активированного белка С. Этот анализ проводят с очищенными реагентами.
Альтернативно эффект слитого белка может быть измерен с использованием анализов времени свертывания плазмы, такого как время частично активированного тромбопластина (ЧАТВ), время свертывания тромбина (ВСТ) и/или протромбиновое время (ПВ). Эти анализы проводят различие между разными механизмами подавления коагуляции и включают активацию белка С. Удлинение времени свертывания в любом из этих анализов показывает, что молекула может подавить коагуляцию в плазме.
Приведенные выше анализы применяются для идентификации слитых белков с активностью ТМ, которые способны связывать тромбин как в очищенных системах, так и в окружающей среде плазмы. Дополнительные анализы затем используют, чтобы оценить другие виды активности нативного ТМ, такие как подавление катализируемого тромбином образования фибрина из фибриногена (H.V. Jakubowski и др., J. Biol. Chem. 261 (8), 1986, с. 3876-3882), подавление активации тромбином фактора V (С.Т. Esmon и др., J. Biol. Chem. 257 (14), 1982, 7944-7947), ускоренное подавление тромбина антитромбином III и гепариновым кофактором II (N.L. Esmon и др., J. Biol. Chem. 258 (20), 1983, с. 12238-12242), подавление тромбином фактора XIII (J. Polgar и др., Thromb. Haemost. 58 (1), 1987, с.140), подавление опосредованной тромбином инактивации белка S (Е.А. Thompson и Н.Н. Salem., J. Clin. Inv.78 (1), 1986, с. 13-17) и подавление опосредованной тромбином активации и агрегации тромбоцитов (N.L. Esmon, и др., 1983, см. выше).
Следующие анализы, описанные в деталях ниже в примере 5, использовали для измерения эффективности in vitro слитых белков по изобретению: (1) анализ (хромогенный) активации белка С; (2) анализ активации sTF/FVIIa; (3) анализ активации фактора X; и (4) анализ активации белка С (на богатой TF поверхности).
Подразумевается, что при осуществлении методик по настоящему изобретению, безусловно, следует понимать, что ссылки на конкретные буферы, среды, реагенты, условия культивирования и тому подобное не являются ограничивающими, но должны восприниматься так, будто включают все родственные материалы, которые специалист в данной области признал бы представляющими интерес или ценность в особом контексте, в котором это обсуждение представлено. Например, часто можно заменить одну буферную систему или культуральную среду другой и все же достичь подобных, если не идентичных, результатов. У таких специалистов будет достаточно информации о таких системах и методологиях, чтобы суметь без ненадлежащего экспериментирования сделать такие замены, которые будут оптимально служить своим целям при применении способов и методик, раскрытых в контексте.
Настоящее изобретение теперь будет, кроме того, описываться с помощью следующих не ограничивающих его примеров. При использовании раскрытия примера следует четко помнить, что другие и разные варианты воплощения способов, раскрытых по настоящему изобретению, будут, без сомнения, предлагаться специалистам в имеющей отношение к делу области.
Без дальнейшего уточнения считается, что любой специалист в этой области, используя предшествующее описание, применит настоящее изобретение в его самом полном объеме. В связи с этим следующие предпочтительные специфические варианты воплощения изобретения должны рассматриваться как просто иллюстративные, а не ограничивающие никоим образом оставшееся раскрытие.
В упомянутых и в следующих примерах все температуры не исправлены и даны в градусах Цельсия, все части и проценты являются массовыми, если не указано иначе.
Полные раскрытия заявок, патентов и публикаций, цитированных выше, тем самым включены путем цитирования.
Следующие примеры предусмотрены в качестве руководства, чтобы содействовать применению изобретения на практике.
Пример 1
Конструкция однопепочечного анти-TF антитела scFv(TF)3e10
(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q V N L R E
S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F T D A W M S
W V R Q A P G K E L E W V S S I S G S G G S T Y Y A G S V K
G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D Т A V Y Y
C A R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V S A G
G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A S P G K T V T I S C T
R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T V I Y E D N
H R P S G V P D R F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E
D E A D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A
A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264)
Одноцепочечное анти-TF антитело scFv(TF)3e10 (SEQ ID No:1) состоит из сигнального пептида (-18 до -1), домена VH (1-126), линкера VH-VL (127-131), домена VL (132-246) и последовательности e-tag (247-264).
Пример 2
Конструкция 1 слитого белка scFv(TF)3e10-TMi456
Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID No:2) состоит из сигнального пептида (-18 до -1), домена VH (1-126), линкера VH-VL (127-131), домена VL (132-246), линкера VL-TM(247-264), домена TMi456 (265-382) и последовательности е-tag (383-400). В TMi456 подчеркнуты мутации H381G, M388L, R456G и H457Q.
