JP2022523007A - 抗血栓症作用および抗炎症作用を有する、第ｘｉ因子に対する新規ヒト化抗体およびその使用 - Google Patents

抗血栓症作用および抗炎症作用を有する、第ｘｉ因子に対する新規ヒト化抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

ＦＸＩおよびＦＸＩａに特異的に結合する新規な結合分子であって、ヒト化抗体、そのフラグメント、変異体、および誘導体を含む新規な結合分子、その組成物、方法、およびキットが記載されている。当該結合分子は、第ＸＩ因子Ａ２ドメインに結合可能であり、免疫複合体を形成することができ、それによって、止血第ＸＩ因子活性または活性化に影響を及ぼすことなく、接触活性化分子複合体を破壊する。本開示の結合分子は、止血を損なうことなく血栓症および炎症を安全に阻害することに有用である。従って、本明細書内に提供される結合分子、組成物、方法、およびキットは、とりわけ、血栓症および炎症関連の疾患および状態を処置することを目的とする。さらに，本開示の結合分子をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、および当該ポリヌクレオチドを産生するための宿主細胞が提供される。

Description

発明の詳細な説明
〔関連出願〕
本出願は２０１９年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７９４，９８７号からの優先権の利益を主張し、当該米国仮特許出願の開示内容は、その全体が本明細書内に参照として援用される。
〔配列表〕
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これによって全体が本明細書内に参照として援用される。２０２０年１月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＡＲＢ００２ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名づけられ、サイズは１８，３３７バイトである。
〔政府支援〕
本開示に記載される発明は、少なくとも部分的に、米国政府補助金番号Ｒ４４ＡＩ０８８９３７、Ｒ４４ＨＬ１２８０１６、Ｒ４３ＮＳ０７７６００、および、Ｒ４４ＨＬ１０６９１９として、米国保健社会福祉省（ＨＨＳ）、米国国立衛生研究所によって支援された。米国政府は、本開示から生じる発明について一定の権利を有する。
〔技術分野〕
本開示は、一般に抗体に関する。本開示は、より具体的には、第ＸＩ因子に結合することができるヒト化モノクローナル抗体およびその使用方法に関し、止血を損なわない抗血栓剤および抗炎症剤としての使用方法を含んでいる。
〔背景〕
静脈血栓症および動脈血栓症の両方を含む血栓塞栓性疾患は、全世界の先進国における重度の慢性罹患率および死亡率の主要原因である。これらの病気は、血管内でのフィブリン、血小板、その他の血液細胞の蓄積に起因する異常な凝血塊（血栓）の形成によって引き起こされ、しばしば、血管閉塞、組織虚血、そして場合によっては、血栓からの凝塊の断片の脱落および移動による塞栓形成を生じる。
正常な状況下では、血液凝固は、血小板の活性化とフィブリンの形成とを誘導することによって、血管損傷部位からの失血を防ぐ重要なメカニズムである止血をもたらす。メカニズムレベルでは、止血は２つの同時プロセスによって進行する。一次止血の間、管腔外環境と接触する血液は、必須な止血タンパク質、組織因子（ＴＦ）によって活性化され、凝固酵素、トロンビンの即時生成を引き起こす。次に、トロンビンは、フィブリノーゲン（ＦＩ）、ＦＸＩＩＩ、ＦＶなどの他の凝固因子（Ｆ）を活性化する。さらに、血小板は、損傷部位に付着し、主にトロンビンによって活性化され、そして最終的に、互いに結合することによって凝集して、血小板血栓を形成する。血小板血栓の形成は、凝固タンパク質ＦＸＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩＩ（プロトロンビン）およびＦＩを含む一連の連続した血小板活性化および酵素反応の結果として生じる二次止血の間に増強され、そして安定化され、最終的に血管壁の裂け目を封止し、放血および死を防止する、より安定な止血栓をもたらす。
Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ．１９６４ Ｍａｙ ２；２０２：４９８－９）が血液凝固の処置のためのカスケードウォーターフォールモデルを導入した１９６４年以来、インビボでの血液凝固のメカニズムおよび機能を取り巻く知見が増大した。この数十年の間に、２つの異なる経路（いわゆる外因系経路（extrinsic pathway）と内因系経路（intrinsic pathway）と呼ばれ、凝固を開始させ、最終的にトロンビン生成とフィブリン沈着とをもたらす共通の経路に収束する経路）の説は、部分的に修正され、厳密に調べられてきた。
関連する医療分野で多くの人々によって一般に受け入れられている１つのモデルにおいては、循環血漿プロテアーゼ活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）が補因子ＴＦと接触し、それによって補因子ＴＦと複合体を形成する際に、当該止血プロセス中のトロンビン生成の開始が起こる。このＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体は、チモーゲンＦＩＸおよびＦＸをそれらの活性（ａ）型であるＦＩＸａおよびＦＸａに変換する。次に、ＦＩＸａは、補因子ＦＶＩＩＩａの存在下でさらなるＦＸを活性化することができ、次いで、ＦＶＩＩＩａおよびＦＸａは、それぞれ、補因子ＦＶａの存在下で、プロトロンビン（ＦＩＩ）を活性化してトロンビン（ＦＩＩａ）を形成することができる。凝固における重要なプレイヤーであるトロンビンは、次に、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒すること、および、血小板上のプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）１および４を切断することができ、血小板の活性化を引き起こす、フィブリンと組み合わされた活性化血小板は止血栓形成に必須であり、それゆえに、正常な止血の基本的なプレイヤーである。
ＦＸＩは、インビトロおよびインビボで、トロンビン生成の接触相および増幅相を橋渡しする際に支持する役割を果たす血漿セリンプロテアーゼ チモーゲンであることが十分に確認されている（Ｄａｖｉｅ ＥＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１ Ｏｃｔ ２９；３０（４３）：１０３６３－７０，Ｇａｉｌａｎｉ Ｄ ａｎｄ Ｂｒｏｚｅ ＧＪ Ｊｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１ Ａｕｇ ２３；２５３（５０２２）：９０９－１２；Ｋｒａｖｔｓｏｖ ＤＶ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｊｕｌ ９；１１４（２）：４５２－８．）。生理学的止血および病理学的プロトロンビン生成の両方は、ＦＸＩの活性化およびＦＸＩａの活性を含む。
しかし、遺伝性のヒトまたは他の哺乳類のＦＸＩ欠損症が、通常、特発性出血を引き起こさないことを実証するデータは、ＦＸＩが止血トロンビン生成に必須の寄与因子ではないことを示唆している。ＦＸＩ欠損症、血友病Ｃは、その出血の重篤度はＦＸＩの血漿レベルまたは活性とはあまり相関しないが、ある種の外科的処置および外傷など特定の止血困難に伴う出血リスクの増加と関連している。一方、ヒトにおける重度のＦＸＩ欠損症は、虚血性脳卒中および深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を含む血栓性疾患からのある種の保護作用を有することが報告されている（Ｓａｌｏｍｏｎ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１１ Ｆｅｂ；１０５（２）：２６９－７３，Ｓａｌｏｍｏｎ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ａｐｒ １５；１１１（８）：４１１３－７）。そして、高レベルのＦＸＩは、血栓性事象と関連しており、ＤＶＴ、心筋梗塞（ＭＩ）、および脳卒中に対して、より高いリスクを与えることが報告されている（Ｍｅｉｊｅｒｓ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０００ Ｍａｒ ９；３４２（１０）：６９６－７０１，Ｂｅｒｌｉｎｅｒ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ １５；１０７（１－２）：５５－６０，Ｙａｎｇ ＤＴ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｓｅｐ；１２６（３）：４１１－５）。従って、ＦＸＩの薬理学的標的化は、従来の抗凝血よりも安全であり得ることが提案されており、霊長類の研究は、この仮説の証拠を提供した（Ｇｒｕｂｅｒ Ａ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ，Ｂｌｏｏｄ．２００３ Ａｕｇ １；１０２（３）：９５３－９５５，Ｔｕｃｋｅｒ ＥＩ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．）。２００９ Ｊａｎ ２２；１１３（４）：９３６－９４４）。
総合すると、理論的考察および以前の研究は、ＦＸＩは止血の維持においては補助的な役割を有するが、血栓症の病因に対する重要な寄与因子であり、それにより、ＦＸＩは安全な抗血栓療法の有望な標的となることを示唆している。十分な非臨床的および臨床的エビデンスが、現在この考えを支持している。現在使用可能な抗血栓薬は、血栓の構成単位（フィブリンと血小板）を標的とするものであるか、血栓形成プロセスと止血栓形成プロセスとの両方に関与する分子（凝固因子）および細胞（血小板）を阻害するものであるか、のいずれかである。抗血小板薬、フィブリン溶解促進薬および抗凝固薬は、何十年もの間、血栓塞栓症の治療および予防のための主力であり、臨床診療における最も一般的な処方薬の１つである。しかし、これらの薬剤の大部分は、有効用量で投与される場合、血栓症および止血の両方を完全に阻止し得るがゆえに、用量制限抗止血毒性を有する。その結果、現在の抗血栓薬は、抗血栓作用と重度で致死的な出血の可能性とのバランスをとるために、慎重な計画で、十分に有効な用量よりも低い用量で、医療従事者によって投与される。
これまでのところ、治療可能性を示す抗ＦＸＩ抗体の数少ない例の１つは、Ｔｕｃｋｅｒらによって公表されたマウス抗体１Ａ６（ａｘｉｍａｂとも呼ばれる）である（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ．Ｅｒｉｋ Ｉ．Ｔｕｃｋｅｒ，Ｕｌｌａ Ｍ．Ｍａｒｚｅｃ，Ｔａｒａ Ｃ．Ｗｈｉｔｅ，Ｓａｗａｎ Ｈｕｒｓｔ，Ｓａｎｄｒａ Ｒｕｇｏｎｙｉ，Ｏｗｅｎ Ｊ．Ｔ．ＭｃＣａｒｔｙ，Ｄａｖｉｄ Ｇａｉｌａｎｉ，Ａｎｄｒａｓ Ｇｒｕｂｅｒ，ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｊａｎ ２２；１１３（４）：９３６－９４４）。抗体１Ａ６は、米国特許第９，１２５，８９５号にも開示されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。しかし、抗体１Ａ６は、マウス抗体であるため、ヒト治療、特に抗血栓療法など、慢性的適用には不適当である。同様に、治療可能性を示す抗ＦＸＩ抗体の別の例は、Ｃｈｅｎｇらによって公表されたマウス抗体１４Ｅ１１（ｘｉｓｏｍａｂとも呼ばれる）である（Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｃｈｅｎｇ Ｑ１，Ｔｕｃｋｅｒ ＥＩ，Ｐｉｎｅ ＭＳ，Ｓｉｓｌｅｒ Ｉ，Ｍａｔａｆｏｎｏｖ Ａ，Ｓｕｎ ＭＦ，Ｗｈｉｔｅ－Ａｄａｍｓ ＴＣ，Ｓｍｉｔｈ ＳＡ，Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ，ＭｃＣａｒｔｙ ＯＪ，Ｒｅｎｎｅ Ｔ，Ｇｒｕｂｅｒ Ａ，Ｇａｉｌａｎｉ ＤＢｌｏｏｄ．２０１０ Ｎｏｖ １１；１１６（１９）：３９８１－３９８９；Ｌｕｏ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ８０（１）：９１０９；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｌｏｏｄ．１１９（２０）：４７６２－８）。抗体１４Ｅ１１はまた、米国特許第９，６３７，５５０号，第８，９４０，８８３号，および第８，３８８，９５９号（「１４Ｅ１１特許」）に開示されている。
マウス抗体を許容可能な治療用抗体に変換する１つの方法は、ヒト化である。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｓ．およびＪｏｎｅｓ Ｔ．の文献（２００１．Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｉｎ：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｄｕｂｅｌ Ｓ．（Ｅｄｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐｐ．５６７－５９０．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ），Ｈｗａｎｇ，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｂｕｓｓ，Ｔａｎ，ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ（２００５） Ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ＣＤＲ ｈｏｍｏｌｏｇｙｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（１）：３５－４２）およびそれらに引用されている参考文献に記載されているような標準的な技術が、当業者に利用可能である。ヒト化抗体の固有の免疫原性の可能性をさらに低減するために、さらなる配列最適化および生殖細胞系列化が必要である。
これらの標準的な方法をマウス１４Ｅ１１抗体のヒト化および最適化に適用して得られる組換えヒト化抗体（以下、ＡＢ０２３と称する）は、生化学的アッセイにおいてマウス前駆体と同等の結合活性を示した。配列改変の導入により、マウス１４Ｅ１１抗体のヒト化変異体（例えばＡＢ０２３抗体）が産生され、それらマウス１４Ｅ１１抗体のヒト化変異体は、インビボで、同等の生化学的プロファイルおよび抗血栓作用の両方を示す。
心血管疾患および静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）は、依然として主要な死因である。一次予防、急性期治療、および、二次予防戦略（抗凝固療法や抗血小板療法など）が有効であるが、これらは一般的に出血の危険性を増大させる。従って、本開示は、止血を損なうことのない、抗血栓療法および抗炎症療法の処置のための、安全かつ有効な薬剤に対する緊急の医学的ニーズを満たすものである。
〔発明の概要〕
本開示に記載される本発明は、止血を損なうことなく血栓症を阻害するための結合分子、組成物、方法、およびキットを提供することによって、既存の欠点および従来技術を克服する。本開示の組成物は、組換え体、ヒト化抗ＦＸＩアップル２ドメイン結合分子、その結合フラグメント、その変異体、その誘導体、細胞株、および、結合分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。本開示はさらに、治療的有効量の結合分子、結合フラグメント、変異体、またはその誘導体を薬学的に許容可能なキャリア中に含む薬学的組成物、およびその使用方法を含む。本開示の方法は、例えば、トロンビンによるＦＸＩ活性化またはＦＸＩａの凝血促進機能を阻害することなしに、第ＸＩＩａ因子媒介ＦＸＩ活性化を妨げることによる抗血栓活性および抗炎症活性を介して血栓症を阻害する、血栓症を予防する、あるいは炎症を治療することを目的として、本開示の組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含み得る。結合分子、結合フラグメント、変異体、またはその誘導体を作製するための方法も提供される。
好ましい態様において、本開示は、以下を含む結合分子を提供する：
配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１；
配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２；
配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３；
配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１；
配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２；および、
配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３。
結合分子は、配列番号８に示されるＶＨ領域、および／または、配列番号９に示されるＶＬ領域を含み得る。
結合分子は、配列番号１０に示される軽鎖、または配列番号１２によってコードされる軽鎖、および／または、配列番号１１に示される重鎖、または配列番号１３によってコードされる重鎖を含み得る。
本開示の結合分子は、ヒトもしくは非ヒト霊長類ＦＸＩ、またはヒトもしくは非ヒト霊長類ＦＸＩａを含む、哺乳類ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａに結合することができる。
特に、結合分子は、配列番号７のアミノ酸９１－１７５を含むＦＸＩのＡ２ドメインに対応するアミノ酸配列に結合し、治療的免疫複合体を形成することができる。ここで、ヒトＦＸＩのアミノ酸の番号付けは、－１８位から－１位のメチオニンから始まり、次いで１位のグルタミンから始まる、シグナル配列を含む。当該結合分子は、抗体、抗原結合性フラグメント、変異体、またはその誘導体であり得ることが意図され、特に、ヒト化モノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、変異体、またはその誘導体（例えば、ＩｇＧ抗体）であり得る。
さらなる態様では、本開示は、本明細書内に規定される結合分子をコードするポリヌクレオチド、およびベクター（例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター）を提供する。本開示はまた、当該ベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
さらなる態様では、本明細書に記載される結合分子の生産のためのプロセスが提供され、このプロセスは、当該結合分子の発現を可能にする条件下で、本明細書に規定される宿主細胞を培養する工程、および任意に、生産された結合分子を培養物から回収する工程を含む。
さらに、本開示は、本明細書で規定される、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主細胞、ならびに任意で１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、１つ以上の追加の活性物質、例えば、抗血栓剤および／または抗凝固剤を含んでもよく、または、追加の活性物質との併用療法の一部として投与されてもよい。
本開示によれば、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または薬学的組成物は、対象における接触活性化、血液凝固、血小板凝集、および／または血栓症を阻害する方法に使用することができる。従って、それらは、障害（例えば、心血管障害、感染性障害、または炎症性障害、好ましくは血栓性障害または血栓塞栓性障害、および／または血栓性合併症または血栓塞栓性合併症）の治療および／または予防に有用である。
さらに、血液サンプル、血液保存剤、血漿製品、生物学的サンプル、または医薬添加物中の抗凝固剤としての結合分子の使用、あるいは、医療デバイス上の被覆のための結合分子の使用が、本明細書内に提供される。
さらに、本開示は、本明細書に記載の結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または薬学的組成物を備えているキットに関する。
〔図面の簡単な説明〕
添付の図面は、本開示を図示するために、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する。これらの図面は、本明細書と共に、本開示の原理を説明する。当該図面は、好ましい実施例および代替の実施例を示し、本開示は、図示され、説明された実施例のみに限定するものとして解釈されるべきではない。さらなる特徴および利点は、以降の記載、詳細には、下記にて参照される図面によって図示されるような、本開示の様々な態様、実施形態、および本開示の構成から明らかになるだろう。
図１は、マウス血漿（白丸）およびヒト血漿（黒丸）における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する、１４Ｅ１１（１０－５－１００μＭ）の濃度依存的効果を示すグラフである。
図２Ａ－Ｆは、１４Ｅ１１の結合特性を明示するブロットおよびグラフである。図２Ａは、ヒト（Ｈ）およびマウス（Ｍ）組換えＦＸＩのクーマシーブルー染色１０％－ポリアクリルアミドゲルを示す；図２ＢおよびＣは、検出のためにビオチン化－１４Ｅ１１を使用した、マウス（Ｂ）およびヒト（Ｃ）正常（Ｎ）およびＦＸＩ欠損（ＸＩ－／－）血漿の非還元１０％ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットを示す。パネルＢ内のｒＸＩは、組換えマウスＦＸＩ対照を示す；図２Ｄは、固定化マウスＦＸＩ（白丸）、ヒトＦＸＩ（黒丸）またはヒトＦＸＩａ（白四角）へのビオチン化１４Ｅ１１の結合を示す；図２Ｅは、ヒトＦＸＩ（ｈＸＩ）、ヒトプレカリクレイン（ＰＫ）、および、Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４ドメインがＰＫ由来の対応するドメインで置換されているヒトＦＸＩの非還元１０％ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットを示す。ＦＸＩ二量体の位置は「Ｄ」で、単量体ＰＫについては「Ｍ」で、右に示される（Ａ４はＦＸＩ二量体形成を媒介するので、ＰＫ Ａ４ドメインを有するＦＸＩは単量体であることに留意されたい）；図２Ｆは、ヒトＦＸＩ（ｈＸＩ）および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）に結合した個々のヒトＦＸＩアップルドメインの、非還元１０％ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロット（左パネル）を示す。図２Ｆの右のパネルは、組換えアップルドメイン－ｔ－ＰＡキメラを示す染色ゲルである（Ａ４キメラが二量体を形成することに注意されたい）。パネルＡ－ＣおよびＥについては、ｋＤａで表した分子量スタンダードの位置は図の左にあり、パネルＦについては、右にある。
図３Ａ－Ｂは、インビトロａＰＴＴに対する、１４Ｅ１１（黒丸）およびヒト化バージョンであるＡＢ０２３（白丸）の効果を示すグラフである。図３Ａは、プールされたヒト血漿における１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示し、図３Ｂは、プールされたヒヒの血漿における１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示す。１４Ｅ１１およびＡＢ０２３はいずれも、ヒトおよびヒヒの血漿中のａＰＴＴを同様に延長させる。
図４Ａ－Ｆは、ＡＢ０２３の結合特性を明示するブロットおよびグラフである。図４Ａは、ヒトＦＸＩ（ｈＸＩ）、ヒトプレカリクレイン（ＰＫ）、および、Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４ドメインがＰＫ由来の対応するドメインで置換されているヒトＦＸＩの非還元１０％ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットを示し、ビオチン化ＡＢ０２３が検出のために使用された；図４Ｂは、組換えｔ－ＰＡに連結された個々のヒトＦＸＩアップルドメイン（Ａ１－Ａ４）の非還元１０％ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットを示し、ＡＢ０２３は、ヒトＦＸＩのＡ２ドメインを認識する；図４Ｃは、ヒトＦＸＩ（黒丸）、ヒトＦＸＩａ（白四角）およびマウスＦＸＩ（黒三角）へのＡＢ０２３の結合を示す；図４Ｄは、ＡＢ０２３がＦＸＩのＦＸＩＩａ活性化を濃度依存的に阻害することを示す；図４Ｅは、ＡＢ０２３がトロンビンによるＦＸＩの活性化を妨げないことを示す；図４Ｆは、ＡＢ０２３がヒト（黒丸）、ヒヒ（白四角）、カニクイザル（白丸）およびラット（白菱形）由来の血漿中でａＰＴＴを濃度依存的に延長することを示す。＊ＦＸＩ／ＰＫＡ４キメラタンパク質（Ａ４＊）は、ＰＫ Ａ４ドメインにおいてＣｙｓ３２６をアラニンで置換することによって作製された二量体分子である。
図５は、インビトロａＰＴＴに対するＡＢ０２３－ＦＸＩ複合体形成の効果を示す。これらの実験は、ＦＸＩ欠乏血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ，Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃１１００，Ｌｏｔ＃６５３８）を用いて連続的な順序で行った。ＦＸＩ欠損症血漿中のベースラインａＰＴＴは、１１８．５ｓ（丸）であると決定された。組換えヒトＦＸＩ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，カタログ番号ＨＦＸＩ１１１１）をＦＸＩ欠損症血漿に最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、ａＰＴＴを測定した。ＦＸＩ欠乏血漿へのＦＸＩの添加は、ａＰＴＴを３２．３ｓ（四角）に短縮した。続いて、ＡＢ０２３をＦＸＩ欠乏血漿＋１０μｇ／ｍＬ ＦＸＩ混合物に１００μｇ／ｍＬの最終抗体濃度で添加し、ａＰＴＴは６６．６秒まで延長された（三角）。第２の実験では、ＡＢ０２３をＦＸＩ欠損症血漿に１００μｇ／ｍＬの最終抗体濃度で添加し、ａＰＴＴを測定した。ＦＸＩ欠乏血漿へのＡＢ０２３の添加は、ａＰＴＴをベースラインから変化させなかった（１１７．７ｓ、逆三角）。この混合物への組換えヒトＦＸＩ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）の添加は、以前の実験で見られたものと同様に、ａＰＴＴを５９．１ｓ（菱形）に短縮した。これらのデータは、ＡＢ０２３の抗凝固作用が、ＦＸＩとＡＢ０２３との複合体が生成された場合にのみ起こることを実証している。
図６は、実験的動脈血栓症のマウスモデルにおける１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス［１４Ｅ１１（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置したもしくは処置しなかったマウス、または、ＡＢ０２３（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置したもしくは処置しなかったマウス］、あるいは、ＦＸＩ－／－マウスが、ＦｅＣｌ３頸動脈血栓症モデルの試験に供された。２．５％－１０％の濃度のＦｅＣｌ３を頸動脈に適用し、閉塞するまでの時間を測定した。棒線の高さは、ＦｅＣｌ３を適用して３０分後の、開存動脈を有するマウスのパーセントを示す。野生型マウスへの１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３の静脈内注射（丸印を有する棒線）は、処置されていない野生型マウス（点を有する棒線）と比較して、３．５％、５．０％および７．５％のＦｅＣｌ３によって誘導される頸動脈閉塞からマウスを保護した。これらの結果は、ＦＸＩ－／－マウス（白無印棒線）、および１４Ｅ１１で処置したマウス（格子模様の棒線）（ｎ＝１０／群）の結果と同等である。
図７は、４匹のヒヒにおけるＡＢ０２３血漿濃度とａＰＴＴとの関係を示す。各グラフは、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３を静脈内投与された単一ヒヒにおけるＡＢ０２３血漿濃度（左ｙ軸、黒丸）およびａＰＴＴ（右ｙ軸、白丸）の時間経過を表す。各ヒヒにおいて、ａＰＴＴは、血漿中ＡＢ０２３濃度が検出可能なレベル（１０００ｎｇ／ｍＬ）を下回るまで延長された。これには、ヒヒ血漿中の遊離ＡＢ０２３を検出するために、部分的にバリデートされたＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ａＰＴＴは、ベースラインに対する倍変化として示す。
