KR20050045945A - 항응고제로서의 신규 조직 인자 표적화된 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단독의 조직 인자 (TF)보다 인자 VIIa/조직 인자 (FVIIa/TF) 복합체에 더 큰 친화성으로 결합하고, TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않으며, FX 활성화를 억제하는 신규 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 손상 부위에 결합하여 혈전증의 개시를 방지한다. 본 발명의 항체를 사용해서 심부 정맥 혈전증, 파종성 혈관내 응고증 및 급성 심장 증후군을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 혈전성 증상을 치료할 수 있다.

Description

항응고제로서의 신규 조직 인자 표적화된 항체 {Novel Tissue Factor Targeted Antibodies as Anticoagulants}
혈관 내에서 전구 응고제 활성과 항응고제 활성 사이에 적절한 균형을 유지시키는 것은 정상적인 지혈을 위해 필수적이다 (문헌 [Davie, E.W. et al. (1991) Biochemistry, 30(43):10363-10370]). 응고에 대한 균형이 깨지면 심장 마비, 발작, 폐 색전증 및 정맥 혈전증을 초래할 수 있는 혈전증이 유발된다. 특정 혈전 질환을 치료하기 위한 보다 효과적이고 안전한 항응고제에 대한 필요성이 제기되고 있다.
조직 인자 ("TF")는 단계적 응고 반응의 주요 개시자인 막횡단 당단백질이다 (문헌 [Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1):180-184]). 정상적인 생리적 조건하에서, 활성인 TF는 혈액과 접촉하지 않는다. 혈관 손상시, 내피하 TF 및 콜라겐이 혈액에 노출되면 응고 인자 및 혈소판이 활성화되어 지혈 플러그를 형성한다. 노출된 TF는 각각 내재성 테나제 및 프로트롬비나제 복합체의 주요 성분인 인자 IX ("FIX") 및 인자 X ("FX")의 인자 VIIa ("FVIIa") 촉매 활성화에 대한 보조인자로서 작용한다. 이는 FXa 및 트롬빈의 급속한 형성을 초래한다. 이어서, 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 절단하며, 이후 피브린이 중합하여 피브린 혈병을 형성한다. 다양한 임상적 상태에서, TF의 발현이 부적절하게 유도되면 생명을 위협하는 혈전증이 초래되고(되거나) 병리적 합병증이 유발될 수 있다. 플라크 파괴시 수반되는 TF 노출은 급성 심근 경색 및 발작을 초래하는 혈전 폐색을 담당하는 것으로 믿어지고 있다. 이러한 상태에서, 응고 인자에 의해 활성화되는 전염증성 신호전달 경로는 또한 부종 형성을 초래하고, 경색 부위를 증가시킨다. 혈관성형술과 관련된 혈관 손상은 재협착과 관련된 세포 신호전달 경로를 유도하는 것으로 믿어지는 SMC 상의 TF를 상향조절시킨다. 암 및 그람-음성 (gram-negative) 패혈증에서의 TF 과다발현은 생명에 위협적인 혈전증 및 염증성 경로의 활성화를 초래한다.
FVIIa/TF 복합체는 다양한 혈전 질환의 병원성 메카니즘에 관여하며, 어떤 환자의 경우에는 순환되는 양의 TF가 위험 인자가 된다. FVIIa 및 TF는 혈관 손상시 지혈 유지 및 혈전형성 개시에 중요한 역할을 한다. TF는 정상적으로는 외막에서 발현되지만, 혈관 질환에서는 혈관의 중막 및 신생혈관내막에서 부적절하게 상향조절 및 발현된다. 아테롬성 동맥경화증 플라크에서는 TF 발현이 증가하고, 얇은 섬유질 캡 (cap)에 의해 혈액으로부터 보호되는데, 이 캡이 파괴되면 TF가 노출된다. 풍선 (balloon) 혈관성형술, 협착술 또는 동맥내막절제술과 같은 외과 시술은 혈관벽을 손상시키고, 그 아래에 있는 TF를 노출시킨다. 아테롬성 동맥경화증에서, 지질이 풍부한 얇은-벽 플라크의 자발적인 파괴 또는 내피 침식은 TF 노출 및 혈전형성을 초래하여 불안정성 앙기나 및 심근 경색을 유발한다. TF는 세포로부터 유래된 미세입자에서 순환될 수 있고, 순환하는 TF 수준은 불안정성 앙기나에서 증가하며, 이는 상기 순환하는 TF가 혈전 형성을 초래할 수 있다는 것을 시사한다 (문헌 [Soejima, H. et al. (1999) Circulation 99(22):2908-2913]). 대체로 암은 종양 세포 상에서 TF 과다발현에 기인하는 과다응고 상태와 관련되어 있다. 이는 환자가 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증 및 낮은 등급의 파종성 혈관내 응고증 ("DIC")에 걸리기 쉽게 한다. DIC는 미세혈관에서 다수의 기관 부전을 초래하는 피브린 침착 현상을 일으킨다.
TF를 표적화하는 단백질계 항응고제로는 TF 중화 항체, 활성 부위 억제된 인자 VIIa ("FVIIai"), 조직 인자 경로 억제제 ("TFPI"), 및 선충류(Nematode) 항응고제 단백질 ("NAPC2")이 포함된다. 혈전증의 급성 동맥 손상 모델로부터의 결과는 FVIIa/TF의 단백질계 억제제가 효과적인 항혈전제이며 헤파린, 직접적 트롬빈 억제제, 혈소판 억제제 및 FXa 억제제에 비해 출혈이 적음을 암시한다 [Himber, J. et al. (2001) Thromb. Haemost. 85: 475-481; Harker, L. A. et al. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 464-472]. 또한, FVIIa/TF 억제는 풍선 손상시 수반되는 신생혈관내막의 후막화 및 혈관 협착을 예방하는 데 있어서 다른 항응고제 (예를 들어, 헤파린, FXa 억제제)보다 우수하다 (문헌 [Jang, Y. et al. (1995) Circulation 92 (10):3041-3050]).
TF, FVIIa 또는 FVIIa/TF 복합체를 억제하는 것은 패혈증의 실험 모델에서 DIC를 예방하고 사망율을 감소시키는 효과적인 항혈전 방법이다. TFPI 유사체는 토끼에서 트롬보플라스틴 및 내독소-유도된 DIC 둘 다를 방지한다 [Day, K. C. et al. (1990) Blood 76: 1538-1545; Bregengard, C. et al. (1993) Blood Coagul. Fibrinolysis 4: 699-706]. FVIIa (Biemond, B. J. et al. (1995) Thromb. Haemost. 73: 223-230 or Levi, M. et al. (1994) J. Clin. Invest. 93: 114-120)에 대한 모노클로날 항체는 원숭이에서 내독소-유도된 DIC를 예방한다. TF 중화 항체, FVIIai 및 TFPI는 이. 콜라이 (E. coli)-유도된 패혈증의 비비 (baboon) 모델에서 DIC를 억제하고 사망율을 감소시킨다 [Creasey, A. A. et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 2850-2860; Taylor, F. B. et al. (1991a) Blood 78: 364-368; Taylor, F. B. et al. (1991b) Circ. Shock 33: 127-134; Taylor, F. B. (1996) Haemostasis Suppl. 126: 83-91]. 자유 FXa 및 FVIIa/TF/FXa 복합체는 둘 다 패혈증에 걸린 환자의 사망 위험 증가와 관련된 염증유발성 사이토카인의 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다 [Riewald, M. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7742-7747]. 흥미롭게도, FVIIai는 비비 모델에서 IL-6 및 IL-8의 혈장 수준을 저하시키는 것으로 밝혀졌으며 [Taylor, F. B. et al. (1998) Blood 91: 1609-1615], 이러한 사실은 FVIIa/TF의 억제가 다른 항응고제 메카니즘이 공유하지 않는 추가의 항염증 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
효과적인 항응고제이며 TF 또는 FVIIa/TF 복합체 또는 이들 둘 다와 결합하여 이들을 중화시키는 여러 항체가 기술되었다 (예를 들어, 문헌 [Carson, S. D. et al. (1985) Blood 66 (1): 152-156; Tanaka, H. et al. (1985) Thromb. Res. 40 (6): 745-756; Kirchhofer, D. et al. (2000) Throomb. Haemost. 84 (6); 1072-1081; Kirchhofer, D. et al. (2001) Biochemistry 40 (3): 675-682; Faelber, K. et al. (2001) J. Mol. Biol. 313: 83-97]; 및 미국 특허 제5,506,134호, 동 제5,986,065호 및 동 제6,274,142호 참조). 본 발명의 TF 표적화된 항체는 본 발명에 앞서 기술된 TF 항체에 비해 향상된 특징을 갖는 효과적인 항응고제이다. 특히, 본 발명의 항체는 FVIIa/TF 복합체에 대해 단독의 TF보다 더 큰 친화성으로 결합하며, TF에 결합하는데 있어서 FVII 또는 FX와 경쟁하지 않는다.
<발명의 개요>
본 발명은 단독의 조직 인자 ("TF")보다 인자 VIIa/조직 인자 ("FVIIa/TF") 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는, 항응고제로서 작용하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 미세열량측정 분석에서 측정된 바로는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 2배 이상 더 큰 친화성으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 5배 이상 더 큰 친화성으로 결합한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 10배 이상 더 큰 친화성으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 TF에 결합하는데 있어서 인자 VII ("FVII"), 인자 IX ("FIX") 및 인자 X ("FX")로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 응고 인자와 경쟁하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체와 더 큰 친화성으로 결합하며, TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는다.
본 발명의 항응고 항체는 손상 부위에서 FVIIa/TF 복합체를 표적화하고 상기 복합체와 결합하여 인자 X ("FX") 활성화를 억제함으로써 혈전 형성을 방지하고, 이에 따라 패혈증, 파종성 혈관내 응고증, 허혈성 발작, 심부 정맥 혈전증, 급성 심장 증후군, 혈관성형술 이후에 수반되는 혈전 합병증, 및 진행성 암에서의 응고증 등을 비롯한 여러 질환의 치료에서 항응고제로서 효과적으로 작용한다. 또한, 상기 항체는 미세혈관 수술, 피부 및 정맥 이식, 및 기관 이식에서 사용된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 혈전 형성으로부터 보호되어야 할 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 항체를 투여함으로써 혈소판의 활성화 및 응집과 같은 다른 응고 파라미터에는 직접적인 영향을 미치지 않으면서 트롬빈 생성을 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 혈전 형성으로부터 보호하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체를 심부 정맥 혈전증 (DVT), 파종성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 심장 증후군, 또는 응고증 징후가 있는 암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 심부 정맥 혈전증 (DVT), 파종성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 심장 증후군, 또는 응고증 징후가 있는 암을 경감시켜 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체를 염증성 반응의 조절이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 염증성 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 혈액과 접촉하는 의료 장비의 표면 상에 혈전형성을 방지하는 코팅을 형성시키는 데 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 FVIIa/TF 복합체에 결합하는 본 발명의 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 별법으로, 키트는 항체 성분을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체를 재조합 및 합성에 의해 제조하는 방법에 개시되어 있다.
도 1은 sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석에서 TF-결합 단쇄 항체의 활성을 나타낸다. sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석을 sTF에 대한 FVIIa의 친화성 (KD(app)는 약 10 nM임)을 기초로 FVIIa (5 nM) 및 sTF (10 nM)의 평형 혼합물을 사용해서 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 발색 펩티드 기질 S2266의 가수분해를 기술된 바와 같이 모니터링하였다. 박테리아에 의해 발현된 단쇄 항체 및 대조 단백질 FVIIai (클로로메틸케톤 펩티드인 PPACK에 의해 불활성화된 FVIIa) 및 Mab#4504 (American Diagnostica)의 최종 농도를 나타낸다.