Пример 3
Конструкция 2 слитого белка scFv(TF)3e10-TMi456A
Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456A (SEQ ID No:3) состоит из сигнального пептида (-18 до -1), домена VH (1-126), линкера VH-VL (127-131), домена VL (132-243), линкера VL-тм (244-261) и домена TMi456 (262-379). В TMi456 подчеркнуты мутации H381G, M388L, R456G и H457Q.
Пример 4
Экспрессия слитого белка в бактериальных клетках/клетках млекопитающих
Экспрессия в бактериальных клетках возможна, но она дает белок, который обладает сильно сниженной кофакторной активностью ТМ. Слитый белок экспрессировали в клетках СНО. Плазмида экспрессии содержала как гигромицин В, так и селектируемые маркеры DHFR. Первоначальная селекция была проведена при 400 мкг/мл гигромицина, чтобы отобрать популяцию. Образующуюся популяцию затем подвергали селекции с 100 нМ метотрексатом. В ходе данной селекции клетки, которые имеют амплифицированные копии участка ДНК, содержащего селектируемый маркер, и ген-мишень, отбирают среди популяции. В результате данной селекции уровни экспрессии были повышенными от приблизительно 0,3 мг/л до примерно 6 мг/л.
Пример 5
Анализы in vitro
1. Анализ (хромогенный) активации белка С
Данный анализ проводили смешиванием 20 мкл каждого из следующих белков в планшете для микротитрования: образец ТМ (неизвестный или стандартный), тромбин (3 нМ) и белок С (1,5 мкМ). Разбавителем в анализе для каждого белка был 20 мМ трис-HCl, 0,1 М NaCl, 2,5 мМ CaCl2, 2,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), рН 7,4. Лунки инкубировали в течение 2 ч при 37°С, после чего активацию белка С прерывали добавлением 20 мкл гирудина (0,16 ед/мкл, 370 нМ) в разбавителе для анализа и инкубировали в течение дополнительных 10 мин.
Количество образовавшегося активированного белка С определяли добавлением 100 мкл 1 мМ субстрата S2266 (в разбавителе для анализа) и продолжали инкубировать планшет при 37°С. Поглощение при 405 нм в каждой лунке считывали каждые 10 сек в течение 30 мин, используя считывающее устройство для планшетов Molecular Devices. Данные поглощения сохраняли, и изменение поглощения в секунду (угловой коэффициент) рассчитывали для каждой лунки. Изменение поглощения в секунду было пропорционально пмолям/мл активированного белка С.
Соотношение определяли эмпирически, используя изменяющиеся концентрации активированного белка С. Образцы, содержащие 100% активированного белка С, генерировали смешиванием белка С при 0-1,5 мкМ с 60 нМ кроличьим ТМ и 30 нМ тромбином, инкубацией в течение 0-4 ч, добавлением гирудина и измерением активности S2266, как описано выше. Условия, при которых активировалось 100% белка С, определяли, как те, при которых активность S2266 (поглощение А405/сек) достигало плато. Единицу активности определяли как 1 пмоль активированного белка С, генерированного в мл/мин с реагентами в условиях, определенных выше. Альтернативно значения активности приведены в сравнении с нативным кроличьим ТМ, растворенным с помощью детергента.
2. Анализ активации sTF/FVIIa
Принцип данного анализа описан ниже. Амидную связь субстрата n-нитроанилида трипептида гидролизовали с помощью комплекса sTF/FVIIa. Выделенный хромофорный продукт n-нитроанилид контролировали при 405 нм и концентрацию продукта, образованного в единицу времени, рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции 9920 М-1 см-1. Значения IC50 (С) определяли путем аппроксимации начальных скоростей в 4-параметрическом уравнении: Y=(A-D)/(1+(х/С)^B)+D
Реагенты и растворы
1. Буфер для анализа: 50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,1% BSA, рН 7,5
2. Человеческий FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): 10x рабочий раствор - приготовить 20 нМ раствор в буфере для анализа перед использованием.
3. Растворимый TF (Berlex): 10х рабочий раствор - приготовить 30 нМ раствор в буфере для анализа перед использованием.
4. Хромогенный субстрат S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): исходный раствор: 10 мМ в Н2О, сохраняемый при 4°С; 2,5х рабочий раствор - приготовить 2,5 мМ раствор в буфере для анализа перед использованием.
5. Антитело: приготовить 2,5х разбавления в буфере для анализа перед использованием.
Условия анализа
Анализы проводили в 96-луночном планшете для титрования при комнатной температуре. Конечные концентрации компонентов были следующими:
STF | 3 нМ |
Антитело | Изменяется от 1000 до 0,625 нМ |
FVIIa | 2 нМ |
S2266 | 1 мМ |
Методика анализа
1. Пипетку на 0,1 мл с 2,5х буфера для анализа (или буферного контроля) в каждую лунку.
2. Прибавить 0,025 мл 10х sTF и инкубировать 10 мин при комнатной температуре при легком встряхивании.