図８Ａ－Ｄは、インビボのヒヒ血栓症モデル（移植＋拡張チャンバー）におけるＡＢ０２３の効果を示す。ＡＢ０２３は、霊長類血栓症モデルにおいて、多血小板血栓の成長を低下させる。コラーゲン被覆された（直径４ｍｍ、長さ２ｃｍ）血管移植片（図８Ａ）上、および、静脈拡張チャンバー（直径９ｍｍ、長さ２ｃｍ）（図８Ｃ）上の血小板（図８Ａおよび８Ｃに示される）沈着に対する、ＡＢ０２３（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ）の効果。図８Ｂおよび８Ｄは、対照処置（斜線の棒線）中およびＡＢ０２３処置（白無印棒線）後の、コラーゲン移植内（図８Ｂ）、静脈拡張チャンバー内（図８Ｄ）のフィブリン沈着を示す。値は、平均±ＳＥＭ、対照群（１４Ｅ１１を用いて行った同じ実験からの履歴対照を含む）４匹中ｎ＝７試験／群の、ＡＢ０２３処置の２匹の動物中ｎ＝２試験である。値は平均±ＳＥＭである。
図９Ａ－Ｆは、インビボヒヒ血栓症モデル（コラーゲン被覆された移植）における多血小板血栓の成長に対するＡＢ０２３の効果を示す。図９Ａ－９Ｃは、コラーゲン被覆（直径４ｍｍ、長さ２ｃｍ）血管移植片（図９Ａ）およびコラーゲン被覆移植片の下流１０ｃｍ（「尾部」）（図９Ｂ）への血小板（直径４ｍｍ、長さ２ｃｍ）沈着に対するＡＢ０２３（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ）の効果を示す（図９Ｂ）；図９Ｃは、両移植片＋尾部の組み合わせにおける血小板沈着を示す；図９Ｄ－Ｆは、コラーゲン移植片（図９Ｄ）、尾部（図９Ｅ）および移植片＋尾部の組み合わせ（図９Ｆ）の、対照処置（斜線の棒線）中およびＡＢ０２３処置後におけるフィブリン沈着を示す。値は、平均±ＳＥＭ、対照群（１４Ｅ１１を用いて行った同じ実験からの履歴対照を含む）４匹の動物中ｎ＝７試験／群の、ＡＢ０２３処置の２匹の動物中ｎ＝２試験である。値は、平均±ＳＥＭである。値は、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４試験／群４匹。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 対照。各動物は、対照実験に供され、続いてＡＢ０２３実験に供された。
図１０Ａ－Ｄは、ＡＢ０２３の活性とマウス抗体１４Ｅ１１の活性との比較を示す。図１０Ａ－Ｂは、１４Ｅ１１（点模様の棒線）およびＡＢ０２３（斜線の棒線）抗体の濃度の関数として、硫酸デキストラン（図１０Ａ）およびＤＮＡ（図１０Ｂ）の存在下でのＦＸＩ自己活性化に対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示す。ヒト化抗体ＡＢ０２３は、インビトロで、精製ヒトＦＸＩのＤＮＡ誘導自己活性化を濃度依存的に阻害する；図１０Ｃは、対照（黒丸）と比較した、ＦＸＩのＦＸＩＩａ活性化の阻害に対する１４Ｅ１１（白丸）およびＡＢ０２３（黒四角）の効果を示す；図１０Ｄは、インビトロでの、ＦＸＩａによるＦＸＩＩ活性化に対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示す。グラフは、ＦＸＩＩａの活性化が抗体濃度の関数として示されることを示す。精製ヒトＦＸＩＩおよびＦＸＩａの混合物を、様々な濃度の１４Ｅ１１（点模様の棒線）またはＡＢ０２３（斜線の棒線）と共にインキュベートし、ＦＸＩＩａアミド分解活性を測定した。ＡＢ０２３は、インビトロで精製ヒトＦＸＩａによる精製ヒトＦＸＩＩの活性化を濃度依存的に阻害するが、１４Ｅ１１は、阻害しない。
〔詳細な説明〕
詳細は、本開示の代表的な実施形態を参照されたい。開示される抗体、フラグメント、変異体、またはその誘導体は、列挙された実施形態に関連して記載されるが、それらは本開示をそれらの実施形態に限定することを意図しないことは当然理解されよう。反対に、開示される抗体、フラグメント、変異体、またはその誘導体は、特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲内に含まれ得る全ての代替物、変異体、および等価物を包含することが意図される。当業者は、本明細書に記載されたものと類似または同等の多くの方法および材料を認識し、それらは本開示内で使用され得、本開示の実施の範囲内である。本開示は、決して記載された方法および材料に限定されない。
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、記載および開示の目的のために、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本開示に関連して使用され得る刊行物に記載される、コンストラクトおよび方法論がそうである。本明細書全体を通して議論される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために提供される。本明細書内のいかなるものも、承認として解釈されるべきではない。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語「ａ」または「ａｎ」はそれが言及する実在物の１つまたはそれ以上を指し、従って、例えば、互換的に使用され得る「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」を意味すると理解される。
本開示の実施は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用し、これらの従来の技術は、従来技術の範囲内である。このような技術は、例えば、以下の文献中で十分に述べられていることが見つかるだろう；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １およびＩＩ；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ） Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕら編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．。１５４および１５５；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｓ．，（１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法、デバイス、および材料いずれもが、実施あるいは開示された抗体、フラグメント、変異体、またはその誘導体の試験に使用され得るが、好ましい方法、デバイスおよび材料は、以下に記載される。
血液凝固第ＸＩ因子（別名、ＦＸＩ）の阻害（－生理学的止血に限定された効果を有するが、病理学的な血栓形成の開発における役割が与えられている－）は、改善されたベネフィット－リスク比を達成するための新しい抗血栓剤の開発において有望な新規アプローチである。本開示は、特に、新規な結合分子ＡＢ０２３を提供する。ＡＢ０２３は、ＦＸＩに特異的に結合することができ、免疫複合体ＦＸＩ－ＡＢ０２３を形成し、それによって、ＦＸＩＩ、ＦＸＩ、プレカリクレイン（ＰＫ）、および高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を含む、正常に機能する接触活性化複合体の適切な分子集合を阻害する。その結果、ＦＸＩ－ＡＢ０２３、ＦＸＩＩ、ＰＫおよびＨＭＷＫ間の分子相互作用は制限され、それゆえに、ＦＸＩａによるＦＸＩ－ＡＢ０２３の活性型ＦＸＩａ－ＡＢ０２３への変換、ＦＸＩａ－ＡＢ０２３によるＦＸＩＩの活性型ＦＸＩＩａへの変換もまた制限される。結合分子ＡＢ０２３は、ＦＸＩに対する新規な抗凝固組換えモノクローナル抗体である。さらに、結合分子はまた、ＦＸＩａに結合することが示されている。従って、本明細書内に提供される結合分子は、血圧調節および炎症に関与するカリクレインおよびブラジキニン生成を含む、病理学的トロンビン生成および血栓症に関与するプレイヤーの相互活性化を阻害する（Ｗｅｉｄｍａｎｎ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８６４（１１ Ｐｔ Ｂ）：２１１８－２１２７，Ｂｊｏｒｋｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１１２（５）：８６８－７５；Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０１９ ３：６５８－６６９によって概説される）。具体的には、１４Ｅ１１と同等である高い結合親和性でＦＸＩに有利に結合する、マウス１４Ｅ１１モノクローナル抗体のヒト化バージョンが提供される。さらに、結合分子とＦＸＩとの間の免疫複合体形成は、それらは、低濃度の結合分子で形成する複合体の存在下での活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長によって示されるように、インビトロでの血液凝固を効果的に減少させる。従って、本開示の結合分子は、接触系の活性化が、病原的役割を果たす障害、特に、炎症性および血栓性または血栓塞栓性の疾患、および／または、血栓性または血栓塞栓性の合併症において、効果的な治療および／または予防のための有望な新薬である。さらに、本開示の結合分子は、止血を著しく損なうことなく有効であり、それによって出血のリスクを最小限にすると考えられる。
本開示の抗体を用いて、免疫原性リスクを減少させ、循環ＦＸＩ（circulating FXI）と免疫複合体を形成した後、インビボにおける血栓発生を減少させる治療分子が産生された。インビボにおける抗体と遊離ＦＸＩ抗原との間のこの免疫複合体の形成は、血栓増殖を効果的に阻害するが、止血を損なうことはない。実際には、ヒト化１４Ｅ１１抗体、ＡＢ０２３、およびＦＸＩ間の免疫複合体の形成は、トロンビンによるＦＸＩ－ＡＢ０２３免疫複合体の止血フィードバック活性化を妨害しない。さらに、本開示のＦＸＩａ－ＡＢ０２３免疫複合体は、ＦＸＩａによるＦＩＸおよび他の凝固因子の活性化を介して、止血トロンビン生成に寄与する酵素活性を保持する。それにより、抗体、結合フラグメント、変異体、またはその誘導体による抗血栓療法は、ＦＸＩの酵素活性または止血活性化を直接阻害するよりも止血的に安全であり、それゆえに、臨床適用の範囲およびこの種の抗血栓療法が適用できるシナリオの範囲を広げる。循環している免疫複合体が存在しない場合、抗体単独では抗凝固活性も抗血栓活性も有さない点に注意することが重要である。さらに、循環中に、遊離の、利用可能な、および活性化可能なＦＸＩが存在しない場合、抗体単独では抗凝固活性または抗血栓活性または他の活性を有さない。従って、循環ＦＸＩ－ＡＢ０２３免疫複合体が存在しない場合、本開示の抗体は、抗凝固活性を欠いていてもよく、ＦＸＩ欠損被験者において抗血栓活性を有さなくてもよい。
〔結合分子〕
本開示の結合分子は、凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）に対する新規な抗凝固組換えモノクローナル抗体である。これは、米国特許第８，３８８，９５９号、第８，９４０，８８３号、および第９，６３７，５５０号（表題：Ａｎｔｉ－ＦＸＩ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ．）に開示されているマウスモノクローナル抗体１４Ｅ１１の相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植を用いたヒト化によって得られた。驚くべきことに、本開示の結合分子は、１４Ｅ１１ ＣＤＲと比較して、ＣＤＲ領域に多数のアミノ酸置換を含まず、さらに、有利な特性を示す。マウスモノクローナル抗体１４Ｅ１１、および、ヒト化抗体ＡＢ０２３の特性を決定し、それらの抗凝固特性をインビトロおよびインビボの両方で評価して、性能の比較可能性を示した。本開示の結合分子は、１４Ｅ１１と同等である結合親和性でＦＸＩに結合することができる。そして、免疫複合体中のＦＸＩはＦＸＩＩａによってＦＸＩａに効率的に変換されないが、トロンビンによってＦＸＩａに効率的に変換される（図４）。興味深いことに、ＡＢ０２３は、この活性化の阻害について、１４Ｅ１１よりも強力であるように見える（図１０Ｃ）。１４Ｅ１１とは対照的に、ＦＸＩａ－ＡＢ０２３複合体は、ＦＸＩＩをその活性型であるＦＸＩＩａに変換することに対して低減された触媒活性を有する（図１０Ｄ）。ＦＸＩ－ＡＢ０２３がトロンビンによってＦＸＩａ－ＡＢ０２３に変換される場合、ＦＩＸ（データは示さず）、ならびに他の高分子基質および低分子基質に対する酵素活性を保持する。結果として、ＦＸＩ－ＡＢ０２３の止血トロンビンを介する活性化が循環ＦＸＩの止血活性を保つ間、接触活性化を介する事象はダウンレギュレートされる。
本開示の結合分子は、ヒト化モノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、変異体、またはその誘導体であり、好ましくは、ＦＸＩを標的とするモノクローナル治療用抗体であるＡＢ０２３である。それは、ＩｇＧ４であってもよく、抗体アーム交換を防ぐためにＳ２４１Ｐヒンジ修飾を有していてもよい。軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、ＬＣのコードＤＮＡ配列を配列番号１２に示す。重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、ＨＣのコードＤＮＡ配列を配列番号１３に示す。ＡＢ０２３は、ＣＤＲ移植によって生成され、カッパ（κ）軽鎖およびＩｇＧ４アイソタイプ重鎖を含む。マウスモノクローナル前駆体抗体である１４Ｅ１１からの可変配列（ＶＨおよびＶＬ）を、ヒトＩｇＧ４（Ｋａｂａｔ付番システムを使用したＳＰ２４１ヒンジ修飾）重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子にクローニングした。４つの鎖は、共有結合（ジスルフィド）および非共有結合の組み合わせによって一緒に保持される。１６個のシステイン残基が存在し、従って、１分子あたり［１６／２］の潜在的ジスルフィド結合が存在する。重鎖サブユニットは、重鎖上に位置する潜在的なＮ－結合グリコシル化のための１つのコンセンサス配列（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）を含む。
１４Ｅ１１で見られた抗血栓作用は、ヒト化後も維持され、ＡＢ０２３は、静脈型および動脈型血栓症を予防した。本開示は、第１の態様において、第ＸＩ因子に特異的に結合することができる結合分子に関し、結合分子は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１；配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２；配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３；配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１；配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２；および、配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３を含む。結合分子は、Ｓ２４１Ｐ修飾をさらに含んでもよい。
ヒト化プロセスの間、１４Ｅ１１のＣＤＲ領域を決定し、ＶＨおよびＶＬの両方の可変領域をモデリングプログラムにプラグインして、フレームワーク中のどのアミノ酸残基が抗体の結合特性に有用であったかを同定した。次いで、ＣＤＲ領域を、１４Ｅ１１フレームワークとの最高度の相同性を有するヒトフレームワーク上に移植した。必要であれば、結合に有用であると同定された特定のマウスフレームワークへの復帰突然変異を行った。このプロセスから、３ＶＨおよび３ＶＬを生成した。いくつかの実施形態において、抗体ＡＢ０２３は、ＶＨ３（配列番号８）およびＶＬ３（配列番号９）の組み合わせである。
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン酸（ＧＩｕまたはＥ）；セリン（ＧＩｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；およびバリン（ＶａＩまたはＶ）からなる群より選択されるアミノ酸のような、当技術分野で認識されている規定を有するアミノ酸を指し、修飾された、合成された、あるいは希少アミノ酸であっても、所望に応じて使用することができる。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＶａＩ）；負に荷電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、ＧＩｕ）；正に荷電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧＩｎ、ＧＩｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を有するものとして分類することができる。
〔置換の数と分布〕
アミノ酸置換は、一般に、任意の様式でＣＤＲのいたるところに分布され得る。すなわち、１つのＣＤＲは、例えば、１つまたはそれ以上の転換（exchanges）を含み得、第２のＣＤＲは、１つ以上の置換（substitutions）を含み得る。あるいは、２つのＣＤＲが１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得るか、または、６つ全てのＣＤＲがアミノ酸置換を含み得る。例えば、ＣＤＲ当たり１つまたは２つの置換、および好ましくは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３における１つまたはそれ以上の置換、または重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む結合分子である。その重鎖は、非ヒト化分子のＣＤＲを（機能性を破壊することなく可能な限り最大限に）保持する。一般に、アミノ酸置換は、１４Ｅ１１ ＣＤＲアミノ酸と比較した累積アミノ酸置換の数が、ＦＸＩに結合する結合分子の能力を無効にしない限り、実質的に任意の様式で分布され得る。
〔置換の種類〕
一般に、本開示の結合分子の有利な特性を無効にしない限り、１４Ｅ１１と比較したＣＤＲにおけるアミノ酸置換の任意の組み合わせが考えられる。アミノ酸の交換は、保存的であり得る（すなわち、１つのクラスまたはグループのアミノ酸を、上記に列挙したのと同じクラスまたはグループからの別のアミノ酸と交換する）。あるいは、アミノ酸の交換は、非保存的であり得る（すなわち、１つのクラス／グループからのアミノ酸を別のクラス／グループからの別のアミノ酸と交換する）。
好ましい置換は、本明細書に記載されるように、ａＰＴＴの延長をもたらす本開示の結合分子を産出する。
本開示による結合分子は、任意に組み合わせて、１つまたはそれ以上の上記のＣＤＲを含み得る。好ましい置換は、本明細書に記載されるように、ａＰＴＴの約１．５倍、２倍、またはそれ以上の延長をもたらす、本開示の結合分子を産出する。
本開示の好ましい結合分子は、モノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、変異体、またはその誘導体であり得、以下のＣＤＲを含む：配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１；配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２；配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３；配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１；配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２；および、配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３。好ましい結合分子は、Ｓ２４１Ｐヒンジ修飾をさらに、および任意に含むことができる。
さらに、本発明の結合分子は、配列番号８に示される軽鎖の可変領域（ＶＨ またはＶＨ領域）、および／または、配列番号９に示される重鎖の可変領域（ＶＬ またはＶＬ領域）を含むことが考えられる。しかしながら、ＶＬおよびＶＨ領域の他の組み合わせも考えられる。従って、好ましい実施形態は、本明細書内に開示され、そして配列番号１、２、３、４、５、６、８および９に示される配列を有する、ヒト化モノクローナル抗体ＡＢ０２３である。
〔第ＸＩ因子〕
本明細書に記載されるように、本開示の結合分子は、好ましくは選択された高分子基質認識反応に関与するＦＸＩホモ二量体上の２つの同一のエキソサイトに結合することができる。ヒト「第ＸＩ因子」は、「血漿トロンボプラスチン前駆体」、「ＰＴＡ」、「ローゼンタール因子」、「凝固第ＸＩ因子」、「ＦＸＩ」、「Ｆ１１」、または「ＦＸＩ」とも称され、約１６０キロダルトン（ｋＤ）の結合分子量を有する二本鎖糖タンパク質ホモ二量体として血液中を循環する。ホモ二量体を形成する２つの単量体は、それぞれ約８０，０００ダルトンの分子量を有する同一のジスルフィド結合ポリペプチドである。各ＦＸＩ単量体は、４つの「アップルドメイン」（Ｎ末端からＡ１－Ａ４、単量体の重鎖）およびＣ末端触媒ドメイン（単量体の軽鎖）を有する。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、４つのアップルドメインが、他のタンパク質に対するＦＸＩ結合部位を含むと、当分野の一部の専門家によって考えられている。例えば、トロンビンに対するＡ１、高分子量キニノーゲン（ＨＫ、ＨＭＷＫ）に対するＡ２、ＦＩＸ、糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）、およびヘパリンに対するＡ３、ならびに二量体形成およびおそらくＦＸＩＩａに対するＡ４である。ＦＸＩは、ＦＸＩＩａ、トロンビン、ＦＸＩａ、およびおそらく他のプロテアーゼセリンプロテアーゼによって、活性型である凝固ＦＸＩａに変換され得る。セリンプロテアーゼＦＸＩａは、ＦＸＩＩ、ＦＸ、ＦＶ、ＴＦＰＩ、ＦＩＸ、およびおそらく他のものを含む多くの高分子基質を切断することができる。最もよく説明されている反応の１つは、ＦＩＸのＦＩＸａへの変換に感受性であり、通常の臨床検査室において血漿または血液中で容易に測定することができる、一般的なａＰＴＴアッセイである。ＦＸＩａは、続いて、凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）を活性化することができ、次いで、第Ｘ因子（ＦＸａ）は、凝固ＦＩＩ（プロトロンビン）のトロンビンへの活性化を媒介し得る、凝固因子ＩＸ（ＩＸａ）を活性化する。次いで、トロンビンは、さらなるＦＸＩ分子を活性化し得、それにより、正のフィードバック反応を通して酵素プロセスを増幅する。そして、それはより多くのトロンビンの生成をもたらし、また、ａＰＴＴアッセイにおいて、負に帯電した表面およびリン脂質との反応の開始から通常４０秒未満で、再石灰化クエン酸塩化血液または血漿の間接的な凝固をもたらす。
用語「第ＸＩ因子」は、「Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ Ｎｏ．Ｐ０３９５１，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １９４ ｏｆ １４ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５（配列番号７）」を有するヒト凝固第ＸＩ因子（Ｆ１１、ＦＸＩ）を言う。本明細書の他の箇所に記載されているように、本開示の結合分子は、配列番号７のアミノ酸９１－１７５に対応するアミノ酸配列内のドメインに結合すると考えられている。ヒトＦＸＩのアミノ酸の番号付けは、－１８から－１位のメチオニンで始まり、次いで１位のグルタミンで始まるシグナル配列を含む。
用語「位置」は、本開示に従って使用される場合、本明細書に記載されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または、本明細書に記載される核酸配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。用語「対応する」は、位置が、先行するヌクレオチド／アミノ酸の数によって決定されるだけでなく、むしろ、配列の周囲の部分の前後関係において考えられるべきであることも含む。その結果、本開示において、与えられたアミノ酸またはヌクレオチドの位置は、アミノ酸または、ヌクレオチドの欠失または付加によって変化し得る。従って、位置が本開示に従って「対応する位置」と称される場合、ヌクレオチド／アミノ酸は、特定された数字に関しては異なり得るが、類似の隣接するヌクレオチド／アミノ酸を依然として有し得ることが理解される。与えられた配列中のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が「親」アミノ酸（またはポリヌクレオチド配列）（例えば、配列番号７に示されるヒトＦＸＩのアミノ酸配列）のアミノ酸配列（またはポリヌクレオチド配列）の特定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、当技術分野で周知の手段および方法（例えば、手動で、または本明細書に例示されるようなコンピュータプログラムを用いた配列アラインメント）を使用することができる。
用語「エピトープ」は、一般に、抗原上の部位、すなわち、結合ドメインが認識し、「抗原構造」または「抗原決定基」とも呼ばれる（ポリ）ペプチド上の部位を言う。用語「結合ドメイン」は、抗原結合部位を言う。換言すれば、与えられた抗原または抗原群上の標的エピトープまたは抗原群（例えば、異なる種の同一抗原）と結合／相互作用する結合分子のドメインを特徴づける。標的抗原は、単一のエピトープを含むことができ、好ましくは少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、コンホメーション、およびタイプに応じて、任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的抗原上の「エピトープ」は、標的（ポリ）ペプチドであってもよいが、標的抗原上の「エピトープ」は、例えば、非ポリペプチド要素であってもよく、または非ポリペプチド要素を含んでもよい（例えば、エピトープは炭水化物側鎖を含んでいてもよい）ことに留意されたい。
用語「エピトープ」は、一般に、線形エピトープおよび立体配座エピトープを包含する。線形エピトープは、アミノ酸一次配列に含まれる連続エピトープであり、例えば、少なくとも２アミノ酸以上またはそれ以上を含み得る。立体配座エピトープは、標的抗原、好ましくは標的（ポリ）ペプチドの折り畳みによって並列配置された非連続アミノ酸によって形成される。
本開示の結合分子は、エピトープが第ＸＩ因子（配列番号７）の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の連続または非連続アミノ酸の配列を含む、第ＸＩ因子の重鎖上に位置する構造的に保存されたエピトープを認識すると考えられる。
本明細書で提供される結合分子は、配列番号７のアミノ酸９１－１７５を含むヒト第ＸＩ因子のＡ２ドメインに結合し、免疫複合体を形成する。しかしながら、ＡＢ０２３、１４Ｅ１１の親分子は、複数の、しかし全てではない哺乳動物種由来の血漿中で免疫複合体またはＦＸＩとの複合体を形成するので、結合分子は、本明細書で特定されたヒトＦＸＩの変異体に対して結合能を有することも考えられる。結合分子が天然（native）（ＩｇＧ４）形態である場合、それは、１つまたは２つのＦＸＩホモ二量体に結合することができる。多量体または凝集体も同様に形成することができる。用語「変異体」は、ＦＸＩに関して使用される場合、「親」ＦＸＩ配列と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の置換、欠失、および／または付加を含み、「親」ＦＸＩ配列と同じ生物学的機能を発揮する、すなわち、活性型ＦＸＩａはプロテアーゼ活性を有し、ＦＩＸの活性化および／またはＴＦＰＩ、ＳＥＲＰＩＮ－ｓ、タンパク質Ｓ、ＦＶ、ＦＸ、およびＦＸＩＩなどの他の高分子基板の活性化／不活性化を触媒する、活性型ＦＸＩａに変換され得るポリペプチドを言う。アミノ酸置換は、本明細書で規定されるように、保存的であり得るか、または非保存的であり得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ＦＸＩ変異体は、カルボキシ末端またはアミノ末端（アミノ末端はリーダー配列を含んでいても、含まなくてもよい）のいずれかにアミノ酸残基の付加を有し得る。用語「変異体」は、ＦＸＩに関して使用される場合、既知のＦＸＩポリペプチド（例えば、配列番号７に示される配列を有するＦＸＩポリペプチド）のアイソフォーム、対立遺伝子またはスプライシング変異体、または翻訳後修飾変異体（例えば、グリコシル化変異体）を含む。本開示の結合分子は、配列番号７のアミノ酸９１－１７５に対応するアミノ酸配列を含むＦＸＩ変異体に対する結合親和性を示し得ることが容易に理解される。前記によれば、当該結合分子はまた、それらが前記のアミノ酸の伸長またはそれに対応するアミノ酸の位置を含む場合には、ＦＸＩａ分子およびその変異体に結合し、それと可変複合体を形成する能力があることが考えられる。