도 2는 scFv(TF)3e10과 sTF의 결합이 FVIIa에 대한 sTF의 친화성을 증가시킴을 나타낸다. sTF/FVIIa 펩티드 가수분해를 박테리아에 의해 발현된 800 nM scFv(TF)3e10의 존재 및 부재하에 2 nM FVIIa를 사용해서 실시예 4에 기술된 바와같이 수행하였다. 분석에서 sTF를 적정하였으며, 발색 펩티드 기질 S2266의 절단 속도를 측정하였다. 표준 4-파라미터 피트(fit)를 이용해서 sTF에 대한 KD(apparent)를 계산하였다.
도 3은 프로트롬빈 시간 (PT) 분석에서 TF-결합 단쇄 항체의 활성을 나타낸다. PT 분석을 인지질 소포내에 전장 인간 TF를 함유하는 재조합 인간 트롬보플라스틴 (Dade, Inc.)을 사용해서 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 박테리아에 의해 발현되는 단쇄 항체 및 대조 단백질 FVIIai의 최종 농도를 나타낸다.
도 4는 sTF에 대한 scFv(TF)3e10의 겉보기 결합 친화성의 측정을 나타낸다. sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석을, 3 nM sTF 및 2 nM FVIIa를 사용하여 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 사용된 sTF의 농도는 FVIIa에 결합하는데 있어서 KD 미만이었다. 박테리아에 의해 발현되는 scFv(TF)3e10을 농도를 증가시키면서 첨가하고, 증가된 반응 속도를 이용해서 sTF에 대한 상기 항체의 KD(apparent)를 결정하였으며, 표준 4-파라미터 피트를 사용하였다. sTF/FVIIa 복합체에 대한 scFv(TF)3e10의 친화성 (KD(app) = 65 nM)은 BIAcore를 사용해서 측정한 sTF에 대한 scFv(TF)3e10의 친화성 (KD(app) = 470 nM)보다 더 컸다.
도 5는 TF 및 FVIIa/TF 복합체에 대한 scFv(TF)3e10의 결합 친화성의 측정을 나타낸다. 미세열량측정 분석을 CHO 세포에서 발현된 scFv(TF)3e10을 사용해서 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이 분석은 scFv(TF)3e10이 sTF ("자유TF")보다 sTF/FVIIa 복합체 ("복합체")에 대해 약 20배 더 큰 친화성을 가짐을 보여준다.
도 6은 scFv(TF)3e10이 투여량 의존적으로 FX 활성화를 억제함을 나타낸다. FX 활성화 분석을, 박테리아에 의해 발현되는 scFv(TF)3e10, 250 nM FX, 및 인지질 표면 상의 FVIIa/TF 복합체 (10 pM FVIIa)의 농도를 증가시키면서 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. IC50은 50％ 최대 억제에 도달하는데 필요한 투여량을 나타낸다.
도 7은 scFv(TF)3e10이 FVIIa/TF 복합체에 의해 FX 활성화를 비경쟁적으로 억제함을 나타낸다. FX 활성화 분석을, 박테리아에 의해 발현되는 scFv(TF)3e10, 25 nM 내지 400 nM FX, 및 인지질 표면상의 FVIIa/TF 복합체 (10 pM FVIIa)를 사용해서 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 분석에서 scFv(TF)3e10의 농도를 증가시키면서 적정하였다 (0 nM, 속이 빈 사각형; 0.25 nM, 속이 빈 다이아몬드형; 0.74 nM, 속이 빈 삼각형, 2.2 nM, 속이 빈 원형; 6.7 nM, 속이 채워진 다이아몬드형, 20 nM, 속이 채워진 삼각형). (1/[S], 여기서 S(기질) = 인자 X(μM); 대 1/v, 여기서 v(속도) = mOD/분 (5분 간격 동안 생성된 FXa에 의한 S2222 가수분해로부터 구함))의 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 그래프는 scFv(TF)3e10이 기질 FX에 대해 비경쟁적 억제제임을 나타낸다. 모든 선은 비경쟁적 억제제의 경우에 예상된 바와 같이 x-축(또는 그 근처)을 지난다 (경쟁적 억제제의 경우, 모든 선은 y-축을 지남).
도 8은 scFv(TF)3e10이 파종성 혈관내 응고증 ("DIC")의 생체내 모델에서 효능이 있음을 보여준다. CHO 세포에서 발현된 TF-항체 scFV(TF)3e10을, (A) 사망율 비율 및 (B) 질병율-사망율 점수에 대하여 실시예 6에 기술된 래트 혈전색전증 모델에서 평가하였다. (A) 비히클-처리된 군에서, 사용된 TF의 투여량은 60％의 치사율 (LD60)을 나타냈다. 0.7 nmol/kg의 scFv(TF)3e10은 사망율에 영향을 주지 않았지만, 7.0 nmol/kg의 scFv(TF)3e10은 치사율을 40％ 미만으로 감소시켰다. (B) 비히클-처리된 군에서, TF의 생체내 투여량은 2.6의 평균 질병율-사망율 점수를 나타내었다. 0.7 nmol/kg의 scFv(TF)3e10은 사망율에 영향을 주지 않았으며 호흡 장애에 대하여 거의 또는 전혀 영향을 주지 않았지만, 14 nmol/kg에서 평균 질병율-사망율 점수는 약 1.5로 감소되었다.
본 발명의 항응고 항체는 단독의 조직 인자 ("TF")보다 인자 VIIa/조직 인자 ("FVIIa/TF") 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상 더 큰 친화성으로 결합한다. 본 발명의 항체는 TF에 결합하는데 있어서 인자 VII ("FVII"), 인자 IX ("FIX") 및 인자 ("FX")로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 응고 인자와 경쟁하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는다.
정의:
본 발명의 설명에 있어서, 하기 용어를 다음에 나타낸 바와 같이 정의한다.
"재조합 단백질 또는 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된, 즉 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 외생 DNA 구조물에 의해 형질전환된 세포, 미생물 또는 포유동물로부터 생성된 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 대부분의 박테리아 배양물에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에는 글리칸이 포함되어 있지 않을 것이다. 효모에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현되는 것과 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.
"천연" 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 발생 공급원으로부터 회수된 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 용어 "천연 항체"는 자연적으로 발생한 항체 및 그의 단편을 포함할 것이다.
DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 조절하에 놓여진 경우에 숙주 세포에서 mRNA로 전사되고 폴리펩티드로 번역되는 DNA 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' N-말단의 개시 코돈 및 3' C-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
"뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드 (아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신 염기)의 헤테로폴리머이다. 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 합성 cDNA-유래의 DNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커로부터 조립하여 재조합 발현 벡터에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공할 수 있다. 특정 이중-가닥의 DNA 분자의 구조를 논의하는데 있어서, 서열은 cDNA의 비전사 가닥을 따라 단지 5'에서 3'의 방향으로 서열을 제공하는 통상의 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
"재조합 발현 벡터"는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 증폭시키거나 발현시키는 데 사용되는 복제가능한 DNA 구조물이다. 발현 벡터는 DNA 조절 서열 및 코딩 서열을 함유한다. DNA 조절 서열로는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인 및 인핸서를 들 수 있다. 본원에 정의된 재조합 발현 시스템은 조절 요소의 유도시에 항체를 발현시킬 것이다.
"형질전환된 숙주 세포"는 외생 DNA로 형질전환 및 형질감염된 세포를 의미한다. 외생 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합 (또는 공유 결합)되거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 및 효모에 있어서, 외생 DNA는 에피좀 요소, 예를 들어 플라스미드상에 유지되거나 또는 염색체 DNA에 안정하게 통합될 수 있다. 진핵 세포에 있어서, 안정하게 형질전환된 세포란 외생 DNA가 염색체 복제로 통합된 세포를 말한다. 이러한 안전성은 진핵 세포주 또는 클론이 외생 DNA를 함유하는 딸세포 집단을 생성시키는 능력에 의해 입증된다.
용어 "유사체," "단편," "유도체" 및 "변이체"는, 본 발명의 항체를 언급하는 경우, 하기 추가로 기재된 바와 같이, 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 항체의 유사체, 단편, 유도체 및 변이체를 의미한다.
"유사체"는 그의 내부에 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 프로-폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 활성 항체는 천연의 생체내 프로세스에 의해 또는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단에 의해 프로-항체 분자와 경쟁하는 추가의 아미노산으로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 재조합 scFV(TF)3e10 폴리펩티드 (서열 1)는 282 아미노산의 프로-폴리펩티드로서 발현된 다음, 생체내에서 프로세싱되어 성숙한 264 아미노산의 활성 폴리펩티드를 방출시킨다.
"단편"은 본원에서 하기에 추가로 기술된 시험관내 분석에 나타낸 바와 같이 실질적으로 유사한 기능적 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 일부이다.
"유도체"는 본원에 개시된 기능을 실질적으로 보존하며 추가의 구조 및 부수적 기능을 포함하는 본 발명의 항체에 대한 모든 변형물, 예를 들어 하기에서 추가로 기재된, 긴 반감기를 갖는 PEG화(PEGylated) 항체 및 비오티닐화 항체를 포함한다. 유도체는 또한 표준 재조합 DNA 기술에 의해 N- 또는 O-글리코실화 부위를 항체 서열로 삽입시킴으로써 발생될 수 있는 N- 또는 O-연결된 글리코실화 항체를 포함한다.
"실질적으로 유사한 기능적 활성" 및 "실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성"은, 각 폴리펩티드의 생물학적 활성을 동일한 방법 또는 분석에 의해 결정하는 경우, 비교 대상 폴리펩티드에 의해 입증된 생물학적 활성의 약 30％ 내지 100％ 또는 그보다 높은 범위인 생물학적 활성의 정도를 각각 의미한다. 예를 들어, 실시예 1 (서열 1)의 항체와 실질적으로 유사한 기능적 활성을 갖는 항체는 실시예 4에 기재된 sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 및 FX 활성화 분석에서 시험하는 경우에 FVIIa/TF 복합체와 결합하여 그를 중화시키는 능력을 입증하는 항체이다.
두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정한다. 이러한 보존적 치환으로는 문헌 [The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff (1978) and by Argos (1989) EMBO J. 8:779-785]에 있는 상기 기술된 것들을 들 수 있다. 예를 들어, 하기 군의 하나에 속하는 아미노산들은 보존적 변화를 나타낸다:
- Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr;
- Cys, Ser, Tyr, Thr;
- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
- Lys, Arg, His;
- Phe, Tyr, Trp, His; 및
- Asp, Glu.
본원에 사용된 "항체"는 원형 이뮤노글로불린 ("Ig") 분자, 및 그의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2 및 Fv를 포함하며, 이들은 선택된 표적 단백질의 에피토프, 예를 들어 가용성 TF ("sTF")와 결합할 수 있다. 통상적으로, 에피토프를 형성하기 위해 6개, 8개, 10개 또는 12개 이상의 인접 아미노산이 필요하다. 그러나, 인접하지 않는 아미노산을 포함하는 에피토프는 더 많은 아미노산, 예를 들어 15개, 25개 또는 50개 이상의 아미노산을 필요로 할 수 있다.
본원에 사용된 모든 다른 기술 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 항체 및 그의 발생 :
본 발명의 항응고 항체는 단독의 조직 인자 ("TF")보다 인자 VIIa/조직 인자 ("FVIIa/TF") 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 미세열량측정 분석으로 측정한 바로는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 더 바람직하게는 10배 이상 더 큰 친화성으로 결합한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 TF에 결합하는데 있어서 인자 VII ("FVII"), 인자 IX ("FIX") 및 인자 X ("FX")로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 응고 인자와 경쟁하지 않는다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는다. 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하며 TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는다.
일반적으로 말해서, 선택된 표적 단백질 (예, FVIIa/TF 복합체 또는 TF)에 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 분석에서 사용되는 경우에 다른 단백질에 제공되는 검출 신호보다 5배, 10배 또는 20배 더 높은 검출 신호를 제공한다. 바람직하게는, 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 분석에서 다른 단백질을 검출하지 않으며, 용액에서 표적 단백질을 면역침전시킬 수 있다.