3. Прибавить 0,025 мл 10х FVIIa, инкубировать 10 мин при комнатной температуре при легком встряхивании.
4. Прибавить 0,1 мл 2,5х субстрата S2266, незамедлительно перенести планшет в приспособление для считывания планшетов и измерять ферментную кинетику при 405 нм с интервалом в 10 сек в течение 15 мин.
5. Анализ активации фактора Х
Принцип данного анализа описан ниже. Инкубировали FVIIa с везикулами рекомбинантного человеческого TF, чтобы образовать протеазный комплекс, способный активировать субстрат FX. Данный комплекс образуется в присутствии (или в отсутствие) различных концентраций антитела, затем вводили субстрат FX и давали проходить реакции с образованием продукта - активной протеазы Fxa, которая способна гидролизовать амидную связь n-нитроанилида хромогенного субстрата S2222. Выделенный хромофорный продукт, n-нитроанилид, контролировали при 405 нм и концентрацию продукта, образованного в единицу времени, рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции 9920 М-1 см-1. Величины IC50 (С) определяли путем аппроксимации начальных скоростей в 4-параметрическом уравнении: Y=(А-D)/ (l+ (х/С^В)+D
Реагенты и растворы
1. Буфер для анализа: 50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl, 0,1% BSA, рН7,5
2. Человеческий FVIIa (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4x рабочий раствор - приготовить 100 пМ раствор в буфере для анализа перед использованием.
3. Рекомбинантный человеческий TF (восстановленный в лаборатории заявителя из Innovin, Dade): рабочий раствор - приготовить разведение 1:480 в буфере для анализа перед использованием.
4. Фактор Х (НСХ-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4х рабочий раствор - приготовить 1000 нМ раствор в буфере для анализа перед использованием.
5. Хромогенный субстрат S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): исходный раствор: 6 мМ в Н2О, сохраняемый при 4°С. Рабочий раствор - приготовить 0,78 мМ раствор в 3,57 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (EDTA) (чтобы остановить реакцию), 150 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5 перед использованием.
6. Антитело: приготовить 4х разведения в буфере для анализа перед использованием.
Условия анализа
Анализы проводили в 96-луночном планшете для микротитрования при комнатной температуре. Конечные концентрации компонентов были следующими.
Везикулы rTF | 1/4 от разведения 1:480 |
Антитело | Изменяется от 1000 до 0,625 нМ |
FVIIa | 25 пМ |
FX | 250 нМ |
S2222 | 0,546 мМ |
Методика анализа
1. Пипетку на 0,015 мл с 4х буфера для анализа (или буферного контроля) в каждую лунку.
2. Прибавить 0,015 мл 4х пузырьков TF.
3. Прибавить 0,015 мл 4х FVIIa, инкубировать 10 мин при комнатной температуре при легком встряхивании.
4. Прибавить 0,015 мл 4х FX, инкубировать 5 мин при комнатной температуре при легком встряхивании.
5. Прибавить 0,14 мл субстрата S2222, незамедлительно перенести планшет в приспособление для считывания планшетов и измерять ферментную кинетику при 405 нм с интервалом в 10 сек в течение 15 мин.
4. Анализ активации белка С (на TF-богатой поверхности)
Данный анализ проводили, как и хромогенный анализ активации белка С, приведенный выше, за исключением того, что в данном анализе человеческие TF-содержащие везикулы пептидного хромофора/пептидного субстрата (PC/PS) прибавляли к слитому белку или контрольному ТМ до прибавления тромбина и белка С.
Пример 6
Характеристика антител против TF
Семь разных связывающих TF антител выделяли из фаговой дисплейной библиотеки человеческих одноцепочечных антител. Значения сродства связывающих sTF антител, измеренные с использованием BIAcore, были между 35 и 470 нм. Анализ sTF/VIIa использовали, чтобы определить, блокируют ли антитела образование активного комплекса VIIa/TF. В анализе sTF/VIIa связывание Vila с sTF более чем 20-кратно увеличивает скорость расщепления по сравнению с хромогенным пептидным субстратом S2266. Антитела, которые подавляют связывание FVIIa с TF, блокируют данное ускорение. Среди выделенных семи разных антител только одно из них, scFv(TF)3e10, не вызывало подавления в анализе sTF/VIIa. Данное антитело увеличивало сродство FVIIa к sTF, понижая константу диссоциации kd пятикратно (фиг.1). Значение k.d антитела scFv(TF)3e10 для sTF, измеренное с использованием анализа sTF/FVIIa, составило 65,4 нМ (фиг.2). Микрокалориметрию использовали, чтобы сравнить сродство scFv(TF)3e10 к TF при сопоставлении с комплексом FVIIa/TF. Эти эксперименты показали, что антитело имело 20-кратно более высокое сродство к комплексу TF/FVIIa по сравнению со свободным sTF 9 (33 нМ против 600 нМ, фиг.3). Антитела сравнивали, используя анализ активации FX, который состоял из TF полной протяженности в фосфолипидных везикулах, FVIIa и FX. Количество генерированного FXa определяли, используя хромогенный субстрат S2765. Хотя антитело scFv(TF)3e10 не обладало самым высоким сродством, как измерено с помощью BIAcore, и это повышало сродство FVIIa к sTF, оно было единственным антителом в группе, которое подавляло активацию FX и удлиняло время свертывания в анализе ПВ. Значение IC50 (димерного) антитела scFv(TF)3e10 для ингибирования в анализе активации FX составило 0,44 нМ (фиг.4), и двукратное увеличение ПВ происходило при 417 нМ (фиг.5).