本開示の結合分子はまた、任意の種に優先して、または優先せずに、多数の他の哺乳動物種由来のＦＸＩに対する結合能を有し得る。これらの非ヒトＦＸＩポリペプチドは、好ましくはＦＸＩ遺伝子またはそのオルソログもしくはパラログによってコードされ、ホモ二量体として存在しない場合であっても、ヒトＦＸＩと同じ生物学的機能を示す。本開示の結合分子の潜在的な非ヒト霊長類たんぱく質標的には、以下を有するポリペプチドが含まれる；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｈ２ＱＱＪ４（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２６ ｏｆ １１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５），Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｈ２ＰＥＸ７（Ｐｏｎｇｏａｂｅｌｉｉ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２７ ｏｆ １１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５），Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ａ０Ａ０Ｄ９ｓ２Ｍ６（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓｓａｂａｅｕｓ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ６ ｏｆ １１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５），ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｇ３Ｒ２Ｘ１（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２７ ｏｆ １４ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５），Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．２０ Ａ０Ａ０９６ＮＣ９５（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉs，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １１ ｏｆ １１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５），Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｇ１ＲＬＥ８（Ｎｏｍａｓｃｕｓｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２８ ｏｆ １１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５），Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｇ７ＰＫＦ５（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １３ ｏｆ １４ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５），ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｇ７ＭＳＦ８（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ，ｅｎｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １２ ｏｆ １４ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５）。他の種には、ヒトと同じＡ２ドメインにおける保存された抗原領域を有する一連の哺乳類ＦＸＩ変異体が含まれる。上記のポリペプチドの変異体もまた、本開示の結合分子の標的として考えられる。本開示の結合分子によって認識される予想される非ヒト霊長類ポリペプチド標的は、配列番号７のアミノ酸９１－１７５に対応する配列、または、それらはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことが考えられる。従って、ＦＸＩに対して指向される種間特異的結合分子、例えば、非ヒト霊長類においてもまた、本明細書内に提供される。従って、本明細書で使用される用語「種間認識」または「種間特異性」は、ヒトおよび非ヒト、例えば、非ヒト霊長類種において、本明細書に記載の結合分子が同じ標的ポリペプチドへ結合することを意味する。１４Ｅ１１は、広範囲の無関係な哺乳動物種と複合体を形成するように見受けられることを意味する普遍的抗体である。この見地は、ＦＸＩのＡ２ドメイン上の高度に保存された、または同一の配列に結合することを示唆する。１４Ｅ１１に対するＡＢ０２３の同等性が示されているので、ＡＢ０２３の普遍性は、ほとんど種の制限のない治療用抗体の開発を可能にする。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される結合分子はまた、ヒトまたは非ヒト哺乳類のＦＸＩａに結合し得ることが考えられる。従って、ＦＸＩに関する結合分子の結合特性の文脈において開示されるものは、好ましくは必要な変更を加えて、ＦＸＩａに関するその結合特性に等しく適用可能である。
〔抗体〕
本開示の結合分子は、抗体であると考えられる。当技術分野で周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して標的エピトープに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。用語「抗体」、「抗体分子」および「免疫グロブリン」は、互換的に、および本明細書内でそれらの最も広い意味で使用される。また、それらは、天然抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、（天然または合成）抗体誘導体、フラグメントまたは変異体、必要とされる特異性を有する抗原結合性フラグメントを含む融合タンパク質、および、必要とされる特異性を有する抗原結合部位を含む抗体の任意の他の改変された形態を含み得る。本開示による抗体は、本明細書に記載されるように、哺乳類ＦＸＩに結合能を有することが想定され、そして好ましくは本明細書に記載されるような抗体ＡＢ０２３の有利な特徴を示す。
〔天然抗体〕
「天然抗体」は、四量体の糖タンパク質である。天然抗体では、各四量体は２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０－７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００－１１０以上のアミノ酸である「（超）可変」領域を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」またはＣＤＲまたは「ＣＤＲ領域」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
軽鎖および重鎖の両方は、「定常領域」および「可変領域」と呼ばれる構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この点に関して、当然のことながら、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が抗原認識および特異性を決定する。用語「ＶＬ」、「ＶＬ領域」および「ＶＬドメイン」は、本明細書全体を通して、軽鎖の可変領域を言うために互換的に使用される。同様に、用語「ＶＨ」、「ＶＨ領域」および「ＶＨドメイン」は、本明細書において、重鎖の可変領域を言うために互換的に使用される。
用語「ＣＬ」、「ＣＬ領域」および「ＣＬドメイン」は、ここでは軽鎖の定常領域を示すために互換的に使用される。用語「ＣＨ」、「ＣＨ領域」および「ＣＨドメイン」は、ここでは重鎖の定常領域を示すために互換的に使用され、「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、および「ＣＨ３」領域またはドメインを含む。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常領域は、分泌、経胎盤運動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ－末端部分は可変領域であり、Ｃ－末端部分は定常領域である。ＣＨ３領域およびＣＬ領域は、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のＣ－末端を含む。
可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、これらの可変ドメイン内のＶＬおよびＶＨ領域、または、これらの可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、結合して、３次元の抗原結合部位を規定する可変ドメインを形成する。この四次抗体構造は、Ｙ型の各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、ＶＨ領域およびＶＬ領域のそれぞれについて、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、Ｋａｂａｔ付番システムに従って決定される）によって、抗原結合部位が規定される。軽鎖の３つのＣＤＲは、本明細書内ではＣＤＲ１ ＬＣまたはＣＤＲＬ１、ＣＤＲ２ ＬＣまたはＣＤＲＬ２、および、ＣＤＲ３ ＬＣまたはＣＤＲＬ３とも指定される。重鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１ ＨＣ またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲ２ ＨＣ またはＣＤＲＨ２、および、ＣＤＲ３ ＨＣ またはＣＤＲＨ３ と称される。天然抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ領域」は、典型的には、抗体が水性環境中でその三次元配置をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される、アミノ酸の短い非連続配列である。
本開示の結合分子、および、例えば抗体は、配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１；配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２；配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３；配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１；配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２；配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３；および、任意選択でＳ２４１Ｐ修飾を含むと考えられる。当業者は、ＣＤＲがそれぞれ、軽鎖および重鎖の可変領域に位置することを容易に理解する。前記のＣＤＲを含むモノクローナル抗体は、本明細書内に開示され、そして本明細書内で「ＡＢ０２３」と称される。
本開示の結合分子および好ましいモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント、その変異体、または誘導体は、配列番号８に示されるＶＬ領域、および／または、配列番号９に示されるＶＨ領域を含むと考えられる。しかしながら、ＶＬ領域およびＶＨ領域の他の組み合わせも考えられる。本開示の結合分子および好ましいモノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、その変異体、またはその誘導体は、配列番号１０または配列番号１２に示される軽鎖、および／または、配列番号１１または配列番号１３に示される重鎖を含むと考えられる。しかしながら、軽鎖と重鎖との他の組み合わせも考えられる。
各軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、様々なクラスに割り当てられ得る。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、イプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥと規定する。これらのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、しばしば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を有する。軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部は、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。全ての免疫グロブリン型、クラス、およびサブクラスは、本開示の範囲内である。本開示による抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ４モノクローナル抗体であってもよい。
〔モノクローナル抗体〕
本開示に基づき、モノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、変異体、およびその誘導体が想定される。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、換言すれば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。異なるエピトープに対する異なる抗体を含み得る従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は実質的に類似したエピトープ結合部位を含有し、それゆえに、モノクローナル抗体は抗原上の同一エピトープに対するものであり得る。従って、用語「モノクローナル抗体」は、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（登録商標）モノクローナル抗体を含む。
モノクローナル抗体を産生するための種々の産生方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．１１６－２２７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）に記載される。適切な技術としては、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡの単離および配列決定ならびに適切な宿主細胞におけるその後の導入および発現を含む組換えＤＮＡ法、ならびに、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２～５５４（１９９０）に最初に記載された技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーからの抗体の単離が含まれる。
〔キメラ抗体〕
本明細書に記載されるように、用語「抗体」は、キメラ抗体も包含する。用語「キメラ抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる種に由来し得る２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体を言う。具体的には、この用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、ある種に由来するか、または抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同である抗体を言う。鎖の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列、ならびにこのような抗体のフラグメントと同一であるか、または相同である。言い換えると、用語「キメラ抗体」は、抗原結合部位は第１の種から得られるか、または誘導され、定常領域（これはインタクト、部分的、または本発明に従って改変され得る）は第２の種から得られる任意の抗体を意味するものとする。例えば、抗原結合部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）由来であり得、そして定常領域はヒト由来であり得る。キメラ抗体は、例えば、ヒトおよびマウス抗体フラグメント（例えば、ヒト定常領域およびマウス可変領域）を含み得る。
〔ヒト化抗体〕
本明細書に記載されるように、本開示は、（当技術分野で周知であり、かつ使用される方法ならびに独自の方法論の両方を使用してＡｂｚｅｎａ（別名Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＧＢ）によって実施されるような）マウス抗ＦＸＩ １４Ｅ１１に由来する、（モノクローナル）ヒト化抗体、その抗原結合性フラグメント、変異体、および誘導体に関する。
「ヒト化抗体」は一般に、（Ｉ）非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来し、抗体はヒト生殖系列配列に基づくもの、または（ＩＩ）可変領域のＣＤＲが非ヒト起源由来であるＣＤＲ移植されたものであって、可変領域の１つまたはそれ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ配列の一部はヒト起源であり、例えば、定常領域（もしあれば）はヒト起源であるもの、として規定される。
従って、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体の重鎖、軽鎖、またはその両方における可変領域が既知の特異性の非ヒト抗体からの１つまたはそれ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって改変されており、そして場合により、ヒト抗体は部分的なフレームワーク領域置換および配列変換によって改変されている抗体を含む。換言すれば、既知の特異性の非ヒト抗体（マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類抗体など）由来の１つまたはそれ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植されている抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ぶ。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに転移するために、ＣＤＲの全てをドナー可変ドメインからの完全なＣＤＲで置換することは有用ではないかもしれない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに有用な残基のみを転移することができる。
本開示において、本明細書に詳述されるように、前駆体マウス１４Ｅ１１抗体は、１４Ｅ１１ ＣＤＲ残基を決定すること、そして、ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲをそれぞれ移植するためのアクセプターヒト生殖系列フレームワークとして、マウスＶＨおよびＶＬ配列に対して最良の全相同性を有するヒト生殖系列配列をデータベースから選択することによって、ヒト化された。簡潔には、キメラ抗ＦＸＩ抗体Ｖ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを用いて作製し、抗体の結合特性を支持し得るＶ領域フレームワーク中のアミノ酸を同定するために分析した。これらのアミノ酸は、１つまたはそれ以上の変異体ＣＤＲ移植抗体への組み込みのために注目された。結合分子のＶＨおよびＶκ配列の両方は、典型的なフレームワーク残基を含み、ＣＤＲ１、２および３モチーフは、多くのマウス抗体と同等である。ヒトＶ領域フレームワークとして使用するための相同性の程度が最も大きい重鎖および軽鎖ヒト配列を同定するために、当該重鎖および軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列をヒト生殖細胞系Ｖ領域配列のデータベースと比較した。次いで、ＣＤＲをフレームワーク上に移植することによって、そして必要に応じて、抗体結合効率を回復し得る、以前に同定された残基の特定のマウス配列への復帰突然変異によって、一連のヒト化重鎖および軽鎖Ｖ領域を設計した。次に、Ａｂｚｅｎａが独自に開発したエクスビボ技術、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ（Ｊｏｎｅｓ ＴＤ，Ｈａｎｌｏｎ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ ＢＪ，Ｈｅｉｓｅ ＣＴ，Ｎａｙｅｅ ＰＤ，Ｓａｎｄｅｒｓ ＤＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ａ，Ｓｗｅｅｔ Ｃ，Ｕｎｉｔｔ Ｅ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｇ，Ｌｏ ＫＭ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ，Ｃａｒｒ ＦＪ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ ＭＰ．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ａｌｐｈａ２ｂ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｃ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２００４ ２４（９）：５６０－７２；Ｊｏｎｅｓ ＴＤ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＷＪ，Ｓｍｉｔｈ ＢＪ，Ｂａｍｆｏｒｄ ＣＡ，Ｎａｙｅｅ ＰＤ，Ｂａｇｌｉｎ ＴＰ，Ｇａｓｔｏｎ ＪＳ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ ＭＰ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ａ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ＣＤ４＋ ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ.２００５ ３（５）：９９１－１０００）を適用して決定することにより、可能性のあるＴ細胞エピトープの発生率が最も低い変異体配列を選択した。本開示の目的のために、ＣＤＲ最適化された（「生殖系列化された」）ヒト化抗体は、用語「ヒト化された」抗体内に含まれる。
ヒト化抗体の重鎖、軽鎖、またはその両方における可変領域内のフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト起源の実質的に全て、または全ての残基から構成され得る。この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は、「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。ヒトおよびドナーのフレームワーク残基の混合物を含むヒトフレームワーク領域は、本明細書では「部分的ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために（例えば、所望の親和性を得るために）行われる。従って、一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、場合によっては２つの可変領域（可変領域において、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲの全てまたは一部、および、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである）の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、例えば、ヒト免疫グロブリンのそれも含む。
〔ヒト抗体〕
「ヒト」抗体は、本明細書において、キメラまたは「ヒト化」されておらず、非ヒト種（全部または一部）に由来しないものとして規定される。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントは、ヒト由来であってもよいし、合成ヒト抗体であってもよい。「合成ヒト抗体」は、本明細書において、全部または一部が、既知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列からインシリコで生成された配列を有する抗体として規定される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してアミノ酸配列を考案することによって達成することができる。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントの別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである（換言すれば、このようなライブラリーは、ヒト天然供給源から採取された抗体に基づく）。
〔フラグメント、変異体および誘導体〕
本明細書に記載されるように、本開示は、全長抗体、ならびにその抗原結合性フラグメント、変異体、および誘導体を包含する。
〔フラグメント〕
用語「抗体フラグメント」は、「親」抗体に由来し、その基本構造および機能を保持するポリペプチドを言う。従って、抗体フラグメントは、好ましくはその特異的抗原、すなわちＦＸＩに対する結合能を有する。さらに、本開示による抗体フラグメントは、抗原結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、換言すれば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）、および／または、３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）の存在によって規定される。従って、用語「抗体フラグメント」は、「親」抗体の抗原結合部位（すなわち、当該ＣＤＲおよび任意選択で当該ＦＲ（の一部））を保持する「機能的」または「抗原結合」ポリペプチドを言う。本開示の抗体フラグメントは、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト「親」抗体に由来し得る。
好ましい抗原結合抗体フラグメントは、配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１；配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２；配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３；配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１；配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２；配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを含む。
上記に基づき、用語「抗原結合抗体フラグメント」は、例えば、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ＩｇＧ」（「半抗体」）のような全長抗体のフラグメントを指し得る。本開示に基づく抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖあるいはｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ｚｉｐｐｅr、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアポディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、単鎖ダイアポディ、タンデムダイアポディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２あるいは（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２のような構成によって例示される「ミニボディ」、トリアボディまたはテトラボディのようなマルチボディのような抗体の修飾フラグメントでもあり得る。さらに、用語「抗体フラグメント」の規定は、フラグメント、すなわち、一価、二価および多価（ポリ／マルチ）コンストラクトを含むコンストラクトを包含する。そしてそれゆえに、１つの標的抗原のみに特異的に結合する単一特異性コンストラクトも、１またはそれ以上の抗原（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の別個の抗原結合部位）に特異的に結合する二重特異性／多重（ポリ／マルチ）特異性コンストラクトも包含する。さらに、用語「抗体フラグメント」の規定は、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、および、複数のポリペプチド鎖からなる分子を包含し、その鎖は、同一（ホモ二量体、ホモトリマーまたはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロトリマーまたはヘテロオリゴマー）のいずれかであり得る。