선택된 표적 단백질을 사용해서 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이 또는 인간을 면역화함으로써 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 필요하다면, 표적 단백질을 운반 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민, 티로글로불린, 및 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합시킬 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 보조제를 사용해서 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제로는 프로인트(Freund's) 보조제, 미네랄 겔 (예, 수산화 알루미늄), 및 표면 활성 물질 (예, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀)을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 인간에 사용되는 보조제 중에서, BCG (바실러스 칼메트-구에린(bacilli Calmette-Guerin)) 및 코르니박테리움 파르붐(Cornybacterium parvum)이 특히 유용하다.
선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 배양에서 연속 세포주에 의해 항체 분자를 제조하는 임의의 기술을 사용해서 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술 [Kohler et al. (1985) Nature 256: 495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; and Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120]을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, "마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자로 스플라이싱시켜 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻는 기술"인, "키메라 항체"의 제조를 위해 개발된 기술을 이용할 수 있다 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452-454]. 또한, 모노클로날 및 다른 항체를 "인간화"시킴으로써 환자가 치료적으로 사용되는 항체에 대해 면역 반응을 수행하지 못하도록 할 수도 있다. 이러한 항체는 직접 사용될 인간 항체의 서열과 충분히 유사할 수 있거나 또는 몇몇 핵심 잔기의 변형을 필요로 할 수 있다. 설치류 항체와 인간 서열 사이의 서열 차이는 각 잔기의 부위 지시적 돌연변이유발에 의해 인간 서열의 잔기와 상이한 잔기를 대체하거나 또는 전체 상보성 결정 영역을 이식 (grafting)하여 최소화할 수 있다. 또는, 인간화 항체는 GB2188638B에 기재된 바와 같은 재조합 방법을 이용해서 제조할 수 있다. 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 제5,565,332호에 개시된 바와 같이 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항원-결합 부위를 함유할 수 있다.
또는, 당업계에 공지된 방법을 이용해서 단쇄 항체의 제조를 위한 기술을 변형하여 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체 ("scFv")를 제조할 수 있다. 관련된 특이성을 갖지만 구별되는 이디오타입(idiotypic) 조성의 항체는 랜덤 조합의 Ig 라이브러리로부터의 체인 셔플링(chain shuffling)에 의해 생성시킬 수 있다 [Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123].
또한, 단쇄 항체는 템플레이트로서 하이브리도마 cDNA를 사용하여 PCR과 같은 DNA 증폭 방법을 이용해서 구성할 수도 있다 [Thirion et al. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5: 507-511]. 단쇄 항체는 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있으며, 2가 또는 4가일 수 있다. 4가의 이중특이적 단쇄 항체의 구성은 예를 들어 문헌 [Coloma and Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15: 159-163]에 교시되어 있다. 2가의 이중특이적 단쇄 항체의 구성은 문헌 [Mallendar and Voss (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-216]에 교시되어 있다.
단쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 수동 또는 자동 뉴클레오티드 합성을 이용해서 구성하고, 표준 재조합 DNA 방법을 사용해서 발현 구조물내에 클로닝하고, 세포내에 도입하여 코딩 서열을 발현시킨다. 또는, 단쇄 항체는 예를 들어 섬유상 파지 디스플레이 기술 [Verhaar et al. (1995) Int. J. Cancer 61: 497-501; and Nicholls et al. (1993) J. Immunol. Meth. 165: 81-91]을 이용해서 직접 제조할 수 있다.
또한, 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 림프구 집단에서 생체내 생성을 유도함으로써 또는 문헌 [Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299]에 개시된 바와 같이 Ig 라이브러리 또는 고 특이적 결합 시약의 패널을 스크리닝함으로써 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 DNA는 당업자에게 공지된 임의의 클로닝 방법에 의해 cDNA 또는 게놈 형태로 클로닝할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Sambrook, J. F. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]을 참조한다.
항체가 모노클로날 항체인 경우, Fv 영역을 코딩하며 발현되었을 때 특이적 결합 활성을 나타내는 DNA 서열을 동정했다면, 그러한 Fv 영역을 포함하는 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Chaudhary, V. K. et al. (1989) Nature 339 (6223): 394-397; Batra, J. K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (25): 15198-15202; Batra, J. K. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (21): 8545-8549; Chaudhary, V. K. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (3): 1066-1070]은 다양한 단쇄 항체 단백질의 제조에 대하여 기술한다.
바람직한 방법으로, 본 발명의 TF-결합 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용해서 제조한 단쇄 항체이다. 단쇄 항체의 에피토프-결합 영역은 2개의 가변 영역 도메인으로 구성되는데, 이중 하나는 중쇄로부터 유래하며, 다른 하나는 경쇄로부터 유래한다. 파지 디스플레이 라이브러리를 구성하는 제1 단계에서, 패밀리 특이적 프라이머 세트를 사용해서 가변 유전자 (VH (IgM에서 유래) Vκ 및 V L)를 인간 골수, 림프절 및 비장으로부터의 취합된 mRNA로부터 PCR 클로닝하였다. 생성된 pCITE-VH (3.8×109개의 구성원), pZ604-Vκ(1.6×107) 및 pZ604-VL (3.2×107) 라이브러리는 V 유전자의 영구적인 높은 다양성을 나타낸다. 이어서, VH 유전자를 pCITE-VH 라이브러리로부터 증폭시킨다. Vκ 및 VL 유전자를 5' 말단에서 반대의 JH 및 링커 서열을 갖는 pZ604-Vκ 및 pZ604-VL 라이브러리로부터 PCR 증폭시킨다. 이어서, PCR 생성물을 함유하는 겔 정제된 VH, Vκ, 및 VL을 함께 스플라이싱하여 scFv 유전자 레퍼토리를 제조한다. scFv 유전자 레퍼토리를 파지미드 벡터 pZ603에 클로닝하고, 라이게이션 생성물을 전기천공된 수용성(competent) TG1 이. 콜라이 세포에 넣어 5.2×109개의 각 형질전환체를 갖는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리 HuPhabL3을 생성시킨다 [Kay, B. K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J. D. et al. (1991) J. Mol Biol. 222 (3): 581-597; Sheets, M. D. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95 (11): 6157-6162].
scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 TF-결합 파지를 선택하고, 증폭시킨 다음, 당업계에 잘 알려진 패닝(panning) 기술을 사용해서 동정한다. 가용성 TF를 플라스틱 튜브에 고정시키고, 탈지 우유를 사용해서 플라스틱에 대한 비-특이적 결합을 감소시킨다. scFv 파지의 집단을 플라스틱 튜브내 고정된 sTF에 노출시키고, 비결합된 파지를 전체적으로 세척하여 제거한다. TF-결합 scFv 파지를 튜브로부터 용출시킨 다음, 용액 중 TG1 이. 콜라이 세포를 감염시켜 증폭시킨다. 이러한 패닝 방법을 3회 반복하고, 생성된 TF-결합 scFv 파지는 TG1 세포를 형질전환시켜 단리한다. TF-결합 항체를 발현시키는 형질전환체는 96-웰 디쉬내 플라스틱상에 고정된 sTF를 사용하는 표준 ELISA를 사용해서 동정한다. ELISA-양성 형질전환체의 단쇄 항체 삽입체의 DNA를 서열화한다. DNA 서열 분석을 기초로, 6개의 특이적 단쇄 항체인 scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 및 scFv(TF)3h2가 본원에서 확인되었고, 이. 콜라이로부터 발현 및 정제하였으며, 하기 실시예 5에 기술된 바와 같이 특성화하였다.
본 발명의 항체의 발현 및 정제:
이. 콜라이, 바쿨로바이러스, 효모, 포유동물 세포 또는 다른 발현 시스템을 비롯하여 시험관내에서 본 발명의 재조합 항체를 발현시키는 여러 방법들이 있다. 클로닝된 유전자를 박테리아에서 발현시키는 방법은 잘 알려져 있다. 클로닝된 유전자를 원핵생물 시스템에서 높은 수준으로 발현시키기 위해서는 최소한 mRNA 전사 종결을 지시하는 강력한 프로모터를 함유하는 발현 벡터를 구성하는 것이 필수적이다. 이러한 목적에 적합한 조절 영역의 예로는 이. 콜라이 베타-글루코시다제 유전자의 프로모터 및 오퍼레이터 영역, 이. 콜라이 트립토판 생합성 경로, 또는 파지 람다로부터의 좌측 프로모터가 있다. 이. 콜라이를 형질전환시키는 DNA 벡터내에 선별 마커를 포함시키는 것이 유용하다. 이러한 마커의 예로는 암피실린, 테트라사이클린 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 지정하는 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 항체, 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 발현에 유용한 고등 진핵 세포 시스템 중에서, 다수의 세포 시스템을 선택한다. 포유동물 세포주의 예로는 RPMI 7932, VERO 및 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7, C127 또는 MDCK 세포주를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 포유동물 세포주는 CHL-1이다. CHL-1을 사용하는 경우, 히그로마이신이 진핵생물 선별 마커로서 포함된다. CHL-1 세포는 쉽게 이용가능한 인간 세포주인 RPMI 7032 흑색종 세포로부터 유도된다. CHL-1 세포주는 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 기탁되었으며, 1987년 6월 18일자로 기탁되어 기탁번호 #CRL 9446을 배정받았다. 본 발명에 사용하기에 적합한 세포는 ATCC로부터 상업적으로 이용가능하다. 예시적인 세포주로는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)를 들 수 있다.
원핵생물 시스템인 이. 콜라이는 번역후 변형, 예를 들어 글리코실화를 수행할 수 없다. 또한, 복잡한 디술피드 패턴을 갖는 단백질은 이. 콜라이에서 발현되는 경우에 흔히 미스폴딩(misfolded)된다. 원핵생물 시스템에 있어서, 발현된 단백질은 이른바 봉입체(inclusion body)라 불리는 불용성 형태로 세포질내에 존재하거나, 세포가 용해된 후에 가용성 분액 중에서 발견되거나, 또는 적절한 분비 신호 서열의 부가에 의해 원형질막주변공간(periplasm)으로 지시된다. 발현된 단백질이 불용성 봉입체내에 존재한다면, 봉입체의 가용화 및 이후의 리폴딩이 일반적으로 요구된다.
많은 원핵생물 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 상업적으로 이용할 수 있는 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) 및 pGEM1 (Promega Biotech, Madison,WI, USA)이 있다.
재조합 미생물 발현 시스템에 통상적으로 사용되는 프로모터로는 베타-락타마제 (페니실리나제) 및 락토스 프로모터 시스템 (Chang, A. C. et al. (1978) Nature 275 (5681): 617-624; Goeddel, D. V. et al. (1979) Nature 281 (5732): 544-548), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel, D. V. et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8 (18): 4057-4074) 및 tac 프로모터 (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982))를 들 수 있다. 다른 유용한 박테리아 발현 시스템은 람다 파지 pL 프로모터 및 clts857 열-유도가능한 리프레서 (Bernard, H. U. et al. (1979) Gene 5 (1): 59-76; Love, C. A. et al. (1996) Gene 176 (1-2): 49-53)를 사용한다. 또한, 재조합 항체는 효모 숙주, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 발현될 수도 있다. 이는 다양한 번역후 변형을 수행하는 능력을 제공하는 것이 일반적이다. 발현된 항체는 다수의 기타 단백질들이 존재하지 않는 배양 상등액으로 분비될 수 있으며, 이로서 정제가 보다 용이해진다. 본 발명의 항체의 발현을 위한 효모 벡터는 여러 필요한 특징을 포함한다. 벡터의 요소는 일반적으로 효모 및 박테리아로부터 유도되며 이들 둘 다에서 플라스미드의 증식을 허용한다. 박테리아 요소로는 복제 기점 및 선택가능한 마커를 들 수 있다. 효모 요소로는 복제 기점 서열 (ARS), 선택가능한 마커, 프로모터 및 전사 종결자를 들 수 있다.
발현을 위한 효모 벡터내 적합한 프로모터로는 TRP1 유전자, ADH1 또는 ADHII 유전자, 산 포스파타제 (PH03 또는 PH05) 유전자, 이소시토크롬 유전자의 프로모터, 또는 해당 경로에 관여하는 프로모터, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GADPH), 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 헥소키나제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제 및 포스포글루코스 이소머라제의 프로모터를 들 수 있다 [Hitzeman, R. A. et al. (1980) J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-12080; Hess, B. et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149-167; and Holland, M. J. and Holland, J. P. (1978) Biochemistry 17 (23): 4900-4907].