Антитело scFv(TF)3e10 идентифицировали на основании связывания с рекомбинантным человеческим растворимым TF. Гомология последовательностей TF между человеческой и мышиной или человеческой и кроличьей составила 58% и 71% соответственно. Антитело связывается с уникальным эпитопом на человеческом TF, который препятствует активации FX комплексом FVIIa/TF. Физиологически антитело имеет преимущество над антителами, которые конкурируют со связыванием FVII или FVIIa с TF. Значение KD как FVII, так и FVIIa в человеческой плазме составило 10 нМ или между 100- и 1000-кратным значением, более высоким, чем KD. Диссоциация для комплекса с высоким сродством будет медленной (70-700 сек, предполагая значение константы скорости ассоциации kon=108 М-1 сек-1). В противоположность этому, константа Михаэлиса Кm фактора Х для комплекса VIIa/TF была между 0,200 и 4 мкМ, и концентрация FX в человеческой плазме составила 130 нМ (между 0,03- и 0,65-кратным КD). Первичная функция комплекса FVIIa/TF при коагуляции состоит в превращении FX в FXa.
Пример 7
Свойства in vitro слитого белка scFv(TF)3e10-TMi456
Свойства слитого белка по изобретению scFv(TF)3e10-TMi456 оценивали в различных анализах in vitro. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 сохранял способность подавлять активацию FX с помощью комплекса FVIIa/TF (IC50=0,5 нМ, данные не приведены) и действовать в качестве кофактора катализируемой тромбином активации белка С (хромогенный анализ, фиг.6). Не наблюдалось никакого значительного различия в кофакторной активности ТМ между слитым белком и одним TMi456 в отсутствие содержащих TF фосфолипидных пузырьков. В противоположность этому, кофакторная активность ТМ слитого белка, но не TMi456, повышалась более чем 5-кратно в присутствии содержащих TF фосфолипидных везикул (фиг.7). Активность in vitro слитого белка scFv(TF)3e10-TMi456 против индуцируемой TF коагуляции (анализ ПВ, несвойственный путь коагуляции) была в 6 раз выше, чем антитела scFv(TF)3e10, и в 17 раз выше, чем одного TMi456 (фиг.5). В противоположность этому, эффективность слитого белка in vitro против присущих и общих путей коагуляции не была затронута значительно (анализы АРТТ и ТСТ, данные не приведены). Следовательно, доза слитого белка, которая вызывала двукратное увеличение ПВ, оказывала только умеренное действие на АРТТ, тогда как TMi456 в эквивалентной дозе в анализе ПВ вызывал 4-кратное увеличение АРТТ (фиг.8). Профиль in vitro был совместим с таковым, ожидаемым для антикоагулянтов, направленных на TF/FVIIa, которые, как известно, обладают исключительным воздействием на соотношения кровотечения на животных моделях тромбоза. В соответствии с анализами основанной на плазме коагуляции слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 был более мощным в анализе индуцированной TF коагуляции цельной крови (тромбоэластограф, TEG), чем или антитело scFv(TF)3e10, или один TMi456 (фиг.9). Кроме того, слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 давал более предсказуемый дозовый отклик при коагуляции цельной крови, индуцированной TF, чем низкомолекулярный гепарин (LMWH, фиг.10). В итоге приведенные выше данные демонстрируют, что слитые белки по изобретению являются мощными и селективными антикоагулянтами in vitro.
Пример 8
Модель крысиной тромбоэмболии in vivo
TF-часть антитела слитого белка scFv(TF)3e10-TMi456 является специфичной для TF приматов. Модель тромбоэмболии, инициированная с помощью человеческого TF (тромбопластиновый реагент, содержащий человеческий рекомбинантный TF, Ortho), была создана у находящихся в сознании самцов крыс линии Sprague-Dawley (350-400 г, n>7/группу). На этой модели коагулопатии потребления (DIC) фактор ткани через посредство инъекции тромбопластина индуцирует отложение легочного фибрина, нарушение дыхания и смерть. Эквимолярные дозы scFv(TF)3e10-TMi456, или scFv(TF)3e10, или наполнителя вводили с помощью инъекции в хвостовую вену, затем через 15 мин с помощью болюсной инъекции вводили тромбопластин (0,5 мг/кг). В группе, обработанной наполнителем, данная доза TF приводила к 60% летальности (LD60) обычно в течение 5 мин после инъекции тромбопластина.