抗体フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または、インタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、産生され得る。このようなフラグメントを産生するための方法は、当該分野で周知である。
〔変異体〕
用語「変異体」は、抗体または抗体フラグメントなどの「親」結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを言うが、アミノ酸配列は、変異体が依然として（特異的に）ＦＸＩ、好ましくは配列番号７に示されるヒトＦＸＩのＡ２ドメインに結合することができ、また、それらは、好ましくは抗体ＡＢ０２３と比較して、類似の、またはさらに改善された特性を示すような、「親」アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、または挿入）を含む。本開示の結合分子の変異体（例えば、抗体および抗体フラグメント）は、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸に適切なヌクレオチド変換を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製され得る。一般に、上記のアミノ酸修飾は、配列番号１、２、３、４、５、および６に示されるようなＡＢ０２３ＣＤＲと比較して、変異体のＣＤＲが２またはそれ以上の累積的に１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸置換を含むという前提の下で、可変領域または定常領域に導入され得るか、または存在し得る。アミノ酸修飾は、例えば、医薬開発に影響を及ぼす熱力学的安定性、溶解度または粘度のような抗体特性を調節するために導入することができる（「配列最適化」）。
本明細書に記載されるように、アミノ酸修飾は、例えば、本明細書に記載される結合分子（好ましくは、抗体または抗原結合抗体フラグメント）のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または、残基の中への挿入、および／または、残基の置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、本明細書に記載される所望の特徴を有する限り、最終産物に到達するために、「親」アミノ酸配列に導入され得る。アミノ酸修飾はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、結合分子の翻訳後プロセスを変化させてもよい。
例えば、変異体は、ＣＤＲの各々において挿入または欠失された、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸（当然、ＣＤＲの長さに依存する）を含み得る。一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が、ＦＲの各々において挿入または欠失され得る。本明細書内で考えられるアミノ酸配列の挿入は、例えば、（１）単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入も、（２）１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲の、アミノ末端／またはカルボキシル末端への融合も、包含する。本開示の結合分子の挿入変異体（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、抗体または抗体フラグメントと、酵素または別の機能的ポリペプチド（例えば、結合分子（例えば、抗体または抗体フラグメント）の血清半減期を増加させ得るポリペプチド）との融合産物を包含し得る。
アミノ酸置換は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ（例えば、超可変領域）、または、重鎖および／または軽鎖のＦＲ領域に導入することができる。例えば、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて作製され得る保存的アミノ酸置換が、本明細書内に意図される。
別の変異体は、配列番号１－６に示されるＣＤＲと比較して、ＣＤＲにおいて置換された１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含み得る。一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸は、ＣＤＲまたはＦＲの長さに依存して、フレームワーク領域（ＦＲ）において置換され得る。
一般に、アミノ酸が、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲの１つまたはそれ以上または全てにおいて置換される場合、次いで得られる「変異体」配列は、「親」ＣＤＲ配列と少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることが好ましい。従って、ＣＤＲの長さは、可能なアミノ酸置換の数に影響を及ぼし、その結果、変異体配列は、なお、本開示に包含される。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するためには、好ましくはその置換された配列と８０％同一である。従って、抗体コンストラクトのＣＤＲは、それらの置換配列に対して種々の程度の同一性を有し得、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％の同一性を有し得、一方、ＣＤＲＬ３は９０％の同一性を有し得る。
好ましい置換（または交換）は、保存的置換である。しかしながら、抗体コンストラクトがＦＸＩおよび／またはそのＣＤＲに結合するその能力を保持する限り、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の、置換された配列に対する同一性を有するような任意の置換（非保存的置換または例示的置換からの１つまたはそれ以上を含む）が考えられる。
本明細書内で使用される場合、用語「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアラインメント中の同じ位置に同一の残基を有する範囲を示し、しばしば、パーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。従って、正確に同じ配列の２コピーは１００％同一であるが、それほど高度に保存されておらず、欠失、付加、または置換を有する配列は、より低い度合の同一性を有し得る。当業者は、いくつかのアルゴリズムが標準的なパラメーターを使用して配列同一性を決定するために利用可能であることを認識する。例えば、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、そしてＣｌｕｓｔａｌ Ｗである。
用語「配列相同性」は、共通の祖先に起因する子孫の２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列の類似性を示す。相同な生物学的構成物（遺伝子、タンパク質、構造）は、ホモログと呼ばれ、オルソログやパラログが含まれる。
本開示の好ましい結合分子の変異体は、ＣＤＲ領域において、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはほぼ１００％の配列同一性または相同性を有し、「親」ＣＤＲ、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、および６を含む結合分子と比較して、ＦＸＩに対する同等または改善された結合親和性および／または同等または改善された生物学的活性を示す。
さらに、個々の変異体のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書内に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性または同一性は、少なくとも８０％であり、そして、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、およびほぼ１００％と増加することが好ましい。
ＣＤＲおよびＦＲに加えて、好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである結合分子のＦｃ部分にアミノ酸修飾を導入することもできる。このような修飾は、例えば、他の免疫細胞上のＣ１ｑおよび／またはＦｃレセプターのような補体タンパク質との相互作用、または血清半減期もしくは抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の調節といった、抗体の機能特性を調節するために使用することができる。従って、エフェクター機能の改変のための突然変異は、当該分野で公知の慣用的な方法を使用して、Ｆｃドメインに導入され得る。例示的な修飾には、ＩｇＧ１のグリコシル化をもたらすＡｓｎ２９７からＡｌａ２９７およびＡｓｎ２９７からＧｌｎ２９７、または、Ｌｙｓ３２２０からＡｌａ３２２、および任意選択で、抗体由来細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体由来細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または消失させることが報告されている、Ｌｅｕ２３４からＡｌａ２３４およびＬｅｕ２３５からＡｌａ２３４が含まれる。
〔誘導体〕
用語「結合分子」はまた、誘導体を包含する。本明細書内に意図されるものは、本明細書内の他の箇所に開示されるような抗体または抗体フラグメントの誘導体である。用語「誘導体」は、一般に、付加的な機能を導入するために共有結合的に改変された結合分子を言う。結合分子の共有結合性修飾は、一般に、しかし常にではないが、翻訳後に行われ、分子の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、結合分子に導入され得る。結合分子の誘導体化は、治療剤または診断剤、標識、分子の血清半減期を延長する基の付加または非天然アミノ酸の挿入のために使用され得る。本開示の結合分子の可能な化学修飾には、例えば、Ｎ末端のアシル化もしくはアセチル化、または、Ｃ末端のアミド化もしくはエステル化、あるいはその両方が含まれる。アルキル化（例えば、メチル化、プロピル化、ブチル化）、アリール化、および、エーテル化などの化学修飾も考えられる。
〔血清半減期の延長〕
結合分子の、そして好ましくは、本開示の抗体およびその抗原結合性フラグメントの血清半減期を延長するための手段の例には、ヒト体内の他のタンパク質（血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）など）に結合するペプチドまたはタンパク質ドメインの付加が含まれる。血清半減期を延伸するためのさらなる考えられる修飾には、様々な長さのポリペプチド鎖を有するアミノ基の延伸（例えば、ＸＴＥＮ技術またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））、非タンパク質性ポリマーの結合が含まれる。ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、またはヒドロキシエチルデンプン（例えば、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））またはポリシアル酸（例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術）のような炭水化物のような種々のポリオールが含まれるが、これらに限定されない。加えて、当技術分野で公知であるように、ポリマーの添加を容易にするために、アミノ酸置換は結合分子内の種々の位置で行われ得る。
〔グリコシル化〕
別のタイプの共有結合性修飾の結合分子、および、好ましくは本開示の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、そのグリコシル化パターンを改変することを含む。公知のように、グリコシル化パターンは、分子のアミノ酸配列（例えば、グリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、または、タンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物、の両方に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかであり得る。Ｎ結合とは、炭水化物部位のアスパラギン残基の側鎖への付着を言う。結合分子へのＮ結合グリコシル化部位の付加は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）から選択される１つまたはそれ以上のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成される。Ｏ結合グリコシル化部位は、出発配列への１つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換によって導入され得る。結合分子のグリコシル化の別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的な結合によるものである。これらの方法は、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリングモードに依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。
同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、例えば、結合分子をトリフルオロメタンスルホン酸に暴露することにより化学的に、または、エンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することにより酵素的に達成され得る。
〔標識化〕
本開示の結合分子のさらなる潜在的な共有結合性修飾は、１つまたはそれ以上の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーを介して結合分子に結合され得る。タンパク質を標識するための種々の方法は、当該分野で公知であり、本開示を実施する際に使用することができる。用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を言う。一般に、標識は、それらが検出されるアッセイに応じ、種々のクラスに分類される。例示的な標識は、次のようなものを含むが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）のような同位体標識；磁気標識（例えば、磁性粒子）；レドックス活性部分；蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、化学発光基、および、発蛍光団（これらは「小分子」発蛍光団またはタンパク質性発蛍光団のいずれかであり得る）；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ビオチン化基；または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）のような光学的色素（発色団、リン光体および蛍光体を含むがこれらに限定されない）。
〔ＡＤＣ〕
本開示の結合分子、好ましくは抗体またはその抗原結合性フラグメントに、小分子化合物などの薬物を添加することも考えられる抗体薬物結合体（「ＡＤＣ」）は、薬物または薬剤に連結された抗体またはその抗原結合性フラグメントである。結合は、共有結合、または静電気力などによる非共有相互作用によって確立することができる。当技術分野で知られているように、ＡＤＣを形成するために、当技術分野で知られている様々なリンカーを使用することができる。
〔アフィニティタグ〕
本開示の結合分子、および好ましくは抗体またはその抗原結合性フラグメントはまた、分子（親和性タグ）の精製および単離を補助し得るさらなるドメインを含み得る。このような追加のドメインの非限定的な例には、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡＴ－タグ、ＨＡ－タグ、ＴＡＰ－タグ、ＧＳＴ－タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ－タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ－タグ）、Ｆｌａｇ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグおよびその変異体（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩ－タグ）、ならびにＨｉｓ－タグとして知られるペプチドモチーフが含まれる。
上記のフラグメント、変異体および誘導体は、例えば、それらの抗原結合特性を改善するためにさらに適合化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１領域とＣＬ領域との間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように設計されてもよい。Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み得る。Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常領域および重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基を付加するという点で、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書内の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、当初は、それらの間にヒンジシステイン残基を有するＦａｂ’フラグメントのペアとして産生された。
本発明の結合分子は「単離された」または「実質的に純粋である」形態で提供され得る。「単離された」または「実質的に純粋である」が本明細書内で使用される場合、結合分子がその生産環境の構成要素から同定され、分離され、および／または、回収されたことを意味する。そのような「単離された」結合分子は、治療的または診断的な使用を妨害し得る、結合分子の産生環境由来の他の汚染成分を含まないか、または実質的に含まない。汚染成分は、酵素、ホルモン、および、他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。従って、「単離された」結合分子は、これらの汚染成分を除去または実質的に除去する少なくとも１つの精製工程によって調製される。上記の規定は、必要な変更を加えて、「単離された」ポリヌクレオチドにも同様に適用可能である。
〔特異的結合〕
本開示の結合分子（例えば、抗体およびその抗原結合性フラグメント）は、有利には種々の哺乳動物ＦＸＩ（好ましくは、ヒトＦＸＩ）に結合し得、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。全ての文法的形態における、用語「結合する」および「認識する」は、本明細書において互換的に使用される。好ましくは、結合分子はＦＸＩに特異的に結合する。用語「特異的に結合する」は一般に、結合分子、例えば、本明細書に記載されるような抗体またはその抗原結合性フラグメントがその抗原結合部位を介して、無作為の無関係な非標的エピトープよりも、その意図される標的エピトープに対してより容易に結合することを示す。用語「特異的に結合する」は、結合分子の親和性が、少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上、非標的エピトープに対するその親和性よりも、その標的エピトープに対して大きいことを示す。従って、結合分子、すなわち、抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、非標的エピトープに対する抗体のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）で標的エピトープに結合する場合、その標的エピトープに特異的に結合すると考えることができる。本開示の結合分子はまた、哺乳類ＦＸＩ（好ましくはヒトＦＸＩ）に対するそれらの結合親和性の点から記載され得る。用語「親和性」または「結合親和性」は、個々のエピトープと抗原結合ドメイン（すなわち、結合分子のＣＤＲ）との結合の強度を言う。特定の結合分子のその特異的エピトープへの結合の親和性は、平衡会合定数（ｋａ）および平衡解離定数（ｋｄ）の計測、およびｋｄ対ｋａの商（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）の計算によって決定されることが多い。結合親和性は、平衡透析；ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器を使用すること；放射性標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイ法；その他の当業者に公知の別の方法、などの従来の技術を使用して容易に決定され得る。親和性データは、例えば、「Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪおよびＳｈａｒｐ ＰＡ．（１９８２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１」に記載される方法によって分析され得る。当該発明の結合分子の好ましい結合親和性は、解離定数またはＫＤが５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、または１０－１５Ｍ未満であるものが含まれる。
〔交差反応性〕
しかしながら、用語「特異的に結合する」は、ヒトＦＸＩに（特異的に）結合する結合分子が異なる種由来のＦＸＩタンパク質と交差反応することを排除しない。従って、本開示の結合分子はまた、他の哺乳動物種由来のＦＸＩに結合し得る。
「種間」結合または認識は、ヒトおよび非ヒト種の同一の標的抗原に対する本明細書に記載の結合ドメインの結合を意味する。従って、「種間特異性」は、ＦＸＩ以外の抗原に対するものではなく、異なる種において発現されるＦＸＩに対する種間反応性として理解されるべきである。例えば、ヒトＦＸＩ（好ましくは配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸９１－１７５を含むＡ２ドメイン）に結合する結合ドメインは、他の非ヒトＦＸＩに結合し、および、好ましくは配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸９１－１７５に特徴的な、対応する、または類似する領域にも結合する。
〔生物活性〕
本明細書内に提供される結合分子は、生物学的に活性である、すなわち、哺乳類ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａに結合し、それぞれの生物学的機能のいくつかを阻止することが考えられる。具体的には、「生物学的に活性である」結合分子は、本開示に基づいてＦＸＩと免疫複合体を形成し、当該ＦＸＩ－ＡＢ０２３免疫複合体はＦＸＩＩａによって効率的に活性化され得ず、または自己活性化され得ない。しかしながら、免疫複合体は、トロンビンによって活性化され得る。一度ＦＸＩ－ＡＢ０２３複合体がＦＸＩａ－ＡＢ０２３に活性化されると、ＦＸＩＩに対する、そのＦＸＩＩチモーゲンをＦＸＩＩａに変換する活性が低下する。さらに、活性化された複合体は、機能の喪失なしに、ＦＩＸの第ＩＸａ因子への変換を実施し得、好ましくは、血液のトロンビン依存性止血フィードバック活性化を保存しつつ、接触活性化の完全なまたは部分的な阻害を生じる。従って、生物学的に活性な結合分子の、それらの標的であるＦＸＩおよび／またはＦＸＩａへの結合は、例えば接触活性化複合体を介して凝固を開始するアッセイにおいて、抗凝固活性をもたらすことが考えられる。換言すれば、本開示による結合分子は、ａ）ＦＸＩに結合し、それによって、ＦＸＩＩａによってその活性型であるＦＸＩａへ変換されること、または自己活性化を阻止する、および／または、ｂ）ＦＸＩａに結合し、それによって、その結合およびＦＸＩＩの活性化を減少させる、ことによって、その有益な機能を発揮すると考えられる。それによって、本開示の結合分子は、好ましくは接触活性化複合体を妨害し、それによって、有利には、接触活性化複合体とは独立した止血プロセスを損なうことなく、例えば、炎症および血栓症を含む、接触活性化に関連する病理学的プロセスを減少させる。
結合分子の抗凝固活性は、本明細書に記載されるように、インビトロで決定され得る。簡潔には、接触活性化依存性トロンビン生成を測定する正常ヒトまたは他の哺乳動物血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、市販の試験キット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡからのＳｙｎｔｈＡＳｉｌ試薬）を用いて、様々な濃度の結合分子または対応する溶媒の存在下で測定された。試験化合物を、通常２０－４５ｎＭの濃度範囲の内因性ＦＸＩおよびＳｙｎｔｈＡＳｉｌ試薬（コロイドシリカ活性化剤）を含有する血漿とともに３７℃で約３分間インキュベートする。次いで、２５ｍＭ塩化カルシウムの添加によって凝固を開始し、凝固が生じる時間を測定し、約２．０倍のａＰＴＴ延長効果を示す試験物質の濃度を決定する。本開示の結合分子は、１．５倍、２．０倍、またはそれ以上のａＰＴＴ延長をもたらすことが考えられる。
有利には、本開示による結合分子、好ましくはモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントは、上記の生物学的特性を示し、それゆえ、これらは血栓症および炎症の抑制のための有望な新しい薬剤である。なぜなら、結合分子はＦＸＩに特異的に結合すると考えられるので、それらは止血を損なわず、または重度に損なわず、それによって好ましくは出血の危険性を増大させないと考えられる。
〔ポリヌクレオチド〕
本開示はさらに、本開示の結合分子またはＶＨまたはＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを含む。例えば、１重鎖および／又は多重鎖（例えば、２重鎖）形態、直鎖状又は環状、又はその混合物（ハイブリッド分子を含む）におけるそれぞれの修飾された又は修飾されないＲＮＡ又はＤＮＡである。ポリヌクレオチドは従来のリン酸ジエステル結合または非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。本開示のポリヌクレオチドはまた、１つまたはそれ以上の改変された塩基（例えば、トリチル化塩基）および異常な塩基（例えば、イノシン）を含み得る。本開示の結合分子をポリヌクレオチドから発現させることができる限り、化学的、酵素的、または代謝的修飾を含む他の修飾も考えられる。ポリヌクレオチドは、本明細書内に規定されるような単離された形態で提供され得る。ポリヌクレオチドは、転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなどのような調節配列を含み得る。
本発明は、ＶＨ領域のＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号８と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域（ＶＨ領域）をコードする核酸を含むか、またはその核酸から構成されるポリヌクレオチドを提供する。コードされたＣＤＲまたはＶＨドメインを含む結合分子はＦＸＩに結合することができ、ＦＸＩと結合分子との間の複合体形成により、本明細書に記載の所望の生物学的活性を示すことが好ましいと考えられる。
本発明は、免疫グロブリン軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）をコードする核酸を含むか、またはそれからなり、ＶＬ領域のＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを提供する。コードされたＣＤＲまたはＶＬ領域を含む結合分子は、ＦＸＩに結合することができ、ＦＸＩと結合分子との間の複合体形成により、本明細書に記載の所望の生物学的活性を好ましく示すと考えられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載される抗体定常領域、または、本明細書に記載される他の異種ポリペプチドをコードする追加のヌクレオチド配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。このようなポリヌクレオチドは、従って、本明細書に記載される結合分子の融合ポリペプチド、フラグメント、変種、および他の誘導体をコードし得る。