상업적으로 이용가능한 효모 벡터로는 pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255), 및 YpGX265GAL4 (ATCC # 67233)를 들 수 있다. 포유동물 세포주로는 COS-7, L 세포, C127, 3T3, 차이니스 햄스터 난소 (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO를 들 수 있지만 이에 한정되지 않으며, HEK293을 사용해서 본 발명의 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 포유동물 세포에서 생산되는 재조합 단백질은 통상적으로 가용성이고, 글리코실화되며, 확실한 N-말단을 갖는다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사된 요소, 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 인핸서, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예를 들어 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 어셉터(acceptor) 부위 및 스플라이스 공여자, 및 전사 종결 서열을 함유할 수 있다. 일반적으로 포유동물 발현 벡터에 사용되는 프로모터로는, 예를 들어 바이러스 프로모터, 예를 들어 폴리오마, 아데노바이러스, HTLV, 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV 40), 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)가 있다.
선택된 발현 시스템 및 숙주에 따라, 동종 재조합 항체는 단백질 정제에 사용되는 통상의 크로마토그래피의 다양한 조합을 이용하여 얻을 수 있다. 이러한 크로마토그래피로는 면역친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 HPLC를 들 수 있다. 발현 시스템이 항체를 배양 배지로 분비하는 경우, 단백질을 배지로부터 직접 정제할 수 있다. 항체가 분비되지 않는 경우, 항체는 세포 용해물로부터 단리된다. 세포 파열은 동결-해동 사이클링, 초음파분해, 기계적 파열 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다.
pCANTAB5를 기초로 하는 플라스미드 구조물 (Pharmacia)을 박테리아에서 사용하여 본 발명의 단쇄 항체를 발현시켰다. 예를 들어, 단쇄 항체 scFv(TF)3e10을 함유하는 플라스미드는 pZ612/3e10이며, 단백질 정제에 사용될 수 있는 e-tag 서열 이후의 단쇄 항체 서열을 코딩한다. scFV(TF)3e10 항체의 아미노산 서열은 서열 1 (실시예 1)에 상응하며, scFv(TF)3e10을 코딩하는 DNA 서열은 서열 2에 상응한다.
pTHR525를 기초로 하는 플라스미드 구조물 (미국 특허 제5,827,824호 참조)을 포유동물에서 사용하여 본 발명의 단쇄 항체를 발현시켰다. 예를 들어, 박테리아 발현 플라스미드에서 N-말단 신호 서열 및 C-말단 e-tag 서열을 비롯한 프로-scFv(TF)3e10 아미노산 서열에 걸쳐있는 DNA 단편을 생성시키기 위해 프라이머를 설계하였다. PCR을 수행하여 암피실린 내성 유전자 및 히그로마이신 및 DHFR 선별 마커를 함유하는 포유동물 발현 플라스미드에 삽입된 DNA 단편을 생성시켰다. 본 발명의 단쇄 항체의 발현은 MPSV LTR 프로모터에 의해 유도되었다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 발현 구조물로 CHO DXB11 세포를 형질감염시켰다. HAMS/F12 배지 중 400 ㎍/ml 히그로마이신 B를 사용해서 안정한 집단을 선별하였다. 발현 수준은 대략 500 ㎍/L이었다. 발현 수준을 증가시키기 위해, 알파 MEM 배지 중 100 nM 메토트렉세이트를 사용해서 집단을 선별하였다. 이 집단의 대략적인 발현 수준은 5 mg/L이었다.
본 발명의 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 항체는 TF가 결합된 컬럼상에 통과시켜 친화성 정제할 수 있다. 이어서, 결합된 TF-항체는 고농도의 염을 함유하는 완충액을 사용해서 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다.
본원에 기재된 단쇄 항체는 단백질의 C-말단에서 e-tag 서열을 함유한다. 항-e-tag 친화성 컬럼을 아메리칸/파마시아 바이오테크 (American/Pharmacia Biotech)사로부터 구입하였다. 세포 배양 배지를 0.22 ㎛ 크기의 필터를 통해 여과하고, 2 ml/분의 속도로 5 ml e-tag 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 0.2 M 인산염 완충액 0.05％ NaN3 (pH 7.0)으로 세척한 다음, 0.1 부피의 1 M Tris 완충액 (pH 8.2)을 함유하는 튜브에 모아서 용출 완충액을 중화시켰다. 또는, 여과된 배양 배지를 단백질 A 컬럼에 로딩하였다. 이 경우, 컬럼을 50 mM 시트르산, 300 mM NaCl (pH 6.5)로 세척하고, pH 3.0의 동일 완충액으로 용출시켰다. 상기 두 경우에서, 정제된 샘플을 이후에 세파덱스 (Sephadex) 200 컬럼에 로딩하여 항체의 이량체 형태로부터 단량체를 분리하였다.
본 발명의 항체의 선별:
항체가 생성, 발현 및 정제되면, 본 발명의 항체를 동정하기 위해, BIAcore, sTF 의존성 인자 VIIa 분석 (sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석), FX 활성화 분석, 및 실시예 4에 기술된 PT 분석을 이용해서 항체를 추가로 특성화할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는 TF-결합 scFv 항체를, sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석을 이용해서 선별하였다. 이 분석에서, TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는 TF-항체는 KD(app)를 증가시킬 것으로 예상된다. 도 2는 단쇄 항체 scFv(TF)3e10이 KD(app)를 약 5배 증가시켰음을 보여준다. 미세열량측정 분석을 이용해서 단독의 TF에 비해 FVIIa/TF 복합체에 대한 TF-항체의 친화성을 측정한다. 도 5는 단쇄 항체 scFv(TF)3e10이 FVIIa/TF 복합체 및 자유 TF에 결합하는데 있어서 각각 600 nM and 33 nM의 KD를 가짐을 보여주는데, 이는 단독의 TF에 비해 FVIIa/TF 복합체에 대해 약 20배 더 큰 친화성에 상응한다. 본 발명의 항체는 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상 더 큰 친화성을 갖는다.
TF와 결합하는데 있어서 FVII와 경쟁하지 않는 TF-결합 scFv 항체는 sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석을 이용해서 선별한다. 이 분석에서, TF에 결합하는데 있어서 FVIIa와 경쟁하는 TF-항체는 발색 기질 S2266의 가수분해를 억제할 것으로 예상된다. 도 1은 단쇄 항체 scFv(TF)3e10이 FVIIa 활성을 억제하지 않았으며 실제로는 상기 활성을 증가시켰음을 보여준다.
FX 활성화를 억제하는 TF-결합 scFv 항체는 PT 분석 및 FX 활성화 분석을 이용해서 선별한다. PT 분석에서, PT를 연장하는 TF-항체는 FX 활성화를 억제할 것으로 예상된다. 도 3은 단쇄 항체 scFv(TF)3e10이 PT를 연장했음을 나타내며, 이는 상기 항체가 FX 활성화를 억제함을 암시한다. FX 활성화 분석에서, FXa 활성을 억제하는 TF-항체는 발색 기질 S2222의 가수분해를 억제할 것으로 예상된다. 도 6은 단쇄 항체 scFV(TF)3e10이 FXa 활성을 억제했음을 보여준다.
TF에 결합하는데 있어서 FX와 경쟁하지 않는 TF-결합 scFv 항체는 FX 활성화 분석을 이용해서 선별한다. 이 분석에서, FX와 경쟁하지 않는 TF-항체는 사용된 FX의 농도와는 무관하게 FX 활성화를 억제할 것으로 예상된다. 도 7은 단쇄 항체 scFv(TF)3e10이 FXa 활성을 FX 농도-의존적 방식으로 억제했음을 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, TF에 대한 단일 VH/VL 결합 부위를 갖는 단쇄 항체 (scFv(TF)3e10)를 동정했다. scFv(TF)3e10의 아미노산 서열은 실시예 1에 나타나 있으며, 서열 1에 상응한다. scFv(TF)3e10을 코딩하는 DNA 서열은 서열 2에 상응한다.
본 발명의 항체의 유사체, 단편, 유도체 및 변이체:
본 발명의 항체의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고, 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않는 것; (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; (iii) 성숙 항체가 항체의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합된 것; 또는 (iv) 리더 또는 분비 서열, 또는 성숙 항체의 정제에 사용되는 서열과 같은 부가 아미노산이 성숙 항체와 융합된 것일 수 있다. 그러한 유사체, 단편, 유도체 및 변이체는 본원의 교시 내용으로부터 당업자의 기술 범위 내에 있는 것으로 간주한다.
바람직하게는, 본 발명의 유도체는 하나 이상의 예상된 잔기, 바람직하게는 비필수 아미노산 잔기에서의 보존적 아미노산 치환 (하기에 추가로 정의됨)을 함유할 것이다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 야생형 단백질 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이며, "필수" 아미노산은 생물학적 활성에 필요한 잔기이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이들 군에는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 비보존적 치환은, 이러한 비보존적 치환이 하기 추가로 기술된 항체 변이체를 선별하기 위해 수행된 경우에만, 보존적 아미노산 잔기 또는 보존적 단백질 도메인 내에 있는 아미노산 잔기에 대해 이루어질 것이다. 단편 또는 생물학적 활성 부분에는 의약 및 연구용 시약 등으로서 사용하기 적합한 폴리펩티드 단편이 포함된다. 이러한 단편에는, 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열 또는 상기 항체의 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 폴리펩티드의 활성 중 하나 이상을 나타내지만 본원에 개시된 전장 폴리펩티드의 아미노산 서열보다는 개수가 작은 펩티드가 포함된다.
또한, 본 발명의 바람직한 유도체에는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키고(시키거나) 폴리펩티드의 잠재적 면역원성을 감소시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, "PEG")과 같은 다른 화합물과 융합된 성숙 항체가 포함된다. PEG는 항체에 수 용해도, 크기, 신장을 통한 제거 속도의 완화, 및 면역원성 감소를 부여하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,214,966호 참조). PEG화의 경우, 항체와 PEG의 융합은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, PEG화는 우선 항체에 시스테인 돌연변이를 도입한 후에, PEG-말레이미드를 사용한 부위-특이적 유도체화에 의해 달성될 수 있다. 시스테인은 펩티드의 C-말단에 부가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tsutsumi et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15):8548-8553] 참조). 항체에서 이루어질 수 있는 다른 변형에는 비오티닐화가 포함된다. 특정한 경우, 항체는 스트렙타비딘과 용이하게 반응할 수 있도록 비오티닐화되는 것이 유용할 수 있다. 단백질의 비오티닐화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, N- 또는 O-글리코실화 부위를 항체 서열에 도입하여 항체의 번역후 N- 또는 O-연결된 글리코실화가 생체내에서 일어나도록 할 수 있다.
본 발명의 항체의 변이체에는 본래의 항체의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"이란 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열이 공통의 구조 도메인 및(또는) 공통의 기능적 활성을 갖도록 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기는 충분한 개수로 함유하고 등가인 아미노산 잔기는 최소 개수로 함유하는 것을 의미한다. 예를 들어, 공통의 구조 도메인을 함유하며 약 45％ 이상, 바람직하게는 약 75％ 내지 98％ 동일한 아미노산 서열이 본원에서 충분히 유사한 것으로 정의된다. 바람직하게는, 변이체는 본 발명에 따른 바람직한 항체의 아미노산 서열과 충분히 유사할 것이다. 변이체에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체와 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 변이체가 포함된다. 그러한 변이체는 일반적으로 본 발명에 따른 항체의 기능적 활성을 보유한다. 폴리뉴클레오티드 단편의 라이브러리를 사용하여, 스크리닝 및 추후 선별을 위한 다채로운 단편 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 한 분자 당 약 1회의 닉 (nick)만이 발생하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 이중-가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중-가닥 DNA를 변성시키고, 상기 DNA를 복구시켜 상이한 닉 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중-가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레아제로 처리하여 변형된 이중체 (duplex)로부터 단일-가닥 DNA를 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 라이게이션시킴으로써 단편 라이브러리를 제조할 수 있다. 이 방법에 의해, 본 발명에 따른 항체에 대한 다양한 크기의 N-말단 단편 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.