Крыс оценивали в соответствии со следующей системой показателей в баллах, характеризующих распространенность заболевания-смертность: 0 - без воздействия; 1 - слабое расстройство дыхания (восстановление к норме через 30 мин); 2 - острое расстройство дыхания (агонирующее состояние, восстановление к норме требовало более чем 60 мин); и 3 - гибель. Средняя оценка была выбрана для сравнения эффективности 4 различных обработанных групп. Результаты использования данного анализа in vivo приведены на фиг.11. В этом анализе слитый белок по изобретению был способен подавить гибель и расстройство дыхания.
Предшествующие примеры могут быть повторены с одинаковым успехом с помощью замещающих в родовом отношении или конкретно описанных реагентов и/или рабочих условий по данному изобретению для тех, которые использованы в предшествующих примерах.
Несмотря на то что изобретение иллюстрировано в отношении получения некоторых конструкций слитых белков, очевидно, что могут быть сделаны изменения и модификации по изобретению без отхода от сущности и объема изобретения.
Claims (24)
1. Антикоагулирующий слитый белок, включающий белок, который обеспечивает направленный церенос, взаимодействует с тканевым фактором (TF) или комплексом фактора VIIa/TF, и функционально связан с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF456 и с доменом ТМ, включающим междоменную петлю между EGF3 и EGF4.
2. Слитый белок по п.1, где упомянутый домен EGF456 содержит точечные мутации, которые делают упомянутый слитый белок более устойчивым к окислительному повреждению или протеазной активности или увеличивают каталитическую эффективность упомянутого слитого белка.
3. Слитый белок по п.2, где упомянутый домен EGF456 содержит по меньшей мере одну точечную мутацию, выбранную из группы, состоящей из H381G, M388L, R456G и H457Q.
4. Слитый белок по п.3, где упомянутый домен EGF456 состоит из точечных мутаций H381G, M388L, R456G и H457Q.
5. Слитый белок по п.1, где упомянутый белок, обеспечивающий направленный перенос, означает антитело, которое связывает TF.
6. Слитый белок по п.5, где упомянутое антитело означает моноклональное антитело.
7. Слитый белок по п.6, где, упомянутое моноклональное антитело связывается с комплексом FVIIa/TF с более высоким сродством, чем с одним TF.
8. Слитый белок по п.7, где упомянутое моноклональное антитело означает одноцепочечное антитело, димерное антитело Fab или IgG антитело.
9. Слитый белок по п.8, где упомянутое моноклональное антитело означает одноцепочечное антитело.
10. Слитый белок по п.6, где упомянутое моноклональное антитело нейтрализует TF.
11. Слитый белок по п.1, где упомянутый слитый белок гликозилирован.
12. Слитый белок по п.1, где упомянутый слитый белок модифицирован добавлением полиэтиленгликоля.
13. Слитый белок по п.1, где упомянутый слитый белок биотинилирован для связывания стрептавидина.
14. Слитый белок по п.1, где упомянутый белок, обеспечивающий направленный перенос, означает FVIIai.
15. Слитый белок по п.1, где упомянутый белок, обеспечивающий направленный перенос, означает TFPI.
16. Слитый белок по п.1, где упомянутый слитый белок может быть применен, чтобы образовать нетромбогенное покрытие на поверхности медицинского инструмента, где упомянутый медицинский инструмент входит в контакт с кровью.
17. Фармацевтическая композиция, обладающая антикоагулирующей активностью, которая включает слитый белок по п.1 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый наполнитель.
18. Способ защиты против тромбообразования, включающий введение терапевтически эффективного количества слитого белка по п.1, где упомянутый слитый белок подавляет генерацию тромбина без прямого воздействия на другие параметры коагуляции, такие, как активация и агрегация тромбоцитов.
19. Способ по п.18, где упомянутый способ позволяет защитить от тромбообразования при ишемическом ударе, тромбозных осложнениях после ангиопластики или операционного вмешательства на капиллярных сосудах.
20. Способ предотвращения и лечения тромбоза глубоких вен (DVT), коагулопатии потребления (DIC), острого коронарного синдрома или злокачественной опухоли с проявлением коагулопатии у пациента, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка по п.1.
21. Набор, обладающий антикоагулирующей активностью и включающий слитый белок по п.1.
22. Набор, обладающий антикоагулирующей активностью и включающий последовательности ДНК, кодирующие компоненты слитого белка по п.1.
23. Антикоагулирующий слитый белок, включающий белок, который обеспечивает направленный перенос, и взаимодействует с TF или комплексом FVIIa/TF, где упомянутый белок, обеспечивает направленный перенос, означает одноцепочечное антитело, которое связывает TF, и функционально связан с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF456 и междоменной петлей между EGF3 и EGF4, где упомянутый домен EGF456 включает точечные мутации H381G, M388L, R456G и H457Q.