また、本開示は、上記のポリヌクレオチドの１つまたはそれ以上を含む組成物を含む。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む組成物もまた、本明細書内で提供される。第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなＶＨ領域をコードする。そして、第２のポリフオクテットは本明細書に記載するようなＶＬ領域、具体的には配列番号８に示されるＶＨ領域、および／または配列番号９に示されるＶＬ領域を含む、またはそれらからなる組成物をコードする。
〔ポリヌクレオチドの製造〕
本開示のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の慣用的な方法によって産生され得る。例えば、結合分子のヌクレオチド配列が既知である場合、結合分子をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いで、ＰＣＲによるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅から組立てられ得る。結合分子をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、または配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または同定するための遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって（例えば、結合分子をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローン）、任意の組織または結合分子を発現している細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞）から単離された）核酸（例えば、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ）から入手し得る。
いったん、結合分子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列はヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを使用して修飾されてもよく、それによって、結合分子の天然に存在しないフラグメント、変異体または誘導体、すなわち、本明細書に記載のモノクローナル抗ＦＸＩ抗体（例えば、免疫グロブリン重鎖領域または軽鎖領域）を作成するために、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失をポリヌクレオチド配列に導入してもよい（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）に記載される技術を参照のこと）。
〔ベクター〕
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターがさらに提供される。ポリヌクレオチドは、本開示の結合分子、好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする。「ベクター」は、例えば、複製および／または発現され得る宿主細胞に（外来の）遺伝物質を移入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。
用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、また、アデノウイルス関連ベクター（ＡＡＶ））、ファージ、ファージミド、コスミドおよび人工染色体（ＢＡＣおよびＹＡＣを含む）を含むが、これらに限定されるものではない。一般に、ベクター自体がヌクレオチド配列であり、ベクターは、一般に、ベクターの挿入物（導入遺伝子）、および、ベクターの「バックポーン」として働く、より大きな配列を含むＤＮＡ配列である。操作されたベクターは、宿主細胞における自律複製のための起点（ポリヌクレオチドの安定な発現が所望される場合）、選択マーカー、および制限酵素切断部位（例えば、多重クローニング部位、ＭＣＳ）を含み得る。ベクターはさらに、プロモーター、遺伝子マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列、および／またはタンパク質精製タグを含み得る。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、標的細胞における導入遺伝子の発現のために特に設計され、一般に制御配列を有する。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、そして多くが商業的に入手可能である。適切なベクターの例は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）内で提供されている。
〔標的化ベクター〕
標的化ベクターは、ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。簡潔に言えば、適切な手段には、相同組換え、または組み込み部位の配列を特異的に標的とするハイブリッドリコンビナーゼの使用が含まれる。標的化ベクターは、環状であり得、そして相同組換えのための使用の前に直鎖状化され得る。代替手段として、外来ポリヌクレオチドは、融合ＰＣＲによって連結されたＤＮＡフラグメント、または、その後に宿主細胞内に組換えられる、合成的に構築されたＤＮＡフラグメントであり得る。ランダムまたは非標的組み込みを生じる非相同組換えを使用することも可能である。
〔製造〕
〔発現ベクター〕
「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本開示の結合分子をコードするもの）の転写、および適当な宿主細胞におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳のために使用され得る（このプロセスはまた、本明細書内では、本開示の結合分子の「発現」とも呼ばれる）。発現ベクターは、複製起点、選択マーカー、および制限酵素切断部位に加えて、発現される異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたはそれ以上の調節配列を含み得る。
用語「調節配列」は、宿主生物における（異種）ポリヌクレオチドの作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列を言い、従って、転写調節配列と翻訳調節配列とが含まれる。原核生物における異種ポリヌクレオチド配列の発現に必要な調節配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物では、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、および任意にスプライスシグナルが必要とされ得る。さらに、特定の開始シグナルおよび分泌シグナルもまた、目的のポリペプチドの培養培地への分泌を可能にするために、ベクターに導入され得る。
核酸は、例えば、同じポリヌクレオチド分子上で、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、異種遺伝子のコード配列と作動可能に連結される。プロモーターは、目的のポリペプチドをコードする遺伝子の上流に配置され、遺伝子の発現を調節することができる。
哺乳動物の宿主細胞における発現のための例示的な調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号；Ｃｏｕｓｅｎｓらの米国特許第４，５１０，２４５号；およびＫｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉらの米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含み得る。
本開示のベクターは、１つまたはそれ以上の選択マーカーをさらに含み得る。真核生物の宿主細胞と共に使用するための適当な選択マーカーは、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子を含む。他の遺伝子には、ｄｈｆｒ（メトトレキサート耐性）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸耐性）、ｎｅｏ（Ｇ－４１８耐性）およびｈｙｇｒｏ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅｉｓｔａｎｃｅ）が含まれる。ベクターの増幅が、発現レベルの増加に使用され得る。一般に、選択マーカー遺伝子は、発現されるべきポリヌクレオチド配列に直接連結され得るか、または同時形質転換によって同じ宿主細胞に導入され得る。
従って、上記を考慮し、本開示は、ベクターに挿入され得る、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上をさらに提供する。従って、本開示は、プロモーターに作動可能に連結された、本開示の結合分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、結合分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得、そして結合分子の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のために、このようなベクターにクローニングされ得る。
〔宿主細胞〕
一般に、種々の宿主細胞が、発現ベクターから本開示の結合分子を発現させるために使用され得る。本明細書内で使用される場合、「宿主細胞」とは、本開示の結合分子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターのレシピエントであり得る／レシピエントとなっている細胞を言う。具体的には、宿主細胞は、さらに結合分子を発現および任意に分泌し得る。宿主細胞から結合分子を得るためのプロセスの説明において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、特に明記しない限り、結合分子の供給源を示すために互換的に使用される。用語「宿主細胞」はまた、「宿主細胞系」を含む。
一般に、この用語は、原核細胞または真核細胞を含む。また、この用語は、限定するものではないが、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに動物細胞、例えば昆虫細胞および哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、サル科マカク属のサル、またはヒト細胞を含む。本開示のポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、当該分野で公知の慣用的な方法（例えば、トランスフェクション、形質転換など）を使用して宿主細胞に導入され得る。
「トランスフェクション」とは、核酸分子やポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入するプロセスである、当該用語は、真核細胞における非ウイルス法に用いられることが多い。トランスダクションは、ウイルスを介した核酸分子やポリヌクレオチドの転写を説明するためにしばしば用いられる。動物細胞のトランスフェクションでは、物質の取り込みを可能にするために、細胞膜に一過性の孔または「穴」を開けることを意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションにより、細胞を圧搾することにより、または、カチオン性脂質を材料と混合してリポソーム（細胞膜と融合し、その運搬物を内部に沈着させる）を製造することにより、実施することができる。真核生物宿主細胞をトランスフェクションするための例示的な技術には、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションが含まれる。
用語「形質転換」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌への、また植物細胞を含む非動物真核細胞への、非ウイルス性転写を表すために使用される。従って形質転換とは、細菌または非動物の真核細胞の、その周囲からの細胞膜を介した直接的取り込み、それに続く外因性遺伝物質（核酸分子）の組み込みから生じる遺伝学的変化である。形質転換は、人工的手段によって影響され得る。形質転換が起こるためには、細胞や細菌はコンピテンスの状態になければならない。コンピテンスは、飢餓および細胞密度などの環境条件に対する時間制限された応答として生じ得る。原核生物の形質転換技術は、熱ショック媒介取り込み、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションを含み得る。植物形質転換技術は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるようなアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介転写、高速推進されるタングステンまたは金マイクロプロジェクタイル、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびポリエチレングリコール媒介取り込みを含む。
従って、上記を考慮して、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列および／またはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本開示の結合分子の発現のために、所望に応じて、挿入されたポリヌクレオチド配列の発現を調節し、および／または遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）を修飾およびプロセシングする宿主細胞が選択され得る。遺伝子産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、結合分子の機能に寄与し得る。異なる宿主細胞は、遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、当該産物の正確な修飾およびプロセシングを確実なものにするために選択され得る。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を使用することができる。
本明細書内に提供される結合分子を発現するために使用され得る例示的な哺乳動物宿主細胞は、ＤＧ４４および米国特許第４，６３４，６６５号に記載されているＤＵＸＢ１（（例えば、米国特許第５，１７９，０１７号に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される）のようなＤＨＦＲマイナスＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）、およびＳＰ２（マウス骨髄腫）細胞を含む。他の例示的な宿主細胞株は、限定されるわけではないが、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－ＩｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、およびＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）を含む。宿主細胞株は、商業サービス、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開された文献から入手可能である。
細菌、酵母、昆虫または植物細胞などの非哺乳動物細胞も容易に入手可能であり、原則として、本開示の結合分子の発現に使用することができる。例示的な細菌宿主細胞は、腸内細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。
他の宿主細胞として、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびイキアパストリス（ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母細胞が含まれる。昆虫細胞としては、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。
上記によれば、考えられる発現系（すなわち、発現ベクターを含む宿主細胞）は、以下のような微生物を含む。組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。
本開示の結合分子の発現のために、真核細胞が好ましく考えられる。従って、本開示の結合分子をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要な初期プロモーター（ＭＩＥＰ）に作動可能に連結され得る）を有する真核生物ベクターを含むＣＨＯ細胞は、本開示の結合分子を産生するための有用な発現系である。
〔培養〕
発現ベクターを有する宿主細胞を、本明細書に記載の結合分子（例えば、本明細書に記載されるような軽鎖および重鎖）の産生に適切な条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイを行う。従って、本開示は、プロモーターに作動可能に連結された、本開示の結合分子、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。
〔精製〕
本開示の結合分子が組換え発現されたならば、当技術分野で公知の任意の精製方法によって精製し得る。例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、アフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧまたはレクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製し得る。当業者は、回収される結合分子の個々の特性に基づいて、適切な精製方法を容易に選択することができる。
従って、上記に照らし、本プロセスはまた、結合分子の発現を可能にする条件下で本明細書に規定される宿主細胞を培養する工程、および、任意選択で、培養物から産生された結合分子を回収する工程を含む、本プロセスの結合分子の製造方法を提供する。
〔薬学的組成物〕
本開示はさらに、治療的有効量の本開示の結合分子、核酸、ベクターおよび／または宿主細胞、ならびに任意選択で１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む薬学的組成物を提供する。好ましい薬学的組成物は、本開示の抗体、および任意選択で１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。
従って、一態様では、本開示は、本明細書に記載の結合分子、好ましくは抗ＦＸＩ抗体またはその抗原結合性フラグメントを活性物質として含む薬学的組成物に関する。従って、薬学的組成物の製造のための結合分子の使用もまた、本明細書において想定される。用語「薬学的組成物」は、好ましくは被験体、より具体的にはヒトに投与するのに適した組成物を言う。しかしながら、非ヒト動物への投与に適した組成物もこの用語に包含される。
薬学的組成物およびその構成要素（すなわち、活性物質および任意の賦形剤）は、好ましくは製薬上許容される、すなわち、レシピエントにおいて望ましくない局所的または全身的効果を引き起こすことなく、所望の治療効果を引き出すことができる。本開示の薬学的に受容可能な組成物は、例えば、無菌および／または薬学的に不活性であり得る。具体的には、用語「薬学的に許容される」は、動物、好ましくはヒトにおける使用のために、規制当局または他の一般的に認識されている薬局方によって承認されていることを意味し得る。
本明細書に記載される結合分子は、好ましくは治療的有効量で薬学的組成物中に存在する。「治療的有効量」とは、所望の治療効果を引き出す結合分子の量または投与量を意味する。治療効力および毒性は、細胞培養、実験動物、または臨床試験における標準的な薬学的手順によって決定され得る。例えば、治験では、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な投与量）が用いられている。治療効果と毒性効果との間の投与量比は、治療指数であり、比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。
本明細書に記載されるように、薬学的組成物は、任意で、１つまたは複数の賦形剤および／または追加の活性物質を含むことができる。
抗体およびそのフラグメントは、一般に、非経口的に、好ましくは静脈内（注射または注入）または皮下に投与される。非経口投与のための組成物には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられるが、これらに限定されない。水性溶媒は、水、アルコール／水溶液、生理食塩水を含むエマルジョンまたは懸濁液、および限定されないがリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝媒体からなる群から選択され得る。非経口ビヒクルは、さらに、塩化ナトリウム水溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油を含む。他の適切な薬学的キャリア、希釈剤および／または賦形剤は、当該分野で周知である。本開示による結合分子（例えば、抗体またはその抗体フラグメント）は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／または、薬学的組成物を形成するための上述したような賦形剤と組み合わされ得る。薬学的組成物は、ヒスチジン緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびヒスチジン／ＨＣｌ緩衝液からなる群より選択される緩衝剤を含む水性担体中に、本開示の結合分子を含むことができる。さらなる緩衝液および処方情報は当業者に利用可能であり、例えば、Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ．２００７ Ｊａｎ（１）：１－２６中のものである。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤も存在し得る。
薬学的組成物は、好ましくはヒト起源の、例えば血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体をさらに含んでもよい。一実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥形態の結合分子を含み、好ましくは投与前に溶液または懸濁液中に再構成される。他の実施形態では、薬学的組成物は、結合分子を含み、液体の状態である。
本開示の薬学的組成物、および、任意で適切な賦形剤を調製した後、それらを適切な容器に入れ、指示された状態の処置のためにラベルを貼ることができる。このようなラベルは、例えば、投与量、投与頻度および投与方法を含む。
〔追加の活性物質〕
本開示はさらに、本発明の化合物と、１つまたはそれ以上のさらなる活性成分とを含む医薬または薬学的組成物を提供し、本明細書に記載の障害の治療および／または予防を含む。組み合わせに適した活性成分の好ましい例は、限定されるものではないが、以下が含まれる：
－脂質低下物質、特にＨＭＧ－ＣｏＡ（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａ）レダクターゼ阻害剤。ロバスタチン（メバコール）、シンバスタチン（ゾコール）、プラバスタチン（プラバコール）、フルバスタチン（レスコール）およびアトルバスタチン（リピトール）を含むがこれらに限定されない;
－冠動脈治療薬／血管拡張薬、特にＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害薬（カプトプリル、リシノプリル、エナラプリル、ラミプリル、シラザプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、キナプリルおよびペリンドプリルを含むがこれらに限定されない）、またはＡＩＩ（アンジオテンシンＩＩ）受容体アンタゴニスト（エンブサルタン、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、エプロサルタンおよびテミサルタンを含むがこれらに限定されない）、またはアドレナリン受容体アンタゴニスト（カルベジロール、アルプレノロール、ビソプロロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノールおよびチモロールを含むがこれらに限定されない）、またはα－１－アドレナリン受容体アンタゴニスト（プラゾシン、ブナゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシンおよびテラゾシンを含むが、これらに限定されない）、または利尿薬（ヒドロクロロチアジド、フロセミド、ブメタニド、ピレタニド、トラセミド、アミロリドおよびジヒドララジンを含むが、これらに限定されない）、またはカルシウム拮抗薬（ベラパミルおよびジルチアゼムを含むが、これらに限定されない）、またはジヒドロピリジン誘導体（ニフェジピン（アダラート）およびニトレンジピン（Ｂａｙｏｔｅｎｓｉｎ）を含むが、これらに限定されない）、またはニトロ調製物（イソソルバイド５－モノニトレート、イソソルビデジナイトレートおよびトリニトライト酸グリセロールを含むが、これらに限定されない）、または環状グアノシンモノリン酸（ｃＧＭＰ）の増加を引き起こす物質（リオシグアトを含むが、これらに限定されない、可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激物質を含むが、これらに限定されない）；
－プラスミノーゲン活性化因子（血栓溶解剤／フィブリン溶解剤）および血栓溶解／フィブリン溶解を促進する化合物（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ阻害剤）の阻害剤を含むが、これらに限定されない）、またはトロンビン活性化線溶阻害剤（ＴＡＦＩ阻害剤）（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼおよびウロキナーゼを含むが、これらに限定されない）；
－抗凝固物質（抗凝固物質）（ヘパリン（ＵＦＨ）、チンザパリン、セルトパリン、パルナパリン、ナドロパリン、アルデパリン、エノキサパリン、レビパリン、ダルテパリン、ダナパロイド、セムロパリン（（ＡＶＥ ５０２６）、アドミパリン（Ｍ１１８）およびＥＰ－４２６７５／ＯＲＧ４２６７５を含むが、これらに限定されない低分子量ヘパリン（ＬＭＷ）を含むが、これらに限定されない）；
－Ｐｒａｄａｘａ（ダビガトラン）、アテセガトラン（ＡＺＤ－０８３７）、ＤＰ－４０８８、ＳＳＲ－１８２２８９Ａ、アルガトロバン、ビバリルジンおよびタノギトラン（ＢＩＢＴ－９８６およびプロドラッグＢＩＢＴ－１０１１）、ヒルジンを含むがこれらに限定されない直接的トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）；
－リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン（ＤＵ－１７６ｂ）、ベトリキサバン（ＰＲＴ－５４０２１）、Ｒ－１６６３、ダレキサバン（ＹＭ－１５０）、オタミキサバン（ＦＸＶ６７３／ＲＰＲ－１３０６７３）、レタキサバン（ＴＡＫ－４４２）、ラザキサバン（ＤＰＣ－９０６）、および阻害剤ＤＸ－９０６５ａ、ＬＹ－５１７７１７、タノギトラン（ＢＩＢＴ－９８６、プロドラッグ：ＢＩＢＴ－１０１１）、イドラパリヌクスおよびフォンダパリヌクス、血小板凝集阻害物質（血小板凝集阻害剤、血小板凝集阻害剤）を含むが、これらに限定されない直接的Ｘａ因子阻害剤；
－アセチルサリチル酸（例えば、アスピリン）、チクロピジン（チクリッド）、クロピドグレル（プラビックス）、プラスグレル、チカグレロル、カングレロール、エリノグレル、ボラパキサルを含むがこれらに限定されない血小板凝集阻害物質（血小板凝集阻害剤）；
－フィブリノーゲン受容体拮抗薬（糖タンパク質－ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬）（アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、ラミフィバン、レフラダフィバンおよびフラダフィバンを含むが、これらに限定されない）；
－抗不整脈薬；
－計算された治療法（微生物診断の存在以前）または特異的治療法のいずれかとして、さまざまな抗生物質または抗真菌薬；
－昇圧剤（ノルエピネフリン、ドーパミンおよびバソプレシンを含むがこれらに限定されない）；
－筋収縮性の治療（ドブタミンを含むがこれに限定されない）；
－組換えヒト活性化プロテインＣ、例えばキシグリス；