변이체에는, 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열이 다른 항체가 포함된다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 따라 돌연변이유발을 수행하여 Ig 경쇄 및 중쇄의 VL 및 VH 도메인을 변형시킴으로써 자유 TF에 비해 FVIIa/TF 복합체에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 변이체를 생성시킬 수 있다. 특히 바람직한 변이체에는 VL 및 VH 도메인의 상보성 결정 영역내에 변형된 부분을 갖는 항체가 포함된다.
또한, 변이체에는 돌연변이유발에 의한 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실로 인해 아미노산 서열에서 차이가 있는 항체가 포함된다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용해서 돌연변이유발을 수행하여 Ig 경쇄 및 중쇄의 VL 또는 VH 도메인의 N-말단 또는 C-말단 부위의 아미노산을 삽입 또는 결실시킴으로써 실질적으로 유사한 기능적 활성을 보유하는 변이체를 생성시킬 수 있다. 특히 바람직한 변이체에는 VL 및 VH 도메인 사이에 있는 VL-VH 링커의 아미노산 잔기가 삽입 또는 결실된 단쇄 항체가 포함된다. 실시예 1에 나타낸 단쇄 항체의 VL-VH 링커 서열은 아미노산 잔기 5개의 길이이다. 아미노산 0개 내지 20개의 다른 짧은 링커 서열을 사용할 수 있으며 이 항체는 실질적으로 유사한 기능적 활성을 보유한다는 것은 분명할 것이다. 존재하는 VL-VH 링커의 변형은 단쇄 항체의 이량체 형태의 안정성을 증가시키 것에 목적을 둘 수 있다.
한 실시양태에서, 다채로운 변이체 라이브러리는 핵산 수준에서의 조합 돌연변이유발에 의해 생성되며, 다채로운 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 다채로운 변이체 라이브러리는, 예를 들어 잠재적 변이체 아미노산 서열의 다의성 (degenerate) 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 별법으로 서열들의 세트를 내부에 함유하는 큰 융합 단백질 (예컨대, 파지 디스플레이를 위한 것)로서 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 효소에 의해 유전자 서열로 라이게이션시킴으로써 생성될 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 이용될 수 있는 방법은 다양하다. 다의성 유전자 서열의 화학 합성을 자동화 DNA 합성기에서 수행하고, 이어서 합성 유전자를 적당한 발현 벡터 내에 라이게이션시킬 수 있다. 다의성 유전자 세트를 사용하면, 잠재적 변이체 서열의 원하는 세트를 코딩하는 모든 서열을 하나의 혼합물에 제공할 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang (1983) Tetrahedron 39:3], [Itakura et al. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323], [Itakura et al. (1984b) Science 198:1056], [Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).
점 돌연변이 또는 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선별된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러가지 기술이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 기술은 항체의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리를, TF- 또는 FVIIa/TF 복합체-결합 활성 또는 FX 활성화 억제 활성에 대해 신속하게 스크리닝하도록 개조될 수 있다. 통상적으로, 고처리량 분석을 수행하여 대규모 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 이용되는 기술에는, 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터로 클로닝하는 것, 생성된 벡터 라이브러리로 적당한 세포를 형질전환시키는 것, 및 원하는 활성의 검출이 검출된 유전자 생성물을 코딩하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것이 포함된다. 라이브러리 내에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술인 순환성 앙상블 (recursive ensemble) 돌연변이유발 (REM)을 스크리닝 분석과 함께 이용하여 원하는 변이체를 확인할 수 있다.
실시예 1은 하나의 TF-결합 단쇄 항체, scFv(TF)3e10 (서열 1)의 아미노산 서열을 나타내며, VL-VH 링커 및 VL 및 VH 도메인을 기술한다. TF- 또는 FVIIa/TF 복합체-결합 활성을 갖거나 FX 활성화를 억제하는 변이체는 실시예 4에 기술된 sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 또는 FX 활성화 분석을 이용해서 본 발명의 항체의 돌연변이체, 예를 들어 삽입, 말단절단 또는 점 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 항체는 실시예 1 및 3 (서열 1 및 3)의 항체, 및 이로부터 유래하는 서열내에 실질적이지 않은 변화를 갖는 항체를 포함한다. "실질적이지 않은 변화"로는 본 발명의 항체의 하나 이상의 생물학적 기능, 예를 들어 FX 활성화를 억제하는 능력을 실질적으로 유지하는 임의의 서열, 치환 또는 결실 변이체를 포함한다. 이러한 기능적 등가물은 바람직하게는 서열 1 또는 서열 3의 단쇄 항체의 VL 또는 VH 영역 도메인과 약 90％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 서열 1 또는 서열 3의 단쇄 항체의 VL 또는 VH 영역 도메인과 95％ 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 서열 1 또는 서열 3의 단쇄 항체의 VL 또는 VH 영역 도메인과 97％ 이상의 동일성을 갖는 항체를 포함할 수 있으며, 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 상기 항체의 일부를 포함하기도 한다. 그러나, 본원에 추가로 기술된 기능적 등가성을 입증하는, 서열 1 또는 서열 3의 항체로부터의 아미노산 서열의 실질적이지 않은 변화를 갖는 임의의 항체는 본 발명의 기술내용에 포함된다.
제약 조성물:
또한, 본 발명은 치료 효과를 달성하기 위해 환자에게 투여될 수 있는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은, 원하는 정도의 순도를 갖는 본 발명의 항체를 제약상 허용되는 제약상 유효량의 담체와 조합하여 투여하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 정맥내 투여, 피하 투여 또는 경막내 투여용 제약 조성물에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 기재된 항체는 5％ 덱스트로스, 락테이트 처리된 링거액, 통상의 염수, 멸균수, 또는 정맥내 관주용으로 디자인된 임의의 다른 시판용 생리 완충액과 같은 허용가능한 멸균 제약 담체와 조합되는 것이 바람직하다. 담체 용액의 선택, 및 조성물의 투여량 및 투여법은 대상체 및 특정한 임상적 환경에 따라 달라질 것이고, 이것이 표준 의학 절차에 의해 제어된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 이들 제약 조성물은 대상체에서의 과량의 트롬빈 생성과 관련한 병리적 결과를 억제하는 데 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
항체는 정맥내 볼루스 주사, 일정한 정맥내 관주, 또는 상기 2가지 경로의 조합에 의해 투여될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 적당한 부형제와 혼합된 항체는 근육내 부위로부터 순환될 수 있다. 항체를 사용한 전신 처치는, 환자로부터 채취한 일련의 혈액 샘플에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (PT)을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이 분석법에서 관찰된 응고 시간은, 항체가 순환계에 충분한 양으로 존재하는 경우에 연장된다.
본 발명의 재조합 항체 및 제약 조성물은 비경구, 국소, 정맥내, 경구 또는 국부 투여에 유용하다. 투여 방법에 따라, 제약 조성물은 다양한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 단위 투여 형태는 정제, 캡슐, 분말, 용액 및 에멀젼 등을 비롯하지만 이에 한정되지 않는 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 재조합 항체 및 제약 조성물은 정맥내 투여에 특히 유용하다. 투여용 조성물은 통상적으로 제약상 허용되는 담체 (바람직하게는 수성 담체) 중에 용해된 단쇄 항체의 용액을 포함할 것이다. 예를 들어, 완충 염수 등과 같은 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균된 것이며, 일반적으로 원치않는 물질이 없는 것이다. 이 조성물은 널리 공지된 통상의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
통상적인 정맥내 투여용 제약 조성물은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여되는 양은 분명히 단백질에 특이적이며, 그의 효능 및 약물동력학적 프로파일에 따라 달라진다. 비경구 투여용 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 분명한 것이며, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980)]과 같은 간행물에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 칵테일 (즉, 다른 단백질과의 혼합물)을 함유하는 조성물은 치료제로서 투여될 수 있다. 치료 분야에 있어서, 조성물은 출혈성 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자에게, 출혈을 치유하거나 적어도 출혈을 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적당한 양을 "치료 유효량"으로 정의한다. 이 용도에 효과적인 양은 질환의 중증도 및 환자의 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
환자가 필요로 하고 허용할 수 있는 투여량 및 투여 빈도에 따라, 조성물을 1회 또는 다수회 투여할 수 있다. 어떤 경우에든, 상기 조성물은 환자를 치료하기에 효과적인 충분한 양으로 본 발명의 단백질을 제공해야만 한다.
본 발명의 항체 또는 그의 제약상 허용되는 조성물은, 사용된 특정 항체의 활성; 항체의 대사 안정성 및 작용 지속 시간; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 방식 및 투여 시간; 배설 속도; 약물 병용 여부; 구체적인 질환 상태의 중증도; 및 치료법을 수행받는 숙주를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라지는 치료 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 일일 치료 유효량은 하루에 체중 1 ㎏당 본 발명의 항체 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 약 0.14 ㎎ 내지 약 14.3 ㎎으로 투여하는 것이고, 바람직하게는 하루에 체중 1 ㎏당 약 0.7 ㎎ 내지 약 10 ㎎으로 투여하는 것이며, 가장 바람직하게는 하루에 체중 1 ㎏당 약 1.4 ㎎ 내지 약 7.2 ㎎으로 투여하는 것이다. 예를 들어, 체중이 70 ㎏인 사람에게 투여하는 경우, 투여량 범위는 본 발명의 항체 또는 제약상 허용되는 그의 조성물 약 10 ㎎/일 내지 약 1.0 g/일이고, 바람직하게는 약 50 ㎎/일 내지 약 700 ㎎/일이며, 가장 바람직하게는 약 100 ㎎/일 내지 약 500 ㎎/일이다.
세포 및 유전자 치료법:
또한, 본 발명의 항체는 상기 항체를 생체내에서 발현시킴으로써 (대체로 "유전자 치료법"으로 언급됨) 본 발명에 따라 사용될 수도 있다. 이와 같이, 예를 들어, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)로 세포를 생체외에서 유전공학적으로 조작하고, 이어서 항체로 처치될 환자에게 상기 조작된 세포를 제공할 수 있다. 이런 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 당업계 공지의 절차에 의해 세포를 유전공학적으로 조작할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 "유전자 치료법"이라 불리는 방법에 의해 생체내에서 상기 항체를 발현시킴으로써 본 발명에 따라 사용할 수도 있다. 이와 같이, 예를 들어, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)로 바이러스를 유전공학적으로 조작하고, 이어서 항체로 처치될 환자에게 상기 조작된 바이러스를 제공할 수 있다. 이런 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스는 당업계에 공지된 방법에 의해 유전공학적으로 조작할 수 있다.
세포 또는 유전자 치료법을 이용하여 본 발명의 항응고 항체를 국부 전달함으로써, 표적 영역 (내피 세포 연결 혈관)에 치료제를 제공할 수 있다.
시험관내 및 생체내 둘 모두의 유전자 치료법을 고려할 수 있다. 잠재적 치료 유전자를 정해진 세포 집단으로 전달하는 여러가지 방법이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mulligan (1993) Science 260:926-931] 참조). 이러한 방법으로는 하기 전달 방법이 포함된다:
1) 직접 유전자 전달 (예를 들어, 문헌 [Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468] 참조);
2) 리포좀에 의해 매개되는 DNA 전달 (예를 들어, 문헌 [Caplen et al. (1995) Nature Med. 3:39-46], [Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17], [Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285] 참조);
3) 레트로바이러스에 의해 매개되는 DNA 전달 (예를 들어, 문헌 [Kay et al. (1993) Science 262: 117-119], [Anderson (1992) Science 256:808-813] 참조);
4) DNA 바이러스에 의해 매개되는 DNA 전달 (상기 DNA 바이러스에는 아데노바이러스 (바람직하게는 Ad2 또는 Ad5에 기초한 벡터), 헤르페스 바이러스 (바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스에 기초한 벡터) 및 파르보바이러스 (바람직하게는 "결함" 또는 비-자발성 파르보바이러스에 기초한 벡터, 보다 바람직하게는 아데노-관련 바이러스에 기초한 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2에 기초한 벡터)가 포함됨; 예를 들어, 문헌 [Ali et al. (1994) Gene Therapy 1:367-384], 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 미국 특허 제4,797,368호, 및 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 간주되는 미국 특허 제5,139,941호 참조).