24. Слитый белок по п.23, где упомянутый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37656602P | 2002-05-01 | 2002-05-01 | |
US60/376,566 | 2002-05-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004135308A RU2004135308A (ru) | 2005-08-10 |
RU2320366C2 true RU2320366C2 (ru) | 2008-03-27 |
Family
ID=29401364
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004135308/15A RU2320366C2 (ru) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов |
RU2004135306/13A RU2345789C2 (ru) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Новые антитела к тканевому фактору в качестве антикоагулянтов |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004135306/13A RU2345789C2 (ru) | 2002-05-01 | 2003-04-30 | Новые антитела к тканевому фактору в качестве антикоагулянтов |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7250168B2 (ru) |
EP (2) | EP1549341B1 (ru) |
JP (2) | JP4460443B2 (ru) |
KR (2) | KR101013697B1 (ru) |
CN (2) | CN100412090C (ru) |
AR (1) | AR039515A1 (ru) |
AT (2) | ATE427121T1 (ru) |
AU (2) | AU2003225255B2 (ru) |
BR (2) | BR0304659A (ru) |
CA (2) | CA2483910A1 (ru) |
CR (1) | CR7584A (ru) |
DE (2) | DE60326970D1 (ru) |
DK (2) | DK1549341T3 (ru) |
EC (2) | ECSP045468A (ru) |
ES (2) | ES2323056T3 (ru) |
HK (1) | HK1080372A1 (ru) |
IL (3) | IL164733A0 (ru) |
MX (2) | MXPA04010851A (ru) |
NO (2) | NO20035849L (ru) |
NZ (2) | NZ536242A (ru) |
PE (1) | PE20040597A1 (ru) |
PL (2) | PL373945A1 (ru) |
PT (2) | PT1503785E (ru) |
RS (2) | RS104504A (ru) |
RU (2) | RU2320366C2 (ru) |
TW (1) | TWI343388B (ru) |
UA (2) | UA81114C2 (ru) |
WO (2) | WO2003092602A2 (ru) |
ZA (2) | ZA200409692B (ru) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1188830T3 (da) * | 1999-06-02 | 2010-04-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10 |
AU7445900A (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel hemopoietin receptor protein, nr12 |
AU9630501A (en) | 2000-09-26 | 2002-04-08 | Univ Duke | Rna aptamers and methods for identifying the same |
JP4460443B2 (ja) * | 2002-05-01 | 2010-05-12 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体 |
US7579000B2 (en) | 2002-05-01 | 2009-08-25 | Bayer Schering Pharma Ag | Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants |
CA2490280A1 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that specifically bind to reg iv |
US7425328B2 (en) | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
US7833978B2 (en) * | 2004-02-20 | 2010-11-16 | Emory University | Thrombomodulin derivatives and conjugates |
CN103045601B (zh) | 2004-04-22 | 2015-04-01 | 雷加多生物科学公司 | 改良的凝血因子调节物 |
CN101189334B (zh) | 2005-06-03 | 2013-11-06 | 持田制药株式会社 | 抗cd14抗体融合蛋白质 |
WO2008039206A2 (en) * | 2005-10-05 | 2008-04-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fusion proteins for inhibition and dissolution of coagulation |
CN101466400B (zh) * | 2006-04-07 | 2014-06-25 | 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 | 共价凝血因子ⅶ-组织因子复合物 |
ES2429407T3 (es) | 2006-06-08 | 2013-11-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agente preventivo o remedio para enfermedades inflamatorias |
US20100152106A1 (en) * | 2006-10-06 | 2010-06-17 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Agent for therapy and/or improvement of disseminated intravascular coagulation |
US9649499B2 (en) | 2007-03-28 | 2017-05-16 | Medtronic ATS Medical, Inc. | Method for inhibiting platelet interaction with biomaterial surfaces |
CA2700293A1 (en) * | 2007-09-20 | 2009-03-26 | Bracco Imaging Spa | Method for the preparation of new oligoclonal antibodies |
MX2010006097A (es) | 2007-12-05 | 2010-08-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para tratar el prurito. |
WO2009086552A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-07-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeting recombinant therapeutics to circulating red blood cells |
UA112050C2 (uk) * | 2008-08-04 | 2016-07-25 | БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі | Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi) |
SG2013061528A (en) * | 2008-08-14 | 2015-03-30 | Merck Sharp & Dohme | Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography |
US20110262466A1 (en) * | 2008-10-16 | 2011-10-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof |
US20120165244A1 (en) * | 2008-10-30 | 2012-06-28 | Hua-Lin Wu | Methods for binding lewis y antigen |
UA109633C2 (uk) | 2008-12-09 | 2015-09-25 | Антитіло людини проти тканинного фактора | |
EP2230251A1 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-22 | Bracco Imaging S.p.A | Antibodies specifically active in the coronary plaque and method for their identification |
EP2470201A4 (en) * | 2009-08-28 | 2013-01-30 | Bayer Healthcare Llc | COFACTORS ENABLING THE THROMBINIC ACTIVATION OF FACTOR VII AND THEIR USES |
GB201007356D0 (en) | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Leverton Licence Holdings Ltd | Conjugated factor VIIa |