－血液製剤（赤血球濃縮物、血小板濃縮物、ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｔｉｎおよび新鮮凍結血漿を含むがこれらに限定されない）；
－ＧＰＶＩおよび／またはＧＰＩｂアンタゴニストのような血小板接着の阻害剤（レバセプトまたはカプラシズマブを含むがこれらに限定されない）；
－ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ依存性シグナル伝達経路の阻害剤（ラニビズマブ、ベバシズマブ、ＫＨ－９０２、ペガプタニブ、ラムシルマブ、ＳｑｕａｌａｍｉｎｏｄｅｒＢｅｖａｓｉｒａｎｉｂ、アパチニブ、アキシチニブ、ブリバニブ、セディラニブ、ドビチニブ、レンバチニブ、リニファニブ、モテサニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、ＶａｒｇａｔｅｆまたはＥ－１００３０を含むがこれらに限定されない）；
－アンジオポイエチン－Ｔｉｅシグナル伝達経路の阻害剤（ＡＭＧ３８６を含むがこれらに限定されない）；
－Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤；
－ボロシキシマブ、シレンギチドまたはＡＬＧ１００１を含むインテグリン依存性シグナル伝達経路の阻害剤；
－ＰＩ３キナーゼ－ＡＫＴ－ｍＴｏｒ依存性シグナル伝達の阻害剤（ＸＬ－１４７、ペリホシン、ＭＫ２２０６、シロリムス、テムシロリムスまたはエベロリムスを含むがこれらに限定されない）；
－コルチコステロイド（ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、アネコルタベン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、フルオシノロンまたはフルオシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない）；
－ＡＬＫ１－Ｓｍａｄ１／５依存性シグナル伝達経路の阻害剤（ＡＣＥ０４１を含むがこれに限定されない）；
－シクロオキシゲナーゼの阻害剤（ブロムフェナクまたはネパフェナクを含むがこれらに限定されない）；
－カリクレイン－キニン系の阻害剤（Ｓａｆｏｔｉｂａｎｔまたはエカランチドを含むがこれらに限定されない）；
－Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔ依存性シグナル伝達経路の阻害剤（ソネプシズマブを含むがこれに限定されない）；
－Ｃ５ａ受容体の阻害剤（エクリズマブを含むがこれに限定されない）；
－５ＨＴ１ａ受容体阻害薬（タンドスピロンを含むがこれに限定されない）；
－Ｒａｆ－Ｍｅｋ－Ｅｒｋ依存性シグナル伝達経路の阻害剤、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達経路の阻害剤、内皮細胞増殖の阻害剤；およびアポトーシスを誘導することができる化合物；または、
－活性物質および光への暴露からなる光線力学的療法であって、活性物質は例えばベルテポルフィンである。
本開示の目的のための「組み合わせ」は、全ての構成要素を含有する剤形（いわゆるこていされた組み合わせ）、および、お互いに分離した構成要素を含有する組み合わせパックのみを意味するものではない。しかしながら、構成要素はまた、それらが同じ疾患の予防および／または治療のために使用されるならば、同時にまたは連続して投与される構成要素である。同様に、２つ以上の活性成分を互いに組み合わせることも可能であり、これは、それらがそれぞれ２成分または多成分の組み合わせであることを意味する。
〔投与〕
様々な経路が、本開示による薬学的組成物の投与に適用可能である。投与は、非経口的に達成され得る。非経口送達の方法には、例えば、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下または鼻腔内投与が含まれる。
非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本開示の薬学的組成物は水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝された生理食塩水などの生理学的に適合性の緩衝液中に製剤化され得る。水溶性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な親油性注射懸濁液として調製され得る。例示的な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。懸濁液はまた、任意に、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させ得る適切な安定剤または剤を含有し得る。局所または経鼻投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、製剤において使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において公知である。製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＥｄＭａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ，２０１２）の２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ内に見出すことができる。
〔治療〕
用語「治療する」または「治療」は、本明細書に記載される疾患の治療的または予防的処置を含む。「治療的または予防的処置」とは、臨床的および／または病理学的徴候の遅延もしくは完全な予防を目的とする予防的処置、または、臨床的および／または病理学的徴候の改善もしくは寛解を目的とする治療的処置を含む。従って、用語「治療」は、記載される疾患の改善または予防も含む。治療はまた、治療を行わない場合に期待される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味しうる。治療を必要とするものには、既に状態または障害を有するもの、状態または障害を有する傾向があるもの、または状態または障害が予防されるべきであるものが含まれる。
用語「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または処置（治療）が所望される任意の対象、好ましくは哺乳動物対象に言及するために、本明細書内で交換可能に使用される。哺乳動物の対象には、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜類、コンパニオン動物、動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ウシなどが含まれる。
本明細書内で使用される場合、「有益である」および「治療を必要とする」などの被験体に関する語句は、ヒト化モノクローナル抗体、その結合フラグメント、変異体、または誘導体の投与によって有益である被験体を含む。
〔投与量〕
結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の正確な投薬量（治療的有効量）は、公知の技術を使用して当業者によって確認され得る。適切な投薬量は、十分な量の結合分子を提供し、そして好ましくは治療的に有効である、すなわち、所望の治療効果または予防効果を引き出す。
当該分野で公知であるように、処置（例えば、予防、寛解維持、疾患の急性発症）、経路、治療の時間および頻度、治療製剤の時間および頻度、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、病態の重篤度、薬剤の組み合わせ、反応感度、治療に対する耐性／反応のために、決定および調節がなされることもある。適切な治療有効用量範囲は、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを用いて決定することができ、また、ＥＤ５０を含み得る。投薬量は、投与経路に依存して、０．１から１０００００μｇ、総用量約２ｇまで変動し得る。結合分子の例示的な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されている。治療は、本開示の結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の治療有効用量の単回投与または治療有効用量の複数回投与を必要とし得ることが認識される。例えば、いくつかの薬学的組成物は、製剤、半減期および製剤のクリアランス速度に応じて、単回、特定の時間周期で定期的に、３－４日毎に、毎週、または２週間毎に１回、１ヶ月以内に１回、２ヶ月以内に１回、投与され得る。適用可能な変数の各々の決定は、当業者に周知である。
〔キット〕
本開示はさらに、本開示の上記の薬学的組成物の１つまたはそれ以上の活性物質で満たされた１つまたはそれ以上の容器またはバイアルを含み、その使用説明書を伴う、医薬パックおよびキットに関する。従って、本明細書に記載の結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または薬学的組成物を含むキットもまた、本明細書に提供される。本明細書に記載される上記キットは本明細書に記載される疾患の処置のために、または他の目的のために使用され得る。
ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販売の代理店による承認を反映している、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知を、上記の容器に関連付けることができる。
キットは、１つまたはそれ以上の活性物質（任意選択で、１つまたはそれ以上の賦形剤を含む薬学的組成物として製剤化される）を含み得る。適切な活性物質は薬学的組成物の文脈において上記に列挙されており、本発明のキットの一部としても考えられる。追加の活性物質は、結合分子、核酸配列、ベクター、宿主細胞、および／または薬学的組成物に関して、患者に同時にまたは連続して投与することができる。本開示は、異なる経路、例えば、経口および静脈内を介する活性物質の投与をさらに包含する。
本開示の結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットが、本明細書においてさらに考えられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞へのトランスフェクションおよび宿主細胞による発現に適した、プラスミドなどのベクター中に提供され得る。このようなベクターおよび宿主細胞は、本明細書に記載される。
〔治療用途〕
本開示はさらに、ヒトおよび／または動物における疾患の治療および／または予防のための薬剤として使用するための、本発明の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
本開示はさらに、障害（例えば、心血管障害、好ましくは血栓性または血栓塞栓性障害および／または血栓性または血栓塞栓性合併症、および炎症状態、好ましくは自己免疫炎症または感染関連炎症応答）の処置および／または予防における使用のための、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
ＦＸＩａは、凝固の状況において、トロンビンおよびＦＸＩＩａの両方によって活性化され得、従って、凝固のプロセスに関与する酵素である。ＦＸＩは、凝固の開始から増幅および増殖への遷移の中心的な構成要素である。さらに、ＦＸＩａは、血管内の病理学的血液凝固の開始および維持のための構成要素である。血液の接触活性化システムは、負に帯電した血管内表面上で活性化され得、コラーゲンおよびラミニンを含む内皮下または血管外の物質への流動血液の露出、異物細胞（例えば、細菌）の表面構造の露出を含むだけでなく、人工血管、カテーテル、ステント、心室補助装置、バルブ、および人工肺、ポンプ、チューブ、透析器などの体外生命維持システムなどの人工表面も含む。表面では、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が活性化されて第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）となり、続いてＦＸＩＩａの表面に付着したＦＸＩが活性化される。ＦＸＩはまた、負に帯電した表面上で自己活性化され得る。このＦＸＩの活性化は、下流のトロンビン生成、ならびにＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびプレカリクレインを含む全ての接触活性化複合体酵素のフィードバック増幅をもたらす。
対照的に、止血トロンビン生成は、いずれも、接触活性化複合体の機能の薬理学的干渉によって有意に影響されない、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体およびトロンビンによるＦＸＩのフィードバック活性化によって駆動されるので、創傷を通って血管から脱する血中の血管外での止血トロンビン生成は、接触活性化の阻害による影響を受けないままである。接触システム不全の哺乳類において、明らかな出血傾向がなく、急性炎症の傾向が減少していることは、ＦＸＩと結合分子との間の複合体形成のインビボの効果を特徴づけ、ヒト（例えば、出血または炎症反応のリスクが増大した患者）で使用するための他の種類のＦＸＩ／ＦＸＩａ阻害剤または他のプロテアーゼ阻害剤に対して大きな優位性を有する。従って、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、とりわけ血栓形成および炎症をそれぞれ生じる、病理学的接触開始トロンビンおよびブラジキニン生成を含む、接触活性化複合体の酵素活性および非酵素活性から生じる可能性のある障害または合併症の治療および／または予防に使用するためのものである。
本開示の目的のために、「血栓性障害または血栓塞栓性障害」は、例えば、動脈および静脈血管系の両方で生じ、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントで処置され得る障害を含み、ならびに好ましくは、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）、ＳＴセグメント上昇を伴う心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）、ＳＴセグメント上昇を伴わない心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、ステント移植または大動脈冠動脈バイパスなどのような冠動脈インターベンション後の再閉塞および再狭窄のような心臓の冠状動脈における障害だけでなく、末梢動脈閉塞性障害、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症、静脈血栓症に至る、さらなる血管における血栓性または血栓塞栓性障害すなわち、下肢深部静脈および腎静脈、一過性脳虚血発作、ならびに血栓性脳卒中および血栓塞栓性脳卒中をも含む。
本開示の目的のために、「炎症性障害」は、全ての会合した接触系複合体（ＦＸＩＩ／ＦＸＩ／ＰＫ／ＨＫ）活性化がサポートするまたは媒介する病理学的事象；ＨＫ（ＨＭＷＫ）の過剰な切断と最も強力な既知の炎症誘発性ペプチド、ブラジキニンの生成、結果として起こる、または関連する病理学的血管拡張と血管透過性の増加、血圧調節異常、異物に対する免疫応答の増加、過剰な内因性自己免疫応答が含まれる；抗原抗体反応を伴う、それゆえに補体やプラスミノーゲンの活性化、および局所環境（細胞、器官）あるいは全身系のいずれかに影響を及ぼす結果として生じるその他の事象が含まれる；を含む。
接触システムの活性化は、様々な原因または関連する障害によって起こり得る。不動症、寝たきり状態、感染、炎症、癌、組織損傷および壊死、自己免疫、一時的または慢性的な異物埋め込み、および虚血に限定されないが、これらを含む外科的介入および他の組織外傷との関連では、とりわけ、接触システムは、血栓性および炎症性合併症を引き起こすように活性化され得る。従って、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、外科的介入との関連での血栓症および炎症の予防（例えば、消化管、肺、神経系、泌尿器、整形外科、および血栓形成および／または炎症と関連することが知られているか、関連する可能性があるような、他の主要な手術を受ける患者におけるもの）にて有用である。従って、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、活性化接触系を有する患者における血栓症の予防で使用するためのものである。
従って、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、静脈血栓塞栓症および心原性血栓塞栓症の治療および／または予防にも使用するためのものである（例えば脳虚血、脳卒中、ならびに全身的血栓塞栓症および虚血、例えば心房細動のような、急性、間欠的なまたは持続性の心不整脈を有する患者、電気的除細動を受けている患者、心臓弁障害のある患者や人工心臓弁を有する患者）。さらに、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、とりわけ敗血症（これに限定されないが、これを含む）に関連し得る、しかし、外科的介入、腫瘍性疾患、熱傷または他の損傷もまた原因で、微小血栓症が原因で重篤な臓器損傷に至ることもある、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の治療および／または予防に使用するためのものである。
血栓塞栓性および炎症性の合併症はさらに、微小血管症性溶血性貧血において、体外循環（例えば、心肺バイパス）、血液透析、体外膜型人工肺（ＥＣＭＯ）、左心室補助装置（ＬＶＡＤ）、および類似の方法、ＡＶフィステル、血管および心臓弁補綴物などの他の生命維持システムとの関連で、血液が異物表面と接触することによって生じる。
さらに、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、脳血管における微小凝血塊形成またはフィブリン沈着が関与し、脳血管性認知症またはアルツハイマー病などの認知症性障害を引き起こす可能性がある障害の治療および／または予防おいて使用するためのものである。ここで、凝血塊は、閉塞およびさらなる障害関連因子と結合することの両方を介して、障害の一因となる可能性がある。
さらに、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、血栓性合併症および／または血栓塞栓性合併症（例えば、主要な外科的介入または化学療法もしくは放射線療法を受ける患者を含む、癌患者における静脈血栓塞栓症）の予防および／または治療のために使用され得る。
本開示の文脈において、用語「肺高血圧症」は、肺動脈高血圧症、左心の障害と関連する肺高血圧症、肺障害と関連する肺高血圧症および／または慢性血栓塞栓症（ＣＴＥＰＨ）による低酸素症および肺高血圧症を含む。
さらに、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、全身性炎症、および、感染症、および／または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症性臓器機能不全、敗血症性臓器不全および多臓器不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症性ショックおよび／または敗血症性臓器不全との関連での播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療および／または予防に使用するためのものである。感染の過程で、症候性ＤＩＣ（消耗性凝固障害を伴う場合と伴わない場合がある）を引き起こし、様々な臓器における（微小）血栓症および二次的な出血性合併症を伴う、接触系と凝固系の全身的な活性化が起こることがある。さらに、血管の透過性の増加、および血管外空間への流体およびタンパク質の拡散を伴う内皮損傷が存在し得る。感染症が進行すると、臓器不全（腎不全、肝不全、呼吸不全、中枢神経障害、心血管不全など）や多臓器不全が生じる。ＤＩＣの場合、損傷した内皮細胞の表面、異物の表面、またはクロスリンクした血管外組織において、凝固系の大規模な活性化が存在する。その結果、低酸素症およびそれに続く臓器機能不全を伴う様々な臓器の小血管における凝固が存在する。二次的効果は、凝固因子（消耗性凝固障害）、例えば、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ならびにフィブリノーゲン（ＦＩ）および血小板の消耗である。それらは血液のホメオスタシスバランスの制御を低下させ、重篤な、さらには致死的な出血をもたらすことがある。
本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、血栓性または血栓塞栓性障害および／または炎症性障害、および／または患者において血管透過性の増加を伴う疾患（遺伝子突然変異が酵素の活性の増強、またはチモーゲンのレベルの増加をもたらし、そして、これらは、適切な酵素活性またはチモーゲン濃度の試験／測定によって確立される）の一次予防に使用するためのものである。
さらに、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、エクスビボでの凝固を防止するために使用され得る。例えば、凝血塊の形成による臓器障害に対する移植臓器の保護、移植臓器からレシピエントの血栓塞栓を防ぐため、血液および血漿製剤を保存するため、カテーテルおよび他の医療補助具および器具を洗浄／前処置するため、インビボまたはエクスビボで使用される医療補助具および器具の合成表面を被覆するため、または、ＦＸＩ／ＦＸＩａを含み得る生物学的サンプルのためである。
本開示はさらに、障害、特に上記の障害の治療および／または予防のための、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
本開示はさらに、特に本明細書に記載される障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、好ましくは血栓性障害または血栓塞栓性障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
本開示はさらに、本開示の結合分子（好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメント）の治療的有効量を使用する、障害、特に本明細書に記載の障害の治療および／または予防のための方法を提供する。
本開示はさらに、治療的有効量の本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを使用する、障害、特に本明細書に記載の障害の治療および／または予防のための、本開示の結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
本開示はさらに、治療的有効量の本開示の少なくとも１つの結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメント、または本開示の薬学的組成物の治療的有効量の投与による、ヒトおよび／または動物における血栓性障害または血栓塞栓性障害の治療方法を提供する。本開示はさらに、治療的有効量の本開示の少なくとも１つの結合分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメント、または本開示の薬学的組成物である、本開示の少なくとも１つの結合分子の治療的有効量の投与による、対象における血液凝固、血小板凝集および／または血栓症を阻害する方法を提供する。
〔遺伝子治療〕
本明細書内にさらに提供されるのは、本明細書内に開示されるようなポリヌクレオチドを含む、哺乳動物の遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクター、および、本明細書に記載される外因性核酸を、当該外因性核酸が発現され、疾患が予防または治療されるように、それを必要とする哺乳動物患者の細胞に組み込むことを含む、疾患を治療または予防する方法である。１つの実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子は、患者に投与される。好ましい実施形態において、核酸分子はＢ細胞の染色体に安定に組み込まれるように投与される。これらの細胞が抗体を産生するために特殊化されているためである。１つの実施形態において、前駆体Ｂ細胞は、トランスフェクトまたはエクスビボにて感染され、それを必要とする患者に再移植される。他の実施形態において、前駆体Ｂ細胞または他の細胞は、目的の細胞型に感染することが知られている組換えウイルスを使用して、インビボにて感染される。
好ましい実施形態において、遺伝子治療方法は、本明細書内に開示される抗ＦＸＩ抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および核酸分子を発現させる工程を包含する。他の好ましい実施形態において、遺伝子治療方法は、本明細書内に開示される抗ＦＸＩ抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および核酸分子を発現させる工程を包含する。他の実施形態において、遺伝子治療方法は、重鎖またはその抗原結合性部分をコードする単離された核酸分子、および本明細書内に開示される抗ＦＸＩ抗体の軽鎖またはその抗原結合性部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および核酸分子を発現させる工程を包含する。
外因性核酸の取り込みのための特定の条件は、当該分野で周知である。これらは、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、プラスミドによる形質転換、外因性核酸を含有するリポソームを用いた形質転換、バイオリスティック核酸送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、すなわち、核酸を金または他の金属粒子上に装填し、細胞中にシューティングまたは注入すること）、アデノ随伴ウイルス感染およびエプスタイン－バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）感染を含むがこれに限定されない。これらは全て、本開示の目的のための「発現ベクター」と考え得る。発現ベクターは、染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。一般に、これらの発現ベクターは、外因性核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸を含む。一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーターならびに転写開始配列および転写停止配列を含む。さらに、発現ベクターは、さらなる要素を含み得る。例えば、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列、および好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みベクターは、ベクターに組み込むための適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞内の特定の遺伝子座に方向付けられ得る。ベクターを組み込むための構築物は、当該分野で周知である。
［実験］
マウス１４Ｅ１１抗ＦＸＩ抗体から出発して、新規ヒト化抗体を作製した。候補抗体を、競合ＥＬＩＳＡによって決定されるそれらのＦＸＩ結合活性、およびＦＸＩのその活性型への変換を阻害するそれらの能力によって試験した。典型的な抗体であるＡＢ０２３の特性が決定された。ＣＤＲ移植による１４Ｅ１１のヒト化後、結合特性および抗凝固特性が維持され、同等であることを確認するために、ＡＢ０２３を用いて試験を行った。インビトロ結合試験では、ＡＢ０２３が、マウスおよびヒトＦＸＩの両方に高い親和性（それぞれ０．１６ｎＭおよび３．２ｎＭ）で結合することを示したが、マウスモノクローナル抗体１４Ｅ１１よりも低い親和性であった。インビトロａＰＴＴアッセイにより、抗凝固作用はＡＢ０２３としてヒト化後も維持され、ヒト、ヒヒ、カニクイザルおよびラット血漿中のａＰＴＴが濃度依存的に延長することが確認された。
興味深いことに、１４Ｅ１１とＡＢ０２３との間の幾つかの違いが、いくつかのインビトロアッセイで認められた。第１に、ＡＢ０２３は、濃度依存的に、硫酸デキストランおよびＤＮＡの両方の存在下でＦＸＩ自己活性化を阻害することができたが、１４Ｅ１１は、試験した全ての濃度では阻害することができなかった。第２に、ＡＢ０２３は、１４Ｅ１１とは対照的に、濃度依存的にＦＸＩａによるＦＸＩＩの活性化を阻害した。最後に、ＡＢ０２３は、ＨＫおよび硫酸デキストランの存在下で、ヒトＦＸＩＩａのヒトＦＸＩ活性化を阻害するのにより有効であった。