목적하는 유전자를 전달하기 위한 특정 벡터 시스템은 다양한 인자에 따라 다르게 선택될 것이다. 중요한 인자 중 하나는 표적 세포 집단의 성질이다. 레트로바이러스 벡터가 널리 연구되고 많은 유전자 치료 분야에서 사용되어 왔지만, 이 벡터는 일반적으로 분열하지 않는 세포를 감염시키는데 적합하지 못하다. 또한, 레트로바이러스는 종양형성에 대한 잠재력을 갖는다. 그러나, 렌티바이러스 벡터 분야에서의 최근의 개발에 의해 이러한 몇몇 한계를 극복할 수 있다 (문헌 [Naldini et al. (1996) Science 272: 263-267] 참조).
본원에서 상기 언급된 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 몰로네이 뮤린(Moloney Murine) 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어 로우스(Rous) 육종 바이러스, 하베이(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 기번(gibbon) 원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로네이 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유도된다.
넓은 숙주 범위를 갖는 이점이 있는 아데노바이러스는 정지 상태이거나 최종적으로 분화된 세포, 예를 들어 신경세포 또는 간세포를 감염시킬 수 있으며, 본질적으로는 종양을 형성하지 않는 것으로 보인다 (예를 들어, 문헌 [Ali et al. (1994), supra, p. 367] 참조). 아데노바이러스는 숙주 게놈으로 통합되지 않는 것으로 보인다. 아데노바이러스가 염색체 외부에 존재하기 때문에, 삽입에 의한 돌연변이유발의 위험은 크게 감소한다 [Ali et al. (1994), supra, p. 373].
아데노-관련 바이러스는 아데노바이러스에 기초한 벡터와 유사한 이점을 나타낸다. 그러나, AAV는 인간의 19번 염색체에 대해 부위-특이적 통합을 나타낸다 [Ali et al. (1994), supra, p. 377].
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA는 심부 정맥 혈전증, 파종성 혈관내 응고증, 급성 심장 증후군, 또는 응고증의 징후가 있는 암을 비롯하지만 이에 한정되지 않는 질환에 대한 세포 또는 유전자 치료법에서 사용된다.
이러한 실시양태에 따라, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 사용한 세포 또는 유전자 치료법을, 그를 필요로 하는 환자에게 진단과 동시에 또는 진단 직후에 제공한다.
당업자라면 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 또는 본 발명의 항체의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 코딩하는 DNA를 함유하는 임의의 적합한 유전자 치료 벡터를 상기 실시양태에 따라 사용할 수 있음을 알 것이다. 그러한 벡터를 구성하는 기술은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Anderson, W. F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I. M. and Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242] 참조). 항체-DNA 함유 벡터를 표적 부위에 도입하는 것은 공지된 기술을 이용해서 달성할 수 있다.
세포 또는 유전자 치료 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 문헌 [Miller et al. (1989) Biotechniques 7 (9): 980-990]에 기재된 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 또는 임의의 다른 프로모터 (예, 히스톤, pol III 및 β-액틴 프로모터를 비롯하지만 이에 한정되지 않는 진핵생물 세포 프로모터와 같은 세포 프로모터)를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제 (TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 프로모터의 선택은 본원에 포함된 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 (major late) 프로모터; 또는 이종 프로모터, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 프로모터; 유도가능한 프로모터, 예를 들어 MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 열 충격 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예를 들어 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR (상기 기술된 변형된 레트로바이러스 LTR 포함); β-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용해서 패키징(packaging) 세포주를 형질도입함으로써 생산자(producer) 세포주를 형성시킨다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+#86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주 (전체내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Miller (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14]에 기재됨)를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이러한 방법으로는 전기천공법, 리포좀의 사용 및 CaP04 침전법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 하나의 대안으로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀내에 캡슐화하거나 또는 지질에 연결한 다음, 숙주에 투여할 수 있다. 생산자 세포주는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성시킨다. 이어서, 상기 레트로바이러스 벡터 입자를 사용해서 진핵 세포를 시험관내 또는 생체내에서 형질도입시킬 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현시킬 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포, 및 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근육모세포, 각질세포, 내피 세포, 및 기관지 상피 세포를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
유전자 치료법에 대한 다른 방법은 "트랜스케리오틱(transkaryotic) 치료법"인데, 여기서 환자의 세포를 생체외에서 처리하여 휴지기 염색체 유전자를 유도함으로써 환자로 재도입한 후에 목적하는 단백질을 생산한다. 트랜스케리오틱 치료법은 개체가 활성화에 필요한 유전자의 정상적인 상보체를 갖는 것으로 추정한다. 트랜스케리오틱 치료법은 초기(nascent) 유전자를 활성화할 수 있는 프로모터 또는 다른 외생 조절 서열을 생체외에서 환자의 세포의 염색체 DNA로 도입하는 단계, 활성 단백질-생산 세포를 배양하여 선별하는 단계, 및 이후에 활성화된 세포를 이들 세포가 완전히 확립되도록 환자에게 재도입하는 단계를 포함한다. 이어서, "유전자 활성화된" 세포는 다소 유의한 시간 동안, 아마도 환자의 수명 동안 목적하는 단백질을 제조한다. 전체내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,641,670호 및 동 제5,733,761호는 이러한 개념을 상세히 개시한다.
키트:
또한, 본 발명은 연구 또는 진단 목적을 위한 키트에 관한 것이다. 통상적으로, 키트는 본 발명의 항체를 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 키트는 제2 분자로 유도체화하는데 적합한 형태의 단쇄 항체를 함유하는 용기를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 키트는 서열 1 또는 서열 3의 항체를 함유하는 용기를 포함한다.
다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현에 적합한 플라스미드에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서 DNA의 발현을 조절하는 프로모터 (흔히, 유도가능한 프로모터)를 함유할 수 있다. 또한, 플라스미드는 다양한 항체를 제조하기 위해 다른 DNA 서열이 플라스미드로 삽입되는 것을 용이하게 하는 적절한 제한 부위를 함유할 수도 있다. 또한, 플라스미드는 코딩된 단백질의 클로닝 및 발현을 촉진시키는 다수의 다른 요소를 함유할 수도 있다. 이러한 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 선별가능한 마커, 개시 코돈 및 종결 코돈 등을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 키트는 서열 2 또는 서열 4의 DNA 서열을 함유하는 용기를 포함한다.
치료 적응증:
혈전 형성이 병인론적으로 유의한 역할을 하는 질병으로는 심근경색, 파종성 혈관내 응고증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 허혈성 발작, 패혈성 쇼크, 급성 호흡기 장애 증후군, 불안정성 앙기나 및 기타 동맥 및 정맥 폐색 증상을 들 수 있다. 본 발명의 항체는 이들 질병 모두, 및 혈전 형성이 병리학적 원인인 다른 질병에서 유용하다. 본 발명의 항체가 유용할 수 있는 다른 병리학적 증상에는 응고증 및 염증 증상이 있는 암이 포함된다. 또한, 항체는 피부 및 정맥 이식 및 기관 이식에서 유용할 수도 있다. 유용하다는 것은 항체가 질병을 예방하거나 또는 질병이 더 심각한 상황으로 진전하는 것을 방지하기 위한 치료에 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어 심장 밸브와 같은 생체인공삽입물을 수용하는 환자에서 안전하고 효과적인 항응고제를 제공하기도 한다. 이러한 항체는 예를 들어 폐 색전증 또는 급성 심근경색의 치료에서 헤파린 및 와파린을 대체할 수 있다. 본 발명의 항체는 응고 염려가 있는 의료 장비를 코팅하는데 사용할 수도 있다.
분석:
본 발명의 항체의 시험관내 항응고 활성을 측정하기 위해 수많은 실험 분석을 이용할 수 있다. 항체의 항응고 효과는 혈장 응고 시간 분석, 예를 들어 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 ("APTT"), 트롬빈 응고 시간 ("TCT") 및(또는) 프로트롬빈 시간 ("PT")을 이용해서 측정할 수 있다. 이들 분석법은 응고 억제의 상이한 메카니즘들과 구별되며, 단백질 C의 활성화를 포함한다. 이들 분석법 중 어느 하나에서의 응고 시간의 연장은 분자가 혈장에서 응고를 억제할 수 있음을 입증한다.
상기 분석법을 이용해서, 정제된 시스템 및 혈장 환경 둘 다에서 TF와 결합할 수 있는 항응고 활성을 갖는 항체를 동정한다. 이후, 다른 분석법을 이용해서 본 발명의 항체의 다른 활성, 예를 들어 트롬빈 촉매작용에 의한 피브리노겐으로부터 피브린의 형성의 억제 [Jakubowski, H. V. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 (8): 3876-3882], 인자 V의 트롬빈 활성화의 억제 [Esmon, C. T. et al. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14): 7944-7947], 항트롬빈 III 및 헤파린 보조인자 II에 의한 트롬빈의 억제 촉진 [Esmon, N. L. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258 (20): 12238-12242], 인자 XIII의 트롬빈 활성화의 억제 [Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58 (1): 140], 단백질 S의 트롬빈 매개 불활성화의 억제 [Thompson, E. A. and Salem, H. H. (1986) J. Clin. Inv. 78 (1): 13-17], 및 트롬빈 매개된 혈소판 활성화 및 응집의 억제 [Esmon, N. L. et al. (1983), supra]를 평가한다.
실시예 4에 상세히 기술된 다음과 같은 분석법을 이용해서 본 발명의 항체의 시험관내 효능 또는 시험관내 결합 친화성을 측정한다: 1) sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석; 2) 인자 X 활성화 분석; 3) PT 분석; 및 4) 미세열량측정 분석.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 물론, 특정 완충액, 배지, 시약, 세포 및 배양 조건 등에 대해 제한하려는 것은 아니지만, 논의가 있는 특정 상황에서 당업자가 목적하거나 또는 유용한 것으로 인식하는 모든 관련 재료를 포함하도록 해석되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 흔히 완충액 시스템 또는 배양 배지를 다른 것으로 대체하여, 동일하지 않다해도 여전히 유사한 결과를 달성할 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 방법 및 절차를 이용하는데 있어서 소정의 목적을 최적으로 제공하도록 과도한 실험 없이 이러한 대체를 수행할 수 있도록 상기 시스템 및 방법에 대해 충분한 지식을 가질 것이다.
본 발명은 본 발명의 실시를 보조하는 지침으로서 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다. 실시예의 개시내용을 적용하는데 있어서, 본 발명에 따라 개시된 방법의 다른 상이한 실시양태가 관련 기술 분야의 숙련가에게는 자명할 것임을 분명히 명심해야 한다.
상기 개시내용 및 하기 실시예에서, 모든 온도는 보정되지 않은 섭씨 온도로 기재되어 있으며, 달리 나타내지 않는다면 모든 부 및 비율은 중량 기준이다.
상기 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
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실시예 1
단쇄 항-TF 항체 구조물 scFv(TF)3e10
단쇄 항-TF 항체 scFv(TF)3e10 (서열 1)은 신호 펩티드 (-18 내지 -1), VH 도메인 (1 내지 126), VH-VL 링커 (127 내지 131), VL 도메인 (132 내지 246), 및 e-태그 서열 (247 내지 264)로 구성된다. scFv(TF)3e10 DNA 서열 (서열 2)는 서열 1의 아미노산 서열을 코딩한다.