US9644197B2 (en) * | 2010-06-04 | 2017-05-09 | Sk Chemicals Co., Ltd. | Fusion protein having factor VII activity |
CN106084053B (zh) | 2010-06-15 | 2020-01-17 | 根马布股份公司 | 针对组织因子的人抗体药物缀合物 |
CA2807749C (en) | 2010-08-05 | 2023-02-28 | Council Of Scientific & Industrial Research | Protein fusion constructs possessing thrombolytic and anticoagulant properties |
RU2445365C1 (ru) * | 2010-11-03 | 2012-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный Центр "Новые Технологии и Материалы" (ООО "ИЦ Новтехмат") | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) |
MA43918A (fr) | 2015-04-14 | 2018-12-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composition pharmaceutique pour la prã‰vention et/ou le traitement de la dermatite atopique contenant comme principe actif un antagoniste de l'il-31 |
WO2016176440A2 (en) * | 2015-04-28 | 2016-11-03 | Saint Louis University | Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as protein c activators |
US11085031B2 (en) | 2016-04-28 | 2021-08-10 | Saint Louis University | Thrombin-thrombomodulin fusion proteins as a powerful anticoagulant |
KR20190083355A (ko) * | 2016-11-16 | 2019-07-11 | 바이엘 헬쓰케어 엘엘씨 | 적혈구 표적화된 인자 viii 및 이를 사용하는 방법 |
BR102017005783A2 (pt) * | 2017-03-21 | 2018-10-02 | Fund Butantan | processo de obtenção de esculptina e seus fragmentos, esculptina recombinante e seus usos |
US20210318338A1 (en) * | 2018-10-04 | 2021-10-14 | Thrombosis And Coagulation Ab | Method for the determination of protein s levels |
TW202128222A (zh) | 2019-11-20 | 2021-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 含有抗體之製劑 |
CN114686444A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 |
CN114686443B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-11-03 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
US5874407A (en) * | 1995-12-04 | 1999-02-23 | Genentech, Inc. | Factor VIIA inhibitors |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4208479A (en) | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
ZA862768B (en) * | 1985-04-17 | 1986-12-30 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US5589173A (en) | 1986-11-04 | 1996-12-31 | Genentech, Inc. | Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction |
US5223427A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
US5437864A (en) * | 1987-03-31 | 1995-08-01 | The Scripps Research Institute | Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor |
US4912207A (en) | 1987-05-06 | 1990-03-27 | Washington University | DNA clone of human thrombomodulin and portions thereof |
DK299087D0 (da) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | Novo Industri As | Proteins and derivatives thereof |
KR920701459A (ko) * | 1989-02-17 | 1992-08-11 | 코돈 | 트롬보모듈린의 가용성 유사체 |
US6063763A (en) | 1989-04-28 | 2000-05-16 | Schering Aktiengesellschaft | Protease-resistant thrombomodulin analogs |
US5256770A (en) * | 1990-04-09 | 1993-10-26 | Schering Ag | Oxidation resistant thrombomodulin analogs |
US5466668A (en) | 1989-04-28 | 1995-11-14 | Schering Aktiengesellschaft | Superior thrombomodulin analogs for pharmaceutical use |
KR930008093B1 (ko) | 1990-08-03 | 1993-08-25 | 아사히가세이고오교 가부시끼가이샤 | 신규 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 하는 의약조성물 |
US5843442A (en) * | 1990-10-22 | 1998-12-01 | Corvas International, Inc. | Blood coagulation protein antagonists and uses therefor |
US5506134A (en) | 1990-10-22 | 1996-04-09 | Corvas International, Inc. | Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex |
JPH0578397A (ja) * | 1991-01-29 | 1993-03-30 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 血栓溶解タンパク質 |
JPH06133780A (ja) * | 1992-10-23 | 1994-05-17 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規なt−PA改変体 |
US5916874A (en) | 1994-04-20 | 1999-06-29 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for treating liver injury |
US5986065A (en) * | 1997-03-10 | 1999-11-16 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
ES2364266T3 (es) * | 1998-04-03 | 2011-08-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticuerpo humanizado hacia el factor tisular humano (tf) y procedimiento para construir el anticuerpo humanizado. |
AU2001250814B2 (en) * | 2000-03-16 | 2007-02-15 | Genentech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency |
US6632791B1 (en) | 2000-06-21 | 2003-10-14 | Schering Aktiengesellschaft | Thrombomodulin analogs for pharmaceutical use |
TWI338009B (en) * | 2001-10-29 | 2011-03-01 | Genentech Inc | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
EP1465998A2 (en) | 2002-01-08 | 2004-10-13 | Bayer HealthCare AG | Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy |
JP4460443B2 (ja) | 2002-05-01 | 2010-05-12 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化された抗体 |