１４Ｅ１１で見られた抗血栓作用（Ｃｈｅｎｇ Ｑ、Ｔｕｃｋｅｒ ＥＩ、Ｐｉｎｅ ＭＳ、Ｓｉｓｌｅｒ Ｉ、Ｍａｔａｆｏｎｏｖ Ａ、Ｓｕｎ ＭＦ、Ｗｈｉｔｅ－Ａｄａｍｓ ＴＣ、Ｓｍｉｔｈ ＳＡ、Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ、ＭｃＣａｒｔｙ ＯＪ、Ｒｅｎｎｅ Ｔ、Ｇｒｕｂｅｒ Ａ、Ｇａｉｌａｎｉ ＤＢｌｏｏｄ。２０１０ Ｎｏｖ １１；１１６（１９）：３９８１－３９８９；Ｔｕｃｋｅｒ ＥＩ、Ｖｅｒｂｏｕｔ ＮＧ、Ｌｅｕｎｇ ＰＹ、Ｈｕｒｓｔ Ｓ、ＭｃＣａｒｔｙ ＯＪ、Ｇａｉｌａｎｉ Ｄ、Ｇｒｕｂｅｒ ＡＢｌｏｏｄ．。２０１２ Ｍａｙ １７；１１９（２０）：４７６２－８；）は、動脈血栓症のマウスモデルおよび動脈・静脈血栓症のヒヒモデルのいずれにおいても、ヒト化（ＡＢ０２３）後も維持された。動脈血栓症のマウスモデルにおいて、ＡＢ０２３は、総ＦＸＩ欠損症と同等であるＦｅＣｌ３誘発性頚動脈閉塞を予防したが、この効果は、同じ投与でマウスモノクローナル抗体（１４Ｅ１１）によって産生される効果ほど大きくはなかった。血栓形成移植片（thrombogenic graft）プラス拡張チャンバーを用いて動脈型および静脈型の流量をそれぞれ模倣する、十分に確立されたヒヒ血栓症モデルにおいて、低用量のＡＢ０２３（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の投与は対照と比較して血管移植内の血小板蓄積率をわずかに低下させたが、拡張チャンバー内では血小板蓄積のほぼ完全な阻害が達成された。フィブリン沈着も、動脈型、静脈型血栓症ともに低かった。興味深いことに、拡張チャンバーなしの血栓形成移植（thrombogenic graft）を使用すると、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３（静脈内）は、血管移植片セグメント自体の内部の血小板およびフィブリン沈着の両方を減少させ、また、下流の血栓「尾」の形成を阻止し、これにより、ＡＢ０２３はそのマウス前駆体である１４Ｅ１１と同様に、試験した全ての用量で静脈型血栓症を予防したことが実証された。さらに、本研究は、コラーゲン被覆血栓形成移植片（thrombogenic graft）における血小板およびフィブリンの減少によって証明されるように、ＡＢ０２３もより高用量で動脈型血栓症を減少させるようであったことを示唆している。
ＡＢ０２３の抗炎症作用を、敗血症ヒヒモデルで試験した。また、１４Ｅ１１としては、以前にマウスにおける感染モデルを試験した（Ｓｉｌａｓｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｂａｂｏｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓ ａｕｒｅｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｒｇａｎ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０１９ ３：６５８－６６９，データは示さず；Ｔｕｃｋｅｒ ＥＩ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ ｗｈｉｌｅ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｍａｙ １７；１１９（２０）：４７６２－８）。ＡＢ０２３と１４Ｅ１１との活性を比較するために用いた全ての試験は、効果の等価性を示した。また、ＡＢ０２３の抗凝固作用は健常人を対象に評価され（Ｌｏｒｅｎｔｚ ＣＵ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ Ａｎｔｉｂｏｄy， ＡＢ０２３， Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ｓａｆｅ， Ｄｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｆｉｒｓｔ－Ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｔｒｉａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２０１９ Ａｐｒ；３９（４）：７９９－８０９）、データ（示さず）から、ＡＢ０２３ は安全であり、用量依存的な抗凝固作用を示すことが示された。
ＡＢ０２３の潜在的な交差反応性を、健康なヒト組織の凍結切片を用いて評価したが、いずれも見出されなかった。
総合すると、ＡＢ０２３について実施された試験は、ＡＢ０２３の抗凝固特性および抗血栓特性を実証している。追加試験では、止血障害のリスクが低く、交差反応性およびオフターゲット効果の確率が低く、免疫活性化および免疫原性の確率が低く、神経毒性および心毒性作用の確率が低いことが実証された（データは示さず）。
＜マウス抗体１４Ｅ１１の特性評価＞
本明細書内で引用される１４Ｅ１１特許および他の刊行物に記載されるように、実施された試験にて、モノクローナル、マウス、抗ＦＸＩ抗体、１４Ｅ１１の結合特性および抗凝固特性を決定した。簡潔には、結合特性および抗凝固特性をインビトロで試験した。結果は、１４Ｅ１１がａＰＴＴアッセイにおいてマウス（白丸）またはヒト（黒丸）血漿のａＰＴＴを延長し（図１）、２５－５０ｎＭで最大阻害を示した。これはヒト血漿中のＦＸＩ濃度（２０－４５ｎＭ）の範囲内である。凝固時間の延長は、ＦＸＩ欠損ヒトおよびマウス血漿の約半分であった。１４Ｅ１１は、ヒト血漿のプロトロンビン時間に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
１４Ｅ１１は、正常マウスおよびヒト血漿、ならびに組換えマウスＦＸＩ（図２Ａ－Ｃ）血漿におけるＦＸＩホモ二量体（～１６０ｋＤａ）の予想されるサイズである単一のバンドに結合し、認識することが見出されたが、ＦＸＩ欠乏血漿では結合は見られなかった。固相結合アッセイにおいて、マウスおよびヒトＦＸＩ、ならびにヒトＦＸＩａに対する１４Ｅ１１の結合親和性を決定した（見かけのＫｄ～２－３ｐＭ、図２Ｄ）。ほとんどの哺乳動物において、ＦＸＩは２つの８０ｋＤａサブユニットのホモ二量体であり、各々は、４つのアップルドメイン（Ａ１－Ａ４）およびプロテアーゼドメインを含む。ＦＸＩの単量体ホモログであるプレカリクレイン（ＰＫ）は、ＦＸＩ単量体と略同一の構造を有する。ヒトＦＸＩ／ＰＫキメラを用いて、Ａ２ドメインが、１４Ｅ１１のＦＸＩへの結合に必要であることを示した（図２Ｅ）。ｔ－ＰＡに連結された個々のＦＸＩアップルドメインを用いるウェスタンブロットは、１４Ｅ１１結合部位がおそらく完全にＡ２ドメイン内に位置することを示す（図２Ｆ）。
示されるように、マウスモノクローナル抗体１４Ｅ１１は、ヒトおよびマウスＦＸＩのアップル２（Ａ２）ドメインに結合し、ＦＸＩＩａおよび下流のトロンビン生成ならびにＦＸＩ自己活性化によるＦＸＩの活性化を阻害する。１４Ｅ１１は多くの異なる種のＦＸＩに結合し、マウス、ヒト、ヒヒ、ウサギ、ラット、ブタ、アカゲザルの血漿中のａＰＴＴを延長させることができる（データは示さず）。
＜マウス抗体１４Ｅ１１のヒト化＞
マウスモノクローナル抗体１４Ｅ１１のヒト化を、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植技術（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｓ． ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ Ｔ．２００１ Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｉｎ：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ、Ｄｕｂｅｌ Ｓ．（Ｅｄｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐｐ．５６７－５９０．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を使用して、Ａｂｚｅｎａ（別名Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＧＢ）で行った。詳細には、生殖細胞系列アクセプターファミリーサブセットの選択のために、マウス抗体のＣＤＲ残基を決定し、Ｋａｂａｔ付番システムに従って注釈を付けた（詳細についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍ）を参照）。抗体ヒト化に対するＣＤＲ相同性に基づくアプローチにおいて、ヒト生殖細胞系列遺伝子を使用して、重鎖および軽鎖ＣＤＲの標準的構造を決定し、同じ標準的構造を有するヒト生殖細胞系列フレームワークアクセプターを選択した（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００１；Ｈｗａｎｇ，２００５）。同じ標準構造を有するヒト生殖細胞系フレームワークアクセプターを選択した。
１４Ｅ１１可変（Ｖ）領域遺伝子を、１４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株から単離されたＲＮＡから配列決定し、これらの配列を使用してキメラ抗体を生成し、一連の生殖細胞系列ヒト化抗体の変異体を設計した。Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを用いて１４Ｅ１１可変ドメインおよびヒトＩｇＧ４およびκ軽鎖からなるキメラ抗体のインシリコ構造モデルを作製することによって、抗体の結合特性を支持し得る１４Ｅ１１の可変領域フレームワーク中のアミノ酸を同定し、１つまたはそれ以上のＣＤＲ移植変異体への組み込みについて留意した。ヒト化Ｖ領域遺伝子はマウス配列に最も近い相同性のあるヒト生殖細胞系配列に基づいて設計し、遺伝子合成によって構築した。次に、ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）変異体を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＭｌｕ Ｉを用いた改変Ｓ２４１Ｐヒンジ領域を用いて、ヒトＩｇＧ４重鎖共通領域（ＣＨ）１－３を含む第１ベクターにクローニングした。ヒト化された軽鎖可変領域変異体（Ｖκ）を、制限酵素ＢｓｓＨ ＩおよびＢａｍＨ Ｉを用いて、ヒトカッパ共通領域（Ｃκ）を含む第２ベクターにクローニングした。キメラ抗体も、マウス可変領域を同じベクターにクローニングすることにより作製した。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、ＮＳ０細胞において安定に発現され、１４Ｅ１１と比較する競合ＥＬＩＳＡにおける標的抗原（組換えヒトＦＸＩ）への結合について試験された（データは示さず）。さらに、ヒト化抗体の抗凝固特性を、ａＰＴＴアッセイを用いて試験した（図３）。これらのアッセイの結果は、好ましい抗体候補である変異体ＶＨ３／Ｖκ３（クローン３Ｇ３）、ＡＢ０２３を明らかにし、複合ＣＨＯＴＭテクノロジーを用いて、安定な製造細胞株をＡｂｚｅｎａで作製した。
安定な細胞株由来の細胞は、製造バイオリアクターに播種するために使用され得る。例えば、細胞は、バッチ供給プロセスを使用して培養され得、例えば、１４日目に回収され得る。次に、細胞は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム工程、ウイルスクリアランス工程によって精製され得、そして濃縮され、そしてダイアフィルトレーションされ得る。緩衝液中での最終処方の後、抗体、すなわちＡＢ０２３は、濾過され、凍結乾燥産物として凍結保存され得る（例えば、再構成後１５ｍｇ／ｍＬ）が、必須ではない。
＜ＡＢ０２３の特性＞
ＡＢ０２３を、種々の分析方法を用いて特徴付けた。これらの方法を用いて、タンパク質の一次構造、部分的立体配座構造、結合および翻訳後修飾を理解した。使用した分析は、ペプチドマッピング、質量分析（ＭＳ）、チップベースのキャピラリー電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、サイズ排除（ＳＥＣ）クロマトグラフィー、オリゴ糖マッピング、蛍光、円偏光二色性（ＣＤ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）であり、それぞれ、当技術分野で周知である。
構造および翻訳後修飾を検証するために、ＡＢ０２３、１４６，５６０Ｄａの分子量をＭＳによって決定し、分子の無傷性を立証した。分子中のジスルフィド結合を還元した後、重鎖および軽鎖の分子量（それぞれ４９，８９０Ｄａおよび２３，４０１Ｄａ）を決定した。理論分子量（１４４，０２０Ｄａ）と比較した差異は、翻訳後修飾、特にグリコシル化に起因する。
〔結合親和性〕
ヒトおよびマウス凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）に対するヒト化モノクローナル抗体ＡＢ０２３の結合親和性を、固相結合アッセイを用いて決定した。さらに、ＡＢ０２３および１４Ｅ１１の両方への、活性化ヒトＦＸＩ（ＦＸＩａ）に対するＡＢ０２３の結合親和性を評価した。簡潔には、この固相結合アッセイのために、１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の両方を、使用説明書に従ってＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してビオチン化した。マイクロタイタープレートを、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中のＦＸＩまたはＦＸＩａ（２μｇ／ｍｌ，１００μＬ／ウェル）で被覆し、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、２％ＢＳＡを含む１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．２、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ［ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水］）中の、１００マイクロリットルのビオチン化１４Ｅ１１またはＡＢ０２３（０．７ｐｍｏｌ／Ｌから６．７μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、室温で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄した後、１００μＬのストレプトアビジン－西洋ワサビ－ペルオキシダーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＨＢＳ中１：８０００希釈）を添加し、室温で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、１００μＬの基質液（１２ｍＬの３０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸；１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５．０；および１ ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリド錠剤、１２μＬの３０％Ｈ２Ｏ２）を添加した。反応は５０μＬ ２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で１０分後に停止した。４９５ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ ３４０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定した。データを非線形回帰解析により分析し、そして見かけのＫｄ（平衡解離定数）を、平衡で最大半量結合（ｈａｌｆ－ｍａｘ ｂｉｎｄｉｎｇ）を達成するのに必要なＡＢ０２３の濃度として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．５．０）を用いて計算した。
この固相結合アッセイを用いて、マウスおよびヒトＦＸＩに対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の結合親和性を決定した。１４Ｅ１１は、より低い親和性（以前に決定されたように）でマウスＦＸＩに結合した（～２－３ｐＭと比較して見かけのＫｄ～０．０７ｎＭ）。１４Ｅ１１はまた、ヒトＦＸＩおよびヒトＦＸＩａに対する結合親和性が、マウスＦＸＩに対する結合親和性よりも低いことを示した（それぞれ、見かけのＫｄ～０．３９ｎＭおよび０．２０ｎＭ）（表１）。ＡＢ０２３はまた、ヒトおよびマウスＦＸＩの両方に対する結合親和性は１４Ｅ１１よりも低かったが、マウスおよびヒトＦＸＩに対するナノモル親和性結合を示した（ｍＦＸＩに対する見かけのＫｄ－０．１６ｎＭ、ｈＦＸＩに対する見かけのＫｄ～３．２ｎＭ、およびｈＦＸＩａに対する見かけのＫｄ～１．３ｎＭ）（図４Ｃ、表１）。総合すると、これらの結果は、１４Ｅ１１抗体のヒト化後、同じドメインへの高い親和性結合が維持されたことを裏付ける。
Figure 2022523007000001
〔Ａ２ドメイン結合確認〕
ＡＢ０２３がＦＸＩのアップル２（Ａ２）ドメインに結合することを確認するために、標準的な技術を用いてイムノブロットを行った（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。図４Ａは、組換えヒトＦＸＩ（レーン１）およびヒトＦＸＩの免疫ブロットを示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４ドメインがプレカリクレイン（ＰＫ）由来の対応するドメインによって置換され、電気泳動によって分離され、ＡＢ０２３で免疫ブロットされ、そして、ＡＢ０２３は１４Ｅ１１と同様に、ＦＸＩのアップル２（Ａ２）ドメインに結合することを立証する。ＦＸＩ由来の個々のアップルドメインを組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）に融合させた融合タンパク質も作製した。次に、融合タンパク質を電気泳動によって分離し、ＡＢ０２３で免疫ブロットした。図４Ｂは、ＡＢ０２３がＦＸＩのＡ２ドメインに結合することを示す。
〔ＦＸＩＩａのＦＸＩの活性化抑制〕
１４Ｅ１１のヒト化後にＦＸＩのＦＸＩＩａ活性化を阻害する能力がＡＢ０２３によって維持されることを立証するために、インビトロアッセイを行った。簡潔には、ＦＸＩ（３０ｎｍｏｌ／Ｌ）を、０．５ｎｍｏｌ／Ｌのα－ＦＸＩＩａおよび硫酸デキストラン（０．１μｇ／ｍＬ）と共に、２５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および０．１％のＢＳＡ中、３７℃で、ＡＢ０２３（０ｎｍｏｌ／Ｌから３００ｎｍｏｌ／Ｌ）の存在下または非存在下でインキュベートした。３０分のインキュベーション後、サンプルを取り出し、そしてポリブレン（６μｇ／ｍＬ）でクエンチし、デキストラン硫酸およびＣＴＩ（５０μｇ／ｍＬ）を中和して、ＦＸＩＩａを不活性化した。その後、４０５ｎｍでのＳ－２３６６加水分解の速度を測定することによって、ＦＸＩａの生成を定量した。Ｓ－２３６６加水分解の速度を、標準曲線を用いてＦＸＩａ濃度に変換した。図４Ｄは、ＡＢ０２３がＦＸＩのＦＸＩＩａ活性化を濃度依存的に阻害することを示す。１４Ｅ１１と同様に、ＡＢ０２３は、ＦＸＩのトロンビン接触活性化を阻害しない（図４Ｅ）。これを決定するために、ＦＸＩ（３０ｎＭ）を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ中、ＡＢ０２３（３００ｎＭ）の存在下または非存在下で、３７℃で２．５ｎＭ α－トロンビンおよび硫酸デキストラン（０．１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートする、インビトロアッセイを行った。０、５、１５、３０、または６０分間のインキュベーション後、サンプルを取り出し、ポリブレン（６μｇ／ｍＬ）でクエンチし、硫酸デキストランおよびヒルジン（１０ Ｕ／ｍＬ）を中和してトロンビンを不活性化した。その後、４０５ｎｍでのＳ－２３６６加水分解の速度を測定することによって、ＦＸＩａの生成を定量した。Ｓ－２３６６加水分解の速度を、標準曲線を用いてＦＸＩａ濃度に変換した。
〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長する〕
ＡＢ０２３の、いくつかの哺乳類血漿中のａＰＴＴを延長する能力を試験した。０．３８％クエン酸ナトリウムで抗凝固処置したヒト、ヒヒ、ラット、およびカニクイザル（９０μＬ、３人の個々の被験者から）からのプールした血漿を、１０μＬのＡＢ０２３（０．１８３－１５００μｇ／ｍＬ）または対照（ＰＢＳ）と混合した。そして、室温で５分間インキュベートした。次に、４０マイクロリットルの血漿／抗体混合物を、４０μＬのａＰＴＴ試薬（ＳｙｎｔｈＡＳｉｌ，＃００２０００６８００，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）と共に３７℃で３分間インキュベートした。インキュベート後、４０μＬのＣａＣｌ２を添加し、ＫＣ４（登録商標）分析器（ＴＣｏａｇ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で凝固までの時間を測定した。各サンプルを二重にアッセイした。試験した各種について、ＡＢ０２３は、試験した全ての種において濃度依存的にａＰＴＴを延長した（図４Ｆ）。ＡＰＴＴデータがベースラインの倍数変化として表され、再度、ＡＢ０２３のｌｏｇ１０濃度をプロットした。
総合すると、これらのデータは、１４Ｅ１１の特性がヒト化後に維持されたことを実証する。
＜抗凝固複合体形成＞
これらの実験は、複合体が、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を使用して、モノクローナル抗体またはその任意の結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体と、抗凝固剤であるＦＸＩとの間で形成されるものであるかどうかを調べた。他の実施例（図４）において、ＦＸＩは、高い親和性抗ＦＸＩ Ａ２ドメイン抗体であるＡＢ０２３と安定な免疫複合体を即時に形成することが十分に確立されている。ここで、ＦＸＩ欠損ヒト対象（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＫＳ）由来のＦＸＩ欠乏血漿を使用する２つの別々の実験を行い、その結果を図５に示す。
最初の実験では、ベースラインのａＰＴＴをＦＸＩ欠乏血漿で測定した。４０マイクロリットルの血漿を４０μＬのａＰＴＴ試薬（ＳｙｎｔｈＡＳｉｌ，＃００２０００６８００，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に３７℃で３分間インキュベートした。インキュベート後、４０μＬのＣａＣｌ２を添加し、ＫＣ４（登録商標）分析器（ＴＣｏａｇ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で凝固までの時間を測定した。各サンプルを８回アッセイした。ＦＸＩ欠乏血漿のベースラインの平均ａＰＴＴは１１８．５秒であった。ベースライン測定後、ＦＸＩ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＨＣＦＸＩ－１１１１）を、４００μＬのＦＸＩ欠乏血漿に１０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。ＦＸＩ／ＦＸＩ欠乏血漿を室温で５分間インキュベートし、上記のように、２００μＬの混合物についてａＰＴＴを測定した。図５は、ＦＸＩが凝血促進酵素ＦＸＩａのチモーゲンであるので、ＦＸＩ欠乏血漿への精製ＦＸＩ（ＭＷ １６０ｋＤ）の添加が、予想通り、凝固時間を３２．３秒に減少させることを示す。最後に、残りの２００μＬのＦＸＩ欠乏血漿＋１０μｇ／ｍＬのＦＸＩに、ＡＢ０２３を１００μｇ／ｍＬの最終濃度（１０×過剰量の抗体）で添加した。この混合物を室温で５分間インキュベートし、上記のようにａＰＴＴを測定した。添加されたＦＸＩの１０倍モル過剰量の抗体ＡＢ０２３（ＭＷ １４６ｋＤ）のＦＸＩ欠乏血漿への添加は、ａＰＴＴを平均６６．６秒まで約２倍延長し、ＡＢ０２３濃度がＦＸＩと比較して過剰であったインビトロ（図４）およびインビボ（表２）実験と一致した。ＦＸＩを含む正常血漿へのＡＢ０２３を添加では、ＦＸＩ欠乏血漿で観察されるのと同程度のａＰＴＴの延長は認められなかった。これは、ａＰＴＴアッセイにおいて生成されるＦＸＩａの凝血促進活性がＡＢ０２３によって阻害されないためであると考えられる（図４Ｅ）。
第２の実験では、ＡＢ０２３を４００μＬのＦＸＩ欠乏血漿に１００μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、室温で５分間インキュベートし、上記のように２００μＬの混合物についてａＰＴＴを測定した。ＡＢ０２３の添加の結果、凝固時間に変化はなく（ＦＸＩ欠乏血漿の平均ａＰＴＴが１１８．５秒であるのに対し、平均ａＰＴＴは１１７．７秒）、ＡＢ０２３のみではＦＸＩと複合体を形成せず、抗凝固作用を示さないことが明らかになった。最後に、ＦＸＩを、ＦＸＩ欠乏血漿／ＡＢ０２３（１００μｇ／ｍＬ）混合物に、１０μｇ／ｍＬの最終ＦＸＩ濃度（全てのＦＸＩが免疫複合体になることを確実にするために、ＦＸＩに対する抗体の１０倍過剰量）で添加した。混合物を室温で５分間インキュベートし、上記のようにａＰＴＴを測定した。ＦＸＩの添加は、ａＰＴＴを平均１１７．７秒から５９．１秒に減少させた（図５）。
これらの実験から、１）ＦＸＩ欠乏血漿へのＦＸＩを添加は、凝血促進作用を示す、２）ＡＢ０２３単独では抗凝血作用を示さない、３）ＦＸＩとＡＢ０２３との間に形成される免疫複合体は抗凝血作用を示すが、ＦＸＩ欠損症による同等の抗凝血作用は生じない、ことが示された。
＜ＡＢ０２３の抗凝固作用の特徴＞
〔マウス動脈血栓症モデル〕
実験的動脈血栓症の十分に確立されたマウスモデルを使用して、ＡＢ０２３の抗血栓特性を、１４Ｅ１１について以前に行われたように決定した（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。簡潔には、マウスを５０ｍｇ／ｋｇのＩＰペントバルビタールで麻酔した。右総頸動脈を露出させ、ドップラーフロープローブを取り付けた。ＡＢ０２３（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を内頚静脈に１５分注入した後、損傷を与え、ＦｅＣｌ３（２．５％－１０％溶液）で飽和した２枚の１×１．５ｍｍ濾紙を動脈の両側に３分間適用することによって血栓形成を誘導した。パッドを除去した後、その領域をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、流量を３０分間モニターした。
野生型マウスへの１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３の静脈内注入は、３．５％、５．０％および７．５％のＦｅＣｌ３によって誘導される頸動脈閉塞からマウスを保護した（図６）。これらの結果は、ＦＸＩ－／－マウスからの結果と同等である。この結果はこの血栓症モデルにおいてＦＸＩＩａによりＦＸＩが活性化されるという前提と一致しており、マウスにおいても、１４Ｅ１１抗体のヒト化後に抗血栓作用が維持されたことを実証している。
〔ヒヒモデルにおけるＰＫ／ＰＤ〕
この実験では、ＡＢ０２３の血漿濃度を経時的に評価し、ａＰＴＴへのＡＢ０２３暴露の相関関係を示した。６匹の雄ヒヒに、１日目に１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３を単回静脈内ボーラス注射または単回皮下注射により投与した。投与後、いくつかの時点で採血し、０．３２％クエン酸ナトリウム（１／１０体積）で抗凝固処置を行った。１つのアリコートを使用して血漿ＡＢ０２３濃度を決定し、別のアリコートを使用してａＰＴＴ測定を行った。ａＰＴＴを測定するために、血漿（４０μＬ）を４０μＬのａＰＴＴ試薬と共に３７℃で３分間インキュベートした。３７℃で３分間インキュベートした後、４０μＬのＣａＣｌ２を添加し、ＫＣ４ Ｄｅｌｔａ（登録商標）分析器（Ｔｃｏａｇ Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｌｔｄ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で凝固までの時間を測定した。血漿中の遊離ＡＢ０２３を検出するために、部分的にバリデートされた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて血漿中ＡＢ０２３濃度を測定した。
結果は、ａＰＴＴの迅速かつ即時的な延長を示し、全動物で、少なくとも１週間（１６８ｈ）のａＰＴＴのベースラインよりも約２倍高い延長を示した。図７は、ＡＢ０２３血漿濃度とａＰＴＴとの関係を示す。同様に、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３投与ＳＣも、ａＰＴＴの迅速かつ即時の延長をもたらした。しかしながら、ＳＣ投与後、ａＰＴＴは少なくとも２週間（３３６時間）、ベースラインの約２倍延長したままであった（示さず）。これらの試験は、ａＰＴＴ延長がＡＢ０２３暴露により厳密に追跡されることを示している。
〔ヒヒの動脈および静脈型血栓症モデルにおける予防的治療〕
これらの研究は、実験的動脈および静脈型血栓症の十分に確立された霊長類モデルにおいて、ヒト化モノクローナル抗体ＡＢ０２３を用いて、ＦＸＩＩａによるＦＸＩ活性化を阻害する抗血栓作用を明らかにした。