실시예 2
단쇄 항-TF 항체 구조물 scFv(TF)3e10△
단쇄 항-TF 항체 scFv(TF)3e10△ (서열 3)은 신호 펩티드 (-18 내지 -1), VH 도메인 (1 내지 126), VH-VL 링커 (127 내지 131), 및 VL 도메인 (132 내지 243)으로 구성된다. scFv(TF)3e10△는 scFv(TF)3e10과 VL 도메인의 N-말단에서 아미노산 3개의 결실 (GAP) 및 C-말단의 e-tag 서열의 결실에 의한 차이가 있다. scFv(TF)3e10△ DNA 서열 (서열 4)는 서열 3의 아미노산 서열을 코딩한다.
실시예 3
박테리아 및 포유동물 세포에서의 항-TF 항체의 발현
상기 기술된 바와 같이, 6가지 상이한 단쇄 항체인 scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 및 scFv(TF)3h2를 TF-결합 파지로부터 동정하고, 이. 콜라이에서 과발현시키고, e-tag 친화성 컬럼을 사용해서 친화성 정제하였다. sTF에 대한 6가지 정제된 항체의 친화성을 BIAcore를 사용해서 측정한 다음, 이들 항체를 실시예 4에 기술된 바와 같은 sTF/FVIIa 펩티드 가수분해, FX 활성화, PT 및 미세열량측정 분석으로 특성화하였으며, 그 결과를 실시예 5에 기재하였다.
scFv(TF)3e10 항체 (서열 1)는 또한 CHO 세포에서 발현되었다. 발현 플라스미드는 scFv(TF)3e10을 코딩하는 DNA 서열 (서열 2), 히그로마이신 B 및 DHFR 선별 마커를 모두 함유하였다. 원래의 선별은 히그로마이신 400 ㎍/ml에서 수행하여 개체군을 선별하였다. 생성된 개체군을 이어서 100 nM 메토트렉세이트 선별 처리하였다. 이 선별 동안, 선별 마커를 함유한 DNA 영역 및 표적 유전자의 카피를 증폭한 세포를 개체군으로부터 선별하였다. 이 선별의 결과로서 발현 수준이 약 0.3 mg/L에서 약 6 mg/L로 증가하였다.
실시예 4
시험관내 효능 및 결합 친화성 분석
1. sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석
이 분석의 원리를 하기에 기술한다. 기질의 트리펩티드 p-니트로아닐리드 아미드 결합을 sTF/FVIIa 복합체에 의해 가수분해한다. 유리된 발색단 생성물인 p-니트로아닐리드를 405 nm에서 모니터링하고, 9920 M-1cm-1의 몰 흡광 계수를 이용하여 단위 시간 당 형성된 생성물의 농도를 계산한다. 초기 비율을 4 파라미터 방정식에 넣어 IC50 값 (C)을 결정하였다: Y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA ⇒ H-D-Val-Leu-Arg + p-NA
S2266 기질 트리펩티드 발색단
시약 및 용액:
1. 분석 완충액: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1％ BSA, pH 7.5
2. 인간 FVIIa (HCVIIA-0060, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크. (Haematologic Technologies Inc.)): 10×작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 20 nM 용액을 제조함.
3. 가용성 TF (베를렉스 (Berlex)): 10×작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 30 nM 용액을 제조함.
4. 발색 기질 S2266 (카비 파마시아 헤파르 인크 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.)): 원액: H2O 중 10 mM, 4 ℃에서 보관함. 2.5×작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 2.5 mM 용액을 제조함.
5. 항체: 사용 전에 분석 완충액 중의 2.5×희석액을 제조함.
분석 조건:
분석을 96-웰 미량역가 플레이트 중에서 실온에서 수행하였다. 구성 성분의 최종 농도는 하기와 같았다:
sTF 3 nM
항체 1000 내지 0.625 nM로 다양함
FVIIa 2 nM
S2266 1 mM
분석 절차:
1. 2.5 × AB (또는 완충액 대조군) 0.1 ml를 각각의 웰 내로 파이펫으로 옮김.
2. 10 × sTF 0.025 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
3. 10 × FVIIa 0.025 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
4. 2.5 × S2266 기질 0.1 ml를 첨가하고, 플레이트를 플레이트 판독기 내로 즉시 옮기고, 효소 반응속도를 405 nm에서 10 초 간격으로 15 분 동안 측정함.
이 분석을 이용해서 본 발명의 항체와 sTF 또는 FVIIa/TF 복합체의 결합의 겉보기 KD 값을 측정하고, 본 발명의 항체가 TF에 결합하는데 있어서 FVII와 경쟁하는지를 결정할 수 있다.
2. 인자 X 활성화 분석
이 분석의 원리를 하기에 기술한다. FVIIa를 재조합 인간 TF 소포(vesicle)와 인큐베이션하여 기질인 FX를 활성화시킬 수 있는 프로테아제 복합체를 형성시킨다. 이 복합체는 상이한 농도의 항체의 존재 (또는 부재)하에 형성되고, 이어서 기질 FX를 도입하고, 반응을 진행시켜 생성물인 활성 프로테아제 FXa를 형성시키며, 여기서 활성 프로테아제 FXa는 발색성 기질 S2222의 p-니트로아닐리드 아미드 결합을 가수분해할 수 있다. 유리된 발색단 생성물인 p-니트로아닐리드를 405 nm에서 모니터링하고, 9920 M-1cm-1의 몰 흡광 계수를 이용하여 단위 시간 당 형성된 생성물의 농도를 계산한다. 초기 비율을 4 파라미터 방정식에 넣어 IC50 값 (C)을 결정하였다:
Y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA ⇒ Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA
S2222 기질 발색단
시약 및 용액:
1. 분석 완충액: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1％ BSA, pH 7.5
2. 인간 FVIIa (HCVIIA-0031, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크.): 4×작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 100 pM 용액을 제조함.
3. 재조합 인간 TF (이노빈, 다데 (Innovin, Dade)로부터의 것을 본 발명자 실험실에서 재구성함): 작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 1:480 희석액을 제조함.
4. 인간 인자 X (HCX-0060, 헤머톨로직 테크놀로지즈 인크.): 4×작업 용액 - 사용 전에 분석 완충액 중의 1000 nM 용액을 제조함.
5. 발색 기질 S2222 (카비 파마시아 헤파르 인크.):
원액: H2O 중 6 mM, 4 ℃에서 보관함.
작업 용액 - 사용 전에 3.57 mM EDTA (반응을 정지시키기 위함), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 중의 0.78 mM 용액을 제조함.
6. 항체:
사용 전에 분석 완충액 중의 4×희석액을 제조함.
분석 조건:
분석을 96-웰 미량역가 플레이트에서 실온에서 수행하였다. 구성 성분의 최종 농도는 하기와 같았다:
rTF 소포 1:480 희석물의 1/4
항체 1000 내지 0.625 nM로 다양함
FVIIa 25 pM
FX 250 nM
S2222 0.546 mM
분석 절차:
1. 4 × AB (또는 완충액 대조군) 0.015 ml를 각각의 웰 내로 파이펫으로 옮김.
2. 4 × rTF 소포 0.015 ml를 첨가함.
3. 4 × FVIIa 0.015 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
4. 4 × FX 0.015 ml를 첨가하고, 약한 진탕과 함께 5 분 동안 실온에서 인큐베이션함.
5. S2222 기질 0.14 ml를 첨가하고, 플레이트를 플레이트 판독기 내로 즉시 옮기고, 효소 반응속도를 405 nm에서 10 초 간격으로 15 분 동안 측정함.
이 분석을 이용해서 본 발명의 항체가 FVIIa/TF 복합체를 억제하여 FX를 활성화하는지를 결정하고, 본 발명의 항체가 FVIIa/TF 복합체에 결합하는데 있어서 FX와 경쟁하는지를 결정할 수 있다.
3. 프로트롬빈 시간 (PT) 분석
표준 PT 반응의 경우, 적정 농도의 항체 또는 PBS 90 ㎕를 큐벳내 트롬보플라스틴 IS (Dade) 20 ㎕ 및 25 mM CaCl2 90 ㎕에 첨가한다. 혼합물을 37 ℃에서 1분 동안 인큐베이션한 다음, 시트레이트화 혈장 (Helena Laboratories) 100 ㎕를 넣었다. 또는, 적정 부피의 농축된 항체를 재조합 인간 트롬보플라스틴 (Ortho Recombiplastin) 100 ㎕에 가하고, 대략 2분 후, 재구성된 인간 혈장 100 ㎕를 가하였다. 각각의 개별 응고 분석에 대한 응고 시간은 일렉트라(Electra) 900C 응고측정기(Coagulometer)(Hemoliance)를 사용해서 두 측정치의 평균을 취하여 측정하였으며, 평균 값은 반복 분석 (n = 3 또는 4)으로부터 결정하였다. 각 억제제에 대해 투여량 반응 그래프를 작성하였으며, 회귀 분석을 이용해서 응고 시간을 2배 연장하는데 필요한 농도 (nM 단위)를 계산하였다.
상기 분석법을 이용해서 외부 혈액 응고 경로에 대한 본 발명의 항체의 효과를 평가할 수 있다. PT를 2배로 하는데 필요한 항체의 양을 결정하고, 이를 다른 항응고제와 비교하여 본 발명의 항체의 상대적 효능을 평가할 수 있다.
4. 미세열량측정 분석
미세열량측정 (등온 적정 열량측정) 분석법을 이용해서 단독의 TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 대한 본 발명의 항체의 결합 친화성 (KD)을 측정하였다. 이 분석법은 마이크로칼(MicroCal) VP-ITC 기기를 사용해서 수행하였다. 2.3배 몰 과량의 FVIIai를 sTF에 가하여 FVIIa/TF 복합체를 형성시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용해서 이 분석에서의 sTF가 완전하게 복합체를 형성했음을 확인했다. 복합체에 대한 항체 친화성을 측정하기 위해, 1.2 μM VIIa/TF 복합체를 미세열량측정기 셀에 가하고, 65 μM 항체를 주사기에 넣었다. 단독의 sTF에 대한 항체 친화성을 결정하기 위해, 10 μM sTF를 셀에 넣고, 141 μM 항체를 주사기에 넣었다. 마이크로칼 오리진(MicroCal Origin) 소프트웨어를 사용해서 데이타 분석을 수행하였다. 데이타를 단일 결합 부위에 핏팅하였다.
실시예 5
본 발명의 항-TF 항체의 시험관내 특징
다음과 같은 6가지 상이한 TF-결합 항체를 완전한 인간 단쇄 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다: scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 및 scFv(TF)3h2. BIAcore를 사용해서 측정한 바로는 이. 콜라이에서 발현되는 상기 sTF-결합 항체의 친화도는 35 내지 470 nM였다. 실시예 4에 기술된 sTF/VIIa 펩티드 가수분해 분석을 이용해서 상기 항체가 활성 VIIa/TF 복합체의 형성을 차단했는지를 결정하였다. 이 분석에서, VIIa와 sTF의 결합은 발색 펩티드 기질 S2266에 대한 절단 속도를 20배 넘게 가속시켰다. FVIIa와 TF의 결합을 억제하는 항체는 이러한 가속을 차단시킨다. 단쇄 항체 중 5가지인 scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 및 scFv(TF)3h2는 S2266 가수분해를 억제하였으며, 이는 상기 항체들이 FVIIa와 sTF의 결합을 억제한다는 것을 시사한다 (도 1). 이와는 달리, 단쇄 항체 scFv(TF)3e10은 sTF/VIIa 펩티드 가수분해 분석을 억제하지 않았으며, 실제로는 이 항체가 S2266의 가수분해 속도를 증가시켰는데, 이러한 결과는 scFv(TF)3e10이 FVIIa에 대한 sTF의 친화성을 증가시킨다는 것을 시사한다. sTF/VIIa 펩티드 가수분해 분석을 이용해서, scFv(TF)3e10 항체는 sTF에 대한 FVIIa의 친화성을 증가시켰으며, KD(apparent)를 5배 감소시켰다 (도 2). scFv(TF)3e10은 sTF의 부재하에 FVIIa에 의한 가수분해 속도에 영향을 주지 않았으며, 이러한 결과는 상기 항체가 단독의 FVIIa와는 상호작용하지 않음을 암시한다. sTF/FVIIa 펩티드 가수분해 분석을 이용해서 측정한 sTF에 대한 scFv(TF)3e10 항체의 KD는 65.4 nM였다 (도 4). 미세열량측정 분석법을 이용해서 TF에 대한 scFv(TF)3e10의 친화성을 FVIIa/TF 복합체와 비교하였다. 이러한 실험에 의해 포유동물 세포에 의해 발현된 scFv(TF)3e10이 자유 sTF에 비해 TF/FVIIa 복합체에 대해 약 20배 더 높은 친화성을 가짐을 밝혀냈다 (33 nM 대 600 nM, 도 5).