US7579000B2 (en) | 2002-05-01 | 2009-08-25 | Bayer Schering Pharma Ag | Tissue factor targeted antibodies as anticoagulants |
-
2003
- 2003-04-30 JP JP2004501558A patent/JP4460443B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 KR KR1020047017456A patent/KR101013697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 RU RU2004135308/15A patent/RU2320366C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 MX MXPA04010851A patent/MXPA04010851A/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 MX MXPA04010795A patent/MXPA04010795A/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 NZ NZ536242A patent/NZ536242A/en unknown
- 2003-04-30 AT AT03721974T patent/ATE427121T1/de active
- 2003-04-30 WO PCT/US2003/013522 patent/WO2003092602A2/en active Application Filing
- 2003-04-30 PL PL03373945A patent/PL373945A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-04-30 PT PT03721975T patent/PT1503785E/pt unknown
- 2003-04-30 AU AU2003225255A patent/AU2003225255B2/en not_active Ceased
- 2003-04-30 RS YUP-1045/04A patent/RS104504A/sr unknown
- 2003-04-30 US US10/427,805 patent/US7250168B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 BR BR0304659-1A patent/BR0304659A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 DE DE60326970T patent/DE60326970D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 IL IL16473303A patent/IL164733A0/xx unknown
- 2003-04-30 EP EP03721974A patent/EP1549341B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 WO PCT/US2003/013521 patent/WO2003093422A2/en active Application Filing
- 2003-04-30 RS YU102404A patent/RS102404A/sr unknown
- 2003-04-30 EP EP03721975A patent/EP1503785B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 DK DK03721974T patent/DK1549341T3/da active
- 2003-04-30 CN CNB038157020A patent/CN100412090C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 PE PE2003000426A patent/PE20040597A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-04-30 UA UA20041109787A patent/UA81114C2/uk unknown
- 2003-04-30 PL PL373960A patent/PL210582B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 DK DK03721975.5T patent/DK1503785T3/da active
- 2003-04-30 UA UA20041109788A patent/UA85996C2/ru unknown
- 2003-04-30 AR ARP030101529A patent/AR039515A1/es active IP Right Grant
- 2003-04-30 KR KR1020047017458A patent/KR101080587B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 CA CA002483910A patent/CA2483910A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-30 AU AU2003225256A patent/AU2003225256B2/en not_active Ceased
- 2003-04-30 RU RU2004135306/13A patent/RU2345789C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 NZ NZ536243A patent/NZ536243A/en unknown
- 2003-04-30 CN CNB038157039A patent/CN100563709C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 ES ES03721974T patent/ES2323056T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 DE DE60334538T patent/DE60334538D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 PT PT03721974T patent/PT1549341E/pt unknown
- 2003-04-30 BR BR0304660-5A patent/BR0304660A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 ES ES03721975T patent/ES2354419T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 JP JP2004500787A patent/JP4567437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-30 CA CA002483909A patent/CA2483909A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-30 TW TW092110159A patent/TWI343388B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 AT AT03721975T patent/ATE484524T1/de active
- 2003-12-30 NO NO20035849A patent/NO20035849L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-12-30 NO NO20035848A patent/NO20035848L/no not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-10-20 IL IL16473204A patent/IL164732A0/xx unknown
- 2004-10-20 IL IL164733A patent/IL164733A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-11-24 CR CR7584A patent/CR7584A/es not_active Application Discontinuation
- 2004-11-30 ZA ZA200409692A patent/ZA200409692B/xx unknown
- 2004-11-30 EC EC2004005468A patent/ECSP045468A/es unknown
- 2004-11-30 EC EC2004005467A patent/ECSP045467A/es unknown
- 2004-11-30 ZA ZA200409694A patent/ZA200409694B/en unknown
-
2006
- 2006-01-06 HK HK06100300.9A patent/HK1080372A1/zh unknown
-
2007
- 2007-06-21 US US11/766,160 patent/US7622122B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 US US11/766,155 patent/US7622457B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
US5874407A (en) * | 1995-12-04 | 1999-02-23 | Genentech, Inc. | Factor VIIA inhibitors |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2320366C2 (ru) | Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов | |
US7960532B2 (en) | Polynucleotides encoding anticoagulant antibodies | |
US8252287B2 (en) | Blood coagulation factor VIII activation-enhancing antibodies | |
JP2022523007A (ja) | 抗血栓症作用および抗炎症作用を有する、第xi因子に対する新規ヒト化抗体およびその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140501 |