体重９－１３ｋｇの幼若雄ヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）を用いて、ノンターミナル（Non-terminal）試験を行った。全ての試験は、施設内動物実験委員会の承認を受けた。各ヒヒは、他で説明したように（Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ，Ｈａｒｋｅｒ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３ Ｏｃｔ；９２（４）：２００３－１２）、治癒した、外科的に設置された、大腿部の動脈と静脈を結ぶ、慢性の動脈静脈（ＡＶ）シャントを持っていた。実験は、座位で拘束された非抗凝固性覚醒動物で実施された。不安は、２ｍｇ／ｋｇを超えない低用量のケタミンを１時間に１回まで筋肉内投与することで管理した。実験的処置を投与し、実験中、ＡＶシャントに組み込まれたシリコンゴム延長チューブから血液サンプルを採取した。実験前後を含め、各動物の赤血球数とヘマトクリット値を毎日測定し、算出した失血は、いずれの実験日においても総血液量の４％を超えなかった。処置の有無にかかわらず、別々の日に同じ動物で複数の実験を行った。反復実験では、良好な無制限のベースライン流量（＞２５０ｍＬ／分）を有するシャントを有する動物のみを使用した。
この実験的血栓症モデルにおいて、急性局所血栓症は、以前に記載されているように、
ＡＶシャント内への短時間介入された人工改変血栓形成移植片セグメント（prosthetic modified thrombogenic graft segment）により開始した（Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ，Ｈａｒｋｅｒ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓＪ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３ Ｏｃｔ；９２（４）：２００３－１２；Ｋｅｌｌｙ ＡＢ，Ｍａｒｚｅｃ ＵＭ，Ｋｒｕｐｓｋｉ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｒｕｄｉｎ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｒｔｅｒｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ． Ｂｌｏｏｄ １９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１００６－１２）。血管損傷は細胞外マトリックス（血小板およびＦＸＩＩ活性化を誘発するコラーゲンのような構造タンパク質を含む）に流れる血液を暴露させるため、本発明者らは、ＦＩＸ化コラーゲン被覆を用いて移植片セグメントを血栓形成性にした。内径（ｉ．ｄ．）４ｍｍの長さ２０ｍｍの臨床血管移植片（発泡ポリテトラフルオロエチレン、ｅＰＴＦＥ，Ｇｏｒｅ－Ｔｅｘ；ＷＬＧｏｒｅ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｆｌａｇｓｔａｆｆ，ＡＺ）の内腔を、ウマＩ型コラーゲン（ＣＨＲＯＮＯ－ＬＯＧ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｖｅｒｔｏｎ，ＰＡ）で１５分間被覆し、次いで、無菌気流下で一晩乾燥させた。この方法は走査型電子顕微鏡法によって決定されるように、移植片内腔に均一なコラーゲン被覆を生成する（データは示さず）。コラーゲン被覆（血栓形成性）移植片セグメントをシリコンゴム管に組み込み、６０分間の急性血栓症実験の全期間にわたってヒヒのＡＶシャントに配置した。
非抗凝固ヒヒにおけるシャントを通る血液の流れは、コラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ移植片セグメントにおける急性血栓形成を常に誘発する。それぞれの試験の間、移植を通る最高血流速度（約２５０ｍＬ／分）は、遠位クランプにより１００ｍＬ／分に制限され、４ｍｍ移植片において２６５ｓ－１の最初の壁面剪断速度をもたらした。超音波流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を用いて、流量を連続的にモニターした。これらの直径４ｍｍの移植片は閉塞せず、脈動流量は、血栓形成の間、１００ｍＬ／分のままであった。移植片セグメント（および血栓）を６０分または９０分でシャントから除去し、各実験後に永久シャントを回復させた。血栓形成は、時間の経過と共にコラーゲン表面から下流に広がることが見出されたので、血小板蓄積もまた、移植片のすぐ遠位の動静脈シャントの長さ１０ｃｍの領域内で測定された。近位コラーゲン表面（血栓「ヘッド」）上での血栓成長のこのモデルは、コラーゲンセグメントの遠位に伝播する血栓（血栓「尾部」を形成する）を伴う。
血栓形成は、６０－９０分間の長さの実験の間に、移植片セグメントにおける無線標識血小板の定量的ガンマカメラ画像化によって評価した。血栓形成は、さらに、（１）に記載されるように、各実験の終了後の終点無線標識フィブリン沈着の測定によって評価した。血小板沈着の定量化のために、自己由来のヒヒ血小板を１ｍＣｉの１１１Ｉｎで標識し、次いで動物に再注入し、少なくとも１時間および４日間循環させた後、試験を行った。
慢性ＡＶシャントモデルにおける他のデバイスについて記載されているような、ＮｕＱｕｅｓｔ ＩｎｔｅＣａｍコンピュータシステムに接続されたＧＥ－４００Ａ－６１ガンマシンチレーションカメラを使用することによって、移植片上への血小板関連放射活性の蓄積を５分間隔で測定した（Ｇｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：９５３－９５５；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２００７；１１９：１２１－１２７；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３；９２：２００３－２０１２；Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００９；１１３：９３６－９４４）。６０－９０分で、移植片を取り出し、すすぎ、乾燥させ、そして以前に記載されているように（Ｇｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：９５３－９５５；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３；９２：２００３－２０１２）、その後の１２５Ｉ－フィブリン含量の評価のために冷蔵保存した。簡潔には、相同１２５Ｉ標識ヒヒフィブリノゲン（５－２５μｇ，４μＣｉ，＞９０％凝固性）を、それぞれの試験の１０分前に静脈内注射した。血小板に付着した１１１Ｉｎを減衰させるため、ＡＶシャントから移植片を取り出してから少なくとも３０日後に、血栓への標識フィブリノーゲン／フィブリンの取り込みを、ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ－３，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を用いて評価した。移植片に沈着した１２５Ｉ－放射活性を測定し、最初の試験の間に採取した血漿試料中の凝固性フィブリン（フィブリノーゲン）の放射活性と比較した。
第１の実験（図８）において、静脈流を模倣するために２０ｍｍ下流に配置した直径９ｍｍのシリコンチャンバーを有する、直径４ｍｍのコラーゲン被覆された血管移植片セグメントを用いて、ＡＢ０２３抗血栓作用を試験した（実験の１時間前に０．２ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与）。２匹の幼若雄ヒヒを用いて、計４件のノンターミナル（Non-terminal）試験を実施し、そのデータを同一の１４Ｅ１１実験に用いた対照群（対照群４匹中ｎ＝７例／群）と比較した。
この試験からの結果を図８Ａ－Ｄに示す。左側のパネルは血小板沈着を示し、右側のパネルは末端フィブリン沈着（terminal fibrin deposition）を示す。この試験は、血管移植片内の血小板蓄積速度がＡＢ０２３処置動物において、未処置対照よりもわずかに低いようであることを示したが（図８Ａ）、一方、ＡＢ０２３処置ヒヒにおいて、血小板蓄積のほぼ完全な阻害が拡張チャンバー内で達成された（図８Ｃ）。これらのデータは１４Ｅ１１投与後に観察されたものと類似しており、ＡＢ０２３の抗血栓作用がマウス前駆体１４Ｅ１１と同等であることを実証している。動脈型および静脈型血栓症の両方において、フィブリン沈着もまた、より低かった（図８ＢおよびＤ）。
実験の第２セットでは、４匹の幼若雄ヒヒを用いた８回のノンターミナル（Non-terminal）試験において、６０分間、慢性ＡＶシャントに配置した、長さ２０ｍｍ、内径４ｍｍのコラーゲン被覆人工血管移植片セグメントを用いて、急性局所血栓症を開始した。ヒヒをＡＢ０２３（１．０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注入）または生理食塩水（対照、静脈内）のいずれかで処置した。ＡＢ０２３の抗血栓作用を、静脈内投与２４時間後に評価した。
コラーゲン被覆血管移植片内の血小板沈着は、ＡＢ０２３処置動物（図９Ａ）においてより低く、血小板沈着のほぼ完全な阻害は、ＡＢ０２３（図９Ｂ）によって移植片（「尾部」）のすぐ下流の領域１０ｃｍにおいて達成された。全体として、血小板沈着（血栓形成移植片（thrombogenic graft）プラス尾部内の血小板沈着）、はＡＢ０２３（１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、図９Ｃ）での前処置後に減少した。これらの試験は、ＡＢ０２３がそのマウス前駆体と同様に、血栓症の霊長類モデルにおいて抗血栓性であることを示した。さらに、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２３のより高い用量では、血栓形成移植（thrombogenic graft）片および「尾部」における動脈型血栓成長速度を減弱させるのに有効であった。移植片および「尾部」の両方におけるフィブリン沈着がＡＢ０２３処置後に減少した。
ＡＰＴＴは試験期間を通じてモニタリングされ、注入後のＡＢ０２３処置後に延長された。また、ＡＢ０２３処置群では、処置後２４時間を超えて上昇したままであったが（実験の３０分および６０分、表２）、対照群ではａＰＴＴの変化は観察されなかった。ＰＴはまた、試験の過程を通して測定された。ＡＢ０２３は対照と比較してＰＴを変化させなかった（表２）。
Figure 2022523007000002
これらのデータは、ヒト化ＡＢ０２３抗体がその抗凝固特性を維持し、血栓症のマウスおよび非ヒト霊長類モデルの両方における実験的血栓症を減少させたことを実証する。
〔１４Ｅ１１とＡＢ０２３との比較〕
ヒト化に続いて、ＡＢ０２３の抗凝固効果を、上記のａＰＴＴアッセイを用いて１４Ｅ１１と比較し、ＡＢ０２３は、１４Ｅ１１と比較してヒトおよびヒヒの血漿中のａＰＴＴを同様に延長したことが示された（図３）。
ＦＸＩａによる接触経路活性化、ＦＸＩ自己活性化、および相互ＦＸＩＩ活性化に対する１４Ｅ１１またはＡＢ０２３の効果も検討した。簡潔には、接触経路活性化に対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を比較するために、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＥＧ－８０００）中のＦＸＩ（８０ｎＭ）を、１２８０ｎＭ １４Ｅ１１または８００ｎＭ ＡＢ０２３を伴って、または伴わずに、３７℃で１５分間インキュベートした。ゼロ時点で、全てＨＥＰＥＳ中のＦＸＩＩａ、ＨＫ、およびデキストラン硫酸は、最終濃度がＦＸＩ（３０ｎＭ）、ＦＸＩＩａ（５ｎＭ）、ＨＫ（３０ｎＭ）、硫酸デキストラン（０．１μｇ／ｍｌ）、および４８０ｎＭ １４Ｅ１１または３００ｎＭ ＡＢ０２３となるように添加した。種々の時点で、５μＬのアリコートにトウモロコシトリプシンインヒビター（ＣＴＩ）（最終濃度５００ｎＭ）およびポリブレン２０μｇ／ｍｌ（最終濃度）を追加した。そしてΔＯＤ４０５ｎｍを、２５０μＭ Ｓ－２３６６の存在下で、マイクロプレートリーダー上で追跡した。
ＦＸＩａ自己活性化に対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を比較するために、精製ヒトＦＸＩを、２５および１００ｎＭの１４Ｅ１１またはＡＢ０２３の存在下でＤＸＳ（０．１μＭ）と混合した。または、精製ヒトＦＸＩを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＥＧ－８０００、ＺｎＣｌ２（１０μＭ）中の１４Ｅ１１（０－１００ｎＭ）またはＡＢ０２３（０－１００ｎＭ）の種々の濃度の存在下で、３７℃で６０分間、精製した白血球由来ＤＮＡと混合した。ＦＸＩ活性化を、アリコートをポリブレン（０．２ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって終了させ、ＦＸＩａアミド分解活性を、発色基質Ｓ－２３６６（１ｍＭ）を使用して測定し、ＶｍａｘをＯＤ４０５ｎｍ／分として測定した。
最後に、ＦＸＩａによる相互ＦＸＩＩ活性化に対する１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を比較するために、精製ヒトＦＸＩＩ（２００ｎＭ）およびＦＸＩａ（１０ｎＭ）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＥＧ－８０００、ＺｎＣｌ２（１０μＭ）中、３７℃で６０分間、１４Ｅ１１またはＡＢ０２３（０－２００ｎＭ）とインキュベートした。ＦＸＩＩ活性化をアプロチニン（１０μＭ）によって停止させ、ＦＸＩＩａアミドライト活性を発色基質Ｓ－２３０２（１ｍＭ）を用いて測定し、ＶｍａｘをＯＤ４０５ｎｍ／分として測定した。
ＦＸＩに対する明らかに低い親和性にもかかわらず、ＡＢ０２３は、ＦＸＩのＦＸＩＩａ活性化を阻害するのにより有効であった（図１０Ｃ）。さらに、ＡＢ０２３による陰性表面（硫酸デキストランまたはＤＮＡ）の存在下でのＦＸＩ自己活性化の減衰は、１４Ｅ１１と比較して大きかった（図１０Ａ－Ｂ）。
１４Ｅ１１のＡＢ０２３へのヒト化は、例えば、予想外の機能獲得、すなわち、ＦＸＩＩおよびＦＸＩの相互作用に対する２方向阻害活性を有する新規な結合分子をもたらした（図１０Ｃ、Ｄ）。図１０Ｃは、ＦＸＩＩａによるＦＸＩ活性化を示す。図１０Ｄは、ヒトＦＸＩＩ（２００ｎＭ）が１４Ｅ１１またはＡＢ０２３の存在下で１０ｎＭヒトＦＸＩａによって活性化された場合の、ＦＸＩａによるＦＸＩＩ活性化に対するそれぞれの抗ＦＸＩ ＩｇＧの阻害効果を示す。ＡＢ０２３はそのマウス前駆体よりもＦＸＩＩａの活性化を阻害するのにより有効であるだけでなく（図１０Ｃ）、ＡＢ０２３はＦＸＩＩとＦＸＩとの間の相互活性化プロセスを阻害するが、１４Ｅ１１は阻害しない。予想外の阻害作用の獲得は、分子間の配列相同性に関係している可能性がある。Ｂｌａｓｔアラインメントは、１４Ｅ１１とＡＢ０２３との間の配列相同性が約６０－７０％であることを示した（データは示さず）。
〔記載された配列〕
添付の配列表に列挙されている核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されているように、ヌクレオチド塩基については標準文字略語を使用し、アミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対するいかなる参照によっても含まれていると理解される。
〔ＬＣ ＣＤＲ １ （配列番号１）〕
ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ
〔ＬＣ ＣＤＲ ２ （配列番号２）〕
ＬＴＳＹＲＮＴ
〔ＬＣ ＣＤＲ ３ （配列番号３）〕
ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ
〔ＨＣ ＣＤＲ １ （配列番号４）〕
ＧＹＧＩＹ
〔ＨＣ ＣＤＲ ２ （配列番号５）〕
ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ
〔ＨＣ ＣＤＲ ３ （配列番号６）〕
ＤＹＹＧＳＫＤＹ
Figure 2022523007000003
〔ＡＢ０２３のＶＨドメイン （配列番号８）〕
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＩＹＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＹＹＧＳＫＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
〔ＡＢ０２３のＶＬドメイン （配列番号９）〕
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＴＳＹＲＮＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＶＹＹＣＱＱＨＹＫＴＰＹＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
〔ＡＢ０２３のＬＣ （配列番号１０）〕
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＴＳＹＲＮＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＶＹＹＣＱＱＨＹＫＴＰＹＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
〔ＡＢ０２３のＨＣ （配列番号１１）〕
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＩＹＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＹＹＧＳＫＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
〔配列番号１０をコードするＡＢ０２３ ＤＮＡのＬＣドメイン （配列番号１２）〕
ＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ
〔配列番号１１をコードするＡＢ０２３ ＤＮＡのＨＣドメイン （配列番号１３）〕
ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＧＴＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ。
本開示の上記の議論は、例示および説明の目的で提示されている。上記は、本開示を本明細書に開示された形態または形態に限定することを意図しない。例えば、本開示の様々な特徴は、本開示を合理化し、理解を容易にするために、１つまたは複数の態様、実施形態、および構成でグループ化される。本開示の態様、実施形態、および構成の特徴は、議論されたもの以外の代替の態様、実施形態、および構成において組み合わされてもよい。従って、本開示は、特許請求される開示が各特許請求の範囲に明示的に列挙されるよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の上記の開示された態様、実施形態、および構成のすべての特徴の範囲よりも少ない範囲内にある。従って、以下の特許請求の範囲は本発明の詳細な説明に組み込まれ、各特許請求の範囲はそれ自体が本開示の別個の好ましい実施形態として存在する。さらに、本開示の説明は、例えば、本開示を理解した後、当業者の技術および知識の範囲内であり得るような、１つまたは複数の態様、実施形態、または構成、および特定のバリエーションおよび修正、他のバリエーション、組み合わせ、修正の説明を含んでいる。そのような代替の互換性のあるおよび／または同等の構造、機能、範囲または工程が本明細書に開示されているか否かにかかわらず、特許請求されるものに対する代替の、交換可能な、および／または同等の構造、機能、範囲、または工程を含む、代替の態様、実施形態、および構成を許可される範囲まで含む権利を取得することが意図され、そして、特許性のある対象の事柄を公に寄進することを意図するものではない。
マウス血漿（白丸）およびヒト血漿（黒丸）における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する、１４Ｅ１１（１０－５－１００μＭ）の濃度依存的効果を示すグラフである。 図２のＡ－Ｆは、１４Ｅ１１の結合特性を明示するブロットおよびグラフである。 図３のＡ－Ｂは、インビトロａＰＴＴに対する、１４Ｅ１１（黒丸）およびヒト化バージョンであるＡＢ０２３（白丸）の効果を示すグラフである。 図４Ａ－Ｆは、ＡＢ０２３の結合特性を明示するブロットおよびグラフである。 図５は、インビトロａＰＴＴに対するＡＢ０２３－ＦＸＩ複合体形成の効果を示す。 図６は、実験的動脈血栓症のマウスモデルにおける１４Ｅ１１およびＡＢ０２３の効果を示す。 図７は、４匹のヒヒにおけるＡＢ０２３血漿濃度とａＰＴＴとの関係を示す。 図８Ａ－Ｄは、インビボのヒヒ血栓症モデル（移植＋拡張チャンバー）におけるＡＢ０２３の効果を示す。 図９Ａ－Ｆは、インビボヒヒ血栓症モデル（コラーゲン被覆された移植）における多血小板血栓の成長に対するＡＢ０２３の効果を示す。 図１０Ａ－Ｄは、ＡＢ０２３の活性とマウス抗体１４Ｅ１１の活性との比較を示す。

Claims (26)

  1. 配列ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含む軽鎖のＣＤＲ１、
    配列ＬＴＳＹＲＮＴ（配列番号２）を含む軽鎖のＣＤＲ２、
    配列ＱＱＨＹＫＴＰＹＳ（配列番号３）を含む軽鎖のＣＤＲ３、
    配列ＧＹＧＩＹ（配列番号４）を含む重鎖のＣＤＲ１、
    配列ＭＩＷＧＤＧＲＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号５）を含む重鎖のＣＤＲ２、
    配列ＤＹＹＧＳＫＤＹ（配列番号６）を含む重鎖のＣＤＲ３、
    を含み、ヒト第ＸＩ因子および／またはヒト第ＸＩａ因子に特異的に結合する、モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  2. 配列番号８に記載のＶＨ領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  3. 上記モノクローナル抗体は、配列番号９に記載のＶＬ領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  4. 上記モノクローナル抗体は、配列番号８に記載のＶＨ領域、および、配列番号９に記載のＶＬ領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  5. 上記モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメントが、配列番号１０に記載の軽鎖、または、配列番号１２によってコードされる軽鎖を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  6. 上記モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメントが、配列番号１１に記載の重鎖、または、配列番号１３によってコードされる重鎖を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  7. 上記モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体が、
    配列番号１０に記載の軽鎖、または、配列番号１２によってコードされる軽鎖；および、
    配列番号１１に記載の重鎖、または、配列番号１３によってコードされる重鎖、を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  8. 上記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体、または、キメラモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  9. 上記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  10. 上記抗体がＩｇＧ４である、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体。
  11. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  13. 上記ベクターが発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
  14. 請求項１１に記載の核酸を有する宿主細胞を含む、培養物。
  15. モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体の製造方法であって、当該製造方法は、当該モノクローナル抗体、当該抗原結合性フラグメント、当該変異体、もしくは当該誘導体の発現を可能にする条件下にて、請求項１４記載の宿主細胞を培養する工程を含む、製造方法。
  16. 請求項１５に記載の製造方法にしたがって製造されたモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体；および、
    薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
  17. 治療的有効量の、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体；および、
    薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
  18. １つ以上の追加的な活性物質をさらに含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
  19. 上記さらなる追加的な活性物質が、
    プラスミノーゲン活性化因子（血栓溶解剤／線溶剤）；
    プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤；
    組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ、およびウロキナーゼを含む、トロンビン活性化線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）の阻害剤；
    非分画ヘパリン；
    低分子量ヘパリン；
    ヘパリノイド；
    ヒルジン；
    ビバリルジン；および、
    アルガトロバン
    を含む群から選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
  20. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を医薬として使用する方法であって、当該方法は、治療的有効量の当該モノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント、変異体、または誘導体を、当該医薬を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
  21. 上記対象が、血栓性もしくは血栓塞栓性の障害、血栓性もしくは血栓塞栓性の合併症、または、炎症性疾患に対する、治療および／または予防を必要とする、請求項２０に記載の方法。
  22. 上記対象が、血液凝固、血小板凝集、および／または、血栓症に対する、治療および／または予防を必要とする、請求項２０に記載の方法。
  23. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を、血液サンプル、血液保存剤、血漿製剤、生物学的サンプル、または、医学的添加剤もしくはデバイス中の抗凝固剤として使用する方法であって、当該方法は、当該モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメントを、当該抗凝固剤を必要とするサンプルに添加する工程を含む、方法。
  24. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体；および、
    その取扱説明書を備えている、キット。
  25. 上記モノクローナル抗体、または、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体が凍結乾燥の形態であり、
    さらに、上記モノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体の再懸濁のための薬学的に許容可能なキャリアを備えている、請求項２１に記載のキット。
  26. 製造された抗体、その抗原結合性フラグメント、変異体、または誘導体を培養物から回収する工程をさらに含む、請求項１５に記載の製造方法。

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