박테리아에서 발현된 6가지 TF-결합 단쇄 항체를, FX 활성화 분석 및 PT 분석을 이용해서 비교하였다. sTF/FVIIa 복합체에 의해 S2266의 가수분해 속도를 억제한 5가지 항체인 scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 및 scFv(TF)3h2의 어느 것도 PT를 PBS 완충액 대조군을 넘어서 연장하지 않았다 (도 3). 대조적으로, scFv(TF)3e10 항체가 BIAcore에 의해 측정된 바로는 가장 높은 친화성을 갖지 않았으며 그가 sTF에 대한 FVIIa의 친화성을 증가시켰지만, scFv(TF)3e10은 그룹 중에서 FX 활성화를 억제하고 (도 6, 데이타는 나타내지 않음) PT 분석에서 응고 시간을 연장시킨 (도 3) 유일한 항체였다. FX 활성화 분석에서 억제에 관한 scFv(TF)3e10 (이량체) 항체의 IC50은 0.44 nM였다 (도 6). 마지막으로, FX 활성화 분석을 이용해서 scFv(TF)3e10 항체가 FVIIa/TF 복합체에 결합하는데 있어서 FX와 경쟁하는지를 결정하였다. scFv(TF)3e10은 기질 FX의 모든 농도에서 FX 활성화를 동일한 KD(app)로 투여량 의존적으로 억제하였으며, 이러한 결과는 scFv(TF)3e10이 FX와 경쟁하지 않으며 FX와 동일한 부위에서 TF 또는 FVIIa/TF 복합체에 결합하지 않는다는 것을 암시한다 (도 7).
재조합 인간 가용성 TF에 대한 결합을 기초로 하여 scFv(TF)3e10 항체를 동정하였다. 인간과 쥐과동물 또는 인간과 토끼 사이의 TF의 서열 상동성은 각각 58％ 및 71 ％이다. 항체는 FVIIa/TF 복합체에 의한 FX의 활성화를 방해하는 인간 TF 상의 특이적 에피토프에 결합하는 것으로 보인다. 생리학적으로, 이러한 항체는 TF와 결합하는 FVII 또는 FVIIa와 경쟁하는 항체에 비해 이점을 갖는다. 가용성 TF에 대한 FVIIa의 KD는 약 10 nM이며 (도 2), 이 값은 FVIIa와 sTF의 결합 (4.8 nM, Neuenschwander, P. F. and Morrissey, J. H. (1994) J. Biol. Chem. 269 (11): 8007-8013) 또는 FVII, FVIIa 및 DIP 불활성화-FVIIai와 중성 포스파티딜콜린 소포내에 재구성된 전장 TF의 결합 (Bach R. et al. (1986) Biochemistry 25: 4007-4020)에 대한 공개된 값과 일치한다. 전장 TF에 결합하는 FVII 또는 FVIIa의 친화성은, FVII 또는 FVIIa의 GLA 도메인과 하전된 막 표면의 상호작용 [Neuenschwander, P. F. and Morrissey, J. H. (1994) supra]으로 인해, 하전된 포스파티딜 세린이 인지질 소포내에 포함되는 경우에 크게 증가한다 [Bach R. et al. (1986) supra]. 이러한 최적 조건하에, FVIIa는 전장 TF와 매우 높은 친화성 (41 pM)으로 결합한다. FVII 또는 FVIIa 결합과 경쟁하는 TF 항체는 이러한 높은 친화성의 FVIIa/TF 복합체에 대해 경쟁하는데 있어서의 어려움을 가질 것이다. 대조적으로, scFv(TF)3e10 항체는 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 더 큰 친화성을 가질뿐만 아니라, TF에 결합하는데 있어서 FVIIa와 경쟁하지 않는다. FVIIa와 경쟁하지 않는 scFv(TF)3e10과 같은 항체는 약 10 nM인 FVII의 혈장 농도와는 무관하게 FX의 활성화를 억제할 것이다.
또한, scFv(TF)3e10 항체는 TF에 결합하는데 있어서 FX와 경쟁하는 항체에 비해 이점을 갖는다. VIIa/TF 복합체에 대한 FX의 Km은 도 7에 나타낸 데이타를 기준으로 0.061 내지 0.099 μM이며, 공개된 값 (0.1 μM, Baugh, R. J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 (37): 28826-28833)과 일치한다. 인간 혈장내 FX의 농도는 140 nM (1.4배 내지 2배의 Km)이다. scFv(TF)3e10과 같은 항체는 도 7에 나타낸 바와 같이 FX와 경쟁하지 않으며, FX의 혈장 농도와 무관하게 FX의 활성화를 억제할 것이다.
실시예 6
생체내 래트 혈전색전증 모델
TF-결합 단쇄 항체 scFv(TF)3e10은 영장류 TF에 대해 특이적이다. 인간 TF (인간 재조합 TF를 함유하는 트롬보플라스틴 제제, 오르토 (Ortho))에 의해 유도되는 혈전색전증 모델을 의식있는 수컷 스프라그-돌리 래트 (350-400 g, n > 7/군)에서 개발하였다. 파종성 혈관내 응고증 (DIC)의 이러한 모델에서, 트롬보플라스틴 주사를 통해 TF가 폐 피브린 침착, 호흡 부전증, 및 사망을 유도하였다. 포유동물 세포에 의해 발현된 소정 투여량의 scFv(TF)3e10 또는 비히클을 미부 정맥내로 주사하고, 15 분 후에 볼루스 주사에 의해 트롬보플라스틴 (0.5 ml/kg)을 주사하였다. 비히클 처리 군에서, 상기 투여량의 TF는 통상적으로 트롬보플라스틴 주사 후 5 분 내에 60％ 치사율 (LD60)을 나타냈다. 래트를 하기 질병율-사망율 점수 시스템에 따라 채점하였다: 0 = 영향이 없음; 1 = 약간의 호흡 곤란 (30 분 내에 회복됨); 2 = 중증의 호흡 곤란 (빈사상태, 60 분 이상을 요구하는 회복); 및 3 = 사망. 평균 점수를 사용하여 상이한 처리 군의 효능을 비교하였다. 이 생체내 분석을 이용하는 결과를 도 8에 도시한다. 본 발명의 항체는 이러한 분석에서 사망 및 호흡 장애를 경감시킬 수 있었다.
일반적으로 또는 특정하게 기재된 반응물을 대체하고(거나) 상기 실시예에 이용된 것들에 대한 본 발명의 조건들로 수행함으로써 상기 실시예를 반복하여 유사한 결과를 가질 수 있었다.
본 발명은 특정 항체 구조물의 생산에 관해 설명되었지만, 본 발명의 변법 및 별법이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 수행될 수 있다는 것은 명백하다.
<110> Light, David McLean, Kirk <120> Novel Tissue Factor Targeted Antibodies as Anticoagulants <130> 52295AWOM2 <150> US 60/376,566 <151> 2002-05-01 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of scFv(TF)3e10 antibody <400> 1 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His 145 150 155 160 Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg 180 185 190 Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro 195 200 205 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220 Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro 260 265 270 Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 280 <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding scFv(TF) 3e10 antibody <400> 2 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60 gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac 240 tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta 360 ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc 420 accgtctcgg ccggtggcgg cggatctggc gcgccaaatt ttatgctgac tcagccccac 480 tctgtgtcgg cgtctccggg gaagacggta accatctcct gcacccgcag cagtggcagc 540 gttgccagct actatgtgca gtggtaccag cagcgcccgg gcagttcccc caccactgtg 600 atctatgagg ataaccacag accctctggg gtccctgatc ggttctctgg ctccatcgac 660 acctcctcca actctgcctc cctcaccatc tctggactga agactgagga cgaggctgac 720 tactactgtc agtcttatga tagcaacaac cttgtggttt tcggcggagg gaccaagctg 780 accgtcctag gtgcggccgc aggagctccg gtgccggatc cggatccgct ggaaccgcgt 840 gccgcatga 849 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of scFv(TF)3e10delta antibody <400> 3 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser 145 150 155 160 Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly 165 170 175 Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser 180 185 190 Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser 210 215 220 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly 260 <210> 4 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding scFv(TF)3e10delta antibody <400> 4 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60 gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac 240 tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta 360 ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc 420 accgtctcgg ccggtggcgg cggatctaat tttatgctga ctcagcccca ctctgtgtcg 480 gcgtctccgg ggaagacggt aaccatctcc tgcacccgca gcagtggcag cgttgccagc 540 tactatgtgc agtggtacca gcagcgcccg ggcagttccc ccaccactgt gatctatgag 600 gataaccaca gaccctctgg ggtccctgat cggttctctg gctccatcga cacctcctcc 660 aactctgcct ccctcaccat ctctggactg aagactgagg acgaggctga ctactactgt 720 cagtcttatg atagcaacaa ccttgtggtt ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 780 ggt 783

Claims (25)

  1. 단독의 조직 인자 (TF)보다 인자 VIIa/조직 인자 (FVIIa/TF) 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는 항응고 항체.
  2. 제1항에 있어서, 미세열량측정 분석으로 측정시 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 2배 이상 더 큰 친화성으로 결합하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 5배 이상 더 큰 친화성으로 결합하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 10배 이상 더 큰 친화성으로 결합하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 단쇄 항체, Fab 이량체 항체 또는 IgG 항체인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 단쇄 항체인 항체.
  8. 제7항에 있어서, TF에 결합하는데 있어서 인자 VII (FVII), 인자 IX (FIX) 및 인자 X (FX)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 응고 인자와 경쟁하지 않는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 응고 인자가 FVII 및 FX인 항체.
  10. 제1항에 있어서, 글리코실화된 항체.
  11. 제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜의 부가에 의해 변형된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 비오티닐화되어 스트렙타비딘과 결합하는 항체.
  13. 치료 유효량의 제1항의 항체 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  14. 혈소판의 활성화 및 혈소판의 응집과 같은 다른 응고 파라미터에 직접 영향을 주지 않으면서 트롬빈의 생성을 억제하는 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈전 형성을 방지하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 허혈성 발작, 혈관성형술 이후의 혈전성 합병증 또는 미세혈관 수술에서 혈전 형성을 방지하는 방법.
  16. 환자에게 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자의 심부 정맥 혈전증 (DVT), 파종성 혈관내 응고증 (DIC), 급성 심장 증후군, 또는 응고증 징후가 있는 암을 경감시키고 치료하는 방법.
  17. 치료 유효량의 제1항의 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 염증 반응을 조절하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 염증 반응이 패혈증, 피부 및 정맥 이식, 및 기관 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 혈액과 접촉하는 의료 장비의 표면상에서 혈전형성을 방지하는 코팅을 형성시키는데 사용될 수 있는 항체.
  20. 제1항의 항체를 포함하는 키트.
  21. 제1항의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 키트.
  22. 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 항체를 코딩하는 서열 2 또는 서열 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 치료 유효량의 유전자 치료 벡터와 함께 포함하는 유전자 치료 조성물.
  23. 단독의 TF보다 FVIIa/TF 복합체에 대해 더 큰 친화성으로 결합하는 단쇄 항체이며, TF에 결합하는데 있어서 FVII 및 FX와 경쟁하지 않는 항응고 항체.
  24. 제23항에 있어서, 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  25. 서열 2 또는 서열 4의 핵산 서열을 포함하는, 제23항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
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